プロアントシアニジン含有茶飲料
【課題】持続的に摂取可能で、かつ血管内皮細胞からのＮＯの分泌を促進してNOの作用を増強する等により血管内皮機能を改善する効果を有する飲料を提供することにある。
【解決手段】プロアントシアニジン（procyanidin B1；ＰＢ１）と、プロアントシアニジン（procyanidin B3；ＰＢ３）とを含有し、その合計量が一定濃度以上である、癖がなく飲み易い、プロアントシアニジン含有茶飲料であって、持続的に摂取可能で、血管内皮機能を改善する効果を有する茶飲料を提供する。
【解決手段】プロアントシアニジン（procyanidin B1；ＰＢ１）と、プロアントシアニジン（procyanidin B3；ＰＢ３）とを含有し、その合計量が一定濃度以上である、癖がなく飲み易い、プロアントシアニジン含有茶飲料であって、持続的に摂取可能で、血管内皮機能を改善する効果を有する茶飲料を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
臨床上有効量のプロアントシアニジンを含有する食品の提供、特に、効率的かつ持続的に摂取可能な血管内皮機能改善作用を有する茶飲料を提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活やライフスタイルの変化に伴って生活習慣病が増加している。生活習慣病とは、高血圧症、高脂血症、糖尿病などの疾患に加え、狭心症、心筋梗塞、脳循環障害、悪性腫瘍など生活習慣を改善することによって発病を予防することができると考えられる疾患の総称である。高血圧症、高脂血症、糖尿病などは重複して発症することが多く、合併した場合は互いにその病態を増悪させ、動脈硬化などの続発症を高率に引き起こして予後を悪化させることになる。
【０００３】
最近、こういった悪循環の要因の一つに血管の内皮機能の低下が関与していることがわかってきた（非特許文献１参照）。血管内皮機能低下のリスクファクターとして、高血圧、耐糖能異常、高脂血症、閉経後女性、喫煙などが挙げられるが、血管病変の終末的な状態である動脈硬化をきたす前に、その端緒である血管内皮機能低下を発見し、予防することが、生活習慣病を予防する上で非常に重要であると考えられる。特に、慢性的な無症候な病態である血管病変に対しては、長く安全に摂取できる食品による予防がより重要であると考えられ、そのような効果を奏する食品の開発が期待されている。
【０００４】
一方、ポリフェノールの摂取量が多いほど、循環器疾患の発症が少ないことが明らかにされており、最近の研究では、ココア、チョコレート、ブドウ、ワインなどの主要なポリフェノールとしてプロシアニジンを豊富に含む食品やその素材には、ヒトにおいて血管内皮機能の改善効果が報告されている（非特許文献２〜４参照）。また、このプロシアニジンを含む松樹皮抽出物を含有するカプセル剤の経口投与による血管内皮機能の改善効果も確認されている（非特許文献５，６参照）。
【非特許文献１】Verma S, Anderson TJ, Circulation 2002;105:546-549
【非特許文献２】Stein JH, Circulation 1999;100:1050-5
【非特許文献３】Chou EJ, Am J Cardiol 2001;88:553-5
【非特許文献４】Agewall S, Eur Heart J 2000;21:74-8
【非特許文献５】Shand B, Phytother Res 2003;17:490-4
【非特許文献６】Young JM, Free Radic Res 2006;40:85-94
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記非特許文献５（Shand B, Phytother Res 2003;17:490-4）には、松樹皮抽出物としてエンゾジノールを使用し、これを１２週間継続摂取させることにより最大前腕血流が増加する、すなわち血管内皮機能改善作用があることが記載されている。また、上記非特許文献６（Young JM, Free Radic Res 2006;40:85-94）には、松樹皮抽出物としてエンゾジノールを使用し、これを１２週間継続摂取させることにより血管径が増大することが記載されている。上記文献のいずれも固形の経口摂取用組成物（カプセル剤）が用いられ、しかも４８０ｍｇ／ｄａｙという比較的大量の松樹皮抽出物を摂取しなければならず、毎日の摂取には不都合を生じることもあった。一般に、固形の経口摂取用組成物では摂取する際に手間がかかり、摂取するという義務化した感覚になってしまうこと、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等、固形の経口摂取用組成物の形態が医薬品の形態に近いことから、医薬品を摂取しているような感覚になってしまうこと等の理由から、持続的に摂取可能な形態としては、食事中や休憩中に気軽に摂取できる飲料の形態が適しているとの指摘がある。このことからも、上記した固形状の松樹皮抽出物の大量摂取が持続的な摂取に適当でないといえる。
【０００６】
また、上記文献に示される効果は血液生化学検査に反映されるほどのものではなく、明確な有効性が認められるまでには至っていなかった。
【０００７】
本発明の課題は、持続的に摂取可能で、かつ血管内皮細胞からのＮＯの分泌を促進してNOの作用を増強する等により血管内皮機能を改善する明確な効果を有する飲料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、オリゴメリックプロアントシアニジンに分析方法を確立し、松樹皮抽出物中のプロアントシアニジンの定量的測定を可能にした（特開２００６−３８７６３号）。そして、本分析方法により、熱安定性を有するといわれているプロアントシアニジンが、殺菌処理により一部が分解及び／又は異性化されて低減することが判明した。この知見から、単に松樹皮抽出物を配合しただけでは、臨床上有効な血流改善組成物が得られないとの考えのもと、本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、procyanidin B1（ＰＢ１）及びprocyanidin B3（ＰＢ３）の合計量がプロアントシアニジン含量の指標となることを見出した。そして、このＰＢ１及びＰＢ３の合計量が、６．４ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは８．１ｍｇ／Ｌ以上であるプロアントシアニジン含有茶飲料を一日あたり３５０ｍＬずつ１〜１２週間継続摂取することにより血管内皮機能が顕著に改善されることがわかった。また、官能評価から、ＰＢ１及びＰＢ３の合計量が、３０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは２０ｍｇ／Ｌ以下であるプロアントシアニジン含有茶飲料が好ましいこと、また、熱水で抽出した松樹皮抽出物がエタノールで抽出した松樹皮抽出物と比べてフェルラ酸等のフェニルプロパノイド及びジヒドロケルセチン等のジヒドロフラバノール含量が少なく、香味面において極めて好ましいことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
１． 式（Ｉ）
【００１０】
【化１】
【００１１】
で表されるプロアントシアニジン（procyanidin B1；ＰＢ１）と、式（ＩＩ）
【００１２】
【化２】
【００１３】
で表されるプロアントシアニジン（procyanidin B3；ＰＢ３）とを含有し、その合計量が６．４ｍｇ／Ｌ以上であるプロアントシアニジン含有茶飲料。
２． 前記ＰＢ１及びＰＢ３が、松樹皮抽出物中に含有された形で添加されたものである、上記１に記載の茶飲料。
３． 前記松樹皮抽出物が、松樹皮の熱水抽出物である、上記２に記載の茶飲料。
４． 茶の抽出液にプロアントシアニジンを配合して調合液を調製する調合工程、前記調合液を殺菌処理する殺菌工程、殺菌された調合液を容器に充填する充填工程を経て得られる、容器詰めされた上記１〜３のいずれかに記載の茶飲料。
５． 血管内皮機能の改善作用を有する、上記１〜４のいずれかに記載の茶飲料。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、プロアントシアニジン（procyanidin B1；ＰＢ１）とプロアントシアニジン（procyanidin B3；ＰＢ３）の合計量を有効成分の指標とし、前記ＰＢ１及びＰＢ３の合計量が６．４ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは８．１ｍｇ／Ｌ以上含有する茶飲料を提供する。この茶飲料を、一日あたり３５０ｍＬ摂取するだけで、ＮＯの産生増強等により血管内皮機能を改善することができ、動脈硬化等の循環器疾患を予防することができる。
【発明を実施するための好ましい形態】
【００１５】
（プロアントシアニジン）
本発明の茶飲料は、プロアントシアニジン、特に松樹皮由来のプロアントシアニジンを有効成分として含有する。松樹皮由来のプロアントシアニジンは、松樹皮を５０〜１２０℃、好ましくは７０〜１００℃の熱水又は食品の製造に許容される溶媒（エタノール等）あるいはその水溶液で抽出して得ることができる（以下、前者を「水抽出物」、後者のエタノール又はエタノール水溶液による抽出物を「エタノール抽出物」と表記することもある）。原料となる松樹皮としては、松樹皮抽出物の原料となる松樹皮としては、フランス海岸松（Pinus Martima）、カラマツ、クロマツ、アカマツ、ヒメコマツ、ゴヨウマツ、チョウセンマツ、ハイマツ、リュウキュウマツ、ウツクシマツ、ダイオウマツ、シロマツ、カナダのケベック地方のアネダ等の樹皮等が好ましく用いられるが、中でも、フランス海岸松の樹皮が好ましい。ここで、フランス海岸松は、南仏の大西洋沿岸の一部に生育している海洋性松をいう。
【００１６】
このフランス海岸松の樹皮は、カテキン、プロアントシアニジン及び有機酸等の成分を含有する。抽出溶媒により得られる抽出物の組成は異なり、例えば、松樹皮中に含まれるフェルラ酸等のフェニルプロパノイド（ＰＰ）は、水抽出物ではほとんど含有されないが、エタノール抽出物には約１０％程度含有される。また、ジヒドロケルセチン等のジヒドロフラバノール（ＤＨＦ）も、水抽出物にはほとんど含有されないが、エタノール抽出物には、数％程度含有される。フェルラ酸やジヒドロケルセチンは優れた抗酸化剤として知られ、フェルラ酸については脳血管保護作用（第１４回日本循環薬理学会要旨集プログラムＡ５，２００４）や、血管内皮機能改善作用（特開２００３−２６１４４４号参照）が報告されている。したがって、エタノール抽出物を用いれば、プロアントシアニジンとフェルラ酸及び／又はジヒドロケルセチンとの相加的又は相乗的な血管内皮機能の改善効果が期待されるが、上記ＰＰやＤＨＦは香味面に影響を及ぼすことがあり、特に本発明のような飲料では、香味が持続的摂取のための重要な因子であることから、その影響は無視できない。官能検査において、エタノール抽出物と比較して水抽出物を添加した茶飲料が、良好な風味であると判断されたことから、本発明の茶飲料においては、水抽出物を用いることが好ましい。具体的には、フェルラ酸とジヒドロケルセチンを指標として、その含量の合計が、１０μｇ／ｍｇ以下、好ましくは５μｇ／ｍｇ以下となるような抽出物を用いることが好ましい。
【００１７】
松樹皮抽出物中のフェルラ酸及びジヒドロケルセチン含量は、例えば次のようにＨＰＬＣ等を用いて分析することができる。松樹皮抽出物をｐＨ４から５の緩衝液に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、β―グルコシダーゼ（セルラーゼＲＳ，エムルシンなど）を加え４０℃で１〜６時間インキュベートしアグリコンを作る。このアグリコンを含む反応溶液に同量のアセトニトリル（０．１から１％のＴＦＡを含む）を加え酵素反応を止めると同時に、アグリコンを溶解させる。この溶液を逆相のＨＰＬＣで分析することにより定量が可能である。
【００１８】
（ＨＰＬＣ条件）
・カラム：Shim-pack FC-ODS, 4.6mm ｘ 150mm
・移動相：A:0.1%TFA/H2O、B:0.1%TFA/90%CH3CN、0.6ml/min
・グラジエント：B20%→B70%（10min）、B70%iso（5min）
・検出：Photodiodearrey検出器（島津製作所 SPD-M10A）、Ａ３３０ｎｍ
・インジェクション：１０μＬ
ＨＰＬＣはこれ以外にも逆相系であればＯＤＳ、Ｃ３０などの担体が使用可能である。
【００１９】
松樹皮からの抽出方法に特に制限はなく、例えば、加温抽出法、超臨界流体抽出法、液体二酸化炭素回分法、液体二酸化炭素還流法、超臨界二酸化炭素還流法などの公知の方法を単独で又は複数の抽出方法を組み合わせて用いることができる。
【００２０】
本発明では、松樹皮に抽出溶媒（熱水、エタノール、含水エタノール等）を加えた抽出後、濾過して得られる濾液、又はその精製品を抽出液として用いることもできるし、この抽出液を凍結乾燥等により粉末化したものを用いることもできる。また、松樹皮抽出物として市販されているフラバンジェノール（株式会社東洋新薬）、ピクノジェノール（シーベルヘグナー株式会社）等を用いてもよく、中でも、上記理由から水抽出タイプのフラバンジェノールを好適に用いることができる。
【００２１】
本発明におけるプロアントシアニジンとは、フラバン−３−オール及び／又はフラバン−３，４−ジオールを構成単位とする重合度が２以上の縮重合体からなる化合物群をいう。松樹皮中のプロアントシアニジンとしては、ＰＢ１、ＰＢ３、ＰＢ６などの２量体及びプロシアニジンＣ２（Ｃ−Ｃ−Ｃ）の３量体などが知られている。ブドウ種子より抽出されたプロアントシアニジンが熱に対して安定であることが知られている（特許第２６９４７４８号）が、本発明の茶飲料、特に加熱殺菌され容器に収容して販売される茶飲料では、１２０℃を超える温度で殺菌処理されることから、有効成分であるプロアントシアニジンの一部が、分解されたり異性化されたりするために、加熱（殺菌処理）前の松樹皮抽出物中のプロアントシアニジンと加熱（殺菌処理後）の松樹皮中のプロアントシアニジンとでは、その含量及び組成が異なることがある。本発明の茶飲料では、臨床上、有効量のプロアントシアニジンを含有することを特徴とする。プロアントシアニジンは、上記のとおり、飲料製造工程における殺菌処理等により分解されることがあるが、その含量は、式（Ｉ）
【００２２】
【化３】
【００２３】
で表されるプロアントシアニジン（procyanidin B1；ＰＢ１）と、式（ＩＩ）
【００２４】
【化４】
【００２５】
で表されるプロアントシアニジン（procyanidin B3；ＰＢ３）の合計量を指標とすることができる。本発明の血管内皮機能改善作用を有する茶飲料では、上記ＰＢ１及びＰＢ３の合計量を指標に、プロアントシアニジン又はそれを含有する植物抽出物の種類・添加量を選択及び調整するのが好ましい。
【００２６】
本発明は、ＰＢ１及びＰＢ３を指標として、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり、２．２ｍｇ以上、好ましくは２．８ｍｇ以上を含有する茶飲料を提供する。例えば、３５０ｍＬの容器にＰＢ１及びＰＢ３の合計含有量が２．２ｍｇ（好ましくは２．８ｍｇ）となるように製造された松樹皮抽出物配合茶飲料では、１日１本（３５０ｍＬ）という少量でありながら、血管内皮機能の改善作用を得ることができる。
【００２７】
このように、本発明は、プロアントシアニジンを茶飲料として摂取することで、少量でありながら明確な効果を奏するものである。本発明の茶飲料に配合されるプロアントシアニジンの上限は実質的に存在しないが、プロアントシアニジンの配合量とその効果の大きさに顕著な関連はない（図４、図６参照）ことから、経済性を考慮して臨床上有効な量を配合するようにすればよい。また、プロアントシアニジンとして松樹皮を用いた場合には、多量に配合すると香味的に渋みや癖を感じて飲みにくくなることからも多量の配合は好ましくなく、具体的にはＰＢ１及びＰＢ３の合計含有量を指標として、３０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは２０ｍｇ／Ｌ以下となるように配合するのがよい。
【００２８】
本発明の茶飲料中のＰＢ１及びＰＢ３含量は、例えば次のようにして測定することができる。まず茶飲料について、カラム等による前処理を行う。カラムとしては、ＳｈｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０等を例示できる。ＳｈｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０を充填し、水で膨潤したカラム茶飲料を負荷して水で洗浄した後、３５％エタノール及び７０％エタノールで溶出する。７０％エタノール溶出画分を減圧濃縮下で濃縮後、メスフラスコでフィルアップし、各溶出画分をＨＰＬＣに供す。
（ＨＰＬＣ条件）
・カラム：Cosmosil 5C18-MS-II、5μm、4.6mmφｘ150mm
・移動相：A-0.05%TFA/H2O、B-90%CH3CN/0.05%TFA/H2O、1ml/min
・グラジエントプログラム：9%Bアイソクラティク（15min）9%B→100% B（1min）100%Bアイソクラティク（10min）100%B→9%B（1min）で10min平衡化後、次の分析を開始
・検出：Ａ２２５ｎｍ
・インジェクション：１０μＬ
（茶飲料の製造方法）
本発明の茶飲料は、茶の抽出液にＰＢ１及びＰＢ３を含有するプロアントシアニジン、好ましくはプロアントシアニジンを含有する植物抽出物を添加して調製する。茶の抽出液は、原料茶葉を加温水にて抽出し、その茶抽出液から抽出残渣を取り除くことにより得られる。本発明でも用いる原料茶葉としては、煎茶、玉露、てん茶などの緑茶類、総称してウーロン茶と呼ばれる鉄管音、色種、黄金桂等の半発酵茶、紅茶と呼ばれるダージリン、アッサム、スリランカなどの発酵茶の他、包種茶、松葉茶、麦茶、その他ブレンド茶など特に限定されないが、中でも、緑茶類や包種茶が風味的な好ましさから好適に用いられる。また、茶葉の品種、産地、摘採時期、摘採方法、栽培方法などは何ら限定されず、どのような茶葉も対象とすることができ、例えば生茶葉等（葉や茎を含む）を原料茶葉とすることも可能である。抽出は、ニーダー等の抽出装置を用いた公知の方法で行うことができ、具体的には、原料茶葉に対して２０〜１００倍量、７０〜１００℃（好ましくは、７０〜９０℃）の抽出水で約１分〜２０分間、必要に応じて１回〜数回攪拌して、常圧又は加圧下で抽出を行えばよい。ここで、抽出に用いる抽出水は、純水（硬水、軟水、イオン交換水を含む）のほか、アスコルビン酸含有水溶液及びｐＨ調製水等を例示することができる。
【００２９】
原料茶葉の抽出によって得られた茶抽出液は、次に、その茶抽出液から濾過等により抽出残渣を取り除き、必要に応じ遠心分離等を行って微粉を除去する。遠心分離の条件（流速、回転数等）は、最終的に得られる茶飲料の清澄度等を考慮して、適宜選択すればよい。なお、遠心分離を行うには、抽出液を５〜４０℃程度に冷却するとよい。冷却して遠心分離することにより、最終的に得られる茶飲料の清澄度が高くなる。
【００３０】
本発明の茶飲料は、上記抽出残渣を除去した茶抽出液に、プロアントシアニジン又はそれを含有する植物抽出物を添加して混合溶解して製造する（調合工程）。本発明の茶飲料では、臨床上有効量のプロアントシアニジンを含有することを特徴とし、その含量は、ＰＢ１及びＰＢ３の合計含有量を指標として、６．４ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは８．１ｍｇ／Ｌである。殺菌処理によりプロアントシアニジンが分解あるいはエピ化（異性化）されることを考慮して調合工程では目標の含有量より多量のプロアントシアニジンを添加する。
【００３１】
また、本発明の茶飲料では、ｐＨ６．０前後に調整、濃度調整、味の調整等を目的に、必要に応じて、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等を加えてもよい。アスコルビン酸の添加は、茶飲料中の茶抽出成分の酸化を防ぐことができるだけでなく、アスコルビン酸が有する抗酸化作用が本発明のプロアントシアニジンと相加的又は相乗的に血管内皮機能改善作用を高めることが期待できる。
【００３２】
本発明の茶飲料は、容器詰飲料として好適に提供される。ここでいう容器詰飲料とは、ＰＥＴ容器、缶、瓶、紙容器等の容器に収容した飲料をいい、希釈せずに飲用できるものをいう。容器詰飲料は、通常、調合工程で得られた調合液を加熱殺菌処理した後、容器に充填して製造される。加熱殺菌処理は食品衛生法に定められた処理を行えばよく、例えば、缶飲料の場合には、ホットパックした後充填してレトルト殺菌（例えば、適宜加圧下（１．２ｍｍＨｇなど）、１２１℃で７分間加熱殺菌する。）を行い、プラスチックボトル飲料の場合には、ＵＨＴ殺菌（調合液を１２０〜１５０℃で１秒〜数十秒保持する。）を行うようにすればよい。
【００３３】
なお、本発明の茶飲料は、上記のとおり、茶葉を加温水にて抽出する抽出工程、茶抽出液から抽出残渣を取り除く工程、茶抽出液にプロアントシアニジン又はそれを含有する植物抽出物等を混合して調合液を調製する調合工程、その他適宜殺菌工程、容器充填工程を経て製造される。ただし、当該製造工程はあくまでも一例である。各工程の順序を入れ替えることも可能であるし、また各工程間に別の工程を挿入することも可能である。
（血管内皮機能改善作用）
血管内皮は、単に血管の内壁を覆う表層の組織であるだけでなく、血管の恒常性維持において重要な役割を担っている。血管内皮機能の評価には、血流依存性血管拡張反応測定法（flow mediated dilatation；ＦＭＤ）を用いることができる。ＦＭＤを実験的に求める方法として一般的に用いられているものは、プレティスモグラフィーによる反応充血時動脈血流量及び安静時基礎血流量の測定である。これは、安静時の基礎血流量を測定した後に、上腕を駆血し、駆血解放後の単位筋肉組織（１００ｍＬ）あたりの血流量（反応充血時動脈血流量）変化を測定するもので、評価項目としては、（１）駆血解放後の血流量のＡＵＣ（反応充血時動脈血流量／安静時動脈流入量比曲線下面積（AUC； area under the curve））、（２）駆血解放後の最大血流量、（３）駆血解放３０〜６０秒後の血流量等が挙げられる（J Pharmacol Sci. 2003;93:399-404）。本発明のプロアントシアニジン含有茶飲料は、持続的な摂取（１〜１２週間の継続摂取）により駆血解放後の血流量のＡＵＣが増加し、駆血解放後の最大血流量が増加し、駆血解放４５秒後の血流量が増加することから、優れた血管内皮機能改善作用を有するといえる。
【００３４】
また、血管内皮機能は血液検査によっても評価できる。血管の最も内側に存在する内皮細胞が一酸化窒素（ＮＯ）に代表される様々な生理活性物質を分泌することが知られている。したがって、この血管内皮機能と関連の深いＮＯ量を測定して血管内皮機能を評価できる。ＮＯの測定には、ＮＯが血管内皮細胞より分泌された後にすぐに酸化されることから、その代謝物であるＮＯ２−、ニトロソチオール、ＮＯｘなどが用いられている。継続摂取試験や疫学研究などには、ＮＯ２−とＮＯ３−の合計であるＮＯｘが用いられており、高血圧者や喫煙者において血中ＮＯｘ量が低下しているという報告もある。本発明のプロアントシアニジン含有茶飲料は、４〜１２週間の持続的な摂取により血中のＮＯｘが増加することから、ＮＯ依存的な血管内皮機能の改善作用を有するといえる。
【００３５】
上記のとおり、本発明の茶飲料は、血管内皮機能の改善作用を有するものである。したがって、血管内皮機能が低下した人（動脈硬化者及びその傾向者）に好適に用いることができるが、健常人が飲用してもその予防効果が期待される。なお、動脈血流増加比、すなわち反応充血時動脈血流量を安静時基礎血流量で除した値の最大値が、健常人の動脈血流増加比はおおむね４００以上であるのに対して、血管内皮機能が低下した人のそれは、０以上４００以下であるといわれる。本発明の主な対象者は、動脈血流増加比の最大値が０〜４００の人である。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
〔試験例１〕血管内皮機能改善作用（in vivo 評価）
１．プロアントシアニジン高含有画分（PF; procyanidin fraction）の調製
松樹皮抽出物（PBE; pine bark extract）として、フラバンジェノール（株式会社東洋新薬、Lot.T-0027）を用いた。この松樹皮抽出物から、分離・精製してプロシアニジン高含有画分（PF; procyanidin fraction）を調製した。すなわち、松樹皮抽出物７．５ｇを３０ｍｌの１０％ＥｔＯＨに溶解し、ＳｈｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０樹脂（アマシャムファルマシア株式会社）カラムに負荷し、３ＬのＨ２Ｏ、３Ｌの３５％ＥｔＯＨで順次溶出を行い、その後７０％ＥｔＯＨを１．５Ｌずつ、４フラクションに分画して７０％ＥｔＯＨ溶出の２〜４フラクションを合併し、減圧濃縮後凍結乾燥してプロシアニジン高含有画分（ＰＦ）を調製した。なお、ＬＨ−２０カラムは、１．５Ｌを５０％アセトンで洗浄後、水４．５Ｌで平衡化した後に使用した。
【００３７】
この松樹皮抽出物（ＰＢＥ）及びプロシアニジン高含有画分（ＰＦ）を各々０．１％または０．０８％含有するように餌に混合させ、被験サンプルを得た。
２．血管機能評価（動物試験）
Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）雄性ラットを日本チャールスリバー社より購入し、一定期間馴化させた後、２０〜２１週齢で実験に供した。動物は、空調設備のある飼育室（ＳＰＦ、温度；２３．５±１．０℃、湿度；５５±１０％、換気回数；１２−１５回／時間、照明；７：００−１９：００／日）で飼育した。馴化期間中は、市販飼料（ＣＥ−２，日本クレア株式会社）、及び水道水を自由摂取させた。
【００３８】
一晩絶食させたラット１６匹を３群に分け、水投与群（コントロール群；control）、松樹皮抽出物投与群（松樹皮抽出物群；PBE）、プロシアニジン高含有画分投与群（プロシアニジン高含有画分群；PF）とし、それぞれの被験サンプル溶液を５ｍｌ／ｋｇ強制経口投与した。松樹皮抽出物の投与量は乾燥物重量として１５０ｍｇ／ｋｇ、プロシアニジン高含有画分は乾燥重量として１２０ｍｇ／ｋｇとし、松樹皮抽出物群とプロシアニジン高含有画分群のプロシアニジン量は、ほぼ同等となるように、後述の樹皮抽出物の組成分析の項に示した分析値に基づいて算出し、設定した。
【００３９】
被験サンプル溶液投与１時間後に麻酔薬であるネンブタール０．８ｍｌ／ｋｇを腹腔内投与した後、３７℃に設定したヒーターマット（KN-210-5, 株式会社 夏目製作所）の上にて実験を行った（実験室の温度は２３℃前後に設定）。尾の基部にカフ（DC1.6, D.E.Hokanson,Inc）を装着し、カフから２〜４ｃｍ末端の部位にマーキュリーストレンゲージ（6.0 cm, D.E.Hokanson,Inc）を巻き、プレティスモグラフィー（EC6, D.E.Hokanson,Inc）を用いて、動脈流入量を計測した。安静時の動脈流入量を６回以上計測した後、尾基部に巻いたカフに３００ｍｍＨｇの圧力をかけて３分間駆血した。反応性充血後の動脈流入量を０秒後から２０秒間隔で１５回計測を行った。得られた測定結果を、非観血脈管解析システム（NIVP3, D.E.Hokanson, Inc）を用いて解析した。
【００４０】
安静時動脈流入量は、各群間で有意な差は認められなかった。反応性充血後の動脈流入量／安静時動脈流入量（TBF level; tail blood flow level）を算出し、ベースラインを０に補正した。その結果を図１に示す。松樹皮抽出物群（PBE）、プロシアニジン高含有画分群（ＰＦ）のいずれにおいても、コントロール群に比較して高値を示し、血管内皮機能改善作用があることが明らかとなった。また、反応性充血後０秒から１２０秒までの動脈流入量／安静時動脈流入量比曲線下面積（AUC； area under the curve）について検討した結果を、図２に示す。松樹皮抽出物群、プロシアニジン高含有画分群のいずれにおいても、コントロール群に比較して高値を示した。このことからも血管内皮機能改善作用があることが明らかとなった。
【００４１】
以上より、松樹皮抽出物の血管内皮機能改善作用の関与物質が、プロアントシアニジンであることが示唆された。
３．松樹皮抽出物の組成分析
動物試験で用いた松樹皮抽出物及びプロシアニジン高含有画分について、その組成分析を行った。具体的には、カテキン及びエピカテキン含量（Ｃ＋ＥＣ）、プロアントシアニジン含量（Ｐｒ）、フェニルプロパノイド含量（ＰＰ）、ジヒドロフラバノール含量（ＤＨＦ）及びその他の成分（ｏｔｈｅｒｓ）について測定した。それぞれの分析方法は以下のとおり。
１．Ｃ＋ＥＣ
松樹皮抽出物２ｍｇを１０ｍＬの１０％エタノールに溶解し、０．４５μｍのフィルターで濾過の後、下記条件のＨＰＬＣ（島津製作所 LC-10Aシステム /SPD-10Avp検出器）に供した。ＨＰＬＣ測定結果から、サンプル中のカテキン類を(+)-catechin及び(-)-epicatechinの５０μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬの１０％エタノール溶液で作成した検量線を用いて定量した。定量にはＡ２２５ｎｍの面積値を用いた。本条件で(+)-catechinおよび(-)-epicatechinの溶出時間は８．１ｍｉｎおよび９．５ｍｉｎであった。
【００４２】
（ＨＰＬＣ条件）
・カラム：Cosmosil 5C18-MS-II、5μm、4.6mmφｘ150mm （ナカライテスク株式会社）
・移動相：A-0.05%TFA/H2O、B-90%CH3CN/0.05%TFA/H2O、1ml/min
・グラジエントプログラム：9%Bアイソクラティク（15min）9%B→100% B（1min）100%Bアイソクラティク（10min）100%B→9%B（1min）で10min平衡化後、次の分析を開始した。
【００４３】
・検出：Ａ２２５ｎｍ
・インジェクション：１０μＬ
２．Ｐｒ
松樹皮抽出物１ｍｇを１ｍＬの０．６Ｎ−ＨＣｌ／ブタノールにガラス試験管内で溶解し、９０℃の水浴中で２時間静置した。また反応終了液は０．４５μｍのフィルターで濾過し、以下の条件のＨＰＬＣに供し、anthocyanidinの定量を行った。定量のための標準物質には、cyanidin（フナコシ株式会社より購入）を用いた。なお、Cyanidinは５．５分に溶出し、λｍａｘは５２５ｎｍであることから、これと一致する成分をcyanidinとして定量した。ＯＰＣの標準物質としては、procyanidinB1（フナコシ株式会社）を０．５ｍｇ／ｍＬで同様の反応を行い生成したcyanidin量を比較しＰｒ含有量を求めた。
【００４４】
（ＨＰＬＣ条件）
・カラム：YMC-ODS-A312, 6 mmφ x 150 mm
・移動相：CH3COOH : MeOH : H2O=15 : 17.5 : 67.5
・検出：Ａ５２０ｎｍ （PDAは400〜600nmを測定）
３．ＰＰ
松樹皮抽出物を０．５ｍｇ／ｍＬとなるように酵素液（０．５ｍｇ／ｍＬのセルラーゼＲＳ（ヤクルト株式会社）を含む０．０６Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液）に溶解し、４０℃で１．５時間インキュベートし、０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮで２倍希釈し、０．４５μｍのフィルターで濾過して、以下の条件のＨＰＬＣに供した。定量のための標準物質には、フェルラ酸（ナカライテスク株式会社より購入）を用いた。なお、フェルラ酸は７．５分に溶出し、λｍａｘは３２７ｎｍであることから、これと一致する成分をフェルラ酸として定量した。また、同ＨＰＬＣで求めたｐ−クマル酸及びカフェ酸を合算して、ＰＰ含量とした。
【００４５】
（ＨＰＬＣ条件）
・カラム：Shim-pack FC-ODS, 4.6mm ｘ 150mm
・移動相：A:0.1%TFA/H2O、B:0.1%TFA/90%CH3CN、0.6ml/min
・グラジエント：B20%→B70%（10min）、B70%iso（5min）
・検出：Photodiodearrey検出器（島津製作所 SPD-M10A）、Ａ３３０ｎｍ
・インジェクション：１０μＬ
４．ＤＨＦ
ＨＰＬＣの検出をＡ２８０ｎｍとする以外は、上記ＰＰと同様にしてHPLCを行い、ジヒドロケルセチンを定量した。定量のための標準物質には、ジヒドロケルセチン（フナコシ株式会社より購入）を用いた。なお、ジヒドロケルセチンは７．２分に溶出し、λｍａｘは２８６ｎｍであることから、これと一致する成分をジヒドロケルセチンとして定量した。また、同ＨＰＬＣで求めたジヒドロケンフェロール及びジヒドロミリセチンを合算して、ＤＨＦ含量とした。
【００４６】
表１に分析結果を示す。動物試験の結果及び分析結果より、血管内皮機能の改善作用は、プロアントシアニジンが関与していることが示唆された。
【００４７】
【表１】
【００４８】
なお、ＰＢＥのプロアントシアニジン中のＰＢ１、ＰＢ３及びその合計量は、それぞれ３９．３ｍｇ／ｇ、１９．７ｍｇ／ｇ、５９ｍｇ／ｇであり、ＰＦのプロアントシアニジン中のＰＢ１及びＰＢ３は、１０２．９ｍｇ／ｇ、５８．７ｍｇ／ｇ、１６１．６ｍｇであった（測定方法は、実施例１と同じ）。
〔実施例１〕ヒト被験者に対するプロアントシアニジン配合茶飲料の
血管内皮機能改善作用−１
１．プロアントシアニジン配合茶飲料の製造
緑茶及び包種茶の混合茶葉８kｇに約８０℃の温水３００Ｌを加えて５分間抽出した後、３０℃以下になるまで冷却し、遠心分離により茶葉を除去して茶抽出液を得た。この茶抽出液に、表２に示す処方で、松樹皮抽出物及びL−アスコルビン酸を混合して溶解させた後、炭酸水素ナトリウムを添加してｐＨを６．０に調整し調合液を得た。次いでこの調合液について脱気処理、殺菌処理（殺菌条件：１３５℃、３０秒）を行い、３５０ｍＬペットボトル容器に充填（約８０℃）して冷却し、対照（Ｐ）及び３種の被験飲料（Ｑ，Ｒ，Ｓ）、計４種の試験飲料を得た。なお、試験飲料間（Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ）では、官能面（香味）、外観、性状において識別がつかないことを確認している。
【００４９】
【表２】
【００５０】
２．ＰＢ１及びＰＢ３含量の測定
４種の試験飲料（Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ）について、procyanidin B1（ＰＢ１）及びprocyanidin B3（ＰＢ３）量を以下の方法により測定した。
【００５１】
まず、４種の試験飲料（Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ）について、ＳｈｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０による前処理を行った。乾燥重量０．２５ｇのＬＨ−２０（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を充填し、水で膨潤したカラムに試験飲料５ｍＬを負荷し、２ｍＬの水で洗浄した後、３５％ＥｔＯＨ ２ｍＬ、７０％ＥｔＯＨ ４ｍＬで溶出した。７０％ＥｔＯＨ溶出画分を減圧下で濃縮後２ｍＬのメスフラスコでフィルアップし、０．４５μｍのフィルターで濾過し、各種試験溶液を得た。
【００５２】
下記の条件でＨＰＬＣに供し、ＰＢ１の定量を行った。定性は、試験溶液を標準品と同一条件下でＨＰＬＣ分析を行い、ＰＢ１標準品の溶出保持時間（６．３分）と一致するピークおよび溶出時間７．５分のプロシアニジンＢ３（ＰＢ３）と一致するピークをそれぞれＰＢ１、ＰＢ３として同定しプロシアニジン類として合算した。定量試験は、ＰＢ１と同定された溶出ピークについてのピーク面積を測定し、ＰＢ１標準品のピーク面積に基づいて作成した検量線から試験溶液中のＰＢ１類含量を算出した。検量線は、ＰＢ１標準品を１０％エタノール溶液に溶解し、２、５、１０μｇ／ｍＬに調製したものを各濃度の標準溶液とし（用時調製）、各標準溶液について、下記ＨＰＬＣ条件にて操作を行い、横軸にＰＢ１の濃度を、縦軸にピーク面積をとり、作成した。
（ＨＰＬＣ条件）
・カラム ：Cosmosil 5C18-MS-II（4.6Φ×150 mm、ナカライテスク製）
・移動相 ：（Ａ液） アセトニトリル−水（8:92）0.05%トリフルオロ酢酸
（Ｂ液） アセトニトリル−水（50:50）0.05%トリフルオロ酢酸
・流速 ：１．０ ｍｌ／ｍｉｎ
・温度 ：４０℃
・検出 ：紫外部吸収 ２２５ ｎｍ
・注入量 ：１０ μＬ
・グラジエントプログラム：表３参照
【００５３】
【表３】
【００５４】
表４に測定結果を示す。なお、被験飲料Ｑにおいて殺菌処理を行わない場合には、ＰＢ１及びＰＢ３はそれぞれ１．８４、３．２９ｍｇ／Ｌであり、合計で５．１３ｍｇ／Ｌであった。
【００５５】
【表４】
【００５６】
３．プレティスモグラフィーによる血管内皮機能評価
倫理的配慮により試験開始前に試験参加に同意が得られた２０歳以上６５歳以下の健常な成人男女２１名で、２週間前の予備検査時に空腹時血糖が１１０〜１３９ｍｇ／ｄＬの男性、または血圧が収縮期血圧１３０〜１５９ｍｍＨｇまたは拡張期血圧８５〜９９ｍｍＨｇの男性、または閉経後女性のいずれか該当する人を、被験者として選定した。被験者をｎ＝４〜６の無作為の４群に分け、二重盲検法による１週間摂取のクロスオーバー法を採用した。すなわち、４群の被験者に、１日１本（３５０ｍＬ）ずつ１週間飲用させる試験を４種の試験飲料（Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ）それぞれについて行った。
【００５７】
血管内皮機能は、被験者の反応充血時動脈血流量と安静時基礎血流量をプレティスモグラフィー（Plethymograph EC6、Primetech Co.）を用いて測定した。安静時基礎血流量は、被験者が３０分間仰臥位となり安静となった後、利き腕と対側の腕にカフ３つとストレインゲージを巻いた１５分後からの前腕動脈血流量を測定した。測定は７回以上行い、その測定結果から５回のトリム平均を算出した。反応充血時動脈血流量は、安静時基礎血流量測定後に、上腕に巻いたカフに収縮期血圧より５０ｍｍＨｇ以上高い圧をかけて、５分間駆血した後に解放した際の解放後の前腕動脈血流量を０秒後より１５秒間隔で測定した。
【００５８】
図３及び図４に、動脈血流増加比（％ＦＢＦ）、すなわち反応充血時動脈血流量を安静時基礎血流量で除した値の経時的変化を示す。また、表５に、安静時基礎血流量（安静時前腕動脈血流量）（Ａ）、反応充血時動脈血流量（駆血解放後の最大前腕動脈血流量）（Ｂ）の測定結果、及びこれらの測定結果より算出される、動脈血流増加比（％ＦＢＦ）、すなわち反応充血時動脈血流量を安静時基礎血流量で除した値（Ｂ／Ａ）の算出結果を示す。
【００５９】
安静時基礎血流量（Ａ）は、摂取前及び摂取後のいずれの被験飲料（Ｑ，Ｒ，Ｓ）摂取群も対照（P）摂取群と比較して有意な差異を認めなかったが、反応充血時動脈血流量（駆血解放後の最大前腕動脈血流量＝駆血解放０秒後の血流量）（Ｂ）及び動脈血流増加比（Ｂ／Ａ）は、松樹皮抽出物８０ｍｇ添加の被験飲料（Ｒ）摂取群及び松樹皮抽出物１６０ｍｇ添加の被験飲料（Ｓ）摂取群において、対照（Ｐ）摂取群と比較して有意に高い値となった。なお、今回、被験者として用いた健常人では、動脈血流増加比（Ｂ／Ａ）の最大値が１９０．１〜１４３６．２であったことから、血管内皮機能の低下した人も含まれていたと思われる。被験者の動脈血流増加比は、被験飲料（Ｑ，Ｒ，Ｓ）の継続摂取の結果、２３５.４〜２２００.３となった。
【００６０】
【表５】
【００６１】
また、駆血解放４５秒後の血流量Ｃについても解析した。表６に、駆血解放４５秒後の血流量Ｃ及びこれより算出される動脈血流増加比（Ｃ／Ａ）の結果を示す（安静時基礎血流量Ａは表５の値を採用した）。駆血解放４５秒後の血流量（Ｃ）及び動脈血流増加比（Ｃ／Ａ）は、いずれの被験飲料（Ｑ，Ｒ，Ｓ）摂取群も対照（Ｐ）摂取群と比較して高い値となり、特に、松樹皮抽出物８０ｍｇ添加の被験飲料（Ｒ）摂取群及び松樹皮抽出物１６０ｍｇ添加の被験飲料（Ｓ）摂取群において、対照（Ｐ）摂取群と比較して高い値となった。
【００６２】
【表６】
【００６３】
さらに、駆血解放直後から駆血解放６０秒後までの％ＦＢＦ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。表７にその結果を示す。ＡＵＣは、松樹皮抽出物８０ｍｇ添加の被験飲料（Ｒ）摂取群及び松樹皮抽出物１６０ｍｇ添加の被験飲料（Ｓ）摂取群において、対照（Ｐ）摂取群と比較して高い値となった。
【００６４】
【表７】
【００６５】
以上の結果から、松樹皮抽出物４０ｍｇ以上添加した茶飲料の一週間継続摂取により、血管内皮機能の改善が示唆され、特に、松樹皮抽出物８０ｍｇ以上を添加した茶飲料、すなわちＰＢ１及びＰＢ３を８．１０ｍｇ／Ｌ以上の濃度で含有する茶飲料において、優れた血管内皮機能改善作用があることが確認された。
〔実施例２〕ヒト被験者に対するプロアントシアニジン配合茶飲料の血管内皮機能改善
作用−２
１．プロアントシアニジン配合茶飲料の製造
実施例１と同様にして、茶抽出液を調製し、これに表８に示す処方で、松樹皮抽出物及びL−アスコルビン酸を混合して溶解させた後、炭酸水素ナトリウムを添加してｐＨを６．０に調整した。次いで、実施例１と同様にして脱気処理、殺菌処理を行った後、３５０ｍＬペットボトル容器に充填し、対照（Ｌ）及び２種の被験飲料（Ｍ、Ｎ）の計３種の試験飲料を得た。なお、Ｌ，Ｍ，Ｎでは、官能面（香味）、外観、性状において識別がつかないことを確認している。
【００６６】
【表８】
【００６７】
２．ＰＢ１及びＰＢ３含量の測定
対照（Ｌ）及び被験飲料（Ｍ，Ｎ）について、実施例１と同様の方法にて、procyanidin B1（ＰＢ１）及びprocyanidin B3（ＰＢ３）量を測定した。表９に測定結果を示す。
【００６８】
【表９】
【００６９】
３．プレティスモグラフィーによる血管内皮機能評価
倫理的配慮により試験開始前に試験参加に同意が得られた２０歳以上６５歳以下の健常な成人男女６７名で、２週間前の予備検査時に空腹時血糖が１１０〜１３９ｍｇ／ｄＬ、収縮期血圧１３０〜１５９ｍｍＨｇまたは拡張期血圧８５〜９９ｍｍＨｇ、更年期症状を有する女性（Kupperman指数が21以上）、のいずれかに該当する人を、被験者として選定した。被験者をｎ＝２２又は２３の３群に分け、二重盲検法による１２週間摂取の３群並行群間比較試験を行った。すなわち、３群の被験者に、対照（Ｌ）又は被験飲料（Ｍ，Ｎ）のいずれかを１日１本（３５０ｍＬ）ずつ１２週間飲用させる試験である。
【００７０】
血管内皮機能は、実施例１と同様に、プレティスモグラフィー（Plethymograph EC6、Primetech Co.）を用いて行った。ただし、血管内皮機能の測定は、摂取４週間前（前観察）、摂取直前（０週間）、摂取４，８，１２週間後及び摂取終了４週後（後観察）の計６回実施した。
【００７１】
なお、今回、被験者として用いた健常人では、動脈血流増加比（Ｂ／Ａ）の初期値が１６６.０〜１２６５．６であり、血管内皮機能が低下した人が含まれていたと思われる。被験者の動脈血流増加比は、被験飲料（Ｍ，Ｎ））の継続摂取の結果、２６１．９〜１４１７.５であった。
【００７２】
図５及び図６に、試験飲料摂取直前及び摂取１２週間後における、動脈血流増加比（％ＦＢＦ）、すなわち反応充血時動脈血流量（前腕動脈血流量）を安静時基礎血流量で除した値の経時的変化を示す。摂取１２週間後では、駆血解放０〜９０秒後のいずれにおいても、被験飲料（Ｍ，Ｎ）摂取群で対照（Ｌ）摂取群と比較して高い値となった。
【００７３】
表１０に、安静時基礎血流量（安静時前腕動脈血流量）に対する駆血解放４５秒後の血流量Ｃの動脈血流増加比（Ｃ／Ａ）（％ＦＢＦ）の推移を示す（上段：実測値、下段：摂取直前からの変化量（Δ値））。動脈血流増加比（Ｃ／Ａ）は、いずれの被験飲料（Ｍ，Ｎ）摂取群も対照（Ｌ）摂取群と比較して高い値となった。被験飲料（Ｍ，Ｎ）摂取群の効果は、Δ値において対照（Ｌ）摂取群と比較して大きな差異があることからも明らかである。
【００７４】
【表１０】
【００７５】
表１１に、駆血解放直後から駆血解放６０秒後までの％ＦＢＦ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）の推移を示す（上段：実測値、下段：摂取直前からの変化量（Δ値））。ＡＵＣは、４週間以上の摂取において、いずれの被験飲料（Ｍ，Ｎ）摂取群も対照（Ｌ）摂取群と比較して高い値となった。被験飲料（Ｍ，Ｎ）摂取群の効果は、Δ値において対照（Ｌ）摂取群と比較して大きな差異があることからも明らかである。
【００７６】
【表１１】
【００７７】
以上の結果から、松樹皮抽出物６０ｍｇ以上を添加した茶飲料、すなわちＰＢ１及びＰＢ３を６．３９ｍｇ／Ｌ以上の合計濃度で含有する茶飲料の継続摂取により、血流量が増加することが示唆された。特に、図６に示されるように、松樹皮抽出物６０ｍｇ以上を添加した茶飲料の継続摂取により、最大前腕動脈血流量だけでなく、駆血解放９０秒後までの血流量が増加することは、血管内皮機能が大きく改善されたことを示唆していると考える。
４．血液生化学検査による血管内皮機能評価
血液検査を、摂取４週間前（前観察）、摂取直前（０週間）、摂取４，８，１２週間後及び摂取終了４週後（後観察）に実施し、血中ＮＯｘ濃度（ＮＯ２− とＮＯ３− の合計）を分析した。また、摂取直前及び摂取１２週間後における尿中８−ＯＨｄＧ濃度を測定した。
【００７８】
表１２に、血中ＮＯｘの濃度推移（μＭ）を示す。対照（Ｌ）摂取群では、試験飲料による変動はみられなかったが、被験飲料（Ｍ，Ｎ）摂取群では、いずれも摂取直前と比較してＮＯｘが増加し、その増加は摂取期間に応じて大きくなった。特に、松樹皮抽出物を８０ｍｇ添加した茶飲料（Ｎ）摂取群では、対照（Ｌ）摂取群と比較して有意に高い値となった。この結果より、松樹皮抽出物６０ｍｇ以上を添加した茶飲料、すなわちＰＢ１及びＰＢ３を６．３９ｍｇ／Ｌ以上の合計濃度で含有する茶飲料の継続摂取により、ＮＯ依存的な血管内皮機能の改善が示唆された。
【００７９】
【表１２】
【００８０】
表１３に、尿中８−ＯＨｄＧ濃度（ｍｇ／ｍＬ）の推移を示す。いずれの被験飲料（Ｌ，Ｍ，Ｎ）摂取群においても、飲料の１２週間摂取により尿中の８−ＯＨｄＧ濃度が低くなったが、特に、松樹皮抽出物を８０ｍｇ添加した茶飲料（Ｎ）摂取群において、摂取直前と比較して有意に低値となった。このことから、茶飲料の継続摂取により酸化ストレス障害が低減されること、特に、松樹皮抽出物を８０ｍｇ添加した茶飲料、すなわちＰＢ１及びＰＢ３を８．１ｍｇ／Ｌ以上の合計濃度で含有する茶飲料の継続摂取により酸化ストレス障害が低減されることが明らかとなった。
【００８１】
【表１３】
【００８２】
〔実施例３〕官能評価試験−１
緑茶８kgを８０℃の熱水３００Ｌに入れ、同温度で5分間抽出を行った。得られた抽出液を冷却後、遠心分離し、清澄な上清を採取してこれを緑茶抽出物とした。この抽出液に重曹を０．６ｋｇ、ビタミンＣを０．４ｋｇ配合し、さらに熱水で抽出された松樹皮抽出物（フラバンジェノール、株式会社東洋新薬Lot.T-0030）を、最終組成物（３５０ｍＬ）中に０、４０、６０、８０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００ｍｇ含まれるように添加して、純水で最終容量が１０００Ｌになるように調整した。これをフラバンジェノール配合緑茶飲料として、製造後まもなくモニター８名（男性３名、女性５名）に試飲してもらって香味評価を行った。上記８名のモニターによって好ましい順位をつけてもらい、下記評価基準にてポイントとして算出した。また、試験飲料中に含まれるＰＢ１及びＰＢ３を実施例１に準じて定量した。
【００８３】
官能評価結果を表１４に、ＰＢ１及びＰＢ３の測定結果を表１５示す。３５０ｍＬあたりの松樹皮含有量が０〜２００ｍｇまで、好ましくは０〜１２５ｍｇまでの茶飲料、すなわちＰＢ１及びＰＢ３の合計量が３０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは２０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で含有する茶飲料が、渋みが少なく、また癖がなく、飲みやすい茶飲料であるという結果であった。
（評価基準） 最も好ましい： 5点
好ましい： 4点
普通： 3点
あまり好ましくない： 2点
好ましくない： 1点
【００８４】
【表１４】
【００８５】
【表１５】
【００８６】
〔実施例４〕官能評価試験−２
緑茶８ｋｇを８０℃の熱水３００Ｌに入れ、同温度で５分間抽出を行った。得られた抽出液を冷却後、遠心分離し、清澄な上清を採取してこれを緑茶抽出物とした。この抽出液に重曹を０．６ｋｇ、ビタミンＣを０．４ｋｇ配合し、さらに最終組成物（３５０ｍＬ）中に熱水抽出タイプの松樹皮抽出物「フラバンジェノール」（株式会社東洋新薬Lot.T-0030；Ｔ−２７）を８０ｍｇ、または含水エタノール抽出タイプの松樹皮抽出物「ピクノジェノール」（日本シーベルヘグナー株式会社製Lot.Ｆ-830；Ｆ８３０）を８０ｍｇ含まれるように添加して、純水で最終容量が１０００Ｌになるように調整した。これを製造後まもなくモニター８名（男性３名、女性５名）に試飲してもらって香味評価を行った。評価項目は、実施例３と同様である。また、試験例１と同様にして、松樹皮抽出物中の組成分析を行った。なお、組成分析は、比較として含水エタノール抽出タイプの松樹皮抽出物「フラバンジェノール」（株式会社東洋新薬Lot.P-0015；Ｐ−１５）についても実施した。
【００８７】
官能評価結果を表１６に、組成分析結果を表１７に、ＰＰ中のフェルラ酸及びＤＨＦ中のジヒドロケルセチン濃度を表１８に示す。表１６より明らかなように、熱水抽出タイプの松樹皮抽出物配合茶飲料が、含水エタノール抽出タイプの松樹皮抽出物配合茶飲料に比べ、渋みが少なく、また癖がなく、飲みやすいという結果であった。表１７より、熱水抽出物は、含水エタノール抽出物と比較して、ＰＰやＤＨＦが極めて少ないことが判明した。表１８より、フェルラ酸及びジヒドロケルセチンの合計量を指標として、１０μｇ／ｍｇ、好ましくは５μｇ／ｍｇである松樹皮抽出物を用いるのが好ましいといえる。
（評価基準） 最も好ましい： 5点
好ましい： 4点
普通： 3点
あまり好ましくない： 2点
好ましくない： 1点
【００８８】
【表１６】
【００８９】
【表１７】
【００９０】
【表１８】
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明の被験飲料の投与によるラットの反応性充血後の動脈流入量／安静時動脈流入量（TBF level; tail blood flow level）の経時変化を示すグラフである。なお、グラフ中、PBEは松樹皮抽出物群、ＰＦはプロシアニジン高含有画分群である。
【図２】本発明の被験飲料の投与によるラットの反応性充血後０秒から１２０秒までの動脈流入量／安静時動脈流入量比曲線下面積（AUC； area under the curve）を示すグラフである。
【図３】本発明の試験飲料の摂取によるヒトの動脈血流増加比（％ＦＢＦ）、すなわち反応充血時動脈血流量を安静時基礎血流量で除した値（Ｂ／Ａ）の経時的変化を示すグラフである。
【図４】本発明の試験飲料の摂取によるヒトの動脈血流増加比（％ＦＢＦ）、すなわち反応充血時動脈血流量を安静時基礎血流量で除した値（Ｂ／Ａ）の経時的変化を示すグラフである。
【図５】本発明の試験飲料摂取直前及び摂取１２週間後における、ヒトの安静時に対する駆血解放後の前腕動脈血流量（ＦＢＦ）の比（％ＦＢＦ）の測定結果を示すグラフである。
【図６】本発明の試験飲料摂取直前及び摂取１２週間後における、ヒトの安静時に対する駆血解放後の前腕動脈血流量（ＦＢＦ）の比（％ＦＢＦ）の測定結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
臨床上有効量のプロアントシアニジンを含有する食品の提供、特に、効率的かつ持続的に摂取可能な血管内皮機能改善作用を有する茶飲料を提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活やライフスタイルの変化に伴って生活習慣病が増加している。生活習慣病とは、高血圧症、高脂血症、糖尿病などの疾患に加え、狭心症、心筋梗塞、脳循環障害、悪性腫瘍など生活習慣を改善することによって発病を予防することができると考えられる疾患の総称である。高血圧症、高脂血症、糖尿病などは重複して発症することが多く、合併した場合は互いにその病態を増悪させ、動脈硬化などの続発症を高率に引き起こして予後を悪化させることになる。
【０００３】
最近、こういった悪循環の要因の一つに血管の内皮機能の低下が関与していることがわかってきた（非特許文献１参照）。血管内皮機能低下のリスクファクターとして、高血圧、耐糖能異常、高脂血症、閉経後女性、喫煙などが挙げられるが、血管病変の終末的な状態である動脈硬化をきたす前に、その端緒である血管内皮機能低下を発見し、予防することが、生活習慣病を予防する上で非常に重要であると考えられる。特に、慢性的な無症候な病態である血管病変に対しては、長く安全に摂取できる食品による予防がより重要であると考えられ、そのような効果を奏する食品の開発が期待されている。
【０００４】
一方、ポリフェノールの摂取量が多いほど、循環器疾患の発症が少ないことが明らかにされており、最近の研究では、ココア、チョコレート、ブドウ、ワインなどの主要なポリフェノールとしてプロシアニジンを豊富に含む食品やその素材には、ヒトにおいて血管内皮機能の改善効果が報告されている（非特許文献２〜４参照）。また、このプロシアニジンを含む松樹皮抽出物を含有するカプセル剤の経口投与による血管内皮機能の改善効果も確認されている（非特許文献５，６参照）。
【非特許文献１】Verma S, Anderson TJ, Circulation 2002;105:546-549
【非特許文献２】Stein JH, Circulation 1999;100:1050-5
【非特許文献３】Chou EJ, Am J Cardiol 2001;88:553-5
【非特許文献４】Agewall S, Eur Heart J 2000;21:74-8
【非特許文献５】Shand B, Phytother Res 2003;17:490-4
【非特許文献６】Young JM, Free Radic Res 2006;40:85-94
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記非特許文献５（Shand B, Phytother Res 2003;17:490-4）には、松樹皮抽出物としてエンゾジノールを使用し、これを１２週間継続摂取させることにより最大前腕血流が増加する、すなわち血管内皮機能改善作用があることが記載されている。また、上記非特許文献６（Young JM, Free Radic Res 2006;40:85-94）には、松樹皮抽出物としてエンゾジノールを使用し、これを１２週間継続摂取させることにより血管径が増大することが記載されている。上記文献のいずれも固形の経口摂取用組成物（カプセル剤）が用いられ、しかも４８０ｍｇ／ｄａｙという比較的大量の松樹皮抽出物を摂取しなければならず、毎日の摂取には不都合を生じることもあった。一般に、固形の経口摂取用組成物では摂取する際に手間がかかり、摂取するという義務化した感覚になってしまうこと、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等、固形の経口摂取用組成物の形態が医薬品の形態に近いことから、医薬品を摂取しているような感覚になってしまうこと等の理由から、持続的に摂取可能な形態としては、食事中や休憩中に気軽に摂取できる飲料の形態が適しているとの指摘がある。このことからも、上記した固形状の松樹皮抽出物の大量摂取が持続的な摂取に適当でないといえる。
【０００６】
また、上記文献に示される効果は血液生化学検査に反映されるほどのものではなく、明確な有効性が認められるまでには至っていなかった。
【０００７】
本発明の課題は、持続的に摂取可能で、かつ血管内皮細胞からのＮＯの分泌を促進してNOの作用を増強する等により血管内皮機能を改善する明確な効果を有する飲料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、オリゴメリックプロアントシアニジンに分析方法を確立し、松樹皮抽出物中のプロアントシアニジンの定量的測定を可能にした（特開２００６−３８７６３号）。そして、本分析方法により、熱安定性を有するといわれているプロアントシアニジンが、殺菌処理により一部が分解及び／又は異性化されて低減することが判明した。この知見から、単に松樹皮抽出物を配合しただけでは、臨床上有効な血流改善組成物が得られないとの考えのもと、本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、procyanidin B1（ＰＢ１）及びprocyanidin B3（ＰＢ３）の合計量がプロアントシアニジン含量の指標となることを見出した。そして、このＰＢ１及びＰＢ３の合計量が、６．４ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは８．１ｍｇ／Ｌ以上であるプロアントシアニジン含有茶飲料を一日あたり３５０ｍＬずつ１〜１２週間継続摂取することにより血管内皮機能が顕著に改善されることがわかった。また、官能評価から、ＰＢ１及びＰＢ３の合計量が、３０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは２０ｍｇ／Ｌ以下であるプロアントシアニジン含有茶飲料が好ましいこと、また、熱水で抽出した松樹皮抽出物がエタノールで抽出した松樹皮抽出物と比べてフェルラ酸等のフェニルプロパノイド及びジヒドロケルセチン等のジヒドロフラバノール含量が少なく、香味面において極めて好ましいことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
１． 式（Ｉ）
【００１０】
【化１】
【００１１】
で表されるプロアントシアニジン（procyanidin B1；ＰＢ１）と、式（ＩＩ）
【００１２】
【化２】
【００１３】
で表されるプロアントシアニジン（procyanidin B3；ＰＢ３）とを含有し、その合計量が６．４ｍｇ／Ｌ以上であるプロアントシアニジン含有茶飲料。
２． 前記ＰＢ１及びＰＢ３が、松樹皮抽出物中に含有された形で添加されたものである、上記１に記載の茶飲料。
３． 前記松樹皮抽出物が、松樹皮の熱水抽出物である、上記２に記載の茶飲料。
４． 茶の抽出液にプロアントシアニジンを配合して調合液を調製する調合工程、前記調合液を殺菌処理する殺菌工程、殺菌された調合液を容器に充填する充填工程を経て得られる、容器詰めされた上記１〜３のいずれかに記載の茶飲料。
５． 血管内皮機能の改善作用を有する、上記１〜４のいずれかに記載の茶飲料。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、プロアントシアニジン（procyanidin B1；ＰＢ１）とプロアントシアニジン（procyanidin B3；ＰＢ３）の合計量を有効成分の指標とし、前記ＰＢ１及びＰＢ３の合計量が６．４ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは８．１ｍｇ／Ｌ以上含有する茶飲料を提供する。この茶飲料を、一日あたり３５０ｍＬ摂取するだけで、ＮＯの産生増強等により血管内皮機能を改善することができ、動脈硬化等の循環器疾患を予防することができる。
【発明を実施するための好ましい形態】
【００１５】
（プロアントシアニジン）
本発明の茶飲料は、プロアントシアニジン、特に松樹皮由来のプロアントシアニジンを有効成分として含有する。松樹皮由来のプロアントシアニジンは、松樹皮を５０〜１２０℃、好ましくは７０〜１００℃の熱水又は食品の製造に許容される溶媒（エタノール等）あるいはその水溶液で抽出して得ることができる（以下、前者を「水抽出物」、後者のエタノール又はエタノール水溶液による抽出物を「エタノール抽出物」と表記することもある）。原料となる松樹皮としては、松樹皮抽出物の原料となる松樹皮としては、フランス海岸松（Pinus Martima）、カラマツ、クロマツ、アカマツ、ヒメコマツ、ゴヨウマツ、チョウセンマツ、ハイマツ、リュウキュウマツ、ウツクシマツ、ダイオウマツ、シロマツ、カナダのケベック地方のアネダ等の樹皮等が好ましく用いられるが、中でも、フランス海岸松の樹皮が好ましい。ここで、フランス海岸松は、南仏の大西洋沿岸の一部に生育している海洋性松をいう。
【００１６】
このフランス海岸松の樹皮は、カテキン、プロアントシアニジン及び有機酸等の成分を含有する。抽出溶媒により得られる抽出物の組成は異なり、例えば、松樹皮中に含まれるフェルラ酸等のフェニルプロパノイド（ＰＰ）は、水抽出物ではほとんど含有されないが、エタノール抽出物には約１０％程度含有される。また、ジヒドロケルセチン等のジヒドロフラバノール（ＤＨＦ）も、水抽出物にはほとんど含有されないが、エタノール抽出物には、数％程度含有される。フェルラ酸やジヒドロケルセチンは優れた抗酸化剤として知られ、フェルラ酸については脳血管保護作用（第１４回日本循環薬理学会要旨集プログラムＡ５，２００４）や、血管内皮機能改善作用（特開２００３−２６１４４４号参照）が報告されている。したがって、エタノール抽出物を用いれば、プロアントシアニジンとフェルラ酸及び／又はジヒドロケルセチンとの相加的又は相乗的な血管内皮機能の改善効果が期待されるが、上記ＰＰやＤＨＦは香味面に影響を及ぼすことがあり、特に本発明のような飲料では、香味が持続的摂取のための重要な因子であることから、その影響は無視できない。官能検査において、エタノール抽出物と比較して水抽出物を添加した茶飲料が、良好な風味であると判断されたことから、本発明の茶飲料においては、水抽出物を用いることが好ましい。具体的には、フェルラ酸とジヒドロケルセチンを指標として、その含量の合計が、１０μｇ／ｍｇ以下、好ましくは５μｇ／ｍｇ以下となるような抽出物を用いることが好ましい。
【００１７】
松樹皮抽出物中のフェルラ酸及びジヒドロケルセチン含量は、例えば次のようにＨＰＬＣ等を用いて分析することができる。松樹皮抽出物をｐＨ４から５の緩衝液に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、β―グルコシダーゼ（セルラーゼＲＳ，エムルシンなど）を加え４０℃で１〜６時間インキュベートしアグリコンを作る。このアグリコンを含む反応溶液に同量のアセトニトリル（０．１から１％のＴＦＡを含む）を加え酵素反応を止めると同時に、アグリコンを溶解させる。この溶液を逆相のＨＰＬＣで分析することにより定量が可能である。
【００１８】
（ＨＰＬＣ条件）
・カラム：Shim-pack FC-ODS, 4.6mm ｘ 150mm
・移動相：A:0.1%TFA/H2O、B:0.1%TFA/90%CH3CN、0.6ml/min
・グラジエント：B20%→B70%（10min）、B70%iso（5min）
・検出：Photodiodearrey検出器（島津製作所 SPD-M10A）、Ａ３３０ｎｍ
・インジェクション：１０μＬ
ＨＰＬＣはこれ以外にも逆相系であればＯＤＳ、Ｃ３０などの担体が使用可能である。
【００１９】
松樹皮からの抽出方法に特に制限はなく、例えば、加温抽出法、超臨界流体抽出法、液体二酸化炭素回分法、液体二酸化炭素還流法、超臨界二酸化炭素還流法などの公知の方法を単独で又は複数の抽出方法を組み合わせて用いることができる。
【００２０】
本発明では、松樹皮に抽出溶媒（熱水、エタノール、含水エタノール等）を加えた抽出後、濾過して得られる濾液、又はその精製品を抽出液として用いることもできるし、この抽出液を凍結乾燥等により粉末化したものを用いることもできる。また、松樹皮抽出物として市販されているフラバンジェノール（株式会社東洋新薬）、ピクノジェノール（シーベルヘグナー株式会社）等を用いてもよく、中でも、上記理由から水抽出タイプのフラバンジェノールを好適に用いることができる。
【００２１】
本発明におけるプロアントシアニジンとは、フラバン−３−オール及び／又はフラバン−３，４−ジオールを構成単位とする重合度が２以上の縮重合体からなる化合物群をいう。松樹皮中のプロアントシアニジンとしては、ＰＢ１、ＰＢ３、ＰＢ６などの２量体及びプロシアニジンＣ２（Ｃ−Ｃ−Ｃ）の３量体などが知られている。ブドウ種子より抽出されたプロアントシアニジンが熱に対して安定であることが知られている（特許第２６９４７４８号）が、本発明の茶飲料、特に加熱殺菌され容器に収容して販売される茶飲料では、１２０℃を超える温度で殺菌処理されることから、有効成分であるプロアントシアニジンの一部が、分解されたり異性化されたりするために、加熱（殺菌処理）前の松樹皮抽出物中のプロアントシアニジンと加熱（殺菌処理後）の松樹皮中のプロアントシアニジンとでは、その含量及び組成が異なることがある。本発明の茶飲料では、臨床上、有効量のプロアントシアニジンを含有することを特徴とする。プロアントシアニジンは、上記のとおり、飲料製造工程における殺菌処理等により分解されることがあるが、その含量は、式（Ｉ）
【００２２】
【化３】
【００２３】
で表されるプロアントシアニジン（procyanidin B1；ＰＢ１）と、式（ＩＩ）
【００２４】
【化４】
【００２５】
で表されるプロアントシアニジン（procyanidin B3；ＰＢ３）の合計量を指標とすることができる。本発明の血管内皮機能改善作用を有する茶飲料では、上記ＰＢ１及びＰＢ３の合計量を指標に、プロアントシアニジン又はそれを含有する植物抽出物の種類・添加量を選択及び調整するのが好ましい。
【００２６】
本発明は、ＰＢ１及びＰＢ３を指標として、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり、２．２ｍｇ以上、好ましくは２．８ｍｇ以上を含有する茶飲料を提供する。例えば、３５０ｍＬの容器にＰＢ１及びＰＢ３の合計含有量が２．２ｍｇ（好ましくは２．８ｍｇ）となるように製造された松樹皮抽出物配合茶飲料では、１日１本（３５０ｍＬ）という少量でありながら、血管内皮機能の改善作用を得ることができる。
【００２７】
このように、本発明は、プロアントシアニジンを茶飲料として摂取することで、少量でありながら明確な効果を奏するものである。本発明の茶飲料に配合されるプロアントシアニジンの上限は実質的に存在しないが、プロアントシアニジンの配合量とその効果の大きさに顕著な関連はない（図４、図６参照）ことから、経済性を考慮して臨床上有効な量を配合するようにすればよい。また、プロアントシアニジンとして松樹皮を用いた場合には、多量に配合すると香味的に渋みや癖を感じて飲みにくくなることからも多量の配合は好ましくなく、具体的にはＰＢ１及びＰＢ３の合計含有量を指標として、３０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは２０ｍｇ／Ｌ以下となるように配合するのがよい。
【００２８】
本発明の茶飲料中のＰＢ１及びＰＢ３含量は、例えば次のようにして測定することができる。まず茶飲料について、カラム等による前処理を行う。カラムとしては、ＳｈｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０等を例示できる。ＳｈｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０を充填し、水で膨潤したカラム茶飲料を負荷して水で洗浄した後、３５％エタノール及び７０％エタノールで溶出する。７０％エタノール溶出画分を減圧濃縮下で濃縮後、メスフラスコでフィルアップし、各溶出画分をＨＰＬＣに供す。
（ＨＰＬＣ条件）
・カラム：Cosmosil 5C18-MS-II、5μm、4.6mmφｘ150mm
・移動相：A-0.05%TFA/H2O、B-90%CH3CN/0.05%TFA/H2O、1ml/min
・グラジエントプログラム：9%Bアイソクラティク（15min）9%B→100% B（1min）100%Bアイソクラティク（10min）100%B→9%B（1min）で10min平衡化後、次の分析を開始
・検出：Ａ２２５ｎｍ
・インジェクション：１０μＬ
（茶飲料の製造方法）
本発明の茶飲料は、茶の抽出液にＰＢ１及びＰＢ３を含有するプロアントシアニジン、好ましくはプロアントシアニジンを含有する植物抽出物を添加して調製する。茶の抽出液は、原料茶葉を加温水にて抽出し、その茶抽出液から抽出残渣を取り除くことにより得られる。本発明でも用いる原料茶葉としては、煎茶、玉露、てん茶などの緑茶類、総称してウーロン茶と呼ばれる鉄管音、色種、黄金桂等の半発酵茶、紅茶と呼ばれるダージリン、アッサム、スリランカなどの発酵茶の他、包種茶、松葉茶、麦茶、その他ブレンド茶など特に限定されないが、中でも、緑茶類や包種茶が風味的な好ましさから好適に用いられる。また、茶葉の品種、産地、摘採時期、摘採方法、栽培方法などは何ら限定されず、どのような茶葉も対象とすることができ、例えば生茶葉等（葉や茎を含む）を原料茶葉とすることも可能である。抽出は、ニーダー等の抽出装置を用いた公知の方法で行うことができ、具体的には、原料茶葉に対して２０〜１００倍量、７０〜１００℃（好ましくは、７０〜９０℃）の抽出水で約１分〜２０分間、必要に応じて１回〜数回攪拌して、常圧又は加圧下で抽出を行えばよい。ここで、抽出に用いる抽出水は、純水（硬水、軟水、イオン交換水を含む）のほか、アスコルビン酸含有水溶液及びｐＨ調製水等を例示することができる。
【００２９】
原料茶葉の抽出によって得られた茶抽出液は、次に、その茶抽出液から濾過等により抽出残渣を取り除き、必要に応じ遠心分離等を行って微粉を除去する。遠心分離の条件（流速、回転数等）は、最終的に得られる茶飲料の清澄度等を考慮して、適宜選択すればよい。なお、遠心分離を行うには、抽出液を５〜４０℃程度に冷却するとよい。冷却して遠心分離することにより、最終的に得られる茶飲料の清澄度が高くなる。
【００３０】
本発明の茶飲料は、上記抽出残渣を除去した茶抽出液に、プロアントシアニジン又はそれを含有する植物抽出物を添加して混合溶解して製造する（調合工程）。本発明の茶飲料では、臨床上有効量のプロアントシアニジンを含有することを特徴とし、その含量は、ＰＢ１及びＰＢ３の合計含有量を指標として、６．４ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは８．１ｍｇ／Ｌである。殺菌処理によりプロアントシアニジンが分解あるいはエピ化（異性化）されることを考慮して調合工程では目標の含有量より多量のプロアントシアニジンを添加する。
【００３１】
また、本発明の茶飲料では、ｐＨ６．０前後に調整、濃度調整、味の調整等を目的に、必要に応じて、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等を加えてもよい。アスコルビン酸の添加は、茶飲料中の茶抽出成分の酸化を防ぐことができるだけでなく、アスコルビン酸が有する抗酸化作用が本発明のプロアントシアニジンと相加的又は相乗的に血管内皮機能改善作用を高めることが期待できる。
【００３２】
本発明の茶飲料は、容器詰飲料として好適に提供される。ここでいう容器詰飲料とは、ＰＥＴ容器、缶、瓶、紙容器等の容器に収容した飲料をいい、希釈せずに飲用できるものをいう。容器詰飲料は、通常、調合工程で得られた調合液を加熱殺菌処理した後、容器に充填して製造される。加熱殺菌処理は食品衛生法に定められた処理を行えばよく、例えば、缶飲料の場合には、ホットパックした後充填してレトルト殺菌（例えば、適宜加圧下（１．２ｍｍＨｇなど）、１２１℃で７分間加熱殺菌する。）を行い、プラスチックボトル飲料の場合には、ＵＨＴ殺菌（調合液を１２０〜１５０℃で１秒〜数十秒保持する。）を行うようにすればよい。
【００３３】
なお、本発明の茶飲料は、上記のとおり、茶葉を加温水にて抽出する抽出工程、茶抽出液から抽出残渣を取り除く工程、茶抽出液にプロアントシアニジン又はそれを含有する植物抽出物等を混合して調合液を調製する調合工程、その他適宜殺菌工程、容器充填工程を経て製造される。ただし、当該製造工程はあくまでも一例である。各工程の順序を入れ替えることも可能であるし、また各工程間に別の工程を挿入することも可能である。
（血管内皮機能改善作用）
血管内皮は、単に血管の内壁を覆う表層の組織であるだけでなく、血管の恒常性維持において重要な役割を担っている。血管内皮機能の評価には、血流依存性血管拡張反応測定法（flow mediated dilatation；ＦＭＤ）を用いることができる。ＦＭＤを実験的に求める方法として一般的に用いられているものは、プレティスモグラフィーによる反応充血時動脈血流量及び安静時基礎血流量の測定である。これは、安静時の基礎血流量を測定した後に、上腕を駆血し、駆血解放後の単位筋肉組織（１００ｍＬ）あたりの血流量（反応充血時動脈血流量）変化を測定するもので、評価項目としては、（１）駆血解放後の血流量のＡＵＣ（反応充血時動脈血流量／安静時動脈流入量比曲線下面積（AUC； area under the curve））、（２）駆血解放後の最大血流量、（３）駆血解放３０〜６０秒後の血流量等が挙げられる（J Pharmacol Sci. 2003;93:399-404）。本発明のプロアントシアニジン含有茶飲料は、持続的な摂取（１〜１２週間の継続摂取）により駆血解放後の血流量のＡＵＣが増加し、駆血解放後の最大血流量が増加し、駆血解放４５秒後の血流量が増加することから、優れた血管内皮機能改善作用を有するといえる。
【００３４】
また、血管内皮機能は血液検査によっても評価できる。血管の最も内側に存在する内皮細胞が一酸化窒素（ＮＯ）に代表される様々な生理活性物質を分泌することが知られている。したがって、この血管内皮機能と関連の深いＮＯ量を測定して血管内皮機能を評価できる。ＮＯの測定には、ＮＯが血管内皮細胞より分泌された後にすぐに酸化されることから、その代謝物であるＮＯ２−、ニトロソチオール、ＮＯｘなどが用いられている。継続摂取試験や疫学研究などには、ＮＯ２−とＮＯ３−の合計であるＮＯｘが用いられており、高血圧者や喫煙者において血中ＮＯｘ量が低下しているという報告もある。本発明のプロアントシアニジン含有茶飲料は、４〜１２週間の持続的な摂取により血中のＮＯｘが増加することから、ＮＯ依存的な血管内皮機能の改善作用を有するといえる。
【００３５】
上記のとおり、本発明の茶飲料は、血管内皮機能の改善作用を有するものである。したがって、血管内皮機能が低下した人（動脈硬化者及びその傾向者）に好適に用いることができるが、健常人が飲用してもその予防効果が期待される。なお、動脈血流増加比、すなわち反応充血時動脈血流量を安静時基礎血流量で除した値の最大値が、健常人の動脈血流増加比はおおむね４００以上であるのに対して、血管内皮機能が低下した人のそれは、０以上４００以下であるといわれる。本発明の主な対象者は、動脈血流増加比の最大値が０〜４００の人である。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
〔試験例１〕血管内皮機能改善作用（in vivo 評価）
１．プロアントシアニジン高含有画分（PF; procyanidin fraction）の調製
松樹皮抽出物（PBE; pine bark extract）として、フラバンジェノール（株式会社東洋新薬、Lot.T-0027）を用いた。この松樹皮抽出物から、分離・精製してプロシアニジン高含有画分（PF; procyanidin fraction）を調製した。すなわち、松樹皮抽出物７．５ｇを３０ｍｌの１０％ＥｔＯＨに溶解し、ＳｈｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０樹脂（アマシャムファルマシア株式会社）カラムに負荷し、３ＬのＨ２Ｏ、３Ｌの３５％ＥｔＯＨで順次溶出を行い、その後７０％ＥｔＯＨを１．５Ｌずつ、４フラクションに分画して７０％ＥｔＯＨ溶出の２〜４フラクションを合併し、減圧濃縮後凍結乾燥してプロシアニジン高含有画分（ＰＦ）を調製した。なお、ＬＨ−２０カラムは、１．５Ｌを５０％アセトンで洗浄後、水４．５Ｌで平衡化した後に使用した。
【００３７】
この松樹皮抽出物（ＰＢＥ）及びプロシアニジン高含有画分（ＰＦ）を各々０．１％または０．０８％含有するように餌に混合させ、被験サンプルを得た。
２．血管機能評価（動物試験）
Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）雄性ラットを日本チャールスリバー社より購入し、一定期間馴化させた後、２０〜２１週齢で実験に供した。動物は、空調設備のある飼育室（ＳＰＦ、温度；２３．５±１．０℃、湿度；５５±１０％、換気回数；１２−１５回／時間、照明；７：００−１９：００／日）で飼育した。馴化期間中は、市販飼料（ＣＥ−２，日本クレア株式会社）、及び水道水を自由摂取させた。
【００３８】
一晩絶食させたラット１６匹を３群に分け、水投与群（コントロール群；control）、松樹皮抽出物投与群（松樹皮抽出物群；PBE）、プロシアニジン高含有画分投与群（プロシアニジン高含有画分群；PF）とし、それぞれの被験サンプル溶液を５ｍｌ／ｋｇ強制経口投与した。松樹皮抽出物の投与量は乾燥物重量として１５０ｍｇ／ｋｇ、プロシアニジン高含有画分は乾燥重量として１２０ｍｇ／ｋｇとし、松樹皮抽出物群とプロシアニジン高含有画分群のプロシアニジン量は、ほぼ同等となるように、後述の樹皮抽出物の組成分析の項に示した分析値に基づいて算出し、設定した。
【００３９】
被験サンプル溶液投与１時間後に麻酔薬であるネンブタール０．８ｍｌ／ｋｇを腹腔内投与した後、３７℃に設定したヒーターマット（KN-210-5, 株式会社 夏目製作所）の上にて実験を行った（実験室の温度は２３℃前後に設定）。尾の基部にカフ（DC1.6, D.E.Hokanson,Inc）を装着し、カフから２〜４ｃｍ末端の部位にマーキュリーストレンゲージ（6.0 cm, D.E.Hokanson,Inc）を巻き、プレティスモグラフィー（EC6, D.E.Hokanson,Inc）を用いて、動脈流入量を計測した。安静時の動脈流入量を６回以上計測した後、尾基部に巻いたカフに３００ｍｍＨｇの圧力をかけて３分間駆血した。反応性充血後の動脈流入量を０秒後から２０秒間隔で１５回計測を行った。得られた測定結果を、非観血脈管解析システム（NIVP3, D.E.Hokanson, Inc）を用いて解析した。
【００４０】
安静時動脈流入量は、各群間で有意な差は認められなかった。反応性充血後の動脈流入量／安静時動脈流入量（TBF level; tail blood flow level）を算出し、ベースラインを０に補正した。その結果を図１に示す。松樹皮抽出物群（PBE）、プロシアニジン高含有画分群（ＰＦ）のいずれにおいても、コントロール群に比較して高値を示し、血管内皮機能改善作用があることが明らかとなった。また、反応性充血後０秒から１２０秒までの動脈流入量／安静時動脈流入量比曲線下面積（AUC； area under the curve）について検討した結果を、図２に示す。松樹皮抽出物群、プロシアニジン高含有画分群のいずれにおいても、コントロール群に比較して高値を示した。このことからも血管内皮機能改善作用があることが明らかとなった。
【００４１】
以上より、松樹皮抽出物の血管内皮機能改善作用の関与物質が、プロアントシアニジンであることが示唆された。
３．松樹皮抽出物の組成分析
動物試験で用いた松樹皮抽出物及びプロシアニジン高含有画分について、その組成分析を行った。具体的には、カテキン及びエピカテキン含量（Ｃ＋ＥＣ）、プロアントシアニジン含量（Ｐｒ）、フェニルプロパノイド含量（ＰＰ）、ジヒドロフラバノール含量（ＤＨＦ）及びその他の成分（ｏｔｈｅｒｓ）について測定した。それぞれの分析方法は以下のとおり。
１．Ｃ＋ＥＣ
松樹皮抽出物２ｍｇを１０ｍＬの１０％エタノールに溶解し、０．４５μｍのフィルターで濾過の後、下記条件のＨＰＬＣ（島津製作所 LC-10Aシステム /SPD-10Avp検出器）に供した。ＨＰＬＣ測定結果から、サンプル中のカテキン類を(+)-catechin及び(-)-epicatechinの５０μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬの１０％エタノール溶液で作成した検量線を用いて定量した。定量にはＡ２２５ｎｍの面積値を用いた。本条件で(+)-catechinおよび(-)-epicatechinの溶出時間は８．１ｍｉｎおよび９．５ｍｉｎであった。
【００４２】
（ＨＰＬＣ条件）
・カラム：Cosmosil 5C18-MS-II、5μm、4.6mmφｘ150mm （ナカライテスク株式会社）
・移動相：A-0.05%TFA/H2O、B-90%CH3CN/0.05%TFA/H2O、1ml/min
・グラジエントプログラム：9%Bアイソクラティク（15min）9%B→100% B（1min）100%Bアイソクラティク（10min）100%B→9%B（1min）で10min平衡化後、次の分析を開始した。
【００４３】
・検出：Ａ２２５ｎｍ
・インジェクション：１０μＬ
２．Ｐｒ
松樹皮抽出物１ｍｇを１ｍＬの０．６Ｎ−ＨＣｌ／ブタノールにガラス試験管内で溶解し、９０℃の水浴中で２時間静置した。また反応終了液は０．４５μｍのフィルターで濾過し、以下の条件のＨＰＬＣに供し、anthocyanidinの定量を行った。定量のための標準物質には、cyanidin（フナコシ株式会社より購入）を用いた。なお、Cyanidinは５．５分に溶出し、λｍａｘは５２５ｎｍであることから、これと一致する成分をcyanidinとして定量した。ＯＰＣの標準物質としては、procyanidinB1（フナコシ株式会社）を０．５ｍｇ／ｍＬで同様の反応を行い生成したcyanidin量を比較しＰｒ含有量を求めた。
【００４４】
（ＨＰＬＣ条件）
・カラム：YMC-ODS-A312, 6 mmφ x 150 mm
・移動相：CH3COOH : MeOH : H2O=15 : 17.5 : 67.5
・検出：Ａ５２０ｎｍ （PDAは400〜600nmを測定）
３．ＰＰ
松樹皮抽出物を０．５ｍｇ／ｍＬとなるように酵素液（０．５ｍｇ／ｍＬのセルラーゼＲＳ（ヤクルト株式会社）を含む０．０６Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液）に溶解し、４０℃で１．５時間インキュベートし、０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮで２倍希釈し、０．４５μｍのフィルターで濾過して、以下の条件のＨＰＬＣに供した。定量のための標準物質には、フェルラ酸（ナカライテスク株式会社より購入）を用いた。なお、フェルラ酸は７．５分に溶出し、λｍａｘは３２７ｎｍであることから、これと一致する成分をフェルラ酸として定量した。また、同ＨＰＬＣで求めたｐ−クマル酸及びカフェ酸を合算して、ＰＰ含量とした。
【００４５】
（ＨＰＬＣ条件）
・カラム：Shim-pack FC-ODS, 4.6mm ｘ 150mm
・移動相：A:0.1%TFA/H2O、B:0.1%TFA/90%CH3CN、0.6ml/min
・グラジエント：B20%→B70%（10min）、B70%iso（5min）
・検出：Photodiodearrey検出器（島津製作所 SPD-M10A）、Ａ３３０ｎｍ
・インジェクション：１０μＬ
４．ＤＨＦ
ＨＰＬＣの検出をＡ２８０ｎｍとする以外は、上記ＰＰと同様にしてHPLCを行い、ジヒドロケルセチンを定量した。定量のための標準物質には、ジヒドロケルセチン（フナコシ株式会社より購入）を用いた。なお、ジヒドロケルセチンは７．２分に溶出し、λｍａｘは２８６ｎｍであることから、これと一致する成分をジヒドロケルセチンとして定量した。また、同ＨＰＬＣで求めたジヒドロケンフェロール及びジヒドロミリセチンを合算して、ＤＨＦ含量とした。
【００４６】
表１に分析結果を示す。動物試験の結果及び分析結果より、血管内皮機能の改善作用は、プロアントシアニジンが関与していることが示唆された。
【００４７】
【表１】
【００４８】
なお、ＰＢＥのプロアントシアニジン中のＰＢ１、ＰＢ３及びその合計量は、それぞれ３９．３ｍｇ／ｇ、１９．７ｍｇ／ｇ、５９ｍｇ／ｇであり、ＰＦのプロアントシアニジン中のＰＢ１及びＰＢ３は、１０２．９ｍｇ／ｇ、５８．７ｍｇ／ｇ、１６１．６ｍｇであった（測定方法は、実施例１と同じ）。
〔実施例１〕ヒト被験者に対するプロアントシアニジン配合茶飲料の
血管内皮機能改善作用−１
１．プロアントシアニジン配合茶飲料の製造
緑茶及び包種茶の混合茶葉８kｇに約８０℃の温水３００Ｌを加えて５分間抽出した後、３０℃以下になるまで冷却し、遠心分離により茶葉を除去して茶抽出液を得た。この茶抽出液に、表２に示す処方で、松樹皮抽出物及びL−アスコルビン酸を混合して溶解させた後、炭酸水素ナトリウムを添加してｐＨを６．０に調整し調合液を得た。次いでこの調合液について脱気処理、殺菌処理（殺菌条件：１３５℃、３０秒）を行い、３５０ｍＬペットボトル容器に充填（約８０℃）して冷却し、対照（Ｐ）及び３種の被験飲料（Ｑ，Ｒ，Ｓ）、計４種の試験飲料を得た。なお、試験飲料間（Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ）では、官能面（香味）、外観、性状において識別がつかないことを確認している。
【００４９】
【表２】
【００５０】
２．ＰＢ１及びＰＢ３含量の測定
４種の試験飲料（Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ）について、procyanidin B1（ＰＢ１）及びprocyanidin B3（ＰＢ３）量を以下の方法により測定した。
【００５１】
まず、４種の試験飲料（Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ）について、ＳｈｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０による前処理を行った。乾燥重量０．２５ｇのＬＨ−２０（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を充填し、水で膨潤したカラムに試験飲料５ｍＬを負荷し、２ｍＬの水で洗浄した後、３５％ＥｔＯＨ ２ｍＬ、７０％ＥｔＯＨ ４ｍＬで溶出した。７０％ＥｔＯＨ溶出画分を減圧下で濃縮後２ｍＬのメスフラスコでフィルアップし、０．４５μｍのフィルターで濾過し、各種試験溶液を得た。
【００５２】
下記の条件でＨＰＬＣに供し、ＰＢ１の定量を行った。定性は、試験溶液を標準品と同一条件下でＨＰＬＣ分析を行い、ＰＢ１標準品の溶出保持時間（６．３分）と一致するピークおよび溶出時間７．５分のプロシアニジンＢ３（ＰＢ３）と一致するピークをそれぞれＰＢ１、ＰＢ３として同定しプロシアニジン類として合算した。定量試験は、ＰＢ１と同定された溶出ピークについてのピーク面積を測定し、ＰＢ１標準品のピーク面積に基づいて作成した検量線から試験溶液中のＰＢ１類含量を算出した。検量線は、ＰＢ１標準品を１０％エタノール溶液に溶解し、２、５、１０μｇ／ｍＬに調製したものを各濃度の標準溶液とし（用時調製）、各標準溶液について、下記ＨＰＬＣ条件にて操作を行い、横軸にＰＢ１の濃度を、縦軸にピーク面積をとり、作成した。
（ＨＰＬＣ条件）
・カラム ：Cosmosil 5C18-MS-II（4.6Φ×150 mm、ナカライテスク製）
・移動相 ：（Ａ液） アセトニトリル−水（8:92）0.05%トリフルオロ酢酸
（Ｂ液） アセトニトリル−水（50:50）0.05%トリフルオロ酢酸
・流速 ：１．０ ｍｌ／ｍｉｎ
・温度 ：４０℃
・検出 ：紫外部吸収 ２２５ ｎｍ
・注入量 ：１０ μＬ
・グラジエントプログラム：表３参照
【００５３】
【表３】
【００５４】
表４に測定結果を示す。なお、被験飲料Ｑにおいて殺菌処理を行わない場合には、ＰＢ１及びＰＢ３はそれぞれ１．８４、３．２９ｍｇ／Ｌであり、合計で５．１３ｍｇ／Ｌであった。
【００５５】
【表４】
【００５６】
３．プレティスモグラフィーによる血管内皮機能評価
倫理的配慮により試験開始前に試験参加に同意が得られた２０歳以上６５歳以下の健常な成人男女２１名で、２週間前の予備検査時に空腹時血糖が１１０〜１３９ｍｇ／ｄＬの男性、または血圧が収縮期血圧１３０〜１５９ｍｍＨｇまたは拡張期血圧８５〜９９ｍｍＨｇの男性、または閉経後女性のいずれか該当する人を、被験者として選定した。被験者をｎ＝４〜６の無作為の４群に分け、二重盲検法による１週間摂取のクロスオーバー法を採用した。すなわち、４群の被験者に、１日１本（３５０ｍＬ）ずつ１週間飲用させる試験を４種の試験飲料（Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ）それぞれについて行った。
【００５７】
血管内皮機能は、被験者の反応充血時動脈血流量と安静時基礎血流量をプレティスモグラフィー（Plethymograph EC6、Primetech Co.）を用いて測定した。安静時基礎血流量は、被験者が３０分間仰臥位となり安静となった後、利き腕と対側の腕にカフ３つとストレインゲージを巻いた１５分後からの前腕動脈血流量を測定した。測定は７回以上行い、その測定結果から５回のトリム平均を算出した。反応充血時動脈血流量は、安静時基礎血流量測定後に、上腕に巻いたカフに収縮期血圧より５０ｍｍＨｇ以上高い圧をかけて、５分間駆血した後に解放した際の解放後の前腕動脈血流量を０秒後より１５秒間隔で測定した。
【００５８】
図３及び図４に、動脈血流増加比（％ＦＢＦ）、すなわち反応充血時動脈血流量を安静時基礎血流量で除した値の経時的変化を示す。また、表５に、安静時基礎血流量（安静時前腕動脈血流量）（Ａ）、反応充血時動脈血流量（駆血解放後の最大前腕動脈血流量）（Ｂ）の測定結果、及びこれらの測定結果より算出される、動脈血流増加比（％ＦＢＦ）、すなわち反応充血時動脈血流量を安静時基礎血流量で除した値（Ｂ／Ａ）の算出結果を示す。
【００５９】
安静時基礎血流量（Ａ）は、摂取前及び摂取後のいずれの被験飲料（Ｑ，Ｒ，Ｓ）摂取群も対照（P）摂取群と比較して有意な差異を認めなかったが、反応充血時動脈血流量（駆血解放後の最大前腕動脈血流量＝駆血解放０秒後の血流量）（Ｂ）及び動脈血流増加比（Ｂ／Ａ）は、松樹皮抽出物８０ｍｇ添加の被験飲料（Ｒ）摂取群及び松樹皮抽出物１６０ｍｇ添加の被験飲料（Ｓ）摂取群において、対照（Ｐ）摂取群と比較して有意に高い値となった。なお、今回、被験者として用いた健常人では、動脈血流増加比（Ｂ／Ａ）の最大値が１９０．１〜１４３６．２であったことから、血管内皮機能の低下した人も含まれていたと思われる。被験者の動脈血流増加比は、被験飲料（Ｑ，Ｒ，Ｓ）の継続摂取の結果、２３５.４〜２２００.３となった。
【００６０】
【表５】
【００６１】
また、駆血解放４５秒後の血流量Ｃについても解析した。表６に、駆血解放４５秒後の血流量Ｃ及びこれより算出される動脈血流増加比（Ｃ／Ａ）の結果を示す（安静時基礎血流量Ａは表５の値を採用した）。駆血解放４５秒後の血流量（Ｃ）及び動脈血流増加比（Ｃ／Ａ）は、いずれの被験飲料（Ｑ，Ｒ，Ｓ）摂取群も対照（Ｐ）摂取群と比較して高い値となり、特に、松樹皮抽出物８０ｍｇ添加の被験飲料（Ｒ）摂取群及び松樹皮抽出物１６０ｍｇ添加の被験飲料（Ｓ）摂取群において、対照（Ｐ）摂取群と比較して高い値となった。
【００６２】
【表６】
【００６３】
さらに、駆血解放直後から駆血解放６０秒後までの％ＦＢＦ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。表７にその結果を示す。ＡＵＣは、松樹皮抽出物８０ｍｇ添加の被験飲料（Ｒ）摂取群及び松樹皮抽出物１６０ｍｇ添加の被験飲料（Ｓ）摂取群において、対照（Ｐ）摂取群と比較して高い値となった。
【００６４】
【表７】
【００６５】
以上の結果から、松樹皮抽出物４０ｍｇ以上添加した茶飲料の一週間継続摂取により、血管内皮機能の改善が示唆され、特に、松樹皮抽出物８０ｍｇ以上を添加した茶飲料、すなわちＰＢ１及びＰＢ３を８．１０ｍｇ／Ｌ以上の濃度で含有する茶飲料において、優れた血管内皮機能改善作用があることが確認された。
〔実施例２〕ヒト被験者に対するプロアントシアニジン配合茶飲料の血管内皮機能改善
作用−２
１．プロアントシアニジン配合茶飲料の製造
実施例１と同様にして、茶抽出液を調製し、これに表８に示す処方で、松樹皮抽出物及びL−アスコルビン酸を混合して溶解させた後、炭酸水素ナトリウムを添加してｐＨを６．０に調整した。次いで、実施例１と同様にして脱気処理、殺菌処理を行った後、３５０ｍＬペットボトル容器に充填し、対照（Ｌ）及び２種の被験飲料（Ｍ、Ｎ）の計３種の試験飲料を得た。なお、Ｌ，Ｍ，Ｎでは、官能面（香味）、外観、性状において識別がつかないことを確認している。
【００６６】
【表８】
【００６７】
２．ＰＢ１及びＰＢ３含量の測定
対照（Ｌ）及び被験飲料（Ｍ，Ｎ）について、実施例１と同様の方法にて、procyanidin B1（ＰＢ１）及びprocyanidin B3（ＰＢ３）量を測定した。表９に測定結果を示す。
【００６８】
【表９】
【００６９】
３．プレティスモグラフィーによる血管内皮機能評価
倫理的配慮により試験開始前に試験参加に同意が得られた２０歳以上６５歳以下の健常な成人男女６７名で、２週間前の予備検査時に空腹時血糖が１１０〜１３９ｍｇ／ｄＬ、収縮期血圧１３０〜１５９ｍｍＨｇまたは拡張期血圧８５〜９９ｍｍＨｇ、更年期症状を有する女性（Kupperman指数が21以上）、のいずれかに該当する人を、被験者として選定した。被験者をｎ＝２２又は２３の３群に分け、二重盲検法による１２週間摂取の３群並行群間比較試験を行った。すなわち、３群の被験者に、対照（Ｌ）又は被験飲料（Ｍ，Ｎ）のいずれかを１日１本（３５０ｍＬ）ずつ１２週間飲用させる試験である。
【００７０】
血管内皮機能は、実施例１と同様に、プレティスモグラフィー（Plethymograph EC6、Primetech Co.）を用いて行った。ただし、血管内皮機能の測定は、摂取４週間前（前観察）、摂取直前（０週間）、摂取４，８，１２週間後及び摂取終了４週後（後観察）の計６回実施した。
【００７１】
なお、今回、被験者として用いた健常人では、動脈血流増加比（Ｂ／Ａ）の初期値が１６６.０〜１２６５．６であり、血管内皮機能が低下した人が含まれていたと思われる。被験者の動脈血流増加比は、被験飲料（Ｍ，Ｎ））の継続摂取の結果、２６１．９〜１４１７.５であった。
【００７２】
図５及び図６に、試験飲料摂取直前及び摂取１２週間後における、動脈血流増加比（％ＦＢＦ）、すなわち反応充血時動脈血流量（前腕動脈血流量）を安静時基礎血流量で除した値の経時的変化を示す。摂取１２週間後では、駆血解放０〜９０秒後のいずれにおいても、被験飲料（Ｍ，Ｎ）摂取群で対照（Ｌ）摂取群と比較して高い値となった。
【００７３】
表１０に、安静時基礎血流量（安静時前腕動脈血流量）に対する駆血解放４５秒後の血流量Ｃの動脈血流増加比（Ｃ／Ａ）（％ＦＢＦ）の推移を示す（上段：実測値、下段：摂取直前からの変化量（Δ値））。動脈血流増加比（Ｃ／Ａ）は、いずれの被験飲料（Ｍ，Ｎ）摂取群も対照（Ｌ）摂取群と比較して高い値となった。被験飲料（Ｍ，Ｎ）摂取群の効果は、Δ値において対照（Ｌ）摂取群と比較して大きな差異があることからも明らかである。
【００７４】
【表１０】
【００７５】
表１１に、駆血解放直後から駆血解放６０秒後までの％ＦＢＦ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）の推移を示す（上段：実測値、下段：摂取直前からの変化量（Δ値））。ＡＵＣは、４週間以上の摂取において、いずれの被験飲料（Ｍ，Ｎ）摂取群も対照（Ｌ）摂取群と比較して高い値となった。被験飲料（Ｍ，Ｎ）摂取群の効果は、Δ値において対照（Ｌ）摂取群と比較して大きな差異があることからも明らかである。
【００７６】
【表１１】
【００７７】
以上の結果から、松樹皮抽出物６０ｍｇ以上を添加した茶飲料、すなわちＰＢ１及びＰＢ３を６．３９ｍｇ／Ｌ以上の合計濃度で含有する茶飲料の継続摂取により、血流量が増加することが示唆された。特に、図６に示されるように、松樹皮抽出物６０ｍｇ以上を添加した茶飲料の継続摂取により、最大前腕動脈血流量だけでなく、駆血解放９０秒後までの血流量が増加することは、血管内皮機能が大きく改善されたことを示唆していると考える。
４．血液生化学検査による血管内皮機能評価
血液検査を、摂取４週間前（前観察）、摂取直前（０週間）、摂取４，８，１２週間後及び摂取終了４週後（後観察）に実施し、血中ＮＯｘ濃度（ＮＯ２− とＮＯ３− の合計）を分析した。また、摂取直前及び摂取１２週間後における尿中８−ＯＨｄＧ濃度を測定した。
【００７８】
表１２に、血中ＮＯｘの濃度推移（μＭ）を示す。対照（Ｌ）摂取群では、試験飲料による変動はみられなかったが、被験飲料（Ｍ，Ｎ）摂取群では、いずれも摂取直前と比較してＮＯｘが増加し、その増加は摂取期間に応じて大きくなった。特に、松樹皮抽出物を８０ｍｇ添加した茶飲料（Ｎ）摂取群では、対照（Ｌ）摂取群と比較して有意に高い値となった。この結果より、松樹皮抽出物６０ｍｇ以上を添加した茶飲料、すなわちＰＢ１及びＰＢ３を６．３９ｍｇ／Ｌ以上の合計濃度で含有する茶飲料の継続摂取により、ＮＯ依存的な血管内皮機能の改善が示唆された。
【００７９】
【表１２】
【００８０】
表１３に、尿中８−ＯＨｄＧ濃度（ｍｇ／ｍＬ）の推移を示す。いずれの被験飲料（Ｌ，Ｍ，Ｎ）摂取群においても、飲料の１２週間摂取により尿中の８−ＯＨｄＧ濃度が低くなったが、特に、松樹皮抽出物を８０ｍｇ添加した茶飲料（Ｎ）摂取群において、摂取直前と比較して有意に低値となった。このことから、茶飲料の継続摂取により酸化ストレス障害が低減されること、特に、松樹皮抽出物を８０ｍｇ添加した茶飲料、すなわちＰＢ１及びＰＢ３を８．１ｍｇ／Ｌ以上の合計濃度で含有する茶飲料の継続摂取により酸化ストレス障害が低減されることが明らかとなった。
【００８１】
【表１３】
【００８２】
〔実施例３〕官能評価試験−１
緑茶８kgを８０℃の熱水３００Ｌに入れ、同温度で5分間抽出を行った。得られた抽出液を冷却後、遠心分離し、清澄な上清を採取してこれを緑茶抽出物とした。この抽出液に重曹を０．６ｋｇ、ビタミンＣを０．４ｋｇ配合し、さらに熱水で抽出された松樹皮抽出物（フラバンジェノール、株式会社東洋新薬Lot.T-0030）を、最終組成物（３５０ｍＬ）中に０、４０、６０、８０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００ｍｇ含まれるように添加して、純水で最終容量が１０００Ｌになるように調整した。これをフラバンジェノール配合緑茶飲料として、製造後まもなくモニター８名（男性３名、女性５名）に試飲してもらって香味評価を行った。上記８名のモニターによって好ましい順位をつけてもらい、下記評価基準にてポイントとして算出した。また、試験飲料中に含まれるＰＢ１及びＰＢ３を実施例１に準じて定量した。
【００８３】
官能評価結果を表１４に、ＰＢ１及びＰＢ３の測定結果を表１５示す。３５０ｍＬあたりの松樹皮含有量が０〜２００ｍｇまで、好ましくは０〜１２５ｍｇまでの茶飲料、すなわちＰＢ１及びＰＢ３の合計量が３０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは２０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で含有する茶飲料が、渋みが少なく、また癖がなく、飲みやすい茶飲料であるという結果であった。
（評価基準） 最も好ましい： 5点
好ましい： 4点
普通： 3点
あまり好ましくない： 2点
好ましくない： 1点
【００８４】
【表１４】
【００８５】
【表１５】
【００８６】
〔実施例４〕官能評価試験−２
緑茶８ｋｇを８０℃の熱水３００Ｌに入れ、同温度で５分間抽出を行った。得られた抽出液を冷却後、遠心分離し、清澄な上清を採取してこれを緑茶抽出物とした。この抽出液に重曹を０．６ｋｇ、ビタミンＣを０．４ｋｇ配合し、さらに最終組成物（３５０ｍＬ）中に熱水抽出タイプの松樹皮抽出物「フラバンジェノール」（株式会社東洋新薬Lot.T-0030；Ｔ−２７）を８０ｍｇ、または含水エタノール抽出タイプの松樹皮抽出物「ピクノジェノール」（日本シーベルヘグナー株式会社製Lot.Ｆ-830；Ｆ８３０）を８０ｍｇ含まれるように添加して、純水で最終容量が１０００Ｌになるように調整した。これを製造後まもなくモニター８名（男性３名、女性５名）に試飲してもらって香味評価を行った。評価項目は、実施例３と同様である。また、試験例１と同様にして、松樹皮抽出物中の組成分析を行った。なお、組成分析は、比較として含水エタノール抽出タイプの松樹皮抽出物「フラバンジェノール」（株式会社東洋新薬Lot.P-0015；Ｐ−１５）についても実施した。
【００８７】
官能評価結果を表１６に、組成分析結果を表１７に、ＰＰ中のフェルラ酸及びＤＨＦ中のジヒドロケルセチン濃度を表１８に示す。表１６より明らかなように、熱水抽出タイプの松樹皮抽出物配合茶飲料が、含水エタノール抽出タイプの松樹皮抽出物配合茶飲料に比べ、渋みが少なく、また癖がなく、飲みやすいという結果であった。表１７より、熱水抽出物は、含水エタノール抽出物と比較して、ＰＰやＤＨＦが極めて少ないことが判明した。表１８より、フェルラ酸及びジヒドロケルセチンの合計量を指標として、１０μｇ／ｍｇ、好ましくは５μｇ／ｍｇである松樹皮抽出物を用いるのが好ましいといえる。
（評価基準） 最も好ましい： 5点
好ましい： 4点
普通： 3点
あまり好ましくない： 2点
好ましくない： 1点
【００８８】
【表１６】
【００８９】
【表１７】
【００９０】
【表１８】
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明の被験飲料の投与によるラットの反応性充血後の動脈流入量／安静時動脈流入量（TBF level; tail blood flow level）の経時変化を示すグラフである。なお、グラフ中、PBEは松樹皮抽出物群、ＰＦはプロシアニジン高含有画分群である。
【図２】本発明の被験飲料の投与によるラットの反応性充血後０秒から１２０秒までの動脈流入量／安静時動脈流入量比曲線下面積（AUC； area under the curve）を示すグラフである。
【図３】本発明の試験飲料の摂取によるヒトの動脈血流増加比（％ＦＢＦ）、すなわち反応充血時動脈血流量を安静時基礎血流量で除した値（Ｂ／Ａ）の経時的変化を示すグラフである。
【図４】本発明の試験飲料の摂取によるヒトの動脈血流増加比（％ＦＢＦ）、すなわち反応充血時動脈血流量を安静時基礎血流量で除した値（Ｂ／Ａ）の経時的変化を示すグラフである。
【図５】本発明の試験飲料摂取直前及び摂取１２週間後における、ヒトの安静時に対する駆血解放後の前腕動脈血流量（ＦＢＦ）の比（％ＦＢＦ）の測定結果を示すグラフである。
【図６】本発明の試験飲料摂取直前及び摂取１２週間後における、ヒトの安静時に対する駆血解放後の前腕動脈血流量（ＦＢＦ）の比（％ＦＢＦ）の測定結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
で表されるプロアントシアニジン（procyanidin B1；ＰＢ１）と、式（ＩＩ）
【化２】
で表されるプロアントシアニジン（procyanidin B3；ＰＢ３）とを含有し、その合計量が６．４ｍｇ／Ｌ以上であるプロアントシアニジン含有茶飲料。
【請求項２】
前記ＰＢ１及びＰＢ３が、松樹皮抽出物中に含有された形で添加されたものである、請求項１に記載の茶飲料。
【請求項３】
前記松樹皮抽出物が、松樹皮の熱水抽出物である、請求項２に記載の茶飲料。
【請求項４】
茶の抽出液にプロアントシアニジンを配合して調合液を調製する調合工程、前記調合液を殺菌処理する殺菌工程、殺菌された調合液を容器に充填する充填工程を経て得られる、容器詰めされた請求項１〜３のいずれかに記載の茶飲料。
【請求項５】
血管内皮機能の改善作用を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の茶飲料。
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
で表されるプロアントシアニジン（procyanidin B1；ＰＢ１）と、式（ＩＩ）
【化２】
で表されるプロアントシアニジン（procyanidin B3；ＰＢ３）とを含有し、その合計量が６．４ｍｇ／Ｌ以上であるプロアントシアニジン含有茶飲料。
【請求項２】
前記ＰＢ１及びＰＢ３が、松樹皮抽出物中に含有された形で添加されたものである、請求項１に記載の茶飲料。
【請求項３】
前記松樹皮抽出物が、松樹皮の熱水抽出物である、請求項２に記載の茶飲料。
【請求項４】
茶の抽出液にプロアントシアニジンを配合して調合液を調製する調合工程、前記調合液を殺菌処理する殺菌工程、殺菌された調合液を容器に充填する充填工程を経て得られる、容器詰めされた請求項１〜３のいずれかに記載の茶飲料。
【請求項５】
血管内皮機能の改善作用を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の茶飲料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００７−３０６８７２（Ｐ２００７−３０６８７２Ａ）
【公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１４０６７０（Ｐ２００６−１４０６７０）
【出願日】平成１８年５月１９日（２００６．５．１９）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月１９日（２００６．５．１９）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
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