ヘッド−テイル型共重合体の中空ナノ微粒子
【課題】水中で安定であり、特定の環境下で崩壊する中空ナノ微粒子及びその製造方法を提供することを課題とする。
【解決手段】ポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体のベシクルからなり、ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋されている水中で安定な中空ナノ微粒子により、上記課題を解決する。
【解決手段】ポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体のベシクルからなり、ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋されている水中で安定な中空ナノ微粒子により、上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジスルフィド架橋により水中で安定化された中空ナノ微粒子に関し、より詳細にはポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体のベシクルからなり、該ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋されている水中で安定な中空ナノ微粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブロック共重合体が選択溶媒中での自己組織化により形成する多分子集合体は、高分子ミセルやロッド、ラメラ、ベシクルなど様々な形態をとることが報告されている(非特許文献１〜４)。
樹木状高分子であるポリアミドアミン(ＰＡＭＡＭ)デンドロンとポリペプチドであるポリ-Ｌ-リシン(ＰＬＬ)からなるヘッド-テイル型ブロック共重合体は、水/高濃度メタノール混合溶媒中で、自己組織化によりベシクルを形成することが知られている(非特許文献５〜７)。
【０００３】
上記のヘッド-テイル型ブロック共重合体が高濃度メタノール/水混合溶媒中で形成するベシクルは、水中に移行すると崩壊してしまう。ベシクル構造を維持するために分散媒としてメタノール含有溶媒を必要とする限り、該ベシクルからなる中空ナノ微粒子を、例えば遺伝子ベクターやドラッグデリバリーシステム(ＤＤＳ)として応用・発展させることはできない。
【０００４】
そこで、テイル間に不可逆的架橋を導入することにより水中で安定化されたヘッド-テイル型共重合体(ＰＡＭＡＭデンドロン−ポリ-Ｌ-リシン)の中空ナノ微粒子及びその製造方法が開発されている(非特許文献９及び特許文献１)。
この技術による中空ナノ微粒子において、ベシクル内部に保持された物質は、周囲環境のｐＨ低下に伴い放出されるか又は(物質がアニオン性である場合には)自発的に漏出する。いずれにしても、物質は、重合体からなる殻を通過する必要があり、その結果、物質の放出/漏出は緩慢である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２６９９９８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】van Hest, J. C. M.; Delnoye, D. A. P.; Baars, M. W. P. L.; van Genderen, M. H. P.; Meijer, E. W. Science 1995, 268, 1592-1595
【非特許文献２】Vandermeulen, G. W. M.; Klok, H. A. Macromol. Biosci. 2004, 4, 383-398
【非特許文献３】Klok, H. A.; Lecommandoux, S. Adv. Mater. 2001, 13, 1217-1229
【非特許文献４】Kim, K. T. K.; Winnik, M. A.; Manners, I. Soft Matter 2006, 2, 957-965
【非特許文献５】高分子学会予稿集55巻１号1276頁 平成18年５月10日発行
【非特許文献６】第53回高分子研究発表会(神戸)予稿集138頁 平成19年７月20日発行
【非特許文献７】高分子学会予稿集56巻２号5058頁 平成19年９月４日発行
【非特許文献８】Kakizawa, Y., Harada, A.及びKataoka, K., Biomacromolecules, 2: 491-497 (2001)
【非特許文献９】Harada, A.; Ichimura, S.; Yuba, E.; Kono, K. Soft Matter 2011, 7, 4629-4635
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
物質(特に、遺伝子や薬物のような治療薬)の送達という観点からは、目的の部位に到達した後は、ベシクルが崩壊することにより内部に保持された物質が速やかに放出されることが好都合である場合が多い。
例えば、(特に動物)細胞内は、還元剤であるグルタチオンが、細胞外に比べ１０〜１００倍高い濃度(１〜１００ｍＭ)で存在し、還元環境にあることが知られている(非特許文献８)。
よって、水中で安定であるが、特定の環境(例えば、所定の還元環境)下で崩壊する中空ナノ微粒子についての必要性が存在していた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は、ポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体のベシクルからなり、ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋されている水中で安定な中空ナノ微粒子を提供する。
【０００９】
また、本発明は、上記ヘッド-テイル型ブロック共重合体を１００/０〜５０/５０の水/水と混和性のアルコール混合溶媒に溶解させ；得られる溶液に、水/アルコール比が３０/７０〜０/１００となるまでアルコールを滴下して、該ブロック共重合体を中空ナノ微粒子に自己組織化させ；得られた自己組織体においてポリ-Ｌ-リシンにチオール基含有リンカーを導入し；酸化条件下でチオール基含有リンカー間にジスルフィド結合を生成させてテイル部をジスルフィド架橋することを含んでなる、水中で安定な中空ナノ微粒子の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の中空ナノ微粒子によれば、例えば運搬体/送達剤(ベクター、キャリア又はＤＤＳ製剤)として利用可能な、水中で安定であるが特定の還元環境/条件下で崩壊する中空ナノ微粒子が提供される。
本発明の中空ナノ微粒子の製造方法によれば、単分散の上記中空ナノ微粒子が容易に製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】水/メタノール溶媒中におけるＰＡＭＡＭ-ＰＬＬの自己組織化ベシクルの粒径分布を示す。
【図２】本発明の中空ナノ微粒子(ジスルフィド架橋ベシクル)の透過型電子顕微鏡写真である。
【図３】水中における本発明の中空ナノ微粒子の粒径分布を示す。
【図４】本発明の中空ナノ微粒子の1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】本発明の中空ナノ微粒子の平均粒径のｐＨ依存性を示す。
【図６】種々の濃度のグルタチオン存在下における、本発明の中空ナノ微粒子(ジスルフィド架橋型中空ナノ微粒子)及び不可逆的架橋型中空ナノ微粒子を含む溶液の散乱光強度の時間に対する変化を示す。
【図７】種々の濃度のＤＴＴ存在下における、本発明の中空ナノ微粒子を含む溶液の散乱光強度の時間に対する変化を示す。
【図８】ローダミン６Ｇを内包し、フルオレセインで標識された(Ａ)不可逆的架橋型中空ナノ微粒子及び(Ｂ)本発明のジスルフィド架橋型中空ナノ微粒子とインキュベートしたＨｅＬａ細胞におけるローダミン６Ｇ(赤色蛍光)及びフルオレセイン(緑色蛍光)の細胞内分布を示す共焦点顕微鏡写真及び重ね合わせ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜中空ナノ微粒子＞
本発明の中空ナノ微粒子は、ポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体のベシクルからなり、ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋されていることを特徴とする。この構成により、本発明の中空ナノ微粒子は水中で安定である(すなわち、水中でベシクル構造を維持できる)が、特定の還元環境条件下で崩壊する。本発明においては、特に言及しない限り、「水」は、還元剤を含有しない水を意味する。
【００１３】
本発明の中空ナノ微粒子は、好ましくは３００μＭ、より好ましくは５００μＭ以上、より好ましくは１ｍＭ以上のグルタチオンの存在下で崩壊する。
本発明において、ベシクルが「崩壊する」とは、必ずしも全てのベシクルが崩壊することを意味せず、所定の割合のベシクルが崩壊することをいう。所定の割合のベシクルの崩壊は、散乱光強度の低下として理解される。よって、例えば「３００μＭのグルタチオンの存在下で崩壊する」とは、還元剤を含まない水(例えば、蒸留水)中の中空ナノ微粒子分散液の散乱光強度を１００％としたとき、３００μＭのグルタチオン添加後８時間以内に散乱光強度が例えば４０％未満に低下することを意味するものとする。
【００１４】
ポリ-Ｌ-リシン間のジスルフィド架橋は、ポリ-Ｌ-リシンの側鎖アミノ基(εアミノ基)を介するが、水中で安定なベシクル構造を維持でき、特定の還元環境(例えば、３００μＭ以上のグルタチオンの存在)下で崩壊する限り、ポリ-Ｌ-リシンの全ての側鎖アミノ基がジスルフィド架橋に関与している必要はない。
【００１５】
好ましくは、ポリ-Ｌ-リシン間のジスルフィド架橋は、εアミノ基間の結合-Ｌ1-Ｓ-Ｓ-Ｌ2-による。前記式中、Ｌ1及びＬ2は独立して、-(ＣＨ2)n-、-Ｃ6Ｈ4-、-(ＣＨ2)n-Ｃ6Ｈ4-、-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)n-、-(ＣＨ2)m-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)p-、-(ＣＨ2)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)p-、-ＣＯ-(ＣＨ2)n-、-Ｃ(=ＮＨ2+)-(ＣＨ2)n-、-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-、-ＣＯ-(ＣＨ2)n-Ｃ6Ｈ4-、-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)n-、-ＣＯ-(ＣＨ2)m-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)p-、-ＣＯ-(ＣＨ2)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)p-又は-ＣＯ-(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)p-を表す。ここで、ｎ、ｍ及びｐはそれぞれ独立して１〜１４の整数であり(ただしｍ＋ｐ≦１４)、好ましくは１〜６の整数である。ｐはより好ましくは１〜３の整数である。
Ｌ1及びＬ2中のアルキレン基は置換されていてもよい。置換基は好ましくはＣ1〜4アルキル基である。
【００１６】
Ｌ1及びＬ2の具体例として、-Ｃ(=ＮＨ2+)-(ＣＨ2)3-、-ＣＯ-ＣＨ(ＮＨＣＯＣＨ3)-(ＣＨ2)2-、-ＣＯ-ＣＨ2-、-ＣＯ-(ＣＨ2)2-、-ＣＯ-(ＣＨ2)5-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)2-、-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-Ｃ(ＣＨ3)-、-ＣＯ-(ＣＨ2)5-ＮＨ-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-Ｃ(ＣＨ3)-、-ＣＯ-(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)4-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)2-及び-ＣＯ-(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)12-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)2-(ここで、前記のいずれの式においても、アルキレン基はＣ1〜4アルキル基で置換されていてもよい)が挙げられる。
【００１７】
本発明において、ポリアミドアミンデンドロンは、世代数が３.０〜４.０であることが好ましい。ポリアミドアミンデンドロンにおいて、好ましい繰り返し単位は、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜である。
末端基(又は表面基)は親水性基であり、例えばヒドロキシ基、アミノ基、(Ｃ1〜Ｃ4)アシル基、カルボキシル基、カルボキシル(Ｃ1〜Ｃ4)アルキル基、スルホ基、スルホ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキル基であり、好ましくはヒドロキシ基である。
【００１８】
繰り返し単位をＸ(好ましくは、Ｘ＝−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜)、末端基をＹとすると３.０世代のポリアミドアミンデンドロンは式：
−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ(Ｘ(Ｘ(ＸＹ2)2)2
で表され、４.０世代のポリアミドアミンデンドロンは式：
−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ((Ｘ(Ｘ(Ｘ(ＸＹ2)2)2)2
で表される。
【００１９】
１つの実施形態において、ポリアミドアミンデンドロンは３.５世代である。繰り返し単位が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜であり、末端基がカルボキシ基である３.５世代のポリアミドアミンデンドロンは、次式で表される。
【００２０】
【化１】
【００２１】
ポリ-Ｌ-リシン：
【化２】
(式中、ｎは重合度)
は、重合度が例えば６０〜１２０、好ましくは７０〜１１０である。
【００２２】
本発明の中空ナノ微粒子の粒径は、ナノメートルオーダーである。例えば、平均粒径は１００〜３００ｎｍであり得る。１つの好ましい実施形態において、粒径分布は単分散(例えば、多分散指数０.１５以下、より好ましくは０.１以下である。下限は特に限定されない(当然のことながら０以上である)が、例えば０.０３であり得る)である。
【００２３】
本発明の中空ナノ微粒子は、その表面を、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)−ポリカルボン酸ブロック共重合体でコーティングされていてもよい。コーティングにより、中空ナノ微粒子の生体適合性が向上する。
ＰＥＧ−ポリカルボン酸ブロック共重合体の例としては、ＰＥＧ−ポリアクリル酸(ＰＡＡ)共重合体、ＰＥＧ−ポリメタクリル酸(ＰＭＡ)共重合体、ＰＥＧ−ポリグリコール酸(ＰＡＧ)共重合体、ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸が挙げられる。
【００２４】
本発明の中空ナノ微粒子は、水性媒体、特に医薬的に許容され得る水性媒体(例えば、水、生理食塩水、緩衝化生理食塩水)に分散させた水性分散液として提供され得る。１つの好ましい実施形態において、水性分散液中の本発明の中空ナノ微粒子の粒径分布は単分散である。
【００２５】
本発明の中空ナノ微粒子は、好適には、繰り返し単位が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜であり、末端基が親水性基である３.０〜４.０世代(好ましくは３.５世代)のポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシン(重合度は６０〜１２０、より好ましくは７０〜１１０である)のテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体の１００/０〜５０/５０の水/メタノール混合溶媒の溶液に、該溶液の水/メタノールが３０/７０〜０/１００(より好ましくは２０/８０〜０/１００、より好ましくは２０/８０〜１０/９０)となるようにメタノールを滴下して形成される自己組織体において、ポリ-Ｌ-リシン(の側鎖アミノ基)にチオール含有リンカー(特に、２-イミノチオランに由来するもの)を導入し、酸化条件下でチオール基含有リンカー間にジスルフィド結合を生成させてテイル部をジスルフィド架橋して得られた中空ナノ微粒子である。
【００２６】
＜中空ナノ微粒子の製造方法＞
本発明の中空ナノ微粒子の製造方法は、
ポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体を、１００/０〜５０/５０の水/水と混和性のアルコール混合溶媒に溶解させ、
得られる溶液に、水/アルコール比が３０/７０〜０/１００となるまでアルコールを滴下して、該ブロック共重合体を中空ナノ微粒子に自己組織化させ、
得られた自己組織体においてポリ-Ｌ-リシンにチオール基含有リンカーを導入し、
酸化条件下でチオール基含有リンカー間にジスルフィド結合を生成させてテイル部をジスルフィド架橋することを含んでなることを特徴とする。
【００２７】
ヘッド-テイル型ブロック共重合体は、公知の方法(例えば、Bioconjugate Chem., 17, 3(2006)に記載の方法)に基づいて製造できる。
【００２８】
簡潔には、ヘッド部のポリアミドアミンデンドロンは、例えば、一方のアミノ基を保護したエチレンジアミンに、マイケル付加反応と続くエステルアミド交換反応とからなる１サイクルの反応を所望の世代数と同じ数のサイクル繰り返し、任意に(上記のような)末端基を付加することにより製造することができる。例えば、世代数３.５のポリアミドアミンデンドロンは、マイケル付加反応とエステルアミド交換反応とからなる反応サイクルを３.５サイクル繰り返す。ここで、「３.５サイクル」とは、３サイクルの反応後、マイケル付加反応を行い、エステルアミド交換反応を行わないことを意味する。
繰り返し単位が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜であるポリアミドアミンデンドロンを作製する場合、アクリル酸メチルを用いるマイケル付加反応とエチレンジアミンを用いるエステルアミド交換反応との反応サイクルを用いことができる。
【００２９】
一方、テイル部(ポリ-Ｌ-リシン)は、例えば、ε-ベンジルオキシカルボニル-Ｌ-リシン無水物の重合反応により製造できる。
ヘッド部とテイル部は、別々に製造した後に結合してもよいし、予め製造したヘッド部に対してテイル部を、又は予め製造したテイル部に対してヘッド部を形成してもよい。
【００３０】
このブロック共重合体は１００/０〜５０/５０の水/水と混和性のアルコール混合溶媒に容易に溶解する。水と混和性のアルコールとしては、好ましくは低級アルコール、より好ましくはＣ1〜Ｃ4アルコール、最も好ましくはメタノールである。
【００３１】
得られる溶液に、該溶液中の水/水と混和性のアルコール比３０/７０〜０/１００(好ましくは２０/８０〜０/１００、より好ましくは２０/８０〜１０/９０)までアルコールを滴下すると、ブロック共重合体が単分散の自己組織体(中空ナノ微粒子)を形成する。
【００３２】
この時点(ジスルフィド架橋処理前)の自己組織体は、水中又は高水/低アルコール混合溶媒中に移すとベシクル構造が崩壊し、ブロック共重合体は溶解する。
得られる自己組織体をジスルフィド架橋処理すると、自己組織体は、水中でもベシクル構造が維持されるようになる。
【００３３】
チオール含有リンカー-Ｌ-ＳＨ(式中：Ｌは上記Ｌ1及びＬ2について定義と同じ)は、第一級アミノ基と反応性であるチオール化剤を用いてポリ-Ｌ-リシンの側鎖アミノ基(εアミノ基)に導入することができる。第一級アミノ基と反応性であるチオール化剤は、例えば、２-イミノチオラン、そのＣ1〜4アルキル置換誘導体(Goff, D. A.及びCarroll, S. F., BioConjugate Chem., 1: 381-386 (1990))及びそれらの塩(好ましくは塩酸塩)、Ｎ-アセチルホモシステインチオラクトン(ＮＡＨＣＴ)、Ｎ-スクシンイミジルＳ-アセチルチオアセテート(ＳＡＴＡ)、スクシンイミジル３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)及びその誘導体(例えば、ＬＣ-ＳＰＤＰ(スクシンイミジル６-(３-[２-ピリジルジチオ]プロピオンアミド)ヘキサノエート)、スルホ-ＬＣ-ＳＰＤＰ、(ＰＥＧ)4又ハ12-ＳＰＤＰ)、４-スクシンイミジルオキシカルボニル-メチル(２-ピリジルジチオ)トルエン(ＳＭＰＴ)及びその誘導体(例えば、スルホ-ＬＣ-ＳＭＰＴ)、３,３'-ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(ＤＴＳＳＰ)、ジメチル３,３'-ジチオビスプロピオンイミデート(ＤＴＢＰ)である。
２-イミノチオラン、その誘導体及びそれらの塩並びにＮＡＨＣＴは、一段階での(ジスルフィド基のチオール基への還元工程を経ることなく)チオール基の導入が可能であるので好ましい。
【００３４】
チオール化剤は、自己組織体の分散媒体と同じ水/水と混和性のアルコール混合溶媒に溶解させて添加する。
チオール化剤の添加量は、ヘッド-テイル型共重合体のポリ-Ｌ-リシン中の側鎖アミノ基に対して例えば０.０１〜１０当量、好ましくは０.０５〜２当量、より好ましくは０.１〜１等量である。全量を１回で添加してもよいし、２回又はそれ以上に分けて添加してもよい。
チオール化剤として、ジスルフィド基-Ｓ-Ｓ-を含有するものを使用する場合、還元剤(例えば、ＤＴＴ)を用いてジスルフィド基-Ｓ-Ｓ-をチオール基-ＳＨに還元する。
その後、酸化条件下(例えば酸素バブリング下)で、チオール基間にジスルフィド結合を形成させる。
【００３５】
本発明の方法によれば、ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋され水中で安定な中空ナノ微粒子が、従来の分粒処理を要することなく、狭い単分散で取得することができる。
なお、適切な場合には、公知の方法(例えばフィルタリングや超音波処理)により更に分粒してもよい。
【実施例】
【００３６】
実施例１：ポリアミドアミン(ＰＡＭＡＭ)デンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシン(ＰＬＬ)のテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体から形成されるベシクルへのジスルフィド架橋導入による中空ナノ微粒子の調製
Haradaら(Bioconjugate Chem., 17, 3(2006))に記載される方法に従って、次式(２)で示されるヘッド-テイル型共重合体(ＰＡＭＡＭデンドロン世代数は３.５、ＰＬＬ数平均重合度は１０１) ５.０ｍｇに蒸留水５００μｌを加えて溶解させた後、更にメタノール５００μｌを加えた。
【００３７】
【化３】
【００３８】
続いて、攪拌しながら、メタノール１５００μｌを１５分かけて滴下し、溶媒組成を体積分率にして水：メタノール＝２：８にまで変化させ、該溶媒中で該ヘッド-テイル型共重合体のベシクルを形成させた。その後、再び５分間超音波を照射し、十分時間静置して粒径を安定させた後、形成されたベシクルの粒径を動的光散乱(ＤＬＳ)測定(レーザーゼータ電位計ELS-8000F、大塚電子株式会社製；２０℃)により確認した(図１)。Ｚ−平均粒径が１７４.９ｎｍの単分散なベシクルが形成されていることが確認された。
【００３９】
この溶液２.５ｍｌに、ＰＡＭＡＭデンドロン-ＰＬＬのリシン残基数(εアミノ基数)に対して０.１等量の２-イミノチオラン塩酸塩を滴下した。撹拌後、１日静置し、その後酸素バブリングを行った。更に２-イミノチオラン塩酸塩を合計０.２５当量となるように添加した。１日間の静置後、酸素バブリングを行った。
こうして、ＰＬＬ中の第一級アミンにチオール基を導入して、ＰＬＬ間にジスルフィド結合を生成させた。この反応のスキームを下記に示す。
【００４０】
【化４】
【００４１】
外相５００ｍｌの蒸留水に対して透析を行うことにより溶媒を水へと置換した。得られたジスルフィド架橋ベシクルの水中での形態を透過型電子顕微鏡(ＴＥＭ)観察(JEM-2000FEXII、日本電子株式会社製)により、粒径分布を上記と同様なＤＬＳ測定により確認した。得られたＴＥＭ写真を図２に、粒径分布を図３に示す。
【００４２】
ＴＥＭ観察により、中空ベシクル構造を有する粒径約２８０ｎｍの球状粒子が確認された。このことから、ＰＡＭＡＭデンドロン-ＰＬＬブロック共重合体の自己組織化ベシクルが、ＰＬＬ間のジスルフィド架橋により、水中で安定化されることが理解できる。また、観察された粒径は、下記に示すＤＬＳ測定による粒径分布とよい一致を示した。
【００４３】
ＤＬＳ測定により、Ｚ−平均粒径が２３８.４ｎｍの単分散な微粒子の存在が観察された。すなわち、ＤＬＳ測定によっても、ジスルフィド架橋によりベシクル構造が安定化され、水系溶媒中で安定に存在していることが確認された。また、架橋前のベシクルの水/メタノール混合溶媒中での粒径と比較すると、ジスルフィド架橋ベシクルの水中での粒径は６０ｎｍ程度大きい。この粒径増大は、ＰＬＬの第一級アミンが水中でプロトン化して正電位を帯びる結果、ＰＬＬ間の静電反発により粒径が増大したものと考えられる。
【００４４】
この溶液を凍結乾燥後、水で再構成させたところ、水中での中空ナノ微粒子の再分散が観察され、中空ナノ微粒子は凍結乾燥が可能であることが確認された。
よって、本発明の中空ナノ微粒子は、凍結乾燥による長期保存が可能であることが理解される。
【００４５】
＜チオール含有リンカーの導入率＞
次に、ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子を凍結乾燥により回収し、1Ｈ ＮＭＲによってチオール基含有リンカーの反応率を算出した。
回収したジスルフィド架橋中空ナノ微粒子を少量のＤＣｌを加えたＤ2Ｏに溶解して、1Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定した。得られたスペクトルを図４に示す。
【００４６】
架橋構造導入によって生成したジスルフィド結合に隣接するメチレンに由来する２.６ｐｐｍのピーク(ｘ)、ジスルフィド結合に対してβ位のメチレンに由来する２.１ｐｐｍのピーク(ｖ)、γ位のメチレンに由来する３.３ｐｐｍのピーク(ｗ)の積分値から、架橋剤はＰＬＬの側鎖の一級アミンの２２％と反応していると求められた。
【００４７】
＜チオール含有リンカーによるジスルフィド架橋の形成率＞
残存するチオール基を比色分析法であるＥｌｌｍａｎ法で定量した。Ｅｌｌｍａｎ法によれば、チオール基が存在すれば、５,５'-ジチオビス(２-ニトロ安息香酸)(ＤＴＮＢ)と反応して、５-メルカプト-２-ニトロベンゾ安息香酸が生成されるので、その極大吸収波長である４１２ｎｍに吸光が観察される。
上記で得られたジスルフィド架橋中空ナノ微粒子の水溶液１００μｌに脱気した超純水を加え、全量３ｍｌにした。この溶液に、脱気した０.１Ｍのリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)を６ｍｌ加え、更に脱気０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)中０.４ｍｇ/ｍｌのＤＴＮＢ溶液１ｍｌを加え、１５分間遮光して静置した。静置後、JASCO V-550 UV/vis spectrophotometerを用いてＵＶ測定を行った。
その結果、４１２ｎｍに極大吸収は観察されなかった。このことは、上記で得られたジスルフィド架橋中空ナノ微粒子中にチオール基が残存していないことを示す。すなわち、導入されたチオール基がほとんど全てジスルフィド結合の形成に使用されたことを示唆している。
【００４８】
実施例２：中空ナノ微粒子の平均粒径へのｐＨの影響
実施例１で調製された中空ナノ微粒子溶液について、０.１Ｎ塩酸及び０.１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを変化させることにより、種々ｐＨ条件下での中空ナノカプセルのＺ−平均粒径を上記と同様なＤＬＳ測定により評価した。
図５に中空ナノ微粒子の平均粒径のｐＨ依存性を示す。
ｐＨ１０程度の高ｐＨ条件下では収縮し、粒径は、ジスルフィド架橋導入前の自己組織化ベシクルの粒径と同程度になる。
一方、低ｐＨ条件下では、膨潤して粒径が増大する。これは、ｐＨの低下に伴い、第一級、第二級、第三級アミノ基が順次プロトン化し、その結果中空ナノ微粒子が正電荷を帯びるため、ベシクル膜内のイオン浸透圧が増加し静電反発が引き起こされることによると考えられる。
まとめると、本発明の中空ナノ微粒子は、高ｐＨ環境下では凝集を引き起こすが、酸性〜弱アルカリ条件(ｐＨ４〜１０)下では単分散性を維持した状態で存在することが確認された。
【００４９】
実施例３：中空ナノ微粒子の還元環境応答性
＜散乱光強度測定による評価＞
不可逆的架橋型中空ナノ微粒子の及びジスルフィド架橋型中空ナノ微粒子それぞれの水溶液５００μｌに、グルタチオン濃度が０、１、５、１０、１００、５００μＭ、１、５ｍＭとなるように蒸留水又はグルタチオン水溶液を加えて全量を２ｍｌとした。不可逆的架橋型中空ナノ微粒子は、架橋剤としてエチレングリコールジグリシジルエーテル(ＥＧ１)を用いて、特開２００９−２６９９９８号公報に記載の方法に従って製造した。
蒸留水又はグルタチオン水溶液の添加前、及び添加後０.５、１、２、４、８、２４、４８時間に散乱光強度を測定した(日本分光製分光蛍光光度計FP-6500)。
測定結果を図６に示す。ＥＧ１架橋中空ナノ微粒子については、低濃度、いずれの濃度のグルタチオン存在下においても散乱光強度の変化はほとんど観測されなかった。これは、還元条件下で、中空ベシクル形態が維持されることを示唆する。
【００５０】
一方、ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子については、グルタチオンの非存在下(すなわち、還元剤を含有しない水中)及び１、５μＭのグルタチオンの存在下では、散乱光強度の劇的な減少は見られなかった。グルタチオン１０、１００μＭの存在下では、添加の３０分後までは散乱光強度は劇的に減少したが、その後更に劇的に減少することはかった。グルタチオン５００μＭの存在下では、散乱光強度は１０、１００μＭの存在下と比較して顕著に低下したが、その後更なる劇的な減少が観察されないという挙動は似通っていた。
対照的に、グルタチオンを１、５ｍＭの存在下では添加後３０分間までは、散乱光強度の劇的な減少が観察され、４時間後までには値が３００ｃｐｓ程度になった。ＰＡＭＡＭデンドロン−ＰＬＬを水中に分散させたとき、散乱光強度は２００ｃｐｓ程度である。
これのデータより、本発明のジスルフィド架橋中空ナノ微粒子は、１ｍＭ、５ｍＭのグルタチオン存在下では、ジスルフィド結合がチオール基に還元され、自己組織化ベシクルが解離することが示唆される。一方、１、５μＭの低濃度グルタチオン存在下では、ジスルフィド結合の還元が起こらず、自己組織化ベシクルの形態が維持されることが示唆される。１０、１００、５００μＭのグルタチオン存在下では、散乱光強度の減少は観測されたが、ベシクルは完全には解離しない。
【００５１】
ＤＴＴ濃度が１、５、１０、１００、５００μＭの存在下についても同様な測定を行った。
結果を図７に示す。グルタチオンとＤＴＴの還元能の違いによる濃度のずれはみられるが、高濃度のＤＴＴ存在下では、高濃度のグルタチオン存在下と同様に、ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子が解離することが示唆される。一方、１μＭ程度の低濃度のＤＴＴ存在下では、ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子は、形態が維持されることも示唆される。
【００５２】
実施例４：ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子及び不可逆的架橋型の中空ナノ微粒子の細胞内動態
実施例１に記載のように、水/メタノールの混合溶媒中で自己組織体(ベシクル)を作製した。この自己組織体溶液(２ｍｌ)にローダミン６Ｇ溶液(溶媒：水/メタノール＝２/８、１.０ｍｇ/ｍｌ）を１０μｌ加え、１日静置した。
ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子の作製のためには、得られた溶液に、ＰＡＭＡＭデンドロン-ＰＬＬのリシン残基数に対して０.２５当量の２-イミノチオラン塩酸塩を滴下し、１日間の静置後、酸素バブリングを行った。
不可逆的架橋型の中空ナノ微粒子の作製のためには、上記で得られた溶液に、ＰＡＭＡＭデンドロン-ＰＬＬのリシン残基数に対してエポキシ基が２０当量のＥＧ１を滴下し撹拌した。
次いで、得られた両溶液に、ＰＡＭＡＭデンドロン-ＰＬＬのＰＬＬ側鎖の第一級アミンに対して１５当量のＮＨＳ-フルオレセインを加えた。その後、外相５００ｍｌの蒸留水に対して３日間透析して溶媒を水へと置換すると共に、過剰なＮＨＳ-フルオレセインと内包されていないローダミン６Ｇを除去した。
【００５３】
松並ボトムディッシュにＨｅＬａ細胞２×１０5を撒き、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地１.５ｍｌ中３７℃で２４時間培養し、０.３６ｍＭ ＣａＣｌ2と０.４２ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むＰＢＳ(ＰＢＳ＋)で３回洗浄した。
得られた細胞に、上記で作製したローダミン６Ｇを内包するジスルフィド架橋中空ナノ微粒子の溶液を血清含有ＤＭＥＭ培地で１００倍希釈したもの３６０μｌ加え、更に培地を加えて全量１.５ｍｌとして４時間培養後、ＰＢＳ＋で２回洗浄した。
共焦点顕微鏡により細胞内でのローダミン６Ｇ及びフルオレセインの分布を観察した。
【００５４】
図８に観察結果を示す。(Ａ)は、不可逆的架橋型の中空ナノ微粒子とインキュベートした細胞から得られた共焦点顕微鏡写真である。(Ｂ)は、ジスルフィド架橋型の中空ナノ微粒子とインキュベートした細胞から得られた共焦点顕微鏡写真である。いずれにも、ローダミン６Ｇに由来する赤色蛍光及びフルオレセインに由来する緑色蛍光が観察される。
それぞれについて２つの画像を重ねると、不可逆的架橋型の中空ナノ微粒子とインキュベートした細胞では、黄色蛍光のみが観察される。これは、同じ位置から緑色蛍光及び赤色蛍光が発せられていることを示し、ローダミン６Ｇ及びフルオレセインが同位置に局在していることを意味する。すなわち、不可逆的架橋型の中空ナノ微粒子からは、ローダミン６Ｇが放出されないことが示唆される。
【００５５】
一方、ジスルフィド架橋型の中空ナノ微粒子とインキュベートした細胞では、黄色蛍光と共に赤色蛍光も観察される。これは、赤色蛍光を発する物質が緑色蛍光を発する物質とは離れて位置していることを示す。すなわち、ジスルフィド架橋型の中空ナノ微粒子から、ローダミン６Ｇが放出されることが示唆される。
本実施例の結果を、動物細胞内には高濃度のグルタチオンが存在すること及び実施例３の結果と考え合わせれば、本発明のジスルフィド架橋中空ナノ微粒子は、(還元剤を含有しない)水中及び低濃度の還元剤の存在下で安定であり、動物細胞内のような高濃度の還元剤の存在下で不安定化し、このため内包する物質を放出することができる。よって、本発明のジスルフィド架橋中空ナノ微粒子は、目的物質(例えば、遺伝子や薬物などの治療剤)を細胞内に送達することに極めて有用であることが理解される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジスルフィド架橋により水中で安定化された中空ナノ微粒子に関し、より詳細にはポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体のベシクルからなり、該ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋されている水中で安定な中空ナノ微粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブロック共重合体が選択溶媒中での自己組織化により形成する多分子集合体は、高分子ミセルやロッド、ラメラ、ベシクルなど様々な形態をとることが報告されている(非特許文献１〜４)。
樹木状高分子であるポリアミドアミン(ＰＡＭＡＭ)デンドロンとポリペプチドであるポリ-Ｌ-リシン(ＰＬＬ)からなるヘッド-テイル型ブロック共重合体は、水/高濃度メタノール混合溶媒中で、自己組織化によりベシクルを形成することが知られている(非特許文献５〜７)。
【０００３】
上記のヘッド-テイル型ブロック共重合体が高濃度メタノール/水混合溶媒中で形成するベシクルは、水中に移行すると崩壊してしまう。ベシクル構造を維持するために分散媒としてメタノール含有溶媒を必要とする限り、該ベシクルからなる中空ナノ微粒子を、例えば遺伝子ベクターやドラッグデリバリーシステム(ＤＤＳ)として応用・発展させることはできない。
【０００４】
そこで、テイル間に不可逆的架橋を導入することにより水中で安定化されたヘッド-テイル型共重合体(ＰＡＭＡＭデンドロン−ポリ-Ｌ-リシン)の中空ナノ微粒子及びその製造方法が開発されている(非特許文献９及び特許文献１)。
この技術による中空ナノ微粒子において、ベシクル内部に保持された物質は、周囲環境のｐＨ低下に伴い放出されるか又は(物質がアニオン性である場合には)自発的に漏出する。いずれにしても、物質は、重合体からなる殻を通過する必要があり、その結果、物質の放出/漏出は緩慢である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２６９９９８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】van Hest, J. C. M.; Delnoye, D. A. P.; Baars, M. W. P. L.; van Genderen, M. H. P.; Meijer, E. W. Science 1995, 268, 1592-1595
【非特許文献２】Vandermeulen, G. W. M.; Klok, H. A. Macromol. Biosci. 2004, 4, 383-398
【非特許文献３】Klok, H. A.; Lecommandoux, S. Adv. Mater. 2001, 13, 1217-1229
【非特許文献４】Kim, K. T. K.; Winnik, M. A.; Manners, I. Soft Matter 2006, 2, 957-965
【非特許文献５】高分子学会予稿集55巻１号1276頁 平成18年５月10日発行
【非特許文献６】第53回高分子研究発表会(神戸)予稿集138頁 平成19年７月20日発行
【非特許文献７】高分子学会予稿集56巻２号5058頁 平成19年９月４日発行
【非特許文献８】Kakizawa, Y., Harada, A.及びKataoka, K., Biomacromolecules, 2: 491-497 (2001)
【非特許文献９】Harada, A.; Ichimura, S.; Yuba, E.; Kono, K. Soft Matter 2011, 7, 4629-4635
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
物質(特に、遺伝子や薬物のような治療薬)の送達という観点からは、目的の部位に到達した後は、ベシクルが崩壊することにより内部に保持された物質が速やかに放出されることが好都合である場合が多い。
例えば、(特に動物)細胞内は、還元剤であるグルタチオンが、細胞外に比べ１０〜１００倍高い濃度(１〜１００ｍＭ)で存在し、還元環境にあることが知られている(非特許文献８)。
よって、水中で安定であるが、特定の環境(例えば、所定の還元環境)下で崩壊する中空ナノ微粒子についての必要性が存在していた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は、ポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体のベシクルからなり、ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋されている水中で安定な中空ナノ微粒子を提供する。
【０００９】
また、本発明は、上記ヘッド-テイル型ブロック共重合体を１００/０〜５０/５０の水/水と混和性のアルコール混合溶媒に溶解させ；得られる溶液に、水/アルコール比が３０/７０〜０/１００となるまでアルコールを滴下して、該ブロック共重合体を中空ナノ微粒子に自己組織化させ；得られた自己組織体においてポリ-Ｌ-リシンにチオール基含有リンカーを導入し；酸化条件下でチオール基含有リンカー間にジスルフィド結合を生成させてテイル部をジスルフィド架橋することを含んでなる、水中で安定な中空ナノ微粒子の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の中空ナノ微粒子によれば、例えば運搬体/送達剤(ベクター、キャリア又はＤＤＳ製剤)として利用可能な、水中で安定であるが特定の還元環境/条件下で崩壊する中空ナノ微粒子が提供される。
本発明の中空ナノ微粒子の製造方法によれば、単分散の上記中空ナノ微粒子が容易に製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】水/メタノール溶媒中におけるＰＡＭＡＭ-ＰＬＬの自己組織化ベシクルの粒径分布を示す。
【図２】本発明の中空ナノ微粒子(ジスルフィド架橋ベシクル)の透過型電子顕微鏡写真である。
【図３】水中における本発明の中空ナノ微粒子の粒径分布を示す。
【図４】本発明の中空ナノ微粒子の1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】本発明の中空ナノ微粒子の平均粒径のｐＨ依存性を示す。
【図６】種々の濃度のグルタチオン存在下における、本発明の中空ナノ微粒子(ジスルフィド架橋型中空ナノ微粒子)及び不可逆的架橋型中空ナノ微粒子を含む溶液の散乱光強度の時間に対する変化を示す。
【図７】種々の濃度のＤＴＴ存在下における、本発明の中空ナノ微粒子を含む溶液の散乱光強度の時間に対する変化を示す。
【図８】ローダミン６Ｇを内包し、フルオレセインで標識された(Ａ)不可逆的架橋型中空ナノ微粒子及び(Ｂ)本発明のジスルフィド架橋型中空ナノ微粒子とインキュベートしたＨｅＬａ細胞におけるローダミン６Ｇ(赤色蛍光)及びフルオレセイン(緑色蛍光)の細胞内分布を示す共焦点顕微鏡写真及び重ね合わせ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜中空ナノ微粒子＞
本発明の中空ナノ微粒子は、ポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体のベシクルからなり、ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋されていることを特徴とする。この構成により、本発明の中空ナノ微粒子は水中で安定である(すなわち、水中でベシクル構造を維持できる)が、特定の還元環境条件下で崩壊する。本発明においては、特に言及しない限り、「水」は、還元剤を含有しない水を意味する。
【００１３】
本発明の中空ナノ微粒子は、好ましくは３００μＭ、より好ましくは５００μＭ以上、より好ましくは１ｍＭ以上のグルタチオンの存在下で崩壊する。
本発明において、ベシクルが「崩壊する」とは、必ずしも全てのベシクルが崩壊することを意味せず、所定の割合のベシクルが崩壊することをいう。所定の割合のベシクルの崩壊は、散乱光強度の低下として理解される。よって、例えば「３００μＭのグルタチオンの存在下で崩壊する」とは、還元剤を含まない水(例えば、蒸留水)中の中空ナノ微粒子分散液の散乱光強度を１００％としたとき、３００μＭのグルタチオン添加後８時間以内に散乱光強度が例えば４０％未満に低下することを意味するものとする。
【００１４】
ポリ-Ｌ-リシン間のジスルフィド架橋は、ポリ-Ｌ-リシンの側鎖アミノ基(εアミノ基)を介するが、水中で安定なベシクル構造を維持でき、特定の還元環境(例えば、３００μＭ以上のグルタチオンの存在)下で崩壊する限り、ポリ-Ｌ-リシンの全ての側鎖アミノ基がジスルフィド架橋に関与している必要はない。
【００１５】
好ましくは、ポリ-Ｌ-リシン間のジスルフィド架橋は、εアミノ基間の結合-Ｌ1-Ｓ-Ｓ-Ｌ2-による。前記式中、Ｌ1及びＬ2は独立して、-(ＣＨ2)n-、-Ｃ6Ｈ4-、-(ＣＨ2)n-Ｃ6Ｈ4-、-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)n-、-(ＣＨ2)m-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)p-、-(ＣＨ2)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)p-、-ＣＯ-(ＣＨ2)n-、-Ｃ(=ＮＨ2+)-(ＣＨ2)n-、-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-、-ＣＯ-(ＣＨ2)n-Ｃ6Ｈ4-、-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)n-、-ＣＯ-(ＣＨ2)m-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)p-、-ＣＯ-(ＣＨ2)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)p-又は-ＣＯ-(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)p-を表す。ここで、ｎ、ｍ及びｐはそれぞれ独立して１〜１４の整数であり(ただしｍ＋ｐ≦１４)、好ましくは１〜６の整数である。ｐはより好ましくは１〜３の整数である。
Ｌ1及びＬ2中のアルキレン基は置換されていてもよい。置換基は好ましくはＣ1〜4アルキル基である。
【００１６】
Ｌ1及びＬ2の具体例として、-Ｃ(=ＮＨ2+)-(ＣＨ2)3-、-ＣＯ-ＣＨ(ＮＨＣＯＣＨ3)-(ＣＨ2)2-、-ＣＯ-ＣＨ2-、-ＣＯ-(ＣＨ2)2-、-ＣＯ-(ＣＨ2)5-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)2-、-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-Ｃ(ＣＨ3)-、-ＣＯ-(ＣＨ2)5-ＮＨ-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-Ｃ(ＣＨ3)-、-ＣＯ-(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)4-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)2-及び-ＣＯ-(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)12-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)2-(ここで、前記のいずれの式においても、アルキレン基はＣ1〜4アルキル基で置換されていてもよい)が挙げられる。
【００１７】
本発明において、ポリアミドアミンデンドロンは、世代数が３.０〜４.０であることが好ましい。ポリアミドアミンデンドロンにおいて、好ましい繰り返し単位は、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜である。
末端基(又は表面基)は親水性基であり、例えばヒドロキシ基、アミノ基、(Ｃ1〜Ｃ4)アシル基、カルボキシル基、カルボキシル(Ｃ1〜Ｃ4)アルキル基、スルホ基、スルホ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキル基であり、好ましくはヒドロキシ基である。
【００１８】
繰り返し単位をＸ(好ましくは、Ｘ＝−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜)、末端基をＹとすると３.０世代のポリアミドアミンデンドロンは式：
−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ(Ｘ(Ｘ(ＸＹ2)2)2
で表され、４.０世代のポリアミドアミンデンドロンは式：
−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ((Ｘ(Ｘ(Ｘ(ＸＹ2)2)2)2
で表される。
【００１９】
１つの実施形態において、ポリアミドアミンデンドロンは３.５世代である。繰り返し単位が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜であり、末端基がカルボキシ基である３.５世代のポリアミドアミンデンドロンは、次式で表される。
【００２０】
【化１】
【００２１】
ポリ-Ｌ-リシン：
【化２】
(式中、ｎは重合度)
は、重合度が例えば６０〜１２０、好ましくは７０〜１１０である。
【００２２】
本発明の中空ナノ微粒子の粒径は、ナノメートルオーダーである。例えば、平均粒径は１００〜３００ｎｍであり得る。１つの好ましい実施形態において、粒径分布は単分散(例えば、多分散指数０.１５以下、より好ましくは０.１以下である。下限は特に限定されない(当然のことながら０以上である)が、例えば０.０３であり得る)である。
【００２３】
本発明の中空ナノ微粒子は、その表面を、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)−ポリカルボン酸ブロック共重合体でコーティングされていてもよい。コーティングにより、中空ナノ微粒子の生体適合性が向上する。
ＰＥＧ−ポリカルボン酸ブロック共重合体の例としては、ＰＥＧ−ポリアクリル酸(ＰＡＡ)共重合体、ＰＥＧ−ポリメタクリル酸(ＰＭＡ)共重合体、ＰＥＧ−ポリグリコール酸(ＰＡＧ)共重合体、ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸が挙げられる。
【００２４】
本発明の中空ナノ微粒子は、水性媒体、特に医薬的に許容され得る水性媒体(例えば、水、生理食塩水、緩衝化生理食塩水)に分散させた水性分散液として提供され得る。１つの好ましい実施形態において、水性分散液中の本発明の中空ナノ微粒子の粒径分布は単分散である。
【００２５】
本発明の中空ナノ微粒子は、好適には、繰り返し単位が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜であり、末端基が親水性基である３.０〜４.０世代(好ましくは３.５世代)のポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシン(重合度は６０〜１２０、より好ましくは７０〜１１０である)のテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体の１００/０〜５０/５０の水/メタノール混合溶媒の溶液に、該溶液の水/メタノールが３０/７０〜０/１００(より好ましくは２０/８０〜０/１００、より好ましくは２０/８０〜１０/９０)となるようにメタノールを滴下して形成される自己組織体において、ポリ-Ｌ-リシン(の側鎖アミノ基)にチオール含有リンカー(特に、２-イミノチオランに由来するもの)を導入し、酸化条件下でチオール基含有リンカー間にジスルフィド結合を生成させてテイル部をジスルフィド架橋して得られた中空ナノ微粒子である。
【００２６】
＜中空ナノ微粒子の製造方法＞
本発明の中空ナノ微粒子の製造方法は、
ポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体を、１００/０〜５０/５０の水/水と混和性のアルコール混合溶媒に溶解させ、
得られる溶液に、水/アルコール比が３０/７０〜０/１００となるまでアルコールを滴下して、該ブロック共重合体を中空ナノ微粒子に自己組織化させ、
得られた自己組織体においてポリ-Ｌ-リシンにチオール基含有リンカーを導入し、
酸化条件下でチオール基含有リンカー間にジスルフィド結合を生成させてテイル部をジスルフィド架橋することを含んでなることを特徴とする。
【００２７】
ヘッド-テイル型ブロック共重合体は、公知の方法(例えば、Bioconjugate Chem., 17, 3(2006)に記載の方法)に基づいて製造できる。
【００２８】
簡潔には、ヘッド部のポリアミドアミンデンドロンは、例えば、一方のアミノ基を保護したエチレンジアミンに、マイケル付加反応と続くエステルアミド交換反応とからなる１サイクルの反応を所望の世代数と同じ数のサイクル繰り返し、任意に(上記のような)末端基を付加することにより製造することができる。例えば、世代数３.５のポリアミドアミンデンドロンは、マイケル付加反応とエステルアミド交換反応とからなる反応サイクルを３.５サイクル繰り返す。ここで、「３.５サイクル」とは、３サイクルの反応後、マイケル付加反応を行い、エステルアミド交換反応を行わないことを意味する。
繰り返し単位が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜であるポリアミドアミンデンドロンを作製する場合、アクリル酸メチルを用いるマイケル付加反応とエチレンジアミンを用いるエステルアミド交換反応との反応サイクルを用いことができる。
【００２９】
一方、テイル部(ポリ-Ｌ-リシン)は、例えば、ε-ベンジルオキシカルボニル-Ｌ-リシン無水物の重合反応により製造できる。
ヘッド部とテイル部は、別々に製造した後に結合してもよいし、予め製造したヘッド部に対してテイル部を、又は予め製造したテイル部に対してヘッド部を形成してもよい。
【００３０】
このブロック共重合体は１００/０〜５０/５０の水/水と混和性のアルコール混合溶媒に容易に溶解する。水と混和性のアルコールとしては、好ましくは低級アルコール、より好ましくはＣ1〜Ｃ4アルコール、最も好ましくはメタノールである。
【００３１】
得られる溶液に、該溶液中の水/水と混和性のアルコール比３０/７０〜０/１００(好ましくは２０/８０〜０/１００、より好ましくは２０/８０〜１０/９０)までアルコールを滴下すると、ブロック共重合体が単分散の自己組織体(中空ナノ微粒子)を形成する。
【００３２】
この時点(ジスルフィド架橋処理前)の自己組織体は、水中又は高水/低アルコール混合溶媒中に移すとベシクル構造が崩壊し、ブロック共重合体は溶解する。
得られる自己組織体をジスルフィド架橋処理すると、自己組織体は、水中でもベシクル構造が維持されるようになる。
【００３３】
チオール含有リンカー-Ｌ-ＳＨ(式中：Ｌは上記Ｌ1及びＬ2について定義と同じ)は、第一級アミノ基と反応性であるチオール化剤を用いてポリ-Ｌ-リシンの側鎖アミノ基(εアミノ基)に導入することができる。第一級アミノ基と反応性であるチオール化剤は、例えば、２-イミノチオラン、そのＣ1〜4アルキル置換誘導体(Goff, D. A.及びCarroll, S. F., BioConjugate Chem., 1: 381-386 (1990))及びそれらの塩(好ましくは塩酸塩)、Ｎ-アセチルホモシステインチオラクトン(ＮＡＨＣＴ)、Ｎ-スクシンイミジルＳ-アセチルチオアセテート(ＳＡＴＡ)、スクシンイミジル３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)及びその誘導体(例えば、ＬＣ-ＳＰＤＰ(スクシンイミジル６-(３-[２-ピリジルジチオ]プロピオンアミド)ヘキサノエート)、スルホ-ＬＣ-ＳＰＤＰ、(ＰＥＧ)4又ハ12-ＳＰＤＰ)、４-スクシンイミジルオキシカルボニル-メチル(２-ピリジルジチオ)トルエン(ＳＭＰＴ)及びその誘導体(例えば、スルホ-ＬＣ-ＳＭＰＴ)、３,３'-ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(ＤＴＳＳＰ)、ジメチル３,３'-ジチオビスプロピオンイミデート(ＤＴＢＰ)である。
２-イミノチオラン、その誘導体及びそれらの塩並びにＮＡＨＣＴは、一段階での(ジスルフィド基のチオール基への還元工程を経ることなく)チオール基の導入が可能であるので好ましい。
【００３４】
チオール化剤は、自己組織体の分散媒体と同じ水/水と混和性のアルコール混合溶媒に溶解させて添加する。
チオール化剤の添加量は、ヘッド-テイル型共重合体のポリ-Ｌ-リシン中の側鎖アミノ基に対して例えば０.０１〜１０当量、好ましくは０.０５〜２当量、より好ましくは０.１〜１等量である。全量を１回で添加してもよいし、２回又はそれ以上に分けて添加してもよい。
チオール化剤として、ジスルフィド基-Ｓ-Ｓ-を含有するものを使用する場合、還元剤(例えば、ＤＴＴ)を用いてジスルフィド基-Ｓ-Ｓ-をチオール基-ＳＨに還元する。
その後、酸化条件下(例えば酸素バブリング下)で、チオール基間にジスルフィド結合を形成させる。
【００３５】
本発明の方法によれば、ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋され水中で安定な中空ナノ微粒子が、従来の分粒処理を要することなく、狭い単分散で取得することができる。
なお、適切な場合には、公知の方法(例えばフィルタリングや超音波処理)により更に分粒してもよい。
【実施例】
【００３６】
実施例１：ポリアミドアミン(ＰＡＭＡＭ)デンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシン(ＰＬＬ)のテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体から形成されるベシクルへのジスルフィド架橋導入による中空ナノ微粒子の調製
Haradaら(Bioconjugate Chem., 17, 3(2006))に記載される方法に従って、次式(２)で示されるヘッド-テイル型共重合体(ＰＡＭＡＭデンドロン世代数は３.５、ＰＬＬ数平均重合度は１０１) ５.０ｍｇに蒸留水５００μｌを加えて溶解させた後、更にメタノール５００μｌを加えた。
【００３７】
【化３】
【００３８】
続いて、攪拌しながら、メタノール１５００μｌを１５分かけて滴下し、溶媒組成を体積分率にして水：メタノール＝２：８にまで変化させ、該溶媒中で該ヘッド-テイル型共重合体のベシクルを形成させた。その後、再び５分間超音波を照射し、十分時間静置して粒径を安定させた後、形成されたベシクルの粒径を動的光散乱(ＤＬＳ)測定(レーザーゼータ電位計ELS-8000F、大塚電子株式会社製；２０℃)により確認した(図１)。Ｚ−平均粒径が１７４.９ｎｍの単分散なベシクルが形成されていることが確認された。
【００３９】
この溶液２.５ｍｌに、ＰＡＭＡＭデンドロン-ＰＬＬのリシン残基数(εアミノ基数)に対して０.１等量の２-イミノチオラン塩酸塩を滴下した。撹拌後、１日静置し、その後酸素バブリングを行った。更に２-イミノチオラン塩酸塩を合計０.２５当量となるように添加した。１日間の静置後、酸素バブリングを行った。
こうして、ＰＬＬ中の第一級アミンにチオール基を導入して、ＰＬＬ間にジスルフィド結合を生成させた。この反応のスキームを下記に示す。
【００４０】
【化４】
【００４１】
外相５００ｍｌの蒸留水に対して透析を行うことにより溶媒を水へと置換した。得られたジスルフィド架橋ベシクルの水中での形態を透過型電子顕微鏡(ＴＥＭ)観察(JEM-2000FEXII、日本電子株式会社製)により、粒径分布を上記と同様なＤＬＳ測定により確認した。得られたＴＥＭ写真を図２に、粒径分布を図３に示す。
【００４２】
ＴＥＭ観察により、中空ベシクル構造を有する粒径約２８０ｎｍの球状粒子が確認された。このことから、ＰＡＭＡＭデンドロン-ＰＬＬブロック共重合体の自己組織化ベシクルが、ＰＬＬ間のジスルフィド架橋により、水中で安定化されることが理解できる。また、観察された粒径は、下記に示すＤＬＳ測定による粒径分布とよい一致を示した。
【００４３】
ＤＬＳ測定により、Ｚ−平均粒径が２３８.４ｎｍの単分散な微粒子の存在が観察された。すなわち、ＤＬＳ測定によっても、ジスルフィド架橋によりベシクル構造が安定化され、水系溶媒中で安定に存在していることが確認された。また、架橋前のベシクルの水/メタノール混合溶媒中での粒径と比較すると、ジスルフィド架橋ベシクルの水中での粒径は６０ｎｍ程度大きい。この粒径増大は、ＰＬＬの第一級アミンが水中でプロトン化して正電位を帯びる結果、ＰＬＬ間の静電反発により粒径が増大したものと考えられる。
【００４４】
この溶液を凍結乾燥後、水で再構成させたところ、水中での中空ナノ微粒子の再分散が観察され、中空ナノ微粒子は凍結乾燥が可能であることが確認された。
よって、本発明の中空ナノ微粒子は、凍結乾燥による長期保存が可能であることが理解される。
【００４５】
＜チオール含有リンカーの導入率＞
次に、ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子を凍結乾燥により回収し、1Ｈ ＮＭＲによってチオール基含有リンカーの反応率を算出した。
回収したジスルフィド架橋中空ナノ微粒子を少量のＤＣｌを加えたＤ2Ｏに溶解して、1Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定した。得られたスペクトルを図４に示す。
【００４６】
架橋構造導入によって生成したジスルフィド結合に隣接するメチレンに由来する２.６ｐｐｍのピーク(ｘ)、ジスルフィド結合に対してβ位のメチレンに由来する２.１ｐｐｍのピーク(ｖ)、γ位のメチレンに由来する３.３ｐｐｍのピーク(ｗ)の積分値から、架橋剤はＰＬＬの側鎖の一級アミンの２２％と反応していると求められた。
【００４７】
＜チオール含有リンカーによるジスルフィド架橋の形成率＞
残存するチオール基を比色分析法であるＥｌｌｍａｎ法で定量した。Ｅｌｌｍａｎ法によれば、チオール基が存在すれば、５,５'-ジチオビス(２-ニトロ安息香酸)(ＤＴＮＢ)と反応して、５-メルカプト-２-ニトロベンゾ安息香酸が生成されるので、その極大吸収波長である４１２ｎｍに吸光が観察される。
上記で得られたジスルフィド架橋中空ナノ微粒子の水溶液１００μｌに脱気した超純水を加え、全量３ｍｌにした。この溶液に、脱気した０.１Ｍのリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)を６ｍｌ加え、更に脱気０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)中０.４ｍｇ/ｍｌのＤＴＮＢ溶液１ｍｌを加え、１５分間遮光して静置した。静置後、JASCO V-550 UV/vis spectrophotometerを用いてＵＶ測定を行った。
その結果、４１２ｎｍに極大吸収は観察されなかった。このことは、上記で得られたジスルフィド架橋中空ナノ微粒子中にチオール基が残存していないことを示す。すなわち、導入されたチオール基がほとんど全てジスルフィド結合の形成に使用されたことを示唆している。
【００４８】
実施例２：中空ナノ微粒子の平均粒径へのｐＨの影響
実施例１で調製された中空ナノ微粒子溶液について、０.１Ｎ塩酸及び０.１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを変化させることにより、種々ｐＨ条件下での中空ナノカプセルのＺ−平均粒径を上記と同様なＤＬＳ測定により評価した。
図５に中空ナノ微粒子の平均粒径のｐＨ依存性を示す。
ｐＨ１０程度の高ｐＨ条件下では収縮し、粒径は、ジスルフィド架橋導入前の自己組織化ベシクルの粒径と同程度になる。
一方、低ｐＨ条件下では、膨潤して粒径が増大する。これは、ｐＨの低下に伴い、第一級、第二級、第三級アミノ基が順次プロトン化し、その結果中空ナノ微粒子が正電荷を帯びるため、ベシクル膜内のイオン浸透圧が増加し静電反発が引き起こされることによると考えられる。
まとめると、本発明の中空ナノ微粒子は、高ｐＨ環境下では凝集を引き起こすが、酸性〜弱アルカリ条件(ｐＨ４〜１０)下では単分散性を維持した状態で存在することが確認された。
【００４９】
実施例３：中空ナノ微粒子の還元環境応答性
＜散乱光強度測定による評価＞
不可逆的架橋型中空ナノ微粒子の及びジスルフィド架橋型中空ナノ微粒子それぞれの水溶液５００μｌに、グルタチオン濃度が０、１、５、１０、１００、５００μＭ、１、５ｍＭとなるように蒸留水又はグルタチオン水溶液を加えて全量を２ｍｌとした。不可逆的架橋型中空ナノ微粒子は、架橋剤としてエチレングリコールジグリシジルエーテル(ＥＧ１)を用いて、特開２００９−２６９９９８号公報に記載の方法に従って製造した。
蒸留水又はグルタチオン水溶液の添加前、及び添加後０.５、１、２、４、８、２４、４８時間に散乱光強度を測定した(日本分光製分光蛍光光度計FP-6500)。
測定結果を図６に示す。ＥＧ１架橋中空ナノ微粒子については、低濃度、いずれの濃度のグルタチオン存在下においても散乱光強度の変化はほとんど観測されなかった。これは、還元条件下で、中空ベシクル形態が維持されることを示唆する。
【００５０】
一方、ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子については、グルタチオンの非存在下(すなわち、還元剤を含有しない水中)及び１、５μＭのグルタチオンの存在下では、散乱光強度の劇的な減少は見られなかった。グルタチオン１０、１００μＭの存在下では、添加の３０分後までは散乱光強度は劇的に減少したが、その後更に劇的に減少することはかった。グルタチオン５００μＭの存在下では、散乱光強度は１０、１００μＭの存在下と比較して顕著に低下したが、その後更なる劇的な減少が観察されないという挙動は似通っていた。
対照的に、グルタチオンを１、５ｍＭの存在下では添加後３０分間までは、散乱光強度の劇的な減少が観察され、４時間後までには値が３００ｃｐｓ程度になった。ＰＡＭＡＭデンドロン−ＰＬＬを水中に分散させたとき、散乱光強度は２００ｃｐｓ程度である。
これのデータより、本発明のジスルフィド架橋中空ナノ微粒子は、１ｍＭ、５ｍＭのグルタチオン存在下では、ジスルフィド結合がチオール基に還元され、自己組織化ベシクルが解離することが示唆される。一方、１、５μＭの低濃度グルタチオン存在下では、ジスルフィド結合の還元が起こらず、自己組織化ベシクルの形態が維持されることが示唆される。１０、１００、５００μＭのグルタチオン存在下では、散乱光強度の減少は観測されたが、ベシクルは完全には解離しない。
【００５１】
ＤＴＴ濃度が１、５、１０、１００、５００μＭの存在下についても同様な測定を行った。
結果を図７に示す。グルタチオンとＤＴＴの還元能の違いによる濃度のずれはみられるが、高濃度のＤＴＴ存在下では、高濃度のグルタチオン存在下と同様に、ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子が解離することが示唆される。一方、１μＭ程度の低濃度のＤＴＴ存在下では、ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子は、形態が維持されることも示唆される。
【００５２】
実施例４：ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子及び不可逆的架橋型の中空ナノ微粒子の細胞内動態
実施例１に記載のように、水/メタノールの混合溶媒中で自己組織体(ベシクル)を作製した。この自己組織体溶液(２ｍｌ)にローダミン６Ｇ溶液(溶媒：水/メタノール＝２/８、１.０ｍｇ/ｍｌ）を１０μｌ加え、１日静置した。
ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子の作製のためには、得られた溶液に、ＰＡＭＡＭデンドロン-ＰＬＬのリシン残基数に対して０.２５当量の２-イミノチオラン塩酸塩を滴下し、１日間の静置後、酸素バブリングを行った。
不可逆的架橋型の中空ナノ微粒子の作製のためには、上記で得られた溶液に、ＰＡＭＡＭデンドロン-ＰＬＬのリシン残基数に対してエポキシ基が２０当量のＥＧ１を滴下し撹拌した。
次いで、得られた両溶液に、ＰＡＭＡＭデンドロン-ＰＬＬのＰＬＬ側鎖の第一級アミンに対して１５当量のＮＨＳ-フルオレセインを加えた。その後、外相５００ｍｌの蒸留水に対して３日間透析して溶媒を水へと置換すると共に、過剰なＮＨＳ-フルオレセインと内包されていないローダミン６Ｇを除去した。
【００５３】
松並ボトムディッシュにＨｅＬａ細胞２×１０5を撒き、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地１.５ｍｌ中３７℃で２４時間培養し、０.３６ｍＭ ＣａＣｌ2と０.４２ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むＰＢＳ(ＰＢＳ＋)で３回洗浄した。
得られた細胞に、上記で作製したローダミン６Ｇを内包するジスルフィド架橋中空ナノ微粒子の溶液を血清含有ＤＭＥＭ培地で１００倍希釈したもの３６０μｌ加え、更に培地を加えて全量１.５ｍｌとして４時間培養後、ＰＢＳ＋で２回洗浄した。
共焦点顕微鏡により細胞内でのローダミン６Ｇ及びフルオレセインの分布を観察した。
【００５４】
図８に観察結果を示す。(Ａ)は、不可逆的架橋型の中空ナノ微粒子とインキュベートした細胞から得られた共焦点顕微鏡写真である。(Ｂ)は、ジスルフィド架橋型の中空ナノ微粒子とインキュベートした細胞から得られた共焦点顕微鏡写真である。いずれにも、ローダミン６Ｇに由来する赤色蛍光及びフルオレセインに由来する緑色蛍光が観察される。
それぞれについて２つの画像を重ねると、不可逆的架橋型の中空ナノ微粒子とインキュベートした細胞では、黄色蛍光のみが観察される。これは、同じ位置から緑色蛍光及び赤色蛍光が発せられていることを示し、ローダミン６Ｇ及びフルオレセインが同位置に局在していることを意味する。すなわち、不可逆的架橋型の中空ナノ微粒子からは、ローダミン６Ｇが放出されないことが示唆される。
【００５５】
一方、ジスルフィド架橋型の中空ナノ微粒子とインキュベートした細胞では、黄色蛍光と共に赤色蛍光も観察される。これは、赤色蛍光を発する物質が緑色蛍光を発する物質とは離れて位置していることを示す。すなわち、ジスルフィド架橋型の中空ナノ微粒子から、ローダミン６Ｇが放出されることが示唆される。
本実施例の結果を、動物細胞内には高濃度のグルタチオンが存在すること及び実施例３の結果と考え合わせれば、本発明のジスルフィド架橋中空ナノ微粒子は、(還元剤を含有しない)水中及び低濃度の還元剤の存在下で安定であり、動物細胞内のような高濃度の還元剤の存在下で不安定化し、このため内包する物質を放出することができる。よって、本発明のジスルフィド架橋中空ナノ微粒子は、目的物質(例えば、遺伝子や薬物などの治療剤)を細胞内に送達することに極めて有用であることが理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体のベシクルからなり、ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋されている水中で安定な中空ナノ微粒子。
【請求項２】
３００μＭ以上のグルタチオンの存在下で崩壊する請求項１に記載の中空ナノ微粒子。
【請求項３】
ポリ-Ｌ-リシン間のジスルフィド架橋が、ポリ-Ｌ-リシンのεアミノ基間の結合-Ｌ1-Ｓ-Ｓ-Ｌ2-(式中：Ｌ1及びＬ2は独立して、-(ＣＨ2)n-、-Ｃ6Ｈ4-、-(ＣＨ2)n-Ｃ6Ｈ4-、-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)n-、-(ＣＨ2)m-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)p-、-(ＣＨ2)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)p-、-ＣＯ-(ＣＨ2)n-、-Ｃ(=ＮＨ2+)-(ＣＨ2)n-、-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-、-ＣＯ-(ＣＨ2)n-Ｃ6Ｈ4-、-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)n-、-ＣＯ-(ＣＨ2)m-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)p-、-ＣＯ-(ＣＨ2)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)p-又は-ＣＯ-(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)p-を表す。ここで、ｎ、ｍ及びｐはそれぞれ独立して１〜１４の整数、ただしｍ＋ｐ≦１４、アルキレン基は置換されていてもよい。)による請求項１又は２に記載の中空ナノ微粒子。
【請求項４】
ポリアミドアミンデンドロンの繰り返し単位が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜であり、世代数が３.０〜４.０である請求項１〜３のいずれか１項に記載の中空ナノ微粒子。
【請求項５】
ポリアミドアミンデンドロンが３.５世代である請求項４に記載の中空ナノ微粒子。
【請求項６】
ベシクルの内部空間に遺伝子又は薬物を含んでなる請求項１〜５のいずれか１項に記載の中空ナノ微粒子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の中空ナノ微粒子を含んでなる水性分散液。
【請求項８】
ポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体を、１００/０〜５０/５０の水/水と混和性のアルコール混合溶媒に溶解させ、
得られる溶液に、水/アルコール比が３０/７０〜０/１００となるまでアルコールを滴下して、該ブロック共重合体を中空ナノ微粒子に自己組織化させ、
得られた自己組織体においてポリ-Ｌ-リシンにチオール基含有リンカーを導入し、
酸化条件下でチオール基含有リンカー間にジスルフィド結合を生成させてテイル部をジスルフィド架橋すること
を含んでなる、水中で安定な中空ナノ微粒子の製造方法。
【請求項１】
ポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体のベシクルからなり、ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋されている水中で安定な中空ナノ微粒子。
【請求項２】
３００μＭ以上のグルタチオンの存在下で崩壊する請求項１に記載の中空ナノ微粒子。
【請求項３】
ポリ-Ｌ-リシン間のジスルフィド架橋が、ポリ-Ｌ-リシンのεアミノ基間の結合-Ｌ1-Ｓ-Ｓ-Ｌ2-(式中：Ｌ1及びＬ2は独立して、-(ＣＨ2)n-、-Ｃ6Ｈ4-、-(ＣＨ2)n-Ｃ6Ｈ4-、-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)n-、-(ＣＨ2)m-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)p-、-(ＣＨ2)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)p-、-ＣＯ-(ＣＨ2)n-、-Ｃ(=ＮＨ2+)-(ＣＨ2)n-、-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-、-ＣＯ-(ＣＨ2)n-Ｃ6Ｈ4-、-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)n-、-ＣＯ-(ＣＨ2)m-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)p-、-ＣＯ-(ＣＨ2)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)p-又は-ＣＯ-(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)p-を表す。ここで、ｎ、ｍ及びｐはそれぞれ独立して１〜１４の整数、ただしｍ＋ｐ≦１４、アルキレン基は置換されていてもよい。)による請求項１又は２に記載の中空ナノ微粒子。
【請求項４】
ポリアミドアミンデンドロンの繰り返し単位が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜であり、世代数が３.０〜４.０である請求項１〜３のいずれか１項に記載の中空ナノ微粒子。
【請求項５】
ポリアミドアミンデンドロンが３.５世代である請求項４に記載の中空ナノ微粒子。
【請求項６】
ベシクルの内部空間に遺伝子又は薬物を含んでなる請求項１〜５のいずれか１項に記載の中空ナノ微粒子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の中空ナノ微粒子を含んでなる水性分散液。
【請求項８】
ポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体を、１００/０〜５０/５０の水/水と混和性のアルコール混合溶媒に溶解させ、
得られる溶液に、水/アルコール比が３０/７０〜０/１００となるまでアルコールを滴下して、該ブロック共重合体を中空ナノ微粒子に自己組織化させ、
得られた自己組織体においてポリ-Ｌ-リシンにチオール基含有リンカーを導入し、
酸化条件下でチオール基含有リンカー間にジスルフィド結合を生成させてテイル部をジスルフィド架橋すること
を含んでなる、水中で安定な中空ナノ微粒子の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１３−４０２３２（Ｐ２０１３−４０２３２Ａ）
【公開日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７６２３０（Ｐ２０１１−１７６２３０）
【出願日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]