プライマーセット及び相同性組み換え方法
【課題】モーレラ属細菌において、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を欠失又は破壊して、ウラシル要求性を付与する形質転換に用いられるプライマーセットの提供。
【解決手段】プライマーセットは、モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は破壊されたウラシル要求性株を作出する際に用いられるプライマーセットであって、前記オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する上流領域を増幅する特定の配列で示されることを特徴とする。
【解決手段】プライマーセットは、モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は破壊されたウラシル要求性株を作出する際に用いられるプライマーセットであって、前記オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する上流領域を増幅する特定の配列で示されることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相同性組み換えによるモーレラ属細菌における形質転換遺伝子発現のためのプロセスに用いられるプライマーセット及び該プライマーセットを用いた相同性組み換え方法に関し、詳しくは、モーレラ属細菌において、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を欠失又は破壊して、ウラシル要求性を付与する形質転換に用いられるプライマーセット及び該プライマーセットを用いた相同性組み換え方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モーレラ属細菌は、ガスから酢酸やエタノール生産できる等、産業上有用な性質を有するが、例えばエタノール生産に着目した場合、生産効率に向上の余地がある。
【０００３】
本発明者は、モーレラ属細菌を形質転換して、エタノールの生産効率を向上する等の有用な機能を付与することを検討したが、モーレラ属細菌の遺伝学的性質は、他の細菌と比べて特異的であり、また十分に解明されていないことなどから、形質転換は困難であった。例えば、モーレラ属細菌に対してニトロソグアニジン（ＮＴＧ）など化学物質による変異処理を行った場合は、継代後もエタノール高生産を維持する株は得られず、あるいは、染色体外遺伝子としてプラスミドベクターの導入を試みた場合は、形質転換が確認された株は得られなかった。
【０００４】
本発明者は、研究によって、これまでに、モーレラ属細菌であるMoorella sp. HUC22-1株を元株として用い、相同性組み換えによって、ウラシルの生合成系に関与する酵素であるオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｐｙｒＥ）を破壊し、ウラシル要求性モーレラ属細菌を得ることに成功している（特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、かかるウラシル要求性モーレラ属細菌は、ｐｙｒＥを再度組み込んで相補を行うことが困難であったため、形質転換遺伝子を導入して、形質転換遺伝子を発現させる具体的手法を確立するまでには至っていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１７１３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、更に研究を行い、相同性組み換えによるモーレラ属細菌における形質転換遺伝子発現のためのプロセスの確立を試み、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｐｙｒＦ）を破壊し、新規なウラシル要求性モーレラ属細菌を得ると共に、このウラシル要求性モーレラ属細菌の染色体に、ｐｙｒＦ及び形質転換遺伝子を導入して、形質転換遺伝子を発現させる具体的手法を見出して本発明を完成するに至った。
【０００８】
そこで、本発明の課題は、モーレラ属細菌において、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を欠失又は破壊して、ウラシル要求性を付与する形質転換に用いられるプライマーセット及び該プライマーセットを用いた相同性組み換え方法を提供することにある。
【０００９】
また本発明の他の課題は、以下の記載によって明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題は、以下の各発明によって解決される。
【００１１】
（請求項１）
モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は破壊されたウラシル要求性株を作出する際に用いられるプライマーセットであって、
前記オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する上流領域を増幅する配列番号１及び配列番号２で示されることを特徴とするプライマーセット。
【００１２】
（請求項２）
モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は破壊されたウラシル要求性株を作出する際に用いられるプライマーセットであって、
前記オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する下流領域を増幅する配列番号３及び配列番号４で示されることを特徴とするプライマーセット。
【００１３】
（請求項３）
モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は破壊されたウラシル要求性株を作出する際に用いられるプライマーセットであって、
前記オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する上流領域を増幅する配列番号１及び配列番号２で示されプライマーセット、及び、該オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する下流領域を増幅する配列番号３及び配列番号４で示されるプライマーセットを備えることを特徴とするプライマーセット。
【００１４】
（請求項４）
請求項１〜３の何れかに記載のプライマーセットを用いて、モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を欠失又は破壊してウラシル要求性株を作出することを特徴とする相同性組み換え方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、モーレラ属細菌において、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を欠失又は破壊して、ウラシル要求性を付与する形質転換に用いられるプライマーセット及び該プライマーセットを用いた相同性組み換え方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】プライマーの位置を示す図
【図２】ｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターｐｋ１８-ｄｐｒｙＦの構築方法を示す図
【図３】各プライマーの位置及び予想される断片の長さを示す図
【図４】ダイレクトＰＣＲによるｐｙｒＦ相補候補株の確認の結果を示す図
【図５】プラスミド構築のスキームを示す図
【図６】ｐｙｒＦ遺伝子上流領域の配列とプライマーの位置を示す図
【図７】ＫｐｎＩ処理による確認の結果を示す図
【図８】コロニーダイレクトＰＣＲ結果を示す図
【図９】制限酵素ＫｐｎＩサイトの位置を示す図
【図１０】コロニーダイレクトＰＣＲ産物の制限酵素ＫｐｎＩ処理の結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に、本発明を実施するための形態を説明する。
【００１８】
本発明に係るプライマーは、相同性組み換えによるモーレラ属細菌における形質転換遺伝子発現のためのプロセスに用いることができる。
【００１９】
モーレラ（Moorella）属細菌としては、格別限定されるものではないが、Moorella thermoacetia、M．thermoautotrophica、M．glycerini等を好ましく例示でき、エタノール生産効率が高い菌株の作出の上では、水素と二酸化炭素、又は、一酸化炭素からエタノールを生産する能力を有するモーレラ属細菌であることが好ましく、更には、Moorella thermoacetica ATCC 39073株等を好ましく例示できる。
【００２０】
ウラシル要求性とは、菌株がその生育にウラシルを栄養として要求する性質を指す。モーレラ属細菌は、通常ウラシルを生合成できるため、ウラシル要求性を有さないが、変異によりウラシルの生合成ができなくなった場合、ウラシルを栄養として要求するようになる。ウラシル要求性株とは、このようなウラシル要求性を有する菌株である。
【００２１】
オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼは、ウラシルの生合成に必要なピリミジン塩基の前駆体であるＵＭＰ（ウリジン一リン酸）の生合成に関与する酵素の一つであり、これをコードする遺伝子を欠いた株は、ＵＭＰを生合成できなくなるために、ウラシル要求性株となる。
【００２２】
本発明の配列番号１〜４に示されるプライマーセットは、元株となるモーレラ属細菌において、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（以下ｐｙｒＦという場合がある。）を欠失又は破壊して、ウラシル要求性を付与する相同性組換えに用いられる。
【００２３】
具体的には、配列番号１及び配列番号２で示されるプライマーセットは、モーレラ属細菌の染色体上において、ｐｙｒＦに隣接する上流領域を増幅する。
【００２４】
一方、配列番号３及び配列番号４で示されるプライマーセットは、モーレラ属細菌の染色体上において、ｐｙｒＦに隣接する下流領域を増幅する。
【００２５】
配列番号１及び配列番号２で示されるプライマーセットを用いたＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物、及び、配列番号３及び配列番号４で示されるプライマーセットを用いたＰＣＲにより得られる各ＰＣＲ産物をライゲーションすることにより、ｐｙｒＦが欠失または破壊されていると共に、ｐｙｒＦに隣接した上流領域及び下流領域を含むＤＮＡ断片が得られる。
【００２６】
得られたＤＮＡ断片をプラスミドに組み込んでｐｙｒＦ破壊用プラスミドを構築し、元株となるモーレラ属細菌に導入する。これにより、元株において、相同性組み換えが誘発され、染色体上の遺伝子においてｐｙｒＦが欠失または破壊される。
【００２７】
本発明において、ｐｙｒＦ破壊用プラスミドをモーレラ属細菌に導入する方法は、格別限定されず、例えば、エレクトロポレーション法等により、モーレラ属細菌に導入する方法を好ましく用いることができる。
【００２８】
以上のようにして、ｐｙｒＦを相同性組換えにより欠失または破壊してなるウラシル要求性モーレラ属細菌（ｐｙｒＦ破壊株）が得られる。
【００２９】
ｐｙｒＦ遺伝子が破壊されたことを確認するためには、元株として用いたモーレラ属細菌のゲノムＤＮＡと、ｐｙｒＦ破壊株のゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型にＰＣＲ等を行って確認することができる。
【００３０】
配列番号５〜配列番号１０のプライマーは、作出した細胞からｐｙｒＦが欠失又は破壊されているかをＰＣＲにより確認する際に好ましく使用することができる。
【００３１】
得られたｐｙｒＦ破壊株について、ｐｙｒＦ遺伝子を導入して、一度失われたピリミジン生合成経路を回復して、ウラシル要求性を消失させることが可能であること、即ち、相補が可能であることを確認することができる。
【００３２】
相補の確認のためには、まず、配列番号１及び配列番号４で示されるプライマーセットを用いて、モーレラ属細菌における染色体上のオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子と、それに隣接する上流領域及び下流領域を増幅する。
【００３３】
次いで、増幅されたＤＮＡ断片をプラスミドに組み込んで、上流領域及び下流領域からなる相同性部位間にｐｙｒＦを有する相補確認用プラスミドを構成する。
【００３４】
相補確認用プラスミドをｐｙｒＦ破壊株に導入し、ウラシル欠損培地での生育が確認されれば、ｐｙｒＦ破壊株が相補可能であることが確認される。
【００３５】
本発明の配列番号１〜４に示されるプライマーセットを用いて、元株となるモーレラ属細菌Moorella thermoacetica ATCC 39073株のｐｙｒＦ遺伝子を相同性組換えによって破壊しウラシル要求性を付与した菌株は、ＭＴＡ−Ｄ−ｐＦ株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０５７）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００３６】
培養的な性質は、以下の通りである。
【００３７】
改変型ＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ 寒天培地（※１）において、嫌気的、５５℃、
培養日数３〜５日で直径３〜５ｍｍの円形コロニーを形成する。
【００３８】
ｉ）色： 茶色
ｉｉ）表面の形状：スムーズ
ｉｉｉ）透明度：不透明
【００３９】
※１ 改変型ＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ 寒天培地
ＮＨ４Ｃｌ １．０ｇ
ＫＣｌ ０．１ｇ
ＭｇＳＯ４ ０．２ｇ
ＮａＣｌ ０．８ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ
ＣａＣｌ２ ０．０２ｇ
Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １．０ｇ
（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ無添加の場合 Ｕｒａｃｉｌ ０．０１ｇ）
ＮａＨＣＯ３ ２．０ｇ
Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ＨＣｌ ０．３ｇ
Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉ） １０ｍｌ
Ｖｉｔａｍｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＩＩ） １０ｍｌ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ １０００ｍｌ
（Ａｇａｒ（高温用） ２０ｇ）
（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ ５．０ｇ）
ｐＨ ５．９（滅菌前）
滅菌温度・時間 １２１℃ １５分
【００４０】
なお、上記の（Ｉ）Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ及び（ＩＩ） Ｖｉｔａｍｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎは以下の組成である。
【００４１】
（Ｉ）Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ２．０ｇ
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １．０ｇ
Ｆｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２・６Ｈ２Ｏ ０．８ｇ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２ｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００２ｇ
ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ
Ｎａ２ＳｅＯ４ ０．０２ｇ
Ｎａ２ＷＯ４ ０．０２ｇ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ １０００ｍｌ
（ＩＩ）Ｖｉｔａｍｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｂｉｏｔｉｎ ２．０ｍｇ
Ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ２．０ｍｇ
Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ−ＨＣｌ １０ｍｇ
Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ ５．０ｍｇ
Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ ５．０ｍｇ
Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ５．０ｍｇ
Ｄ−Ｃａ−ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ ５．０ｍｇ
Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ12 ０．１ｍｇ
ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ５．０ｍｇ
Ｔｈｉｏｃｔｉｃ ａｃｉｄ ５．０ｍｇ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ １０００ｍｌ
【００４２】
得られたｐｙｒＦ破壊株は、相同性部位と、破壊遺伝子がわかっているので、例えばエタノール生産性の向上のような特定の機能を付与する遺伝子を導入する形質転換の元株として好適に用いることができる。
【００４３】
例えば、２つの相同性部位の間にｐｙｒＦ遺伝子及び導入したい形質転換遺伝子（特定の機能を付与する遺伝子）を有する形質転換遺伝子導入用ベクターを作製し、これをｐｙｒＦ破壊株に導入することで、ピリミジン生合成経路が回復してウラシル要求性を消失させると共に、特定の形質転換遺伝子が発現可能なモーレラ属細菌が形成される。ウラシル欠損培地で生育可能な菌を分離する等、ウラシル要求性に基づいて菌の分離を行うことで、形質転換遺伝子が導入され、特定の機能が付与された形質転換株を容易に得ることができる。
【００４４】
形質転換遺伝子導入用ベクターの作出に際しては、配列番号１及び配列番号４で示されるプライマーセットを好適に用いることができる。
【００４５】
即ち、配列番号１及び配列番号４で示されるプライマーセットは、モーレラ属細菌における染色体上のオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子と、その上流及び下流に隣接する両隣接領域とを増幅する。
【００４６】
配列番号１及び配列番号４で示されるプライマーセットを用いて、モーレラ属細菌における染色体を鋳型に増幅されたＤＮＡ断片において、ｐｙｒＦの上流側又は下流側に形質転換遺伝子を組み込んで、両隣接領域間に、ｐｙｒＦ及び形質転換遺伝子が介在するＤＮＡ断片を作成する。
【００４７】
作成されたＤＮＡ断片をプラスミドに組み込むことにより、形質転換遺伝子導入用ベクターを構成することができる。
【００４８】
本発明において、形質転換遺伝子としては、元来モーレラ属細菌が保有していない遺伝子の他に、元来モーレラ属細菌が保有している遺伝子であってもよい。即ち、遺伝子保有数増加（発現増加）の目的で元来モーレラ属細菌が保有している遺伝子を追加的に組み込むことも好ましいことである。
【００４９】
ｐｙｒＦ破壊株に形質転換遺伝子導入用ベクターを導入することにより、相同性組み換えが誘発され、ｐｙｒＦ破壊株の染色体上にｐｙｒＦ及び形質転換遺伝子が組み込まれる。
【００５０】
以上のようにして、ｐｙｒＦ破壊株の染色体上に、相同性組み換えによって形質転換遺伝子を導入してなる形質転換遺伝子導入モーレラ属細菌が得られる。
【００５１】
かかる形質転換遺伝子導入モーレラ属細菌は、染色体上に、形質転換遺伝子を発現可能に保有することができる。
【実施例】
【００５２】
（実施例１）
以下、モーレラ属細菌に対して使用する培地、試薬等は全て嫌気的、無菌的に調製したものを用い、また操作は嫌気雰囲気下で行った。
【００５３】
１. Moorella thermoacetica ATCC 39073株のｐｙｒＦ遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）の作製
【００５４】
１．１. ｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターの構築
以下の手順で、Moorella thermoacetica ATCC 39073株のorotidine-5'-phosphate decarboxylase遺伝子ｐｙｒＦを破壊するためのベクターを構築した。
【００５５】
［ｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターpk18-dpryFの構築］
まず、表１に示したプライマーpyrF-up-F1（配列番号１）及びpyrF-up-R1（配列番号２）、並びに、pyrF-dn-F1（配列番号３）及びpyrF-dn-R1（配列番号４）の組み合わせを用いて、表２に示す条件でＰＣＲを行い、ｐｙｒＦ遺伝子の上流及び下流それぞれ約１０００ ｂｐを増幅した。
【００５６】
図１及び図２に示す通り、プライマーpyrF-up-F1（配列番号１）及びpyrF-up-R1（配列番号２）は、ｐｙｒＦ遺伝子の上流の隣接領域を増幅し、pyrF-dn-F1（配列番号３）及びpyrF-dn-R1（配列番号４）は、ｐｙｒＦ遺伝子の下流の隣接領域を増幅する。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】
得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＳｐｅＩで処理をした後に、MagExtractor Kit（東洋紡製）を用いて精製を行い、ｐｙｒＦ遺伝子上流領域のＰＣＲ産物を５μｌ、下流領域のＰＣＲ産物を５μｌ、Ligation high Ver.2（東洋紡製）を１０μｌ混合し、１６℃で３
０分間インキュベートし、ライゲーション産物を鋳型として、プライマーpyrF-up-F1（配列番号１）およびpyrF-dn-R1（配列番号４）を用いて表３に示す条件でＰＣＲを行った。
【００６０】
【表３】
【００６１】
得られたＰＣＲ産物をMagExtractor Kit（東洋紡製）を用いてゲル抽出を行った後、２μｌのＳｍａＩ処理をしたプラスミドpK18mobを、８μｌのゲル抽出したＰＣＲ産物、１
０μｌのLigation high Ver.2（東洋紡製）と混合し、１６℃で１時間インキュベートし
、Escherichia coli HST08 Premiumコンピテントセル（タカラバイオ製）にライゲーション溶液１０μｌを添加して軽く攪拌した後、氷中に１０分静置し、４２℃で１分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。
【００６２】
ＳＯＣ培地を１ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベート後、ＬＢ寒天培地（カナマイシン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）に塗沫し、３７℃で一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。
【００６３】
［ｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターの確認］
上記（ｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターpk18-dpryFの構築）で生育が見られたコロニーを、
カナマイシンを添加したＬＢ培地に移植した後、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、インサートの確認を行った。プライマーは表１に示すpyrF-up-F1（配列番号１）、pyrF-dn-R1（配列番号４）を用いた。コロニーダイレクトＰＣＲの条件を表４に示す。
【００６４】
【表４】
【００６５】
得られたＰＣＲ産物について、電気泳動によりバンドを確認した。
【００６６】
バンドが確認できた株を、カナマイシンを添加したＬＢ液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
【００６７】
吸光度による濃度測定および電気泳動による確認後、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的のｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターpk18-dpryFが構築できていることを確認した。
【００６８】
１．２. M. thermoacetica ATCC 39073株のｐｙｒＦ遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）の作製
１．１.で構築したｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターpk18-dpryFを、以下の手順で、M. thermoacetica ATCC 39073株に導入し、ダブルクロスオーバーの相同性組換えによってｐｙｒＦ遺伝子が破壊された株（ΔｐｙｒＦ株）を選抜した。
【００６９】
［M. thermoacetica ATCC 39073株へのｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターpk18-dpryFの導入］
２７２ｍＭスクロース、１６ｍＭ ＨＥＰＥＳの組成で、水酸化カリウムを用いてｐＨ ７に合わせたＨＳ ｂｕｆｆｅｒを調製し、２０分間煮沸した後、さらに２０分間Ｎ２ガ
スで置換した。
【００７０】
８０％の水素、２０％の二酸化炭素の混合ガスを基質とし、改変型ＡＴＣＣ １７５４
ＰＥＴＣ培地、あるいは、グリシンを終濃度５ｇ/Ｌになるように添加した改変型ＡＴ
ＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ培地でM. thermoacetica ATCC39073株を培養した。
【００７１】
菌体濃度がＯＤ６００で約０．３になるまで培養し、培養液約１００ｍｌ分を集菌した後、ＨＳ ｂｕｆｆｅｒで菌体を２度洗浄した。
【００７２】
洗浄した菌体を適当な量のＨＳ ｂｕｆｆｅｒ（約３ｍｌ）に懸濁し、懸濁液３８０μ
ｌとプラスミド２０μｌを混合した。
【００７３】
Bio-Rad Gene Pulser（登録商標）、及び０．２ｃｍ ｇａｐのキュベット（バイオラ
ッド製）を用いて、１．５ｋＶ、５００Ω、５０μＦまたは２．０ｋＶ、５００Ω、５０μＦでエレクトロポレーションを行った。
【００７４】
エレクトロポレーション後の懸濁液を、ピルビン酸４０ｍＭの終濃度で添加した５ｍｌの培地に植菌し、５５℃で２日間培養後に、ウラシル１０μｇ/ｍｌ、５−フルオロオロ
チン酸（５−ＦＯＡ）０．２％の終濃度で添加した寒天培地に植菌し、ロールチューブを作製した。
【００７５】
［ダイレクトＰＣＲによるｐｙｒＦ遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）の確認］
上記寒天培地に形成された２０個のコロニーを、５ ｍｌのウラシル１０μｇ/ｍｌ、５−ＦＯＡ ０．２％の終濃度で添加した液体培地に植菌し、培養３日目に培地が濁っていることが確認できた６株を選択し、培養液１ｍｌを集菌した。
【００７６】
アクロモペプチダーゼ（２０ｍｇ/ｍｌ）＋リゾチーム（２０ｍｇ/ｍｌ）の入ったＴＥ
ｂｕｆｆｅｒ ２０μｌで懸濁し、３７℃で５分間インキュベートし、ＤＭＳＯを２０μｌ添加して懸濁し、ＰＣＲの鋳型とした。
【００７７】
表５に示すプライマーのうち、pyrF-up-F2（配列番号５）及びpyrF-dn-R2（配列番号６）、pyrF-up-F3（配列番号７）及びpyrF-dn-R3（配列番号８）、又は、pyrF-F（配列番号９）及びpyrF-R（配列番号１０）の組み合わせを用い、各々の組合せについて、表６に示す条件でコロニーダイレクトＰＣＲを行い、電気泳動によりバンドを確認した。図３は各プライマーの位置及び予想される断片の長さを示している。図３は各プライマーの位置及び予想される断片の長さを示している。
【００７８】
【表５】
【００７９】
【表６】
【００８０】
＜評価＞
ロールチューブ法によるコロニー形成を試みた結果、多数のコロニーを得た。そこで、コロニーを２０株選択し、液体培地（１０μｇ/ｍｌウラシル、０．２％ ５−ＦＯＡ）にて培養した。菌体の生育が確認できた培養液から菌体を集菌し、ダイレクトＰＣＲによる確認を行った。
【００８１】
培養３日目に増殖が確認できた６株について、プライマーpyrF-up-F2及びpyrF-dn-R2、又は、pyrF-up-F3及びpyrF-dn-R3の組み合わせを用い、ｐｙｒＦの外側からＰＣＲを行ったところ、６株中１株において野生株よりも短いバンドが確認できた。
【００８２】
さらに、プライマーｐｙｒＦ-Ｆ及びｐｙｒＦ−Ｒの組み合わせを用い、ｐｙｒＦの内
側をＰＣＲしたところ前述の株においてはバンドが確認できなかった。
【００８３】
これらの結果から、野生株よりも短いバンドを確認できた株がｐｙｒＦ遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）である可能性があると判断し、染色体抽出を行った後にもう一度ＰＣＲを行った。その結果、ダイレクトＰＣＲの際と同様のバンドパターンが得られた。
【００８４】
さらに、ｐｙｒＦ遺伝子が破壊された部分には制限酵素ＳｐｅＩサイトが１か所付与されることから（プライマーpyrF-up-R1、pyrF-dn-F1参照）、上記のＰＣＲ産物についてＳｐｅＩで処理したところ、ＳｐｅＩサイトで切断が起こり、バンドが２本になることを確認した。
【００８５】
次に、ｐｙｒＦ遺伝子破壊候補株についてウラシル要求性試験を行った。酵母エキスを除いた改変型ＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ培地にｐｙｒＦ遺伝子破壊株を植菌し、１０μｇ/ｍｌの終濃度でウラシルを添加した場合と添加しなかった場合で増殖の確認を行っ
た。
【００８６】
その結果、ウラシルを添加したサンプルでは培養２日目には菌体の増殖が確認できたが、ウラシルを添加しなかったサンプルにおいては増殖が確認できなかった。これらの結果から、pyrF遺伝子の破壊が確認できた。
【００８７】
このｐｙｒＦ遺伝子破壊株は、ＭＴＡ−Ｄ−ｐＦ株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０５７）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００８８】
２. M. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）の相補試験１
【００８９】
２．１. ｐｙｒＦ遺伝子相補ベクター（遺伝子発現ベクター）の構築
以下の手順で、M. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）の相補試験を行うために、ｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターを構築した。
【００９０】
［ｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターの構築］
表１に示したプライマーpyrF-up-F1（配列番号１）とpyrF-dn-R1（配列番号４）の組み合わせを用いて、表７に示す条件でＰＣＲを行い、ｐｙｒＦ遺伝子翻訳領域とその５’側の約１０００ｂｐ、３’側の約１０００ｂｐを含む約２．７ｋｂｐの遺伝子断片を増幅した。
【００９１】
【表７】
【００９２】
得られたＰＣＲ産物についてMagExtractor Kit（東洋紡製）を用いてゲル抽出を行った。
【００９３】
２μｌのＥｃｏＲＶ処理をしたプラスミドpBluescript II KS+、または、２μｌのＳｍａＩ処理をしたプラスミドpK18mobを、８μｌのゲル抽出したＰＣＲ産物、１０μｌのLigation high Ver.2（東洋紡製）と混合し、１６℃で１時間インキュベートした。
【００９４】
Escherichia coli HST08 Premiumコンピテントセル（タカラバイオ製）にライゲーション溶液１０μｌを添加して軽く攪拌し、氷中に１０分静置した後、４２℃で１分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。
【００９５】
ＳＯＣ培地を１ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベート後、pBluescript II KS+を用いた場合はＬＢ寒天培地（アンピシリン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）に、pK18mobを用
いた場合はＬＢ寒天培地（カナマイシン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）に塗沫し、３７℃で一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。
【００９６】
［ｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターの確認］
上記で生育が見られたコロニーをアンピシリン、あるいはカナマイシンを添加したＬＢ寒天培地に移植した後、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、インサートの確認を行った。プライマーは表１に示すpyrF-up-F1（配列番号１）、pyrF-dn-R1（配列番号４）を用いた。コロニーダイレクトＰＣＲの条件を表８に示す。
【００９７】
【表８】
【００９８】
さらに、電気泳動によりバンドが確認できた株について、pBluescript II KS+を用いた場合はアンピシリンを、pK18mobを用いた場合はカナマイシン（pK18-epyrF）を添加した
ＬＢ液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
【００９９】
吸光度による濃度測定、及び、ＥｃｏＲＩ又はＰｓｔＩ処理サンプルの電気泳動を行い、さらに、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的のｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターpK18-epyrFおよびpBS-epyrFが構築できていることを確認した。
【０１００】
２．２. M. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）へのｐｙｒ
Ｆ遺伝子相補ベクターpBS-epyrFの導入
以下の手順で、１．２.で構築したM. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株（
ΔｐｙｒＦ株）に、２．１.で構築したｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターpBS-epyrFを導入し、相同組換えによる相補試験を行った。
【０１０１】
［エレクトロポレーションによるｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターpBS-epyrFの導入］
２７２ｍＭスクロース、１６ｍＭ ＨＥＰＥＳの組成で、水酸化カリウムを用いてｐＨ ６．７に合わせたＨＳ ｂｕｆｆｅｒを調製し、２０分間煮沸した後、さらに２０分間Ｎ２ガスで置換した。
【０１０２】
８０%水素、２０%二酸化炭素の混合ガスを基質とし、ウラシルを終濃度が１０μｇ/ｍ
ｌになるように添加した完全合成培地でΔｐｙｒＦ株を培養した。
【０１０３】
菌体濃度がＯＤ６００で約０．１になるまで培養し、培養液約１００ｍｌ分を集菌した後、水酸化カリウムでｐＨ７に調整した２７２ｍＭスクロースバッファーで２度洗浄した。
【０１０４】
洗浄した菌体を適当な量のＨＳ ｂｕｆｆｅｒ（約３ｍｌ）に懸濁し、懸濁液３８０μｌとプラスミド２０μｌを混合した。
【０１０５】
Bio-Rad Gene Pulser（登録商標）、 及び０．２ｃｍ ｇａｐのキュベット （バイオ
ラッド製）を用いて、１．５ｋＶ、５００Ω、５０μＦ、または２．０ｋＶ、５００Ω、５０μＦでエレクトロポレーションを行った。
【０１０６】
エレクトロポレーション後の懸濁液をウラシル１０μｇ/ｍｌ、ピルビン酸４０ｍＭの
終濃度で添加した５ｍｌの完全合成培地に植菌し、５５℃で２日間培養後、完全合成培地で洗浄し、完全合成培地と寒天を含む培地に植菌し、ロールチューブを作製した。
【０１０７】
［ダイレクトＰＣＲによるｐｙｒＦ遺伝子相補株の確認］
上記で得られたコロニーを５ｍｌの完全合成培地に植菌し、培養４日目に培地が濁っているサンプルを選択し、培養液１ｍｌを集菌した。
【０１０８】
アクロモペプチダーゼ（２０ｍｇ/ｍｌ）＋リゾチーム（２０ｍｇ/ｍｌ）の入ったＴＥ
ｂｕｆｆｅｒ１０μｌで懸濁し、３７℃で５分間インキュベートし、ＤＭＳＯを１０μｌ添加して懸濁し、ＰＣＲの鋳型とした。
【０１０９】
表５に示すpyrF-up-F3（配列番号７）、pyrF-dn-R3（配列番号８）の組み合わせのプライマーを用い、表９に示す条件でコロニーダイレクトＰＣＲを行った。
【０１１０】
電気泳動によりバンドを確認し、ｐｙｒＦ遺伝子相補株が得られたと判断した。
【０１１１】
【表９】
【０１１２】
＜評価＞
培養４日目で培養液が白く濁っていたサンプル４株についてダイレクトＰＣＲによる確認を実施した。結果を図４に示す。
【０１１３】
図４の電気泳動結果において、レーン１〜４は相補株、レーン５は野生株、レーン６はｐｙｒＦ破壊株であり、今回確認した４株全てが野生株と同じ約１．６ｋｂｐのサイズの位置にバンドを示した。これは、相補プラスミドがエレクトロポレーションによりｐｙｒＦ遺伝子破壊株の細胞内へ取り込まれ、相同組換えによりｐｙｒＦが元の場所に挿入されたことを意味している。尚、ｐｙｒＦ破壊株ではバンドの長さは約０．９ ｂｐであり、
予想された大きさであった。
【０１１４】
３. M. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）の相補試験２
【０１１５】
３．１. 形質転換ＤＮＡ挿入用相補ベクターの構築
ΔｐｙｒＦ株に対するｐｙｒＦ遺伝子相補試験を行う際に、ｐｙｒＦ上流に形質転換遺伝子の一部を挿入し、相同組換えによる染色体加工が可能であることを示すためのプラスミドを構築する。具体的には、Thermoanaerobacter ethanolicus 39E株のｌａｃＺ遺伝子の一部（約５００ｂｐ）を２．１.で構築したｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターpK18-epyrFの
ｐｙｒＦ遺伝子上流へ挿入した。手順を以下に示す。
【０１１６】
［Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲによる形質転換ＤＮＡ挿入用相補ベクターの構築］
表１０に示すプライマーpyrF-1-R（配列番号１１）及びpyrF-1-F（配列番号１２）、pyrF-2-R（配列番号１３）及びpyrF-2-F（配列番号１４）、又は、pyrF-3-R（配列番号１５）及びpyrF-3-F（配列番号１６）の各組み合わせを用いて、ｐｙｒＦ遺伝子領域を含むベクター領域をＰＣＲ増幅した。何れの組合せにおいても、ＰＣＲの条件は表１１に示した通りである。
【０１１７】
【表１０】
【０１１８】
【表１１】
【０１１９】
表１０に示したプライマーlacZ-500-F（配列番号１７）とlacZ-500-R（配列暗号１８）を用いて、ｌａｃＺ遺伝子領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲの条件は表１２に示した通りである。
【０１２０】
【表１２】
【０１２１】
各ＰＣＲ産物をゲル抽出し、表１３に示した条件で、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ（In-Fusion・Advantage PCR Cloning Kit、タカラバイオ製）を行った。
【０１２２】
【表１３】
【０１２３】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎサンプルに滅菌水を５０μｌ加えて希釈し、希釈したサンプル１０μｌを形質転換に用いた。
【０１２４】
ダイレクトＰＣＲによりコロニーを選択した。
【０１２５】
＜評価＞
ｐｙｒＦの上流領域へｌａｃＺ遺伝子の一部を挿入するために、２．１.で構築したpK18-epyrFを鋳型とし、プライマーpyrF-1-R及びpyrF-1-F、pyrF-2-R及びpyrF-2-F、又は、pyrF-3-R及びpyrF-3-Fの組み合わせを用いてインバースＰＣＲを行った。その際に、プロモーター領域が３００ｂｐ、２０３ｂｐ、１４７ｂｐとなるようにプライマーの位置をずらして３パターンのＰＣＲ産物を得た（図５及び図６）。さらに、Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎＰＣＲを用いてプラスミドへｌａｃＺ遺伝子を挿入するため、プライマーにはｌａｃＺ遺伝子と相同配列を付加しておいた。表１０において配列番号１１〜１６のＳｅｑｕｅｎｃｅ下線部はプロモーター領域である。下線以外の部分がプライマーの位置を決める配列であり、配列番号１１は図６における丸囲み数字１、配列番号１２は図６における丸囲み数字２、配列番号１３は図６における丸囲み数字３、配列番号１４は図６における丸囲み数字４、配列番号１５は図６における丸囲み数字５、配列番号１６は図６における丸囲み数字６に、矢印の向きで対応している。
【０１２６】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲおよび大腸菌における形質転換の結果、複数のコロニーを
得た。lacZ-500-FおよびlacZ-500-RをプライマーとしたコロニーダイレクトＰＣＲの結果、全ての株において目的のバンドが確認できた。
【０１２７】
それらの株の中から３株ずつを培養し、プラスミドを抽出した。プライマーpyrF-1-R及びpyrF-1-Fの組み合わせによるプラスミドをpK18-pyz-1とし、プライマーpyrF-2-R及びpyrF-2-Fの組み合わせによるプラスミドをpK18-pyz-2とし、さらに、プライマーpyrF-3-R及びpyrF-3-Fの組み合わせによるプラスミドをpK18-pyz-3とする。
【０１２８】
制限酵素ＫｐｎＩ処理による確認の結果、図７に示す通り、全ての株においてｌａｃＺ遺伝子の挿入が確認できた。
【０１２９】
図７の電気泳動結果において、レーン１、２、３は、プロモーター領域３００ｂｐ（pK18-pyz-1）、レーン４、５、６は、プロモーター領域２０３ｂｐ（pK18-pyz-2）、レーン７、８、９は、プロモーター領域１４７ｂｐ（pK18-pyz-3）に各々対応している。レーン１０は、pK18-epyrFである。
【０１３０】
３．２. M. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）への形質転
換ＤＮＡ挿入用相補ベクターpK18-pyz-1、pK18-pyz-2、pK18-pyz-3の導入
以下の手順で、１．２.で構築したM. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株（
ΔｐｙｒＦ株）に、３．１.で構築した形質転換ＤＮＡ挿入用相補ベクターpK18-pyz-1、pK18-pyz-2、pK18-pyz-3を導入し、相同組換えによる相補試験を行った。
【０１３１】
［エレクトロポレーションによる形質転換ＤＮＡ挿入用相補ベクターpK18-pyz-1、pK18-pyz-2、pK18-pyz-3の導入］
２７２ｍＭスクロース、１６ｍＭ ＨＥＰＥＳの組成で、水酸化カリウムを用いてｐＨ ６．７に合わせたＨＳ ｂｕｆｆｅｒを調製し、２０分間煮沸した後、さらに２０分間Ｎ
２ガスで置換した。
【０１３２】
８０%水素、２０%二酸化炭素の混合ガスを基質とし、ウラシルを終濃度が１０μｇ/ｍ
ｌになるように添加した完全合成培地でΔｐｙｒＦ株を培養した。
【０１３３】
菌体濃度がＯＤ６００で約０．１になるまで培養し、培養液約５０ｍｌ分を集菌した後、水酸化カリウムでｐＨ７に調整した２７２ｍＭスクロースバッファーで２度洗浄し、洗浄した菌体を適当な量のＨＳ ｂｕｆｆｅｒ（約３ｍｌ）に懸濁した。
【０１３４】
懸濁液３８０μｌとプラスミド５〜１０μｌを混合し、Bio-Rad Gene Pulser（登録商
標）、及び０．２ｃｍ ｇａｐのキュベット （バイオラッド製）を用いて、１．５ ｋＶ、５００Ω、５０μＦ、または２．０ｋＶ、５００Ω、５０μＦでエレクトロポレーションを行った。
【０１３５】
エレクトロポレーション後の懸濁液を、ウラシル１０μｇ/ｍｌの終濃度で添加した５
ｍｌの完全合成培地に植菌し、８０％水素、２０％二酸化炭素の混合ガスを基質として培養し、５５℃で２日間培養後、完全合成培地で洗浄し、完全合成培地と寒天を含む培地に植菌し、ロールチューブを作製した。
【０１３６】
［ダイレクトＰＣＲによるｐｙｒＦ遺伝子相補株の確認］
上記で得られたコロニーを５ｍｌの完全合成培地に植菌し、培養後に培地が濁っているサンプルを選択し、培養液１ｍｌを集菌した。
【０１３７】
アクロモペプチダーゼ（２０ｍｇ/ｍｌ）＋リゾチーム（２０ｍｇ/ｍｌ）の入ったＴＥ
ｂｕｆｆｅｒ １０μｌで懸濁し、３７℃で５分間インキュベートした後、ＤＭＳＯを
１０μｌ添加して懸濁し、ＰＣＲの鋳型とした。
【０１３８】
表５に示したpyrF-up-F3（配列番号７）、pyrF-dn-R3（配列番号８）の組み合わせのプライマーを用い、表１４に示す条件でコロニーダイレクトＰＣＲを行った。
【０１３９】
電気泳動によりバンドを確認し、ｐｙｒＦ遺伝子相補株が得られたと判断した。
【０１４０】
【表１４】
【０１４１】
＜評価＞
計２０コロニー取得し、そのうち８株についてダイレクトＰＣＲによる確認を実施した（図８）。
【０１４２】
図８の電気泳動結果において、レーン１〜８は、コロニー単離株、レーン９は、ΔｐｙｒＦ株ダイレクト、レーン１０は、ATCC39073野生株ダイレクト、レーン１１は、ATCC39073野生株の抽出ＤＮＡ、レーン１２は、形質転換ＤＮＡ挿入用相補ベクターpK18-pyz-1、レーン１３は、ｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターpk18-dpryFに各々対応している。
【０１４３】
図８に示される通り、４株（レーン３、４、５、６）で野生株（レーン１０、１１）より大きいサイズの約２．１ｋｂｐの位置にバンドが見られ、約５００ｂｐのＬａｃＺ遺伝子（形質転換遺伝子）の導入が確認された。残り４株については野生株と同じ約１．６ｋｂｐのサイズの位置にバンドを示した。
【０１４４】
次に、６株分のＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＫｐｎＩで処理して電気泳動にて確認した。ＫｐｎＩの制限酵素サイトは図９の位置にある。ＰＣＲ産物をＫｐｎＩで処理すると２本のバンドが見えるが、形質転換遺伝子が挿入されていた場合には下側のバンドが野生株の時よりも大きい位置に現れる。結果を図１０に示す。
【０１４５】
図１０において、レーン１〜６は、コロニー単離株、レーン７は、ΔｐｙｒＦ株ダイレクト、レーン８は、ATCC39073野生株の抽出ＤＮＡ、レーン９は、形質転換ＤＮＡ挿入用
相補ベクターpK18-pyz-1、レーン１０は、形質転換ＤＮＡ挿入用相補ベクターpK18-pyz-2、レーン１１は、形質転換ＤＮＡ挿入用相補ベクターpK18-pyz-3に各々対応している。
【０１４６】
図１０に示される通り、レーン１、２は野生株と同じバンドが確認され、レーン３、４、５、６では野生株より大きい位置にバンドが見られ、形質転換遺伝子ＬａｃＺの挿入が確認された。
【０１４７】
さらに、ダイレクトＰＣＲではなく、増殖によって得られた菌体からＴｏｔａｌ ＤＮＡを抽出し、同様の条件でＰＣＲを行って形質転換遺伝子ＬａｃＺの挿入を確認した結果、ダイレクトＰＣＲの時と同じ結果が得られた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相同性組み換えによるモーレラ属細菌における形質転換遺伝子発現のためのプロセスに用いられるプライマーセット及び該プライマーセットを用いた相同性組み換え方法に関し、詳しくは、モーレラ属細菌において、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を欠失又は破壊して、ウラシル要求性を付与する形質転換に用いられるプライマーセット及び該プライマーセットを用いた相同性組み換え方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モーレラ属細菌は、ガスから酢酸やエタノール生産できる等、産業上有用な性質を有するが、例えばエタノール生産に着目した場合、生産効率に向上の余地がある。
【０００３】
本発明者は、モーレラ属細菌を形質転換して、エタノールの生産効率を向上する等の有用な機能を付与することを検討したが、モーレラ属細菌の遺伝学的性質は、他の細菌と比べて特異的であり、また十分に解明されていないことなどから、形質転換は困難であった。例えば、モーレラ属細菌に対してニトロソグアニジン（ＮＴＧ）など化学物質による変異処理を行った場合は、継代後もエタノール高生産を維持する株は得られず、あるいは、染色体外遺伝子としてプラスミドベクターの導入を試みた場合は、形質転換が確認された株は得られなかった。
【０００４】
本発明者は、研究によって、これまでに、モーレラ属細菌であるMoorella sp. HUC22-1株を元株として用い、相同性組み換えによって、ウラシルの生合成系に関与する酵素であるオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｐｙｒＥ）を破壊し、ウラシル要求性モーレラ属細菌を得ることに成功している（特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、かかるウラシル要求性モーレラ属細菌は、ｐｙｒＥを再度組み込んで相補を行うことが困難であったため、形質転換遺伝子を導入して、形質転換遺伝子を発現させる具体的手法を確立するまでには至っていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１７１３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、更に研究を行い、相同性組み換えによるモーレラ属細菌における形質転換遺伝子発現のためのプロセスの確立を試み、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｐｙｒＦ）を破壊し、新規なウラシル要求性モーレラ属細菌を得ると共に、このウラシル要求性モーレラ属細菌の染色体に、ｐｙｒＦ及び形質転換遺伝子を導入して、形質転換遺伝子を発現させる具体的手法を見出して本発明を完成するに至った。
【０００８】
そこで、本発明の課題は、モーレラ属細菌において、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を欠失又は破壊して、ウラシル要求性を付与する形質転換に用いられるプライマーセット及び該プライマーセットを用いた相同性組み換え方法を提供することにある。
【０００９】
また本発明の他の課題は、以下の記載によって明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題は、以下の各発明によって解決される。
【００１１】
（請求項１）
モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は破壊されたウラシル要求性株を作出する際に用いられるプライマーセットであって、
前記オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する上流領域を増幅する配列番号１及び配列番号２で示されることを特徴とするプライマーセット。
【００１２】
（請求項２）
モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は破壊されたウラシル要求性株を作出する際に用いられるプライマーセットであって、
前記オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する下流領域を増幅する配列番号３及び配列番号４で示されることを特徴とするプライマーセット。
【００１３】
（請求項３）
モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は破壊されたウラシル要求性株を作出する際に用いられるプライマーセットであって、
前記オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する上流領域を増幅する配列番号１及び配列番号２で示されプライマーセット、及び、該オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する下流領域を増幅する配列番号３及び配列番号４で示されるプライマーセットを備えることを特徴とするプライマーセット。
【００１４】
（請求項４）
請求項１〜３の何れかに記載のプライマーセットを用いて、モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を欠失又は破壊してウラシル要求性株を作出することを特徴とする相同性組み換え方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、モーレラ属細菌において、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を欠失又は破壊して、ウラシル要求性を付与する形質転換に用いられるプライマーセット及び該プライマーセットを用いた相同性組み換え方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】プライマーの位置を示す図
【図２】ｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターｐｋ１８-ｄｐｒｙＦの構築方法を示す図
【図３】各プライマーの位置及び予想される断片の長さを示す図
【図４】ダイレクトＰＣＲによるｐｙｒＦ相補候補株の確認の結果を示す図
【図５】プラスミド構築のスキームを示す図
【図６】ｐｙｒＦ遺伝子上流領域の配列とプライマーの位置を示す図
【図７】ＫｐｎＩ処理による確認の結果を示す図
【図８】コロニーダイレクトＰＣＲ結果を示す図
【図９】制限酵素ＫｐｎＩサイトの位置を示す図
【図１０】コロニーダイレクトＰＣＲ産物の制限酵素ＫｐｎＩ処理の結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に、本発明を実施するための形態を説明する。
【００１８】
本発明に係るプライマーは、相同性組み換えによるモーレラ属細菌における形質転換遺伝子発現のためのプロセスに用いることができる。
【００１９】
モーレラ（Moorella）属細菌としては、格別限定されるものではないが、Moorella thermoacetia、M．thermoautotrophica、M．glycerini等を好ましく例示でき、エタノール生産効率が高い菌株の作出の上では、水素と二酸化炭素、又は、一酸化炭素からエタノールを生産する能力を有するモーレラ属細菌であることが好ましく、更には、Moorella thermoacetica ATCC 39073株等を好ましく例示できる。
【００２０】
ウラシル要求性とは、菌株がその生育にウラシルを栄養として要求する性質を指す。モーレラ属細菌は、通常ウラシルを生合成できるため、ウラシル要求性を有さないが、変異によりウラシルの生合成ができなくなった場合、ウラシルを栄養として要求するようになる。ウラシル要求性株とは、このようなウラシル要求性を有する菌株である。
【００２１】
オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼは、ウラシルの生合成に必要なピリミジン塩基の前駆体であるＵＭＰ（ウリジン一リン酸）の生合成に関与する酵素の一つであり、これをコードする遺伝子を欠いた株は、ＵＭＰを生合成できなくなるために、ウラシル要求性株となる。
【００２２】
本発明の配列番号１〜４に示されるプライマーセットは、元株となるモーレラ属細菌において、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（以下ｐｙｒＦという場合がある。）を欠失又は破壊して、ウラシル要求性を付与する相同性組換えに用いられる。
【００２３】
具体的には、配列番号１及び配列番号２で示されるプライマーセットは、モーレラ属細菌の染色体上において、ｐｙｒＦに隣接する上流領域を増幅する。
【００２４】
一方、配列番号３及び配列番号４で示されるプライマーセットは、モーレラ属細菌の染色体上において、ｐｙｒＦに隣接する下流領域を増幅する。
【００２５】
配列番号１及び配列番号２で示されるプライマーセットを用いたＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物、及び、配列番号３及び配列番号４で示されるプライマーセットを用いたＰＣＲにより得られる各ＰＣＲ産物をライゲーションすることにより、ｐｙｒＦが欠失または破壊されていると共に、ｐｙｒＦに隣接した上流領域及び下流領域を含むＤＮＡ断片が得られる。
【００２６】
得られたＤＮＡ断片をプラスミドに組み込んでｐｙｒＦ破壊用プラスミドを構築し、元株となるモーレラ属細菌に導入する。これにより、元株において、相同性組み換えが誘発され、染色体上の遺伝子においてｐｙｒＦが欠失または破壊される。
【００２７】
本発明において、ｐｙｒＦ破壊用プラスミドをモーレラ属細菌に導入する方法は、格別限定されず、例えば、エレクトロポレーション法等により、モーレラ属細菌に導入する方法を好ましく用いることができる。
【００２８】
以上のようにして、ｐｙｒＦを相同性組換えにより欠失または破壊してなるウラシル要求性モーレラ属細菌（ｐｙｒＦ破壊株）が得られる。
【００２９】
ｐｙｒＦ遺伝子が破壊されたことを確認するためには、元株として用いたモーレラ属細菌のゲノムＤＮＡと、ｐｙｒＦ破壊株のゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型にＰＣＲ等を行って確認することができる。
【００３０】
配列番号５〜配列番号１０のプライマーは、作出した細胞からｐｙｒＦが欠失又は破壊されているかをＰＣＲにより確認する際に好ましく使用することができる。
【００３１】
得られたｐｙｒＦ破壊株について、ｐｙｒＦ遺伝子を導入して、一度失われたピリミジン生合成経路を回復して、ウラシル要求性を消失させることが可能であること、即ち、相補が可能であることを確認することができる。
【００３２】
相補の確認のためには、まず、配列番号１及び配列番号４で示されるプライマーセットを用いて、モーレラ属細菌における染色体上のオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子と、それに隣接する上流領域及び下流領域を増幅する。
【００３３】
次いで、増幅されたＤＮＡ断片をプラスミドに組み込んで、上流領域及び下流領域からなる相同性部位間にｐｙｒＦを有する相補確認用プラスミドを構成する。
【００３４】
相補確認用プラスミドをｐｙｒＦ破壊株に導入し、ウラシル欠損培地での生育が確認されれば、ｐｙｒＦ破壊株が相補可能であることが確認される。
【００３５】
本発明の配列番号１〜４に示されるプライマーセットを用いて、元株となるモーレラ属細菌Moorella thermoacetica ATCC 39073株のｐｙｒＦ遺伝子を相同性組換えによって破壊しウラシル要求性を付与した菌株は、ＭＴＡ−Ｄ−ｐＦ株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０５７）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００３６】
培養的な性質は、以下の通りである。
【００３７】
改変型ＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ 寒天培地（※１）において、嫌気的、５５℃、
培養日数３〜５日で直径３〜５ｍｍの円形コロニーを形成する。
【００３８】
ｉ）色： 茶色
ｉｉ）表面の形状：スムーズ
ｉｉｉ）透明度：不透明
【００３９】
※１ 改変型ＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ 寒天培地
ＮＨ４Ｃｌ １．０ｇ
ＫＣｌ ０．１ｇ
ＭｇＳＯ４ ０．２ｇ
ＮａＣｌ ０．８ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ
ＣａＣｌ２ ０．０２ｇ
Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １．０ｇ
（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ無添加の場合 Ｕｒａｃｉｌ ０．０１ｇ）
ＮａＨＣＯ３ ２．０ｇ
Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ＨＣｌ ０．３ｇ
Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉ） １０ｍｌ
Ｖｉｔａｍｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＩＩ） １０ｍｌ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ １０００ｍｌ
（Ａｇａｒ（高温用） ２０ｇ）
（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ ５．０ｇ）
ｐＨ ５．９（滅菌前）
滅菌温度・時間 １２１℃ １５分
【００４０】
なお、上記の（Ｉ）Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ及び（ＩＩ） Ｖｉｔａｍｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎは以下の組成である。
【００４１】
（Ｉ）Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ２．０ｇ
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １．０ｇ
Ｆｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２・６Ｈ２Ｏ ０．８ｇ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２ｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００２ｇ
ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ
Ｎａ２ＳｅＯ４ ０．０２ｇ
Ｎａ２ＷＯ４ ０．０２ｇ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ １０００ｍｌ
（ＩＩ）Ｖｉｔａｍｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｂｉｏｔｉｎ ２．０ｍｇ
Ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ２．０ｍｇ
Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ−ＨＣｌ １０ｍｇ
Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ ５．０ｍｇ
Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ ５．０ｍｇ
Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ５．０ｍｇ
Ｄ−Ｃａ−ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ ５．０ｍｇ
Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ12 ０．１ｍｇ
ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ５．０ｍｇ
Ｔｈｉｏｃｔｉｃ ａｃｉｄ ５．０ｍｇ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ １０００ｍｌ
【００４２】
得られたｐｙｒＦ破壊株は、相同性部位と、破壊遺伝子がわかっているので、例えばエタノール生産性の向上のような特定の機能を付与する遺伝子を導入する形質転換の元株として好適に用いることができる。
【００４３】
例えば、２つの相同性部位の間にｐｙｒＦ遺伝子及び導入したい形質転換遺伝子（特定の機能を付与する遺伝子）を有する形質転換遺伝子導入用ベクターを作製し、これをｐｙｒＦ破壊株に導入することで、ピリミジン生合成経路が回復してウラシル要求性を消失させると共に、特定の形質転換遺伝子が発現可能なモーレラ属細菌が形成される。ウラシル欠損培地で生育可能な菌を分離する等、ウラシル要求性に基づいて菌の分離を行うことで、形質転換遺伝子が導入され、特定の機能が付与された形質転換株を容易に得ることができる。
【００４４】
形質転換遺伝子導入用ベクターの作出に際しては、配列番号１及び配列番号４で示されるプライマーセットを好適に用いることができる。
【００４５】
即ち、配列番号１及び配列番号４で示されるプライマーセットは、モーレラ属細菌における染色体上のオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子と、その上流及び下流に隣接する両隣接領域とを増幅する。
【００４６】
配列番号１及び配列番号４で示されるプライマーセットを用いて、モーレラ属細菌における染色体を鋳型に増幅されたＤＮＡ断片において、ｐｙｒＦの上流側又は下流側に形質転換遺伝子を組み込んで、両隣接領域間に、ｐｙｒＦ及び形質転換遺伝子が介在するＤＮＡ断片を作成する。
【００４７】
作成されたＤＮＡ断片をプラスミドに組み込むことにより、形質転換遺伝子導入用ベクターを構成することができる。
【００４８】
本発明において、形質転換遺伝子としては、元来モーレラ属細菌が保有していない遺伝子の他に、元来モーレラ属細菌が保有している遺伝子であってもよい。即ち、遺伝子保有数増加（発現増加）の目的で元来モーレラ属細菌が保有している遺伝子を追加的に組み込むことも好ましいことである。
【００４９】
ｐｙｒＦ破壊株に形質転換遺伝子導入用ベクターを導入することにより、相同性組み換えが誘発され、ｐｙｒＦ破壊株の染色体上にｐｙｒＦ及び形質転換遺伝子が組み込まれる。
【００５０】
以上のようにして、ｐｙｒＦ破壊株の染色体上に、相同性組み換えによって形質転換遺伝子を導入してなる形質転換遺伝子導入モーレラ属細菌が得られる。
【００５１】
かかる形質転換遺伝子導入モーレラ属細菌は、染色体上に、形質転換遺伝子を発現可能に保有することができる。
【実施例】
【００５２】
（実施例１）
以下、モーレラ属細菌に対して使用する培地、試薬等は全て嫌気的、無菌的に調製したものを用い、また操作は嫌気雰囲気下で行った。
【００５３】
１. Moorella thermoacetica ATCC 39073株のｐｙｒＦ遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）の作製
【００５４】
１．１. ｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターの構築
以下の手順で、Moorella thermoacetica ATCC 39073株のorotidine-5'-phosphate decarboxylase遺伝子ｐｙｒＦを破壊するためのベクターを構築した。
【００５５】
［ｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターpk18-dpryFの構築］
まず、表１に示したプライマーpyrF-up-F1（配列番号１）及びpyrF-up-R1（配列番号２）、並びに、pyrF-dn-F1（配列番号３）及びpyrF-dn-R1（配列番号４）の組み合わせを用いて、表２に示す条件でＰＣＲを行い、ｐｙｒＦ遺伝子の上流及び下流それぞれ約１０００ ｂｐを増幅した。
【００５６】
図１及び図２に示す通り、プライマーpyrF-up-F1（配列番号１）及びpyrF-up-R1（配列番号２）は、ｐｙｒＦ遺伝子の上流の隣接領域を増幅し、pyrF-dn-F1（配列番号３）及びpyrF-dn-R1（配列番号４）は、ｐｙｒＦ遺伝子の下流の隣接領域を増幅する。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】
得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＳｐｅＩで処理をした後に、MagExtractor Kit（東洋紡製）を用いて精製を行い、ｐｙｒＦ遺伝子上流領域のＰＣＲ産物を５μｌ、下流領域のＰＣＲ産物を５μｌ、Ligation high Ver.2（東洋紡製）を１０μｌ混合し、１６℃で３
０分間インキュベートし、ライゲーション産物を鋳型として、プライマーpyrF-up-F1（配列番号１）およびpyrF-dn-R1（配列番号４）を用いて表３に示す条件でＰＣＲを行った。
【００６０】
【表３】
【００６１】
得られたＰＣＲ産物をMagExtractor Kit（東洋紡製）を用いてゲル抽出を行った後、２μｌのＳｍａＩ処理をしたプラスミドpK18mobを、８μｌのゲル抽出したＰＣＲ産物、１
０μｌのLigation high Ver.2（東洋紡製）と混合し、１６℃で１時間インキュベートし
、Escherichia coli HST08 Premiumコンピテントセル（タカラバイオ製）にライゲーション溶液１０μｌを添加して軽く攪拌した後、氷中に１０分静置し、４２℃で１分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。
【００６２】
ＳＯＣ培地を１ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベート後、ＬＢ寒天培地（カナマイシン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）に塗沫し、３７℃で一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。
【００６３】
［ｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターの確認］
上記（ｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターpk18-dpryFの構築）で生育が見られたコロニーを、
カナマイシンを添加したＬＢ培地に移植した後、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、インサートの確認を行った。プライマーは表１に示すpyrF-up-F1（配列番号１）、pyrF-dn-R1（配列番号４）を用いた。コロニーダイレクトＰＣＲの条件を表４に示す。
【００６４】
【表４】
【００６５】
得られたＰＣＲ産物について、電気泳動によりバンドを確認した。
【００６６】
バンドが確認できた株を、カナマイシンを添加したＬＢ液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
【００６７】
吸光度による濃度測定および電気泳動による確認後、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的のｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターpk18-dpryFが構築できていることを確認した。
【００６８】
１．２. M. thermoacetica ATCC 39073株のｐｙｒＦ遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）の作製
１．１.で構築したｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターpk18-dpryFを、以下の手順で、M. thermoacetica ATCC 39073株に導入し、ダブルクロスオーバーの相同性組換えによってｐｙｒＦ遺伝子が破壊された株（ΔｐｙｒＦ株）を選抜した。
【００６９】
［M. thermoacetica ATCC 39073株へのｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターpk18-dpryFの導入］
２７２ｍＭスクロース、１６ｍＭ ＨＥＰＥＳの組成で、水酸化カリウムを用いてｐＨ ７に合わせたＨＳ ｂｕｆｆｅｒを調製し、２０分間煮沸した後、さらに２０分間Ｎ２ガ
スで置換した。
【００７０】
８０％の水素、２０％の二酸化炭素の混合ガスを基質とし、改変型ＡＴＣＣ １７５４
ＰＥＴＣ培地、あるいは、グリシンを終濃度５ｇ/Ｌになるように添加した改変型ＡＴ
ＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ培地でM. thermoacetica ATCC39073株を培養した。
【００７１】
菌体濃度がＯＤ６００で約０．３になるまで培養し、培養液約１００ｍｌ分を集菌した後、ＨＳ ｂｕｆｆｅｒで菌体を２度洗浄した。
【００７２】
洗浄した菌体を適当な量のＨＳ ｂｕｆｆｅｒ（約３ｍｌ）に懸濁し、懸濁液３８０μ
ｌとプラスミド２０μｌを混合した。
【００７３】
Bio-Rad Gene Pulser（登録商標）、及び０．２ｃｍ ｇａｐのキュベット（バイオラ
ッド製）を用いて、１．５ｋＶ、５００Ω、５０μＦまたは２．０ｋＶ、５００Ω、５０μＦでエレクトロポレーションを行った。
【００７４】
エレクトロポレーション後の懸濁液を、ピルビン酸４０ｍＭの終濃度で添加した５ｍｌの培地に植菌し、５５℃で２日間培養後に、ウラシル１０μｇ/ｍｌ、５−フルオロオロ
チン酸（５−ＦＯＡ）０．２％の終濃度で添加した寒天培地に植菌し、ロールチューブを作製した。
【００７５】
［ダイレクトＰＣＲによるｐｙｒＦ遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）の確認］
上記寒天培地に形成された２０個のコロニーを、５ ｍｌのウラシル１０μｇ/ｍｌ、５−ＦＯＡ ０．２％の終濃度で添加した液体培地に植菌し、培養３日目に培地が濁っていることが確認できた６株を選択し、培養液１ｍｌを集菌した。
【００７６】
アクロモペプチダーゼ（２０ｍｇ/ｍｌ）＋リゾチーム（２０ｍｇ/ｍｌ）の入ったＴＥ
ｂｕｆｆｅｒ ２０μｌで懸濁し、３７℃で５分間インキュベートし、ＤＭＳＯを２０μｌ添加して懸濁し、ＰＣＲの鋳型とした。
【００７７】
表５に示すプライマーのうち、pyrF-up-F2（配列番号５）及びpyrF-dn-R2（配列番号６）、pyrF-up-F3（配列番号７）及びpyrF-dn-R3（配列番号８）、又は、pyrF-F（配列番号９）及びpyrF-R（配列番号１０）の組み合わせを用い、各々の組合せについて、表６に示す条件でコロニーダイレクトＰＣＲを行い、電気泳動によりバンドを確認した。図３は各プライマーの位置及び予想される断片の長さを示している。図３は各プライマーの位置及び予想される断片の長さを示している。
【００７８】
【表５】
【００７９】
【表６】
【００８０】
＜評価＞
ロールチューブ法によるコロニー形成を試みた結果、多数のコロニーを得た。そこで、コロニーを２０株選択し、液体培地（１０μｇ/ｍｌウラシル、０．２％ ５−ＦＯＡ）にて培養した。菌体の生育が確認できた培養液から菌体を集菌し、ダイレクトＰＣＲによる確認を行った。
【００８１】
培養３日目に増殖が確認できた６株について、プライマーpyrF-up-F2及びpyrF-dn-R2、又は、pyrF-up-F3及びpyrF-dn-R3の組み合わせを用い、ｐｙｒＦの外側からＰＣＲを行ったところ、６株中１株において野生株よりも短いバンドが確認できた。
【００８２】
さらに、プライマーｐｙｒＦ-Ｆ及びｐｙｒＦ−Ｒの組み合わせを用い、ｐｙｒＦの内
側をＰＣＲしたところ前述の株においてはバンドが確認できなかった。
【００８３】
これらの結果から、野生株よりも短いバンドを確認できた株がｐｙｒＦ遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）である可能性があると判断し、染色体抽出を行った後にもう一度ＰＣＲを行った。その結果、ダイレクトＰＣＲの際と同様のバンドパターンが得られた。
【００８４】
さらに、ｐｙｒＦ遺伝子が破壊された部分には制限酵素ＳｐｅＩサイトが１か所付与されることから（プライマーpyrF-up-R1、pyrF-dn-F1参照）、上記のＰＣＲ産物についてＳｐｅＩで処理したところ、ＳｐｅＩサイトで切断が起こり、バンドが２本になることを確認した。
【００８５】
次に、ｐｙｒＦ遺伝子破壊候補株についてウラシル要求性試験を行った。酵母エキスを除いた改変型ＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ培地にｐｙｒＦ遺伝子破壊株を植菌し、１０μｇ/ｍｌの終濃度でウラシルを添加した場合と添加しなかった場合で増殖の確認を行っ
た。
【００８６】
その結果、ウラシルを添加したサンプルでは培養２日目には菌体の増殖が確認できたが、ウラシルを添加しなかったサンプルにおいては増殖が確認できなかった。これらの結果から、pyrF遺伝子の破壊が確認できた。
【００８７】
このｐｙｒＦ遺伝子破壊株は、ＭＴＡ−Ｄ−ｐＦ株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０５７）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００８８】
２. M. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）の相補試験１
【００８９】
２．１. ｐｙｒＦ遺伝子相補ベクター（遺伝子発現ベクター）の構築
以下の手順で、M. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）の相補試験を行うために、ｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターを構築した。
【００９０】
［ｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターの構築］
表１に示したプライマーpyrF-up-F1（配列番号１）とpyrF-dn-R1（配列番号４）の組み合わせを用いて、表７に示す条件でＰＣＲを行い、ｐｙｒＦ遺伝子翻訳領域とその５’側の約１０００ｂｐ、３’側の約１０００ｂｐを含む約２．７ｋｂｐの遺伝子断片を増幅した。
【００９１】
【表７】
【００９２】
得られたＰＣＲ産物についてMagExtractor Kit（東洋紡製）を用いてゲル抽出を行った。
【００９３】
２μｌのＥｃｏＲＶ処理をしたプラスミドpBluescript II KS+、または、２μｌのＳｍａＩ処理をしたプラスミドpK18mobを、８μｌのゲル抽出したＰＣＲ産物、１０μｌのLigation high Ver.2（東洋紡製）と混合し、１６℃で１時間インキュベートした。
【００９４】
Escherichia coli HST08 Premiumコンピテントセル（タカラバイオ製）にライゲーション溶液１０μｌを添加して軽く攪拌し、氷中に１０分静置した後、４２℃で１分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。
【００９５】
ＳＯＣ培地を１ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベート後、pBluescript II KS+を用いた場合はＬＢ寒天培地（アンピシリン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）に、pK18mobを用
いた場合はＬＢ寒天培地（カナマイシン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）に塗沫し、３７℃で一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。
【００９６】
［ｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターの確認］
上記で生育が見られたコロニーをアンピシリン、あるいはカナマイシンを添加したＬＢ寒天培地に移植した後、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、インサートの確認を行った。プライマーは表１に示すpyrF-up-F1（配列番号１）、pyrF-dn-R1（配列番号４）を用いた。コロニーダイレクトＰＣＲの条件を表８に示す。
【００９７】
【表８】
【００９８】
さらに、電気泳動によりバンドが確認できた株について、pBluescript II KS+を用いた場合はアンピシリンを、pK18mobを用いた場合はカナマイシン（pK18-epyrF）を添加した
ＬＢ液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
【００９９】
吸光度による濃度測定、及び、ＥｃｏＲＩ又はＰｓｔＩ処理サンプルの電気泳動を行い、さらに、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的のｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターpK18-epyrFおよびpBS-epyrFが構築できていることを確認した。
【０１００】
２．２. M. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）へのｐｙｒ
Ｆ遺伝子相補ベクターpBS-epyrFの導入
以下の手順で、１．２.で構築したM. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株（
ΔｐｙｒＦ株）に、２．１.で構築したｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターpBS-epyrFを導入し、相同組換えによる相補試験を行った。
【０１０１】
［エレクトロポレーションによるｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターpBS-epyrFの導入］
２７２ｍＭスクロース、１６ｍＭ ＨＥＰＥＳの組成で、水酸化カリウムを用いてｐＨ ６．７に合わせたＨＳ ｂｕｆｆｅｒを調製し、２０分間煮沸した後、さらに２０分間Ｎ２ガスで置換した。
【０１０２】
８０%水素、２０%二酸化炭素の混合ガスを基質とし、ウラシルを終濃度が１０μｇ/ｍ
ｌになるように添加した完全合成培地でΔｐｙｒＦ株を培養した。
【０１０３】
菌体濃度がＯＤ６００で約０．１になるまで培養し、培養液約１００ｍｌ分を集菌した後、水酸化カリウムでｐＨ７に調整した２７２ｍＭスクロースバッファーで２度洗浄した。
【０１０４】
洗浄した菌体を適当な量のＨＳ ｂｕｆｆｅｒ（約３ｍｌ）に懸濁し、懸濁液３８０μｌとプラスミド２０μｌを混合した。
【０１０５】
Bio-Rad Gene Pulser（登録商標）、 及び０．２ｃｍ ｇａｐのキュベット （バイオ
ラッド製）を用いて、１．５ｋＶ、５００Ω、５０μＦ、または２．０ｋＶ、５００Ω、５０μＦでエレクトロポレーションを行った。
【０１０６】
エレクトロポレーション後の懸濁液をウラシル１０μｇ/ｍｌ、ピルビン酸４０ｍＭの
終濃度で添加した５ｍｌの完全合成培地に植菌し、５５℃で２日間培養後、完全合成培地で洗浄し、完全合成培地と寒天を含む培地に植菌し、ロールチューブを作製した。
【０１０７】
［ダイレクトＰＣＲによるｐｙｒＦ遺伝子相補株の確認］
上記で得られたコロニーを５ｍｌの完全合成培地に植菌し、培養４日目に培地が濁っているサンプルを選択し、培養液１ｍｌを集菌した。
【０１０８】
アクロモペプチダーゼ（２０ｍｇ/ｍｌ）＋リゾチーム（２０ｍｇ/ｍｌ）の入ったＴＥ
ｂｕｆｆｅｒ１０μｌで懸濁し、３７℃で５分間インキュベートし、ＤＭＳＯを１０μｌ添加して懸濁し、ＰＣＲの鋳型とした。
【０１０９】
表５に示すpyrF-up-F3（配列番号７）、pyrF-dn-R3（配列番号８）の組み合わせのプライマーを用い、表９に示す条件でコロニーダイレクトＰＣＲを行った。
【０１１０】
電気泳動によりバンドを確認し、ｐｙｒＦ遺伝子相補株が得られたと判断した。
【０１１１】
【表９】
【０１１２】
＜評価＞
培養４日目で培養液が白く濁っていたサンプル４株についてダイレクトＰＣＲによる確認を実施した。結果を図４に示す。
【０１１３】
図４の電気泳動結果において、レーン１〜４は相補株、レーン５は野生株、レーン６はｐｙｒＦ破壊株であり、今回確認した４株全てが野生株と同じ約１．６ｋｂｐのサイズの位置にバンドを示した。これは、相補プラスミドがエレクトロポレーションによりｐｙｒＦ遺伝子破壊株の細胞内へ取り込まれ、相同組換えによりｐｙｒＦが元の場所に挿入されたことを意味している。尚、ｐｙｒＦ破壊株ではバンドの長さは約０．９ ｂｐであり、
予想された大きさであった。
【０１１４】
３. M. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）の相補試験２
【０１１５】
３．１. 形質転換ＤＮＡ挿入用相補ベクターの構築
ΔｐｙｒＦ株に対するｐｙｒＦ遺伝子相補試験を行う際に、ｐｙｒＦ上流に形質転換遺伝子の一部を挿入し、相同組換えによる染色体加工が可能であることを示すためのプラスミドを構築する。具体的には、Thermoanaerobacter ethanolicus 39E株のｌａｃＺ遺伝子の一部（約５００ｂｐ）を２．１.で構築したｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターpK18-epyrFの
ｐｙｒＦ遺伝子上流へ挿入した。手順を以下に示す。
【０１１６】
［Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲによる形質転換ＤＮＡ挿入用相補ベクターの構築］
表１０に示すプライマーpyrF-1-R（配列番号１１）及びpyrF-1-F（配列番号１２）、pyrF-2-R（配列番号１３）及びpyrF-2-F（配列番号１４）、又は、pyrF-3-R（配列番号１５）及びpyrF-3-F（配列番号１６）の各組み合わせを用いて、ｐｙｒＦ遺伝子領域を含むベクター領域をＰＣＲ増幅した。何れの組合せにおいても、ＰＣＲの条件は表１１に示した通りである。
【０１１７】
【表１０】
【０１１８】
【表１１】
【０１１９】
表１０に示したプライマーlacZ-500-F（配列番号１７）とlacZ-500-R（配列暗号１８）を用いて、ｌａｃＺ遺伝子領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲの条件は表１２に示した通りである。
【０１２０】
【表１２】
【０１２１】
各ＰＣＲ産物をゲル抽出し、表１３に示した条件で、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ（In-Fusion・Advantage PCR Cloning Kit、タカラバイオ製）を行った。
【０１２２】
【表１３】
【０１２３】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎサンプルに滅菌水を５０μｌ加えて希釈し、希釈したサンプル１０μｌを形質転換に用いた。
【０１２４】
ダイレクトＰＣＲによりコロニーを選択した。
【０１２５】
＜評価＞
ｐｙｒＦの上流領域へｌａｃＺ遺伝子の一部を挿入するために、２．１.で構築したpK18-epyrFを鋳型とし、プライマーpyrF-1-R及びpyrF-1-F、pyrF-2-R及びpyrF-2-F、又は、pyrF-3-R及びpyrF-3-Fの組み合わせを用いてインバースＰＣＲを行った。その際に、プロモーター領域が３００ｂｐ、２０３ｂｐ、１４７ｂｐとなるようにプライマーの位置をずらして３パターンのＰＣＲ産物を得た（図５及び図６）。さらに、Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎＰＣＲを用いてプラスミドへｌａｃＺ遺伝子を挿入するため、プライマーにはｌａｃＺ遺伝子と相同配列を付加しておいた。表１０において配列番号１１〜１６のＳｅｑｕｅｎｃｅ下線部はプロモーター領域である。下線以外の部分がプライマーの位置を決める配列であり、配列番号１１は図６における丸囲み数字１、配列番号１２は図６における丸囲み数字２、配列番号１３は図６における丸囲み数字３、配列番号１４は図６における丸囲み数字４、配列番号１５は図６における丸囲み数字５、配列番号１６は図６における丸囲み数字６に、矢印の向きで対応している。
【０１２６】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲおよび大腸菌における形質転換の結果、複数のコロニーを
得た。lacZ-500-FおよびlacZ-500-RをプライマーとしたコロニーダイレクトＰＣＲの結果、全ての株において目的のバンドが確認できた。
【０１２７】
それらの株の中から３株ずつを培養し、プラスミドを抽出した。プライマーpyrF-1-R及びpyrF-1-Fの組み合わせによるプラスミドをpK18-pyz-1とし、プライマーpyrF-2-R及びpyrF-2-Fの組み合わせによるプラスミドをpK18-pyz-2とし、さらに、プライマーpyrF-3-R及びpyrF-3-Fの組み合わせによるプラスミドをpK18-pyz-3とする。
【０１２８】
制限酵素ＫｐｎＩ処理による確認の結果、図７に示す通り、全ての株においてｌａｃＺ遺伝子の挿入が確認できた。
【０１２９】
図７の電気泳動結果において、レーン１、２、３は、プロモーター領域３００ｂｐ（pK18-pyz-1）、レーン４、５、６は、プロモーター領域２０３ｂｐ（pK18-pyz-2）、レーン７、８、９は、プロモーター領域１４７ｂｐ（pK18-pyz-3）に各々対応している。レーン１０は、pK18-epyrFである。
【０１３０】
３．２. M. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株（ΔｐｙｒＦ株）への形質転
換ＤＮＡ挿入用相補ベクターpK18-pyz-1、pK18-pyz-2、pK18-pyz-3の導入
以下の手順で、１．２.で構築したM. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株（
ΔｐｙｒＦ株）に、３．１.で構築した形質転換ＤＮＡ挿入用相補ベクターpK18-pyz-1、pK18-pyz-2、pK18-pyz-3を導入し、相同組換えによる相補試験を行った。
【０１３１】
［エレクトロポレーションによる形質転換ＤＮＡ挿入用相補ベクターpK18-pyz-1、pK18-pyz-2、pK18-pyz-3の導入］
２７２ｍＭスクロース、１６ｍＭ ＨＥＰＥＳの組成で、水酸化カリウムを用いてｐＨ ６．７に合わせたＨＳ ｂｕｆｆｅｒを調製し、２０分間煮沸した後、さらに２０分間Ｎ
２ガスで置換した。
【０１３２】
８０%水素、２０%二酸化炭素の混合ガスを基質とし、ウラシルを終濃度が１０μｇ/ｍ
ｌになるように添加した完全合成培地でΔｐｙｒＦ株を培養した。
【０１３３】
菌体濃度がＯＤ６００で約０．１になるまで培養し、培養液約５０ｍｌ分を集菌した後、水酸化カリウムでｐＨ７に調整した２７２ｍＭスクロースバッファーで２度洗浄し、洗浄した菌体を適当な量のＨＳ ｂｕｆｆｅｒ（約３ｍｌ）に懸濁した。
【０１３４】
懸濁液３８０μｌとプラスミド５〜１０μｌを混合し、Bio-Rad Gene Pulser（登録商
標）、及び０．２ｃｍ ｇａｐのキュベット （バイオラッド製）を用いて、１．５ ｋＶ、５００Ω、５０μＦ、または２．０ｋＶ、５００Ω、５０μＦでエレクトロポレーションを行った。
【０１３５】
エレクトロポレーション後の懸濁液を、ウラシル１０μｇ/ｍｌの終濃度で添加した５
ｍｌの完全合成培地に植菌し、８０％水素、２０％二酸化炭素の混合ガスを基質として培養し、５５℃で２日間培養後、完全合成培地で洗浄し、完全合成培地と寒天を含む培地に植菌し、ロールチューブを作製した。
【０１３６】
［ダイレクトＰＣＲによるｐｙｒＦ遺伝子相補株の確認］
上記で得られたコロニーを５ｍｌの完全合成培地に植菌し、培養後に培地が濁っているサンプルを選択し、培養液１ｍｌを集菌した。
【０１３７】
アクロモペプチダーゼ（２０ｍｇ/ｍｌ）＋リゾチーム（２０ｍｇ/ｍｌ）の入ったＴＥ
ｂｕｆｆｅｒ １０μｌで懸濁し、３７℃で５分間インキュベートした後、ＤＭＳＯを
１０μｌ添加して懸濁し、ＰＣＲの鋳型とした。
【０１３８】
表５に示したpyrF-up-F3（配列番号７）、pyrF-dn-R3（配列番号８）の組み合わせのプライマーを用い、表１４に示す条件でコロニーダイレクトＰＣＲを行った。
【０１３９】
電気泳動によりバンドを確認し、ｐｙｒＦ遺伝子相補株が得られたと判断した。
【０１４０】
【表１４】
【０１４１】
＜評価＞
計２０コロニー取得し、そのうち８株についてダイレクトＰＣＲによる確認を実施した（図８）。
【０１４２】
図８の電気泳動結果において、レーン１〜８は、コロニー単離株、レーン９は、ΔｐｙｒＦ株ダイレクト、レーン１０は、ATCC39073野生株ダイレクト、レーン１１は、ATCC39073野生株の抽出ＤＮＡ、レーン１２は、形質転換ＤＮＡ挿入用相補ベクターpK18-pyz-1、レーン１３は、ｐｙｒＦ遺伝子破壊ベクターpk18-dpryFに各々対応している。
【０１４３】
図８に示される通り、４株（レーン３、４、５、６）で野生株（レーン１０、１１）より大きいサイズの約２．１ｋｂｐの位置にバンドが見られ、約５００ｂｐのＬａｃＺ遺伝子（形質転換遺伝子）の導入が確認された。残り４株については野生株と同じ約１．６ｋｂｐのサイズの位置にバンドを示した。
【０１４４】
次に、６株分のＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＫｐｎＩで処理して電気泳動にて確認した。ＫｐｎＩの制限酵素サイトは図９の位置にある。ＰＣＲ産物をＫｐｎＩで処理すると２本のバンドが見えるが、形質転換遺伝子が挿入されていた場合には下側のバンドが野生株の時よりも大きい位置に現れる。結果を図１０に示す。
【０１４５】
図１０において、レーン１〜６は、コロニー単離株、レーン７は、ΔｐｙｒＦ株ダイレクト、レーン８は、ATCC39073野生株の抽出ＤＮＡ、レーン９は、形質転換ＤＮＡ挿入用
相補ベクターpK18-pyz-1、レーン１０は、形質転換ＤＮＡ挿入用相補ベクターpK18-pyz-2、レーン１１は、形質転換ＤＮＡ挿入用相補ベクターpK18-pyz-3に各々対応している。
【０１４６】
図１０に示される通り、レーン１、２は野生株と同じバンドが確認され、レーン３、４、５、６では野生株より大きい位置にバンドが見られ、形質転換遺伝子ＬａｃＺの挿入が確認された。
【０１４７】
さらに、ダイレクトＰＣＲではなく、増殖によって得られた菌体からＴｏｔａｌ ＤＮＡを抽出し、同様の条件でＰＣＲを行って形質転換遺伝子ＬａｃＺの挿入を確認した結果、ダイレクトＰＣＲの時と同じ結果が得られた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は破壊されたウラシル要求性株を作出する際に用いられるプライマーセットであって、
前記オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する上流領域を増幅する配列番号１及び配列番号２で示されることを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は破壊されたウラシル要求性株を作出する際に用いられるプライマーセットであって、
前記オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する下流領域を増幅する配列番号３及び配列番号４で示されることを特徴とするプライマーセット。
【請求項３】
モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は破壊されたウラシル要求性株を作出する際に用いられるプライマーセットであって、
前記オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する上流領域を増幅する配列番号１及び配列番号２で示されプライマーセット、及び、該オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する下流領域を増幅する配列番号３及び配列番号４で示されるプライマーセットを備えることを特徴とするプライマーセット。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載のプライマーセットを用いて、モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を欠失又は破壊してウラシル要求性株を作出することを特徴とする相同性組み換え方法。
【請求項１】
モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は破壊されたウラシル要求性株を作出する際に用いられるプライマーセットであって、
前記オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する上流領域を増幅する配列番号１及び配列番号２で示されることを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は破壊されたウラシル要求性株を作出する際に用いられるプライマーセットであって、
前記オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する下流領域を増幅する配列番号３及び配列番号４で示されることを特徴とするプライマーセット。
【請求項３】
モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は破壊されたウラシル要求性株を作出する際に用いられるプライマーセットであって、
前記オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する上流領域を増幅する配列番号１及び配列番号２で示されプライマーセット、及び、該オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子に隣接する下流領域を増幅する配列番号３及び配列番号４で示されるプライマーセットを備えることを特徴とするプライマーセット。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載のプライマーセットを用いて、モーレラ属細菌において、相同性組換えによってオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を欠失又は破壊してウラシル要求性株を作出することを特徴とする相同性組み換え方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１２−２４９５７３（Ｐ２０１２−２４９５７３Ａ）
【公開日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１２４４５９（Ｐ２０１１−１２４４５９）
【出願日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度独立行政法人科学技術振興機構 研究成果最適展開支援事業 産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（３０４０１９３９９）国立大学法人岐阜大学 (289)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度独立行政法人科学技術振興機構 研究成果最適展開支援事業 産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（３０４０１９３９９）国立大学法人岐阜大学 (289)
【Ｆターム（参考）】
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