プロテアソーム活性化剤
【課題】プロテアソーム活性化剤を提供する。
【解決手段】リンゴ抽出物を有効成分とするプロテアソーム活性化剤、リンゴ抽出物を有
効成分とする酸化カルボニルタンパク抑制剤。
【解決手段】リンゴ抽出物を有効成分とするプロテアソーム活性化剤、リンゴ抽出物を有
効成分とする酸化カルボニルタンパク抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアソーム活性化技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、活性酸素による生体内の細胞や組織で見られる様々な酸化傷害が問題になっている。活性酸素は非常に反応性が高く、生体の様々な成分を破壊し、脳卒中、心筋梗塞、白内障、リウマチ、癌、胃潰瘍、皮膚におけるしわやしみなどの様々な疾患に関与することが明らかになっている（非特許文献１）。活性酸素を増加させる要因として、加齢、過度の運動、紫外線暴露、精神的ストレスなどが知られている。活性酸素が増加すると、生体内に酸化タンパク質、いわゆる異常タンパク質が蓄積し、前述したような様々な疾患を引き起こす（非特許文献２）。皮膚においては、特に紫外線暴露による酸化障害の影響が大きく、紫外線暴露により、表皮角化細胞や皮膚線維芽細胞のＤＮＡ損傷、皮膚の弾性成分であるエラスチンやコラーゲンの分解などが起こり、しわやしみの形成を促進することが知られている（非特許文献３）。
【０００３】
これまで、活性酸素による酸化障害を防ぐために、抗酸化物質の摂取、適用により生体内の活性酸素を消去し、タンパク質の酸化を抑制するという試みがなされてきた。代表的な抗酸化物質として、トコフェロール類、カロテノイド類及びフラボノイド類などが知られており、これらのいくつかは食品や化粧品に配合されて利用されている。
しかしながら、抗酸化物質の摂取、適用は、生体内で発生する活性酸素の消去には関与するが、既に蓄積している異常タンパク質の除去には全く関与しない。したがって、生体内に蓄積した異常タンパク質が関与する種々の疾病の改善をするには蓄積している異常タンパク質の除去が必須となる。
【０００４】
生体内の異常タンパク質を除去する酵素として、プロテアソームが知られている。プロテアソームは複雑な分子構成をした巨大な多成分複合体であり、近年その生体内における生理機能の研究が注目されている。プロテアソームは、タンパク質が立体構造を形成する過程で正常な折り畳みや分子集合に支障をきたした異常タンパク質の除去を行い、タンパク質の品質管理の役割を担うとともに、紫外線や酸化ストレスなどにより、変性や傷害を受けたタンパク質を除去することにより、ストレス応答にも密接に関係している（非特許文献４）。このように、プロテアソームは異常タンパク質を除去することにより、細胞の
恒常性を維持、監視する中心的役割を担う物質である。
【０００５】
以上のようなことから、生体内のプロテアソーム活性を促進し、種々の疾病を予防及び改善する組成物が開発されている。例えば、マンネンタケの抽出物を含むプロテアソーム活性促進剤（特許文献１）、特定のペプチド化合物を含むプロテアソーム作用増強剤（特許文献２）、プロテアソーム活性促進作用をもつ大豆由来サポニンを含む異常タンパク質除去用組成物（特許文献３）、及びケール及び／又はその抽出物を含むプロテアソーム活性促進用組成物（特許文献４）が開発されている。
【０００６】
さらに、本発明者は、大豆由来サポニンやケール及び／又はその抽出物のプロテアソーム活性促進成分が、生体内の異常タンパク質を除去するのみではなく、紫外線傷害を予防又は改善する作用をもつことを見出し、大豆由来のサポニンを含むことを特徴とする紫外線傷害予防又は改善用組成物（特許文献５）の開発を行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−２９９９６号公報
【特許文献２】国際公開００／０４０４２号パンフレット
【特許文献３】特開２００２−１７９５９２号公報
【特許文献４】特開２００４−９１３９８号公報
【特許文献５】特開２００４−１３１４３１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】老化のメカニズムと制御、藤本大三郎編著、株式会社アイピーシー、平成５年６月３０日
【非特許文献２】ＢＩＯ Ｃｌｉｎｉｃａ、１１巻、第５号、１９９６年
【非特許文献３】化粧品の有用性・評価技術の進歩と将来展望、日本化粧品技術者会編、薬事日報社、２００１年３月３１日
【非特許文献４】蛋白質 核酸 酵素、第４４巻、第６号、７６６〜７７５頁、１９９９年、共立出版社
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、異常タンパクを除去するプロテアソームを活性化するプロテアソーム活性化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
リンゴ抽出物に着目して試験した結果、リンゴポリフェノールにプロテアソーム活性化作用及び酸化カルボニルタンパク抑制作用があることを知見したことに基づき、本発明を提案する。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）リンゴ抽出物を有効成分とするプロテアソーム活性化剤。
（２）リンゴ抽出物が、リンゴ由来のポリフェノールを含む、（１）に記載のプロテアソーム活性化剤。
（３）リンゴ抽出物が、リンゴ幼果の抽出物である（１）または（２）に記載のプロテアソーム活性化剤。
（４）リンゴ抽出物を有効成分とする酸化カルボニルタンパク抑制剤。
（５）リンゴ抽出物が、リンゴ由来のポリフェノールを含む、（４）に記載の酸化カルボニルタンパク抑制剤。
（６）リンゴ抽出物が、リンゴ幼果の抽出物である（４）または（５）に記載の酸化カルボニルタンパク抑制剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、プロテアソーム活性を増強し、さらに、酸化カルボニルタンパクの生成を抑制する剤である。本発明のリンゴ抽出物は、紫外線に暴露されるとプロテアソームを活性化し、また、酸化カルボニルタンパク質の生成を抑制することから、紫外線暴露により生じた異常タンパク質が蓄積することにより生じる白内障、皮膚がん、皮膚におけるしわやしみなどの予防又は改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】紫外線B波照射時のトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ
【図２】紫外線B波照射時のキモトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ
【図３】紫外線A波照射時のトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ
【図４】紫外線A波照射時のキモトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ
【図５】紫外線A波照射時のリンゴ抽出物（Appl’in）添加による酸化カルボニルタンパク抑制を示すグラフ
【図６】紫外線B波照射時のリンゴ抽出物（Appl’in）添加による酸化カルボニルタンパク抑制を示すグラフ
【図７】紫外線A波照射時のリンゴ抽出物（ポマクティブHFV）添加による酸化カルボニルタンパク抑制を示すグラフ
【図８】紫外線B波照射時のリンゴ抽出物（ポマクティブHFV）添加による酸化カルボニルタンパク抑制を示すグラフ
【図９】リンゴポリフェノール（ポマクティブHFV）を投与したヘアレスマウスに紫外線A・B波を照射した時の肝臓におけるトリプシン様プロテオソーム活性の変動を示すグラフ
【図１０】リンゴポリフェノール（ポマクティブHFV）を投与したヘアレスマウスに紫外線A・B波を照射した時の肝臓におけるキモトリプシン様プロテオソーム活性の変動を示すグラフ
【図１１】リンゴポリフェノール（ポマクティブHFV）を投与したヘアレスマウスに紫外線A・B波を照射した時の皮膚におけるトリプシン様プロテオソーム活性の変動を示すグラフ
【図１２】リンゴポリフェノール（ポマクティブHFV）を投与したヘアレスマウスに紫外線A・B波を照射した時の皮膚におけるキモトリプシン様プロテオソーム活性の変動を示すグラフ
【図１３】リンゴポリフェノール（ポマクティブHFV）を投与したヘアレスマウスに紫外線A・B波を照射した時の皮膚の酸化カルボニルタンパクの変動を示すグラフ
【図１４】リンゴポリフェノール（ポマクティブHFV）を投与したヘアレスマウスに紫外線A・B波を照射した時の皮膚の酸化カルボニルタンパクの変動を観察した免疫染色病理組織標本の写真。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のプロテアソーム活性化剤及び酸化カルボニルタンパク抑制剤は、リンゴ抽出物を有効成分とし、前記リンゴ抽出物が、リンゴ果実の抽出物であることが好ましい。特に、リンゴ幼果抽出物に含まれるポリフェノールを、主成分とすることが好ましい。
【００１５】
リンゴ抽出物には、ポリフェノール、有機酸、アミノ酸などが含まれることが知られている。
リンゴ抽出物は、血管機能改善作用を高めることが可能なBNP調節剤として該抽出物を有効成分として含有してなるBNP調節剤、血行促進剤（特開２００７−００８８３７号公報、特開２００６−２６５２２０号公報）や飲料（特開２００４−３０５０８７号公報）、化粧料配合剤（特開２００１−１８７７２４号公報）、消臭剤成分（特開平１１−３１９０５１号公報）、香料成分（特開平０８−０２３９３９号公報）などに用いられることが知られている。
しかしながら、リンゴ抽出物およびリンゴ由来のポリフェノールについて、プロテアソーム活性化機能があることは知られていない。
【００１６】
以下に、本発明のプロテアソーム活性化剤について、詳細に説明する。
本発明のプロテアソーム活性化剤は、ポリユビキチン化異常タンパク質を分解する酵素であるプロテアソームの活性化剤であって、リンゴ抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
【００１７】
リンゴ抽出物において、リンゴ（Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ）の品種は、例えば、ふじ、国光、王林、紅玉、ジョナゴールド、デリシャス、さんさ、千秋などが挙げられ、特に制限されない。リンゴの抽出部位は、特に制限されず、例えば、果実、葉、幹、花などが挙げられ、好ましくは、果実である。前記果実は、例えば、未熟果（幼果）でも良く、完熟果でも良く、特に制限されない。抽出に用いる前記果実の部位は、特に制限されず、例えば、全果、果肉、果皮、種などが挙げられる。リンゴ抽出物は、これらの部位を、単独で、または２種以上組み合わせて抽出しても良い。
【００１８】
リンゴ抽出物を抽出する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。抽出方法の具体例としては、例えば、以下のようであっても良い。まず、リンゴの全果を、水洗後、グラインダーなどにより粉砕する。この粉砕物を、ペクチナーゼ処理に供し、遠心分離後、抽出溶媒により分配ろ過して、リンゴ抽出物を調製しても良い。前記ペクチナーゼ処理としては、特に制限されないが、例えば、２０〜６０℃の温度条件化で、ペクチナーゼを１０〜５０ｐｐｍ添加して行っても良い。抽出溶媒としては、特に制限されないが、例えば、ヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒が挙げられる。
【００１９】
本発明において、リンゴ抽出物は、例えば、市販のリンゴ抽出物を用いても良く、リンゴ果実から抽出して調製しても良く、特に制限されない。
本発明のプロテアソーム活性化剤及び酸化カルボニルタンパク抑制剤は、リンゴ由来のポリフェノールを含むリンゴ抽出物が好ましい。
【００２０】
ポリフェノールの分画方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。ポリフェノールは、例えば、リンゴ抽出物をカラムに通液後、カラムの吸着物を溶出し、この溶出画分を減圧留去濃縮して分画しても良い。また、さらに、この濃縮液に粉末助剤を添加し、凍結乾燥または噴霧乾燥して、ポリフェノール粉末を調製しても良い。
【００２１】
本発明において、ポリフェノールは、例えば、市販のリンゴ由来のポリフェノール含有物を用いても良く、リンゴ果実から抽出および分画して調製しても良く、特に制限されない。
【００２２】
本発明のプロテアソーム活性化剤は、紫外線暴露により発生した活性酸素により産生された細胞内の変性タンパク質（異常タンパク質）を分解するプロテアーゼを活性化し、紫外線暴露による細胞傷害を抑制することにより、白内障、皮膚癌、皮膚におけるしわやしみなどの様々な疾患を予防及び改善することができる。また、酸化カルボニルタンパク抑制剤は、紫外線照射による酸化カルボニルタンパク質の生成を抑制することができる。
【実施例】
【００２３】
（１）試料及び正常ヒト皮膚線維芽細胞の培養
[リンゴ抽出物試料]
リンゴ抽出物としては、
・アップルフェノンSH（アサヒフード アンド ヘルスケア、総ポリフェノール（UV 法）９８％以上）
・Appl’in（清田産業、総ポリフェノール（UV法）８０％以上）
・ポマクティブHFV（ユニテックフーズ、総ポリフェノール（UV法）９０％以上）
をサンプルとし、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、GIBCO社製）に添加し、評価検体であるリンゴ抽出物含有液を作製した。
【００２４】
［正常ヒト皮膚線維芽細胞の培養］
新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＦＢ、三光純薬）を線維芽細胞用培地（ＦＢＭ、三光純薬）で３７℃−５％ＣＯ２インキュベーターにて培養した。
ＦＢＭにヒト線維芽細胞増殖因子（１μｇ／ｍｌ）、インシュリン（５ｍｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、アンフォテリシンＢ（５０μｇ／ｍｌ）を添加して継代培養に用いた。本実験には集団倍加数（population doubling level：PDL）がPDL２０〜４０の若い細胞を紫外線B波照射の試験に使用し、PDL４０〜６０の老化した細胞を紫外線A波照射の試験に使用した。トリプシン処理で剥がした線維芽細胞の細胞数をコールターカウンターで計測し、２０００００cells/mlの細胞密度になるように調整した。
【００２５】
（２）細胞培養と紫外線照射
［リンゴ抽出物含有液の紫外線B波傷害］
PDL２０〜４０の若い細胞を６ウェル平底プレートに１０５個／ウェルの細胞密度で播種し、２４時間培養した。
紫外線照射前に、前記リンゴ抽出物含有液の最終濃度が１０μg/mlとなるように添加し、２４ｈ培養した。培養液を廃棄し、細胞をHanｋ’ｓ（−）液（ハンクス緩衝塩類溶液、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋非含有）で洗浄後、再度Hanｋ’ｓ（−）液を添加し、プレートに蓋をしない状態でＵＶＢを２．５Ｗ/ｍ2で３分間照射した（５０ｍＪ／ｃｍ２）。対照として、ＵＶＢを照射しない群の細胞も作製した。照射終了後、直ちにHank’s（−）液を評価検体であるリンゴ抽出物を１０μg/ml含有する５％ＦＢＳ及び１％ＤＭＳＯ含有ＤＭＥＭに置換し、２４h培養した。
【００２６】
［リンゴ抽出物含有液の紫外線A波傷害］
PDL４０〜６０の老化した細胞を６ウェル平底プレートに１０５個／ウェルの細胞密度で播種し、２４時間培養した。紫外線照射前に、前記リンゴ抽出物含有液の最終濃度が１０μg/mlとなるように添加し、２４ｈ培養した。培養液を廃棄し、細胞をHanｋ’ｓ（−）液で洗浄後、再度Hanｋ’ｓ（−）液を添加し、プレートに蓋をしない状態でＵＶAを３０Ｗ/ｍ2で１．５時間照射した（１５Ｊ／ｃｍ２）。対照として、ＵＶＡを照射しない群の細胞も作製した。照射終了後、直ちにHank’s液を評価検体であるリンゴ抽出物を１０μg/ml含有する５％ＦＢＳ及び１％ＤＭＳＯ含有ＤＭＥＭに置換し、２４h培養した。
【００２７】
以後のプロテアソーム活性測定操作は紫外線B波および紫外線A波を照射した試験で共通している。
（３）細胞懸濁液回収、プロテアソーム活性溶液調整、タンパク濃度の測定
培養液を除去しＰＢＳ（−）で各ウェルを洗浄後、各ウェルにトリプシン-ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を８００μｌ添加し、３７℃で５分間処理して線維芽細胞をディッシュ底面から剥離させ、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ１.５ｍｌでトリプシン反応を終止した。溶液と一部底着したままの細胞についてはスクレーパー処理で細胞を１５ｍｌ容遠沈管に回収した。１，５００rpm ５minの条件で遠沈して培養液を除去、ＰＢＳ（−）で洗浄し再び１，５００rpm ５minの条件で遠沈してＤＭＥＭ中の色素（フェノールレッド）を完全に除去した。
この細胞塊をホモジナイズＢｕｆｆｅｒ(５０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭＭｇＣｌ２、５％（v/v）グリセリン、pH=７．５)３００μｌに懸濁させた。その後、氷冷中でホモジナイズ処理（ＵＤ−２０１超音波破砕装置、ＴＯＭＹ製を使用、条件は「ＯＵＴ ＰＵＴ １、ＤＵＴＹ４０、１５secを２set」）した。ホモジナイズ溶液を１．５ｍｌ容エッペンチューブに全量移し、１５,０００ｒｐｍで１０min遠心分離して上清をプロテアソーム活性溶液として回収した。
このプロテアソーム活性溶液について、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に準拠してＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、SIGMA社製）換算で全タンパク量を求めた。
発色試薬はＢｉｏ−Ｒａｄ protein assay（脱イオン水で５倍希釈）を用いた。
平板９６ウェルプレートに、
プロテアソーム活性溶液／BSA 溶媒：ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ １０μｌ
Ｂｉｏ−Ｒａｄ protein assay（脱イオン水で5倍希釈） ２００μｌ
を加えて１０min室温にてプレートごとに撹拌反応した。吸光度５９０nmをプレートリーダーで計測し、ＢＳＡ溶液で作成した検量線について全タンパク濃度を求めた。
【００２８】
（４）プロテアソーム活性の測定
トリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ
（ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルギニル−４−メチル−クマリル−７−アミド）（ペプチド研究所）、
キモトリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ（キモトリプシン様プロテアソーム活性を測定するための基質として、サクシニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−Ｌ−チロシル−４−メチル−クマリル−７−アミド（ペプチド研究所））（ペプチド研究所）、をそれぞれ１０ｍＭ（溶媒、ＤＭＳＯ）で調整し、３０μｌずつを分注して−２０℃冷凍保存した。使用時に解凍し６００μｌの反応液で希釈して使用した。
蛍光分析用平板９６ウェルプレートに以下の溶液をそれぞれ加えた。
1. 基質ペプチド（トリプシン様／キモトリプシン様） １０．５μｌ （蛍光分 析時の基質ペプチド濃度２３．８μM）
2. 反応液（１００mMトリス塩酸、１mM ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、pH=８．０） ２５μｌ
3. １０mM ATP含有ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ １９．５μｌ（蛍光分析時のＡＴ Ｐ濃度は０．９７５ｍＭ）
4. プロテアソーム活性サンプル（cell lysate） ２０μｌ
３７℃で１h撹拌反応した。反応終了後に、
5. １０%(w/v) SDS（反応停止液） ２５μｌ
6. １００mMトリス塩酸（pH=９．０） １００μｌ （全量２００μｌ/well）
として、プロテアソームによって基質ペプチドから遊離した７−アミノ−４−メチルクマリン（ＭＣＡ）由来の蛍光強度（励起波長Ｅｘ３８０ｎｍ、蛍光波長Ｅｍ４４０nm）を測定した。
【００２９】
（５）データ処理
（蛍光強度／タンパク濃度）で算出されるプロテアソーム活性について、ＵＶ（−）のコントロール群を基準（１．００）とし、平均値で他の各群と比較した。
遊離した７−アミノ−４−メチルクマリンの蛍光強度を励起波長（Ｅｘ）３８０ｎｍ、吸収波長（Ｅｍ）４４０ｎｍで測定した。結果はリンゴ抽出物含有液を各濃度で処理した３試料の測定値から、平均±標準偏差を計算し、グラフ化した。
統計解析は多重比較検討としてDunnett test（vs UV A or UV B＋ コントロール群**:p<０．０１, *p<０．０５）を行った。また、p値が０．０５＜ｐ＜０．１を有意傾向として表記した。
【実施例１】
【００３０】
［紫外線B波照射時のプロテアソーム活性］
PDL２６の若い状態の線維芽細胞を用いて、リンゴ抽出物のプロテアソーム活性化評価を行った。
試験群１ 紫外線B波 非照射 コントロール群
試験群２ 紫外線B波 照射 コントロール群
試験群３ 紫外線B波 照射 １０μｇ／ｍｌアップルフェノンSH 添加
試験群４ 紫外線B波 照射 １０μｇ／ｍｌAppl’in添加
試験群５ 紫外線B波 照射 １０μｇ／ｍｌポマクティブHFV添加
【００３１】
図１に紫外線B波照射時のトリプシン様プロテアソーム活性を、表１にDunnett testの結果を示す。
紫外線B波照射条件時のトリプシン様活性では、試験群２の紫外線B波照射群が試験群１の紫外線B波未照射群（ｐ値０．０４６５）に対してプロテアソーム活性が低下していた。また、試験群４（ｐ値０．０２５６）および試験群５（ｐ値０．０１６９）が、試験群２に対して有意にプロテアソームが活性化したことから、リンゴ抽出物である「Appl’in」及び「ポマクティブHFV」は、若い状態の線維芽細胞のトリプシン様プロテアソームを活性化することが分かった。
【００３２】
【表１】
【実施例２】
【００３３】
図２に紫外線B照射時のキモトリプシン様プロテアソーム活性を、表２にDunnett testの結果を示す。
紫外線B照射時のキモトリプシン様活性では、試験群２の紫外線B波照射群が試験群１の紫外線B波未照射群（ｐ値０．０００７３４）に対してプロテアソーム活性が低下していた。また、試験群３（ｐ値０．０００７３９）、試験群４（ｐ値０．００００２５５）および試験群５（ｐ値０．００００５１１）のいずれもが試験群２の紫外線B波照射群に対して有意にプロテアソームが活性化したことから、リンゴ抽出物である「アップルフェノンSH」、「Appl’in」及び「ポマクティブHFV」は、若い状態の線維芽細胞のキモトリプシン様プロテアソームを活性化することが分かった。
【００３４】
【表２】
【実施例３】
【００３５】
［紫外線A波照射時のプロテアソーム活性］
PDL５０の老化した状態の線維芽細胞を用いて、リンゴ抽出物のプロテアソーム活性化評価を行った。
試験群１ 紫外線A波 非照射 コントロール群
試験群２ 紫外線A波 照射 コントロール群
試験群３ 紫外線A波 照射 １０μｇ／ｍｌアップルフェノンSH 添加
試験群４ 紫外線A波 照射 １０μｇ／ｍｌAppl’in添加
試験群５ 紫外線A波 照射 １０μｇ／ｍｌポマクティブHFV添加
【００３６】
図３に紫外線A照射時のトリプシン様プロテアソーム活性を、表３にDunnett testの結果を示す。
紫外線A波照射条件時のトリプシン様活性では、試験群２の紫外線A波照射群が試験群１の紫外線A波未照射群（ｐ値０．０１３７）に対してプロテアソーム活性が低下していた。また、試験群３は試験群２の紫外線A波照射群に対して有意（ｐ値０．０３４７）にプロテアソ−ム活性が上がった。また、試験群４は有意傾向（ｐ＝０．０９３７）でプロテアソームが活性化した。このことから、リンゴ抽出物である「アップルフェノンSH」、「Appl’in」は、老化した状態の線維芽細胞のトリプシン様プロテアソームを活性化することが分かった。
【００３７】
【表３】
【実施例４】
【００３８】
図４に紫外線A照射時のキモトリプシン様プロテアソーム活性を、表４にDunnett testの結果を示す。
紫外線A照射時のキモトリプシン様活性では、試験群２の紫外線A波照射群が試験群１の紫外線A波未照射群（ｐ値０．０６８１、有意傾向）に対してプロテアソーム活性が低下していた。また、試験群３は試験群２の紫外線A波照射群に対して有意（ｐ値０．００３７０）にプロテアソ−ム活性が上がった。また、試験群４も有意（ｐ＝０．０１２０）でプロテアソームが活性化した。このことから、リンゴ抽出物である「アップルフェノンSH」、「Appl’in」は、老化した状態の線維芽細胞のキモトリプシン様プロテアソームを活性化することが分かった。
【００３９】
【表４】
【００４０】
以上の結果から、リンゴ抽出物には線維芽細胞の状態（若い或いは老化）を問わず、細胞内のプロテアソームを活性化させるという顕著な機能を有することが分かった。
【００４１】
［酸化カルボニルタンパクの測定］
（１）タンパク濃度０．１〜０．４μｇ／μｌの範囲で凍結保存していた線維芽細胞由来のサンプルを自然解凍後にトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）処理してタンパク沈殿し、２０μｇタンパク重量に相当するサンプルを用意した。そのサンプルについて、カルボニル化蛋白質測定キット（日研ザイル製）で酸化カルボニルタンパク量を定量した。具体的には、前処理したサンプル、スタンダード、コントロール、各２００μｌをウェルに分注し、プレートをシールして、４℃一晩反応させた。EIAバッファー ３００μｌ/ウェルにて５回洗浄後に、全てのウェルに「希釈済みブロッキング試薬」を２５０μｌ/ウェル分注し、室温にて３０分 インキュベート後にEIAバッファー ３００μｌ/ウェルにて５回洗浄、そして、ビオチン標識-抗DNP抗体を２００μｌ分注し、３７℃にて１時間インキュベートした。EIAバッファー ３００μｌ/ウェルにて５回洗浄、「希釈済み HRP標識-ストレプトアビジン」を２００μｌ分注し、室温にて１時間インキュベートした。EIAバッファー ３００μｌ/ウェルにて５回洗浄、「発色液」を２００μｌ/ウェル分注し、室温にて各ウェルでの反応時間が５分になるよう調整し、「反応停止液」を１００μｌ/ウェル分注し、反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４２】
（２）データ処理
反応生成物であるｐ−ニトロアニリン由来の吸光度４５０ｎｍを測定し、カルボニル化蛋白質測定キットに付属している標準カルボニルタンパクで作成した検量線に対する各サンプルのカルボニル化タンパクを測定した。
【実施例５】
【００４３】
[紫外線A波照射時のAppl’in添加による酸化カルボニル抑制]
PDL５０の老化した状態の線維芽細胞を用いて評価した。
試験群１ 紫外線A波 非照射 コントロール群
試験群２ 紫外線A波 照射 コントロール群
試験群３ 紫外線A波 照射 １０μｇ／ｍｌAppl’in添加
【００４４】
図５に紫外線A照射時の酸化カルボニル量を、表５にDunnett testの結果を示す。
紫外線A照射時の酸化カルボニル量は、試験群２の紫外線A波照射群が試験群１の紫外線A波未照射群（ｐ値０．０００６４５）に対して増加していた。また、試験群３の１０μｇ／ｍｌAppl’in添加群が試験群２の紫外線A波照射群に対して有意（ｐ値０．００７２０）に酸化カルボニルを抑制していた。
【００４５】
【表５】
【実施例６】
【００４６】
[紫外線B波照射時のAppl’in添加による酸化カルボニル抑制]
PDL２６の若い状態の線維芽細胞を用いて評価した。
試験群１ 紫外線B波 非照射 コントロール群
試験群２ 紫外線B波 照射 コントロール群
試験群３ 紫外線B波 照射 １０μｇ／ｍｌAppl’in添加
【００４７】
図６に紫外線B照射時の酸化カルボニル量を、表６にDunnett testの結果を示す。
紫外線B照射時の酸化カルボニル量は、試験群２の紫外線B波照射群が試験群１の紫外線B波未照射群（ｐ値０．０００２１４）に対して増加していた。また、試験群３の１０μｇ／ｍｌAppl’in添加群が試験群２の紫外線B波照射群に対して有意（ｐ値０．００１９２）に酸化カルボニルを抑制していた。
【００４８】
【表６】
【実施例７】
【００４９】
[紫外線A照射時におけるポマクティブHFVの酸化カルボニルタンパク抑制]
PDL５４の老化した線維芽細胞を用いて評価した。
試験群１ 紫外線A波 非照射 コントロール群
試験群２ 紫外線A波 照射 コントロール群
試験群３ 紫外線A波 照射 １０μｇ／ｍｌポマクティブHFV添加
【００５０】
図７に紫外線A波照射時の酸化カルボニル量を、表７にDunnett testの結果を示す。
紫外線A照射時の酸化カルボニル量は、試験群２の紫外線A波照射群が試験群１の紫外線A波未照射群（ｐ値０．００２３０）に対して増加していた。また、試験群３の１０μｇ／ｍｌポマクティブHFV添加群が試験群２の紫外線A波照射群に対して有意（ｐ値０．００１５１）に酸化カルボニルを抑制していた。
【００５１】
【表７】
【実施例８】
【００５２】
[紫外線B照射時におけるポマクティブHFVの酸化カルボニルタンパク抑制]
PDL２７の若い線維芽細胞を用いて評価した。
試験群１ 紫外線B波 非照射 コントロール群
試験群２ 紫外線B波 照射 コントロール群
試験群３ 紫外線B波 照射 １０μｇ／ｍｌポマクティブHFV添加
【００５３】
図８に紫外線B波照射時の酸化カルボニル量を、表８にDunnett testの結果を示す。
紫外線B照射時の酸化カルボニル量は、試験群２の紫外線B波照射群が試験群１の紫外線B波未照射群（ｐ値０．０００１３９）に対して増加していた。また、試験群３の１０μｇ／ｍｌポマクティブHFV添加群が試験群２の紫外線B波照射群に対して有意（ｐ値０．００１９３）に酸化カルボニルを抑制していた。
【００５４】
【表８】
【００５５】
以上の結果から、リンゴ抽出物であるAppl’inやポマクティブHFVは、線維芽細胞の状態（若い或いは老化）を問わず、いずれも紫外線惹起性の酸化カルボニルタンパクを抑制除去する効果に優れていることが分かった。
【実施例９】
【００５６】
［光老化動物による試験］
紫外線Ａ（ＵＶＡ）波および紫外線Ｂ（ＵＶＢ）波をヘアレスマウスに照射させてシワを形成させる試験系によりポマクティブＨＦＶのシワの抑制および皮膚老化抑制効果について確認試験を行った。
導入時６週齢のヘアレスマウス（Ｈｏｓ：ＨＲ−１雌）を用いて試験を行った。
【００５７】
（１）試験対象物の調製および投与
ヘアレスマウスの群分けは投与開始日に、一般状態が良好な動物を体重により、群間での差が無いように１群６匹に振り分けた。なお、各々の個体は１ゲージ/群で飼育とした。
マウス用飼料ＭＦ（オリエンタルバイオサービス製）に、それぞれポマクティブＨＦＶを均一に混合処理し、自由摂取させた。投与群と配合成分の一覧を表９に示す。
【００５８】
【表９】
【００５９】
混餌飼料の投与は動物搬入直後から解剖１８時間前までとした。
【００６０】
（２）ＵＶ照射
ＵＶ照射は、動物を専用のケージに移し、１群ずつＵＶＢ２０ｍＪ／ｃｍ２およびＵＶＡ１０Ｊ／ｃｍ２を照射した。照射は週三回とし、このサイクルを１０週間繰り返した。
【００６１】
（３）解剖
各群、本飼育期間終了翌日より１８時間絶食させた後、氷冷したＡｖｅｒｔｉｎ（２，２，２−トリブロモエタノール）０．５ｍｇ／ｋｇＢＷを腹腔内投与して麻酔した。その後、皮膚背部の尾付け根より首に向かい２ｃｍ、腰椎から右側に０.５ｃｍ部位範囲で反射型レプリカ（（有）アサヒバイオメッド製）を採取した。次いで開腹し解剖を行った。皮膚組織はメタカン固定液（メタノール：クロロホルム：酢酸＝6：3：1（ｖ／ｖ／ｖ））で浸潤、パラフィン包埋処理し、組織染色実験時に５μｍの厚さでスライドガラスに貼付した。
【００６２】
（４）皮膚形態観察シワ体積率計測
皮膚表面部の写真撮影と採取したレプリカの判定を行った。シワ形成度合を指標としてＡＳＡ−０３ＲＸＤ（（有）アサヒバイオメッド製）を用いてシワ体積率％(μｍ３／ｍｍ２／１００) を算出した。
紫外線照射第４週目頃よりＵＶ照射動物において、頭部の皮膚の軽度褐色化や頸部のしわの深さならびに後肢背部のしわがＵＶ非照射動物に比較して目立つようになった。
解剖時の外観観察では、ＵＶ照射動物で顔、頸部および後肢背部のしわが明瞭に確認されたが、ＵＶ照射においても高濃度（０．０６％）、中濃度（０．０１２％）および低濃度（０．００６％）ポマクティブＨＦＶを摂取したマウスではその症状は軽度であり、特に高濃度摂取動物のしわの深度が浅く、肉眼的にはしわの程度が皆無であった。また、ポマクティブＨＦＶ摂取動物は、コントロール群に比較して皮膚にしっとり感があり、特に高濃度摂取群でその症状は顕著に感じられた。
【００６３】
表１０に結果を示すが、紫外線照射により明確なシワの形成が認められた。特に、同一線量の紫外線照射条件下で 混餌群ではポマクティブＨＦＶの濃度依存的にシワ抑制効果が有意に認められた。特に０．０６％および０．０１２％混餌で有意にシワ体積率を抑制した。
【００６４】
【表１０】
【００６５】
（５）マウス肝臓のプロテアソーム活性
測定試料の調整
上記の解剖で得たマウス肝臓を１００ｍｇから２００ｍｇの範囲で湿重量を秤量し、以下の条件でホモジナイズした。
【００６６】
ホモジナイズ条件
肝臓：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．５，グリセロール、DTT、MgCl2含有）＝１：３（ｗ／ｖ）
ホモジナイザー（ＵＤ−２０１超音波破砕装置、ＴＯＭＹ製を使用、条件は「ＯＵＴ ＰＵＴ ２、ＤＵＴＹ４０、３０secを２set」）。
【００６７】
試験溶液の調整
このホモジネートを遠心分離（１０，０００ｇ、３０分間、４℃）して上澄み画分を採取し、これを再度遠心分離（２０，０００ｇ、３０分間、４℃）し、得られた上澄み画分をプロテアソーム活性測定試験溶液とした。
【００６８】
タンパク質量の測定
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に準拠してＢＳＡ換算で全タンパク量を求めた。
発色試薬はＢｉｏ−Ｒａｄprotein assay（バイオラッド社）を用いた。平板96ウェルプレートに、プロテアソーム活性測定溶液1μｌ、ホモジナイズ緩衝液 ９μｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ protein assay（脱イオン水で5倍希釈） 200μｌを加えて10min室温にて撹拌して反応させた。次いで590nmの吸光度を、プレートリーダーを用いて測定した。次いで得られた吸光度からＢＳＡ溶液で作成した検量線を用いて全タンパク質濃度（０．７〜１．５μg/μｌの範囲）を求めた。
【００６９】
プロテアソーム活性の測定
トリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（ペプチド研究所）キモトリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ（ペプチド研究所）をそれぞれ１０ｍＭ（溶媒；ＤＭＳＯ）に調整し、30μｌずつを分注して−20℃冷凍保存し、使用時に解凍し600μｌの反応液で希釈して使用した。
蛍光分析用平板96ウェルプレートに以下の溶液をそれぞれ加えた。
1. 基質ペプチド（トリプシン様／キモトリプシン様） 10.5μｌ （蛍光分析 時の基質ペプチド濃度23.8μM）
2. 反応液（100mMトリス塩酸、1mM ＤＴＴ、5ｍＭ ＭｇＣｌ2、pH=8.0） 25μｌ
3. 10mM ATP含有ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ 19.5μｌ（蛍光分析時のＡＴＰ濃 度は0.975ｍＭ）
4. ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ 15μｌ
5. マウス肝臓プロテアソーム活性サンプル 5μｌ
37℃３０分間撹拌反応。反応終了後に、
6. 10%(w/v) SDS（反応停止液） 25μｌ
7. 100mMトリス塩酸（pH=9.0） 100μｌ
１ウエル当たり全量200μｌとして37℃30分間インキュベートし、基質ペプチドから遊離したＭＣＡ由来の蛍光強度（Ｅｘ３８０ｎｍ、Ｅｍ４４０nm）を測定し、プロテアソーム活性を求めた。
【００７０】
データ処理
蛍光強度／タンパク濃度 で算出されるプロテアソーム活性値を、紫外線非照射動物（ＵＶ（−））を対照（１．００）として活性値をもとめ、各動物個体の活性値を平均して、試験群の値として表した。
【００７１】
測定結果
測定結果を表１１、表１２及び図９、図１０、に示す。
【００７２】
【表１１】
【００７３】
【表１２】
【００７４】
以上の試験結果から以下のことが明らかになった。
すなわち、
Ａ．コントロール食群では、紫外線照射の有無でマウス肝臓のプロテアソーム活性に 有意な差は無かった。
Ｂ．トリプシン様活性は、ポマクティブＨＦＶ０．０６％（ｐ＝０．０１０８）混餌 群で有意な活性上昇が確認された。
Ｃ．キモトリプシン様活性は、ポマクティブＨＦＶ０．０１２％（ｐ＝ ０．０１３２）および０．０６％（ｐ＝０．０００００１６０）混餌群で有意な 活性上昇が確認された。
Ｄ．従ってポマクティブＨＦＶ投与によりマウス肝臓におけるプロテアソーム活性化 効果が確認できた。
すなわち、本発明により肝臓のプロテアソームが活性化され、異常タンパク質を除去する機能が高まり、種々の疾病予防に寄与する事が可能となった。
【００７５】
（６）マウス皮膚のプロテアソーム活性の測定
測定試料の調整
次のホモジナイズ条件で背部ヒフ試料をホモジナイズ処理した。
【００７６】
ホモジナイズ条件
背部皮膚（前足周縁）：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、グリセロール、DTT、MgCl2 含有）＝１：３（ｗ／ｖ）
ホモジナイザーを使用して試料調製した（ＵＤ−２０１超音波破砕装置、ＴＯＭＹ製を使用、条件は「ＯＵＴ ＰＵＴ 5(皮膚は肝臓よりも硬組織なので、激しいホジナイズを実施した、ＤＵＴＹ４０、３０secを２set」）。
【００７７】
試験溶液の調整
得られたホモジネートを遠心分離（１０，０００ｇ、３０分間、4℃）し、上澄み画分を引き続き遠心分離（２０，０００ｇ、３０分間、4℃）した。得られた上澄み画分をプロテアソーム活性測定試験溶液とした。
【００７８】
タンパク質量の測定
上記と同様に、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に準拠してＢＳＡ換算で全タンパク量を求めた。
発色試薬はＢｉｏ−Ｒａｄprotein assayを用いた。平板96ウェルプレートに、プロテアソーム活性測定溶液1μｌ、ホモジナイズ緩衝液 ９μｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ protein assay（脱イオン水で5倍希釈） 200μｌを加えて10min室温にて撹拌して反応させた。次いで590nmの吸光度をプレートリーダーを用いて測定した。次いで得られた吸光度からＢＳＡ溶液で作成した検量線を用いて全タンパク質濃度（０．７〜１．５μg/μｌの範囲）を求めた。
【００７９】
プロテアソーム活性の測定
トリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（ペプチド研究所）キモトリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ（ペプチド研究所）をそれぞれ１０ｍＭ（溶媒；ＤＭＳＯ）に調整し、30μｌずつを分注して−20℃冷凍保存し、使用時に解凍し600μｌの反応液で希釈して使用した。
蛍光分析用平板96ウェルプレートに以下の溶液をそれぞれ加えた。
1. 基質ペプチド（トリプシン様／キモトリプシン様） 10.5μｌ （蛍光分析時 の基質ペプチド濃度23.8μM）
2. 反応液（100mMトリス塩酸、1mM ＤＴＴ、5ｍＭ ＭｇＣｌ2、pH=8.0） 25μｌ
3. 10mM ATP含有ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ 19.5μｌ（蛍光分析時のＡＴＰ濃度 は0.975ｍＭ）
4. マウス皮膚プロテアソーム活性サンプル ２０μｌ
37℃３０分間撹拌反応。反応終了後に、
5. 10%(w/v) SDS（反応停止液） 25μｌ
6. 100mMトリス塩酸（pH=9.0） 100μｌ
１ウエル当たり全量200μｌとして37℃30分間インキュベートし、基質ペプチドから遊離したＭＣＡ由来の蛍光強度（Ｅｘ３８０ｎｍ、Ｅｍ４４０nm）を測定し、プロテアソーム活性を求めた。
【００８０】
データ処理
蛍光強度／タンパク濃度 で算出されるプロテアソーム活性を、紫外線非照射動物（ＵＶ（−））を対照（１．００）としてもとめ、各動物個体の活性値の平均値を試験群の値として表した。
【００８１】
測定結果
測定結果を表１３、表１４ 及び図１１、図１２に示す。
【００８２】
【表１３】
【００８３】
【表１４】
【００８４】
以上の試験結果から次の点が明らかとなった。
Ａ．コントロール食群において、紫外線照射の有無でマウス皮膚のプロテアソーム活 性に有意な差は無かったが紫外線照射群の皮膚でプロテアソーム活性が低下する 傾向が認められた。
Ｂ．トリプシン様活性はポマクティブＨＦＶ０．０６％混餌群（ｐ＝０．０１５３） で有意な活性上昇が確認された。
Ｃ．キモトリプシン様活性において、ポマクティブＨＦＶ０．０６％混餌群（ｐ＝ ０．０１０３）で有意な活性上昇が確認された。
Ｄ．以上の結果からポマクティブＨＦＶ投与によるマウス皮膚におけるプロテアソー ム活性化作用が証明された。
【００８５】
従って、本発明により皮膚の異常タンパク質を除去する機能が高まり、種々の疾病予防に寄与する事が期待できる。
【００８６】
（７）マウス皮膚の酸化カルボニルタンパクの抑制効果の確認
プロテアソーム活性化によって酸化タンパク質の一種であるカルボニル化タンパク質の抑制を確認した。
上記（３）で得たメタカン固定液浸潤してパラフィン包埋した５μmマウス皮膚切片を、免疫組織染色の手法を用いて評価した。抗体等の試薬はカルボニル化タンパク質免疫組織染色キット（株式会社シマ研究所）を用いた。
脱パラフィン処理、親水化は公知の方法に基づいて実施した。それぞれの皮膚切片サンプルに対し本キットに付属のDNPH溶液を室温で30分間反応させた。DNPHは２，４−ジニトロフェニルヒドラジンの略語である。DNPH反応終了後、２％塩酸を５分間、８０％エタノールを５分間、１００％エタノールを５分間、５０％エタノール／５０％酢酸を５分間、８０％エタノールを１分間、蒸留水で１分間順次洗浄した。常温下0.3％過酸化水素含有メタノールで３０分反応させて内因性ペルオキシダーゼを阻害した。水洗、10mMPBS(-)洗浄後、ブロッキング液２％BSA/PBS‐２％ヤギ血清を３０分間ブロッキング反応、ブロッキング終了後にPBS（−）で５分間３回洗浄し、１次抗体（本キット付属のウサギ抗DNPポリクローナル抗体の１００倍希釈、希釈液はブロッキング溶液）を１時間室温で反応させた。PBS（−）で2回洗浄し、ビオチン化二次抗体（ビオチン化抗ウサギ免疫グロブリンG；ＤＡＫＯ製）を２００倍希釈したものを３０分間室温で反応させた。PBS（−）で２回洗浄し、ABC試薬（アビジン−ビオチン複合体ABC-HRP；Dako製）を３０分間室温にて反応させた。PBS（−）で２回洗浄し、発色試薬としてDAB（３,３-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド：DAKO製）を用いて４分常温下で反応させた。水洗後、脱水、封入処理を行い、酸化カルボニル化タンパク質の病理組織標本を得た。
【００８７】
得られた病理組織標本を顕微鏡で染色状況を観察し、DAB発色の程度をスコア評価（スコア０→酸化カルボニル無し、スコア１→酸化カルボニル僅かに形成、スコア２→酸化カルボニル形成、スコア３→酸化カルボニルが非常に多い）し、各群の平均値から酸化カルボニルタンパクの形成および抑制を評価した。上記組織標本は、酸化カルボニル化タンパク質の存在量に応じて、着色度合いが高まる。着色度合いに基づく評価結果を表１５、図１３に示す。また、各試験群の動物の評価スコアの病理組織を図１４に示す。酸化カルボニル化タンパク質が多いものほど病理組織が濃く着色されていることが明らかである。
【００８８】
【表１５】
【００８９】
染色標本の評価に基づく多重検定により、紫外線照射群では明確に酸化カルボニルタンパクが増加しており、試験群３から試験群５におけるポマクティブＨＦＶ摂取群では濃度依存的にマウス皮膚の酸化カルボニルタンパクの抑制が確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアソーム活性化技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、活性酸素による生体内の細胞や組織で見られる様々な酸化傷害が問題になっている。活性酸素は非常に反応性が高く、生体の様々な成分を破壊し、脳卒中、心筋梗塞、白内障、リウマチ、癌、胃潰瘍、皮膚におけるしわやしみなどの様々な疾患に関与することが明らかになっている（非特許文献１）。活性酸素を増加させる要因として、加齢、過度の運動、紫外線暴露、精神的ストレスなどが知られている。活性酸素が増加すると、生体内に酸化タンパク質、いわゆる異常タンパク質が蓄積し、前述したような様々な疾患を引き起こす（非特許文献２）。皮膚においては、特に紫外線暴露による酸化障害の影響が大きく、紫外線暴露により、表皮角化細胞や皮膚線維芽細胞のＤＮＡ損傷、皮膚の弾性成分であるエラスチンやコラーゲンの分解などが起こり、しわやしみの形成を促進することが知られている（非特許文献３）。
【０００３】
これまで、活性酸素による酸化障害を防ぐために、抗酸化物質の摂取、適用により生体内の活性酸素を消去し、タンパク質の酸化を抑制するという試みがなされてきた。代表的な抗酸化物質として、トコフェロール類、カロテノイド類及びフラボノイド類などが知られており、これらのいくつかは食品や化粧品に配合されて利用されている。
しかしながら、抗酸化物質の摂取、適用は、生体内で発生する活性酸素の消去には関与するが、既に蓄積している異常タンパク質の除去には全く関与しない。したがって、生体内に蓄積した異常タンパク質が関与する種々の疾病の改善をするには蓄積している異常タンパク質の除去が必須となる。
【０００４】
生体内の異常タンパク質を除去する酵素として、プロテアソームが知られている。プロテアソームは複雑な分子構成をした巨大な多成分複合体であり、近年その生体内における生理機能の研究が注目されている。プロテアソームは、タンパク質が立体構造を形成する過程で正常な折り畳みや分子集合に支障をきたした異常タンパク質の除去を行い、タンパク質の品質管理の役割を担うとともに、紫外線や酸化ストレスなどにより、変性や傷害を受けたタンパク質を除去することにより、ストレス応答にも密接に関係している（非特許文献４）。このように、プロテアソームは異常タンパク質を除去することにより、細胞の
恒常性を維持、監視する中心的役割を担う物質である。
【０００５】
以上のようなことから、生体内のプロテアソーム活性を促進し、種々の疾病を予防及び改善する組成物が開発されている。例えば、マンネンタケの抽出物を含むプロテアソーム活性促進剤（特許文献１）、特定のペプチド化合物を含むプロテアソーム作用増強剤（特許文献２）、プロテアソーム活性促進作用をもつ大豆由来サポニンを含む異常タンパク質除去用組成物（特許文献３）、及びケール及び／又はその抽出物を含むプロテアソーム活性促進用組成物（特許文献４）が開発されている。
【０００６】
さらに、本発明者は、大豆由来サポニンやケール及び／又はその抽出物のプロテアソーム活性促進成分が、生体内の異常タンパク質を除去するのみではなく、紫外線傷害を予防又は改善する作用をもつことを見出し、大豆由来のサポニンを含むことを特徴とする紫外線傷害予防又は改善用組成物（特許文献５）の開発を行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−２９９９６号公報
【特許文献２】国際公開００／０４０４２号パンフレット
【特許文献３】特開２００２−１７９５９２号公報
【特許文献４】特開２００４−９１３９８号公報
【特許文献５】特開２００４−１３１４３１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】老化のメカニズムと制御、藤本大三郎編著、株式会社アイピーシー、平成５年６月３０日
【非特許文献２】ＢＩＯ Ｃｌｉｎｉｃａ、１１巻、第５号、１９９６年
【非特許文献３】化粧品の有用性・評価技術の進歩と将来展望、日本化粧品技術者会編、薬事日報社、２００１年３月３１日
【非特許文献４】蛋白質 核酸 酵素、第４４巻、第６号、７６６〜７７５頁、１９９９年、共立出版社
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、異常タンパクを除去するプロテアソームを活性化するプロテアソーム活性化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
リンゴ抽出物に着目して試験した結果、リンゴポリフェノールにプロテアソーム活性化作用及び酸化カルボニルタンパク抑制作用があることを知見したことに基づき、本発明を提案する。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）リンゴ抽出物を有効成分とするプロテアソーム活性化剤。
（２）リンゴ抽出物が、リンゴ由来のポリフェノールを含む、（１）に記載のプロテアソーム活性化剤。
（３）リンゴ抽出物が、リンゴ幼果の抽出物である（１）または（２）に記載のプロテアソーム活性化剤。
（４）リンゴ抽出物を有効成分とする酸化カルボニルタンパク抑制剤。
（５）リンゴ抽出物が、リンゴ由来のポリフェノールを含む、（４）に記載の酸化カルボニルタンパク抑制剤。
（６）リンゴ抽出物が、リンゴ幼果の抽出物である（４）または（５）に記載の酸化カルボニルタンパク抑制剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、プロテアソーム活性を増強し、さらに、酸化カルボニルタンパクの生成を抑制する剤である。本発明のリンゴ抽出物は、紫外線に暴露されるとプロテアソームを活性化し、また、酸化カルボニルタンパク質の生成を抑制することから、紫外線暴露により生じた異常タンパク質が蓄積することにより生じる白内障、皮膚がん、皮膚におけるしわやしみなどの予防又は改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】紫外線B波照射時のトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ
【図２】紫外線B波照射時のキモトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ
【図３】紫外線A波照射時のトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ
【図４】紫外線A波照射時のキモトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ
【図５】紫外線A波照射時のリンゴ抽出物（Appl’in）添加による酸化カルボニルタンパク抑制を示すグラフ
【図６】紫外線B波照射時のリンゴ抽出物（Appl’in）添加による酸化カルボニルタンパク抑制を示すグラフ
【図７】紫外線A波照射時のリンゴ抽出物（ポマクティブHFV）添加による酸化カルボニルタンパク抑制を示すグラフ
【図８】紫外線B波照射時のリンゴ抽出物（ポマクティブHFV）添加による酸化カルボニルタンパク抑制を示すグラフ
【図９】リンゴポリフェノール（ポマクティブHFV）を投与したヘアレスマウスに紫外線A・B波を照射した時の肝臓におけるトリプシン様プロテオソーム活性の変動を示すグラフ
【図１０】リンゴポリフェノール（ポマクティブHFV）を投与したヘアレスマウスに紫外線A・B波を照射した時の肝臓におけるキモトリプシン様プロテオソーム活性の変動を示すグラフ
【図１１】リンゴポリフェノール（ポマクティブHFV）を投与したヘアレスマウスに紫外線A・B波を照射した時の皮膚におけるトリプシン様プロテオソーム活性の変動を示すグラフ
【図１２】リンゴポリフェノール（ポマクティブHFV）を投与したヘアレスマウスに紫外線A・B波を照射した時の皮膚におけるキモトリプシン様プロテオソーム活性の変動を示すグラフ
【図１３】リンゴポリフェノール（ポマクティブHFV）を投与したヘアレスマウスに紫外線A・B波を照射した時の皮膚の酸化カルボニルタンパクの変動を示すグラフ
【図１４】リンゴポリフェノール（ポマクティブHFV）を投与したヘアレスマウスに紫外線A・B波を照射した時の皮膚の酸化カルボニルタンパクの変動を観察した免疫染色病理組織標本の写真。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のプロテアソーム活性化剤及び酸化カルボニルタンパク抑制剤は、リンゴ抽出物を有効成分とし、前記リンゴ抽出物が、リンゴ果実の抽出物であることが好ましい。特に、リンゴ幼果抽出物に含まれるポリフェノールを、主成分とすることが好ましい。
【００１５】
リンゴ抽出物には、ポリフェノール、有機酸、アミノ酸などが含まれることが知られている。
リンゴ抽出物は、血管機能改善作用を高めることが可能なBNP調節剤として該抽出物を有効成分として含有してなるBNP調節剤、血行促進剤（特開２００７−００８８３７号公報、特開２００６−２６５２２０号公報）や飲料（特開２００４−３０５０８７号公報）、化粧料配合剤（特開２００１−１８７７２４号公報）、消臭剤成分（特開平１１−３１９０５１号公報）、香料成分（特開平０８−０２３９３９号公報）などに用いられることが知られている。
しかしながら、リンゴ抽出物およびリンゴ由来のポリフェノールについて、プロテアソーム活性化機能があることは知られていない。
【００１６】
以下に、本発明のプロテアソーム活性化剤について、詳細に説明する。
本発明のプロテアソーム活性化剤は、ポリユビキチン化異常タンパク質を分解する酵素であるプロテアソームの活性化剤であって、リンゴ抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
【００１７】
リンゴ抽出物において、リンゴ（Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ）の品種は、例えば、ふじ、国光、王林、紅玉、ジョナゴールド、デリシャス、さんさ、千秋などが挙げられ、特に制限されない。リンゴの抽出部位は、特に制限されず、例えば、果実、葉、幹、花などが挙げられ、好ましくは、果実である。前記果実は、例えば、未熟果（幼果）でも良く、完熟果でも良く、特に制限されない。抽出に用いる前記果実の部位は、特に制限されず、例えば、全果、果肉、果皮、種などが挙げられる。リンゴ抽出物は、これらの部位を、単独で、または２種以上組み合わせて抽出しても良い。
【００１８】
リンゴ抽出物を抽出する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。抽出方法の具体例としては、例えば、以下のようであっても良い。まず、リンゴの全果を、水洗後、グラインダーなどにより粉砕する。この粉砕物を、ペクチナーゼ処理に供し、遠心分離後、抽出溶媒により分配ろ過して、リンゴ抽出物を調製しても良い。前記ペクチナーゼ処理としては、特に制限されないが、例えば、２０〜６０℃の温度条件化で、ペクチナーゼを１０〜５０ｐｐｍ添加して行っても良い。抽出溶媒としては、特に制限されないが、例えば、ヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒が挙げられる。
【００１９】
本発明において、リンゴ抽出物は、例えば、市販のリンゴ抽出物を用いても良く、リンゴ果実から抽出して調製しても良く、特に制限されない。
本発明のプロテアソーム活性化剤及び酸化カルボニルタンパク抑制剤は、リンゴ由来のポリフェノールを含むリンゴ抽出物が好ましい。
【００２０】
ポリフェノールの分画方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。ポリフェノールは、例えば、リンゴ抽出物をカラムに通液後、カラムの吸着物を溶出し、この溶出画分を減圧留去濃縮して分画しても良い。また、さらに、この濃縮液に粉末助剤を添加し、凍結乾燥または噴霧乾燥して、ポリフェノール粉末を調製しても良い。
【００２１】
本発明において、ポリフェノールは、例えば、市販のリンゴ由来のポリフェノール含有物を用いても良く、リンゴ果実から抽出および分画して調製しても良く、特に制限されない。
【００２２】
本発明のプロテアソーム活性化剤は、紫外線暴露により発生した活性酸素により産生された細胞内の変性タンパク質（異常タンパク質）を分解するプロテアーゼを活性化し、紫外線暴露による細胞傷害を抑制することにより、白内障、皮膚癌、皮膚におけるしわやしみなどの様々な疾患を予防及び改善することができる。また、酸化カルボニルタンパク抑制剤は、紫外線照射による酸化カルボニルタンパク質の生成を抑制することができる。
【実施例】
【００２３】
（１）試料及び正常ヒト皮膚線維芽細胞の培養
[リンゴ抽出物試料]
リンゴ抽出物としては、
・アップルフェノンSH（アサヒフード アンド ヘルスケア、総ポリフェノール（UV 法）９８％以上）
・Appl’in（清田産業、総ポリフェノール（UV法）８０％以上）
・ポマクティブHFV（ユニテックフーズ、総ポリフェノール（UV法）９０％以上）
をサンプルとし、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、GIBCO社製）に添加し、評価検体であるリンゴ抽出物含有液を作製した。
【００２４】
［正常ヒト皮膚線維芽細胞の培養］
新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＦＢ、三光純薬）を線維芽細胞用培地（ＦＢＭ、三光純薬）で３７℃−５％ＣＯ２インキュベーターにて培養した。
ＦＢＭにヒト線維芽細胞増殖因子（１μｇ／ｍｌ）、インシュリン（５ｍｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、アンフォテリシンＢ（５０μｇ／ｍｌ）を添加して継代培養に用いた。本実験には集団倍加数（population doubling level：PDL）がPDL２０〜４０の若い細胞を紫外線B波照射の試験に使用し、PDL４０〜６０の老化した細胞を紫外線A波照射の試験に使用した。トリプシン処理で剥がした線維芽細胞の細胞数をコールターカウンターで計測し、２０００００cells/mlの細胞密度になるように調整した。
【００２５】
（２）細胞培養と紫外線照射
［リンゴ抽出物含有液の紫外線B波傷害］
PDL２０〜４０の若い細胞を６ウェル平底プレートに１０５個／ウェルの細胞密度で播種し、２４時間培養した。
紫外線照射前に、前記リンゴ抽出物含有液の最終濃度が１０μg/mlとなるように添加し、２４ｈ培養した。培養液を廃棄し、細胞をHanｋ’ｓ（−）液（ハンクス緩衝塩類溶液、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋非含有）で洗浄後、再度Hanｋ’ｓ（−）液を添加し、プレートに蓋をしない状態でＵＶＢを２．５Ｗ/ｍ2で３分間照射した（５０ｍＪ／ｃｍ２）。対照として、ＵＶＢを照射しない群の細胞も作製した。照射終了後、直ちにHank’s（−）液を評価検体であるリンゴ抽出物を１０μg/ml含有する５％ＦＢＳ及び１％ＤＭＳＯ含有ＤＭＥＭに置換し、２４h培養した。
【００２６】
［リンゴ抽出物含有液の紫外線A波傷害］
PDL４０〜６０の老化した細胞を６ウェル平底プレートに１０５個／ウェルの細胞密度で播種し、２４時間培養した。紫外線照射前に、前記リンゴ抽出物含有液の最終濃度が１０μg/mlとなるように添加し、２４ｈ培養した。培養液を廃棄し、細胞をHanｋ’ｓ（−）液で洗浄後、再度Hanｋ’ｓ（−）液を添加し、プレートに蓋をしない状態でＵＶAを３０Ｗ/ｍ2で１．５時間照射した（１５Ｊ／ｃｍ２）。対照として、ＵＶＡを照射しない群の細胞も作製した。照射終了後、直ちにHank’s液を評価検体であるリンゴ抽出物を１０μg/ml含有する５％ＦＢＳ及び１％ＤＭＳＯ含有ＤＭＥＭに置換し、２４h培養した。
【００２７】
以後のプロテアソーム活性測定操作は紫外線B波および紫外線A波を照射した試験で共通している。
（３）細胞懸濁液回収、プロテアソーム活性溶液調整、タンパク濃度の測定
培養液を除去しＰＢＳ（−）で各ウェルを洗浄後、各ウェルにトリプシン-ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を８００μｌ添加し、３７℃で５分間処理して線維芽細胞をディッシュ底面から剥離させ、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ１.５ｍｌでトリプシン反応を終止した。溶液と一部底着したままの細胞についてはスクレーパー処理で細胞を１５ｍｌ容遠沈管に回収した。１，５００rpm ５minの条件で遠沈して培養液を除去、ＰＢＳ（−）で洗浄し再び１，５００rpm ５minの条件で遠沈してＤＭＥＭ中の色素（フェノールレッド）を完全に除去した。
この細胞塊をホモジナイズＢｕｆｆｅｒ(５０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭＭｇＣｌ２、５％（v/v）グリセリン、pH=７．５)３００μｌに懸濁させた。その後、氷冷中でホモジナイズ処理（ＵＤ−２０１超音波破砕装置、ＴＯＭＹ製を使用、条件は「ＯＵＴ ＰＵＴ １、ＤＵＴＹ４０、１５secを２set」）した。ホモジナイズ溶液を１．５ｍｌ容エッペンチューブに全量移し、１５,０００ｒｐｍで１０min遠心分離して上清をプロテアソーム活性溶液として回収した。
このプロテアソーム活性溶液について、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に準拠してＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、SIGMA社製）換算で全タンパク量を求めた。
発色試薬はＢｉｏ−Ｒａｄ protein assay（脱イオン水で５倍希釈）を用いた。
平板９６ウェルプレートに、
プロテアソーム活性溶液／BSA 溶媒：ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ １０μｌ
Ｂｉｏ−Ｒａｄ protein assay（脱イオン水で5倍希釈） ２００μｌ
を加えて１０min室温にてプレートごとに撹拌反応した。吸光度５９０nmをプレートリーダーで計測し、ＢＳＡ溶液で作成した検量線について全タンパク濃度を求めた。
【００２８】
（４）プロテアソーム活性の測定
トリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ
（ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルギニル−４−メチル−クマリル−７−アミド）（ペプチド研究所）、
キモトリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ（キモトリプシン様プロテアソーム活性を測定するための基質として、サクシニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−Ｌ−チロシル−４−メチル−クマリル−７−アミド（ペプチド研究所））（ペプチド研究所）、をそれぞれ１０ｍＭ（溶媒、ＤＭＳＯ）で調整し、３０μｌずつを分注して−２０℃冷凍保存した。使用時に解凍し６００μｌの反応液で希釈して使用した。
蛍光分析用平板９６ウェルプレートに以下の溶液をそれぞれ加えた。
1. 基質ペプチド（トリプシン様／キモトリプシン様） １０．５μｌ （蛍光分 析時の基質ペプチド濃度２３．８μM）
2. 反応液（１００mMトリス塩酸、１mM ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、pH=８．０） ２５μｌ
3. １０mM ATP含有ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ １９．５μｌ（蛍光分析時のＡＴ Ｐ濃度は０．９７５ｍＭ）
4. プロテアソーム活性サンプル（cell lysate） ２０μｌ
３７℃で１h撹拌反応した。反応終了後に、
5. １０%(w/v) SDS（反応停止液） ２５μｌ
6. １００mMトリス塩酸（pH=９．０） １００μｌ （全量２００μｌ/well）
として、プロテアソームによって基質ペプチドから遊離した７−アミノ−４−メチルクマリン（ＭＣＡ）由来の蛍光強度（励起波長Ｅｘ３８０ｎｍ、蛍光波長Ｅｍ４４０nm）を測定した。
【００２９】
（５）データ処理
（蛍光強度／タンパク濃度）で算出されるプロテアソーム活性について、ＵＶ（−）のコントロール群を基準（１．００）とし、平均値で他の各群と比較した。
遊離した７−アミノ−４−メチルクマリンの蛍光強度を励起波長（Ｅｘ）３８０ｎｍ、吸収波長（Ｅｍ）４４０ｎｍで測定した。結果はリンゴ抽出物含有液を各濃度で処理した３試料の測定値から、平均±標準偏差を計算し、グラフ化した。
統計解析は多重比較検討としてDunnett test（vs UV A or UV B＋ コントロール群**:p<０．０１, *p<０．０５）を行った。また、p値が０．０５＜ｐ＜０．１を有意傾向として表記した。
【実施例１】
【００３０】
［紫外線B波照射時のプロテアソーム活性］
PDL２６の若い状態の線維芽細胞を用いて、リンゴ抽出物のプロテアソーム活性化評価を行った。
試験群１ 紫外線B波 非照射 コントロール群
試験群２ 紫外線B波 照射 コントロール群
試験群３ 紫外線B波 照射 １０μｇ／ｍｌアップルフェノンSH 添加
試験群４ 紫外線B波 照射 １０μｇ／ｍｌAppl’in添加
試験群５ 紫外線B波 照射 １０μｇ／ｍｌポマクティブHFV添加
【００３１】
図１に紫外線B波照射時のトリプシン様プロテアソーム活性を、表１にDunnett testの結果を示す。
紫外線B波照射条件時のトリプシン様活性では、試験群２の紫外線B波照射群が試験群１の紫外線B波未照射群（ｐ値０．０４６５）に対してプロテアソーム活性が低下していた。また、試験群４（ｐ値０．０２５６）および試験群５（ｐ値０．０１６９）が、試験群２に対して有意にプロテアソームが活性化したことから、リンゴ抽出物である「Appl’in」及び「ポマクティブHFV」は、若い状態の線維芽細胞のトリプシン様プロテアソームを活性化することが分かった。
【００３２】
【表１】
【実施例２】
【００３３】
図２に紫外線B照射時のキモトリプシン様プロテアソーム活性を、表２にDunnett testの結果を示す。
紫外線B照射時のキモトリプシン様活性では、試験群２の紫外線B波照射群が試験群１の紫外線B波未照射群（ｐ値０．０００７３４）に対してプロテアソーム活性が低下していた。また、試験群３（ｐ値０．０００７３９）、試験群４（ｐ値０．００００２５５）および試験群５（ｐ値０．００００５１１）のいずれもが試験群２の紫外線B波照射群に対して有意にプロテアソームが活性化したことから、リンゴ抽出物である「アップルフェノンSH」、「Appl’in」及び「ポマクティブHFV」は、若い状態の線維芽細胞のキモトリプシン様プロテアソームを活性化することが分かった。
【００３４】
【表２】
【実施例３】
【００３５】
［紫外線A波照射時のプロテアソーム活性］
PDL５０の老化した状態の線維芽細胞を用いて、リンゴ抽出物のプロテアソーム活性化評価を行った。
試験群１ 紫外線A波 非照射 コントロール群
試験群２ 紫外線A波 照射 コントロール群
試験群３ 紫外線A波 照射 １０μｇ／ｍｌアップルフェノンSH 添加
試験群４ 紫外線A波 照射 １０μｇ／ｍｌAppl’in添加
試験群５ 紫外線A波 照射 １０μｇ／ｍｌポマクティブHFV添加
【００３６】
図３に紫外線A照射時のトリプシン様プロテアソーム活性を、表３にDunnett testの結果を示す。
紫外線A波照射条件時のトリプシン様活性では、試験群２の紫外線A波照射群が試験群１の紫外線A波未照射群（ｐ値０．０１３７）に対してプロテアソーム活性が低下していた。また、試験群３は試験群２の紫外線A波照射群に対して有意（ｐ値０．０３４７）にプロテアソ−ム活性が上がった。また、試験群４は有意傾向（ｐ＝０．０９３７）でプロテアソームが活性化した。このことから、リンゴ抽出物である「アップルフェノンSH」、「Appl’in」は、老化した状態の線維芽細胞のトリプシン様プロテアソームを活性化することが分かった。
【００３７】
【表３】
【実施例４】
【００３８】
図４に紫外線A照射時のキモトリプシン様プロテアソーム活性を、表４にDunnett testの結果を示す。
紫外線A照射時のキモトリプシン様活性では、試験群２の紫外線A波照射群が試験群１の紫外線A波未照射群（ｐ値０．０６８１、有意傾向）に対してプロテアソーム活性が低下していた。また、試験群３は試験群２の紫外線A波照射群に対して有意（ｐ値０．００３７０）にプロテアソ−ム活性が上がった。また、試験群４も有意（ｐ＝０．０１２０）でプロテアソームが活性化した。このことから、リンゴ抽出物である「アップルフェノンSH」、「Appl’in」は、老化した状態の線維芽細胞のキモトリプシン様プロテアソームを活性化することが分かった。
【００３９】
【表４】
【００４０】
以上の結果から、リンゴ抽出物には線維芽細胞の状態（若い或いは老化）を問わず、細胞内のプロテアソームを活性化させるという顕著な機能を有することが分かった。
【００４１】
［酸化カルボニルタンパクの測定］
（１）タンパク濃度０．１〜０．４μｇ／μｌの範囲で凍結保存していた線維芽細胞由来のサンプルを自然解凍後にトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）処理してタンパク沈殿し、２０μｇタンパク重量に相当するサンプルを用意した。そのサンプルについて、カルボニル化蛋白質測定キット（日研ザイル製）で酸化カルボニルタンパク量を定量した。具体的には、前処理したサンプル、スタンダード、コントロール、各２００μｌをウェルに分注し、プレートをシールして、４℃一晩反応させた。EIAバッファー ３００μｌ/ウェルにて５回洗浄後に、全てのウェルに「希釈済みブロッキング試薬」を２５０μｌ/ウェル分注し、室温にて３０分 インキュベート後にEIAバッファー ３００μｌ/ウェルにて５回洗浄、そして、ビオチン標識-抗DNP抗体を２００μｌ分注し、３７℃にて１時間インキュベートした。EIAバッファー ３００μｌ/ウェルにて５回洗浄、「希釈済み HRP標識-ストレプトアビジン」を２００μｌ分注し、室温にて１時間インキュベートした。EIAバッファー ３００μｌ/ウェルにて５回洗浄、「発色液」を２００μｌ/ウェル分注し、室温にて各ウェルでの反応時間が５分になるよう調整し、「反応停止液」を１００μｌ/ウェル分注し、反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４２】
（２）データ処理
反応生成物であるｐ−ニトロアニリン由来の吸光度４５０ｎｍを測定し、カルボニル化蛋白質測定キットに付属している標準カルボニルタンパクで作成した検量線に対する各サンプルのカルボニル化タンパクを測定した。
【実施例５】
【００４３】
[紫外線A波照射時のAppl’in添加による酸化カルボニル抑制]
PDL５０の老化した状態の線維芽細胞を用いて評価した。
試験群１ 紫外線A波 非照射 コントロール群
試験群２ 紫外線A波 照射 コントロール群
試験群３ 紫外線A波 照射 １０μｇ／ｍｌAppl’in添加
【００４４】
図５に紫外線A照射時の酸化カルボニル量を、表５にDunnett testの結果を示す。
紫外線A照射時の酸化カルボニル量は、試験群２の紫外線A波照射群が試験群１の紫外線A波未照射群（ｐ値０．０００６４５）に対して増加していた。また、試験群３の１０μｇ／ｍｌAppl’in添加群が試験群２の紫外線A波照射群に対して有意（ｐ値０．００７２０）に酸化カルボニルを抑制していた。
【００４５】
【表５】
【実施例６】
【００４６】
[紫外線B波照射時のAppl’in添加による酸化カルボニル抑制]
PDL２６の若い状態の線維芽細胞を用いて評価した。
試験群１ 紫外線B波 非照射 コントロール群
試験群２ 紫外線B波 照射 コントロール群
試験群３ 紫外線B波 照射 １０μｇ／ｍｌAppl’in添加
【００４７】
図６に紫外線B照射時の酸化カルボニル量を、表６にDunnett testの結果を示す。
紫外線B照射時の酸化カルボニル量は、試験群２の紫外線B波照射群が試験群１の紫外線B波未照射群（ｐ値０．０００２１４）に対して増加していた。また、試験群３の１０μｇ／ｍｌAppl’in添加群が試験群２の紫外線B波照射群に対して有意（ｐ値０．００１９２）に酸化カルボニルを抑制していた。
【００４８】
【表６】
【実施例７】
【００４９】
[紫外線A照射時におけるポマクティブHFVの酸化カルボニルタンパク抑制]
PDL５４の老化した線維芽細胞を用いて評価した。
試験群１ 紫外線A波 非照射 コントロール群
試験群２ 紫外線A波 照射 コントロール群
試験群３ 紫外線A波 照射 １０μｇ／ｍｌポマクティブHFV添加
【００５０】
図７に紫外線A波照射時の酸化カルボニル量を、表７にDunnett testの結果を示す。
紫外線A照射時の酸化カルボニル量は、試験群２の紫外線A波照射群が試験群１の紫外線A波未照射群（ｐ値０．００２３０）に対して増加していた。また、試験群３の１０μｇ／ｍｌポマクティブHFV添加群が試験群２の紫外線A波照射群に対して有意（ｐ値０．００１５１）に酸化カルボニルを抑制していた。
【００５１】
【表７】
【実施例８】
【００５２】
[紫外線B照射時におけるポマクティブHFVの酸化カルボニルタンパク抑制]
PDL２７の若い線維芽細胞を用いて評価した。
試験群１ 紫外線B波 非照射 コントロール群
試験群２ 紫外線B波 照射 コントロール群
試験群３ 紫外線B波 照射 １０μｇ／ｍｌポマクティブHFV添加
【００５３】
図８に紫外線B波照射時の酸化カルボニル量を、表８にDunnett testの結果を示す。
紫外線B照射時の酸化カルボニル量は、試験群２の紫外線B波照射群が試験群１の紫外線B波未照射群（ｐ値０．０００１３９）に対して増加していた。また、試験群３の１０μｇ／ｍｌポマクティブHFV添加群が試験群２の紫外線B波照射群に対して有意（ｐ値０．００１９３）に酸化カルボニルを抑制していた。
【００５４】
【表８】
【００５５】
以上の結果から、リンゴ抽出物であるAppl’inやポマクティブHFVは、線維芽細胞の状態（若い或いは老化）を問わず、いずれも紫外線惹起性の酸化カルボニルタンパクを抑制除去する効果に優れていることが分かった。
【実施例９】
【００５６】
［光老化動物による試験］
紫外線Ａ（ＵＶＡ）波および紫外線Ｂ（ＵＶＢ）波をヘアレスマウスに照射させてシワを形成させる試験系によりポマクティブＨＦＶのシワの抑制および皮膚老化抑制効果について確認試験を行った。
導入時６週齢のヘアレスマウス（Ｈｏｓ：ＨＲ−１雌）を用いて試験を行った。
【００５７】
（１）試験対象物の調製および投与
ヘアレスマウスの群分けは投与開始日に、一般状態が良好な動物を体重により、群間での差が無いように１群６匹に振り分けた。なお、各々の個体は１ゲージ/群で飼育とした。
マウス用飼料ＭＦ（オリエンタルバイオサービス製）に、それぞれポマクティブＨＦＶを均一に混合処理し、自由摂取させた。投与群と配合成分の一覧を表９に示す。
【００５８】
【表９】
【００５９】
混餌飼料の投与は動物搬入直後から解剖１８時間前までとした。
【００６０】
（２）ＵＶ照射
ＵＶ照射は、動物を専用のケージに移し、１群ずつＵＶＢ２０ｍＪ／ｃｍ２およびＵＶＡ１０Ｊ／ｃｍ２を照射した。照射は週三回とし、このサイクルを１０週間繰り返した。
【００６１】
（３）解剖
各群、本飼育期間終了翌日より１８時間絶食させた後、氷冷したＡｖｅｒｔｉｎ（２，２，２−トリブロモエタノール）０．５ｍｇ／ｋｇＢＷを腹腔内投与して麻酔した。その後、皮膚背部の尾付け根より首に向かい２ｃｍ、腰椎から右側に０.５ｃｍ部位範囲で反射型レプリカ（（有）アサヒバイオメッド製）を採取した。次いで開腹し解剖を行った。皮膚組織はメタカン固定液（メタノール：クロロホルム：酢酸＝6：3：1（ｖ／ｖ／ｖ））で浸潤、パラフィン包埋処理し、組織染色実験時に５μｍの厚さでスライドガラスに貼付した。
【００６２】
（４）皮膚形態観察シワ体積率計測
皮膚表面部の写真撮影と採取したレプリカの判定を行った。シワ形成度合を指標としてＡＳＡ−０３ＲＸＤ（（有）アサヒバイオメッド製）を用いてシワ体積率％(μｍ３／ｍｍ２／１００) を算出した。
紫外線照射第４週目頃よりＵＶ照射動物において、頭部の皮膚の軽度褐色化や頸部のしわの深さならびに後肢背部のしわがＵＶ非照射動物に比較して目立つようになった。
解剖時の外観観察では、ＵＶ照射動物で顔、頸部および後肢背部のしわが明瞭に確認されたが、ＵＶ照射においても高濃度（０．０６％）、中濃度（０．０１２％）および低濃度（０．００６％）ポマクティブＨＦＶを摂取したマウスではその症状は軽度であり、特に高濃度摂取動物のしわの深度が浅く、肉眼的にはしわの程度が皆無であった。また、ポマクティブＨＦＶ摂取動物は、コントロール群に比較して皮膚にしっとり感があり、特に高濃度摂取群でその症状は顕著に感じられた。
【００６３】
表１０に結果を示すが、紫外線照射により明確なシワの形成が認められた。特に、同一線量の紫外線照射条件下で 混餌群ではポマクティブＨＦＶの濃度依存的にシワ抑制効果が有意に認められた。特に０．０６％および０．０１２％混餌で有意にシワ体積率を抑制した。
【００６４】
【表１０】
【００６５】
（５）マウス肝臓のプロテアソーム活性
測定試料の調整
上記の解剖で得たマウス肝臓を１００ｍｇから２００ｍｇの範囲で湿重量を秤量し、以下の条件でホモジナイズした。
【００６６】
ホモジナイズ条件
肝臓：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．５，グリセロール、DTT、MgCl2含有）＝１：３（ｗ／ｖ）
ホモジナイザー（ＵＤ−２０１超音波破砕装置、ＴＯＭＹ製を使用、条件は「ＯＵＴ ＰＵＴ ２、ＤＵＴＹ４０、３０secを２set」）。
【００６７】
試験溶液の調整
このホモジネートを遠心分離（１０，０００ｇ、３０分間、４℃）して上澄み画分を採取し、これを再度遠心分離（２０，０００ｇ、３０分間、４℃）し、得られた上澄み画分をプロテアソーム活性測定試験溶液とした。
【００６８】
タンパク質量の測定
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に準拠してＢＳＡ換算で全タンパク量を求めた。
発色試薬はＢｉｏ−Ｒａｄprotein assay（バイオラッド社）を用いた。平板96ウェルプレートに、プロテアソーム活性測定溶液1μｌ、ホモジナイズ緩衝液 ９μｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ protein assay（脱イオン水で5倍希釈） 200μｌを加えて10min室温にて撹拌して反応させた。次いで590nmの吸光度を、プレートリーダーを用いて測定した。次いで得られた吸光度からＢＳＡ溶液で作成した検量線を用いて全タンパク質濃度（０．７〜１．５μg/μｌの範囲）を求めた。
【００６９】
プロテアソーム活性の測定
トリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（ペプチド研究所）キモトリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ（ペプチド研究所）をそれぞれ１０ｍＭ（溶媒；ＤＭＳＯ）に調整し、30μｌずつを分注して−20℃冷凍保存し、使用時に解凍し600μｌの反応液で希釈して使用した。
蛍光分析用平板96ウェルプレートに以下の溶液をそれぞれ加えた。
1. 基質ペプチド（トリプシン様／キモトリプシン様） 10.5μｌ （蛍光分析 時の基質ペプチド濃度23.8μM）
2. 反応液（100mMトリス塩酸、1mM ＤＴＴ、5ｍＭ ＭｇＣｌ2、pH=8.0） 25μｌ
3. 10mM ATP含有ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ 19.5μｌ（蛍光分析時のＡＴＰ濃 度は0.975ｍＭ）
4. ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ 15μｌ
5. マウス肝臓プロテアソーム活性サンプル 5μｌ
37℃３０分間撹拌反応。反応終了後に、
6. 10%(w/v) SDS（反応停止液） 25μｌ
7. 100mMトリス塩酸（pH=9.0） 100μｌ
１ウエル当たり全量200μｌとして37℃30分間インキュベートし、基質ペプチドから遊離したＭＣＡ由来の蛍光強度（Ｅｘ３８０ｎｍ、Ｅｍ４４０nm）を測定し、プロテアソーム活性を求めた。
【００７０】
データ処理
蛍光強度／タンパク濃度 で算出されるプロテアソーム活性値を、紫外線非照射動物（ＵＶ（−））を対照（１．００）として活性値をもとめ、各動物個体の活性値を平均して、試験群の値として表した。
【００７１】
測定結果
測定結果を表１１、表１２及び図９、図１０、に示す。
【００７２】
【表１１】
【００７３】
【表１２】
【００７４】
以上の試験結果から以下のことが明らかになった。
すなわち、
Ａ．コントロール食群では、紫外線照射の有無でマウス肝臓のプロテアソーム活性に 有意な差は無かった。
Ｂ．トリプシン様活性は、ポマクティブＨＦＶ０．０６％（ｐ＝０．０１０８）混餌 群で有意な活性上昇が確認された。
Ｃ．キモトリプシン様活性は、ポマクティブＨＦＶ０．０１２％（ｐ＝ ０．０１３２）および０．０６％（ｐ＝０．０００００１６０）混餌群で有意な 活性上昇が確認された。
Ｄ．従ってポマクティブＨＦＶ投与によりマウス肝臓におけるプロテアソーム活性化 効果が確認できた。
すなわち、本発明により肝臓のプロテアソームが活性化され、異常タンパク質を除去する機能が高まり、種々の疾病予防に寄与する事が可能となった。
【００７５】
（６）マウス皮膚のプロテアソーム活性の測定
測定試料の調整
次のホモジナイズ条件で背部ヒフ試料をホモジナイズ処理した。
【００７６】
ホモジナイズ条件
背部皮膚（前足周縁）：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、グリセロール、DTT、MgCl2 含有）＝１：３（ｗ／ｖ）
ホモジナイザーを使用して試料調製した（ＵＤ−２０１超音波破砕装置、ＴＯＭＹ製を使用、条件は「ＯＵＴ ＰＵＴ 5(皮膚は肝臓よりも硬組織なので、激しいホジナイズを実施した、ＤＵＴＹ４０、３０secを２set」）。
【００７７】
試験溶液の調整
得られたホモジネートを遠心分離（１０，０００ｇ、３０分間、4℃）し、上澄み画分を引き続き遠心分離（２０，０００ｇ、３０分間、4℃）した。得られた上澄み画分をプロテアソーム活性測定試験溶液とした。
【００７８】
タンパク質量の測定
上記と同様に、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に準拠してＢＳＡ換算で全タンパク量を求めた。
発色試薬はＢｉｏ−Ｒａｄprotein assayを用いた。平板96ウェルプレートに、プロテアソーム活性測定溶液1μｌ、ホモジナイズ緩衝液 ９μｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ protein assay（脱イオン水で5倍希釈） 200μｌを加えて10min室温にて撹拌して反応させた。次いで590nmの吸光度をプレートリーダーを用いて測定した。次いで得られた吸光度からＢＳＡ溶液で作成した検量線を用いて全タンパク質濃度（０．７〜１．５μg/μｌの範囲）を求めた。
【００７９】
プロテアソーム活性の測定
トリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（ペプチド研究所）キモトリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ（ペプチド研究所）をそれぞれ１０ｍＭ（溶媒；ＤＭＳＯ）に調整し、30μｌずつを分注して−20℃冷凍保存し、使用時に解凍し600μｌの反応液で希釈して使用した。
蛍光分析用平板96ウェルプレートに以下の溶液をそれぞれ加えた。
1. 基質ペプチド（トリプシン様／キモトリプシン様） 10.5μｌ （蛍光分析時 の基質ペプチド濃度23.8μM）
2. 反応液（100mMトリス塩酸、1mM ＤＴＴ、5ｍＭ ＭｇＣｌ2、pH=8.0） 25μｌ
3. 10mM ATP含有ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ 19.5μｌ（蛍光分析時のＡＴＰ濃度 は0.975ｍＭ）
4. マウス皮膚プロテアソーム活性サンプル ２０μｌ
37℃３０分間撹拌反応。反応終了後に、
5. 10%(w/v) SDS（反応停止液） 25μｌ
6. 100mMトリス塩酸（pH=9.0） 100μｌ
１ウエル当たり全量200μｌとして37℃30分間インキュベートし、基質ペプチドから遊離したＭＣＡ由来の蛍光強度（Ｅｘ３８０ｎｍ、Ｅｍ４４０nm）を測定し、プロテアソーム活性を求めた。
【００８０】
データ処理
蛍光強度／タンパク濃度 で算出されるプロテアソーム活性を、紫外線非照射動物（ＵＶ（−））を対照（１．００）としてもとめ、各動物個体の活性値の平均値を試験群の値として表した。
【００８１】
測定結果
測定結果を表１３、表１４ 及び図１１、図１２に示す。
【００８２】
【表１３】
【００８３】
【表１４】
【００８４】
以上の試験結果から次の点が明らかとなった。
Ａ．コントロール食群において、紫外線照射の有無でマウス皮膚のプロテアソーム活 性に有意な差は無かったが紫外線照射群の皮膚でプロテアソーム活性が低下する 傾向が認められた。
Ｂ．トリプシン様活性はポマクティブＨＦＶ０．０６％混餌群（ｐ＝０．０１５３） で有意な活性上昇が確認された。
Ｃ．キモトリプシン様活性において、ポマクティブＨＦＶ０．０６％混餌群（ｐ＝ ０．０１０３）で有意な活性上昇が確認された。
Ｄ．以上の結果からポマクティブＨＦＶ投与によるマウス皮膚におけるプロテアソー ム活性化作用が証明された。
【００８５】
従って、本発明により皮膚の異常タンパク質を除去する機能が高まり、種々の疾病予防に寄与する事が期待できる。
【００８６】
（７）マウス皮膚の酸化カルボニルタンパクの抑制効果の確認
プロテアソーム活性化によって酸化タンパク質の一種であるカルボニル化タンパク質の抑制を確認した。
上記（３）で得たメタカン固定液浸潤してパラフィン包埋した５μmマウス皮膚切片を、免疫組織染色の手法を用いて評価した。抗体等の試薬はカルボニル化タンパク質免疫組織染色キット（株式会社シマ研究所）を用いた。
脱パラフィン処理、親水化は公知の方法に基づいて実施した。それぞれの皮膚切片サンプルに対し本キットに付属のDNPH溶液を室温で30分間反応させた。DNPHは２，４−ジニトロフェニルヒドラジンの略語である。DNPH反応終了後、２％塩酸を５分間、８０％エタノールを５分間、１００％エタノールを５分間、５０％エタノール／５０％酢酸を５分間、８０％エタノールを１分間、蒸留水で１分間順次洗浄した。常温下0.3％過酸化水素含有メタノールで３０分反応させて内因性ペルオキシダーゼを阻害した。水洗、10mMPBS(-)洗浄後、ブロッキング液２％BSA/PBS‐２％ヤギ血清を３０分間ブロッキング反応、ブロッキング終了後にPBS（−）で５分間３回洗浄し、１次抗体（本キット付属のウサギ抗DNPポリクローナル抗体の１００倍希釈、希釈液はブロッキング溶液）を１時間室温で反応させた。PBS（−）で2回洗浄し、ビオチン化二次抗体（ビオチン化抗ウサギ免疫グロブリンG；ＤＡＫＯ製）を２００倍希釈したものを３０分間室温で反応させた。PBS（−）で２回洗浄し、ABC試薬（アビジン−ビオチン複合体ABC-HRP；Dako製）を３０分間室温にて反応させた。PBS（−）で２回洗浄し、発色試薬としてDAB（３,３-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド：DAKO製）を用いて４分常温下で反応させた。水洗後、脱水、封入処理を行い、酸化カルボニル化タンパク質の病理組織標本を得た。
【００８７】
得られた病理組織標本を顕微鏡で染色状況を観察し、DAB発色の程度をスコア評価（スコア０→酸化カルボニル無し、スコア１→酸化カルボニル僅かに形成、スコア２→酸化カルボニル形成、スコア３→酸化カルボニルが非常に多い）し、各群の平均値から酸化カルボニルタンパクの形成および抑制を評価した。上記組織標本は、酸化カルボニル化タンパク質の存在量に応じて、着色度合いが高まる。着色度合いに基づく評価結果を表１５、図１３に示す。また、各試験群の動物の評価スコアの病理組織を図１４に示す。酸化カルボニル化タンパク質が多いものほど病理組織が濃く着色されていることが明らかである。
【００８８】
【表１５】
【００８９】
染色標本の評価に基づく多重検定により、紫外線照射群では明確に酸化カルボニルタンパクが増加しており、試験群３から試験群５におけるポマクティブＨＦＶ摂取群では濃度依存的にマウス皮膚の酸化カルボニルタンパクの抑制が確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンゴ抽出物を有効成分とするプロテアソーム活性化剤。
【請求項２】
リンゴ抽出物が、リンゴ由来のポリフェノールを含む、請求項１に記載のプロテアソーム活性化剤。
【請求項３】
リンゴ抽出物が、リンゴ幼果の抽出物である請求項１または２記載のプロテアソーム活性化剤。
【請求項４】
リンゴ抽出物を有効成分とする酸化カルボニルタンパク抑制剤。
【請求項５】
リンゴ抽出物が、リンゴ由来のポリフェノールを含む、請求項４に記載の酸化カルボニルタンパク抑制剤。
【請求項６】
リンゴ抽出物が、リンゴ幼果の抽出物である請求項４または５記載の酸化カルボニルタンパク抑制剤。
【請求項１】
リンゴ抽出物を有効成分とするプロテアソーム活性化剤。
【請求項２】
リンゴ抽出物が、リンゴ由来のポリフェノールを含む、請求項１に記載のプロテアソーム活性化剤。
【請求項３】
リンゴ抽出物が、リンゴ幼果の抽出物である請求項１または２記載のプロテアソーム活性化剤。
【請求項４】
リンゴ抽出物を有効成分とする酸化カルボニルタンパク抑制剤。
【請求項５】
リンゴ抽出物が、リンゴ由来のポリフェノールを含む、請求項４に記載の酸化カルボニルタンパク抑制剤。
【請求項６】
リンゴ抽出物が、リンゴ幼果の抽出物である請求項４または５記載の酸化カルボニルタンパク抑制剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１２−３１１３３（Ｐ２０１２−３１１３３Ａ）
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−３９４９９（Ｐ２０１１−３９４９９）
【出願日】平成２３年２月２５日（２０１１．２．２５）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２５日（２０１１．２．２５）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
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