プロポリス変換物、その製造方法及び健康食品
【課題】 抗癌作用のような生理作用を効果的に発揮することが可能なプロポリス変換物、その製造方法及び健康食品を提供する。
【解決手段】 プロポリス変換物は、担子菌類を利用してプロポリスを変換してなり、プロポリス発酵物及びプロポリス酵素処理物に分類される。プロポリス発酵物は、担子菌類の菌糸体によりプロポリスを発酵処理することにより製造され、プロポリス酵素処理物は、担子菌類の菌糸体由来の酵素によりプロポリスを酵素処理することにより製造される。酵素処理は、担子菌類の菌糸体の培養上清を用いて実施されることが好ましい。プロポリスは、好ましくはプロポリス抽出物であり、より好ましくはプロポリスのアルコール抽出物であり、特に好ましくはプロポリスのエタノール抽出物である。健康食品は、プロポリス変換物を含有する。
【解決手段】 プロポリス変換物は、担子菌類を利用してプロポリスを変換してなり、プロポリス発酵物及びプロポリス酵素処理物に分類される。プロポリス発酵物は、担子菌類の菌糸体によりプロポリスを発酵処理することにより製造され、プロポリス酵素処理物は、担子菌類の菌糸体由来の酵素によりプロポリスを酵素処理することにより製造される。酵素処理は、担子菌類の菌糸体の培養上清を用いて実施されることが好ましい。プロポリスは、好ましくはプロポリス抽出物であり、より好ましくはプロポリスのアルコール抽出物であり、特に好ましくはプロポリスのエタノール抽出物である。健康食品は、プロポリス変換物を含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担子菌類を利用してプロポリスを変換してなるプロポリス変換物及びその製造方法、並びにそのプロポリス変換物を含有する健康食品に関する。より詳しくは、抗癌作用等の有用な生理作用を有するプロポリス変換物、その製造方法及び健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
アガリクスのような担子菌類の菌糸体及びプロポリスには、いずれも抗癌作用及び抗菌作用があることが知られている。例えば特許文献１には、アガリクス及びプロポリス並びにアマゾン酵素の三者に共通する溶剤を用いて、それぞれのエキスを別々若しくは複合して抽出し、その一種類又は二種類若しくは三種類混合液化し、飲食料品に混入又は添加して保存貯蔵を可能とする方法によって製造された飲食料品が開示されている。
【特許文献１】特開平１０−２１５８３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、鋭意研究の結果、アガリクスのような担子菌類を利用して、プロポリスを変換することにより、プロポリス単独、担子菌類単独又はその両方でそれぞれ発揮される抗癌作用のような生理作用よりも飛躍的に高い生理作用を発揮させ得ることを見出した。そして、これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。本発明の目的とするところは、抗癌作用のような生理作用を効果的に発揮することが可能なプロポリス変換物、その製造方法及び健康食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載のプロポリス変換物は、担子菌類を利用してプロポリスを変換してなることを要旨とする。
請求項２に記載のプロポリス変換物は、請求項１に記載の発明において、前記担子菌類の菌糸体により前記プロポリスを発酵処理してなることを要旨とする。
【０００５】
請求項３に記載のプロポリス変換物は、請求項１に記載の発明において、前記担子菌類の菌糸体由来の酵素により前記プロポリスを酵素処理してなることを要旨とする。
請求項４に記載の発明は、請求項２に記載のプロポリス変換物を製造する方法であって、前記担子菌類の菌糸体を前記プロポリスに接種し、該菌糸体により前記プロポリスを発酵処理する工程を備えることを要旨とする。
【０００６】
請求項５に記載の発明は、請求項３に記載のプロポリス変換物を製造する方法であって、前記担子菌類の菌糸体由来の酵素を前記プロポリスに作用させ、該酵素により前記プロポリスを酵素処理する工程を備えることを要旨とする。
【０００７】
請求項６に記載の健康食品は、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のプロポリス変換物を含有することを要旨とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、抗癌作用のような生理作用を効果的に発揮することが可能なプロポリス変換物、その製造方法及び健康食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明のプロポリス変換物、その製造方法及び健康食品を具体化した一実施形態を説明する。
本実施形態のプロポリス変換物は、担子菌類を利用して、プロポリスを変換してなるものである。前記プロポリスを変換するとは、担子菌類の菌糸体又は該菌糸体によって生産される酵素等の生産物により、プロポリス中に含まれる少なくとも一種の化合物を、異なる構造を有する化合物に変換することを意味する。本実施形態のプロポリス変換物は、主として、プロポリス発酵物及びプロポリス酵素処理物の２種類に分類される。プロポリス発酵物は、担子菌類の菌糸体によりプロポリスを発酵処理することにより得られ、プロポリス酵素処理物は、担子菌類の菌糸体由来の酵素によりプロポリスを酵素処理することにより得られる。
【００１０】
これらのプロポリス変換物は、プロポリス単独、担子菌類単独又はその両方でそれぞれ発揮される抗癌作用よりも、飛躍的に高い抗癌作用を発揮することが可能である。なお、プロポリス変換物によって発揮される抗癌作用は、癌細胞及び癌化しつつある異常細胞のいずれに対しても有効である。このため、プロポリス変換物は、抗癌剤として利用可能であるとともに、癌の発生を予防する癌予防剤として利用することも可能である。即ち、本実施形態のプロポリス変換物は、健康食品のような飲食品、医薬品、医薬部外品等の用途に利用可能である。プロポリス変換物をこのような用途に利用する場合の投与経路は、経口及び非経口のいずれでもよい。経口投与の剤型としては、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、散剤等が挙げられ、非経口投与の剤型としては、点眼剤、注射剤、点鼻剤等が挙げられる。これらの剤型は、汎用技術により製剤化される。
【００１１】
ちなみに、健康食品の場合、プロポリス変換物を０．０１〜５０質量％含有していることが好ましく、０．０１〜２５質量％含有していることがより好ましく、０．１〜１０質量％含有していることがさらに好ましい。健康食品中に含有されるプロポリス変換物の含量が０．０１質量％未満の場合、十分な抗癌作用を発揮させることができず、逆に５０質量％を超える場合、不経済である。
【００１２】
次に、プロポリス変換物の製造方法について説明する。
本実施形態の製造方法で用いられる担子菌類としては、あらゆる種類のものが使用可能であるが、アガリクス（Agaricus blazei Murill）、冬虫夏草（Cordyceps militaris）、霊芝（Ganoderma lucidum）、カバノアナタケ（Fuscoporia oblique）等が好適に使用される。これらの担子菌類のうち、高い抗癌作用を有するプロポリス変換物を製造可能であることから、アガリクスを利用することが特に好ましい。菌糸体は、担子菌類の子実体から採取して利用しても良いし、寄託機関等から入手して利用しても良い。ちなみに、アガリクスの菌糸体は、高いラッカーゼ活性を有しており、該ラッカーゼ活性は、プロポリス中に含まれる少なくとも一種の化合物を、異なる構造を有する化合物に変換させやすくすると考えられる。
【００１３】
本実施形態の製造方法で用いられるプロポリスとしては、プロポリス原塊を公知の抽出方法によって抽出したプロポリス抽出物が好適に使用される。
プロポリス原塊は、ミツバチが樹木の特定部位、主として新芽や蕾及び樹皮から採取したガム質、樹液、植物色素系の物質及び香油等の集合体に、ミツバチ自身の分泌物や蜂ロウ等を混合して作製した暗緑色や褐色から暗褐色を呈した粘着性のある樹脂状の固形天然物質である。プロポリス抽出物を得るために用いられるプロポリス原塊としては、ブラジルを含む南アメリカ諸国、中国や日本等のアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、オセアニア諸国等のあらゆる産地のものが使用可能である。
【００１４】
プロポリス抽出物としては、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物、含水アルコール抽出物、有機溶媒抽出物、超臨界抽出物、ミセル化抽出物等が挙げられるが、高い抗癌作用を有する成分を容易かつ多量に抽出可能であることから、プロポリスのアルコール抽出物を使用することが特に好ましい。アルコール抽出物を調製するために用いられるアルコールは、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコールであることが好ましく、プロポリス変換物を経口投与する場合には、エタノールであることが特に好ましい。なお、プロポリスのアルコール抽出物中には、クロロゲン酸、ｐ−クマル酸、カフェ酸、４，５−ジカフェオイルキナ酸、３，５−ジカフェオイルキナ酸、３，４−ジカフェオイルキナ酸、３，４，５−トリカフェオイルキナ酸、ドルパニン、フラボノイド類、アルテピリンＣ、バッカリン等が含まれている。また、有機溶媒抽出物を調製するために用いられる有機溶媒としては、アセトンやヘキサン等の公知の有機溶媒が使用可能である。
【００１５】
次に、プロポリス発酵物の製造方法について説明する。
本実施形態のプロポリス発酵物の製造方法では、担子菌類の菌糸体をプロポリスに接種し、該菌糸体によりプロポリスを発酵処理する工程を備えている。なお、発酵処理する工程に先立って、担子菌類の菌糸体を前培養することにより、該担子菌類の菌糸体をあらかじめ活性化させておくことが好ましい。ちなみに、発酵処理する工程に先立って、担子菌類の胞子を前培養することにより、活性化された菌糸体を調製することも可能である。
【００１６】
発酵処理では、担子菌類の菌糸体の培養に適した培地、温度、振とう速度等の処理条件を適宜選択すればよい。発酵処理及び前培養では、担子菌類の菌糸体をより早く増殖させることが可能な培地を選択することが好ましい。このような培地には、通常、糖分、酵母エキス、ペプトン、塩類等が含有されている。また、培地には、プロポリス抽出物を調製する際に用いられたアルコールや有機溶媒等が、菌糸体の培養を阻害しない程度の低濃度で含有されていても構わない。
【００１７】
発酵処理を実施する時間、即ち発酵時間は、特に限定されないが、好ましくは０．５〜３００時間、より好ましくは０．５〜１５０時間、さらに好ましくは３〜７２時間である。発酵時間が０．５時間未満の場合、プロポリス発酵物の抗癌作用を十分に高めることができず、逆に発酵時間が３００時間を越える場合、プロポリス発酵物の製造コストが上昇するために好ましくない。
【００１８】
発酵処理する工程を実施した後の発酵処理物は、そのままの状態でプロポリス発酵物として利用することが可能であるうえ、スプレードライや、凍結乾燥等の公知の乾燥処理を行うことにより、粉末状のプロポリス発酵物として利用することも可能である。なお、得られたプロポリス発酵物に対して、さらに公知の精製方法を実施することも可能であるうえ、汎用技術により様々な剤形の製剤に加工（製剤化）することも可能である。
【００１９】
次に、プロポリス酵素処理物の製造方法について説明する。
本実施形態のプロポリス酵素処理物の製造方法では、担子菌類の菌糸体由来の酵素をプロポリスに作用させ、該酵素によりプロポリスを酵素処理する工程を備えている。酵素処理では、担子菌類の菌糸体若しくは該菌糸体の培養上清から精製（粗精製も含む）された酵素、又は、担子菌類からクローニングされた酵素遺伝子を強制発現する形質転換体若しくは該形質転換体の培養上清から精製（粗精製も含む）された酵素を用いることが可能である。このような酵素としては、ラッカーゼのような酸化酵素が挙げられる。なお、菌糸体、形質転換体又はそれらの培養上清から酵素を精製する場合、透析や公知のカラム処理等が実施され、好ましくは酵素が濃縮されるような条件で透析やカラム処理等が実施される。また、酵素処理では、最も簡便には、担子菌類の菌糸体を培養した培養上清が用いられる。
【００２０】
担子菌類の菌糸体由来の酵素をプロポリスに作用させる場合、該酵素は、ラッカーゼ活性として２００Ｕ／ｍＬ以上の酵素量となるようにプロポリスに添加されることが好ましい。ここで、前記ラッカーゼ活性は、基質としてのシリンガルダジン（syringaldazine）を含む反応溶液３ｍＬ（ｐＨ６．５、３０℃）中で、５３０ｎｍにおける吸光度を１分間に０．００１増加させる酵素活性の量を１Ｕ（ユニット）とする。
【００２１】
酵素処理を実施する時間、即ち酵素処理時間は、特に限定されないが、好ましくは０．５〜３００時間、より好ましくは０．５〜１５０時間、さらに好ましくは３〜７２時間である。酵素処理時間が０．５時間未満の場合、プロポリス酵素処理物の抗癌作用を十分に高めることができず、逆に酵素処理時間が３００時間を越える場合、プロポリス酵素処理物の製造コストが上昇するために好ましくない。
【００２２】
酵素処理する工程を実施した後の酵素処理物は、そのままの状態でプロポリス酵素処理物として利用することが可能であるうえ、スプレードライや、凍結乾燥等の公知の乾燥処理を行うことにより、粉末状のプロポリス酵素処理物として利用することも可能である。なお、得られたプロポリス酵素処理物に対して、さらに公知の精製方法を実施することも可能であるうえ、汎用技術により様々な剤形の製剤に加工（製剤化）することも可能である。
【００２３】
前記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ 本実施形態のプロポリス変換物は、担子菌類を利用して、プロポリスを生物学的に変換することにより得られる。このプロポリス変換物では、担子菌類の生物学的作用により、プロポリス中に含まれる少なくとも一種の化合物が異なる構造を有する化合物に変換されるため、その変換後の化合物に起因して、プロポリス単独、担子菌類単独又はその両方でそれぞれ発揮される生理作用よりも飛躍的に高い生理作用を発揮することが可能である。特に、担子菌類に由来するラッカーゼ様の酵素作用により高分子化された化合物が高い抗癌作用を発揮するものと考えられるが、このような高分子化された化合物が変換前のプロポリス及び担子菌類のいずれにもほとんど存在していないことは極めて重要である。
【００２４】
・ 本実施形態のプロポリス変換物は、担子菌類の菌糸体によりプロポリスを発酵処理すること、又は、担子菌類の菌糸体由来の酵素によりプロポリスを酵素処理することにより得られる。従って、プロポリス変換物の製造にかかる手間を容易に低減させることが可能であるため、プロポリス変換物を容易かつ安価に提供することが可能となる。
【実施例】
【００２５】
＜プロポリスのエタノール抽出物（抽出液）の調製＞
プロポリス原塊１．２ｋｇに９５％エタノール溶液４Ｌを加え、常温で１２時間エタノール抽出した後、珪藻土ろ過後に脱ロウすることにより、プロポリスのエタノール抽出物を得た。このエタノール抽出物を濃縮後、乳化剤（キラヤニンＳ−１００（丸善化成株式会社製、キラヤ抽出物２５％含有））を１０％添加し、プロポリス固形分２０％程度のエタノール抽出液を作製した。
【００２６】
＜プロポリス変換物の調製＞
（実施例１）アガリクス菌糸体によるプロポリス発酵物の製造１
２．４ｇ／Ｌの濃度のポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ）培地（Ｄｉｆｃｏ製）で培養したアガリクス菌糸体（（有）ニューピアーズより子実体入手）を集菌し、乾燥させた。次に、乾燥菌糸体を１ｍＬあたり０．００３５ｇの濃度となるように、０．２４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地に懸濁することにより、アガリクス培養液を調製した。続いて、ミニシェーカー（ＩＷＡＫＩ製）を用いて、アガリクス培養液を２５℃、１００ｒｐｍで６日間振とうすることにより前培養した後、前記エタノール抽出液（プロポリス固形分２０％程度）を固形分の終濃度が０．５％となるように添加し、４０℃で３．５時間撹拌することにより、発酵処理を行った。発酵処理後のアガリクス培養液を凍結乾燥することにより、プロポリス発酵物とした。
【００２７】
（実施例２）アガリクス菌糸体によるプロポリス発酵物の製造２
ポテトデキストロースアガー（ＰＤＡ）（Ｎｉｓｓｕｉ製）よりなる寒天培地を用いて、アガリクス菌糸体を２５℃、暗所で２〜３週間培養した。その後、寒天培地上で増殖したアガリクス菌糸体をかきとり、２．４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地５０ｍＬを入れたフラスコに添加し、５〜１０日間静置することにより前培養した。次に、このフラスコ（乾燥菌糸体重量１１３ｍｇに相当）内の培地をＰＹＳ培地（０．３％ポリペプトン、０．３％酵母エキス、１％ショ糖；いずれもナカライテスク製）５Ｌに添加し、ミニジャーファーメンター（高崎科学機器製）にて、通気０．５Ｌ／分、撹拌１００ｒｐｍの培養条件で１０〜１５日間通気培養（前培養）した。通気培養後の菌糸体を集菌後、０．２４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地に懸濁してアガリクス懸濁液を調製し、さらに該アガリクス懸濁液に前記エタノール抽出液（プロポリス固形分２０％程度）を固形分の終濃度が０．５％となるように添加し、４０℃で７２時間撹拌することにより、発酵処理を行った。発酵処理後のアガリクス懸濁液を凍結乾燥することにより、プロポリス発酵物とした。
【００２８】
（実施例３）冬虫夏草菌糸体によるプロポリス発酵物の製造
２．４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地で培養した冬虫夏草（Cordyceps militaris）菌糸体（ＩＦＯ５２９８）を集菌し、乾燥させた。次に、乾燥菌糸体を１ｍＬあたり０．００３５ｇの濃度となるように、０．２４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地に懸濁することにより、冬中夏草培養液を調製した。続いて、ミニシェーカー（ＩＷＡＫＩ製）を用いて、冬中夏草培養液を２５℃、１００ｒｐｍで３日間振とうすることにより前培養した後、前記エタノール抽出液（プロポリス固形分２０％程度）を固形分の終濃度が０．５％となるように添加し、４０℃で７２時間撹拌することにより、発酵処理を行った。発酵処理後の冬中夏草培養液を凍結乾燥することにより、プロポリス発酵物とした。
【００２９】
（実施例４）霊芝菌糸体によるプロポリス発酵物の製造
２．４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地で培養した霊芝（Ganoderma lucidum）菌糸体（ＩＦＯ８３４６）を集菌し、乾燥させた。次に、乾燥菌糸体を１ｍＬあたり０．００３５ｇの濃度となるように、０．２４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地に懸濁することにより、霊芝培養液を調製した。続いて、ミニシェーカー（ＩＷＡＫＩ製）を用いて、霊芝培養液を２５℃、１００ｒｐｍで３日間振とうすることにより前培養した後、前記エタノール抽出液（プロポリス固形分２０％程度）を固形分の終濃度が０．５％となるように添加し、４０℃で７２時間撹拌することにより、発酵処理を行った。発酵処理後の霊芝培養液を凍結乾燥することにより、プロポリス発酵物とした。
【００３０】
（実施例５）カバノアナタケ菌糸体によるプロポリス発酵物の製造
２．４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地で培養したカバノアナタケ（Fuscoporia oblique）菌糸体（ＩＦＯ８６８１）を集菌し、乾燥させた。次に、乾燥菌糸体を１ｍＬあたり０．００３５ｇの濃度となるように、０．２４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地に懸濁することにより、カバノアナタケ培養液を調製した。続いて、ミニシェーカー（ＩＷＡＫＩ製）を用いて、カバノアナタケ培養液を２５℃、１００ｒｐｍで３日間振とうすることにより前培養した後、前記エタノール抽出液（プロポリス固形分２０％程度）を固形分の終濃度が０．５％となるように添加し、４０℃で７２時間撹拌することにより、発酵処理を行った。発酵処理後の霊芝培養液を凍結乾燥することにより、プロポリス発酵物とした。
【００３１】
（実施例６）アガリクス菌糸体培養上清によるプロポリス酵素処理物の製造
２．４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地で培養したアガリクス菌糸体の培養上清を回収した後、蒸留水に対して透析することにより、菌糸体外酵素溶液を得た。該菌糸体外酵素溶液に対して、前記エタノール抽出液（プロポリス固形分２０％程度）を固形分の終濃度が０．５％となるように添加し、４０℃で７２時間反応させることにより、酵素処理を行った。酵素処理後の反応液を凍結乾燥することにより、プロポリス酵素処理物とした。なお、菌糸体外酵素溶液は、酵素活性の目安として、２００Ｕ／ｍＬのラッカーゼ活性を発揮する濃度となるように反応液中に加えられた。
【００３２】
＜予備検討＞疑似プロポリス変換物の成分変化
担子菌類の菌糸体は、ラッカーゼ等の酵素を菌体外に生産することが知られている。このため、プロポリス発酵物及びプロポリス酵素処理物ではいずれも、プロポリス中の成分にラッカーゼによる酸化反応が引き起されているものと考えられる。そこで、プロポリスのエタノール抽出物にラッカーゼ（ＳＩＧＭＡ製）を２００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、４０℃で７２時間反応させたときの分子量の変化を下記分析条件にて分析した。なお、ラッカーゼを添加していない試料（プロポリスのみ）についても同条件で分析した。分析結果の一部であるクロマトグラムチャートを図１（ａ）、（ｂ）に示す。
【００３３】
分析条件（ゲルろ過）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（７．５ｍｍＩＤ×３０ｃｍ）
ガードカラム：ＴＳＫ−ＧＵＡＲＤ ＣＯＬＭＵＮ（７．５ｍｍＩＤ×７５ｍｍ）
溶媒：０．０５Ｍリン酸緩衝液＋０．３Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７）
流速：１ｍＬ／分
温度：２５℃
検出：２２０ｎｍ
図１（ａ）、（ｂ）より、酵素無添加のもの（プロポリスのみ）と比較して、酵素を添加したもの（プロポリス＋ラッカーゼ）では、分子量の大きな成分が多く検出されており、プロポリス中の成分が、ラッカーゼにより高分子化されていることが強く示唆される。
【００３４】
＜本試験＞プロポリス発酵物の成分変化
前記エタノール抽出液（プロポリス固形分２０％程度）及び実施例１のプロポリス発酵物について、それぞれ前記＜予備検討＞と同様に分子量の変化を分析した。分析結果の一部であるクロマトグラムチャートを図２（ａ）、（ｂ）に示す。その結果、図２（ａ）、（ｂ）に示すように、＜予備検討＞の場合と全く同様の結果が得られた。即ち、発酵処理することによって、プロポリス中に含まれる化合物の一部が高分子化されていることが示された。ちなみに、＜予備検討＞において高分子化された化合物と、＜本試験＞において高分子化された化合物とは、クロマトグラムチャートにおける保持時間が同じであるため、同一の化合物であることが強く示唆される。この場合、ラッカーゼ処理されたプロポリスでも、プロポリス発酵物と同様の生理作用が発揮されるはずである。
【００３５】
＜プロポリス発酵物の抗癌作用１＞
ｄｄＹ系マウスに継代されているＳａｒｃｏｍａ１８０細胞をマウス腹水より採取し、生理食塩水で目的の細胞濃度となるように調整した。次に、中部科学資材株式会社より購入したｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）の背部に、Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を１×１０７細胞／マウスの移植量となるように皮下移植した。Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を移植したマウスを第一群から第三群（各群１０匹ずつ）に分けた。第一群には、生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇの投与量で２８日間連続腹腔内投与した。第二群には、実施例１のプロポリス発酵物を生理食塩水に懸濁したものを１０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍＬの投与量で、２８日間連続腹腔内投与した。第三群には、抗癌剤としてのカルボクリン（日本ケミファ（株）製）を１０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍＬの投与量で、２８日間連続腹腔内投与した。移植後２８日目に各群のマウスから腫瘍を摘出し、その重量をそれぞれ測定した。結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
その結果、プロポリス発酵物を投与した第二群では、第一群と比較して、腫瘍重量が有意に低下した（ｐ＜０．０１）。プロポリス発酵物の抗癌作用は、抗癌剤カルボクリンよりも若干劣るが、十分に高い抗癌作用を有していることが示された。
【００３７】
＜プロポリス発酵物の抗癌作用２＞
＜プロポリス発酵物の抗癌作用１＞と同様の方法にてプロポリス発酵物の抗癌作用について検討した。なお、ここでは、生理食塩水及び実施例１のプロポリス発酵物を腹腔内投与したものに加えて、実施例１で集菌したアガリクス菌糸体の乾燥菌糸体を生理食塩水に懸濁したもの、プロポリスのエタノール抽出物を生理食塩水に懸濁したもの、並びに、前記乾燥菌糸体及びエタノール抽出物の混合物についても同様に腹腔内投与した。各サンプルの投与量及び各群のマウスから摘出された腫瘍重量をそれぞれ表２に示す。
【００３８】
【表２】
その結果、アガリクス菌糸体投与群及びプロポリス発酵物投与群では、生理食塩水投与群と比較して、それぞれｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１で有意に腫瘍重量が低下した。また、エタノール抽出物投与群及び混合物投与群では、生理食塩水投与群と比較して、いずれも腫瘍重量が低下する傾向が認められた（ｐ＜０．１）。これらの結果より、プロポリス発酵物は、エタノール抽出物、アガリクス菌糸体、及び両者の混合物よりも飛躍的に高い抗癌作用を有していることが確認された。
【００３９】
＜プロポリス変換物の抗癌作用＞
ｄｄＹ系マウスに継代されているＥｈｒｌｉｃｈ細胞をマウスの腹水より採取し、滅菌生理食塩水で目的の細胞濃度となるように調整した。次に、表３に示す各サンプル（いずれも蒸留水に懸濁）をｄｄＹ系雄性マウス（６週齢、体重３０ｇ前後）に対し、１日１回の割合で７日間、同表に示す投与量で経口投与した。７日間の経口投与後、６×１０６のＥｈｒｌｉｃｈ細胞を各マウスの腹腔内に移植した。その後、引き続き、表３に示す各サンプルを同じ投与量で６日間経口投与した。各サンプルを経口投与してから１５日目に、各マウスの腹水を採取した。採取後の腹水について、全容積（ＴＶ；total volume）を測定した後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して腫瘍細胞を分離し、その分離された腫瘍細胞容積（ＰＣＶ；packed cell volume）を測定した。また、ＴＶよりＰＣＶを差し引くことにより、腹水容積（ＥＶ；exudate volume）を求めた。これらの結果を表３に示す。なお、表３に示す５−ＦＵは、抗癌剤５−フルオロウラシル（ナカライテスク製）を表す。
【００４０】
【表３】
その結果、エタノール抽出物投与群、実施例１，２のプロポリス発酵物投与群及び５−ＦＵ投与群では、いずれも蒸留水投与群と比較して、ＰＣＶが有意に低下した。よって、これらのサンプルは、経口投与によって、高い抗癌作用を発揮することが示された。さらに、これらのサンプルを投与した群では、いずれもＥＶ及びＴＶに関しても同様の傾向が見られた。特に、発酵処理を７２時間行った実施例２では、発酵処理を３．５時間しか行っていない実施例１と比べて、ＰＣＶが著しく低下している。従って、発酵処理を長時間実施することにより、プロポリス発酵物の抗癌作用が顕著に高められることが明確に示された。なお、アガリクス菌糸体及びエタノール抽出物の混合物を投与した群では、抗癌作用が認められなかった点も重要である。一方、実施例６のプロポリス酵素処理物投与群にも、ＰＣＶ、ＥＶ及びＴＶの減少傾向が認められた。
【００４１】
なお、本実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・ プロポリス原塊に担子菌類の菌糸体を直接接種することにより、発酵処理を実施することも可能である。また、プロポリス原塊に担子菌類の菌糸体由来の酵素を作用させることにより、酵素処理を実施することも可能である。
【００４２】
・ プロポリスに対して、発酵処理及び酵素処理の両方を実施することにより、プロポリス変換物を得ることも可能である。なおこの場合、発酵処理及び酵素処理を実施するタイミングは、同時であっても異なっていてもいずれでもよい。
【００４３】
・ プロポリス変換物は、抗癌作用以外の生理作用も発揮し得るため、抗癌剤及び癌予防剤以外の効能・効果を有する健康食品や医薬品に利用することが可能である。
本発明を応用した技術として、プロポリスにラッカーゼを作用させることにより、ラッカーゼ処理プロポリスを提供することができる。このラッカーゼ処理プロポリスは、上記実施形態のプロポリス変換物と同様に、抗癌作用のような生理作用を効果的に発揮することが可能である。
【００４４】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・ 前記担子菌類はアガリクスである請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のプロポリス変換物。前記プロポリスはプロポリス抽出物である請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のプロポリス変換物。
【００４５】
・ 前記酵素処理は、前記担子菌類の菌糸体の培養上清を用いて実施されることを特徴とする請求項３に記載のプロポリス変換物。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】（ａ）、（ｂ）は実施例の疑似プロポリス変換物の成分変化の結果を示すクロマトグラムチャート。
【図２】（ａ）、（ｂ）は実施例のプロポリス発酵物の成分変化の結果を示すクロマトグラムチャート。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担子菌類を利用してプロポリスを変換してなるプロポリス変換物及びその製造方法、並びにそのプロポリス変換物を含有する健康食品に関する。より詳しくは、抗癌作用等の有用な生理作用を有するプロポリス変換物、その製造方法及び健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
アガリクスのような担子菌類の菌糸体及びプロポリスには、いずれも抗癌作用及び抗菌作用があることが知られている。例えば特許文献１には、アガリクス及びプロポリス並びにアマゾン酵素の三者に共通する溶剤を用いて、それぞれのエキスを別々若しくは複合して抽出し、その一種類又は二種類若しくは三種類混合液化し、飲食料品に混入又は添加して保存貯蔵を可能とする方法によって製造された飲食料品が開示されている。
【特許文献１】特開平１０−２１５８３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、鋭意研究の結果、アガリクスのような担子菌類を利用して、プロポリスを変換することにより、プロポリス単独、担子菌類単独又はその両方でそれぞれ発揮される抗癌作用のような生理作用よりも飛躍的に高い生理作用を発揮させ得ることを見出した。そして、これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。本発明の目的とするところは、抗癌作用のような生理作用を効果的に発揮することが可能なプロポリス変換物、その製造方法及び健康食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載のプロポリス変換物は、担子菌類を利用してプロポリスを変換してなることを要旨とする。
請求項２に記載のプロポリス変換物は、請求項１に記載の発明において、前記担子菌類の菌糸体により前記プロポリスを発酵処理してなることを要旨とする。
【０００５】
請求項３に記載のプロポリス変換物は、請求項１に記載の発明において、前記担子菌類の菌糸体由来の酵素により前記プロポリスを酵素処理してなることを要旨とする。
請求項４に記載の発明は、請求項２に記載のプロポリス変換物を製造する方法であって、前記担子菌類の菌糸体を前記プロポリスに接種し、該菌糸体により前記プロポリスを発酵処理する工程を備えることを要旨とする。
【０００６】
請求項５に記載の発明は、請求項３に記載のプロポリス変換物を製造する方法であって、前記担子菌類の菌糸体由来の酵素を前記プロポリスに作用させ、該酵素により前記プロポリスを酵素処理する工程を備えることを要旨とする。
【０００７】
請求項６に記載の健康食品は、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のプロポリス変換物を含有することを要旨とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、抗癌作用のような生理作用を効果的に発揮することが可能なプロポリス変換物、その製造方法及び健康食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明のプロポリス変換物、その製造方法及び健康食品を具体化した一実施形態を説明する。
本実施形態のプロポリス変換物は、担子菌類を利用して、プロポリスを変換してなるものである。前記プロポリスを変換するとは、担子菌類の菌糸体又は該菌糸体によって生産される酵素等の生産物により、プロポリス中に含まれる少なくとも一種の化合物を、異なる構造を有する化合物に変換することを意味する。本実施形態のプロポリス変換物は、主として、プロポリス発酵物及びプロポリス酵素処理物の２種類に分類される。プロポリス発酵物は、担子菌類の菌糸体によりプロポリスを発酵処理することにより得られ、プロポリス酵素処理物は、担子菌類の菌糸体由来の酵素によりプロポリスを酵素処理することにより得られる。
【００１０】
これらのプロポリス変換物は、プロポリス単独、担子菌類単独又はその両方でそれぞれ発揮される抗癌作用よりも、飛躍的に高い抗癌作用を発揮することが可能である。なお、プロポリス変換物によって発揮される抗癌作用は、癌細胞及び癌化しつつある異常細胞のいずれに対しても有効である。このため、プロポリス変換物は、抗癌剤として利用可能であるとともに、癌の発生を予防する癌予防剤として利用することも可能である。即ち、本実施形態のプロポリス変換物は、健康食品のような飲食品、医薬品、医薬部外品等の用途に利用可能である。プロポリス変換物をこのような用途に利用する場合の投与経路は、経口及び非経口のいずれでもよい。経口投与の剤型としては、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、散剤等が挙げられ、非経口投与の剤型としては、点眼剤、注射剤、点鼻剤等が挙げられる。これらの剤型は、汎用技術により製剤化される。
【００１１】
ちなみに、健康食品の場合、プロポリス変換物を０．０１〜５０質量％含有していることが好ましく、０．０１〜２５質量％含有していることがより好ましく、０．１〜１０質量％含有していることがさらに好ましい。健康食品中に含有されるプロポリス変換物の含量が０．０１質量％未満の場合、十分な抗癌作用を発揮させることができず、逆に５０質量％を超える場合、不経済である。
【００１２】
次に、プロポリス変換物の製造方法について説明する。
本実施形態の製造方法で用いられる担子菌類としては、あらゆる種類のものが使用可能であるが、アガリクス（Agaricus blazei Murill）、冬虫夏草（Cordyceps militaris）、霊芝（Ganoderma lucidum）、カバノアナタケ（Fuscoporia oblique）等が好適に使用される。これらの担子菌類のうち、高い抗癌作用を有するプロポリス変換物を製造可能であることから、アガリクスを利用することが特に好ましい。菌糸体は、担子菌類の子実体から採取して利用しても良いし、寄託機関等から入手して利用しても良い。ちなみに、アガリクスの菌糸体は、高いラッカーゼ活性を有しており、該ラッカーゼ活性は、プロポリス中に含まれる少なくとも一種の化合物を、異なる構造を有する化合物に変換させやすくすると考えられる。
【００１３】
本実施形態の製造方法で用いられるプロポリスとしては、プロポリス原塊を公知の抽出方法によって抽出したプロポリス抽出物が好適に使用される。
プロポリス原塊は、ミツバチが樹木の特定部位、主として新芽や蕾及び樹皮から採取したガム質、樹液、植物色素系の物質及び香油等の集合体に、ミツバチ自身の分泌物や蜂ロウ等を混合して作製した暗緑色や褐色から暗褐色を呈した粘着性のある樹脂状の固形天然物質である。プロポリス抽出物を得るために用いられるプロポリス原塊としては、ブラジルを含む南アメリカ諸国、中国や日本等のアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、オセアニア諸国等のあらゆる産地のものが使用可能である。
【００１４】
プロポリス抽出物としては、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物、含水アルコール抽出物、有機溶媒抽出物、超臨界抽出物、ミセル化抽出物等が挙げられるが、高い抗癌作用を有する成分を容易かつ多量に抽出可能であることから、プロポリスのアルコール抽出物を使用することが特に好ましい。アルコール抽出物を調製するために用いられるアルコールは、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコールであることが好ましく、プロポリス変換物を経口投与する場合には、エタノールであることが特に好ましい。なお、プロポリスのアルコール抽出物中には、クロロゲン酸、ｐ−クマル酸、カフェ酸、４，５−ジカフェオイルキナ酸、３，５−ジカフェオイルキナ酸、３，４−ジカフェオイルキナ酸、３，４，５−トリカフェオイルキナ酸、ドルパニン、フラボノイド類、アルテピリンＣ、バッカリン等が含まれている。また、有機溶媒抽出物を調製するために用いられる有機溶媒としては、アセトンやヘキサン等の公知の有機溶媒が使用可能である。
【００１５】
次に、プロポリス発酵物の製造方法について説明する。
本実施形態のプロポリス発酵物の製造方法では、担子菌類の菌糸体をプロポリスに接種し、該菌糸体によりプロポリスを発酵処理する工程を備えている。なお、発酵処理する工程に先立って、担子菌類の菌糸体を前培養することにより、該担子菌類の菌糸体をあらかじめ活性化させておくことが好ましい。ちなみに、発酵処理する工程に先立って、担子菌類の胞子を前培養することにより、活性化された菌糸体を調製することも可能である。
【００１６】
発酵処理では、担子菌類の菌糸体の培養に適した培地、温度、振とう速度等の処理条件を適宜選択すればよい。発酵処理及び前培養では、担子菌類の菌糸体をより早く増殖させることが可能な培地を選択することが好ましい。このような培地には、通常、糖分、酵母エキス、ペプトン、塩類等が含有されている。また、培地には、プロポリス抽出物を調製する際に用いられたアルコールや有機溶媒等が、菌糸体の培養を阻害しない程度の低濃度で含有されていても構わない。
【００１７】
発酵処理を実施する時間、即ち発酵時間は、特に限定されないが、好ましくは０．５〜３００時間、より好ましくは０．５〜１５０時間、さらに好ましくは３〜７２時間である。発酵時間が０．５時間未満の場合、プロポリス発酵物の抗癌作用を十分に高めることができず、逆に発酵時間が３００時間を越える場合、プロポリス発酵物の製造コストが上昇するために好ましくない。
【００１８】
発酵処理する工程を実施した後の発酵処理物は、そのままの状態でプロポリス発酵物として利用することが可能であるうえ、スプレードライや、凍結乾燥等の公知の乾燥処理を行うことにより、粉末状のプロポリス発酵物として利用することも可能である。なお、得られたプロポリス発酵物に対して、さらに公知の精製方法を実施することも可能であるうえ、汎用技術により様々な剤形の製剤に加工（製剤化）することも可能である。
【００１９】
次に、プロポリス酵素処理物の製造方法について説明する。
本実施形態のプロポリス酵素処理物の製造方法では、担子菌類の菌糸体由来の酵素をプロポリスに作用させ、該酵素によりプロポリスを酵素処理する工程を備えている。酵素処理では、担子菌類の菌糸体若しくは該菌糸体の培養上清から精製（粗精製も含む）された酵素、又は、担子菌類からクローニングされた酵素遺伝子を強制発現する形質転換体若しくは該形質転換体の培養上清から精製（粗精製も含む）された酵素を用いることが可能である。このような酵素としては、ラッカーゼのような酸化酵素が挙げられる。なお、菌糸体、形質転換体又はそれらの培養上清から酵素を精製する場合、透析や公知のカラム処理等が実施され、好ましくは酵素が濃縮されるような条件で透析やカラム処理等が実施される。また、酵素処理では、最も簡便には、担子菌類の菌糸体を培養した培養上清が用いられる。
【００２０】
担子菌類の菌糸体由来の酵素をプロポリスに作用させる場合、該酵素は、ラッカーゼ活性として２００Ｕ／ｍＬ以上の酵素量となるようにプロポリスに添加されることが好ましい。ここで、前記ラッカーゼ活性は、基質としてのシリンガルダジン（syringaldazine）を含む反応溶液３ｍＬ（ｐＨ６．５、３０℃）中で、５３０ｎｍにおける吸光度を１分間に０．００１増加させる酵素活性の量を１Ｕ（ユニット）とする。
【００２１】
酵素処理を実施する時間、即ち酵素処理時間は、特に限定されないが、好ましくは０．５〜３００時間、より好ましくは０．５〜１５０時間、さらに好ましくは３〜７２時間である。酵素処理時間が０．５時間未満の場合、プロポリス酵素処理物の抗癌作用を十分に高めることができず、逆に酵素処理時間が３００時間を越える場合、プロポリス酵素処理物の製造コストが上昇するために好ましくない。
【００２２】
酵素処理する工程を実施した後の酵素処理物は、そのままの状態でプロポリス酵素処理物として利用することが可能であるうえ、スプレードライや、凍結乾燥等の公知の乾燥処理を行うことにより、粉末状のプロポリス酵素処理物として利用することも可能である。なお、得られたプロポリス酵素処理物に対して、さらに公知の精製方法を実施することも可能であるうえ、汎用技術により様々な剤形の製剤に加工（製剤化）することも可能である。
【００２３】
前記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ 本実施形態のプロポリス変換物は、担子菌類を利用して、プロポリスを生物学的に変換することにより得られる。このプロポリス変換物では、担子菌類の生物学的作用により、プロポリス中に含まれる少なくとも一種の化合物が異なる構造を有する化合物に変換されるため、その変換後の化合物に起因して、プロポリス単独、担子菌類単独又はその両方でそれぞれ発揮される生理作用よりも飛躍的に高い生理作用を発揮することが可能である。特に、担子菌類に由来するラッカーゼ様の酵素作用により高分子化された化合物が高い抗癌作用を発揮するものと考えられるが、このような高分子化された化合物が変換前のプロポリス及び担子菌類のいずれにもほとんど存在していないことは極めて重要である。
【００２４】
・ 本実施形態のプロポリス変換物は、担子菌類の菌糸体によりプロポリスを発酵処理すること、又は、担子菌類の菌糸体由来の酵素によりプロポリスを酵素処理することにより得られる。従って、プロポリス変換物の製造にかかる手間を容易に低減させることが可能であるため、プロポリス変換物を容易かつ安価に提供することが可能となる。
【実施例】
【００２５】
＜プロポリスのエタノール抽出物（抽出液）の調製＞
プロポリス原塊１．２ｋｇに９５％エタノール溶液４Ｌを加え、常温で１２時間エタノール抽出した後、珪藻土ろ過後に脱ロウすることにより、プロポリスのエタノール抽出物を得た。このエタノール抽出物を濃縮後、乳化剤（キラヤニンＳ−１００（丸善化成株式会社製、キラヤ抽出物２５％含有））を１０％添加し、プロポリス固形分２０％程度のエタノール抽出液を作製した。
【００２６】
＜プロポリス変換物の調製＞
（実施例１）アガリクス菌糸体によるプロポリス発酵物の製造１
２．４ｇ／Ｌの濃度のポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ）培地（Ｄｉｆｃｏ製）で培養したアガリクス菌糸体（（有）ニューピアーズより子実体入手）を集菌し、乾燥させた。次に、乾燥菌糸体を１ｍＬあたり０．００３５ｇの濃度となるように、０．２４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地に懸濁することにより、アガリクス培養液を調製した。続いて、ミニシェーカー（ＩＷＡＫＩ製）を用いて、アガリクス培養液を２５℃、１００ｒｐｍで６日間振とうすることにより前培養した後、前記エタノール抽出液（プロポリス固形分２０％程度）を固形分の終濃度が０．５％となるように添加し、４０℃で３．５時間撹拌することにより、発酵処理を行った。発酵処理後のアガリクス培養液を凍結乾燥することにより、プロポリス発酵物とした。
【００２７】
（実施例２）アガリクス菌糸体によるプロポリス発酵物の製造２
ポテトデキストロースアガー（ＰＤＡ）（Ｎｉｓｓｕｉ製）よりなる寒天培地を用いて、アガリクス菌糸体を２５℃、暗所で２〜３週間培養した。その後、寒天培地上で増殖したアガリクス菌糸体をかきとり、２．４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地５０ｍＬを入れたフラスコに添加し、５〜１０日間静置することにより前培養した。次に、このフラスコ（乾燥菌糸体重量１１３ｍｇに相当）内の培地をＰＹＳ培地（０．３％ポリペプトン、０．３％酵母エキス、１％ショ糖；いずれもナカライテスク製）５Ｌに添加し、ミニジャーファーメンター（高崎科学機器製）にて、通気０．５Ｌ／分、撹拌１００ｒｐｍの培養条件で１０〜１５日間通気培養（前培養）した。通気培養後の菌糸体を集菌後、０．２４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地に懸濁してアガリクス懸濁液を調製し、さらに該アガリクス懸濁液に前記エタノール抽出液（プロポリス固形分２０％程度）を固形分の終濃度が０．５％となるように添加し、４０℃で７２時間撹拌することにより、発酵処理を行った。発酵処理後のアガリクス懸濁液を凍結乾燥することにより、プロポリス発酵物とした。
【００２８】
（実施例３）冬虫夏草菌糸体によるプロポリス発酵物の製造
２．４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地で培養した冬虫夏草（Cordyceps militaris）菌糸体（ＩＦＯ５２９８）を集菌し、乾燥させた。次に、乾燥菌糸体を１ｍＬあたり０．００３５ｇの濃度となるように、０．２４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地に懸濁することにより、冬中夏草培養液を調製した。続いて、ミニシェーカー（ＩＷＡＫＩ製）を用いて、冬中夏草培養液を２５℃、１００ｒｐｍで３日間振とうすることにより前培養した後、前記エタノール抽出液（プロポリス固形分２０％程度）を固形分の終濃度が０．５％となるように添加し、４０℃で７２時間撹拌することにより、発酵処理を行った。発酵処理後の冬中夏草培養液を凍結乾燥することにより、プロポリス発酵物とした。
【００２９】
（実施例４）霊芝菌糸体によるプロポリス発酵物の製造
２．４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地で培養した霊芝（Ganoderma lucidum）菌糸体（ＩＦＯ８３４６）を集菌し、乾燥させた。次に、乾燥菌糸体を１ｍＬあたり０．００３５ｇの濃度となるように、０．２４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地に懸濁することにより、霊芝培養液を調製した。続いて、ミニシェーカー（ＩＷＡＫＩ製）を用いて、霊芝培養液を２５℃、１００ｒｐｍで３日間振とうすることにより前培養した後、前記エタノール抽出液（プロポリス固形分２０％程度）を固形分の終濃度が０．５％となるように添加し、４０℃で７２時間撹拌することにより、発酵処理を行った。発酵処理後の霊芝培養液を凍結乾燥することにより、プロポリス発酵物とした。
【００３０】
（実施例５）カバノアナタケ菌糸体によるプロポリス発酵物の製造
２．４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地で培養したカバノアナタケ（Fuscoporia oblique）菌糸体（ＩＦＯ８６８１）を集菌し、乾燥させた。次に、乾燥菌糸体を１ｍＬあたり０．００３５ｇの濃度となるように、０．２４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地に懸濁することにより、カバノアナタケ培養液を調製した。続いて、ミニシェーカー（ＩＷＡＫＩ製）を用いて、カバノアナタケ培養液を２５℃、１００ｒｐｍで３日間振とうすることにより前培養した後、前記エタノール抽出液（プロポリス固形分２０％程度）を固形分の終濃度が０．５％となるように添加し、４０℃で７２時間撹拌することにより、発酵処理を行った。発酵処理後の霊芝培養液を凍結乾燥することにより、プロポリス発酵物とした。
【００３１】
（実施例６）アガリクス菌糸体培養上清によるプロポリス酵素処理物の製造
２．４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地で培養したアガリクス菌糸体の培養上清を回収した後、蒸留水に対して透析することにより、菌糸体外酵素溶液を得た。該菌糸体外酵素溶液に対して、前記エタノール抽出液（プロポリス固形分２０％程度）を固形分の終濃度が０．５％となるように添加し、４０℃で７２時間反応させることにより、酵素処理を行った。酵素処理後の反応液を凍結乾燥することにより、プロポリス酵素処理物とした。なお、菌糸体外酵素溶液は、酵素活性の目安として、２００Ｕ／ｍＬのラッカーゼ活性を発揮する濃度となるように反応液中に加えられた。
【００３２】
＜予備検討＞疑似プロポリス変換物の成分変化
担子菌類の菌糸体は、ラッカーゼ等の酵素を菌体外に生産することが知られている。このため、プロポリス発酵物及びプロポリス酵素処理物ではいずれも、プロポリス中の成分にラッカーゼによる酸化反応が引き起されているものと考えられる。そこで、プロポリスのエタノール抽出物にラッカーゼ（ＳＩＧＭＡ製）を２００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、４０℃で７２時間反応させたときの分子量の変化を下記分析条件にて分析した。なお、ラッカーゼを添加していない試料（プロポリスのみ）についても同条件で分析した。分析結果の一部であるクロマトグラムチャートを図１（ａ）、（ｂ）に示す。
【００３３】
分析条件（ゲルろ過）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（７．５ｍｍＩＤ×３０ｃｍ）
ガードカラム：ＴＳＫ−ＧＵＡＲＤ ＣＯＬＭＵＮ（７．５ｍｍＩＤ×７５ｍｍ）
溶媒：０．０５Ｍリン酸緩衝液＋０．３Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７）
流速：１ｍＬ／分
温度：２５℃
検出：２２０ｎｍ
図１（ａ）、（ｂ）より、酵素無添加のもの（プロポリスのみ）と比較して、酵素を添加したもの（プロポリス＋ラッカーゼ）では、分子量の大きな成分が多く検出されており、プロポリス中の成分が、ラッカーゼにより高分子化されていることが強く示唆される。
【００３４】
＜本試験＞プロポリス発酵物の成分変化
前記エタノール抽出液（プロポリス固形分２０％程度）及び実施例１のプロポリス発酵物について、それぞれ前記＜予備検討＞と同様に分子量の変化を分析した。分析結果の一部であるクロマトグラムチャートを図２（ａ）、（ｂ）に示す。その結果、図２（ａ）、（ｂ）に示すように、＜予備検討＞の場合と全く同様の結果が得られた。即ち、発酵処理することによって、プロポリス中に含まれる化合物の一部が高分子化されていることが示された。ちなみに、＜予備検討＞において高分子化された化合物と、＜本試験＞において高分子化された化合物とは、クロマトグラムチャートにおける保持時間が同じであるため、同一の化合物であることが強く示唆される。この場合、ラッカーゼ処理されたプロポリスでも、プロポリス発酵物と同様の生理作用が発揮されるはずである。
【００３５】
＜プロポリス発酵物の抗癌作用１＞
ｄｄＹ系マウスに継代されているＳａｒｃｏｍａ１８０細胞をマウス腹水より採取し、生理食塩水で目的の細胞濃度となるように調整した。次に、中部科学資材株式会社より購入したｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）の背部に、Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を１×１０７細胞／マウスの移植量となるように皮下移植した。Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を移植したマウスを第一群から第三群（各群１０匹ずつ）に分けた。第一群には、生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇの投与量で２８日間連続腹腔内投与した。第二群には、実施例１のプロポリス発酵物を生理食塩水に懸濁したものを１０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍＬの投与量で、２８日間連続腹腔内投与した。第三群には、抗癌剤としてのカルボクリン（日本ケミファ（株）製）を１０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍＬの投与量で、２８日間連続腹腔内投与した。移植後２８日目に各群のマウスから腫瘍を摘出し、その重量をそれぞれ測定した。結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
その結果、プロポリス発酵物を投与した第二群では、第一群と比較して、腫瘍重量が有意に低下した（ｐ＜０．０１）。プロポリス発酵物の抗癌作用は、抗癌剤カルボクリンよりも若干劣るが、十分に高い抗癌作用を有していることが示された。
【００３７】
＜プロポリス発酵物の抗癌作用２＞
＜プロポリス発酵物の抗癌作用１＞と同様の方法にてプロポリス発酵物の抗癌作用について検討した。なお、ここでは、生理食塩水及び実施例１のプロポリス発酵物を腹腔内投与したものに加えて、実施例１で集菌したアガリクス菌糸体の乾燥菌糸体を生理食塩水に懸濁したもの、プロポリスのエタノール抽出物を生理食塩水に懸濁したもの、並びに、前記乾燥菌糸体及びエタノール抽出物の混合物についても同様に腹腔内投与した。各サンプルの投与量及び各群のマウスから摘出された腫瘍重量をそれぞれ表２に示す。
【００３８】
【表２】
その結果、アガリクス菌糸体投与群及びプロポリス発酵物投与群では、生理食塩水投与群と比較して、それぞれｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１で有意に腫瘍重量が低下した。また、エタノール抽出物投与群及び混合物投与群では、生理食塩水投与群と比較して、いずれも腫瘍重量が低下する傾向が認められた（ｐ＜０．１）。これらの結果より、プロポリス発酵物は、エタノール抽出物、アガリクス菌糸体、及び両者の混合物よりも飛躍的に高い抗癌作用を有していることが確認された。
【００３９】
＜プロポリス変換物の抗癌作用＞
ｄｄＹ系マウスに継代されているＥｈｒｌｉｃｈ細胞をマウスの腹水より採取し、滅菌生理食塩水で目的の細胞濃度となるように調整した。次に、表３に示す各サンプル（いずれも蒸留水に懸濁）をｄｄＹ系雄性マウス（６週齢、体重３０ｇ前後）に対し、１日１回の割合で７日間、同表に示す投与量で経口投与した。７日間の経口投与後、６×１０６のＥｈｒｌｉｃｈ細胞を各マウスの腹腔内に移植した。その後、引き続き、表３に示す各サンプルを同じ投与量で６日間経口投与した。各サンプルを経口投与してから１５日目に、各マウスの腹水を採取した。採取後の腹水について、全容積（ＴＶ；total volume）を測定した後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して腫瘍細胞を分離し、その分離された腫瘍細胞容積（ＰＣＶ；packed cell volume）を測定した。また、ＴＶよりＰＣＶを差し引くことにより、腹水容積（ＥＶ；exudate volume）を求めた。これらの結果を表３に示す。なお、表３に示す５−ＦＵは、抗癌剤５−フルオロウラシル（ナカライテスク製）を表す。
【００４０】
【表３】
その結果、エタノール抽出物投与群、実施例１，２のプロポリス発酵物投与群及び５−ＦＵ投与群では、いずれも蒸留水投与群と比較して、ＰＣＶが有意に低下した。よって、これらのサンプルは、経口投与によって、高い抗癌作用を発揮することが示された。さらに、これらのサンプルを投与した群では、いずれもＥＶ及びＴＶに関しても同様の傾向が見られた。特に、発酵処理を７２時間行った実施例２では、発酵処理を３．５時間しか行っていない実施例１と比べて、ＰＣＶが著しく低下している。従って、発酵処理を長時間実施することにより、プロポリス発酵物の抗癌作用が顕著に高められることが明確に示された。なお、アガリクス菌糸体及びエタノール抽出物の混合物を投与した群では、抗癌作用が認められなかった点も重要である。一方、実施例６のプロポリス酵素処理物投与群にも、ＰＣＶ、ＥＶ及びＴＶの減少傾向が認められた。
【００４１】
なお、本実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・ プロポリス原塊に担子菌類の菌糸体を直接接種することにより、発酵処理を実施することも可能である。また、プロポリス原塊に担子菌類の菌糸体由来の酵素を作用させることにより、酵素処理を実施することも可能である。
【００４２】
・ プロポリスに対して、発酵処理及び酵素処理の両方を実施することにより、プロポリス変換物を得ることも可能である。なおこの場合、発酵処理及び酵素処理を実施するタイミングは、同時であっても異なっていてもいずれでもよい。
【００４３】
・ プロポリス変換物は、抗癌作用以外の生理作用も発揮し得るため、抗癌剤及び癌予防剤以外の効能・効果を有する健康食品や医薬品に利用することが可能である。
本発明を応用した技術として、プロポリスにラッカーゼを作用させることにより、ラッカーゼ処理プロポリスを提供することができる。このラッカーゼ処理プロポリスは、上記実施形態のプロポリス変換物と同様に、抗癌作用のような生理作用を効果的に発揮することが可能である。
【００４４】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・ 前記担子菌類はアガリクスである請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のプロポリス変換物。前記プロポリスはプロポリス抽出物である請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のプロポリス変換物。
【００４５】
・ 前記酵素処理は、前記担子菌類の菌糸体の培養上清を用いて実施されることを特徴とする請求項３に記載のプロポリス変換物。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】（ａ）、（ｂ）は実施例の疑似プロポリス変換物の成分変化の結果を示すクロマトグラムチャート。
【図２】（ａ）、（ｂ）は実施例のプロポリス発酵物の成分変化の結果を示すクロマトグラムチャート。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌類を利用してプロポリスを変換してなるプロポリス変換物。
【請求項２】
前記担子菌類の菌糸体により前記プロポリスを発酵処理してなることを特徴とする請求項１に記載のプロポリス変換物。
【請求項３】
前記担子菌類の菌糸体由来の酵素により前記プロポリスを酵素処理してなることを特徴とする請求項１に記載のプロポリス変換物。
【請求項４】
請求項２に記載のプロポリス変換物を製造する方法であって、
前記担子菌類の菌糸体を前記プロポリスに接種し、該菌糸体により前記プロポリスを発酵処理する工程を備えることを特徴とするプロポリス変換物の製造方法。
【請求項５】
請求項３に記載のプロポリス変換物を製造する方法であって、
前記担子菌類の菌糸体由来の酵素を前記プロポリスに作用させ、該酵素により前記プロポリスを酵素処理する工程を備えることを特徴とするプロポリス変換物の製造方法。
【請求項６】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のプロポリス変換物を含有する健康食品。
【請求項１】
担子菌類を利用してプロポリスを変換してなるプロポリス変換物。
【請求項２】
前記担子菌類の菌糸体により前記プロポリスを発酵処理してなることを特徴とする請求項１に記載のプロポリス変換物。
【請求項３】
前記担子菌類の菌糸体由来の酵素により前記プロポリスを酵素処理してなることを特徴とする請求項１に記載のプロポリス変換物。
【請求項４】
請求項２に記載のプロポリス変換物を製造する方法であって、
前記担子菌類の菌糸体を前記プロポリスに接種し、該菌糸体により前記プロポリスを発酵処理する工程を備えることを特徴とするプロポリス変換物の製造方法。
【請求項５】
請求項３に記載のプロポリス変換物を製造する方法であって、
前記担子菌類の菌糸体由来の酵素を前記プロポリスに作用させ、該酵素により前記プロポリスを酵素処理する工程を備えることを特徴とするプロポリス変換物の製造方法。
【請求項６】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のプロポリス変換物を含有する健康食品。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−５５９２７（Ｐ２００７−５５９２７Ａ）
【公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２４２３３４（Ｐ２００５−２４２３３４）
【出願日】平成１７年８月２４日（２００５．８．２４）
【出願人】（５９１０４５４７１）アピ株式会社 (59)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月２４日（２００５．８．２４）
【出願人】（５９１０４５４７１）アピ株式会社 (59)
【Ｆターム（参考）】
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