プライマーの作製方法、プライマーの使用方法、プライマーセット、ＰＣＲ用反応液、及びプライマーの設計方法
【課題】 複数の検出対象生物を、同時かつそれぞれ特異的に増幅することが可能なＰＣＲ用プライマーセットを作製する。
【解決手段】 ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットを、増幅対象生物のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅させるためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないように作製する。
【解決手段】 ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットを、増幅対象生物のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅させるためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないように作製する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ用プライマーの作製方法に関し、特に複数の増幅対象生物を特異的に検出可能なマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットの作製に用いることができるプライマーの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応，Polymerase Chain Reaction）法は微生物の検出や微生物の分類などの研究や産業に幅広く利用されており、様々な点で世間に貢献している。ＰＣＲ法が産業界に利用されている例として、食品製造現場や臨床現場において、日常的に危害菌などの有無が判定できる微生物検査が行われている。
ＰＣＲを行うにあたっては、対象微生物を特異的に増幅することが可能なプライマーを設計することが重要である。
しかしながら、異なる微生物でも同じ機能を持つ遺伝子では配列が類似している場合が多いことや対象領域が非対象領域と類似している可能性があることから、増幅の干渉や特異性が高いプライマーを設計するのは容易ではなかった。またＰＣＲ条件が最適化されていないため、ＰＣＲ条件を検討する手間も大変だった。
特にマルチプレックスＰＣＲにおける検証試験は、従来のＰＣＲよりもプライマー数や対象微生物数が増えるため検証数の増加につながり、プライマー設計には特異性の付与が重要であった。
【０００３】
また、微生物検査を簡単かつ迅速に行うためには、複数の微生物を同時に特異的に増幅するマルチプレックスＰＣＲを行うことが望ましい。
しかし、このように複数の微生物を同時に増幅する場合には、プライマー同士の競合、あるいはダイマー形成などが起こり、さらに増幅が干渉するため、結果として感度の低下や非特異増幅に影響する。
このため、同時検出する対象微生物の数が多くなるに従って、特異性の高いプライマーの設計は非常に難しくなるという問題があった。
【０００４】
ここで、マルチプレックスＰＣＲにおけるプライマーに関連する発明としては、特許文献１に記載のプライマーキットを挙げることができる。
このプライマーキットによれば、検体ごとに必要なプライマーを自由に組み換えて使用できるとされている。また、検体ごとにそれぞれ異なる検査項目が要求される遺伝子検査等においても、不要な遺伝情報の検出を回避しつつ、必要な標的塩基配列のみを過不足なく増幅することができ、また各プライマーの反応条件が標準化されているため、いずれの組み合わせのプライマーを用いた場合であっても、同一の反応条件で、それぞれの標的塩基配列を効率よく増幅することができるとされている。
【０００５】
また、特許文献２には、分離データからの解釈がしやすいように設計されたマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットが開示されている。
さらに、特許文献３には、検出対象とする複数の食中毒菌を検出するためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットが開示されている。
また、特許文献４には、長さが３０塩基以上のプライマーを使用し、プライマーのハイブリダイゼーション効率が９０％以上である温度のうち、最も高い温度でアニーリングさせ、３分〜１０分間の長時間アニーリング・伸長反応を行うことにより、マルチプレックスＰＣＲを行う方法が開示されている。
【０００６】
しかしながら、これらの文献には、プライマー設計条件やＰＣＲの条件設定を網羅したような記載がなく、さらに特異性の高いプライマーを得るための手法については未だ十分な検討がなされておらず、高い特異性を有するプライマーセットの開発が求められていた。
ここで、プライマーの設計方法に関連する発明としては、特許文献５〜８に記載のものを挙げることができる。
【０００７】
特許文献５には、複雑な温度制御を必要としない遺伝子増幅法であるＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法に適するプライマーの設計方法が開示されている。
また、特許文献６には、遺伝子を恒温増幅するＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法などに適するプライマーの設計方法が開示されている。
【０００８】
また、特許文献７には、遺伝子発現の定量方法において、増幅したい部分の片側に共通のアダプターが付加されるが、従来の遺伝子発現用プライマー設計方法では、このアダプター部分のプライマー情報を１つ１つ入力しているため時間がかかるという問題を解消すべく、そのプライマー配列を保持して逐次入力の手間を省き、またプライマー候補の絞り込みを自動的に行うプライマーの設計方法が開示されている。
さらに、特許文献８には、互いに異なるＤＮＡに、それぞれ特異的にハイブリダイズする複数のプライマーを効率よく設計するためのプライマーの設計方法が開示されている。
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−５５８１５号公報
【特許文献２】特開２００５−９５０２５号公報
【特許文献３】特開２００７−２７４９３４号公報
【特許文献４】特開２００６−３２０２１７号公報
【特許文献５】特開２００７−１８９９８３号公報
【特許文献６】特開２００５−３０１５３２号公報
【特許文献７】特開２００２−２７９８８号公報
【特許文献８】特開２００１−２５８５６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献５，６に記載のプライマーの設計方法は、上記の通り、ＬＡＭＰ法やＮＡＳＢＡ法等など恒温反応による遺伝子増幅法に関するものであり、また特許文献７に記載のプライマーの設計方法は、遺伝子発現の定量のために常に片側のプライマーを固定する手法に関するものであり、一般的なＰＣＲ法において特異性の高いプライマーを作製する場合に有効なものではなかった。
また、特許文献８には、プライマーを設計するにあたっての塩基長やＧＣ含有量、融解温度（Ｔｍ値）などについての一般的な手法が開示されているが、ＰＣＲ条件などに関する記載は無く、プライマーの特異性を十分に向上するためには、さらに改良する余地があった。
【００１１】
そこで、本発明者らは、複数の検出対象生物が存在する場合に、どのような条件でプライマーを設計すれば、プライマーの競合やダイマーの形成を抑止して、特異的な増幅を行い得るプライマーセットを得ることができるかにつき鋭意研究した結果、その条件を見いだすことに成功し、本発明を完成させた。
本発明によれば、一回の試験で検出対象生物を検出することができるため、検査コストを大幅に削減することができる。また、特異性の高いプライマーの設計が容易にできるため、従来の検証数を削減することができ検証に掛かるコストの削減にもなる。
すなわち、本発明は、複数の検出対象生物を、同時かつそれぞれ特異的に増幅することが可能なプライマーの作製方法、プライマーの使用方法、プライマーセット、ＰＣＲ用反応液、及びプライマーの設計方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のプライマーの作製方法は、上記目的を達成するために、ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列（核酸断片）を増幅できるプライマーセットを、増幅対象生物のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅させるためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないように、作製する方法としてある。
なお、非増幅対象生物（又は増幅対象生物）のＤＮＡの塩基配列とは、非増幅対象生物（又は増幅対象生物）のゲノムＤＮＡの全部又は一部の塩基配列を意味する。
また、本発明のプライマーの作製方法は、プライマーセットを、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満となるように作製することが好ましい。
【００１３】
また、本発明のプライマーの作製方法は、プライマーセットを、フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒであり、かつ融解温度が７０〜７８℃となるように作製することが好ましい。
また、本発明のプライマーの作製方法は、ＰＣＲ法が、複数の生物のＤＮＡの塩基配列を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲ法であり、各増幅対象生物のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅させるためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないように作製することが好ましい。
また、本発明のプライマーの使用方法は、ＰＣＲのアニーリング温度を、上記プライマーの作製方法を用いて得られたプライマーセットにおけるフォワードプライマーとリバースプライマーの中で、融解温度が低いプライマーの融解温度よりも０〜５℃低い温度に設定して、ＰＣＲを行う方法としてある。
【００１４】
また、本発明のプライマーセットは、上記のプライマーの作製方法を用いて得られるものとしてある。
また、本発明のＰＣＲ用反応液は、上記のプライマーの作製方法を用いて得られたプライマーセットを含有するものとしてある。
【００１５】
また、本発明のプライマーの設計方法は、ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーの設計方法であって、ＤＮＡの塩基配列を増幅する対象の一又は二以上の増幅対象生物を選択するステップと、ＤＮＡの塩基配列を増幅しない対象の一又は二以上の非増幅対象生物を選択するステップと、選択された増幅対象生物のＤＮＡからフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択するステップと、フォワードプライマー及びリバースプライマーの候補の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なるか否かを判定するステップと、判定の結果、フォワードプライマー及びリバースプライマーの候補の両方の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は非増幅対象生物のいずれかのＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なる場合、再度選択された増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して１２塩基以上連続で重なるか否かの判定を行うステップと、判定の結果、フォワードプライマー及びリバースプライマーの候補の少なくとも一方の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は非増幅対象生物の全てのＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならない場合、フォワードプライマーとリバースプライマーの候補をＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップを有する方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、マルチプレックスＰＣＲ法においても検出対象生物を適切に増幅し得る、特異性の高いプライマーセットを作製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の第一実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図である。
【図２】本発明の第一実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【図３】本発明の第二実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図である。
【図４】本発明の第二実施形態において作製されたプライマーの配列の例を示す図である。
【図５】本発明の第二実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【図６】本発明の第三実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図である。
【図７】本発明の第三実施形態において作製されたプライマーの配列の例を示す図である。
【図８】本発明の第三実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【図９】本発明の第四実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図である。
【図１０】本発明の第四実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【図１１】本発明の第五実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図である。
【図１２】本発明の第五実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【図１３】本発明の第六実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図である。
【図１４】本発明の第六実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【図１５】本発明の第七実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図である。
【図１６】本発明の第七実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【図１７】本発明における１２塩基以上連続で重ならない条件に関する実施例及び比較例で用いたプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図１８】本発明における１２塩基以上連続で重ならない条件に関する実施例の結果を示す図である。
【図１９】本発明における１２塩基以上連続で重ならない条件に関する比較例の結果を示す図である。
【図２０】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（セレウス検出用プライマー 対象領域：ｃｅｓＢ，ｎｈｅ）に関する実施例及び比較例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図２１】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（カンピロバクター検出用プライマー，大腸菌検出用プライマー）に関する実施例及び比較例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図２２】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（リステリア検出用プライマー，サルモネラ検出用プライマー）に関する実施例及び比較例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図２３】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（黄色ブドウ球菌検出用プライマー，ビブリオ検出用プライマー）に関する実施例及び比較例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図２４】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（セレウス検出用プライマー 対象領域：ｃｅｓＢ，ｎｈｅ）に関する実施例及び比較例の結果を示す図である。
【図２５】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（カンピロバクター検出用プライマー，大腸菌検出用プライマー）に関する実施例及び比較例の結果を示す図である。
【図２６】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（リステリア検出用プライマー，サルモネラ検出用プライマー）に関する実施例及び比較例の結果を示す図である。
【図２７】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（黄色ブドウ球菌検出用プライマー，ビブリオ検出用プライマー）に関する実施例及び比較例の結果を示す図である。
【図２８】本発明におけるプライマーの長さに関する参考例及び実施例及び比較例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図２９】本発明におけるプライマーの長さに関する参考例及び実施例の結果を示す図である。
【図３０】本発明におけるプライマーの長さに関する比較例の結果を示す図である。
【図３１】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（セレウス検出用プライマー 対象領域：ｃｅｓＢ，ｎｈｅ）に関する実施例及び参考例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図３２】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（カンピロバクター検出用プライマー，大腸菌検出用プライマー）に関する実施例及び参考例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図３３】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（リステリア検出用プライマー，サルモネラ検出用プライマー）に関する実施例及び参考例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図３４】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（黄色ブドウ球菌検出用プライマー，ビブリオ検出用プライマー）に関する実施例及び参考例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図３５】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（セレウス検出用プライマー 対象領域：ｃｅｓＢ）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図３６】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（セレウス検出用プライマー 対象領域：ｎｈｅ）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図３７】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（カンピロバクター検出用プライマー）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図３８】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（大腸菌検出用プライマー）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図３９】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（リステリア検出用プライマー）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図４０】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（サルモネラ検出用プライマー）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図４１】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（黄色ブドウ球菌検出用プライマー）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図４２】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（ビブリオ検出用プライマー）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図４３】本発明におけるマルチプレックスＰＣＲにおける単独菌及び複数菌での増幅試験で用いたプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図４４】本発明におけるマルチプレックスＰＣＲにおける単独菌での増幅試験結果を示す図である。
【図４５】本発明におけるマルチプレックスＰＣＲにおける複数菌での増幅試験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明のプライマーの作製方法、プライマーの使用方法、プライマーセット、ＰＣＲ用反応液、及びプライマーの設計方法の実施形態について、詳細に説明する。
【００１９】
まず、本発明のプライマーの作製方法の一実施形態について、詳細に説明する。なお、本発明のプライマーの作製方法は、ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットを、対象生物のＤＮＡにおける対象領域を増幅させるためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならないように、作製するものであれば良く、以下の具体的な内容に限定されるものではない。
【００２０】
［プライマーの作製方法］
（１）プライマーの設計
マルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセットの設計にあたっては、同時に使用する他のプライマーセットと競合しないように設計する必要がある。また特異性が高いプライマーに求められる機能として、増幅対象生物のＤＮＡでは増幅対象領域以外が増幅しないこと、及び非増幅対象生物のＤＮＡが増幅しないことが求められる。
【００２１】
（条件Ａ）
このようなマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットに求められる機能を向上させ得るプライマーの条件として、本発明者らはプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないという条件を見いだした。すなわち、このような条件のプライマーセットによれば、その他の環境や各種条件に問題がなければ、増幅対象遺伝子領域を特異的に増幅させることが可能であることがわかった。
【００２２】
また、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないものとすることがより好ましい。
さらに、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、並びに、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないものとすることがより好ましい。このような条件のプライマーセットによれば、その他の環境や各種条件に問題がなければ、増幅対象遺伝子領域のみを好適に増幅させることが可能である。
なお、当該増幅対象生物とは、プライマーセット候補の選択元の増幅対象生物であり、そのフォワードプライマー及びリバースプライマーにより検出する対象の増幅対象生物を意味する。
【００２３】
ここで、「重ならない」とは、塩基が重複しないことを意味し、同じ塩基の配列ではないことを意味する。また「重なる」とは、塩基が重複することを意味し、同じ塩基の配列であることを意味する。プライマーの塩基配列が比較対象の塩基配列と「１２塩基以上連続で重ならない」とは、プライマーの塩基配列と、比較対象の塩基配列を比較した場合に、プライマーの塩基配列が、１２塩基以上連続してプライマーの塩基配列に存在しないことを意味する。
【００２４】
このようなプライマーセットを設計するにあたっては、増幅対象生物における増幅対象領域を決定し、その領域を増幅させるためのプライマー候補を選択する。そして、選択したプライマー候補の塩基配列が、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、並びに、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないか否かを確認する。このとき、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物を予め選択して、その塩基配列と選択したプライマー候補の塩基配列との比較を行い、１２塩基以上連続で重ならないか否かを判定することができる。
【００２５】
フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方の塩基配列が、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、他の増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列、又は所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重なる場合は、再度プライマー候補を選択し直す。そして、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくともいずれかの塩基配列が、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、並びに、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないプライマーセットが見つかるまで、プライマー候補の選択をし直し、及び１２塩基以上連続で重ならないか否かの判定を繰り返し実行する。
そして、１２塩基以上連続で重ならないプライマー候補が見つかった場合、そのプライマー候補を含むプライマーセットを、実際に作製するプライマーセットとして決定する。
【００２６】
また、このようなプライマーセットが、以下の条件Ｂ〜条件Ｅの条件を満たすか否かを判定し、条件Ａに加えて、さらにこれらの条件のうちの一又は二以上を満たすものをプライマーセットとして用いることも好ましい。プライマーセットが条件Ｂ〜条件Ｅを満たせば、その増幅の特異性を一層向上させることが可能となる。
【００２７】
（条件Ｂ）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、３’末端側半分において、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備える配列を有することが好ましい。なお、Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを意味し、Ａはアデニン、Ｔはチミンを意味する。ＤＮＡ分子は、これらいずれかの塩基を備えたヌクレオチドが鎖状に結合して構成されている。
【００２８】
（条件Ｃ）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、それぞれのプライマーの配列の中心から３’末端側及び５’末端側の両方向に向かってプライマーの全長の四分の１の範囲を含む領域に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備える配列を有することが好ましい。
【００２９】
（条件Ｄ）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度（Ｔｍ値）の差が５℃未満であることが好ましい。
【００３０】
（条件Ｅ）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒであり、かつ融解温度が７０〜７８℃であることが好ましく、融解温度が７３〜７８℃であることがさらに好ましい。
【００３１】
（２）プライマーの作製工程
以上のようにして決定されたプライマーセットの塩基配列にもとづいて、フォワードプライマー及びリバースプライマーを作製する。これらのプライマーの作製は、一般的な方法で行うことができ、ＤＮＡ合成装置を使用して、人工的に作製することができる。
【００３２】
［プライマーの使用方法］
次に、本発明のプライマーの使用方法の一実施形態について、詳細に説明する。
上述した本実施形態のプライマーの作製方法によって作製されたプライマーセット、及び後述するプライマーの設計方法にもとづき作製されたプライマーセットは、ＰＣＲに用いることができ、特にマルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセットとして好適に使用することが可能である。
【００３３】
まず、本実施形態のプライマーの作製方法又はプライマーの設計方法にもとづいて、増幅対象生物のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅するためのＰＣＲ用プライマーセットを作製する。
作製されたプライマーセットは、少なくとも条件Ａを満たすもの、すなわち、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないものである。また、条件Ｂ〜Ｅの少なくともいずれかをさらに満たすものであることがより好ましい。
【００３４】
次いで、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製する。
ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下のような組成のものを用いることができる。
・緩衝液
・核酸合成基質（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）
・フォワードプライマー
・リバースプライマー
・核酸合成酵素
・増幅対象生物のＤＮＡ
・水
【００３５】
ここで、複数菌種を一括検出の場合する場合には、ＰＣＲ用反応液におけるプライマー濃度を菌種毎に適した値にすることが好ましい。
すなわち、検出対象菌種毎にプライマー量を調整して、ＰＣＲ用反応液を作成することが好ましい。
例えば、セレウス、カンピロバクター、大腸菌、リステリア、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、及びビブリオを同時に検出する場合は、ビブリオ以外の菌種のフォワードプライマー及びリバースプライマーの濃度を同一にすると共に、ビブリオ検出用のフォワードプライマー及びリバースプライマーの濃度を、その他の各菌種の２倍にすることが好ましい。
【００３６】
ＰＣＲ法による遺伝子の増幅は、サーマルサイクラーなどのＰＣＲ装置を用いて行うことができる。
また、ＰＣＲの反応条件は、例えば次の条件で行うことができる。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
【００３７】
このとき、アニーリング温度（アニーリング工程における温度）設定は、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度のうち、低い方の温度からさらに０〜５℃低い温度とすることが好ましい。
また、増幅対象生物が複数の場合や、増幅対象領域が複数存在する場合は、複数のプライマーセットにおける全てのプライマーの融解温度のうち、最も低い温度からさらに０〜５℃低い温度とすることが好ましい。
【００３８】
具体的には、アニーリング温度を６５〜７３℃とすることが好ましく、６８〜７３℃とすることがより好ましく、６８℃とすることが最も好ましい。なお、これらに対応して、プライマーの融解温度の最小が、７０〜７８℃となるようにプライマーを設計することが好ましく、７３〜７８℃となるようにすることがより好ましい。特に、プライマーの融解温度の最小は、７３℃となるようにすることが最も好ましい。
このように、上記のアニーリング条件を適用することにより、増幅効率の不安定や増幅の干渉を防止することが可能となる。
【００３９】
ここで、ＰＣＲのアニーリング工程において、鋳型ＤＮＡとプライマーが結合するためには耐熱性菌由来のＤＮＡポリメラーゼの働きが必要である。すなわち、このＤＮＡポリメラーゼは、７０〜８０℃周辺の温度で高い活性を示す。一方、アニーリング温度が高すぎると塩基同士の結合において、熱エネルギーが過大となって結合が阻害され、増幅産物量が減少する。
また、増幅産物を電気泳動ではなく、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイで検出する際に、核酸合成物質へ蛍光色素を付与した場合、アニーリング温度が７０℃以上になると蛍光が増幅産物に取り込まれないことがある一方、アニーリング温度が６８℃では高い蛍光強度が得られる。
【００４０】
以上のことから、上述したように、アニーリング温度を６５〜７３℃とすることが好ましく、６８〜７３℃とすることがより好ましく、６８℃とすることが最も好ましい。また、以下の実施例において示されるように、プライマーの融解温度の最小は、アニーリング温度に０〜５℃を加えた温度が適している。このため、プライマーの融解温度のうち最小は、７３〜７８℃に設定することが好ましい。
【００４１】
次に、ＰＣＲ法による産物を、マイクロキャピラリーなどの電気泳動により増幅対象領域ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認する。また、電気泳動に代えて、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイなどを用いて、正しい増幅産物が得られているか否かを確認することも好ましい。これらは通常の方法により行うことが可能である。
【００４２】
［プライマーの設計方法］
次に、本発明のプライマーの設計方法の実施形態について、詳細に説明する。
【００４３】
［プライマーの設計方法の第一実施形態］
まず、図１及び図２を参照して、本発明のプライマーの設計方法の第一実施形態について説明する。図１は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図２は、本実施形態におけるプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【００４４】
ＰＣＲを行うにあたっては、上述したように、増幅対象生物を特異的に増幅することが可能なプライマーを設計することが重要であり、特に複数の微生物を同時に特異的に増幅するマルチプレックスＰＣＲを行う場合には、プライマーの競合やダイマーの形成がなく、増幅の干渉が少ないプライマーを設計することが必要である。
特に、マルチプレックスＰＣＲを用いての同時増幅および検出の場合においては、同じような機能を持つ遺伝子では塩基配列が類似していることが多い。このため、複数の微生物をそれぞれ増幅するためのプライマーを作製して、これらの微生物を同時に増幅する場合、増幅が干渉し合うことで、検出感度の低下につながることが多い。
【００４５】
本実施形態は、このようなプライマーの設計条件として、各増幅対象生物の遺伝子における増幅対象領域を増幅させるためフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないように作製するものである（条件Ａ−１）。また、このとき、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列を、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないものとすることがより好ましく（条件Ａ−２）、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、並びに、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないものとすることがさらに好ましい（条件Ａ−３）。本実施形態では、条件Ａとして、Ａ−１〜３のいずれかを用いることができる。
このような条件でプライマーを設計すれば、後述する実施例に示すように増幅反応が干渉しにくいプライマーを作製することができる。
【００４６】
本実施形態のプライマーの設計方法は、図１に示すプライマー設計装置１０により行うことができる。
プライマー設計装置１０としては、パーソナルコンピュータやサーバ、タブレット型コンピュータ、携帯端末などの情報処理装置を用いることができる。このプライマー設計装置１０は、図１に示すように、塩基配列記憶手段１１、増幅対象生物選択手段１２、非増幅対象生物選択手段１３、プライマー候補選択手段１４、十二塩基連続重複判定手段１５、及びプライマーセット記憶手段１６を備えている。
【００４７】
なお、プライマー設計装置１０におけるこれらの構成は、利用者が使用する情報処理装置内に備えられる必要はなく、これらの全部又は一部を他の情報処理装置に備え、ネットワークを通じて接続することによって構成することもできる。また、プライマー設計装置１０は、独立した情報処理装置により構成することができるほか、ＡＳＰ（Application Service Provider）や、ＳａａＳ（software as a service）などや、二以上の情報処理装置によって構成することができ、クライアント端末からアクセス可能なものにすることもできる。これは以下の実施形態における各種プライマー設計装置についても同様である。
【００４８】
塩基配列記憶手段１１は、増幅対象生物及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列を記憶するデータベースなどの記憶装置である。この塩基配列記憶手段１１は、増幅対象生物及び非増幅対象生物の識別情報ごとにＤＮＡの塩基配列、各生物名称や分類等の各種属性情報を記憶する。これらの増幅対象生物及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列としては、それぞれの生物における全塩基配列（全ゲノムＤＮＡ配列）とすることが好ましい。なお、全塩基配列ではなく、一部の領域を欠くものや一部の塩基配列のみを用いても良い。
【００４９】
増幅対象生物選択手段１２は、塩基配列記憶手段１１から増幅対象生物を選択して記憶する。このとき、増幅対象生物選択手段１２は、例えば塩基配列記憶手段１１から記憶されている生物名称を一覧表示し、選択された一又は二以上の生物の名称とその識別情報を、増幅対象生物として記憶することができる。
【００５０】
非増幅対象生物選択手段１３は、塩基配列記憶手段１１から非増幅対象生物を選択して記憶する。このとき、非増幅対象生物選択手段１３は、例えば塩基配列記憶手段１１から記憶されている生物名称を一覧表示し、選択された一又は二以上の生物の名称とその識別情報を、非増幅対象生物として記憶することができる。
なお、先に増幅対象領域を決定した後に、相同性検索を行って、増幅対象生物における当該領域と類似する配列を備えた非増幅対象生物を選択することも好ましい。
【００５１】
プライマー候補選択手段１４は、増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列からプライマーセットの候補となる塩基配列を選択し、これを当該増幅対象生物の識別情報に対応付けて一時的に記憶する。なお、このときプライマー候補選択手段１４に、増幅対象領域の両端付近の領域から２３ｍｅｒ〜４１ｍｅｒ程度の長さのフォワードプライマー及びリバースプライマーを選択させることが好ましい。
【００５２】
十二塩基連続重複判定手段１５は、プライマー候補選択手段１４により選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重複するか否かを判定する。
また、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列が、他の増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列又は所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重複するか否かを判定することがより好ましく、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、当該増幅対象生物以外の他の増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列、又は所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重複するか否かを判定することがさらに好ましい。
【００５３】
このとき、十二塩基連続重複判定手段１５は、非増幅対象生物選択手段１３により選択された一又は二以上の非増幅対象生物について、塩基配列記憶手段１１における非増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列に、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列と１２塩基以上連続で重複する領域が存在するか否かを判定する。
【００５４】
また、増幅対象生物選択手段１２により選択された増幅対象生物について、プライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物以外の一又は二以上の他の増幅対象生物が存在する場合、十二塩基連続重複判定手段１５は、塩基配列記憶手段１１におけるこれら他の増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列に、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列と１２塩基以上連続で重複する領域が存在するか否かを判定する。
【００５５】
さらに、プライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物について、十二塩基連続重複判定手段１５は、塩基配列記憶手段１１における当該増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列の非増幅対象領域に、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列と１２塩基以上連続で重複する領域が存在するか否かを判定する。
【００５６】
十二塩基連続重複判定手段１５による判定の結果、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列について、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、１２塩基以上連続で重複しない場合、当該プライマーセットを、作製に用いるプライマーセットとして決定することができる。また、このとき、上記その他の増幅対象生物及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列について、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、１２塩基以上連続で重複しない場合、当該プライマーセットを、作製に用いるプライマーセットとして決定することが好ましい。さらに、このとき、当該増幅対象生物とその他の増幅対象生物及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列について、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、１２塩基以上連続で重複しない場合、当該プライマーセットを、作製に用いるプライマーセットとして決定することがより好ましい。
【００５７】
十二塩基連続重複判定手段１５による判定の結果、それぞれ上記以外の場合、例えば、当該増幅対象生物とその他の増幅対象生物及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列の少なくともいずれかについて、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の両方が、１２塩基以上連続で重複する場合、プライマー候補選択手段１４は、増幅対象である当該増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列から再度プライマーセットの候補となる塩基配列を選択し直して、これを当該増幅対象生物の識別情報に対応付けて一時的に記憶する。そして、再度、十二塩基連続重複判定手段１５による上記判定が行われる。
【００５８】
プライマーセット記憶手段１６は、十二塩基連続重複判定手段１５により、作製に用いるプライマーセットとして決定されたプライマーセットの塩基配列を、増幅対象生物の識別情報に対応付けて記憶する。
【００５９】
次に、図２を参照して、本実施形態のプライマーの設計方法における各工程について説明する。なお、プライマー設計装置１０における各手段の処理の順序は、適宜変更しても良い。これは以下の実施形態における各種プライマー設計装置についても同様である。
まず、プライマー設計装置１０における増幅対象生物選択手段１２は、塩基配列記憶手段１１から、記憶されている生物名称を一覧表示し、選択された一又は二以上の生物の名称とその識別情報を、増幅対象生物として記憶する（ステップ１０）。また、プライマー設計装置１０における非増幅対象生物選択手段１３は、塩基配列記憶手段１１から、記憶されている生物名称を一覧表示し、選択された一又は二以上の生物の名称とその識別情報を、非増幅対象生物として記憶する（ステップ１１）。
【００６０】
次に、プライマー設計装置１０におけるプライマー候補選択手段１４により、増幅対象生物選択手段１２により選択された増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列を塩基配列記憶手段１１から検索して取得する。そして、取得された塩基配列からプライマーセットの候補となるフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列を選択し、これを当該増幅対象生物の識別情報に対応付けて一時的に記憶する（ステップ１２）。なお、増幅対象生物選択手段１２により複数の増幅対象生物及び対象領域が選択されている場合は、各増幅対象生物毎及び対象領域毎にプライマーセットの候補を選択して記憶することができる。
【００６１】
次に、プライマー設計装置１０における十二塩基連続重複判定手段１５により、上記プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、非増幅対象生物選択手段１３により選択された非増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列と１２塩基以上連続して重複するか否かを判定する（ステップ１３）。このとき、プライマー設計装置１０における十二塩基連続重複判定手段１５により、上記プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、このプライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列の非増幅対象領域、他の増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列、又は非増幅対象生物選択手段１３により選択された非増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列と１２塩基以上連続して重複するか否かを判定することも好ましい。
【００６２】
そして、プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の両方が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列のいずれかと１２塩基以上連続して重複した場合（ステップ１４のＹＥＳ）、再度ステップ１２のプライマーセットの候補の選択から繰り返す。このとき、プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の両方が、このプライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列の非増幅対象領域、他の増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列、又は非増幅対象生物選択手段１３により選択された非増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列のいずれかと１２塩基以上連続して重複した場合に、再度ステップ１２のプライマーセットの候補の選択から繰り返すようにすることも好ましい。
【００６３】
プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続して重複しない場合（ステップ１４のＮＯ）、十二塩基連続重複判定手段１５は、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定する（ステップ１５）。このとき、プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、このプライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列の非増幅対象領域、他の増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列、及び非増幅対象生物選択手段１３により選択された非増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列と、１２塩基以上連続して重複しない場合（ステップ１４のＮＯ）、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定することも好ましい。
十二塩基連続重複判定手段１５は、以上の工程を、ステップ１０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
【００６４】
このような本実施形態のプライマーの設計方法によれば、非特異的な増幅を行い難いプライマーセットを設計することができる。このため、このような設計方法により作製されたプライマーセットは、マルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセットに用いた場合にも、ＰＣＲにおける非特異的な増幅を抑制でき、好適に使用することが可能である。
【００６５】
［プライマーの設計方法の第二実施形態］
次に、図３〜図５を参照して、本発明のプライマーの設計方法の第二実施形態について説明する。図３は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図４は、本実施形態において作製されたプライマーの配列の例を示す図であり、図５は、本実施形態におけるプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【００６６】
微生物のＤＮＡの塩基配列において、ＧＣ配列は、ＧＣ含有量が少ない菌類で約２５％、多い菌類で約８０％程度（配列数の百分率。以下ＧＣ又はＡＴ含有量について同様。）含まれており、その範囲は非常に幅広くなっている。また、ＧＣリッチな部分やＡＴリッチな部分などがあるため、プライマーの設計において、ＧＣ含有量に適したプライマー配列の設計思想が求められる。
本実施形態は、主に塩基配列のＧＣ含有量が多い生物を増幅対象生物とする場合に、好適に用いられるものである。ここで、「ＧＣ含有量が多い」とは、塩基配列におけるＧ又はＣ塩基の含有量が５０％以上である場合を意味する。
【００６７】
本実施形態におけるプライマー設計装置２０は、図３に示すように、塩基配列記憶手段２１、増幅対象生物選択手段２２、非増幅対象生物選択手段２３、プライマー候補選択手段２４、ＧＣ配列判定手段２５、及びプライマーセット記憶手段２６を備えている。
本実施形態では、ＧＣ配列判定手段２５により、候補のプライマーの塩基配列におけるＧ又はＣの連続配列にもとづいて、これをＰＣＲ用のプライマーセットとして用いるか否かを決定する点で第一実施形態と異なっている。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができ、本実施形態におけるその他の各手段は、第一実施形態における同名の各手段とそれぞれ同様の処理を行うものとすることができる。また、図５に示す本実施形態のプライマーの設計方法の各工程は、図２の条件Ａ（ステップ１３，１４）を、条件Ｂ（ステップ２３，２４）に変更した点以外は同様である。
【００６８】
ＧＣ配列判定手段２５は、プライマー候補選択手段２４により選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー配列及びリバースプライマー配列が、３’末端側半分において、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備える配列を有するか否かを判定する（ステップ２３）。
ＧＣ配列判定手段２５による判定の結果、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくとも一方が、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えている場合（ステップ２４のＹＥＳ）、ＧＣ配列判定手段２５は、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定する（ステップ２５）。そして、プライマーセット記憶手段２６は、この決定されたプライマーセットを記憶する。
【００６９】
ＧＣ配列判定手段２５による判定の結果、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の両方が、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えていない場合（ステップ２４のＮＯ）、再度ステップ２２からの処理を繰り返す。すなわち、プライマー候補選択手段２４により増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して、ＧＣ配列判定手段２５により、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えているプライマーを含むプライマーセットが見つかるまで、条件Ｂの処理を繰り返す。
ＧＣ配列判定手段２５による判定は、ステップ２０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
【００７０】
このようにしてＰＣＲに用いるものとして決定されたプライマーセットにおける、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えているプライマーの塩基配列の例を図４に示す。
同図において、リステリアのｄｎａＪ領域から選択されたリバースプライマー（配列番号１：GAGAATCCTCCACCGCTAAATCCGCC）は、３’末端側において、Ｇ又はＣを連続で５塩基備えている。
また、黄色ブドウ球菌のｄｎａＪ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号２：CACGCCTGGAGAGCCTTCACCAGC）は、３’末端側（中央を含む）において、Ｇ又はＣを連続で３塩基備えている。
【００７１】
また、サルモネラのｉｎｖＡ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号３：GAACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGC）は、３’末端側において、Ｇ又はＣを連続で４塩基備えている。
さらに、大腸菌のｐｙｒＨ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号４：CGCTCGTCTGATGTCCGCTATTCCATTGAAT）は、３’末端側（中央を含む）において、Ｇ又はＣを連続で３塩基備えている。
また、カンピロバクターの１６ＳｒＤＮＡ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号５：GAAATCTAATGGCTTAACCATTAAACTGCTTGGG）は、３’末端側において、Ｇ又はＣを連続で３塩基備えている。
【００７２】
このようにして得られたプライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、増幅の特異性を、一層向上させることが経験上明らかとなっている。
【００７３】
［プライマーの設計方法の第三実施形態］
次に、図６〜図８を参照して、本発明の第三実施形態について説明する。図６は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図７は、本実施形態において作製されたプライマーの配列の例を示す図であり、図８は、本実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
本実施形態は、主に塩基配列のＧＣ含有量が少ない生物を増幅対象生物とする場合に、好適に用いられるものである。ここで、「ＧＣ含有量が少ない」とは、塩基配列におけるＧ又はＣ塩基の含有量が５０％未満である場合を意味する。
【００７４】
本実施形態におけるプライマー設計装置３０は、図６に示すように、塩基配列記憶手段３１、増幅対象生物選択手段３２、非増幅対象生物選択手段３３、プライマー候補選択手段３４、ＡＴ配列判定手段３５、及びプライマーセット記憶手段３６を備えている。
本実施形態では、ＡＴ配列判定手段３５により、候補のプライマーの塩基配列におけるＡ又はＴの連続配列にもとづいて、これをＰＣＲ用のプライマーセットとして用いるか否かを決定する点で第一実施形態と異なっている。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができ、本実施形態におけるその他の各手段は、第一実施形態における同名の各手段とそれぞれ同様の処理を行うものとすることができる。また、図８に示す本実施形態のプライマーの設計方法の各工程は、図２の条件Ａ（ステップ１３，１４）を、条件Ｃ（ステップ３３，３４）に変更した点以外は、図２におけるものと同様である。
【００７５】
ＡＴ配列判定手段３５は、プライマー候補選択手段３４により選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列が、それぞれのプライマーの塩基配列の中心から３’末端側及び５’末端側の両方向に向かってそれぞれのプライマーの全長の四分の１の範囲を含む領域（以下、この領域を中央領域と称する。）に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備える配列を有するか否かを判定する（ステップ３３）。
ＡＴ配列判定手段３５による判定の結果、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくとも一方が、中央領域に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えている場合（ステップ３４のＹＥＳ）、ＡＴ配列判定手段３５は、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定する（ステップ３５）。そして、プライマーセット記憶手段３６は、この決定されたプライマーセットを記憶する。
【００７６】
ＡＴ配列判定手段３５による判定の結果、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の両方が、中央領域に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えていない場合（ステップ３４のＮＯ）、再度ステップ３２からの処理を繰り返す。すなわち、プライマー候補選択手段３４により増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して、ＡＴ配列判定手段３５により、中央領域にＡ又はＴを連続で４塩基以上備えているプライマー配列を含むプライマーセットが見つかるまで、条件Ｃの処理を繰り返す。
【００７７】
ＡＴ配列判定手段３５による判定は、ステップ３０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
このようにしてＰＣＲに用いるものとして決定されたプライマーセットにおける、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えているプライマー配列の例を図７に示す。
【００７８】
同図において、ビブリオのｔｄｈ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号６：TCAGTTTACTTTTTTGGGTTTTTTGGCTTTCATGAAACCTG）は、中央領域に、Ａ又はＴを連続で６塩基備えている。
また、セレウスのｎｈｅ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号７：CATCTGTTGATGCGGCTTTAAAAGGGAAGT）は、中央領域に、Ａ又はＴを連続で７塩基備えている。
さらに、セレウスのｃｅｓＢ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号８：CACCTGCCGGAGGAGCAAAAATGATACAAC）は、中央領域に、Ａ又はＴを連続で６塩基備えている。
【００７９】
このようにして得られたプライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、増幅の特異性を、一層向上させることが経験上明らかとなっている。
【００８０】
［プライマーの設計方法の第四実施形態］
次に、図９及び図１０を参照して、本発明の第四実施形態について説明する。図９は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図１０は、本実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【００８１】
本実施形態におけるプライマー設計装置４０は、図９に示すように、塩基配列記憶手段４１、増幅対象生物選択手段４２、非増幅対象生物選択手段４３、プライマー候補選択手段４４、融解温度判定手段４５、及びプライマーセット記憶手段４６を備えている。
本実施形態におけるプライマー設計装置４０は、プライマー候補選択手段４４が増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列から所定の長さのフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択するとともに、融解温度判定手段４５により、フォワードプライマーとリバースプライマーの融解温度が所定の範囲内である場合に、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして用いることを決定する点で第一実施形態と異なっている。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができ、本実施形態におけるその他の各手段は、第一実施形態における同名の各手段とそれぞれ同様の処理を行うものとすることができる。また、図１０に示す本実施形態のプライマーの設計方法の各工程は、ステップ４２の内容、及び図２の条件Ａ（ステップ１３，１４）を条件Ｄ（ステップ４３〜４５）に変更した点以外は、図２におけるものと同様である。
【００８２】
プライマー候補選択手段４４は、増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列からプライマーセットの候補となる塩基配列を選択し、これを当該増幅対象生物の識別情報に対応付けて一時的に記憶する。本実施形態におけるこのプライマー候補選択手段４４は、増幅対象領域の両端付近の領域から２３ｍｅｒ〜４１ｍｅｒ程度の長さのフォワードプライマー及びリバースプライマーを選択する。
【００８３】
融解温度判定手段４５は、プライマー候補選択手段４４により選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度（Ｔｍ値）を算出し、その融解温度が７０〜７８℃であるか否かを判定することができる（ステップ４３、４４）。この判定において、融解温度が７３〜７８℃であるか否かを判定するようにすることがより好ましい。以下においても同様である。ＰＣＲにおけるアニーリング温度との関係で、プライマーの融解温度をこのような範囲にすれば、より特異性の高い増幅を実現することができる。
【００８４】
なお、融解温度判定手段４５によるフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の算出方法としては、例えばＷａｌｌａｃｅ法、ＧＣ％法、最近接塩基対法等を用いることができる。このうち、最近接塩基対法はプライマーの塩基組成、反応溶液の塩濃度、プライマーの長さや使用濃度、塩基の組成の他、塩濃度以外に隣接塩基間の熱力学エネルギー安定性を考慮するものであり、特に好ましい。以下の実施例では、この最近接塩基対法を用いて融解温度を算出している。
【００８５】
融解温度判定手段４５による判定の結果、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方の融解温度が７０〜７８℃である場合（ステップ４５のＹＥＳ）、融解温度判定手段４５は、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定する（ステップ４６）。そして、プライマーセット記憶手段４６は、この決定されたプライマーセットを記憶する。
【００８６】
融解温度判定手段４５による判定の結果、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくともいずれか一方の融解温度が７０〜７８℃でない場合（ステップ４５のＮＯ）、再度ステップ４２からの処理を繰り返す。すなわち、プライマー候補選択手段４４は、増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して、融解温度判定手段４５によりフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度を算出し、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方の融解温度が７０〜７８℃であるプライマーセットが見つかるまで、条件Ｄの処理を繰り返すことができる。
【００８７】
融解温度判定手段４５による判定は、ステップ４０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
本実施形態のプライマーの設計方法によれば、作製されるプライマーセットによる増幅の特異性を、一層向上させることが可能となる。
【００８８】
［プライマーの設計方法の第五実施形態］
次に、図１１及び図１２を参照して、本発明の第五実施形態について説明する。図１１は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図１２は、本実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【００８９】
上述したように、微生物のＤＮＡの塩基配列は、例えばＧＣ含有量が少ない菌類で２５％、多い菌類で８０％程度と非常に幅広い。このＧＣ含有量は、プライマーの融解温度に影響を与えるため、プライマーの設計にあたっては、フォワードプライマーとリバースプライマーの融解温度をできるだけ揃えることが好ましい。
さらに、マルチプレックスＰＣＲにおいては、複数の増幅対象生物間で、プライマーの融解温度を揃えることができればより好ましい。
そこで、本実施形態では、プライマーの融解温度に着目して、以下に説明する条件Ｅを行うものとしている。
【００９０】
本実施形態におけるプライマー設計装置５０は、図１１に示すように、塩基配列記憶手段５１、増幅対象生物選択手段５２、非増幅対象生物選択手段５３、プライマー候補選択手段５４、融解温度算出手段５５、温度差判定手段５６、及びプライマーセット記憶手段５７を備えている。
本実施形態におけるプライマー設計装置５０は、融解温度算出手段５５と温度差判定手段５６により、フォワードプライマーとリバースプライマーの融解温度差が所定の範囲内である場合に、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして用いることを決定する点で第一実施形態と異なっている。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができ、本実施形態におけるその他の各手段は、第一実施形態における同名の各手段とそれぞれ同様の処理を行うものとすることができる。また、図１２に示す本実施形態のプライマーの設計方法の各工程は、図２の条件Ａ（ステップ１３，１４）を、条件Ｅ（ステップ５３〜５５）に変更した点以外は、図２におけるものと同様である。
【００９１】
融解温度算出手段５５は、プライマー候補選択手段５４により選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度を算出する。
また、温度差判定手段５６は、算出された融解温度の差（融解温度の差の絶対値。以下同様。）が、５℃未満であるか否かを判定する（ステップ５３，５４）。融解温度の差が、このような範囲であれば、特異性の高い増幅が行えるためである。
【００９２】
温度差判定手段５６による判定の結果、算出された融解温度の差が、５℃未満である場合（ステップ５５のＹＥＳ）、温度差判定手段５６は、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定する（ステップ５６）。そして、プライマーセット記憶手段５７は、この決定されたプライマーセットを記憶する。
【００９３】
温度差判定手段５６による判定の結果、算出された融解温度の差が、５℃未満でない場合（ステップ５５のＮＯ）、再度ステップ５２からの処理を繰り返す。すなわち、プライマー候補選択手段５４は、増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して、融解温度算出手段５５によりフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度を算出し、温度差判定手段５６により融解温度の差が５℃未満のフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマーセットが見つかるまで、条件Ｅの処理を繰り返すことができる。
【００９４】
融解温度算出手段５５と温度差判定手段５６による判定は、ステップ５０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
本実施形態のプライマーの設計方法によれば、作製されるプライマーセットによる増幅の特異性を、一層向上させることが可能となる。
【００９５】
［プライマーの設計方法の第六実施形態］
次に、図１３及び図１４を参照して、本発明の第六実施形態について説明する。図１３は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図１４は、本実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【００９６】
本実施形態におけるプライマー設計装置６０は、図１３に示すように、塩基配列記憶手段６１、増幅対象生物選択手段６２、非増幅対象生物選択手段６３、プライマー候補選択手段６４、融解温度算出手段６５、温度差判定手段６６、十二塩基連続重複判定手段６７、及びプライマーセット記憶手段６８を備えている。
本実施形態におけるプライマー設計装置６０は、上記条件の一部、すなわち第一実施形態における条件Ａと、第五実施形態における条件Ｅを組み合わせた構成を備えており、これによって、ＰＣＲに用いるプライマーセットを決定するものである。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができ、本実施形態におけるその他の各手段は、第一実施形態における同名の各手段とそれぞれ同様の処理を行うことができる。
【００９７】
本実施形態のプライマーの設計方法は、条件Ｅを行うまでの動作（ステップ６０〜６５）については、第五実施形態における図１２の動作（ステップ５０〜５５）と同様のものとすることができる。
温度差判定手段６６による判定の結果、算出された融解温度の差が、５℃未満である場合（ステップ６５のＹＥＳ）、次に、条件Ａを第一実施形態と同様に行って（ステップ６６、６７）、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重複しない場合（ステップ６７のＮＯ）、当該プライマーセットを、作製に用いるプライマーセットとして決定する（ステップ６８）。このとき、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、このプライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列の非増幅対象領域、他の増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列、及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続して重複しない場合、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定することも好ましい。
【００９８】
また、十二塩基連続重複判定手段６７による判定の結果、上記以外の場合、すなわち、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列の少なくともいずれかについて、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の両方が、１２塩基以上連続で重複する場合（ステップ６７のＹＥＳ）、プライマー候補選択手段６４により増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列から再度プライマーセットの候補となる塩基配列を選択し、ステップ６２からの動作を繰り返す。このとき、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の両方が、このプライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列の非増幅対象領域、他の増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列、又は非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列の少なくともいずれかと、１２塩基以上連続して重複する場合、再度プライマーセットの候補となる塩基配列を選択し直して、ステップ６２からの動作を繰り返すことも好ましい。
【００９９】
また、温度差判定手段６６による判定の結果、算出された融解温度の差が、５℃未満でない場合（ステップ６５のＮＯ）にも、再度ステップ６２からの処理を繰り返す。
これらの判定についても、ステップ６０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
本実施形態のプライマーの設計方法によれば、作製されるプライマーセットによる増幅の特異性を、より一層向上させることが可能となる。
【０１００】
［プライマーの設計方法の第七実施形態］
次に、図１５及び図１６を参照して、本発明の第七実施形態について説明する。図１５は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図１６は、本実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【０１０１】
本実施形態におけるプライマー設計装置７０は、図１５に示すように、塩基配列記憶手段７１、増幅対象生物選択手段７２、非増幅対象生物選択手段７３、プライマー候補選択手段７４、ＧＣ含量判定手段７５、ＧＣ配列判定手段７６、ＡＴ配列判定手段７７、融解温度判定手段７８、融解温度算出手段７９、温度差判定手段７ａ、十二塩基連続重複判定手段７ｂ、及びプライマーセット記憶手段７ｃを備えている。
本実施形態におけるプライマー設計装置７０は、このように第一実施形態〜第五実施形態における判定手段を全て備えるとともに、さらにＧＣ含量判定手段７５を備え、これらによってＰＣＲに用いるプライマーセットを決定するものである。具体的には、以下の通りであるが、その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができる。
【０１０２】
なお、本実施形態では、条件Ａ〜Ｅのすべてを満たすプライマーセットを設計する例を示しているが、その一部の条件のみを満たすプライマーセットを設計することもできる。また、図１６における各条件の判定を行う順序は、入れ替えても良い。さらに、複数の条件において同じデータを用いる場合には、後の算出処理を省略しても良い。例えば、条件Ｅの処理において、融解温度算出手段７９による融解温度の算出処理を省略し、条件Ｄの処理で融解温度判定手段７８により算出された融解温度を用い、温度差判定手段７ａによる融解温度差を算出することが可能である。
【０１０３】
ＧＣ含量判定手段７５は、入力したフォワードプライマー及びリバースプライマーの候補のＧＣ含量を算出し、含有量が５０％であるか否かを判定する。ＧＣ含量は、これらのプライマーの全塩基配列数に対するＧ及びＣの塩基配列数の割合にもとづき算出することができる。
本実施形態では、プライマー候補選択手段７４により、増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列から長さが２３〜４１ｍｅｒのフォワードプライマー及びリバースプライマーが選択されて、これらがＧＣ含量判定手段７５に入力される。なお、条件Ｄの判定を省略する場合は、プライマー候補選択手段７４により、長さが２３〜４１ｍｅｒの制限なくプライマーセットの候補が選択され、ＧＣ含量判定手段７５による上記ＧＣ含量の判定を行うことができる。
【０１０４】
本実施形態のプライマーの設計方法は、ＧＣ含量判定手段７５による判定が行われる前までの動作（ステップ７０〜７２）については、第四実施形態における図１０の動作（ステップ４０〜４２）と同様のものとすることができる。
次に、ＧＣ含量判定手段７５により、フォワードプライマー及びリバースプライマーの候補のＧＣ含量を算出し、含有量が５０％であるか否かを判定する（ステップ７３）。
【０１０５】
そして、ＧＣ含量が５０％以上の場合、条件ＢのＧＣ配列判定処理を実行し（ステップ７４）、ＧＣ含量が５０％未満の場合、条件ＣのＡＴ配列判定処理を実行し（ステップ７５）、次いで条件Ｄにおける融解温度判定処理を実行する（ステップ７６）。ここで、ステップ７４は、第二実施形態における図５の動作（ステップ２３〜２４）と同様のものとすることができ、ステップ７５は、第三実施形態における図８の動作（ステップ３３〜３４）と同様のものとすることができ、ステップ７６は、第四実施形態における図１０の動作（ステップ４３〜４５）と同様のものとすることができる。
【０１０６】
続いて、条件Ｅの融解温度差判定処理を実行し（ステップ７７）、さらに条件Ａの１２塩基連続重複判定処理を実行して（ステップ７８）、全ての条件を満たすものを、プライマーセットとして決定することができる（ステップ７９）。ここで、ステップ７７は、第五実施形態における図１２の動作（ステップ５３〜５５）と同様のものとすることができ、ステップ７５は、第一実施形態における図２の動作（ステップ１３〜１４）と同様のものとすることができる。
【０１０７】
本実施形態のプライマーの設計方法によれば、作製されるプライマーセットによる増幅の特異性を、極めて高い精度にまで向上させることが可能となっている。
【０１０８】
以上の通り、本発明のプライマーの作製方法、プライマーの使用方法、プライマーセット、ＰＣＲ用反応液、及びプライマーの設計方法によれば、作業者の経験や技能に関係なく簡単に、特異性の高いプライマーを作成することができるため、一回の試験で複数菌を検出することが可能となる。このため、検査コストを大幅に削減することが可能となる。
また、このように特異性の高いプライマーを設計できるため、特異性の検証に必要なプライマー量を削減することが可能となる。
さらに、本発明はＤＮＡを有する各種生物体の検出にも応用でき、産業の発展に寄与する有用性の高いものであると言える。
【実施例】
【０１０９】
＜実験１：「１２塩基以上連続で重ならない」に関して＞
本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづいて、「プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならない（条件Ａ）」を満たすプライマーセットを１５５個作製し、これらをそれぞれ用いてＰＣＲ法を行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した。その結果、全てのプライマーセットについて、特異的な増幅が行われ、非増幅対象領域が増幅されなかった。このうち３例について、以下の実施例１〜３に示す。
【０１１０】
また、条件Ａを満たさず、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方が非増幅対象領域と１２塩基以上重複するプライマーセットを５６個作製して、増幅対象領域がＰＣＲ法により特異的に増幅されるか否かを確認した。その結果、全てのプライマーセットについて、非特異的な増幅が行われ、非増幅対象領域が増幅されていた。このうち２例について、以下の比較例１，２に示す。
【０１１１】
（実施例１）
まず、増幅対象生物として食中毒菌である以下のビブリオ（RIMD2210050）を選択するとともに、非増幅対象生物として以下の６種類の食中毒菌を選択した。なお、Negative Cont.は対照である。
１．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
【０１１２】
これらの食中毒菌の菌株は、次の機関から分譲されたものである（以下においても同様）。
・NBRC 独立行政法人製品評価基盤機構
・TIFT 公益財団法人東洋食品研究所
・ATCC American type culture collection
・RIMD 大阪大学微生物病研究所
【０１１３】
次いで、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社製）を用いてこれらの生物の塩基配列を比較した。そして、ビブリオの塩基配列から条件Ａを満たし、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図１７の実施例１に示すビブリオ検出用の両方のプライマー（配列番号９，１０）が、上記６種類の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならないもの（条件Ａ）である。
【０１１４】
なお、図１７において、配列番号は、配列表に示される塩基配列の配列番号を示している。Ｆ／Ｒは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの区別を示しており、Ｆがフォワードプライマー、Ｒがリバースプライマーを示している。食中毒菌は、本実施形態のプライマーセットにより増幅する対象の食中毒菌の名称を表している。対象領域は、その食中毒菌における本実施形態のプライマーセットにより増幅される対象領域に存在する遺伝子の名称を示している。また、同図において、食中毒菌の増幅対象領域ごとに対応するＰＣＲ用プライマーセットの塩基配列を示している。これらの配列番号に示される塩基配列は、５’末端から３’末端方向の配列を示している。
【０１１５】
次に、設計したプライマーセットを、ライフテクノロジージャパン株式会社によって人工合成を行うことで作製した。さらに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。具体的には、以下の組成のものを作製した。
・緩衝液（10× Ex Taq buffer (20mM Mg2＋ plus)，2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP Mixture (dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)，1.6μl）
・フォワードプライマー（10ng/μl，0.4μl）
・リバースプライマー（10ng/μl，0.4μl）
・核酸合成酵素（EX Taq(5U/μl)，0.1μl）
・試料のＤＮＡ（1.0μl）
・滅菌水（14.5μl）
（全量 20μl）
ここで、試料のＤＮＡは、増幅対象生物と６種類の非増幅対象生物のＤＮＡを個別に含めて、それぞれ別個にＰＣＲを行った。
【０１１６】
次に、ｅｐグラジエントs（エッペンドルフ社製）を用いて、以下の反応条件でＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
【０１１７】
最後に、ＰＣＲ法による産物を、ＭｕｌｔｉＮＡ（登録商標、株式会社島津製作所製）を用いて、マイクロキャピラリー電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１８（ａ）に示す。
同図において、７の増幅対象生物（ビブリオ）から選択された、１〜６の非対象生物のＤＮＡと１２塩基以上連続で重ならないプライマーを含む本発明のプライマーセットによれば、ビブリオの増幅対象領域ｔｄｈ（３８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。なお、同図の縦軸にはｂｐの対数目盛りが示されているが、比較的大きな誤差があり、バンドの大凡の位置を確認することはできるが、厳密な値を示すものではない。また、電気泳動の結果を示す図において、プライマーやそのダイマーによるバンドが現れている場合があるが、これらは増幅によるものではない。以下においても同様である。
【０１１８】
（実施例２）
増幅対象生物として食中毒菌である以下の大腸菌（NBRC102203）を選択するとともに、非増幅対象生物として以下の６種類の食中毒菌を選択した。
１．Negative Cont.
２．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
３．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
４．増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
５．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
６．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
７．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
８．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
【０１１９】
次いで、実施例１と同様に、これらの生物の塩基配列を比較して、大腸菌の塩基配列から条件Ａを満たし、増幅対象領域ｐｙｒＨ（ウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子，１５７ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図１７の実施例２に示す大腸菌検出用の両方のプライマー（配列番号１１，１２）が、上記６種類の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならないものである。
【０１２０】
次に、実施例１と同様に、本実施例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。さらに、実施例１と同様にＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行い、その増幅産物を、ＭｕｌｔｉＮＡにより、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１８（ｂ）に示す。
同図において、４の増幅対象生物（大腸菌）から選択された、２，３，及び５〜８の非対象生物のＤＮＡと１２塩基以上連続で重ならないプライマーを含む本発明のプライマーセットによれば、大腸菌の増幅対象領域ｐｙｒＨ（１５７ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１２１】
（実施例３）
実施例２に示した７種類の菌株のうち、増幅対象生物として食中毒菌であるサルモネラ（ATCC9270）を選択するとともに、非増幅対象生物として残りの６種類の食中毒菌を選択し、以下のように８を対照とした。
１．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
【０１２２】
次いで、実施例１と同様に、これらの生物の塩基配列を比較して、サルモネラの塩基配列から条件Ａを満たし、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図１７の実施例３に示すサルモネラ検出用の両方のプライマー（配列番号１３，１４）が、上記６種類の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならないものである。
【０１２３】
次に、実施例１と同様に、本実施例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。さらに、実施例１と同様にＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行い、その増幅産物をＭｕｌｔｉＮＡによりそれぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１８（ｃ）に示す。
同図において、５の増幅対象生物（サルモネラ）から選択された、１〜４，及び６，７の非対象生物のＤＮＡと１２塩基以上連続で重ならないプライマーを含む本発明のプライマーセットによれば、サルモネラの増幅対象領域ｉｎｖＡ（１８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１２４】
（比較例１）
増幅対象生物として食中毒菌である以下の大腸菌（NBRC102203）を選択するとともに、非増幅対象生物として以下の６種類の食中毒菌を選択した。
１．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
【０１２５】
次いで、これらの生物の塩基配列を比較して、大腸菌の塩基配列から条件Ａを満さない、増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショック遺伝子）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図１７の比較例１に示す大腸菌検出用のフォワードプライマー（配列番号１５）及びリバースプライマー（配列番号１６）の両方が、上記６種類の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なっている。
【０１２６】
次に、実施例１と同様に、本比較例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。さらに、実施例１と同様にＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行い、その増幅産物をＭｕｌｔｉＮＡによりそれぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１９（ａ）に示す。
同図において、３の増幅対象生物（大腸菌）から選択された、条件Ａを満たさないプライマーセットによれば、１，５，６の非増幅対象生物についても、増幅が行われていることがわかる。
【０１２７】
（比較例２）
比較例１に示した７種類の菌株のうち、増幅対象生物として食中毒菌であるサルモネラ（ATCC9270）を選択するとともに、非増幅対象生物として残りの６種類の食中毒菌を選択した。
【０１２８】
次いで、これらの生物の塩基配列を比較して、サルモネラの塩基配列から条件Ａを満さない、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図１７の比較例２に示すサルモネラ検出用のフォワードプライマー（配列番号１７）及びリバースプライマー（配列番号１８）の両方が、上記１〜４，６，７の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なっている。
【０１２９】
次に、実施例１と同様に、本比較例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。さらに、実施例１と同様にＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行い、その増幅産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１９（ｂ）に示す。
同図において、５の増幅対象生物（サルモネラ）から選択された、条件Ａを満たさないプライマーセットによれば、上記１及び３の非増幅対象生物についても、増幅を行っていることがわかる。
以上の通り、プライマーセットが（条件Ａ）を満足する場合、ＰＣＲ法によって増幅が特異的に行われることが確認された。
【０１３０】
＜実験２：フォワードプライマーとリバースプライマーの融解温度の差に関して＞
本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづいて、各種食中毒菌について、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度（Ｔｍ値）の差が５℃未満（条件Ｅ）」を満たすプライマーセットを作製し、これを用いてＰＣＲ法を行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した（実施例４〜１１）。
また、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上かつ１０℃未満になるプライマーセットと、１０℃以上になるプライマーセットを作製し、これを用いてＰＣＲ法を行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した（比較例３〜１８）。
【０１３１】
（１）セレウス（対象領域：ｃｅｓＢ）検出用プライマー
（実施例４）
増幅対象生物として食中毒菌である以下のセレウス（TIFT114011）を選択するとともに、非増幅対象生物として以下に示す６種類の食中毒菌を選択した。
１．増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
【０１３２】
次いで、セレウスの塩基配列から上記条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｃｅｓＢ（セレウリド合成酵素遺伝子，２３８ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図２０の実施例４に示すセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号１９）及びリバースプライマー（配列番号２０）を設計した。これらの融解温度の差は、３．３３℃となっている。
【０１３３】
次に、実施例１と同様に、本実施例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。
そして、以下の反応条件でＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
なお、上記アニーリング温度は、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度に設定した。これは、実験２における以下の実施例及び比較例についても同様である。
【０１３４】
そして、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図２４に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、セレウスの増幅対象領域ｃｅｓＢ（２３８ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１３５】
（比較例３）
実施例４と同様に、増幅対象生物として食中毒菌であるセレウスを選択するとともに、非増幅対象生物として６種類の食中毒菌を選択した。
次いで、セレウスの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｃｅｓＢ（セレウリド合成酵素遺伝子，２３８ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図２０の比較例３に示すセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号１９）及びリバースプライマー（配列番号２１）を設計した。これらの融解温度の差は、６．１２℃となっている。
【０１３６】
次に、実施例４と同様に、本比較例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。
そして、以下の反応条件でＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６５℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
【０１３７】
そして、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図２４に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、セレウスの非増幅対象領域、及び非増幅対象生物の黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１３８】
（比較例４）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６０℃とした点以外は、比較例３と同様にして、実験を行った。図２０に示すように、比較例４のセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号１９）及びリバースプライマー（配列番号２２）の融解温度の差は、１１．２９℃である。その結果を図２４に示す。
同図において、本比較例のプライマーセットによっては、非増幅対象領域は増幅されておらず、非特異的増幅は行われていない。
【０１３９】
（２）セレウス（対象領域：ｎｈｅ）検出用プライマー
（実施例５）
セレウスの塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｎｈｅ（溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子，１９５ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２０に示すように、実施例５のセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号２３）及びリバースプライマー（配列番号２４）の融解温度の差は、０．３１℃となっている。その結果を図２４に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１４０】
（比較例５）
セレウスの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｎｈｅを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６２℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２０に示すように、比較例５のセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号２５）及びリバースプライマー（配列番号２４）の融解温度の差は、７．４７℃となっている。その結果を図２４に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、セレウスの非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１４１】
（比較例６）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃とした点以外は、比較例５と同様にして、実験を行った。図２０に示すように、比較例６のセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号２６）及びリバースプライマー（配列番号２４）の融解温度の差は、１１．０２℃となっている。その結果を図２４に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のカンピロバクター及び大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１４２】
（３）カンピロバクター検出用プライマー
（実施例６）
増幅対象生物として実施例４に示したカンピロバクターを選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（リボソーム遺伝子，２６３ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２１に示すように、実施例６のカンピロバクター検出用のフォワードプライマー（配列番号２７）及びリバースプライマー（配列番号２８）の融解温度の差は、１．９８℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、カンピロバクターの増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（２６３ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１４３】
（比較例７）
カンピロバクターの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２１に示すように、比較例７のカンピロバクター検出用のフォワードプライマー（配列番号２９）及びリバースプライマー（配列番号２８）の融解温度の差は、５．６℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、カンピロバクターの非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１４４】
（比較例８）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃とした点以外は、比較例７と同様にして実験を行った。図２１に示すように、比較例８のカンピロバクター検出用のフォワードプライマー（配列番号３０）及びリバースプライマー（配列番号２８）の融解温度の差は、１０．８２℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、カンピロバクターの非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１４５】
（４）大腸菌検出用プライマー
（実施例７）
増幅対象生物として実施例４に示した大腸菌を選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｐｙｒＨ（ウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子，１５７ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を７２℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２１に示すように、実施例７の大腸菌検出用のフォワードプライマー（配列番号３１）及びリバースプライマー（配列番号３２）の融解温度の差は、３．４３℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、大腸菌の増幅対象領域ｐｙｒＨ（１５７ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１４６】
（比較例９）
大腸菌の塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｐｙｒＨを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６７℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２１に示すように、比較例９の大腸菌検出用のフォワードプライマー（配列番号３３）及びリバースプライマー（配列番号３２）の融解温度の差は、７．８９℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のセレウス、カンピロバクター、リステリア、サルモネラ、及び黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１４７】
（比較例１０）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６４℃とした点以外は、比較例９と同様にして実験を行った。図２１に示すように、比較例１０の大腸菌検出用のフォワードプライマー（配列番号３４）及びリバースプライマー（配列番号３２）の融解温度の差は、１１．７９℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、カンピロバクター、リステリア、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、及びビブリオにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１４８】
（５）リステリア検出用プライマー
（実施例８）
増幅対象生物として実施例４に示したリステリアを選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｄｎａＪ （ヒートショックタンパク遺伝子，１７６ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を７０℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２２に示すように、実施例８のリステリア検出用のフォワードプライマー（配列番号３５）及びリバースプライマー（配列番号３６）の融解温度の差は、１．３３℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、リステリアの増幅対象領域ｄｎａＪ（１７６ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１４９】
（比較例１１）
リステリアの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｄｎａＪを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２２に示すように、比較例１１のリステリア検出用のフォワードプライマー（配列番号３５）及びリバースプライマー（配列番号３７）の融解温度の差は、６．９７℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のカンピロバクター、大腸菌、サルモネラ、及びビブリオにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１５０】
（比較例１２）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６０℃とした点以外は、比較例１１と同様にして実験を行った。図２２に示すように、比較例１２のリステリア検出用のフォワードプライマー（配列番号３５）及びリバースプライマー（配列番号３８）の融解温度の差は、１０．２７℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のサルモネラ、及びビブリオにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１５１】
（６）サルモネラ検出用プライマー
（実施例９）
増幅対象生物として実施例４に示したサルモネラを選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２２に示すように、実施例９のサルモネラ検出用のフォワードプライマー（配列番号３９）及びリバースプライマー（配列番号４０）の融解温度の差は、１．３３℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、サルモネラの増幅対象領域ｉｎｖＡ（１８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１５２】
（比較例１３）
サルモネラの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｉｎｖＡを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２２に示すように、比較例１３のサルモネラ検出用のフォワードプライマー（配列番号４１）及びリバースプライマー（配列番号４０）の融解温度の差は、５．６１℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、サルモネラの非増幅対象領域、並びに非増幅対象生物のセレウス、大腸菌、黄色ブドウ球菌、及びビブリオにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１５３】
（比較例１４）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を
５８℃とした点以外は、比較例１３と同様にして実験を行った。図２２に示すように、比較例１４のサルモネラ検出用のフォワードプライマー（配列番号４２）及びリバースプライマー（配列番号４０）の融解温度の差は、１０．７１℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物の大腸菌、及びリステリアにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１５４】
（７）黄色ブドウ球菌検出用プライマー
（実施例１０）
増幅対象生物として実施例４に示した黄色ブドウ球菌を選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショックタンパク遺伝子，２３６ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２３に示すように、実施例１０の黄色ブドウ球菌検出用のフォワードプライマー（配列番号４３）及びリバースプライマー（配列番号４４）の融解温度の差は、４．１２℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１５５】
（比較例１５）
黄色ブドウ球菌の塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｄｎａＪを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６６℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２３に示すように、比較例１５の黄色ブドウ球菌検出用のフォワードプライマー（配列番号４３）及びリバースプライマー（配列番号４５）の融解温度の差は、６．２℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本比較例のプライマーセットによっては、非増幅対象領域は増幅されておらず、非特異的増幅は行われていない。
【０１５６】
（比較例１６）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を
６２℃とした点以外は、比較例１５と同様にして実験を行った。図２３に示すように、比較例１６の黄色ブドウ球菌検出用のフォワードプライマー（配列番号４３）及びリバースプライマー（配列番号４６）の融解温度の差は、１１．５５℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物の大腸菌、サルモネラ、及びビブリオにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１５７】
（８）ビブリオ検出用プライマー
（実施例１１）
増幅対象生物として実施例４に示したビブリオを選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２３に示すように、実施例１１のビブリオ検出用のフォワードプライマー（配列番号４７）及びリバースプライマー（配列番号４８）の融解温度の差は、３．７℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、ビブリオの増幅対象領域ｔｄｈ（３８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１５８】
（比較例１７）
ビブリオの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｔｄｈを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６０℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２３に示すように、比較例１７のビブリオ検出用のフォワードプライマー（配列番号４７）及びリバースプライマー（配列番号４９）の融解温度の差は、８．４３℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のサルモネラにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１５９】
（比較例１８）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を５５℃とした点以外は、比較例１７と同様にして実験を行った。図２３に示すように、比較例１８のビブリオ検出用のフォワードプライマー（配列番号４７）及びリバースプライマー（配列番号５０）の融解温度の差は、１３．９１℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のセレウス、リステリア、サルモネラ、及び黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１６０】
＜実験３：プライマーの長さに関して＞
本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづいて、各種食中毒菌について、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たすプライマーセットを作製し、これを用いてＰＣＲ法を行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した（参考例１，実施例１２）。なお、参考例１と実施例１２のプライマーセットは、条件Ｄを満たしている。
また、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさないプライマーセットを作製し、これを用いてＰＣＲ法を行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した（比較例１９〜２１）。
【０１６１】
（参考例１）Ｆプライマー：４１ｍｅｒ，Ｒプライマー：２３ｍｅｒ
増幅対象生物として以下のサルモネラ（ATCC9270）を選択するとともに、非増幅対象生物として、以下の１０種類の食中毒菌を選択した。
１．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus NBRC 15305）
２．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
３．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter coli ATCC 43478）
４．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
５．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
６．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
７．増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
８．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
９．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
１０．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802）
１１．非増幅対象生物 エルシニア（Yersinia enterocolitica ATCC 9610）
１２．Negative Cont.
【０１６２】
次いで、サルモネラの塩基配列から「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」である、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図２８の参考例１に示すサルモネラ検出用のフォワードプライマー（配列番号５１，４１ｍｅｒ）及びリバースプライマー（配列番号５２，２３ｍｅｒ）のプライマーセットを設計した。
【０１６３】
次に、実施例１と同様に、本実施例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。
そして、以下の反応条件でＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６９℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
なお、上記アニーリング温度は、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度に設定した。これは、実験３における以下の実施例及び比較例についても同様である。
【０１６４】
そして、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図２９（ａ）に示す。
同図において、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」のプライマーセットによれば、サルモネラの増幅対象領域ｉｎｖＡ（１８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１６５】
（実施例１２）Ｆプライマー：４１ｍｅｒ，Ｒプライマー：３４ｍｅｒ
増幅対象生物として参考例１における供試菌株９のビブリオを選択し、その塩基配列から「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たす、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、参考例１と同様にして実験を行った。本実施例のプライマーセットは、図２８に示すように、フォワードプライマー（配列番号５３，４１ｍｅｒ）及びリバースプライマー（配列番号５４，３４ｍｅｒ）からなっている。実験結果を図２９（ｂ）に示す。
同図において、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たすプライマーセットによれば、ビブリオの増幅対象領域ｔｄｈ（３８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。なお、供試菌株１０のビブリオ（ATCC 17802）は、増幅対象領域ｔｄｈを有していない。
【０１６６】
（比較例１９）Ｆプライマー：２２ｍｅｒ，Ｒプライマー：３４ｍｅｒ
増幅対象生物として以下のビブリオを選択するとともに、非増幅対象生物として、以下に示す６種類の食中毒菌を選択した。
１．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter coli ATCC 43478）
３．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
【０１６７】
増幅対象生物のビブリオの塩基配列から「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさない、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。また、ＰＣＲにおけるアニーリング温度を４８℃とした。その他の点は、参考例１と同様にして実験を行った。本実施例のプライマーセットは、図２８に示すように、フォワードプライマー（配列番号５５，２２ｍｅｒ）及びリバースプライマー（配列番号５６，３４ｍｅｒ）からなっている。実験結果を図３０（ａ）に示す。
同図において、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のセレウス、大腸菌、リステリア、サルモネラ、及び黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１６８】
（比較例２０）Ｆプライマー：３４ｍｅｒ，Ｒプライマー：２２ｍｅｒ
増幅対象生物として比較例１９に示すビブリオを選択し、そのＤＮＡの塩基配列から「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさない、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。また、ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５５℃とした。その他の点は、参考例１と同様にして実験を行った。本実施例のプライマーセットは、図２８に示すように、フォワードプライマー（配列番号５７，３４ｍｅｒ）及びリバースプライマー（配列番号５８，２２ｍｅｒ）からなっている。実験結果を図３０（ｂ）に示す。
同図において、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のセレウス、カンピロバクター、サルモネラ、及び黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１６９】
（比較例２１）Ｆプライマー：４２ｍｅｒ，Ｒプライマー：２３ｍｅｒ
増幅対象生物として比較例１９における供試菌株５のサルモネラを選択し、増幅対象生物のサルモネラの塩基配列から「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさない、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。また、ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６９℃とした。その他の点は、参考例１と同様にして実験を行った。本実施例のプライマーセットは、図２８に示すように、フォワードプライマー（配列番号５９，４２ｍｅｒ）及びリバースプライマー（配列番号６０，２３ｍｅｒ）からなっている。実験結果を図３０（ｃ）に示す。
同図において、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさないプライマーセットによれば、全ての非増幅対象生物における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１７０】
以上の結果から、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たすプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことで、増幅対象領域の増幅の特異性が向上することがわかる。
【０１７１】
＜実験４：アニーリング温度とプライマーの融解温度との関係に関して＞
本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづき作製したプライマーセットを用いて、種々のアニーリング温度によりＰＣＲを行うことで、プライマーセットにおけるプライマーの融解温度とアニーリング温度との関係について検討した。
具体的には、各種食中毒菌について、アニーリング温度を、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度のうち、低い方の温度よりも所定の範囲で低くしてＰＣＲを行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した（参考例２〜２５，実施例１３〜２８）。
【０１７２】
（１）セレウス（ｃｅｓＢ）検出用プライマー
（参考例２）アニーリング温度：融解温度（Ｔｍ値）−２０℃
増幅対象生物として以下のセレウスを選択するとともに、非増幅対象生物として、以下の６種類の食中毒菌を選択した。
１．増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
【０１７３】
次いで、実施例１と同様に、これらの生物の塩基配列を比較して、セレウスの塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｃｅｓＢ（セレウリド合成酵素遺伝子，２３８ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。このプライマーセットは、図３１の参考例２に示すように、フォワードプライマー（配列番号１９）及びリバースプライマー（配列番号２０）からなっている。参考例３，４、及び実施例１３，１４においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。
【０１７４】
次に、実施例１と同様に、本参考例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。
そして、以下の反応条件でＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）５３℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
本参考例では、上記アニーリング温度として、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から２０℃低い温度（Ｔｍ−２０℃）を設定した。
【０１７５】
そして、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図３５に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｃｅｓＢ（２３８ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１７６】
（参考例３）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。その結果を図３５に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウス及びカンピロバクターにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１７７】
（参考例４）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。その結果を図３５に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｃｅｓＢ（２３８ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１７８】
（実施例１３）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。その結果を図３５に示す。
同図において、本実施例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｃｅｓＢ（２３８ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１７９】
（実施例１４）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。その結果を図３５に示す。
同図において、本実施例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｃｅｓＢ（２３８ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１８０】
（２）セレウス（ｎｈｅ）検出用プライマー
（参考例５）アニーリング温度：融解温度−２０℃
セレウスの塩基配列から増幅対象領域ｎｈｅ（溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子，１９５ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３１の参考例５に示すように、フォワードプライマー（配列番号２３）及びリバースプライマー（配列番号２４）からなっている。参考例６，７、及び実施例１５，１６においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。アニーリング温度は５３℃とした。その結果を図３６に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１８１】
（参考例６）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例５と同様にして実験を行った。その結果を図３６に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１８２】
（参考例７）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例５と同様にして実験を行った。その結果を図３６に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１８３】
（実施例１５）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例５と同様にして実験を行った。その結果を図３６に示す。
同図において、本実施例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１８４】
（実施例１６）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例５と同様にして実験を行った。その結果を図３６に示す。
同図において、本実施例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１８５】
（３）カンピロバクター検出用プライマー
（参考例８）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として参考例２における供試菌株２のカンピロバクターを選択し、カンピロバクターの塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（リボソーム遺伝子，２６３ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３２の参考例８に示すように、フォワードプライマー（配列番号２７）及びリバースプライマー（配列番号２８）からなっている。アニーリング温度は５３℃とした。参考例９，１０、及び実施例１７，１８においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。その結果を図３７に示す。
同図において、本参考例におけるカンピロバクター検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、カンピロバクターにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。なお、同図の点線囲み内における下側のバンドが非特異的増幅を示し、上側のバンドは検出対象のものである。以下の参考例９，１０においても同様である。
【０１８６】
（参考例９）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例８と同様にして実験を行った。その結果を図３７に示す。
同図において、本参考例におけるカンピロバクター検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、カンピロバクターにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１８７】
（参考例１０）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例８と同様にして実験を行った。その結果を図３７に示す。
同図において、本参考例におけるカンピロバクター検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、カンピロバクターにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１８８】
（実施例１７）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例８と同様にして実験を行った。その結果を図３７に示す。
同図において、本実施例におけるカンピロバクター検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、カンピロバクターの増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（２６３ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１８９】
（実施例１８）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７２℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例８と同様にして実験を行った。その結果を図３７に示す。
同図において、本実施例におけるカンピロバクター検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、カンピロバクターの増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（２６３ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１９０】
（４）大腸菌検出用プライマー
（参考例１１）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として食中毒菌である大腸菌を選択し、大腸菌の塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｐｙｒＨ（ウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子，１５７ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計し、アニーリング温度を５７℃とした点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３２の参考例１１に示すように、フォワードプライマー（配列番号３１）及びリバースプライマー（配列番号３２）からなっている。参考例１２，１３、及び実施例１９，２０においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。その結果を図３８に示す。
同図において、本参考例における大腸菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１９１】
（参考例１２）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６２℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例１１と同様にして実験を行った。その結果を図３８に示す。
同図において、本参考例における大腸菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１９２】
（参考例１３）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６７℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例１１と同様にして実験を行った。その結果を図３８に示す。
同図において、本参考例における大腸菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌の増幅対象領域ｐｙｒＨ（１５７ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１９３】
（実施例１９）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７２℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例１１と同様にして実験を行った。その結果を図３８に示す。
同図において、本実施例における大腸菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌の増幅対象領域ｐｙｒＨ（１５７ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１９４】
（実施例２０）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７７℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例１１と同様にして実験を行った。その結果を図３８に示す。
同図において、本実施例における大腸菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌の増幅対象領域ｐｙｒＨ（１５７ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１９５】
（５）リステリア検出用プライマー
（参考例１４）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として参考例２における供試菌株４のリステリアを選択し、リステリアの塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショックタンパク遺伝子，１７６ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計し、アニーリング温度を５４℃とした点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３３の参考例１４に示すように、フォワードプライマー（配列番号３５）及びリバースプライマー（配列番号３６）からなっている。参考例１５，１６、及び実施例２１，２２においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。その結果を図３９に示す。
同図において、本参考例におけるリステリア検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１９６】
（参考例１５）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５９℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例１４と同様にして実験を行った。その結果を図３９に示す。
同図において、本参考例におけるリステリア検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、リステリアの増幅対象領域ｄｎａＪ（１７６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１９７】
（参考例１６）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６４℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例１４と同様にして実験を行った。その結果を図３９に示す。
同図において、本参考例におけるリステリア検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、リステリアの増幅対象領域ｄｎａＪ（１７６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１９８】
（実施例２１）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６９℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例１４と同様にして実験を行った。その結果を図３９に示す。
同図において、本実施例におけるリステリア検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、リステリアの増幅対象領域ｄｎａＪ（１７６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１９９】
（実施例２２）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７４℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例１４と同様にして実験を行った。その結果を図３９に示す。
同図において、本実施例におけるリステリア検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、リステリアの増幅対象領域ｄｎａＪ（１７６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２００】
（６）サルモネラ検出用プライマー
（参考例１７）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として参考例２における供試菌株５のサルモネラを選択し、サルモネラの塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３３の参考例１７に示すように、フォワードプライマー（配列番号３９）及びリバースプライマー（配列番号４０）からなっている。参考例１８，１９、及び実施例２３，２４においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。アニーリング温度は５３℃とした。その結果を図４０に示す。
同図において、本参考例におけるサルモネラ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０２０１】
（参考例１８）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例１７と同様にして実験を行った。その結果を図４０に示す。
同図において、本参考例におけるサルモネラ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０２０２】
（参考例１９）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例１７と同様にして実験を行った。その結果を図４０に示す。
同図において、本参考例におけるサルモネラ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、サルモネラ及び黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０２０３】
（実施例２３）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例１７と同様にして実験を行った。その結果を図４０に示す。
同図において、本実施例におけるサルモネラ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、サルモネラの増幅対象領域ｉｎｖＡ（１８０ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２０４】
（実施例２４）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例１７と同様にして実験を行った。その結果を図４０に示す。
同図において、本実施例におけるサルモネラ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、サルモネラの増幅対象領域ｉｎｖＡ（１８０ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２０５】
（７）黄色ブドウ球菌検出用プライマー
（参考例２０）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として参考例１における供試菌株６の黄色ブドウ球菌を選択し、黄色ブドウ球菌の塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショックタンパク遺伝子，２３６ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３４の参考例２０に示すように、フォワードプライマー（配列番号４３）及びリバースプライマー（配列番号４４）からなっている。参考例２１，２２、及び実施例２５，２６においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。アニーリング温度は５３℃とした。その結果を図４１に示す。
同図において、本参考例における黄色ブドウ球菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２０６】
（参考例２１）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例２０と同様にして実験を行った。その結果を図４１に示す。
同図において、本参考例における黄色ブドウ球菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２０７】
（参考例２２）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例２０と同様にして実験を行った。その結果を図４１に示す。
同図において、本参考例における黄色ブドウ球菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２０８】
（実施例２５）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例２０と同様にして実験を行った。その結果を図４１に示す。
同図において、本実施例における黄色ブドウ球菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２０９】
（実施例２６）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例２０と同様にして実験を行った。その結果を図４１に示す。
同図において、本実施例における黄色ブドウ球菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２１０】
（８）ビブリオ検出用プライマー
（参考例２３）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として参考例２における供試菌株７のビブリオを選択し、ビブリオの塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３４の参考例２３に示すように、フォワードプライマー（配列番号４７）及びリバースプライマー（配列番号４８）からなっている。参考例２４，２５、及び実施例２７，２８においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。アニーリング温度は５３℃とした。その結果を図４２に示す。
同図において、本参考例におけるビブリオ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、全ての非増幅対象生物における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０２１１】
（参考例２４）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例２３と同様にして実験を行った。その結果を図４２に示す。
同図において、本参考例におけるビブリオ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、全ての非増幅対象生物における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０２１２】
（参考例２５）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例２３と同様にして実験を行った。その結果を図４２に示す。
同図において、本参考例におけるビブリオ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスを除く全ての非増幅対象生物における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０２１３】
（実施例２７）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例２３と同様にして実験を行った。その結果を図４２に示す。
同図において、本実施例におけるビブリオ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、ビブリオの増幅対象領域ｔｄｈ（３８０ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２１４】
（実施例２８）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７２℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例２３と同様にして実験を行った。その結果を図４２に示す。
同図において、本実施例におけるビブリオ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、ビブリオの増幅対象領域ｔｄｈ（３８０ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２１５】
以上の結果から、アニーリング温度を、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から０〜５℃低い温度に設定して、ＰＣＲを行うことで、増幅対象領域の増幅の特異性が向上することがわかる。
【０２１６】
＜実験５：本発明におけるマルチプレックスＰＣＲ法における単独菌での増幅試験に関して＞
本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづき作製したプライマーセットを複数同時に用いるとともに、増幅対象生物を単独として、その増幅対象領域を特異的に増幅できるかを検証した。
【０２１７】
（実施例２９）
まず、本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづいて、図４３に示すプライマーセットを設計した。すなわち、配列番号６１のフォワードプライマー及び配列番号６２のリバースプライマーとからなる、セレウスにおける増幅対象領域ｎｈｅ（溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子，１９５ｂｐ）を増幅するプライマーセット１、配列番号６３のフォワードプライマー及び配列番号６４のリバースプライマーとからなる、セレウスにおける増幅対象領域ｃｅｓＢ（セレウリド合成酵素遺伝子，２３８ｂｐ）を増幅するプライマーセット２、配列番号６５のフォワードプライマー及び配列番号６６のリバースプライマーとからなる、カンピロバクターにおける増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（リボソーム遺伝子，２６３ｂｐ）を増幅するプライマーセット３、配列番号６７のフォワードプライマー及び配列番号６８のリバースプライマーとからなる、大腸菌における増幅対象領域ｐｙｒＨ（ウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子，１５７ｂｐ）を増幅するプライマーセット４、配列番号６９のフォワードプライマー及び配列番号７０のリバースプライマーとからなる、リステリアにおける増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショックタンパク遺伝子，１７６ｂｐ）を増幅するプライマーセット５、配列番号７１のフォワードプライマー及び配列番号７２のリバースプライマーとからなる、サルモネラにおける増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセット６、配列番号７３のフォワードプライマー及び配列番号７４のリバースプライマーとからなる、黄色ブドウ球菌における増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショックタンパク遺伝子，２３６ｂｐ）を増幅するプライマーセット７、配列番号７５のフォワードプライマー及び配列番号７６のリバースプライマーとからなる、ビブリオにおける増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセット８を設計した。また、図４３において、これらのプライマーセットを用いた場合の各増幅産物の理論上の塩基配列の長さを示している。
【０２１８】
これらのプライマーセットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方が、当該対象生物の非増幅対象領域や他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならない。また、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方が、３’末端側半分において、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備える配列を有する、あるいは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方が、それぞれのプライマーの配列の中心から３’末端側及び５’末端側の両方向に向かってプライマーの全長の四分の１の範囲を含む領域に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備える配列を有している。また、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度（Ｔｍ値）の差が５℃未満である。さらに、フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒであり、かつ融解温度が７３〜７８℃となっている。
【０２１９】
また、上記プライマーセット１〜８の設計にあたり、それぞれ順に対応する番号の以下の食中毒菌を増幅対象生物にすると共に、他の食中毒菌を非増幅対象生物として使用した。
１．セレウス（Bacillus cereus NBRC 15305）
２．セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
３．カンピロバクター（Campylobacter coli ATCC 43478）
４．大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
５．リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
６．サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
７．黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
８．ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
【０２２０】
次に、実施例１と同様に、設計したプライマーセットを、ライフテクノロジージャパン株式会社によって人工合成を行うことで作製した。
次に、ＰＣＲ用反応液として、上記プライマーセット１〜８を全て含有させ、以下の組成のものを作製した。
・緩衝液 10×Ex Taq buffer（20mM Mg 2＋ plus） 2.0μl
・核酸合成基質 dNTP Mixture（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM） 1.6μl
・ビブリオ検出用primer R（10ng/μl、final conc.4ng） 0.4μl
・ビブリオ検出用primer F（10ng/μl、final conc.4ng） 0.4μl
・その他のprimer R（10ng/μl、final conc.2ng） 0.2μl×7
・その他のprimer F（10ng/μl、final conc.2ng） 0.2μl×7
・核酸合成酵素 EX Taq（5U/μl） 0.1μl
・試料のＤＮＡ 1.0μl
・滅菌水 11.7μl
（全量 20μl）
【０２２１】
また、試料のＤＮＡは、次の１〜７に示す食中毒菌のＤＮＡをそれぞれ別個に含有させ、個別にＰＣＲを行った。
１．セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus GTC 2055）
なお、ビブリオは、次の機関から分譲されたものである。
・GTC 岐阜大学大学院医学系研究科病原体制御分野
【０２２２】
ＰＣＲ法による遺伝子の増幅は、ｅｐグラジエントｓ（エッペンドルフ株式会社製）を使用して、以下の条件で行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
【０２２３】
次に、実施例１と同様に、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図４４に示す。
同図において、各試料の生物ごとに、それぞれ以下のピークが示されている。
１．セレウス １９８ｂｐ及び２５２ｂｐ
２．カンピロバクター ２７０ｂｐ
３．大腸菌 １５８ｂｐ
４．リステリア １９５ｂｐ
５．サルモネラ １７７ｂｐ
６．黄色ブドウ球菌 ２３８ｂｐ
７．ビブリオ ３９０ｂｐ
【０２２４】
ここで、ＰＣＲによる増幅産物を電気泳動した場合、ＭｕｌｔｉＮＡ(株式会社島津製作所製)に用いる試薬などの影響から、理論上の増幅産物の塩基配列と完全には一致せず、近似する値の結果が得られる。
図４４に示す結果は、それぞれの理論上の増幅産物の塩基配列の長さに近似するものであり、それぞれ対象とする食中毒菌の増幅対象領域が増幅されていると考えられる。
【０２２５】
このように、本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづき作製したプライマーセットを複数同時に用いた場合でも、それぞれ対象とする食中毒菌の増幅対象領域をそれぞれ個別に特異的に増幅できることが明らかとなった。
なお、リステリアの増幅産物は１９５ｂｐとなっており、理論上の増幅産物１７６ｂｐに比較して２０ｂｐ近く長くなっているが、これは誤差又は当該菌株（ATCC 15313）に配列の挿入が生じていることなどによるものと推定される。
【０２２６】
＜実験６：本発明におけるマルチプレックスＰＣＲ法における複数菌での増幅試験に関して＞
（実施例３０）
実施例２９と同じプライマーセットを同様に作製すると共に、ＰＣＲ用反応液として、作製したプライマーセット１〜８を全て含有させた、以下の組成のものを作製した。
・緩衝液 10×Ex Taq buffer（20mM Mg 2＋ plus） 2.0μl
・核酸合成基質 dNTP Mixture（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM） 1.6μl
・ビブリオ検出用primer R（10ng/μl、final conc.4ng） 0.4μl
・ビブリオ検出用primer F（10ng/μl、final conc.4ng） 0.4μl
・その他のprimer R（10ng/μl、final conc.2ng） 0.2μl×7
・その他のprimer F（10ng/μl、final conc.2ng） 0.2μl×7
・核酸合成酵素 EX Taq（5U/μl） 0.1μl
・試料のＤＮＡ 1.0μl×7
・滅菌水 5.7μl
（全量 20μl）
【０２２７】
また、本実施例では、試料のＤＮＡとして、実施例２９と同じものを全て同時に含有させた。次いで、実施例１と同様のＰＣＲの条件によって、各試料のＤＮＡを複数のプライマーセット１〜８を用いて同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲを行った。そして、増幅産物を電気泳動によりそれぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図４５に示す。
【０２２８】
同図に示すように、次の８つの増幅産物のピークが見られた。
（１）１６８ｂｐ （２）１７２ｂｐ （３）１８７ｂｐ （４）２０１ｂｐ
（５）２２４ｂｐ （６）２４３ｂｐ （７）２７３ｂｐ （８）３８７ｂｐ
これらのピークは、それぞれ大腸菌、サルモネラ、リステリア、セレウス（ｎｈｅ）、黄色ブドウ球菌、セレウス（ｃｅｓＢ）、カンピロバクター、ビブリオの理論上の増幅産物の塩基配列の長さに近似するものであり、各食中毒菌の増幅対象領域が特異的に増幅されていると考えられる。
このように、本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづき作製したプライマーセットを複数同時に用いることで、それぞれ対象とする食中毒菌の増幅対象領域を同時に特異的に増幅できることが明らかとなった。
【０２２９】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記各実施形態や実施例の内容の適宜組み合わせたものとすることが可能である。また、生物の遺伝子のみならず、人工のＤＮＡの塩基配列の増幅に使用するなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【０２３０】
本発明は、食品製造現場や臨床現場における微生物検査や、遺伝子診断、遺伝子検査等の産業や研究開発において、好適に利用することが可能である。
【符号の説明】
【０２３１】
１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０ プライマー設計装置
１１，２１，３１，４１，５１，６１，７１ 塩基配列記憶手段
１２，２２，３２，４２，５２，６２，７２ 増幅対象生物選択手段
１３，２３，３３，４３，５３，６３，７３ 非増幅対象生物選択手段
１４，２４，３４，４４，５４，６４，７４ プライマー候補選択手段
１５，６７，７ｂ 十二塩基連続重複判定手段
１６，２６，３６，４６，５７，６８，７ｃ プライマーセット記憶手段
７５ ＧＣ含量判定手段
２５，７６ ＧＣ配列判定手段
３５，７７ ＡＴ配列判定手段
５５，６５，７９ 融解温度算出手段
５６，６６，７ａ 温度差判定手段
４５，７８ 融解温度判定手段
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ用プライマーの作製方法に関し、特に複数の増幅対象生物を特異的に検出可能なマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットの作製に用いることができるプライマーの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応，Polymerase Chain Reaction）法は微生物の検出や微生物の分類などの研究や産業に幅広く利用されており、様々な点で世間に貢献している。ＰＣＲ法が産業界に利用されている例として、食品製造現場や臨床現場において、日常的に危害菌などの有無が判定できる微生物検査が行われている。
ＰＣＲを行うにあたっては、対象微生物を特異的に増幅することが可能なプライマーを設計することが重要である。
しかしながら、異なる微生物でも同じ機能を持つ遺伝子では配列が類似している場合が多いことや対象領域が非対象領域と類似している可能性があることから、増幅の干渉や特異性が高いプライマーを設計するのは容易ではなかった。またＰＣＲ条件が最適化されていないため、ＰＣＲ条件を検討する手間も大変だった。
特にマルチプレックスＰＣＲにおける検証試験は、従来のＰＣＲよりもプライマー数や対象微生物数が増えるため検証数の増加につながり、プライマー設計には特異性の付与が重要であった。
【０００３】
また、微生物検査を簡単かつ迅速に行うためには、複数の微生物を同時に特異的に増幅するマルチプレックスＰＣＲを行うことが望ましい。
しかし、このように複数の微生物を同時に増幅する場合には、プライマー同士の競合、あるいはダイマー形成などが起こり、さらに増幅が干渉するため、結果として感度の低下や非特異増幅に影響する。
このため、同時検出する対象微生物の数が多くなるに従って、特異性の高いプライマーの設計は非常に難しくなるという問題があった。
【０００４】
ここで、マルチプレックスＰＣＲにおけるプライマーに関連する発明としては、特許文献１に記載のプライマーキットを挙げることができる。
このプライマーキットによれば、検体ごとに必要なプライマーを自由に組み換えて使用できるとされている。また、検体ごとにそれぞれ異なる検査項目が要求される遺伝子検査等においても、不要な遺伝情報の検出を回避しつつ、必要な標的塩基配列のみを過不足なく増幅することができ、また各プライマーの反応条件が標準化されているため、いずれの組み合わせのプライマーを用いた場合であっても、同一の反応条件で、それぞれの標的塩基配列を効率よく増幅することができるとされている。
【０００５】
また、特許文献２には、分離データからの解釈がしやすいように設計されたマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットが開示されている。
さらに、特許文献３には、検出対象とする複数の食中毒菌を検出するためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットが開示されている。
また、特許文献４には、長さが３０塩基以上のプライマーを使用し、プライマーのハイブリダイゼーション効率が９０％以上である温度のうち、最も高い温度でアニーリングさせ、３分〜１０分間の長時間アニーリング・伸長反応を行うことにより、マルチプレックスＰＣＲを行う方法が開示されている。
【０００６】
しかしながら、これらの文献には、プライマー設計条件やＰＣＲの条件設定を網羅したような記載がなく、さらに特異性の高いプライマーを得るための手法については未だ十分な検討がなされておらず、高い特異性を有するプライマーセットの開発が求められていた。
ここで、プライマーの設計方法に関連する発明としては、特許文献５〜８に記載のものを挙げることができる。
【０００７】
特許文献５には、複雑な温度制御を必要としない遺伝子増幅法であるＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法に適するプライマーの設計方法が開示されている。
また、特許文献６には、遺伝子を恒温増幅するＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法などに適するプライマーの設計方法が開示されている。
【０００８】
また、特許文献７には、遺伝子発現の定量方法において、増幅したい部分の片側に共通のアダプターが付加されるが、従来の遺伝子発現用プライマー設計方法では、このアダプター部分のプライマー情報を１つ１つ入力しているため時間がかかるという問題を解消すべく、そのプライマー配列を保持して逐次入力の手間を省き、またプライマー候補の絞り込みを自動的に行うプライマーの設計方法が開示されている。
さらに、特許文献８には、互いに異なるＤＮＡに、それぞれ特異的にハイブリダイズする複数のプライマーを効率よく設計するためのプライマーの設計方法が開示されている。
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−５５８１５号公報
【特許文献２】特開２００５−９５０２５号公報
【特許文献３】特開２００７−２７４９３４号公報
【特許文献４】特開２００６−３２０２１７号公報
【特許文献５】特開２００７−１８９９８３号公報
【特許文献６】特開２００５−３０１５３２号公報
【特許文献７】特開２００２−２７９８８号公報
【特許文献８】特開２００１−２５８５６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献５，６に記載のプライマーの設計方法は、上記の通り、ＬＡＭＰ法やＮＡＳＢＡ法等など恒温反応による遺伝子増幅法に関するものであり、また特許文献７に記載のプライマーの設計方法は、遺伝子発現の定量のために常に片側のプライマーを固定する手法に関するものであり、一般的なＰＣＲ法において特異性の高いプライマーを作製する場合に有効なものではなかった。
また、特許文献８には、プライマーを設計するにあたっての塩基長やＧＣ含有量、融解温度（Ｔｍ値）などについての一般的な手法が開示されているが、ＰＣＲ条件などに関する記載は無く、プライマーの特異性を十分に向上するためには、さらに改良する余地があった。
【００１１】
そこで、本発明者らは、複数の検出対象生物が存在する場合に、どのような条件でプライマーを設計すれば、プライマーの競合やダイマーの形成を抑止して、特異的な増幅を行い得るプライマーセットを得ることができるかにつき鋭意研究した結果、その条件を見いだすことに成功し、本発明を完成させた。
本発明によれば、一回の試験で検出対象生物を検出することができるため、検査コストを大幅に削減することができる。また、特異性の高いプライマーの設計が容易にできるため、従来の検証数を削減することができ検証に掛かるコストの削減にもなる。
すなわち、本発明は、複数の検出対象生物を、同時かつそれぞれ特異的に増幅することが可能なプライマーの作製方法、プライマーの使用方法、プライマーセット、ＰＣＲ用反応液、及びプライマーの設計方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のプライマーの作製方法は、上記目的を達成するために、ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列（核酸断片）を増幅できるプライマーセットを、増幅対象生物のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅させるためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないように、作製する方法としてある。
なお、非増幅対象生物（又は増幅対象生物）のＤＮＡの塩基配列とは、非増幅対象生物（又は増幅対象生物）のゲノムＤＮＡの全部又は一部の塩基配列を意味する。
また、本発明のプライマーの作製方法は、プライマーセットを、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満となるように作製することが好ましい。
【００１３】
また、本発明のプライマーの作製方法は、プライマーセットを、フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒであり、かつ融解温度が７０〜７８℃となるように作製することが好ましい。
また、本発明のプライマーの作製方法は、ＰＣＲ法が、複数の生物のＤＮＡの塩基配列を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲ法であり、各増幅対象生物のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅させるためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないように作製することが好ましい。
また、本発明のプライマーの使用方法は、ＰＣＲのアニーリング温度を、上記プライマーの作製方法を用いて得られたプライマーセットにおけるフォワードプライマーとリバースプライマーの中で、融解温度が低いプライマーの融解温度よりも０〜５℃低い温度に設定して、ＰＣＲを行う方法としてある。
【００１４】
また、本発明のプライマーセットは、上記のプライマーの作製方法を用いて得られるものとしてある。
また、本発明のＰＣＲ用反応液は、上記のプライマーの作製方法を用いて得られたプライマーセットを含有するものとしてある。
【００１５】
また、本発明のプライマーの設計方法は、ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーの設計方法であって、ＤＮＡの塩基配列を増幅する対象の一又は二以上の増幅対象生物を選択するステップと、ＤＮＡの塩基配列を増幅しない対象の一又は二以上の非増幅対象生物を選択するステップと、選択された増幅対象生物のＤＮＡからフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択するステップと、フォワードプライマー及びリバースプライマーの候補の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なるか否かを判定するステップと、判定の結果、フォワードプライマー及びリバースプライマーの候補の両方の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は非増幅対象生物のいずれかのＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なる場合、再度選択された増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して１２塩基以上連続で重なるか否かの判定を行うステップと、判定の結果、フォワードプライマー及びリバースプライマーの候補の少なくとも一方の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は非増幅対象生物の全てのＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならない場合、フォワードプライマーとリバースプライマーの候補をＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップを有する方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、マルチプレックスＰＣＲ法においても検出対象生物を適切に増幅し得る、特異性の高いプライマーセットを作製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の第一実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図である。
【図２】本発明の第一実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【図３】本発明の第二実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図である。
【図４】本発明の第二実施形態において作製されたプライマーの配列の例を示す図である。
【図５】本発明の第二実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【図６】本発明の第三実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図である。
【図７】本発明の第三実施形態において作製されたプライマーの配列の例を示す図である。
【図８】本発明の第三実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【図９】本発明の第四実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図である。
【図１０】本発明の第四実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【図１１】本発明の第五実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図である。
【図１２】本発明の第五実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【図１３】本発明の第六実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図である。
【図１４】本発明の第六実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【図１５】本発明の第七実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図である。
【図１６】本発明の第七実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【図１７】本発明における１２塩基以上連続で重ならない条件に関する実施例及び比較例で用いたプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図１８】本発明における１２塩基以上連続で重ならない条件に関する実施例の結果を示す図である。
【図１９】本発明における１２塩基以上連続で重ならない条件に関する比較例の結果を示す図である。
【図２０】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（セレウス検出用プライマー 対象領域：ｃｅｓＢ，ｎｈｅ）に関する実施例及び比較例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図２１】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（カンピロバクター検出用プライマー，大腸菌検出用プライマー）に関する実施例及び比較例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図２２】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（リステリア検出用プライマー，サルモネラ検出用プライマー）に関する実施例及び比較例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図２３】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（黄色ブドウ球菌検出用プライマー，ビブリオ検出用プライマー）に関する実施例及び比較例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図２４】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（セレウス検出用プライマー 対象領域：ｃｅｓＢ，ｎｈｅ）に関する実施例及び比較例の結果を示す図である。
【図２５】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（カンピロバクター検出用プライマー，大腸菌検出用プライマー）に関する実施例及び比較例の結果を示す図である。
【図２６】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（リステリア検出用プライマー，サルモネラ検出用プライマー）に関する実施例及び比較例の結果を示す図である。
【図２７】本発明におけるプライマーの融解温度差条件（黄色ブドウ球菌検出用プライマー，ビブリオ検出用プライマー）に関する実施例及び比較例の結果を示す図である。
【図２８】本発明におけるプライマーの長さに関する参考例及び実施例及び比較例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図２９】本発明におけるプライマーの長さに関する参考例及び実施例の結果を示す図である。
【図３０】本発明におけるプライマーの長さに関する比較例の結果を示す図である。
【図３１】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（セレウス検出用プライマー 対象領域：ｃｅｓＢ，ｎｈｅ）に関する実施例及び参考例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図３２】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（カンピロバクター検出用プライマー，大腸菌検出用プライマー）に関する実施例及び参考例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図３３】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（リステリア検出用プライマー，サルモネラ検出用プライマー）に関する実施例及び参考例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図３４】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（黄色ブドウ球菌検出用プライマー，ビブリオ検出用プライマー）に関する実施例及び参考例で用いるプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図３５】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（セレウス検出用プライマー 対象領域：ｃｅｓＢ）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図３６】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（セレウス検出用プライマー 対象領域：ｎｈｅ）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図３７】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（カンピロバクター検出用プライマー）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図３８】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（大腸菌検出用プライマー）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図３９】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（リステリア検出用プライマー）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図４０】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（サルモネラ検出用プライマー）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図４１】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（黄色ブドウ球菌検出用プライマー）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図４２】本発明におけるアニーリング温度とプライマーの融解温度条件（ビブリオ検出用プライマー）に関する実施例及び参考例の結果を示す図である。
【図４３】本発明におけるマルチプレックスＰＣＲにおける単独菌及び複数菌での増幅試験で用いたプライマーの塩基配列及び融解温度を示す図である。
【図４４】本発明におけるマルチプレックスＰＣＲにおける単独菌での増幅試験結果を示す図である。
【図４５】本発明におけるマルチプレックスＰＣＲにおける複数菌での増幅試験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明のプライマーの作製方法、プライマーの使用方法、プライマーセット、ＰＣＲ用反応液、及びプライマーの設計方法の実施形態について、詳細に説明する。
【００１９】
まず、本発明のプライマーの作製方法の一実施形態について、詳細に説明する。なお、本発明のプライマーの作製方法は、ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットを、対象生物のＤＮＡにおける対象領域を増幅させるためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならないように、作製するものであれば良く、以下の具体的な内容に限定されるものではない。
【００２０】
［プライマーの作製方法］
（１）プライマーの設計
マルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセットの設計にあたっては、同時に使用する他のプライマーセットと競合しないように設計する必要がある。また特異性が高いプライマーに求められる機能として、増幅対象生物のＤＮＡでは増幅対象領域以外が増幅しないこと、及び非増幅対象生物のＤＮＡが増幅しないことが求められる。
【００２１】
（条件Ａ）
このようなマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットに求められる機能を向上させ得るプライマーの条件として、本発明者らはプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないという条件を見いだした。すなわち、このような条件のプライマーセットによれば、その他の環境や各種条件に問題がなければ、増幅対象遺伝子領域を特異的に増幅させることが可能であることがわかった。
【００２２】
また、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないものとすることがより好ましい。
さらに、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、並びに、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないものとすることがより好ましい。このような条件のプライマーセットによれば、その他の環境や各種条件に問題がなければ、増幅対象遺伝子領域のみを好適に増幅させることが可能である。
なお、当該増幅対象生物とは、プライマーセット候補の選択元の増幅対象生物であり、そのフォワードプライマー及びリバースプライマーにより検出する対象の増幅対象生物を意味する。
【００２３】
ここで、「重ならない」とは、塩基が重複しないことを意味し、同じ塩基の配列ではないことを意味する。また「重なる」とは、塩基が重複することを意味し、同じ塩基の配列であることを意味する。プライマーの塩基配列が比較対象の塩基配列と「１２塩基以上連続で重ならない」とは、プライマーの塩基配列と、比較対象の塩基配列を比較した場合に、プライマーの塩基配列が、１２塩基以上連続してプライマーの塩基配列に存在しないことを意味する。
【００２４】
このようなプライマーセットを設計するにあたっては、増幅対象生物における増幅対象領域を決定し、その領域を増幅させるためのプライマー候補を選択する。そして、選択したプライマー候補の塩基配列が、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、並びに、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないか否かを確認する。このとき、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物を予め選択して、その塩基配列と選択したプライマー候補の塩基配列との比較を行い、１２塩基以上連続で重ならないか否かを判定することができる。
【００２５】
フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方の塩基配列が、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、他の増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列、又は所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重なる場合は、再度プライマー候補を選択し直す。そして、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくともいずれかの塩基配列が、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、並びに、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないプライマーセットが見つかるまで、プライマー候補の選択をし直し、及び１２塩基以上連続で重ならないか否かの判定を繰り返し実行する。
そして、１２塩基以上連続で重ならないプライマー候補が見つかった場合、そのプライマー候補を含むプライマーセットを、実際に作製するプライマーセットとして決定する。
【００２６】
また、このようなプライマーセットが、以下の条件Ｂ〜条件Ｅの条件を満たすか否かを判定し、条件Ａに加えて、さらにこれらの条件のうちの一又は二以上を満たすものをプライマーセットとして用いることも好ましい。プライマーセットが条件Ｂ〜条件Ｅを満たせば、その増幅の特異性を一層向上させることが可能となる。
【００２７】
（条件Ｂ）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、３’末端側半分において、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備える配列を有することが好ましい。なお、Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを意味し、Ａはアデニン、Ｔはチミンを意味する。ＤＮＡ分子は、これらいずれかの塩基を備えたヌクレオチドが鎖状に結合して構成されている。
【００２８】
（条件Ｃ）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、それぞれのプライマーの配列の中心から３’末端側及び５’末端側の両方向に向かってプライマーの全長の四分の１の範囲を含む領域に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備える配列を有することが好ましい。
【００２９】
（条件Ｄ）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度（Ｔｍ値）の差が５℃未満であることが好ましい。
【００３０】
（条件Ｅ）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒであり、かつ融解温度が７０〜７８℃であることが好ましく、融解温度が７３〜７８℃であることがさらに好ましい。
【００３１】
（２）プライマーの作製工程
以上のようにして決定されたプライマーセットの塩基配列にもとづいて、フォワードプライマー及びリバースプライマーを作製する。これらのプライマーの作製は、一般的な方法で行うことができ、ＤＮＡ合成装置を使用して、人工的に作製することができる。
【００３２】
［プライマーの使用方法］
次に、本発明のプライマーの使用方法の一実施形態について、詳細に説明する。
上述した本実施形態のプライマーの作製方法によって作製されたプライマーセット、及び後述するプライマーの設計方法にもとづき作製されたプライマーセットは、ＰＣＲに用いることができ、特にマルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセットとして好適に使用することが可能である。
【００３３】
まず、本実施形態のプライマーの作製方法又はプライマーの設計方法にもとづいて、増幅対象生物のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅するためのＰＣＲ用プライマーセットを作製する。
作製されたプライマーセットは、少なくとも条件Ａを満たすもの、すなわち、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないものである。また、条件Ｂ〜Ｅの少なくともいずれかをさらに満たすものであることがより好ましい。
【００３４】
次いで、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製する。
ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下のような組成のものを用いることができる。
・緩衝液
・核酸合成基質（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）
・フォワードプライマー
・リバースプライマー
・核酸合成酵素
・増幅対象生物のＤＮＡ
・水
【００３５】
ここで、複数菌種を一括検出の場合する場合には、ＰＣＲ用反応液におけるプライマー濃度を菌種毎に適した値にすることが好ましい。
すなわち、検出対象菌種毎にプライマー量を調整して、ＰＣＲ用反応液を作成することが好ましい。
例えば、セレウス、カンピロバクター、大腸菌、リステリア、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、及びビブリオを同時に検出する場合は、ビブリオ以外の菌種のフォワードプライマー及びリバースプライマーの濃度を同一にすると共に、ビブリオ検出用のフォワードプライマー及びリバースプライマーの濃度を、その他の各菌種の２倍にすることが好ましい。
【００３６】
ＰＣＲ法による遺伝子の増幅は、サーマルサイクラーなどのＰＣＲ装置を用いて行うことができる。
また、ＰＣＲの反応条件は、例えば次の条件で行うことができる。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
【００３７】
このとき、アニーリング温度（アニーリング工程における温度）設定は、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度のうち、低い方の温度からさらに０〜５℃低い温度とすることが好ましい。
また、増幅対象生物が複数の場合や、増幅対象領域が複数存在する場合は、複数のプライマーセットにおける全てのプライマーの融解温度のうち、最も低い温度からさらに０〜５℃低い温度とすることが好ましい。
【００３８】
具体的には、アニーリング温度を６５〜７３℃とすることが好ましく、６８〜７３℃とすることがより好ましく、６８℃とすることが最も好ましい。なお、これらに対応して、プライマーの融解温度の最小が、７０〜７８℃となるようにプライマーを設計することが好ましく、７３〜７８℃となるようにすることがより好ましい。特に、プライマーの融解温度の最小は、７３℃となるようにすることが最も好ましい。
このように、上記のアニーリング条件を適用することにより、増幅効率の不安定や増幅の干渉を防止することが可能となる。
【００３９】
ここで、ＰＣＲのアニーリング工程において、鋳型ＤＮＡとプライマーが結合するためには耐熱性菌由来のＤＮＡポリメラーゼの働きが必要である。すなわち、このＤＮＡポリメラーゼは、７０〜８０℃周辺の温度で高い活性を示す。一方、アニーリング温度が高すぎると塩基同士の結合において、熱エネルギーが過大となって結合が阻害され、増幅産物量が減少する。
また、増幅産物を電気泳動ではなく、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイで検出する際に、核酸合成物質へ蛍光色素を付与した場合、アニーリング温度が７０℃以上になると蛍光が増幅産物に取り込まれないことがある一方、アニーリング温度が６８℃では高い蛍光強度が得られる。
【００４０】
以上のことから、上述したように、アニーリング温度を６５〜７３℃とすることが好ましく、６８〜７３℃とすることがより好ましく、６８℃とすることが最も好ましい。また、以下の実施例において示されるように、プライマーの融解温度の最小は、アニーリング温度に０〜５℃を加えた温度が適している。このため、プライマーの融解温度のうち最小は、７３〜７８℃に設定することが好ましい。
【００４１】
次に、ＰＣＲ法による産物を、マイクロキャピラリーなどの電気泳動により増幅対象領域ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認する。また、電気泳動に代えて、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイなどを用いて、正しい増幅産物が得られているか否かを確認することも好ましい。これらは通常の方法により行うことが可能である。
【００４２】
［プライマーの設計方法］
次に、本発明のプライマーの設計方法の実施形態について、詳細に説明する。
【００４３】
［プライマーの設計方法の第一実施形態］
まず、図１及び図２を参照して、本発明のプライマーの設計方法の第一実施形態について説明する。図１は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図２は、本実施形態におけるプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【００４４】
ＰＣＲを行うにあたっては、上述したように、増幅対象生物を特異的に増幅することが可能なプライマーを設計することが重要であり、特に複数の微生物を同時に特異的に増幅するマルチプレックスＰＣＲを行う場合には、プライマーの競合やダイマーの形成がなく、増幅の干渉が少ないプライマーを設計することが必要である。
特に、マルチプレックスＰＣＲを用いての同時増幅および検出の場合においては、同じような機能を持つ遺伝子では塩基配列が類似していることが多い。このため、複数の微生物をそれぞれ増幅するためのプライマーを作製して、これらの微生物を同時に増幅する場合、増幅が干渉し合うことで、検出感度の低下につながることが多い。
【００４５】
本実施形態は、このようなプライマーの設計条件として、各増幅対象生物の遺伝子における増幅対象領域を増幅させるためフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないように作製するものである（条件Ａ−１）。また、このとき、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列を、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないものとすることがより好ましく（条件Ａ−２）、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、並びに、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないものとすることがさらに好ましい（条件Ａ−３）。本実施形態では、条件Ａとして、Ａ−１〜３のいずれかを用いることができる。
このような条件でプライマーを設計すれば、後述する実施例に示すように増幅反応が干渉しにくいプライマーを作製することができる。
【００４６】
本実施形態のプライマーの設計方法は、図１に示すプライマー設計装置１０により行うことができる。
プライマー設計装置１０としては、パーソナルコンピュータやサーバ、タブレット型コンピュータ、携帯端末などの情報処理装置を用いることができる。このプライマー設計装置１０は、図１に示すように、塩基配列記憶手段１１、増幅対象生物選択手段１２、非増幅対象生物選択手段１３、プライマー候補選択手段１４、十二塩基連続重複判定手段１５、及びプライマーセット記憶手段１６を備えている。
【００４７】
なお、プライマー設計装置１０におけるこれらの構成は、利用者が使用する情報処理装置内に備えられる必要はなく、これらの全部又は一部を他の情報処理装置に備え、ネットワークを通じて接続することによって構成することもできる。また、プライマー設計装置１０は、独立した情報処理装置により構成することができるほか、ＡＳＰ（Application Service Provider）や、ＳａａＳ（software as a service）などや、二以上の情報処理装置によって構成することができ、クライアント端末からアクセス可能なものにすることもできる。これは以下の実施形態における各種プライマー設計装置についても同様である。
【００４８】
塩基配列記憶手段１１は、増幅対象生物及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列を記憶するデータベースなどの記憶装置である。この塩基配列記憶手段１１は、増幅対象生物及び非増幅対象生物の識別情報ごとにＤＮＡの塩基配列、各生物名称や分類等の各種属性情報を記憶する。これらの増幅対象生物及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列としては、それぞれの生物における全塩基配列（全ゲノムＤＮＡ配列）とすることが好ましい。なお、全塩基配列ではなく、一部の領域を欠くものや一部の塩基配列のみを用いても良い。
【００４９】
増幅対象生物選択手段１２は、塩基配列記憶手段１１から増幅対象生物を選択して記憶する。このとき、増幅対象生物選択手段１２は、例えば塩基配列記憶手段１１から記憶されている生物名称を一覧表示し、選択された一又は二以上の生物の名称とその識別情報を、増幅対象生物として記憶することができる。
【００５０】
非増幅対象生物選択手段１３は、塩基配列記憶手段１１から非増幅対象生物を選択して記憶する。このとき、非増幅対象生物選択手段１３は、例えば塩基配列記憶手段１１から記憶されている生物名称を一覧表示し、選択された一又は二以上の生物の名称とその識別情報を、非増幅対象生物として記憶することができる。
なお、先に増幅対象領域を決定した後に、相同性検索を行って、増幅対象生物における当該領域と類似する配列を備えた非増幅対象生物を選択することも好ましい。
【００５１】
プライマー候補選択手段１４は、増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列からプライマーセットの候補となる塩基配列を選択し、これを当該増幅対象生物の識別情報に対応付けて一時的に記憶する。なお、このときプライマー候補選択手段１４に、増幅対象領域の両端付近の領域から２３ｍｅｒ〜４１ｍｅｒ程度の長さのフォワードプライマー及びリバースプライマーを選択させることが好ましい。
【００５２】
十二塩基連続重複判定手段１５は、プライマー候補選択手段１４により選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重複するか否かを判定する。
また、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列が、他の増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列又は所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重複するか否かを判定することがより好ましく、当該増幅対象生物のＤＮＡにおける非増幅対象領域の塩基配列、当該増幅対象生物以外の他の増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列、又は所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重複するか否かを判定することがさらに好ましい。
【００５３】
このとき、十二塩基連続重複判定手段１５は、非増幅対象生物選択手段１３により選択された一又は二以上の非増幅対象生物について、塩基配列記憶手段１１における非増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列に、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列と１２塩基以上連続で重複する領域が存在するか否かを判定する。
【００５４】
また、増幅対象生物選択手段１２により選択された増幅対象生物について、プライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物以外の一又は二以上の他の増幅対象生物が存在する場合、十二塩基連続重複判定手段１５は、塩基配列記憶手段１１におけるこれら他の増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列に、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列と１２塩基以上連続で重複する領域が存在するか否かを判定する。
【００５５】
さらに、プライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物について、十二塩基連続重複判定手段１５は、塩基配列記憶手段１１における当該増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列の非増幅対象領域に、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列と１２塩基以上連続で重複する領域が存在するか否かを判定する。
【００５６】
十二塩基連続重複判定手段１５による判定の結果、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列について、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、１２塩基以上連続で重複しない場合、当該プライマーセットを、作製に用いるプライマーセットとして決定することができる。また、このとき、上記その他の増幅対象生物及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列について、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、１２塩基以上連続で重複しない場合、当該プライマーセットを、作製に用いるプライマーセットとして決定することが好ましい。さらに、このとき、当該増幅対象生物とその他の増幅対象生物及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列について、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、１２塩基以上連続で重複しない場合、当該プライマーセットを、作製に用いるプライマーセットとして決定することがより好ましい。
【００５７】
十二塩基連続重複判定手段１５による判定の結果、それぞれ上記以外の場合、例えば、当該増幅対象生物とその他の増幅対象生物及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列の少なくともいずれかについて、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の両方が、１２塩基以上連続で重複する場合、プライマー候補選択手段１４は、増幅対象である当該増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列から再度プライマーセットの候補となる塩基配列を選択し直して、これを当該増幅対象生物の識別情報に対応付けて一時的に記憶する。そして、再度、十二塩基連続重複判定手段１５による上記判定が行われる。
【００５８】
プライマーセット記憶手段１６は、十二塩基連続重複判定手段１５により、作製に用いるプライマーセットとして決定されたプライマーセットの塩基配列を、増幅対象生物の識別情報に対応付けて記憶する。
【００５９】
次に、図２を参照して、本実施形態のプライマーの設計方法における各工程について説明する。なお、プライマー設計装置１０における各手段の処理の順序は、適宜変更しても良い。これは以下の実施形態における各種プライマー設計装置についても同様である。
まず、プライマー設計装置１０における増幅対象生物選択手段１２は、塩基配列記憶手段１１から、記憶されている生物名称を一覧表示し、選択された一又は二以上の生物の名称とその識別情報を、増幅対象生物として記憶する（ステップ１０）。また、プライマー設計装置１０における非増幅対象生物選択手段１３は、塩基配列記憶手段１１から、記憶されている生物名称を一覧表示し、選択された一又は二以上の生物の名称とその識別情報を、非増幅対象生物として記憶する（ステップ１１）。
【００６０】
次に、プライマー設計装置１０におけるプライマー候補選択手段１４により、増幅対象生物選択手段１２により選択された増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列を塩基配列記憶手段１１から検索して取得する。そして、取得された塩基配列からプライマーセットの候補となるフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列を選択し、これを当該増幅対象生物の識別情報に対応付けて一時的に記憶する（ステップ１２）。なお、増幅対象生物選択手段１２により複数の増幅対象生物及び対象領域が選択されている場合は、各増幅対象生物毎及び対象領域毎にプライマーセットの候補を選択して記憶することができる。
【００６１】
次に、プライマー設計装置１０における十二塩基連続重複判定手段１５により、上記プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、非増幅対象生物選択手段１３により選択された非増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列と１２塩基以上連続して重複するか否かを判定する（ステップ１３）。このとき、プライマー設計装置１０における十二塩基連続重複判定手段１５により、上記プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、このプライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列の非増幅対象領域、他の増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列、又は非増幅対象生物選択手段１３により選択された非増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列と１２塩基以上連続して重複するか否かを判定することも好ましい。
【００６２】
そして、プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の両方が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列のいずれかと１２塩基以上連続して重複した場合（ステップ１４のＹＥＳ）、再度ステップ１２のプライマーセットの候補の選択から繰り返す。このとき、プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の両方が、このプライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列の非増幅対象領域、他の増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列、又は非増幅対象生物選択手段１３により選択された非増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列のいずれかと１２塩基以上連続して重複した場合に、再度ステップ１２のプライマーセットの候補の選択から繰り返すようにすることも好ましい。
【００６３】
プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続して重複しない場合（ステップ１４のＮＯ）、十二塩基連続重複判定手段１５は、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定する（ステップ１５）。このとき、プライマーセットの候補のフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、このプライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列の非増幅対象領域、他の増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列、及び非増幅対象生物選択手段１３により選択された非増幅対象生物の識別情報に対応する塩基配列と、１２塩基以上連続して重複しない場合（ステップ１４のＮＯ）、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定することも好ましい。
十二塩基連続重複判定手段１５は、以上の工程を、ステップ１０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
【００６４】
このような本実施形態のプライマーの設計方法によれば、非特異的な増幅を行い難いプライマーセットを設計することができる。このため、このような設計方法により作製されたプライマーセットは、マルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセットに用いた場合にも、ＰＣＲにおける非特異的な増幅を抑制でき、好適に使用することが可能である。
【００６５】
［プライマーの設計方法の第二実施形態］
次に、図３〜図５を参照して、本発明のプライマーの設計方法の第二実施形態について説明する。図３は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図４は、本実施形態において作製されたプライマーの配列の例を示す図であり、図５は、本実施形態におけるプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【００６６】
微生物のＤＮＡの塩基配列において、ＧＣ配列は、ＧＣ含有量が少ない菌類で約２５％、多い菌類で約８０％程度（配列数の百分率。以下ＧＣ又はＡＴ含有量について同様。）含まれており、その範囲は非常に幅広くなっている。また、ＧＣリッチな部分やＡＴリッチな部分などがあるため、プライマーの設計において、ＧＣ含有量に適したプライマー配列の設計思想が求められる。
本実施形態は、主に塩基配列のＧＣ含有量が多い生物を増幅対象生物とする場合に、好適に用いられるものである。ここで、「ＧＣ含有量が多い」とは、塩基配列におけるＧ又はＣ塩基の含有量が５０％以上である場合を意味する。
【００６７】
本実施形態におけるプライマー設計装置２０は、図３に示すように、塩基配列記憶手段２１、増幅対象生物選択手段２２、非増幅対象生物選択手段２３、プライマー候補選択手段２４、ＧＣ配列判定手段２５、及びプライマーセット記憶手段２６を備えている。
本実施形態では、ＧＣ配列判定手段２５により、候補のプライマーの塩基配列におけるＧ又はＣの連続配列にもとづいて、これをＰＣＲ用のプライマーセットとして用いるか否かを決定する点で第一実施形態と異なっている。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができ、本実施形態におけるその他の各手段は、第一実施形態における同名の各手段とそれぞれ同様の処理を行うものとすることができる。また、図５に示す本実施形態のプライマーの設計方法の各工程は、図２の条件Ａ（ステップ１３，１４）を、条件Ｂ（ステップ２３，２４）に変更した点以外は同様である。
【００６８】
ＧＣ配列判定手段２５は、プライマー候補選択手段２４により選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー配列及びリバースプライマー配列が、３’末端側半分において、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備える配列を有するか否かを判定する（ステップ２３）。
ＧＣ配列判定手段２５による判定の結果、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくとも一方が、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えている場合（ステップ２４のＹＥＳ）、ＧＣ配列判定手段２５は、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定する（ステップ２５）。そして、プライマーセット記憶手段２６は、この決定されたプライマーセットを記憶する。
【００６９】
ＧＣ配列判定手段２５による判定の結果、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の両方が、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えていない場合（ステップ２４のＮＯ）、再度ステップ２２からの処理を繰り返す。すなわち、プライマー候補選択手段２４により増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して、ＧＣ配列判定手段２５により、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えているプライマーを含むプライマーセットが見つかるまで、条件Ｂの処理を繰り返す。
ＧＣ配列判定手段２５による判定は、ステップ２０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
【００７０】
このようにしてＰＣＲに用いるものとして決定されたプライマーセットにおける、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えているプライマーの塩基配列の例を図４に示す。
同図において、リステリアのｄｎａＪ領域から選択されたリバースプライマー（配列番号１：GAGAATCCTCCACCGCTAAATCCGCC）は、３’末端側において、Ｇ又はＣを連続で５塩基備えている。
また、黄色ブドウ球菌のｄｎａＪ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号２：CACGCCTGGAGAGCCTTCACCAGC）は、３’末端側（中央を含む）において、Ｇ又はＣを連続で３塩基備えている。
【００７１】
また、サルモネラのｉｎｖＡ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号３：GAACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGC）は、３’末端側において、Ｇ又はＣを連続で４塩基備えている。
さらに、大腸菌のｐｙｒＨ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号４：CGCTCGTCTGATGTCCGCTATTCCATTGAAT）は、３’末端側（中央を含む）において、Ｇ又はＣを連続で３塩基備えている。
また、カンピロバクターの１６ＳｒＤＮＡ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号５：GAAATCTAATGGCTTAACCATTAAACTGCTTGGG）は、３’末端側において、Ｇ又はＣを連続で３塩基備えている。
【００７２】
このようにして得られたプライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、増幅の特異性を、一層向上させることが経験上明らかとなっている。
【００７３】
［プライマーの設計方法の第三実施形態］
次に、図６〜図８を参照して、本発明の第三実施形態について説明する。図６は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図７は、本実施形態において作製されたプライマーの配列の例を示す図であり、図８は、本実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
本実施形態は、主に塩基配列のＧＣ含有量が少ない生物を増幅対象生物とする場合に、好適に用いられるものである。ここで、「ＧＣ含有量が少ない」とは、塩基配列におけるＧ又はＣ塩基の含有量が５０％未満である場合を意味する。
【００７４】
本実施形態におけるプライマー設計装置３０は、図６に示すように、塩基配列記憶手段３１、増幅対象生物選択手段３２、非増幅対象生物選択手段３３、プライマー候補選択手段３４、ＡＴ配列判定手段３５、及びプライマーセット記憶手段３６を備えている。
本実施形態では、ＡＴ配列判定手段３５により、候補のプライマーの塩基配列におけるＡ又はＴの連続配列にもとづいて、これをＰＣＲ用のプライマーセットとして用いるか否かを決定する点で第一実施形態と異なっている。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができ、本実施形態におけるその他の各手段は、第一実施形態における同名の各手段とそれぞれ同様の処理を行うものとすることができる。また、図８に示す本実施形態のプライマーの設計方法の各工程は、図２の条件Ａ（ステップ１３，１４）を、条件Ｃ（ステップ３３，３４）に変更した点以外は、図２におけるものと同様である。
【００７５】
ＡＴ配列判定手段３５は、プライマー候補選択手段３４により選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列が、それぞれのプライマーの塩基配列の中心から３’末端側及び５’末端側の両方向に向かってそれぞれのプライマーの全長の四分の１の範囲を含む領域（以下、この領域を中央領域と称する。）に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備える配列を有するか否かを判定する（ステップ３３）。
ＡＴ配列判定手段３５による判定の結果、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくとも一方が、中央領域に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えている場合（ステップ３４のＹＥＳ）、ＡＴ配列判定手段３５は、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定する（ステップ３５）。そして、プライマーセット記憶手段３６は、この決定されたプライマーセットを記憶する。
【００７６】
ＡＴ配列判定手段３５による判定の結果、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の両方が、中央領域に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えていない場合（ステップ３４のＮＯ）、再度ステップ３２からの処理を繰り返す。すなわち、プライマー候補選択手段３４により増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して、ＡＴ配列判定手段３５により、中央領域にＡ又はＴを連続で４塩基以上備えているプライマー配列を含むプライマーセットが見つかるまで、条件Ｃの処理を繰り返す。
【００７７】
ＡＴ配列判定手段３５による判定は、ステップ３０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
このようにしてＰＣＲに用いるものとして決定されたプライマーセットにおける、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えているプライマー配列の例を図７に示す。
【００７８】
同図において、ビブリオのｔｄｈ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号６：TCAGTTTACTTTTTTGGGTTTTTTGGCTTTCATGAAACCTG）は、中央領域に、Ａ又はＴを連続で６塩基備えている。
また、セレウスのｎｈｅ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号７：CATCTGTTGATGCGGCTTTAAAAGGGAAGT）は、中央領域に、Ａ又はＴを連続で７塩基備えている。
さらに、セレウスのｃｅｓＢ領域から選択されたフォワードプライマー（配列番号８：CACCTGCCGGAGGAGCAAAAATGATACAAC）は、中央領域に、Ａ又はＴを連続で６塩基備えている。
【００７９】
このようにして得られたプライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、増幅の特異性を、一層向上させることが経験上明らかとなっている。
【００８０】
［プライマーの設計方法の第四実施形態］
次に、図９及び図１０を参照して、本発明の第四実施形態について説明する。図９は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図１０は、本実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【００８１】
本実施形態におけるプライマー設計装置４０は、図９に示すように、塩基配列記憶手段４１、増幅対象生物選択手段４２、非増幅対象生物選択手段４３、プライマー候補選択手段４４、融解温度判定手段４５、及びプライマーセット記憶手段４６を備えている。
本実施形態におけるプライマー設計装置４０は、プライマー候補選択手段４４が増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列から所定の長さのフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択するとともに、融解温度判定手段４５により、フォワードプライマーとリバースプライマーの融解温度が所定の範囲内である場合に、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして用いることを決定する点で第一実施形態と異なっている。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができ、本実施形態におけるその他の各手段は、第一実施形態における同名の各手段とそれぞれ同様の処理を行うものとすることができる。また、図１０に示す本実施形態のプライマーの設計方法の各工程は、ステップ４２の内容、及び図２の条件Ａ（ステップ１３，１４）を条件Ｄ（ステップ４３〜４５）に変更した点以外は、図２におけるものと同様である。
【００８２】
プライマー候補選択手段４４は、増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列からプライマーセットの候補となる塩基配列を選択し、これを当該増幅対象生物の識別情報に対応付けて一時的に記憶する。本実施形態におけるこのプライマー候補選択手段４４は、増幅対象領域の両端付近の領域から２３ｍｅｒ〜４１ｍｅｒ程度の長さのフォワードプライマー及びリバースプライマーを選択する。
【００８３】
融解温度判定手段４５は、プライマー候補選択手段４４により選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度（Ｔｍ値）を算出し、その融解温度が７０〜７８℃であるか否かを判定することができる（ステップ４３、４４）。この判定において、融解温度が７３〜７８℃であるか否かを判定するようにすることがより好ましい。以下においても同様である。ＰＣＲにおけるアニーリング温度との関係で、プライマーの融解温度をこのような範囲にすれば、より特異性の高い増幅を実現することができる。
【００８４】
なお、融解温度判定手段４５によるフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の算出方法としては、例えばＷａｌｌａｃｅ法、ＧＣ％法、最近接塩基対法等を用いることができる。このうち、最近接塩基対法はプライマーの塩基組成、反応溶液の塩濃度、プライマーの長さや使用濃度、塩基の組成の他、塩濃度以外に隣接塩基間の熱力学エネルギー安定性を考慮するものであり、特に好ましい。以下の実施例では、この最近接塩基対法を用いて融解温度を算出している。
【００８５】
融解温度判定手段４５による判定の結果、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方の融解温度が７０〜７８℃である場合（ステップ４５のＹＥＳ）、融解温度判定手段４５は、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定する（ステップ４６）。そして、プライマーセット記憶手段４６は、この決定されたプライマーセットを記憶する。
【００８６】
融解温度判定手段４５による判定の結果、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくともいずれか一方の融解温度が７０〜７８℃でない場合（ステップ４５のＮＯ）、再度ステップ４２からの処理を繰り返す。すなわち、プライマー候補選択手段４４は、増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して、融解温度判定手段４５によりフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度を算出し、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方の融解温度が７０〜７８℃であるプライマーセットが見つかるまで、条件Ｄの処理を繰り返すことができる。
【００８７】
融解温度判定手段４５による判定は、ステップ４０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
本実施形態のプライマーの設計方法によれば、作製されるプライマーセットによる増幅の特異性を、一層向上させることが可能となる。
【００８８】
［プライマーの設計方法の第五実施形態］
次に、図１１及び図１２を参照して、本発明の第五実施形態について説明する。図１１は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図１２は、本実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【００８９】
上述したように、微生物のＤＮＡの塩基配列は、例えばＧＣ含有量が少ない菌類で２５％、多い菌類で８０％程度と非常に幅広い。このＧＣ含有量は、プライマーの融解温度に影響を与えるため、プライマーの設計にあたっては、フォワードプライマーとリバースプライマーの融解温度をできるだけ揃えることが好ましい。
さらに、マルチプレックスＰＣＲにおいては、複数の増幅対象生物間で、プライマーの融解温度を揃えることができればより好ましい。
そこで、本実施形態では、プライマーの融解温度に着目して、以下に説明する条件Ｅを行うものとしている。
【００９０】
本実施形態におけるプライマー設計装置５０は、図１１に示すように、塩基配列記憶手段５１、増幅対象生物選択手段５２、非増幅対象生物選択手段５３、プライマー候補選択手段５４、融解温度算出手段５５、温度差判定手段５６、及びプライマーセット記憶手段５７を備えている。
本実施形態におけるプライマー設計装置５０は、融解温度算出手段５５と温度差判定手段５６により、フォワードプライマーとリバースプライマーの融解温度差が所定の範囲内である場合に、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして用いることを決定する点で第一実施形態と異なっている。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができ、本実施形態におけるその他の各手段は、第一実施形態における同名の各手段とそれぞれ同様の処理を行うものとすることができる。また、図１２に示す本実施形態のプライマーの設計方法の各工程は、図２の条件Ａ（ステップ１３，１４）を、条件Ｅ（ステップ５３〜５５）に変更した点以外は、図２におけるものと同様である。
【００９１】
融解温度算出手段５５は、プライマー候補選択手段５４により選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度を算出する。
また、温度差判定手段５６は、算出された融解温度の差（融解温度の差の絶対値。以下同様。）が、５℃未満であるか否かを判定する（ステップ５３，５４）。融解温度の差が、このような範囲であれば、特異性の高い増幅が行えるためである。
【００９２】
温度差判定手段５６による判定の結果、算出された融解温度の差が、５℃未満である場合（ステップ５５のＹＥＳ）、温度差判定手段５６は、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定する（ステップ５６）。そして、プライマーセット記憶手段５７は、この決定されたプライマーセットを記憶する。
【００９３】
温度差判定手段５６による判定の結果、算出された融解温度の差が、５℃未満でない場合（ステップ５５のＮＯ）、再度ステップ５２からの処理を繰り返す。すなわち、プライマー候補選択手段５４は、増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して、融解温度算出手段５５によりフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度を算出し、温度差判定手段５６により融解温度の差が５℃未満のフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマーセットが見つかるまで、条件Ｅの処理を繰り返すことができる。
【００９４】
融解温度算出手段５５と温度差判定手段５６による判定は、ステップ５０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
本実施形態のプライマーの設計方法によれば、作製されるプライマーセットによる増幅の特異性を、一層向上させることが可能となる。
【００９５】
［プライマーの設計方法の第六実施形態］
次に、図１３及び図１４を参照して、本発明の第六実施形態について説明する。図１３は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図１４は、本実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【００９６】
本実施形態におけるプライマー設計装置６０は、図１３に示すように、塩基配列記憶手段６１、増幅対象生物選択手段６２、非増幅対象生物選択手段６３、プライマー候補選択手段６４、融解温度算出手段６５、温度差判定手段６６、十二塩基連続重複判定手段６７、及びプライマーセット記憶手段６８を備えている。
本実施形態におけるプライマー設計装置６０は、上記条件の一部、すなわち第一実施形態における条件Ａと、第五実施形態における条件Ｅを組み合わせた構成を備えており、これによって、ＰＣＲに用いるプライマーセットを決定するものである。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができ、本実施形態におけるその他の各手段は、第一実施形態における同名の各手段とそれぞれ同様の処理を行うことができる。
【００９７】
本実施形態のプライマーの設計方法は、条件Ｅを行うまでの動作（ステップ６０〜６５）については、第五実施形態における図１２の動作（ステップ５０〜５５）と同様のものとすることができる。
温度差判定手段６６による判定の結果、算出された融解温度の差が、５℃未満である場合（ステップ６５のＹＥＳ）、次に、条件Ａを第一実施形態と同様に行って（ステップ６６、６７）、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重複しない場合（ステップ６７のＮＯ）、当該プライマーセットを、作製に用いるプライマーセットとして決定する（ステップ６８）。このとき、選択されたプライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の少なくともいずれかが、このプライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列の非増幅対象領域、他の増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列、及び非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続して重複しない場合、当該プライマーセットの候補を、ＰＣＲに用いるプライマーセットとして決定することも好ましい。
【００９８】
また、十二塩基連続重複判定手段６７による判定の結果、上記以外の場合、すなわち、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列の少なくともいずれかについて、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の両方が、１２塩基以上連続で重複する場合（ステップ６７のＹＥＳ）、プライマー候補選択手段６４により増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列から再度プライマーセットの候補となる塩基配列を選択し、ステップ６２からの動作を繰り返す。このとき、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列の両方が、このプライマーセットの候補が選択された当該増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列の非増幅対象領域、他の増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列、又は非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列の少なくともいずれかと、１２塩基以上連続して重複する場合、再度プライマーセットの候補となる塩基配列を選択し直して、ステップ６２からの動作を繰り返すことも好ましい。
【００９９】
また、温度差判定手段６６による判定の結果、算出された融解温度の差が、５℃未満でない場合（ステップ６５のＮＯ）にも、再度ステップ６２からの処理を繰り返す。
これらの判定についても、ステップ６０で選択された全ての増幅対象生物について、それぞれ行うことができる。
本実施形態のプライマーの設計方法によれば、作製されるプライマーセットによる増幅の特異性を、より一層向上させることが可能となる。
【０１００】
［プライマーの設計方法の第七実施形態］
次に、図１５及び図１６を参照して、本発明の第七実施形態について説明する。図１５は、本実施形態におけるプライマー設計装置の構成を示すブロック図であり、図１６は、本実施形態のプライマーの設計方法を示すフローチャートである。
【０１０１】
本実施形態におけるプライマー設計装置７０は、図１５に示すように、塩基配列記憶手段７１、増幅対象生物選択手段７２、非増幅対象生物選択手段７３、プライマー候補選択手段７４、ＧＣ含量判定手段７５、ＧＣ配列判定手段７６、ＡＴ配列判定手段７７、融解温度判定手段７８、融解温度算出手段７９、温度差判定手段７ａ、十二塩基連続重複判定手段７ｂ、及びプライマーセット記憶手段７ｃを備えている。
本実施形態におけるプライマー設計装置７０は、このように第一実施形態〜第五実施形態における判定手段を全て備えるとともに、さらにＧＣ含量判定手段７５を備え、これらによってＰＣＲに用いるプライマーセットを決定するものである。具体的には、以下の通りであるが、その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができる。
【０１０２】
なお、本実施形態では、条件Ａ〜Ｅのすべてを満たすプライマーセットを設計する例を示しているが、その一部の条件のみを満たすプライマーセットを設計することもできる。また、図１６における各条件の判定を行う順序は、入れ替えても良い。さらに、複数の条件において同じデータを用いる場合には、後の算出処理を省略しても良い。例えば、条件Ｅの処理において、融解温度算出手段７９による融解温度の算出処理を省略し、条件Ｄの処理で融解温度判定手段７８により算出された融解温度を用い、温度差判定手段７ａによる融解温度差を算出することが可能である。
【０１０３】
ＧＣ含量判定手段７５は、入力したフォワードプライマー及びリバースプライマーの候補のＧＣ含量を算出し、含有量が５０％であるか否かを判定する。ＧＣ含量は、これらのプライマーの全塩基配列数に対するＧ及びＣの塩基配列数の割合にもとづき算出することができる。
本実施形態では、プライマー候補選択手段７４により、増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列から長さが２３〜４１ｍｅｒのフォワードプライマー及びリバースプライマーが選択されて、これらがＧＣ含量判定手段７５に入力される。なお、条件Ｄの判定を省略する場合は、プライマー候補選択手段７４により、長さが２３〜４１ｍｅｒの制限なくプライマーセットの候補が選択され、ＧＣ含量判定手段７５による上記ＧＣ含量の判定を行うことができる。
【０１０４】
本実施形態のプライマーの設計方法は、ＧＣ含量判定手段７５による判定が行われる前までの動作（ステップ７０〜７２）については、第四実施形態における図１０の動作（ステップ４０〜４２）と同様のものとすることができる。
次に、ＧＣ含量判定手段７５により、フォワードプライマー及びリバースプライマーの候補のＧＣ含量を算出し、含有量が５０％であるか否かを判定する（ステップ７３）。
【０１０５】
そして、ＧＣ含量が５０％以上の場合、条件ＢのＧＣ配列判定処理を実行し（ステップ７４）、ＧＣ含量が５０％未満の場合、条件ＣのＡＴ配列判定処理を実行し（ステップ７５）、次いで条件Ｄにおける融解温度判定処理を実行する（ステップ７６）。ここで、ステップ７４は、第二実施形態における図５の動作（ステップ２３〜２４）と同様のものとすることができ、ステップ７５は、第三実施形態における図８の動作（ステップ３３〜３４）と同様のものとすることができ、ステップ７６は、第四実施形態における図１０の動作（ステップ４３〜４５）と同様のものとすることができる。
【０１０６】
続いて、条件Ｅの融解温度差判定処理を実行し（ステップ７７）、さらに条件Ａの１２塩基連続重複判定処理を実行して（ステップ７８）、全ての条件を満たすものを、プライマーセットとして決定することができる（ステップ７９）。ここで、ステップ７７は、第五実施形態における図１２の動作（ステップ５３〜５５）と同様のものとすることができ、ステップ７５は、第一実施形態における図２の動作（ステップ１３〜１４）と同様のものとすることができる。
【０１０７】
本実施形態のプライマーの設計方法によれば、作製されるプライマーセットによる増幅の特異性を、極めて高い精度にまで向上させることが可能となっている。
【０１０８】
以上の通り、本発明のプライマーの作製方法、プライマーの使用方法、プライマーセット、ＰＣＲ用反応液、及びプライマーの設計方法によれば、作業者の経験や技能に関係なく簡単に、特異性の高いプライマーを作成することができるため、一回の試験で複数菌を検出することが可能となる。このため、検査コストを大幅に削減することが可能となる。
また、このように特異性の高いプライマーを設計できるため、特異性の検証に必要なプライマー量を削減することが可能となる。
さらに、本発明はＤＮＡを有する各種生物体の検出にも応用でき、産業の発展に寄与する有用性の高いものであると言える。
【実施例】
【０１０９】
＜実験１：「１２塩基以上連続で重ならない」に関して＞
本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづいて、「プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならない（条件Ａ）」を満たすプライマーセットを１５５個作製し、これらをそれぞれ用いてＰＣＲ法を行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した。その結果、全てのプライマーセットについて、特異的な増幅が行われ、非増幅対象領域が増幅されなかった。このうち３例について、以下の実施例１〜３に示す。
【０１１０】
また、条件Ａを満たさず、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方が非増幅対象領域と１２塩基以上重複するプライマーセットを５６個作製して、増幅対象領域がＰＣＲ法により特異的に増幅されるか否かを確認した。その結果、全てのプライマーセットについて、非特異的な増幅が行われ、非増幅対象領域が増幅されていた。このうち２例について、以下の比較例１，２に示す。
【０１１１】
（実施例１）
まず、増幅対象生物として食中毒菌である以下のビブリオ（RIMD2210050）を選択するとともに、非増幅対象生物として以下の６種類の食中毒菌を選択した。なお、Negative Cont.は対照である。
１．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
【０１１２】
これらの食中毒菌の菌株は、次の機関から分譲されたものである（以下においても同様）。
・NBRC 独立行政法人製品評価基盤機構
・TIFT 公益財団法人東洋食品研究所
・ATCC American type culture collection
・RIMD 大阪大学微生物病研究所
【０１１３】
次いで、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社製）を用いてこれらの生物の塩基配列を比較した。そして、ビブリオの塩基配列から条件Ａを満たし、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図１７の実施例１に示すビブリオ検出用の両方のプライマー（配列番号９，１０）が、上記６種類の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならないもの（条件Ａ）である。
【０１１４】
なお、図１７において、配列番号は、配列表に示される塩基配列の配列番号を示している。Ｆ／Ｒは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの区別を示しており、Ｆがフォワードプライマー、Ｒがリバースプライマーを示している。食中毒菌は、本実施形態のプライマーセットにより増幅する対象の食中毒菌の名称を表している。対象領域は、その食中毒菌における本実施形態のプライマーセットにより増幅される対象領域に存在する遺伝子の名称を示している。また、同図において、食中毒菌の増幅対象領域ごとに対応するＰＣＲ用プライマーセットの塩基配列を示している。これらの配列番号に示される塩基配列は、５’末端から３’末端方向の配列を示している。
【０１１５】
次に、設計したプライマーセットを、ライフテクノロジージャパン株式会社によって人工合成を行うことで作製した。さらに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。具体的には、以下の組成のものを作製した。
・緩衝液（10× Ex Taq buffer (20mM Mg2＋ plus)，2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP Mixture (dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)，1.6μl）
・フォワードプライマー（10ng/μl，0.4μl）
・リバースプライマー（10ng/μl，0.4μl）
・核酸合成酵素（EX Taq(5U/μl)，0.1μl）
・試料のＤＮＡ（1.0μl）
・滅菌水（14.5μl）
（全量 20μl）
ここで、試料のＤＮＡは、増幅対象生物と６種類の非増幅対象生物のＤＮＡを個別に含めて、それぞれ別個にＰＣＲを行った。
【０１１６】
次に、ｅｐグラジエントs（エッペンドルフ社製）を用いて、以下の反応条件でＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
【０１１７】
最後に、ＰＣＲ法による産物を、ＭｕｌｔｉＮＡ（登録商標、株式会社島津製作所製）を用いて、マイクロキャピラリー電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１８（ａ）に示す。
同図において、７の増幅対象生物（ビブリオ）から選択された、１〜６の非対象生物のＤＮＡと１２塩基以上連続で重ならないプライマーを含む本発明のプライマーセットによれば、ビブリオの増幅対象領域ｔｄｈ（３８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。なお、同図の縦軸にはｂｐの対数目盛りが示されているが、比較的大きな誤差があり、バンドの大凡の位置を確認することはできるが、厳密な値を示すものではない。また、電気泳動の結果を示す図において、プライマーやそのダイマーによるバンドが現れている場合があるが、これらは増幅によるものではない。以下においても同様である。
【０１１８】
（実施例２）
増幅対象生物として食中毒菌である以下の大腸菌（NBRC102203）を選択するとともに、非増幅対象生物として以下の６種類の食中毒菌を選択した。
１．Negative Cont.
２．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
３．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
４．増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
５．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
６．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
７．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
８．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
【０１１９】
次いで、実施例１と同様に、これらの生物の塩基配列を比較して、大腸菌の塩基配列から条件Ａを満たし、増幅対象領域ｐｙｒＨ（ウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子，１５７ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図１７の実施例２に示す大腸菌検出用の両方のプライマー（配列番号１１，１２）が、上記６種類の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならないものである。
【０１２０】
次に、実施例１と同様に、本実施例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。さらに、実施例１と同様にＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行い、その増幅産物を、ＭｕｌｔｉＮＡにより、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１８（ｂ）に示す。
同図において、４の増幅対象生物（大腸菌）から選択された、２，３，及び５〜８の非対象生物のＤＮＡと１２塩基以上連続で重ならないプライマーを含む本発明のプライマーセットによれば、大腸菌の増幅対象領域ｐｙｒＨ（１５７ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１２１】
（実施例３）
実施例２に示した７種類の菌株のうち、増幅対象生物として食中毒菌であるサルモネラ（ATCC9270）を選択するとともに、非増幅対象生物として残りの６種類の食中毒菌を選択し、以下のように８を対照とした。
１．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
【０１２２】
次いで、実施例１と同様に、これらの生物の塩基配列を比較して、サルモネラの塩基配列から条件Ａを満たし、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図１７の実施例３に示すサルモネラ検出用の両方のプライマー（配列番号１３，１４）が、上記６種類の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならないものである。
【０１２３】
次に、実施例１と同様に、本実施例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。さらに、実施例１と同様にＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行い、その増幅産物をＭｕｌｔｉＮＡによりそれぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１８（ｃ）に示す。
同図において、５の増幅対象生物（サルモネラ）から選択された、１〜４，及び６，７の非対象生物のＤＮＡと１２塩基以上連続で重ならないプライマーを含む本発明のプライマーセットによれば、サルモネラの増幅対象領域ｉｎｖＡ（１８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１２４】
（比較例１）
増幅対象生物として食中毒菌である以下の大腸菌（NBRC102203）を選択するとともに、非増幅対象生物として以下の６種類の食中毒菌を選択した。
１．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
【０１２５】
次いで、これらの生物の塩基配列を比較して、大腸菌の塩基配列から条件Ａを満さない、増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショック遺伝子）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図１７の比較例１に示す大腸菌検出用のフォワードプライマー（配列番号１５）及びリバースプライマー（配列番号１６）の両方が、上記６種類の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なっている。
【０１２６】
次に、実施例１と同様に、本比較例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。さらに、実施例１と同様にＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行い、その増幅産物をＭｕｌｔｉＮＡによりそれぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１９（ａ）に示す。
同図において、３の増幅対象生物（大腸菌）から選択された、条件Ａを満たさないプライマーセットによれば、１，５，６の非増幅対象生物についても、増幅が行われていることがわかる。
【０１２７】
（比較例２）
比較例１に示した７種類の菌株のうち、増幅対象生物として食中毒菌であるサルモネラ（ATCC9270）を選択するとともに、非増幅対象生物として残りの６種類の食中毒菌を選択した。
【０１２８】
次いで、これらの生物の塩基配列を比較して、サルモネラの塩基配列から条件Ａを満さない、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図１７の比較例２に示すサルモネラ検出用のフォワードプライマー（配列番号１７）及びリバースプライマー（配列番号１８）の両方が、上記１〜４，６，７の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なっている。
【０１２９】
次に、実施例１と同様に、本比較例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。さらに、実施例１と同様にＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行い、その増幅産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１９（ｂ）に示す。
同図において、５の増幅対象生物（サルモネラ）から選択された、条件Ａを満たさないプライマーセットによれば、上記１及び３の非増幅対象生物についても、増幅を行っていることがわかる。
以上の通り、プライマーセットが（条件Ａ）を満足する場合、ＰＣＲ法によって増幅が特異的に行われることが確認された。
【０１３０】
＜実験２：フォワードプライマーとリバースプライマーの融解温度の差に関して＞
本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづいて、各種食中毒菌について、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度（Ｔｍ値）の差が５℃未満（条件Ｅ）」を満たすプライマーセットを作製し、これを用いてＰＣＲ法を行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した（実施例４〜１１）。
また、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上かつ１０℃未満になるプライマーセットと、１０℃以上になるプライマーセットを作製し、これを用いてＰＣＲ法を行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した（比較例３〜１８）。
【０１３１】
（１）セレウス（対象領域：ｃｅｓＢ）検出用プライマー
（実施例４）
増幅対象生物として食中毒菌である以下のセレウス（TIFT114011）を選択するとともに、非増幅対象生物として以下に示す６種類の食中毒菌を選択した。
１．増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
【０１３２】
次いで、セレウスの塩基配列から上記条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｃｅｓＢ（セレウリド合成酵素遺伝子，２３８ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図２０の実施例４に示すセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号１９）及びリバースプライマー（配列番号２０）を設計した。これらの融解温度の差は、３．３３℃となっている。
【０１３３】
次に、実施例１と同様に、本実施例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。
そして、以下の反応条件でＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
なお、上記アニーリング温度は、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度に設定した。これは、実験２における以下の実施例及び比較例についても同様である。
【０１３４】
そして、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図２４に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、セレウスの増幅対象領域ｃｅｓＢ（２３８ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１３５】
（比較例３）
実施例４と同様に、増幅対象生物として食中毒菌であるセレウスを選択するとともに、非増幅対象生物として６種類の食中毒菌を選択した。
次いで、セレウスの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｃｅｓＢ（セレウリド合成酵素遺伝子，２３８ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図２０の比較例３に示すセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号１９）及びリバースプライマー（配列番号２１）を設計した。これらの融解温度の差は、６．１２℃となっている。
【０１３６】
次に、実施例４と同様に、本比較例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。
そして、以下の反応条件でＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６５℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
【０１３７】
そして、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図２４に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、セレウスの非増幅対象領域、及び非増幅対象生物の黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１３８】
（比較例４）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６０℃とした点以外は、比較例３と同様にして、実験を行った。図２０に示すように、比較例４のセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号１９）及びリバースプライマー（配列番号２２）の融解温度の差は、１１．２９℃である。その結果を図２４に示す。
同図において、本比較例のプライマーセットによっては、非増幅対象領域は増幅されておらず、非特異的増幅は行われていない。
【０１３９】
（２）セレウス（対象領域：ｎｈｅ）検出用プライマー
（実施例５）
セレウスの塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｎｈｅ（溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子，１９５ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２０に示すように、実施例５のセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号２３）及びリバースプライマー（配列番号２４）の融解温度の差は、０．３１℃となっている。その結果を図２４に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１４０】
（比較例５）
セレウスの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｎｈｅを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６２℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２０に示すように、比較例５のセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号２５）及びリバースプライマー（配列番号２４）の融解温度の差は、７．４７℃となっている。その結果を図２４に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、セレウスの非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１４１】
（比較例６）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃とした点以外は、比較例５と同様にして、実験を行った。図２０に示すように、比較例６のセレウス検出用のフォワードプライマー（配列番号２６）及びリバースプライマー（配列番号２４）の融解温度の差は、１１．０２℃となっている。その結果を図２４に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のカンピロバクター及び大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１４２】
（３）カンピロバクター検出用プライマー
（実施例６）
増幅対象生物として実施例４に示したカンピロバクターを選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（リボソーム遺伝子，２６３ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２１に示すように、実施例６のカンピロバクター検出用のフォワードプライマー（配列番号２７）及びリバースプライマー（配列番号２８）の融解温度の差は、１．９８℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、カンピロバクターの増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（２６３ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１４３】
（比較例７）
カンピロバクターの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２１に示すように、比較例７のカンピロバクター検出用のフォワードプライマー（配列番号２９）及びリバースプライマー（配列番号２８）の融解温度の差は、５．６℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、カンピロバクターの非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１４４】
（比較例８）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃とした点以外は、比較例７と同様にして実験を行った。図２１に示すように、比較例８のカンピロバクター検出用のフォワードプライマー（配列番号３０）及びリバースプライマー（配列番号２８）の融解温度の差は、１０．８２℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、カンピロバクターの非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１４５】
（４）大腸菌検出用プライマー
（実施例７）
増幅対象生物として実施例４に示した大腸菌を選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｐｙｒＨ（ウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子，１５７ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を７２℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２１に示すように、実施例７の大腸菌検出用のフォワードプライマー（配列番号３１）及びリバースプライマー（配列番号３２）の融解温度の差は、３．４３℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、大腸菌の増幅対象領域ｐｙｒＨ（１５７ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１４６】
（比較例９）
大腸菌の塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｐｙｒＨを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６７℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２１に示すように、比較例９の大腸菌検出用のフォワードプライマー（配列番号３３）及びリバースプライマー（配列番号３２）の融解温度の差は、７．８９℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のセレウス、カンピロバクター、リステリア、サルモネラ、及び黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１４７】
（比較例１０）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６４℃とした点以外は、比較例９と同様にして実験を行った。図２１に示すように、比較例１０の大腸菌検出用のフォワードプライマー（配列番号３４）及びリバースプライマー（配列番号３２）の融解温度の差は、１１．７９℃となっている。その結果を図２５に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、カンピロバクター、リステリア、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、及びビブリオにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１４８】
（５）リステリア検出用プライマー
（実施例８）
増幅対象生物として実施例４に示したリステリアを選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｄｎａＪ （ヒートショックタンパク遺伝子，１７６ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を７０℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２２に示すように、実施例８のリステリア検出用のフォワードプライマー（配列番号３５）及びリバースプライマー（配列番号３６）の融解温度の差は、１．３３℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、リステリアの増幅対象領域ｄｎａＪ（１７６ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１４９】
（比較例１１）
リステリアの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｄｎａＪを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２２に示すように、比較例１１のリステリア検出用のフォワードプライマー（配列番号３５）及びリバースプライマー（配列番号３７）の融解温度の差は、６．９７℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のカンピロバクター、大腸菌、サルモネラ、及びビブリオにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１５０】
（比較例１２）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６０℃とした点以外は、比較例１１と同様にして実験を行った。図２２に示すように、比較例１２のリステリア検出用のフォワードプライマー（配列番号３５）及びリバースプライマー（配列番号３８）の融解温度の差は、１０．２７℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のサルモネラ、及びビブリオにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１５１】
（６）サルモネラ検出用プライマー
（実施例９）
増幅対象生物として実施例４に示したサルモネラを選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２２に示すように、実施例９のサルモネラ検出用のフォワードプライマー（配列番号３９）及びリバースプライマー（配列番号４０）の融解温度の差は、１．３３℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、サルモネラの増幅対象領域ｉｎｖＡ（１８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１５２】
（比較例１３）
サルモネラの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｉｎｖＡを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２２に示すように、比較例１３のサルモネラ検出用のフォワードプライマー（配列番号４１）及びリバースプライマー（配列番号４０）の融解温度の差は、５．６１℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、サルモネラの非増幅対象領域、並びに非増幅対象生物のセレウス、大腸菌、黄色ブドウ球菌、及びビブリオにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１５３】
（比較例１４）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を
５８℃とした点以外は、比較例１３と同様にして実験を行った。図２２に示すように、比較例１４のサルモネラ検出用のフォワードプライマー（配列番号４２）及びリバースプライマー（配列番号４０）の融解温度の差は、１０．７１℃となっている。その結果を図２６に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物の大腸菌、及びリステリアにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１５４】
（７）黄色ブドウ球菌検出用プライマー
（実施例１０）
増幅対象生物として実施例４に示した黄色ブドウ球菌を選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショックタンパク遺伝子，２３６ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２３に示すように、実施例１０の黄色ブドウ球菌検出用のフォワードプライマー（配列番号４３）及びリバースプライマー（配列番号４４）の融解温度の差は、４．１２℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１５５】
（比較例１５）
黄色ブドウ球菌の塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｄｎａＪを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６６℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２３に示すように、比較例１５の黄色ブドウ球菌検出用のフォワードプライマー（配列番号４３）及びリバースプライマー（配列番号４５）の融解温度の差は、６．２℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本比較例のプライマーセットによっては、非増幅対象領域は増幅されておらず、非特異的増幅は行われていない。
【０１５６】
（比較例１６）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を
６２℃とした点以外は、比較例１５と同様にして実験を行った。図２３に示すように、比較例１６の黄色ブドウ球菌検出用のフォワードプライマー（配列番号４３）及びリバースプライマー（配列番号４６）の融解温度の差は、１１．５５℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物の大腸菌、サルモネラ、及びビブリオにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１５７】
（８）ビブリオ検出用プライマー
（実施例１１）
増幅対象生物として実施例４に示したビブリオを選択し、その塩基配列から条件Ｅを満たす、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、実施例４と同様にして実験を行った。図２３に示すように、実施例１１のビブリオ検出用のフォワードプライマー（配列番号４７）及びリバースプライマー（配列番号４８）の融解温度の差は、３．７℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本実施例の条件Ｅを満たす、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満のプライマーセットによれば、ビブリオの増幅対象領域ｔｄｈ（３８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１５８】
（比較例１７）
ビブリオの塩基配列から条件Ｅを満たさない、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃以上１０℃未満である、増幅対象領域ｔｄｈを増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６０℃とした点以外は、比較例３と同様にして実験を行った。図２３に示すように、比較例１７のビブリオ検出用のフォワードプライマー（配列番号４７）及びリバースプライマー（配列番号４９）の融解温度の差は、８．４３℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のサルモネラにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１５９】
（比較例１８）
フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が１０℃以上であるプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を５５℃とした点以外は、比較例１７と同様にして実験を行った。図２３に示すように、比較例１８のビブリオ検出用のフォワードプライマー（配列番号４７）及びリバースプライマー（配列番号５０）の融解温度の差は、１３．９１℃となっている。その結果を図２７に示す。
同図において、本比較例の条件Ｅを満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のセレウス、リステリア、サルモネラ、及び黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１６０】
＜実験３：プライマーの長さに関して＞
本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづいて、各種食中毒菌について、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たすプライマーセットを作製し、これを用いてＰＣＲ法を行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した（参考例１，実施例１２）。なお、参考例１と実施例１２のプライマーセットは、条件Ｄを満たしている。
また、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさないプライマーセットを作製し、これを用いてＰＣＲ法を行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した（比較例１９〜２１）。
【０１６１】
（参考例１）Ｆプライマー：４１ｍｅｒ，Ｒプライマー：２３ｍｅｒ
増幅対象生物として以下のサルモネラ（ATCC9270）を選択するとともに、非増幅対象生物として、以下の１０種類の食中毒菌を選択した。
１．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus NBRC 15305）
２．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
３．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter coli ATCC 43478）
４．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
５．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
６．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
７．増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
８．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
９．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
１０．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802）
１１．非増幅対象生物 エルシニア（Yersinia enterocolitica ATCC 9610）
１２．Negative Cont.
【０１６２】
次いで、サルモネラの塩基配列から「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」である、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。
具体的には、図２８の参考例１に示すサルモネラ検出用のフォワードプライマー（配列番号５１，４１ｍｅｒ）及びリバースプライマー（配列番号５２，２３ｍｅｒ）のプライマーセットを設計した。
【０１６３】
次に、実施例１と同様に、本実施例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。
そして、以下の反応条件でＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６９℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
なお、上記アニーリング温度は、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度に設定した。これは、実験３における以下の実施例及び比較例についても同様である。
【０１６４】
そして、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図２９（ａ）に示す。
同図において、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」のプライマーセットによれば、サルモネラの増幅対象領域ｉｎｖＡ（１８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。
【０１６５】
（実施例１２）Ｆプライマー：４１ｍｅｒ，Ｒプライマー：３４ｍｅｒ
増幅対象生物として参考例１における供試菌株９のビブリオを選択し、その塩基配列から「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たす、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点、及びＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃とした点以外は、参考例１と同様にして実験を行った。本実施例のプライマーセットは、図２８に示すように、フォワードプライマー（配列番号５３，４１ｍｅｒ）及びリバースプライマー（配列番号５４，３４ｍｅｒ）からなっている。実験結果を図２９（ｂ）に示す。
同図において、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たすプライマーセットによれば、ビブリオの増幅対象領域ｔｄｈ（３８０ｂｐ）のみが特異的に増幅され、非増幅対象領域については、増幅が行われていないことがわかる。なお、供試菌株１０のビブリオ（ATCC 17802）は、増幅対象領域ｔｄｈを有していない。
【０１６６】
（比較例１９）Ｆプライマー：２２ｍｅｒ，Ｒプライマー：３４ｍｅｒ
増幅対象生物として以下のビブリオを選択するとともに、非増幅対象生物として、以下に示す６種類の食中毒菌を選択した。
１．非増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter coli ATCC 43478）
３．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
【０１６７】
増幅対象生物のビブリオの塩基配列から「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさない、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。また、ＰＣＲにおけるアニーリング温度を４８℃とした。その他の点は、参考例１と同様にして実験を行った。本実施例のプライマーセットは、図２８に示すように、フォワードプライマー（配列番号５５，２２ｍｅｒ）及びリバースプライマー（配列番号５６，３４ｍｅｒ）からなっている。実験結果を図３０（ａ）に示す。
同図において、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のセレウス、大腸菌、リステリア、サルモネラ、及び黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１６８】
（比較例２０）Ｆプライマー：３４ｍｅｒ，Ｒプライマー：２２ｍｅｒ
増幅対象生物として比較例１９に示すビブリオを選択し、そのＤＮＡの塩基配列から「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさない、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。また、ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５５℃とした。その他の点は、参考例１と同様にして実験を行った。本実施例のプライマーセットは、図２８に示すように、フォワードプライマー（配列番号５７，３４ｍｅｒ）及びリバースプライマー（配列番号５８，２２ｍｅｒ）からなっている。実験結果を図３０（ｂ）に示す。
同図において、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさないプライマーセットによれば、非増幅対象生物のセレウス、カンピロバクター、サルモネラ、及び黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１６９】
（比較例２１）Ｆプライマー：４２ｍｅｒ，Ｒプライマー：２３ｍｅｒ
増幅対象生物として比較例１９における供試菌株５のサルモネラを選択し、増幅対象生物のサルモネラの塩基配列から「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさない、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。また、ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６９℃とした。その他の点は、参考例１と同様にして実験を行った。本実施例のプライマーセットは、図２８に示すように、フォワードプライマー（配列番号５９，４２ｍｅｒ）及びリバースプライマー（配列番号６０，２３ｍｅｒ）からなっている。実験結果を図３０（ｃ）に示す。
同図において、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たさないプライマーセットによれば、全ての非増幅対象生物における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１７０】
以上の結果から、「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒ」を満たすプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことで、増幅対象領域の増幅の特異性が向上することがわかる。
【０１７１】
＜実験４：アニーリング温度とプライマーの融解温度との関係に関して＞
本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづき作製したプライマーセットを用いて、種々のアニーリング温度によりＰＣＲを行うことで、プライマーセットにおけるプライマーの融解温度とアニーリング温度との関係について検討した。
具体的には、各種食中毒菌について、アニーリング温度を、プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度のうち、低い方の温度よりも所定の範囲で低くしてＰＣＲを行うことにより、増幅対象領域が特異的に増幅されるか否かを確認した（参考例２〜２５，実施例１３〜２８）。
【０１７２】
（１）セレウス（ｃｅｓＢ）検出用プライマー
（参考例２）アニーリング温度：融解温度（Ｔｍ値）−２０℃
増幅対象生物として以下のセレウスを選択するとともに、非増幅対象生物として、以下の６種類の食中毒菌を選択した。
１．増幅対象生物 セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．非増幅対象生物 カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．非増幅対象生物 大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．非増幅対象生物 リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．非増幅対象生物 サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．非増幅対象生物 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．非増幅対象生物 ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
８．Negative Cont.
【０１７３】
次いで、実施例１と同様に、これらの生物の塩基配列を比較して、セレウスの塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｃｅｓＢ（セレウリド合成酵素遺伝子，２３８ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した。このプライマーセットは、図３１の参考例２に示すように、フォワードプライマー（配列番号１９）及びリバースプライマー（配列番号２０）からなっている。参考例３，４、及び実施例１３，１４においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。
【０１７４】
次に、実施例１と同様に、本参考例において設計したプライマーセットを作製するとともに、このプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製した。
そして、以下の反応条件でＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）５３℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
本参考例では、上記アニーリング温度として、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から２０℃低い温度（Ｔｍ−２０℃）を設定した。
【０１７５】
そして、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図３５に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｃｅｓＢ（２３８ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１７６】
（参考例３）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。その結果を図３５に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウス及びカンピロバクターにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１７７】
（参考例４）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。その結果を図３５に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｃｅｓＢ（２３８ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１７８】
（実施例１３）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。その結果を図３５に示す。
同図において、本実施例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｃｅｓＢ（２３８ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１７９】
（実施例１４）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。その結果を図３５に示す。
同図において、本実施例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｃｅｓＢ（２３８ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１８０】
（２）セレウス（ｎｈｅ）検出用プライマー
（参考例５）アニーリング温度：融解温度−２０℃
セレウスの塩基配列から増幅対象領域ｎｈｅ（溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子，１９５ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３１の参考例５に示すように、フォワードプライマー（配列番号２３）及びリバースプライマー（配列番号２４）からなっている。参考例６，７、及び実施例１５，１６においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。アニーリング温度は５３℃とした。その結果を図３６に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１８１】
（参考例６）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例５と同様にして実験を行った。その結果を図３６に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１８２】
（参考例７）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例５と同様にして実験を行った。その結果を図３６に示す。
同図において、本参考例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１８３】
（実施例１５）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例５と同様にして実験を行った。その結果を図３６に示す。
同図において、本実施例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１８４】
（実施例１６）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例５と同様にして実験を行った。その結果を図３６に示す。
同図において、本実施例におけるセレウス検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスの増幅対象領域ｎｈｅ（１９５ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１８５】
（３）カンピロバクター検出用プライマー
（参考例８）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として参考例２における供試菌株２のカンピロバクターを選択し、カンピロバクターの塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（リボソーム遺伝子，２６３ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３２の参考例８に示すように、フォワードプライマー（配列番号２７）及びリバースプライマー（配列番号２８）からなっている。アニーリング温度は５３℃とした。参考例９，１０、及び実施例１７，１８においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。その結果を図３７に示す。
同図において、本参考例におけるカンピロバクター検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、カンピロバクターにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。なお、同図の点線囲み内における下側のバンドが非特異的増幅を示し、上側のバンドは検出対象のものである。以下の参考例９，１０においても同様である。
【０１８６】
（参考例９）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例８と同様にして実験を行った。その結果を図３７に示す。
同図において、本参考例におけるカンピロバクター検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、カンピロバクターにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１８７】
（参考例１０）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例８と同様にして実験を行った。その結果を図３７に示す。
同図において、本参考例におけるカンピロバクター検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、カンピロバクターにおける非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１８８】
（実施例１７）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例８と同様にして実験を行った。その結果を図３７に示す。
同図において、本実施例におけるカンピロバクター検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、カンピロバクターの増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（２６３ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１８９】
（実施例１８）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７２℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例８と同様にして実験を行った。その結果を図３７に示す。
同図において、本実施例におけるカンピロバクター検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、カンピロバクターの増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（２６３ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１９０】
（４）大腸菌検出用プライマー
（参考例１１）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として食中毒菌である大腸菌を選択し、大腸菌の塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｐｙｒＨ（ウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子，１５７ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計し、アニーリング温度を５７℃とした点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３２の参考例１１に示すように、フォワードプライマー（配列番号３１）及びリバースプライマー（配列番号３２）からなっている。参考例１２，１３、及び実施例１９，２０においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。その結果を図３８に示す。
同図において、本参考例における大腸菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１９１】
（参考例１２）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６２℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例１１と同様にして実験を行った。その結果を図３８に示す。
同図において、本参考例における大腸菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１９２】
（参考例１３）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６７℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例１１と同様にして実験を行った。その結果を図３８に示す。
同図において、本参考例における大腸菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌の増幅対象領域ｐｙｒＨ（１５７ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１９３】
（実施例１９）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７２℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例１１と同様にして実験を行った。その結果を図３８に示す。
同図において、本実施例における大腸菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌の増幅対象領域ｐｙｒＨ（１５７ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１９４】
（実施例２０）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７７℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例１１と同様にして実験を行った。その結果を図３８に示す。
同図において、本実施例における大腸菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌の増幅対象領域ｐｙｒＨ（１５７ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１９５】
（５）リステリア検出用プライマー
（参考例１４）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として参考例２における供試菌株４のリステリアを選択し、リステリアの塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショックタンパク遺伝子，１７６ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計し、アニーリング温度を５４℃とした点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３３の参考例１４に示すように、フォワードプライマー（配列番号３５）及びリバースプライマー（配列番号３６）からなっている。参考例１５，１６、及び実施例２１，２２においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。その結果を図３９に示す。
同図において、本参考例におけるリステリア検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０１９６】
（参考例１５）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５９℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例１４と同様にして実験を行った。その結果を図３９に示す。
同図において、本参考例におけるリステリア検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、リステリアの増幅対象領域ｄｎａＪ（１７６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１９７】
（参考例１６）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６４℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例１４と同様にして実験を行った。その結果を図３９に示す。
同図において、本参考例におけるリステリア検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、リステリアの増幅対象領域ｄｎａＪ（１７６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１９８】
（実施例２１）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６９℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例１４と同様にして実験を行った。その結果を図３９に示す。
同図において、本実施例におけるリステリア検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、リステリアの増幅対象領域ｄｎａＪ（１７６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０１９９】
（実施例２２）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７４℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例１４と同様にして実験を行った。その結果を図３９に示す。
同図において、本実施例におけるリステリア検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、リステリアの増幅対象領域ｄｎａＪ（１７６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２００】
（６）サルモネラ検出用プライマー
（参考例１７）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として参考例２における供試菌株５のサルモネラを選択し、サルモネラの塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３３の参考例１７に示すように、フォワードプライマー（配列番号３９）及びリバースプライマー（配列番号４０）からなっている。参考例１８，１９、及び実施例２３，２４においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。アニーリング温度は５３℃とした。その結果を図４０に示す。
同図において、本参考例におけるサルモネラ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０２０１】
（参考例１８）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例１７と同様にして実験を行った。その結果を図４０に示す。
同図において、本参考例におけるサルモネラ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、大腸菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０２０２】
（参考例１９）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例１７と同様にして実験を行った。その結果を図４０に示す。
同図において、本参考例におけるサルモネラ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、サルモネラ及び黄色ブドウ球菌における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０２０３】
（実施例２３）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例１７と同様にして実験を行った。その結果を図４０に示す。
同図において、本実施例におけるサルモネラ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、サルモネラの増幅対象領域ｉｎｖＡ（１８０ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２０４】
（実施例２４）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例１７と同様にして実験を行った。その結果を図４０に示す。
同図において、本実施例におけるサルモネラ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、サルモネラの増幅対象領域ｉｎｖＡ（１８０ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２０５】
（７）黄色ブドウ球菌検出用プライマー
（参考例２０）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として参考例１における供試菌株６の黄色ブドウ球菌を選択し、黄色ブドウ球菌の塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショックタンパク遺伝子，２３６ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３４の参考例２０に示すように、フォワードプライマー（配列番号４３）及びリバースプライマー（配列番号４４）からなっている。参考例２１，２２、及び実施例２５，２６においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。アニーリング温度は５３℃とした。その結果を図４１に示す。
同図において、本参考例における黄色ブドウ球菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２０６】
（参考例２１）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例２０と同様にして実験を行った。その結果を図４１に示す。
同図において、本参考例における黄色ブドウ球菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２０７】
（参考例２２）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例２０と同様にして実験を行った。その結果を図４１に示す。
同図において、本参考例における黄色ブドウ球菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２０８】
（実施例２５）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例２０と同様にして実験を行った。その結果を図４１に示す。
同図において、本実施例における黄色ブドウ球菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２０９】
（実施例２６）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例２０と同様にして実験を行った。その結果を図４１に示す。
同図において、本実施例における黄色ブドウ球菌検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、黄色ブドウ球菌の増幅対象領域ｄｎａＪ（２３６ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２１０】
（８）ビブリオ検出用プライマー
（参考例２３）アニーリング温度：融解温度−２０℃
増幅対象生物として参考例２における供試菌株７のビブリオを選択し、ビブリオの塩基配列から条件Ａを満たす、増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセットを設計した点以外は、参考例２と同様にして実験を行った。このプライマーセットは、図３４の参考例２３に示すように、フォワードプライマー（配列番号４７）及びリバースプライマー（配列番号４８）からなっている。参考例２４，２５、及び実施例２７，２８においてもこのプライマーセットを使用して、実験を行った。アニーリング温度は５３℃とした。その結果を図４２に示す。
同図において、本参考例におけるビブリオ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−２０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、全ての非増幅対象生物における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０２１１】
（参考例２４）アニーリング温度：融解温度−１５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を５８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１５℃低い温度（Ｔｍ−１５℃）に設定した点以外は、参考例２３と同様にして実験を行った。その結果を図４２に示す。
同図において、本参考例におけるビブリオ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、全ての非増幅対象生物における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０２１２】
（参考例２５）アニーリング温度：融解温度−１０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６３℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から１０℃低い温度（Ｔｍ−１０℃）に設定した点以外は、参考例２３と同様にして実験を行った。その結果を図４２に示す。
同図において、本参考例におけるビブリオ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−１０℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、セレウスを除く全ての非増幅対象生物における非増幅対象領域が増幅されており、非特異的増幅が行われていることがわかる。
【０２１３】
（実施例２７）アニーリング温度：融解温度−５℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を６８℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から５℃低い温度（Ｔｍ−５℃）に設定した点以外は、参考例２３と同様にして実験を行った。その結果を図４２に示す。
同図において、本実施例におけるビブリオ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度−５℃をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、ビブリオの増幅対象領域ｔｄｈ（３８０ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２１４】
（実施例２８）アニーリング温度：融解温度−０℃
ＰＣＲにおけるアニーリング温度を７２℃、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度（Ｔｍ−０℃）に設定した点以外は、参考例２３と同様にして実験を行った。その結果を図４２に示す。
同図において、本実施例におけるビブリオ検出用プライマーを用いて、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度をアニーリング温度としてＰＣＲを行った場合、ビブリオの増幅対象領域ｔｄｈ（３８０ｂｐ）のみが増幅されており、非増幅対象領域の増幅は、行われていなかった。
【０２１５】
以上の結果から、アニーリング温度を、フォワードプライマー又はリバースプライマーの融解温度の小さい方の温度から０〜５℃低い温度に設定して、ＰＣＲを行うことで、増幅対象領域の増幅の特異性が向上することがわかる。
【０２１６】
＜実験５：本発明におけるマルチプレックスＰＣＲ法における単独菌での増幅試験に関して＞
本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづき作製したプライマーセットを複数同時に用いるとともに、増幅対象生物を単独として、その増幅対象領域を特異的に増幅できるかを検証した。
【０２１７】
（実施例２９）
まず、本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづいて、図４３に示すプライマーセットを設計した。すなわち、配列番号６１のフォワードプライマー及び配列番号６２のリバースプライマーとからなる、セレウスにおける増幅対象領域ｎｈｅ（溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子，１９５ｂｐ）を増幅するプライマーセット１、配列番号６３のフォワードプライマー及び配列番号６４のリバースプライマーとからなる、セレウスにおける増幅対象領域ｃｅｓＢ（セレウリド合成酵素遺伝子，２３８ｂｐ）を増幅するプライマーセット２、配列番号６５のフォワードプライマー及び配列番号６６のリバースプライマーとからなる、カンピロバクターにおける増幅対象領域１６Ｓ ｒＤＮＡ（リボソーム遺伝子，２６３ｂｐ）を増幅するプライマーセット３、配列番号６７のフォワードプライマー及び配列番号６８のリバースプライマーとからなる、大腸菌における増幅対象領域ｐｙｒＨ（ウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子，１５７ｂｐ）を増幅するプライマーセット４、配列番号６９のフォワードプライマー及び配列番号７０のリバースプライマーとからなる、リステリアにおける増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショックタンパク遺伝子，１７６ｂｐ）を増幅するプライマーセット５、配列番号７１のフォワードプライマー及び配列番号７２のリバースプライマーとからなる、サルモネラにおける増幅対象領域ｉｎｖＡ（侵入性因子関連遺伝子，１８０ｂｐ）を増幅するプライマーセット６、配列番号７３のフォワードプライマー及び配列番号７４のリバースプライマーとからなる、黄色ブドウ球菌における増幅対象領域ｄｎａＪ（ヒートショックタンパク遺伝子，２３６ｂｐ）を増幅するプライマーセット７、配列番号７５のフォワードプライマー及び配列番号７６のリバースプライマーとからなる、ビブリオにおける増幅対象領域ｔｄｈ（耐熱性溶血毒素遺伝子，３８０ｂｐ）を増幅するプライマーセット８を設計した。また、図４３において、これらのプライマーセットを用いた場合の各増幅産物の理論上の塩基配列の長さを示している。
【０２１８】
これらのプライマーセットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方が、当該対象生物の非増幅対象領域や他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならない。また、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方が、３’末端側半分において、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備える配列を有する、あるいは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方が、それぞれのプライマーの配列の中心から３’末端側及び５’末端側の両方向に向かってプライマーの全長の四分の１の範囲を含む領域に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備える配列を有している。また、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度（Ｔｍ値）の差が５℃未満である。さらに、フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒであり、かつ融解温度が７３〜７８℃となっている。
【０２１９】
また、上記プライマーセット１〜８の設計にあたり、それぞれ順に対応する番号の以下の食中毒菌を増幅対象生物にすると共に、他の食中毒菌を非増幅対象生物として使用した。
１．セレウス（Bacillus cereus NBRC 15305）
２．セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
３．カンピロバクター（Campylobacter coli ATCC 43478）
４．大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
５．リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
６．サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
７．黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
８．ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210050）
【０２２０】
次に、実施例１と同様に、設計したプライマーセットを、ライフテクノロジージャパン株式会社によって人工合成を行うことで作製した。
次に、ＰＣＲ用反応液として、上記プライマーセット１〜８を全て含有させ、以下の組成のものを作製した。
・緩衝液 10×Ex Taq buffer（20mM Mg 2＋ plus） 2.0μl
・核酸合成基質 dNTP Mixture（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM） 1.6μl
・ビブリオ検出用primer R（10ng/μl、final conc.4ng） 0.4μl
・ビブリオ検出用primer F（10ng/μl、final conc.4ng） 0.4μl
・その他のprimer R（10ng/μl、final conc.2ng） 0.2μl×7
・その他のprimer F（10ng/μl、final conc.2ng） 0.2μl×7
・核酸合成酵素 EX Taq（5U/μl） 0.1μl
・試料のＤＮＡ 1.0μl
・滅菌水 11.7μl
（全量 20μl）
【０２２１】
また、試料のＤＮＡは、次の１〜７に示す食中毒菌のＤＮＡをそれぞれ別個に含有させ、個別にＰＣＲを行った。
１．セレウス（Bacillus cereus TIFT 114011）
２．カンピロバクター（Campylobacter jejuni ATCC 33560）
３．大腸菌（Escherichia coli NBRC 102203）
４．リステリア（Listeria monocytogenes ATCC 15313）
５．サルモネラ（Salmonella enterica ATCC 9270）
６．黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus NBRC 100910）
７．ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus GTC 2055）
なお、ビブリオは、次の機関から分譲されたものである。
・GTC 岐阜大学大学院医学系研究科病原体制御分野
【０２２２】
ＰＣＲ法による遺伝子の増幅は、ｅｐグラジエントｓ（エッペンドルフ株式会社製）を使用して、以下の条件で行った。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
【０２２３】
次に、実施例１と同様に、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により、それぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図４４に示す。
同図において、各試料の生物ごとに、それぞれ以下のピークが示されている。
１．セレウス １９８ｂｐ及び２５２ｂｐ
２．カンピロバクター ２７０ｂｐ
３．大腸菌 １５８ｂｐ
４．リステリア １９５ｂｐ
５．サルモネラ １７７ｂｐ
６．黄色ブドウ球菌 ２３８ｂｐ
７．ビブリオ ３９０ｂｐ
【０２２４】
ここで、ＰＣＲによる増幅産物を電気泳動した場合、ＭｕｌｔｉＮＡ(株式会社島津製作所製)に用いる試薬などの影響から、理論上の増幅産物の塩基配列と完全には一致せず、近似する値の結果が得られる。
図４４に示す結果は、それぞれの理論上の増幅産物の塩基配列の長さに近似するものであり、それぞれ対象とする食中毒菌の増幅対象領域が増幅されていると考えられる。
【０２２５】
このように、本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづき作製したプライマーセットを複数同時に用いた場合でも、それぞれ対象とする食中毒菌の増幅対象領域をそれぞれ個別に特異的に増幅できることが明らかとなった。
なお、リステリアの増幅産物は１９５ｂｐとなっており、理論上の増幅産物１７６ｂｐに比較して２０ｂｐ近く長くなっているが、これは誤差又は当該菌株（ATCC 15313）に配列の挿入が生じていることなどによるものと推定される。
【０２２６】
＜実験６：本発明におけるマルチプレックスＰＣＲ法における複数菌での増幅試験に関して＞
（実施例３０）
実施例２９と同じプライマーセットを同様に作製すると共に、ＰＣＲ用反応液として、作製したプライマーセット１〜８を全て含有させた、以下の組成のものを作製した。
・緩衝液 10×Ex Taq buffer（20mM Mg 2＋ plus） 2.0μl
・核酸合成基質 dNTP Mixture（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM） 1.6μl
・ビブリオ検出用primer R（10ng/μl、final conc.4ng） 0.4μl
・ビブリオ検出用primer F（10ng/μl、final conc.4ng） 0.4μl
・その他のprimer R（10ng/μl、final conc.2ng） 0.2μl×7
・その他のprimer F（10ng/μl、final conc.2ng） 0.2μl×7
・核酸合成酵素 EX Taq（5U/μl） 0.1μl
・試料のＤＮＡ 1.0μl×7
・滅菌水 5.7μl
（全量 20μl）
【０２２７】
また、本実施例では、試料のＤＮＡとして、実施例２９と同じものを全て同時に含有させた。次いで、実施例１と同様のＰＣＲの条件によって、各試料のＤＮＡを複数のプライマーセット１〜８を用いて同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲを行った。そして、増幅産物を電気泳動によりそれぞれの生物ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図４５に示す。
【０２２８】
同図に示すように、次の８つの増幅産物のピークが見られた。
（１）１６８ｂｐ （２）１７２ｂｐ （３）１８７ｂｐ （４）２０１ｂｐ
（５）２２４ｂｐ （６）２４３ｂｐ （７）２７３ｂｐ （８）３８７ｂｐ
これらのピークは、それぞれ大腸菌、サルモネラ、リステリア、セレウス（ｎｈｅ）、黄色ブドウ球菌、セレウス（ｃｅｓＢ）、カンピロバクター、ビブリオの理論上の増幅産物の塩基配列の長さに近似するものであり、各食中毒菌の増幅対象領域が特異的に増幅されていると考えられる。
このように、本発明のプライマーの作製方法及びプライマーの設計方法にもとづき作製したプライマーセットを複数同時に用いることで、それぞれ対象とする食中毒菌の増幅対象領域を同時に特異的に増幅できることが明らかとなった。
【０２２９】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記各実施形態や実施例の内容の適宜組み合わせたものとすることが可能である。また、生物の遺伝子のみならず、人工のＤＮＡの塩基配列の増幅に使用するなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【０２３０】
本発明は、食品製造現場や臨床現場における微生物検査や、遺伝子診断、遺伝子検査等の産業や研究開発において、好適に利用することが可能である。
【符号の説明】
【０２３１】
１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０ プライマー設計装置
１１，２１，３１，４１，５１，６１，７１ 塩基配列記憶手段
１２，２２，３２，４２，５２，６２，７２ 増幅対象生物選択手段
１３，２３，３３，４３，５３，６３，７３ 非増幅対象生物選択手段
１４，２４，３４，４４，５４，６４，７４ プライマー候補選択手段
１５，６７，７ｂ 十二塩基連続重複判定手段
１６，２６，３６，４６，５７，６８，７ｃ プライマーセット記憶手段
７５ ＧＣ含量判定手段
２５，７６ ＧＣ配列判定手段
３５，７７ ＡＴ配列判定手段
５５，６５，７９ 融解温度算出手段
５６，６６，７ａ 温度差判定手段
４５，７８ 融解温度判定手段
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅させるために用いるプライマーセットを、増幅対象生物のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅させるためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないように作製する
ことを特徴とするプライマーの作製方法。
【請求項２】
前記プライマーセットを、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満となるように作製する
ことを特徴とする請求項１記載のプライマーの作製方法。
【請求項３】
前記プライマーセットを、フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒであり、かつ融解温度が７０〜７８℃となるように作製する
ことを特徴とする請求項１又は２記載のプライマーの作製方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲ法が、複数の生物のＤＮＡの塩基配列を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲ法であり、各増幅対象生物のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅させるためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないように作製する
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のプライマーの作製方法。
【請求項５】
ＰＣＲのアニーリング温度を、請求項１〜４のいずれかに記載のプライマーの作製方法を用いて得られたプライマーセットにおけるフォワードプライマーとリバースプライマーの中で、融解温度が最も低いプライマーの融解温度よりも０〜５℃低い温度に設定して、ＰＣＲを行う
ことを特徴とするプライマーの使用方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のプライマーの作製方法を用いて得られた
ことを特徴とするプライマーセット。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のプライマーの作製方法を用いて得られた一又は二以上のプライマーセットを含有する
ことを特徴とするＰＣＲ用反応液。
【請求項８】
検出対象菌種毎にプライマー量を調整した請求項７に記載のＰＣＲ用反応液。
【請求項９】
ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーの設計方法であって、
ＤＮＡの塩基配列を増幅する対象の一又は二以上の増幅対象生物を選択するステップと、
ＤＮＡの塩基配列を増幅しない対象の一又は二以上の非増幅対象生物を選択するステップと、
選択された増幅対象生物のＤＮＡからフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択するステップと、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は前記非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なるか否かを判定するステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の両方の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は前記非増幅対象生物のいずれかのＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なる場合、再度前記選択された増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して前記１２塩基以上連続で重なるか否かの判定を行うステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の少なくとも一方の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は前記非増幅対象生物の全てのＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならない場合、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの候補を前記ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップと、を有する
ことを特徴とするプライマーの設計方法。
【請求項１０】
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の塩基配列が、３’末端側半分において、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備える否かを判定するステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の両方の塩基配列が、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えていない場合、再度前記増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補の塩基配列を選択し直して、前記Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えるか否かの判定を行うステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の少なくとも一方の塩基配列が、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えている場合、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補を前記ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップと、を有する
ことを特徴とする請求項９記載のプライマーの設計方法。
【請求項１１】
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の塩基配列が、それぞれのプライマーの配列の中心から３’末端側及び５’末端側の両方向に向かってそれぞれのプライマーの全長の四分の１の範囲を含む領域に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えるか否かを判定するステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の両方の塩基配列が、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えていない場合、再度前記増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して前記Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えるか否かの判定を行うステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の少なくとも一方の塩基配列が、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えている場合、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの候補を前記ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップと、を有する
ことを特徴とする請求項９又は１０記載のプライマーの設計方法。
【請求項１２】
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の融解温度を算出するステップと、
算出した融解温度の差が、５℃未満であるか否かを判定するステップと、
判定の結果、５℃未満でない場合、再度前記増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して５℃未満であるか否かの判定を行うステップと、
判定の結果、５℃未満である場合、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの候補を前記ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップと、を有する
ことを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載のプライマーの設計方法。
【請求項１３】
選択された増幅対象生物のＤＮＡから長さが２３〜４１ｍｅｒのフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択するステップと、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の融解温度を算出するステップと、
算出した融解温度が、７０〜７８℃であるか否かを判定するステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の融解温度の少なくとも一方が、７０〜７８℃でない場合、再度前記増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して前記７０〜７８℃であるか否かの判定を行うステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の両方の融解温度が、７０〜７８℃である場合、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの候補を前記ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップと、を有する
ことを特徴とする請求項９〜１２のいずれかに記載のプライマーの設計方法。
【請求項１４】
前記ＰＣＲ法が、複数の生物のＤＮＡの塩基配列を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲ法である
ことを特徴とする請求項９〜１３のいずれかに記載のプライマーの設計方法。
【請求項１５】
前記増幅対象生物が、食中毒菌であることを特徴とする請求項９〜１４のいずれかに記載のプライマーの設計方法。
【請求項１６】
ＰＣＲのアニーリング温度を、請求項９〜１５のいずれかに記載のプライマーの設計方法を用いて得られたプライマーセットにおけるフォワードプライマーとリバースプライマーの中で、融解温度が最も低いプライマーの融解温度よりも０〜５℃低い温度に設定して、ＰＣＲを行う
ことを特徴とするプライマーの使用方法。
【請求項１７】
請求項９〜１５のいずれかに記載のプライマーの設計方法を用いて得られた
ことを特徴とするプライマーセット。
【請求項１８】
請求項９〜１５のいずれかに記載のプライマーの設計方法を用いて得られた一又は二以上のプライマーセットを含有する
ことを特徴とするＰＣＲ用反応液。
【請求項１９】
検出対象菌種毎にプライマー量を調整した請求項１８に記載のＰＣＲ用反応液。
【請求項１】
ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅させるために用いるプライマーセットを、増幅対象生物のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅させるためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないように作製する
ことを特徴とするプライマーの作製方法。
【請求項２】
前記プライマーセットを、フォワードプライマー及びリバースプライマーの融解温度の差が５℃未満となるように作製する
ことを特徴とする請求項１記載のプライマーの作製方法。
【請求項３】
前記プライマーセットを、フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さが２３〜４１ｍｅｒであり、かつ融解温度が７０〜７８℃となるように作製する
ことを特徴とする請求項１又は２記載のプライマーの作製方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲ法が、複数の生物のＤＮＡの塩基配列を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲ法であり、各増幅対象生物のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅させるためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の塩基配列が、他の増幅対象生物及び所定の非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と、１２塩基以上連続で重ならないように作製する
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のプライマーの作製方法。
【請求項５】
ＰＣＲのアニーリング温度を、請求項１〜４のいずれかに記載のプライマーの作製方法を用いて得られたプライマーセットにおけるフォワードプライマーとリバースプライマーの中で、融解温度が最も低いプライマーの融解温度よりも０〜５℃低い温度に設定して、ＰＣＲを行う
ことを特徴とするプライマーの使用方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のプライマーの作製方法を用いて得られた
ことを特徴とするプライマーセット。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のプライマーの作製方法を用いて得られた一又は二以上のプライマーセットを含有する
ことを特徴とするＰＣＲ用反応液。
【請求項８】
検出対象菌種毎にプライマー量を調整した請求項７に記載のＰＣＲ用反応液。
【請求項９】
ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーの設計方法であって、
ＤＮＡの塩基配列を増幅する対象の一又は二以上の増幅対象生物を選択するステップと、
ＤＮＡの塩基配列を増幅しない対象の一又は二以上の非増幅対象生物を選択するステップと、
選択された増幅対象生物のＤＮＡからフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択するステップと、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は前記非増幅対象生物のＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なるか否かを判定するステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の両方の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は前記非増幅対象生物のいずれかのＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重なる場合、再度前記選択された増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して前記１２塩基以上連続で重なるか否かの判定を行うステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の少なくとも一方の塩基配列が、選択された他の増幅対象生物又は前記非増幅対象生物の全てのＤＮＡの塩基配列と１２塩基以上連続で重ならない場合、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの候補を前記ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップと、を有する
ことを特徴とするプライマーの設計方法。
【請求項１０】
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の塩基配列が、３’末端側半分において、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備える否かを判定するステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の両方の塩基配列が、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えていない場合、再度前記増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補の塩基配列を選択し直して、前記Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えるか否かの判定を行うステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の少なくとも一方の塩基配列が、Ｇ又はＣを連続で３塩基以上備えている場合、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補を前記ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップと、を有する
ことを特徴とする請求項９記載のプライマーの設計方法。
【請求項１１】
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の塩基配列が、それぞれのプライマーの配列の中心から３’末端側及び５’末端側の両方向に向かってそれぞれのプライマーの全長の四分の１の範囲を含む領域に、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えるか否かを判定するステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の両方の塩基配列が、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えていない場合、再度前記増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して前記Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えるか否かの判定を行うステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の少なくとも一方の塩基配列が、Ａ又はＴを連続で４塩基以上備えている場合、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの候補を前記ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップと、を有する
ことを特徴とする請求項９又は１０記載のプライマーの設計方法。
【請求項１２】
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の融解温度を算出するステップと、
算出した融解温度の差が、５℃未満であるか否かを判定するステップと、
判定の結果、５℃未満でない場合、再度前記増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して５℃未満であるか否かの判定を行うステップと、
判定の結果、５℃未満である場合、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの候補を前記ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップと、を有する
ことを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載のプライマーの設計方法。
【請求項１３】
選択された増幅対象生物のＤＮＡから長さが２３〜４１ｍｅｒのフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択するステップと、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の融解温度を算出するステップと、
算出した融解温度が、７０〜７８℃であるか否かを判定するステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の融解温度の少なくとも一方が、７０〜７８℃でない場合、再度前記増幅対象生物からフォワードプライマーとリバースプライマーの候補を選択し直して前記７０〜７８℃であるか否かの判定を行うステップと、
判定の結果、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの候補の両方の融解温度が、７０〜７８℃である場合、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの候補を前記ＰＣＲ法によってＤＮＡの塩基配列を増幅するために用いるプライマーセットとして決定するステップと、を有する
ことを特徴とする請求項９〜１２のいずれかに記載のプライマーの設計方法。
【請求項１４】
前記ＰＣＲ法が、複数の生物のＤＮＡの塩基配列を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲ法である
ことを特徴とする請求項９〜１３のいずれかに記載のプライマーの設計方法。
【請求項１５】
前記増幅対象生物が、食中毒菌であることを特徴とする請求項９〜１４のいずれかに記載のプライマーの設計方法。
【請求項１６】
ＰＣＲのアニーリング温度を、請求項９〜１５のいずれかに記載のプライマーの設計方法を用いて得られたプライマーセットにおけるフォワードプライマーとリバースプライマーの中で、融解温度が最も低いプライマーの融解温度よりも０〜５℃低い温度に設定して、ＰＣＲを行う
ことを特徴とするプライマーの使用方法。
【請求項１７】
請求項９〜１５のいずれかに記載のプライマーの設計方法を用いて得られた
ことを特徴とするプライマーセット。
【請求項１８】
請求項９〜１５のいずれかに記載のプライマーの設計方法を用いて得られた一又は二以上のプライマーセットを含有する
ことを特徴とするＰＣＲ用反応液。
【請求項１９】
検出対象菌種毎にプライマー量を調整した請求項１８に記載のＰＣＲ用反応液。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【公開番号】特開２０１３−１７４１６（Ｐ２０１３−１７４１６Ａ）
【公開日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５２９１０（Ｐ２０１１−１５２９１０）
【出願日】平成２３年７月１１日（２０１１．７．１１）
【出願人】（０００００３７６８）東洋製罐株式会社 (1,150)
【出願人】（３９０００３１９３）東洋鋼鈑株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１１日（２０１１．７．１１）
【出願人】（０００００３７６８）東洋製罐株式会社 (1,150)
【出願人】（３９０００３１９３）東洋鋼鈑株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
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