プライマーセット、アゾスピリラム属菌の検出キット及び検出方法
【課題】アゾスピリラム属菌を精度よく、迅速かつシンプルに検出・識別することのできるプライマーセットを提供する。
【解決手段】特定の塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第一のプライマーと、特定の塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第二のプライマーとからなるプライマーセット。
【解決手段】特定の塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第一のプライマーと、特定の塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第二のプライマーとからなるプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプライマーセット、アゾスピリラム属菌の検出キット及び検出方法に係るものである。詳しくは、アゾスピリラム属菌１６Ｓ ｒＤＮＡに由来するＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し得るプライマーセット、当該プライマーセットを用いたアゾスピリラム属菌の検出キット及び検出方法に係るものである。
【背景技術】
【０００２】
アゾスピリラム属菌は、窒素固定能を有する好気性の桿状α−プロテオバクテリアとして知られている。アゾスピリラム属菌は世界中において、根圏土壌及び多種の植物根部から分離されている。多くのアゾスピリラム属菌株は、植物成長促進細菌（ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ，ＰＧＰＢ）として報告されている。植物成長促進細菌とは、作物の生長を促進させることができる細菌である。この成長促進は、アゾスピリラム属菌株による植物ホルモンの生成、窒素固定、植物免疫によってもたらされるものとして考えられている。従って、アゾスピリラム属の細菌は、バイオ肥料及びバイオ殺虫剤として利用され、近年の農業用の化学薬品を減らす需要により、多くの注目を集めている。
【０００３】
しかしながら、根圏土壌及び植物体からのアゾスピリラム属菌の識別及び分離は、選択培地及び形態生物学的評価による従来的な方法に頼るしかなかった。従来の方法では、複数の選択培地（例えばＮＦｂ、ＲＣ培地など）を利用しながら、菌の形態または窒素固定能などを評価して、候補となる菌株を絞り込んだ上で、さらにｒＤＮＡ配列の解読を行う必要があった。これらの従来の方法は、アゾスピリラム属菌に対する専門知識と実験経験、１〜２ヶ月の時間と、多大な労力とコストを必要とする。さらに、選択培地の利用と菌種特性の評価を繰り返すため、培地適応性と評価値の高い菌株が分離されやすく、分離した菌株には意図していない選択バイアスが生じることがある。
【０００４】
最近のＤＮＡ配列解析技術の発展によって、ターゲットとなる微生物の検出及び識別において分子遺伝学的な識別法が考えられるようになった。非特許文献１〜非特許文献２３は、アゾスピリラム属菌の検出と識別にかかわる情報を開示しており、これらのうち、特に非特許文献１〜３，７，１０，１１，１３〜１７は分子遺伝学的な識別法について開示しているものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｌｄａｎｉ ＪＩ， Ｋｒｉｅｇ ＮＲ， Ｂａｌｄａｎｉ ＶＬＤ， Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａ， Ｄｏｂｅｒｅｉｎｅｒ Ｊ （２００５） Ｇｅｎｕｓ ＩＩ． Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ． Ｉｎ： Ｂｒｅｎｎｅｒ ＤＪ， Ｋｒｉｅｇ ＮＲ， Ｓｔａｌｅｙ ＪＴ， Ｇａｒｒｉｔｙ ＧＭ （ｅｄｓ） Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄｎ ｖｏｌ ２ ｐａｒｔ Ｃ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ＮＹ， ｐｐ １６−１７
【非特許文献２】Ｂａｓｈａｎ Ｙ， Ｈｏｌｇｕｉｎ Ｇ， Ｌｉｆｓｈｉｔｚ Ｒ （１９９３） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ． Ｉｎ： Ｇｌｉｃｋ ＢＲ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＥ （ｅｄｓ） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ， ＦＬ， ｐｐ ３３１−３４５
【非特許文献３】Ｂａｕｄｏｉｎ Ｅ， Ｃｏｕｉｌｌｅｒｏｔ Ｏ， Ｓｐａｅｐｅｎ Ｓ， Ｍｏｅｎｎｅ−Ｌｏｃｃｏｚ Ｙ， Ｎａｚａｒｅｔ Ｓ （２０１０） Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ １６Ｓ−２３Ｓ ｒＤＮＡ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｐａｃｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ＰＧＰＲ ｉｎｏｃｕｌａｎｔｓ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ ＣＲＴ１ ｉｎ ｆｉｅｌｄ ｓｏｉｌ． Ｊ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １０８：２５−３８． ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２６７２．２００９．０４３９３．ｘ
【非特許文献４】Ｂｏｄｄｅｙ ＲＭ， Ｂａｌｄａｎｉ ＶＬＤ， Ｂａｌｄａｎｉ ＪＩ， Ｄｏｂｅｒｅｉｎｅｒ Ｊ （１９８６） Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐｐ． ｏｎ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｉｅｌｄ−ｇｒｏｗｎ ｗｈｅａｔ． Ｐｌａｎｔ Ｓｏｉｌ ９５：１０９−１２１． ｄｏｉ：１０．１００７／ＢＦ０２３７８８５７
【非特許文献５】Ｂｕｒｒｉｓ ＲＨ （１９７２） Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｆｉｘｉｎｇ−ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２４：４１５−４３１
【非特許文献６】Ｃａｃｅｒｅｓ ＥＡ （１９８２） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐｐ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４４：９９０−９９１
【非特許文献７】Ｃｏｌｅ ＪＲ， Ｃｈａｉ Ｂ， Ｆａｒｒｉｓ ＲＪ， Ｗａｎｇ Ｑ， Ｋｕｌａｍ ＳＡ， ＭｃＧａｒｒｅｌｌ ＤＭ， Ｇａｒｒｉｔｙ ＧＭ， Ｔｉｅｄｊｅ ＪＭ （２００５） Ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｄａｔａｂａｓｅ ｐｒｏｊｅｃｔ （ＲＤＰ−ＩＩ）： ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｒＲＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：２９４−２９６ ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｉ０３８
【非特許文献８】Ｄｏｂｂｅｌａｅｒｅ Ｓ， Ｃｒｏｏｎｅｎｂｏｒｇｈｓ Ａ， Ｔｈｙｓ Ａ， Ｂｒｏｅｋ ＡＶ， Ｖａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ Ｊ （１９９９） Ｐｈｙｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ａｌｔｅｒｅｄ ｉｎ ＩＡＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｎ ｗｈｅａｔ． Ｐｌａｎｔ Ｓｏｉｌ ２１２：１５５−１６４． ｄｏｉ：１０．１００７／ＢＦ０２３７８８５７
【非特許文献９】Ｅｃｋｅｒｔ Ｂ， Ｗｅｂｅｒ ＯＢ， Ｋｉｒｃｈｈ Ｇ， Ｈａｌｂｒｉｔｔｅｒ Ａ， Ｓｔｏｆｆｅｌｓ Ｍ， Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａ （２００１） Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｄｏｅｂｅｒｅｉｎｅｒａｅ ｓｐ． ｎｏｖ．， ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃ４−ｇｒａｓｓ Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ３３：３００−３０８
【非特許文献１０】Ｆａｎｃｅｌｌｉ Ｓ， Ｃａｓｔａｌｄｉｎｉ Ｍ， Ｃｅｃｃｈｅｒｉｎｉ ＭＴ， Ｓｅｒｉｏ ＣＤ， Ｆａｎｉ Ｒ， Ｇａｌｌｏｒｉ Ｅ， Ｍａｒａｎｇｏｌｏ Ｍ， Ｍｉｃｌａｕｓ Ｎ， Ｂａｚｚｉｃａｌｕｐｏ Ｍ （１９９８） Ｕｓｅ ｏｆ ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｓｏｉｌ ｍｉｃｒｏｃｏｓｍｓ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ４９：２２１−２２５． ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２５３００５１１６２
【非特許文献１１】Ｇｒｉｆｏｎｉ Ａ， Ｂａｚｚｉｃａｌｕｐｏ Ｍ， Ｓｅｒｉｏ ＣＤ， Ｆａｎｃｅｌｌｉ Ｓ， Ｆａｎｉ Ｒ （１９９５）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｏｐｅｒｏｎ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １２７：８５−９１． ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５７４−６９６８．１９９５．ｔｂ０７４５４．ｘ
【非特許文献１２】Ｇｌｉｃｋｍａｎｎ Ｅ， Ｄｅｓｓａｕｘ Ｙ （１９９５） Ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｌｋｏｗｓｋｉ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｉｎｄｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６１：７９３−７９６
【非特許文献１３】Ｊａｃｏｕｄ Ｃ， Ｆａｕｒｅ Ｄ， Ｗａｄｏｕｘ Ｐ， Ｂａｌｌｅｙ Ｒ （１９９８） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｔｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｂｅ ｔｏ ｆｏｌｌｏｗ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ ＣＲＴ１ ｕｎｄｅｒ ｆｉｅｌｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｒｏｏｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌ ２７：４３−５１ ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５７４−６９４１．１９９８．ｔｂ００５２４．ｘ
【非特許文献１４】Ｋａｂｉｒ ＭＭ， Ｆａｕｒｅ Ｄ， Ｈａｕｒａｔ Ｊ， Ｎｏｒｍａｎｄ Ｐ， Ｊａｃｏｕｄ Ｃ， Ｗａｄｏｕｘ Ｐ， Ｂａｌｌｙ Ｒ （１９９５） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｃａｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４１： １０８１−１０８７． ｄｏｉ：１０．１１３９／ｍ９５−１５１
【非特許文献１５】Ｍｅｈｈａｚ Ｓ， Ｍｉｒｚａ ＭＳ， Ｈａｕｒａｔ Ｊ， Ｂａｌｌｙ Ｒ， Ｎｏｒｍａｎｄ Ｐ， Ｂａｎｏ Ａ， Ｍａｌｉｋ ＫＡ （２００１） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｏｆ ｒｉｃｅ． Ｃａｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４７：１１０−１１７． ｄｏｉ：１０．１１３９／ｃｊｍ−４７−２−１１０
【非特許文献１６】Ｓｔｏｆｆｅｌｓ Ｍ， Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ Ｔ， Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａ （２００１） Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ １６Ｓ ｒＲＮＡ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ−Ｓｋｅｒｍａｎｅｌｌａ−Ｒｈｏｄｏｃｉｓｔａ−ｃｌｕｓｔｅｒ． Ｓｙｓｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２４：８３−９７． ｄｏｉ：１０１０７８／０７２３−２０２０−０００１１
【非特許文献１７】Ｘｉａ Ｙ， Ｅｍｂｌｅｙ ＴＭ， Ｏ’ｄｏｎｎｅｌｌ ＡＧ （１９９４） Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ １６Ｓ ｒＤＮＡ． Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １７：１９７−２０１
【非特許文献１８】Ｌｉｎ ＳＹ，Ｙｏｕｎｇ ＣＣ，Ｈｕｐｆｅｒ Ｈ，Ｓｉｅｒｉｎｇ Ｃ，Ａｒｕｎ ＡＢ，Ｃｈｅｎ ＷＭ，Ｌａｉ ＷＡ，Ｓｈｅｎ ＦＴ,Ｒｅｋｈａ ＰＤ, Ｙａｓｓｈｉｎ ＡＦ．（２００９）Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｐｉｃｉｓ ｓｐ．ｎｏｖ．，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｓｃａｒｄｅｄ ｔａｒ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５９：７６１−７６５．ｄｏｉ：１０.１０９９／ｉｊｓ．０．６５８３７−０
【非特許文献１９】Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｗｅｉ Ｗ，Ｗａｎｇ Ｘ，Ｘｕ Ｌ， Ｌａｉ Ｒ（２００９）Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｐａｌａｔｕｍ ｓｐ．ｎｏｖ．，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｏｒｅｓｔ ｓｏｉｌ ｉｎ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ．Ｊ Ｇｅｎ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５５：１−７．
【非特許文献２０】Ｐｅｎｇ Ｇ， Ｗａｎｇ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｇ，Ｈｏｕ Ｗ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｗａｎｇ ＥＴ， Ｔａｎ Ｚ（２００６）Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍｅｌｉｎｉｓ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｍｏｌａｓｓｅｓ ｇｒａｓｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５６：１２６３−１２７１．ｄｏｉ：１０.１０９９／ｉｊｓ．０．６４０２５−０
【非特許文献２１】Ｍｅｈｎａｚ Ｓ，Ｗｅｓｅｌｏｗｓｋｉ Ｂ， Ｌａｚａｒｏｖｉｔｓ Ｇ（２００７ａ） Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｃａｎａｄｅｎｓｅ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｒｎ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５７：６２０−６２４．ｄｏｉ：１０.１０９９／ｉｊｓ．０．６４８０４−０
【非特許文献２２】Ｍｅｈｎａｚ Ｓ，Ｗｅｓｅｌｏｗｓｋｉ Ｂ， Ｌａｚａｒｏｖｉｔｓ Ｇ （２００７ｂ） Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｚｅａｅ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ｏｆ Ｚｅａ ｍａｙｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５７：２８０５−２８０９．ｄｏｉ：１０.１０９９／ｉｊｓ．０．６５１２８−０
【非特許文献２３】Ｙｏｕｎｇ ＣＣ，Ｈｕｐｆｅｒ Ｈ，Ｓｉｅｒｉｎｇ Ｃ，Ｈｏ ＭＪ，Ａｒｕｎ ＡＢ，Ｌａｉ ＷＡ，Ｒｅｋｈａ ＰＤ，Ｓｈｅｎ ＦＴ， Ｈｕｎｇ ＭＨ， Ｃｈｅｎ ＷＭ， Ｙａｓｓｈｉｎ ＡＦ（２００８）Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｇｏｓｕｍ ｓｐ．ｎｏｖ．，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｏｉｌ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｓｏｉｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５８，９５９−９６３．ｄｏｉ：１０.１０９９／ｉｊｓ．０．６５０６５−０
【非特許文献２４】Ｈａｎ， Ｓ．Ｏ． ａｎｄ Ｎｅｗ， Ｐ．Ｂ． （１９９８） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐｐ． ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒａｌ ｓｏｉｌｓ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ． Ｓｏｉｌ Ｂｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３０， ９７５−９８１．
【非特許文献２５】Ｍｃｇｉｌｌｏｗａｙ， Ｒ．Ｌ．， Ｗｅａｖｅｒ， Ｒ．Ｗ．， Ｍｉｎｇ， Ｄ．Ｗ． ａｎｄ Ｐｉｌｌａｉ， Ｓ．Ｄ． （２００２） Ａ ＰＣＲ−ＭＰＮ ｂａｓｅｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｅｎｕｍｅｒａｔｅ ｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｚｅｏｐｏｎｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． Ｊ Ｒａｐｉｄ Ｍｅｔｈ Ａｕｔｏｍ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １０， ４９−５８．
【非特許文献２６】Ｍｉｒｚａ， Ｍ．Ｓ．， Ｍｅｈｎａｚ， Ｓ．， Ｎｏｒｍａｎｄ， Ｐ．， Ｃｏｍｂａｒｅｔ， Ｃ．Ｐ．， Ｌｏｃｃｏｚ， Ｙ．Ｍ．， Ｂａｌｌｙ， Ｒ． ａｎｄ Ｍａｌｉｋ， Ｋ．Ａ． （２００６） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒａｉｎ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｒｉｃｅ ｇｒｏｗｔｈ． Ｂｉｏｌ Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｏｉｌｓ ４３， １６３−１７０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
分子遺伝学的な識別法において、例えば、アゾスピリラム属菌については、ランダムに増幅される多型ＤＮＡの分析、及び増幅されたリボソームＤＮＡ断片の制限酵素分析をすることによって、アゾスピリラム属菌を他菌属と識別することが試みられた（非特許文献１０、非特許文献１１参照）。しかしながら、この方法は特定のアゾスピリラム属菌種、菌株のみを識別可能にすぎない。
【０００７】
また、アゾスピリラム株の１６Ｓ ｒＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブも開発され、アゾスピリラム属に属する菌の所在をつきとめ、その動的特徴を知るために使用された（非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１６参照）。しかしながら、プローブを使用するこの方法は煩雑な実験操作を必要とし、精密な操作及び熟練性を必要とする。
【０００８】
制限酵素及びプローブを用いた方法に比べ、プライマーセットを用いた方法は煩雑な実験操作を必要とせず、迅速かつシンプルな方法である。非特許文献３では、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子間スペーサ領域（ＩＳＲ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ）に基づき設計されたＰＣＲプライマーセットｆＡＺＯ／ｒＡＺＯについて開示している。しかしこのプライマーセットは、菌株によってはアゾスピリラム属菌を認識できなかったり（偽陰性）、非アゾスピリラム属菌を誤認識したりする（偽陽性）ことがしばしばあり、検出精度に問題点がある。
【０００９】
上記事情を鑑みて、本発明は、アゾスピリラム属菌をより精度よく、迅速かつシンプルに検出・識別することのできるプライマーセット、検出キット及び検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）アゾスピリラム属菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに由来するＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なプライマーセットであって、配列番号１で示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第一のプライマーと、配列番号２で示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第二のプライマーとからなるプライマーセット。
（２）上記第一のプライマーが、配列番号１で示される塩基配列においてｋがグアニンであるヌクレオチド、及び配列番号１で示される塩基配列においてｋがチミンであるヌクレオチドの少なくとも一方からなり、上記第二のプライマーが配列番号２で示される塩基配列を有するヌクレオチドからなる上記（１）に記載のプライマーセット。
（３）上記第一のプライマーが、配列番号１で示される塩基配列においてｋがグアニンである上記ヌクレオチド、及び配列番号１で示される塩基配列においてｋがチミンである上記ヌクレオチドの混合物からなる上記（２）に記載のプライマーセット。
（４）上記第一のプライマーにおいて１〜２個の塩基が欠失、置換、又は付加されており、かつ上記第二のプライマーにおいて１〜２個の塩基が欠失、置換、又は付加している上記（２）に記載のプライマーセット。
（５）上記（１）〜（４）の何れか一項に記載のプライマーセットを備えるアゾスピリラム属菌の検出キット。
（６）以下の工程：（ａ）対象サンプルからＤＮＡを含有する試料を調製する工程、（ｂ）上記試料に対して、上記（１）〜（４）の何れか一項に記載のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、（ｃ）上記工程（ｂ）で得られる増幅断片の有無を検出する工程、を含むアゾスピリラム属菌の検出方法。
（７）上記対象サンプルが、土壌サンプル又は植物由来サンプルである（６）に記載の検出方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、ＰＣＲ法でアゾスピリラム属菌を検出することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】プライマーセットＡｚ１６Ｓ−Ａを用いた、未知分離株に対するＰＣＲ実験の結果を示した図である。
【図２】純粋培養物及び混合培養物における、プライマーセットＡｚ１６Ｓ−Ａを用いたアゾスピリラム菌のＰＣＲ検出を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００１４】
（プライマーセット）
本発明に係るプライマーセットは、アゾスピリラム属に属する細菌（アゾスピリラム属菌）の１６Ｓ ｒＤＮＡに由来するＤＮＡ断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能なものである。すなわち、本発明に係るプライマーセットは、アゾスピリラム属菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ及び１６Ｓ ｒＤＮＡの断片にハイブリダイズして、ＰＣＲにより所定サイズの上記ＤＮＡ断片を増幅させる。
【００１５】
上記プライマーセットは、アゾスピリラム属菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに由来するＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって選択的に増幅可能という特性を有する。ここで、「選択的に増幅可能」とは、当該プライマーセットを用いたＰＣＲを行った場合に、アゾスピリラム属菌由来のＤＮＡ断片が専ら増幅産物として得られるが、他の多くの生物由来のＤＮＡ断片は増幅産物として実質的に得られないことを指す。実施例にも示すように、本発明に係るプライマーセットを用いた増幅では、アゾスピリラム属に属する複数種の細菌において共通のＰＣＲ増幅産物が得られる反面、アゾスピリラム属に近縁な細菌を含む多くの細菌ではＰＣＲ増幅産物が得られない。また、土壌サンプル及び植物含有サンプル（植物の根部等）に対するＰＣＲ増幅の結果から、本発明に係るプライマーは、植物、及びアゾスピリラム属菌ではない多くの土壌微生物由来のＰＣＲ増幅産物が実質的に得られないことが示されている（実施例参照）。従って、本発明に係るプライマーは、アゾスピリラム属菌の検出に極めて有用である。
【００１６】
本発明に係るプライマーセットは、具体的には以下の（１）〜（４）の何れかに示すヌクレオチド（より具体的にはＤＮＡ）である。
（１）配列番号１で示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第一のプライマーと、配列番号２で示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第二のプライマーとからなるプライマーセット。なお、配列番号１で表される塩基配列中のｋはグアニン又はチミンを示す。なお、ＰＣＲ増幅の選択性をより向上させる観点では、第一のプライマーは、配列番号１で示される塩基配列のうち連続する少なくとも１８塩基部分を有するヌクレオチドからなることがより好ましい。また、同様に、第二のプライマーは、配列番号２で示される塩基配列のうち連続する少なくとも１８塩基部分を有するヌクレオチドからなることがより好ましく、少なくとも２０塩基部分を有するヌクレオチドからなることがさらに好ましい。また、後述するように第一のプライマー、及び第二のプライマーともに、上記条件を満たす複数種のプライマーの混合物であってもよく、単独（１種類）のプライマーであってもよい。
（２）上記第一のプライマーが、配列番号１で示される塩基配列においてｋがグアニンであるヌクレオチド、及び配列番号１で示される塩基配列においてｋがチミンであるヌクレオチドの少なくとも一方からなり、上記第二のプライマーが配列番号２で示される塩基配列を有するヌクレオチドからなる上記（１）に記載のプライマーセット。
（３）上記第一のプライマーが、配列番号１で示される塩基配列においてｋがグアニンである上記ヌクレオチド、及び配列番号１で示される塩基配列においてｋがチミンである上記ヌクレオチドの混合物からなる上記（２）に記載のプライマーセット。第一のプライマーとして当該混合物を用いれば、アゾスピリラム属菌に対する特異性がより高まり、より多種類にわたるアゾスピリラム属菌を増幅可能となる。
【００１７】
上記第一のプライマーとして上記混合物を用いる場合、ｋがグアニンである上記ヌクレオチドとｋがチミンである上記ヌクレオチドとの混合比率は特に限定されず、例えば、１：９〜９：１の範囲内、より好ましくは４：６〜６：４の範囲内とすることができる。
（４）上記第一のプライマーにおいて１〜２個の塩基が欠失、置換、又は付加されており、かつ上記第二のプライマーにおいて１〜２個の塩基が欠失、置換、又は付加している上記（２）又は（３）に記載のプライマーセット。なお、基本となるプライマーに対して１〜２個の塩基に変異がある場合でも、所望のＰＣＲ増幅断片は得られる。また、上記（３）に記載のプライマーセットを構成する第一のプライマー（混合物）において、１〜２個の塩基が欠失又は置換する場合は、配列番号１で示される塩基配列におけるｋ以外の塩基が欠失又は置換しているものとする。
【００１８】
また、特に限定されないが各プライマーのＧＣ含量は、例えば、５０％〜７０％の範囲とするのが好ましく、５０％〜６５％の範囲とすることがより好ましい。プライマーのＴｍ値も特に限定されないが、例えば、５０℃〜６５℃とすることが好ましく、５０℃〜６０℃とすることがより好ましい。
【００１９】
本発明に係るプライマーセットは常法に従って合成することができる。また、本発明に係るプライマーセットを用いたＰＣＲの反応条件は特に限定されない。
【００２０】
（アゾスピリラム属菌の検出キット）
本発明に係るアゾスピリラム属菌の検出キットは、上記説明した本発明に係るプライマーセットを備える。この検出キットは、アゾスピリラム属菌の有無の判別を含む検出に用いる。さらに、必要に応じて、１）ＰＣＲに用いる各種試薬及び器具（ポリメラーゼ、ＰＣＲバッファー、各ｄＮＴＰ、ピペット等）、２）ＰＣＲに供するＤＮＡを含有する試料を調製するための各種試薬及び器具（試験管、バッファー等）、３）ＰＣＲ増幅断片を解析するための各種試薬及び器具（電気泳動ゲル材料、ピペット等）、４）さらなる詳細解析のため、アゾスピリラム属に属する特定種のみを増幅可能なＰＣＲプライマーセット、５）検出キットの使用説明書、等の少なくとも１つを備えていてもよい。
【００２１】
（アゾスピリラム属菌の検出方法）
本発明に係るアゾスピリラム属菌の検出方法は、以下の工程：
（ａ）対象サンプルからＤＮＡを含有する試料を調製する工程、
（ｂ）上記試料に対して、本発明に係るプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
（ｃ）上記工程（ｂ）で得られる増幅断片の有無を検出する工程、
を含む。
【００２２】
以下、各工程を説明する。
【００２３】
（１）工程（ａ）
工程（ａ）は、対象サンプルからＤＮＡを含有する試料を調製する工程である。
ここで、「対象サンプル」とは、アゾスピリラム属菌の有無を判別しようとするサンプルを意味する。対象サンプルは、アゾスピリラム属菌を含む可能性のあるものであればよく、限り特に限定されない。例えば、土壌サンプル、植物の根部等の植物由来サンプル、培地上の微生物コロニー、微生物を含む培養液等が挙げられる。
【００２４】
ＤＮＡを含有する試料は、例えば、土壌サンプル等の対象サンプルから常法に従って調製することができる。例えば、ボイル法、ＣＴＡＢ法等が挙げられる。これらの中では、操作の簡便さの観点では、ボイル法が好ましい。なお、ボイル法とは、対象サンプルを液体中（例えば、滅菌蒸留水又はバッファー）に懸濁して短時間（例えば５分程度以下）加熱して、ＤＮＡを取り出す方法である。
【００２５】
なお、調製されたＤＮＡを含有する試料には、ＤＮＡの他に、各種ＲＮＡ、タンパク質、細胞破砕物、等が含まれる。従って、該試料を常法に従って精製してもよい。但し、実施例にも示す通り、本発明の方法では、当該試料に対して一切の精製を行わなくとも、一度のＰＣＲにより非常に高感度な検出を行うことができる。
【００２６】
（２）工程（ｂ）
工程（ｂ）は、上記試料に対して、上記した本発明に係るプライマーセットを用いたＰＣＲを行う工程である。工程（ｂ）におけるＰＣＲは、常法に従って行うことができる。工程（ｂ）により、試料中にアゾスピリラム属菌が含まれている場合には、使用したプライマーの塩基配列を両端に有するアゾスピリラム１６Ｓ ｒＤＮＡ由来のＰＣＲ増幅断片が得られる。
【００２７】
（３）工程（ｃ）
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られるＰＣＲ増幅断片の有無を検出する工程である。ＰＣＲ増幅断片（アンプリコン）の有無の確認は、常法に従って行うことができる。例えば、電気泳動によりＰＣＲ増幅断片の有無及びサイズを確認することができる。
【００２８】
ＰＣＲ増幅断片の有無の確認の結果、ＰＣＲ増幅断片が存在する場合には、対象サンプルにアゾスピリラム属菌が存在すると判別することができる。また、ＰＣＲ増幅断片の有無の確認の結果、ＰＣＲ増幅断片が存在しない場合には、対象サンプルにアゾスピリラム属菌が存在していないと判別することができる。
【００２９】
従来法による農業サンプルからのアゾスピリラム属菌の分離プロセスでは、選択培地の使用と菌の生理形態学的評価を繰り返し行うため、一定の特徴を持った菌株のみを分離する選択バイアスが生じる。例えば、非特許文献２４では、窒素源を含まない培地を使用した従来の分離プロセスにおいて、高い窒素固定能を有するアゾスピリラム属菌が分離され、低い窒素固定能の菌株は分離できなかったことを開示している。後述する実施例にも示す通り、本発明の一形態としてのＡｚ１６Ｓ−Ａプライマーセットを使用したアゾスピリラム属菌のＰＣＲ検出により、選択培地と生理形態学的評価の使用を減らすことができるため、結果的に選択バイアスを低減させた分離プロセスを実現できる。また、本発明の一形態であるこのＰＣＲ検出法は、農業サンプルから多様なアゾスピリラム属菌を分離し、新規の植物成長促進細菌株を探索する上で有用な手法、またはアゾスピリラム属菌集団の多様性と生態とを分析するための有用な手法として利用できる。多数のアゾスピリラム属菌及び分離株を対象にしてＡｚ１６Ｓ−ＡプライマーセットによるＰＣＲ増幅産物（アンプリコン）のＤＮＡ配列を決定したところ、少なくとも１５の一塩基多型（ＳＮＰ）が見出され、そのうち１２の一塩基多型は購入可能な制限酵素の認識サイトである。さらに、この１２のＳＮＰのうちの一つは、アゾスピリラム属菌とＲ．ｃｅｎｔｅｎａｒｉａとの識別に有用であると見込まれる。一塩基多型について更なる分析と確認が必要であるが、おそらく、Ａｚ１６Ｓ−Ａプライマーセットの利用により、一回のＰＣＲと制限酵素処理（例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析法）によって、アゾスピリラム属分離株またはアゾスピリラム属菌集団の精密な同定及び多様性分析の両方が可能である。さらに、発明者らの実験では、根圏土壌と植物体部位に対してＡｚ１６Ｓ−Ａプライマーセットを使用し、アゾスピリラム属菌の局在性を予測している。このような微生物動態の分析では、非特許文献１６で開示された、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブも使用できるが、しかし我々の方法は、アゾスピリラム属菌の動態分析後の分離プロセスにおいても利用できる点で優位性がある。ＰＣＲ法は最確数（ＭＰＮ）法と併用することによって、アゾスピリラム属菌集団の定量にも利用できる（非特許文献２５、２６参照）。本発明のＰＣＲ法を組み込んだ迅速、容易且つ選択バイアスが最小となったアゾスピリラム分離技術、及びＡｚ１６Ｓ−Ａプライマー配列に基づくリアルタイムＰＣＲ定量技術に対するさらなる応用が考えられる。
【実施例】
【００３０】
〔実施例１〕
＜プライマーセットの設計及び作製＞
アメリカ国立バイオテクノロジーインフォメーションセンター （ＮＣＢＩ， ＵＳＡ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／ＧｅｎＢａｎｋＦｔｐ．ｈｔｍｌ）ジーンバンクヌクレオチドデータベースから合計３０個のアゾスピリラム１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（１４の種から）を入手し、バチルス属菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ属菌を含む関連する類縁細菌群の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と比較しながら、１６Ｓ ｒＤＮＡの開始コドンの下流３００ｂｐ〜１２００ｂｐにおける、推測上の属特異的且つ保存的領域について同定した。
【００３１】
推測上のアゾスピリラム属特異的領域に基づき、属特異的なプライマーセットを設計するために、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｏ ４．８．５ソフトウエア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ Ｌｔｄ社， Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を使用して、アゾスピリラム及びその類縁細菌群に属する菌に対して、ＤＮＡ配列アライメント解析を実施した。同様に、ジーンバンクから６つのｉｐｄＣ遺伝子配列（３つのアゾスピリラム属菌種から）、３つのｎｉｆＡ遺伝子配列（２つのアゾスピリラム属菌種から）、１２のｎｉｆＨ遺伝子配列（３つのアゾスピリラム属菌種から）を入手し、プライマーセットを設計した。ｉｐｄＣ、ｎｉｆＡ及びｎｉｆＨ遺伝子は何れも細菌による植物成長促進において重要な遺伝子である。具体的には、ｉｐｄＣ遺伝子は、インドール−３−酢酸生合成酵素をコード化するものであり、ｎｉｆＡ遺伝子及びｎｉｆＨ遺伝子はそれぞれ、窒素固定のためのニトロゲナーゼ酵素の制御遺伝子及び構造遺伝子をコード化するものである。
【００３２】
各プライマーセットの設計に際して、次の条件（１）〜（３）を適用した。（１）原則として２０個前後、好ましくは２０個を超えるヌクレオチド塩基を有するプライマーセットを設計し、（２）上記プライマーセットは２００−８００ｂｐのＤＮＡ断片（アンプリコン）を生成させると予測されるものを選択し、（３）上記プライマーセットのヌクレオチドコードはアゾスピリラム属菌の間で同じかまたは最大で２塩基程度異なるものを許容するように設計した。表１は、Ｂａｕｄｏｉｎらによって報告されたｆＡＺＯ／ｒＡＺＯプライマー（非特許文献３参照）と共に、今回設計されたプライマーを表示したものである。設計されたが、簡易ＰＣＲを伴う予備分析（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ａｓｓａｙｓ）によって排除されたものは、表１には示されていない。
【００３３】
＜結果＞
表１は、今回設計した９つのプライマーセットと共に、Ｂａｕｄｏｉｎらによって報告されたプライマーセットｆＡＺＯ／ｒＡＺＯ（非特許文献３参照）を表示したものである。プライマー名に１６Ｓが含まれるもの、ｉｐｄが含まれるもの、ｎｉｆが含まれるものは、順に、１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列、ｉｐｄの塩基配列、ｎｉｆの塩基配列に基づき設計されたものである。設計されたが予備分析（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ａｓｓａｙｓ）によって排除されたものは、表１には示されていない。表において、ＫはＧ及びＴの二種の塩基の混合（すなわち、Ｋがグアニンであるプライマーと、Ｋがチミンであるプライマーとの混合物。両者の混合比率は約１：１。）であることを意味している。アンプリコンサイズはアゾスピリラム・ブラシレンセ ＪＣＭ １２２４ＴＳのＤＮＡ配列により推測されたものである。
【００３４】
【表１】
【００３５】
〔実施例２〕
＜プライマーセットの属特異性評価＞
１２のアゾスピリラム標準株（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ）及び１５の非アゾスピリラム標準株について、実施例１で作製したプライマーセットの属特異性について調べた。
【００３６】
使用した１２のアゾスピリラム標準株及び１５の非アゾスピリラム標準株、合計２７の標準株を以下に示した。ＴＳは基準株であることを示している。
【００３７】
（アゾスピリラム属の１２の標準株）
（１）Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２４ＴＳ
（２）Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２５
（３）Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２６
（４）Ａ． ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ ＪＣＭ １２２７
（５）Ａ． ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ ＪＣＭ １２２８
（６）Ａ． ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ ＪＣＭ １２４７ＴＳ
（７）Ａ． ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ ＪＣＭ １２７０
（８）Ａ． ａｍａｚｏｎｅｎｓｅ ＤＳＭ ２７８７ＴＳ
（９）Ａ． ｈａｌｏｐｒａｅｆｅｒｅｎｓ ＤＳＭ ３６７５ＴＳ
（１０）Ａ． ｉｒａｋｅｎｓｅ ＤＳＭ １１５８６ＴＳ
（１１）Ａ． ｐｉｃｉｓ ＤＳＭ １９９２２ＴＳ
（１２）Ａ． ｒｕｇｏｓｕｍ ＤＳＭ １９６５７ＴＳ
（非アゾスピリラム属の１５の標準株）
アゾスピリラム属の類縁細菌群に属するもの：
（１）Ｒｈｏｄｏｃｉｓｔａ ｃｅｎｔｅｎａｒｉａ ＤＳＭ ９８９４ＴＳ
（２）Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃｕｍ ＤＳＭ ３８５６ＴＳ
（３）Ｐａｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｆｕｌｖｕｍ ＤＳＭ １１３ＴＳ
（４）Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ ＤＳＭ ４６７ＴＳ
（５）Ｒ． ｓａｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ ９１５４ＴＳ
（６）Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ ｌｕｃｅｎｔｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １４０００ＴＳ
そのほかのプロテオバクテリア：
（７）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＭＡＦＦ ３０１２２４
（８）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＭＡＦＦ ３０１５４０
（９）Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ ＭＡＦＦ ２１００３９
（１０）Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ ｓｐ． ＲＥＲＴ ０２０１２６
（１１）Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＭＡＦＦ ３０１６９０
（１２）Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＲＥＲＴ ０２００１８
Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓに属するもの：
（１３）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ＭＡＦＦ １１８２５６
（１４）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ＲＥＲＴ ０２０１１１
（１５）Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ ＲＥＲＴ ０２００２０
１２のアゾスピリラム及び１５の非アゾスピリラム、合計２７の標準株（表２を参照）は、ドイツ微生物・培養細胞収集有限会社（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ、ＤＳＭＺ）から（１１のＤＳＭ菌株）、日本独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＪＣＭ）から（７つのＪＣＭ菌株）、日本独立行政法人農業生物資源研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＩＡＳ）から（５つのＭＡＦＦ菌株）、および発明者の細菌コレクションから（上記（１０）、（１２）、（１４）、（１５）のＲＥＲＴ菌株４つ）入手したものである。１２のアゾスピリラム属菌株は、ＰＣＲ実験の時点で、上記機関において入手できるアゾスピリラム属７種すべてを含む。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ及びＮＣＢＩで報告された１４のアゾスピリラム属菌種のうち（非特許文献１８、非特許文献１９参照）、その種の菌株の取得または培養の困難さのために７つの種は本実施例での考慮対象外とした（例えばＡ．ｄｏｅｂｅｒｅｉｎｅｒａｅ ＤＳＭＺ １３１３１ＴＳ）。
【００３８】
これまでの系統分類学的解析では、種間の関係が分析間で多少異なる点はあるが、考慮対象外とした上記７つの種は何れも本研究で使用された７つのアゾスピリラム属菌種の間に位置するという結果を示す。考慮対象外とした上記７つの種は、
（１）Ａ．ｄｏｅｂｅｒｅｉｎｅｒａｅ（非特許文献９、非特許文献１９）、
（２）Ａ．ｌａｒｇｉｍｏｂｉｌｅ（非特許文献９、非特許文献２０）、
（３）Ａ．ｃａｎａｄｅｎｓｅ（非特許文献２１、非特許文献２３、非特許文献１９）、
（４）Ａ． ｍｅｌｉｎｉｓ（非特許文献２１、非特許文献２３）、
（５）Ａ． ｚｅａｅ（非特許文献２２、非特許文献２３）、
（６）Ａ． ｏｒｙｚａｅ（非特許文献２０、非特許文献２４）、
（７）Ａ．ｐａｌａｔｕｍ（非特許文献１９参照）である。
【００３９】
１５の非アゾスピリラム菌株は、類縁細菌群（非特許文献１７参照）とＢａｕｄｏｉｎら（非特許文献３参照）が研究において使用した土壌バクテリアの菌株から選択された。
【００４０】
プライマーセットの属特異性の分析実験は、次のように行われた。２７の標準株の定常期培養物（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ−ｐｈａｓｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）の一定分量を、遠心し、滅菌蒸留水に再懸濁させた溶液を９５°Ｃにおいて５分間放置した後、遠心を行いＰＣＲの鋳型となる細胞溶解物上清を得た。
【００４１】
ＰＣＲ反応混合物は、１０ｘＰＣＲバッファー２．５μｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰを０．２５ｍＭずつ、各プライマーを０．０２μＭずつ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＩＯＴＡＱ，ＢｉｏＬｉｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を２．５ユニット、粗製のバクテリア溶解物１０μｌを含み、総量は２５μｌである。
【００４２】
ＰＣＲはＶｅｒｉｔｉサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳ）によって、下記条件に基づいて実施された。まず９４°Ｃにおいて３分間放置し、初期変性させる。次に、下記操作を３５サイクル繰り返す。各サイクルは、９４°Ｃで３０秒間変性させた後、各プライマーセットの最適温度で３０秒アニーリングさせ、７２°Ｃで１分間伸長させる。上記最適温度として、Ａｚ１６Ｓ-Ａ（配列番号１及び２として示す）,Ａｚ１６Ｓ-Ｂ、Ａｚ１６Ｓ‐Ｃは５８°Ｃである。ＡｚｉｐｄＣ、ＡｚｎｉｆＡ−Ａ、ＡｚｎｉｆＡ−Ｂは５２°Ｃである。ＡｚｎｉｆＨ‐Ａ，ＡｚｎｉｆＨ‐Ｂ，ＡｚｎｉｆＨ‐Ｃは５５°Ｃである（塩基配列に関しては表１を参照）。上記３５サイクルが終了した後、７２°Ｃで５分間放置し最終的な伸長をさせた。Ｂａｕｄｏｉｎらによって報告されたｆＡＺＯ／ｒＡＺＯプライマーを使用したＰＣＲは、彼らの報告した手順に従って実施した。ＰＣＲ産物は、１００−ｂｐＤＮＡラダー（ＨｙｐｅｒＬａｄｄｅｒＩＶ，ＢｉｏＬｉｎｅ）と共に２％アガロースゲル中に展開され、臭化エチジウム溶液によって染色され、ＡＥ‐６９０５Ｈ Ｉｍａｇｅ Ｓａｖｅｒ ＨＲ（ＡＴＴＯ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって撮影された。
【００４３】
このＰＣＲ実験によって選ばれたＡｚ１６Ｓ‐Ａプライマーセットの属特異性は、さらに、３５のアゾスピリラム様分離株及び７０の未知の分離株に対しても、同様のＰＣＲ及び電気泳動の手順によって分析された（後述の実施例３を参照）。
【００４４】
＜結果＞
上記属特異性分析実験の結果を、表２に示した。表２において＋及び−はそれぞれ、予測アンプリコンの有無を示している。すなわち、＋は予測アンプリコンが得られたことを指し、−は予測アンプリコンが得られなかったことを指す。
【００４５】
【表２】
【００４６】
実験が行われた１０のプライマーセット（表１を参照）において、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に基づき設計されたプライマーセットＡｚ１６Ｓ-Ａは、１２のアゾスピリラム標準株（７の種）すべて及び１の非アゾスピリラム属菌株Ｒｈｏｄｏｃｉｓｔａ ｃｅｎｔｅｎａｒｉａ ＤＳＭ９８９４（表２参照）に対して、単一のアンプリコンを生成させることに成功した。アンプリコンは単一のＤＮＡバンドとして観察され、上記ＤＮＡバンドの長さはおおよそ６４０ｂｐであって（図１を参照）、この長さはＡ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ １６Ｓ ｒＤＮＡ配列から予測された長さ（表１を参照）に一致するものである。なお、非アゾスピリラム属菌株Ｒｈｏｄｏｃｉｓｔａ ｃｅｎｔｅｎａｒｉａは、自然界では温泉などの特殊環境に棲息することが報告されており、アゾスピリラム属菌とは棲息環境が異なる。
【００４７】
プライマーセットＡｚ１６Ｓ-Ｂを用いたＰＣＲは、１２のアゾスピリラム標準株すべてから予測アンプリコンを生成させただけでなく、α−プロテオバクテリア及びβ−プロテオバクテリアにわたる１０の非アゾスピリラム属菌株からも、予測アンプリコンを生成させた。
【００４８】
プライマーセットＡｚ１６Ｓ-Ｃ、ＡｚｎｉｆＨ-Ａ、及びＡｚｎｉｆＨ-Ｂは、Ｂａｕｄｏｉｎらによって報告されたプライマーセットｆＡＺＯ／ｒＡＺＯと同じように、１２のアゾスピリラム属菌株のうち、１−３の株に対してはアンプリコンを生成させることができず、１７の非アゾスピリラム属菌株のうち、２-５の株に対しては複数のアンプリコンを生成させた。これらの４のプライマーセットにおいて、プライマーセットＡｚｎｉｆＨ-Ａ及びＡｚｎｉｆＨ-Ｂは、他の２のプライマーセットに比べ比較的良い属特異性を示した。残りの４つのプライマーセットからは良くない結果が得られた。従って、プライマーセットＡｚ１６Ｓ-Ａはアゾスピリラム属菌に対して最も優れた特異性を示した。
【００４９】
ここで、図１について説明すると、図１は、プライマーセットＡｚ１６Ｓ−Ａを用いた、未知分離株に対するＰＣＲ実験の結果を示している。ＰＣＲ産物は２％アガロースに溶解され、臭化エチジウム溶液によって染色された。識別された分離株は、１６ＳｒＤＮＡ配列決定解析によって、下記のように確認された。レーン１はＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ及びＲａｈｎｅｌｌａによって汚染された、アゾスピリラム属菌培養物であり、レーン２はＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、レーン３はＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、レーン４はアゾスピリラム、レーン５はアゾスピリラム、レーン６はＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、レーン７はアゾスピリラム、レーン８はＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、レーン９はアゾスピリラム、レーン１０はＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、レーン１１は参照物としてのＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２４ＴＳ、レーンＭは１００−ｂｐＤＮＡラダーである。
【００５０】
〔実施例３〕
＜作製されたプライマーセットの利用可能性＞
さらに、３５のアゾスピリラム様分離株と、農業サンプルから得られた７０の未知の分離株を用いて、選択されたプライマー候補の特異性、検出限界及び利用可能性について調べた。アゾスピリラム属菌の分離において検出限界は重要な面であって、根圏土壌及び植物体から分離するプロセスにおいては、アゾスピリラム属の菌落及び培養物はしばしば非アゾスピリラム微生物によって汚染されているからである。
【００５１】
（使用された３５のアゾスピリラム様分離株と７０の未知の分離株）
アゾスピリラム様分離株は、根圏土壌並びに作物及び草の根部から収集されたものである。上記収集は、独立行政法人農業生物資源研究所（ＮＩＡＳ）と十勝農業協同組合連合会農産化学研究所（ＡＲＩＴＦＡＣ）によって、選択培地及び形態生理学評価の両方を用いて行われた。選択培地は例えば、窒素不含有ブロモチモールブルー（ＮＦｂ）培地、Ｒｏｊｏ Ｃｏｎｇｏ（コンゴレッド）培地である。形態生理学評価は、例えば、アセチレン減少分析（ＡＲＡ）（非特許文献５、非特許文献９）である。これらの分離株のｒＤＮＡ配列データは入手できないものであった。全部で３５のアゾスピリラム様分離株を、上記収集されたコレクションからランダムに選出した。さらに、根圏土壌、穀物及び飼草の根部から、ＡＲＡとｒＤＮＡ配列決定を用いずに、選択培地のみによって収集した我々のストックから、７０の未知の分離株をランダムに選出した。これらの分離株の「属」及び「種」は未知であった。使用された３５のアゾスピリラム様分離株は多数の、７０の未知の分離株は少数の、アゾスピリラム属菌を含むものと考えられる。
【００５２】
（作製したプライマーセットによる検出実験）
すべての菌株及び分離株に対して、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定解析を行った。ボイル法によって抽出された粗製ＤＮＡは、アゾスピリラム１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に基づき設計されたＡｚ１６Ｓ-Ｄ配列決定プライマーによって、ＰＣＲ増幅された。Ａｚ１６Ｓ-Ｄ配列決定プライマーセットのフォワードプライマーは５’ＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＡＧＧＧＧＧＣであり、リバースプライマーは５’ＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＧＣである。当該プライマーセットによるアンプリコンサイズは、おおよそ６５０ｂｐと推測され、それは属レベルで系統発生的分類をするのには充分である。ＰＣＲはアニーリング温度６０°Ｃで、前記のＰＣＲ実験で記載されているのと同じ手順によって実施された。ＰＣＲ産物はＭｉｎ−Ｅｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製され、Ａｚ１６Ｓ-Ｄフォワードプライマー、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクル配列決定キット，３７３０ｘｌＤＮＡアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって配列決定された。配列データは、ＳＥＱ ＭＡＴＣＨ ｐｒｏｇｒａｍ ｖｅｒ．３．０（非特許文献７参照）を使用し、リボソームデータベースプロジェクト（リリース１０、ミシガン州立大学微生物生態学センター［ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ］）で得られたデータと比較し、カットオフ類似性（Ｓａｂ）値を＞０．７に設定しマッチする微生物種を探索し上位２０マッチに基づき菌株及び分離株の属を決定した。
【００５３】
＜結果＞
上記作製したプライマーセットによる検出実験の結果を、表３に示した。
【００５４】
【表３】
【００５５】
表３は、３５のアゾスピリラム様分離株及び７０の未知分離株に対するＰＣＲ実験及びｒＤＮＡ配列決定解析の結果を比較したものである。表３において、ＮＩＡＳは独立行政法人農業生物資源研究所であり、ＡＲＩＴＦＡＣは十勝農業協同組合連合会農産化学研究所である。＋と−はそれぞれ、予測されたアンプリコンの有無を示している。
【００５６】
表３によれば、プライマーセットＡｚ１６Ｓ-Ａを用いたＰＣＲは、ＮＩＡＳから入手した２０のアゾスピリラム様分離株のうち１７の菌株から、予測された単一のアンプリコンを得た。ＰＣＲ検出においてアンプリコンが得られた１７の分離株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定解析によって、アゾスピリラム属に分類され、残りの３つの株は、Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍに分類された。ＰＣＲ実験及びｒＤＮＡ配列決定解析の結果における完全な一致は、ＡＲＩＴＦＡＣから入手した１５のアゾスピリラム様分離株及び我々のストックから入手した７０の未知分離株においても見られた（表３及び図１を参照）。アンプリコンが得られた５つの未知分離株のうちの一つ（図１レーン１参照）のｒＤＮＡ配列決定解析は、この培養物はアゾスピリラムのほかにも二つの種、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ及びＲａｈｎｅｌｌａを含んでいることを示した。従って、プライマーセットＡｚ１６Ｓ-Ａを用いたＰＣＲは、混合培養物におけるアゾスピリラムを成功裏に検出することができた。Ｂａｕｄｏｉｎらによって報告されたプライマーセットｆＡＺＯ／ｒＡＺＯを用いたＰＣＲでは、アゾスピリラム疑似分離株に対して、ＰＣＲ実験及びｒＤＮＡ配列決定解析の結果における完全な一致が見られた。しかし、７０の未知分離株のうち（詳細は示していない）、２つの非アゾスピリラム分離物（ＢａｃｉｌｌｕｓとＰａｎｔｏｅａ）からも、５つのアゾスピリラムと同様に、アンプリコンを生成させた。
【００５７】
ＮＩＡＳから入手した分離株のうち、３つの非アゾスピリラム分離株は、Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ種である。同じように、我々のストックからの６７の非アゾスピリラム分離株のうち、３４はＢａｃｉｌｌｕｓとして同定され、８はＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとして、６はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓとして、６はＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓとして、６はＡｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒとして、２はＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓとして、２はＬｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓとして、１はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕとして、１はＰａｎｔｏｒａとして、１はＹｅｒｓｉｎｉａとして同定された。
【００５８】
〔実施例４〕
＜アンプリコンの存在を示した分離株のキャラクタリゼーション＞
上記実施例３において、７０の未知分離株のうち、Ａｚ１６Ｓ-Ａプライマーを用いたＰＣＲによって得られたアンプリコンの存在が確認されたのは５つの分離株である。この５つの分離株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定解析によって、アゾスピリラム属に分類された。これらの属種及び生理学的特性をさらに調べるため、この５つの分離株における炭素源利用、ＩＡＡ生成、窒素固定化について、Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２４ＴＳ及びＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２６と比較しながら評価した。炭素源利用の評価についてはＡＰＩ２０ＮＥシステム（ｂｉｏＭＥＲＩＥＵＸ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、製造元のプロトコルに従って実施した。ＩＡＡ生成については、修飾されたＳａｌｋｏｗｓｋｉ試薬（非特許文献１２を参照）を用いて比色法によって計測された。分離株は１ｍＭトリプトファンを補充したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロスにおいて、３０°Ｃ条件下において２日間、定常期になるまで培養され、それからＩＡＡの計測に供された（非特許文献８を参照）。窒素固定能は、水素炎イオン検出器を備えたガスクロマトグラフ装置（ＧＣ-４０００ ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ＡＲＡ法（非特許文献９、非特許文献１５を参照）によって見積もられた。ＡＲＡを行うため、バクテリア培養物は、２ｍｌの濃度１％（ｖ／ｖ）の半固体ＮＦｂ培地に添加され、９−ｍｌ密封バイアル瓶中において、３０°Ｃ条件下で２４時間培養された。上記培養後に１０体積％（気体体積）のアセチレンをバイアル瓶中に導入し、さらに２４時間培養し、それからガスクロマトグラフィーを実施した。それぞれの分離株のＩＡＡ生成及びアセチレン減少については、それぞれ３〜４のバイアル瓶で重複して実験された。
【００５９】
＜結果＞
上記アンプリコンの存在を示した分離株のキャラクタリゼーション実験の結果を、表４に示した。
【００６０】
【表４】
【００６１】
表４は、いわゆる農業サンプルからＰＣＲ実験によって分離されたアゾスピリラム属菌の炭素源利用、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）生成及びアセチレン減少について示した表である。炭素源利用タイプはＡＰＩ２０ＮＥシステムによって評価されたものであり、ＡＢタイプはＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅに特有の利用型であって、Ｎ−アセチルグルコサミン（−）、Ｌ−アラビノース（＋）、Ｄ−グルコース（−）、Ｄ−マンニトール（−）、Ｄ−マンノース（−）を利用するものである。
【００６２】
我々のストックから入手の分離株のうち、アンプリコンが得られた５つの分離株は、Ａ ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ（表４を参照）に特有的な炭素源利用型と同様の炭素源利用型を示した。ＩＡＡ生成能及びアセチレン減少（窒素固定）能力は、５つの分離株すべてにおいて見られた。分離株におけるこれら二つの能力は、Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２４ＴＳより優れていた。アセチレン減少に見られる分離株同士の大きな差異は、ＩＡＡ生成に見られる分離株同士より顕著であった。分離株のＩＡＡ生成とアセチレン減少との間には、顕著な相関性は観察されなかった。これらの結果から、プライマーセットＡｚ１６Ｓ‐Ａは、アゾスピリラム独特の生理学特性を示す分離株を正確に識別する能力を有することがさらに確認された。
【００６３】
〔実施例５〕
＜プライマーセットの検出限界＞
Ａｚ１６Ｓ-Ａプライマーを用いたＰＣＲを、異なる濃度（１０‐１０６ＣＦＵｍｌ−１）のＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ（ＪＣＭ １２２４ＴＳ）に対して、上記と同じ手順にて実施した。さらに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕs（ＭＡＦＦ １１８２５６）が混入されたＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ（ＪＣＭ １２２４ＴＳ）培養物に対しても、ＰＣＲを実施した。バチルス属菌がモデル汚染菌として選ばれた理由は、我々の実験系において、アゾスピリラム選択培地に観察される非アゾスピリラム属菌の大部分においてバチルス属菌が存在するからである。混合培養物を得るために、アゾスピリラム及びバチルス培養物はそれぞれ、ＬＢ培養液において３７℃条件下において４８時間及び２４時間培養された。それから、最終菌濃度が１０７ＣＦＵｍｌ−１となるように、Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ：Ｂ． ｐｕｍｉｌｕｓを１：１〜１：１０４の異なる比率で混合した。プライマーの検出限界とは、検出可能なＰＣＲアンプリコンをもたらすことのできる、最小のアゾスピリラム濃度または比率である。
【００６４】
＜結果＞
プライマーセットＡｚ１６Ｓ-Ａを用いるＰＣＲは、１０３ＣＦＵｍｌ−１の濃度を有するＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ純粋培養物から、予測サイズに該当する検出可能な量のアンプリコンを生成させることが出来た（図２中の（ａ）を参照）。同様に、Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ：Ｂ． ｐｕｍｉｌｕｓを１：１０４またはそれ以上の比率で混合して得られた混合培養物からも、ＰＣＲでは同じように予想アンプリコンを生成することが出来た（図２中の（ｂ）を参照）。Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ：Ｂ． ｐｕｍｉｌｕｓを１：１０４の比率で混合した混合培養物は、おおよそ１０３ＣＦＵｍｌ−１のＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅを含んでいる。したがって、プライマーセットの検出限界は、純粋培養物及び混合培養物において同じである。さらに、ＰＣＲの汚染菌存在時におけるアゾスピリラム菌の検出能力は、農業サンプルから得られた７０の未知分離株においても確認された（図１レーン１参照）。
【００６５】
なお、図２は純粋培養物及び混合培養物におけるプライマーセットＡｚ１６Ｓ−Ａを用いたアゾスピリラム属菌のＰＣＲ検出を示した図である。図中（ａ）のＰＣＲ産物はＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２４ＴＳ純粋培養物から得られ、図中（ｂ）のＰＣＲ産物はＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ＭＡＦＦ １１８２５６が混合されたＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ 培養物から得られた。ＰＣＲ産物は２％アガロースに展開され、臭化エチジウム溶液によって染色された。図中（ａ）における、レーン上部の数字は、Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ濃度（ＣＦＵ ｍｌ−１）である。レーンＭは１００−ｂｐＤＮＡラダーである。図中（ｂ）において、レーン１はＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅのみ、レーン２は、Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ：Ｂ． ｐｕｍｉｌｕｓを１：１で混合したもの、レーン３は、１：１０で混合したもの、レーン４は、１：１０２で混合したもの、レーン５は、１：１０３で混合したもの、レーン６は１：１０４で混合したもの、レーン７は、Ｂ． ｐｕｍｉｌｕｓのみのもの、を夫々示す。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルに展開され、臭化エチジウム溶液によって染色された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、土壌サンプルを始め、各種サンプルからアゾスピリラム属菌を検出・同定する際に好適に利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明はプライマーセット、アゾスピリラム属菌の検出キット及び検出方法に係るものである。詳しくは、アゾスピリラム属菌１６Ｓ ｒＤＮＡに由来するＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し得るプライマーセット、当該プライマーセットを用いたアゾスピリラム属菌の検出キット及び検出方法に係るものである。
【背景技術】
【０００２】
アゾスピリラム属菌は、窒素固定能を有する好気性の桿状α−プロテオバクテリアとして知られている。アゾスピリラム属菌は世界中において、根圏土壌及び多種の植物根部から分離されている。多くのアゾスピリラム属菌株は、植物成長促進細菌（ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ，ＰＧＰＢ）として報告されている。植物成長促進細菌とは、作物の生長を促進させることができる細菌である。この成長促進は、アゾスピリラム属菌株による植物ホルモンの生成、窒素固定、植物免疫によってもたらされるものとして考えられている。従って、アゾスピリラム属の細菌は、バイオ肥料及びバイオ殺虫剤として利用され、近年の農業用の化学薬品を減らす需要により、多くの注目を集めている。
【０００３】
しかしながら、根圏土壌及び植物体からのアゾスピリラム属菌の識別及び分離は、選択培地及び形態生物学的評価による従来的な方法に頼るしかなかった。従来の方法では、複数の選択培地（例えばＮＦｂ、ＲＣ培地など）を利用しながら、菌の形態または窒素固定能などを評価して、候補となる菌株を絞り込んだ上で、さらにｒＤＮＡ配列の解読を行う必要があった。これらの従来の方法は、アゾスピリラム属菌に対する専門知識と実験経験、１〜２ヶ月の時間と、多大な労力とコストを必要とする。さらに、選択培地の利用と菌種特性の評価を繰り返すため、培地適応性と評価値の高い菌株が分離されやすく、分離した菌株には意図していない選択バイアスが生じることがある。
【０００４】
最近のＤＮＡ配列解析技術の発展によって、ターゲットとなる微生物の検出及び識別において分子遺伝学的な識別法が考えられるようになった。非特許文献１〜非特許文献２３は、アゾスピリラム属菌の検出と識別にかかわる情報を開示しており、これらのうち、特に非特許文献１〜３，７，１０，１１，１３〜１７は分子遺伝学的な識別法について開示しているものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｌｄａｎｉ ＪＩ， Ｋｒｉｅｇ ＮＲ， Ｂａｌｄａｎｉ ＶＬＤ， Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａ， Ｄｏｂｅｒｅｉｎｅｒ Ｊ （２００５） Ｇｅｎｕｓ ＩＩ． Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ． Ｉｎ： Ｂｒｅｎｎｅｒ ＤＪ， Ｋｒｉｅｇ ＮＲ， Ｓｔａｌｅｙ ＪＴ， Ｇａｒｒｉｔｙ ＧＭ （ｅｄｓ） Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄｎ ｖｏｌ ２ ｐａｒｔ Ｃ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ＮＹ， ｐｐ １６−１７
【非特許文献２】Ｂａｓｈａｎ Ｙ， Ｈｏｌｇｕｉｎ Ｇ， Ｌｉｆｓｈｉｔｚ Ｒ （１９９３） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ． Ｉｎ： Ｇｌｉｃｋ ＢＲ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＥ （ｅｄｓ） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ， ＦＬ， ｐｐ ３３１−３４５
【非特許文献３】Ｂａｕｄｏｉｎ Ｅ， Ｃｏｕｉｌｌｅｒｏｔ Ｏ， Ｓｐａｅｐｅｎ Ｓ， Ｍｏｅｎｎｅ−Ｌｏｃｃｏｚ Ｙ， Ｎａｚａｒｅｔ Ｓ （２０１０） Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ １６Ｓ−２３Ｓ ｒＤＮＡ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｐａｃｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ＰＧＰＲ ｉｎｏｃｕｌａｎｔｓ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ ＣＲＴ１ ｉｎ ｆｉｅｌｄ ｓｏｉｌ． Ｊ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １０８：２５−３８． ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２６７２．２００９．０４３９３．ｘ
【非特許文献４】Ｂｏｄｄｅｙ ＲＭ， Ｂａｌｄａｎｉ ＶＬＤ， Ｂａｌｄａｎｉ ＪＩ， Ｄｏｂｅｒｅｉｎｅｒ Ｊ （１９８６） Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐｐ． ｏｎ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｉｅｌｄ−ｇｒｏｗｎ ｗｈｅａｔ． Ｐｌａｎｔ Ｓｏｉｌ ９５：１０９−１２１． ｄｏｉ：１０．１００７／ＢＦ０２３７８８５７
【非特許文献５】Ｂｕｒｒｉｓ ＲＨ （１９７２） Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｆｉｘｉｎｇ−ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２４：４１５−４３１
【非特許文献６】Ｃａｃｅｒｅｓ ＥＡ （１９８２） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐｐ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４４：９９０−９９１
【非特許文献７】Ｃｏｌｅ ＪＲ， Ｃｈａｉ Ｂ， Ｆａｒｒｉｓ ＲＪ， Ｗａｎｇ Ｑ， Ｋｕｌａｍ ＳＡ， ＭｃＧａｒｒｅｌｌ ＤＭ， Ｇａｒｒｉｔｙ ＧＭ， Ｔｉｅｄｊｅ ＪＭ （２００５） Ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｄａｔａｂａｓｅ ｐｒｏｊｅｃｔ （ＲＤＰ−ＩＩ）： ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｒＲＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：２９４−２９６ ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｉ０３８
【非特許文献８】Ｄｏｂｂｅｌａｅｒｅ Ｓ， Ｃｒｏｏｎｅｎｂｏｒｇｈｓ Ａ， Ｔｈｙｓ Ａ， Ｂｒｏｅｋ ＡＶ， Ｖａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ Ｊ （１９９９） Ｐｈｙｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ａｌｔｅｒｅｄ ｉｎ ＩＡＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｎ ｗｈｅａｔ． Ｐｌａｎｔ Ｓｏｉｌ ２１２：１５５−１６４． ｄｏｉ：１０．１００７／ＢＦ０２３７８８５７
【非特許文献９】Ｅｃｋｅｒｔ Ｂ， Ｗｅｂｅｒ ＯＢ， Ｋｉｒｃｈｈ Ｇ， Ｈａｌｂｒｉｔｔｅｒ Ａ， Ｓｔｏｆｆｅｌｓ Ｍ， Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａ （２００１） Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｄｏｅｂｅｒｅｉｎｅｒａｅ ｓｐ． ｎｏｖ．， ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃ４−ｇｒａｓｓ Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ３３：３００−３０８
【非特許文献１０】Ｆａｎｃｅｌｌｉ Ｓ， Ｃａｓｔａｌｄｉｎｉ Ｍ， Ｃｅｃｃｈｅｒｉｎｉ ＭＴ， Ｓｅｒｉｏ ＣＤ， Ｆａｎｉ Ｒ， Ｇａｌｌｏｒｉ Ｅ， Ｍａｒａｎｇｏｌｏ Ｍ， Ｍｉｃｌａｕｓ Ｎ， Ｂａｚｚｉｃａｌｕｐｏ Ｍ （１９９８） Ｕｓｅ ｏｆ ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｓｏｉｌ ｍｉｃｒｏｃｏｓｍｓ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ４９：２２１−２２５． ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２５３００５１１６２
【非特許文献１１】Ｇｒｉｆｏｎｉ Ａ， Ｂａｚｚｉｃａｌｕｐｏ Ｍ， Ｓｅｒｉｏ ＣＤ， Ｆａｎｃｅｌｌｉ Ｓ， Ｆａｎｉ Ｒ （１９９５）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｏｐｅｒｏｎ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １２７：８５−９１． ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５７４−６９６８．１９９５．ｔｂ０７４５４．ｘ
【非特許文献１２】Ｇｌｉｃｋｍａｎｎ Ｅ， Ｄｅｓｓａｕｘ Ｙ （１９９５） Ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｌｋｏｗｓｋｉ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｉｎｄｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６１：７９３−７９６
【非特許文献１３】Ｊａｃｏｕｄ Ｃ， Ｆａｕｒｅ Ｄ， Ｗａｄｏｕｘ Ｐ， Ｂａｌｌｅｙ Ｒ （１９９８） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｔｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｂｅ ｔｏ ｆｏｌｌｏｗ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ ＣＲＴ１ ｕｎｄｅｒ ｆｉｅｌｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｒｏｏｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌ ２７：４３−５１ ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５７４−６９４１．１９９８．ｔｂ００５２４．ｘ
【非特許文献１４】Ｋａｂｉｒ ＭＭ， Ｆａｕｒｅ Ｄ， Ｈａｕｒａｔ Ｊ， Ｎｏｒｍａｎｄ Ｐ， Ｊａｃｏｕｄ Ｃ， Ｗａｄｏｕｘ Ｐ， Ｂａｌｌｙ Ｒ （１９９５） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｃａｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４１： １０８１−１０８７． ｄｏｉ：１０．１１３９／ｍ９５−１５１
【非特許文献１５】Ｍｅｈｈａｚ Ｓ， Ｍｉｒｚａ ＭＳ， Ｈａｕｒａｔ Ｊ， Ｂａｌｌｙ Ｒ， Ｎｏｒｍａｎｄ Ｐ， Ｂａｎｏ Ａ， Ｍａｌｉｋ ＫＡ （２００１） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｏｆ ｒｉｃｅ． Ｃａｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４７：１１０−１１７． ｄｏｉ：１０．１１３９／ｃｊｍ−４７−２−１１０
【非特許文献１６】Ｓｔｏｆｆｅｌｓ Ｍ， Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ Ｔ， Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａ （２００１） Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ １６Ｓ ｒＲＮＡ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ−Ｓｋｅｒｍａｎｅｌｌａ−Ｒｈｏｄｏｃｉｓｔａ−ｃｌｕｓｔｅｒ． Ｓｙｓｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２４：８３−９７． ｄｏｉ：１０１０７８／０７２３−２０２０−０００１１
【非特許文献１７】Ｘｉａ Ｙ， Ｅｍｂｌｅｙ ＴＭ， Ｏ’ｄｏｎｎｅｌｌ ＡＧ （１９９４） Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ １６Ｓ ｒＤＮＡ． Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １７：１９７−２０１
【非特許文献１８】Ｌｉｎ ＳＹ，Ｙｏｕｎｇ ＣＣ，Ｈｕｐｆｅｒ Ｈ，Ｓｉｅｒｉｎｇ Ｃ，Ａｒｕｎ ＡＢ，Ｃｈｅｎ ＷＭ，Ｌａｉ ＷＡ，Ｓｈｅｎ ＦＴ,Ｒｅｋｈａ ＰＤ, Ｙａｓｓｈｉｎ ＡＦ．（２００９）Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｐｉｃｉｓ ｓｐ．ｎｏｖ．，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｓｃａｒｄｅｄ ｔａｒ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５９：７６１−７６５．ｄｏｉ：１０.１０９９／ｉｊｓ．０．６５８３７−０
【非特許文献１９】Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｗｅｉ Ｗ，Ｗａｎｇ Ｘ，Ｘｕ Ｌ， Ｌａｉ Ｒ（２００９）Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｐａｌａｔｕｍ ｓｐ．ｎｏｖ．，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｏｒｅｓｔ ｓｏｉｌ ｉｎ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ．Ｊ Ｇｅｎ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５５：１−７．
【非特許文献２０】Ｐｅｎｇ Ｇ， Ｗａｎｇ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｇ，Ｈｏｕ Ｗ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｗａｎｇ ＥＴ， Ｔａｎ Ｚ（２００６）Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍｅｌｉｎｉｓ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｍｏｌａｓｓｅｓ ｇｒａｓｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５６：１２６３−１２７１．ｄｏｉ：１０.１０９９／ｉｊｓ．０．６４０２５−０
【非特許文献２１】Ｍｅｈｎａｚ Ｓ，Ｗｅｓｅｌｏｗｓｋｉ Ｂ， Ｌａｚａｒｏｖｉｔｓ Ｇ（２００７ａ） Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｃａｎａｄｅｎｓｅ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｒｎ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５７：６２０−６２４．ｄｏｉ：１０.１０９９／ｉｊｓ．０．６４８０４−０
【非特許文献２２】Ｍｅｈｎａｚ Ｓ，Ｗｅｓｅｌｏｗｓｋｉ Ｂ， Ｌａｚａｒｏｖｉｔｓ Ｇ （２００７ｂ） Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｚｅａｅ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ｏｆ Ｚｅａ ｍａｙｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５７：２８０５−２８０９．ｄｏｉ：１０.１０９９／ｉｊｓ．０．６５１２８−０
【非特許文献２３】Ｙｏｕｎｇ ＣＣ，Ｈｕｐｆｅｒ Ｈ，Ｓｉｅｒｉｎｇ Ｃ，Ｈｏ ＭＪ，Ａｒｕｎ ＡＢ，Ｌａｉ ＷＡ，Ｒｅｋｈａ ＰＤ，Ｓｈｅｎ ＦＴ， Ｈｕｎｇ ＭＨ， Ｃｈｅｎ ＷＭ， Ｙａｓｓｈｉｎ ＡＦ（２００８）Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｇｏｓｕｍ ｓｐ．ｎｏｖ．，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｏｉｌ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｓｏｉｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５８，９５９−９６３．ｄｏｉ：１０.１０９９／ｉｊｓ．０．６５０６５−０
【非特許文献２４】Ｈａｎ， Ｓ．Ｏ． ａｎｄ Ｎｅｗ， Ｐ．Ｂ． （１９９８） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐｐ． ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒａｌ ｓｏｉｌｓ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ． Ｓｏｉｌ Ｂｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３０， ９７５−９８１．
【非特許文献２５】Ｍｃｇｉｌｌｏｗａｙ， Ｒ．Ｌ．， Ｗｅａｖｅｒ， Ｒ．Ｗ．， Ｍｉｎｇ， Ｄ．Ｗ． ａｎｄ Ｐｉｌｌａｉ， Ｓ．Ｄ． （２００２） Ａ ＰＣＲ−ＭＰＮ ｂａｓｅｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｅｎｕｍｅｒａｔｅ ｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｚｅｏｐｏｎｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． Ｊ Ｒａｐｉｄ Ｍｅｔｈ Ａｕｔｏｍ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １０， ４９−５８．
【非特許文献２６】Ｍｉｒｚａ， Ｍ．Ｓ．， Ｍｅｈｎａｚ， Ｓ．， Ｎｏｒｍａｎｄ， Ｐ．， Ｃｏｍｂａｒｅｔ， Ｃ．Ｐ．， Ｌｏｃｃｏｚ， Ｙ．Ｍ．， Ｂａｌｌｙ， Ｒ． ａｎｄ Ｍａｌｉｋ， Ｋ．Ａ． （２００６） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒａｉｎ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｒｉｃｅ ｇｒｏｗｔｈ． Ｂｉｏｌ Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｏｉｌｓ ４３， １６３−１７０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
分子遺伝学的な識別法において、例えば、アゾスピリラム属菌については、ランダムに増幅される多型ＤＮＡの分析、及び増幅されたリボソームＤＮＡ断片の制限酵素分析をすることによって、アゾスピリラム属菌を他菌属と識別することが試みられた（非特許文献１０、非特許文献１１参照）。しかしながら、この方法は特定のアゾスピリラム属菌種、菌株のみを識別可能にすぎない。
【０００７】
また、アゾスピリラム株の１６Ｓ ｒＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブも開発され、アゾスピリラム属に属する菌の所在をつきとめ、その動的特徴を知るために使用された（非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１６参照）。しかしながら、プローブを使用するこの方法は煩雑な実験操作を必要とし、精密な操作及び熟練性を必要とする。
【０００８】
制限酵素及びプローブを用いた方法に比べ、プライマーセットを用いた方法は煩雑な実験操作を必要とせず、迅速かつシンプルな方法である。非特許文献３では、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子間スペーサ領域（ＩＳＲ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ）に基づき設計されたＰＣＲプライマーセットｆＡＺＯ／ｒＡＺＯについて開示している。しかしこのプライマーセットは、菌株によってはアゾスピリラム属菌を認識できなかったり（偽陰性）、非アゾスピリラム属菌を誤認識したりする（偽陽性）ことがしばしばあり、検出精度に問題点がある。
【０００９】
上記事情を鑑みて、本発明は、アゾスピリラム属菌をより精度よく、迅速かつシンプルに検出・識別することのできるプライマーセット、検出キット及び検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）アゾスピリラム属菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに由来するＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なプライマーセットであって、配列番号１で示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第一のプライマーと、配列番号２で示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第二のプライマーとからなるプライマーセット。
（２）上記第一のプライマーが、配列番号１で示される塩基配列においてｋがグアニンであるヌクレオチド、及び配列番号１で示される塩基配列においてｋがチミンであるヌクレオチドの少なくとも一方からなり、上記第二のプライマーが配列番号２で示される塩基配列を有するヌクレオチドからなる上記（１）に記載のプライマーセット。
（３）上記第一のプライマーが、配列番号１で示される塩基配列においてｋがグアニンである上記ヌクレオチド、及び配列番号１で示される塩基配列においてｋがチミンである上記ヌクレオチドの混合物からなる上記（２）に記載のプライマーセット。
（４）上記第一のプライマーにおいて１〜２個の塩基が欠失、置換、又は付加されており、かつ上記第二のプライマーにおいて１〜２個の塩基が欠失、置換、又は付加している上記（２）に記載のプライマーセット。
（５）上記（１）〜（４）の何れか一項に記載のプライマーセットを備えるアゾスピリラム属菌の検出キット。
（６）以下の工程：（ａ）対象サンプルからＤＮＡを含有する試料を調製する工程、（ｂ）上記試料に対して、上記（１）〜（４）の何れか一項に記載のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、（ｃ）上記工程（ｂ）で得られる増幅断片の有無を検出する工程、を含むアゾスピリラム属菌の検出方法。
（７）上記対象サンプルが、土壌サンプル又は植物由来サンプルである（６）に記載の検出方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、ＰＣＲ法でアゾスピリラム属菌を検出することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】プライマーセットＡｚ１６Ｓ−Ａを用いた、未知分離株に対するＰＣＲ実験の結果を示した図である。
【図２】純粋培養物及び混合培養物における、プライマーセットＡｚ１６Ｓ−Ａを用いたアゾスピリラム菌のＰＣＲ検出を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００１４】
（プライマーセット）
本発明に係るプライマーセットは、アゾスピリラム属に属する細菌（アゾスピリラム属菌）の１６Ｓ ｒＤＮＡに由来するＤＮＡ断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能なものである。すなわち、本発明に係るプライマーセットは、アゾスピリラム属菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ及び１６Ｓ ｒＤＮＡの断片にハイブリダイズして、ＰＣＲにより所定サイズの上記ＤＮＡ断片を増幅させる。
【００１５】
上記プライマーセットは、アゾスピリラム属菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに由来するＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって選択的に増幅可能という特性を有する。ここで、「選択的に増幅可能」とは、当該プライマーセットを用いたＰＣＲを行った場合に、アゾスピリラム属菌由来のＤＮＡ断片が専ら増幅産物として得られるが、他の多くの生物由来のＤＮＡ断片は増幅産物として実質的に得られないことを指す。実施例にも示すように、本発明に係るプライマーセットを用いた増幅では、アゾスピリラム属に属する複数種の細菌において共通のＰＣＲ増幅産物が得られる反面、アゾスピリラム属に近縁な細菌を含む多くの細菌ではＰＣＲ増幅産物が得られない。また、土壌サンプル及び植物含有サンプル（植物の根部等）に対するＰＣＲ増幅の結果から、本発明に係るプライマーは、植物、及びアゾスピリラム属菌ではない多くの土壌微生物由来のＰＣＲ増幅産物が実質的に得られないことが示されている（実施例参照）。従って、本発明に係るプライマーは、アゾスピリラム属菌の検出に極めて有用である。
【００１６】
本発明に係るプライマーセットは、具体的には以下の（１）〜（４）の何れかに示すヌクレオチド（より具体的にはＤＮＡ）である。
（１）配列番号１で示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第一のプライマーと、配列番号２で示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第二のプライマーとからなるプライマーセット。なお、配列番号１で表される塩基配列中のｋはグアニン又はチミンを示す。なお、ＰＣＲ増幅の選択性をより向上させる観点では、第一のプライマーは、配列番号１で示される塩基配列のうち連続する少なくとも１８塩基部分を有するヌクレオチドからなることがより好ましい。また、同様に、第二のプライマーは、配列番号２で示される塩基配列のうち連続する少なくとも１８塩基部分を有するヌクレオチドからなることがより好ましく、少なくとも２０塩基部分を有するヌクレオチドからなることがさらに好ましい。また、後述するように第一のプライマー、及び第二のプライマーともに、上記条件を満たす複数種のプライマーの混合物であってもよく、単独（１種類）のプライマーであってもよい。
（２）上記第一のプライマーが、配列番号１で示される塩基配列においてｋがグアニンであるヌクレオチド、及び配列番号１で示される塩基配列においてｋがチミンであるヌクレオチドの少なくとも一方からなり、上記第二のプライマーが配列番号２で示される塩基配列を有するヌクレオチドからなる上記（１）に記載のプライマーセット。
（３）上記第一のプライマーが、配列番号１で示される塩基配列においてｋがグアニンである上記ヌクレオチド、及び配列番号１で示される塩基配列においてｋがチミンである上記ヌクレオチドの混合物からなる上記（２）に記載のプライマーセット。第一のプライマーとして当該混合物を用いれば、アゾスピリラム属菌に対する特異性がより高まり、より多種類にわたるアゾスピリラム属菌を増幅可能となる。
【００１７】
上記第一のプライマーとして上記混合物を用いる場合、ｋがグアニンである上記ヌクレオチドとｋがチミンである上記ヌクレオチドとの混合比率は特に限定されず、例えば、１：９〜９：１の範囲内、より好ましくは４：６〜６：４の範囲内とすることができる。
（４）上記第一のプライマーにおいて１〜２個の塩基が欠失、置換、又は付加されており、かつ上記第二のプライマーにおいて１〜２個の塩基が欠失、置換、又は付加している上記（２）又は（３）に記載のプライマーセット。なお、基本となるプライマーに対して１〜２個の塩基に変異がある場合でも、所望のＰＣＲ増幅断片は得られる。また、上記（３）に記載のプライマーセットを構成する第一のプライマー（混合物）において、１〜２個の塩基が欠失又は置換する場合は、配列番号１で示される塩基配列におけるｋ以外の塩基が欠失又は置換しているものとする。
【００１８】
また、特に限定されないが各プライマーのＧＣ含量は、例えば、５０％〜７０％の範囲とするのが好ましく、５０％〜６５％の範囲とすることがより好ましい。プライマーのＴｍ値も特に限定されないが、例えば、５０℃〜６５℃とすることが好ましく、５０℃〜６０℃とすることがより好ましい。
【００１９】
本発明に係るプライマーセットは常法に従って合成することができる。また、本発明に係るプライマーセットを用いたＰＣＲの反応条件は特に限定されない。
【００２０】
（アゾスピリラム属菌の検出キット）
本発明に係るアゾスピリラム属菌の検出キットは、上記説明した本発明に係るプライマーセットを備える。この検出キットは、アゾスピリラム属菌の有無の判別を含む検出に用いる。さらに、必要に応じて、１）ＰＣＲに用いる各種試薬及び器具（ポリメラーゼ、ＰＣＲバッファー、各ｄＮＴＰ、ピペット等）、２）ＰＣＲに供するＤＮＡを含有する試料を調製するための各種試薬及び器具（試験管、バッファー等）、３）ＰＣＲ増幅断片を解析するための各種試薬及び器具（電気泳動ゲル材料、ピペット等）、４）さらなる詳細解析のため、アゾスピリラム属に属する特定種のみを増幅可能なＰＣＲプライマーセット、５）検出キットの使用説明書、等の少なくとも１つを備えていてもよい。
【００２１】
（アゾスピリラム属菌の検出方法）
本発明に係るアゾスピリラム属菌の検出方法は、以下の工程：
（ａ）対象サンプルからＤＮＡを含有する試料を調製する工程、
（ｂ）上記試料に対して、本発明に係るプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
（ｃ）上記工程（ｂ）で得られる増幅断片の有無を検出する工程、
を含む。
【００２２】
以下、各工程を説明する。
【００２３】
（１）工程（ａ）
工程（ａ）は、対象サンプルからＤＮＡを含有する試料を調製する工程である。
ここで、「対象サンプル」とは、アゾスピリラム属菌の有無を判別しようとするサンプルを意味する。対象サンプルは、アゾスピリラム属菌を含む可能性のあるものであればよく、限り特に限定されない。例えば、土壌サンプル、植物の根部等の植物由来サンプル、培地上の微生物コロニー、微生物を含む培養液等が挙げられる。
【００２４】
ＤＮＡを含有する試料は、例えば、土壌サンプル等の対象サンプルから常法に従って調製することができる。例えば、ボイル法、ＣＴＡＢ法等が挙げられる。これらの中では、操作の簡便さの観点では、ボイル法が好ましい。なお、ボイル法とは、対象サンプルを液体中（例えば、滅菌蒸留水又はバッファー）に懸濁して短時間（例えば５分程度以下）加熱して、ＤＮＡを取り出す方法である。
【００２５】
なお、調製されたＤＮＡを含有する試料には、ＤＮＡの他に、各種ＲＮＡ、タンパク質、細胞破砕物、等が含まれる。従って、該試料を常法に従って精製してもよい。但し、実施例にも示す通り、本発明の方法では、当該試料に対して一切の精製を行わなくとも、一度のＰＣＲにより非常に高感度な検出を行うことができる。
【００２６】
（２）工程（ｂ）
工程（ｂ）は、上記試料に対して、上記した本発明に係るプライマーセットを用いたＰＣＲを行う工程である。工程（ｂ）におけるＰＣＲは、常法に従って行うことができる。工程（ｂ）により、試料中にアゾスピリラム属菌が含まれている場合には、使用したプライマーの塩基配列を両端に有するアゾスピリラム１６Ｓ ｒＤＮＡ由来のＰＣＲ増幅断片が得られる。
【００２７】
（３）工程（ｃ）
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られるＰＣＲ増幅断片の有無を検出する工程である。ＰＣＲ増幅断片（アンプリコン）の有無の確認は、常法に従って行うことができる。例えば、電気泳動によりＰＣＲ増幅断片の有無及びサイズを確認することができる。
【００２８】
ＰＣＲ増幅断片の有無の確認の結果、ＰＣＲ増幅断片が存在する場合には、対象サンプルにアゾスピリラム属菌が存在すると判別することができる。また、ＰＣＲ増幅断片の有無の確認の結果、ＰＣＲ増幅断片が存在しない場合には、対象サンプルにアゾスピリラム属菌が存在していないと判別することができる。
【００２９】
従来法による農業サンプルからのアゾスピリラム属菌の分離プロセスでは、選択培地の使用と菌の生理形態学的評価を繰り返し行うため、一定の特徴を持った菌株のみを分離する選択バイアスが生じる。例えば、非特許文献２４では、窒素源を含まない培地を使用した従来の分離プロセスにおいて、高い窒素固定能を有するアゾスピリラム属菌が分離され、低い窒素固定能の菌株は分離できなかったことを開示している。後述する実施例にも示す通り、本発明の一形態としてのＡｚ１６Ｓ−Ａプライマーセットを使用したアゾスピリラム属菌のＰＣＲ検出により、選択培地と生理形態学的評価の使用を減らすことができるため、結果的に選択バイアスを低減させた分離プロセスを実現できる。また、本発明の一形態であるこのＰＣＲ検出法は、農業サンプルから多様なアゾスピリラム属菌を分離し、新規の植物成長促進細菌株を探索する上で有用な手法、またはアゾスピリラム属菌集団の多様性と生態とを分析するための有用な手法として利用できる。多数のアゾスピリラム属菌及び分離株を対象にしてＡｚ１６Ｓ−ＡプライマーセットによるＰＣＲ増幅産物（アンプリコン）のＤＮＡ配列を決定したところ、少なくとも１５の一塩基多型（ＳＮＰ）が見出され、そのうち１２の一塩基多型は購入可能な制限酵素の認識サイトである。さらに、この１２のＳＮＰのうちの一つは、アゾスピリラム属菌とＲ．ｃｅｎｔｅｎａｒｉａとの識別に有用であると見込まれる。一塩基多型について更なる分析と確認が必要であるが、おそらく、Ａｚ１６Ｓ−Ａプライマーセットの利用により、一回のＰＣＲと制限酵素処理（例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析法）によって、アゾスピリラム属分離株またはアゾスピリラム属菌集団の精密な同定及び多様性分析の両方が可能である。さらに、発明者らの実験では、根圏土壌と植物体部位に対してＡｚ１６Ｓ−Ａプライマーセットを使用し、アゾスピリラム属菌の局在性を予測している。このような微生物動態の分析では、非特許文献１６で開示された、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブも使用できるが、しかし我々の方法は、アゾスピリラム属菌の動態分析後の分離プロセスにおいても利用できる点で優位性がある。ＰＣＲ法は最確数（ＭＰＮ）法と併用することによって、アゾスピリラム属菌集団の定量にも利用できる（非特許文献２５、２６参照）。本発明のＰＣＲ法を組み込んだ迅速、容易且つ選択バイアスが最小となったアゾスピリラム分離技術、及びＡｚ１６Ｓ−Ａプライマー配列に基づくリアルタイムＰＣＲ定量技術に対するさらなる応用が考えられる。
【実施例】
【００３０】
〔実施例１〕
＜プライマーセットの設計及び作製＞
アメリカ国立バイオテクノロジーインフォメーションセンター （ＮＣＢＩ， ＵＳＡ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／ＧｅｎＢａｎｋＦｔｐ．ｈｔｍｌ）ジーンバンクヌクレオチドデータベースから合計３０個のアゾスピリラム１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（１４の種から）を入手し、バチルス属菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ属菌を含む関連する類縁細菌群の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と比較しながら、１６Ｓ ｒＤＮＡの開始コドンの下流３００ｂｐ〜１２００ｂｐにおける、推測上の属特異的且つ保存的領域について同定した。
【００３１】
推測上のアゾスピリラム属特異的領域に基づき、属特異的なプライマーセットを設計するために、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｏ ４．８．５ソフトウエア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ Ｌｔｄ社， Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を使用して、アゾスピリラム及びその類縁細菌群に属する菌に対して、ＤＮＡ配列アライメント解析を実施した。同様に、ジーンバンクから６つのｉｐｄＣ遺伝子配列（３つのアゾスピリラム属菌種から）、３つのｎｉｆＡ遺伝子配列（２つのアゾスピリラム属菌種から）、１２のｎｉｆＨ遺伝子配列（３つのアゾスピリラム属菌種から）を入手し、プライマーセットを設計した。ｉｐｄＣ、ｎｉｆＡ及びｎｉｆＨ遺伝子は何れも細菌による植物成長促進において重要な遺伝子である。具体的には、ｉｐｄＣ遺伝子は、インドール−３−酢酸生合成酵素をコード化するものであり、ｎｉｆＡ遺伝子及びｎｉｆＨ遺伝子はそれぞれ、窒素固定のためのニトロゲナーゼ酵素の制御遺伝子及び構造遺伝子をコード化するものである。
【００３２】
各プライマーセットの設計に際して、次の条件（１）〜（３）を適用した。（１）原則として２０個前後、好ましくは２０個を超えるヌクレオチド塩基を有するプライマーセットを設計し、（２）上記プライマーセットは２００−８００ｂｐのＤＮＡ断片（アンプリコン）を生成させると予測されるものを選択し、（３）上記プライマーセットのヌクレオチドコードはアゾスピリラム属菌の間で同じかまたは最大で２塩基程度異なるものを許容するように設計した。表１は、Ｂａｕｄｏｉｎらによって報告されたｆＡＺＯ／ｒＡＺＯプライマー（非特許文献３参照）と共に、今回設計されたプライマーを表示したものである。設計されたが、簡易ＰＣＲを伴う予備分析（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ａｓｓａｙｓ）によって排除されたものは、表１には示されていない。
【００３３】
＜結果＞
表１は、今回設計した９つのプライマーセットと共に、Ｂａｕｄｏｉｎらによって報告されたプライマーセットｆＡＺＯ／ｒＡＺＯ（非特許文献３参照）を表示したものである。プライマー名に１６Ｓが含まれるもの、ｉｐｄが含まれるもの、ｎｉｆが含まれるものは、順に、１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列、ｉｐｄの塩基配列、ｎｉｆの塩基配列に基づき設計されたものである。設計されたが予備分析（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ａｓｓａｙｓ）によって排除されたものは、表１には示されていない。表において、ＫはＧ及びＴの二種の塩基の混合（すなわち、Ｋがグアニンであるプライマーと、Ｋがチミンであるプライマーとの混合物。両者の混合比率は約１：１。）であることを意味している。アンプリコンサイズはアゾスピリラム・ブラシレンセ ＪＣＭ １２２４ＴＳのＤＮＡ配列により推測されたものである。
【００３４】
【表１】
【００３５】
〔実施例２〕
＜プライマーセットの属特異性評価＞
１２のアゾスピリラム標準株（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ）及び１５の非アゾスピリラム標準株について、実施例１で作製したプライマーセットの属特異性について調べた。
【００３６】
使用した１２のアゾスピリラム標準株及び１５の非アゾスピリラム標準株、合計２７の標準株を以下に示した。ＴＳは基準株であることを示している。
【００３７】
（アゾスピリラム属の１２の標準株）
（１）Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２４ＴＳ
（２）Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２５
（３）Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２６
（４）Ａ． ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ ＪＣＭ １２２７
（５）Ａ． ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ ＪＣＭ １２２８
（６）Ａ． ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ ＪＣＭ １２４７ＴＳ
（７）Ａ． ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ ＪＣＭ １２７０
（８）Ａ． ａｍａｚｏｎｅｎｓｅ ＤＳＭ ２７８７ＴＳ
（９）Ａ． ｈａｌｏｐｒａｅｆｅｒｅｎｓ ＤＳＭ ３６７５ＴＳ
（１０）Ａ． ｉｒａｋｅｎｓｅ ＤＳＭ １１５８６ＴＳ
（１１）Ａ． ｐｉｃｉｓ ＤＳＭ １９９２２ＴＳ
（１２）Ａ． ｒｕｇｏｓｕｍ ＤＳＭ １９６５７ＴＳ
（非アゾスピリラム属の１５の標準株）
アゾスピリラム属の類縁細菌群に属するもの：
（１）Ｒｈｏｄｏｃｉｓｔａ ｃｅｎｔｅｎａｒｉａ ＤＳＭ ９８９４ＴＳ
（２）Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃｕｍ ＤＳＭ ３８５６ＴＳ
（３）Ｐａｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｆｕｌｖｕｍ ＤＳＭ １１３ＴＳ
（４）Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ ＤＳＭ ４６７ＴＳ
（５）Ｒ． ｓａｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ ９１５４ＴＳ
（６）Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ ｌｕｃｅｎｔｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １４０００ＴＳ
そのほかのプロテオバクテリア：
（７）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＭＡＦＦ ３０１２２４
（８）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＭＡＦＦ ３０１５４０
（９）Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ ＭＡＦＦ ２１００３９
（１０）Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ ｓｐ． ＲＥＲＴ ０２０１２６
（１１）Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＭＡＦＦ ３０１６９０
（１２）Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＲＥＲＴ ０２００１８
Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓに属するもの：
（１３）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ＭＡＦＦ １１８２５６
（１４）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ＲＥＲＴ ０２０１１１
（１５）Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ ＲＥＲＴ ０２００２０
１２のアゾスピリラム及び１５の非アゾスピリラム、合計２７の標準株（表２を参照）は、ドイツ微生物・培養細胞収集有限会社（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ、ＤＳＭＺ）から（１１のＤＳＭ菌株）、日本独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＪＣＭ）から（７つのＪＣＭ菌株）、日本独立行政法人農業生物資源研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＩＡＳ）から（５つのＭＡＦＦ菌株）、および発明者の細菌コレクションから（上記（１０）、（１２）、（１４）、（１５）のＲＥＲＴ菌株４つ）入手したものである。１２のアゾスピリラム属菌株は、ＰＣＲ実験の時点で、上記機関において入手できるアゾスピリラム属７種すべてを含む。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ及びＮＣＢＩで報告された１４のアゾスピリラム属菌種のうち（非特許文献１８、非特許文献１９参照）、その種の菌株の取得または培養の困難さのために７つの種は本実施例での考慮対象外とした（例えばＡ．ｄｏｅｂｅｒｅｉｎｅｒａｅ ＤＳＭＺ １３１３１ＴＳ）。
【００３８】
これまでの系統分類学的解析では、種間の関係が分析間で多少異なる点はあるが、考慮対象外とした上記７つの種は何れも本研究で使用された７つのアゾスピリラム属菌種の間に位置するという結果を示す。考慮対象外とした上記７つの種は、
（１）Ａ．ｄｏｅｂｅｒｅｉｎｅｒａｅ（非特許文献９、非特許文献１９）、
（２）Ａ．ｌａｒｇｉｍｏｂｉｌｅ（非特許文献９、非特許文献２０）、
（３）Ａ．ｃａｎａｄｅｎｓｅ（非特許文献２１、非特許文献２３、非特許文献１９）、
（４）Ａ． ｍｅｌｉｎｉｓ（非特許文献２１、非特許文献２３）、
（５）Ａ． ｚｅａｅ（非特許文献２２、非特許文献２３）、
（６）Ａ． ｏｒｙｚａｅ（非特許文献２０、非特許文献２４）、
（７）Ａ．ｐａｌａｔｕｍ（非特許文献１９参照）である。
【００３９】
１５の非アゾスピリラム菌株は、類縁細菌群（非特許文献１７参照）とＢａｕｄｏｉｎら（非特許文献３参照）が研究において使用した土壌バクテリアの菌株から選択された。
【００４０】
プライマーセットの属特異性の分析実験は、次のように行われた。２７の標準株の定常期培養物（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ−ｐｈａｓｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）の一定分量を、遠心し、滅菌蒸留水に再懸濁させた溶液を９５°Ｃにおいて５分間放置した後、遠心を行いＰＣＲの鋳型となる細胞溶解物上清を得た。
【００４１】
ＰＣＲ反応混合物は、１０ｘＰＣＲバッファー２．５μｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰを０．２５ｍＭずつ、各プライマーを０．０２μＭずつ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＩＯＴＡＱ，ＢｉｏＬｉｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を２．５ユニット、粗製のバクテリア溶解物１０μｌを含み、総量は２５μｌである。
【００４２】
ＰＣＲはＶｅｒｉｔｉサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳ）によって、下記条件に基づいて実施された。まず９４°Ｃにおいて３分間放置し、初期変性させる。次に、下記操作を３５サイクル繰り返す。各サイクルは、９４°Ｃで３０秒間変性させた後、各プライマーセットの最適温度で３０秒アニーリングさせ、７２°Ｃで１分間伸長させる。上記最適温度として、Ａｚ１６Ｓ-Ａ（配列番号１及び２として示す）,Ａｚ１６Ｓ-Ｂ、Ａｚ１６Ｓ‐Ｃは５８°Ｃである。ＡｚｉｐｄＣ、ＡｚｎｉｆＡ−Ａ、ＡｚｎｉｆＡ−Ｂは５２°Ｃである。ＡｚｎｉｆＨ‐Ａ，ＡｚｎｉｆＨ‐Ｂ，ＡｚｎｉｆＨ‐Ｃは５５°Ｃである（塩基配列に関しては表１を参照）。上記３５サイクルが終了した後、７２°Ｃで５分間放置し最終的な伸長をさせた。Ｂａｕｄｏｉｎらによって報告されたｆＡＺＯ／ｒＡＺＯプライマーを使用したＰＣＲは、彼らの報告した手順に従って実施した。ＰＣＲ産物は、１００−ｂｐＤＮＡラダー（ＨｙｐｅｒＬａｄｄｅｒＩＶ，ＢｉｏＬｉｎｅ）と共に２％アガロースゲル中に展開され、臭化エチジウム溶液によって染色され、ＡＥ‐６９０５Ｈ Ｉｍａｇｅ Ｓａｖｅｒ ＨＲ（ＡＴＴＯ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって撮影された。
【００４３】
このＰＣＲ実験によって選ばれたＡｚ１６Ｓ‐Ａプライマーセットの属特異性は、さらに、３５のアゾスピリラム様分離株及び７０の未知の分離株に対しても、同様のＰＣＲ及び電気泳動の手順によって分析された（後述の実施例３を参照）。
【００４４】
＜結果＞
上記属特異性分析実験の結果を、表２に示した。表２において＋及び−はそれぞれ、予測アンプリコンの有無を示している。すなわち、＋は予測アンプリコンが得られたことを指し、−は予測アンプリコンが得られなかったことを指す。
【００４５】
【表２】
【００４６】
実験が行われた１０のプライマーセット（表１を参照）において、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に基づき設計されたプライマーセットＡｚ１６Ｓ-Ａは、１２のアゾスピリラム標準株（７の種）すべて及び１の非アゾスピリラム属菌株Ｒｈｏｄｏｃｉｓｔａ ｃｅｎｔｅｎａｒｉａ ＤＳＭ９８９４（表２参照）に対して、単一のアンプリコンを生成させることに成功した。アンプリコンは単一のＤＮＡバンドとして観察され、上記ＤＮＡバンドの長さはおおよそ６４０ｂｐであって（図１を参照）、この長さはＡ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ １６Ｓ ｒＤＮＡ配列から予測された長さ（表１を参照）に一致するものである。なお、非アゾスピリラム属菌株Ｒｈｏｄｏｃｉｓｔａ ｃｅｎｔｅｎａｒｉａは、自然界では温泉などの特殊環境に棲息することが報告されており、アゾスピリラム属菌とは棲息環境が異なる。
【００４７】
プライマーセットＡｚ１６Ｓ-Ｂを用いたＰＣＲは、１２のアゾスピリラム標準株すべてから予測アンプリコンを生成させただけでなく、α−プロテオバクテリア及びβ−プロテオバクテリアにわたる１０の非アゾスピリラム属菌株からも、予測アンプリコンを生成させた。
【００４８】
プライマーセットＡｚ１６Ｓ-Ｃ、ＡｚｎｉｆＨ-Ａ、及びＡｚｎｉｆＨ-Ｂは、Ｂａｕｄｏｉｎらによって報告されたプライマーセットｆＡＺＯ／ｒＡＺＯと同じように、１２のアゾスピリラム属菌株のうち、１−３の株に対してはアンプリコンを生成させることができず、１７の非アゾスピリラム属菌株のうち、２-５の株に対しては複数のアンプリコンを生成させた。これらの４のプライマーセットにおいて、プライマーセットＡｚｎｉｆＨ-Ａ及びＡｚｎｉｆＨ-Ｂは、他の２のプライマーセットに比べ比較的良い属特異性を示した。残りの４つのプライマーセットからは良くない結果が得られた。従って、プライマーセットＡｚ１６Ｓ-Ａはアゾスピリラム属菌に対して最も優れた特異性を示した。
【００４９】
ここで、図１について説明すると、図１は、プライマーセットＡｚ１６Ｓ−Ａを用いた、未知分離株に対するＰＣＲ実験の結果を示している。ＰＣＲ産物は２％アガロースに溶解され、臭化エチジウム溶液によって染色された。識別された分離株は、１６ＳｒＤＮＡ配列決定解析によって、下記のように確認された。レーン１はＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ及びＲａｈｎｅｌｌａによって汚染された、アゾスピリラム属菌培養物であり、レーン２はＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、レーン３はＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、レーン４はアゾスピリラム、レーン５はアゾスピリラム、レーン６はＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、レーン７はアゾスピリラム、レーン８はＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、レーン９はアゾスピリラム、レーン１０はＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、レーン１１は参照物としてのＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２４ＴＳ、レーンＭは１００−ｂｐＤＮＡラダーである。
【００５０】
〔実施例３〕
＜作製されたプライマーセットの利用可能性＞
さらに、３５のアゾスピリラム様分離株と、農業サンプルから得られた７０の未知の分離株を用いて、選択されたプライマー候補の特異性、検出限界及び利用可能性について調べた。アゾスピリラム属菌の分離において検出限界は重要な面であって、根圏土壌及び植物体から分離するプロセスにおいては、アゾスピリラム属の菌落及び培養物はしばしば非アゾスピリラム微生物によって汚染されているからである。
【００５１】
（使用された３５のアゾスピリラム様分離株と７０の未知の分離株）
アゾスピリラム様分離株は、根圏土壌並びに作物及び草の根部から収集されたものである。上記収集は、独立行政法人農業生物資源研究所（ＮＩＡＳ）と十勝農業協同組合連合会農産化学研究所（ＡＲＩＴＦＡＣ）によって、選択培地及び形態生理学評価の両方を用いて行われた。選択培地は例えば、窒素不含有ブロモチモールブルー（ＮＦｂ）培地、Ｒｏｊｏ Ｃｏｎｇｏ（コンゴレッド）培地である。形態生理学評価は、例えば、アセチレン減少分析（ＡＲＡ）（非特許文献５、非特許文献９）である。これらの分離株のｒＤＮＡ配列データは入手できないものであった。全部で３５のアゾスピリラム様分離株を、上記収集されたコレクションからランダムに選出した。さらに、根圏土壌、穀物及び飼草の根部から、ＡＲＡとｒＤＮＡ配列決定を用いずに、選択培地のみによって収集した我々のストックから、７０の未知の分離株をランダムに選出した。これらの分離株の「属」及び「種」は未知であった。使用された３５のアゾスピリラム様分離株は多数の、７０の未知の分離株は少数の、アゾスピリラム属菌を含むものと考えられる。
【００５２】
（作製したプライマーセットによる検出実験）
すべての菌株及び分離株に対して、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定解析を行った。ボイル法によって抽出された粗製ＤＮＡは、アゾスピリラム１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に基づき設計されたＡｚ１６Ｓ-Ｄ配列決定プライマーによって、ＰＣＲ増幅された。Ａｚ１６Ｓ-Ｄ配列決定プライマーセットのフォワードプライマーは５’ＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＡＧＧＧＧＧＣであり、リバースプライマーは５’ＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＧＣである。当該プライマーセットによるアンプリコンサイズは、おおよそ６５０ｂｐと推測され、それは属レベルで系統発生的分類をするのには充分である。ＰＣＲはアニーリング温度６０°Ｃで、前記のＰＣＲ実験で記載されているのと同じ手順によって実施された。ＰＣＲ産物はＭｉｎ−Ｅｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製され、Ａｚ１６Ｓ-Ｄフォワードプライマー、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクル配列決定キット，３７３０ｘｌＤＮＡアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって配列決定された。配列データは、ＳＥＱ ＭＡＴＣＨ ｐｒｏｇｒａｍ ｖｅｒ．３．０（非特許文献７参照）を使用し、リボソームデータベースプロジェクト（リリース１０、ミシガン州立大学微生物生態学センター［ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ］）で得られたデータと比較し、カットオフ類似性（Ｓａｂ）値を＞０．７に設定しマッチする微生物種を探索し上位２０マッチに基づき菌株及び分離株の属を決定した。
【００５３】
＜結果＞
上記作製したプライマーセットによる検出実験の結果を、表３に示した。
【００５４】
【表３】
【００５５】
表３は、３５のアゾスピリラム様分離株及び７０の未知分離株に対するＰＣＲ実験及びｒＤＮＡ配列決定解析の結果を比較したものである。表３において、ＮＩＡＳは独立行政法人農業生物資源研究所であり、ＡＲＩＴＦＡＣは十勝農業協同組合連合会農産化学研究所である。＋と−はそれぞれ、予測されたアンプリコンの有無を示している。
【００５６】
表３によれば、プライマーセットＡｚ１６Ｓ-Ａを用いたＰＣＲは、ＮＩＡＳから入手した２０のアゾスピリラム様分離株のうち１７の菌株から、予測された単一のアンプリコンを得た。ＰＣＲ検出においてアンプリコンが得られた１７の分離株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定解析によって、アゾスピリラム属に分類され、残りの３つの株は、Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍに分類された。ＰＣＲ実験及びｒＤＮＡ配列決定解析の結果における完全な一致は、ＡＲＩＴＦＡＣから入手した１５のアゾスピリラム様分離株及び我々のストックから入手した７０の未知分離株においても見られた（表３及び図１を参照）。アンプリコンが得られた５つの未知分離株のうちの一つ（図１レーン１参照）のｒＤＮＡ配列決定解析は、この培養物はアゾスピリラムのほかにも二つの種、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ及びＲａｈｎｅｌｌａを含んでいることを示した。従って、プライマーセットＡｚ１６Ｓ-Ａを用いたＰＣＲは、混合培養物におけるアゾスピリラムを成功裏に検出することができた。Ｂａｕｄｏｉｎらによって報告されたプライマーセットｆＡＺＯ／ｒＡＺＯを用いたＰＣＲでは、アゾスピリラム疑似分離株に対して、ＰＣＲ実験及びｒＤＮＡ配列決定解析の結果における完全な一致が見られた。しかし、７０の未知分離株のうち（詳細は示していない）、２つの非アゾスピリラム分離物（ＢａｃｉｌｌｕｓとＰａｎｔｏｅａ）からも、５つのアゾスピリラムと同様に、アンプリコンを生成させた。
【００５７】
ＮＩＡＳから入手した分離株のうち、３つの非アゾスピリラム分離株は、Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ種である。同じように、我々のストックからの６７の非アゾスピリラム分離株のうち、３４はＢａｃｉｌｌｕｓとして同定され、８はＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとして、６はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓとして、６はＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓとして、６はＡｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒとして、２はＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓとして、２はＬｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓとして、１はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕとして、１はＰａｎｔｏｒａとして、１はＹｅｒｓｉｎｉａとして同定された。
【００５８】
〔実施例４〕
＜アンプリコンの存在を示した分離株のキャラクタリゼーション＞
上記実施例３において、７０の未知分離株のうち、Ａｚ１６Ｓ-Ａプライマーを用いたＰＣＲによって得られたアンプリコンの存在が確認されたのは５つの分離株である。この５つの分離株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定解析によって、アゾスピリラム属に分類された。これらの属種及び生理学的特性をさらに調べるため、この５つの分離株における炭素源利用、ＩＡＡ生成、窒素固定化について、Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２４ＴＳ及びＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２６と比較しながら評価した。炭素源利用の評価についてはＡＰＩ２０ＮＥシステム（ｂｉｏＭＥＲＩＥＵＸ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、製造元のプロトコルに従って実施した。ＩＡＡ生成については、修飾されたＳａｌｋｏｗｓｋｉ試薬（非特許文献１２を参照）を用いて比色法によって計測された。分離株は１ｍＭトリプトファンを補充したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロスにおいて、３０°Ｃ条件下において２日間、定常期になるまで培養され、それからＩＡＡの計測に供された（非特許文献８を参照）。窒素固定能は、水素炎イオン検出器を備えたガスクロマトグラフ装置（ＧＣ-４０００ ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ＡＲＡ法（非特許文献９、非特許文献１５を参照）によって見積もられた。ＡＲＡを行うため、バクテリア培養物は、２ｍｌの濃度１％（ｖ／ｖ）の半固体ＮＦｂ培地に添加され、９−ｍｌ密封バイアル瓶中において、３０°Ｃ条件下で２４時間培養された。上記培養後に１０体積％（気体体積）のアセチレンをバイアル瓶中に導入し、さらに２４時間培養し、それからガスクロマトグラフィーを実施した。それぞれの分離株のＩＡＡ生成及びアセチレン減少については、それぞれ３〜４のバイアル瓶で重複して実験された。
【００５９】
＜結果＞
上記アンプリコンの存在を示した分離株のキャラクタリゼーション実験の結果を、表４に示した。
【００６０】
【表４】
【００６１】
表４は、いわゆる農業サンプルからＰＣＲ実験によって分離されたアゾスピリラム属菌の炭素源利用、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）生成及びアセチレン減少について示した表である。炭素源利用タイプはＡＰＩ２０ＮＥシステムによって評価されたものであり、ＡＢタイプはＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅに特有の利用型であって、Ｎ−アセチルグルコサミン（−）、Ｌ−アラビノース（＋）、Ｄ−グルコース（−）、Ｄ−マンニトール（−）、Ｄ−マンノース（−）を利用するものである。
【００６２】
我々のストックから入手の分離株のうち、アンプリコンが得られた５つの分離株は、Ａ ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ（表４を参照）に特有的な炭素源利用型と同様の炭素源利用型を示した。ＩＡＡ生成能及びアセチレン減少（窒素固定）能力は、５つの分離株すべてにおいて見られた。分離株におけるこれら二つの能力は、Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２４ＴＳより優れていた。アセチレン減少に見られる分離株同士の大きな差異は、ＩＡＡ生成に見られる分離株同士より顕著であった。分離株のＩＡＡ生成とアセチレン減少との間には、顕著な相関性は観察されなかった。これらの結果から、プライマーセットＡｚ１６Ｓ‐Ａは、アゾスピリラム独特の生理学特性を示す分離株を正確に識別する能力を有することがさらに確認された。
【００６３】
〔実施例５〕
＜プライマーセットの検出限界＞
Ａｚ１６Ｓ-Ａプライマーを用いたＰＣＲを、異なる濃度（１０‐１０６ＣＦＵｍｌ−１）のＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ（ＪＣＭ １２２４ＴＳ）に対して、上記と同じ手順にて実施した。さらに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕs（ＭＡＦＦ １１８２５６）が混入されたＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ（ＪＣＭ １２２４ＴＳ）培養物に対しても、ＰＣＲを実施した。バチルス属菌がモデル汚染菌として選ばれた理由は、我々の実験系において、アゾスピリラム選択培地に観察される非アゾスピリラム属菌の大部分においてバチルス属菌が存在するからである。混合培養物を得るために、アゾスピリラム及びバチルス培養物はそれぞれ、ＬＢ培養液において３７℃条件下において４８時間及び２４時間培養された。それから、最終菌濃度が１０７ＣＦＵｍｌ−１となるように、Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ：Ｂ． ｐｕｍｉｌｕｓを１：１〜１：１０４の異なる比率で混合した。プライマーの検出限界とは、検出可能なＰＣＲアンプリコンをもたらすことのできる、最小のアゾスピリラム濃度または比率である。
【００６４】
＜結果＞
プライマーセットＡｚ１６Ｓ-Ａを用いるＰＣＲは、１０３ＣＦＵｍｌ−１の濃度を有するＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ純粋培養物から、予測サイズに該当する検出可能な量のアンプリコンを生成させることが出来た（図２中の（ａ）を参照）。同様に、Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ：Ｂ． ｐｕｍｉｌｕｓを１：１０４またはそれ以上の比率で混合して得られた混合培養物からも、ＰＣＲでは同じように予想アンプリコンを生成することが出来た（図２中の（ｂ）を参照）。Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ：Ｂ． ｐｕｍｉｌｕｓを１：１０４の比率で混合した混合培養物は、おおよそ１０３ＣＦＵｍｌ−１のＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅを含んでいる。したがって、プライマーセットの検出限界は、純粋培養物及び混合培養物において同じである。さらに、ＰＣＲの汚染菌存在時におけるアゾスピリラム菌の検出能力は、農業サンプルから得られた７０の未知分離株においても確認された（図１レーン１参照）。
【００６５】
なお、図２は純粋培養物及び混合培養物におけるプライマーセットＡｚ１６Ｓ−Ａを用いたアゾスピリラム属菌のＰＣＲ検出を示した図である。図中（ａ）のＰＣＲ産物はＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＪＣＭ １２２４ＴＳ純粋培養物から得られ、図中（ｂ）のＰＣＲ産物はＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ＭＡＦＦ １１８２５６が混合されたＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ 培養物から得られた。ＰＣＲ産物は２％アガロースに展開され、臭化エチジウム溶液によって染色された。図中（ａ）における、レーン上部の数字は、Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ濃度（ＣＦＵ ｍｌ−１）である。レーンＭは１００−ｂｐＤＮＡラダーである。図中（ｂ）において、レーン１はＡ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅのみ、レーン２は、Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ：Ｂ． ｐｕｍｉｌｕｓを１：１で混合したもの、レーン３は、１：１０で混合したもの、レーン４は、１：１０２で混合したもの、レーン５は、１：１０３で混合したもの、レーン６は１：１０４で混合したもの、レーン７は、Ｂ． ｐｕｍｉｌｕｓのみのもの、を夫々示す。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルに展開され、臭化エチジウム溶液によって染色された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、土壌サンプルを始め、各種サンプルからアゾスピリラム属菌を検出・同定する際に好適に利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アゾスピリラム属菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに由来するＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なプライマーセットであって、
配列番号１で示される塩基配列（ｋはグアニン又はチミンを表す）のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第一のプライマーと、
配列番号２で示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第二のプライマーとからなることを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
上記第一のプライマーが、配列番号１で示される塩基配列においてｋがグアニンであるヌクレオチド、及び配列番号１で示される塩基配列においてｋがチミンであるヌクレオチドの少なくとも一方からなり、
上記第二のプライマーが配列番号２で示される塩基配列を有するヌクレオチドからなる、ことを特徴とする請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
上記第一のプライマーが、配列番号１で示される塩基配列においてｋがグアニンである上記ヌクレオチド、及び配列番号１で示される塩基配列においてｋがチミンである上記ヌクレオチドの混合物からなることを特徴とする請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
上記第一のプライマーにおいて１〜２個の塩基が欠失、置換、又は付加されており、かつ上記第二のプライマーにおいて１〜２個の塩基が欠失、置換、又は付加していることを特徴とする請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項に記載のプライマーセットを備えることを特徴とするアゾスピリラム属菌の検出キット。
【請求項６】
以下の工程：
（ａ）対象サンプルからＤＮＡを含有する試料を調製する工程、
（ｂ）上記試料に対して、請求項１〜４の何れか一項に記載のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
（ｃ）上記工程（ｂ）で得られる増幅断片の有無を検出する工程、
を含むことを特徴とする、アゾスピリラム属菌の検出方法。
【請求項７】
上記対象サンプルが、土壌サンプル又は植物由来サンプルであることを特徴とする請求項６に記載の検出方法。
【請求項１】
アゾスピリラム属菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに由来するＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なプライマーセットであって、
配列番号１で示される塩基配列（ｋはグアニン又はチミンを表す）のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第一のプライマーと、
配列番号２で示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基部分を有するヌクレオチドからなる第二のプライマーとからなることを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
上記第一のプライマーが、配列番号１で示される塩基配列においてｋがグアニンであるヌクレオチド、及び配列番号１で示される塩基配列においてｋがチミンであるヌクレオチドの少なくとも一方からなり、
上記第二のプライマーが配列番号２で示される塩基配列を有するヌクレオチドからなる、ことを特徴とする請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
上記第一のプライマーが、配列番号１で示される塩基配列においてｋがグアニンである上記ヌクレオチド、及び配列番号１で示される塩基配列においてｋがチミンである上記ヌクレオチドの混合物からなることを特徴とする請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
上記第一のプライマーにおいて１〜２個の塩基が欠失、置換、又は付加されており、かつ上記第二のプライマーにおいて１〜２個の塩基が欠失、置換、又は付加していることを特徴とする請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項に記載のプライマーセットを備えることを特徴とするアゾスピリラム属菌の検出キット。
【請求項６】
以下の工程：
（ａ）対象サンプルからＤＮＡを含有する試料を調製する工程、
（ｂ）上記試料に対して、請求項１〜４の何れか一項に記載のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
（ｃ）上記工程（ｂ）で得られる増幅断片の有無を検出する工程、
を含むことを特徴とする、アゾスピリラム属菌の検出方法。
【請求項７】
上記対象サンプルが、土壌サンプル又は植物由来サンプルであることを特徴とする請求項６に記載の検出方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−１７０４４８（Ｐ２０１２−１７０４４８Ａ）
【公開日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−３８６５７（Ｐ２０１１−３８６５７）
【出願日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
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