説明

プロテアーゼ耐性ポリペプチドを選択する方法

本発明は、プロテアーゼ、例えばヒトの胃腸管または肺組織に見出されるプロテアーゼによる分解に対して耐性があるペプチドおよびポリペプチドのライブラリーまたはレパートリー(例えば、ディスプレイシステム)からペプチドまたはポリペプチドを選択、単離および/または回収する方法に関する。一般に、本方法はペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーを提供するステップ;プロテアーゼ活性に好適な条件下でそのライブラリーまたはレパートリーをプロテアーゼと組合わせるステップ;およびプロテアーゼによる分解に耐性でありかつ所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを選択し、単離しおよび/または回収するステップを含んでなる方法である。選択したペプチドおよびポリペプチドは、例えば、ヒトの胃腸管または肺組織の疾患または症状を治療するための治療薬として有用である。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーからプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを選択する方法であって、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供するステップ、そのレパートリーとプロテアーゼをプロテアーゼ活性に好適な条件下で組合わせるステップ、およびプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを選択する、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを回収するステップを含んでなり、ここでプロテアーゼは痰、粘液(例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液)、気管支肺胞洗浄液、肺ホモジネート、肺抽出液、膵臓抽出液、胃液、唾液または涙中に見出されるプロテアーゼから選択される前記方法。
【請求項2】
ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーからプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを選択する方法であって、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供するステップ、そのレパートリーとプロテアーゼをプロテアーゼ活性に好適な条件下で組合わせるステップ、およびプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを選択する、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを回収するステップを含んでなり、ここで前記条件は(i)約1Oμg/ml〜約3mg/mlプロテアーゼ、(ii)約2O℃〜約4O℃、および(iii)少なくとも約30分間である前記方法。
【請求項3】
前記条件(i)が約10〜約100μg/mlプロテアーゼである、請求項2に記載の方法。
【請求項4】
前記条件(ii)が約30〜約37℃である、請求項2または3に記載の方法。
【請求項5】
前記条件(iii)が少なくとも約1時間である、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項6】
プロテアーゼが痰、粘液(例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液)、気管支肺胞洗浄液、肺ホモジネート、肺抽出液、膵臓抽出液、胃液、唾液または涙中に見出されるプロテアーゼから選択される、請求項2〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項7】
前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ(例えば、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB)、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン(例えば、カテプシンG)、プロテイナーゼ(例えば、プロテイナーゼ1、プロテイナーゼ2、プロテイナーゼ3)、サーモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ(例えば、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ9、カスパーゼ12、カスパーゼ13)、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメライン、およびセパラーゼの1以上を含む、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項8】
前記プロテアーゼがトリプシンまたはエラスターゼである、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項9】
前記プロテアーゼが生体抽出液、生体ホモジネートまたは生体調製物により提供される、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項10】
前記生体抽出液、生体ホモジネートまたは生体調製物が痰、粘液(例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液)、気管支肺胞洗浄液、肺ホモジネート、肺抽出液、膵臓抽出液、胃液、唾液または涙からなる群より選択される、請求項9に記載の方法。
【請求項11】
前記所望の生物学的活性が結合活性である、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項12】
前記結合活性がジェネリックリガンドとの結合である、請求項11に記載の方法。
【請求項13】
前記ジェネリックリガンドがプロテインA、プロテインGまたはプロテインLである、請求項12に記載の方法。
【請求項14】
前記結合活性が標的リガンドとの特異的結合である、請求項11に記載の方法。
【請求項15】
前記標的リガンドが、ApoE、Apo-SAA、BDNF、カルジオトロフィン-1、CEA、CD40、CD40リガンド、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受容体、ENA-78、エオタキシン、エオタキシン-2、Exodus-2、FAPα、酸性FGF、塩基性FGF、繊維芽細胞成長因子-10、FLT3リガンド、フラクタルカイン(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、ヒト血清アルブミン、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-1受容体、IL-1受容体1型、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト成長因子-2(KGF-2)、KGF、レプチン、LIF、リンフォタクチン、ミューラー阻害物質、単球コロニー阻害因子、単球誘引タンパク質、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄前駆体インヒビター因子-1(MPIF-1)、NAP-2、ニュールツリン、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受容体I、TNF受容体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF受容体1、VEGF受容体2、VEGF受容体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清アルブミン、vWF、アミロイドタンパク質(例えば、アミロイドα)、MMP12、PDK1、IgE、IL-13Rα1、IL-13Rα2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、キマーゼ、FGF、フューリン、エンドテリン-1、エオタキシン類(例えば、エオタキシン、エオタキシン-2、エオタキシン-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、インテグリン、L-セレクチン、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、好中球エラスターゼ、オステオポンチン、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、siglec-8、TARC、TGFb、トロンビン、Tim-1、TNF、TRANCE、トリプターゼ、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6、αvβ8、cMET、CD8、vWF、アミロイドタンパク質(例えば、アミロイドα)、MMP12、PDK1、およびIgEからなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項16】
所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドをパニングにより回収する、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項17】
前記レパートリーがディスプレイシステムを含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項18】
前記ディスプレイシステムがバクテリオファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、乳濁液コンパートメント化ディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のディスプレイ、または共有結合ディスプレイからなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
【請求項19】
前記ディスプレイシステムが核酸のコーディング機能と核酸がコードするペプチドまたはポリペプチドの機能的特徴を連結する、請求項17または18に記載の方法。
【請求項20】
前記ディスプレイシステムが複製可能な遺伝子パッケージを含む、請求項17、18または19に記載の方法。
【請求項21】
前記ディスプレイシステムがバクテリオファージディスプレイを含む、請求項17〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項22】
バクテリオファージディスプレイシステムが多価である、請求項21に記載の方法。
【請求項23】
前記バクテリオファージがfd、M13、λ、MS2またはT7からなる群より選択される、請求項21に記載の方法。
【請求項24】
ペプチドまたはポリペプチドがpIII融合タンパク質として提示される、請求項23に記載の方法。
【請求項25】
ペプチドまたはポリペプチドがpIIIのドメイン1のアミノ末端にある、請求項19に記載の方法。
【請求項26】
さらに、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を増幅するステップを含んでなる、請求項19に記載の方法。
【請求項27】
前記核酸をファージ増幅、細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応により増幅する、請求項26に記載の方法。
【請求項28】
前記レパートリーが免疫グロブリン単一可変ドメインのレパートリーである、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項29】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインが重鎖可変ドメインである、請求項28に記載の方法。
【請求項30】
前記重鎖可変ドメインがヒトまたはヒト化重鎖可変ドメインである、請求項29に記載の方法。
【請求項31】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインが軽鎖可変ドメインである、請求項28に記載の方法。
【請求項32】
前記軽鎖可変ドメインがヒトまたはヒト化軽鎖可変ドメインである、請求項31に記載の方法。
【請求項33】
標的リガンドと高アフィニティで結合するペプチドまたはポリペプチドを、前記ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーから選択する、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項34】
プロテアーゼを約100μg/mlで使用し、組合わせたレパートリーおよびプロテアーゼを約37℃で少なくとも約1時間インキュベートする、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項35】
それぞれの前記ポリペプチドが標的と結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン(dAb)であるいずれかの先行する請求項に記載の方法であって;そのレパートリーを、免疫グロブリン単一可変ドメインのレパートリーを提示するファージディスプレイシステムにより提供し;組合わせるステップにおいてファージディスプレイシステムをエラスターゼ、ロイコザイムおよびトリプシンからなる群より選択されるプロテアーゼとプロテアーゼ活性に好適な条件下で組み合わせ;そして回収ステップにおいて前記標的リガンドと結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを提示するファージを回収する前記方法。
【請求項36】
いずれかの先行する請求項に記載の方法を行うことを含む、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを作製する方法であって、前記回収ステップにおいて、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを作製する、所望の生物学的活性を有する複数のペプチドまたはポリペプチドを回収する前記方法。
【請求項37】
プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーがナイーブなレパートリーである、請求項36に記載の方法。
【請求項38】
さらに第2のプロテアーゼをプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーと第2のプロテアーゼの活性に好適な条件下で組合わせるステップ;および第2のプロテアーゼに耐性である少なくとも1つのペプチドまたはポリペプチドを選択する、所望の生物学的活性を有する少なくとも1つのペプチドまたはポリペプチドを回収するステップを含む、請求項36または37に記載の方法。
【請求項39】
第2のプロテアーゼが請求項6〜10のいずれか1項に記載されている、請求項38に記載の方法。
【請求項40】
プロテアーゼの前記レパートリー中のペプチドまたはポリペプチドとの比(モル/モル基準で)が8,000〜80,000のプロテアーゼ:ペプチドまたはポリペプチドである、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項41】
プロテアーゼの前記レパートリー中のペプチドまたはポリペプチドとの比(重量/重量基準で)が16,00〜160,000のプロテアーゼ:ペプチドまたはポリペプチドである、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項42】
先行する請求項のいずれか1項の方法により選択可能なまたは選択した、単離されたプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項43】
請求項1〜41のいずれか1項の方法により選択可能なまたは選択した、単離されたプロテアーゼ耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項44】
トリプシン、エラスターゼおよびロイコザイムから選択される1以上のプロテアーゼに対して、そのプロテアーゼと(i)約lOμg/ml〜約3mg/mlプロテアーゼ、(ii)約2O℃〜約4O℃および(iii)少なくとも約30分間の条件下で(例えば、100μg/mlのプロテアーゼ、37℃にて、少なくとも1時間の条件下で)インキュベートしたときに耐性がある免疫グロブリン単一可変ドメインを含む単離された肺標的アンタゴニストであって、肺疾患もしくは症状を治療および/または予防するために患者に投与する前記アンタゴニスト。
【請求項45】
吸入によりまたは鼻腔内に患者に投与する、請求項44に記載のアンタゴニスト。
【請求項46】
トリプシン、エラスターゼおよびロイコザイムから選択される1以上のプロテアーゼに対して、そのプロテアーゼと(i)約lOμg/ml〜約3mg/mlプロテアーゼ、(ii)約2O℃〜約4O℃および(iii)少なくとも約30分間の条件下で(例えば、100μg/mlのプロテアーゼ、37℃にて、少なくとも1時間の条件下で)インキュベートしたときに耐性がある免疫グロブリン単一可変ドメインを含む単離された胃腸管標的アンタゴニストであって、胃腸管疾患もしくは症状を治療および/または予防するために患者に投与する前記アンタゴニスト。
【請求項47】
経口、舌下または経直腸で患者に投与する、請求項46に記載のアンタゴニスト。
【請求項48】
TNFαにアンタゴニスト作用を示す、請求項44〜47のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項49】
可変ドメインがTNFR1との結合部位を含む、請求項48に記載のアンタゴニスト。
【請求項50】
TNFR1、VEGFまたはIL-1R1にアンタゴニスト作用を示す、請求項44〜47のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項51】
可変ドメインがTNFR1、VEGFまたはIL-1R1との結合部位をそれぞれ含む、請求項50に記載のアンタゴニスト。
【請求項52】
トリプシン、エラスターゼおよびロイコザイムから選択される1以上のプロテアーゼに対して、そのプロテアーゼと(i)約lOμg/ml〜約3mg/mlプロテアーゼ、(ii)約2O℃〜約4O℃および(iii)少なくとも約30分間の条件下で(例えば、100μg/mlのプロテアーゼ、37℃にて、少なくとも1時間の条件下で)インキュベートしたときに耐性がある免疫グロブリン単一可変ドメインを含む単離された肺標的アンタゴニストの使用であって、肺疾患もしくは症状を治療および/または予防するために患者に投与する医薬品の製造における前記使用。
【請求項53】
投与が患者への吸入または鼻腔内投与である、請求項52に記載の使用。
【請求項54】
胃腸管疾患もしくは症状を治療および/または予防するために患者に投与する医薬の製造における、トリプシン、エラスターゼおよびロイコザイムから選択される1以上のプロテアーゼに対して、そのプロテアーゼと(i)約lOμg/ml〜約3mg/mlプロテアーゼ、(ii)約2O℃〜約4O℃および(iii)少なくとも約30分間の条件下で(例えば、100μg/mlのプロテアーゼ、37℃にて、少なくとも1時間の条件下で)インキュベートしたときに耐性がある免疫グロブリン単一可変ドメインを含む単離された胃腸管標的アンタゴニストの使用。
【請求項55】
投与が患者への経口、舌下または経直腸投与である、請求項54に記載の使用。
【請求項56】
アンタゴニストがTNFαにアンタゴニスト作用を示す、請求項52〜54のいずれか1項に記載の使用。
【請求項57】
可変ドメインがTNFR1との結合部位を含む、請求項56に記載の使用。
【請求項58】
アンタゴニストがTNFR1、VEGFまたはIL-1R1にアンタゴニスト作用を示す、請求項52〜54のいずれか1項に記載の使用。
【請求項59】
可変ドメインがTNFR1、VEGFまたはIL-1R1との結合部位をそれぞれ含む、請求項58に記載のアンタゴニスト。
【請求項60】
請求項42もしくは43のプロテアーゼ耐性ペプチド、ポリペプチドもしくは可変ドメインまたは請求項44〜51のいずれか1項に記載のアンタゴニストをコードする単離された核酸。
【請求項61】
請求項42もしくは43のプロテアーゼ耐性ペプチド、ポリペプチドもしくは可変ドメインまたは請求項44〜51のいずれか1項に記載のアンタゴニストをコードする組換え核酸。
【請求項62】
請求項60または61に記載の核酸を含むベクター。
【請求項63】
請求項62に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項64】
請求項1〜41のいずれか1項に記載の方法により選択可能なもしくは選択したプロテアーゼ耐性ペプチドもしくはポリペプチドまたは請求項44〜51のいずれか1項に記載のアンタゴニストを作製する方法であって、プロテアーゼ耐性ペプチドもしくはポリペプチドまたはアンタゴニストを作製する、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドもしくはアンタゴニストをコードする組換え核酸を含有する宿主細胞を発現に好適な状況で維持するステップを含んでなる前記方法。
【請求項65】
医薬に使用するための、請求項1〜41のいずれか1項に記載の方法により選択可能なもしくは選択したプロテアーゼ耐性ペプチドもしくはポリペプチドまたは請求項43に記載の可変ドメイン。
【請求項66】
疾患を治療または予防する医薬品を製造するための、請求項1〜41のいずれか1項に記載の方法により選択可能なもしくは選択したプロテアーゼ耐性ペプチドもしくはポリペプチドまたは請求項43に記載の可変ドメイン。
【請求項67】
それを必要とする被験者に、請求項1〜41のいずれか1項に記載の方法により選択可能なもしくは選択したプロテアーゼ耐性ペプチドもしくはポリペプチドまたは可変ドメインの有効量を投与するステップを含んでなる、疾患を治療する方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7A】
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【図7B】
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【図7C】
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【図7D】
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【図8A】
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【図8B】
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【図8C】
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【図9】
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【図10A】
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【図10B】
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【図10C】
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【図11A】
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【図11B】
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【図11C】
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【図12】
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【図13A】
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【図13B】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17A】
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【図17B】
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【図18】
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【図19A】
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【図19B】
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【図19C】
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【図19D】
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【図19E】
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【図19F】
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【図19G】
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【図19H】
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【図19I】
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【図19J】
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【図19K】
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【図19L】
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【図20A】
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【図20B】
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【図20C】
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【図20D】
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【図20E】
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【図21】
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【図22】
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【図23−1】
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【図23−2】
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【図24】
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【図25】
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【図26−1】
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【図26−2】
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【図26−3】
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【図27】
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【図28】
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【図29−1】
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【図29−2】
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【図30】
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【図31】
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【図32】
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【図33】
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【図34】
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【図35】
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【図36】
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【図37】
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【図38】
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【図39】
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【図40】
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【図41】
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【図42a】
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【図42b】
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【図43】
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【図44】
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【図45】
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【図46】
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【図47A】
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【図47B】
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【図48】
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【図49】
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【図50】
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【図51a−1】
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【図51a−2】
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【図51a−3】
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【図51a−4】
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【図51a−5】
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【図51a−6】
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【図51a−7】
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【図51b−1】
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【図51b−2】
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【図51b−3】
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【図51b−4】
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【図51b−5】
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【図51b−6】
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【図51b−7】
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【図51b−8】
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【図51b−9】
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【図51b−10】
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【図51b−11】
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【図51b−12】
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【図51b−13】
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【図51b−14】
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【図51b−15】
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【公表番号】特表2010−528645(P2010−528645A)
【公表日】平成22年8月26日(2010.8.26)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−510882(P2010−510882)
【出願日】平成20年6月3日(2008.6.3)
【国際出願番号】PCT/GB2008/050399
【国際公開番号】WO2008/149143
【国際公開日】平成20年12月11日(2008.12.11)
【出願人】(502197046)ドマンティス リミテッド (47)
【Fターム(参考)】