プロテインホスファターゼ−１阻害剤
【課題】プロテインホスファターゼ−１の阻害剤、該阻害剤を含むＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化剤、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸受容体の発現増強剤及びシナプス伝達促進剤等の提供。
【解決手段】式（Ｉ）
〔式中、
Ｒは、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルであり、１，２−シクロプロピレンは、３位の炭素原子に適切な置換基を有してもよく、
Ｘは、単結合又はアルキレンであり、
炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと１０〜２５である。〕
で表される、１以上のシクロプロパン環を有するカルボン酸化合物又はその塩を含む、プロテインホスファターゼ−１（ＰＰ−１）阻害剤。
【解決手段】式（Ｉ）
〔式中、
Ｒは、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルであり、１，２−シクロプロピレンは、３位の炭素原子に適切な置換基を有してもよく、
Ｘは、単結合又はアルキレンであり、
炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと１０〜２５である。〕
で表される、１以上のシクロプロパン環を有するカルボン酸化合物又はその塩を含む、プロテインホスファターゼ−１（ＰＰ−１）阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロテインホスファターゼ−１の阻害剤、該阻害剤を含むＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化剤、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸受容体の発現増強剤及びシナプス伝達促進剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、認知症が世界的に医療上の大きな問題となっている。認知症は、記憶障害及び判断力の低下を中心にした多種の症状を伴う疾患であるが、その原因となる病気によって症状及びその経過は異なる。しかし、いずれの場合も、患者の生活の質を著しく損なうという点で共通している。また、患者の家族をはじめとする介護者にも多大な労苦を強いるという事実を考えたとき、認知症は社会的にたいへん重大な問題であるといえよう。寿命の長期化による高齢者人口の増加が、認知症患者の増加と関係しているため、日本では今後更に認知症患者が増加すると予測されている。また、認知症には分類されない何らかの認知障害を患う人も多い。
【０００３】
老化やアルツハイマー病等の神経変性疾患に伴う認知症は、脳萎縮を引き起こす脳神経細胞死（アポトーシス）が主な原因であり、特に、海馬が萎縮していく。脳神経細胞のアポトーシスは大きく２つの経路−酸化ストレスと小胞体ストレスによって誘導される。
認知機能を改善する手段として、上記した脳神経細胞のアポトーシスを抑制する方法、シナプス伝達を促進する方法等が挙げられる。シナプス伝達を促進する方法としては、（１）シナプス前終末からの神経伝達物質の放出を刺激する、（２）神経伝達物質の分解を抑制する、（３）神経伝達物質の再吸収を抑制する、（４）シナプス後細胞に発現する神経伝達物質受容体の反応性を増大する、等の方法が検討されている。
【０００４】
一方、近年、海馬シナプス伝達の促進機構が解明されつつある。例えば、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）の活性化がα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体の（シナプス）細胞膜への移送を促進すること、それによって、シナプス上でのＡＭＰＡ受容体の発現量が増加し、応答性が高まり海馬シナプス伝達が促進されること、等が報告されている（非特許文献１）。また、プロテインホスファターゼ−１（ＰＰ−１）を抑制することによりＣａＭＫＩＩが活性化すること、ＰＰ−１は学習や記憶に関連していることが報告されている（非特許文献２）。
【０００５】
本発明者は、体内での代謝の遅延を可能とし、且つシナプス伝達の安定なＬＴＰ（long-term potentiation）様増強を持続できる、シナプス伝達効率の長期増強作用を有する化合物として、８−（２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル）−オクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）を見出している（特許文献１）。ＬＴＰは、例えばアルツハイマー病などの種々の神経及び精神疾患の発症に関与すると考えられ、従って、ＬＴＰ発現を誘導する物質は、認知症を含むこれらの神経及び精神疾患の治療薬又は予防薬となる可能性を有する。
【０００６】
ＤＣＰ−ＬＡについてはまた、幾つかの報告がなされている。例えば、ＤＣＰ−ＬＡが選択的かつ直接的にＰＫＣ−εを活性化すること（非特許文献３）、ＤＣＰ−ＬＡが老化促進マウスの認知機能障害を改善すること（非特許文献４）、ＤＣＰ−ＬＡが海馬神経細胞からのγアミノ酪酸の放出を増加させること（非特許文献５）、ＤＣＰ−ＬＡがアミロイドβペプチドあるいはスコポラミン処理ラットの認知機能障害を改善すること（非特許文献６）、ＤＣＰ−ＬＡがグルタミン酸作動性シナプス前細胞に発現するα７ニコチン性アセチルコリン受容体を標的として海馬シナプス伝達を促進させること（非特許文献７）が報告されている。さらに、近年ＤＣＰ−ＬＡに酸化ストレスによって誘導される神経細胞死を抑制する作用があることが報告されている（特許文献２）。
しかしながら、ＤＣＰ−ＬＡのシナプス伝達促進作用の詳細なメカニズムは未だ解明されていない。該メカニズムを解明し、ＤＣＰ−ＬＡの作用点を明らかにすることは、アルツハイマー病をはじめとした種々の神経変性疾患に対する、既存の薬物とは異なる作用機序を有する予防・治療薬の開発に繋がる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０２／５００１３号
【特許文献２】特開２００８−１４３８１９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Rongo, C., Bioessays, 2002, 24:223-233
【非特許文献２】Genoux, D., Nature, 2002, 418:970-975
【非特許文献３】Kanno Tら，J Lipid Res., 2006, 47(6):1146-56
【非特許文献４】Yaguchi Tら，Neuroreport, 2006, 23;17(1):105-8.
【非特許文献５】Kanno Tら，J Neurochem., 2005, 95(3):695-702.
【非特許文献６】Nagataら T, Psychogeriatrics, 2005, 5:122-126.
【非特許文献７】Yamamotoら, Neuroscience 2005, 130(1):207-213.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、プロテインホスファターゼ−１の阻害剤、該阻害剤を含むＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化剤、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸受容体の発現増強剤及びシナプス伝達促進剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩にＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（以下、単にＣａＭＫＩＩと略する場合がある）を活性化する作用があることを見出し、さらに該ＣａＭＫＩＩ活性化作用がプロテインホスファターゼ−１（以下、単にＰＰ−１と略する場合がある）阻害作用に由来することを見出した。ＣａＭＫＩＩの活性化を通してα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（以下、単にＡＭＰＡと略する場合がある）受容体の細胞膜への移行を促進し、細胞膜上でのＡＭＰＡ受容体発現数増加に伴う海馬シナプス伝達の促進を確認して本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の通りである。
［１］式（Ｉ）
【００１１】
【化１】
【００１２】
〔式中、
Ｒは、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルであり、１，２−シクロプロピレンは、３位の炭素原子に適切な置換基を有してもよく、
Ｘは、単結合又はアルキレンであり、
炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと１０〜２５である。〕
で表される、１以上のシクロプロパン環を有するカルボン酸化合物又はその塩を含む、プロテインホスファターゼ−１（ＰＰ−１）阻害剤。
［２］Ｒが、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルである、上記［１］記載の剤。
［３］Ｒが
【００１３】
【化２】
【００１４】
〔式中、
Ｒ’は、水素又はアルキルであり、
Ｙは、単結合又はアルキレンであり、
Ａは、１，２−シクロプロピレン又はビニレンであり、
ｍは、０〜５の整数であり、
但し、ｍが２〜５のとき、Ａは、同一又は異なっている。〕
である、上記［２］記載の剤。
［４］Ｒが
【００１５】
【化３】
【００１６】
から選択される基であり、
Ｘが−（ＣＨ２）ｎ−である
〔式中、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは各々整数であり、ｐとｎの合計は６〜２１であり、ｑ、ｒ、ｎの合計は４〜１９である。〕、
上記［３］記載の剤。
［５］Ｒが
【００１７】
【化４】
【００１８】
から選択される基であり、
Ｘが−（ＣＨ２）ｎ−である
〔式中、ｓ、ｎは各々整数であり、その合計は３〜１８である。〕、
上記［４］記載の剤。
［６］ｓが４であり、ｎが７である、上記［５］記載の剤。
［７］該カルボン酸化合物又はその塩が、８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸又はその塩である、上記［１］記載の剤。
［８］研究用試薬である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の剤。
［９］上記［１］〜［８］のいずれかに記載の剤を含む、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）の活性化剤。
［１０］上記［９］記載の剤を含む、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体の発現増強剤。
［１１］上記［１０］記載の剤を含む、シナプス伝達促進剤。
［１２］式（Ｉ）
【００１９】
【化５】
【００２０】
〔式中、
Ｒは、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルであり、１，２−シクロプロピレンは、３位の炭素原子に適切な置換基を有してもよく、
Ｘは、単結合又はアルキレンであり、
炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと１０〜２５である。〕
で表される、１以上のシクロプロパン環を有するカルボン酸化合物又はその塩を含む、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化剤。
［１３］Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化が、プロテインホスファターゼ−１を阻害することによるものである、上記［１２］記載の剤。
［１４］式（Ｉ）
【００２１】
【化６】
【００２２】
〔式中、
Ｒは、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルであり、１，２−シクロプロピレンは、３位の炭素原子に適切な置換基を有してもよく、
Ｘは、単結合又はアルキレンであり、
炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと１０〜２５である。〕
で表される、１以上のシクロプロパン環を有するカルボン酸化合物又はその塩を含む、
α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体の発現増強剤。
［１５］α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体の発現増強が、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化によるものである、上記［１４］記載の剤。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の剤は、ＰＰ−１を抑制してＣａＭＫＩＩを活性化することによって、ＡＭＰＡ受容体の細胞膜への移行を促進し、細胞膜上でのＡＭＰＡ受容体発現数増加に伴う海馬シナプス伝達を促進させることができる。すなわち、既存の薬物とは異なる作用機序を有する、海馬シナプス伝達を促進することが有益な疾患（例えば神経変性疾患）の予防・治療薬の開発に繋がる。既存の薬物とは異なる作用機序を有するので、既存の薬物において問題となっていたような副作用を回避することができる。また、本発明の剤は、そのような予防・治療薬の開発に有用なツールとなり得る研究用試薬として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ＧＦ１０９２０３Ｘ（１００ｎＭ）及び／又はＫＮ−９３（３μＭ）の存在下及び非存在下で、ＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）で１０分間処理した前後の、ラット海馬切片のＣＡ１領域から記録されたｆＥＰＳＰを示すグラフである。上段は電位のチャート図を示している。グラフ中、各ポイントはＥＰＳＰ（％基準傾き）の平均値（±ＳＥＭ）を示している（ｎ＝８）。縦軸は、横軸は経過時間(分)を示す。ｆＥＰＳＰ：興奮性シナプス後場電位
【図２】図２は、ＫＮ−９２（３μＭ）又はＫＮ−９３（３μＭ）の存在下又は非存在下、所定濃度のＤＣＰ−ＬＡで処理した（あるいは処理していない）培養海馬ニューロンにおけるＣａＭＫＩＩ活性を測定した結果を示す図である。上段は、ＨＰＬＣのプロファイルを示す図である。ＨＰＬＣのプロファイルにおいて、「Ｓ」及び「Ｐ」は、それぞれリン酸化されていない基質及びリン酸化された基質を示している。縦軸は吸光度を、横軸は保持時間(分)を示す。下段は、リン酸化された基質ペプチド（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ細胞タンパク質）をＣａＭＫＩＩ活性の指標として用いて作成したグラフである。グラフ中、各カラムはＣａＭＫＩＩ活性の平均値（±ＳＥＭ）（ｎ＝１６）を表している。P value, unpaired t-test
【図３】図３は、無細胞系でＣａＭＫＩＩ活性及びＰＰ−１活性を測定した結果を表す図である（Ａ：ＣａＭＫＩＩ活性、Ｂ：ＰＰ−１活性）。Ａ及びＢのいずれも上段はＨＰＬＣのプロファイルを示す図である。ＨＰＬＣプロファイルにおいて、「Ｓ」及び「Ｐ」は、それぞれリン酸化されていない基質及びリン酸化された基質を示している。縦軸は吸光度を、横軸は保持時間(分)を示す。Ａ（下段）：リン酸化された基質ペプチド（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ細胞タンパク質）をＣａＭＫＩＩ活性の指標として用いて作成したグラフ。グラフ中、各カラムはＣａＭＫＩＩ活性の平均値（±ＳＥＭ）（ｎ＝５）を表している。Ｂ（下段）：脱リン酸化された基質ペプチド（Δｐｍｏｌ／ｍｉｎ）をＰＰ−１活性の指標として用いて作成したグラフ。グラフ中、各カラムはＰＰ−１活性の平均値（±ＳＥＭ）（ｎ＝８）を表している。脱リン酸化された基質ペプチドの量はｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ（ＭＣ）あるいはＤＣＰ−ＬＡの存在下及び非存在下、（ＰＰ−１存在下でのリン酸化された基質ペプチドの量）から（ＰＰ−１非存在下でのリン酸化された基質ペプチドの量）を差し引くことによって求めた。P value, unpaired t-test
【図４】ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ３サブユニット、あるいはｍＧｌｕＲ１（Ｓ８３１Ａ）サブユニットの種々の組合わせで構成されるＡＭＰＡ受容体をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた。各卵母細胞に、ＫＮ−９３（３μＭ）の存在下及び非存在下、１０分間のＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）処理の前後にカイニン酸（５０μＭ）を１０秒間、１０分間隔でバスアプライした。保持電位−６０ｍＶで、ＤＣＰ−ＬＡ処理の１０分前から処理後７０分まで電流を測定し記録した。図４は各卵母細胞における電流測定の結果を示すグラフである。併せて、電流測定のチャート図を示す。カイニン酸の適用はチャート図中に横棒で示した。グラフ中、各点は基準となる振幅（−１０分の時点での振幅）に対する平均値（±ＳＥＭ）％（ｎ＝６−１１）を表している。縦軸は電流振幅（％基準値）、横軸は経過時間(分)を示す。
【図５】Ａ：ラット海馬切片からのライセートを抗ＧｌｕＲ１サブユニット抗体で免疫沈降したもの（ＧｌｕＲ１ ＩＰ）あるいは抗ＧｌｕＲ２サブユニット抗体で免疫沈降したもの（ＧｌｕＲ２ ＩＰ）について、ＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットに対する抗体でウェスタンブロット解析を行った結果を示す図である。Ｂ：抗カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）抗体及び抗ＬＤＨ抗体を用いて、海馬切片からのライセートから分離した細胞質画分（Ｃ）及び細胞膜画分（Ｍ）について行ったウェスタンブロット解析の結果を示す図である。Ｃ：ＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットに対する抗体を用いて、海馬切片［ＧＦ１０９２０３Ｘ（ＧＦ）（１００ｎＭ）、ＫＮ−９３（３μＭ）、Ｈ−８９（１μＭ）、ＰＡＯ（３μＭ）又はＢｏＴＸ−Ａ（０．１Ｕ／ｍｌ）の存在下又は非存在下に、所定の濃度のＤＣＰ−ＬＡで処理した、あるいは未処理の］からのライセートから分離した細胞質画分（Ｃ）及び細胞膜画分（Ｍ）について行ったウェスタンブロット解析の結果を示す図である。Ｄ：Ｃの結果を用いてグラフ化したものである。グラフ中、各カラムは、ＧｌｕＲ１又はＧｌｕＲ２サブユニットのシグナル強度について、全細胞におけるシグナル強度に対する細胞膜画分におけるシグナル強度の比を平均値（±ＳＥＭ）で表したものである（ｎ＝４）。P value, one-way ANOVA
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書中で用いられる場合、Ｒにおけるアルキルは直鎖又は分岐鎖であり、当該アルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、エイコサニル、ドコサニルなどが挙げられる。アルキルは、炭素鎖中に１，２−シクロプロピレンを、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよい。アルキルがｎ−ペンチルの場合に１，２−シクロプロピレンが炭素鎖中に存在すると、例えば、１，２−シクロプロピレンがｎ−ペンチルの２位と３位の炭素原子の間に存在している場合には２−（２−プロピルシクロプロパン−１−イル）エチルを意味する。２以上の１，２−シクロプロピレンが存在していてもよい。アルキルがｎ−ペンチルの場合にシクロプロピレンが鎖末端に存在すると、シクロプロピルがｎ−ペンチルの末端炭素原子（５位の炭素原子）に存在する場合には５−シクロプロピルペンタン−１−イルを意味する。本発明におけるアルキルは、炭素鎖中に１，２−シクロプロピレンを、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有するアルキル（例えば、２−（２−（３−シクロプロピルプロピル）−シクロプロパン−１−イル）エチル）を包含する。炭素鎖中に１，２−シクロプロピレンを、鎖末端にシクロプロピルを有するＲでのアルキルの例としては、好ましくは、オクチル、（２−ペンチルシクロプロパン−１−イル）メチル、（２−（（２−エチル−シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロパン−１−イル）メチル、（２−（（２−（（２−ペンチル−シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロパン−１−イル）メチル）−シクロプロパン−１−イル）メチル、（２−（（２−ペンチル−シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロパン−１−イル）メチルが挙げられ、オクチル、（２−ペンチルシクロプロパン−１−イル）メチルが特に好ましい。
【００２６】
Ｒにおけるアルケニルは直鎖又は分岐鎖であり、当該アルケニルとしては、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、sec−ブテニル、tert−ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、エイコセニル、ドコセニル、ブタジエニル、ペンタジエニル、ヘキサジエニル、ヘプタジエニル、オクタジエニル、ノナジエニル、デカジエニル、ウンデカジエニル、ドデカジエニル、トリデカジエニル、テトラデカジエニル、ペンタデカジエニル、ヘキサデカジエニル、ヘプタデカジエニル、オクタデカジエニル、エイコサジエニル、ドコサジエニル、ヘキサトリエニル、ヘプタトリエニル、オクタトリエニル、ノナトリエニル、デカトリエニル、ウンデカトリエニル、ドデカトリエニル、トリデカトリエニル、テトラデカトリエニル、ペンタデカトリエニル、ヘキサデカトリエニル、ヘプタデカトリエニル、オクタデカトリエニル、エイコサトリエニル、ドコサトリエニル、オクタテトラエニル、ノナテトラエニル、デカテトラエニル、ウンデカテトラエニル、ドデカテトラエニル、トリデカテトラエニル、テトラデカテトラエニル、ペンタデカテトラエニル、ヘキサデカテトラエニル、ヘプタデカテトラエニル、オクタデカテトラエニル、エイコサテトラエニル、ドコサテトラエニルなどが挙げられる。アルケニルは、炭素鎖中に１，２−シクロプロピレンを、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよい。アルケニルが１−ペンテニルの場合に１，２−シクロプロピレンが炭素鎖中に存在すると、例えば、１，２−シクロプロピレンが１−ペンテニルの２位と３位の炭素原子の間に存在する場合には２−（２−プロピルシクロプロパン−１−イル）エテニルを意味する。２以上の１，２−シクロプロピレンが存在していてもよい。アルケニルが１−ペンテニルの場合にシクロプロピルが鎖末端に存在すると、シクロプロピルが１−ペンテニルの末端炭素原子（５位の炭素原子）に存在する場合には５−シクロプロピル−１−ペンテニルを意味する。本発明におけるアルケニルは、炭素鎖中に１，２−シクロプロピレンを、鎖末端にシクロプロピルを有するアルケニル（例えば、２−（２−（３−シクロプロピルプロピル）シクロプロパン−１−イル）エテニル）を包含する。炭素鎖中に１，２−シクロプロピレンを、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有するＲでのアルケニルは、好ましくはオクテニルである。
【００２７】
Ｒにおける１，２−シクロプロピレンは、アルキルなどの適切な置換基を３位の炭素原子に有していてもよい。Ｒでの１，２−シクロプロピレンの３位の炭素原子でのアルキルの例としては、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、tert−ペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
【００２８】
Ｘにおけるアルキレンは直鎖又は分岐鎖であり、当該アルキレンとしては、メチレン、エチレン、プロピレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン、オクタメチレン、ノナメチレン、デカメチレン、ウンデカメチレン、ドデカメチレン、トリデカメチレン、テトラデカメチレン、ペンタデカメチレン、ヘキサデカメチレン、ヘプタデカメチレン、オクタデカメチレン、ノナデカメチレン、エイコサメチレンなどが挙げられる。ヘプタメチレン、トリメチレン、テトラメチレンが好ましい。
【００２９】
本発明の式（Ｉ）の化合物では、炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと、１０〜２５、好ましくは１８〜２２であり得る。ｐ、ｑ、ｒ、ｍ、ｎ、ｓは各々、整数（０を含む）である。
【００３０】
例えば、式（Ｉ）の化合物は、以下の構造式を有する８−（２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル）−オクタン酸（本明細書中、必要に応じてＤＣＰ−ＬＡと省略）であり得る。
【００３１】
【化７】
【００３２】
あるいは、式（Ｉ）の化合物としては、例えば、８−（２−（２−（Ｚ）−オクテニル）シクロプロピル）オクタン酸、８−（（２−オクチル）シクロプロピル）オクタン酸、８−（２−（（２−（（２−エチル−シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロピル）オクタン酸、８−（２−（（２−（（２−（（２−ペンチル−シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロピル）ブタン酸、８−（２−（（２−（（２−ペンチル−シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロピル）ペンタン酸が挙げられる。
【００３３】
式（Ｉ）の化合物は、不斉炭素原子や二重結合に起因する１以上の立体異性体（例えば、光学異性体、幾何異性体）を含んでいてもよいことに注意されるべきであり、このような異性体及びそれらの混合物の全てが本発明の範囲に含まれる。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物は、例えば、ＷＯ０２／５００１３で示される方法によって製造できる。式（Ｉ）の化合物はまた、天然物から抽出されたものであってもよい。
【００３５】
式（Ｉ）の化合物の塩は、特に限定されないが、医薬又は食品として許容され得る塩が好ましく、例えば無機塩基（例、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属；アルミニウム、アンモニウム）、有機塩基（例、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン）、無機酸（例、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸）、有機酸（例、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、リジン、オルニチン）又は酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩などが挙げられる。
【００３６】
本明細書中で用いられる場合、被験体は哺乳動物であり得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、ペット（例、イヌ、ネコ、ウサギ）、使役動物又は家畜（例、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）が挙げられるが、ヒトが好ましい。
【００３７】
式（Ｉ）の化合物及びその塩は、ＰＰ−１阻害作用を有し、該作用によりＣａＭＫＩＩを活性化する。
ＰＰ−１（プロテインホスファターゼ−１）は、リン酸化タンパク質を脱リン酸化する酵素の１種であり、セリン／スレオニンホスファターゼに分類される。ＰＰ−１は、幅広い組織分布と細胞内分布を示し、主に糖代謝、細胞運動、細胞周期、ＤＮＡ複製、転写、翻訳、細胞接着など広範囲な細胞機能を制御している。近年、神経活動におけるタンパク質リン酸化の関与が注目されるに伴い、後述のＣａＭＫＩＩとともに、シナプス伝達の可塑性、記憶・学習に代表される高次脳機能に重要な役割を果たすと考えられている。ＣａＭＫＩＩ（Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ）は、神経細胞に豊富に存在し、神経伝達物質合成酵素やシナプス小胞結合タンパク、イオンチャネル、神経伝達物質受容体等をリン酸化することによって、それらの機能を調節し、シナプス伝達の可塑性、記憶・学習に代表される高次脳機能に重要な役割を果たすと考えられている。通常の神経活動状態では、細胞内のＣａ２＋／カルモジュリン、ＣａＭＫＩＩ活性、ホスファターゼ（ＰＰ−１を含む）活性のバランスによってＣａＭＫＩＩの活性状態は平衡状態が保たれている。
【００３８】
さらに、ＣａＭＫＩＩを活性化することにより、ＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸）受容体の移送（エキソサイトーシス）が促進される。ＡＭＰＡ受容体は、中枢神経系での興奮性シナプス伝達を司るグルタミン酸受容体の中でも最も中心的な役割を果たす受容体であり、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４のサブユニットが存在し、４量体を形成することにより機能的なチャネルを形成すると考えられている。ＡＭＰＡ受容体移送が促進されることによって細胞膜上でのＡＭＰＡ受容体の発現が増加し、受容体応答が増強されることによって海馬シナプス伝達が促進される。
従って、ＰＰ−１阻害作用を有し、該作用によりＣａＭＫＩＩを活性化し得る式（Ｉ）の化合物又はその塩を含む本発明の剤（ＰＰ−１阻害剤、ＣａＭＫＩＩ活性化剤）は、ＡＭＰＡ受容体の細胞膜上での発現増強剤として、さらにはシナプス伝達促進剤として有用である。
【００３９】
上述のように、本発明の剤は、シナプス伝達を促進することができるので種々の神経変性疾患、特に認知障害を伴う疾患又は状態の予防又は治療用の剤として有用である。認知障害を伴う疾患又は状態としては、具体的には、認知症（例、老人性認知症、アルツハイマー型認知症、脳血管性認知症、外傷後認知症、脳腫瘍により生じる認知症、慢性硬膜下血腫により生じる認知症、正常圧脳水腫により生じる認知症、髄膜炎後認知症及びパーキンソン型認知症などの種々の疾患により生じる認知症）、非認知症性の認知障害（例、軽度認知障害（ＭＣＩ））、学習又は記憶障害（例、脳発達障害に伴う学習及び記憶障害）などを含む様々の疾患又は状態が挙げられる。さらに本発明の剤は、学習や記憶（例、短期記憶、長期記憶）の向上のために使用することができる。
【００４０】
また、本発明の剤は、「ＰＰ−１阻害作用→ＣａＭＫＩＩ活性化作用→ＡＭＰＡ受容体発現増強作用→海馬シナプス伝達促進作用」というカスケードを駆動することができるので、種々の神経変性疾患、特に認知障害を伴う疾患又は状態の予防薬又は治療薬を開発する為の研究用試薬としても有用である。
【００４１】
本発明の剤は、例えば、医薬として用いられる場合、種々の神経変性疾患の予防又は治療に有用であり得る。本発明の剤を食品として用いることもできるが、その場合には、神経変性疾患を発症する危険性が高い被験体又は当該疾患を発症しないことを切望する被験体が定期的に摂食することで、このような被験体における当該疾患の発症リスクを低減し得る。
【００４２】
本明細書中で用いられる場合、神経変性疾患の「予防」とは、神経変性疾患の症状（認知障害、学習・記憶障害等）を示さない被験体において、該症状が顕在化するのを防ぐことを意味し、「治療」とは、神経変性疾患の症状（認知障害、学習・記憶障害等）を示す被験体において、該症状を軽減すること、あるいは該症状の悪化を防ぐこと又は遅延させることを意味する。
【００４３】
本発明の剤は、式（Ｉ）の化合物又はその塩に加え、任意の担体、例えば医薬又は食品として許容され得る担体を含み得る。このような担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００４４】
本発明の剤はまた、有効成分として、式（Ｉ）の化合物又はその塩が２種以上組み合わされた、又は使用に際して組み合わされ得る、あるいはこのような化合物又はその塩と、他の神経変性疾患の予防又は治療に有用な１以上の別の成分とが組み合わされた併用剤であり得る。このような併用剤は、神経変性疾患を相加的又は相乗的に予防又は治療し得る。
【００４５】
他の神経変性疾患の予防又は治療に有用な成分としては、例えば、ポリフェノール、コエンザイムＱ１、β−シトステロール、イソフラボン、メビニン酸、ビタミンＣ、ビタミンＥ、フラボノイド類、テルペン類、葉酸、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、セスキルペンラクトン、ウロキナーゼ、ナットウキナーゼ、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、硫化プロピル、リンゴペクチン、酢酸、ＥＰＡ、及びＤＨＡ等が挙げられる。
【００４６】
本発明の剤を食品として用いる場合には、食品としては、例えば、一般食品（例えば、パン、乳製品（例、牛乳、ヨーグルト）、菓子、キャンデー、飴、チョコレート、ケーキ、プリン、ゼリー、清涼飲料水、麺類）、健康食品、ダイエタリーサプリメント、並びに厚生労働省の保健機能食品制度に規定される特定保健用食品及び栄養機能食品が挙げられる。該食品は、液状物（水溶性、不溶性）、粉末、顆粒、錠剤、カプセル等の固形物、ゼリー状等の半固形物などの任意の形態であり得る。本発明の剤は水又は所定の水溶液に溶解して用いることができる。このような場合、本発明の剤は溶解補助物（例、リノール酸）、安定化剤を含んでいてもよい。
【００４７】
本発明の剤を食品として用いる場合、その摂取量は、用いる形態（例、液状物、固形物、半固形物）、式（Ｉ）の化合物又はその塩の含有濃度、並びに神経変性疾患の予防又は治療に有用な成分の有無、種類及び量等によって異なり一概に云えないが、通常、式（Ｉ）の化合物又はその塩の単位摂取量（１回又は１日あたりの摂取量）としては、約５ｍｇ〜約５００ｍｇを挙げることができる。
【００４８】
本発明の剤を食品として用いる場合、該食品は、式（Ｉ）の化合物又はその塩を、単位摂取量又はその分割量で含むものであり得る。式（Ｉ）の化合物又はその塩を単位摂取量で含む食品は、式（Ｉ）の化合物又はその塩の単位摂取量を含む、単一の液状物、固形物又は半固形物であり得る。式（Ｉ）の化合物又はその塩を単位摂取量の分割量で含む食品は、１回又は１日あたり、複数個（例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の摂取が推奨される固形物（例、錠剤、カプセル）又は半固形物であり得る。
【００４９】
本発明の剤を食品として用いる場合には、式（Ｉ）の化合物又はその塩の単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填されたもの、あるいは式（Ｉ）の化合物又はその塩の多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填されたものであり得る。式（Ｉ）の化合物又はその塩の単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填された食品としては、例えば、式（Ｉ）の化合物又はその塩の単位摂取量又はその分割量を、通常の包装物（例えば、ＰＴＰ（press through packing）シート、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に別々に包装又は充填したものが挙げられる。このように個別に包装又は充填された食品は、さらに組み合わされて、１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に一緒に包装又は充填されていてもよい。式（Ｉ）の化合物又はその塩の多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填された食品としては、例えば、多数の錠剤又はカプセル剤が区分されることなく１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に包装又は充填されたものが挙げられる。本発明の食品はまた、式（Ｉ）の化合物又はその塩の単位摂取量又はその分割量を、長期間（例えば３日以上、好ましくは７日、１０日、１４日又は２１日以上あるいは１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月以上）の摂取に十分な数で含み得る。
【００５０】
本発明の剤が医薬として用いられる場合、経口投与に好適な医薬は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。
【００５１】
非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な医薬としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該医薬は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００５２】
本発明の剤が医薬として用いられる場合、その投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたりの式（Ｉ）の化合物又はその塩の有効量としては、約５ｍｇ〜約５００ｍｇを挙げることができる。
【００５３】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００５４】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００５５】
（材料と方法）
１．動物
動物に関する取扱いは、全て兵庫医科大学動物実験委員会の認可を受け、ＮＩＨ（国立衛生研究所）の実験動物の管理と使用に関する指針に準拠している。
【００５６】
２．興奮性シナプス後場電位（field excitatory postsynaptic potential (fEPSP)）の測定
雄性Ｗｉｓｔｅｒラット（６週齢）から海馬切片（４００μｍ）を調製した。海馬切片を、ＧＦ１０９２０３Ｘ（１００ｎＭ）及び／又はＫＮ−９３（３μＭ）の存在下及び非存在下、ＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）で１０分間処理した。１０分間のＤＣＰ−ＬＡ処理の前後に、標準の人工脳脊髄液（以下、ＡＣＳＦと略称する）中でシャファー側枝に電気的に刺激を与えること（０．０３Ｈｚ，０．１ミリ秒間）によってＣＡ１領域からのｆＥＰＳＰを記録した。ＡＣＳＦは３４℃、９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２で酸素処理したものを用いた。ＡＣＳＦの組成は以下の通りである
ＡＣＳＦ：117mM NaCl, 3.6mM KCl, 1.2mM NaH2PO4, 1.2mM MgCl2, 2.5mM CaCl2, 25mM NaHCO3及び11.5mM glucose
【００５７】
３．細胞培養
Ｗｉｓｔｅｒラット胎仔（在胎齢、１８日）の脳から海馬を取り出した。解離した海馬細胞を９６ウェルのプレートに播種し、培養液中、５％ＣＯ２及び９５％空気の湿気のある環境下３７℃で培養した。培養液の組成は以下の通りである
培養液：B27(1:50), 2.5mM glutamine, 50μM glutamate, penicillin(最終濃度100U/ml)及びstreptomycin(最終濃度, 0.1mg/ml)を補充したNeurobasal
【００５８】
４．ｉｎ ｓｉｔｕ ＣａＭＫＩＩアッセイ
培養ラット海馬ニューロンにおけるＣａＭＫＩＩ活性を既報に従って測定した(Kanno T.et al, J. Lipid Res. 47:1146-1156, 2006)。培養ニューロンを、ＫＮ−９２又はＫＮ−９３の存在下あるいは非存在下、細胞外液中、３７℃で１０分間、ＤＣＰ−ＬＡで処理した。次いで、細胞を１００μｌのＣａ２＋−ｆｒｅｅリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、３０℃で１５分間、５０μｌの細胞外液(50μg/ml digitonin, 25mM glycerol 2-phosphate, 200μM ATP及び100μM Autocamtide-2 (Calbiochem, San Diego, USA);CaMKIIの合成基質ペプチド)を含有する)中でインキュベートした。上清を回収し、１００℃で５分間煮沸して反応を停止させた。該溶液の一部（２０μｌ）を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）(LC-10ATvp,Shimadzu Co., Kyoto, Japan)にかけた。基質ペプチドのピークと、新しくできた産物のピークが吸光度２１４ｎｍ(SPD-10Avp UV-VIS detector, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)の位置に検出された。各ピークの分子量をｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（ＭＷ１０６０．２）及びｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ（ＭＷ１６７２．９）の標準スペクトルから測定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry；Voyager ST-DER, PE Biosystems Inc., Foster City, USA）での解析によれば、基質のピーク及び新しい産物のピークは、それぞれ分子量１５０８及び分子量１５８８であった。１５８８という分子量が、リン酸化されていない基質タンパク質の分子量（ＭＷ１５０８）にＨＰＯ３（ＭＷ８０）の分子量を加えたものに一致していることから、新しくできた産物のピークがリン酸化された基質タンパク質に対応していることがわかる。リン酸化されていないＣａＭＫＩＩ基質ペプチド、及びリン酸化されているＣａＭＫＩＩ基質ペプチドの面積を測定した（全面積は、ここで使用したＣａＭＫＩＩ基質ペプチドの濃度に相当する）。リン酸化された基質ペプチドの量（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ細胞タンパク）を算出し、ＣａＭＫＩＩ活性の指標として用いた。
細胞外液の組成は以下の通り。
細胞外液;137mM NaCl, 5.4mM KCl, 10mM MgCl2, 5mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA), 0.3mM Na2HPO4, 0.4mM K2HPO4及び20mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid, pH 7.2
【００５９】
５．ＣａＭＫＩＩ活性及びＰＰ−１活性測定の為の無細胞系アッセイ
無細胞系でＣａＭＫＩＩ活性を測定する為には、反応メディウム（２５μｌ，ｐＨ８．０）中、ＤＣＰ−ＬＡの存在下及び非存在下、３５℃で１０分間、合成ＣａＭＫＩＩ基質ペプチド（１０μＭ）をＣａＭＫＩＩ（１．１ｘ１０６Ｕ）(Calbiochem,San Diego, USA)と反応させた。
無細胞系でのＰＰ−１活性を測定する為には、ＣａＭＫＩＩアッセイで用いたのと同じ反応メディウム中、ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ(Sigma)又はＤＣＰ−ＬＡの存在下及び非存在下で、３５℃で１０分間で、合成ＣａＭＫＩＩ基質ペプチド（１０μＭ）をＣａＭＫＩＩ（１．１ｘ１０６Ｕ）(Calbiochem,San Diego,USA)及びＰＰ−１（０．１Ｕ）(Sigma,St. Louis,MO,USA)と反応させた。いずれの反応も１００℃で５分間処理することによって終結させた。各溶液の一部（１０μｌ）をカラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）(COSMOSIL 5C18-AR-II, Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)に注入し、逆相ＨＰＬＣシステムにかけた(LC-10ATvp, Shimadzu)。リン酸化されていないペプチド及びリン酸化されたペプチドを吸光度２１４ｎｍで検出した(SPD-10Avp UV-Vis detector, Shimadzu)。リン酸化された基質ペプチドの量（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ）をＣａＭＫＩＩ活性の指標として用いた。脱リン酸化された基質ペプチドの量（Δｐｍｏｌ／ｍｉｎ）をＰＰ−１活性の指標として用いた。脱リン酸化された基質ペプチドの量はｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎあるいはＤＣＰ−ＬＡの存在下及び非存在下、（ＰＰ−１存在下でのリン酸化された基質ペプチドの量）から（ＰＰ−１非存在下でのリン酸化された基質ペプチドの量）を差し引くことによって求めた。
反応メディウムの組成は以下の通りである。
反応メディウム：40mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid (HEPES)、 5mM Mg-acetate, 0.4mM CaCl2, 0.1mM ATP, 0.1mM EGTA, 1μM calmodulin (Calbiochem, San Diego, USA)
【００６０】
６．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写と翻訳
ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ３サブユニットをコードするｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって合成した。Ｓｅｒ８３１をＡｌａで置き換え、ＣａＭＫＩＩリン酸化部位を欠いている変異ＧｌｕＲ１サブユニットを調製した［ｍＧｌｕＲ１（Ｓ８３１Ａ）］。卵巣から手作業で分離したアフリカツメガエルの卵母細胞に、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ３サブユニット、あるいはｍＧｌｕＲ１（Ｓ８３１Ａ）サブユニットの種々の組み合わせでｍＲＮＡを注入し、１８℃でインキュベートした。
【００６１】
７．２電極ボルテージクランプ測定
ｍＲＮＡを注入して２〜３日後に卵母細胞を測定チャンバーに移し、標準の両生類用リンゲル液(frog Ringer's solution)で連続的に２２℃表面灌流した。１０分間のＤＣＰ−ＬＡ処理の前後で１０分間隔でカイニン酸（５０μＭ）を卵母細胞にバスアプライ(bath-apply)した。全ての細胞膜電流をGeneClamp-500 amplifier (Axon Instruments, Inc., Foster City, CA, USA)で測定・記録し、ｐＣｌａｍｐソフトウェア(version 6.0.3, Axon Instruments, Inc.)を用いてコンピュータ解析した。
標準の両生類用リンゲル液の組成は以下の通りである。
両生類用リンゲル液;115mM NaCl, 2mM KCl, 1.8mM CaCl2,及び5mM HEPES, pH 7.0
【００６２】
８．ＡＭＰＡ受容体の移送の解析
ラット海馬切片（雄性、Ｗｉｓｔａｒ，６ｗ）（４００μｍ）を標準ＡＣＳＦ中、ＤＣＰ−ＬＡの存在下及び非存在下で、２０分、３４℃でインキュベートした。該インキュベートは、ＧＦ１０９２０３Ｘ（１００ｎＭ）、ＫＮ−９３（３μＭ）及びＨ−８９（１μＭ）の存在下及び非存在下に、あるいはＤＣＰ−ＬＡ処理の２０分前から酸化フェニルアルシン（ＰＡＯ）（３μＭ）の存在下及び非存在下に、あるいはＤＣＰ−ＬＡ処理の１２ｈｒ前からボツリヌス毒素Ａ（ＢｏＴＸ−Ａ）（０．１Ｕ／ｍｌ）の存在下及び非存在下に行った。
次いで、切片を、氷冷した、１％プロテアーゼインヒビターカクテルを含むミトコンドリアバッファー中で音波処理によってホモジナイズし、続いて該ホモジネートを遠心分離した(3,000rpm, 5min, 4℃)。上清を遠心分離(11,000rpm, 15min, 4℃)し、さらに回収した上清を超遠心分離(100,000rpm, 60min, 4℃)し、細胞質分画と膜分画に分離した。
各分画のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット(Pierce, Rockford, IL, USA)を用いて測定した。細胞膜分画のタンパク質を１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有するミトコンドリアバッファーに再懸濁した。各分画のタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、ポリフッ化ビニリデン(polyvinylidene difluoride)膜に転写した。５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴＴＢＳ(150mM NaCl, 0.1% Tween20及び20mM Tris, pH7.5)でブロッキングをした後、転写した膜をＧｌｕＲ１サブユニットに対する抗体(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA)、ＧｌｕＲ２サブユニットに対する抗体(Chemicon, Temecula, CA, USA)、カドヘリンに対する抗体(Sigma, St Louis, MO, USA)及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に対する抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)と反応させ、次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体又はヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。免疫反応性を、ＥＣＬ ｋｉｔ(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)で検出し、chemiluminescence detection system (FUJIFILM, Tokyo, Japan)を用いて可視化した。シグナル密度をImage Gauge software (FUJIFILM)で測定した
ミトコンドリアバッファーの組成は以下の通りである。
ミトコンドリアバッファー；210mM mannitol, 70mM sucrose及び1mM EDTA, 10mM HEPES, pH 7.5
【００６３】
９．免疫沈降及びウェスタンブロット解析
ラット海馬切片（雄性 Ｗｉｓｔａｒ，６ｗ）（４００μｍ）を溶解用溶液で溶解した。得られたライセートを遠心分離した後、抽出物（タンパク質換算で５００μｇ）を抗ＧｌｕＲ１サブユニット抗体(Upstate Biotechnology)又は抗ＧｌｕＲ２サブユニット抗体(Chemicon)の存在下、４℃で一晩インキュベートした。次いで、２０μｌのプロテインＧアガロース(GE healthcare)を該抽出物に添加し、４℃で一晩インキュベートした。ペレットを２回ＰＢＳで洗浄し、４０μｌのＳＤＳサンプルバッファー(0.2mM Tris-HCl, 0.04% SDS, 20% glycerol, pH 6.8)で溶解した。５分間煮沸した後、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写した膜を５％ＢＳＡでブロッキングし、ＧｌｕＲ１サブユニットに対する抗体(Upstate Biotechnology)、ＧｌｕＲ２サブユニットに対する抗体(Chemicon)及びＧｌｕＲ３サブユニットに対する抗体(Chemicon)で反応させ、次いでＨＲＰをコンジュゲートしたヤギ抗ＩｇＧ抗体又はヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で反応させた。免疫反応性はＥＣＬ ｋｉｔ(GE Healthcare)で検出した。
溶解用溶液の組成は以下の通りである。
溶解用溶液：0.1% Tween20, 0.1% SDS, 20mM Tris-HCl, 150mM NaCl及び1% プロテアーゼインヒビターカクテル
【００６４】
１０．統計的解析
統計的解析は、unpaired t-test、Fisher's Protected Least Significant Difference (PLSD) test及びone-way analysis of variance（ＡＮＯＶＡ）を用いて行った。
【００６５】
実施例１：ＤＣＰ−ＬＡの海馬シナプス伝達促進作用におけるＣａＭＫＩＩの役割
ＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）はラット海馬切片のＣＡ１領域から記録されるｆＥＰＳＰの傾きにおいて、一過的な急増を誘導することが報告されている（Yaguchi, T. et al., Mol. Brain Res. 133:320-324, 2005）。約２００％の持続的増大に続いて、最大で、基準レベルのおよそ９００％にまで到達する（図１）。ＤＣＰ−ＬＡによるｆＥＰＳＰ傾きの一過的な急増はＰＫＣ阻害剤であるＧＦ１０９２０３Ｘ（１００ｎＭ）では部分的にしか阻害されなかったが、持続的増大についてはこの阻害剤で阻害された（図１）。活性化ＣａＭＫＩＩの阻害剤であるＫＮ−９３（３μＭ）は、ＤＣＰ−ＬＡによるｆＥＰＳＰ傾きの一過的な急増を基準レベルの２００％程度にまで抑制し、さらにＧＦ１０９２０３Ｘ（１００ｎＭ）を加えることによってｆＥＰＳＰの傾きの増加は完全に阻害された（図１）。
この結果より、ＤＣＰ−ＬＡによって誘導される海馬シナプス伝達促進作用は、ＣａＭＫＩＩ及びＰＫＣの両方によって仲介され、特にＣａＭＫＩＩが大きく寄与していることが示された。
【００６６】
実施例２：ＤＣＰ−ＬＡのＣａＭＫＩＩに及ぼす作用
実施例１でＤＣＰ−ＬＡの海馬シナプス伝達促進作用にＣａＭＫＩＩが大きく寄与していることが明らかになったので、次に、ＤＣＰ−ＬＡがＣａＭＫＩＩそのものを活性化しているのかどうかを調べた。
ＣａＭＫＩＩ活性は、逆相ＨＰＬＣを用いて測定した。培養ラット海馬ニューロンを用いた実験系において、ＣａＭＫＩＩ活性の基準値は、７．２±０．３ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇタンパク（図２）であった。ＤＣＰ−ＬＡはＣａＭＫＩＩ活性を濃度（０．０１−１μＭ）依存的に増強した。このＤＣＰ−ＬＡのＣａＭＫＩＩ活性の促進効果は活性型ＣａＭＫＩＩの阻害剤であるＫＮ−９３（３μＭ）で顕著に阻害されたが、不活性型ＣａＭＫＩＩの阻害剤であるＫＮ−９２（３μＭ）では阻害されなかった（図２）。この結果より、ＤＣＰ−ＬＡがＣａＭＫＩＩを活性化し得ることが示された。
次に、無細胞系でＤＣＰ−ＬＡがＣａＭＫＩＩ活性を促進するか否かを検討した。驚くべきことに、無細胞系では、ＤＣＰ−ＬＡ（１００μＭ）によるＣａＭＫＩＩ活性の促進は観察されなかった（図３Ａ）。この結果より、ＤＣＰ−ＬＡが直接ＣａＭＫＩＩを活性化しているのではなく、細胞内に存在する因子に作用することによってＣａＭＫＩＩを活性化していることが考えられた。
ＣａＭＫＩＩはその自己リン酸化を介して活性化され、ＰＰ−１によって触媒される脱リン酸化によって不活性化される。そこで、ＤＣＰ−ＬＡにＰＰ−１に対する作用について調べた。
無細胞系でのＰＰ−１アッセイにおいて、ＰＰ−１の阻害剤であるミクロシスチン（０．１及び１μＭ）は、顕著にＰＰ−１活性を低下させた（図３Ｂ）。ＤＣＰ−ＬＡもまた、ミクロシスチンよりもその作用は弱いものの、濃度（１−１００μＭ）依存的に有意にＰＰ−１活性を低下させた（図３Ｂ）。
これらの結果は、ＤＣＰ−ＬＡはＰＰ−１を阻害することによってＣａＭＫＩＩを活性化するという作用機序を示唆している。
【００６７】
実施例３：ＤＣＰ−ＬＡのＡＭＰＡ受容体応答性に及ぼす作用
ＣａＭＫＩＩは、ＡＭＰＡ受容体の応答性を増強することが知られている。そこでＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ３サブユニットを種々の組合わせで発現している卵母細胞でのＡＭＰＡ受容体応答におけるＤＣＰ−ＬＡの効果を調べた。
２電極ボルテージクランプ測定では、ＡＭＰＡ受容体のアゴニストであるカイニン酸を添加することで、一時的に−６０ｍＶの電位となる（図４Ａ−Ｉ）。ＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）は、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ１／ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ１／ＧｌｕＲ３及びＧｌｕＲ１／ＧｌｕＲ２／ＧｌｕＲ３サブユニットで構成されるＡＭＰＡ受容体に対して、段階的に上昇し且つ持続する電流の増強作用を誘導した。ＤＣＰ−ＬＡで１０分間処理した後、７０分経過した時点でそれぞれ基準レベルの１９３±１９％、１５７±１０％、１３６±８％、１３４±６％及び１４１±７％に達した。いずれも活性型ＣａＭＫＩＩの阻害剤であるＫＮ−９３（３μＭ）によって顕著に阻害された（Ｐ＜０．００１；ＫＮ−９３非存在下でのＤＣＰ−ＬＡの効果と比較して；Fisher's PLSD test）（図４Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ）。対照的に、ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ２／ＧｌｕＲ３サブユニットで構成されるＡＭＰＡ受容体に対しては、ＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）では、増強作用は殆ど見られないか、あるいは全く見られなかった（図４Ｂ、Ｅ）。
これらの結果は、ＤＣＰ−ＬＡによって誘導されるＡＭＰＡ受容体応答性の増強作用にはＧｌｕＲ１サブユニットが必要であること、その増強作用はＣａＭＫＩＩ依存的であることを示唆している。
ＧｌｕＲ１サブユニットには、Ｓｅｒ８３１のＣａＭＫＩＩリン酸化部位が含まれている。ＡＭＰＡ受容体応答性におけるＤＣＰ−ＬＡの増強効果がＧｌｕＲ１サブユニットのＣａＭＫＩＩによるリン酸化によるものであるのか否かを知るために、ＣａＭＫＩＩリン酸化部位を欠失している変異型のＧｌｕＲ１ ＡＭＰＡ受容体［ｍＧｌｕＲ１（Ｓ８３１Ａ）受容体］を卵母細胞に発現させた。ＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）は、ｍＧｌｕＲ１（Ｓ８３１Ａ）受容体に対してもカイニン酸によって誘導される電流を増強した（図４Ｉ）。この結果は、ＤＣＰ−ＬＡがＧｌｕＲ１サブユニットのＣａＭＫＩＩによるリン酸化に依存しない作用機序によってＡＭＰＡ受容体応答性を増強していることを示唆している。
【００６８】
実施例４：ＤＣＰ−ＬＡのＡＭＰＡ受容体のエキソサイトーシスに及ぼす作用
上記の結果より、ＤＣＰ−ＬＡによって活性化されたＣａＭＫＩＩが、ＤＣＬＰ−ＬＡによって誘導されるＡＭＰＡ受容体応答性の増強作用を担うＡＭＰＡ受容体の細胞膜上での発現における増加に貢献していることが考えられた。そこで、ＡＭＰＡ受容体の細胞膜上での発現に及ぼすＤＣＰ−ＬＡの作用を調べた。
ラット海馬切片から得られたライセートを抗ＧｌｕＲ１サブユニット抗体又は抗ＧｌｕＲ２サブユニット抗体で免疫沈降させ、免疫沈降物（ＧｌｕＲ１ ＩＰ、ＧｌｕＲ２ ＩＰ）を用いてウェスタンブロット解析を行った。いずれの免疫沈降物においても、抗ＧｌｕＲ１サブユニット抗体及び抗ＧｌｕＲ２サブユニット抗体に対して免疫応答性であるシグナルが検出されたが、抗ＧｌｕＲ３サブユニット抗体に対してはシグナルが観察されなかった（図５Ａ）。この結果は、ＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットが、ラットの海馬で発現しているＡＭＰＡ受容体を形成することを示唆している。したがって、本発明者は、ＡＭＰＡ受容体の移送におけるＤＣＰ−ＬＡの効果を調べるために、ＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットに注目した。
ラット海馬切片から調製されたライセートを超遠心分離によりペレットと上清の２つの画分に分離した。細胞質マーカーＬＤＨに対する抗体（抗ＬＤＨ抗体）、及び細胞膜マーカーであるカドヘリンに対する抗体（抗カドヘリン抗体）に対する免疫応答性のシグナルがそれぞれ上清及びペレット中に検出された（図５Ｂ）。この結果より、上清画分及びペレット画分は、それぞれ細胞質成分及び細部膜成分で構成されていることを示唆している。ＤＣＰ−ＬＡで処理していない海馬切片から得られたライセートでは、細胞質画分及び細胞膜画分の両方の画分で、同程度のＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットに対する免疫応答シグナルが観察された（図５Ｃ、Ｄ）。ＤＣＰ−ＬＡ処理した海馬切片から得られたライセートでは、釣鐘状に濃度（１ｎＭ−１μＭ）依存的な様式で細胞膜画分においてシグナルを増強した（図５Ｃ、Ｄ）。このことは、ＤＣＰ−ＬＡがＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットの細胞膜上での発現を増加させていることを示している。
ＤＣＰ−ＬＡの効果は、活性型のＣａＭＫＩＩの阻害剤であるＫＮ−９３（３μＭ）で阻害されたが、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の阻害剤であるＧＦ１０９２０３Ｘ（１００ｎＭ）やＨ−８９（１μＭ）では阻害されなかった（図５Ｃ、Ｄ）。このことは、ＤＣＰ−ＬＡがＣａＭＫＩＩ経路を介して、ＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットの細胞膜から細胞質へのエンドサイトーシスを阻害することによって該サブユニットの細胞膜上での発現を増加させていることを示している。
さらにＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）によって誘導されるＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットの細胞膜上での発現増加は、エキソサイトーシスの阻害剤であるＢｏＴＸ−Ａ（０．１Ｕ／ｍｌ）によって阻害され、エンドサイトーシスの阻害剤であるＰＡＯ（３μＭ）では何の作用も示さなかった（図５Ｃ、Ｄ）。
以上の結果より、ＤＣＰ−ＬＡがＣａＭＫＩＩを活性化することによってＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットのエキソサイトーシスを刺激し、それによって細胞膜上でのＡＭＰＡ受容体の発現を増加させている、という作用機序が明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
ＰＰ−１を抑制してＣａＭＫＩＩを活性化することによって、ＡＭＰＡ受容体の細胞膜への移行を促進し、細胞膜上でのＡＭＰＡ受容体発現数増加に伴う海馬シナプス伝達を促進させることができる本発明の剤は、既存の薬物とは異なる作用機序を有する、海馬シナプス伝達を促進することが有益な疾患（例えば神経変性疾患）の予防・治療薬の開発に繋がる。さらに、本発明の剤は、そのような疾患の予防・治療薬の開発に有用なツールとなり得る研究用試薬として提供され得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロテインホスファターゼ−１の阻害剤、該阻害剤を含むＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化剤、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸受容体の発現増強剤及びシナプス伝達促進剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、認知症が世界的に医療上の大きな問題となっている。認知症は、記憶障害及び判断力の低下を中心にした多種の症状を伴う疾患であるが、その原因となる病気によって症状及びその経過は異なる。しかし、いずれの場合も、患者の生活の質を著しく損なうという点で共通している。また、患者の家族をはじめとする介護者にも多大な労苦を強いるという事実を考えたとき、認知症は社会的にたいへん重大な問題であるといえよう。寿命の長期化による高齢者人口の増加が、認知症患者の増加と関係しているため、日本では今後更に認知症患者が増加すると予測されている。また、認知症には分類されない何らかの認知障害を患う人も多い。
【０００３】
老化やアルツハイマー病等の神経変性疾患に伴う認知症は、脳萎縮を引き起こす脳神経細胞死（アポトーシス）が主な原因であり、特に、海馬が萎縮していく。脳神経細胞のアポトーシスは大きく２つの経路−酸化ストレスと小胞体ストレスによって誘導される。
認知機能を改善する手段として、上記した脳神経細胞のアポトーシスを抑制する方法、シナプス伝達を促進する方法等が挙げられる。シナプス伝達を促進する方法としては、（１）シナプス前終末からの神経伝達物質の放出を刺激する、（２）神経伝達物質の分解を抑制する、（３）神経伝達物質の再吸収を抑制する、（４）シナプス後細胞に発現する神経伝達物質受容体の反応性を増大する、等の方法が検討されている。
【０００４】
一方、近年、海馬シナプス伝達の促進機構が解明されつつある。例えば、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）の活性化がα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体の（シナプス）細胞膜への移送を促進すること、それによって、シナプス上でのＡＭＰＡ受容体の発現量が増加し、応答性が高まり海馬シナプス伝達が促進されること、等が報告されている（非特許文献１）。また、プロテインホスファターゼ−１（ＰＰ−１）を抑制することによりＣａＭＫＩＩが活性化すること、ＰＰ−１は学習や記憶に関連していることが報告されている（非特許文献２）。
【０００５】
本発明者は、体内での代謝の遅延を可能とし、且つシナプス伝達の安定なＬＴＰ（long-term potentiation）様増強を持続できる、シナプス伝達効率の長期増強作用を有する化合物として、８−（２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル）−オクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）を見出している（特許文献１）。ＬＴＰは、例えばアルツハイマー病などの種々の神経及び精神疾患の発症に関与すると考えられ、従って、ＬＴＰ発現を誘導する物質は、認知症を含むこれらの神経及び精神疾患の治療薬又は予防薬となる可能性を有する。
【０００６】
ＤＣＰ−ＬＡについてはまた、幾つかの報告がなされている。例えば、ＤＣＰ−ＬＡが選択的かつ直接的にＰＫＣ−εを活性化すること（非特許文献３）、ＤＣＰ−ＬＡが老化促進マウスの認知機能障害を改善すること（非特許文献４）、ＤＣＰ−ＬＡが海馬神経細胞からのγアミノ酪酸の放出を増加させること（非特許文献５）、ＤＣＰ−ＬＡがアミロイドβペプチドあるいはスコポラミン処理ラットの認知機能障害を改善すること（非特許文献６）、ＤＣＰ−ＬＡがグルタミン酸作動性シナプス前細胞に発現するα７ニコチン性アセチルコリン受容体を標的として海馬シナプス伝達を促進させること（非特許文献７）が報告されている。さらに、近年ＤＣＰ−ＬＡに酸化ストレスによって誘導される神経細胞死を抑制する作用があることが報告されている（特許文献２）。
しかしながら、ＤＣＰ−ＬＡのシナプス伝達促進作用の詳細なメカニズムは未だ解明されていない。該メカニズムを解明し、ＤＣＰ−ＬＡの作用点を明らかにすることは、アルツハイマー病をはじめとした種々の神経変性疾患に対する、既存の薬物とは異なる作用機序を有する予防・治療薬の開発に繋がる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０２／５００１３号
【特許文献２】特開２００８−１４３８１９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Rongo, C., Bioessays, 2002, 24:223-233
【非特許文献２】Genoux, D., Nature, 2002, 418:970-975
【非特許文献３】Kanno Tら，J Lipid Res., 2006, 47(6):1146-56
【非特許文献４】Yaguchi Tら，Neuroreport, 2006, 23;17(1):105-8.
【非特許文献５】Kanno Tら，J Neurochem., 2005, 95(3):695-702.
【非特許文献６】Nagataら T, Psychogeriatrics, 2005, 5:122-126.
【非特許文献７】Yamamotoら, Neuroscience 2005, 130(1):207-213.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、プロテインホスファターゼ−１の阻害剤、該阻害剤を含むＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化剤、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸受容体の発現増強剤及びシナプス伝達促進剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩にＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（以下、単にＣａＭＫＩＩと略する場合がある）を活性化する作用があることを見出し、さらに該ＣａＭＫＩＩ活性化作用がプロテインホスファターゼ−１（以下、単にＰＰ−１と略する場合がある）阻害作用に由来することを見出した。ＣａＭＫＩＩの活性化を通してα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（以下、単にＡＭＰＡと略する場合がある）受容体の細胞膜への移行を促進し、細胞膜上でのＡＭＰＡ受容体発現数増加に伴う海馬シナプス伝達の促進を確認して本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の通りである。
［１］式（Ｉ）
【００１１】
【化１】
【００１２】
〔式中、
Ｒは、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルであり、１，２−シクロプロピレンは、３位の炭素原子に適切な置換基を有してもよく、
Ｘは、単結合又はアルキレンであり、
炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと１０〜２５である。〕
で表される、１以上のシクロプロパン環を有するカルボン酸化合物又はその塩を含む、プロテインホスファターゼ−１（ＰＰ−１）阻害剤。
［２］Ｒが、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルである、上記［１］記載の剤。
［３］Ｒが
【００１３】
【化２】
【００１４】
〔式中、
Ｒ’は、水素又はアルキルであり、
Ｙは、単結合又はアルキレンであり、
Ａは、１，２−シクロプロピレン又はビニレンであり、
ｍは、０〜５の整数であり、
但し、ｍが２〜５のとき、Ａは、同一又は異なっている。〕
である、上記［２］記載の剤。
［４］Ｒが
【００１５】
【化３】
【００１６】
から選択される基であり、
Ｘが−（ＣＨ２）ｎ−である
〔式中、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは各々整数であり、ｐとｎの合計は６〜２１であり、ｑ、ｒ、ｎの合計は４〜１９である。〕、
上記［３］記載の剤。
［５］Ｒが
【００１７】
【化４】
【００１８】
から選択される基であり、
Ｘが−（ＣＨ２）ｎ−である
〔式中、ｓ、ｎは各々整数であり、その合計は３〜１８である。〕、
上記［４］記載の剤。
［６］ｓが４であり、ｎが７である、上記［５］記載の剤。
［７］該カルボン酸化合物又はその塩が、８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸又はその塩である、上記［１］記載の剤。
［８］研究用試薬である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の剤。
［９］上記［１］〜［８］のいずれかに記載の剤を含む、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）の活性化剤。
［１０］上記［９］記載の剤を含む、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体の発現増強剤。
［１１］上記［１０］記載の剤を含む、シナプス伝達促進剤。
［１２］式（Ｉ）
【００１９】
【化５】
【００２０】
〔式中、
Ｒは、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルであり、１，２−シクロプロピレンは、３位の炭素原子に適切な置換基を有してもよく、
Ｘは、単結合又はアルキレンであり、
炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと１０〜２５である。〕
で表される、１以上のシクロプロパン環を有するカルボン酸化合物又はその塩を含む、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化剤。
［１３］Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化が、プロテインホスファターゼ−１を阻害することによるものである、上記［１２］記載の剤。
［１４］式（Ｉ）
【００２１】
【化６】
【００２２】
〔式中、
Ｒは、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルであり、１，２−シクロプロピレンは、３位の炭素原子に適切な置換基を有してもよく、
Ｘは、単結合又はアルキレンであり、
炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと１０〜２５である。〕
で表される、１以上のシクロプロパン環を有するカルボン酸化合物又はその塩を含む、
α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体の発現増強剤。
［１５］α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体の発現増強が、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化によるものである、上記［１４］記載の剤。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の剤は、ＰＰ−１を抑制してＣａＭＫＩＩを活性化することによって、ＡＭＰＡ受容体の細胞膜への移行を促進し、細胞膜上でのＡＭＰＡ受容体発現数増加に伴う海馬シナプス伝達を促進させることができる。すなわち、既存の薬物とは異なる作用機序を有する、海馬シナプス伝達を促進することが有益な疾患（例えば神経変性疾患）の予防・治療薬の開発に繋がる。既存の薬物とは異なる作用機序を有するので、既存の薬物において問題となっていたような副作用を回避することができる。また、本発明の剤は、そのような予防・治療薬の開発に有用なツールとなり得る研究用試薬として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ＧＦ１０９２０３Ｘ（１００ｎＭ）及び／又はＫＮ−９３（３μＭ）の存在下及び非存在下で、ＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）で１０分間処理した前後の、ラット海馬切片のＣＡ１領域から記録されたｆＥＰＳＰを示すグラフである。上段は電位のチャート図を示している。グラフ中、各ポイントはＥＰＳＰ（％基準傾き）の平均値（±ＳＥＭ）を示している（ｎ＝８）。縦軸は、横軸は経過時間(分)を示す。ｆＥＰＳＰ：興奮性シナプス後場電位
【図２】図２は、ＫＮ−９２（３μＭ）又はＫＮ−９３（３μＭ）の存在下又は非存在下、所定濃度のＤＣＰ−ＬＡで処理した（あるいは処理していない）培養海馬ニューロンにおけるＣａＭＫＩＩ活性を測定した結果を示す図である。上段は、ＨＰＬＣのプロファイルを示す図である。ＨＰＬＣのプロファイルにおいて、「Ｓ」及び「Ｐ」は、それぞれリン酸化されていない基質及びリン酸化された基質を示している。縦軸は吸光度を、横軸は保持時間(分)を示す。下段は、リン酸化された基質ペプチド（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ細胞タンパク質）をＣａＭＫＩＩ活性の指標として用いて作成したグラフである。グラフ中、各カラムはＣａＭＫＩＩ活性の平均値（±ＳＥＭ）（ｎ＝１６）を表している。P value, unpaired t-test
【図３】図３は、無細胞系でＣａＭＫＩＩ活性及びＰＰ−１活性を測定した結果を表す図である（Ａ：ＣａＭＫＩＩ活性、Ｂ：ＰＰ−１活性）。Ａ及びＢのいずれも上段はＨＰＬＣのプロファイルを示す図である。ＨＰＬＣプロファイルにおいて、「Ｓ」及び「Ｐ」は、それぞれリン酸化されていない基質及びリン酸化された基質を示している。縦軸は吸光度を、横軸は保持時間(分)を示す。Ａ（下段）：リン酸化された基質ペプチド（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ細胞タンパク質）をＣａＭＫＩＩ活性の指標として用いて作成したグラフ。グラフ中、各カラムはＣａＭＫＩＩ活性の平均値（±ＳＥＭ）（ｎ＝５）を表している。Ｂ（下段）：脱リン酸化された基質ペプチド（Δｐｍｏｌ／ｍｉｎ）をＰＰ−１活性の指標として用いて作成したグラフ。グラフ中、各カラムはＰＰ−１活性の平均値（±ＳＥＭ）（ｎ＝８）を表している。脱リン酸化された基質ペプチドの量はｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ（ＭＣ）あるいはＤＣＰ−ＬＡの存在下及び非存在下、（ＰＰ−１存在下でのリン酸化された基質ペプチドの量）から（ＰＰ−１非存在下でのリン酸化された基質ペプチドの量）を差し引くことによって求めた。P value, unpaired t-test
【図４】ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ３サブユニット、あるいはｍＧｌｕＲ１（Ｓ８３１Ａ）サブユニットの種々の組合わせで構成されるＡＭＰＡ受容体をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた。各卵母細胞に、ＫＮ−９３（３μＭ）の存在下及び非存在下、１０分間のＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）処理の前後にカイニン酸（５０μＭ）を１０秒間、１０分間隔でバスアプライした。保持電位−６０ｍＶで、ＤＣＰ−ＬＡ処理の１０分前から処理後７０分まで電流を測定し記録した。図４は各卵母細胞における電流測定の結果を示すグラフである。併せて、電流測定のチャート図を示す。カイニン酸の適用はチャート図中に横棒で示した。グラフ中、各点は基準となる振幅（−１０分の時点での振幅）に対する平均値（±ＳＥＭ）％（ｎ＝６−１１）を表している。縦軸は電流振幅（％基準値）、横軸は経過時間(分)を示す。
【図５】Ａ：ラット海馬切片からのライセートを抗ＧｌｕＲ１サブユニット抗体で免疫沈降したもの（ＧｌｕＲ１ ＩＰ）あるいは抗ＧｌｕＲ２サブユニット抗体で免疫沈降したもの（ＧｌｕＲ２ ＩＰ）について、ＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットに対する抗体でウェスタンブロット解析を行った結果を示す図である。Ｂ：抗カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）抗体及び抗ＬＤＨ抗体を用いて、海馬切片からのライセートから分離した細胞質画分（Ｃ）及び細胞膜画分（Ｍ）について行ったウェスタンブロット解析の結果を示す図である。Ｃ：ＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットに対する抗体を用いて、海馬切片［ＧＦ１０９２０３Ｘ（ＧＦ）（１００ｎＭ）、ＫＮ−９３（３μＭ）、Ｈ−８９（１μＭ）、ＰＡＯ（３μＭ）又はＢｏＴＸ−Ａ（０．１Ｕ／ｍｌ）の存在下又は非存在下に、所定の濃度のＤＣＰ−ＬＡで処理した、あるいは未処理の］からのライセートから分離した細胞質画分（Ｃ）及び細胞膜画分（Ｍ）について行ったウェスタンブロット解析の結果を示す図である。Ｄ：Ｃの結果を用いてグラフ化したものである。グラフ中、各カラムは、ＧｌｕＲ１又はＧｌｕＲ２サブユニットのシグナル強度について、全細胞におけるシグナル強度に対する細胞膜画分におけるシグナル強度の比を平均値（±ＳＥＭ）で表したものである（ｎ＝４）。P value, one-way ANOVA
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書中で用いられる場合、Ｒにおけるアルキルは直鎖又は分岐鎖であり、当該アルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、エイコサニル、ドコサニルなどが挙げられる。アルキルは、炭素鎖中に１，２−シクロプロピレンを、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよい。アルキルがｎ−ペンチルの場合に１，２−シクロプロピレンが炭素鎖中に存在すると、例えば、１，２−シクロプロピレンがｎ−ペンチルの２位と３位の炭素原子の間に存在している場合には２−（２−プロピルシクロプロパン−１−イル）エチルを意味する。２以上の１，２−シクロプロピレンが存在していてもよい。アルキルがｎ−ペンチルの場合にシクロプロピレンが鎖末端に存在すると、シクロプロピルがｎ−ペンチルの末端炭素原子（５位の炭素原子）に存在する場合には５−シクロプロピルペンタン−１−イルを意味する。本発明におけるアルキルは、炭素鎖中に１，２−シクロプロピレンを、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有するアルキル（例えば、２−（２−（３−シクロプロピルプロピル）−シクロプロパン−１−イル）エチル）を包含する。炭素鎖中に１，２−シクロプロピレンを、鎖末端にシクロプロピルを有するＲでのアルキルの例としては、好ましくは、オクチル、（２−ペンチルシクロプロパン−１−イル）メチル、（２−（（２−エチル−シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロパン−１−イル）メチル、（２−（（２−（（２−ペンチル−シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロパン−１−イル）メチル）−シクロプロパン−１−イル）メチル、（２−（（２−ペンチル−シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロパン−１−イル）メチルが挙げられ、オクチル、（２−ペンチルシクロプロパン−１−イル）メチルが特に好ましい。
【００２６】
Ｒにおけるアルケニルは直鎖又は分岐鎖であり、当該アルケニルとしては、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、sec−ブテニル、tert−ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、エイコセニル、ドコセニル、ブタジエニル、ペンタジエニル、ヘキサジエニル、ヘプタジエニル、オクタジエニル、ノナジエニル、デカジエニル、ウンデカジエニル、ドデカジエニル、トリデカジエニル、テトラデカジエニル、ペンタデカジエニル、ヘキサデカジエニル、ヘプタデカジエニル、オクタデカジエニル、エイコサジエニル、ドコサジエニル、ヘキサトリエニル、ヘプタトリエニル、オクタトリエニル、ノナトリエニル、デカトリエニル、ウンデカトリエニル、ドデカトリエニル、トリデカトリエニル、テトラデカトリエニル、ペンタデカトリエニル、ヘキサデカトリエニル、ヘプタデカトリエニル、オクタデカトリエニル、エイコサトリエニル、ドコサトリエニル、オクタテトラエニル、ノナテトラエニル、デカテトラエニル、ウンデカテトラエニル、ドデカテトラエニル、トリデカテトラエニル、テトラデカテトラエニル、ペンタデカテトラエニル、ヘキサデカテトラエニル、ヘプタデカテトラエニル、オクタデカテトラエニル、エイコサテトラエニル、ドコサテトラエニルなどが挙げられる。アルケニルは、炭素鎖中に１，２−シクロプロピレンを、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよい。アルケニルが１−ペンテニルの場合に１，２−シクロプロピレンが炭素鎖中に存在すると、例えば、１，２−シクロプロピレンが１−ペンテニルの２位と３位の炭素原子の間に存在する場合には２−（２−プロピルシクロプロパン−１−イル）エテニルを意味する。２以上の１，２−シクロプロピレンが存在していてもよい。アルケニルが１−ペンテニルの場合にシクロプロピルが鎖末端に存在すると、シクロプロピルが１−ペンテニルの末端炭素原子（５位の炭素原子）に存在する場合には５−シクロプロピル−１−ペンテニルを意味する。本発明におけるアルケニルは、炭素鎖中に１，２−シクロプロピレンを、鎖末端にシクロプロピルを有するアルケニル（例えば、２−（２−（３−シクロプロピルプロピル）シクロプロパン−１−イル）エテニル）を包含する。炭素鎖中に１，２−シクロプロピレンを、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有するＲでのアルケニルは、好ましくはオクテニルである。
【００２７】
Ｒにおける１，２−シクロプロピレンは、アルキルなどの適切な置換基を３位の炭素原子に有していてもよい。Ｒでの１，２−シクロプロピレンの３位の炭素原子でのアルキルの例としては、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、tert−ペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
【００２８】
Ｘにおけるアルキレンは直鎖又は分岐鎖であり、当該アルキレンとしては、メチレン、エチレン、プロピレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン、オクタメチレン、ノナメチレン、デカメチレン、ウンデカメチレン、ドデカメチレン、トリデカメチレン、テトラデカメチレン、ペンタデカメチレン、ヘキサデカメチレン、ヘプタデカメチレン、オクタデカメチレン、ノナデカメチレン、エイコサメチレンなどが挙げられる。ヘプタメチレン、トリメチレン、テトラメチレンが好ましい。
【００２９】
本発明の式（Ｉ）の化合物では、炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと、１０〜２５、好ましくは１８〜２２であり得る。ｐ、ｑ、ｒ、ｍ、ｎ、ｓは各々、整数（０を含む）である。
【００３０】
例えば、式（Ｉ）の化合物は、以下の構造式を有する８−（２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル）−オクタン酸（本明細書中、必要に応じてＤＣＰ−ＬＡと省略）であり得る。
【００３１】
【化７】
【００３２】
あるいは、式（Ｉ）の化合物としては、例えば、８−（２−（２−（Ｚ）−オクテニル）シクロプロピル）オクタン酸、８−（（２−オクチル）シクロプロピル）オクタン酸、８−（２−（（２−（（２−エチル−シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロピル）オクタン酸、８−（２−（（２−（（２−（（２−ペンチル−シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロピル）ブタン酸、８−（２−（（２−（（２−ペンチル−シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロパン−１−イル）メチル）シクロプロピル）ペンタン酸が挙げられる。
【００３３】
式（Ｉ）の化合物は、不斉炭素原子や二重結合に起因する１以上の立体異性体（例えば、光学異性体、幾何異性体）を含んでいてもよいことに注意されるべきであり、このような異性体及びそれらの混合物の全てが本発明の範囲に含まれる。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物は、例えば、ＷＯ０２／５００１３で示される方法によって製造できる。式（Ｉ）の化合物はまた、天然物から抽出されたものであってもよい。
【００３５】
式（Ｉ）の化合物の塩は、特に限定されないが、医薬又は食品として許容され得る塩が好ましく、例えば無機塩基（例、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属；アルミニウム、アンモニウム）、有機塩基（例、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン）、無機酸（例、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸）、有機酸（例、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、リジン、オルニチン）又は酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩などが挙げられる。
【００３６】
本明細書中で用いられる場合、被験体は哺乳動物であり得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、ペット（例、イヌ、ネコ、ウサギ）、使役動物又は家畜（例、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）が挙げられるが、ヒトが好ましい。
【００３７】
式（Ｉ）の化合物及びその塩は、ＰＰ−１阻害作用を有し、該作用によりＣａＭＫＩＩを活性化する。
ＰＰ−１（プロテインホスファターゼ−１）は、リン酸化タンパク質を脱リン酸化する酵素の１種であり、セリン／スレオニンホスファターゼに分類される。ＰＰ−１は、幅広い組織分布と細胞内分布を示し、主に糖代謝、細胞運動、細胞周期、ＤＮＡ複製、転写、翻訳、細胞接着など広範囲な細胞機能を制御している。近年、神経活動におけるタンパク質リン酸化の関与が注目されるに伴い、後述のＣａＭＫＩＩとともに、シナプス伝達の可塑性、記憶・学習に代表される高次脳機能に重要な役割を果たすと考えられている。ＣａＭＫＩＩ（Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ）は、神経細胞に豊富に存在し、神経伝達物質合成酵素やシナプス小胞結合タンパク、イオンチャネル、神経伝達物質受容体等をリン酸化することによって、それらの機能を調節し、シナプス伝達の可塑性、記憶・学習に代表される高次脳機能に重要な役割を果たすと考えられている。通常の神経活動状態では、細胞内のＣａ２＋／カルモジュリン、ＣａＭＫＩＩ活性、ホスファターゼ（ＰＰ−１を含む）活性のバランスによってＣａＭＫＩＩの活性状態は平衡状態が保たれている。
【００３８】
さらに、ＣａＭＫＩＩを活性化することにより、ＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸）受容体の移送（エキソサイトーシス）が促進される。ＡＭＰＡ受容体は、中枢神経系での興奮性シナプス伝達を司るグルタミン酸受容体の中でも最も中心的な役割を果たす受容体であり、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４のサブユニットが存在し、４量体を形成することにより機能的なチャネルを形成すると考えられている。ＡＭＰＡ受容体移送が促進されることによって細胞膜上でのＡＭＰＡ受容体の発現が増加し、受容体応答が増強されることによって海馬シナプス伝達が促進される。
従って、ＰＰ−１阻害作用を有し、該作用によりＣａＭＫＩＩを活性化し得る式（Ｉ）の化合物又はその塩を含む本発明の剤（ＰＰ−１阻害剤、ＣａＭＫＩＩ活性化剤）は、ＡＭＰＡ受容体の細胞膜上での発現増強剤として、さらにはシナプス伝達促進剤として有用である。
【００３９】
上述のように、本発明の剤は、シナプス伝達を促進することができるので種々の神経変性疾患、特に認知障害を伴う疾患又は状態の予防又は治療用の剤として有用である。認知障害を伴う疾患又は状態としては、具体的には、認知症（例、老人性認知症、アルツハイマー型認知症、脳血管性認知症、外傷後認知症、脳腫瘍により生じる認知症、慢性硬膜下血腫により生じる認知症、正常圧脳水腫により生じる認知症、髄膜炎後認知症及びパーキンソン型認知症などの種々の疾患により生じる認知症）、非認知症性の認知障害（例、軽度認知障害（ＭＣＩ））、学習又は記憶障害（例、脳発達障害に伴う学習及び記憶障害）などを含む様々の疾患又は状態が挙げられる。さらに本発明の剤は、学習や記憶（例、短期記憶、長期記憶）の向上のために使用することができる。
【００４０】
また、本発明の剤は、「ＰＰ−１阻害作用→ＣａＭＫＩＩ活性化作用→ＡＭＰＡ受容体発現増強作用→海馬シナプス伝達促進作用」というカスケードを駆動することができるので、種々の神経変性疾患、特に認知障害を伴う疾患又は状態の予防薬又は治療薬を開発する為の研究用試薬としても有用である。
【００４１】
本発明の剤は、例えば、医薬として用いられる場合、種々の神経変性疾患の予防又は治療に有用であり得る。本発明の剤を食品として用いることもできるが、その場合には、神経変性疾患を発症する危険性が高い被験体又は当該疾患を発症しないことを切望する被験体が定期的に摂食することで、このような被験体における当該疾患の発症リスクを低減し得る。
【００４２】
本明細書中で用いられる場合、神経変性疾患の「予防」とは、神経変性疾患の症状（認知障害、学習・記憶障害等）を示さない被験体において、該症状が顕在化するのを防ぐことを意味し、「治療」とは、神経変性疾患の症状（認知障害、学習・記憶障害等）を示す被験体において、該症状を軽減すること、あるいは該症状の悪化を防ぐこと又は遅延させることを意味する。
【００４３】
本発明の剤は、式（Ｉ）の化合物又はその塩に加え、任意の担体、例えば医薬又は食品として許容され得る担体を含み得る。このような担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００４４】
本発明の剤はまた、有効成分として、式（Ｉ）の化合物又はその塩が２種以上組み合わされた、又は使用に際して組み合わされ得る、あるいはこのような化合物又はその塩と、他の神経変性疾患の予防又は治療に有用な１以上の別の成分とが組み合わされた併用剤であり得る。このような併用剤は、神経変性疾患を相加的又は相乗的に予防又は治療し得る。
【００４５】
他の神経変性疾患の予防又は治療に有用な成分としては、例えば、ポリフェノール、コエンザイムＱ１、β−シトステロール、イソフラボン、メビニン酸、ビタミンＣ、ビタミンＥ、フラボノイド類、テルペン類、葉酸、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、セスキルペンラクトン、ウロキナーゼ、ナットウキナーゼ、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、硫化プロピル、リンゴペクチン、酢酸、ＥＰＡ、及びＤＨＡ等が挙げられる。
【００４６】
本発明の剤を食品として用いる場合には、食品としては、例えば、一般食品（例えば、パン、乳製品（例、牛乳、ヨーグルト）、菓子、キャンデー、飴、チョコレート、ケーキ、プリン、ゼリー、清涼飲料水、麺類）、健康食品、ダイエタリーサプリメント、並びに厚生労働省の保健機能食品制度に規定される特定保健用食品及び栄養機能食品が挙げられる。該食品は、液状物（水溶性、不溶性）、粉末、顆粒、錠剤、カプセル等の固形物、ゼリー状等の半固形物などの任意の形態であり得る。本発明の剤は水又は所定の水溶液に溶解して用いることができる。このような場合、本発明の剤は溶解補助物（例、リノール酸）、安定化剤を含んでいてもよい。
【００４７】
本発明の剤を食品として用いる場合、その摂取量は、用いる形態（例、液状物、固形物、半固形物）、式（Ｉ）の化合物又はその塩の含有濃度、並びに神経変性疾患の予防又は治療に有用な成分の有無、種類及び量等によって異なり一概に云えないが、通常、式（Ｉ）の化合物又はその塩の単位摂取量（１回又は１日あたりの摂取量）としては、約５ｍｇ〜約５００ｍｇを挙げることができる。
【００４８】
本発明の剤を食品として用いる場合、該食品は、式（Ｉ）の化合物又はその塩を、単位摂取量又はその分割量で含むものであり得る。式（Ｉ）の化合物又はその塩を単位摂取量で含む食品は、式（Ｉ）の化合物又はその塩の単位摂取量を含む、単一の液状物、固形物又は半固形物であり得る。式（Ｉ）の化合物又はその塩を単位摂取量の分割量で含む食品は、１回又は１日あたり、複数個（例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の摂取が推奨される固形物（例、錠剤、カプセル）又は半固形物であり得る。
【００４９】
本発明の剤を食品として用いる場合には、式（Ｉ）の化合物又はその塩の単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填されたもの、あるいは式（Ｉ）の化合物又はその塩の多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填されたものであり得る。式（Ｉ）の化合物又はその塩の単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填された食品としては、例えば、式（Ｉ）の化合物又はその塩の単位摂取量又はその分割量を、通常の包装物（例えば、ＰＴＰ（press through packing）シート、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に別々に包装又は充填したものが挙げられる。このように個別に包装又は充填された食品は、さらに組み合わされて、１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に一緒に包装又は充填されていてもよい。式（Ｉ）の化合物又はその塩の多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填された食品としては、例えば、多数の錠剤又はカプセル剤が区分されることなく１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に包装又は充填されたものが挙げられる。本発明の食品はまた、式（Ｉ）の化合物又はその塩の単位摂取量又はその分割量を、長期間（例えば３日以上、好ましくは７日、１０日、１４日又は２１日以上あるいは１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月以上）の摂取に十分な数で含み得る。
【００５０】
本発明の剤が医薬として用いられる場合、経口投与に好適な医薬は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。
【００５１】
非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な医薬としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該医薬は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００５２】
本発明の剤が医薬として用いられる場合、その投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたりの式（Ｉ）の化合物又はその塩の有効量としては、約５ｍｇ〜約５００ｍｇを挙げることができる。
【００５３】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００５４】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００５５】
（材料と方法）
１．動物
動物に関する取扱いは、全て兵庫医科大学動物実験委員会の認可を受け、ＮＩＨ（国立衛生研究所）の実験動物の管理と使用に関する指針に準拠している。
【００５６】
２．興奮性シナプス後場電位（field excitatory postsynaptic potential (fEPSP)）の測定
雄性Ｗｉｓｔｅｒラット（６週齢）から海馬切片（４００μｍ）を調製した。海馬切片を、ＧＦ１０９２０３Ｘ（１００ｎＭ）及び／又はＫＮ−９３（３μＭ）の存在下及び非存在下、ＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）で１０分間処理した。１０分間のＤＣＰ−ＬＡ処理の前後に、標準の人工脳脊髄液（以下、ＡＣＳＦと略称する）中でシャファー側枝に電気的に刺激を与えること（０．０３Ｈｚ，０．１ミリ秒間）によってＣＡ１領域からのｆＥＰＳＰを記録した。ＡＣＳＦは３４℃、９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２で酸素処理したものを用いた。ＡＣＳＦの組成は以下の通りである
ＡＣＳＦ：117mM NaCl, 3.6mM KCl, 1.2mM NaH2PO4, 1.2mM MgCl2, 2.5mM CaCl2, 25mM NaHCO3及び11.5mM glucose
【００５７】
３．細胞培養
Ｗｉｓｔｅｒラット胎仔（在胎齢、１８日）の脳から海馬を取り出した。解離した海馬細胞を９６ウェルのプレートに播種し、培養液中、５％ＣＯ２及び９５％空気の湿気のある環境下３７℃で培養した。培養液の組成は以下の通りである
培養液：B27(1:50), 2.5mM glutamine, 50μM glutamate, penicillin(最終濃度100U/ml)及びstreptomycin(最終濃度, 0.1mg/ml)を補充したNeurobasal
【００５８】
４．ｉｎ ｓｉｔｕ ＣａＭＫＩＩアッセイ
培養ラット海馬ニューロンにおけるＣａＭＫＩＩ活性を既報に従って測定した(Kanno T.et al, J. Lipid Res. 47:1146-1156, 2006)。培養ニューロンを、ＫＮ−９２又はＫＮ−９３の存在下あるいは非存在下、細胞外液中、３７℃で１０分間、ＤＣＰ−ＬＡで処理した。次いで、細胞を１００μｌのＣａ２＋−ｆｒｅｅリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、３０℃で１５分間、５０μｌの細胞外液(50μg/ml digitonin, 25mM glycerol 2-phosphate, 200μM ATP及び100μM Autocamtide-2 (Calbiochem, San Diego, USA);CaMKIIの合成基質ペプチド)を含有する)中でインキュベートした。上清を回収し、１００℃で５分間煮沸して反応を停止させた。該溶液の一部（２０μｌ）を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）(LC-10ATvp,Shimadzu Co., Kyoto, Japan)にかけた。基質ペプチドのピークと、新しくできた産物のピークが吸光度２１４ｎｍ(SPD-10Avp UV-VIS detector, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)の位置に検出された。各ピークの分子量をｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（ＭＷ１０６０．２）及びｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ（ＭＷ１６７２．９）の標準スペクトルから測定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry；Voyager ST-DER, PE Biosystems Inc., Foster City, USA）での解析によれば、基質のピーク及び新しい産物のピークは、それぞれ分子量１５０８及び分子量１５８８であった。１５８８という分子量が、リン酸化されていない基質タンパク質の分子量（ＭＷ１５０８）にＨＰＯ３（ＭＷ８０）の分子量を加えたものに一致していることから、新しくできた産物のピークがリン酸化された基質タンパク質に対応していることがわかる。リン酸化されていないＣａＭＫＩＩ基質ペプチド、及びリン酸化されているＣａＭＫＩＩ基質ペプチドの面積を測定した（全面積は、ここで使用したＣａＭＫＩＩ基質ペプチドの濃度に相当する）。リン酸化された基質ペプチドの量（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ細胞タンパク）を算出し、ＣａＭＫＩＩ活性の指標として用いた。
細胞外液の組成は以下の通り。
細胞外液;137mM NaCl, 5.4mM KCl, 10mM MgCl2, 5mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA), 0.3mM Na2HPO4, 0.4mM K2HPO4及び20mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid, pH 7.2
【００５９】
５．ＣａＭＫＩＩ活性及びＰＰ−１活性測定の為の無細胞系アッセイ
無細胞系でＣａＭＫＩＩ活性を測定する為には、反応メディウム（２５μｌ，ｐＨ８．０）中、ＤＣＰ−ＬＡの存在下及び非存在下、３５℃で１０分間、合成ＣａＭＫＩＩ基質ペプチド（１０μＭ）をＣａＭＫＩＩ（１．１ｘ１０６Ｕ）(Calbiochem,San Diego, USA)と反応させた。
無細胞系でのＰＰ−１活性を測定する為には、ＣａＭＫＩＩアッセイで用いたのと同じ反応メディウム中、ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ(Sigma)又はＤＣＰ−ＬＡの存在下及び非存在下で、３５℃で１０分間で、合成ＣａＭＫＩＩ基質ペプチド（１０μＭ）をＣａＭＫＩＩ（１．１ｘ１０６Ｕ）(Calbiochem,San Diego,USA)及びＰＰ−１（０．１Ｕ）(Sigma,St. Louis,MO,USA)と反応させた。いずれの反応も１００℃で５分間処理することによって終結させた。各溶液の一部（１０μｌ）をカラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）(COSMOSIL 5C18-AR-II, Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)に注入し、逆相ＨＰＬＣシステムにかけた(LC-10ATvp, Shimadzu)。リン酸化されていないペプチド及びリン酸化されたペプチドを吸光度２１４ｎｍで検出した(SPD-10Avp UV-Vis detector, Shimadzu)。リン酸化された基質ペプチドの量（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ）をＣａＭＫＩＩ活性の指標として用いた。脱リン酸化された基質ペプチドの量（Δｐｍｏｌ／ｍｉｎ）をＰＰ−１活性の指標として用いた。脱リン酸化された基質ペプチドの量はｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎあるいはＤＣＰ−ＬＡの存在下及び非存在下、（ＰＰ−１存在下でのリン酸化された基質ペプチドの量）から（ＰＰ−１非存在下でのリン酸化された基質ペプチドの量）を差し引くことによって求めた。
反応メディウムの組成は以下の通りである。
反応メディウム：40mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid (HEPES)、 5mM Mg-acetate, 0.4mM CaCl2, 0.1mM ATP, 0.1mM EGTA, 1μM calmodulin (Calbiochem, San Diego, USA)
【００６０】
６．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写と翻訳
ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ３サブユニットをコードするｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって合成した。Ｓｅｒ８３１をＡｌａで置き換え、ＣａＭＫＩＩリン酸化部位を欠いている変異ＧｌｕＲ１サブユニットを調製した［ｍＧｌｕＲ１（Ｓ８３１Ａ）］。卵巣から手作業で分離したアフリカツメガエルの卵母細胞に、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ３サブユニット、あるいはｍＧｌｕＲ１（Ｓ８３１Ａ）サブユニットの種々の組み合わせでｍＲＮＡを注入し、１８℃でインキュベートした。
【００６１】
７．２電極ボルテージクランプ測定
ｍＲＮＡを注入して２〜３日後に卵母細胞を測定チャンバーに移し、標準の両生類用リンゲル液(frog Ringer's solution)で連続的に２２℃表面灌流した。１０分間のＤＣＰ−ＬＡ処理の前後で１０分間隔でカイニン酸（５０μＭ）を卵母細胞にバスアプライ(bath-apply)した。全ての細胞膜電流をGeneClamp-500 amplifier (Axon Instruments, Inc., Foster City, CA, USA)で測定・記録し、ｐＣｌａｍｐソフトウェア(version 6.0.3, Axon Instruments, Inc.)を用いてコンピュータ解析した。
標準の両生類用リンゲル液の組成は以下の通りである。
両生類用リンゲル液;115mM NaCl, 2mM KCl, 1.8mM CaCl2,及び5mM HEPES, pH 7.0
【００６２】
８．ＡＭＰＡ受容体の移送の解析
ラット海馬切片（雄性、Ｗｉｓｔａｒ，６ｗ）（４００μｍ）を標準ＡＣＳＦ中、ＤＣＰ−ＬＡの存在下及び非存在下で、２０分、３４℃でインキュベートした。該インキュベートは、ＧＦ１０９２０３Ｘ（１００ｎＭ）、ＫＮ−９３（３μＭ）及びＨ−８９（１μＭ）の存在下及び非存在下に、あるいはＤＣＰ−ＬＡ処理の２０分前から酸化フェニルアルシン（ＰＡＯ）（３μＭ）の存在下及び非存在下に、あるいはＤＣＰ−ＬＡ処理の１２ｈｒ前からボツリヌス毒素Ａ（ＢｏＴＸ−Ａ）（０．１Ｕ／ｍｌ）の存在下及び非存在下に行った。
次いで、切片を、氷冷した、１％プロテアーゼインヒビターカクテルを含むミトコンドリアバッファー中で音波処理によってホモジナイズし、続いて該ホモジネートを遠心分離した(3,000rpm, 5min, 4℃)。上清を遠心分離(11,000rpm, 15min, 4℃)し、さらに回収した上清を超遠心分離(100,000rpm, 60min, 4℃)し、細胞質分画と膜分画に分離した。
各分画のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット(Pierce, Rockford, IL, USA)を用いて測定した。細胞膜分画のタンパク質を１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有するミトコンドリアバッファーに再懸濁した。各分画のタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、ポリフッ化ビニリデン(polyvinylidene difluoride)膜に転写した。５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴＴＢＳ(150mM NaCl, 0.1% Tween20及び20mM Tris, pH7.5)でブロッキングをした後、転写した膜をＧｌｕＲ１サブユニットに対する抗体(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA)、ＧｌｕＲ２サブユニットに対する抗体(Chemicon, Temecula, CA, USA)、カドヘリンに対する抗体(Sigma, St Louis, MO, USA)及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に対する抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)と反応させ、次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体又はヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。免疫反応性を、ＥＣＬ ｋｉｔ(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)で検出し、chemiluminescence detection system (FUJIFILM, Tokyo, Japan)を用いて可視化した。シグナル密度をImage Gauge software (FUJIFILM)で測定した
ミトコンドリアバッファーの組成は以下の通りである。
ミトコンドリアバッファー；210mM mannitol, 70mM sucrose及び1mM EDTA, 10mM HEPES, pH 7.5
【００６３】
９．免疫沈降及びウェスタンブロット解析
ラット海馬切片（雄性 Ｗｉｓｔａｒ，６ｗ）（４００μｍ）を溶解用溶液で溶解した。得られたライセートを遠心分離した後、抽出物（タンパク質換算で５００μｇ）を抗ＧｌｕＲ１サブユニット抗体(Upstate Biotechnology)又は抗ＧｌｕＲ２サブユニット抗体(Chemicon)の存在下、４℃で一晩インキュベートした。次いで、２０μｌのプロテインＧアガロース(GE healthcare)を該抽出物に添加し、４℃で一晩インキュベートした。ペレットを２回ＰＢＳで洗浄し、４０μｌのＳＤＳサンプルバッファー(0.2mM Tris-HCl, 0.04% SDS, 20% glycerol, pH 6.8)で溶解した。５分間煮沸した後、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写した膜を５％ＢＳＡでブロッキングし、ＧｌｕＲ１サブユニットに対する抗体(Upstate Biotechnology)、ＧｌｕＲ２サブユニットに対する抗体(Chemicon)及びＧｌｕＲ３サブユニットに対する抗体(Chemicon)で反応させ、次いでＨＲＰをコンジュゲートしたヤギ抗ＩｇＧ抗体又はヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で反応させた。免疫反応性はＥＣＬ ｋｉｔ(GE Healthcare)で検出した。
溶解用溶液の組成は以下の通りである。
溶解用溶液：0.1% Tween20, 0.1% SDS, 20mM Tris-HCl, 150mM NaCl及び1% プロテアーゼインヒビターカクテル
【００６４】
１０．統計的解析
統計的解析は、unpaired t-test、Fisher's Protected Least Significant Difference (PLSD) test及びone-way analysis of variance（ＡＮＯＶＡ）を用いて行った。
【００６５】
実施例１：ＤＣＰ−ＬＡの海馬シナプス伝達促進作用におけるＣａＭＫＩＩの役割
ＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）はラット海馬切片のＣＡ１領域から記録されるｆＥＰＳＰの傾きにおいて、一過的な急増を誘導することが報告されている（Yaguchi, T. et al., Mol. Brain Res. 133:320-324, 2005）。約２００％の持続的増大に続いて、最大で、基準レベルのおよそ９００％にまで到達する（図１）。ＤＣＰ−ＬＡによるｆＥＰＳＰ傾きの一過的な急増はＰＫＣ阻害剤であるＧＦ１０９２０３Ｘ（１００ｎＭ）では部分的にしか阻害されなかったが、持続的増大についてはこの阻害剤で阻害された（図１）。活性化ＣａＭＫＩＩの阻害剤であるＫＮ−９３（３μＭ）は、ＤＣＰ−ＬＡによるｆＥＰＳＰ傾きの一過的な急増を基準レベルの２００％程度にまで抑制し、さらにＧＦ１０９２０３Ｘ（１００ｎＭ）を加えることによってｆＥＰＳＰの傾きの増加は完全に阻害された（図１）。
この結果より、ＤＣＰ−ＬＡによって誘導される海馬シナプス伝達促進作用は、ＣａＭＫＩＩ及びＰＫＣの両方によって仲介され、特にＣａＭＫＩＩが大きく寄与していることが示された。
【００６６】
実施例２：ＤＣＰ−ＬＡのＣａＭＫＩＩに及ぼす作用
実施例１でＤＣＰ−ＬＡの海馬シナプス伝達促進作用にＣａＭＫＩＩが大きく寄与していることが明らかになったので、次に、ＤＣＰ−ＬＡがＣａＭＫＩＩそのものを活性化しているのかどうかを調べた。
ＣａＭＫＩＩ活性は、逆相ＨＰＬＣを用いて測定した。培養ラット海馬ニューロンを用いた実験系において、ＣａＭＫＩＩ活性の基準値は、７．２±０．３ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇタンパク（図２）であった。ＤＣＰ−ＬＡはＣａＭＫＩＩ活性を濃度（０．０１−１μＭ）依存的に増強した。このＤＣＰ−ＬＡのＣａＭＫＩＩ活性の促進効果は活性型ＣａＭＫＩＩの阻害剤であるＫＮ−９３（３μＭ）で顕著に阻害されたが、不活性型ＣａＭＫＩＩの阻害剤であるＫＮ−９２（３μＭ）では阻害されなかった（図２）。この結果より、ＤＣＰ−ＬＡがＣａＭＫＩＩを活性化し得ることが示された。
次に、無細胞系でＤＣＰ−ＬＡがＣａＭＫＩＩ活性を促進するか否かを検討した。驚くべきことに、無細胞系では、ＤＣＰ−ＬＡ（１００μＭ）によるＣａＭＫＩＩ活性の促進は観察されなかった（図３Ａ）。この結果より、ＤＣＰ−ＬＡが直接ＣａＭＫＩＩを活性化しているのではなく、細胞内に存在する因子に作用することによってＣａＭＫＩＩを活性化していることが考えられた。
ＣａＭＫＩＩはその自己リン酸化を介して活性化され、ＰＰ−１によって触媒される脱リン酸化によって不活性化される。そこで、ＤＣＰ−ＬＡにＰＰ−１に対する作用について調べた。
無細胞系でのＰＰ−１アッセイにおいて、ＰＰ−１の阻害剤であるミクロシスチン（０．１及び１μＭ）は、顕著にＰＰ−１活性を低下させた（図３Ｂ）。ＤＣＰ−ＬＡもまた、ミクロシスチンよりもその作用は弱いものの、濃度（１−１００μＭ）依存的に有意にＰＰ−１活性を低下させた（図３Ｂ）。
これらの結果は、ＤＣＰ−ＬＡはＰＰ−１を阻害することによってＣａＭＫＩＩを活性化するという作用機序を示唆している。
【００６７】
実施例３：ＤＣＰ−ＬＡのＡＭＰＡ受容体応答性に及ぼす作用
ＣａＭＫＩＩは、ＡＭＰＡ受容体の応答性を増強することが知られている。そこでＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ３サブユニットを種々の組合わせで発現している卵母細胞でのＡＭＰＡ受容体応答におけるＤＣＰ−ＬＡの効果を調べた。
２電極ボルテージクランプ測定では、ＡＭＰＡ受容体のアゴニストであるカイニン酸を添加することで、一時的に−６０ｍＶの電位となる（図４Ａ−Ｉ）。ＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）は、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ１／ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ１／ＧｌｕＲ３及びＧｌｕＲ１／ＧｌｕＲ２／ＧｌｕＲ３サブユニットで構成されるＡＭＰＡ受容体に対して、段階的に上昇し且つ持続する電流の増強作用を誘導した。ＤＣＰ−ＬＡで１０分間処理した後、７０分経過した時点でそれぞれ基準レベルの１９３±１９％、１５７±１０％、１３６±８％、１３４±６％及び１４１±７％に達した。いずれも活性型ＣａＭＫＩＩの阻害剤であるＫＮ−９３（３μＭ）によって顕著に阻害された（Ｐ＜０．００１；ＫＮ−９３非存在下でのＤＣＰ−ＬＡの効果と比較して；Fisher's PLSD test）（図４Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ）。対照的に、ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ２／ＧｌｕＲ３サブユニットで構成されるＡＭＰＡ受容体に対しては、ＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）では、増強作用は殆ど見られないか、あるいは全く見られなかった（図４Ｂ、Ｅ）。
これらの結果は、ＤＣＰ−ＬＡによって誘導されるＡＭＰＡ受容体応答性の増強作用にはＧｌｕＲ１サブユニットが必要であること、その増強作用はＣａＭＫＩＩ依存的であることを示唆している。
ＧｌｕＲ１サブユニットには、Ｓｅｒ８３１のＣａＭＫＩＩリン酸化部位が含まれている。ＡＭＰＡ受容体応答性におけるＤＣＰ−ＬＡの増強効果がＧｌｕＲ１サブユニットのＣａＭＫＩＩによるリン酸化によるものであるのか否かを知るために、ＣａＭＫＩＩリン酸化部位を欠失している変異型のＧｌｕＲ１ ＡＭＰＡ受容体［ｍＧｌｕＲ１（Ｓ８３１Ａ）受容体］を卵母細胞に発現させた。ＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）は、ｍＧｌｕＲ１（Ｓ８３１Ａ）受容体に対してもカイニン酸によって誘導される電流を増強した（図４Ｉ）。この結果は、ＤＣＰ−ＬＡがＧｌｕＲ１サブユニットのＣａＭＫＩＩによるリン酸化に依存しない作用機序によってＡＭＰＡ受容体応答性を増強していることを示唆している。
【００６８】
実施例４：ＤＣＰ−ＬＡのＡＭＰＡ受容体のエキソサイトーシスに及ぼす作用
上記の結果より、ＤＣＰ−ＬＡによって活性化されたＣａＭＫＩＩが、ＤＣＬＰ−ＬＡによって誘導されるＡＭＰＡ受容体応答性の増強作用を担うＡＭＰＡ受容体の細胞膜上での発現における増加に貢献していることが考えられた。そこで、ＡＭＰＡ受容体の細胞膜上での発現に及ぼすＤＣＰ−ＬＡの作用を調べた。
ラット海馬切片から得られたライセートを抗ＧｌｕＲ１サブユニット抗体又は抗ＧｌｕＲ２サブユニット抗体で免疫沈降させ、免疫沈降物（ＧｌｕＲ１ ＩＰ、ＧｌｕＲ２ ＩＰ）を用いてウェスタンブロット解析を行った。いずれの免疫沈降物においても、抗ＧｌｕＲ１サブユニット抗体及び抗ＧｌｕＲ２サブユニット抗体に対して免疫応答性であるシグナルが検出されたが、抗ＧｌｕＲ３サブユニット抗体に対してはシグナルが観察されなかった（図５Ａ）。この結果は、ＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットが、ラットの海馬で発現しているＡＭＰＡ受容体を形成することを示唆している。したがって、本発明者は、ＡＭＰＡ受容体の移送におけるＤＣＰ−ＬＡの効果を調べるために、ＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットに注目した。
ラット海馬切片から調製されたライセートを超遠心分離によりペレットと上清の２つの画分に分離した。細胞質マーカーＬＤＨに対する抗体（抗ＬＤＨ抗体）、及び細胞膜マーカーであるカドヘリンに対する抗体（抗カドヘリン抗体）に対する免疫応答性のシグナルがそれぞれ上清及びペレット中に検出された（図５Ｂ）。この結果より、上清画分及びペレット画分は、それぞれ細胞質成分及び細部膜成分で構成されていることを示唆している。ＤＣＰ−ＬＡで処理していない海馬切片から得られたライセートでは、細胞質画分及び細胞膜画分の両方の画分で、同程度のＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットに対する免疫応答シグナルが観察された（図５Ｃ、Ｄ）。ＤＣＰ−ＬＡ処理した海馬切片から得られたライセートでは、釣鐘状に濃度（１ｎＭ−１μＭ）依存的な様式で細胞膜画分においてシグナルを増強した（図５Ｃ、Ｄ）。このことは、ＤＣＰ−ＬＡがＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットの細胞膜上での発現を増加させていることを示している。
ＤＣＰ−ＬＡの効果は、活性型のＣａＭＫＩＩの阻害剤であるＫＮ−９３（３μＭ）で阻害されたが、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の阻害剤であるＧＦ１０９２０３Ｘ（１００ｎＭ）やＨ−８９（１μＭ）では阻害されなかった（図５Ｃ、Ｄ）。このことは、ＤＣＰ−ＬＡがＣａＭＫＩＩ経路を介して、ＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットの細胞膜から細胞質へのエンドサイトーシスを阻害することによって該サブユニットの細胞膜上での発現を増加させていることを示している。
さらにＤＣＰ−ＬＡ（１００ｎＭ）によって誘導されるＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットの細胞膜上での発現増加は、エキソサイトーシスの阻害剤であるＢｏＴＸ−Ａ（０．１Ｕ／ｍｌ）によって阻害され、エンドサイトーシスの阻害剤であるＰＡＯ（３μＭ）では何の作用も示さなかった（図５Ｃ、Ｄ）。
以上の結果より、ＤＣＰ−ＬＡがＣａＭＫＩＩを活性化することによってＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２サブユニットのエキソサイトーシスを刺激し、それによって細胞膜上でのＡＭＰＡ受容体の発現を増加させている、という作用機序が明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
ＰＰ−１を抑制してＣａＭＫＩＩを活性化することによって、ＡＭＰＡ受容体の細胞膜への移行を促進し、細胞膜上でのＡＭＰＡ受容体発現数増加に伴う海馬シナプス伝達を促進させることができる本発明の剤は、既存の薬物とは異なる作用機序を有する、海馬シナプス伝達を促進することが有益な疾患（例えば神経変性疾患）の予防・治療薬の開発に繋がる。さらに、本発明の剤は、そのような疾患の予防・治療薬の開発に有用なツールとなり得る研究用試薬として提供され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
〔式中、
Ｒは、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルであり、１，２−シクロプロピレンは、３位の炭素原子に適切な置換基を有してもよく、
Ｘは、単結合又はアルキレンであり、
炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと１０〜２５である。〕
で表される、１以上のシクロプロパン環を有するカルボン酸化合物又はその塩を含む、プロテインホスファターゼ−１（ＰＰ−１）阻害剤。
【請求項２】
Ｒが、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルである、請求項１記載の剤。
【請求項３】
Ｒが
【化２】
〔式中、
Ｒ’は、水素又はアルキルであり、
Ｙは、単結合又はアルキレンであり、
Ａは、１，２−シクロプロピレン又はビニレンであり、
ｍは、０〜５の整数であり、
但し、ｍが２〜５のとき、Ａは、同一又は異なっている。〕
である、請求項２記載の剤。
【請求項４】
Ｒが
【化３】
から選択される基であり、
Ｘが−（ＣＨ２）ｎ−である
〔式中、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは各々整数であり、ｐとｎの合計は６〜２１であり、ｑ、ｒ、ｎの合計は４〜１９である。〕、
請求項３記載の剤。
【請求項５】
Ｒが
【化４】
から選択される基であり、
Ｘが−（ＣＨ２）ｎ−である
〔式中、ｓ、ｎは各々整数であり、その合計は３〜１８である。〕、
請求項４記載の剤。
【請求項６】
ｓが４であり、ｎが７である、請求項５記載の剤。
【請求項７】
該カルボン酸化合物又はその塩が、８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸又はその塩である、請求項１記載の剤。
【請求項８】
研究用試薬である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の剤を含む、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）の活性化剤。
【請求項１０】
請求項９記載の剤を含む、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体の発現増強剤。
【請求項１１】
請求項１０記載の剤を含む、シナプス伝達促進剤。
【請求項１２】
式（Ｉ）
【化５】
〔式中、
Ｒは、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルであり、１，２−シクロプロピレンは、３位の炭素原子に適切な置換基を有してもよく、
Ｘは、単結合又はアルキレンであり、
炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと１０〜２５である。〕
で表される、１以上のシクロプロパン環を有するカルボン酸化合物又はその塩を含む、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化剤。
【請求項１３】
Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化が、プロテインホスファターゼ−１を阻害することによるものである、請求項１２記載の剤。
【請求項１４】
式（Ｉ）
【化６】
〔式中、
Ｒは、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルであり、１，２−シクロプロピレンは、３位の炭素原子に適切な置換基を有してもよく、
Ｘは、単結合又はアルキレンであり、
炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと１０〜２５である。〕
で表される、１以上のシクロプロパン環を有するカルボン酸化合物又はその塩を含む、
α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体の発現増強剤。
【請求項１５】
α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体の発現増強が、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化によるものである、請求項１４記載の剤。
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
〔式中、
Ｒは、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルであり、１，２−シクロプロピレンは、３位の炭素原子に適切な置換基を有してもよく、
Ｘは、単結合又はアルキレンであり、
炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと１０〜２５である。〕
で表される、１以上のシクロプロパン環を有するカルボン酸化合物又はその塩を含む、プロテインホスファターゼ−１（ＰＰ−１）阻害剤。
【請求項２】
Ｒが、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルである、請求項１記載の剤。
【請求項３】
Ｒが
【化２】
〔式中、
Ｒ’は、水素又はアルキルであり、
Ｙは、単結合又はアルキレンであり、
Ａは、１，２−シクロプロピレン又はビニレンであり、
ｍは、０〜５の整数であり、
但し、ｍが２〜５のとき、Ａは、同一又は異なっている。〕
である、請求項２記載の剤。
【請求項４】
Ｒが
【化３】
から選択される基であり、
Ｘが−（ＣＨ２）ｎ−である
〔式中、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは各々整数であり、ｐとｎの合計は６〜２１であり、ｑ、ｒ、ｎの合計は４〜１９である。〕、
請求項３記載の剤。
【請求項５】
Ｒが
【化４】
から選択される基であり、
Ｘが−（ＣＨ２）ｎ−である
〔式中、ｓ、ｎは各々整数であり、その合計は３〜１８である。〕、
請求項４記載の剤。
【請求項６】
ｓが４であり、ｎが７である、請求項５記載の剤。
【請求項７】
該カルボン酸化合物又はその塩が、８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸又はその塩である、請求項１記載の剤。
【請求項８】
研究用試薬である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の剤を含む、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）の活性化剤。
【請求項１０】
請求項９記載の剤を含む、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体の発現増強剤。
【請求項１１】
請求項１０記載の剤を含む、シナプス伝達促進剤。
【請求項１２】
式（Ｉ）
【化５】
〔式中、
Ｒは、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルであり、１，２−シクロプロピレンは、３位の炭素原子に適切な置換基を有してもよく、
Ｘは、単結合又はアルキレンであり、
炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと１０〜２５である。〕
で表される、１以上のシクロプロパン環を有するカルボン酸化合物又はその塩を含む、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化剤。
【請求項１３】
Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化が、プロテインホスファターゼ−１を阻害することによるものである、請求項１２記載の剤。
【請求項１４】
式（Ｉ）
【化６】
〔式中、
Ｒは、炭素鎖中に１以上の１，２−シクロプロピレンを有していてもよい、且つ／又は鎖末端にシクロプロピルを有していてもよいアルキル又はアルケニルであり、１，２−シクロプロピレンは、３位の炭素原子に適切な置換基を有してもよく、
Ｘは、単結合又はアルキレンであり、
炭素の総数からシクロプロパン環の数を引くと１０〜２５である。〕
で表される、１以上のシクロプロパン環を有するカルボン酸化合物又はその塩を含む、
α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体の発現増強剤。
【請求項１５】
α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体の発現増強が、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの活性化によるものである、請求項１４記載の剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２０２５２５（Ｐ２０１０−２０２５２５Ａ）
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４６６４５（Ｐ２００９−４６６４５）
【出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【出願人】（５９８１７６３６３）
【出願人】（５０６４０９１２５）株式会社 西崎創薬研究所 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【出願人】（５９８１７６３６３）
【出願人】（５０６４０９１２５）株式会社 西崎創薬研究所 (4)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]