プロテアーゼ検出
発色性アミノ酸を含むポリペプチド。該発色性アミノ酸がそのＮおよびＣ末端において少なくとも１つのアミノ酸に隣接している。該発色性アミノ酸のアミン基は５未満のｐＫａを有する。該発色性アミノ酸は共役アルデヒドと反応可能である。該ポリペプチドは、該発色性アミノ酸のアミノ基を含むペプチド結合を切断しうる標的プロテアーゼに対する標的配列を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発色性アミノ酸を含むポリペプチド、そのようなポリペプチドを含む産物、およびそのようなポリペプチドの製造方法に関する。本発明はまた、プロテアーゼ酵素の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質分解の測定に使用される多数の試薬または化合物が当技術分野で公知である。これらには、タンパク質分解により切断されると指示部分または不安定分子を遊離する合成的に修飾されたポリペプチド基質、例えば、Ｃ末端においてｐ−ニトロアニリドまたはナプチルアミンとして修飾された合成ポリペプチドが含まれる。例えば、ＥＰ−Ａ−０８６４８６４は、発色性ペプチドではなく蛍光性ペプチドであるＤｎＰ−Ｐｒｏ−β−シクロヘキシル−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｕ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｎ−Ｍｅ−ＡｂＺ）−ＮＨ２を使用する、プロテアーゼ酵素の検出を開示している。Ｐｌａｐｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ １９６５，３０，１７８１は、アルギニンの誘導体である、トリプシンにより切断される発色性基質に関して報告している。
【０００３】
そのようなペプチド基質のＣ末端からｐ−ニトロアニリンが切断され溶液中に遊離した後、ＵＶ吸収の増加が測定されうる。ナフチルアミンを含むペプチド基質の場合、遊離した発色性部分は追加的なレポーター分子により捕捉されて、視認可能な変色をもたらしうる。例えば歯周病の診断を補助するためのタンパク質分解活性に関するアッセイにおいては、合成トリプシン基質Ｎα−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−β−ナフタルアミン（ＢＡＮＡ）が一般に使用される。
【０００４】
ＢＡＮＡのような当技術分野で公知の発色性プロテアーゼ基質は、（チオペプトリド以外、後記を参照）該ポリペプチドのＣ末端に配置されたそのそれぞれの発色性部分を有する。そのような発色性プロテアーゼ基質の問題は、該ポリペプチドのＣ末端に配置された発色性部分の場合、隣接アミノ酸を欠く該ポリペプチドの限定形態のため、限られたプロテアーゼ特異性しか存在しないことである。また、当技術分野で公知の発色性ペプチドは低い水溶性を有し、より長いポリペプチドの合成はその合成方法を複雑にする。これは該ポリペプチドの製剤化を困難にし、商業的規模での該ポリペプチドの益々増大する製造のコストを増加させる。
【０００５】
また、該Ｃ末端発色源を固体表面に直接的に結合させることは不可能であり、このことは、診断においてこれらのポリペプチドを使用してタンパク質分解の結果を可視化するために用いられうる方法を制限する。
【０００６】
Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８５，２４，６７３０−６７３４に記載されているとおり、チオペプトリドは該ペプチド配列の内部に発色性部分を有するが、アミド結合を用いていない。チオペプトリドに基づくペプチド基質での問題は、それがタンパク質分解切断部位に通常のアミド結合を含まないため、それが最高の基質認識またはターンオーバーをもたらさないことである。
【０００７】
本発明は、前記の問題の１以上を軽減することを目的とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０８６４８６４号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐｌａｐｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ １９６５，３０，１７８１
【非特許文献２】Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８５，２４，６７３０−６７３４
【発明の概要】
【００１０】
本発明の１つの態様においては、発色性アミノ酸を含むポリペプチドであって、該発色性アミノ酸がそのＮおよびＣ末端において少なくとも１つのアミノ酸に隣接している、ポリペプチドを提供する。
【００１１】
好ましくは、該発色性アミノ酸のアミン基は５未満のｐＫａを有し、該発色性アミノ酸は共役アルデヒドと反応可能である。
【００１２】
有利には、該ポリペプチドは、該発色性アミノ酸のアミノ基を含むペプチド結合を切断しうる標的プロテアーゼに対する標的配列を含む。
【００１３】
本発明においては、発色性アミノ酸を含むポリペプチドであって、該発色性アミノ酸がそのＮおよびＣ末端において少なくとも１つのアミノ酸に隣接しており、該発色性アミノ酸のアミン基が５未満のｐＫａを有し、該発色性アミノ酸が共役アルデヒドと反応可能であり、該ポリペプチドが、該発色性アミノ酸のアミノ基を含むペプチド結合を切断しうる標的プロテアーゼに対する標的配列を含む、ポリペプチドをも提供する。
【００１４】
好都合には、該発色性アミノ酸は、該発色性アミノ酸のアミノ基の窒素原子に直接結合した芳香環部分を含む。
【００１５】
好ましくは、該発色性アミノ酸は立体的な等価性において天然アミノ酸に合致している。
【００１６】
好都合には、該標的配列は該発色性アミノ酸を含む。
【００１７】
好ましくは、該発色性アミノ酸は、標的配列が切断されると検出可能なシグナルを与えるよう共役アルデヒドと反応可能である。
【００１８】
有利には、該共役アルデヒドは、置換ベンズアルデヒドまたはシンナムアルデヒドまたはトランス，トランス フェニルペンタジエナールである。
【００１９】
好ましくは、該共役アルデヒドはＤＭＡＣまたはＤＭＡＢである。
【００２０】
好都合には、該芳香族部分はフェニルまたはナフチル部分である。
【００２１】
有利には、該ポリペプチドは直鎖状ポリペプチドである。
【００２２】
好ましくは、該ポリペプチドは該ポリペプチドのＣ末端もしくはＮ末端において又はその付近において固体表面上に固定化されている。
【００２３】
有利には、該ポリペプチドは該固体表面に共有結合している。
【００２４】
好都合には、該ポリペプチドは更に、該ポリペプチドのＣ末端もしくはＮ末端において又はその付近において第１および第２結合部分を含む。
【００２５】
好ましくは、該ポリペプチドは２から１００アミノ酸長、より好ましくは３から４０アミノ酸長である。
【００２６】
本発明のもう１つの態様においては、サンプル中のプロテアーゼ酵素の検出方法であって、
（ｉ）先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドに該サンプルをさらし、該プロテアーゼに該ポリペプチドを切断させて断片（該断片はそのＮ末端に発色性アミノ酸を示す。）を得る工程、
（ｉｉ）共役アルデヒドを、該発色性アミノ酸を含む該断片と反応させて、着色付加体を得る工程、および
（ｉｉｉ）該着色付加体を検出する工程であって、該着色付加体の存在が該サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在を示す工程、
を含む方法を提供する。
【００２７】
好都合には、工程（ｉ）は、該発色性アミノ酸のアミノ基を含むポリペプチドのペプチド結合を切断するプロテアーゼ酵素を含む。
【００２８】
本発明のもう１つの態様においては、
ｉ．１つの発色性アミノ酸を含むアミノ酸二量体を合成し、
ｉｉ．該ポリペプチドの合成中に、該二量体を該ポリペプチドの残部に取り込ませる工程を含んでなる、本発明の製造方法を提供する
好都合には、工程（ｉｉ）は、該二量体を新生オリゴペプチドに結合させることを含む。
【００２９】
本発明のもう１つの態様においては、
本発明のポリペプチドおよび
該ポリペプチドが固定化されうる固体支持体
を含んでなる、サンプル中のプロテアーゼ酵素を検出するための製品を提供する。
【００３０】
好ましくは、該製品は更に、共役アルデヒドを含む。
【００３１】
有利には、該固体支持体は、ヒンジにより連結された第１および第２シートを含み、該ポリペプチドは第１シート上に固定化されており、該共役アルデヒドは第２シート上に位置していて、それらのシートを一緒に折り畳むすることにより第１シートから第２シートへの物質の移動が可能となる。
【００３２】
好都合には、該製品は更に、第１シート上に固定化されたポリペプチドと、第２シート上に位置する共役アルデヒドとの間に介在しうる膜を含み、該膜は、閾サイズより大きなサイズを有する物質の、第１シートから第２シートへの通過を妨げ、該ポリペプチドは、発色性アミノ酸を含む断片を遊離するようプロテアーゼ酵素により切断可能であり、該断片は該閾サイズより小さい。
【００３３】
あるいは、該固体支持体はクロマトグラフィー媒体を含む。
【００３４】
有利には、該クロマトグラフィー媒体は更に、プロテアーゼ酵素による切断の後に該ポリペプチドから遊離可能な該発色性アミノ酸を含む該ポリペプチドの断片に結合しうる断片結合性分子を含み、該ポリペプチドは指示区域において該クロマトグラフィー媒体上に固定化可能であり、該断片結合性分子は可視化区域において該クロマトグラフィー媒体上に固定化可能である。
【００３５】
好都合には、該ポリペプチドは第１および第２断片へと切断可能であり、第１断片は該発色性アミノ酸を含み、該製品は更に、第２断片と結合可能な検出可能な標識、ならびに該クロマトグラフィー媒体内または上に固定化された第１および第２捕捉分子を含み、第１捕捉分子は第１断片に結合可能であり、第２捕捉分子は第２断片または該検出可能標識に結合可能である。
【００３６】
好ましくは、該標識は、第２断片に結合可能な結合性成分を含む。
【００３７】
有利には、該クロマトグラフィー媒体は試験ストリップを含む。
【００３８】
有利には、該クロマトグラフィー媒体は多孔性物質のカラムを含む。
【００３９】
本発明のもう１つの態様においては、立体的な等価性において天然アミノ酸に合致している少なくとも１つの発色性アミノ酸および複数の成分アミノ酸を含んでなる合成ポリペプチドを提供する。
【００４０】
本発明のもう１つの態様においては、サンプル中のプロテアーゼ酵素の検出のための、本発明の合成ポリペプチドの使用を提供する。
【００４１】
該発色性部分を該ペプチド配列内に埋め込むことにより、合成および使用の際の疎水性の影響が軽減される。本発明における発色源は該ペプチド配列内に存在するため、該ペプチドのＣおよびＮ末端は、当業者に公知の標準的な結合（カップリング）化学法を用いて自由に利用される。
【００４２】
本明細書における「発色性アミノ酸」は、変色可能な（アミノ基およびカルボキシル基を含有する。）アミノ酸分子を意味する。より詳しくは、それがペプチド基質のプロテアーゼ切断部位におけるＰ１’位に位置し、タンパク質分解により遊離し、ついで共有結合化学法により第２の分子と反応すると、それは、４００から９００ｎｍで測定可能な着色付加体を形成しうる。
【００４３】
本明細書における「標的プロテアーゼ」は、発色性ポリペプチド上の標的領域を認識し切断するプロテアーゼとして定義され、ここで、該標的領域は該切断部位のＰ１’位に発色性アミノ酸を含む。
【００４４】
「天然アミノ酸」は以下のアミノ酸のいずれかを意味する：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファンおよびバリン。
【００４５】
本明細書における「隣接」アミノ酸は、少なくとも１つの他のアミノ酸に連結されたアミノ酸であり、ここで、この連結は一方のアミノ酸のアミノ末端と他方のカルボキシル基との間のペプチド結合により生じる。
【００４６】
本明細書における「立体的な等価性において合致」は、天然アミノ酸および対応する発色性アミノ酸に関して用いられる。それは、合致した置換発色性アミノ酸が、それが代用されている天然アミノ酸の場合に類似した空間的占拠状態を有することを意味する。天然アミノ酸を含むペプチド配列に特異的なプロテアーゼが、該天然アミノ酸が発色性アミノ酸により置換されているポリペプチドをも切断する場合、該発色性アミノ酸は立体的な等価性において該天然アミノ酸に合致しているとみなされうる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は本発明のポリペプチドとプロテアーゼ酵素との反応を示す。簡潔に説明するために膵エラスターゼの場合の一例として、配列Ａｌａ−［ｐＡＢＡ］−Ｇｌｙが用いられている（この場合、アラニンアミノ酸がｐＡＢＡにより置換されている。）。
【図２】図２は、本発明の実施形態において使用される発色性アミノ酸の、選ばれた代表例を示す。
【図３】図３は、本発明の１つの実施形態によりプロテアーゼ酵素を検出するための製品の透視図を示す。
【図４】図４は、本発明のもう１つの実施形態によりプロテアーゼ酵素を検出するための製品の断面図を示す。
【図５】図５は、本発明のもう１つの実施形態によりプロテアーゼ酵素を検出するための製品の見取り図を示す。
【図６】図６は、本発明のもう１つの実施形態によるポリペプチドの合成方法を示す流れ図である。固相上で合成される一例として（樹脂が円で示されている。）、配列Ｖａｌ−Ａｒｇ−［ｐ−ＡＢＡ］−Ｇｌｙが用いられている。該分子の合成における鍵反応は工程ｉｉｉ）である。この反応は、入ってくるアミノ酸の活性化エステルを使用する標準的なペプチド化学法では容易には達成され得ない。しかし、入ってくるアミノ酸の酸クロリドの使用は該反応化学を実質的に改善する。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明の１つの実施形態によりプロテアーゼ酵素を検出するための製品の使用の結果および生じた陽性発色反応（陽性プロテアーゼサンプル）のイメージを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図３に記載されている形態の装置において陽性（上の線）および陰性（下の線）サンプルで電子的読取り装置から得られたデータのグラフ表示である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、商業的に入手可能な発色性基質であるベンゾイル−アルギニル−ナフチルアミド（ＢＡＮＡ）と比較した場合の、同じ陽性プロテアーゼサンプルのグラフ表示である。該発色性基質は、同一条件下のＢＡＮＡと比べて改善された酵素ターンオーバーおよび発色を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、エラスターゼ基質としてのＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣおよびＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣを比較するプレートアッセイの結果を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、エラスターゼ基質としてのＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣおよびＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣを比較する垂直流動アッセイの結果を示す。
【図９】図９は発色性アミノ酸ＡＮＡ（２−アミノナフトエ酸）およびｐＡＢＡ（パラ−アミノ安息香酸）の構造比較を示す。
【図１０Ａ】図１０ＡはＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣのエレクトロスプレー質量スペクトルを示し、予想質量は６９２．７８であり、実測質量は６９２．２である。
【図１０Ｂ】図１０ＢはＡＡＰＣ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣのエレクトロスプレー質量スペクトルを示し、予想質量は７４２．８４であり、実測質量は７４２．４である。
【図１１】図１１はＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ｐＡＢＡ−ＯＨの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１２】図１２は、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ｐＡＢＡ−ＧＧＣを使用して合成されたＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣのエレクトロスプレー質量スペクトルを示し、予想質量は６９２．７８であり、実測質量は６９２．３である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明の第１の実施形態においては、サンプル中のプロテアーゼ酵素、例えばパパインまたはトリプシンの検出方法を提供する。該方法は、溶液中の切断可能なポリペプチドが配置される容器を準備することを含む。切断可能なポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、配列アラニン−［ｐ−アミノベンゾイル］−グリシンを含む。すなわち、該ポリペプチドは、２つの他のアミノ酸（アラニンおよびグリシン）にＮおよびＣ末端において隣接している発色性アミノ酸（ｐ−アミノ安息香酸）を含む。ｐ−アミノ安息香酸を含む、このようなポリペプチドは、切断され第２の試薬と反応するまでは無色である。この実施形態において使用される第２試薬は、共役アルデヒドであるジメチル−アミノ−シンナムアルデヒド（ＤＭＡＣ）である。
【００４９】
該サンプルはバイアル内に配置され、標的酵素が該ペプチド基質を切断するのに十分な長さの時間、典型的には１０分未満にわたり、該ポリペプチドと混合される。この例においては、アミノ酸配列が選ばれたものであるため、該プロテアーゼは該ポリペプチド配列を迅速に３分未満で切断する。結果として、図１に示されているとおり、該プロテアーゼ酵素はアラニン残基の−ＣＯ−部分とｐ−アミノ安息香酸残基の−ＮＨ−部分との間のペプチド結合において該ポリペプチドを切断する。この切断は２つの分子の遊離を招き、第１の分子は該遊離アラニン残基であり、第２の分子は、グリシン残基に結合したｐ−アミノ安息香酸残基を含む。第２の分子は発色性中間体である。
【００５０】
該方法の次工程において、ＤＭＡＣを該バイアルに加え、混合する。図１に示されているとおり、ＤＭＡＣは、酸性条件下、該発色性中間体と反応して着色付加体を形成する。より詳しくは、陽性プロテアーゼサンプルにおいては、新たに生成した発色性中間体はＤＭＡＣと反応して赤色を示す。これとは対照的に、陰性プロテアーゼサンプルにおいては、該基質は元のままであり、ｐＡＢＡ部分のマスクは、それを、入ってくるＤＭＡＣに対して無反応性にする。ＤＭＡＣ分子自体は弱酸性条件下で黄色化合物であり、露出したｐＡＢＡの非存在下では黄色を示す。
【００５１】
したがって、本発明のこの実施形態の方法は、サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在（赤色）または非存在（黄色）に応答して発色をもたらす。
【００５２】
図１に例示されている実施形態においては、該ポリペプチド内の発色性アミノ酸のアミノ側のペプチド結合は標的プロテアーゼにより加水分解されて、該発色性アミノ酸のアミン基を露出させる。この実施形態においては、該共役アルデヒドはＤＭＡＣであるが、他の実施形態においては、代替的アルデヒド、例えば置換ベンズアルデヒドおよびシンナムアルデヒド、例えばジメチル−アミノ−ベンズアルデヒド（ＤＭＡＢ）が使用されうる。
【００５３】
本発明の実施形態におけるポリペプチドの合成を以下に説明する。該発色性ポリペプチドは、当業者によく知られた固相上の通常のＦｍｏｃ化学法により合成される。いくつかの実施形態においては、それぞれのアミノ酸カップリングは、入ってくるアミノ酸の活性化エステルを使用することにより達成される。他の実施形態においては、入ってくるアミノ酸を該発色性残基に結合させるために、酸クロリドが使用される。該ペプチド合成の前にＰ１アミノ酸発色源（Ｐ１’）を含むビルディングブロックを合成し、該ビルディングブロック全体を単一部分として導入することにより、効率の改善がもたらされうる。そのようなビルディングブロックの一例は、アミノ酸と同じ方法で新生ポリペプチドに加えられうるＦｍｏｃ−アラニル−パラ−アミノ安息香酸である。該ポリペプチドの長さは、典型的には、２から１００残基の範囲である。この方法を用いて、種々の長さの発色性ポリペプチドを合成するのが容易であり、この製造方法の自動化が容易に利用可能である。これは商業的使用のための大規模製造の場合に有利である。また、本発明の発色性ポリペプチドは、判明している発癌性を有さず、したがって、これは大規模製造における安全性の問題とはならないであろう。
【００５４】
第１の実施形態においては、該ポリペプチドは、発色性アミノ酸であるｐ−アミノ安息香酸を含む。しかし、代替的実施形態においては、異なる発色性アミノ酸、例えば図２に示されているものが使用される。これらの発色性アミノ酸は芳香族部分（例えば、フェニルまたはナフチル）または別の複素環式類似体を含有し、該芳香環部分は該発色性アミノ酸（すなわち、それはアニリンである。）のアミノ基の近位に存在する。それでも、本発明の他の実施形態においては、芳香環部分を含まない発色性酸が提供されると理解されるべきである。重要なのは、該発色性アミノ酸のアミン基が、該ポリペプチド内に存在するいずれの他のアミノ酸（アミノ末端または側鎖）よりも有意に低いｐＫａ（例えば、５未満）を有することである。このようにして、低いｐＨの条件下では、該発色性アミンは少なくとも部分的に脱プロトン化されるが、存在する該構造内のその他のアミンは実質的に完全にプロトン化される。これは、該共役アルデヒドとの反応が、該発色性アミノ酸と優先的に生じることを可能にする。もちろん、該発色性酸は、立体障害が該共役アルデヒドとの相互作用を妨げないようなものであることも必要である。
【００５５】
理想的には、該ポリペプチドにおいて使用される発色性アミノ酸は、標的プロテアーゼの基質の構造を可能な限り厳密に模擬するよう、立体的な等価性において天然アミノ酸に合致している。したがって、個々の標的プロテアーゼに特異的な標的領域を有する発色性ポリペプチドが合成される。該発色性アミノ酸は、それが該アミノ酸のＣ末端に位置しない限り、該ポリペプチドペプチド内のいずれの位置に配置されることも可能である。
【００５６】
いくつかの実施形態においては、本発明のポリペプチドは、ブックレットの形態をとる、サンプル中のプロテアーゼ酵素を検出するための製品に組み込まれる。適当なそのようなブックレットはＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０００６４３号（これを参照により本明細書に組み入れることとする。）に開示されている。図３を参照して、この実施形態におけるブックレット１を以下に説明する。該ブックレットは、ヒンジ４により連結された、厚紙のような平面状の基体の第１および第２シート２、３を含む。第１シートの中央には、吸収パッド５の上に薄い反応フィルム２５が設けられている。反応フィルム２５は該発色性ポリペプチドで含浸されており、ＰＶＡから製造されうる。第２シート３の中央には、反応フィルム２５および吸収パッド５と並ぶ穴６が設けられている。穴６は可視化フィルム７により覆われていて、第１および第２シート２、３が互いに押し合った場合、可視化フィルム７は穴６と反応フィルム２５との間に位置する。可視化フィルム７はＤＭＡＣおよびＨＣｌで含浸される。場合によっては、使用前には、反応フィルム２５および吸収パッド５が環境から密閉されたままとなるよう、反応フィルム２５および吸収パッド５は、取り外し可能なフィルム（示されていない。）で覆われている。
【００５７】
使用の際には、反応フィルム２５および吸収パッド５を覆う取り外し可能なフィルムが使われている場合にはそれを剥がし取り、プロテアーゼ酵素を含有する疑いのあるサンプルを反応フィルム２５上に配置し、吸収パッド５内に染み込ませる。該サンプル中にプロテアーゼが存在する場合には、第１の実施形態において記載されているとおり、該プロテアーゼは該発色性ポリペプチドを切断して発色性中間体を遊離させる。ついでブックレット１の第１および第２シート２、３を互いに押し合わせて、反応フィルム２５上の成分を可視化フィルム７、より詳しくはＤＭＡＣと接触させる。
【００５８】
このようにして、該発色性中間体の幾らかが反応フィルム２５および吸収パッド５から可視化フィルム７上へ移り、この部位において、それはＤＭＡＣと反応して着色付加体を形成する。前記のとおり、該着色付加体は赤色であり、これは穴６を通してブックレット１の使用者に視認可能である。
【００５９】
あるいは、該発色性ポリペプチドを切断しうるプロテアーゼ酵素を該サンプルが含有しない場合には、該発色性中間体は形成されず、該発色性ポリペプチドは黄色のままである。したがって、該可視化フィルムはその色を維持するか、または黄色に着色される。
【００６０】
この実施形態の変形においては、膜が設けられ、これは該可視化フィルムを覆い、ある閾サイズを超える物質がそれを通過するのを阻止する。色を本来有する該サンプル中のいずれの物質も該膜を通過できない程度に大きいが、発色性中間体は通過するのに十分な程度に小さく、したがって該可視化フィルム、より詳しくはその上のＤＭＡＣと接触しうるよう、該閾値は選択される。
【００６１】
つぎに図４を参照して、本発明のもう１つの実施形態を説明する。この実施形態においては、本発明のポリペプチドは、垂直流動生化学的アッセイの形態をとる、プロテアーゼ酵素を検出するための製品内に含まれている。検出装置８は、上部区域１０を有する容器９を含み、上部区域１０は、その最上部に開口部１１を有し、そしてその最下部に、頚部１３に接続された漏斗１２を有する。頚部１３は、透明物質、例えばパースペックスまたはガラスからなり、倒立漏斗１４につながっており、そしてこれは下部区域１５の最上部に位置する。頚部１３はマトリックス１６を含み、ここにおいて、本発明の複数の発色性ポリペプチドが固定化されている。例えば、幾つかの実施形態においては、マトリックス１６は、アミド結合またはチオール相互作用（チオエーテルを形成する。）により発色性ポリペプチドがそのＣ末端またはＣ末端付近において共有結合した複数の粒子を含む。この場合、「付近」は該Ｃ末端の１０または２０アミノ酸残基以内を意味する。
【００６２】
使用の際には、プロテアーゼ酵素を含有する疑いのあるサンプルを、それが漏斗１２内に流動しマトリックス１６内にゆっくりと遊離するよう、容器９の上部区域１０の開口末端１１を経由して加える。該サンプルは重力および毛管作用により一定速度でマトリックス１６を経由して通過する。該サンプル中のプロテアーゼはマトリックス１６内の発色性ポリペプチドを、該発色性アミノ酸の−ＮＨ−部分と、Ｎ末端方向に直接隣接したアミノ酸の−ＣＯ−部分との間のペプチド結合において切断する。このようにして、該発色性ポリペプチドのＮ末端断片は遊離し、該発色性中間体はマトリックス１６内に固定化されたままとなる。場合によっては、全てのＮ末端断片がマトリックス１６から容器９の下部区域１５内へと洗い落とされることが保証されるよう、該サンプルをバッファーで洗浄する。
【００６３】
ついで、ＤＭＡＣを含むバッファーを収容する容器（示されていない。）を容器９の上部区域１０の開口末端１１の上に配置し、その下部末端に穴を開けて、容器９の漏斗１２内に該バッファーを放出させる。ＤＭＡＣを含有するバッファーはマトリックス１６を通って流動し、それが該発色性中間体と接触すると、それと反応して着色付加体を形成する。過剰のＤＭＡＣは基体１６を通って容器９の下部区域１５内に流動する。既に説明されているとおり、該着色付加体は赤色であり、したがってサンプル中のプロテアーゼの存在はマトリックス１６を赤変させる。これは頚部１３から視認可能である。
【００６４】
あるいは、該サンプルが、標的配列において発色性ペプチドを切断しうるプロテアーゼ酵素を含有しない場合には、マトリックス１６内の発色性ペプチドは未切断のままであり、したがって、ＤＭＡＣが反応する発色性中間体は存在しない。ＤＭＡＣは黄色であり、幾らかは非特異的付着によりマトリックス１６内に残存する。したがって、プロテアーゼ陰性サンプルに応答して、マトリックス１６は黄変する。
【００６５】
発色性ポリペプチドの合成中、発色性アミノ酸の−ＮＨ２−部分への天然アミノ酸のアミドカップリング反応は該合成の比較的非効率的な部分であることが観察されている。したがって、該合成反応は、しばしば、該発色性アミノ酸のＮ末端に結合したアミノ酸が存在しない或る割合の不完全なポリペプチドを生成する。該不完全ポリペプチドは該発色性中間体と同じ構造を有し、完全ポリペプチドと共にマトリックス１６に結合するため、そのような不完全なポリペプチドの割合が有意である場合には、これは偽陽性結果をもたらしうる。したがって、該サンプル中にプロテアーゼが存在しない場合であっても、該不完全ポリペプチドはＤＭＡＣと反応し、変色をもたらすであろう。したがって、幾つかの代替的実施形態においては、該発色性ポリペプチドはそれらのＮ末端を介してマトリックス１６に固定化（例えば、共有結合）される。このようにして、いずれの不完全なポリペプチドも該マトリックスに結合されない。なぜなら、それらは、マトリックス１６への結合に用いられるＮ末端アミノ酸を欠くからである。そのような実施形態においては、活性プロテアーゼを含有するサンプルが適用されると、該発色性中間体はマトリックス１６から遊離し、遊離した発色性中間体を捕捉し変色を示すためにマトリックス１６の下に吸収サンプ（例えば、綿毛栓）が設けられる。
【００６６】
本発明の他の実施形態においては、該発色性ポリペプチドは第１および第２結合部分をいずれかの末端に含む。そのようなポリペプチドの合成の一例を実施例２に示す。この特定の実施形態においては、ビオチンを該ポリペプチドのＣ末端に結合させ、フルオレセインをＮ末端に結合させる。該発色性ポリペプチドは、側方流動を含む二官能性リガンド捕捉プロテアーゼ検出アッセイにおいて使用される。側方流動アッセイの更なる詳細はＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０００６３７およびＧＢ０７１６４９２．４（それらを参照により本明細書に組み入れることとする。）に記載されている。図５を参照すると、側方流動装置１７は、上流末端２２と下流末端２３とを含むニトロセルロースストリップ１８を含む。上流末端２２に隣接して、吸収物質から構成されるサンプル受容区域１９が位置する。下流末端２３へ更に進むと、第１可視化区域２０が存在する。下流末端２３へ更に進むと、第２可視化区域２１が存在する。第１可視化区域２０は、ストリップ１８の表面上に固定化された複数のポリペプチド結合性分子を含む。該ポリペプチド結合性分子のそれぞれは、該発色性ポリペプチドに、そのＣ末端により結合しうる。したがって、この特定の実施形態においては、第１ポリペプチド結合性分子は、該ポリペプチドのＣ末端上のビオチンに結合しうるストレプトアビジンである。第２可視化区域２１は、ストリップ１８の表面上に固定化された複数の抗マウス抗体を含む。
【００６７】
使用の際には、プロテアーゼ酵素を含有する疑いのあるサンプルを前記の複数の発色性ポリペプチドと混合する。該プロテアーゼ酵素は該ポリペプチドを切断して、該ポリペプチドのＣ末端に対応する発色性中間体、および該ポリペプチドのＮ末端に対応する断片を遊離させる。ついで該混合物に、該Ｎ末端断片に結合したフルオレセイン基に結合するマウス抗ＦＩＴＣ−金抗体を加える。サンプル受容区域１９上に該サンプル混合物を配置する。ついで、矢印２４の方向の下流末端２３に向かう毛管作用により、ニトロセルロースストリップ１８の長さに沿って該サンプル混合物を吸着させる。したがって、それは第１可視化区域２０を通過し、ついで第２可視化区域２１を通過する。
【００６８】
該サンプル混合物が第１可視化区域２０を通過する際に、該ビオチンタグが該ストレプトアビジンに結合し、該発色性中間体が第１可視化区域２０上に固定化される。該発色性中間体は第１可視化区域に結合したままであり、該Ｎ末端断片は更に、ニトロセルロースストリップ２０に沿って第２可視化区域２１に吸着される。該抗マウス抗体は該マウス抗ＦＩＴＣ−金抗体に結合して、第２可視化区域２１において該Ｎ末端断片を固定化する。
【００６９】
ついでＤＭＡＣをサンプル受容区域１９に加え、それは矢印２４の方向にストリップ１８に沿って吸着される。該ＤＭＡＣが第１可視化区域に到達すると、それは該固定化発色性中間体と反応し、赤色付加体が形成される。また、該抗ＦＩＴＣ抗体に結合した金粒子が、ニトロセルロースストリップ１８上の第２検出区域２１において、視認可能な線を形成すると、該金粒子も観察されうる。
【００７０】
あるいは、プロテアーゼ酵素がサンプル中に存在しない場合には、該ポリペプチドがニトロセルロースストリップ１８に沿って吸着されると、該ポリペプチド全体が第１検出区域において固定化される。ついでＤＭＡＣをサンプル受容区域１９に加えると、それはニトロセルロースストリップ１８に沿って吸着されるが、該発色性アミノ酸は該ポリペプチド上に露出していないため、該ＤＭＡＣは、反応することなく第１検出区域を通過する。したがって、第１検出区域２０においては（黄色である残存ＤＭＡＣ以外は）色は生成されず、さらに、該金粒子は第１検出区域２０において濃縮されている。したがって、該サンプルにおける機能性プロテアーゼ酵素の非存在は、第１検出区域２０における、赤色ではなく、該金粒子により形成される視認可能な線の存在により、および第２検出区域２１における視認可能な線の非存在により示される。
【００７１】
したがって、この実施形態は２波の反応性（すなわち、１つはＤＭＡＣの使用、もう１つは金粒子検出の使用）の検出を可能にする。
【実施例】
【００７２】
実施例１ − Ｖａｌ−Ａｒｇ−［ｐＡＢＡ］−Ｇｌｙの合成
図６を参照して、Ｖａｌ−Ａｒｇ−［ｐＡＢＡ］−Ｇｌｙの合成を以下に説明する。
【００７３】
Ｆｍｏｃ−化学法（Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．２０００ Ｃｈａｎ，ＷＣおよびＷｈｉｔｅ，ＰＤ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）を用いて、固相（Ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でペプチド合成を行った。典型的な合成においては、５０ｍｇの樹脂（ローディング０．９１ｍｍｏｌ／ｇ）を２０μｍ濾過カラム（Ｋｉｎｅｓｉｓ）内でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２ｍｌ）中で１時間膨張させた。該樹脂を更に、ＤＭＦ（２×２ｍｌ）で洗浄し、真空下で排液させて乾固させた。２ｍｌの乾燥ＤＭＦ中に溶解された０．２３ｍｍｏｌ ＰＹＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスファート）および０．２３ｍｍｏｌ ＨＯＢＴ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）および０．２３ｍｍｏｌ 保護グリシン残基を使用して、第１アミノ酸カップリングを行った。０．４６ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルアミン）を該溶液に加え、ついでこれを該樹脂に分注した。該樹脂スラリーを室温で９０分間攪拌した後、真空下で排液させ、ＤＭＦ（２×２ｍｌ）での洗浄を行った。樹脂反応部位が全範囲にわたることが保証されるよう、反復反応を行った。ＤＭＦ（３×２ｍｌ）、ＤＣＭ（ジクロロメタン）（３×２ｍｌ）で洗浄し、更にもう一度ＤＭＦ（２ｍｌ）で洗浄した後、ＤＭＦ（５ｍｌ）中の２０％ ピペリジンの溶液を加え、５分間攪拌することにより、該樹脂のＦｍｏｃ脱保護を行った。ついで該樹脂をＤＭＦ（２×２ｍｌ）で洗浄し、該反応をもう一度反復した。該樹脂をＤＭＦ（３×２ｍｌ）、ＤＣＭ（３×２ｍｌ）、そして最後にＤＭＦ（２ｍｌ）で十分に洗浄した。ついでこの反応を残りのアミノ酸残基に関して反復した。該発色性部分のあとのアミノ酸の付加のために、カップリングの前に以下のとおりに酸クロリドを調製した。トリホスゲン（０．０７７ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．２３ｍｍｏｌ）を１ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した。０．７６ｍｍｏｌ コリジンを該溶液に滴下して白色懸濁液を得た。ついでこれを該樹脂に加え、室温で１時間混合した。該反応混合物を排液させ、ＴＨＦ（２×２ｍｌ）およびＤＣＭ（３×２ｍｌ）で洗浄した。該反応を、完了が保証されるまで反復し、ついで該樹脂を排液させ、ＴＨＦ（２×２ｍｌ）、ＤＣＭ（３×２ｍｌ）、ついでＤＭＦ（２ｍｌ）で十分に洗浄した。前記のとおりに、脱保護を促進させた。
【００７４】
該樹脂からの切断および側鎖の脱保護をＴＦＡ：水：トリエチルシラン（ＴＥＳ）（９５％：２．５％：２．５％）の添加により行った。該スラリーを激しく９０分間攪拌した。該合成を完了させるために、該粗ペプチド混合物を、０．１％ ＴＦＡ水（２×５ｍｌ）での更なる洗浄により、該樹脂スラリーから取り出した。ついで該混合物を蒸発乾固させ、乾燥エーテル（２×１０ｍｌ）を該ペプチド残基上に注意深く流し次いで廃棄することにより、該乾燥エーテルで洗浄した。該残基を１時間風乾させた後、最少量の水（３から５ｍｌ）に溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した。該濾液を、分析および後続の分取ＨＰＬＣのために、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒプロテオカラム上に注入した。純粋画分を合わせ、蒸発乾固させ、ついで純水（０．５から１ｍｌ）に再溶解し、エッペンドルフチューブ内で急速冷凍し、凍結乾燥させて、白色／無色粉末状固体を得た。正イオンエレクトロスプレー質量分析を用いるＬＣ−ＭＳにより、ペプチドを確認した。
【００７５】
実施例２ − パパインの検出
サンプル溶液中のパパインの存在を検出するためのアッセイにおいて、発色性ポリペプチドＶａｌ−Ａｒｇ−［ｐＡＢＡ］−Ｇｌｙを使用した。プロテアーゼ酵素であるパパインを含むサンプルを、図３に記載されている実施形態によるブックレット（図８Ａを参照されたい。）の第１シートに適用した。該ブックレットの第１シートは該発色性ポリペプチドで予め含浸されていた。５分後、該ブックレットの第１および第２シートを一緒に折り畳んだ。該ブックレットの第２シートはＤＭＡＣで予め含浸されており、該ブックレットの第２シート内の穴から観察可能なとおり、１０分後、ＤＭＡＣは黄色から赤色に変化した。また、対照として、該サンプルの代わりに水を使用して、該アッセイを反復した。変色の結果を図８Ｂのグラフに示す。
【００７６】
また、該発色性ポリペプチドの代わりにＢＡＮＡを使用して、同一条件下、該プロテアーゼアッセイを反復した。該アッセイ中に検出された変色の速度を比較し、その結果を図８Ｃにグラフ表示する。Ｖａｌ−Ａｒｇ−［ｐＡＢＡ］−Ｇｌｙは、ＢＡＮＡ（ベンゾイルアルギニルナフチルアミド）より速い検出可能な変色を惹起することが示され、これはｉｎ ｓｉｔｕ検出装置にとって有利である。
【００７７】
実施例３Ａ − エラスターゼの存在を検出するための適当な発色性基質の測定
２つのペプチド、すなわち、ＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣおよびＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣ（ここで、ｐＡＢＡはパラ−アミノ安息香酸であり、ＡＮＡは２−アミノナフトエ酸である。）を合成した。両方のペプチドを、好中球エラスターゼ酵素に対する基質としてのそれらの適合性に関して試験した。ＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣおよびＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣのエレクトロスプレー質量スペクトルを、それぞれ、図１０Ａおよび１０Ｂに示す。
【００７８】
種々の濃度（１８、９、６および３単位／ｍｌの希釈度の５μｌ）のエラスターゼを別々のプレートウェル内の０．５ｍｇ／ｍｌ ペプチド（５μｌ）に加えた。該混合物を２０μｌのバッファー（５０ｍｍ リン酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．４）で希釈し、３７℃で３０分間インキュベートした。１５μｌの実施用ＤＭＡＣ溶液（０．３ｍｇ／ｍｌ ＤＭＡＣ、５０ｍＭ ＨＣｌ）を各プレートウェルに加え、十分に混合して可視化した。
【００７９】
この実験の結果を図８Ａに示す。該ウェル内のエラスターゼの最終濃度が３、１．５または１単位／ｍｌであった場合のＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣを使用するアッセイはエラスターゼ活性に関する陽性結果（すなわち、該ウェルは赤色／オレンジ色に変化した（Ｐａｎｔｏｎｅ（商標）１３６Ｕ））を与えた。この変色はエラスターゼの存在を示した。０．５単位／ｍｌ エラスターゼを含有するウェルは、ＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣ（Ｐａｎｔｏｎｅ（商標）１０８Ｕ）と混合された場合、弱い陽性結果を与えた。該対照ウェルは陰性結果を与えた。
【００８０】
これとは対照的に、ＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣを含有するウェルはいずれも、有意には変色せず、それらは黄色のままであった（Ｐａｎｔｏｎｅ（商標）３９４Ｕ）。したがって、該ウェル内のエラスターゼの存在にもかかわらず、エラスターゼ活性は検出されなかった。
【００８１】
実施例３Ｂ：
２つのペプチド、すなわち、ＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣおよびＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣの存在下の酵素好中球エラスターゼの活性に関して試験するために、もう１つのアッセイ形態を用いた。固体表面への結合の手段として、該ペプチドのＣ末端システイン基を使用した。ヨードアセチル基で官能基化された半融ポリエチレンフリットを５０ｍＭ リン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）中で１０分間洗浄した。ついで該フリットを、３０分間、増感のために０．５ｍｇ／ｍｌ ペプチド（ＰＢＳ中）の溶液に移した。ついで該フリットを、リン酸ＥＤＴＡバッファー中でもう一度、１０分間洗浄した。該フリットを空カラム内にローディングし、２００μｌのエラスターゼを３０秒の概算流動接触時間で加えた。該アッセイを展開するために、１００μｌの実施用ＤＭＡＣ溶液（０．３ｍｇ／ｍｌ ＤＭＡＣ、５０ｍＭ ＨＣｌ）を該カラムに通過させた。
【００８２】
このアッセイの結果を図８Ｂに示す。ＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣおよびエラスターゼ酵素の両方を含有するアッセイカラムは陽性結果を示し（Ｐａｎｔｏｎｅ（登録商標）参照体１５０５ Ｕ＊）、ＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣを含有するがエラスターゼを含有しないカラムは陰性結果を示した（Ｐａｎｔｏｎｅ（登録商標）参照体３９４５ Ｕ＊）。ＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣを含有するカラム（一方はエラスターゼ酵素を含有し、他方はそれを含有しない。）は共に、陰性結果を示した（Ｐａｎｔｏｎｅ（登録商標）参照体３９４５ Ｕ＊）。
【００８３】
実施例３Ａおよび３Ｂの結論
２つのペプチドの間で、それらの存在下で検出されるエラスターゼ活性の点で、明らかな相違が観察される。エラスターゼ基質は、好ましくは、セリン、トレオニン（共に親水性側鎖を有する。）またはグリシンをＰ１’位に有する（情報源：ＭＥＲＯＰＳデータベース）。したがって、大きな疎水性表面を有する嵩高い発色性アミノ酸がこれらの好ましいアミノ酸に対して適度に立体的に合致するとは考えにくい。ナフトエ酸（ＡＮＡ）はパラ−アミノ安息香酸（ｐＡＢＡ）より嵩高く、より疎水性であり、したがって、ＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣは不良なエラスターゼ基質である。これらの両方の分子の構造を図９に示す。ｐＡＢＡ発色性アミノ酸は、セリンおよびトレオニンに対して、遥かに良好に立体的に合致し、したがってＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣは、エラスターゼに対する基質として、有意に、より好適であり、基質および酵素が混合されると、エラスターゼ活性をもたらす。したがってＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣはエラスターゼの存在の検出において使用されうる。
【００８４】
実施例４ − ＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣの合成
発色性アミノ酸を含有するペプチドの合成を改善するために開発された新規タイプのビルディングブロックを製造した。この場合、該ビルディングブロックの合成は自動化合成に適合しうる。このビルディングブロックを合成するために用いた方法は、実施例１に記載されているＢＴＣ／コリジン法の使用を要さない。ＢＴＣ／コリジン法は有効であるが、過酷な条件を要し、不溶性沈殿物を生成して、それを、自動化ペプチド合成との併用に不適当なものにする。
【００８５】
この新規タイプのビルディングブロックはオフラインで合成された。それはＰ１アミノ酸およびＰ１’発色性アミノ酸を含む。それは、該配列内の全ての他のアミノ酸に用いられる標準的な条件を用いて、合成に簡便に組み込まれうる。困難なカップリング工程における望ましくない副反応が回避されて、迅速でクリーンな方法がもたらされる。
【００８６】
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（１０ｍｍｏｌ）およびｔ−ブチル−ｐＡＢＡ（１０ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（３０ｍｌ）に溶解した。該溶液をエチレングリコール／ドライアイスの浴内で−１５℃に冷却し、オキシ塩化リン（１ｍｌ、１１ｍｍｏｌ）を、激しく攪拌しながら滴下した。３０分後、ＴＬＣによれば、該反応は完了した。粉砕された氷（１００ｍｌ）を加え、該水性混合物を酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出した。ついでこの有機抽出物を飽和ＮａＨＣＯ３（３×５０ｍｌ）およびブライン（３×５０ｍｌ）で洗浄した。ついで該有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。該粗混合物を蒸発乾固させ、ついでトルエン、酢酸エチルおよびメタノールで順次、同時蒸発させた。該生成物を、シリカゲル上で、１９：１ ジクロロメタン／メタノールで溶出して精製した。精製されたｔ−Ｂｕエステルを。ジクロロメタン中、１：１ ＴＦＡで１時間、脱保護し、蒸発させて、淡黄色固体を得た。個々のｐＡＢＡおよびバリンカップリング工程を置換して、この化合物をＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣの合成に直接使用して、予想ペプチドを成功裏に得た。ＨＰＬＣによる粗製純度は典型的には７０％であった（一方、元の方法で観察された純度は３５％であった）。Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ｐＡＢＡ−ＯＨの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１１に示し、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ｐＡＢＡ−ＯＨを使用して合成されたＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣのエレクトロスプレー質量スペクトルを図１２に示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発色性アミノ酸を含むポリペプチド、そのようなポリペプチドを含む産物、およびそのようなポリペプチドの製造方法に関する。本発明はまた、プロテアーゼ酵素の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質分解の測定に使用される多数の試薬または化合物が当技術分野で公知である。これらには、タンパク質分解により切断されると指示部分または不安定分子を遊離する合成的に修飾されたポリペプチド基質、例えば、Ｃ末端においてｐ−ニトロアニリドまたはナプチルアミンとして修飾された合成ポリペプチドが含まれる。例えば、ＥＰ−Ａ−０８６４８６４は、発色性ペプチドではなく蛍光性ペプチドであるＤｎＰ−Ｐｒｏ−β−シクロヘキシル−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｕ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｎ−Ｍｅ−ＡｂＺ）−ＮＨ２を使用する、プロテアーゼ酵素の検出を開示している。Ｐｌａｐｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ １９６５，３０，１７８１は、アルギニンの誘導体である、トリプシンにより切断される発色性基質に関して報告している。
【０００３】
そのようなペプチド基質のＣ末端からｐ−ニトロアニリンが切断され溶液中に遊離した後、ＵＶ吸収の増加が測定されうる。ナフチルアミンを含むペプチド基質の場合、遊離した発色性部分は追加的なレポーター分子により捕捉されて、視認可能な変色をもたらしうる。例えば歯周病の診断を補助するためのタンパク質分解活性に関するアッセイにおいては、合成トリプシン基質Ｎα−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−β−ナフタルアミン（ＢＡＮＡ）が一般に使用される。
【０００４】
ＢＡＮＡのような当技術分野で公知の発色性プロテアーゼ基質は、（チオペプトリド以外、後記を参照）該ポリペプチドのＣ末端に配置されたそのそれぞれの発色性部分を有する。そのような発色性プロテアーゼ基質の問題は、該ポリペプチドのＣ末端に配置された発色性部分の場合、隣接アミノ酸を欠く該ポリペプチドの限定形態のため、限られたプロテアーゼ特異性しか存在しないことである。また、当技術分野で公知の発色性ペプチドは低い水溶性を有し、より長いポリペプチドの合成はその合成方法を複雑にする。これは該ポリペプチドの製剤化を困難にし、商業的規模での該ポリペプチドの益々増大する製造のコストを増加させる。
【０００５】
また、該Ｃ末端発色源を固体表面に直接的に結合させることは不可能であり、このことは、診断においてこれらのポリペプチドを使用してタンパク質分解の結果を可視化するために用いられうる方法を制限する。
【０００６】
Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８５，２４，６７３０−６７３４に記載されているとおり、チオペプトリドは該ペプチド配列の内部に発色性部分を有するが、アミド結合を用いていない。チオペプトリドに基づくペプチド基質での問題は、それがタンパク質分解切断部位に通常のアミド結合を含まないため、それが最高の基質認識またはターンオーバーをもたらさないことである。
【０００７】
本発明は、前記の問題の１以上を軽減することを目的とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０８６４８６４号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐｌａｐｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ １９６５，３０，１７８１
【非特許文献２】Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８５，２４，６７３０−６７３４
【発明の概要】
【００１０】
本発明の１つの態様においては、発色性アミノ酸を含むポリペプチドであって、該発色性アミノ酸がそのＮおよびＣ末端において少なくとも１つのアミノ酸に隣接している、ポリペプチドを提供する。
【００１１】
好ましくは、該発色性アミノ酸のアミン基は５未満のｐＫａを有し、該発色性アミノ酸は共役アルデヒドと反応可能である。
【００１２】
有利には、該ポリペプチドは、該発色性アミノ酸のアミノ基を含むペプチド結合を切断しうる標的プロテアーゼに対する標的配列を含む。
【００１３】
本発明においては、発色性アミノ酸を含むポリペプチドであって、該発色性アミノ酸がそのＮおよびＣ末端において少なくとも１つのアミノ酸に隣接しており、該発色性アミノ酸のアミン基が５未満のｐＫａを有し、該発色性アミノ酸が共役アルデヒドと反応可能であり、該ポリペプチドが、該発色性アミノ酸のアミノ基を含むペプチド結合を切断しうる標的プロテアーゼに対する標的配列を含む、ポリペプチドをも提供する。
【００１４】
好都合には、該発色性アミノ酸は、該発色性アミノ酸のアミノ基の窒素原子に直接結合した芳香環部分を含む。
【００１５】
好ましくは、該発色性アミノ酸は立体的な等価性において天然アミノ酸に合致している。
【００１６】
好都合には、該標的配列は該発色性アミノ酸を含む。
【００１７】
好ましくは、該発色性アミノ酸は、標的配列が切断されると検出可能なシグナルを与えるよう共役アルデヒドと反応可能である。
【００１８】
有利には、該共役アルデヒドは、置換ベンズアルデヒドまたはシンナムアルデヒドまたはトランス，トランス フェニルペンタジエナールである。
【００１９】
好ましくは、該共役アルデヒドはＤＭＡＣまたはＤＭＡＢである。
【００２０】
好都合には、該芳香族部分はフェニルまたはナフチル部分である。
【００２１】
有利には、該ポリペプチドは直鎖状ポリペプチドである。
【００２２】
好ましくは、該ポリペプチドは該ポリペプチドのＣ末端もしくはＮ末端において又はその付近において固体表面上に固定化されている。
【００２３】
有利には、該ポリペプチドは該固体表面に共有結合している。
【００２４】
好都合には、該ポリペプチドは更に、該ポリペプチドのＣ末端もしくはＮ末端において又はその付近において第１および第２結合部分を含む。
【００２５】
好ましくは、該ポリペプチドは２から１００アミノ酸長、より好ましくは３から４０アミノ酸長である。
【００２６】
本発明のもう１つの態様においては、サンプル中のプロテアーゼ酵素の検出方法であって、
（ｉ）先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドに該サンプルをさらし、該プロテアーゼに該ポリペプチドを切断させて断片（該断片はそのＮ末端に発色性アミノ酸を示す。）を得る工程、
（ｉｉ）共役アルデヒドを、該発色性アミノ酸を含む該断片と反応させて、着色付加体を得る工程、および
（ｉｉｉ）該着色付加体を検出する工程であって、該着色付加体の存在が該サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在を示す工程、
を含む方法を提供する。
【００２７】
好都合には、工程（ｉ）は、該発色性アミノ酸のアミノ基を含むポリペプチドのペプチド結合を切断するプロテアーゼ酵素を含む。
【００２８】
本発明のもう１つの態様においては、
ｉ．１つの発色性アミノ酸を含むアミノ酸二量体を合成し、
ｉｉ．該ポリペプチドの合成中に、該二量体を該ポリペプチドの残部に取り込ませる工程を含んでなる、本発明の製造方法を提供する
好都合には、工程（ｉｉ）は、該二量体を新生オリゴペプチドに結合させることを含む。
【００２９】
本発明のもう１つの態様においては、
本発明のポリペプチドおよび
該ポリペプチドが固定化されうる固体支持体
を含んでなる、サンプル中のプロテアーゼ酵素を検出するための製品を提供する。
【００３０】
好ましくは、該製品は更に、共役アルデヒドを含む。
【００３１】
有利には、該固体支持体は、ヒンジにより連結された第１および第２シートを含み、該ポリペプチドは第１シート上に固定化されており、該共役アルデヒドは第２シート上に位置していて、それらのシートを一緒に折り畳むすることにより第１シートから第２シートへの物質の移動が可能となる。
【００３２】
好都合には、該製品は更に、第１シート上に固定化されたポリペプチドと、第２シート上に位置する共役アルデヒドとの間に介在しうる膜を含み、該膜は、閾サイズより大きなサイズを有する物質の、第１シートから第２シートへの通過を妨げ、該ポリペプチドは、発色性アミノ酸を含む断片を遊離するようプロテアーゼ酵素により切断可能であり、該断片は該閾サイズより小さい。
【００３３】
あるいは、該固体支持体はクロマトグラフィー媒体を含む。
【００３４】
有利には、該クロマトグラフィー媒体は更に、プロテアーゼ酵素による切断の後に該ポリペプチドから遊離可能な該発色性アミノ酸を含む該ポリペプチドの断片に結合しうる断片結合性分子を含み、該ポリペプチドは指示区域において該クロマトグラフィー媒体上に固定化可能であり、該断片結合性分子は可視化区域において該クロマトグラフィー媒体上に固定化可能である。
【００３５】
好都合には、該ポリペプチドは第１および第２断片へと切断可能であり、第１断片は該発色性アミノ酸を含み、該製品は更に、第２断片と結合可能な検出可能な標識、ならびに該クロマトグラフィー媒体内または上に固定化された第１および第２捕捉分子を含み、第１捕捉分子は第１断片に結合可能であり、第２捕捉分子は第２断片または該検出可能標識に結合可能である。
【００３６】
好ましくは、該標識は、第２断片に結合可能な結合性成分を含む。
【００３７】
有利には、該クロマトグラフィー媒体は試験ストリップを含む。
【００３８】
有利には、該クロマトグラフィー媒体は多孔性物質のカラムを含む。
【００３９】
本発明のもう１つの態様においては、立体的な等価性において天然アミノ酸に合致している少なくとも１つの発色性アミノ酸および複数の成分アミノ酸を含んでなる合成ポリペプチドを提供する。
【００４０】
本発明のもう１つの態様においては、サンプル中のプロテアーゼ酵素の検出のための、本発明の合成ポリペプチドの使用を提供する。
【００４１】
該発色性部分を該ペプチド配列内に埋め込むことにより、合成および使用の際の疎水性の影響が軽減される。本発明における発色源は該ペプチド配列内に存在するため、該ペプチドのＣおよびＮ末端は、当業者に公知の標準的な結合（カップリング）化学法を用いて自由に利用される。
【００４２】
本明細書における「発色性アミノ酸」は、変色可能な（アミノ基およびカルボキシル基を含有する。）アミノ酸分子を意味する。より詳しくは、それがペプチド基質のプロテアーゼ切断部位におけるＰ１’位に位置し、タンパク質分解により遊離し、ついで共有結合化学法により第２の分子と反応すると、それは、４００から９００ｎｍで測定可能な着色付加体を形成しうる。
【００４３】
本明細書における「標的プロテアーゼ」は、発色性ポリペプチド上の標的領域を認識し切断するプロテアーゼとして定義され、ここで、該標的領域は該切断部位のＰ１’位に発色性アミノ酸を含む。
【００４４】
「天然アミノ酸」は以下のアミノ酸のいずれかを意味する：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファンおよびバリン。
【００４５】
本明細書における「隣接」アミノ酸は、少なくとも１つの他のアミノ酸に連結されたアミノ酸であり、ここで、この連結は一方のアミノ酸のアミノ末端と他方のカルボキシル基との間のペプチド結合により生じる。
【００４６】
本明細書における「立体的な等価性において合致」は、天然アミノ酸および対応する発色性アミノ酸に関して用いられる。それは、合致した置換発色性アミノ酸が、それが代用されている天然アミノ酸の場合に類似した空間的占拠状態を有することを意味する。天然アミノ酸を含むペプチド配列に特異的なプロテアーゼが、該天然アミノ酸が発色性アミノ酸により置換されているポリペプチドをも切断する場合、該発色性アミノ酸は立体的な等価性において該天然アミノ酸に合致しているとみなされうる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は本発明のポリペプチドとプロテアーゼ酵素との反応を示す。簡潔に説明するために膵エラスターゼの場合の一例として、配列Ａｌａ−［ｐＡＢＡ］−Ｇｌｙが用いられている（この場合、アラニンアミノ酸がｐＡＢＡにより置換されている。）。
【図２】図２は、本発明の実施形態において使用される発色性アミノ酸の、選ばれた代表例を示す。
【図３】図３は、本発明の１つの実施形態によりプロテアーゼ酵素を検出するための製品の透視図を示す。
【図４】図４は、本発明のもう１つの実施形態によりプロテアーゼ酵素を検出するための製品の断面図を示す。
【図５】図５は、本発明のもう１つの実施形態によりプロテアーゼ酵素を検出するための製品の見取り図を示す。
【図６】図６は、本発明のもう１つの実施形態によるポリペプチドの合成方法を示す流れ図である。固相上で合成される一例として（樹脂が円で示されている。）、配列Ｖａｌ−Ａｒｇ−［ｐ−ＡＢＡ］−Ｇｌｙが用いられている。該分子の合成における鍵反応は工程ｉｉｉ）である。この反応は、入ってくるアミノ酸の活性化エステルを使用する標準的なペプチド化学法では容易には達成され得ない。しかし、入ってくるアミノ酸の酸クロリドの使用は該反応化学を実質的に改善する。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明の１つの実施形態によりプロテアーゼ酵素を検出するための製品の使用の結果および生じた陽性発色反応（陽性プロテアーゼサンプル）のイメージを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図３に記載されている形態の装置において陽性（上の線）および陰性（下の線）サンプルで電子的読取り装置から得られたデータのグラフ表示である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、商業的に入手可能な発色性基質であるベンゾイル−アルギニル−ナフチルアミド（ＢＡＮＡ）と比較した場合の、同じ陽性プロテアーゼサンプルのグラフ表示である。該発色性基質は、同一条件下のＢＡＮＡと比べて改善された酵素ターンオーバーおよび発色を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、エラスターゼ基質としてのＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣおよびＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣを比較するプレートアッセイの結果を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、エラスターゼ基質としてのＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣおよびＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣを比較する垂直流動アッセイの結果を示す。
【図９】図９は発色性アミノ酸ＡＮＡ（２−アミノナフトエ酸）およびｐＡＢＡ（パラ−アミノ安息香酸）の構造比較を示す。
【図１０Ａ】図１０ＡはＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣのエレクトロスプレー質量スペクトルを示し、予想質量は６９２．７８であり、実測質量は６９２．２である。
【図１０Ｂ】図１０ＢはＡＡＰＣ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣのエレクトロスプレー質量スペクトルを示し、予想質量は７４２．８４であり、実測質量は７４２．４である。
【図１１】図１１はＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ｐＡＢＡ−ＯＨの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１２】図１２は、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ｐＡＢＡ−ＧＧＣを使用して合成されたＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣのエレクトロスプレー質量スペクトルを示し、予想質量は６９２．７８であり、実測質量は６９２．３である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明の第１の実施形態においては、サンプル中のプロテアーゼ酵素、例えばパパインまたはトリプシンの検出方法を提供する。該方法は、溶液中の切断可能なポリペプチドが配置される容器を準備することを含む。切断可能なポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、配列アラニン−［ｐ−アミノベンゾイル］−グリシンを含む。すなわち、該ポリペプチドは、２つの他のアミノ酸（アラニンおよびグリシン）にＮおよびＣ末端において隣接している発色性アミノ酸（ｐ−アミノ安息香酸）を含む。ｐ−アミノ安息香酸を含む、このようなポリペプチドは、切断され第２の試薬と反応するまでは無色である。この実施形態において使用される第２試薬は、共役アルデヒドであるジメチル−アミノ−シンナムアルデヒド（ＤＭＡＣ）である。
【００４９】
該サンプルはバイアル内に配置され、標的酵素が該ペプチド基質を切断するのに十分な長さの時間、典型的には１０分未満にわたり、該ポリペプチドと混合される。この例においては、アミノ酸配列が選ばれたものであるため、該プロテアーゼは該ポリペプチド配列を迅速に３分未満で切断する。結果として、図１に示されているとおり、該プロテアーゼ酵素はアラニン残基の−ＣＯ−部分とｐ−アミノ安息香酸残基の−ＮＨ−部分との間のペプチド結合において該ポリペプチドを切断する。この切断は２つの分子の遊離を招き、第１の分子は該遊離アラニン残基であり、第２の分子は、グリシン残基に結合したｐ−アミノ安息香酸残基を含む。第２の分子は発色性中間体である。
【００５０】
該方法の次工程において、ＤＭＡＣを該バイアルに加え、混合する。図１に示されているとおり、ＤＭＡＣは、酸性条件下、該発色性中間体と反応して着色付加体を形成する。より詳しくは、陽性プロテアーゼサンプルにおいては、新たに生成した発色性中間体はＤＭＡＣと反応して赤色を示す。これとは対照的に、陰性プロテアーゼサンプルにおいては、該基質は元のままであり、ｐＡＢＡ部分のマスクは、それを、入ってくるＤＭＡＣに対して無反応性にする。ＤＭＡＣ分子自体は弱酸性条件下で黄色化合物であり、露出したｐＡＢＡの非存在下では黄色を示す。
【００５１】
したがって、本発明のこの実施形態の方法は、サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在（赤色）または非存在（黄色）に応答して発色をもたらす。
【００５２】
図１に例示されている実施形態においては、該ポリペプチド内の発色性アミノ酸のアミノ側のペプチド結合は標的プロテアーゼにより加水分解されて、該発色性アミノ酸のアミン基を露出させる。この実施形態においては、該共役アルデヒドはＤＭＡＣであるが、他の実施形態においては、代替的アルデヒド、例えば置換ベンズアルデヒドおよびシンナムアルデヒド、例えばジメチル−アミノ−ベンズアルデヒド（ＤＭＡＢ）が使用されうる。
【００５３】
本発明の実施形態におけるポリペプチドの合成を以下に説明する。該発色性ポリペプチドは、当業者によく知られた固相上の通常のＦｍｏｃ化学法により合成される。いくつかの実施形態においては、それぞれのアミノ酸カップリングは、入ってくるアミノ酸の活性化エステルを使用することにより達成される。他の実施形態においては、入ってくるアミノ酸を該発色性残基に結合させるために、酸クロリドが使用される。該ペプチド合成の前にＰ１アミノ酸発色源（Ｐ１’）を含むビルディングブロックを合成し、該ビルディングブロック全体を単一部分として導入することにより、効率の改善がもたらされうる。そのようなビルディングブロックの一例は、アミノ酸と同じ方法で新生ポリペプチドに加えられうるＦｍｏｃ−アラニル−パラ−アミノ安息香酸である。該ポリペプチドの長さは、典型的には、２から１００残基の範囲である。この方法を用いて、種々の長さの発色性ポリペプチドを合成するのが容易であり、この製造方法の自動化が容易に利用可能である。これは商業的使用のための大規模製造の場合に有利である。また、本発明の発色性ポリペプチドは、判明している発癌性を有さず、したがって、これは大規模製造における安全性の問題とはならないであろう。
【００５４】
第１の実施形態においては、該ポリペプチドは、発色性アミノ酸であるｐ−アミノ安息香酸を含む。しかし、代替的実施形態においては、異なる発色性アミノ酸、例えば図２に示されているものが使用される。これらの発色性アミノ酸は芳香族部分（例えば、フェニルまたはナフチル）または別の複素環式類似体を含有し、該芳香環部分は該発色性アミノ酸（すなわち、それはアニリンである。）のアミノ基の近位に存在する。それでも、本発明の他の実施形態においては、芳香環部分を含まない発色性酸が提供されると理解されるべきである。重要なのは、該発色性アミノ酸のアミン基が、該ポリペプチド内に存在するいずれの他のアミノ酸（アミノ末端または側鎖）よりも有意に低いｐＫａ（例えば、５未満）を有することである。このようにして、低いｐＨの条件下では、該発色性アミンは少なくとも部分的に脱プロトン化されるが、存在する該構造内のその他のアミンは実質的に完全にプロトン化される。これは、該共役アルデヒドとの反応が、該発色性アミノ酸と優先的に生じることを可能にする。もちろん、該発色性酸は、立体障害が該共役アルデヒドとの相互作用を妨げないようなものであることも必要である。
【００５５】
理想的には、該ポリペプチドにおいて使用される発色性アミノ酸は、標的プロテアーゼの基質の構造を可能な限り厳密に模擬するよう、立体的な等価性において天然アミノ酸に合致している。したがって、個々の標的プロテアーゼに特異的な標的領域を有する発色性ポリペプチドが合成される。該発色性アミノ酸は、それが該アミノ酸のＣ末端に位置しない限り、該ポリペプチドペプチド内のいずれの位置に配置されることも可能である。
【００５６】
いくつかの実施形態においては、本発明のポリペプチドは、ブックレットの形態をとる、サンプル中のプロテアーゼ酵素を検出するための製品に組み込まれる。適当なそのようなブックレットはＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０００６４３号（これを参照により本明細書に組み入れることとする。）に開示されている。図３を参照して、この実施形態におけるブックレット１を以下に説明する。該ブックレットは、ヒンジ４により連結された、厚紙のような平面状の基体の第１および第２シート２、３を含む。第１シートの中央には、吸収パッド５の上に薄い反応フィルム２５が設けられている。反応フィルム２５は該発色性ポリペプチドで含浸されており、ＰＶＡから製造されうる。第２シート３の中央には、反応フィルム２５および吸収パッド５と並ぶ穴６が設けられている。穴６は可視化フィルム７により覆われていて、第１および第２シート２、３が互いに押し合った場合、可視化フィルム７は穴６と反応フィルム２５との間に位置する。可視化フィルム７はＤＭＡＣおよびＨＣｌで含浸される。場合によっては、使用前には、反応フィルム２５および吸収パッド５が環境から密閉されたままとなるよう、反応フィルム２５および吸収パッド５は、取り外し可能なフィルム（示されていない。）で覆われている。
【００５７】
使用の際には、反応フィルム２５および吸収パッド５を覆う取り外し可能なフィルムが使われている場合にはそれを剥がし取り、プロテアーゼ酵素を含有する疑いのあるサンプルを反応フィルム２５上に配置し、吸収パッド５内に染み込ませる。該サンプル中にプロテアーゼが存在する場合には、第１の実施形態において記載されているとおり、該プロテアーゼは該発色性ポリペプチドを切断して発色性中間体を遊離させる。ついでブックレット１の第１および第２シート２、３を互いに押し合わせて、反応フィルム２５上の成分を可視化フィルム７、より詳しくはＤＭＡＣと接触させる。
【００５８】
このようにして、該発色性中間体の幾らかが反応フィルム２５および吸収パッド５から可視化フィルム７上へ移り、この部位において、それはＤＭＡＣと反応して着色付加体を形成する。前記のとおり、該着色付加体は赤色であり、これは穴６を通してブックレット１の使用者に視認可能である。
【００５９】
あるいは、該発色性ポリペプチドを切断しうるプロテアーゼ酵素を該サンプルが含有しない場合には、該発色性中間体は形成されず、該発色性ポリペプチドは黄色のままである。したがって、該可視化フィルムはその色を維持するか、または黄色に着色される。
【００６０】
この実施形態の変形においては、膜が設けられ、これは該可視化フィルムを覆い、ある閾サイズを超える物質がそれを通過するのを阻止する。色を本来有する該サンプル中のいずれの物質も該膜を通過できない程度に大きいが、発色性中間体は通過するのに十分な程度に小さく、したがって該可視化フィルム、より詳しくはその上のＤＭＡＣと接触しうるよう、該閾値は選択される。
【００６１】
つぎに図４を参照して、本発明のもう１つの実施形態を説明する。この実施形態においては、本発明のポリペプチドは、垂直流動生化学的アッセイの形態をとる、プロテアーゼ酵素を検出するための製品内に含まれている。検出装置８は、上部区域１０を有する容器９を含み、上部区域１０は、その最上部に開口部１１を有し、そしてその最下部に、頚部１３に接続された漏斗１２を有する。頚部１３は、透明物質、例えばパースペックスまたはガラスからなり、倒立漏斗１４につながっており、そしてこれは下部区域１５の最上部に位置する。頚部１３はマトリックス１６を含み、ここにおいて、本発明の複数の発色性ポリペプチドが固定化されている。例えば、幾つかの実施形態においては、マトリックス１６は、アミド結合またはチオール相互作用（チオエーテルを形成する。）により発色性ポリペプチドがそのＣ末端またはＣ末端付近において共有結合した複数の粒子を含む。この場合、「付近」は該Ｃ末端の１０または２０アミノ酸残基以内を意味する。
【００６２】
使用の際には、プロテアーゼ酵素を含有する疑いのあるサンプルを、それが漏斗１２内に流動しマトリックス１６内にゆっくりと遊離するよう、容器９の上部区域１０の開口末端１１を経由して加える。該サンプルは重力および毛管作用により一定速度でマトリックス１６を経由して通過する。該サンプル中のプロテアーゼはマトリックス１６内の発色性ポリペプチドを、該発色性アミノ酸の−ＮＨ−部分と、Ｎ末端方向に直接隣接したアミノ酸の−ＣＯ−部分との間のペプチド結合において切断する。このようにして、該発色性ポリペプチドのＮ末端断片は遊離し、該発色性中間体はマトリックス１６内に固定化されたままとなる。場合によっては、全てのＮ末端断片がマトリックス１６から容器９の下部区域１５内へと洗い落とされることが保証されるよう、該サンプルをバッファーで洗浄する。
【００６３】
ついで、ＤＭＡＣを含むバッファーを収容する容器（示されていない。）を容器９の上部区域１０の開口末端１１の上に配置し、その下部末端に穴を開けて、容器９の漏斗１２内に該バッファーを放出させる。ＤＭＡＣを含有するバッファーはマトリックス１６を通って流動し、それが該発色性中間体と接触すると、それと反応して着色付加体を形成する。過剰のＤＭＡＣは基体１６を通って容器９の下部区域１５内に流動する。既に説明されているとおり、該着色付加体は赤色であり、したがってサンプル中のプロテアーゼの存在はマトリックス１６を赤変させる。これは頚部１３から視認可能である。
【００６４】
あるいは、該サンプルが、標的配列において発色性ペプチドを切断しうるプロテアーゼ酵素を含有しない場合には、マトリックス１６内の発色性ペプチドは未切断のままであり、したがって、ＤＭＡＣが反応する発色性中間体は存在しない。ＤＭＡＣは黄色であり、幾らかは非特異的付着によりマトリックス１６内に残存する。したがって、プロテアーゼ陰性サンプルに応答して、マトリックス１６は黄変する。
【００６５】
発色性ポリペプチドの合成中、発色性アミノ酸の−ＮＨ２−部分への天然アミノ酸のアミドカップリング反応は該合成の比較的非効率的な部分であることが観察されている。したがって、該合成反応は、しばしば、該発色性アミノ酸のＮ末端に結合したアミノ酸が存在しない或る割合の不完全なポリペプチドを生成する。該不完全ポリペプチドは該発色性中間体と同じ構造を有し、完全ポリペプチドと共にマトリックス１６に結合するため、そのような不完全なポリペプチドの割合が有意である場合には、これは偽陽性結果をもたらしうる。したがって、該サンプル中にプロテアーゼが存在しない場合であっても、該不完全ポリペプチドはＤＭＡＣと反応し、変色をもたらすであろう。したがって、幾つかの代替的実施形態においては、該発色性ポリペプチドはそれらのＮ末端を介してマトリックス１６に固定化（例えば、共有結合）される。このようにして、いずれの不完全なポリペプチドも該マトリックスに結合されない。なぜなら、それらは、マトリックス１６への結合に用いられるＮ末端アミノ酸を欠くからである。そのような実施形態においては、活性プロテアーゼを含有するサンプルが適用されると、該発色性中間体はマトリックス１６から遊離し、遊離した発色性中間体を捕捉し変色を示すためにマトリックス１６の下に吸収サンプ（例えば、綿毛栓）が設けられる。
【００６６】
本発明の他の実施形態においては、該発色性ポリペプチドは第１および第２結合部分をいずれかの末端に含む。そのようなポリペプチドの合成の一例を実施例２に示す。この特定の実施形態においては、ビオチンを該ポリペプチドのＣ末端に結合させ、フルオレセインをＮ末端に結合させる。該発色性ポリペプチドは、側方流動を含む二官能性リガンド捕捉プロテアーゼ検出アッセイにおいて使用される。側方流動アッセイの更なる詳細はＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０００６３７およびＧＢ０７１６４９２．４（それらを参照により本明細書に組み入れることとする。）に記載されている。図５を参照すると、側方流動装置１７は、上流末端２２と下流末端２３とを含むニトロセルロースストリップ１８を含む。上流末端２２に隣接して、吸収物質から構成されるサンプル受容区域１９が位置する。下流末端２３へ更に進むと、第１可視化区域２０が存在する。下流末端２３へ更に進むと、第２可視化区域２１が存在する。第１可視化区域２０は、ストリップ１８の表面上に固定化された複数のポリペプチド結合性分子を含む。該ポリペプチド結合性分子のそれぞれは、該発色性ポリペプチドに、そのＣ末端により結合しうる。したがって、この特定の実施形態においては、第１ポリペプチド結合性分子は、該ポリペプチドのＣ末端上のビオチンに結合しうるストレプトアビジンである。第２可視化区域２１は、ストリップ１８の表面上に固定化された複数の抗マウス抗体を含む。
【００６７】
使用の際には、プロテアーゼ酵素を含有する疑いのあるサンプルを前記の複数の発色性ポリペプチドと混合する。該プロテアーゼ酵素は該ポリペプチドを切断して、該ポリペプチドのＣ末端に対応する発色性中間体、および該ポリペプチドのＮ末端に対応する断片を遊離させる。ついで該混合物に、該Ｎ末端断片に結合したフルオレセイン基に結合するマウス抗ＦＩＴＣ−金抗体を加える。サンプル受容区域１９上に該サンプル混合物を配置する。ついで、矢印２４の方向の下流末端２３に向かう毛管作用により、ニトロセルロースストリップ１８の長さに沿って該サンプル混合物を吸着させる。したがって、それは第１可視化区域２０を通過し、ついで第２可視化区域２１を通過する。
【００６８】
該サンプル混合物が第１可視化区域２０を通過する際に、該ビオチンタグが該ストレプトアビジンに結合し、該発色性中間体が第１可視化区域２０上に固定化される。該発色性中間体は第１可視化区域に結合したままであり、該Ｎ末端断片は更に、ニトロセルロースストリップ２０に沿って第２可視化区域２１に吸着される。該抗マウス抗体は該マウス抗ＦＩＴＣ−金抗体に結合して、第２可視化区域２１において該Ｎ末端断片を固定化する。
【００６９】
ついでＤＭＡＣをサンプル受容区域１９に加え、それは矢印２４の方向にストリップ１８に沿って吸着される。該ＤＭＡＣが第１可視化区域に到達すると、それは該固定化発色性中間体と反応し、赤色付加体が形成される。また、該抗ＦＩＴＣ抗体に結合した金粒子が、ニトロセルロースストリップ１８上の第２検出区域２１において、視認可能な線を形成すると、該金粒子も観察されうる。
【００７０】
あるいは、プロテアーゼ酵素がサンプル中に存在しない場合には、該ポリペプチドがニトロセルロースストリップ１８に沿って吸着されると、該ポリペプチド全体が第１検出区域において固定化される。ついでＤＭＡＣをサンプル受容区域１９に加えると、それはニトロセルロースストリップ１８に沿って吸着されるが、該発色性アミノ酸は該ポリペプチド上に露出していないため、該ＤＭＡＣは、反応することなく第１検出区域を通過する。したがって、第１検出区域２０においては（黄色である残存ＤＭＡＣ以外は）色は生成されず、さらに、該金粒子は第１検出区域２０において濃縮されている。したがって、該サンプルにおける機能性プロテアーゼ酵素の非存在は、第１検出区域２０における、赤色ではなく、該金粒子により形成される視認可能な線の存在により、および第２検出区域２１における視認可能な線の非存在により示される。
【００７１】
したがって、この実施形態は２波の反応性（すなわち、１つはＤＭＡＣの使用、もう１つは金粒子検出の使用）の検出を可能にする。
【実施例】
【００７２】
実施例１ − Ｖａｌ−Ａｒｇ−［ｐＡＢＡ］−Ｇｌｙの合成
図６を参照して、Ｖａｌ−Ａｒｇ−［ｐＡＢＡ］−Ｇｌｙの合成を以下に説明する。
【００７３】
Ｆｍｏｃ−化学法（Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．２０００ Ｃｈａｎ，ＷＣおよびＷｈｉｔｅ，ＰＤ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）を用いて、固相（Ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でペプチド合成を行った。典型的な合成においては、５０ｍｇの樹脂（ローディング０．９１ｍｍｏｌ／ｇ）を２０μｍ濾過カラム（Ｋｉｎｅｓｉｓ）内でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２ｍｌ）中で１時間膨張させた。該樹脂を更に、ＤＭＦ（２×２ｍｌ）で洗浄し、真空下で排液させて乾固させた。２ｍｌの乾燥ＤＭＦ中に溶解された０．２３ｍｍｏｌ ＰＹＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスファート）および０．２３ｍｍｏｌ ＨＯＢＴ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）および０．２３ｍｍｏｌ 保護グリシン残基を使用して、第１アミノ酸カップリングを行った。０．４６ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルアミン）を該溶液に加え、ついでこれを該樹脂に分注した。該樹脂スラリーを室温で９０分間攪拌した後、真空下で排液させ、ＤＭＦ（２×２ｍｌ）での洗浄を行った。樹脂反応部位が全範囲にわたることが保証されるよう、反復反応を行った。ＤＭＦ（３×２ｍｌ）、ＤＣＭ（ジクロロメタン）（３×２ｍｌ）で洗浄し、更にもう一度ＤＭＦ（２ｍｌ）で洗浄した後、ＤＭＦ（５ｍｌ）中の２０％ ピペリジンの溶液を加え、５分間攪拌することにより、該樹脂のＦｍｏｃ脱保護を行った。ついで該樹脂をＤＭＦ（２×２ｍｌ）で洗浄し、該反応をもう一度反復した。該樹脂をＤＭＦ（３×２ｍｌ）、ＤＣＭ（３×２ｍｌ）、そして最後にＤＭＦ（２ｍｌ）で十分に洗浄した。ついでこの反応を残りのアミノ酸残基に関して反復した。該発色性部分のあとのアミノ酸の付加のために、カップリングの前に以下のとおりに酸クロリドを調製した。トリホスゲン（０．０７７ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．２３ｍｍｏｌ）を１ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した。０．７６ｍｍｏｌ コリジンを該溶液に滴下して白色懸濁液を得た。ついでこれを該樹脂に加え、室温で１時間混合した。該反応混合物を排液させ、ＴＨＦ（２×２ｍｌ）およびＤＣＭ（３×２ｍｌ）で洗浄した。該反応を、完了が保証されるまで反復し、ついで該樹脂を排液させ、ＴＨＦ（２×２ｍｌ）、ＤＣＭ（３×２ｍｌ）、ついでＤＭＦ（２ｍｌ）で十分に洗浄した。前記のとおりに、脱保護を促進させた。
【００７４】
該樹脂からの切断および側鎖の脱保護をＴＦＡ：水：トリエチルシラン（ＴＥＳ）（９５％：２．５％：２．５％）の添加により行った。該スラリーを激しく９０分間攪拌した。該合成を完了させるために、該粗ペプチド混合物を、０．１％ ＴＦＡ水（２×５ｍｌ）での更なる洗浄により、該樹脂スラリーから取り出した。ついで該混合物を蒸発乾固させ、乾燥エーテル（２×１０ｍｌ）を該ペプチド残基上に注意深く流し次いで廃棄することにより、該乾燥エーテルで洗浄した。該残基を１時間風乾させた後、最少量の水（３から５ｍｌ）に溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した。該濾液を、分析および後続の分取ＨＰＬＣのために、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒプロテオカラム上に注入した。純粋画分を合わせ、蒸発乾固させ、ついで純水（０．５から１ｍｌ）に再溶解し、エッペンドルフチューブ内で急速冷凍し、凍結乾燥させて、白色／無色粉末状固体を得た。正イオンエレクトロスプレー質量分析を用いるＬＣ−ＭＳにより、ペプチドを確認した。
【００７５】
実施例２ − パパインの検出
サンプル溶液中のパパインの存在を検出するためのアッセイにおいて、発色性ポリペプチドＶａｌ−Ａｒｇ−［ｐＡＢＡ］−Ｇｌｙを使用した。プロテアーゼ酵素であるパパインを含むサンプルを、図３に記載されている実施形態によるブックレット（図８Ａを参照されたい。）の第１シートに適用した。該ブックレットの第１シートは該発色性ポリペプチドで予め含浸されていた。５分後、該ブックレットの第１および第２シートを一緒に折り畳んだ。該ブックレットの第２シートはＤＭＡＣで予め含浸されており、該ブックレットの第２シート内の穴から観察可能なとおり、１０分後、ＤＭＡＣは黄色から赤色に変化した。また、対照として、該サンプルの代わりに水を使用して、該アッセイを反復した。変色の結果を図８Ｂのグラフに示す。
【００７６】
また、該発色性ポリペプチドの代わりにＢＡＮＡを使用して、同一条件下、該プロテアーゼアッセイを反復した。該アッセイ中に検出された変色の速度を比較し、その結果を図８Ｃにグラフ表示する。Ｖａｌ−Ａｒｇ−［ｐＡＢＡ］−Ｇｌｙは、ＢＡＮＡ（ベンゾイルアルギニルナフチルアミド）より速い検出可能な変色を惹起することが示され、これはｉｎ ｓｉｔｕ検出装置にとって有利である。
【００７７】
実施例３Ａ − エラスターゼの存在を検出するための適当な発色性基質の測定
２つのペプチド、すなわち、ＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣおよびＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣ（ここで、ｐＡＢＡはパラ−アミノ安息香酸であり、ＡＮＡは２−アミノナフトエ酸である。）を合成した。両方のペプチドを、好中球エラスターゼ酵素に対する基質としてのそれらの適合性に関して試験した。ＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣおよびＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣのエレクトロスプレー質量スペクトルを、それぞれ、図１０Ａおよび１０Ｂに示す。
【００７８】
種々の濃度（１８、９、６および３単位／ｍｌの希釈度の５μｌ）のエラスターゼを別々のプレートウェル内の０．５ｍｇ／ｍｌ ペプチド（５μｌ）に加えた。該混合物を２０μｌのバッファー（５０ｍｍ リン酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．４）で希釈し、３７℃で３０分間インキュベートした。１５μｌの実施用ＤＭＡＣ溶液（０．３ｍｇ／ｍｌ ＤＭＡＣ、５０ｍＭ ＨＣｌ）を各プレートウェルに加え、十分に混合して可視化した。
【００７９】
この実験の結果を図８Ａに示す。該ウェル内のエラスターゼの最終濃度が３、１．５または１単位／ｍｌであった場合のＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣを使用するアッセイはエラスターゼ活性に関する陽性結果（すなわち、該ウェルは赤色／オレンジ色に変化した（Ｐａｎｔｏｎｅ（商標）１３６Ｕ））を与えた。この変色はエラスターゼの存在を示した。０．５単位／ｍｌ エラスターゼを含有するウェルは、ＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣ（Ｐａｎｔｏｎｅ（商標）１０８Ｕ）と混合された場合、弱い陽性結果を与えた。該対照ウェルは陰性結果を与えた。
【００８０】
これとは対照的に、ＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣを含有するウェルはいずれも、有意には変色せず、それらは黄色のままであった（Ｐａｎｔｏｎｅ（商標）３９４Ｕ）。したがって、該ウェル内のエラスターゼの存在にもかかわらず、エラスターゼ活性は検出されなかった。
【００８１】
実施例３Ｂ：
２つのペプチド、すなわち、ＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣおよびＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣの存在下の酵素好中球エラスターゼの活性に関して試験するために、もう１つのアッセイ形態を用いた。固体表面への結合の手段として、該ペプチドのＣ末端システイン基を使用した。ヨードアセチル基で官能基化された半融ポリエチレンフリットを５０ｍＭ リン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）中で１０分間洗浄した。ついで該フリットを、３０分間、増感のために０．５ｍｇ／ｍｌ ペプチド（ＰＢＳ中）の溶液に移した。ついで該フリットを、リン酸ＥＤＴＡバッファー中でもう一度、１０分間洗浄した。該フリットを空カラム内にローディングし、２００μｌのエラスターゼを３０秒の概算流動接触時間で加えた。該アッセイを展開するために、１００μｌの実施用ＤＭＡＣ溶液（０．３ｍｇ／ｍｌ ＤＭＡＣ、５０ｍＭ ＨＣｌ）を該カラムに通過させた。
【００８２】
このアッセイの結果を図８Ｂに示す。ＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣおよびエラスターゼ酵素の両方を含有するアッセイカラムは陽性結果を示し（Ｐａｎｔｏｎｅ（登録商標）参照体１５０５ Ｕ＊）、ＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣを含有するがエラスターゼを含有しないカラムは陰性結果を示した（Ｐａｎｔｏｎｅ（登録商標）参照体３９４５ Ｕ＊）。ＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣを含有するカラム（一方はエラスターゼ酵素を含有し、他方はそれを含有しない。）は共に、陰性結果を示した（Ｐａｎｔｏｎｅ（登録商標）参照体３９４５ Ｕ＊）。
【００８３】
実施例３Ａおよび３Ｂの結論
２つのペプチドの間で、それらの存在下で検出されるエラスターゼ活性の点で、明らかな相違が観察される。エラスターゼ基質は、好ましくは、セリン、トレオニン（共に親水性側鎖を有する。）またはグリシンをＰ１’位に有する（情報源：ＭＥＲＯＰＳデータベース）。したがって、大きな疎水性表面を有する嵩高い発色性アミノ酸がこれらの好ましいアミノ酸に対して適度に立体的に合致するとは考えにくい。ナフトエ酸（ＡＮＡ）はパラ−アミノ安息香酸（ｐＡＢＡ）より嵩高く、より疎水性であり、したがって、ＡＡＰＶ−［ＡＮＡ］−ＧＧＣは不良なエラスターゼ基質である。これらの両方の分子の構造を図９に示す。ｐＡＢＡ発色性アミノ酸は、セリンおよびトレオニンに対して、遥かに良好に立体的に合致し、したがってＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣは、エラスターゼに対する基質として、有意に、より好適であり、基質および酵素が混合されると、エラスターゼ活性をもたらす。したがってＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣはエラスターゼの存在の検出において使用されうる。
【００８４】
実施例４ − ＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣの合成
発色性アミノ酸を含有するペプチドの合成を改善するために開発された新規タイプのビルディングブロックを製造した。この場合、該ビルディングブロックの合成は自動化合成に適合しうる。このビルディングブロックを合成するために用いた方法は、実施例１に記載されているＢＴＣ／コリジン法の使用を要さない。ＢＴＣ／コリジン法は有効であるが、過酷な条件を要し、不溶性沈殿物を生成して、それを、自動化ペプチド合成との併用に不適当なものにする。
【００８５】
この新規タイプのビルディングブロックはオフラインで合成された。それはＰ１アミノ酸およびＰ１’発色性アミノ酸を含む。それは、該配列内の全ての他のアミノ酸に用いられる標準的な条件を用いて、合成に簡便に組み込まれうる。困難なカップリング工程における望ましくない副反応が回避されて、迅速でクリーンな方法がもたらされる。
【００８６】
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（１０ｍｍｏｌ）およびｔ−ブチル−ｐＡＢＡ（１０ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（３０ｍｌ）に溶解した。該溶液をエチレングリコール／ドライアイスの浴内で−１５℃に冷却し、オキシ塩化リン（１ｍｌ、１１ｍｍｏｌ）を、激しく攪拌しながら滴下した。３０分後、ＴＬＣによれば、該反応は完了した。粉砕された氷（１００ｍｌ）を加え、該水性混合物を酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出した。ついでこの有機抽出物を飽和ＮａＨＣＯ３（３×５０ｍｌ）およびブライン（３×５０ｍｌ）で洗浄した。ついで該有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。該粗混合物を蒸発乾固させ、ついでトルエン、酢酸エチルおよびメタノールで順次、同時蒸発させた。該生成物を、シリカゲル上で、１９：１ ジクロロメタン／メタノールで溶出して精製した。精製されたｔ−Ｂｕエステルを。ジクロロメタン中、１：１ ＴＦＡで１時間、脱保護し、蒸発させて、淡黄色固体を得た。個々のｐＡＢＡおよびバリンカップリング工程を置換して、この化合物をＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣの合成に直接使用して、予想ペプチドを成功裏に得た。ＨＰＬＣによる粗製純度は典型的には７０％であった（一方、元の方法で観察された純度は３５％であった）。Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ｐＡＢＡ−ＯＨの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１１に示し、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ｐＡＢＡ−ＯＨを使用して合成されたＡＡＰＶ−［ｐＡＢＡ］−ＧＧＣのエレクトロスプレー質量スペクトルを図１２に示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発色性アミノ酸を含むポリペプチドであって、該発色性アミノ酸がそのＮおよびＣ末端において少なくとも１つのアミノ酸に隣接しており、該発色性アミノ酸のアミン基が５未満のｐＫａを有し、および該発色性アミノ酸が共役アルデヒドと反応可能であり、ならびに該ポリペプチドが、該発色性アミノ酸のアミノ基を含むペプチド結合を切断しうる標的プロテアーゼに対する標的配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
発色性アミノ酸が、該発色性アミノ酸のアミノ基の窒素原子に直接結合した芳香環部分を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
発色性アミノ酸が立体的な等価性において天然アミノ酸に合致している、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
標的配列が発色性アミノ酸を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
発色性アミノ酸が、該標的配列が切断されると検出可能なシグナルを与えるよう共役アルデヒドと反応可能である、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
。
【請求項６】
共役アルデヒドが置換ベンズアルデヒドまたはシンナムアルデヒドまたはトランス，トランス フェニルペンタジエナールである、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
共役アルデヒドがＤＭＡＣまたはＤＭＡＢである、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
芳香族部分がフェニルまたはナフチル部分である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドが該ポリペプチドのＣ末端もしくはＮ末端において又はその付近において固体表面上に固定化されている、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ポリペプチドが固体表面に共有結合している、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドのＣ末端もしくはＮ末端において又はその付近において第１および第２結合部分を更に含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ポリペプチドが２から１００アミノ酸長、好ましくは３から４０アミノ酸長である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
サンプル中のプロテアーゼ酵素の検出方法であって、
（ｉ）請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドに該サンプルをさらし、該プロテアーゼに該ポリペプチドを切断させて断片（該断片はそのＮ末端に発色性アミノ酸を示す。）を得る工程、
（ｉｉ）共役アルデヒドを、該発色性アミノ酸を含む該断片と反応させて、着色付加体を得る工程、および
（ｉｉｉ）該着色付加体を検出する工程であって、該着色付加体の存在が該サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在を示す工程、
を含む方法。
【請求項１４】
工程（ｉ）が、発色性アミノ酸のアミノ基を含むポリペプチドのペプチド結合を切断するプロテアーゼ酵素を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドの製造方法であって、
ｉ．１つの発色性アミノ酸を含むアミノ酸二量体を合成する工程、および
ｉｉ．該ポリペプチドの合成中に、該二量体を該ポリペプチドの残部に取り込ませる工程
を含んでなる、方法。
【請求項１６】
工程（ｉｉ）が、該二量体を新生オリゴペプチドに結合させることを含む、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび
該ポリペプチドが固定化されうる固体支持体
を含んでなる、サンプル中のプロテアーゼ酵素を検出するための製品。
【請求項１８】
共役アルデヒドを更に含む、請求項１７に記載の製品。
【請求項１９】
固体支持体が、ヒンジにより連結された第１および第２シートを含み、ポリペプチドが第１シート上に固定化されており、および共役アルデヒドが第２シート上に位置していて、それらのシートを一緒に折り畳むことにより第１シートから第２シートへの物質の移動が可能となる、請求項１８に記載の製品。
【請求項２０】
製品が更に、第１シート上に固定化されたポリペプチドと、第２シート上に位置する共役アルデヒドとの間に介在しうる膜を含み、該膜が、閾サイズより大きなサイズを有する物質の、第１シートから第２シートへの通過を妨げ、該ポリペプチドが、該発色性アミノ酸を含む断片を遊離するようプロテアーゼ酵素により切断可能であり、該断片が該閾サイズより小さい、請求項１９に記載の製品。
【請求項２１】
固体支持体がクロマトグラフィー媒体を含む、請求項１７または１８に記載の製品。
【請求項２２】
クロマトグラフィー媒体が更に、プロテアーゼ酵素による切断の後にポリペプチドから遊離可能な発色性アミノ酸を含む該ポリペプチドの断片に結合しうる断片結合性分子を含み、該ポリペプチドが指示区域において該クロマトグラフィー媒体上に固定化可能であり、ならびに該断片結合性分子が可視化区域において該クロマトグラフィー媒体上に固定化可能である、請求項２１に記載の製品。
【請求項２３】
ポリペプチドが第１および第２断片へと切断可能であり、第１断片が該発色性アミノ酸を含み、ならびに製品が更に、第２断片と結合可能な検出可能な標識、および該クロマトグラフィー媒体内または上に固定化された第１および第２捕捉分子を含み、第１捕捉分子が第１断片に結合可能であり、および第２捕捉分子が第２断片または該検出可能標識に結合可能である、請求項２１に記載の製品。
【請求項２４】
標識が、第２断片に結合可能な結合性成分を含む、請求項２３に記載の製品。
【請求項２５】
クロマトグラフィー媒体が試験ストリップを含む、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の製品。
【請求項２６】
クロマトグラフィー媒体が多孔性物質のカラムを含む、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の製品。
【請求項２７】
複数の成分アミノ酸および立体的な等価性において天然アミノ酸に合致している少なくとも１つの発色性アミノ酸を含んでなる合成ポリペプチド。
【請求項２８】
サンプル中のプロテアーゼ酵素の検出のための、請求項２７に記載の合成ポリペプチドの使用。
【請求項１】
発色性アミノ酸を含むポリペプチドであって、該発色性アミノ酸がそのＮおよびＣ末端において少なくとも１つのアミノ酸に隣接しており、該発色性アミノ酸のアミン基が５未満のｐＫａを有し、および該発色性アミノ酸が共役アルデヒドと反応可能であり、ならびに該ポリペプチドが、該発色性アミノ酸のアミノ基を含むペプチド結合を切断しうる標的プロテアーゼに対する標的配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
発色性アミノ酸が、該発色性アミノ酸のアミノ基の窒素原子に直接結合した芳香環部分を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
発色性アミノ酸が立体的な等価性において天然アミノ酸に合致している、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
標的配列が発色性アミノ酸を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
発色性アミノ酸が、該標的配列が切断されると検出可能なシグナルを与えるよう共役アルデヒドと反応可能である、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
。
【請求項６】
共役アルデヒドが置換ベンズアルデヒドまたはシンナムアルデヒドまたはトランス，トランス フェニルペンタジエナールである、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
共役アルデヒドがＤＭＡＣまたはＤＭＡＢである、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
芳香族部分がフェニルまたはナフチル部分である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドが該ポリペプチドのＣ末端もしくはＮ末端において又はその付近において固体表面上に固定化されている、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ポリペプチドが固体表面に共有結合している、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドのＣ末端もしくはＮ末端において又はその付近において第１および第２結合部分を更に含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ポリペプチドが２から１００アミノ酸長、好ましくは３から４０アミノ酸長である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
サンプル中のプロテアーゼ酵素の検出方法であって、
（ｉ）請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドに該サンプルをさらし、該プロテアーゼに該ポリペプチドを切断させて断片（該断片はそのＮ末端に発色性アミノ酸を示す。）を得る工程、
（ｉｉ）共役アルデヒドを、該発色性アミノ酸を含む該断片と反応させて、着色付加体を得る工程、および
（ｉｉｉ）該着色付加体を検出する工程であって、該着色付加体の存在が該サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在を示す工程、
を含む方法。
【請求項１４】
工程（ｉ）が、発色性アミノ酸のアミノ基を含むポリペプチドのペプチド結合を切断するプロテアーゼ酵素を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドの製造方法であって、
ｉ．１つの発色性アミノ酸を含むアミノ酸二量体を合成する工程、および
ｉｉ．該ポリペプチドの合成中に、該二量体を該ポリペプチドの残部に取り込ませる工程
を含んでなる、方法。
【請求項１６】
工程（ｉｉ）が、該二量体を新生オリゴペプチドに結合させることを含む、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび
該ポリペプチドが固定化されうる固体支持体
を含んでなる、サンプル中のプロテアーゼ酵素を検出するための製品。
【請求項１８】
共役アルデヒドを更に含む、請求項１７に記載の製品。
【請求項１９】
固体支持体が、ヒンジにより連結された第１および第２シートを含み、ポリペプチドが第１シート上に固定化されており、および共役アルデヒドが第２シート上に位置していて、それらのシートを一緒に折り畳むことにより第１シートから第２シートへの物質の移動が可能となる、請求項１８に記載の製品。
【請求項２０】
製品が更に、第１シート上に固定化されたポリペプチドと、第２シート上に位置する共役アルデヒドとの間に介在しうる膜を含み、該膜が、閾サイズより大きなサイズを有する物質の、第１シートから第２シートへの通過を妨げ、該ポリペプチドが、該発色性アミノ酸を含む断片を遊離するようプロテアーゼ酵素により切断可能であり、該断片が該閾サイズより小さい、請求項１９に記載の製品。
【請求項２１】
固体支持体がクロマトグラフィー媒体を含む、請求項１７または１８に記載の製品。
【請求項２２】
クロマトグラフィー媒体が更に、プロテアーゼ酵素による切断の後にポリペプチドから遊離可能な発色性アミノ酸を含む該ポリペプチドの断片に結合しうる断片結合性分子を含み、該ポリペプチドが指示区域において該クロマトグラフィー媒体上に固定化可能であり、ならびに該断片結合性分子が可視化区域において該クロマトグラフィー媒体上に固定化可能である、請求項２１に記載の製品。
【請求項２３】
ポリペプチドが第１および第２断片へと切断可能であり、第１断片が該発色性アミノ酸を含み、ならびに製品が更に、第２断片と結合可能な検出可能な標識、および該クロマトグラフィー媒体内または上に固定化された第１および第２捕捉分子を含み、第１捕捉分子が第１断片に結合可能であり、および第２捕捉分子が第２断片または該検出可能標識に結合可能である、請求項２１に記載の製品。
【請求項２４】
標識が、第２断片に結合可能な結合性成分を含む、請求項２３に記載の製品。
【請求項２５】
クロマトグラフィー媒体が試験ストリップを含む、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の製品。
【請求項２６】
クロマトグラフィー媒体が多孔性物質のカラムを含む、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の製品。
【請求項２７】
複数の成分アミノ酸および立体的な等価性において天然アミノ酸に合致している少なくとも１つの発色性アミノ酸を含んでなる合成ポリペプチド。
【請求項２８】
サンプル中のプロテアーゼ酵素の検出のための、請求項２７に記載の合成ポリペプチドの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１１−５０３１６０（Ｐ２０１１−５０３１６０Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３３６５３（Ｐ２０１０−５３３６５３）
【出願日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３８３３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６３２０８
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５０８２５７３４８）モロジック リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３８３３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６３２０８
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５０８２５７３４８）モロジック リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]