プロテアーゼ活性回復方法
【課題】プロテアーゼ活性を阻害したタンパク質溶液のプロテアーゼ活性を、大量に希釈することなく、効率よく回復する、プロテアーゼ活性回復方法を提供する。
【解決手段】プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法であって、吸光度を利用した活性測定法による（Ｘ）のプロテアーゼ活性Ｘｉが、下記タンパク質溶液（Ｓ）の活性を基準として２０％以下であり、（Ｘ）に、（Ｘ）の重量を基準として１００〜１００００００重量％の（Ｃ）をさらに添加するタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：基質（Ｄ）を用いて、プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤。
【解決手段】プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法であって、吸光度を利用した活性測定法による（Ｘ）のプロテアーゼ活性Ｘｉが、下記タンパク質溶液（Ｓ）の活性を基準として２０％以下であり、（Ｘ）に、（Ｘ）の重量を基準として１００〜１００００００重量％の（Ｃ）をさらに添加するタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：基質（Ｄ）を用いて、プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ活性の回復方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素群の総称で、微生物、動物及び植物中に広く存在が知られている。その応用分野としては、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、コンタクトレンズ用洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤（製パン、肉の軟化、水産加工など）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤及び消炎剤などがあり、多くの分野で盛んに利用されている。
しかしながら、プロテアーゼは、プロテアーゼ自身や他のタンパク質を加水分解してしまい、プロテアーゼ自身や他のタンパク質の活性が経時的に著しく低下するという問題が発生している。
そこで、プロテアーゼや他のタンパク質の加水分解を抑えるために、プロテアーゼ活性を阻害するプロテアーゼ活性阻害剤の研究が行われている。例えば、ボロニックアシッドがセリンプロテアーゼやズブチリシンの活性を阻害することが知られている（非特許文献１）。また、４−置換フェニルボロン酸がプロテアーゼの活性を阻害することが知られている（特許文献１）。
しかしながら、これらのプロテアーゼ活性阻害剤は、プロテアーゼ活性の阻害効果が低く、大量に添加してもプロテアーゼやタンパク質の加水分解を十分に抑えることができず、実用的でない。一方、プロテアーゼ活性の阻害効果が高いプロテアーゼ活性阻害剤を用いた場合、大量に希釈しなければプロテアーゼ活性を回復させることができない問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表平１１−５０７６８０号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５１，１９８３，ｐ５−ｐ３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、プロテアーゼ活性を阻害したタンパク質溶液のプロテアーゼ活性を、大量に希釈することなく、効率よく回復するプロテアーゼ活性回復方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法であって、吸光度を利用した活性測定法による（Ｘ）のプロテアーゼ活性Ｘｉが、下記タンパク質溶液（Ｓ）の活性を基準として２０％以下であり、（Ｘ）に、（Ｘ）の重量を基準として１００〜１００００００重量％の（Ｃ）をさらに添加するタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法である。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：基質（Ｄ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、ベンゾイルアルギニンニトロアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド又はサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤。
タンパク質溶液（Ｓ）：タンパク質溶液（Ｘ）において、（Ｂ）を（Ｂ）と同重量の（Ｃ）で置きかえたタンパク質溶液。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のプロテアーゼ活性回復方法は、大量に希釈することなく効率よくプロテアーゼ活性を回復することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】豚トリプシンに対する基質のミカエリス定数Ｋｍを求めるために作成したＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットであり、縦軸をそれぞれの基質濃度での酵素反応初速度の逆数（１／ｖ）、横軸を基質（Ｄ）の濃度［Ｓ］としてプロットしたグラフである。
【図２】豚トリプシンの活性の最適ｐＨを求めるために、縦軸をｐＨ４．５〜９．５における傾き係数ｋ、横軸をｐＨとしてプロットし、豚トリプシンの活性のｐＨ依存性を表したグラフである。
【図３】豚トリプシンの活性の最適温度を求めるために、縦軸を２０〜７０℃における傾き係数ｋ、横軸を温度としてプロットし、豚トリプシンの活性の温度依存性を表したグラフである。
【図４】大豆トリプシン阻害剤の豚トリプシンに対する阻害定数Ｋｉを求めるために作成したＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットであり、豚トリプシンの残存活性をαとしたときに、縦軸を｛［大豆トリプシン阻害剤のモル濃度］／（１−α）｝、横軸を１／αとしてプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明においてプロテアーゼ（Ａ）とは、ペプチド又はタンパク質を基質として加水分解を触媒する酵素である。（Ａ）としては、セリンプロテアーゼ（Ａ−１）、アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａ−２）、システインプロテアーゼ（Ａ−３）及び金属プロテアーゼ（Ａ−４）が含まれる。
【００１０】
セリンプロテアーゼ（Ａ−１）は、触媒残基としてセリン残基をもつプロテアーゼであり、キモトリプシン、トリプシン、トロンビン、プラスミン、エラスターゼ、スブチリシン及びケキシン等が含まれる。具体的には、ブタすい臓由来トリプシン、バシラス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のサブチリシン Ｎｏｖｏ、サブチリシン Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン ３０９、サブチリシン １４７及びサブチリシン １６８等が挙げられる。
市販のセリンプロテアーゼ（Ａ−１）としては、ノボザイムス社製のセリンプロテアーゼ（アルカラーゼ、サビナーゼ、カンナーゼ、エバラーゼ及びＰＴＮ等）及びジェネンコア社のセリンプロテアーゼ（ピュラフェクト及びピュラフェクト ＯＸＰ等）等が挙げられる。
【００１１】
アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａ−２）は、活性中心にアスパラギン酸の存在するプロテアーゼであり、ペプシン、カテプシンＤ、レニン及びキモシン等が含まれる。具体的には、ヒト胃由来のペプシン等が挙げられる。
【００１２】
システインプロテアーゼ（Ａ−３）は、チオール基が活性中心に存在するプロテアーゼであり、パパイン、ブロメライン、フィシン、アクチニジン、カテプシンＢ、カテプシンＨ、カテプシンＬ及びショウガプロテアーゼ等が含まれる。
【００１３】
金属プロテアーゼ（Ａ−４）は、活性中心に金属イオンを含むプロテアーゼであり、例えば、サーモライシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ及びコラゲナーゼ等が挙げられる。
【００１４】
上記プロテアーゼ（Ａ）のうち、基質であるタンパク質を効率よく低分子に分解するとの観点から、セリンプロテアーゼ（Ａ−１）が好ましく、さらに好ましくはスブチリシンである。
【００１５】
本発明においてプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）は、プロテアーゼ（Ａ）と可逆的に結合し、プロテアーゼ（Ａ）の活性を阻害するものである。さらに、基質（Ｄ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、ベンゾイルアルギニンニトロアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド又はサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤である。
【００１６】
基質（Ｄ）について、上記ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリドは、フェニルアラニンのアミノ基にオキシカルボキシベンジル基が結合し、カルボキシル基にニトロアニリンがペプチド結合したものであり、ＭＰ−バイオメディカル社（製品名：Ｎ−ｃｂｚ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）から入手可能である。
上記ベンゾイルアルギニンニトロアニリドは、アルギニンのアミノ基にカルボキシベンジル基が結合し、アルギニンのカルボキシル基にニトロアニリンがペプチド結合したものであり、和光純薬工業（株）（製品名：Ｎα−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩 ）から入手可能である。
上記フリルアクリロイルグリシルロイシンアミドは、グリシルロイシンアミドのアミノ基にフリルアクリル酸がペプチド結合したものであり、シグマ社（製品名：Ｎ‐（３‐［２‐Ｆｕｒｙｌ］ａｃｒｙｌｏｙｌ）‐Ｇｌｙ‐Ｌｅｕ ａｍｉｄｅ）から入手可能である。
上記サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドは、アラニルアラニルプロリルフェニルアラニンの末端アミノ基に無水コハク酸が結合し、末端カルボキシル基にニトロアニリンがペプチド結合したものであり、Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ社（製品名：Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ）から入手可能である。
【００１７】
上記基質（Ｄ）のうち、Ｋｉを求める際にどの基質を用いるかは、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）が活性を阻害するプロテアーゼ（Ａ）の分類により適宜選択される。上記アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａ−２）であればベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、システインプロテアーゼ（Ａ−３）であればベンゾイルアルギニンニトロアニリド、金属プロテアーゼ（Ａ−４）であればフリルアクリロイルグリシルロイシンアミド、セリンプロテアーゼ（Ａ−１）であればサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドを使用する。
上記にプロテアーゼ（Ａ）として例示されていないプロテアーゼについては、参考文献１（Ｒａｗｌｉｎｇｓ， Ｎ．Ｄ． ＆ Ｂａｒｒｅｔｔ， Ａ．Ｊ． （１９９３） Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２９０， ｐ２０５−２１８）に、（Ａ−１）〜（Ａ−４）のいずれに分類されるかが記載されている。
また、上記にも、参考文献１にも記載されていないプロテアーゼが、（Ａ−１）〜（Ａ−４）のいずれに分類されるかは、参考文献２（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ ＆ Ｂａｒｒｅｔｔ（１９９８）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に示される方法を用いることで分類できる。
【００１８】
本発明においてプロテアーゼ（Ａ）の活性の最適基質濃度は、プロテアーゼ（Ａ）に対する基質（Ｄ）のミカエリス定数Ｋｍの３分の１倍〜２倍である。ミカエリス定数Ｋｍは酵素反応初速度の基質濃度依存性を求めることによって求められる。具体的には、下記のミカエリス定数Ｋｍ測定法によって求めたものである。
＜ミカエリス定数Ｋｍ測定法＞
一定量の基質（Ｄ）、プロテアーゼ（Ａ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含む一定の温度及びｐＨに調製した酵素反応溶液（Ｉ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｉ）の温度は、２０〜７０℃の範囲内で、プロテアーゼ（Ａ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、酵素反応溶液（Ｉ）作成時から測定終了までの間、一定温度に保つことができればいい。
酵素反応溶液（Ｉ）のｐＨは、ｐＨ３〜１２の範囲内であればいい。後述する最適ｐＨがわかっている場合は、最適ｐＨであることが好ましい。
酵素反応溶液（Ｉ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファーなどのＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（Ｉ）中の（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（Ｉ）中のプロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、各プロテアーゼによって適宜選択されるが、後述する吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが直線となる濃度を選ぶ。
酵素反応溶液（Ｉ）中の基質（Ｄ）の濃度（モル濃度）は、経時的な吸光度変化を観測できる最小の基質濃度から最大の基質濃度の間で３点以上選べばよい。測定に使用する（Ａ）と類似のプロテアーゼのミカエリス定数Ｋｍが分かっている場合は、類似プロテアーゼのＫｍの１／５０倍〜１０倍の間で３点以上選べばよい。
酵素反応溶液（Ｉ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（Ｉ）を作成したときの温度と同温度である。測定時間は酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化するのが見られれば良い。基質（Ｄ）及びプロテアーゼ（Ａ）を混合した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）と生成物の測定波長におけるモル吸光定数εを用いて下記数式（１）から酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出する。
ｖ＝ΔＡλ／（ε×ｈ×３６００） （１）
さらに、基質（Ｄ）の濃度が異なる酵素反応溶液（Ｉ）を用いて、同様に測定し、酵素反応初速度ｖを算出する。
ミカエリス定数Ｋｍはミカエリスメンテン式から派生するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを用いて求める。Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットは、横軸（ｘ軸）にそれぞれの基質（Ｄ）の濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）にそれぞれの基質濃度での酵素反応初速度の逆数（１／ｖ）をプロットしたものであり、プロットの近似直線とｘ軸との交点が−Ｋｍである。
【００１９】
プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適ｐＨは、様々なｐＨで酵素反応溶液の吸光度を測定することによって決定できる。具体的には、下記の最適ｐＨ測定法によって求めたｐＨである。
＜最適ｐＨ測定法＞
一定量の基質（Ｄ）、プロテアーゼ（Ａ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含むｐＨを３〜１２の範囲で、ｐＨ１きざみ（３．５、４．５、５．５、６．５及び７．５等）に調製した酵素反応溶液（ＩＩ）を作成する。
酵素反応溶液（ＩＩ）の温度は、２０〜７０℃の範囲内で、プロテアーゼ（Ａ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、酵素反応溶液（ＩＩ）作成時から測定終了までの間、一定温度に保つことができればいい。
酵素反応溶液（ＩＩ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（ＩＩ）中の（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（ＩＩ）中の基質（Ｄ）の濃度（モル濃度）は、上記プロテアーゼ（Ａ）の基質（Ｄ）に対するミカエリス定数Ｋｍの４〜６倍である。
酵素反応溶液（ＩＩ）中のプロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、各プロテアーゼによって適宜選択され、後述する吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが直線となる濃度を選ぶ。
酵素反応溶液（ＩＩ）において、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（ＩＩ）を作成したときの温度と同温度である。測定時間ｈは酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で、０．１以上変化すれば良い。基質（Ｄ）及びプロテアーゼ（Ａ）を混合した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλh（３点以上）とし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き（係数ｋ）を求める。さらに、それぞれのｐＨ（３〜１２）の酵素反応溶液（ＩＩ）を用いて測定した係数ｋを用いて、縦軸を係数ｋ、横軸をｐＨとしてプロットし、係数ｋが極大値となるｐＨが最適ｐＨである。
ｐＨを調整する際に、バッファーの種類を変更する場合は、バッファーによってプロテアーゼ活性が異なるため、適宜これを補正する必要がある。補正する方法としては、バッファーの種類を変える境目のｐＨにおいて、両方のバッファーで活性を測定しておき、片方のバッファーで測定した値を基準として活性を補正する方法が挙げられる。
【００２０】
プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度は、様々な温度で酵素反応溶液の吸光度を測定することによって求められる。具体的には、下記の最適温度測定法によって求めた温度である。
＜最適温度測定法＞
一定量の基質（Ｄ）、プロテアーゼ（Ａ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含む最適ｐＨに調整した酵素反応溶液（ＩＩＩ）を作成する。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）の温度は、２０〜７０℃の範囲で、温度が異なるもの（各温度の間隔がおよそ１０℃くらい）を数種類作成する。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（ＩＩＩ）中の（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）中の基質（Ｄ）の濃度（モル濃度）は、後述するプロテアーゼ（Ａ）の基質（Ｄ）に対するミカエリス定数Ｋｍの４〜６倍である。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）中のプロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、各プロテアーゼによって適宜選択され、後述する吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが直線となる濃度を選ぶ。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（ＩＩＩ）を作成したときの温度と同温度である。測定時間ｈは酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で、０．１以上変化すれば良い。基質（Ｄ）及びプロテアーゼ（Ａ）を混合した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλh（３点以上）とし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｋ）を求める。２０〜７０℃の各温度で作成した酵素反応溶液（ＩＩＩ）において測定した係数ｋを用いて、縦軸を係数ｋ、横軸を温度としてプロットする。係数ｋが極大値となる温度がプロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度である。
【００２１】
阻害定数Ｋｉは、上記の測定法により求めたプロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下、下記測定方法によって求められる。
＜阻害定数Ｋｉの測定方法＞
最適温度、最適ｐＨに調製した、一定量のプロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含むプロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ）を作成する。また、（Ｂ）の濃度が異なる（ｉ）を数種類作成する。作成した（ｉ）は、数十分〜数時間静置する。静置後のそれぞれの（ｉ）に、基質（Ｄ）を添加して酵素反応溶液（ＩＶ）を作成する。
（ｉ）及び（ＩＶ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファーなどのＧｏｏｄバッファーが好ましい。（ｉ）及び（ＩＶ）中の（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭであり、最適ｐＨに調整できればいい。
（ｉ）中のプロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、前述のＫｍを求めた際の（Ａ）の濃度付近であり、且つ、後に（ｉ）に添加する基質（Ｄ）溶液のモル濃度の１０００００分の1倍〜１０００分の１倍の濃度である。（ＩＶ）中の（Ａ）のモル濃度は、（ＩＶ）中の基質（Ｄ）のモル濃度の１０００００分の1倍〜１０００分の１倍の濃度である。
（ｉ）及び（ＩＶ）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の濃度（モル濃度）は、プロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）の１０分の１倍〜１０００倍で、（Ｂ）の濃度が異なる溶液（ｉ）を４種類以上作成する。
酵素反応溶液（ＩＶ）中の基質（Ｄ）のモル濃度は、最適基質濃度（上記ミカエリス定数Ｋｍの３分の１倍〜２倍）であり、且つ、プロテアーゼ（Ａ）のモル濃度の５〜１０００００倍の濃度で作成する。
（ｉ）の静置時間は、（Ａ）と（Ｂ）が十分に結合し、プロテアーゼ（Ａ）の活性が一定になるまでの時間であり、あらかじめ実験して求めておく。
プロテアーゼ（Ａ）の活性が一定になるまでの時間は、後述する吸光度を利用した活性測定法により求めることができる。具体的には、プロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ）を作成してから、一定時間おきに、後述する吸光度を利用した活性測定法により、直線の傾き（係数ｋ）を求める。係数ｋが一定になるまでの時間が（Ａ）の活性が一定になるまでの時間である。
プロテアーゼ活性の最適温度及び最適ｐＨの条件下、酵素反応溶液（ＩＶ）を作成後、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時間ｈは酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化すれば良い。（ＩＶ）を作成した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、吸光度変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）と生成物の測定波長におけるモル吸光定数εから上記数式（１）を用いて酵素反応初速度ｖを算出する。また、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の濃度が異なる（ｉ）を用いて作成した酵素反応溶液（ＩＶ）についても同様に測定し、酵素反応初速度ｖを算出する。
酵素反応溶液（ＩＶ）において、（Ｂ）に変えて溶剤（Ｃ）（（Ｂ）の重量分の（Ｃ）を加えた）以外は同様にして作成した酵素反応溶液（ＩＶ’）を用いて測定した酵素反応初速度をｖｏとし、各（Ｂ）濃度での残存活性α（α＝ｖｉ／ｖｏ）を算出する。
横軸に１／αを、縦軸に［（Ｂ）のモル濃度］／（１−α）をプロットし、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎプロットを作成する。このプロットに近似直線を描いたときの傾きＫｉ（ａｐｐ）、測定時の基質濃度［Ｓ］、ミカエリス定数Ｋｍを、下記数式（２）に当てはめることによりＫｉを算出する。
Ｋｉ＝Ｋｉ（ａｐｐ）／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）（２）
上記Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎプロットは、具体的には、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１２７，１９７２，ｐ２１−３３３に記載されている方法を用いる。
【００２２】
本発明において、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の阻害定数Ｋｉは、１ｐＭ〜１０μＭであり、適度なプロテアーゼ濃度範囲でプロテアーゼ活性を抑制し、回復できるとの観点及びプロテアーゼ活性の持続性の観点から、１ｎＭ〜１μＭが好ましい。
【００２３】
上記阻害定数Ｋｉが１ｐＭ未満では、プロテアーゼとプロテアーゼ活性阻害剤の結合が強いため、プロテアーゼの活性を回復させるには大量に希釈しなければならない。例えば、Ｋｉが０．１ｐＭのプロテアーゼ活性阻害剤を、プロテアーゼと等モル量用いてプロテアーゼの活性を２０％以下にした場合、希釈後の（Ａ）の濃度が約１．０×１０-10重量％になるように大希釈しなければプロテアーゼの活性を５０％以上に回復することができない。しかしながら、（Ａ）の濃度が１．０×１０-10重量％以下では、プロテアーゼを衣料用洗浄剤等として使用する場合、添加することによる有用な効果が得られない。
一方、阻害定数Ｋｉが１０μＭより大きくなると、（Ａ）の活性を２０％以下にするのが困難である。また、タンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性の持続性が低い。
本発明において、プロテアーゼ活性の持続性とは、タンパク質溶液（Ｘ）を一定期間保存した後に回復させたプロテアーゼ活性と、保存する前に回復させたプロテアーゼ活性との差が小さく、プロテアーゼ活性の比（％）｛（一定期間保存した後に回復させたプロテアーゼ活性）／（保存する直前に回復させたプロテアーゼ活性）×１００｝が１００％に近くなり、一定のプロテアーゼ活性の回復性があることを意味する。
【００２４】
本発明において、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであることにより、少量の添加で適度にプロテアーゼ活性を阻害することができ、プロテアーゼや他のタンパク質の加水分解を抑えることができる。そのため、タンパク質溶液（Ｘ）において、（Ｂ）により阻害され、低下したプロテアーゼ（Ａ）の活性を、大量に希釈することなく、効率よく回復させることができる。また、タンパク質溶液（Ｘ）を長期間保存した後も、プロテアーゼ活性を効率よく回復することができ、プロテアーゼ活性の持続性が高い。
【００２５】
上記阻害定数Ｋｉを満たすプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）としては、タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−１）、ペプチド型プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−２）及び低分子プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−３）が挙げられる。
【００２６】
タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−１）は、天然物から抽出された又は宿主細胞に遺伝子を組み込むことで発現されたタンパク質であって、アミノ酸の数が５０を超えるタンパク質で下記（Ｂ−２）以外のタンパク質であり、プロテアーゼの活性を阻害するタンパク質である。上記阻害定数Ｋｉを満たす（Ｂ−１）として、具体的には、配列番号１のコムギ由来のタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（アルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ、サビナーゼに対する阻害定数Ｋｉが７５ｐＭ、カンナーゼに対する阻害定数が１２３ｐＭ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｏｕｓ由来Ｓｔｒｅｐｔｏ ｍｙｃｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＳＩ）に代表されるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属由来のスブチリシン阻害剤（スブチリシンＢＰＮに対する阻害定数Ｋｉが７１ｐｐｍ）、大豆由来トリプシン阻害剤（キモトリプシンに対する阻害定数Ｋｉが０．６７μＭ、豚トリプシンに対する阻害定数Ｋｉが１．４ｎＭ）、ヒト由来シスタチンＢ（パパインに対する阻害定数Ｋｉが０．１２ｎＭ）、回虫由来ペプシン阻害剤及びジャガイモ由来カテプシンＤ阻害剤（カテプシンＤに対する阻害定数Ｋｉが２６０ｎＭ）等が挙げられる。
【００２７】
ペプチド型プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−２）には、２〜５０個のアミノ酸からなるペプチド並びにその末端及び／又はアミノ酸側鎖が修飾されたもの等が含まれる。
２〜５０個のアミノ酸からなるペプチドとしては、天然物から抽出された又は宿主細胞に遺伝子を組み込むことで発現されたペプチドであり、プロテアーゼの活性を阻害するペプチドである。
ペプチドの末端の修飾としては、上記ペプチドのＮ及び／又はＣ末端の化学修飾が挙げられ、具体的にはＮ末端にサクシニルクロリドを反応させてサクシニル基を導入したもの、Ｃ末端にカルボジイミド塩酸塩を反応させてＢｏｃ基を導入したもの等が挙げられる。
アミノ酸側鎖の修飾としては、上記ペプチドのアミノ酸側鎖の化学修飾が挙げられる。具体的には、上記ペプチド中のアミノ酸残基（セリン、トレオニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、リシン及びチロシン等）の側鎖（カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基及びチオール基等）に、官能基（カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、スルホ基）を有する化合物が反応したもの等が挙げられる。また、宿主細胞を用いたペプチド発現の過程で翻訳後、化学修飾を受けたもの等も挙げられる。
（Ｂ−２）として、具体的には、ロイペプチン（トリプシンに対する阻害定数３１ｎＭ）及びエグリンＣ（ケキシンに対する阻害定数Ｋｉが３８ｐＭ）等が挙げられる。また、（Ｂ−１）の一部を加水分解したものも含まれる。
【００２８】
低分子プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−３）には、上記（Ｂ−２）以外の分子量５０〜１０００の化合物であり、プロテアーゼ（Ａ）と可逆的な結合を形成し、プロテアーゼの活性を阻害するものが含まれる。例えば、カルボキシル基やアミノ基等を有し、プロテアーゼと水素結合する化合物等が挙げられる。
（Ｂ−３）として、具体的には、カルボキシフェニルボロン酸（アルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉが１０μＭ）、ジクロロフェニルボランジオール（スブチリシンに対する阻害定数Ｋｉが８μＭ）及び３−ニトロフェニルホウ酸（スブチリシンに対する阻害定数Ｋｉが８μＭ）等が挙げられる。
【００２９】
上記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）のうち、低添加量で（Ａ）の活性を阻害し、大量に希釈せずに活性を回復できるとの観点及びプロテアーゼ活性の持続性の観点から、タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−１）が好ましい。
【００３０】
本発明において、溶剤（Ｃ）としては、水、有機溶剤及びこれらの混合物が挙げられる。
【００３１】
水としては、特に限定されるものではなく、例えば、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。また、水中に、後述するｐＨ調整剤（Ｍ）を含むバッファー水溶液等が挙げられる。
【００３２】
有機溶剤としては、アルコール（炭素数１〜１８のアルコールが挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリン等）、ケトン（アセトン、メチルエチルケトン等）、エーテル（テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、エチレングリコールモノアルキルエーテル、プロピレングリコールモノアルキルエーテル、環状エーテル等）、スルホキシド（ジメチルスルホキシド等）、脂肪族または脂環式炭化水素（ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ミネラルスピリット、シクロヘキサン等）及びふっ素含有化合物（テトラフルオロエチレン等）等が挙げられる。これらの有機溶剤のうち、タンパク質の安定性の観点からスルホキシドが好ましい。
【００３３】
溶剤（Ｃ）としては、タンパク質の安定性の観点からスルホキシド及び水が好ましく、さらに好ましくは水であり、特に好ましくはｐＨ調整剤（Ｍ）を含むバッファー水溶液である。
【００３４】
本発明におけるタンパク質溶液（Ｘ）は、上記プロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するものである。
タンパク質溶液（Ｘ）中の（Ａ）の含有量（重量％）は、（Ａ）の凝集を防止する観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、０．０００００００００１〜５重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００００００００１〜２重量％であり、特に好ましくは０．０００００００１〜０．１重量％である。
タンパク質溶液（Ｘ）中の（Ｂ）の含有量（重量％）は、凝集を防止し、（Ａ）の活性を阻害し、大量に希釈せずに活性を回復させる観点及びプロテアーゼ活性の持続性の観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、０．００００００００１〜２０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０００００００１〜５重量％であり、特に好ましくは０．００００００１〜０．１重量％である。
タンパク質溶液（Ｘ）中の（Ｃ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、７５〜９９．９９９９９９９９８９重量％が好ましく、さらに好ましくは９３〜９９．９９９９９９９８９重量％であり、特に好ましくは９９．８〜９９．９９９９９９８９である。
【００３５】
タンパク質溶液（Ｘ）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）とプロテアーゼ（Ａ）とのモル比（（Ｂ）のモル数／（Ａ）のモル数）は、（Ｘ）中で（Ａ）の活性を十分に阻害し、大量に希釈せずに活性を回復させる観点及びプロテアーゼ活性の持続性の観点から０．８〜１０が好ましく、さらに好ましくは１〜８であり、特に好ましくは１．５〜５である。
【００３６】
本発明におけるタンパク質溶液（Ｘ）には、上記のプロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）以外に、界面活性剤（Ｅ）、無機塩（Ｆ）、糖（Ｇ）、アミノ酸（Ｈ）、低分子有機化合物（Ｉ）、脂肪酸（Ｊ）、油脂（Ｋ）、（Ａ）及び（Ｂ）以外のタンパク質（Ｌ）及びｐＨ調整剤（Ｍ）を含有することができる。
【００３７】
界面活性剤（Ｅ）としては、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレン共重合物、ソルビタンアルキルエステルエチレンオキシド付加物、脂肪族アルコールエチレンオキシド付加物、脂肪酸エチレンオキシド付加物及びアルキルアミンエチレンオキシド付加物等が挙げられる。
【００３８】
無機塩（Ｆ）として、塩化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ギ酸ナトリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸アンモニウム等が挙げられる。
【００３９】
糖（Ｇ）として、トレハロース、スクロース、デキストリン、シクロデキストリン、マルトース、フルクトース、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等が挙げられる。
【００４０】
アミノ酸（Ｈ）として、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、リシン、ヒスチジン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、バリン及びそれらの塩等が挙げられる。
【００４１】
低分子有機化合物（Ｉ）としては、酢酸ベンジル、メチルサリチル酸、ベンジルサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、けい皮酸、カフェ酸、カテキン類、アスコルビン酸及びカロテノイド等が挙げられる。
【００４２】
脂肪酸（Ｊ）として、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸等が挙げられる。
【００４３】
油脂（Ｋ）としては、上記脂肪酸（Ｊ）のモノ、ジ又はトリグリセリドが挙げられる。
【００４４】
（Ａ）及び（Ｂ）以外のタンパク質（Ｌ）としては、特に限定するものではないが、プロテアーゼ以外の酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチド等が挙げられ、具体的には、血清アルブミン、コラーゲン、カゼイン、ゼラチン及びシルクペプチド等が挙げられる。
【００４５】
ｐＨ調整剤（Ｍ）としては、従来のｐＨ調整剤が使用でき、例えば、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー及びクエン酸等が挙げられる。
【００４６】
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる界面活性剤（Ｅ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜２５、特に好ましくは０〜１０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる無機塩（Ｆ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜１０が好ましく、さらに好ましくは０〜５、特に好ましくは０〜３である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる糖（Ｇ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれるアミノ酸（Ｈ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる低分子有機化合物（Ｉ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる脂肪酸（Ｊ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる油脂（Ｋ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれるプロテアーゼ以外のタンパク質（Ｌ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれるｐＨ調整剤（Ｍ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０．０１〜２５が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１５、特に好ましくは０．０１〜１０である。
【００４７】
本発明におけるタンパク質溶液（Ｘ）は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）溶剤（Ｃ）にｐＨ調整剤（Ｍ）及びプロテアーゼ（Ａ）を添加し、２５℃で均一になるまで撹拌する。
（２）プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を添加し、２５℃で均一になるまで撹拌する。
（３）最後に（Ｅ）〜（Ｌ）を添加し、２５℃で均一になるまで撹拌し、タンパク質溶液（Ｘ）を製造する。
【００４８】
本発明におけるタンパク質溶液（Ｘ）のｐＨは、タンパク質の安定性への影響の観点から、ｐＨ５〜１０が好ましく、さらに好ましくはｐＨ７〜９である。
（Ｘ）のｐＨは、ｐＨ調整剤（Ｍ）によって適宜調整できる。
【００４９】
本発明におけるタンパク質溶液（Ｘ）は、吸光度を利用した活性測定法によるプロテアーゼ活性Ｘｉが、タンパク質溶液（Ｓ）の活性を基準として２０％以下であるタンパク質溶液である。
【００５０】
タンパク質溶液（Ｓ）は、タンパク質溶液（Ｘ）において、（Ｂ）を（Ｂ）と同重量の（Ｃ）で置きかえたタンパク質溶液である。例えば、（Ｘ）中の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の含有量（重量％）が（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、（Ａ）が２重量％、（Ｂ）が１８重量％、（Ｃ）が８０重量％である場合、（Ｓ）中の（Ａ）は２重量％、（Ｃ）は９８重量％である。
【００５１】
本発明において、吸光度を利用した活性測定法とは、基質（Ｄ）を用いて、一定温度、一定ｐＨ、上述のプロテアーゼ（Ａ）の活性の最適基質濃度の条件下で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する方法である。
基質（Ｄ）として、どの基質を用いるかは、上記Ｋｉを求める際に使用する基質と同様、タンパク質溶液（Ｘ）中のプロテアーゼ（Ａ）の分類により適宜選択される。
吸光度を利用した活性測定法として、具体的には、下記の測定によって求められる。
【００５２】
＜吸光度を利用した活性測定法＞
○プロテアーゼ活性Ｘｉ
一定量のタンパク質溶液（Ｘ）及び一定量の基質（Ｄ）を添加して酵素反応溶液（Ｖ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｖ）の温度は、２０〜７０℃の範囲内で、プロテアーゼ（Ａ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、測定の間一定に保つことができればいい。
酵素反応溶液（Ｖ）中の基質（Ｄ）のモル濃度は、最適基質濃度で上記ミカエリス定数Ｋｍの３分の１倍〜２倍であり、且つ、（Ｖ）中のプロテアーゼ（Ａ）のモル濃度の５〜１０００００倍の濃度であればいい。
酵素反応溶液（Ｖ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（Ｖ）を作成したときの温度と同温度である。酵素反応溶液（Ｖ）を作成直後の吸光度Ａλ0及び酵素反応溶液（Ｖ）を作成からｈ時間後の吸光度Ａλh（３点以上）を測定し、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を求める。測定時間は酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化するのが見られれば良い。吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｋX）を求める。
【００５３】
タンパク質溶液（Ｘ）に変えてタンパク質溶液（Ｓ）を使用する以外は同様にして吸光度を測定し、直線の傾き（係数ｋS）を求める。
【００５４】
上記タンパク質溶液（Ｘ）及び（Ｓ）は、作成してから３０分以上６時間以内のものを使用する。
【００５５】
（Ｘ）のプロテアーゼ活性Ｘｉは、タンパク質溶液（Ｘ）及びタンパク質溶液（Ｓ）を用いた上記の直線の傾き係数ｋX及びｋSから、下記数式（３）によって求められる。
プロテアーゼ活性Ｘｉ（％）＝｛ｋX／ｋS｝×１００ （３）
【００５６】
本発明において（Ｘ）の吸光度を利用した活性測定法によるプロテアーゼ活性Ｘｉは２０％以下であり、プロテアーゼ活性の残存によるプロテアーゼ自身及び／又は他のタンパク質の分解を防止するとの観点から、０〜１０％が好ましく、さらに好ましくは０．００００１〜５％であり、次にさらに好ましくは０．００１〜３％であり、特に好ましくは０．０１〜３％である。
【００５７】
本発明のプロテアーゼ活性回復方法は、（Ｘ）の重量を基準として（Ｃ）を１００〜１００００００重量％添加する方法である。（Ｃ）の添加量は、プロテアーゼ活性を十分に回復させるとの観点から、５００〜１００００００重量％が好ましく、さらに好ましくは１０００〜１００００００重量％であり、次にさらに好ましくは９９００〜１００００００重量％である。
【００５８】
本発明のプロテアーゼ活性回復方法において、回復とは、（Ｘ）の重量を基準として（Ｃ）を１００〜１００００００重量％添加して希釈した後のタンパク質溶液（Ｙ）のプロテアーゼ活性Ｙｉが、タンパク質溶液（Ｔ）の活性を基準として２０％よりも大きくなることを意味する。プロテアーゼ活性Ｙｉは、産業上で有効なプロテアーゼ活性を得る観点から、２５〜１００％が好ましく、さらに好ましくは４０〜１００％であり、次にさらに好ましくは６０〜１００％であり、特に好ましくは８０〜１００％である。
【００５９】
タンパク質溶液（Ｔ）は、タンパク質溶液（Ｙ）において添加された（Ｃ）と同重量の（Ｃ）をタンパク質溶液（Ｓ）に添加したタンパク質溶液である。
【００６０】
○プロテアーゼ活性Ｙｉ
タンパク質溶液（Ｙ）のプロテアーゼ活性Ｙｉは、上記吸光度を利用した活性測定法において、タンパク質溶液（Ｘ）に変えて（Ｙ）を用いて直線の傾き（係数ｋY）を求め、タンパク質溶液（Ｓ）に変えて（Ｔ）を用いて直線の傾き（係数ｋT）を求め、下記数式（４）に当てはめることによって求められる。
プロテアーゼ活性Ｙｉ（％）＝｛ｋY／ｋT｝×１００ （４）
活性測定法で使用するタンパク質溶液（Ｙ）及び（Ｔ）は、作成してから３０分以上６時間以内のものを使用する。
【００６１】
本発明のプロテアーゼ活性回復方法は、（Ｘ）に（Ｘ）の重量を基準として（Ｃ）を１００〜１００００００重量％添加するものであれば特に限定されないが、（Ｘ）と（Ｃ）を均一に混合することが重要であり、（Ｃ）添加後の粘度及び温度等が均一な溶液になるまで攪拌することが好ましい。また、（Ｘ）中のタンパク質の変性に問題がなければ、なるべく高い温度（２０〜３０℃）の（Ｃ）を一度に添加したほうが速やかに活性を回復できるので好ましい。
１例を下記に示す。
（１）一定量の（Ｘ）に一定量の溶剤（Ｃ）を添加し、２５℃で１２０分攪拌する。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６３】
＜製造例１＞
配列番号１〜３のアミノ酸配列をコードする遺伝子（遺伝子北海道システム・サイエンス社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理後、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合した。そのＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株にこのプラスミドを形質転換してプロテアーゼ活性阻害剤遺伝子発現株（ｒ１）〜（ｒ３）を作成した。
【００６４】
プロテアーゼ活性阻害剤遺伝子発現株（ｒ１）〜（ｒ３）をそれぞれＬＢ培養液（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ含有）１ｍＬに植菌して３０℃で１２時間培養を行い、終夜培養液を作成し、さらにこの終夜培養液０．５ｍｌをＬＢ培養液（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ含有）５ｍｌに植菌して３０℃３時間振とう培養を行い前培養液を作成した。前培養液を５０ｍＬの培養液（水５０ｍＬ中のそれぞれの成分の含有量は、酵母エキス（日本製薬社製）１．２ｇ、ポリペプトン（日本製薬社製）０．６ｇ、リン酸２カリウム０．４７ｇ、リン酸１カリウム０．１１ｇ、硫酸アンモニウム０．３５ｇ、リン酸２ナトリウム１２水和物０．６６ｇ、クエン酸ナトリウム２水和物０．０２ｇ、グリセロール０．２ｇ、ラクトアルブミン水解物１．５ｇ、消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）０．３ｇ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、微量金属溶液（塩化カルシウム１８．９μｇ、塩化鉄（ＩＩＩ）５００μｇ、硫酸亜鉛７水和物９．０μｇ、硫酸銅５．１μｇ、塩化マンガン４水和物６．７μｇ、塩化コバルト４．９μｇ、エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム２００μｇ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）に植菌し微生物培養装置（エイブル社製、製品名「ＢｉｏＪｒ．８」）を用いてｐＨ６．８、３０℃を維持したまま培養を行った。培養開始後１Ｍ ＩＰＴＧ溶液を０．１５ｍＬを加えた。培養開始１４時間後から、グリセリン／タンパク質溶液（５０％ グリセリン、５０ｇ／Ｌ ラクトアルブミン水解物、３３ｇ／Ｌ 消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン）の滴下を開始した。培養開始後、４８時間目に培養液（Ｒ１）〜（Ｒ３）を回収した。
【００６５】
得られた培養液（Ｒ１）〜（Ｒ３）から遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ社製「５９２２」、４℃、６０００×ｇ、１０分）を用いて菌体を分離し上清のみを回収した。その後、上清２５ｍｌに１Ｍ ＣａＣｌ2水溶液を２５μｌとイソプロパノール６．２５ｍｌ加えて、遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ社製「５９２２」、４℃、６０００×ｇ、１０分）を用いて沈殿除去を行った後、限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製「アミコンウルトラ−１５」分画分子量１００００）を用いて、１ｍｌ程度になるまで上清の濃縮を行い、配列番号１〜３のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）〜（Ｂ３）の溶液（Ｌ１）〜（Ｌ３）を得た。
【００６６】
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）〜（Ｂ３）の溶液（Ｌ１）〜（Ｌ３）をそれぞれ１μＬと、クマシーブリリアントブルーとＳＤＳを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル処理液１μＬ（アトー社製「イージーステイン・アクア」をそれぞれ混合し、ポリアクリルアミドゲル（アトー社製、ｅ・パジェル ５〜２０％）を用いて２０ｍＡで６０分間電気泳動した。同様に処理した１μｇ、３μｇおよび５μＬのウシ血清アルブミン（和光純薬工業社製）とのバンドの濃さの比較から、（Ｌ１）〜（Ｌ３）中のプロテアーゼ活性阻害剤の濃度を決定しところ、すべて約１μｇ／μＬであった。
【００６７】
＜豚トリプシンの活性の最適ｐＨの測定＞
豚トリプシン（和光純薬工業株式会社）１００ｍｇを３９０ｍＬのバッファー１［５０ｍＭ 酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ４．５、２５℃）水溶液］に溶解させ、豚トリプシン溶液（Ａ１）（１１．１μＭ）とした。
（Ａ１）を１５７０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れた。分光光度計の試料室を２５℃に保ち、セルを試料室内で５分静置し、温調した。ここに、２５℃に温調した基質溶液（１）｛基質（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド、Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ社製、製品名：Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ）をバッファー１に溶解して５ｍｇ／ｍＬ（０．１１９ｍＭ）の濃度にしたもの｝を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＩ−１）とした。（ＩＩ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
同様に、バッファー１に変えてバッファー２［５０ｍＭ 酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ５．５、２５℃）水溶液］、バッファー３［５０ｍＭ 酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ６．５、２５℃）水溶液］、バッファー４［５０ｍＭ リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ６．５、２５℃）水溶液］、バッファー５［５０ｍＭ リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液］、バッファー６［５０ｍＭ リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ８．５、２５℃）水溶液］、バッファー７［５０ｍＭ ＴＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ８．５、２５℃）水溶液］及びバッファー８［５０ｍＭ ＴＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ９．５、２５℃）水溶液］を用いて豚トリプシン溶液（Ａ２）〜（Ａ８）及び基質溶液（２）〜（８）を作成した。
（Ａ１）に変えて（Ａ２）〜（Ａ８）を、基質溶液（１）に変えて基質溶液（２）〜（８）用いる以外は同様にして、酵素反応溶液（ＩＩ−２）〜（ＩＩ−８）を作成し、（ＩＩ−２）〜（ＩＩ−８）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
酵素反応溶液（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−８）について、それぞれ（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−８）を作成した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋを求た。縦軸を係数ｋ、横軸をｐＨとしてプロットし（図２）、係数ｋが極大値となるｐＨを求めたところ、最適ｐＨはｐＨ７．５であった。
なお、バッファーの種類を変える境目のｐＨ（ｐＨ６.５及び８.５）において、両方のバッファーで活性を測定しておき、片方のバッファーで測定した値を基準として活性を補正した。ｐＨ６.５（バッファー３及び４）では、バッファー４を使用して求めた値をｐＨ６.５での結果とし、バッファー１及び２を用いて求めた係数ｋにはバッファー３と４の比（バッファー４での係数ｋ／バッファー３での係数ｋ）をかけて補正した。同様に、ｐＨ８.５（バッファー６及び７）ではバッファー６での値をｐＨ８.５の結果とし、バッファー８を用いて求めた係数ｋにはバッファー６と７の比（バッファー６での係数ｋ／バッファー７での係数ｋ）をかけて補正した。
【００６８】
＜豚トリプシンの活性の最適温度の測定＞
豚トリプシン（和光純薬工業株式会社）１００ｍｇを３９０ｍＬのバッファー５（ｐＨ７.５）に溶解させた豚トリプシン溶液（Ａ５）（１１．１μＭ）を１５７０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れた。分光光度計の試料室を２０℃に保ち、セルを試料室内で５分静置した。
次に、セルに、２０℃に温調した基質溶液（５）（０．１１９ｍＭ、ｐＨ７.５）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＩＩ−１）とした。（ＩＩＩ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
分光光度計の試料室をそれぞれ３０℃、４０℃、５０℃、６０℃又は７０℃に設定して温調し、基質溶液（５）も試料室と同じ温度で温調してからセルに添加する以外は同様にして、酵素反応溶液（ＩＩＩ−２）〜（ＩＩＩ−６）を作成した。（ＩＩＩ−２）〜（ＩＩＩ−６）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
酵素反応溶液（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−６）について、それぞれ（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−６）を作成した直後の吸光度をＡλ0、２分後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋを求た。縦軸を係数ｋ、横軸を温度としてプロットし（図３）、係数ｋが極大値となる温度を求めたところ、最適温度は４０℃であった。
【００６９】
＜豚トリプシンに対する基質のミカエリス定数Ｋｍの測定＞
豚トリプシン溶液（Ａ５）を１５７０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れた。分光光度計の試料室を２５℃に保ち、セルを試料室内で３０分静置した。ここに、２５℃に温調した基質溶液（５）（基質濃度：５ｍｇ／ｍＬ（０．１１９ｍＭ）、ｐＨ７.５）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｉ−１）とした。（Ｉ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
基質溶液（５）において、基質（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）のバッファー５中のモル濃度を０．０２４ｍＭ（基質溶液（９）、１ｍｇ／ｍＬ）、０．２３７ｍＭ（基質溶液（１０）、１０ｍｇ／ｍＬ）、０．４７４ｍＭ（基質溶液（１１）、２０ｍｇ／ｍＬ）及び１．１９ｍｍＭ（基質溶液（１２）、５０ｍｇ／ｍＬ）とした溶液を作成した。基質溶液（５）に変えて基質溶液（９）〜（１２）を用いる以外は同様にして酵素反応溶液（Ｉ−２）〜（Ｉ−５）を作成した。（Ｉ−２）〜（Ｉ−５）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
（Ｉ−１）〜（Ｉ−５）を作成直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、それぞれ吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）と４０５ｎｍにおけるモル吸光定数εを用いて下記数式（１）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＡλ／（ε×ｈ×３６００）（１）
算出した酵素反応初速度ｖを用いて、横軸（ｘ軸）にそれぞれの基質濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）にそれぞれの基質濃度での酵素反応初速度の逆数１／ｖをプロットし、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを作成した（図１）。プロットの近似直線とｘ軸との交点（−Ｋｍ）から、ミカエリス定数Ｋｍは０．００４ｍＭであった。
【００７０】
＜大豆トリプシン阻害剤の豚トリプシンに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
大豆トリプシン阻害剤（和光純薬工業株式会社）２５ｍｇを５０ｍＬのバッファー５（ｐＨ７．５）に溶解させ、大豆トリプシン阻害剤溶液（ｂ１）（２０μＭ）とした。（ｂ１）をバッファー５で１／１０、１／４、１／２および３／４倍のモル濃度に希釈したものを（ｂ２）〜（ｂ５）とした。
バッファー５を１５３０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れ、豚トリプシン溶液（Ａ５）を４０μＬ及び（ｂ１）を４０μＬ添加し、プロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ−１）を作成した。
分光光度計の試料室を４０℃に保ち、セルを試料室内で３０分静置した。ここに、４０℃に温調した基質溶液（１３）｛基質（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）をバッファー５に溶解して０．１６ｍｇ／ｍＬ（０．００４ｍＭ）の濃度にしたもの｝を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＶ−１）を作成した。（ＩＶ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録した。
（ｂ１）に変えて（ｂ２）〜（ｂ５）及びバッファー５を用いる以外は同様にして、プロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ−２）〜（ｉ−６）を作成し、基質溶液（１３）を用いて酵素反応溶液（ＩＶ−２）〜（ＩＶ−６）を作成し、同様に吸光度を記録した。
（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−６）を作成直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、それぞれ吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）と４０５ｎｍにおけるモル吸光定数εを用いて下記数式（１）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＡλ／（ε×ｈ×３６００）（１）
（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−５）の酵素反応初速度ｖｉ、（ＩＶ−６）の酵素反応初速度をｖｏとし、大豆トリプシン阻害剤の各濃度での残存活性α（ｘ＝ｖｉ／ｖｏ）を算出した。
横軸に１／αを、縦軸に［大豆トリプシン阻害剤の各モル濃度］／（１−α）をプロットし、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎプロットを作成した（図４）。このプロットに近似直線を描いたときの傾きＫｉ（ａｐｐ）、測定時の基質濃度［Ｓ］、豚トリプシンに対する基質のミカエリス定数Ｋｍを、下記数式（２）に当てはめることによりＫｉを算出した。Ｋｉは１．４ｎＭであった。
Ｋｉ＝Ｋｉ（ａｐｐ）／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ） （２）
【００７１】
＜アルカラーゼの活性の最適ｐＨの測定＞
アルカラーゼ（ノボザイムス社製）１０μＬをそれぞれバッファー１〜８（１０ｍＬ）に希釈し、アルカラーゼ溶液（Ａ９）〜（Ａ１６）（０．０４μＭ）とした。また、基質（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）をそれぞれバッファー１〜８に希釈（１１８ｍｇ／ｍＬ（２．８ｍＭ））して、基質溶液（１４）〜（２１）を作成した。
上記［豚トリプシンの活性の最適ｐＨの測定］において、（Ａ１）〜（Ａ８）に変えて（Ａ９）〜（Ａ１６）を用いて、基質溶液（１）〜（８）に変えて（１４）〜（２１）を用いる以外は同様にして測定したところ、アルカラーゼの活性の最適ｐＨは８．５であった。
【００７２】
＜アルカラーゼの活性の最適温度の測定＞
アルカラーゼ（ノボザイムス社製）１０μＬを１０ｍＬのバッファー６（ｐＨ８.５）に溶解させた（Ａ１４）（０．０４μＭ）を使用した。
上記［豚トリプシンの活性の最適温度の測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ１４）を用いて、基質溶液（５）に変えて基質溶液（１９）（ｐＨ８.５）を用いる以外は同様にして測定したところ、アルカラーゼの活性の最適温度は５０℃であった。
【００７３】
＜アルカラーゼに対する基質のミカエリス定数Ｋｍの測定＞
上記［豚トリプシンに対する基質のミカエリス定数Ｋｍの測定］において、（Ａ５）に変えて下記（Ａ１４）を用いて、バッファー５に変えてバッファー６を用いて、基質溶液（５）、（９）〜（１２）に変えて、基質溶液（１９）、（２２）〜（２４）｛バッファー６を用いて、それぞれ基質濃度：５０ｍｇ／ｍＬ（１．１９ｍＭ）、基質濃度：３０ｍｇ／ｍＬ（０．７１４ｍＭ）、基質濃度：１０ｍｇ／ｍＬ（０．２３８ｍＭ）としたもの｝を用いて、分光光度計の試料室及びそれぞれの溶液の温度を５０℃にする以外は同様にした。アルカラーゼの基質に対するミカエリス定数Ｋｍは０．７ｍＭであった。
【００７４】
＜フェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
カルボキシフェニルボロン酸（東京化成工業株式会社）２５ｍｇを５０ｍＬのバッファー６（ｐＨ８．５）に溶解させ、フェニルボロン酸溶液（ｂ６）（４．１ｍＭ）とした。（ｂ６）をバッファー６で１／１０、１／４、１／２および３／４のモル濃度に希釈したものを（ｂ７）〜（ｂ１０）とした。
基質（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）をバッファー６に溶解して、基質溶液（２５）（１５ｍｇ／ｍＬ（０．３５ｍＭ））を作成した。
上記［大豆トリプシン阻害剤の豚トリプシンに対する阻害定数Ｋｉの測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ１４）を、バッファー５に変えてバッファー６を用いて、（ｂ１）〜（ｂ５）に変えて（ｂ６）〜（ｂ１０）を用いて、基質溶液（１３）に変えて（２５）を用いて、分光光度計の試料室及びそれぞれの溶液の温度を５０℃にする以外は同様にした。フェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉは１０μＭであった。
【００７５】
＜コムギプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
製造例１で得た（Ｂ１）の溶液（Ｌ１）（１μｇ／μＬ）１ｍＬを５０ｍＬのバッファー６（ｐＨ８．５）に溶解させ、コムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１１）（０．８μＭ）とした。（ｂ１１）をバッファー６で１／５０、１／３０、１／２０および１／１０倍のモル濃度に希釈したものを（ｂ１２）〜（ｂ１５）とした。上記［フェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定］において、（ｂ６）〜（ｂ１０）に変えて（ｂ１１）〜（ｂ１５）を使用して同様に測定し、コムギプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めたところ、Ｋｉは１ｐＭであった。
【００７６】
＜ストレプトマイセスプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
製造例１で得た（Ｂ２）の溶液（Ｌ２）（１μｇ／μＬ）１ｍＬを５０ｍＬのバッファー６（ｐＨ８．５）に溶解させ、ストレプトマイセスプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１６）（０．７μＭ）とした。（ｂ１６）をバッファー６で１／５０、１／３０、１／２０および１／１０倍のモル濃度に希釈したものを（ｂ１７）〜（ｂ２０）とした。上記［フェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定］において、（ｂ６）〜（ｂ１０）に変えて（ｂ１６）〜（ｂ２０）を使用して同様に測定し、ストレプトマイセスプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めたところ、Ｋｉは０．１ｐＭであった。
【００７７】
＜ヒトプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ３）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
製造例１で得た（Ｂ３）の溶液（Ｌ３）（１μｇ／μＬ）１ｍＬを５０ｍＬのバッファー６（ｐＨ８．５）に溶解させ、コムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ２１）（０．６μＭ）とした。（ｂ２１）をバッファー６で１／５０、１／３０、１／２０および１／１０倍のモル濃度に希釈したものを（ｂ２２）〜（ｂ２５）とした。上記［フェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定］において、（ｂ６）〜（ｂ１０）に変えて（ｂ２１）〜（ｂ２５）を使用して同様に測定し、ヒトプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ３）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めたところ、Ｋｉは２０μＭであった。
【００７８】
＜４−カルボキシフェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
４−カルボキシフェニルボロン酸（東京化成工業株式会社）２５ｍｇを５０ｍＬのバッファー６に溶解させ、４−カルボキシフェニルボロン酸溶液（ｂ２６）（１２１ｍＭ）とした。（ｂ２６）をバッファー６で１／１０、１／４、１／２及び３／４のモル濃度に希釈したものを（ｂ２７）〜（ｂ３０）とした。
上記［フェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定］において、（ｂ６）〜（ｂ１０）に変えて（ｂ２６）〜（ｂ３０）を使用して同様に測定し、４−カルボキシフェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めたところ、Ｋｉは２．１ｍＭであった。
【００７９】
＜サビナーゼ活性の最適ｐＨの測定＞
サビナーゼ（ノボザイムス社製）１０μＬをそれぞれバッファー１〜８及びバッファー９［５０ｍＭ ＴＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０．５、２５℃）水溶液］（１０ｍＬ）に希釈し、サビナーゼ溶液（Ａ１７）〜（Ａ２５）とした。上記［豚トリプシンの活性の最適ｐＨの測定］において、（Ａ１）〜（Ａ８）に変えて（Ａ１７）〜（Ａ２５）を用いて、基質溶液（１）〜（８）に変えて基質溶液（１４）〜（２１）及び（２６）｛基質溶液（２６）はバッファー９を用いて基質濃度：１１８ｍｇ／ｍＬ（２．８ｍＭ）としたもの｝を用いる以外は同様にして測定したところ、サビナーゼの活性の最適ｐＨは９．５であった。
【００８０】
＜サビナーゼ活性の最適温度の測定＞
上記［豚トリプシンの活性の最適温度の測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ２４）を用いて、基質溶液（５）に変えて基質溶液（２１）（ｐＨ９.５）を用いる以外は同様にして測定したところ、サビナーゼの活性の最適温度は５０℃であった。
【００８１】
＜サビナーゼの基質に対するＫｍの測定＞
上記［豚トリプシンに対する基質のミカエリス定数Ｋｍの測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ２４）を用いて、バッファー５に変えてバッファー８を用いて、基質溶液（５）及び（９）〜（１２）に変えて基質溶液（２１）及び（２７）〜（２９）｛基質溶液（２７）〜（２９）はバッファー８を用いて、それぞれ基質濃度：５０ｍｇ／ｍＬ（１．１９ｍＭ）、基質濃度：３０ｍｇ／ｍＬ（０．７１４ｍＭ）、基質濃度：１０ｍｇ／ｍＬ（０．２３８ｍＭ）としたもの｝を用いて、分光光度計の試料室及びそれぞれの溶液の温度を５０℃にする以外は同様にしてサビナーゼの基質に対するＫｍを測定した。サビナーゼの基質に対するミカエリス定数Ｋｍは０．７ｍＭであった。
【００８２】
＜コムギプロテアーゼ活性阻害剤のサビナーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
製造例１で得た（Ｂ１）の溶液（Ｌ１）（１μｇ／μＬ）１ｍＬを５０ｍＬのバッファー８（ｐＨ９．５）に溶解させ、コムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ３１）（２．７μＭ）とした。（ｂ３１）をバッファー８で１／５０、１／３０、１／２０および１／１０倍のモル濃度に希釈したものを（ｂ３２）〜（ｂ３５）とした。上記［大豆トリプシン阻害剤の豚トリプシンに対する阻害定数Ｋｉの測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ２４）を、（ｂ１）〜（ｂ５）に変えて（ｂ３１）〜（ｂ３５）を、基質溶液（１３）に変えて基質溶液（３０）｛バッファー８を用いて、基質濃度：１５ｍｇ／ｍＬ（０．３５ｍＭ）としたもの｝を使用し、分光光度計の試料室及びそれぞれの溶液の温度を５０℃にする以外は同様にした。コムギプロテアーゼ活性阻害剤のサビナーゼに対する阻害定数を測定したところ、Ｋｉは７５ｐＭであった。
【００８３】
＜カンナーゼ活性の最適ｐＨの測定＞
カンナーゼ（ノボザイムス社製）１０μＬをそれぞれバッファー１〜８（１０ｍＬ）に希釈し、カンナーゼ溶液（Ａ２６）〜（Ａ３３）とした。上記［豚トリプシンの活性の最適ｐＨの測定］において、（Ａ１）〜（Ａ８）に変えて（Ａ２６）〜（Ａ３３）を用いて、基質溶液（１）〜（８）に変えて（１４）〜（２１）を用いる以外は同様にして測定したところ、カンナーゼの活性の最適ｐＨは８．５であった。
【００８４】
＜カンナーゼ活性の最適温度の測定＞
上記［豚トリプシンの活性の最適温度の測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ３１）を用いて、基質溶液（５）に変えて基質溶液（１９）（ｐＨ８．５）を用いる以外は同様にして測定したところ、カンナーゼの活性の最適温度は４０℃であった。
【００８５】
＜カンナーゼの基質に対するＫｍの測定＞
上記［豚トリプシンに対する基質のミカエリス定数Ｋｍの測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ３１）を用いて、バッファー５に変えてバッファー６を用いて、基質溶液（５）、（９）〜（１２）に変えて基質溶液（１９）及び（２２）〜（２４）を用いて、分光光度計の試料室及びそれぞれの溶液の温度を４０℃にする以外は同様にカンナーゼの基質に対するＫｍを測定した。カンナーゼの基質に対するミカエリス定数Ｋｍは０．４ｍＭであった。
【００８６】
＜コムギプロテアーゼ活性阻害剤のカンナーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
上記［大豆トリプシン阻害剤の豚トリプシンに対する阻害定数Ｋｉの測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ３１）を、（ｂ１）〜（ｂ５）に変えて（ｂ１１）〜（ｂ１５）を、基質溶液（１３）に変えて基質溶液（２５）を使用し、分光光度計の試料室及びそれぞれの溶液の温度を４０℃にする以外は同様にして測定した。コムギプロテアーゼ活性阻害剤のカンナーゼに対する阻害定数Ｋｉは１２３ｐＭであった。
【００８７】
＜実施例１＞
１５３０μＬのバッファー５に、前述の豚トリプシン溶液（Ａ５）（０.２５６ｇ／Ｌ、１１．１μＭ）４０μＬおよび前述の大豆トリプシン阻害剤溶液（ｂ１）（０．５ｇ／Ｌ、２０μＭ）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−１）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−１）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ１％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−１）を８００μＬと、バッファー５を８００μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−１−１）を作成した（実施例１−１）。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−１−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ、プロテアーゼ活性は２９％に回復していた。
また、（Ｘ−１）とバッファー５を、表１に記載の量（μＬ）で混合し、（Ｙ−１−２）〜（Ｙ−１−８）を作成し（実施例１−２〜１−８）、プロテアーゼ活性Ｙｉを測定した。結果を表１にまとめた。
【００８８】
＜実施例２＞
１５３０μＬのバッファー６に、前述のアルカラーゼ溶液（Ａ１４）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）４０μＬおよび前述のフェニルボロン酸溶液（ｂ６）（０.５ｇ／Ｌ、３２．８ｍＭ）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−２）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−２）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ１％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−２）を１６μＬと、バッファー６を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−２−１）を作成した（実施例２−１）。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−２−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ、プロテアーゼ活性は４１％に回復していた。
また、（Ｘ−２）とバッファー６を、表１に記載の量で混合し、（Ｙ−２−２）〜（Ｙ−２−７）を作成し（実施例２−２〜２−７）、プロテアーゼ活性Ｙｉを測定した。結果を表１にまとめた。
【００８９】
＜実施例３＞
１５３０μＬのバッファー６に、前述のアルカラーゼ溶液（Ａ１４）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）４０μＬおよび前述のコムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１１）（０．０２ｇ／Ｌ、０．８μＭ）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−３）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−３）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ０．０１％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−３）を１６μＬと、バッファー６を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−３−１）を作成した（実施例３−１）。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−３−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ、プロテアーゼ活性は２５％に回復していた。
また、（Ｘ−３）とバッファー６を、表１に記載の量で混合し、（Ｙ−３−２）〜（Ｙ−２−７）を作成し（実施例３−２〜３−７）、プロテアーゼ活性Ｙｉを測定した。結果を表１にまとめた。
【００９０】
＜実施例４＞
１５３０μＬのバッファー８に、前述のサビナーゼ溶液（Ａ２４）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）４０μＬおよび前述のコムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１１）（０．８μＭ）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−４）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−４）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ１％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−４）を１６μＬと、バッファー８を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−４−１）を作成した（実施例４−１）。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−４−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ、プロテアーゼ活性は３５％に回復していた。
また、（Ｘ−４）とバッファー８を、表１に記載の量で混合し、（Ｙ−４−２）〜（Ｙ−４−７）を作成し（実施例４−２〜４−７）、プロテアーゼ活性Ｙｉを測定した。結果を表１にまとめた。
【００９１】
＜実施例５＞
１５３０μＬのバッファー６に、前述のカンナーゼ溶液（Ａ３１）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）４０μＬおよび前述のコムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１１）（０．８μＭ）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−５）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−５）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ３％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−５）を１６μＬと、バッファー６を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−５−１）を作成した（実施例５−１）。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−５−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ、プロテアーゼ活性は３１％に回復していた。
また、（Ｘ−５）とバッファー７を、表１に記載の量で混合し、（Ｙ−５−２）〜（Ｙ−５−７）を作成し（実施例５−２〜５−７）、プロテアーゼ活性Ｙｉを測定した。結果を表１にまとめた。
【００９２】
＜実施例６＞
１３３０μＬのバッファー６に、前述のカンナーゼ溶液（Ａ３１）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）１００μＬおよび前述のコムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１１）（０．８μＭ）１００μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−６）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−６）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ１％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−６）を１６μＬと、バッファー７を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−６−１）を作成した（実施例５−１）。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−６−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ、プロテアーゼ活性は２５％に回復していた。
また、（Ｘ−６）とバッファー６を、表１に記載の量で混合し、（Ｙ−６−２）〜（Ｙ−６−７）を作成し（実施例６−２〜６−７）、プロテアーゼ活性Ｙｉを測定した。結果を表１にまとめた。
【００９３】
＜実施例７＞
１３３０μＬのバッファー６に、前述のカンナーゼ溶液（Ａ３１）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）１００μＬおよび前述のコムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１４）（０．０４μＭ）１００μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−７）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−７）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ１９％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−７）を１６μＬと、バッファー７を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−７−１）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−６−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ、プロテアーゼ活性は５５％に回復していた。
また、（Ｘ−７）とバッファー６を、表１に記載の量で混合し、（Ｙ−７−２）〜（Ｙ−７−７）を作成し（実施例７−２〜７−７）、プロテアーゼ活性Ｙｉを測定した。結果を表１にまとめた。
【００９４】
＜比較例１＞
前述のアルカラーゼ溶液（Ａ１４）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）４０μＬに４−カルボキシフェニルボロン酸溶液（ｂ３６）｛４−カルボキシフェニルボロン酸１ｍｇを２ｍＬのバッファー６に溶解させたもの（４−カルボキシフェニルボロン酸の濃度：０.５ｇ／Ｌ、１２１ｍＭ）｝１５３０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−８）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−８）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ４０％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−８）を１６μＬと、バッファー６を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−８）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−８）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ９８％であった。
【００９５】
＜比較例２＞
１５３０μＬのバッファー６に、前述のアルカラーゼ溶液（Ａ１４）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）４０μＬおよび前述のストレプトマイセスプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１６）（０．７μＭ）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−９）を作成した。プロテアーゼ活性は０％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−９）を１μＬと、バッファー６を１，０００，０００μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−８）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−９）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ７％であった。
【００９６】
＜比較例３＞
前述のアルカラーゼ溶液（Ａ１４）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）４０μＬに、前述のヒトプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ３７）｛溶液（Ｌ３）７８５μＬを７８５μＬのバッファー６に溶解させたもの（ヒトプロテアーゼ（Ｂ３）の濃度：０．５ｇ／Ｌ、１５μＭ）｝１５７０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−１０）を作成した。プロテアーゼ活性は２１％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−１０）を１６μＬと、バッファー６を１５９，９８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−１０）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−１０）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ９６％であった。
【００９７】
【表１】
【００９８】
＜吸光度を利用した活性測定法＞
○タンパク質溶液（Ｘ−１）の場合
タンパク質溶液（Ｘ−１）１５７０μＬを分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れ、分光光度計の試料室を２５℃に保ち、セルを試料室内で３０分静置した。ここに、２５℃に温調した基質溶液（３１）｛基質（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）をバッファー５に溶解して１．３ｍｇ／ｍＬ（０．０２９ｍＭ）の濃度にしたもの｝を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｖ−１）を作成した。（Ｖ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録した。
（Ｖ−１）を作成した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋXを求た。
○タンパク質溶液（Ｓ−１）を用いた吸光度の測定
１５７０μＬのバッファー６に、豚トリプシン溶液（Ａ６）（１１．１μＭ）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｓ−１）を作成した。これを全量、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れ、分光光度計の試料室を２５℃に保ち、セルを試料室内で３０分静置した。ここに、２５℃に温調した基質溶液（２７）（０．０２９ｍＭ）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｖ−２）を作成した。（Ｖ−２）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録した。
（Ｖ−２）を作成した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋSを求た。
○タンパク質溶液（Ｘ−１）のプロテアーゼ活性Ｘｉの算出
係数ｋX及び係数ｋSを用いて、下記数式（３）からタンパク質溶液（Ｘ−１）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
プロテアーゼ活性Ｘｉ（％）＝｛ｋX／ｋS｝×１００ （３）
【００９９】
○タンパク質溶液（Ｘ−２）の場合
基質溶液（３２）｛基質（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）をバッファー６に溶解して１１９ｍｇ／ｍＬ（２．８ｍＭ）の濃度にしたもの｝を作成した。
１５７０μＬのバッファー６に、前述のアルカラーゼ溶液（Ａ１４）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｓ−２）を作成した。
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−２）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３２）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−２）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−２）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１００】
○タンパク質溶液（Ｘ−３）の場合
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−３）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３２）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−２）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−３）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０１】
○タンパク質溶液（Ｘ−４）の場合
基質溶液（３３）｛（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）をバッファー８に溶解して６０ｍｇ／ｍＬ（１．４ｍＭ）の濃度にしたもの｝を作成した。
１５７０μＬのバッファー８に、前述のサビナーゼ溶液（Ａ２４）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｓ−４）を作成した。
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−４）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３３）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−４）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−４）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０２】
○タンパク質溶液（Ｘ−５）の場合
基質溶液（３４）｛（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）をバッファー６に溶解して６０ｍｇ／ｍＬ（１．４ｍＭ）の濃度にしたもの｝を作成した。
１５７０μＬのバッファー６に、前述のカンナーゼ溶液（Ａ３１）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｓ−５）を作成した。
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−５）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３４）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−５）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−５）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０３】
○タンパク質溶液（Ｘ−６）の場合
１４３０μＬのバッファー６に、前述のカンナーゼ溶液（Ａ３１）１００μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｓ−６）を作成した。
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−６）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３４）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−６）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−６）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０４】
○タンパク質溶液（Ｘ−７）の場合
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−７）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３４）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−６）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−７）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０５】
○タンパク質溶液（Ｘ−８）の場合
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−８）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３２）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−２）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−８）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０６】
○タンパク質溶液（Ｘ−９）の場合
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−９）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３２）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−２）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−９）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０７】
○タンパク質溶液（Ｘ−１０）の場合
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−１０）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３２）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−２）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−１０）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０８】
○タンパク質溶液（Ｙ−１）の場合
タンパク質溶液（Ｓ−１）を１６μＬと、バッファー５を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｔ−１−１）を作成した。
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｙ−１−１）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｔ−１−１）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｙ−１−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを求めた。
表１に記載の（Ｘ）の量と同量の（Ｓ−１）及び溶剤を混合し、（Ｔ−１−２）〜（Ｔ−１−８）を作成し、（Ｙ−１−２）〜（Ｙ−１−８）について同様にプロテアーゼ活性Ｙｉを求めた。
【０１０９】
○タンパク質溶液（Ｙ−２）の場合
タンパク質溶液（Ｓ−２）を１６μＬと、バッファー６を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｔ−２−１）を作成した。
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｙ−２−１）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｔ−２−１）を使用し、基質溶液（３１）に変えて基質溶液（３２）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｙ−２−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを求めた。
表１に記載の（Ｘ）の量と同量の（Ｓ−２）及び溶剤を混合し、（Ｔ−２−２）〜（Ｔ−２−７）を作成し、（Ｙ−２−２）〜（Ｙ−２−７）について同様にプロテアーゼ活性Ｙｉを求めた。
【０１１０】
○タンパク質溶液（Ｙ−３）〜（Ｙ−１０）の場合
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えてタンパク質溶液（Ｙ−３）〜（Ｙ−１０）をそれぞれ使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｔ−３）〜（Ｔ−１０）をそれぞれ作成して使用し、基質溶液（３１）に変えて基質溶液（３２）〜（３５）をそれぞれ使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｙ−３）〜（Ｙ−１０）のプロテアーゼ活性Ｙｉを求めた。
【０１１１】
＜実施例８〜１４及び比較例４〜６＞
＜３０℃、３ヶ月保存後のタンパク質溶液のプロテアーゼ活性＞
３０℃で３ヶ月保存した後のタンパク質溶液（Ｘ−１）〜（Ｘ−１０）を用いて表２に記載の通りタンパク質溶液（Ｙ’−１−１）〜（Ｙ’−１０）を作成し、実施例１〜７及び比較例１〜３と同様にして[吸光度を利用した活性測定法］によりプロテアーゼ活性Ｙｉを求めた。結果を表２に示す。
【０１１２】
＜プロテアーゼ活性の持続性＞
タンパク質溶液（Ｙ−１−１）〜（Ｙ−９）及びタンパク質溶液（Ｙ’−１−１）〜（Ｙ’−９）のプロテアーゼ活性Ｙｉを下記式に当てはめることにより、プロテアーゼ活性の持続性を算出した。
プロテアーゼ活性の持続性（％）＝｛タンパク質溶液（Ｙ−１−１）〜（Ｙ−９）のプロテアーゼ活性Ｙｉ｝／｛タンパク質溶液（Ｙ’−１−１）〜（Ｙ’−９）のプロテアーゼ活性Ｙｉ｝
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
プロテアーゼ（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが２．１ｍＭ又は２０μＭのプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を含む比較例１及び比較例３のタンパク質溶液（Ｘ−８）及び（Ｘ−１０）は、実施例１〜７のタンパク質溶液よりも大量の（Ｂ）を含んでいるものの、活性Ｘｉは２１％以上と高く、プロテアーゼ活性を十分に抑制できないことが分かる。また、表２の結果から、３０℃で３ヶ月保存後のタンパク質溶液（Ｘ−８）及び（Ｘ−１０）に溶剤を添加したタンパク質溶液（Ｙ）の活性Ｙｉは３〜５％と低く、プロテアーゼ活性の持続性も３〜５％と低かった。
また、プロテアーゼ（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが０．１ｐＭの比較例２のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を含むタンパク質溶液（Ｘ−９）の活性Ｘｉは０％と低く、プロテアーゼ活性は抑制できていた。しかしながら、表１の結果から、このタンパク質溶液（Ｘ−９）に大量に溶剤を添加したタンパク質溶液（Ｙ）の活性Ｙｉは７％と低く、プロテアーゼの活性を効率よく回復できないことが分かる。
一方、それぞれのプロテアーゼ（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を含む実施例１〜７のタンパク質溶液（Ｘ−１）〜（Ｘ−７）の活性Ｘｉは３以下と低く、プロテアーゼ活性を十分抑制できていた。また、表１の結果から、このタンパク質溶液（Ｘ−１）〜（Ｘ−７）に溶剤を添加したタンパク質溶液（Ｙ）の活性Ｙｉは２５〜９７％と高く、プロテアーゼの活性を大量に希釈することなく効率よく回復できていることが分かる。さらに、表２の結果から、３０℃で３ヶ月保存後のタンパク質溶液（Ｘ−１）〜（Ｘ−７）に溶剤を添加したタンパク質溶液（Ｙ）の活性Ｙｉも高く、プロテアーゼ活性の持続性が４６〜１００％と非常に高かった。
以上のことから、本発明のプロテアーゼ活性回復方法は、タンパク質溶液のプロテアーゼ活性を大量に希釈することなく、効率よく回復できることが分かる。また、タンパク質溶液を長期保存した場合も同様に、プロテアーゼ活性を大量に希釈することなく効率よく回復できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明のプロテアーゼ活性回復方法は、保存溶液中でプロテアーゼ活性を抑え、適度な希釈時にプロテアーゼ活性を回復するので、プロテアーゼと他のタンパク質の混合溶液の保存、例えば液体洗浄剤、繊維改質剤及び化粧品などに使用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ活性の回復方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素群の総称で、微生物、動物及び植物中に広く存在が知られている。その応用分野としては、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、コンタクトレンズ用洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤（製パン、肉の軟化、水産加工など）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤及び消炎剤などがあり、多くの分野で盛んに利用されている。
しかしながら、プロテアーゼは、プロテアーゼ自身や他のタンパク質を加水分解してしまい、プロテアーゼ自身や他のタンパク質の活性が経時的に著しく低下するという問題が発生している。
そこで、プロテアーゼや他のタンパク質の加水分解を抑えるために、プロテアーゼ活性を阻害するプロテアーゼ活性阻害剤の研究が行われている。例えば、ボロニックアシッドがセリンプロテアーゼやズブチリシンの活性を阻害することが知られている（非特許文献１）。また、４−置換フェニルボロン酸がプロテアーゼの活性を阻害することが知られている（特許文献１）。
しかしながら、これらのプロテアーゼ活性阻害剤は、プロテアーゼ活性の阻害効果が低く、大量に添加してもプロテアーゼやタンパク質の加水分解を十分に抑えることができず、実用的でない。一方、プロテアーゼ活性の阻害効果が高いプロテアーゼ活性阻害剤を用いた場合、大量に希釈しなければプロテアーゼ活性を回復させることができない問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表平１１−５０７６８０号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５１，１９８３，ｐ５−ｐ３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、プロテアーゼ活性を阻害したタンパク質溶液のプロテアーゼ活性を、大量に希釈することなく、効率よく回復するプロテアーゼ活性回復方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法であって、吸光度を利用した活性測定法による（Ｘ）のプロテアーゼ活性Ｘｉが、下記タンパク質溶液（Ｓ）の活性を基準として２０％以下であり、（Ｘ）に、（Ｘ）の重量を基準として１００〜１００００００重量％の（Ｃ）をさらに添加するタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法である。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：基質（Ｄ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、ベンゾイルアルギニンニトロアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド又はサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤。
タンパク質溶液（Ｓ）：タンパク質溶液（Ｘ）において、（Ｂ）を（Ｂ）と同重量の（Ｃ）で置きかえたタンパク質溶液。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のプロテアーゼ活性回復方法は、大量に希釈することなく効率よくプロテアーゼ活性を回復することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】豚トリプシンに対する基質のミカエリス定数Ｋｍを求めるために作成したＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットであり、縦軸をそれぞれの基質濃度での酵素反応初速度の逆数（１／ｖ）、横軸を基質（Ｄ）の濃度［Ｓ］としてプロットしたグラフである。
【図２】豚トリプシンの活性の最適ｐＨを求めるために、縦軸をｐＨ４．５〜９．５における傾き係数ｋ、横軸をｐＨとしてプロットし、豚トリプシンの活性のｐＨ依存性を表したグラフである。
【図３】豚トリプシンの活性の最適温度を求めるために、縦軸を２０〜７０℃における傾き係数ｋ、横軸を温度としてプロットし、豚トリプシンの活性の温度依存性を表したグラフである。
【図４】大豆トリプシン阻害剤の豚トリプシンに対する阻害定数Ｋｉを求めるために作成したＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットであり、豚トリプシンの残存活性をαとしたときに、縦軸を｛［大豆トリプシン阻害剤のモル濃度］／（１−α）｝、横軸を１／αとしてプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明においてプロテアーゼ（Ａ）とは、ペプチド又はタンパク質を基質として加水分解を触媒する酵素である。（Ａ）としては、セリンプロテアーゼ（Ａ−１）、アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａ−２）、システインプロテアーゼ（Ａ−３）及び金属プロテアーゼ（Ａ−４）が含まれる。
【００１０】
セリンプロテアーゼ（Ａ−１）は、触媒残基としてセリン残基をもつプロテアーゼであり、キモトリプシン、トリプシン、トロンビン、プラスミン、エラスターゼ、スブチリシン及びケキシン等が含まれる。具体的には、ブタすい臓由来トリプシン、バシラス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のサブチリシン Ｎｏｖｏ、サブチリシン Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン ３０９、サブチリシン １４７及びサブチリシン １６８等が挙げられる。
市販のセリンプロテアーゼ（Ａ−１）としては、ノボザイムス社製のセリンプロテアーゼ（アルカラーゼ、サビナーゼ、カンナーゼ、エバラーゼ及びＰＴＮ等）及びジェネンコア社のセリンプロテアーゼ（ピュラフェクト及びピュラフェクト ＯＸＰ等）等が挙げられる。
【００１１】
アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａ−２）は、活性中心にアスパラギン酸の存在するプロテアーゼであり、ペプシン、カテプシンＤ、レニン及びキモシン等が含まれる。具体的には、ヒト胃由来のペプシン等が挙げられる。
【００１２】
システインプロテアーゼ（Ａ−３）は、チオール基が活性中心に存在するプロテアーゼであり、パパイン、ブロメライン、フィシン、アクチニジン、カテプシンＢ、カテプシンＨ、カテプシンＬ及びショウガプロテアーゼ等が含まれる。
【００１３】
金属プロテアーゼ（Ａ−４）は、活性中心に金属イオンを含むプロテアーゼであり、例えば、サーモライシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ及びコラゲナーゼ等が挙げられる。
【００１４】
上記プロテアーゼ（Ａ）のうち、基質であるタンパク質を効率よく低分子に分解するとの観点から、セリンプロテアーゼ（Ａ−１）が好ましく、さらに好ましくはスブチリシンである。
【００１５】
本発明においてプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）は、プロテアーゼ（Ａ）と可逆的に結合し、プロテアーゼ（Ａ）の活性を阻害するものである。さらに、基質（Ｄ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、ベンゾイルアルギニンニトロアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド又はサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤である。
【００１６】
基質（Ｄ）について、上記ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリドは、フェニルアラニンのアミノ基にオキシカルボキシベンジル基が結合し、カルボキシル基にニトロアニリンがペプチド結合したものであり、ＭＰ−バイオメディカル社（製品名：Ｎ−ｃｂｚ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）から入手可能である。
上記ベンゾイルアルギニンニトロアニリドは、アルギニンのアミノ基にカルボキシベンジル基が結合し、アルギニンのカルボキシル基にニトロアニリンがペプチド結合したものであり、和光純薬工業（株）（製品名：Ｎα−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩 ）から入手可能である。
上記フリルアクリロイルグリシルロイシンアミドは、グリシルロイシンアミドのアミノ基にフリルアクリル酸がペプチド結合したものであり、シグマ社（製品名：Ｎ‐（３‐［２‐Ｆｕｒｙｌ］ａｃｒｙｌｏｙｌ）‐Ｇｌｙ‐Ｌｅｕ ａｍｉｄｅ）から入手可能である。
上記サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドは、アラニルアラニルプロリルフェニルアラニンの末端アミノ基に無水コハク酸が結合し、末端カルボキシル基にニトロアニリンがペプチド結合したものであり、Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ社（製品名：Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ）から入手可能である。
【００１７】
上記基質（Ｄ）のうち、Ｋｉを求める際にどの基質を用いるかは、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）が活性を阻害するプロテアーゼ（Ａ）の分類により適宜選択される。上記アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａ−２）であればベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、システインプロテアーゼ（Ａ−３）であればベンゾイルアルギニンニトロアニリド、金属プロテアーゼ（Ａ−４）であればフリルアクリロイルグリシルロイシンアミド、セリンプロテアーゼ（Ａ−１）であればサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドを使用する。
上記にプロテアーゼ（Ａ）として例示されていないプロテアーゼについては、参考文献１（Ｒａｗｌｉｎｇｓ， Ｎ．Ｄ． ＆ Ｂａｒｒｅｔｔ， Ａ．Ｊ． （１９９３） Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２９０， ｐ２０５−２１８）に、（Ａ−１）〜（Ａ−４）のいずれに分類されるかが記載されている。
また、上記にも、参考文献１にも記載されていないプロテアーゼが、（Ａ−１）〜（Ａ−４）のいずれに分類されるかは、参考文献２（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ ＆ Ｂａｒｒｅｔｔ（１９９８）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に示される方法を用いることで分類できる。
【００１８】
本発明においてプロテアーゼ（Ａ）の活性の最適基質濃度は、プロテアーゼ（Ａ）に対する基質（Ｄ）のミカエリス定数Ｋｍの３分の１倍〜２倍である。ミカエリス定数Ｋｍは酵素反応初速度の基質濃度依存性を求めることによって求められる。具体的には、下記のミカエリス定数Ｋｍ測定法によって求めたものである。
＜ミカエリス定数Ｋｍ測定法＞
一定量の基質（Ｄ）、プロテアーゼ（Ａ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含む一定の温度及びｐＨに調製した酵素反応溶液（Ｉ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｉ）の温度は、２０〜７０℃の範囲内で、プロテアーゼ（Ａ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、酵素反応溶液（Ｉ）作成時から測定終了までの間、一定温度に保つことができればいい。
酵素反応溶液（Ｉ）のｐＨは、ｐＨ３〜１２の範囲内であればいい。後述する最適ｐＨがわかっている場合は、最適ｐＨであることが好ましい。
酵素反応溶液（Ｉ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファーなどのＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（Ｉ）中の（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（Ｉ）中のプロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、各プロテアーゼによって適宜選択されるが、後述する吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが直線となる濃度を選ぶ。
酵素反応溶液（Ｉ）中の基質（Ｄ）の濃度（モル濃度）は、経時的な吸光度変化を観測できる最小の基質濃度から最大の基質濃度の間で３点以上選べばよい。測定に使用する（Ａ）と類似のプロテアーゼのミカエリス定数Ｋｍが分かっている場合は、類似プロテアーゼのＫｍの１／５０倍〜１０倍の間で３点以上選べばよい。
酵素反応溶液（Ｉ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（Ｉ）を作成したときの温度と同温度である。測定時間は酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化するのが見られれば良い。基質（Ｄ）及びプロテアーゼ（Ａ）を混合した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）と生成物の測定波長におけるモル吸光定数εを用いて下記数式（１）から酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出する。
ｖ＝ΔＡλ／（ε×ｈ×３６００） （１）
さらに、基質（Ｄ）の濃度が異なる酵素反応溶液（Ｉ）を用いて、同様に測定し、酵素反応初速度ｖを算出する。
ミカエリス定数Ｋｍはミカエリスメンテン式から派生するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを用いて求める。Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットは、横軸（ｘ軸）にそれぞれの基質（Ｄ）の濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）にそれぞれの基質濃度での酵素反応初速度の逆数（１／ｖ）をプロットしたものであり、プロットの近似直線とｘ軸との交点が−Ｋｍである。
【００１９】
プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適ｐＨは、様々なｐＨで酵素反応溶液の吸光度を測定することによって決定できる。具体的には、下記の最適ｐＨ測定法によって求めたｐＨである。
＜最適ｐＨ測定法＞
一定量の基質（Ｄ）、プロテアーゼ（Ａ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含むｐＨを３〜１２の範囲で、ｐＨ１きざみ（３．５、４．５、５．５、６．５及び７．５等）に調製した酵素反応溶液（ＩＩ）を作成する。
酵素反応溶液（ＩＩ）の温度は、２０〜７０℃の範囲内で、プロテアーゼ（Ａ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、酵素反応溶液（ＩＩ）作成時から測定終了までの間、一定温度に保つことができればいい。
酵素反応溶液（ＩＩ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（ＩＩ）中の（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（ＩＩ）中の基質（Ｄ）の濃度（モル濃度）は、上記プロテアーゼ（Ａ）の基質（Ｄ）に対するミカエリス定数Ｋｍの４〜６倍である。
酵素反応溶液（ＩＩ）中のプロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、各プロテアーゼによって適宜選択され、後述する吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが直線となる濃度を選ぶ。
酵素反応溶液（ＩＩ）において、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（ＩＩ）を作成したときの温度と同温度である。測定時間ｈは酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で、０．１以上変化すれば良い。基質（Ｄ）及びプロテアーゼ（Ａ）を混合した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλh（３点以上）とし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き（係数ｋ）を求める。さらに、それぞれのｐＨ（３〜１２）の酵素反応溶液（ＩＩ）を用いて測定した係数ｋを用いて、縦軸を係数ｋ、横軸をｐＨとしてプロットし、係数ｋが極大値となるｐＨが最適ｐＨである。
ｐＨを調整する際に、バッファーの種類を変更する場合は、バッファーによってプロテアーゼ活性が異なるため、適宜これを補正する必要がある。補正する方法としては、バッファーの種類を変える境目のｐＨにおいて、両方のバッファーで活性を測定しておき、片方のバッファーで測定した値を基準として活性を補正する方法が挙げられる。
【００２０】
プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度は、様々な温度で酵素反応溶液の吸光度を測定することによって求められる。具体的には、下記の最適温度測定法によって求めた温度である。
＜最適温度測定法＞
一定量の基質（Ｄ）、プロテアーゼ（Ａ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含む最適ｐＨに調整した酵素反応溶液（ＩＩＩ）を作成する。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）の温度は、２０〜７０℃の範囲で、温度が異なるもの（各温度の間隔がおよそ１０℃くらい）を数種類作成する。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（ＩＩＩ）中の（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）中の基質（Ｄ）の濃度（モル濃度）は、後述するプロテアーゼ（Ａ）の基質（Ｄ）に対するミカエリス定数Ｋｍの４〜６倍である。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）中のプロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、各プロテアーゼによって適宜選択され、後述する吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが直線となる濃度を選ぶ。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（ＩＩＩ）を作成したときの温度と同温度である。測定時間ｈは酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で、０．１以上変化すれば良い。基質（Ｄ）及びプロテアーゼ（Ａ）を混合した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλh（３点以上）とし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｋ）を求める。２０〜７０℃の各温度で作成した酵素反応溶液（ＩＩＩ）において測定した係数ｋを用いて、縦軸を係数ｋ、横軸を温度としてプロットする。係数ｋが極大値となる温度がプロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度である。
【００２１】
阻害定数Ｋｉは、上記の測定法により求めたプロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下、下記測定方法によって求められる。
＜阻害定数Ｋｉの測定方法＞
最適温度、最適ｐＨに調製した、一定量のプロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含むプロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ）を作成する。また、（Ｂ）の濃度が異なる（ｉ）を数種類作成する。作成した（ｉ）は、数十分〜数時間静置する。静置後のそれぞれの（ｉ）に、基質（Ｄ）を添加して酵素反応溶液（ＩＶ）を作成する。
（ｉ）及び（ＩＶ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファーなどのＧｏｏｄバッファーが好ましい。（ｉ）及び（ＩＶ）中の（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭであり、最適ｐＨに調整できればいい。
（ｉ）中のプロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、前述のＫｍを求めた際の（Ａ）の濃度付近であり、且つ、後に（ｉ）に添加する基質（Ｄ）溶液のモル濃度の１０００００分の1倍〜１０００分の１倍の濃度である。（ＩＶ）中の（Ａ）のモル濃度は、（ＩＶ）中の基質（Ｄ）のモル濃度の１０００００分の1倍〜１０００分の１倍の濃度である。
（ｉ）及び（ＩＶ）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の濃度（モル濃度）は、プロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）の１０分の１倍〜１０００倍で、（Ｂ）の濃度が異なる溶液（ｉ）を４種類以上作成する。
酵素反応溶液（ＩＶ）中の基質（Ｄ）のモル濃度は、最適基質濃度（上記ミカエリス定数Ｋｍの３分の１倍〜２倍）であり、且つ、プロテアーゼ（Ａ）のモル濃度の５〜１０００００倍の濃度で作成する。
（ｉ）の静置時間は、（Ａ）と（Ｂ）が十分に結合し、プロテアーゼ（Ａ）の活性が一定になるまでの時間であり、あらかじめ実験して求めておく。
プロテアーゼ（Ａ）の活性が一定になるまでの時間は、後述する吸光度を利用した活性測定法により求めることができる。具体的には、プロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ）を作成してから、一定時間おきに、後述する吸光度を利用した活性測定法により、直線の傾き（係数ｋ）を求める。係数ｋが一定になるまでの時間が（Ａ）の活性が一定になるまでの時間である。
プロテアーゼ活性の最適温度及び最適ｐＨの条件下、酵素反応溶液（ＩＶ）を作成後、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時間ｈは酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化すれば良い。（ＩＶ）を作成した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、吸光度変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）と生成物の測定波長におけるモル吸光定数εから上記数式（１）を用いて酵素反応初速度ｖを算出する。また、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の濃度が異なる（ｉ）を用いて作成した酵素反応溶液（ＩＶ）についても同様に測定し、酵素反応初速度ｖを算出する。
酵素反応溶液（ＩＶ）において、（Ｂ）に変えて溶剤（Ｃ）（（Ｂ）の重量分の（Ｃ）を加えた）以外は同様にして作成した酵素反応溶液（ＩＶ’）を用いて測定した酵素反応初速度をｖｏとし、各（Ｂ）濃度での残存活性α（α＝ｖｉ／ｖｏ）を算出する。
横軸に１／αを、縦軸に［（Ｂ）のモル濃度］／（１−α）をプロットし、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎプロットを作成する。このプロットに近似直線を描いたときの傾きＫｉ（ａｐｐ）、測定時の基質濃度［Ｓ］、ミカエリス定数Ｋｍを、下記数式（２）に当てはめることによりＫｉを算出する。
Ｋｉ＝Ｋｉ（ａｐｐ）／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）（２）
上記Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎプロットは、具体的には、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１２７，１９７２，ｐ２１−３３３に記載されている方法を用いる。
【００２２】
本発明において、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の阻害定数Ｋｉは、１ｐＭ〜１０μＭであり、適度なプロテアーゼ濃度範囲でプロテアーゼ活性を抑制し、回復できるとの観点及びプロテアーゼ活性の持続性の観点から、１ｎＭ〜１μＭが好ましい。
【００２３】
上記阻害定数Ｋｉが１ｐＭ未満では、プロテアーゼとプロテアーゼ活性阻害剤の結合が強いため、プロテアーゼの活性を回復させるには大量に希釈しなければならない。例えば、Ｋｉが０．１ｐＭのプロテアーゼ活性阻害剤を、プロテアーゼと等モル量用いてプロテアーゼの活性を２０％以下にした場合、希釈後の（Ａ）の濃度が約１．０×１０-10重量％になるように大希釈しなければプロテアーゼの活性を５０％以上に回復することができない。しかしながら、（Ａ）の濃度が１．０×１０-10重量％以下では、プロテアーゼを衣料用洗浄剤等として使用する場合、添加することによる有用な効果が得られない。
一方、阻害定数Ｋｉが１０μＭより大きくなると、（Ａ）の活性を２０％以下にするのが困難である。また、タンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性の持続性が低い。
本発明において、プロテアーゼ活性の持続性とは、タンパク質溶液（Ｘ）を一定期間保存した後に回復させたプロテアーゼ活性と、保存する前に回復させたプロテアーゼ活性との差が小さく、プロテアーゼ活性の比（％）｛（一定期間保存した後に回復させたプロテアーゼ活性）／（保存する直前に回復させたプロテアーゼ活性）×１００｝が１００％に近くなり、一定のプロテアーゼ活性の回復性があることを意味する。
【００２４】
本発明において、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであることにより、少量の添加で適度にプロテアーゼ活性を阻害することができ、プロテアーゼや他のタンパク質の加水分解を抑えることができる。そのため、タンパク質溶液（Ｘ）において、（Ｂ）により阻害され、低下したプロテアーゼ（Ａ）の活性を、大量に希釈することなく、効率よく回復させることができる。また、タンパク質溶液（Ｘ）を長期間保存した後も、プロテアーゼ活性を効率よく回復することができ、プロテアーゼ活性の持続性が高い。
【００２５】
上記阻害定数Ｋｉを満たすプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）としては、タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−１）、ペプチド型プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−２）及び低分子プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−３）が挙げられる。
【００２６】
タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−１）は、天然物から抽出された又は宿主細胞に遺伝子を組み込むことで発現されたタンパク質であって、アミノ酸の数が５０を超えるタンパク質で下記（Ｂ−２）以外のタンパク質であり、プロテアーゼの活性を阻害するタンパク質である。上記阻害定数Ｋｉを満たす（Ｂ−１）として、具体的には、配列番号１のコムギ由来のタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（アルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ、サビナーゼに対する阻害定数Ｋｉが７５ｐＭ、カンナーゼに対する阻害定数が１２３ｐＭ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｏｕｓ由来Ｓｔｒｅｐｔｏ ｍｙｃｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＳＩ）に代表されるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属由来のスブチリシン阻害剤（スブチリシンＢＰＮに対する阻害定数Ｋｉが７１ｐｐｍ）、大豆由来トリプシン阻害剤（キモトリプシンに対する阻害定数Ｋｉが０．６７μＭ、豚トリプシンに対する阻害定数Ｋｉが１．４ｎＭ）、ヒト由来シスタチンＢ（パパインに対する阻害定数Ｋｉが０．１２ｎＭ）、回虫由来ペプシン阻害剤及びジャガイモ由来カテプシンＤ阻害剤（カテプシンＤに対する阻害定数Ｋｉが２６０ｎＭ）等が挙げられる。
【００２７】
ペプチド型プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−２）には、２〜５０個のアミノ酸からなるペプチド並びにその末端及び／又はアミノ酸側鎖が修飾されたもの等が含まれる。
２〜５０個のアミノ酸からなるペプチドとしては、天然物から抽出された又は宿主細胞に遺伝子を組み込むことで発現されたペプチドであり、プロテアーゼの活性を阻害するペプチドである。
ペプチドの末端の修飾としては、上記ペプチドのＮ及び／又はＣ末端の化学修飾が挙げられ、具体的にはＮ末端にサクシニルクロリドを反応させてサクシニル基を導入したもの、Ｃ末端にカルボジイミド塩酸塩を反応させてＢｏｃ基を導入したもの等が挙げられる。
アミノ酸側鎖の修飾としては、上記ペプチドのアミノ酸側鎖の化学修飾が挙げられる。具体的には、上記ペプチド中のアミノ酸残基（セリン、トレオニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、リシン及びチロシン等）の側鎖（カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基及びチオール基等）に、官能基（カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、スルホ基）を有する化合物が反応したもの等が挙げられる。また、宿主細胞を用いたペプチド発現の過程で翻訳後、化学修飾を受けたもの等も挙げられる。
（Ｂ−２）として、具体的には、ロイペプチン（トリプシンに対する阻害定数３１ｎＭ）及びエグリンＣ（ケキシンに対する阻害定数Ｋｉが３８ｐＭ）等が挙げられる。また、（Ｂ−１）の一部を加水分解したものも含まれる。
【００２８】
低分子プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−３）には、上記（Ｂ−２）以外の分子量５０〜１０００の化合物であり、プロテアーゼ（Ａ）と可逆的な結合を形成し、プロテアーゼの活性を阻害するものが含まれる。例えば、カルボキシル基やアミノ基等を有し、プロテアーゼと水素結合する化合物等が挙げられる。
（Ｂ−３）として、具体的には、カルボキシフェニルボロン酸（アルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉが１０μＭ）、ジクロロフェニルボランジオール（スブチリシンに対する阻害定数Ｋｉが８μＭ）及び３−ニトロフェニルホウ酸（スブチリシンに対する阻害定数Ｋｉが８μＭ）等が挙げられる。
【００２９】
上記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）のうち、低添加量で（Ａ）の活性を阻害し、大量に希釈せずに活性を回復できるとの観点及びプロテアーゼ活性の持続性の観点から、タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−１）が好ましい。
【００３０】
本発明において、溶剤（Ｃ）としては、水、有機溶剤及びこれらの混合物が挙げられる。
【００３１】
水としては、特に限定されるものではなく、例えば、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。また、水中に、後述するｐＨ調整剤（Ｍ）を含むバッファー水溶液等が挙げられる。
【００３２】
有機溶剤としては、アルコール（炭素数１〜１８のアルコールが挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリン等）、ケトン（アセトン、メチルエチルケトン等）、エーテル（テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、エチレングリコールモノアルキルエーテル、プロピレングリコールモノアルキルエーテル、環状エーテル等）、スルホキシド（ジメチルスルホキシド等）、脂肪族または脂環式炭化水素（ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ミネラルスピリット、シクロヘキサン等）及びふっ素含有化合物（テトラフルオロエチレン等）等が挙げられる。これらの有機溶剤のうち、タンパク質の安定性の観点からスルホキシドが好ましい。
【００３３】
溶剤（Ｃ）としては、タンパク質の安定性の観点からスルホキシド及び水が好ましく、さらに好ましくは水であり、特に好ましくはｐＨ調整剤（Ｍ）を含むバッファー水溶液である。
【００３４】
本発明におけるタンパク質溶液（Ｘ）は、上記プロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するものである。
タンパク質溶液（Ｘ）中の（Ａ）の含有量（重量％）は、（Ａ）の凝集を防止する観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、０．０００００００００１〜５重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００００００００１〜２重量％であり、特に好ましくは０．０００００００１〜０．１重量％である。
タンパク質溶液（Ｘ）中の（Ｂ）の含有量（重量％）は、凝集を防止し、（Ａ）の活性を阻害し、大量に希釈せずに活性を回復させる観点及びプロテアーゼ活性の持続性の観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、０．００００００００１〜２０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０００００００１〜５重量％であり、特に好ましくは０．００００００１〜０．１重量％である。
タンパク質溶液（Ｘ）中の（Ｃ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、７５〜９９．９９９９９９９９８９重量％が好ましく、さらに好ましくは９３〜９９．９９９９９９９８９重量％であり、特に好ましくは９９．８〜９９．９９９９９９８９である。
【００３５】
タンパク質溶液（Ｘ）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）とプロテアーゼ（Ａ）とのモル比（（Ｂ）のモル数／（Ａ）のモル数）は、（Ｘ）中で（Ａ）の活性を十分に阻害し、大量に希釈せずに活性を回復させる観点及びプロテアーゼ活性の持続性の観点から０．８〜１０が好ましく、さらに好ましくは１〜８であり、特に好ましくは１．５〜５である。
【００３６】
本発明におけるタンパク質溶液（Ｘ）には、上記のプロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）以外に、界面活性剤（Ｅ）、無機塩（Ｆ）、糖（Ｇ）、アミノ酸（Ｈ）、低分子有機化合物（Ｉ）、脂肪酸（Ｊ）、油脂（Ｋ）、（Ａ）及び（Ｂ）以外のタンパク質（Ｌ）及びｐＨ調整剤（Ｍ）を含有することができる。
【００３７】
界面活性剤（Ｅ）としては、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレン共重合物、ソルビタンアルキルエステルエチレンオキシド付加物、脂肪族アルコールエチレンオキシド付加物、脂肪酸エチレンオキシド付加物及びアルキルアミンエチレンオキシド付加物等が挙げられる。
【００３８】
無機塩（Ｆ）として、塩化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ギ酸ナトリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸アンモニウム等が挙げられる。
【００３９】
糖（Ｇ）として、トレハロース、スクロース、デキストリン、シクロデキストリン、マルトース、フルクトース、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等が挙げられる。
【００４０】
アミノ酸（Ｈ）として、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、リシン、ヒスチジン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、バリン及びそれらの塩等が挙げられる。
【００４１】
低分子有機化合物（Ｉ）としては、酢酸ベンジル、メチルサリチル酸、ベンジルサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、けい皮酸、カフェ酸、カテキン類、アスコルビン酸及びカロテノイド等が挙げられる。
【００４２】
脂肪酸（Ｊ）として、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸等が挙げられる。
【００４３】
油脂（Ｋ）としては、上記脂肪酸（Ｊ）のモノ、ジ又はトリグリセリドが挙げられる。
【００４４】
（Ａ）及び（Ｂ）以外のタンパク質（Ｌ）としては、特に限定するものではないが、プロテアーゼ以外の酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチド等が挙げられ、具体的には、血清アルブミン、コラーゲン、カゼイン、ゼラチン及びシルクペプチド等が挙げられる。
【００４５】
ｐＨ調整剤（Ｍ）としては、従来のｐＨ調整剤が使用でき、例えば、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー及びクエン酸等が挙げられる。
【００４６】
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる界面活性剤（Ｅ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜２５、特に好ましくは０〜１０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる無機塩（Ｆ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜１０が好ましく、さらに好ましくは０〜５、特に好ましくは０〜３である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる糖（Ｇ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれるアミノ酸（Ｈ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる低分子有機化合物（Ｉ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる脂肪酸（Ｊ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる油脂（Ｋ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれるプロテアーゼ以外のタンパク質（Ｌ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれるｐＨ調整剤（Ｍ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０．０１〜２５が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１５、特に好ましくは０．０１〜１０である。
【００４７】
本発明におけるタンパク質溶液（Ｘ）は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）溶剤（Ｃ）にｐＨ調整剤（Ｍ）及びプロテアーゼ（Ａ）を添加し、２５℃で均一になるまで撹拌する。
（２）プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を添加し、２５℃で均一になるまで撹拌する。
（３）最後に（Ｅ）〜（Ｌ）を添加し、２５℃で均一になるまで撹拌し、タンパク質溶液（Ｘ）を製造する。
【００４８】
本発明におけるタンパク質溶液（Ｘ）のｐＨは、タンパク質の安定性への影響の観点から、ｐＨ５〜１０が好ましく、さらに好ましくはｐＨ７〜９である。
（Ｘ）のｐＨは、ｐＨ調整剤（Ｍ）によって適宜調整できる。
【００４９】
本発明におけるタンパク質溶液（Ｘ）は、吸光度を利用した活性測定法によるプロテアーゼ活性Ｘｉが、タンパク質溶液（Ｓ）の活性を基準として２０％以下であるタンパク質溶液である。
【００５０】
タンパク質溶液（Ｓ）は、タンパク質溶液（Ｘ）において、（Ｂ）を（Ｂ）と同重量の（Ｃ）で置きかえたタンパク質溶液である。例えば、（Ｘ）中の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の含有量（重量％）が（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、（Ａ）が２重量％、（Ｂ）が１８重量％、（Ｃ）が８０重量％である場合、（Ｓ）中の（Ａ）は２重量％、（Ｃ）は９８重量％である。
【００５１】
本発明において、吸光度を利用した活性測定法とは、基質（Ｄ）を用いて、一定温度、一定ｐＨ、上述のプロテアーゼ（Ａ）の活性の最適基質濃度の条件下で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する方法である。
基質（Ｄ）として、どの基質を用いるかは、上記Ｋｉを求める際に使用する基質と同様、タンパク質溶液（Ｘ）中のプロテアーゼ（Ａ）の分類により適宜選択される。
吸光度を利用した活性測定法として、具体的には、下記の測定によって求められる。
【００５２】
＜吸光度を利用した活性測定法＞
○プロテアーゼ活性Ｘｉ
一定量のタンパク質溶液（Ｘ）及び一定量の基質（Ｄ）を添加して酵素反応溶液（Ｖ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｖ）の温度は、２０〜７０℃の範囲内で、プロテアーゼ（Ａ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、測定の間一定に保つことができればいい。
酵素反応溶液（Ｖ）中の基質（Ｄ）のモル濃度は、最適基質濃度で上記ミカエリス定数Ｋｍの３分の１倍〜２倍であり、且つ、（Ｖ）中のプロテアーゼ（Ａ）のモル濃度の５〜１０００００倍の濃度であればいい。
酵素反応溶液（Ｖ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（Ｖ）を作成したときの温度と同温度である。酵素反応溶液（Ｖ）を作成直後の吸光度Ａλ0及び酵素反応溶液（Ｖ）を作成からｈ時間後の吸光度Ａλh（３点以上）を測定し、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を求める。測定時間は酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化するのが見られれば良い。吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｋX）を求める。
【００５３】
タンパク質溶液（Ｘ）に変えてタンパク質溶液（Ｓ）を使用する以外は同様にして吸光度を測定し、直線の傾き（係数ｋS）を求める。
【００５４】
上記タンパク質溶液（Ｘ）及び（Ｓ）は、作成してから３０分以上６時間以内のものを使用する。
【００５５】
（Ｘ）のプロテアーゼ活性Ｘｉは、タンパク質溶液（Ｘ）及びタンパク質溶液（Ｓ）を用いた上記の直線の傾き係数ｋX及びｋSから、下記数式（３）によって求められる。
プロテアーゼ活性Ｘｉ（％）＝｛ｋX／ｋS｝×１００ （３）
【００５６】
本発明において（Ｘ）の吸光度を利用した活性測定法によるプロテアーゼ活性Ｘｉは２０％以下であり、プロテアーゼ活性の残存によるプロテアーゼ自身及び／又は他のタンパク質の分解を防止するとの観点から、０〜１０％が好ましく、さらに好ましくは０．００００１〜５％であり、次にさらに好ましくは０．００１〜３％であり、特に好ましくは０．０１〜３％である。
【００５７】
本発明のプロテアーゼ活性回復方法は、（Ｘ）の重量を基準として（Ｃ）を１００〜１００００００重量％添加する方法である。（Ｃ）の添加量は、プロテアーゼ活性を十分に回復させるとの観点から、５００〜１００００００重量％が好ましく、さらに好ましくは１０００〜１００００００重量％であり、次にさらに好ましくは９９００〜１００００００重量％である。
【００５８】
本発明のプロテアーゼ活性回復方法において、回復とは、（Ｘ）の重量を基準として（Ｃ）を１００〜１００００００重量％添加して希釈した後のタンパク質溶液（Ｙ）のプロテアーゼ活性Ｙｉが、タンパク質溶液（Ｔ）の活性を基準として２０％よりも大きくなることを意味する。プロテアーゼ活性Ｙｉは、産業上で有効なプロテアーゼ活性を得る観点から、２５〜１００％が好ましく、さらに好ましくは４０〜１００％であり、次にさらに好ましくは６０〜１００％であり、特に好ましくは８０〜１００％である。
【００５９】
タンパク質溶液（Ｔ）は、タンパク質溶液（Ｙ）において添加された（Ｃ）と同重量の（Ｃ）をタンパク質溶液（Ｓ）に添加したタンパク質溶液である。
【００６０】
○プロテアーゼ活性Ｙｉ
タンパク質溶液（Ｙ）のプロテアーゼ活性Ｙｉは、上記吸光度を利用した活性測定法において、タンパク質溶液（Ｘ）に変えて（Ｙ）を用いて直線の傾き（係数ｋY）を求め、タンパク質溶液（Ｓ）に変えて（Ｔ）を用いて直線の傾き（係数ｋT）を求め、下記数式（４）に当てはめることによって求められる。
プロテアーゼ活性Ｙｉ（％）＝｛ｋY／ｋT｝×１００ （４）
活性測定法で使用するタンパク質溶液（Ｙ）及び（Ｔ）は、作成してから３０分以上６時間以内のものを使用する。
【００６１】
本発明のプロテアーゼ活性回復方法は、（Ｘ）に（Ｘ）の重量を基準として（Ｃ）を１００〜１００００００重量％添加するものであれば特に限定されないが、（Ｘ）と（Ｃ）を均一に混合することが重要であり、（Ｃ）添加後の粘度及び温度等が均一な溶液になるまで攪拌することが好ましい。また、（Ｘ）中のタンパク質の変性に問題がなければ、なるべく高い温度（２０〜３０℃）の（Ｃ）を一度に添加したほうが速やかに活性を回復できるので好ましい。
１例を下記に示す。
（１）一定量の（Ｘ）に一定量の溶剤（Ｃ）を添加し、２５℃で１２０分攪拌する。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６３】
＜製造例１＞
配列番号１〜３のアミノ酸配列をコードする遺伝子（遺伝子北海道システム・サイエンス社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理後、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合した。そのＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株にこのプラスミドを形質転換してプロテアーゼ活性阻害剤遺伝子発現株（ｒ１）〜（ｒ３）を作成した。
【００６４】
プロテアーゼ活性阻害剤遺伝子発現株（ｒ１）〜（ｒ３）をそれぞれＬＢ培養液（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ含有）１ｍＬに植菌して３０℃で１２時間培養を行い、終夜培養液を作成し、さらにこの終夜培養液０．５ｍｌをＬＢ培養液（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ含有）５ｍｌに植菌して３０℃３時間振とう培養を行い前培養液を作成した。前培養液を５０ｍＬの培養液（水５０ｍＬ中のそれぞれの成分の含有量は、酵母エキス（日本製薬社製）１．２ｇ、ポリペプトン（日本製薬社製）０．６ｇ、リン酸２カリウム０．４７ｇ、リン酸１カリウム０．１１ｇ、硫酸アンモニウム０．３５ｇ、リン酸２ナトリウム１２水和物０．６６ｇ、クエン酸ナトリウム２水和物０．０２ｇ、グリセロール０．２ｇ、ラクトアルブミン水解物１．５ｇ、消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）０．３ｇ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、微量金属溶液（塩化カルシウム１８．９μｇ、塩化鉄（ＩＩＩ）５００μｇ、硫酸亜鉛７水和物９．０μｇ、硫酸銅５．１μｇ、塩化マンガン４水和物６．７μｇ、塩化コバルト４．９μｇ、エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム２００μｇ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）に植菌し微生物培養装置（エイブル社製、製品名「ＢｉｏＪｒ．８」）を用いてｐＨ６．８、３０℃を維持したまま培養を行った。培養開始後１Ｍ ＩＰＴＧ溶液を０．１５ｍＬを加えた。培養開始１４時間後から、グリセリン／タンパク質溶液（５０％ グリセリン、５０ｇ／Ｌ ラクトアルブミン水解物、３３ｇ／Ｌ 消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン）の滴下を開始した。培養開始後、４８時間目に培養液（Ｒ１）〜（Ｒ３）を回収した。
【００６５】
得られた培養液（Ｒ１）〜（Ｒ３）から遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ社製「５９２２」、４℃、６０００×ｇ、１０分）を用いて菌体を分離し上清のみを回収した。その後、上清２５ｍｌに１Ｍ ＣａＣｌ2水溶液を２５μｌとイソプロパノール６．２５ｍｌ加えて、遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ社製「５９２２」、４℃、６０００×ｇ、１０分）を用いて沈殿除去を行った後、限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製「アミコンウルトラ−１５」分画分子量１００００）を用いて、１ｍｌ程度になるまで上清の濃縮を行い、配列番号１〜３のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）〜（Ｂ３）の溶液（Ｌ１）〜（Ｌ３）を得た。
【００６６】
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）〜（Ｂ３）の溶液（Ｌ１）〜（Ｌ３）をそれぞれ１μＬと、クマシーブリリアントブルーとＳＤＳを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル処理液１μＬ（アトー社製「イージーステイン・アクア」をそれぞれ混合し、ポリアクリルアミドゲル（アトー社製、ｅ・パジェル ５〜２０％）を用いて２０ｍＡで６０分間電気泳動した。同様に処理した１μｇ、３μｇおよび５μＬのウシ血清アルブミン（和光純薬工業社製）とのバンドの濃さの比較から、（Ｌ１）〜（Ｌ３）中のプロテアーゼ活性阻害剤の濃度を決定しところ、すべて約１μｇ／μＬであった。
【００６７】
＜豚トリプシンの活性の最適ｐＨの測定＞
豚トリプシン（和光純薬工業株式会社）１００ｍｇを３９０ｍＬのバッファー１［５０ｍＭ 酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ４．５、２５℃）水溶液］に溶解させ、豚トリプシン溶液（Ａ１）（１１．１μＭ）とした。
（Ａ１）を１５７０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れた。分光光度計の試料室を２５℃に保ち、セルを試料室内で５分静置し、温調した。ここに、２５℃に温調した基質溶液（１）｛基質（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド、Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ社製、製品名：Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ）をバッファー１に溶解して５ｍｇ／ｍＬ（０．１１９ｍＭ）の濃度にしたもの｝を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＩ−１）とした。（ＩＩ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
同様に、バッファー１に変えてバッファー２［５０ｍＭ 酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ５．５、２５℃）水溶液］、バッファー３［５０ｍＭ 酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ６．５、２５℃）水溶液］、バッファー４［５０ｍＭ リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ６．５、２５℃）水溶液］、バッファー５［５０ｍＭ リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液］、バッファー６［５０ｍＭ リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ８．５、２５℃）水溶液］、バッファー７［５０ｍＭ ＴＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ８．５、２５℃）水溶液］及びバッファー８［５０ｍＭ ＴＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ９．５、２５℃）水溶液］を用いて豚トリプシン溶液（Ａ２）〜（Ａ８）及び基質溶液（２）〜（８）を作成した。
（Ａ１）に変えて（Ａ２）〜（Ａ８）を、基質溶液（１）に変えて基質溶液（２）〜（８）用いる以外は同様にして、酵素反応溶液（ＩＩ−２）〜（ＩＩ−８）を作成し、（ＩＩ−２）〜（ＩＩ−８）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
酵素反応溶液（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−８）について、それぞれ（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−８）を作成した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋを求た。縦軸を係数ｋ、横軸をｐＨとしてプロットし（図２）、係数ｋが極大値となるｐＨを求めたところ、最適ｐＨはｐＨ７．５であった。
なお、バッファーの種類を変える境目のｐＨ（ｐＨ６.５及び８.５）において、両方のバッファーで活性を測定しておき、片方のバッファーで測定した値を基準として活性を補正した。ｐＨ６.５（バッファー３及び４）では、バッファー４を使用して求めた値をｐＨ６.５での結果とし、バッファー１及び２を用いて求めた係数ｋにはバッファー３と４の比（バッファー４での係数ｋ／バッファー３での係数ｋ）をかけて補正した。同様に、ｐＨ８.５（バッファー６及び７）ではバッファー６での値をｐＨ８.５の結果とし、バッファー８を用いて求めた係数ｋにはバッファー６と７の比（バッファー６での係数ｋ／バッファー７での係数ｋ）をかけて補正した。
【００６８】
＜豚トリプシンの活性の最適温度の測定＞
豚トリプシン（和光純薬工業株式会社）１００ｍｇを３９０ｍＬのバッファー５（ｐＨ７.５）に溶解させた豚トリプシン溶液（Ａ５）（１１．１μＭ）を１５７０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れた。分光光度計の試料室を２０℃に保ち、セルを試料室内で５分静置した。
次に、セルに、２０℃に温調した基質溶液（５）（０．１１９ｍＭ、ｐＨ７.５）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＩＩ−１）とした。（ＩＩＩ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
分光光度計の試料室をそれぞれ３０℃、４０℃、５０℃、６０℃又は７０℃に設定して温調し、基質溶液（５）も試料室と同じ温度で温調してからセルに添加する以外は同様にして、酵素反応溶液（ＩＩＩ−２）〜（ＩＩＩ−６）を作成した。（ＩＩＩ−２）〜（ＩＩＩ−６）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
酵素反応溶液（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−６）について、それぞれ（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−６）を作成した直後の吸光度をＡλ0、２分後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋを求た。縦軸を係数ｋ、横軸を温度としてプロットし（図３）、係数ｋが極大値となる温度を求めたところ、最適温度は４０℃であった。
【００６９】
＜豚トリプシンに対する基質のミカエリス定数Ｋｍの測定＞
豚トリプシン溶液（Ａ５）を１５７０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れた。分光光度計の試料室を２５℃に保ち、セルを試料室内で３０分静置した。ここに、２５℃に温調した基質溶液（５）（基質濃度：５ｍｇ／ｍＬ（０．１１９ｍＭ）、ｐＨ７.５）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｉ−１）とした。（Ｉ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
基質溶液（５）において、基質（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）のバッファー５中のモル濃度を０．０２４ｍＭ（基質溶液（９）、１ｍｇ／ｍＬ）、０．２３７ｍＭ（基質溶液（１０）、１０ｍｇ／ｍＬ）、０．４７４ｍＭ（基質溶液（１１）、２０ｍｇ／ｍＬ）及び１．１９ｍｍＭ（基質溶液（１２）、５０ｍｇ／ｍＬ）とした溶液を作成した。基質溶液（５）に変えて基質溶液（９）〜（１２）を用いる以外は同様にして酵素反応溶液（Ｉ−２）〜（Ｉ−５）を作成した。（Ｉ−２）〜（Ｉ−５）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
（Ｉ−１）〜（Ｉ−５）を作成直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、それぞれ吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）と４０５ｎｍにおけるモル吸光定数εを用いて下記数式（１）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＡλ／（ε×ｈ×３６００）（１）
算出した酵素反応初速度ｖを用いて、横軸（ｘ軸）にそれぞれの基質濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）にそれぞれの基質濃度での酵素反応初速度の逆数１／ｖをプロットし、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを作成した（図１）。プロットの近似直線とｘ軸との交点（−Ｋｍ）から、ミカエリス定数Ｋｍは０．００４ｍＭであった。
【００７０】
＜大豆トリプシン阻害剤の豚トリプシンに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
大豆トリプシン阻害剤（和光純薬工業株式会社）２５ｍｇを５０ｍＬのバッファー５（ｐＨ７．５）に溶解させ、大豆トリプシン阻害剤溶液（ｂ１）（２０μＭ）とした。（ｂ１）をバッファー５で１／１０、１／４、１／２および３／４倍のモル濃度に希釈したものを（ｂ２）〜（ｂ５）とした。
バッファー５を１５３０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れ、豚トリプシン溶液（Ａ５）を４０μＬ及び（ｂ１）を４０μＬ添加し、プロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ−１）を作成した。
分光光度計の試料室を４０℃に保ち、セルを試料室内で３０分静置した。ここに、４０℃に温調した基質溶液（１３）｛基質（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）をバッファー５に溶解して０．１６ｍｇ／ｍＬ（０．００４ｍＭ）の濃度にしたもの｝を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＶ−１）を作成した。（ＩＶ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録した。
（ｂ１）に変えて（ｂ２）〜（ｂ５）及びバッファー５を用いる以外は同様にして、プロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ−２）〜（ｉ−６）を作成し、基質溶液（１３）を用いて酵素反応溶液（ＩＶ−２）〜（ＩＶ−６）を作成し、同様に吸光度を記録した。
（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−６）を作成直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、それぞれ吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）と４０５ｎｍにおけるモル吸光定数εを用いて下記数式（１）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＡλ／（ε×ｈ×３６００）（１）
（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−５）の酵素反応初速度ｖｉ、（ＩＶ−６）の酵素反応初速度をｖｏとし、大豆トリプシン阻害剤の各濃度での残存活性α（ｘ＝ｖｉ／ｖｏ）を算出した。
横軸に１／αを、縦軸に［大豆トリプシン阻害剤の各モル濃度］／（１−α）をプロットし、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎプロットを作成した（図４）。このプロットに近似直線を描いたときの傾きＫｉ（ａｐｐ）、測定時の基質濃度［Ｓ］、豚トリプシンに対する基質のミカエリス定数Ｋｍを、下記数式（２）に当てはめることによりＫｉを算出した。Ｋｉは１．４ｎＭであった。
Ｋｉ＝Ｋｉ（ａｐｐ）／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ） （２）
【００７１】
＜アルカラーゼの活性の最適ｐＨの測定＞
アルカラーゼ（ノボザイムス社製）１０μＬをそれぞれバッファー１〜８（１０ｍＬ）に希釈し、アルカラーゼ溶液（Ａ９）〜（Ａ１６）（０．０４μＭ）とした。また、基質（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）をそれぞれバッファー１〜８に希釈（１１８ｍｇ／ｍＬ（２．８ｍＭ））して、基質溶液（１４）〜（２１）を作成した。
上記［豚トリプシンの活性の最適ｐＨの測定］において、（Ａ１）〜（Ａ８）に変えて（Ａ９）〜（Ａ１６）を用いて、基質溶液（１）〜（８）に変えて（１４）〜（２１）を用いる以外は同様にして測定したところ、アルカラーゼの活性の最適ｐＨは８．５であった。
【００７２】
＜アルカラーゼの活性の最適温度の測定＞
アルカラーゼ（ノボザイムス社製）１０μＬを１０ｍＬのバッファー６（ｐＨ８.５）に溶解させた（Ａ１４）（０．０４μＭ）を使用した。
上記［豚トリプシンの活性の最適温度の測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ１４）を用いて、基質溶液（５）に変えて基質溶液（１９）（ｐＨ８.５）を用いる以外は同様にして測定したところ、アルカラーゼの活性の最適温度は５０℃であった。
【００７３】
＜アルカラーゼに対する基質のミカエリス定数Ｋｍの測定＞
上記［豚トリプシンに対する基質のミカエリス定数Ｋｍの測定］において、（Ａ５）に変えて下記（Ａ１４）を用いて、バッファー５に変えてバッファー６を用いて、基質溶液（５）、（９）〜（１２）に変えて、基質溶液（１９）、（２２）〜（２４）｛バッファー６を用いて、それぞれ基質濃度：５０ｍｇ／ｍＬ（１．１９ｍＭ）、基質濃度：３０ｍｇ／ｍＬ（０．７１４ｍＭ）、基質濃度：１０ｍｇ／ｍＬ（０．２３８ｍＭ）としたもの｝を用いて、分光光度計の試料室及びそれぞれの溶液の温度を５０℃にする以外は同様にした。アルカラーゼの基質に対するミカエリス定数Ｋｍは０．７ｍＭであった。
【００７４】
＜フェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
カルボキシフェニルボロン酸（東京化成工業株式会社）２５ｍｇを５０ｍＬのバッファー６（ｐＨ８．５）に溶解させ、フェニルボロン酸溶液（ｂ６）（４．１ｍＭ）とした。（ｂ６）をバッファー６で１／１０、１／４、１／２および３／４のモル濃度に希釈したものを（ｂ７）〜（ｂ１０）とした。
基質（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）をバッファー６に溶解して、基質溶液（２５）（１５ｍｇ／ｍＬ（０．３５ｍＭ））を作成した。
上記［大豆トリプシン阻害剤の豚トリプシンに対する阻害定数Ｋｉの測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ１４）を、バッファー５に変えてバッファー６を用いて、（ｂ１）〜（ｂ５）に変えて（ｂ６）〜（ｂ１０）を用いて、基質溶液（１３）に変えて（２５）を用いて、分光光度計の試料室及びそれぞれの溶液の温度を５０℃にする以外は同様にした。フェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉは１０μＭであった。
【００７５】
＜コムギプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
製造例１で得た（Ｂ１）の溶液（Ｌ１）（１μｇ／μＬ）１ｍＬを５０ｍＬのバッファー６（ｐＨ８．５）に溶解させ、コムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１１）（０．８μＭ）とした。（ｂ１１）をバッファー６で１／５０、１／３０、１／２０および１／１０倍のモル濃度に希釈したものを（ｂ１２）〜（ｂ１５）とした。上記［フェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定］において、（ｂ６）〜（ｂ１０）に変えて（ｂ１１）〜（ｂ１５）を使用して同様に測定し、コムギプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めたところ、Ｋｉは１ｐＭであった。
【００７６】
＜ストレプトマイセスプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
製造例１で得た（Ｂ２）の溶液（Ｌ２）（１μｇ／μＬ）１ｍＬを５０ｍＬのバッファー６（ｐＨ８．５）に溶解させ、ストレプトマイセスプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１６）（０．７μＭ）とした。（ｂ１６）をバッファー６で１／５０、１／３０、１／２０および１／１０倍のモル濃度に希釈したものを（ｂ１７）〜（ｂ２０）とした。上記［フェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定］において、（ｂ６）〜（ｂ１０）に変えて（ｂ１６）〜（ｂ２０）を使用して同様に測定し、ストレプトマイセスプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めたところ、Ｋｉは０．１ｐＭであった。
【００７７】
＜ヒトプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ３）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
製造例１で得た（Ｂ３）の溶液（Ｌ３）（１μｇ／μＬ）１ｍＬを５０ｍＬのバッファー６（ｐＨ８．５）に溶解させ、コムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ２１）（０．６μＭ）とした。（ｂ２１）をバッファー６で１／５０、１／３０、１／２０および１／１０倍のモル濃度に希釈したものを（ｂ２２）〜（ｂ２５）とした。上記［フェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定］において、（ｂ６）〜（ｂ１０）に変えて（ｂ２１）〜（ｂ２５）を使用して同様に測定し、ヒトプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ３）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めたところ、Ｋｉは２０μＭであった。
【００７８】
＜４−カルボキシフェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
４−カルボキシフェニルボロン酸（東京化成工業株式会社）２５ｍｇを５０ｍＬのバッファー６に溶解させ、４−カルボキシフェニルボロン酸溶液（ｂ２６）（１２１ｍＭ）とした。（ｂ２６）をバッファー６で１／１０、１／４、１／２及び３／４のモル濃度に希釈したものを（ｂ２７）〜（ｂ３０）とした。
上記［フェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定］において、（ｂ６）〜（ｂ１０）に変えて（ｂ２６）〜（ｂ３０）を使用して同様に測定し、４−カルボキシフェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めたところ、Ｋｉは２．１ｍＭであった。
【００７９】
＜サビナーゼ活性の最適ｐＨの測定＞
サビナーゼ（ノボザイムス社製）１０μＬをそれぞれバッファー１〜８及びバッファー９［５０ｍＭ ＴＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０．５、２５℃）水溶液］（１０ｍＬ）に希釈し、サビナーゼ溶液（Ａ１７）〜（Ａ２５）とした。上記［豚トリプシンの活性の最適ｐＨの測定］において、（Ａ１）〜（Ａ８）に変えて（Ａ１７）〜（Ａ２５）を用いて、基質溶液（１）〜（８）に変えて基質溶液（１４）〜（２１）及び（２６）｛基質溶液（２６）はバッファー９を用いて基質濃度：１１８ｍｇ／ｍＬ（２．８ｍＭ）としたもの｝を用いる以外は同様にして測定したところ、サビナーゼの活性の最適ｐＨは９．５であった。
【００８０】
＜サビナーゼ活性の最適温度の測定＞
上記［豚トリプシンの活性の最適温度の測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ２４）を用いて、基質溶液（５）に変えて基質溶液（２１）（ｐＨ９.５）を用いる以外は同様にして測定したところ、サビナーゼの活性の最適温度は５０℃であった。
【００８１】
＜サビナーゼの基質に対するＫｍの測定＞
上記［豚トリプシンに対する基質のミカエリス定数Ｋｍの測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ２４）を用いて、バッファー５に変えてバッファー８を用いて、基質溶液（５）及び（９）〜（１２）に変えて基質溶液（２１）及び（２７）〜（２９）｛基質溶液（２７）〜（２９）はバッファー８を用いて、それぞれ基質濃度：５０ｍｇ／ｍＬ（１．１９ｍＭ）、基質濃度：３０ｍｇ／ｍＬ（０．７１４ｍＭ）、基質濃度：１０ｍｇ／ｍＬ（０．２３８ｍＭ）としたもの｝を用いて、分光光度計の試料室及びそれぞれの溶液の温度を５０℃にする以外は同様にしてサビナーゼの基質に対するＫｍを測定した。サビナーゼの基質に対するミカエリス定数Ｋｍは０．７ｍＭであった。
【００８２】
＜コムギプロテアーゼ活性阻害剤のサビナーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
製造例１で得た（Ｂ１）の溶液（Ｌ１）（１μｇ／μＬ）１ｍＬを５０ｍＬのバッファー８（ｐＨ９．５）に溶解させ、コムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ３１）（２．７μＭ）とした。（ｂ３１）をバッファー８で１／５０、１／３０、１／２０および１／１０倍のモル濃度に希釈したものを（ｂ３２）〜（ｂ３５）とした。上記［大豆トリプシン阻害剤の豚トリプシンに対する阻害定数Ｋｉの測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ２４）を、（ｂ１）〜（ｂ５）に変えて（ｂ３１）〜（ｂ３５）を、基質溶液（１３）に変えて基質溶液（３０）｛バッファー８を用いて、基質濃度：１５ｍｇ／ｍＬ（０．３５ｍＭ）としたもの｝を使用し、分光光度計の試料室及びそれぞれの溶液の温度を５０℃にする以外は同様にした。コムギプロテアーゼ活性阻害剤のサビナーゼに対する阻害定数を測定したところ、Ｋｉは７５ｐＭであった。
【００８３】
＜カンナーゼ活性の最適ｐＨの測定＞
カンナーゼ（ノボザイムス社製）１０μＬをそれぞれバッファー１〜８（１０ｍＬ）に希釈し、カンナーゼ溶液（Ａ２６）〜（Ａ３３）とした。上記［豚トリプシンの活性の最適ｐＨの測定］において、（Ａ１）〜（Ａ８）に変えて（Ａ２６）〜（Ａ３３）を用いて、基質溶液（１）〜（８）に変えて（１４）〜（２１）を用いる以外は同様にして測定したところ、カンナーゼの活性の最適ｐＨは８．５であった。
【００８４】
＜カンナーゼ活性の最適温度の測定＞
上記［豚トリプシンの活性の最適温度の測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ３１）を用いて、基質溶液（５）に変えて基質溶液（１９）（ｐＨ８．５）を用いる以外は同様にして測定したところ、カンナーゼの活性の最適温度は４０℃であった。
【００８５】
＜カンナーゼの基質に対するＫｍの測定＞
上記［豚トリプシンに対する基質のミカエリス定数Ｋｍの測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ３１）を用いて、バッファー５に変えてバッファー６を用いて、基質溶液（５）、（９）〜（１２）に変えて基質溶液（１９）及び（２２）〜（２４）を用いて、分光光度計の試料室及びそれぞれの溶液の温度を４０℃にする以外は同様にカンナーゼの基質に対するＫｍを測定した。カンナーゼの基質に対するミカエリス定数Ｋｍは０．４ｍＭであった。
【００８６】
＜コムギプロテアーゼ活性阻害剤のカンナーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
上記［大豆トリプシン阻害剤の豚トリプシンに対する阻害定数Ｋｉの測定］において、（Ａ５）に変えて（Ａ３１）を、（ｂ１）〜（ｂ５）に変えて（ｂ１１）〜（ｂ１５）を、基質溶液（１３）に変えて基質溶液（２５）を使用し、分光光度計の試料室及びそれぞれの溶液の温度を４０℃にする以外は同様にして測定した。コムギプロテアーゼ活性阻害剤のカンナーゼに対する阻害定数Ｋｉは１２３ｐＭであった。
【００８７】
＜実施例１＞
１５３０μＬのバッファー５に、前述の豚トリプシン溶液（Ａ５）（０.２５６ｇ／Ｌ、１１．１μＭ）４０μＬおよび前述の大豆トリプシン阻害剤溶液（ｂ１）（０．５ｇ／Ｌ、２０μＭ）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−１）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−１）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ１％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−１）を８００μＬと、バッファー５を８００μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−１−１）を作成した（実施例１−１）。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−１−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ、プロテアーゼ活性は２９％に回復していた。
また、（Ｘ−１）とバッファー５を、表１に記載の量（μＬ）で混合し、（Ｙ−１−２）〜（Ｙ−１−８）を作成し（実施例１−２〜１−８）、プロテアーゼ活性Ｙｉを測定した。結果を表１にまとめた。
【００８８】
＜実施例２＞
１５３０μＬのバッファー６に、前述のアルカラーゼ溶液（Ａ１４）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）４０μＬおよび前述のフェニルボロン酸溶液（ｂ６）（０.５ｇ／Ｌ、３２．８ｍＭ）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−２）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−２）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ１％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−２）を１６μＬと、バッファー６を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−２−１）を作成した（実施例２−１）。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−２−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ、プロテアーゼ活性は４１％に回復していた。
また、（Ｘ−２）とバッファー６を、表１に記載の量で混合し、（Ｙ−２−２）〜（Ｙ−２−７）を作成し（実施例２−２〜２−７）、プロテアーゼ活性Ｙｉを測定した。結果を表１にまとめた。
【００８９】
＜実施例３＞
１５３０μＬのバッファー６に、前述のアルカラーゼ溶液（Ａ１４）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）４０μＬおよび前述のコムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１１）（０．０２ｇ／Ｌ、０．８μＭ）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−３）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−３）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ０．０１％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−３）を１６μＬと、バッファー６を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−３−１）を作成した（実施例３−１）。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−３−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ、プロテアーゼ活性は２５％に回復していた。
また、（Ｘ−３）とバッファー６を、表１に記載の量で混合し、（Ｙ−３−２）〜（Ｙ−２−７）を作成し（実施例３−２〜３−７）、プロテアーゼ活性Ｙｉを測定した。結果を表１にまとめた。
【００９０】
＜実施例４＞
１５３０μＬのバッファー８に、前述のサビナーゼ溶液（Ａ２４）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）４０μＬおよび前述のコムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１１）（０．８μＭ）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−４）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−４）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ１％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−４）を１６μＬと、バッファー８を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−４−１）を作成した（実施例４−１）。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−４−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ、プロテアーゼ活性は３５％に回復していた。
また、（Ｘ−４）とバッファー８を、表１に記載の量で混合し、（Ｙ−４−２）〜（Ｙ−４−７）を作成し（実施例４−２〜４−７）、プロテアーゼ活性Ｙｉを測定した。結果を表１にまとめた。
【００９１】
＜実施例５＞
１５３０μＬのバッファー６に、前述のカンナーゼ溶液（Ａ３１）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）４０μＬおよび前述のコムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１１）（０．８μＭ）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−５）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−５）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ３％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−５）を１６μＬと、バッファー６を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−５−１）を作成した（実施例５−１）。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−５−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ、プロテアーゼ活性は３１％に回復していた。
また、（Ｘ−５）とバッファー７を、表１に記載の量で混合し、（Ｙ−５−２）〜（Ｙ−５−７）を作成し（実施例５−２〜５−７）、プロテアーゼ活性Ｙｉを測定した。結果を表１にまとめた。
【００９２】
＜実施例６＞
１３３０μＬのバッファー６に、前述のカンナーゼ溶液（Ａ３１）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）１００μＬおよび前述のコムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１１）（０．８μＭ）１００μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−６）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−６）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ１％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−６）を１６μＬと、バッファー７を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−６−１）を作成した（実施例５−１）。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−６−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ、プロテアーゼ活性は２５％に回復していた。
また、（Ｘ−６）とバッファー６を、表１に記載の量で混合し、（Ｙ−６−２）〜（Ｙ−６−７）を作成し（実施例６−２〜６−７）、プロテアーゼ活性Ｙｉを測定した。結果を表１にまとめた。
【００９３】
＜実施例７＞
１３３０μＬのバッファー６に、前述のカンナーゼ溶液（Ａ３１）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）１００μＬおよび前述のコムギプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１４）（０．０４μＭ）１００μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−７）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−７）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ１９％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−７）を１６μＬと、バッファー７を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−７−１）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−６−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ、プロテアーゼ活性は５５％に回復していた。
また、（Ｘ−７）とバッファー６を、表１に記載の量で混合し、（Ｙ−７−２）〜（Ｙ−７−７）を作成し（実施例７−２〜７−７）、プロテアーゼ活性Ｙｉを測定した。結果を表１にまとめた。
【００９４】
＜比較例１＞
前述のアルカラーゼ溶液（Ａ１４）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）４０μＬに４−カルボキシフェニルボロン酸溶液（ｂ３６）｛４−カルボキシフェニルボロン酸１ｍｇを２ｍＬのバッファー６に溶解させたもの（４−カルボキシフェニルボロン酸の濃度：０.５ｇ／Ｌ、１２１ｍＭ）｝１５３０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−８）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｘ−８）のプロテアーゼ活性Ｘｉを測定したところ４０％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−８）を１６μＬと、バッファー６を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−８）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−８）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ９８％であった。
【００９５】
＜比較例２＞
１５３０μＬのバッファー６に、前述のアルカラーゼ溶液（Ａ１４）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）４０μＬおよび前述のストレプトマイセスプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ１６）（０．７μＭ）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−９）を作成した。プロテアーゼ活性は０％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−９）を１μＬと、バッファー６を１，０００，０００μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−８）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−９）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ７％であった。
【００９６】
＜比較例３＞
前述のアルカラーゼ溶液（Ａ１４）（０．１ｍｇ／Ｌ、０．０４μＭ）４０μＬに、前述のヒトプロテアーゼ活性阻害剤溶液（ｂ３７）｛溶液（Ｌ３）７８５μＬを７８５μＬのバッファー６に溶解させたもの（ヒトプロテアーゼ（Ｂ３）の濃度：０．５ｇ／Ｌ、１５μＭ）｝１５７０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｘ−１０）を作成した。プロテアーゼ活性は２１％であった。
作成して３０分以上２時間以内のタンパク質溶液（Ｘ−１０）を１６μＬと、バッファー６を１５９，９８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ−１０）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−１０）のプロテアーゼ活性Ｙｉを測定したところ９６％であった。
【００９７】
【表１】
【００９８】
＜吸光度を利用した活性測定法＞
○タンパク質溶液（Ｘ−１）の場合
タンパク質溶液（Ｘ−１）１５７０μＬを分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れ、分光光度計の試料室を２５℃に保ち、セルを試料室内で３０分静置した。ここに、２５℃に温調した基質溶液（３１）｛基質（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）をバッファー５に溶解して１．３ｍｇ／ｍＬ（０．０２９ｍＭ）の濃度にしたもの｝を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｖ−１）を作成した。（Ｖ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録した。
（Ｖ−１）を作成した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋXを求た。
○タンパク質溶液（Ｓ−１）を用いた吸光度の測定
１５７０μＬのバッファー６に、豚トリプシン溶液（Ａ６）（１１．１μＭ）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｓ−１）を作成した。これを全量、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れ、分光光度計の試料室を２５℃に保ち、セルを試料室内で３０分静置した。ここに、２５℃に温調した基質溶液（２７）（０．０２９ｍＭ）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｖ−２）を作成した。（Ｖ−２）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録した。
（Ｖ−２）を作成した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋSを求た。
○タンパク質溶液（Ｘ−１）のプロテアーゼ活性Ｘｉの算出
係数ｋX及び係数ｋSを用いて、下記数式（３）からタンパク質溶液（Ｘ−１）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
プロテアーゼ活性Ｘｉ（％）＝｛ｋX／ｋS｝×１００ （３）
【００９９】
○タンパク質溶液（Ｘ−２）の場合
基質溶液（３２）｛基質（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）をバッファー６に溶解して１１９ｍｇ／ｍＬ（２．８ｍＭ）の濃度にしたもの｝を作成した。
１５７０μＬのバッファー６に、前述のアルカラーゼ溶液（Ａ１４）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｓ−２）を作成した。
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−２）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３２）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−２）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−２）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１００】
○タンパク質溶液（Ｘ−３）の場合
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−３）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３２）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−２）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−３）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０１】
○タンパク質溶液（Ｘ−４）の場合
基質溶液（３３）｛（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）をバッファー８に溶解して６０ｍｇ／ｍＬ（１．４ｍＭ）の濃度にしたもの｝を作成した。
１５７０μＬのバッファー８に、前述のサビナーゼ溶液（Ａ２４）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｓ−４）を作成した。
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−４）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３３）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−４）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−４）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０２】
○タンパク質溶液（Ｘ−５）の場合
基質溶液（３４）｛（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）をバッファー６に溶解して６０ｍｇ／ｍＬ（１．４ｍＭ）の濃度にしたもの｝を作成した。
１５７０μＬのバッファー６に、前述のカンナーゼ溶液（Ａ３１）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｓ−５）を作成した。
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−５）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３４）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−５）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−５）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０３】
○タンパク質溶液（Ｘ−６）の場合
１４３０μＬのバッファー６に、前述のカンナーゼ溶液（Ａ３１）１００μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｓ−６）を作成した。
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−６）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３４）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−６）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−６）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０４】
○タンパク質溶液（Ｘ−７）の場合
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−７）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３４）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−６）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−７）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０５】
○タンパク質溶液（Ｘ−８）の場合
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−８）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３２）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−２）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−８）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０６】
○タンパク質溶液（Ｘ−９）の場合
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−９）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３２）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−２）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−９）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０７】
○タンパク質溶液（Ｘ−１０）の場合
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｘ−１０）を使用し、基質溶液（３１）に変えて（３２）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｓ−２）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｘ−１０）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
【０１０８】
○タンパク質溶液（Ｙ−１）の場合
タンパク質溶液（Ｓ−１）を１６μＬと、バッファー５を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｔ−１−１）を作成した。
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｙ−１−１）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｔ−１−１）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｙ−１−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを求めた。
表１に記載の（Ｘ）の量と同量の（Ｓ−１）及び溶剤を混合し、（Ｔ−１−２）〜（Ｔ−１−８）を作成し、（Ｙ−１−２）〜（Ｙ−１−８）について同様にプロテアーゼ活性Ｙｉを求めた。
【０１０９】
○タンパク質溶液（Ｙ−２）の場合
タンパク質溶液（Ｓ−２）を１６μＬと、バッファー６を１５８４μＬ、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｔ−２−１）を作成した。
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えて（Ｙ−２−１）を使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｔ−２−１）を使用し、基質溶液（３１）に変えて基質溶液（３２）を使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｙ−２−１）のプロテアーゼ活性Ｙｉを求めた。
表１に記載の（Ｘ）の量と同量の（Ｓ−２）及び溶剤を混合し、（Ｔ−２−２）〜（Ｔ−２−７）を作成し、（Ｙ−２−２）〜（Ｙ−２−７）について同様にプロテアーゼ活性Ｙｉを求めた。
【０１１０】
○タンパク質溶液（Ｙ−３）〜（Ｙ−１０）の場合
上記［吸光度を利用した活性測定法］において、タンパク質溶液（Ｘ−１）に変えてタンパク質溶液（Ｙ−３）〜（Ｙ−１０）をそれぞれ使用し、（Ｓ−１）に変えて（Ｔ−３）〜（Ｔ−１０）をそれぞれ作成して使用し、基質溶液（３１）に変えて基質溶液（３２）〜（３５）をそれぞれ使用する以外は同様にして、タンパク質溶液（Ｙ−３）〜（Ｙ−１０）のプロテアーゼ活性Ｙｉを求めた。
【０１１１】
＜実施例８〜１４及び比較例４〜６＞
＜３０℃、３ヶ月保存後のタンパク質溶液のプロテアーゼ活性＞
３０℃で３ヶ月保存した後のタンパク質溶液（Ｘ−１）〜（Ｘ−１０）を用いて表２に記載の通りタンパク質溶液（Ｙ’−１−１）〜（Ｙ’−１０）を作成し、実施例１〜７及び比較例１〜３と同様にして[吸光度を利用した活性測定法］によりプロテアーゼ活性Ｙｉを求めた。結果を表２に示す。
【０１１２】
＜プロテアーゼ活性の持続性＞
タンパク質溶液（Ｙ−１−１）〜（Ｙ−９）及びタンパク質溶液（Ｙ’−１−１）〜（Ｙ’−９）のプロテアーゼ活性Ｙｉを下記式に当てはめることにより、プロテアーゼ活性の持続性を算出した。
プロテアーゼ活性の持続性（％）＝｛タンパク質溶液（Ｙ−１−１）〜（Ｙ−９）のプロテアーゼ活性Ｙｉ｝／｛タンパク質溶液（Ｙ’−１−１）〜（Ｙ’−９）のプロテアーゼ活性Ｙｉ｝
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
プロテアーゼ（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが２．１ｍＭ又は２０μＭのプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を含む比較例１及び比較例３のタンパク質溶液（Ｘ−８）及び（Ｘ−１０）は、実施例１〜７のタンパク質溶液よりも大量の（Ｂ）を含んでいるものの、活性Ｘｉは２１％以上と高く、プロテアーゼ活性を十分に抑制できないことが分かる。また、表２の結果から、３０℃で３ヶ月保存後のタンパク質溶液（Ｘ−８）及び（Ｘ−１０）に溶剤を添加したタンパク質溶液（Ｙ）の活性Ｙｉは３〜５％と低く、プロテアーゼ活性の持続性も３〜５％と低かった。
また、プロテアーゼ（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが０．１ｐＭの比較例２のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を含むタンパク質溶液（Ｘ−９）の活性Ｘｉは０％と低く、プロテアーゼ活性は抑制できていた。しかしながら、表１の結果から、このタンパク質溶液（Ｘ−９）に大量に溶剤を添加したタンパク質溶液（Ｙ）の活性Ｙｉは７％と低く、プロテアーゼの活性を効率よく回復できないことが分かる。
一方、それぞれのプロテアーゼ（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を含む実施例１〜７のタンパク質溶液（Ｘ−１）〜（Ｘ−７）の活性Ｘｉは３以下と低く、プロテアーゼ活性を十分抑制できていた。また、表１の結果から、このタンパク質溶液（Ｘ−１）〜（Ｘ−７）に溶剤を添加したタンパク質溶液（Ｙ）の活性Ｙｉは２５〜９７％と高く、プロテアーゼの活性を大量に希釈することなく効率よく回復できていることが分かる。さらに、表２の結果から、３０℃で３ヶ月保存後のタンパク質溶液（Ｘ−１）〜（Ｘ−７）に溶剤を添加したタンパク質溶液（Ｙ）の活性Ｙｉも高く、プロテアーゼ活性の持続性が４６〜１００％と非常に高かった。
以上のことから、本発明のプロテアーゼ活性回復方法は、タンパク質溶液のプロテアーゼ活性を大量に希釈することなく、効率よく回復できることが分かる。また、タンパク質溶液を長期保存した場合も同様に、プロテアーゼ活性を大量に希釈することなく効率よく回復できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明のプロテアーゼ活性回復方法は、保存溶液中でプロテアーゼ活性を抑え、適度な希釈時にプロテアーゼ活性を回復するので、プロテアーゼと他のタンパク質の混合溶液の保存、例えば液体洗浄剤、繊維改質剤及び化粧品などに使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法であって、
吸光度を利用した活性測定法による（Ｘ）のプロテアーゼ活性Ｘｉが、下記タンパク質溶液（Ｓ）の活性を基準として２０％以下であり、
（Ｘ）に、（Ｘ）の重量を基準として１００〜１００００００重量％の（Ｃ）をさらに添加するタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：基質（Ｄ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、ベンゾイルアルギニンニトロアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド又はサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤。
タンパク質溶液（Ｓ）：タンパク質溶液（Ｘ）において、（Ｂ）を（Ｂ）と同重量の（Ｃ）で置きかえたタンパク質溶液。
【請求項２】
タンパク質溶液（Ｘ）中のプロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）の重量が、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、（Ａ）が０．０００００００００１〜５重量％、（Ｂ）が０．００００００００１〜２０重量％、（Ｃ）が７５〜９９．９９９９９９９９８９重量％である請求項１に記載のプロテアーゼ活性回復方法。
【請求項３】
タンパク質溶液（Ｘ）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）とプロテアーゼ（Ａ）とのモル比（（Ｂ）のモル数／（Ａ）のモル数）が０．８〜１０である請求項１又は２に記載のプロテアーゼ活性回復方法。
【請求項４】
プロテアーゼ（Ａ）がセリンプロテアーゼである請求項1〜３のいずれかに記載のプロテアーゼ活性回復方法。
【請求項５】
プロテアーゼ（Ａ）がスブチリシンである請求項1〜４のいずれかに記載のプロテアーゼ活性回復方法。
【請求項６】
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）が、天然物から抽出された又は宿主細胞に遺伝子を組み込むことで発現されたタンパク質であって、５０個を超えるアミノ酸からなるタンパク質であるタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−１）である請求項１〜５のいずれかに記載のプロテアーゼ活性回復方法。
【請求項１】
プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法であって、
吸光度を利用した活性測定法による（Ｘ）のプロテアーゼ活性Ｘｉが、下記タンパク質溶液（Ｓ）の活性を基準として２０％以下であり、
（Ｘ）に、（Ｘ）の重量を基準として１００〜１００００００重量％の（Ｃ）をさらに添加するタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：基質（Ｄ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、ベンゾイルアルギニンニトロアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド又はサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤。
タンパク質溶液（Ｓ）：タンパク質溶液（Ｘ）において、（Ｂ）を（Ｂ）と同重量の（Ｃ）で置きかえたタンパク質溶液。
【請求項２】
タンパク質溶液（Ｘ）中のプロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）の重量が、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、（Ａ）が０．０００００００００１〜５重量％、（Ｂ）が０．００００００００１〜２０重量％、（Ｃ）が７５〜９９．９９９９９９９９８９重量％である請求項１に記載のプロテアーゼ活性回復方法。
【請求項３】
タンパク質溶液（Ｘ）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）とプロテアーゼ（Ａ）とのモル比（（Ｂ）のモル数／（Ａ）のモル数）が０．８〜１０である請求項１又は２に記載のプロテアーゼ活性回復方法。
【請求項４】
プロテアーゼ（Ａ）がセリンプロテアーゼである請求項1〜３のいずれかに記載のプロテアーゼ活性回復方法。
【請求項５】
プロテアーゼ（Ａ）がスブチリシンである請求項1〜４のいずれかに記載のプロテアーゼ活性回復方法。
【請求項６】
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）が、天然物から抽出された又は宿主細胞に遺伝子を組み込むことで発現されたタンパク質であって、５０個を超えるアミノ酸からなるタンパク質であるタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ−１）である請求項１〜５のいずれかに記載のプロテアーゼ活性回復方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１７５９７２（Ｐ２０１２−１７５９７２Ａ）
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１７４３４（Ｐ２０１２−１７４３４）
【出願日】平成２４年１月３１日（２０１２．１．３１）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１月３１日（２０１２．１．３１）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
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