プラスミドＤＮＡ醗酵プロセス
【課題】
【解決手段】
プラスミドＤＮＡ生成技術の改良は、将来のＤＮＡワクチン及びＤＮＡ治療の経済的実現可能性を保証するために必要である。一般的な方法が、記載されており、これによって醗酵層中でのプラスミドＤＮＡ生産性を劇的に増加することができる。これらのプロセスは、新規の増殖と誘導期の温度シフトと組み合わせて、流加培養醗酵戦略を特徴付ける。
【解決手段】
プラスミドＤＮＡ生成技術の改良は、将来のＤＮＡワクチン及びＤＮＡ治療の経済的実現可能性を保証するために必要である。一般的な方法が、記載されており、これによって醗酵層中でのプラスミドＤＮＡ生産性を劇的に増加することができる。これらのプロセスは、新規の増殖と誘導期の温度シフトと組み合わせて、流加培養醗酵戦略を特徴付ける。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府後援研究又は開発に関する陳述
適用されない。
【０００２】
本出願は、２００４年８月１９日に出願された、米国暫定特許出願第６０／６０３０００号の利益を主張する。
【０００３】
本発明の分野
本発明は、プラスミド、コスミド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣｓ）、バクテリオファージ、ウイルス性ベクタ及びこれらのハイブリッド等の閉環状（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ：ｃｃｃ）組み換え型ＤＮＡ分子の生産に関し、より具体的には、醗酵培養における高レベルでのＤＮＡ分子の生産方法である。
【０００４】
本発明の背景
本発明は、閉環状（ｃｃｃ）組み換え型ＤＮＡ分子の生産に関する。このような分子は、バイオテクノロジ、遺伝子組み換え生物、遺伝子治療、治療上のワクチン接種、農業及びＤＮＡワクチンに有益である。
【０００５】
本発明を念頭に置いて、先行技術の調査を実施した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドは、長い間、研究者及び企業によって用いられた組み換え型ＤＮＡ分子のただ１つの最も重要な源であった。今日、プラスミドＤＮＡは、次世代のバイオテクノロジ生産物（遺伝子医薬品及びＤＮＡワクチン）が、臨床試験及び、医薬市場への道を作るに当たって、ますます重要性が高まっている。プラスミドＤＮＡワクチンは、ウイルス性、細菌性、又は寄生性疾患に対する予防的ワクチン；高力価免疫グロブリン生産物の生産用免疫剤；伝染性疾患用のワクチン；又は癌ワクチン；としての適用を見出すことができる。プラスミドは、また、遺伝子治療又は遺伝子置換用途に利用され、患者に投与した後に所望の遺伝子生産物が、プラスミドから発現する。
【０００６】
今日、ＦＤＡ（アメリカ食品医薬品局）基準は、暫定段階にあるもの以外には規定されていない（ＦＤＡ Ｐｏｉｎｔｓ ｔｏ Ｃｏｎｓｉｄｅｒ ｏｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９６参照）。しかしながら、将来は、プラスミドＤＮＡ純度についての国際基準が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）醗酵から同様に作られる組み換えタンパク生産物に使用される基準と同じか、又は非常に類似するものになりそうであり、このような基準は、確立された方法から達成できる現行の純度を超える。最も明らかなことには、投与量当たり１００ｐｇ未満の主宿遺伝子ＤＮＡの許容された基準は（ＦＤＡ Ｐｏｉｎｔｓ ｔｏ ｃｏｎｓｉｄｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，１９９３参照）、精製プラスミド製剤について現在達成できるレベルより遙かに低い（投与量１ｍｇ当たり１００ｐｇは、１０００万分の１に等価である）。
【０００７】
プラスミド（細菌醗酵によって）、及びこれらの純度（例えば、アルカリ溶菌法（ａｌｋａｌｉｎｅ ｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，ＨＣ，ＤｏＩｙ Ｊ．１９７９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７：１５１３−１５２３）によって）を得る基本的な方法は公知である。最初に、醗酵した細菌性細胞ペーストを、再懸濁して、（水酸化ナトリウム及びドデシル硫酸ナトリウムの組み合わせを使用して）溶解し、その後溶液を、酸性塩（例えば、酢酸カリウム）の添加によって中和し、細菌性ＤＮＡ及び細胞崩壊堆積物の大部分を沈殿させる。大量のスーパーコイル状のプラスミドＤＮＡは、汚染細菌性ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質、又は大腸菌内毒素（リポポリサッカライド、又はＬＰＳ）と共に溶液中に残る。次いで、可溶性画分をろ過によって分離し、種々の精製工程を受けさせる。この工程には、ＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）消化；クロマトグラフィ（イオン交換ゲルろ過、ハイドロキシアパタイト、ゲルろ過、疎水性相互作用、逆相、ＨＰＬＣ、等）；膜分離；有機抽出（ｏｒｇａｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）；選択的沈殿、等が含まれる。
【０００８】
明らかに、開始材料の純度が増し、より良い下流純度を達成することは、工業規模の臨床段階のＤＮＡを生産するために不可欠な目標である。
【０００９】
醗酵媒体の考察
安定した媒体の型は、細胞のエネルギィ所要量及び基本的な組成に基づいている。一般的に、栄養学的な所要量は、最少培地又は半合成培地によって満たされる。
【００１０】
半合成培地は、酵母エキス、カザミノ酸、及びペプトン等の複合体成分を含む。複合体成分の追加は、増殖因子、アミノ酸、プリン類及びピリミジンを供給し、しばしばより高い細胞密度をサポートする。
【００１１】
炭素は、細胞組成の半数を数える。従って、炭素は、最も多量に含まれている。炭素源は、エネルギィ及びバイオマスを提供し、制限栄養素として通常使用される。グルコースは、通常の炭素源である。グルコースは非常に効果的に代謝され、従って、細胞収率がより高い。しかしながら、高グルコース濃度は、（クラブトリー効果（Ｃｒａｂｔｒｅｅ ｅｆｆｅｃｔ）として知られる）代謝過剰に起因して、望ましくない産生を引き起こす。グリセロールも用いられ、しばしば回文培養の好適な炭素源となる。グリセロールからの細胞収率は、グルコース由来のものよりも僅かに小さいが、グリセロールは、高レベルの酢酸産物を作らず、阻害されることなく、より高濃度で使用することができる。グリセロールも、最大比増殖濃度を減少させる。
【００１２】
窒素の所要量には、無機又は有機窒素源によって応ずることができる。アンモニア及びアンモニア塩（例えば、ＮＨ４Ｃｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４）は、最少培地で使用される。半合成培地は、イースト抽出物、ペプトン、及びカザミノ酸を含有する複合体成分から部分的に又は全体的に窒素を供給する。
【００１３】
鉱物は、増殖、代謝、及び酵素反応に必要である。マグネシウム、リン、カリウム、及び硫黄は、個別の媒質成分として一般的に加えられる。リン酸ジカリウム又はリン酸モノカリウムは、カリウム及びリンを提供し、ある比率で緩衝剤としても機能する。硫酸マグネシウム・７水和物は、マグネシウム及び硫黄の源として、しばしば利用される。その他の必須鉱物は、カルシウム、銅、コバルト、鉄、マンガン、モリブデン及び亜鉛を含む。これらは主要成分中に不純物として通常存在するが、これらは、極少量必要とされ、微量鉱物溶液の添加によって、しばしば補給される。浸透圧は、塩化ナトリウムで調節する。
【００１４】
動物由来の生成物、特にプラスミド生産におけるウシ生成物の使用は、プリオン又はウイルス汚染物質の危険性に起因して許容できない。全培地成分は、認定された動物由来生成物を含まないものであるべきである。植物由来の代用物は、動物に起源を有する多くの成分に使用可能である（例えば、植物グリセロール、大豆ペプトン）。
【００１５】
プラスミド醗酵プロセスの考察
増殖速度
減少した増殖速度の使用が、高品質、高収率プラスミド醗酵の統一原理である。高増殖速度は、酢酸生成物、プラスミド不安定性、及びスーパーコイル状のプラスミドのより低い割合と関連している。減少した増殖速度は、細胞分裂と同期したプラスミド複製のための時間を提供することによって、増殖速度依存プラスミド不安定性を緩和する。
【００１６】
増殖状態
醗酵は、プラスミドの質及び収率に影響する多くのパラメータを制御及び監視する可能性を与える。スーパーコイル形成は、酸素及び温度によって影響されることが知られている（Ｄｏｒｍａｎ ＣＪ ｅｔ ａｌ．１９８８ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：２８１６−２８２６）、（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ Ｅ，Ｄｒｌｉｃａ Ｋ．１９８４ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８１：４０４６−４０５０）。酸素は、プラスミド安定性において重要な役割を演じることが示されている。ある研究（Ｈｏｐｋｉｎｓ ＤＪ，Ｂｅｔｅｎｂａｕｇｈ ＭＪ，Ｄｈｕｒｊａｔｉ Ｐ．１９８７ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２９：８５−９１）では、５％の空気飽和率に対する溶存酸素濃度中の１滴が、プラスミド安定化の急速な減少を導くことを発見した。別の研究（Ｎａｍｄｅｖ ＰＫ，Ｉｒｗｉｎ Ｎ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＢＧ，Ｇｒａｙ ＭＲ．１９９３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．４１：６６６−６７０）では、酸素導入の変動が、プラスミドの不安定化をまねくことを示した。更に、ニックプラスミド及び多重体の形成は、温度、ｐＨ、溶存酸素、栄養素濃度、及び増殖速度を含む多くのパラメータによって影響を受け得る（Ｄｕｒｌａｎｄ ＲＨ，Ｅａｓｔｍａｎ ＥＭ．１９９８ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒ Ｒｅｖ．３０：３３−４８）。大腸菌増殖の最適温度は、３７℃である。しかしながら、回分醗酵では、より低い温度（３０から４８℃）を用いて、最大比増殖速度を低くすることができる。また、より高い温度を用いて、ｐＵＣ、及びｐＭＭ１（Ｗｏｎｇ ＥＭ，Ｍｕｅｓｉｎｇ ＭＡ，Ｐｏｌｉｓｋｙ，Ｂ．１９８２ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．７９：３５７０−３５７４）、（Ｌｉｎ−Ｃｈａｏ Ｓ，Ｃｈｅｎ ＷＴ，Ｗｏｎｇ ＴＴ．１９９２ ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．６：３３８５−３３９３）及びランアウェイレプリコンＲプラスミド等の複製起源を伴う選択的なプラスミド増幅を誘発することもできる。Ｈａｍａｎｎ ｅｔ．ａｌ．２０００（Ｈａｍａｎｎ ＣＷ，Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｊ，Ｉｎｇｅｒｓｌｅｖ Ｅ．２０００ Ｗｏｒｌｄ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ００２８０４８）は、プラスミド生産を（低温度によって）低レベルに維持して、プラスミドＤＮＡ合成による増殖の遅延を避けるＲプラスミドの生産方法を報告している。ここでは、宿主細胞集団が高くなると、温度変化によってプラスミド生産が誘発される。
【００１７】
回分醗酵
回分醗酵は、簡単であるという主な利点を有する。培養期間を通して細胞増殖及びプラスミド生産に用いられる全栄養素が、植菌時に存在する。回分醗酵は、誘導期、指数増殖期、及び静止期を有する。好適な植菌材料（１から５％の培養液量）は、誘導期の長さを低減させる。指数増殖期間には、全栄養素が過剰であり；従って、この比増殖速度は、本質的にモノ−キネティックスによって予測される最大比増殖速度、μｍａｘになる。上述したように、増殖速度が減少することは、プラスミド生産にとって望ましい。回分醗酵において、増殖速度は、μｍａｘを減少させることによってのみ低減する。これは、より低い温度での増殖によって、及びグルコースの代わりにグリセロール上で増殖することによって達成される。グリセロールを用いた３０℃での回分醗酵は、一般的にμｍａｘ＜０．３ｈ−１となり、このことは、有害な酢酸蓄積及びプラスミド不安定に関する増殖速度を妨ぐのに十分である（Ｔｈａｔｃｈｅｒ ＤＲ，Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ Ａ，Ｈａｎａｋ ＪＡＪ，Ｖａｒｌｅｙ ＤＬ．２００３ Ｕ．Ｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ６５０３７３８）。また、阻害されることのなくグルコースよりずっと高い濃度でグリセロールを、使用することができ、より高いバイオマス収率にすることができる。一般的に、６０ｇ／Ｌ ＤＣＷ以上のバイオマス収率を、回分醗酵で得ることができる。
【００１８】
流加培養醗酵
流加培養醗酵は、プラスミド生産に特に有益である。制限栄養素を制御して加えることは、率＜μｍａｘでの増殖速度の制御を可能にする。また、流加培養醗酵は、収率をより高くする結果となる。流加培養醗酵の鍵は、完全に消費されるような比率で基質を供給することである。結果として、残留基質濃度は、ほぼ０であり、基質の最大転換が得られる。過剰の基質からの代謝過剰を回避し、阻害酢酸の形成を低減する。
【００１９】
流加培養醗酵は、回分期で開始する。全ての非制限栄養素を含有する開始量の培地及び開始濃度の制限基質内に細胞を植菌する。細胞がこの開始量の基質を消費したら、制限栄養素を制御して与え始める。
【００２０】
最も簡単で、最も効果的な供給戦略の一つは、指数関数的供給である。この方法によれば、フィードバック制御を必要とすることなくμｍａｘ未満の所定の比率で培地が増殖することを可能である。醗酵は、非阻害濃度の基質を含有する回分モードで開始する。細胞は、この基質がなくなるまでμｍａｘで増殖し、この時点で、栄養素供給が始まる。
【００２１】
ＤＯ−ｓｔａｔ法及びｐＨ−ｓｔａｔ法を実施するのは実に簡単である。というのも、最も標準的な醗酵装置システムは、溶存酸素とｐＨの監視を含むからである。溶存酸素（ＤＯ）及びｐＨの傾向は、基質が細胞に利用できるかどうかを示す。基質の消耗は、酸素摂取量を低減させ、培地中のＤＯ濃度を上げる。また、ｐＨは、代謝性の酸の消費によって上昇する。ＤＯ又はｐＨが設定閾値以上に上昇すると、供給が誘発される。増殖速度は、ＤＯ又はｐＨ閾値を変更することによって調節することができる。
【００２２】
例示的プラスミド醗酵プロセス
現行の収率の試験により、一般的なラボの振盪フラスコ培養は１から５ｍｇのプラスミドＤＮＡ／Ｌの培地を作るが、コンピュータ制御の醗酵装置は、一般的に、１０から２５０ｍｇ／ＬのプラスミドＤＮＡ／Ｌの培地を作ることが明らかである。
【００２３】
Ｌａｈｉｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．（Ｌａｈｉｊａｎｉ Ｒ，Ｈｕｌｌｅｙ Ｇ，Ｓｏｒｉａｎｏ Ｇ，Ｈｏｒｎ ＮＡ，Ｍａｒｑｕｅｔ Ｍ．１９９６ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１９７１−１９８０）は、指数関数的供給と、３７℃から４２−４５℃の温度シフトで醗酵における温度感受性単一ポイント突然変異（ｐＵＣ起源）を伴うｐＢＲ３２２−誘導プラスミドを用いることを報告している。このことは、１０Ｌの醗酵装置中２２０ｍｇ／Ｌのプラスミド収率を達成した。３０℃での回分醗酵（ｐＢＲ３２２誘導起源）中の突然変異のない同じプラスミドは、３ｍｇ／Ｌプラスミドを得たのみである。Ｆｒｉｅｈｓ ｅｔ ａｌ．（Ｆｒｉｅｈｓ Ｋ，Ｆｌａｓｃｈｅｌ Ｅ，Ｓｃｈｌｅｅｆ Ｍ，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｔ．２００３ ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ ６６６４０７８）は、ＤＯ−ｓｔａｔフィードバック制御供給で、グリセロールイースト抽出培地を用いる流加培養プロセスを記載している。醗酵は、７．５Ｌの開始回分体積で開始した。攪拌を増して３０％以上のＤＯを保った。ＤＯが閾値設定点の４５％に達した時に供給培地を投入した。培養は、４１時間後に静止期に達し、６０ｇ／Ｌ ＤＣＷ及び２３０ｍｇ／Ｌのプラスミドを得た。Ｃｈｅｎ（Ｃｈｅｎ，Ｗ．１９９９ Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ ５９５５３２３）は、ＤＯ−ｓｔａｔとｐＨ−ｓｔａｔフィードバック制御を組み合わせた半合成培地の流加培養プロセスを用いた。ＤＯとｐＨ閾値設定点は、それぞれ５０％と７．２であった。ＤＯが３０％以下に落ちると、高い代謝活性から攪拌速度が以前の速度の割合まで増加した。７Ｌの培養装置中で、この戦略は、０．１３ｈ−１の比増殖速度、及び８２から９８ｍｇ／Ｌのプラスミド収率を導いた。Ｄｕｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｅａｓｔｍａｎ，Ｓｕｐｒａ，１９９８は、専売培地中で３７℃での回分醗酵を報告している。彼らのプロセスによれば、一般的には１３０ｍｇ／Ｌの収率が得られ、２５０ｍｇ／Ｌの高い収率が得られた。
【００２４】
先行技術を考慮しても、高純度プラスミドＤＮＡ生産についての費用対効果の大きい方法の必要性がある。上記の醗酵培地及びプロセスは、現在技術的に知られているものを組み込んでおり、増殖速度の減少及び高温でのプラスミド複製数誘発等のプラスミド生産性を改善している。これらのプロセスは、約２００から２５０ｍｇのプラスミドＤＮＡ／Ｌで横ばいになる。この低い収率は、プラスミドＤＮＡ生産プロセスを商品化する上でのコスト及び純度に負担を与える。スケールメリットは将来著しくＤＮＡのコストを下げるが、所望のコストを達成するためには、この問題に対する更なる経済的解決策が必要である。その上、プラスミドＤＮＡ純度の国際基準は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）醗酵から同様に生産される組み換えタンパク質生産物について使用される基準と同じ又は非常に似ている。この基準は、確立された方法から得られる現在の純度を超えている。醗酵における収率（細胞ペーストのＤＮＡ／グラムのｍｇ）の増加は、コストを減少させ、ＤＮＡの純度を上げるであろう（処理される材料の量を低減するからである）。
【００２５】
本発明の開示
本発明は、プラスミド生産用の改善された回分及び流加培養プロセスを用いるＤＮＡレプリコンの生産方法である。特に、流加培養醗酵方法が開示されており、ここでは、プラスミド含有大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が、流加培養期中に低い温度で増殖し、この増殖中は増殖速度が制限され、次いで、プラスミドを蓄積するために温度をアップシフト（ｕｐ−ｓｈｉｆｔ）し、段階的に温度を高くして継続的に増殖させることによって、温度シフトと制限された増殖速度が、プラスミドの収率及び純度を改善する。好ましい実施例では、低減した増殖速度をほぼ２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ以下のプラスミド収率を維持するように決定する。別の好ましい実施例では、この低減した温度はおよそ３０℃である。別の好ましい実施例では、温度のアップシフトは、ほぼ３６から４５℃までである。別の好ましい実施例では、プラスミドはＣｏｌＥ１誘導複製起源を含む。更にもう１つの好ましい実施例では、プラスミドはｐＵＣＧからｐＵＣＡまでの突然変異を含むｐＭＢ１複製起源を含む。更に別の実施例では、プラスミドは、ＶＲ１０１２バックボーンから誘導される。一の極めて好ましい実施例では、醗酵媒体が、実質的に半合成グリセロール媒体である。更に最後の好ましい実施例では、ｐＢＲ３２２−誘導プラスミドは、増殖速度が流加培養期間で制限され、増殖がプラスミド生産物を継続して蓄積する間に、流加培養醗酵の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増殖する。要約すれば、これらのプロセスは、新規の増殖と誘発期の温度シフトとを組み合わせた、高い細胞密度培養戦略を特徴とする。ＤＮＡレプリコンを含有するｐＢＲ３２２−誘導起源の生産において、流加培養醗酵は、制限された細胞増殖速度で実施される。温度誘導ＤＮＡレプリコン（例えば、プラスミド含有ｐＵＣ又はｐＭＭ１起源）の生産において、流加培養醗酵は、増殖期中の制限された細胞増殖速度と低減された温度で実施され；次いで、プラスミド生産は、温度をアップシフトすることによって誘発される。これらのプロセスは、プラスミドＤＮＡ醗酵収率を劇的に改善し、その一方で、従来技術のプロセスと比較して、プラスミドの完全性を維持又は改善する。
【００２６】
本発明の簡単な概要
本発明の目的及び／又は対象は、プラスミドＤＮＡの生産のための醗酵プロセスを提供することである。本発明のもう一つの対象及び／又は目的は、醗酵培養のプラスミドＤＮＡ生産収率を改善することである。本発明の更に別の対象及び／又は目的は、醗酵培養のプラスミドＤＮＡの品質を改善することである。本発明の更に別の対象及び／又は目的は、精製プラスミドＤＮＡ中の不純物を低減することである。別の開示は、従来技術に記載されたプロセスと比較して改善された改善醗酵プロセスであり、バイオマス生産後のプラスミドレベルの誘導によってプラスミドの増加した収量；バイオマス生産中の低プラスミドレベルの維持による毒性又は不安定プラスミドと共に増加した収量及び完全性；プラスミドのニック（開環）又は直鎖バージョンの低減したレベルによってプラスミドの質を向上すること；プラスミドのパーセントモノマ（ｐｅｒｃｅｎｔ ｍｏｎｏｍｅｒ）の増加によってプラスミドの質を向上すること；ロバスト、自動制御パラメータ及び供給を用いる簡略化した生産；増殖中に必要な増殖制御及び低減した酸素補給によって簡略化したスケーリング；ダウンストリームプロセシング内へのフィードストリームのプラスミドの濃縮レベルによるプラスミド精製後の不純物の低減したレベル；及び全ての動物性生成物誘導成分の除去によって、改善した標準コンプライアンス；によって改善される。
【００２７】
本発明の更なる目的及び利点は、図面及び次の記載の考察から明らかになる。
【００２８】
本発明の詳細な説明
図面を参照すると、図１は、ＮＴＣ３０１９培地を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｐＢＲ３２２−誘導プラスミド流加培養醗酵を示し、これは（ａ）ＮＴＣ３０１９培地を用いた流加培養中の、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｐＢＲ３２２−誘導プラスミドの一般的な増殖及びプラスミド生産性プロファイルと；（ｂ）高スーパーコイル状であり、ギザギザで開環したアイソフォームを含まないＮＴＣ３０１９培地流加培養醗酵プロセスによって生産されたプラスミドＤＮＡと；を明らかにしている。
【００２９】
図２では、ＮＴＣ３０１８培地を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｐＵＣプラスミド（ｐＷ２．０）回分醗酵のプラスミド増殖及びプラスミド生産性プロファイルが示されている。回分醗酵中のｐＷ２．０プラスミドは、５７ＯＤ６００の細胞密度に達し、２３０ｍｇプラスミド／Ｌの収率であった。
【００３０】
図３では、ＮＴＣ３０１９培地を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｇＷｉｚ ＧＦＰプラスミド流加培養醗酵を示している：（ａ）ｇＷｉｚ ＧＦＰの流加培養醗酵プロファイルの増殖及び制御パラメータプロファイル（溶存酸素、温度、攪拌）と；（ｂ）ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉで染色された細胞の蛍光顕微鏡観察が、プラトウ（左）でフィラメンテーションを示すが、温度を３３℃で低下させた後は、再開された増殖及びフィラメンテーションが低下した（右）。
【００３１】
図４では、ＮＴＣ３０１９培地（３７℃又は４２℃誘導）を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｇＷｉｚ ＧＦＰ誘導プラスミド流加培養醗酵を示している：（ａ）３５時間で、３０→３７℃の温度シフトを用いて、ｇＷｉｚ ＧＦＰ／大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α醗酵の増殖及びプラスミド生産性プロファイルが明らかにされ、プラスミド収量が６７０ｍｇ／Ｌに達した；（ｂ）３５時間で、３０→４２℃の温度シフトを用いて、ｇＷｉｚ ＧＦＰ／大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α醗酵の増殖及びプラスミド生産性プロファイルが明示されている。プラスミド収量は１１００ｍｇ／Ｌに達した。
【００３２】
図５では、誘導流加培養醗酵プロセスを図示する。
【００３３】
定義
【００３４】
ｃｃｃ：閉環状
【００３５】
ＣｏｌＥ１誘導起源：欠失（例えば、ｐＢＲ３２２誘導起源）及び／又は塩基交換（例えば、ｐＭＢ１、ｐＭＭ１、ＣｏｌＥ１等由来のｐＭＭ５由来のｐＵＣ）によるＣｏｌＥ１型プラスミド（例えば、ｐＭＢ１、ＣｏｌＥ１）から誘導された複製された起源
【００３６】
ＤＮＡレプリコン：プラスミド、コスミド、細菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）バクテリオファージ、ウイルス性ベクタ、及びこれらのハイブリッド
【００３７】
ＮＴＣ３０１８醗酵培地：グリセロール半合成回分醗酵培地
【００３８】
ＮＴＣ３０１９醗酵培地：グリセロール半合成流加培養培地
【００３９】
ｐＤＮＡ：プラスミドＤＮＡ
【００４０】
ｐＢＲ３２２−誘導起源：ｒｏｐ（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ：プライマの抑制体）遺伝子が欠失した、ｐＢＲ３２２由来のｐＭＢ１起源
【００４１】
プラスミド：プラスミド、コスミド、細菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）、バクテリオファージ、ウイルス性ベクタ、及びこれらのハイブリッド
【００４２】
ｐＵＣ起源：段階的な温度でコピー数を増加するＧからＡへの転位を有する、ｐＢＲ３２２−誘導起源
【００４３】
半合成グリセロール培地：複合窒素源（例えば、イースト抽出物、大豆抽出物）及びグリセロール炭素源を含む醗酵培地
【００４４】
本発明は、機械的醗酵容器を用いたプラスミド、コスミド、細菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）、バクテリオファージ、ウイルス性ベクタ及びこれらのハイブリッド（本明細書では、集合的にプラスミドと称される）等の閉環状（ｃｃｃ）組み換えＤＮＡ分子の製造方法に関する。
【００４５】
従来技術の醗酵プロセスは、次善のプラスミド収率、品質（例えば、プラスミドの切断又は線形化）、拡張性の無さ（例えば、過剰な酸素供給要求）、及び限られた応用範囲（例えば、不安定又は毒性シークエンスを含有するプラスミドで使用する能力がない）のために最適ではない。本発明は、醗酵培養中にプラスミドＤＮＡの収率及び純度を改善する方法である。誘発性流加培養醗酵プロセスを用いる高収率醗酵に対する費用効率のアプローチを発展させて、プラスミド収率及び純度を改善する。
【００４６】
プラスミド製造プロセス及び培地の好ましい実施例
ｐＢＲ３２２−誘導プラスミドを生産する１つの好ましい実施例では、流加培養醗酵を制限された細胞増殖速度で実施する。このプロセスは、プラスミドＤＮＡ醗酵収率を劇的に改善するにも関わらず、従来技術に記載されているプロセスと比較して、プラスミドの完全性を維持又は改善する。
【００４７】
適度の複製プラスミド（例えば、ここではｐＢＲ誘導プラスミドと呼ばれるｒｏｐ遺伝子が欠損したｐＢＲ３２２複製起源）を使用したこのプロセスを用いて、０．１２ｈｒ−１の比増殖速度を維持するように制御して供給をしながら、３７℃で自動流加培養醗酵プロセスを行って、２５０から４５０ｍｇ／Ｌのプラスミド収率及び１２０ＯＤ６００の細胞密度を達成した。これは、報告されている収率（Ｌａｈｉｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｒａ，１９９６）の１００倍の改良である。この新規で劇的な改良の分子的な根拠は、知られていない。この機構に関わらず、その他のプラスミドの生産への本発明を適用することで、プラスミドの質を下げることなく醗酵生産性は上がるであろう。
【００４８】
温度誘発性ＤＮＡレプリコン（例えば、プラスミド含有ｐＵＣ又はｐＭＭ１起源）の生産についての１つの好ましい実施例では、増殖期中に、制限された細胞増殖速度及び低減した温度で、流加培養醗酵を実施し；次いで、アップシフトした温度でプラスミド生産を誘発する。このプロセスは、従来技術に記載されているプロセスと比較すると、プラスミドの完全性を維持又は改善しつつ、プラスミドＤＮＡ醗酵収率を劇的に改善する。
【００４９】
本明細書で開示されているプラスミド（例えば、ｐＵＣ起源）を含む高コピー起源の高収率プラスミド生産についてのこの新規な戦略は、予想外に高いプラスミド生産性とプラスミドの品質をもたらす。加えて、流加培養期中に増殖速度が減少する。このプロセスは、図５に示されている。この要素の新規な組み合わせは、ＣｏｌＥ１誘導起源プラスミドの生産には適用されず、試験してみると、新しく予想外の改善された生産性となった。従って、我々は、低減した増殖速度と、１）増殖及びバイオマス生産のための低減した温度、及び２）プラスミド生産の誘発のための上昇させた温度と、の組み合わせに対する新しい使用（改善された生産性）を教示する。
【００５０】
初期の低減した温度増殖期と後の高温度生産期との組み合わせが、全体的な増殖、バイオマス、及びプラスミド収率の改善をもたらすという発見は、新規で予想外であり、従来技術には教示されていない。Ｈａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｒａ，２０００は、増殖中のＲプラスミドに関連する代謝負担を特に低減するために温度誘発醗酵を用いた。この戦略は、Ｒプラスミドの生産に利用されたが、プラスミド含有ＣｏｌＥ１起源については教示していない。同様に、Ｈａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｒａ，２０００は、この戦略を用いて、全体の生産性を改善することを意図していない。従って、この要素の組み合わせは、従来技術では、収率の改善のために提言されたものではない。改善された生産性によって明らかであるように、この組み合わせの相乗効果は、部分同士の総和より大きい。同様に、この高収量醗酵は、これまで要求されてきたが解決されなかった必要性を満たすものである。何故ならここ１０年以上もの間、この分野で記載された様々なプロセスは、高収率醗酵を教示していないからである。要約すれば、我々は、プラスミド生産を含むＣｏｌＥ１起源についての、新しい組み合わせを教示する。このことは、改善されたプラスミド生産性の、予想外で驚くべき新しい使用を示す温度誘発と組み合わせたゆっくりとした増殖を具える。
【００５１】
高コピープラスミド生産用誘発性流加培養醗酵プロセスの適用は、１１００ｍｇ／ＬプラスミドＤＮＡの収率、及び１００のＯＤ６００をもたらす。これは、従来技術に規定されている醗酵プロセスで得られる収率の５倍の改良である。これらの全プロセスから精製されたＤＮＡは、高品質であり、事実上１００％スーパーコイル状である。我々は、プラスミド生産性を改善するために本明細書に記載された回分及び流加培養醗酵プロセスの使用を意図する。
【００５２】
本明細書に記載された誘発性流加培養プロセスは、このプロセスのバイオマス生産期の間、低プラスミドレベル（ＶＲ１０１２誘導ベクタに対して＜２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）を維持し、バイオマス生産後は予想外で前例のない超高プラスミド生産（ＶＲ１０１２誘導ベクタに対して＞６ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）を容易にした。細菌１グラム当たりのプラスミド収率が増加することは、最終生産物のより高い純度に直接つながるので、高比産出量は非常に望ましい。我々は、本発明の温度シフトを用いて、増殖の間中、プラスミドレベルを低く保ち（ＶＲ１０１２誘導ベクタに対して＜２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）、バイオマス生産後のプラスミド生産を高いレベル（ＶＲ１０１２誘導ベクタ＞３ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）に誘発する。これらのレベルは、ＶＲ１０１２誘導ベクタの生産に対するガイドラインである。その他のプラスミドは、増殖期中に２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００よりも高い又は低いレベルで許容される。許容できる代謝負担、プラスミド安定性、及び温度シフト後の高い生産性を維持する増殖期中の最大プラスミドレベルは、平均的な当業者によって、各新しいプラスミドについて実験的に決定することができる。
【００５３】
醗酵培地の代替の実施例
本発明を実施する上で、例示的な動物由来成分を含まない醗酵培地配合、ＮＴＣ３０１８（回分）、ＮＴＣ３０１９（流加培養）を用いることができる。これらの培地は、グリセロール炭素源、イースト抽出窒素源、及び微量金属、塩及び緩衝液を含む半合成増殖培地である。従来技術に記載された培地を、この培地で代用することも本明細書に記載されているような醗酵プロセスを用いた改善されたプラスミド生産性をもたらす。
【００５４】
ＮＴＣ３０１８及びＮＴＣ３０１９培地用の代替の非動物源の窒素源が考えられる。複合培地成分として、イースト抽出物は、窒素、アミノ酸、ビタミン、及び炭素を提供する。プラスミド生産中の細胞代謝の鍵となる複合培地（例えば、イースト又は大豆抽出物）のあり得る成分は、制限アミノ酸、ビタミン、微量無機物及び代替の炭素源を含む。一例として、我々は、代替イースト抽出調製物、大豆調製物（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製のソイトン、又はファイトンペプトンを選択する）又はＮＴＣ３０１８及びＮＴＣ３０１９培地中のその他の植物調製物（例えば、Ｏｘｏｉｄ社製のエンドウの花のペプトン）の使用を意図している。
【００５５】
培地の規定された要素の変型も意図している。例えば、リン酸塩又はマグネシウムの増加は、回分培地成分の増加として、或いは流加培養醗酵における供給に対する追加として意図している。醗酵の分野における当業者は、系統だった成分測定による培地の更なる最適化を行うことができる。
【００５６】
ある栄養要求性細胞株を利用する場合、培地への添加物を意図している。例えば、ｐｒｏＡＢ欠失を含むＳｔｂｌ２（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）等の細胞株は、最大増殖を達成するためには、アミノ酸補給、又はプロリンが豊富な代替窒素源を必要とする。このような修飾は、醗酵の分野における平均的な当業者によって決定することができる。
【００５７】
また、我々は、従来技術に記載されているプラスミド醗酵培地を用いた本明細書に記載されている回分及び流加培養醗酵プロセスの使用を意図している。これは、Ｓｏｕｂｒｉｅｒ（Ｓｏｕｂｒｉｅｒ Ｆ．２００４ ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２００４／０１４２４５２）によって開示されているような規定された培地を含む。本発明の流加培養醗酵プロセスで使用する好ましい培地は、ＮＴＣ３０１９や、Ｌａｈｉｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｒａ，１９９６、Ｆｒｉｅｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｒａ，２００３、Ｃｈｅｎ Ｓｕｐｒａ，１９９９．及びＵｒｔｈａｌｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｕｒｔｈａｌｅｒ Ｊ，Ｒｏｍａｎ Ｎ，Ａｓｃｈｅｒ Ｃ，Ｗｏｅｈｒｅｒ Ｈ．２００５ ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２００５／００２６１７７）に開示されている培地等の半合成供給によるグリセロール培地配合である。
【００５８】
醗酵プロセスの代替的実施例
改善されたプラスミド生産のための流加培養及び回分プロセスが、本明細書に開示されている。これらは、新規な増殖及び誘発期温度シフトと組み合わせて、指数関数的供給戦略を特徴付けるものである。
【００５９】
本発明の流加培養プロセスの実施において、我々は、フィードバック、フィードフォワード、及び栄養素供給の所定の制御を含む、増殖速度を低減するための種々の供給戦略を意図している。例えば、炭素制御した指数関数的供給戦略によって、栄養素供給を加えてもよい。我々は、許容できる範囲内で増殖速度を制御するための、この供給戦略の変型を予想している。好ましい増殖速度の範囲は、μ＝０．０５から０．３ｈ−１である。好ましいターゲット増殖速度は、μ＝０．１２ｈｒ−１である。許容される増殖速度の範囲は、プラスミド特異的であり、当業者によって実験的に決定することができる。
【００６０】
本発明の流加培養プロセスの実施において、我々は、生産時間を低減するための種々の回分戦略を意図している。回分期に含まれる半合成栄養素を調節して、回分期をより高い濃度又はバイオマス濃度にすることができる。より高いバイオマス濃度の場合に、流加培養期と比較して回分期で増殖がより早く進むので、全体的な発酵時間が低減される。我々は、プロセスの流加培養の開始を制御するための、この回分戦略の変型を予想している。開始のための流加培養期の好ましいＯＤ６００の範囲は、１から６０である。許容できる流加培養開始ＯＤ６００の範囲はプラスミド特異的であり、当業者によって実験的に決定することができる。
【００６１】
本発明の誘導性流加培養及び回分プロセスの実施において、我々は、増殖期から誘導期への種々の温度シフト戦略を意図している。増殖期は２５から３７℃、好ましくは３０から３７℃の温度で実施することができる。高コピープラスミドについては、増殖期は、最も好ましくは３０から３２℃である。誘導期を３３℃から４５℃、好ましくは３７から４２℃の温度で実施することができる。
【００６２】
温度シフト戦略を伴う誘導性プロセスの実施において、我々は、増殖期から誘導期へ移る時の指標として栄養素濃度、バイオマス濃度、又は光学密度を使用することを意図している。醗酵培養の規則的なサンプリングは、バイオマス又は光学密度測定を得るための材料を提供することができ、温度シフトは、あるバイオマス濃度で実施することができる。また、オンラインセンサを使用して、バイオマス濃度の継続的なモニタリングを行い、醗酵装置を設定して特定のバイオマス濃度で温度シフトを自動的に実施することができる。温度シフト戦略を伴う誘導流加培養プロセスの実施において、我々は、また、ある量の供給栄養素を加えると温度シフトが実行されることを意図している。
【００６３】
温度シフト戦略を伴う誘導性プロセスの実施において、我々は、生産回数を最小限にするために増殖期中により高い温度を用いることを意図している。本明細書に記載されている誘導性流加培養プロセスは、このプロセスの増殖期の間中、低い（＜２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）プラスミドレベルを維持した。温度シフト後に、許容できる代謝負担、プラスミド安定性、及び生産性の向上を維持する増殖期中に利用できる最大温度は、プラスミド特異的であり、様々なプラスミドバックボーン間で異なる。例えば、いくつかのプラスミドは、２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００よりずっと高いレベルに許容できる。同様に、プラスミド生産性は、低い温度で変化し、従って、いくつかのプラスミドは、高いレベルのプラスミドとしては生産されない。これらの場合、我々は、増殖期中に、より高い温度を使用することを意図している。加えて、上昇した最大温度は、無制限の増殖とこれに相当するプラスミドコピー数の低下に起因して、開始回分期中で許容される（図５）。増殖期（回分及び流加培養成分）中に用いることができ、温度シフト後に許容できる代謝負担、プラスミド安定性、及び生産性の向上を維持する最大温度は、この分野の平均的な当業者によって実験的に決定することができる。
【００６４】
プラスミド及び宿主菌株
我々は、高コピー、低コピー及び中程度のコピーのいずれかであり、温度誘導性であるか温度誘導性ではない種々の起源の複製を伴うプラスミドの生産において本発明を使用することを意図している。いくつかの好ましい複製の起源、及びこれらを組み込んだプラスミドが、表１に記されている。これらの起源の変更はこの分野において公知であり、また、使用を意図している。
【００６５】
表１：複製起源
【００６６】
代替宿主菌株が意図されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５αは、プラスミド生産用に広く使用されている宿主である。その鍵となる品質は、クローンＤＮＡの非特異的組み換えを最小限にするｒｅｃＡ突然変異、及びエンドヌクレアーゼＩによってプラスミドの非特異的消化を除去するｅｎｄＡ１突然変異を含む。ＤＨ５αに加えて、その他の様々な菌株が、プラスミド生産に好適である；例示的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主菌株の非限定的リストを表２に示す。
【００６７】
表２：宿主菌株
【００６８】
ＤＨ５α、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＤＨ１０Ｂ、ＪＭ１０９及びＴｏｐ１０は、プラスミド生産菌株として、非常に良く確立されている。Ｍａｃｈ１、及びＥＣＯＳ１０１は、最近開発されたものであり、望ましいプラスミド生産宿主である。Ｓｔｂ１２、ＧＴ１１６及びＳｕｒｅ細胞はプラスミド含有不安定ＤＮＡの生産に利用されている。不安定ＤＮＡは、直接（例えば、レトロウイルスの長い末端反復）又は逆方向反復（例えば、ｓｈＲＮＡパリンドローム）ＺＤＮＡ、その他のような構造を含む。ＧＴ１１６のｄｃｍ遺伝子の削除は、免疫刺激であるダムメチル化（ｄａｍ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）を解消する。このため、ＧＴ１１６の生産は、プラスミドＤＮＡの免疫原性を低減する。類似の免疫原性の低減は、ＣｐＧメチラーゼを発現する菌株を使用して観察される。
【００６９】
不安定プラスミドの生産
【００７０】
我々は、また、不安定なシークエンスを含むプラスミドの生産に本発明を使用することを意図している。パリンドロームシークエンス、定方向又は逆方向反復塩基配列、及びシークエンスを形成するＺＤＮＡが不安定であり、大腸菌（Ｅ，ｃｏｌｉ）宿主によって除去、又は再編成される。いくつかの場合には、治療に使用するプラスミドは、不安定なシークエンス（ＡＡＶ及びＨＩＶ等のウイルス性ベクタについての逆方向又は定方向反復塩基配列、ある治療用遺伝子についてセグメント又は三塩基反復を形成するＺＤＮＡ）を含んでいなければならない。不安定シークエンスを含むプラスミドを維持するための現在行われている戦略は、安定化突然変異を用いた宿主細胞株を使用することである。いくつかの宿主は、これらのプラスミド、例えば、Ｓｕｒｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＧＴ１１５（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）又はＳｔｂ１２及びＳｔｂ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の増殖用に商業的に入手できる。Ｓｔｂ１２及びＳｔｂ１４細胞株は、レトロウイルスベクタ等のベクタを含む定方向反復塩基配列の安定性を増進する未公表の突然変異を用い；この効果は、恐らくは減少したコピー数に起因して低下した温度で強化される。修復突然変異の特異的組み合わせは、プラスミド増殖を、特に低温で安定化することができる。Ｓｕｒｅ及びＳｕｒｅ２細胞株は、ＵＶ修復（ｕｖｒＣ）及びＳＯＳ修復（ｕｍｕＣ）欠損（ＬＴＲｓを安定化するため）と関連した相同性組み換え欠損（ｒｅｃＢ、ｒｅｃＪ）、及びＺＤＮＡを安定化するためのＳｂｃＣ（及びｒｅｃＪ）を有するこのような組み合わせを用いる。ＧＴ１１６細胞株は、パリンドロームシークエンスを安定化するためにＳｂｃＣ及びＳｂｃＤを用いる。これらの菌株は、恐らくはプラスミドコピー数の低下に起因して、低温（即ち、３０℃）でのみプラスミドを安定化するように機能する。この戦略は明らかに生産コストを上げる。本明細書に記載されている誘導性醗酵プロセスの使用は、集菌前の短期間にのみコピー数が増加する前に、安定化細胞株中の３０℃の不安定プラスミドを増殖することができる。これは、不安定プラスミドの収量及び安定性（即ち、質）を最大にするであろう。
【００７１】
ＤＮＡ及びプラスミド生産
誘導性流加培養プロセスにおけるプラスミドＤＮＡ（＞６ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）の実際の増加した収量についての根底にある機構は知られていない。遅い増殖及び低下した温度でのバイオマス生産中に、ＤＮＡ凝縮剤（例えば、ｄｐｓ遺伝子生産物等のヒストン状タンパク質、又はその他のクロマチン結合タンパク質）に潜在的に起因する。
【００７２】
誘導期中にＤＮＡ凝縮を変化させることで、許容プラスミドレベル又はコピー数を増加することによって、プラスミド収量を増やすことができる。ＤＮＡの凝縮度合は、２つの対立因子；クロマチンタンパク質の凝縮と、転写複合体の脱凝縮と、によって設定される。プラスミド凝縮は、プラスミドプロモータからの転写レベルによって影響を受けることがある。転写が少ないほど、より高い凝縮となり、潜在的により高い運搬能力となる。
【００７３】
Ｅ．ｃｏｌｉ中で、ＤＮＡ凝縮に含まれる多数のクロマチンタンパク質を同定した。これらの遺伝子生産物は、プラスミドとゲノムＤＮＡを結合させる。ゲノムＤＮＡの場合には、核様体内にＤＮＡを凝縮する（（Ｒｏｂｉｎｏｗ Ｃ，Ｋｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｅ．１９９４ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ５８：２１１−２３２）参照）。核様体の主要成分は、ヒストン状タンパク質ＨＵ、ＩＨＦ、及びＨＮ−Ｓ、ＳｔｐＡ（ＨＮ−Ｓに関連して、約１／１０レベルで発現される）及びＤｐｓであり、これらは核様体内に均一に分配され、一方で、ＳｅｑＡ、ＣｂｐＡ、ＣｂｐＢ、Ｆｉｓ及びＩｃｉＡ等のその他のタンパク質はより少ない量であり、核様体内に不均一に分配され、調整機能を有する。遊離Ｒプラスミドタンパク質複合体は、３つの主要なタンパク質、２３％のＨＮ−Ｓ、２３％のＲＮＡポリメラーゼ、及び５％のＨＵを含む。これは、クロマチン関連遺伝子生産物が異なる培地、異なる細胞密度で、増殖期及び静止期中に様々に調整されるので、増殖期に依存して、恐らく変化するであろう。Ｆｉｓ、ＨＵ、ＨＦ−１は、一般的に、対数期により高度に発現し、一方で、ＩＨＦ及びＤｐｓは、静止期により高いレベルにある。Ｄｐｓは、静止期に液状生物結晶性複合体にＤＮＡを凝縮して、ストレス耐性を改善する。増殖期中のＨＮ−Ｓの過剰発現は、ＤＮＡ凝縮と生存度の減少を引き起こす。細胞は、ＤＮＡが高度に凝縮される場合、より高度なプラスミド能力を有する。ＮＴＣ誘導性醗酵プロセスにおいて、増殖期細胞は、誘導期細胞よりもプラスミドＤＮＡに対する全体的な能力が低い。これは、許容プラスミドを増殖期よりも高いレベルにする、誘導期に存在するクロマチンタンパク質の組み合わせの相違に起因する。誘導期中のクロマチンタンパク質の比率の変化が、プラスミド凝縮、及び運搬能力を上げる。
【００７４】
また、誘導期中のクロマチンタンパク質の比率の変化は、プラスミド複製率を上げる。例えば、ｐ１５Ａ起源ＲＮＡＩＩプロモータからの発現であって、ｐＭＢ１（ｐＢＲ３２２）ＲＮＡＩＩプロモータからではない発現は、ＩＨＦによって表される；ｐ１５Ａ ＲＮＡＩＩ転写は、ＩＨＦ突然変異中で増加する。Ｄｐｓ及びＨＵは、非特異的ＤＮＡ結合剤、ＨＮ−Ｓ、ＣｂｐＡ及びＣｂｐＢであり、湾曲したＤＮＡと結合する。ＳｔｐＡは、ＨＮ−Ｓに関連し、より高い親和性でＤＮＡと結合し、また、湾曲ＤＮＡと結合する。Ｆｉｓ、ＩＨＦ、ＩｃｉＡ及びｓｅｑＡは、シークエンス特異的である。ＨＮ−Ｓは、湾曲ＤＮＡを含む多数のプロモータからの転写を抑制する。ｐＭＢ１（ｐＵＣ及びｐＢＲ３２２）のＲＮＡＩＩプロモータは、ポリＡ及びポリＴトラックを含み、これらのシークエンスは、湾曲ＤＮＡを形成する。静止期の転写（例えば、ＨＮ−Ｓ）を抑制する減少したレベルの湾曲ＤＮＡ結合性クロマチンタンパク質は、ＲＮＡＩＩのＲＮＡＩへの転写の増加した比率に関連し、文書化静止期は、プラスミドコピー数を増やす。ＮＴＣ醗酵プロセスの誘導期中に存在するクロマチンタンパク質の組成の変化（例えば、ＨＮ−Ｓの更なる減少）は、ｐＵＣ等のｐＭＢ１を有するプラスミドコピー数の増加をもたらす。
【００７５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現する場合、異種ＤＮＡ凝縮体、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の酸可溶性胞子タンパク質は、プラスミド収量を上げるための有益なＤＮＡ凝縮体でもある。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）酸可溶性小タンパク質の発現は、ＤＮＡに起因する（Ｓｅｔｌｏｗ Ｂ，Ｈａｎｄ ＡＲ，ａｎｄ Ｓｅｔｌｏｗ Ｐ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：１６４２−１６５３）。
【００７６】
また、プロセス変化は、ＤＮＡ凝縮の効果を通じて収量を改善する。Ｄｐｓは、マグネシウム（Ｍｇ＋＋）濃度；Ｄｐｓの存在は、ＤＮＡ凝縮をもたらさない；密集した結晶性ＤＮＡ：Ｍｇ＋＋濃度が閾値以下に下がると、Ｄｐｓ複合体を形成する［（Ｆｒｅｎｋｉｅｌ−Ｋｒｉｓｐｉｎ Ｄ，Ｌｅｖｉｎ−Ｚａｉｄｍａｎ Ｓ，Ｓｈｉｍｏｎｉ Ｅ，Ｗｏｌｆ ＳＧ，Ｗａｃｈｔｅｌ ＥＪ，Ａｒａｄ Ｔ，Ｆｉｎｋｅｌ ＳＥ，Ｋｏｌｔｅｒ Ｒ，Ｍｉｎｓｋｙ Ａ．２００１ ＥＭＢＯ Ｊ．２０：１１８４−１１９１）参照］；によって調整される。形態学的に、この複合体は、静止期中にクロラムフェニコールを添加することによって誘導されるのに似ている。増殖する培地への０．２ｍＭのスペルミジンの添加は、Ｄｐｓの不存在下でＤＮＡ凝縮を加速する。リン酸塩欠乏は、恐らくスペルミジンに対するスレオニン及びアルギニンの分解の促進を介して同様の効果を有する。２価カチオンのレベルを変更（例えば、Ｍｇ＋＋、外因性添加又は減少による）するための、又は正電荷ポリアミン（例えば、スペルミジン、細菌合成の外因性添加又は制御による）の変化を変更するための誘導期中の醗酵組成又は状態への変化によって、プラスミド収量を増やすことができ、この変更は、培地の交換を意図する。
【００７７】
我々は、更なる収量の増加が、プラスミドＤＮＡの更なる凝縮によって得られることを意図している。これは、醗酵プロセス中に、スペルミン生産又はｄｐｓタンパク質生産等の宿主菌株ＤＮＡ凝縮剤の生産を増やす、供給（例えば、ポリエチレンイミン、スペルミジン、スペルミン）又は菌株組み換えへのＤＮＡ凝縮剤の添加によって達成される。このような菌株組み換えは、関連する遺伝子生産物が、醗酵プロセス中に減少することを可能にする変更になり得る。
【００７８】
誘導性プロセスの実施において、我々は、代替戦略を用いて、増殖期中に低レベルでプラスミドコピー数を維持することを意図している。例えば、低温での増殖に加えて、増殖期中に組み込むことができるコピー数を減らすためのその他の機構が存在する。例えば、醗酵中の溶存酸素の減少は、プラスミドコピー数を減少させるために示される （Ｃａｒｎｅｓ ＡＥ，２００５ ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ３：９，ｉｎ ｐｒｅｓｓ）。
【００７９】
最終産物純度の改善
我々は、例示的なプラスミド精製プロセス中に記載された醗酵培地からのプラスミド濃縮供給ストリームを用いることを意図している。このようなプロセスは、技術的によく知られている。高収量醗酵と例示的な精製プロセスの組み合わせは、費用対効果のある方法論を提供し、ゲノミックＤＮＡを更に遺伝子治療及びＤＮＡワクチン接種適用に許容されるレベルにまで減らす。
【００８０】
例
本発明の方法を、以下の例において更に説明する。これらは、例示によって提供され、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８１】
例１：ＮＴＣ３０１８及びＮＴＣ３０１９醗酵培地
次の基準はプラスミドＤＮＡを製造するための最適化醗酵プロセスの評価として確立された：
１） プラスミドの高い比収量（ｇ細胞質量当たりのｍｇプラスミドＤＮＡ）；
２） 高バイオマス収量；
３） 高度のスーパーコイル状のプラスミドを保つであろう；
４） ダウンストリームプロセシング中に生じる問題が最小になる；
５） 調整要求条件を満足する；
６） プラスミド構造を保持する（例えば、遺伝子欠失がない、又はその他の再配列）；
【００８２】
高い比プラスミド収量、高バイオマス収量、及び高プラスミド品質をサポートするように、培養培地を調整した。回分醗酵培地は、比増殖速度を減らすように構成した。低減した増殖速度の使用は、より高いプラスミドコピー数とより良いプラスミド安定性と関連していた。流加培養醗酵中に、制限栄養素の供給によって、増殖速度を０．１２ｈｒ−１に制御した。加えて、培地に使用した全組成は、良く特徴付けられており、認定された動物由来成分が含まれていなかった。
【００８３】
ＮＴＣ３０１８（回分）及びＮＴＣ３０１９（流加培養）培地は、回分及び流加培養プロセス培地の双方の多くの成分用に最適化されている。例えば、グリセロールを、炭素源として使用して、増殖速度を低減している。イースト抽出物は、窒素源として使用される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）生産菌株の所定の条件に基づいて、微量金属及びＭｇＳＯ４濃度を最適化した。
【００８４】
例２：ｐＢＲ３２２−誘導プラスミドを用いたＮＴＣ３０１９培地流加培養
３７℃での、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ＢｉｏＦｌｏ １１０ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ中で流加培養醗酵を実施した。３０％の水酸化アンモニウム又は１０％のリン酸を自動的に添加することによって、ｐＨを制御した。窒素ガス散布によって０％に、及び空気飽和で１００％に溶存酸素プローブを調節した。容器を１ＶＶＭで通気し、溶存酸素を攪拌の比例積分制御によって３０％に維持した。また、約２０ＯＤ６００以上の細胞密度で、３０％の飽和を維持するためにＯ２補給を必要とした。
【００８５】
ＬＢプラス５０μｇ／ｍｌカナマイシン内に植菌した単一の遊離コロニーから種培養を開始し、３７℃で培養した。中間指数関数期（０．５から１．５ＯＤ６００）で、種培養を用いて、醗酵装置に対して１％の接種材料を提供した。
【００８６】
流加培養中に、炭素の制限指数関数的供給戦略に応じて、半合成供給栄養素を添加した。要約すれば、回分期中にμｍａｘの比増殖速度で炭素基質の初期量が消費される。炭素基質が消耗すると、流加培養期が始まり、供給栄養素が、次の式によって決定される割合で、自動的に加えられる（Ｃａｒｎｅｓ，Ｓｕｐｒａ，２００５）：
【００８７】
【００８８】
ここで、
μ＝流加培養期中の所望の比増殖速度、
ＸＢ＝回分期の終わりのバイオマス濃度、ｇＤＣＷ／Ｌ、
ＶＢ＝培地の初期液体体積、Ｌ、
Ｓｆ＝栄養素供給培地の制限基質濃度、ｇ／Ｌ、
ＹＸ／Ｓ＝基質からのバイオマスの収量係数、ｇ／ｇ
ｔ＝流加培養期の開始からの時間、
である。
【００８９】
一般的に、いくつかの独立したカナマイシン耐性ｐＢＲ３２２−誘導プラスミドを用いたＮＴＣ３０１９培地の流加培養醗酵は、１００から１２０ＯＤ６００の細胞密度、又は１リットル当たり５５から６５ｇ乾燥細胞重量に達する（図１）。プラスミドは、平均２６０ｍｇ／Ｌであり、４３０ｍｇ／Ｌ程度に高かった。比較すると、ｐＢＲ３２２−誘導プラスミドを用いた公開されている醗酵収量は、約３から４ｍｇ／Ｌである（Ｌａｈｉｊａｎｉ ｅｔ ａｉ，Ｓｕｐｒａ，１９９６）。
【００９０】
重要なことには、比プラスミド収量が非常に高く、一般的に２．５から３．８ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００の間であり、かなり高いコピーｐＵＣ起源プラスミドを用いるその他の醗酵培地／プロセスで観察されたレベルを十分越えている（表３）。比収量ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００に関する発現プラスミド収量は、全細胞質量と比較したプラスミドの量を示す。細菌１グラム当たりの増加したプラスミドの収量が、より高い最終産物純度を直接導くので、高い比収量は非常に望ましい。
【００９１】
表３：公開高収量醗酵プロセスと比プラスミド収量の比較
【００９２】
これは、ＮＴＣ３０１９醗酵培地が、従来技術に記載された培地及びプロセスと比較して、中程度のコピー数のプラスミド（例えば、ｒｏｐ欠失を有するｐＢＲ３２２）の醗酵収量を、劇的に促進することを明示している。この効果は、プラスミド特異的ではない。
【００９３】
これらのプロセスで精製したＤＮＡは高品質であり、欠失又はその他の再配列を検出することなく、実質的に１００％スーパーコイル状である。同様に、このプロセスで、細胞を使用して１グラムスケールでＤＮＡ精製を実施した。これは、ＮＴＣ３０１９流加培養培地で実施された醗酵が、大きいスケールのダウンストリームプロセシングに敏感に反応することを明示している。
【００９４】
例３：高コピー遺伝子治療プラスミドを用いたＮＴＣ３０１８培養回分醗酵
ｐＵＣ起源プラスミドを用いたＮＴＣ３０１８培地回分培養を実施した。以下のプラスミド含有ｐＵＣ起源を使用した：
１）ｐＷ２．０、変質ポリリンカーシークエンスを有するｐＵＣ１９の誘導体
２）ｐＭａｘＧＦＰ
３）ｐＥＧＦＰ−Ｃ１
【００９５】
３７℃の、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ＢｉｏＦｌｏ １１０ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ中で回分醗酵を実施した。３０％水酸化アンモニウム又は１０％リン酸の自動添加によって、ｐＨを制御した。窒素ガス散布によって０％に、及び空気飽和で１００％に溶存酸素プローブを調節した。容器を１ＶＶＭで通気し、溶存酸素を攪拌の比例積分制御によって３０％に維持した。また、約２０ＯＤ６００以上の細胞密度で、Ｏ２補給を３０％の飽和を維持するためには、Ｏ２の補給が必要であった。
【００９６】
ＬＢプラス５０μｇ／ｍｌカナマイシン中に植菌した単一遊離コロニーから種培養を開始し、３７℃で培養した。中間指数関数期（０．５から１．５ＯＤ６００）で、種培養を用いて、醗酵装置に対して１％の接種材料を提供した。
【００９７】
全ての醗酵を３７℃で実施した。ｐＷ２．０について、プラスミドコピー数を醗酵の遅い４２℃での増殖によって誘発した。ｐＵＣプラスミドを用いた回分醗酵は、１６から５７ＯＤ６００の細胞密度に達したのみであった。しかしながら、比プラスミド収量の結果は有望である。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１についての最終収量は、細胞密度が５６ＯＤ６００であり、収量が１６３ｍｇプラスミド／Ｌ（２．９ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）であり、ｐＭａｘＧＦＰについては、細胞密度が１６ＯＤ６００であり、収量が８４ｍｇプラスミド／Ｌ（５．３ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）であり、ｐＷ２．０については、細胞密度が５７ＯＤ６００であり、収量が２３０ｍｇプラスミド／Ｌ（４．０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００；図２）であった。
【００９８】
これらのプロセスから精製したＤＮＡは高品質であり、欠失又はその他の再配列を検出することなく、実質的に１００％スーパーコイル状である。同様に、このプロセスで細胞を使用して実質０．５グラムスケールでＤＮＡ精製を実施した。これは、ＮＴＣ３０１８回分培地で実施された醗酵が、大きいスケールのダウンストリームプロセシングに敏感に反応することを明示している。
【００９９】
例４：高コピー遺伝子治療プラスミドを用いたＮＴＣ３０１９培地の流加培養醗酵
Ｖｉｃａｌ ＶＲ１０１２ベクタの誘導体を含有するＧＦＰ遺伝子であるプラスミドｇＷｉｚ ＧＦＰ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、流加培養醗酵評価用に選択した。これは、５７５７ｂｐの大きさの広く用いられているＤＮＡワクチンプラスミド含有カナマイシン耐性（ｋａｎＲ）ｐＵＣ起源である。このプラスミドｇＷｉｚ ＧＦＰ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αに変質させた。また、ｐＭａｘＧＦＰを、流加培養培地内で試験し；両方のプラスミドについて、同様の結果を得た。
【０１００】
これらのプラスミドの生産にＮＴＣ３０１９培地を使用したときに、２つの問題に直面した。増殖がｐＢＲ３２２−誘導プラスミドを用いてうまく行われているときに、３７℃でのｇＷｉｚ ＧＦＰプラスミド培地の増殖時に第１の問題が発見された。ｐＵＣプラスミド培地では、細胞増殖は１５ＯＤ６００のあたりで止まった。蛍光顕微鏡は、細胞分裂の阻害を意味する広範なフィラメンテーションを示した。フィラメントが実質的に溶解するので、このことは致命的である（Ａｒｅｎｄｓ ＳＪＲ， Ｗｅｉｓｓ，ＤＳ．２００４ Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８６：８８０−８８４）。例えば、図３（Ａ）は、プラスミドｇＷｉｚ ＧＦＰを用いた流加培養醗酵を示す。細胞増殖は遅くなり、１５ＯＤ６００の早い段階で静止期に入るように見えた。プラスミド収量分析は、細胞増殖が停止し始めたときに、２．７ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００の上昇比プラスミド収量を示した。ｐＵＣプラスミドは、３０℃の場合と比較すると、４２℃でのコピー数の３０から４０倍の増加を示す温度感受性点突然変異を含む（Ｌｉｎ−Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ，１９９２）。次いで、プラスミドコピー数を減らし、細胞の代謝負荷を軽減しようとして、温度を３３℃に下げた。温度の低下後に、プラスミドは１．６ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００に下がり、細胞増殖が再開した。興味深いことに、比プラスミド収量は再び徐々に増加し、供給栄養素が加えられていたにも関わらず、増殖は、予想通りに＞１００ＯＤ６００に増殖することなく、約６０ＯＤ６００で静止期に入った。
【０１０１】
図３（Ｂ）は、３７℃で発生する細胞フィラメンテーションを示す。温度を３３℃に下げた後に、増殖細胞のサンプルは、より少ないフィラメンテーションを示した。
【０１０２】
考えられる説明は、３７℃で増殖が開始した時に、細胞母集団は、フィラメンテーション及び生存率の低下から完全に回復しないことであった。このことを試験するために、同じプラスミドで、引き続いて２つの流加培養醗酵を、３３℃で完全に実施した。両醗酵において、細胞密度＜６０ＯＤ６００で培養がピークに達した。
【０１０３】
これらの醗酵からのバイオマス及びプラスミドＤＮＡ収量データは、比増殖速度の低下と、細胞増殖阻害前の比プラスミド収量の急激な上昇を示す。このような高いレベルへのプラスミド含有量の急激な増加は予想されておらず、増殖速度の低下を招く細胞母集団上の代謝負担を認識する。しかしながら、増殖速度の低下は、しばしばプラスミドコピー数の増加を導くことも示されている（Ｓａｔｙａｇａｌ ＶＮ，Ａｇｒａｗａｌ Ｐ．１９８９ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３３：１１３５−１１４４）、（Ｓｅｏ ＪＨ，Ｂａｉｌｅｙ ＪＥ．１９８５ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２７：１６６８−１６７４）。予期しない増加比プラスミド収量が、増殖速度の低下を引き起こしているのか、又は予期しない低下した比プラスミド収量が、増殖速度の増加を引き起こすのか、或いは、それぞれが、複合してどちらかを引き起こすかは、明らかではない。
【０１０４】
例５：ＮＴＣ３０１９培地を用いた高コピープラスミドの高収量生産のための誘導流加培養プロセス
【０１０５】
３３℃及び３７℃での醗酵の結果（例５）に基づいて、ｐＵＣ起源プラスミドを用いた流加培養モードで観察される予期しないプラスミド増加を克服するように戦略を構成した。ＤＨ５α中のプラスミドｇＷｉｚ ＧＦＰを、誘導流加培養プロセスで用いた。ＮＴＣ３０１９流加培養醗酵は、３０℃で６０ＯＤ６００まで培養することを除いて、例５で説明されるように実施した。この時に、温度を３７℃にシフトした。驚くべき結果が、図４Ａに示されている。６０ＯＤ６００まで３０℃で増殖することで、増殖阻止問題がなくなり、この培養は、全プラスミド収量が６７０ｍｇ／Ｌの１００ＯＤ６００を最終的に上回った。このプロセスのサンプルから精製されたＤＮＡは高品質であり、欠失又はその他の再配列を検出することなく、実質的に１００％スーパーコイル状である。
【０１０６】
２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以下に維持して、増殖期を通じて低く維持される温度シフトの前に、プラスミドが産生する。このことは、３３℃又は３７℃の醗酵の結果と対照的である。注目すべきことに、温度シフト後の比プラスミド収量は、６．５ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００と非常に高くなり、その他の醗酵培地／プロセスを用いて観察されたレベルを十分に越えている（表３）。増殖期を通して３０℃での醗酵させ、４２℃へシフトすることは、ｇＷｉｚ ＧＦＰを伴う１．１ｇｍ／Ｌ（１１ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）の生産量をもたらす結果となった（図４Ｂ）。生産性安定期は、細胞の大多数が生き残るので、大量の細胞死に関連していない。
【０１０７】
また、流加培養期間を低減する（回分期をより高いＯＤ６００にすることによる）ためのＮＴＣ３０１９培地（グリセロール、イースト抽出物、及び回分培地のマグネシウムの４倍の増加）の修飾も、４２℃での誘導後に同様の高プラスミド収量を産生し、プラスミド誘導のロスなしで、より高いＯＤ６００で流加培養期を開始できることを明示している。
【０１０８】
様々な抗生物質抵抗性遺伝子及び原核生物要素の配向性を含む、種々のｐＵＣ起源バックボーンを有する多数の異なるプラスミドが、ＤＨ５α中での３０℃から４２℃の誘導性プロセスを用いて、ＮＴＣ３０１９培地中の０．５ｇｍ／Ｌよりも大きい収量で生産された。これらの結果は、この誘導性プロセスが、特定のプラスミドに特異的でないことを明示している。
【０１０９】
また、ｇＷｉｚ−ＧＦＰプラスミドが、ＤＨ１細胞株中で、３０℃から４２℃での誘導性プロセスを用いて、ＮＴＣ３０１９培地の０．５ｇｍ／Ｌよりも大きい収量で生産された。この結果は誘導性プロセスが、特定の大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ）に特異的でないことを明示している。
【０１１０】
同様に、このプロセスからの細胞を用いて、１グラムスケールでのＤＮＡ精製を実施した。このことは、ＮＴＣ３０１９流加培養培地で実施された誘導性醗酵が、大きいスケールのダウンストリームプロセシングに敏感に反応することを明示している。
【０１１１】
比収量（ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）の用語でのプラスミド収量の表現は、全細胞質量に対するプラスミドの量を示す。本明細書に記載された誘導性流加培養プロセスは、このプロセスの増殖期を通してプラスミドレベルを低く（＜２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）維持し、バイオマス生産後の、前代未聞の非常に高いプラスミド生産（６から１１ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）を容易なものにした。細菌の１グラム当たりのプラスミド収量の増加は、直接的に最終産物純度を高くするので、高い比収量は非常に望ましい。
【０１１２】
これらの結果は、プラスミドＤＮＡ生産性と品質を改善する、本発明の流加培養及び回分醗酵プロセスの一般的な使用を明示する。
【０１１３】
このように、本発明の生産プロセスが、改善されたプラスミド生産方法を提供するものであることを、読者は理解するであろう。
【０１１４】
上記記述が多くの特異性を含んでいる一方で、これらは、本発明の限定として解釈するべきではなく、むしろ本発明の好ましい一の実施例の例示として解釈するべきである。その他の多くの変形が可能である。例えば、誘導性流加培養プロセスを、回分プロセスと一体化して、栄養素がなくなるまでＮＴＣ３０１８培養培地中で醗酵を行うことができる。ここでは、ＮＴＣ３０１９由来の流加培養培地及び誘導は同時に開始される。いくつかのプラスミドを用いて、この実施例においては、プラスミドコピー数をより高い増殖速度で低下するため、増殖期を３７℃以上で実施することができる。増殖期中に細胞分裂を可能にし、硫化培養期中にプラスミド誘導性を保持する最適な温度は、当業者が決定できる。従って、本発明の範囲は、説明した実施例によってではなく、添付の特許請求の範囲及びこれらの法律的均等物によって決定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、ＮＴＣ３０１９培地を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のｐＢＲ３２２−誘導プラスミド流加培養醗酵を示す。
【図２】図２は、ＮＴＣ３０１８培地を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のｐＵＣプラスミド回分醗酵を示す。
【図３】図３は、ＮＴＣ３０１９培地を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のｇＷｉｚ ＧＦＰプラスミド流加培養醗酵を示す。
【図４】図４は、ＮＴＣ３０１９培地を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のｇＷｉｚ ＧＦＰ誘導流加培養醗酵を示す。
【図５】図５は、誘導性流加培養醗酵プロセスを示す。
【技術分野】
【０００１】
連邦政府後援研究又は開発に関する陳述
適用されない。
【０００２】
本出願は、２００４年８月１９日に出願された、米国暫定特許出願第６０／６０３０００号の利益を主張する。
【０００３】
本発明の分野
本発明は、プラスミド、コスミド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣｓ）、バクテリオファージ、ウイルス性ベクタ及びこれらのハイブリッド等の閉環状（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ：ｃｃｃ）組み換え型ＤＮＡ分子の生産に関し、より具体的には、醗酵培養における高レベルでのＤＮＡ分子の生産方法である。
【０００４】
本発明の背景
本発明は、閉環状（ｃｃｃ）組み換え型ＤＮＡ分子の生産に関する。このような分子は、バイオテクノロジ、遺伝子組み換え生物、遺伝子治療、治療上のワクチン接種、農業及びＤＮＡワクチンに有益である。
【０００５】
本発明を念頭に置いて、先行技術の調査を実施した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドは、長い間、研究者及び企業によって用いられた組み換え型ＤＮＡ分子のただ１つの最も重要な源であった。今日、プラスミドＤＮＡは、次世代のバイオテクノロジ生産物（遺伝子医薬品及びＤＮＡワクチン）が、臨床試験及び、医薬市場への道を作るに当たって、ますます重要性が高まっている。プラスミドＤＮＡワクチンは、ウイルス性、細菌性、又は寄生性疾患に対する予防的ワクチン；高力価免疫グロブリン生産物の生産用免疫剤；伝染性疾患用のワクチン；又は癌ワクチン；としての適用を見出すことができる。プラスミドは、また、遺伝子治療又は遺伝子置換用途に利用され、患者に投与した後に所望の遺伝子生産物が、プラスミドから発現する。
【０００６】
今日、ＦＤＡ（アメリカ食品医薬品局）基準は、暫定段階にあるもの以外には規定されていない（ＦＤＡ Ｐｏｉｎｔｓ ｔｏ Ｃｏｎｓｉｄｅｒ ｏｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９６参照）。しかしながら、将来は、プラスミドＤＮＡ純度についての国際基準が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）醗酵から同様に作られる組み換えタンパク生産物に使用される基準と同じか、又は非常に類似するものになりそうであり、このような基準は、確立された方法から達成できる現行の純度を超える。最も明らかなことには、投与量当たり１００ｐｇ未満の主宿遺伝子ＤＮＡの許容された基準は（ＦＤＡ Ｐｏｉｎｔｓ ｔｏ ｃｏｎｓｉｄｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，１９９３参照）、精製プラスミド製剤について現在達成できるレベルより遙かに低い（投与量１ｍｇ当たり１００ｐｇは、１０００万分の１に等価である）。
【０００７】
プラスミド（細菌醗酵によって）、及びこれらの純度（例えば、アルカリ溶菌法（ａｌｋａｌｉｎｅ ｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，ＨＣ，ＤｏＩｙ Ｊ．１９７９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７：１５１３−１５２３）によって）を得る基本的な方法は公知である。最初に、醗酵した細菌性細胞ペーストを、再懸濁して、（水酸化ナトリウム及びドデシル硫酸ナトリウムの組み合わせを使用して）溶解し、その後溶液を、酸性塩（例えば、酢酸カリウム）の添加によって中和し、細菌性ＤＮＡ及び細胞崩壊堆積物の大部分を沈殿させる。大量のスーパーコイル状のプラスミドＤＮＡは、汚染細菌性ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質、又は大腸菌内毒素（リポポリサッカライド、又はＬＰＳ）と共に溶液中に残る。次いで、可溶性画分をろ過によって分離し、種々の精製工程を受けさせる。この工程には、ＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）消化；クロマトグラフィ（イオン交換ゲルろ過、ハイドロキシアパタイト、ゲルろ過、疎水性相互作用、逆相、ＨＰＬＣ、等）；膜分離；有機抽出（ｏｒｇａｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）；選択的沈殿、等が含まれる。
【０００８】
明らかに、開始材料の純度が増し、より良い下流純度を達成することは、工業規模の臨床段階のＤＮＡを生産するために不可欠な目標である。
【０００９】
醗酵媒体の考察
安定した媒体の型は、細胞のエネルギィ所要量及び基本的な組成に基づいている。一般的に、栄養学的な所要量は、最少培地又は半合成培地によって満たされる。
【００１０】
半合成培地は、酵母エキス、カザミノ酸、及びペプトン等の複合体成分を含む。複合体成分の追加は、増殖因子、アミノ酸、プリン類及びピリミジンを供給し、しばしばより高い細胞密度をサポートする。
【００１１】
炭素は、細胞組成の半数を数える。従って、炭素は、最も多量に含まれている。炭素源は、エネルギィ及びバイオマスを提供し、制限栄養素として通常使用される。グルコースは、通常の炭素源である。グルコースは非常に効果的に代謝され、従って、細胞収率がより高い。しかしながら、高グルコース濃度は、（クラブトリー効果（Ｃｒａｂｔｒｅｅ ｅｆｆｅｃｔ）として知られる）代謝過剰に起因して、望ましくない産生を引き起こす。グリセロールも用いられ、しばしば回文培養の好適な炭素源となる。グリセロールからの細胞収率は、グルコース由来のものよりも僅かに小さいが、グリセロールは、高レベルの酢酸産物を作らず、阻害されることなく、より高濃度で使用することができる。グリセロールも、最大比増殖濃度を減少させる。
【００１２】
窒素の所要量には、無機又は有機窒素源によって応ずることができる。アンモニア及びアンモニア塩（例えば、ＮＨ４Ｃｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４）は、最少培地で使用される。半合成培地は、イースト抽出物、ペプトン、及びカザミノ酸を含有する複合体成分から部分的に又は全体的に窒素を供給する。
【００１３】
鉱物は、増殖、代謝、及び酵素反応に必要である。マグネシウム、リン、カリウム、及び硫黄は、個別の媒質成分として一般的に加えられる。リン酸ジカリウム又はリン酸モノカリウムは、カリウム及びリンを提供し、ある比率で緩衝剤としても機能する。硫酸マグネシウム・７水和物は、マグネシウム及び硫黄の源として、しばしば利用される。その他の必須鉱物は、カルシウム、銅、コバルト、鉄、マンガン、モリブデン及び亜鉛を含む。これらは主要成分中に不純物として通常存在するが、これらは、極少量必要とされ、微量鉱物溶液の添加によって、しばしば補給される。浸透圧は、塩化ナトリウムで調節する。
【００１４】
動物由来の生成物、特にプラスミド生産におけるウシ生成物の使用は、プリオン又はウイルス汚染物質の危険性に起因して許容できない。全培地成分は、認定された動物由来生成物を含まないものであるべきである。植物由来の代用物は、動物に起源を有する多くの成分に使用可能である（例えば、植物グリセロール、大豆ペプトン）。
【００１５】
プラスミド醗酵プロセスの考察
増殖速度
減少した増殖速度の使用が、高品質、高収率プラスミド醗酵の統一原理である。高増殖速度は、酢酸生成物、プラスミド不安定性、及びスーパーコイル状のプラスミドのより低い割合と関連している。減少した増殖速度は、細胞分裂と同期したプラスミド複製のための時間を提供することによって、増殖速度依存プラスミド不安定性を緩和する。
【００１６】
増殖状態
醗酵は、プラスミドの質及び収率に影響する多くのパラメータを制御及び監視する可能性を与える。スーパーコイル形成は、酸素及び温度によって影響されることが知られている（Ｄｏｒｍａｎ ＣＪ ｅｔ ａｌ．１９８８ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：２８１６−２８２６）、（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ Ｅ，Ｄｒｌｉｃａ Ｋ．１９８４ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８１：４０４６−４０５０）。酸素は、プラスミド安定性において重要な役割を演じることが示されている。ある研究（Ｈｏｐｋｉｎｓ ＤＪ，Ｂｅｔｅｎｂａｕｇｈ ＭＪ，Ｄｈｕｒｊａｔｉ Ｐ．１９８７ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２９：８５−９１）では、５％の空気飽和率に対する溶存酸素濃度中の１滴が、プラスミド安定化の急速な減少を導くことを発見した。別の研究（Ｎａｍｄｅｖ ＰＫ，Ｉｒｗｉｎ Ｎ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＢＧ，Ｇｒａｙ ＭＲ．１９９３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．４１：６６６−６７０）では、酸素導入の変動が、プラスミドの不安定化をまねくことを示した。更に、ニックプラスミド及び多重体の形成は、温度、ｐＨ、溶存酸素、栄養素濃度、及び増殖速度を含む多くのパラメータによって影響を受け得る（Ｄｕｒｌａｎｄ ＲＨ，Ｅａｓｔｍａｎ ＥＭ．１９９８ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒ Ｒｅｖ．３０：３３−４８）。大腸菌増殖の最適温度は、３７℃である。しかしながら、回分醗酵では、より低い温度（３０から４８℃）を用いて、最大比増殖速度を低くすることができる。また、より高い温度を用いて、ｐＵＣ、及びｐＭＭ１（Ｗｏｎｇ ＥＭ，Ｍｕｅｓｉｎｇ ＭＡ，Ｐｏｌｉｓｋｙ，Ｂ．１９８２ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．７９：３５７０−３５７４）、（Ｌｉｎ−Ｃｈａｏ Ｓ，Ｃｈｅｎ ＷＴ，Ｗｏｎｇ ＴＴ．１９９２ ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．６：３３８５−３３９３）及びランアウェイレプリコンＲプラスミド等の複製起源を伴う選択的なプラスミド増幅を誘発することもできる。Ｈａｍａｎｎ ｅｔ．ａｌ．２０００（Ｈａｍａｎｎ ＣＷ，Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｊ，Ｉｎｇｅｒｓｌｅｖ Ｅ．２０００ Ｗｏｒｌｄ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ００２８０４８）は、プラスミド生産を（低温度によって）低レベルに維持して、プラスミドＤＮＡ合成による増殖の遅延を避けるＲプラスミドの生産方法を報告している。ここでは、宿主細胞集団が高くなると、温度変化によってプラスミド生産が誘発される。
【００１７】
回分醗酵
回分醗酵は、簡単であるという主な利点を有する。培養期間を通して細胞増殖及びプラスミド生産に用いられる全栄養素が、植菌時に存在する。回分醗酵は、誘導期、指数増殖期、及び静止期を有する。好適な植菌材料（１から５％の培養液量）は、誘導期の長さを低減させる。指数増殖期間には、全栄養素が過剰であり；従って、この比増殖速度は、本質的にモノ−キネティックスによって予測される最大比増殖速度、μｍａｘになる。上述したように、増殖速度が減少することは、プラスミド生産にとって望ましい。回分醗酵において、増殖速度は、μｍａｘを減少させることによってのみ低減する。これは、より低い温度での増殖によって、及びグルコースの代わりにグリセロール上で増殖することによって達成される。グリセロールを用いた３０℃での回分醗酵は、一般的にμｍａｘ＜０．３ｈ−１となり、このことは、有害な酢酸蓄積及びプラスミド不安定に関する増殖速度を妨ぐのに十分である（Ｔｈａｔｃｈｅｒ ＤＲ，Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ Ａ，Ｈａｎａｋ ＪＡＪ，Ｖａｒｌｅｙ ＤＬ．２００３ Ｕ．Ｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ６５０３７３８）。また、阻害されることのなくグルコースよりずっと高い濃度でグリセロールを、使用することができ、より高いバイオマス収率にすることができる。一般的に、６０ｇ／Ｌ ＤＣＷ以上のバイオマス収率を、回分醗酵で得ることができる。
【００１８】
流加培養醗酵
流加培養醗酵は、プラスミド生産に特に有益である。制限栄養素を制御して加えることは、率＜μｍａｘでの増殖速度の制御を可能にする。また、流加培養醗酵は、収率をより高くする結果となる。流加培養醗酵の鍵は、完全に消費されるような比率で基質を供給することである。結果として、残留基質濃度は、ほぼ０であり、基質の最大転換が得られる。過剰の基質からの代謝過剰を回避し、阻害酢酸の形成を低減する。
【００１９】
流加培養醗酵は、回分期で開始する。全ての非制限栄養素を含有する開始量の培地及び開始濃度の制限基質内に細胞を植菌する。細胞がこの開始量の基質を消費したら、制限栄養素を制御して与え始める。
【００２０】
最も簡単で、最も効果的な供給戦略の一つは、指数関数的供給である。この方法によれば、フィードバック制御を必要とすることなくμｍａｘ未満の所定の比率で培地が増殖することを可能である。醗酵は、非阻害濃度の基質を含有する回分モードで開始する。細胞は、この基質がなくなるまでμｍａｘで増殖し、この時点で、栄養素供給が始まる。
【００２１】
ＤＯ−ｓｔａｔ法及びｐＨ−ｓｔａｔ法を実施するのは実に簡単である。というのも、最も標準的な醗酵装置システムは、溶存酸素とｐＨの監視を含むからである。溶存酸素（ＤＯ）及びｐＨの傾向は、基質が細胞に利用できるかどうかを示す。基質の消耗は、酸素摂取量を低減させ、培地中のＤＯ濃度を上げる。また、ｐＨは、代謝性の酸の消費によって上昇する。ＤＯ又はｐＨが設定閾値以上に上昇すると、供給が誘発される。増殖速度は、ＤＯ又はｐＨ閾値を変更することによって調節することができる。
【００２２】
例示的プラスミド醗酵プロセス
現行の収率の試験により、一般的なラボの振盪フラスコ培養は１から５ｍｇのプラスミドＤＮＡ／Ｌの培地を作るが、コンピュータ制御の醗酵装置は、一般的に、１０から２５０ｍｇ／ＬのプラスミドＤＮＡ／Ｌの培地を作ることが明らかである。
【００２３】
Ｌａｈｉｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．（Ｌａｈｉｊａｎｉ Ｒ，Ｈｕｌｌｅｙ Ｇ，Ｓｏｒｉａｎｏ Ｇ，Ｈｏｒｎ ＮＡ，Ｍａｒｑｕｅｔ Ｍ．１９９６ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１９７１−１９８０）は、指数関数的供給と、３７℃から４２−４５℃の温度シフトで醗酵における温度感受性単一ポイント突然変異（ｐＵＣ起源）を伴うｐＢＲ３２２−誘導プラスミドを用いることを報告している。このことは、１０Ｌの醗酵装置中２２０ｍｇ／Ｌのプラスミド収率を達成した。３０℃での回分醗酵（ｐＢＲ３２２誘導起源）中の突然変異のない同じプラスミドは、３ｍｇ／Ｌプラスミドを得たのみである。Ｆｒｉｅｈｓ ｅｔ ａｌ．（Ｆｒｉｅｈｓ Ｋ，Ｆｌａｓｃｈｅｌ Ｅ，Ｓｃｈｌｅｅｆ Ｍ，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｔ．２００３ ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ ６６６４０７８）は、ＤＯ−ｓｔａｔフィードバック制御供給で、グリセロールイースト抽出培地を用いる流加培養プロセスを記載している。醗酵は、７．５Ｌの開始回分体積で開始した。攪拌を増して３０％以上のＤＯを保った。ＤＯが閾値設定点の４５％に達した時に供給培地を投入した。培養は、４１時間後に静止期に達し、６０ｇ／Ｌ ＤＣＷ及び２３０ｍｇ／Ｌのプラスミドを得た。Ｃｈｅｎ（Ｃｈｅｎ，Ｗ．１９９９ Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ ５９５５３２３）は、ＤＯ−ｓｔａｔとｐＨ−ｓｔａｔフィードバック制御を組み合わせた半合成培地の流加培養プロセスを用いた。ＤＯとｐＨ閾値設定点は、それぞれ５０％と７．２であった。ＤＯが３０％以下に落ちると、高い代謝活性から攪拌速度が以前の速度の割合まで増加した。７Ｌの培養装置中で、この戦略は、０．１３ｈ−１の比増殖速度、及び８２から９８ｍｇ／Ｌのプラスミド収率を導いた。Ｄｕｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｅａｓｔｍａｎ，Ｓｕｐｒａ，１９９８は、専売培地中で３７℃での回分醗酵を報告している。彼らのプロセスによれば、一般的には１３０ｍｇ／Ｌの収率が得られ、２５０ｍｇ／Ｌの高い収率が得られた。
【００２４】
先行技術を考慮しても、高純度プラスミドＤＮＡ生産についての費用対効果の大きい方法の必要性がある。上記の醗酵培地及びプロセスは、現在技術的に知られているものを組み込んでおり、増殖速度の減少及び高温でのプラスミド複製数誘発等のプラスミド生産性を改善している。これらのプロセスは、約２００から２５０ｍｇのプラスミドＤＮＡ／Ｌで横ばいになる。この低い収率は、プラスミドＤＮＡ生産プロセスを商品化する上でのコスト及び純度に負担を与える。スケールメリットは将来著しくＤＮＡのコストを下げるが、所望のコストを達成するためには、この問題に対する更なる経済的解決策が必要である。その上、プラスミドＤＮＡ純度の国際基準は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）醗酵から同様に生産される組み換えタンパク質生産物について使用される基準と同じ又は非常に似ている。この基準は、確立された方法から得られる現在の純度を超えている。醗酵における収率（細胞ペーストのＤＮＡ／グラムのｍｇ）の増加は、コストを減少させ、ＤＮＡの純度を上げるであろう（処理される材料の量を低減するからである）。
【００２５】
本発明の開示
本発明は、プラスミド生産用の改善された回分及び流加培養プロセスを用いるＤＮＡレプリコンの生産方法である。特に、流加培養醗酵方法が開示されており、ここでは、プラスミド含有大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が、流加培養期中に低い温度で増殖し、この増殖中は増殖速度が制限され、次いで、プラスミドを蓄積するために温度をアップシフト（ｕｐ−ｓｈｉｆｔ）し、段階的に温度を高くして継続的に増殖させることによって、温度シフトと制限された増殖速度が、プラスミドの収率及び純度を改善する。好ましい実施例では、低減した増殖速度をほぼ２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ以下のプラスミド収率を維持するように決定する。別の好ましい実施例では、この低減した温度はおよそ３０℃である。別の好ましい実施例では、温度のアップシフトは、ほぼ３６から４５℃までである。別の好ましい実施例では、プラスミドはＣｏｌＥ１誘導複製起源を含む。更にもう１つの好ましい実施例では、プラスミドはｐＵＣＧからｐＵＣＡまでの突然変異を含むｐＭＢ１複製起源を含む。更に別の実施例では、プラスミドは、ＶＲ１０１２バックボーンから誘導される。一の極めて好ましい実施例では、醗酵媒体が、実質的に半合成グリセロール媒体である。更に最後の好ましい実施例では、ｐＢＲ３２２−誘導プラスミドは、増殖速度が流加培養期間で制限され、増殖がプラスミド生産物を継続して蓄積する間に、流加培養醗酵の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増殖する。要約すれば、これらのプロセスは、新規の増殖と誘発期の温度シフトとを組み合わせた、高い細胞密度培養戦略を特徴とする。ＤＮＡレプリコンを含有するｐＢＲ３２２−誘導起源の生産において、流加培養醗酵は、制限された細胞増殖速度で実施される。温度誘導ＤＮＡレプリコン（例えば、プラスミド含有ｐＵＣ又はｐＭＭ１起源）の生産において、流加培養醗酵は、増殖期中の制限された細胞増殖速度と低減された温度で実施され；次いで、プラスミド生産は、温度をアップシフトすることによって誘発される。これらのプロセスは、プラスミドＤＮＡ醗酵収率を劇的に改善し、その一方で、従来技術のプロセスと比較して、プラスミドの完全性を維持又は改善する。
【００２６】
本発明の簡単な概要
本発明の目的及び／又は対象は、プラスミドＤＮＡの生産のための醗酵プロセスを提供することである。本発明のもう一つの対象及び／又は目的は、醗酵培養のプラスミドＤＮＡ生産収率を改善することである。本発明の更に別の対象及び／又は目的は、醗酵培養のプラスミドＤＮＡの品質を改善することである。本発明の更に別の対象及び／又は目的は、精製プラスミドＤＮＡ中の不純物を低減することである。別の開示は、従来技術に記載されたプロセスと比較して改善された改善醗酵プロセスであり、バイオマス生産後のプラスミドレベルの誘導によってプラスミドの増加した収量；バイオマス生産中の低プラスミドレベルの維持による毒性又は不安定プラスミドと共に増加した収量及び完全性；プラスミドのニック（開環）又は直鎖バージョンの低減したレベルによってプラスミドの質を向上すること；プラスミドのパーセントモノマ（ｐｅｒｃｅｎｔ ｍｏｎｏｍｅｒ）の増加によってプラスミドの質を向上すること；ロバスト、自動制御パラメータ及び供給を用いる簡略化した生産；増殖中に必要な増殖制御及び低減した酸素補給によって簡略化したスケーリング；ダウンストリームプロセシング内へのフィードストリームのプラスミドの濃縮レベルによるプラスミド精製後の不純物の低減したレベル；及び全ての動物性生成物誘導成分の除去によって、改善した標準コンプライアンス；によって改善される。
【００２７】
本発明の更なる目的及び利点は、図面及び次の記載の考察から明らかになる。
【００２８】
本発明の詳細な説明
図面を参照すると、図１は、ＮＴＣ３０１９培地を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｐＢＲ３２２−誘導プラスミド流加培養醗酵を示し、これは（ａ）ＮＴＣ３０１９培地を用いた流加培養中の、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｐＢＲ３２２−誘導プラスミドの一般的な増殖及びプラスミド生産性プロファイルと；（ｂ）高スーパーコイル状であり、ギザギザで開環したアイソフォームを含まないＮＴＣ３０１９培地流加培養醗酵プロセスによって生産されたプラスミドＤＮＡと；を明らかにしている。
【００２９】
図２では、ＮＴＣ３０１８培地を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｐＵＣプラスミド（ｐＷ２．０）回分醗酵のプラスミド増殖及びプラスミド生産性プロファイルが示されている。回分醗酵中のｐＷ２．０プラスミドは、５７ＯＤ６００の細胞密度に達し、２３０ｍｇプラスミド／Ｌの収率であった。
【００３０】
図３では、ＮＴＣ３０１９培地を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｇＷｉｚ ＧＦＰプラスミド流加培養醗酵を示している：（ａ）ｇＷｉｚ ＧＦＰの流加培養醗酵プロファイルの増殖及び制御パラメータプロファイル（溶存酸素、温度、攪拌）と；（ｂ）ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉで染色された細胞の蛍光顕微鏡観察が、プラトウ（左）でフィラメンテーションを示すが、温度を３３℃で低下させた後は、再開された増殖及びフィラメンテーションが低下した（右）。
【００３１】
図４では、ＮＴＣ３０１９培地（３７℃又は４２℃誘導）を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｇＷｉｚ ＧＦＰ誘導プラスミド流加培養醗酵を示している：（ａ）３５時間で、３０→３７℃の温度シフトを用いて、ｇＷｉｚ ＧＦＰ／大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α醗酵の増殖及びプラスミド生産性プロファイルが明らかにされ、プラスミド収量が６７０ｍｇ／Ｌに達した；（ｂ）３５時間で、３０→４２℃の温度シフトを用いて、ｇＷｉｚ ＧＦＰ／大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α醗酵の増殖及びプラスミド生産性プロファイルが明示されている。プラスミド収量は１１００ｍｇ／Ｌに達した。
【００３２】
図５では、誘導流加培養醗酵プロセスを図示する。
【００３３】
定義
【００３４】
ｃｃｃ：閉環状
【００３５】
ＣｏｌＥ１誘導起源：欠失（例えば、ｐＢＲ３２２誘導起源）及び／又は塩基交換（例えば、ｐＭＢ１、ｐＭＭ１、ＣｏｌＥ１等由来のｐＭＭ５由来のｐＵＣ）によるＣｏｌＥ１型プラスミド（例えば、ｐＭＢ１、ＣｏｌＥ１）から誘導された複製された起源
【００３６】
ＤＮＡレプリコン：プラスミド、コスミド、細菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）バクテリオファージ、ウイルス性ベクタ、及びこれらのハイブリッド
【００３７】
ＮＴＣ３０１８醗酵培地：グリセロール半合成回分醗酵培地
【００３８】
ＮＴＣ３０１９醗酵培地：グリセロール半合成流加培養培地
【００３９】
ｐＤＮＡ：プラスミドＤＮＡ
【００４０】
ｐＢＲ３２２−誘導起源：ｒｏｐ（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ：プライマの抑制体）遺伝子が欠失した、ｐＢＲ３２２由来のｐＭＢ１起源
【００４１】
プラスミド：プラスミド、コスミド、細菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）、バクテリオファージ、ウイルス性ベクタ、及びこれらのハイブリッド
【００４２】
ｐＵＣ起源：段階的な温度でコピー数を増加するＧからＡへの転位を有する、ｐＢＲ３２２−誘導起源
【００４３】
半合成グリセロール培地：複合窒素源（例えば、イースト抽出物、大豆抽出物）及びグリセロール炭素源を含む醗酵培地
【００４４】
本発明は、機械的醗酵容器を用いたプラスミド、コスミド、細菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）、バクテリオファージ、ウイルス性ベクタ及びこれらのハイブリッド（本明細書では、集合的にプラスミドと称される）等の閉環状（ｃｃｃ）組み換えＤＮＡ分子の製造方法に関する。
【００４５】
従来技術の醗酵プロセスは、次善のプラスミド収率、品質（例えば、プラスミドの切断又は線形化）、拡張性の無さ（例えば、過剰な酸素供給要求）、及び限られた応用範囲（例えば、不安定又は毒性シークエンスを含有するプラスミドで使用する能力がない）のために最適ではない。本発明は、醗酵培養中にプラスミドＤＮＡの収率及び純度を改善する方法である。誘発性流加培養醗酵プロセスを用いる高収率醗酵に対する費用効率のアプローチを発展させて、プラスミド収率及び純度を改善する。
【００４６】
プラスミド製造プロセス及び培地の好ましい実施例
ｐＢＲ３２２−誘導プラスミドを生産する１つの好ましい実施例では、流加培養醗酵を制限された細胞増殖速度で実施する。このプロセスは、プラスミドＤＮＡ醗酵収率を劇的に改善するにも関わらず、従来技術に記載されているプロセスと比較して、プラスミドの完全性を維持又は改善する。
【００４７】
適度の複製プラスミド（例えば、ここではｐＢＲ誘導プラスミドと呼ばれるｒｏｐ遺伝子が欠損したｐＢＲ３２２複製起源）を使用したこのプロセスを用いて、０．１２ｈｒ−１の比増殖速度を維持するように制御して供給をしながら、３７℃で自動流加培養醗酵プロセスを行って、２５０から４５０ｍｇ／Ｌのプラスミド収率及び１２０ＯＤ６００の細胞密度を達成した。これは、報告されている収率（Ｌａｈｉｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｒａ，１９９６）の１００倍の改良である。この新規で劇的な改良の分子的な根拠は、知られていない。この機構に関わらず、その他のプラスミドの生産への本発明を適用することで、プラスミドの質を下げることなく醗酵生産性は上がるであろう。
【００４８】
温度誘発性ＤＮＡレプリコン（例えば、プラスミド含有ｐＵＣ又はｐＭＭ１起源）の生産についての１つの好ましい実施例では、増殖期中に、制限された細胞増殖速度及び低減した温度で、流加培養醗酵を実施し；次いで、アップシフトした温度でプラスミド生産を誘発する。このプロセスは、従来技術に記載されているプロセスと比較すると、プラスミドの完全性を維持又は改善しつつ、プラスミドＤＮＡ醗酵収率を劇的に改善する。
【００４９】
本明細書で開示されているプラスミド（例えば、ｐＵＣ起源）を含む高コピー起源の高収率プラスミド生産についてのこの新規な戦略は、予想外に高いプラスミド生産性とプラスミドの品質をもたらす。加えて、流加培養期中に増殖速度が減少する。このプロセスは、図５に示されている。この要素の新規な組み合わせは、ＣｏｌＥ１誘導起源プラスミドの生産には適用されず、試験してみると、新しく予想外の改善された生産性となった。従って、我々は、低減した増殖速度と、１）増殖及びバイオマス生産のための低減した温度、及び２）プラスミド生産の誘発のための上昇させた温度と、の組み合わせに対する新しい使用（改善された生産性）を教示する。
【００５０】
初期の低減した温度増殖期と後の高温度生産期との組み合わせが、全体的な増殖、バイオマス、及びプラスミド収率の改善をもたらすという発見は、新規で予想外であり、従来技術には教示されていない。Ｈａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｒａ，２０００は、増殖中のＲプラスミドに関連する代謝負担を特に低減するために温度誘発醗酵を用いた。この戦略は、Ｒプラスミドの生産に利用されたが、プラスミド含有ＣｏｌＥ１起源については教示していない。同様に、Ｈａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｒａ，２０００は、この戦略を用いて、全体の生産性を改善することを意図していない。従って、この要素の組み合わせは、従来技術では、収率の改善のために提言されたものではない。改善された生産性によって明らかであるように、この組み合わせの相乗効果は、部分同士の総和より大きい。同様に、この高収量醗酵は、これまで要求されてきたが解決されなかった必要性を満たすものである。何故ならここ１０年以上もの間、この分野で記載された様々なプロセスは、高収率醗酵を教示していないからである。要約すれば、我々は、プラスミド生産を含むＣｏｌＥ１起源についての、新しい組み合わせを教示する。このことは、改善されたプラスミド生産性の、予想外で驚くべき新しい使用を示す温度誘発と組み合わせたゆっくりとした増殖を具える。
【００５１】
高コピープラスミド生産用誘発性流加培養醗酵プロセスの適用は、１１００ｍｇ／ＬプラスミドＤＮＡの収率、及び１００のＯＤ６００をもたらす。これは、従来技術に規定されている醗酵プロセスで得られる収率の５倍の改良である。これらの全プロセスから精製されたＤＮＡは、高品質であり、事実上１００％スーパーコイル状である。我々は、プラスミド生産性を改善するために本明細書に記載された回分及び流加培養醗酵プロセスの使用を意図する。
【００５２】
本明細書に記載された誘発性流加培養プロセスは、このプロセスのバイオマス生産期の間、低プラスミドレベル（ＶＲ１０１２誘導ベクタに対して＜２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）を維持し、バイオマス生産後は予想外で前例のない超高プラスミド生産（ＶＲ１０１２誘導ベクタに対して＞６ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）を容易にした。細菌１グラム当たりのプラスミド収率が増加することは、最終生産物のより高い純度に直接つながるので、高比産出量は非常に望ましい。我々は、本発明の温度シフトを用いて、増殖の間中、プラスミドレベルを低く保ち（ＶＲ１０１２誘導ベクタに対して＜２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）、バイオマス生産後のプラスミド生産を高いレベル（ＶＲ１０１２誘導ベクタ＞３ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）に誘発する。これらのレベルは、ＶＲ１０１２誘導ベクタの生産に対するガイドラインである。その他のプラスミドは、増殖期中に２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００よりも高い又は低いレベルで許容される。許容できる代謝負担、プラスミド安定性、及び温度シフト後の高い生産性を維持する増殖期中の最大プラスミドレベルは、平均的な当業者によって、各新しいプラスミドについて実験的に決定することができる。
【００５３】
醗酵培地の代替の実施例
本発明を実施する上で、例示的な動物由来成分を含まない醗酵培地配合、ＮＴＣ３０１８（回分）、ＮＴＣ３０１９（流加培養）を用いることができる。これらの培地は、グリセロール炭素源、イースト抽出窒素源、及び微量金属、塩及び緩衝液を含む半合成増殖培地である。従来技術に記載された培地を、この培地で代用することも本明細書に記載されているような醗酵プロセスを用いた改善されたプラスミド生産性をもたらす。
【００５４】
ＮＴＣ３０１８及びＮＴＣ３０１９培地用の代替の非動物源の窒素源が考えられる。複合培地成分として、イースト抽出物は、窒素、アミノ酸、ビタミン、及び炭素を提供する。プラスミド生産中の細胞代謝の鍵となる複合培地（例えば、イースト又は大豆抽出物）のあり得る成分は、制限アミノ酸、ビタミン、微量無機物及び代替の炭素源を含む。一例として、我々は、代替イースト抽出調製物、大豆調製物（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製のソイトン、又はファイトンペプトンを選択する）又はＮＴＣ３０１８及びＮＴＣ３０１９培地中のその他の植物調製物（例えば、Ｏｘｏｉｄ社製のエンドウの花のペプトン）の使用を意図している。
【００５５】
培地の規定された要素の変型も意図している。例えば、リン酸塩又はマグネシウムの増加は、回分培地成分の増加として、或いは流加培養醗酵における供給に対する追加として意図している。醗酵の分野における当業者は、系統だった成分測定による培地の更なる最適化を行うことができる。
【００５６】
ある栄養要求性細胞株を利用する場合、培地への添加物を意図している。例えば、ｐｒｏＡＢ欠失を含むＳｔｂｌ２（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）等の細胞株は、最大増殖を達成するためには、アミノ酸補給、又はプロリンが豊富な代替窒素源を必要とする。このような修飾は、醗酵の分野における平均的な当業者によって決定することができる。
【００５７】
また、我々は、従来技術に記載されているプラスミド醗酵培地を用いた本明細書に記載されている回分及び流加培養醗酵プロセスの使用を意図している。これは、Ｓｏｕｂｒｉｅｒ（Ｓｏｕｂｒｉｅｒ Ｆ．２００４ ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２００４／０１４２４５２）によって開示されているような規定された培地を含む。本発明の流加培養醗酵プロセスで使用する好ましい培地は、ＮＴＣ３０１９や、Ｌａｈｉｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｒａ，１９９６、Ｆｒｉｅｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｒａ，２００３、Ｃｈｅｎ Ｓｕｐｒａ，１９９９．及びＵｒｔｈａｌｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｕｒｔｈａｌｅｒ Ｊ，Ｒｏｍａｎ Ｎ，Ａｓｃｈｅｒ Ｃ，Ｗｏｅｈｒｅｒ Ｈ．２００５ ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２００５／００２６１７７）に開示されている培地等の半合成供給によるグリセロール培地配合である。
【００５８】
醗酵プロセスの代替的実施例
改善されたプラスミド生産のための流加培養及び回分プロセスが、本明細書に開示されている。これらは、新規な増殖及び誘発期温度シフトと組み合わせて、指数関数的供給戦略を特徴付けるものである。
【００５９】
本発明の流加培養プロセスの実施において、我々は、フィードバック、フィードフォワード、及び栄養素供給の所定の制御を含む、増殖速度を低減するための種々の供給戦略を意図している。例えば、炭素制御した指数関数的供給戦略によって、栄養素供給を加えてもよい。我々は、許容できる範囲内で増殖速度を制御するための、この供給戦略の変型を予想している。好ましい増殖速度の範囲は、μ＝０．０５から０．３ｈ−１である。好ましいターゲット増殖速度は、μ＝０．１２ｈｒ−１である。許容される増殖速度の範囲は、プラスミド特異的であり、当業者によって実験的に決定することができる。
【００６０】
本発明の流加培養プロセスの実施において、我々は、生産時間を低減するための種々の回分戦略を意図している。回分期に含まれる半合成栄養素を調節して、回分期をより高い濃度又はバイオマス濃度にすることができる。より高いバイオマス濃度の場合に、流加培養期と比較して回分期で増殖がより早く進むので、全体的な発酵時間が低減される。我々は、プロセスの流加培養の開始を制御するための、この回分戦略の変型を予想している。開始のための流加培養期の好ましいＯＤ６００の範囲は、１から６０である。許容できる流加培養開始ＯＤ６００の範囲はプラスミド特異的であり、当業者によって実験的に決定することができる。
【００６１】
本発明の誘導性流加培養及び回分プロセスの実施において、我々は、増殖期から誘導期への種々の温度シフト戦略を意図している。増殖期は２５から３７℃、好ましくは３０から３７℃の温度で実施することができる。高コピープラスミドについては、増殖期は、最も好ましくは３０から３２℃である。誘導期を３３℃から４５℃、好ましくは３７から４２℃の温度で実施することができる。
【００６２】
温度シフト戦略を伴う誘導性プロセスの実施において、我々は、増殖期から誘導期へ移る時の指標として栄養素濃度、バイオマス濃度、又は光学密度を使用することを意図している。醗酵培養の規則的なサンプリングは、バイオマス又は光学密度測定を得るための材料を提供することができ、温度シフトは、あるバイオマス濃度で実施することができる。また、オンラインセンサを使用して、バイオマス濃度の継続的なモニタリングを行い、醗酵装置を設定して特定のバイオマス濃度で温度シフトを自動的に実施することができる。温度シフト戦略を伴う誘導流加培養プロセスの実施において、我々は、また、ある量の供給栄養素を加えると温度シフトが実行されることを意図している。
【００６３】
温度シフト戦略を伴う誘導性プロセスの実施において、我々は、生産回数を最小限にするために増殖期中により高い温度を用いることを意図している。本明細書に記載されている誘導性流加培養プロセスは、このプロセスの増殖期の間中、低い（＜２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）プラスミドレベルを維持した。温度シフト後に、許容できる代謝負担、プラスミド安定性、及び生産性の向上を維持する増殖期中に利用できる最大温度は、プラスミド特異的であり、様々なプラスミドバックボーン間で異なる。例えば、いくつかのプラスミドは、２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００よりずっと高いレベルに許容できる。同様に、プラスミド生産性は、低い温度で変化し、従って、いくつかのプラスミドは、高いレベルのプラスミドとしては生産されない。これらの場合、我々は、増殖期中に、より高い温度を使用することを意図している。加えて、上昇した最大温度は、無制限の増殖とこれに相当するプラスミドコピー数の低下に起因して、開始回分期中で許容される（図５）。増殖期（回分及び流加培養成分）中に用いることができ、温度シフト後に許容できる代謝負担、プラスミド安定性、及び生産性の向上を維持する最大温度は、この分野の平均的な当業者によって実験的に決定することができる。
【００６４】
プラスミド及び宿主菌株
我々は、高コピー、低コピー及び中程度のコピーのいずれかであり、温度誘導性であるか温度誘導性ではない種々の起源の複製を伴うプラスミドの生産において本発明を使用することを意図している。いくつかの好ましい複製の起源、及びこれらを組み込んだプラスミドが、表１に記されている。これらの起源の変更はこの分野において公知であり、また、使用を意図している。
【００６５】
表１：複製起源
【００６６】
代替宿主菌株が意図されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５αは、プラスミド生産用に広く使用されている宿主である。その鍵となる品質は、クローンＤＮＡの非特異的組み換えを最小限にするｒｅｃＡ突然変異、及びエンドヌクレアーゼＩによってプラスミドの非特異的消化を除去するｅｎｄＡ１突然変異を含む。ＤＨ５αに加えて、その他の様々な菌株が、プラスミド生産に好適である；例示的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主菌株の非限定的リストを表２に示す。
【００６７】
表２：宿主菌株
【００６８】
ＤＨ５α、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＤＨ１０Ｂ、ＪＭ１０９及びＴｏｐ１０は、プラスミド生産菌株として、非常に良く確立されている。Ｍａｃｈ１、及びＥＣＯＳ１０１は、最近開発されたものであり、望ましいプラスミド生産宿主である。Ｓｔｂ１２、ＧＴ１１６及びＳｕｒｅ細胞はプラスミド含有不安定ＤＮＡの生産に利用されている。不安定ＤＮＡは、直接（例えば、レトロウイルスの長い末端反復）又は逆方向反復（例えば、ｓｈＲＮＡパリンドローム）ＺＤＮＡ、その他のような構造を含む。ＧＴ１１６のｄｃｍ遺伝子の削除は、免疫刺激であるダムメチル化（ｄａｍ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）を解消する。このため、ＧＴ１１６の生産は、プラスミドＤＮＡの免疫原性を低減する。類似の免疫原性の低減は、ＣｐＧメチラーゼを発現する菌株を使用して観察される。
【００６９】
不安定プラスミドの生産
【００７０】
我々は、また、不安定なシークエンスを含むプラスミドの生産に本発明を使用することを意図している。パリンドロームシークエンス、定方向又は逆方向反復塩基配列、及びシークエンスを形成するＺＤＮＡが不安定であり、大腸菌（Ｅ，ｃｏｌｉ）宿主によって除去、又は再編成される。いくつかの場合には、治療に使用するプラスミドは、不安定なシークエンス（ＡＡＶ及びＨＩＶ等のウイルス性ベクタについての逆方向又は定方向反復塩基配列、ある治療用遺伝子についてセグメント又は三塩基反復を形成するＺＤＮＡ）を含んでいなければならない。不安定シークエンスを含むプラスミドを維持するための現在行われている戦略は、安定化突然変異を用いた宿主細胞株を使用することである。いくつかの宿主は、これらのプラスミド、例えば、Ｓｕｒｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＧＴ１１５（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）又はＳｔｂ１２及びＳｔｂ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の増殖用に商業的に入手できる。Ｓｔｂ１２及びＳｔｂ１４細胞株は、レトロウイルスベクタ等のベクタを含む定方向反復塩基配列の安定性を増進する未公表の突然変異を用い；この効果は、恐らくは減少したコピー数に起因して低下した温度で強化される。修復突然変異の特異的組み合わせは、プラスミド増殖を、特に低温で安定化することができる。Ｓｕｒｅ及びＳｕｒｅ２細胞株は、ＵＶ修復（ｕｖｒＣ）及びＳＯＳ修復（ｕｍｕＣ）欠損（ＬＴＲｓを安定化するため）と関連した相同性組み換え欠損（ｒｅｃＢ、ｒｅｃＪ）、及びＺＤＮＡを安定化するためのＳｂｃＣ（及びｒｅｃＪ）を有するこのような組み合わせを用いる。ＧＴ１１６細胞株は、パリンドロームシークエンスを安定化するためにＳｂｃＣ及びＳｂｃＤを用いる。これらの菌株は、恐らくはプラスミドコピー数の低下に起因して、低温（即ち、３０℃）でのみプラスミドを安定化するように機能する。この戦略は明らかに生産コストを上げる。本明細書に記載されている誘導性醗酵プロセスの使用は、集菌前の短期間にのみコピー数が増加する前に、安定化細胞株中の３０℃の不安定プラスミドを増殖することができる。これは、不安定プラスミドの収量及び安定性（即ち、質）を最大にするであろう。
【００７１】
ＤＮＡ及びプラスミド生産
誘導性流加培養プロセスにおけるプラスミドＤＮＡ（＞６ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）の実際の増加した収量についての根底にある機構は知られていない。遅い増殖及び低下した温度でのバイオマス生産中に、ＤＮＡ凝縮剤（例えば、ｄｐｓ遺伝子生産物等のヒストン状タンパク質、又はその他のクロマチン結合タンパク質）に潜在的に起因する。
【００７２】
誘導期中にＤＮＡ凝縮を変化させることで、許容プラスミドレベル又はコピー数を増加することによって、プラスミド収量を増やすことができる。ＤＮＡの凝縮度合は、２つの対立因子；クロマチンタンパク質の凝縮と、転写複合体の脱凝縮と、によって設定される。プラスミド凝縮は、プラスミドプロモータからの転写レベルによって影響を受けることがある。転写が少ないほど、より高い凝縮となり、潜在的により高い運搬能力となる。
【００７３】
Ｅ．ｃｏｌｉ中で、ＤＮＡ凝縮に含まれる多数のクロマチンタンパク質を同定した。これらの遺伝子生産物は、プラスミドとゲノムＤＮＡを結合させる。ゲノムＤＮＡの場合には、核様体内にＤＮＡを凝縮する（（Ｒｏｂｉｎｏｗ Ｃ，Ｋｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｅ．１９９４ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ５８：２１１−２３２）参照）。核様体の主要成分は、ヒストン状タンパク質ＨＵ、ＩＨＦ、及びＨＮ−Ｓ、ＳｔｐＡ（ＨＮ−Ｓに関連して、約１／１０レベルで発現される）及びＤｐｓであり、これらは核様体内に均一に分配され、一方で、ＳｅｑＡ、ＣｂｐＡ、ＣｂｐＢ、Ｆｉｓ及びＩｃｉＡ等のその他のタンパク質はより少ない量であり、核様体内に不均一に分配され、調整機能を有する。遊離Ｒプラスミドタンパク質複合体は、３つの主要なタンパク質、２３％のＨＮ−Ｓ、２３％のＲＮＡポリメラーゼ、及び５％のＨＵを含む。これは、クロマチン関連遺伝子生産物が異なる培地、異なる細胞密度で、増殖期及び静止期中に様々に調整されるので、増殖期に依存して、恐らく変化するであろう。Ｆｉｓ、ＨＵ、ＨＦ−１は、一般的に、対数期により高度に発現し、一方で、ＩＨＦ及びＤｐｓは、静止期により高いレベルにある。Ｄｐｓは、静止期に液状生物結晶性複合体にＤＮＡを凝縮して、ストレス耐性を改善する。増殖期中のＨＮ−Ｓの過剰発現は、ＤＮＡ凝縮と生存度の減少を引き起こす。細胞は、ＤＮＡが高度に凝縮される場合、より高度なプラスミド能力を有する。ＮＴＣ誘導性醗酵プロセスにおいて、増殖期細胞は、誘導期細胞よりもプラスミドＤＮＡに対する全体的な能力が低い。これは、許容プラスミドを増殖期よりも高いレベルにする、誘導期に存在するクロマチンタンパク質の組み合わせの相違に起因する。誘導期中のクロマチンタンパク質の比率の変化が、プラスミド凝縮、及び運搬能力を上げる。
【００７４】
また、誘導期中のクロマチンタンパク質の比率の変化は、プラスミド複製率を上げる。例えば、ｐ１５Ａ起源ＲＮＡＩＩプロモータからの発現であって、ｐＭＢ１（ｐＢＲ３２２）ＲＮＡＩＩプロモータからではない発現は、ＩＨＦによって表される；ｐ１５Ａ ＲＮＡＩＩ転写は、ＩＨＦ突然変異中で増加する。Ｄｐｓ及びＨＵは、非特異的ＤＮＡ結合剤、ＨＮ−Ｓ、ＣｂｐＡ及びＣｂｐＢであり、湾曲したＤＮＡと結合する。ＳｔｐＡは、ＨＮ−Ｓに関連し、より高い親和性でＤＮＡと結合し、また、湾曲ＤＮＡと結合する。Ｆｉｓ、ＩＨＦ、ＩｃｉＡ及びｓｅｑＡは、シークエンス特異的である。ＨＮ−Ｓは、湾曲ＤＮＡを含む多数のプロモータからの転写を抑制する。ｐＭＢ１（ｐＵＣ及びｐＢＲ３２２）のＲＮＡＩＩプロモータは、ポリＡ及びポリＴトラックを含み、これらのシークエンスは、湾曲ＤＮＡを形成する。静止期の転写（例えば、ＨＮ−Ｓ）を抑制する減少したレベルの湾曲ＤＮＡ結合性クロマチンタンパク質は、ＲＮＡＩＩのＲＮＡＩへの転写の増加した比率に関連し、文書化静止期は、プラスミドコピー数を増やす。ＮＴＣ醗酵プロセスの誘導期中に存在するクロマチンタンパク質の組成の変化（例えば、ＨＮ−Ｓの更なる減少）は、ｐＵＣ等のｐＭＢ１を有するプラスミドコピー数の増加をもたらす。
【００７５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現する場合、異種ＤＮＡ凝縮体、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の酸可溶性胞子タンパク質は、プラスミド収量を上げるための有益なＤＮＡ凝縮体でもある。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）酸可溶性小タンパク質の発現は、ＤＮＡに起因する（Ｓｅｔｌｏｗ Ｂ，Ｈａｎｄ ＡＲ，ａｎｄ Ｓｅｔｌｏｗ Ｐ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：１６４２−１６５３）。
【００７６】
また、プロセス変化は、ＤＮＡ凝縮の効果を通じて収量を改善する。Ｄｐｓは、マグネシウム（Ｍｇ＋＋）濃度；Ｄｐｓの存在は、ＤＮＡ凝縮をもたらさない；密集した結晶性ＤＮＡ：Ｍｇ＋＋濃度が閾値以下に下がると、Ｄｐｓ複合体を形成する［（Ｆｒｅｎｋｉｅｌ−Ｋｒｉｓｐｉｎ Ｄ，Ｌｅｖｉｎ−Ｚａｉｄｍａｎ Ｓ，Ｓｈｉｍｏｎｉ Ｅ，Ｗｏｌｆ ＳＧ，Ｗａｃｈｔｅｌ ＥＪ，Ａｒａｄ Ｔ，Ｆｉｎｋｅｌ ＳＥ，Ｋｏｌｔｅｒ Ｒ，Ｍｉｎｓｋｙ Ａ．２００１ ＥＭＢＯ Ｊ．２０：１１８４−１１９１）参照］；によって調整される。形態学的に、この複合体は、静止期中にクロラムフェニコールを添加することによって誘導されるのに似ている。増殖する培地への０．２ｍＭのスペルミジンの添加は、Ｄｐｓの不存在下でＤＮＡ凝縮を加速する。リン酸塩欠乏は、恐らくスペルミジンに対するスレオニン及びアルギニンの分解の促進を介して同様の効果を有する。２価カチオンのレベルを変更（例えば、Ｍｇ＋＋、外因性添加又は減少による）するための、又は正電荷ポリアミン（例えば、スペルミジン、細菌合成の外因性添加又は制御による）の変化を変更するための誘導期中の醗酵組成又は状態への変化によって、プラスミド収量を増やすことができ、この変更は、培地の交換を意図する。
【００７７】
我々は、更なる収量の増加が、プラスミドＤＮＡの更なる凝縮によって得られることを意図している。これは、醗酵プロセス中に、スペルミン生産又はｄｐｓタンパク質生産等の宿主菌株ＤＮＡ凝縮剤の生産を増やす、供給（例えば、ポリエチレンイミン、スペルミジン、スペルミン）又は菌株組み換えへのＤＮＡ凝縮剤の添加によって達成される。このような菌株組み換えは、関連する遺伝子生産物が、醗酵プロセス中に減少することを可能にする変更になり得る。
【００７８】
誘導性プロセスの実施において、我々は、代替戦略を用いて、増殖期中に低レベルでプラスミドコピー数を維持することを意図している。例えば、低温での増殖に加えて、増殖期中に組み込むことができるコピー数を減らすためのその他の機構が存在する。例えば、醗酵中の溶存酸素の減少は、プラスミドコピー数を減少させるために示される （Ｃａｒｎｅｓ ＡＥ，２００５ ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ３：９，ｉｎ ｐｒｅｓｓ）。
【００７９】
最終産物純度の改善
我々は、例示的なプラスミド精製プロセス中に記載された醗酵培地からのプラスミド濃縮供給ストリームを用いることを意図している。このようなプロセスは、技術的によく知られている。高収量醗酵と例示的な精製プロセスの組み合わせは、費用対効果のある方法論を提供し、ゲノミックＤＮＡを更に遺伝子治療及びＤＮＡワクチン接種適用に許容されるレベルにまで減らす。
【００８０】
例
本発明の方法を、以下の例において更に説明する。これらは、例示によって提供され、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８１】
例１：ＮＴＣ３０１８及びＮＴＣ３０１９醗酵培地
次の基準はプラスミドＤＮＡを製造するための最適化醗酵プロセスの評価として確立された：
１） プラスミドの高い比収量（ｇ細胞質量当たりのｍｇプラスミドＤＮＡ）；
２） 高バイオマス収量；
３） 高度のスーパーコイル状のプラスミドを保つであろう；
４） ダウンストリームプロセシング中に生じる問題が最小になる；
５） 調整要求条件を満足する；
６） プラスミド構造を保持する（例えば、遺伝子欠失がない、又はその他の再配列）；
【００８２】
高い比プラスミド収量、高バイオマス収量、及び高プラスミド品質をサポートするように、培養培地を調整した。回分醗酵培地は、比増殖速度を減らすように構成した。低減した増殖速度の使用は、より高いプラスミドコピー数とより良いプラスミド安定性と関連していた。流加培養醗酵中に、制限栄養素の供給によって、増殖速度を０．１２ｈｒ−１に制御した。加えて、培地に使用した全組成は、良く特徴付けられており、認定された動物由来成分が含まれていなかった。
【００８３】
ＮＴＣ３０１８（回分）及びＮＴＣ３０１９（流加培養）培地は、回分及び流加培養プロセス培地の双方の多くの成分用に最適化されている。例えば、グリセロールを、炭素源として使用して、増殖速度を低減している。イースト抽出物は、窒素源として使用される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）生産菌株の所定の条件に基づいて、微量金属及びＭｇＳＯ４濃度を最適化した。
【００８４】
例２：ｐＢＲ３２２−誘導プラスミドを用いたＮＴＣ３０１９培地流加培養
３７℃での、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ＢｉｏＦｌｏ １１０ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ中で流加培養醗酵を実施した。３０％の水酸化アンモニウム又は１０％のリン酸を自動的に添加することによって、ｐＨを制御した。窒素ガス散布によって０％に、及び空気飽和で１００％に溶存酸素プローブを調節した。容器を１ＶＶＭで通気し、溶存酸素を攪拌の比例積分制御によって３０％に維持した。また、約２０ＯＤ６００以上の細胞密度で、３０％の飽和を維持するためにＯ２補給を必要とした。
【００８５】
ＬＢプラス５０μｇ／ｍｌカナマイシン内に植菌した単一の遊離コロニーから種培養を開始し、３７℃で培養した。中間指数関数期（０．５から１．５ＯＤ６００）で、種培養を用いて、醗酵装置に対して１％の接種材料を提供した。
【００８６】
流加培養中に、炭素の制限指数関数的供給戦略に応じて、半合成供給栄養素を添加した。要約すれば、回分期中にμｍａｘの比増殖速度で炭素基質の初期量が消費される。炭素基質が消耗すると、流加培養期が始まり、供給栄養素が、次の式によって決定される割合で、自動的に加えられる（Ｃａｒｎｅｓ，Ｓｕｐｒａ，２００５）：
【００８７】
【００８８】
ここで、
μ＝流加培養期中の所望の比増殖速度、
ＸＢ＝回分期の終わりのバイオマス濃度、ｇＤＣＷ／Ｌ、
ＶＢ＝培地の初期液体体積、Ｌ、
Ｓｆ＝栄養素供給培地の制限基質濃度、ｇ／Ｌ、
ＹＸ／Ｓ＝基質からのバイオマスの収量係数、ｇ／ｇ
ｔ＝流加培養期の開始からの時間、
である。
【００８９】
一般的に、いくつかの独立したカナマイシン耐性ｐＢＲ３２２−誘導プラスミドを用いたＮＴＣ３０１９培地の流加培養醗酵は、１００から１２０ＯＤ６００の細胞密度、又は１リットル当たり５５から６５ｇ乾燥細胞重量に達する（図１）。プラスミドは、平均２６０ｍｇ／Ｌであり、４３０ｍｇ／Ｌ程度に高かった。比較すると、ｐＢＲ３２２−誘導プラスミドを用いた公開されている醗酵収量は、約３から４ｍｇ／Ｌである（Ｌａｈｉｊａｎｉ ｅｔ ａｉ，Ｓｕｐｒａ，１９９６）。
【００９０】
重要なことには、比プラスミド収量が非常に高く、一般的に２．５から３．８ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００の間であり、かなり高いコピーｐＵＣ起源プラスミドを用いるその他の醗酵培地／プロセスで観察されたレベルを十分越えている（表３）。比収量ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００に関する発現プラスミド収量は、全細胞質量と比較したプラスミドの量を示す。細菌１グラム当たりの増加したプラスミドの収量が、より高い最終産物純度を直接導くので、高い比収量は非常に望ましい。
【００９１】
表３：公開高収量醗酵プロセスと比プラスミド収量の比較
【００９２】
これは、ＮＴＣ３０１９醗酵培地が、従来技術に記載された培地及びプロセスと比較して、中程度のコピー数のプラスミド（例えば、ｒｏｐ欠失を有するｐＢＲ３２２）の醗酵収量を、劇的に促進することを明示している。この効果は、プラスミド特異的ではない。
【００９３】
これらのプロセスで精製したＤＮＡは高品質であり、欠失又はその他の再配列を検出することなく、実質的に１００％スーパーコイル状である。同様に、このプロセスで、細胞を使用して１グラムスケールでＤＮＡ精製を実施した。これは、ＮＴＣ３０１９流加培養培地で実施された醗酵が、大きいスケールのダウンストリームプロセシングに敏感に反応することを明示している。
【００９４】
例３：高コピー遺伝子治療プラスミドを用いたＮＴＣ３０１８培養回分醗酵
ｐＵＣ起源プラスミドを用いたＮＴＣ３０１８培地回分培養を実施した。以下のプラスミド含有ｐＵＣ起源を使用した：
１）ｐＷ２．０、変質ポリリンカーシークエンスを有するｐＵＣ１９の誘導体
２）ｐＭａｘＧＦＰ
３）ｐＥＧＦＰ−Ｃ１
【００９５】
３７℃の、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ＢｉｏＦｌｏ １１０ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ中で回分醗酵を実施した。３０％水酸化アンモニウム又は１０％リン酸の自動添加によって、ｐＨを制御した。窒素ガス散布によって０％に、及び空気飽和で１００％に溶存酸素プローブを調節した。容器を１ＶＶＭで通気し、溶存酸素を攪拌の比例積分制御によって３０％に維持した。また、約２０ＯＤ６００以上の細胞密度で、Ｏ２補給を３０％の飽和を維持するためには、Ｏ２の補給が必要であった。
【００９６】
ＬＢプラス５０μｇ／ｍｌカナマイシン中に植菌した単一遊離コロニーから種培養を開始し、３７℃で培養した。中間指数関数期（０．５から１．５ＯＤ６００）で、種培養を用いて、醗酵装置に対して１％の接種材料を提供した。
【００９７】
全ての醗酵を３７℃で実施した。ｐＷ２．０について、プラスミドコピー数を醗酵の遅い４２℃での増殖によって誘発した。ｐＵＣプラスミドを用いた回分醗酵は、１６から５７ＯＤ６００の細胞密度に達したのみであった。しかしながら、比プラスミド収量の結果は有望である。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１についての最終収量は、細胞密度が５６ＯＤ６００であり、収量が１６３ｍｇプラスミド／Ｌ（２．９ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）であり、ｐＭａｘＧＦＰについては、細胞密度が１６ＯＤ６００であり、収量が８４ｍｇプラスミド／Ｌ（５．３ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）であり、ｐＷ２．０については、細胞密度が５７ＯＤ６００であり、収量が２３０ｍｇプラスミド／Ｌ（４．０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００；図２）であった。
【００９８】
これらのプロセスから精製したＤＮＡは高品質であり、欠失又はその他の再配列を検出することなく、実質的に１００％スーパーコイル状である。同様に、このプロセスで細胞を使用して実質０．５グラムスケールでＤＮＡ精製を実施した。これは、ＮＴＣ３０１８回分培地で実施された醗酵が、大きいスケールのダウンストリームプロセシングに敏感に反応することを明示している。
【００９９】
例４：高コピー遺伝子治療プラスミドを用いたＮＴＣ３０１９培地の流加培養醗酵
Ｖｉｃａｌ ＶＲ１０１２ベクタの誘導体を含有するＧＦＰ遺伝子であるプラスミドｇＷｉｚ ＧＦＰ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、流加培養醗酵評価用に選択した。これは、５７５７ｂｐの大きさの広く用いられているＤＮＡワクチンプラスミド含有カナマイシン耐性（ｋａｎＲ）ｐＵＣ起源である。このプラスミドｇＷｉｚ ＧＦＰ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αに変質させた。また、ｐＭａｘＧＦＰを、流加培養培地内で試験し；両方のプラスミドについて、同様の結果を得た。
【０１００】
これらのプラスミドの生産にＮＴＣ３０１９培地を使用したときに、２つの問題に直面した。増殖がｐＢＲ３２２−誘導プラスミドを用いてうまく行われているときに、３７℃でのｇＷｉｚ ＧＦＰプラスミド培地の増殖時に第１の問題が発見された。ｐＵＣプラスミド培地では、細胞増殖は１５ＯＤ６００のあたりで止まった。蛍光顕微鏡は、細胞分裂の阻害を意味する広範なフィラメンテーションを示した。フィラメントが実質的に溶解するので、このことは致命的である（Ａｒｅｎｄｓ ＳＪＲ， Ｗｅｉｓｓ，ＤＳ．２００４ Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８６：８８０−８８４）。例えば、図３（Ａ）は、プラスミドｇＷｉｚ ＧＦＰを用いた流加培養醗酵を示す。細胞増殖は遅くなり、１５ＯＤ６００の早い段階で静止期に入るように見えた。プラスミド収量分析は、細胞増殖が停止し始めたときに、２．７ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００の上昇比プラスミド収量を示した。ｐＵＣプラスミドは、３０℃の場合と比較すると、４２℃でのコピー数の３０から４０倍の増加を示す温度感受性点突然変異を含む（Ｌｉｎ−Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ，１９９２）。次いで、プラスミドコピー数を減らし、細胞の代謝負荷を軽減しようとして、温度を３３℃に下げた。温度の低下後に、プラスミドは１．６ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００に下がり、細胞増殖が再開した。興味深いことに、比プラスミド収量は再び徐々に増加し、供給栄養素が加えられていたにも関わらず、増殖は、予想通りに＞１００ＯＤ６００に増殖することなく、約６０ＯＤ６００で静止期に入った。
【０１０１】
図３（Ｂ）は、３７℃で発生する細胞フィラメンテーションを示す。温度を３３℃に下げた後に、増殖細胞のサンプルは、より少ないフィラメンテーションを示した。
【０１０２】
考えられる説明は、３７℃で増殖が開始した時に、細胞母集団は、フィラメンテーション及び生存率の低下から完全に回復しないことであった。このことを試験するために、同じプラスミドで、引き続いて２つの流加培養醗酵を、３３℃で完全に実施した。両醗酵において、細胞密度＜６０ＯＤ６００で培養がピークに達した。
【０１０３】
これらの醗酵からのバイオマス及びプラスミドＤＮＡ収量データは、比増殖速度の低下と、細胞増殖阻害前の比プラスミド収量の急激な上昇を示す。このような高いレベルへのプラスミド含有量の急激な増加は予想されておらず、増殖速度の低下を招く細胞母集団上の代謝負担を認識する。しかしながら、増殖速度の低下は、しばしばプラスミドコピー数の増加を導くことも示されている（Ｓａｔｙａｇａｌ ＶＮ，Ａｇｒａｗａｌ Ｐ．１９８９ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３３：１１３５−１１４４）、（Ｓｅｏ ＪＨ，Ｂａｉｌｅｙ ＪＥ．１９８５ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２７：１６６８−１６７４）。予期しない増加比プラスミド収量が、増殖速度の低下を引き起こしているのか、又は予期しない低下した比プラスミド収量が、増殖速度の増加を引き起こすのか、或いは、それぞれが、複合してどちらかを引き起こすかは、明らかではない。
【０１０４】
例５：ＮＴＣ３０１９培地を用いた高コピープラスミドの高収量生産のための誘導流加培養プロセス
【０１０５】
３３℃及び３７℃での醗酵の結果（例５）に基づいて、ｐＵＣ起源プラスミドを用いた流加培養モードで観察される予期しないプラスミド増加を克服するように戦略を構成した。ＤＨ５α中のプラスミドｇＷｉｚ ＧＦＰを、誘導流加培養プロセスで用いた。ＮＴＣ３０１９流加培養醗酵は、３０℃で６０ＯＤ６００まで培養することを除いて、例５で説明されるように実施した。この時に、温度を３７℃にシフトした。驚くべき結果が、図４Ａに示されている。６０ＯＤ６００まで３０℃で増殖することで、増殖阻止問題がなくなり、この培養は、全プラスミド収量が６７０ｍｇ／Ｌの１００ＯＤ６００を最終的に上回った。このプロセスのサンプルから精製されたＤＮＡは高品質であり、欠失又はその他の再配列を検出することなく、実質的に１００％スーパーコイル状である。
【０１０６】
２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以下に維持して、増殖期を通じて低く維持される温度シフトの前に、プラスミドが産生する。このことは、３３℃又は３７℃の醗酵の結果と対照的である。注目すべきことに、温度シフト後の比プラスミド収量は、６．５ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００と非常に高くなり、その他の醗酵培地／プロセスを用いて観察されたレベルを十分に越えている（表３）。増殖期を通して３０℃での醗酵させ、４２℃へシフトすることは、ｇＷｉｚ ＧＦＰを伴う１．１ｇｍ／Ｌ（１１ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）の生産量をもたらす結果となった（図４Ｂ）。生産性安定期は、細胞の大多数が生き残るので、大量の細胞死に関連していない。
【０１０７】
また、流加培養期間を低減する（回分期をより高いＯＤ６００にすることによる）ためのＮＴＣ３０１９培地（グリセロール、イースト抽出物、及び回分培地のマグネシウムの４倍の増加）の修飾も、４２℃での誘導後に同様の高プラスミド収量を産生し、プラスミド誘導のロスなしで、より高いＯＤ６００で流加培養期を開始できることを明示している。
【０１０８】
様々な抗生物質抵抗性遺伝子及び原核生物要素の配向性を含む、種々のｐＵＣ起源バックボーンを有する多数の異なるプラスミドが、ＤＨ５α中での３０℃から４２℃の誘導性プロセスを用いて、ＮＴＣ３０１９培地中の０．５ｇｍ／Ｌよりも大きい収量で生産された。これらの結果は、この誘導性プロセスが、特定のプラスミドに特異的でないことを明示している。
【０１０９】
また、ｇＷｉｚ−ＧＦＰプラスミドが、ＤＨ１細胞株中で、３０℃から４２℃での誘導性プロセスを用いて、ＮＴＣ３０１９培地の０．５ｇｍ／Ｌよりも大きい収量で生産された。この結果は誘導性プロセスが、特定の大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ）に特異的でないことを明示している。
【０１１０】
同様に、このプロセスからの細胞を用いて、１グラムスケールでのＤＮＡ精製を実施した。このことは、ＮＴＣ３０１９流加培養培地で実施された誘導性醗酵が、大きいスケールのダウンストリームプロセシングに敏感に反応することを明示している。
【０１１１】
比収量（ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）の用語でのプラスミド収量の表現は、全細胞質量に対するプラスミドの量を示す。本明細書に記載された誘導性流加培養プロセスは、このプロセスの増殖期を通してプラスミドレベルを低く（＜２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）維持し、バイオマス生産後の、前代未聞の非常に高いプラスミド生産（６から１１ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）を容易なものにした。細菌の１グラム当たりのプラスミド収量の増加は、直接的に最終産物純度を高くするので、高い比収量は非常に望ましい。
【０１１２】
これらの結果は、プラスミドＤＮＡ生産性と品質を改善する、本発明の流加培養及び回分醗酵プロセスの一般的な使用を明示する。
【０１１３】
このように、本発明の生産プロセスが、改善されたプラスミド生産方法を提供するものであることを、読者は理解するであろう。
【０１１４】
上記記述が多くの特異性を含んでいる一方で、これらは、本発明の限定として解釈するべきではなく、むしろ本発明の好ましい一の実施例の例示として解釈するべきである。その他の多くの変形が可能である。例えば、誘導性流加培養プロセスを、回分プロセスと一体化して、栄養素がなくなるまでＮＴＣ３０１８培養培地中で醗酵を行うことができる。ここでは、ＮＴＣ３０１９由来の流加培養培地及び誘導は同時に開始される。いくつかのプラスミドを用いて、この実施例においては、プラスミドコピー数をより高い増殖速度で低下するため、増殖期を３７℃以上で実施することができる。増殖期中に細胞分裂を可能にし、硫化培養期中にプラスミド誘導性を保持する最適な温度は、当業者が決定できる。従って、本発明の範囲は、説明した実施例によってではなく、添付の特許請求の範囲及びこれらの法律的均等物によって決定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、ＮＴＣ３０１９培地を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のｐＢＲ３２２−誘導プラスミド流加培養醗酵を示す。
【図２】図２は、ＮＴＣ３０１８培地を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のｐＵＣプラスミド回分醗酵を示す。
【図３】図３は、ＮＴＣ３０１９培地を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のｇＷｉｚ ＧＦＰプラスミド流加培養醗酵を示す。
【図４】図４は、ＮＴＣ３０１９培地を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のｇＷｉｚ ＧＦＰ誘導流加培養醗酵を示す。
【図５】図５は、誘導性流加培養醗酵プロセスを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉環状スーパーコイル状プラスミドＤＮＡの流加培養醗酵生産方法において：Ａ）流加培養期中に、低下させた温度でプラスミド、コスミド、又は細菌性人工染色体複製を培養するステップと；Ｂ）前記流加培養期中に、増殖速度を制限するステップと；Ｃ）温度上昇シフトによってプラスミド生産を誘導するステップと；Ｄ）段階的温度で増殖を継続して、プラスミド産物を蓄積するステップと；を具え、
前記方法がプラスミド収量を増やすことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記流加培養期中の低下した温度が、プラスミド収量をほぼ２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以下に維持するように決定されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記流加培養期中の低下した温度が、ほぼ３０℃であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記温度シフトが、３６から４５℃の範囲であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記プラスミドが、ＣｏｌＥ１−誘導複製起源を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記プラスミドが、ｐＵＣＧからｐＵＣＡの突然変異を含むｐＭＢ１複製起源を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記プラスミドが、ＶＲ１０１２バックボーンから誘導されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記醗酵培地が、実質的に半合成グリセロール培地であることを特徴とする方法。
【請求項９】
閉環状スーパーコイル状プラスミドＤＮＡの醗酵生産方法において：Ａ）流加培養醗酵培地中にｐＢＲ３２２−誘導プラスミド、コスミド、又は細菌性人工染色体複製を含む細菌性細胞を増殖するステップと；Ｂ）流加培養期中の増殖速度を制限するステップと；Ｃ）増殖を継続して、プラスミド産物を蓄積するステップと；を具え、
前記方法がプラスミド収量を増やすことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記醗酵培地が、実質的に半合成グリセロール培地であることを特徴とする方法。
【請求項１】
閉環状スーパーコイル状プラスミドＤＮＡの流加培養醗酵生産方法において：Ａ）流加培養期中に、低下させた温度でプラスミド、コスミド、又は細菌性人工染色体複製を培養するステップと；Ｂ）前記流加培養期中に、増殖速度を制限するステップと；Ｃ）温度上昇シフトによってプラスミド生産を誘導するステップと；Ｄ）段階的温度で増殖を継続して、プラスミド産物を蓄積するステップと；を具え、
前記方法がプラスミド収量を増やすことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記流加培養期中の低下した温度が、プラスミド収量をほぼ２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以下に維持するように決定されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記流加培養期中の低下した温度が、ほぼ３０℃であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記温度シフトが、３６から４５℃の範囲であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記プラスミドが、ＣｏｌＥ１−誘導複製起源を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記プラスミドが、ｐＵＣＧからｐＵＣＡの突然変異を含むｐＭＢ１複製起源を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記プラスミドが、ＶＲ１０１２バックボーンから誘導されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記醗酵培地が、実質的に半合成グリセロール培地であることを特徴とする方法。
【請求項９】
閉環状スーパーコイル状プラスミドＤＮＡの醗酵生産方法において：Ａ）流加培養醗酵培地中にｐＢＲ３２２−誘導プラスミド、コスミド、又は細菌性人工染色体複製を含む細菌性細胞を増殖するステップと；Ｂ）流加培養期中の増殖速度を制限するステップと；Ｃ）増殖を継続して、プラスミド産物を蓄積するステップと；を具え、
前記方法がプラスミド収量を増やすことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記醗酵培地が、実質的に半合成グリセロール培地であることを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００８−５１０４６０（Ｐ２００８−５１０４６０Ａ）
【公表日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２７９７０（Ｐ２００７−５２７９７０）
【出願日】平成１７年８月１６日（２００５．８．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２９２３８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２３５４６
【国際公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願人】（５０７０４８７６５）ネイチャー テクノロジー コーポレーション (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１６日（２００５．８．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２９２３８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２３５４６
【国際公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願人】（５０７０４８７６５）ネイチャー テクノロジー コーポレーション (2)
【Ｆターム（参考）】
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