プライマー、プライマーセット、それを用いた核酸増幅方法および変異検出方法

【課題】核酸の二重らせん構造を効果的に検出可能なプライマーの提供。
【解決手段】下記式（１６）で表される構造を少なくとも一つ含む標識核酸であるプライマー。

Ｂは、核酸塩基骨格を有する原子団であり、Ｅは、デオキシリボース骨格、リボース骨格、もしくはそれらのいずれかから誘導される構造を有する原子団、Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ、蛍光性を示す原子団。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列を増幅するためのプライマーであって、
下記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）または（１８ｂ）で表される構造を少なくとも一つ含む標識核酸であることを特徴とするプライマー。
【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【化５】

【化６】

式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｂは、天然核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル）骨格または人工核酸塩基骨格を有する原子団であり、
Ｅは、
（ｉ）デオキシリボース骨格、リボース骨格、もしくはそれらのいずれかから誘導される構造を有する原子団、または
（ii）ペプチド構造もしくはペプトイド構造を有する原子団であり、
Ｚ^１１およびＺ^１２は、それぞれ、蛍光性を示す原子団であり、同一でも異なっていてもよく、
Ｌ^１、Ｌ^２およびＬ^３は、それぞれ、リンカー（架橋原子または原子団）であり、主鎖長（主鎖原子数）は任意であり、主鎖中に、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＰおよびＳｉを、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、主鎖中に、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合を、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、Ｌ^１、Ｌ^２およびＬ^３は、互いに同一でも異なっていても良く、
Ｄは、ＣＲ、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、ＢもしくはＳｉＲであり、Ｒは、水素原子、アルキル基または任意の置換基であり、
ｂは、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、
または、前記式（１６）および（１６ｂ）中、Ｌ^１およびＬ^２は前記リンカーであり、Ｌ^３、Ｄおよびｂは存在せず、Ｌ^１およびＬ^２がＢに直接結合していてもよく、
ただし、
式（１６）、（１７）および（１８）中、Ｅは、前記（ｉ）の原子団であり、リン酸架橋中の少なくとも一つのＯ原子がＳ原子で置換されていても良く、
式（１６ｂ）、（１７ｂ）および（１８ｂ）中、Ｅは、前記（ii）の原子団であり、
式（１７）および（１７ｂ）中、各Ｂは、同一でも異なっていても良く、各Ｅは、同一でも異なっていても良い。
【請求項２】
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｌ^１、Ｌ^２およびＬ^３の主鎖長（主鎖原子数）が、それぞれ２以上の整数である、請求項１記載のプライマー。
【請求項３】
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｚ^１１およびＺ^１２が、エキシトン効果を示す原子団である、請求項１または２記載のプライマー。
【請求項４】
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｚ^１１およびＺ^１２が、それぞれ独立に、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、シアニン、ヘミシアニン、その他のシアニン色素、メチルレッド、アゾ色素またはそれらの誘導体から誘導される基である、請求項１から３のいずれか一項に記載のプライマー。
【請求項５】
Ｚ^１１およびＺ^１２が、それぞれ独立に、下記式（７）から（９）のいずれかで表される原子団である、請求項１から４のいずれか一項に記載のプライマー。
【化７】

【化８】

【化９】

式（７）〜（９）中、
Ｘ^１およびＸ^２は、ＳまたはＯであり、
ｎは、０または正の整数であり、
Ｒ^１〜Ｒ^１０、Ｒ^１３〜Ｒ^２１は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、またはアミノ基であり、
Ｒ^１１およびＲ^１２のうち、一方は、前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中のＬ^１もしくはＬ^２に結合する連結基であり、他方は、水素原子または低級アルキル基であり、
Ｒ^１５は、式（７）、（８）または（９）中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Ｒ^１６は、式（７）、（８）または（９）中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Ｚ^１１中のＸ^１、Ｘ^２およびＲ^１〜Ｒ^２１と、Ｚ^１２中のＸ^１、Ｘ^２およびＲ^１〜Ｒ^２１とは、互いに同一でも異なっていてもよい。
【請求項６】
前記式（７）〜（９）中、
Ｒ^１〜Ｒ^２１において、前記低級アルキル基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルキル基であり、前記低級アルコキシ基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルコキシ基である、請求項５記載のプライマー。
【請求項７】
前記式（７）〜（９）中、
Ｒ^１１およびＲ^１２において、前記連結基が、炭素数２以上のポリメチレンカルボニル基であり、カルボニル基部分で前記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中のＬ^１もしくはＬ^２に結合する、請求項５または６記載のプライマー。
【請求項８】
標的核酸配列を増幅するためのプライマーセットであって、
一対のプライマーを含み、
前記一対のプライマーの少なくとも一方のプライマーが、請求項１から７のいずれか一項に記載のプライマーであることを特徴とするプライマーセット。
【請求項９】
前記プライマーセットが、等温増幅法に使用するプライマーセットである、請求項８記載のプライマーセット。
【請求項１０】
さらに、鎖置換能を有するポリメラーゼを含む、請求項９記載のプライマーセット。
【請求項１１】
さらに、ミスマッチ結合タンパク質を含む、請求項９または１０記載のプライマーセット。
【請求項１２】
前記ミスマッチ結合タンパク質が、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１１に記載のプライマーセット。
【請求項１３】
前記一対のプライマーが、一方のプライマーの形態と他方のプライマーの形態とが異なる非対称型である、請求項９から１２のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１４】
前記一対のプライマーが、第一のプライマーと第二のプライマーとを含み、
前記第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含むものであり、
前記第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含むものである、請求項１３記載のプライマーセット。
【請求項１５】
前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのいずれか一方が、前記標識核酸である、請求項１３または１４記載のプライマーセット。
【請求項１６】
前記プライマーセットが、さらに、第三のプライマーを含み、
前記第三のプライマーは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズし、かつ標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないプライマーであり、
前記第三のプライマーは、前記第一のプライマーまたは第二のプライマーの増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的核酸配列にアニーリングすることができ、これにより前記増幅産物中の標的核酸配列に新たな相補鎖合成起点が提供されるプライマーである、請求項１３から１５のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１７】
前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのいずれか一方に加えて、または、代えて、前記第三のプライマーが前記標識核酸である、請求項１６記載のプライマーセット。
【請求項１８】
前記一対のプライマーが、一方のプライマーの形態と他方のプライマーの形態とが同じ対称型である、請求項９から１２のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１９】
前記プライマーセットが、ランプ法に使用するプライマーセットである、請求項１８記載のプライマーセット。
【請求項２０】
前記プライマーセットが、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法に使用するプライマーセットである、請求項８記載のプライマーセット。
【請求項２１】
標的核酸配列を増幅する核酸増幅方法に使用する核酸増幅用キットであり、
請求項１から７のいずれか一項に記載のプライマー、または、請求項８から２０のいずれか一項に記載のプライマーセットを含むことを特徴とする核酸増幅用キット。
【請求項２２】
等温増幅法に使用するための核酸増幅用キットであり、請求項９から１９のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、請求項２１記載の核酸増幅用キット。
【請求項２３】
ＰＣＲ法に使用するための核酸増幅用キットであり、請求項２０記載のプライマーセットを含む、請求項２１記載の核酸増幅用キット。
【請求項２４】
標的核酸配列における変異の有無を検出する変異検出方法に使用する変異検出用キットであり、
請求項２１から２３のいずれか一項に記載の核酸増幅用キットを含むことを特徴とする変異検出用キット。
【請求項２５】
核酸試料中の標的核酸配列を増幅する方法であって、下記（Ａ）工程と、下記（Ｂ）または（Ｂ’）工程とを含むことを特徴とする核酸増幅方法。
（Ａ）前記核酸試料を準備する工程
（Ｂ）請求項１から７のいずれか一項に記載のプライマー、または、請求項８から２０のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて、核酸試料中の標的核酸配列を増幅する工程
（Ｂ’）下記（Ｂ１’）工程および（Ｂ２’）工程を含む工程
（Ｂ１’）プライマー、または、一対のプライマーを含むプライマーセットを用いて、核酸試料中の標的核酸配列を増幅する工程
（Ｂ２’）前記（Ｂ１’）工程で増幅した一本鎖の核酸配列と、下記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）または（１８ｂ）で表される構造を少なくとも一つ含む標識核酸からなるプローブとのハイブリダイゼーションを行う工程
【化１０】

【化１１】

【化１２】

【化１３】

【化１４】

【化１５】

式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｂは、天然核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル）骨格または人工核酸塩基骨格を有する原子団であり、
Ｅは、
（ｉ）デオキシリボース骨格、リボース骨格、もしくはそれらのいずれかから誘導される構造を有する原子団、または
（ii）ペプチド構造もしくはペプトイド構造を有する原子団であり、
Ｚ^１１およびＺ^１２は、それぞれ、蛍光性を示す原子団であり、同一でも異なっていてもよく、
Ｌ^１、Ｌ^２およびＬ^３は、それぞれ、リンカー（架橋原子または原子団）であり、主鎖長（主鎖原子数）は任意であり、主鎖中に、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＰおよびＳｉを、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、主鎖中に、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合を、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、Ｌ^１、Ｌ^２およびＬ^３は、互いに同一でも異なっていても良く、
Ｄは、ＣＲ、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、ＢもしくはＳｉＲであり、Ｒは、水素原子、アルキル基または任意の置換基であり、
ｂは、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、
または、前記式（１６）および（１６ｂ）中、Ｌ^１およびＬ^２は前記リンカーであり、Ｌ^３、Ｄおよびｂは存在せず、Ｌ^１およびＬ^２がＢに直接結合していてもよく、
ただし、
式（１６）、（１７）および（１８）中、Ｅは、前記（ｉ）の原子団であり、リン酸架橋中の少なくとも一つのＯ原子がＳ原子で置換されていても良く、
式（１６ｂ）、（１７ｂ）および（１８ｂ）中、Ｅは、前記（ii）の原子団であり、
式（１７）および（１７ｂ）中、各Ｂは、同一でも異なっていても良く、各Ｅは、同一でも異なっていても良い。
【請求項２６】
前記（Ｂ）または（Ｂ’）工程における核酸増幅が、等温増幅法による核酸増幅反応である、請求項２５記載の核酸増幅方法。
【請求項２７】
前記等温増幅法が、鎖置換能を有するポリメラーゼを用いた増幅法である、請求項２６記載の核酸増幅方法。
【請求項２８】
前記（Ｂ）または（Ｂ’）工程において、ミスマッチ結合タンパク質の存在下、核酸増幅を行う、請求項２６または２７記載の核酸増幅方法。
【請求項２９】
前記ミスマッチ結合タンパク質が、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項２８に記載の核酸増幅方法。
【請求項３０】
前記（Ｂ）工程における前記プライマーセットが、請求項９から１９のいずれか一項に記載のプライマーセットである、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項３１】
前記（Ｂ）工程におけるプライマーセットが、請求項１３から１７のいずれか一項に記載のプライマーセットである、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項３２】
前記（Ｂ）工程におけるプライマーセットが、請求項１８または１９記載のプライマーセットである、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項３３】
前記（Ｂ）または（Ｂ’）工程における核酸増幅が、ＰＣＲ法による核酸増幅反応である、請求項２５記載の核酸増幅方法。
【請求項３４】
前記（Ｂ）工程におけるプライマーセットが、請求項２０記載のプライマーセットである、請求項３３記載の核酸増幅方法。
【請求項３５】
前記（Ｂ）工程において、検出波長が異なる蛍光性原子団を有する２種類以上の請求項１から７のいずれか一項に記載のプライマーを使用する、請求項２５から３４のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項３６】
前記標的核酸配列が変異を有する核酸配列であって、
前記（Ｂ）工程において、前記標的核酸配列における変異部位を含む領域に対して完全に相補な配列を有する請求項１から７のいずれか一項に記載のプライマーと、前記変異部位を含む領域に対して前記変異部位を除いて完全に相補な配列を有するプライマーとを使用する、請求項２５から３５のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項３７】
核酸試料中の標的核酸配列における変異の有無を検出する方法であって、
下記（ａ）〜（ｃ）工程を含むことを特徴とする変異検出方法。
（ａ）請求項２５から３６のいずれか一項に記載の核酸増幅方法により、核酸試料中の標的核酸配列を増幅する工程
（ｂ）前記（ａ）工程の前後における蛍光強度をそれぞれ測定する工程
（ｃ）前記（ｂ）工程で測定した前記（ａ）工程前後の蛍光強度を比較することにより、変異の有無を検出する工程
【請求項３８】
前記変異が、塩基の置換、欠失または挿入である、請求項３７記載の変異検出方法。
【請求項３９】
前記（ａ）工程において、検出波長が異なる蛍光性原子団を有する２種類以上の請求項１から７のいずれか一項に記載のプライマーを使用して、標的核酸配列を増幅し、
前記（ｃ）工程において、前記各蛍光性原子団に応じた各検出波長により、それぞれの蛍光強度を測定する、請求項３７記載の変異検出方法。
【請求項４０】
前記（ａ）工程において、前記標的核酸配列における変異部位を含む領域に対して完全に相補な配列を有する請求項１から７のいずれか一項に記載のプライマーと、前記変異部位を含む領域に対して前記変異部位を除いて完全に相補な配列を有するプライマーとを使用する、請求項３７記載の変異検出方法。
【請求項４１】
標的核酸配列に対するプライマーの特異性を向上させる方法であって、
前記標的核酸配列を増幅するための前記プライマーとして、請求項１から７のいずれか一項に記載の蛍光原子団を有するプライマーを使用することを特徴とする特異性の向上方法。
【請求項４２】
標的核酸配列に対するプライマーの特異性を向上させる方法であって、
前記標的核酸配列を増幅するための前記プライマーとして、前記標的核酸配列における変異部位を含む領域に対して完全に相補な配列を有する請求項１から７のいずれか一項に記載のプライマーを使用し、
さらに、前記プライマーの特異性を向上させるプライマーとして、前記変異部位を含む領域に対して前記変異部位を除いて完全に相補な配列を有するプライマーを併用することを特徴とする特異性の向上方法。
【請求項４３】
請求項２５から３６のいずれか一項に記載の核酸増幅方法を実施するための核酸増幅装置であって、
核酸増幅反応を実施する反応部と、前記反応部の温度を制御する温度制御手段と、前記反応部の蛍光強度を検出する検出手段とを備えることを特徴とする核酸増幅装置。
【請求項４４】
請求項３７から４０のいずれか一項に記載の変異検出方法を実施するための変異検出装置であって、
核酸増幅反応を実施する反応部と、前記反応部の温度を制御する温度制御手段と、前記反応部の蛍光強度を検出する検出手段とを備えることを特徴とする変異検出装置。

【図１２】