ヘマグルチニン結合ペプチド、インフルエンザウイルス感染阻害剤、リポソーム、インフルエンザ治療薬、インフルエンザ予防薬
【課題】ヘマグルチニンに対するより親和性の高いペプチド、及び、このようなペプチドを用いた医薬組成物を提供すること。
【解決手段】ＡＲＬＳＰＴＭＶＨＰＮＧＡＱＰ（ペプチドＡ−１）に対し、変異を導入したペプチドを作製し、ヘマグルチニンに対するより親和性の高いペプチドをスクリーニングすることにより得られた特定の配列を有するポリペプチドを用いる。
【解決手段】ＡＲＬＳＰＴＭＶＨＰＮＧＡＱＰ（ペプチドＡ−１）に対し、変異を導入したペプチドを作製し、ヘマグルチニンに対するより親和性の高いペプチドをスクリーニングすることにより得られた特定の配列を有するポリペプチドを用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘマグルチニンに結合するヘマグルチニン結合ペプチド、インフルエンザウイルスの感染を阻害するインフルエンザウイルス感染阻害剤、ヘマグルチニン結合ペプチドを含有するリポソーム、ヘマグルチニン結合ペプチドを含有するインフルエンザの治療薬及び予防薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルス膜にはヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ、シアリダーゼ）といった２種類のスパイク糖蛋白質が存在し、それぞれウイルスの感染成立及びウイルスの宿主細胞からの出芽に重要な役割を果たしている。前者のヘマグルチニンは、ヒトやその他の動物（ほ乳類、鳥類、は虫類、魚類、両生類等）といった宿主の細胞膜上に普遍的に存在するシアル酸含有糖鎖を受容体として認識してそれに特異的に結合し、インフルエンザウイルスの細胞内へのエンドサイトーシスを導く。一方、後者のノイラミニダーゼは、受容体破壊酵素であり、宿主細胞からウイルス粒子が出芽または遊離する際に、自らのまたは宿主細胞膜上のシアル酸残基を切断する役割を担っている。
【０００３】
インフルエンザウイルス感染の第１ステップに関与するヘマグルチニンには、極めて変異しやすい抗原決定領域（Ａ〜Ｅ）のアミノ酸配列の多様性に基づいて、種々の亜型が存在する。ヘマグルチニンの亜型間のアミノ酸配列の相同性は２５〜７５％であるため、抗原性を基にしたインフルエンザワクチンの開発は非常に困難である。一方、宿主細胞の受容体と結合するいわゆる受容体結合ポケット領域は、比較的変異が少なく、その三次元構造はよく保存されている（例えば、非特許文献１参照）。従って、インフルエンザウイルスの感染を防止するために、感染成立に寄与するヘマグルチニンに特異的に結合することによってその働きを阻害すれば、広くインフルエンザウイルスの感染防止に効果があることが期待され、そのような薬剤の開発が求められている。
例えば、ヘマグルチニンが宿主受容体のシアル酸含有糖鎖を認識して結合することに基づいて、ヘマグルチニンのその結合部位に特異的に結合する糖アナログをスクリーニングするという手法により、現在までに種々のヘマグルチニン結合性糖アナログが取得されている（例えば、非特許文献２〜５参照）。
そのほか、ヘマグルチニンの受容体糖鎖に対するモノクローナル抗体の抗原結合部位のもつ抗原性（イディオタイプ）に対する抗体（抗イディオタイプ抗体）を作成する手法もある。すなわち、これはヘマグルチニンの受容体となるシアル酸およびシアロ糖鎖の三次元構造に代えて、それと立体構造が類似する抗イディオタイプ抗体の超可変部のアミノ酸配列を作成し、宿主細胞のヘマグルチニン受容体に模擬させるというものである（例えば、非特許文献６参照）。 しかし、受容体結合ポケット領域は、比較的変異が少なく、その三次元構造はよく保存されているとは言え、これらのいずれもヘマグルチニンの亜型に特異的であり、また結合定数も高くない。従って、ヘマグルチニンの亜型に関わらずインフルエンザウイルス全般に働く薬剤の開発が待たれている。
【０００４】
そこで、ファージディスプレイ法を用いて、ヘマグルチニンに結合し、インフルエンザウイルスの感染を防止する１５merのオリゴペプチドがスクリーニングされ、１１種類（例えば、特許文献１参照）及び３種類（例えば、特許文献２及び非特許文献７参照）のオリゴペプチドが同定された（例えば、特許文献１参照）。
【非特許文献１】Y.Suzuki, Prog.Lipid.Res., 33, 429 (1994)
【非特許文献２】R.Roy, et al., J.Chem.Soc., Chem.Commun., 1869 (1993)
【非特許文献３】M.Mammen, et al., J.Med.Chem., 38,4179 (1995)
【非特許文献４】T.Sato, et al., Chem.Lett., 145 (1999)
【非特許文献５】M.ltzstein, et al., Nature, 363, 418 (1993)
【非特許文献６】鈴木康夫「ウイルス感染と糖鎖」、別冊日経サイエンス「糖鎖と細胞」,89-101頁, 1994年10月
【非特許文献７】T. Sato, et al., Peptide Science 2001, 329 (2002)
【特許文献１】国際公開ＷＯ００／５９９３２
【特許文献２】特開２００２−２８４７９８明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１及び２においてなされたスクリーニングに用いられたファージライブラリーのタイターは２．５ｘ１０８であり、アミノ酸１５merの総配列数である２０１５（＝３．３ｘ１０１９）には程遠く、それらのオリゴペプチドより、ヘマグルチニンに対する親和性の高いペプチドが存在することと考えられた。
【０００６】
そこで、本願発明は、より多くのペプチドをスクリーニングすることによって、さらにヘマグルチニンに対する親和性の高いペプチドを提供し、さらに、このようなヘマグルチニンに対する親和性の高いペプチドを用いた医薬組成物を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、特許文献１において得られたヘマグルチニン結合ペプチドＡＲＬＳＰＴＭＶＨＰＮＧＡＱＰ（ペプチドＡ−１：配列番号１）を基にして、このペプチドに複数の変異を有するペプチドを作製した。具体的には、このヘマグルチニン結合ペプチドをコードするＤＮＡに変異を導入するために、（１）オリゴヌクレオチドをＰＣＲで増幅する際、Taq ＤＮＡポリメラーゼの塩基取り込みエラーを利用したエラー・プローンＰＣＲ（error-prone PCR）を用いて変異を導入する方法（２）オリゴヌクレオチドを化学合成する際、本来とは異なるヌクレオチドを混合させておくことによって変異を導入する方法、の２通りの方法を用い、上記ヘマグルチニン結合ペプチドの変異ペプチドを有する２次ファージディスプレイ・ライブラリーを作製した。方法（１）によっては、ペプチド１個当たりの平均変異オリゴヌクレオチド数は２．４２個、平均アミノ酸置換数は１．２５個であり、方法（２）によっては、ペプチド１個当たりの平均変異オリゴヌクレオチド数は７．５個、平均アミノ酸置換数は５．０個であった。また、方法（１）によって作製したライブラリーのタイターは約５ｘ１０４であり、方法（２）によって作製したライブラリーのタイターは約１ｘ１０５であり、従って、２次ライブラリーの総タイター数は約１．５ｘ１０５となった。この２次ライブラリーを２次スクリーニングすると、１次スクリーニングも考慮して、２．５ｘ１０８ｘ１．５ｘ１０５＝約４ｘ１０１３のペプチドをスクリーニングしたことになる。このようにして、かなり大きなペプチドライブラリーをスクリーニングした結果、ＡＲＬＳＰＴＭＶＨＰＮＧＡＱＰ（配列番号１）よりヘマグルチニンのＨ１及びＨ３の両方に親和性の高いペプチドを得ることができ、本発明の完成に至った。
【０００８】
即ち、本発明にかかるヘマグルチニン結合ペプチドは、配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８のいずれかのアミノ酸配列を有する。また、配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８において、１〜数アミノ酸残基の置換・欠失・付加を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合ペプチドに比べ、ヘマグルチニンＨ１またはＨ３の少なくとも一方に対し、より高い結合活性を有するヘマグルチニン結合ペプチドであってもよい。また、アミノ酸配列
ｘＲＬ（Ｓ／Ｐ）ｘｘＭＶ（Ｈ／Ｒ）ｘｘｘｘＱｘ
を有し、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合ペプチドに比べ、ヘマグルチニンＨ１またはＨ３の少なくとも一方に対し、より高い結合活性を有するヘマグルチニン結合ペプチドであってもよい。
【０００９】
上記ヘマグルチニン結合ペプチドは、ヘマグルチニンＨ１及びＨ３の両方に結合することが好ましい。また、アルキル化または脂質化されていてもよい。
【００１０】
本発明にかかるインフルエンザウイルス感染阻害剤は、上記いずれかのヘマグルチニン結合ペプチドを有効成分として含有する。また、ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方の感染を阻害することが好ましい。また、インフルエンザウイルス感染阻害剤が含有するポリペプチドがアルキル化または脂質化されていてもよい。
【００１１】
本発明にかかるリポソームは、上記いずれかのヘマグルチニン結合ペプチドを含有する。このヘマグルチニン結合ペプチドはヘマグルチニンＨ１及びＨ３の両方に結合することが好ましい。また、このヘマグルチニン結合ペプチドはアルキル化または脂質化されていてもよい。
【００１２】
本発明にかかるインフルエンザ治療薬及びインフルエンザ予防薬は、上記いずれかのヘマグルチニン結合ペプチドを有効成分として含有する。また、ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方に効果を有することが好ましい。また、インフルエンザ治療薬及びインフルエンザ予防薬の含有するポリペプチドがアルキル化または脂質化されていることが好ましい。
【００１３】
本発明にかかるＤＮＡは、上記いずれかのヘマグルチニン結合ペプチドをコードする。また、本発明にかかる発現ベクターは、このＤＮＡを有する。また、本発明にかかる細胞は、この発現ベクターが導入され、上記いずれかのヘマグルチニン結合ペプチドを分泌する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、ヘマグルチニンに対する親和性の高いペプチドを提供し、さらに、このようなヘマグルチニンに対する親和性の高いペプチドを用いた医薬組成物を提供することができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１６】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１７】
＝＝ヘマグルチニン結合ペプチド＝＝
本明細書で用いられるヘマグルチニン結合タンパク質のアミノ酸配列を表１に示す。
【表１】
【００１８】
この中で、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドＡ−１は、これまで同定されたヘマグルチニン結合ペプチドのうち最も高い結合活性を有するが（特許文献１、特許文献２及び実施例参照）、配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、実施例に示すように、Ａ−１より、さらにヘマグルチニンに対する結合活性が高い。また、実施例に示すように、これら配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ヘマグルチニンＨ１及びＨ３の両方に結合する。
【００１９】
また、本発明にかかるヘマグルチニン結合タンパク質は、配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８において、１〜数アミノ酸残基の置換・欠失・付加を有するアミノ酸配列を有し、Ａ−１より、ヘマグルチニンに対し高い結合活性を有するペプチドであってもよい。
【００２０】
ここで、ヘマグルチニンに対するヘマグルチニン結合ペプチドの結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定することができるが、これに限らず、ＲＩＡ、ＥＩＡ、ウエスタン・ブロッティング、など、タンパク質間の相互作用を定量的に測定できる手法であればどんなものを用いて測定してもよい。
【００２１】
＝＝ヘマグルチニン結合ペプチドを含有する医薬組成物＝＝
インフルエンザウイルスが細胞に感染する際、インフルエンザウイルスの有するヘマグルチニンが、宿主細胞の受容体に特異的に結合し、その受容体を足場として、ウイルスが細胞に感染する。本発明のＨＡ結合性ペプチドは、そのヘマグルチニンに特異的に結合する。この結合により、ヘマグルチニンが宿主細胞受容体に結合することを妨げることができ、従って、インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染するのを阻害することができる。実際、これまでに阻害効果の有無を調べた全てのＨＡ結合性ペプチドは、ヘマグルチニンの宿主細胞への結合を阻害することができた（特許文献１及び２）。
【００２２】
このように、本発明のＨＡ結合性ペプチドは、インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染するのを阻害することができ、従って、インフルエンザに罹患した患者に投与することにより、体内でのインフルエンザウイルスの増殖を抑制することができる。また、インフルエンザ罹患前の健常人に予め投与しておくことにより、インフルエンザウイルスが体内に進入しても感染を防止することができる。
【００２３】
こうした医療用以外にも、本発明のＨＡ結合性ペプチドは、ヘマグルチニンを介して生じるインフルエンザウイルスの感染、及びそれに伴う種々の細胞機能や生命現象を解明するためのツールとして用いることもできる。
【００２４】
なお、本発明が対象とするインフルエンザウイルスは、ヘマグルチニンＨ１またはＨ３を有していれば、その型や由来を特に制限するものでなく、Ａ型、Ｂ型またはＣ型ないしはヒト分離型、ブタやウマ等の他の哺乳動物分離型または鳥類分離型等のいずれであってもよい。
【００２５】
以上のように、本発明のヘマグルチニン結合ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物として、インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染するのを阻害するためのインフルエンザウイルス感染阻害剤、インフルエンザに罹患した患者を治療するためのインフルエンザ治療剤、インフルエンザに罹患する前に予防的に投与するためのインフルエンザ予防剤などが考えられる。これらの医薬組成物は、有効成分としてのＨＡ結合性ペプチドと、必要に応じて薬学的に許容される担体とを含有する製剤として、インフルエンザウイルスに感染した患者に投与したり、感染前の健常人に予防的に投与したりすることができる。
【００２６】
ここで用いられる薬学的に許容される担体は、調製される医薬組成物の形態に応じて、慣用されている担体の中から適宜選択して用いることができる。例えば、医薬組成物が溶液形態として調製される場合、担体として、精製水（滅菌水）または生理学的緩衝液、グリコール、グリセロール、オリーブ油のような注射投与可能な有機エステルなどを使用することができる。また、この医薬組成物には、慣用的に用いられる安定剤、賦形剤などを含むことができる。
【００２７】
これらの医薬組成物の投与方法には特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾病の重篤度等に応じて適宜決定すればよいが、製剤形態としては、特に注射剤、点滴剤、噴霧剤（点鼻剤や吸入剤など）等の非経口投与形態が好ましい。その場合、特に注射剤や点滴剤として調製する場合は、必要に応じて塩溶液、ブドウ糖やアミノ酸等の通常の補液などと混合して静脈内、筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内に投与する。噴霧剤として調製する場合、例えば、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体として、乳糖、グリセリン等を使用してエアロゾル、ドライパウダー等に製剤化した噴霧剤を、口腔または気道粘膜へ噴霧することにより粘膜投与する。
【００２８】
また、これらの医薬組成物の１日当りの投与量は、投与する者の症状、年齢、体重、性別、治療期間、治療効果、投与方法などにより適宜変更しうるが、ＨＡ結合性ペプチドの量に換算して通常成人１日当り約０．００１〜１００ｍｇ程度の範囲から選ぶことができる。当該製剤は１日１回投与に限らず、数回に分けて投与してもよい。当該製剤は１日１回投与に限らず、数回に分けて投与してもよい。
【００２９】
これらの医薬組成物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、他の抗ウイルス剤、抗炎症剤や、症状を緩和する薬剤など）と組み合わせて使用してもよい。
【００３０】
＝＝ヘマグルチニン結合ペプチドの製造方法＝＝
本発明のヘマグルチニン結合ペプチドは、常法に従って、化学合成することにより製造できる。例えば、通常の液相法及び固相法によってペプチド合成することができる。より具体的には、上記アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法などを利用できる。
【００３１】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ(ジフェニルホスホリルアジド)法、ＤＣＣ＋添加物(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド等)、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種のペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えば ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
【００３２】
なお、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸及至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばＴｙｒの水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に例えばＡｒｇのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、２−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って行うことができる。
【００３３】
このように作製されたペプチドは、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、向流分配法等、ペプチド化学の分野で汎用されている常法に従って、適宜その精製を行うことができる。
【００３４】
別法として、上記ヘマグルチニン結合ペプチドをコードするＤＮＡを作製して発現ベクターに組み込み、培養細胞などの真核細胞または大腸菌などの原核細胞に導入し、そこで発現させたペプチドを精製してもよい。発現ベクターは、導入する宿主細胞に従って、適宜選択する。ペプチドをコードするＤＮＡの組み込みなどを含むベクターの構築、宿主細胞への導入、宿主細胞での発現、宿主細胞の抽出物の調製は、分子生物学的手法を用いて、常法に従って行うことができる。目的のペプチドは、その抽出物から、上記したペプチド化学の分野で汎用されている常法によって、精製することができる。
【００３５】
また、上記ヘマグルチニン結合ペプチドにタグ（例えば、Hisタグ、Flagタグ、GSTタグなど）を付加したペプチドをコードするＤＮＡを作製し、上記と同様に宿主細胞で発現させ、このタグを利用して、アフィニティカラム等で精製することもでき、その後タグのみを切断しペプチド部分のみを精製できるように発現ベクターを設計することもできる。さらに、最終的に、上記したペプチド化学の分野で汎用されている常法によって、ヘマグルチニン結合ペプチドを精製してもよい。
【００３６】
＝＝ＨＡ結合性ペプチドの化学修飾＝＝
上記本発明のＨＡ結合性ペプチドは、適宜に化学修飾することができる。例えば、アルキル化や脂質化（リン脂質化）等による化学修飾によって、ＨＡ結合性ペプチドの細胞親和性や組織親和性を増大させたり、血中半減期を延長させ薬理効果を増強をさせたりすることができる。
【００３７】
ＨＡ結合性ペプチドのアルキル化は、常法に従って行うことができる。例えば、上記ペプチド合成と同様に、脂肪酸とＨＡ結合性ペプチドのＮ末端アミノ基とのアミド結合形成反応により容易に行うことができる。脂肪酸としては、直鎖脂肪酸でも分枝鎖脂肪酸でもよく、また飽和脂肪酸でも不飽和脂肪酸でもよく、どんな脂肪酸でも広く使用できるが、特に、生体内に存在する脂肪酸を用いるのが好ましく、具体的にはラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸等の飽和脂肪酸；オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等の不飽和脂肪酸など、炭素数が１２〜２０程度の脂肪酸が挙げられる。
【００３８】
またアルキル化は、前記ペプチド合成と同様にして、アルキルアミンとＨＡ結合性ペプチドのＣ末端カルボキシル基とのアミド結合形成反応によっても行うことができる。アルキルアミンとしては、上記脂肪酸と同様に各種のアルキルアミンを用いることができるが、特に生体内に存在する脂肪鎖（炭素数が１２〜２０程度）を用いるのが好ましい。
【００３９】
ＨＡ結合性ペプチドの脂質化も常法に従って実施できる（例えば、New Current, 11(3), 15-20 (2000); Biochemica et Biophysica Acta., 1128, 44-49 (1992); FEBSLetters, 413, 177-180 (1997); J.Biol.Chem., 257, 286-288 (1982)等を参照）。例えば、各種リン脂質の２位水酸基或いは３位のリン酸基に対し、任意のスペーサーを介して、縮合法によってＨＡ結合性ペプチドに結合させることができる。必要によっては、ＨＡ結合性ペプチドのＮ端或いはＣ端に任意の長さ（通常数個）のシステインを含むアミノ酸配列を付加して、縮合に利用される反応性ＳＨ基をあらかじめ導入することもできる。ここで用いられるリン脂質には、特に制限はなく、例えば、上記脂肪酸からなる、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール等が使用できる。
【００４０】
なお、これらのアルキル化や脂質化された本発明のＨＡ結合性ペプチド（リポペプチド）は、リポソーム調製の際の脂質成分として利用することができる。その際、ＨＡ結合性ペプチドがリポソーム上に提示されることにより、ＨＡ結合性ペプチドは後述するリポソーム製剤として有効に利用できる。
【００４１】
＝＝ヘマグルチニン結合ペプチドを含有するリポソーム＝＝
本発明のＨＡ結合性ペプチドはリポソーム製剤として調製することができる。このリポソーム製剤においては、酸性リン脂質を膜構成成分とするか或いは中性リン脂質と酸性リン脂質とを膜構成成分とするリポソームに、本発明のＨＡ結合性ペプチドが保持されている。
【００４２】
膜構成成分としての酸性リン脂質としては、例えば、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、卵黄ホスファチジルグリセロール（卵黄ＰＧ）、水添卵黄ホスファチジルグリセロール等の天然または合成ホスファチジルグリセロール類（ＰＧ）およびジラウロイルホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）；ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレオイルホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）、大豆ホスファチジルイノシトール（大豆ＰＩ）、水添大豆ホスファチジルイノシトール等の天然または合成ホスファチジルイノシトール類（ＰＩ）などを用いることができる。これらの酸性リン脂質は一種単独でまたは二種以上混合して使用することができる。
【００４３】
また、中性リン脂質としては、例えば、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、水添大豆ホスファチジルコリン、水添卵黄ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、パルミトイルステアリイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）等の天然または合成ホスファチジルコリン類（ＰＣ）、大豆ホスファチジルエタノールアミン、卵黄ホスファチジルエタノールアミン、水添大豆ホスファチジルエタノールアミン、水添卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ミリストイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＰＥ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等の天然または合成ホスファチジルエタノールアミン類（ＰＥ）等を用いることができる。これらの中性リン脂質は、一種単独でまたは二種以上混合して使用することができる。
【００４４】
上記リポソーム膜は、上記酸性リン脂質を単独で構成成分として用いるかまたは上記中性リン脂質と酸性リン脂質とを併用して、常法に従い形成される。ここで酸性リン脂質の併用割合は、リポソーム膜構成成分中に約０．１〜１００モル％程度、好ましくは約１〜９０モル％、より好ましくは約１０〜５０モル％程度とするのがよい。
【００４５】
リポソームの調製に当たっては、さらに、例えばコレステロールなどを添加することができる。このコレステロールの添加によってリン脂質の流動性を調整し、リポソームの調製をより簡便にすることができる。このコレステロールは、通常リン脂質に対して等量まで添加できるが、特に０．５〜１倍量で添加されるのが好ましい。
【００４６】
リポソームを調製する際、脂質化ＨＡ結合性ペプチドと酸性リン脂質との分子数の割合は、ペプチド１に対して酸性リン脂質が０．５〜１００程度、好ましくは１〜６０程度、より好ましくは１．５〜２０程度とするのがよい。
【００４７】
このような脂質を用いて、例えば多重層リポソーム（ＭＬＶ）を次のようにして調製する。まず、脂質を有機溶媒（クロロホルム、エーテル等）に溶解した後、丸底フラスコに入れ、窒素気流下または減圧下で有機溶媒を除去し、フラスコ底部に脂質の薄膜をつくる。この場合、さらに減圧下でデシケーター中に放置することによって有機溶媒を完全に除去することもできる。次いで、脂質化ＨＡ結合性ペプチドの水溶液を脂質薄膜上に加えて脂質を水和させることによって乳濁色のリポソーム懸濁液が得られる。
【００４８】
また、大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）は、ホスファチジルセリンの小さな一枚膜リポソームにＣａ２＋を添加し、融合させてシリンダー状のシートとした後、キレート剤であるＥＤＴＡを添加しＣａ２＋を除去する方法 （Biochim. Biophys. Acta394, 483-491, 1975）やエーテルに溶解した脂質を約６０℃の水溶液中に注入し、エーテルを蒸発させる方法（Biochim. Biophys. Acta 443, 629-634, 1976）により作ることができる。
【００４９】
また、作製されたリポソーム懸濁液にペプチドの水溶液を加えることでペプチド組み込みリポソームを作製できる。
【００５０】
これらの調製法のほかに、フレンチプレス法により粒子径の小さなリポソームを調製することもできる（FEBS lett. 99, 210-214, 1979）。また大沢らによって報告されているリポソームへの保持効率の高い凍結乾燥法（Chem. Pharm. Bull. 32, 2442-2445, 1984）と凍結融解法（Chem. Pharm. Bull. 33, 2916-2923,1985）を利用することもできる。
【００５１】
このように調製されたリポソームに含まれる脂質化ＨＡ結合性ペプチドの割合は、全脂質中、数モル％から数十モル％程度であればよく、５〜２０モル％程度であるのが好ましいが、通常は５モル％程度でもあってもよい。
【００５２】
さらに、こうして調製されたリポソームは、透析法（J. Pharm. Sci. 71, 806-812,1982）やポリカーボネート膜を用いたろ過法（Biochim. Biophys. Acta 557, 9-23, 1979；Biochim. Biophys. Acta 601, 559-571, 1980）により、粒子径を一定にすることができる。また調製されたリポソーム溶液から、リポソーム内に保持されなかった脂質化ＨＡ結合性ペプチドを除くためには、透析法、ゲルろ過法、遠心分離法を利用することができる（リポソーム．"脂質の化学"[日本生化学会編、生化学実験講座３]、東京化学同人、1974）。更にまた透析膜を用いてリポソームを濃縮することも可能である。
【００５３】
このようにして調製されるリポソーム分散液には、製剤設計上必要な添加剤として、防腐剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、吸収促進剤等の各種の公知物質を適宜配合することができ、また必要に応じてこれらの添加物を含む液または水で希釈することもできる。上記添加剤の具体例としては、防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、パラベン類（メチルパラベン、エチルパラベン等）、チメロサール等の真菌および細菌に有効な防腐剤を、等張化剤としてはＤ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−キシリトール、グリセリン、ブドウ糖、マルトース、庶糖、プロピレングリコール等の多価アルコール類や塩化ナトリウム等の電解質類を、また安定化剤としてはトコフェロール、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、システイン等をそれぞれ用いることができる。
【００５４】
また、本発明のＨＡ結合性ペプチドからなる上記リポソームの内部には、例えば抗ウイルス剤等の他の薬剤を更に封入させて、リポソーム製剤とすることも可能である。
【００５５】
リポソーム製剤の製造は、具体的には例えばウッドレら（Long Circulating Liposomes: old drugs, New therapeutics., M.C. Woodle, G.Storm,Eds: Springer-Verlag Berlin (1998)）またはナンバら（Liposomal applications to cancer therapy, Y.Namba, N.Oku, J.Bioact.Compat.Polymers, 8, 158-177 (1993)）の文献に記載される方法に従って調製することができる。
【００５６】
上記リポソーム製剤中のＨＡ結合性ペプチドの量としては、特に限定されず、広範囲に適宜選択されるが、通常組成物中０．０００２〜０．２（ｗ／ｖ％）程度、好ましくは０．００１〜０．１（ｗ／ｖ％）程度とするのがよい。
【００５７】
＝＝他の形態を有する医薬組成物＝＝
配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８を有するヘマグルチニン結合ペプチドを投与する代わりに、これらのペプチドをヒト細胞で発現できる発現ベクターを投与してもよい。ベクターは、プラスミドでもウイルスベクターでもよいが、ヒト細胞で挿入遺伝子を発現できるプロモーターを有する必要がある。投与形態としては、ＤＮＡをそのまま投与しても、このＤＮＡを含むウイルスを感染させても、このＤＮＡを含む細胞を移植してもよい。ウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルスなど、特に限定されないが、体内で細胞に感染し、ヘマグルチニン結合ペプチドを発現し、分泌できるようにするのが好ましい。また、細胞を移植する場合も、ヘマグルチニン結合ペプチドを発現し、分泌できるようにベクターが構築されているのが好ましい。発現したペプチドを分泌させるためには、例えば、ヘマグルチニン結合ペプチドのＮ端側にシグナルペプチドが融合した融合ペプチドを発現させるようにベクターを構築すればよいが、分泌させるための方法は必ずしもこれに限定されない。
【実施例１】
【００５８】
まず、西、佐谷らの報告（Nishi T., Saya H., et al., FEBS Lett, 399, 237-240 (1996)）で使用されたファージディスプレイシステムを用い、配列番号１〜１８の各アミノ酸配列を有するペプチドを外殻表面に提示する繊維状ファージｆｄを作製した。即ち、これらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（表１参照）を外殻タンパク質ｐIII遺伝子のＮ末端部分に相当する領域に遺伝子組み換えの手法を用いて挿入すると、この挿入ＤＮＡにコードされた１５残基のアミノ酸配列からなるペプチドをファージ外殻表面に発現するように、ファージＤＮＡを構築することができる。K91Kanの宿主菌を用い、常法により、これらの各ファージを増幅し、ファージ溶液を作製した。
【００５９】
次に、配列番号２〜１８の各アミノ酸配列を表面に提示するこれらのファージのヘマグルチニン（ＨＡ）に対する結合性をＥＬＩＳＡで調べた。なお、プレートに固定するヘマグルチニンとして、Ａ型のＨ１亜型であるA/PR/8/34(Ｈ１Ｎ１)のエーテル抽出物、及びＡ型のＨ３亜型であるA/武漢/359/95(Ｈ３Ｎ２)のエーテル抽出物を用いた。以下、具体的な手順を述べる。
【００６０】
まず、９６穴カルボプレート（SUMILON社製）に結合したカルボキシル基を活性化させるため、プレートの各ウエルに、ＥＤＣ（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide）およびＮ−ヒドロキシスクシイミドの等量混合液６０μlを添加して、１０分放置した。
【００６１】
次に、活性化プレートにヘマグルチニンを固定するため、各ウエルを５０ｍＭ ＴＢＳ緩衝液（pH7.6）で６回洗浄し、Ｈ１Ｎ１溶液（７０μl/ml）またはＨ３Ｎ２溶液（７０μl/ml）を１００μl 添加した。２時間放置した後、５０ｍＭ ＴＢＳ緩衝液（pH7.6）で６回洗浄し、１ｍＭエタノールアミン水溶液を１００μl添加した。１０分放置した後、再度５０ｍＭ ＴＢＳ緩衝液（pH7.6）で６回洗浄した。
【００６２】
ヘマグルチニンを固定したプレートに各ファージクローン溶液を５０μl（１ｘ１０１０pfu含有）添加し、室温で２時間放置した。各ウエルをＴＢＳＴ（TBS/5% Tween20）で５回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴで希釈した抗fdファージ抗体（シグマ社；１０００倍希釈で使用）を１００μl添加し、室温で１時間放置した。各ウエルをＴＢＳＴ（TBS/5% Tween20）で５回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴで希釈したＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（シグマ社；１０００倍希釈）を１００μl添加し、室温で１時間放置した。各ウエルをＴＢＳＴ（TBS/5% Tween20）で５回洗浄後、基質としてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液を１００μl添加し、１０〜１５分放置した。３ＮＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸収を測定し、結合活性とした。
【００６３】
なお、コントロールとして、上記記載の１次ファージディスプレイ・ライブラリー及び２次ファージディスプレイ・ライブラリー、及びＡ−１の結合活性と比較した。Ａ−１は、これまで同定されたヘマグルチニン結合ペプチド（特許文献１及び２参照）に比べ、同等の結合活性を有する。（一例として、図１に、同様にして測定したＨ３Ｇ−１の結合活性との比較を示す。）そこで、配列番号２〜１８のアミノ酸配列を有するペプチドの結合活性を、ここでは、Ａ−１のＨ１Ｎ１とＨ３Ｎ２各々に対する結合活性を１として全データを標準化し、グラフにした（図２）。この図２のグラフから、ｅ−４とｅ−７以外のペプチドは、両者のヘマグルチニンに対し、Ａ−１より強い結合活性を示すことがわかった。特にｓ−２はＡ−１に比べ約３倍もの強い結合活性を示した。なお、上記各ライブラリーは、Ａ−１の数分の一の活性しか示さなかった。
【００６４】
以上より、配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８を有するポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合ペプチドより、ヘマグルチニンに対し高い結合活性を有するペプチドであって、本発明の一つの目的である医薬組成物として有用であると考えられる。
【００６５】
なお、これらの配列は、共通配列（コンセンサス配列）として
ｘＲＬ（Ｓ／Ｐ）ｘｘＭＶ（Ｈ／Ｒ）ｘｘｘｘＱｘ
を有するので、この共通配列をもつペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合ペプチドより、ヘマグルチニンに対し高い結合活性を有すると考えられる。
【実施例２】
【００６６】
実施例１で行ったＥＬＩＳＡにおいて、特にヘマグルチニン（ＨＡ）に対する結合性の高かったｓ−２ およびｅ−１の配列を持つペプチドを化学合成し（東レ株式会社に依頼）、ペプチドだけの状態でＨＡ に対する結合性を評価した。本実施例で用いたペプチド及びそのアミノ酸配列を表２に示す。
【表２】
【００６７】
これらのHA 結合性ペプチドを用いて、以下のように、ＨＡ固定化膜に対する結合性を評価した。実施例１のプレートと同様にSensor Chip CM5 (Biacore, BR-1000-14) にＨ３Ｎ２を固定化し、これに対するペプチドの結合性を Biacore装置（Biacore社） によって評価を行った。具体的には、各ペプチドに対し、時間を追ってレゾナンスがどのように変化するかを、複数のペプチド濃度で測定した。
【００６８】
まず、ｓ−２ ペプチドに関し、各濃度における時間（ｘ軸）とレゾナンス（ｙ軸）との関係を図３Ａに示す。そして、同様の実験を各ＨＡ結合性ペプチドで行い、所定の時間における濃度（ｘ軸）に対するレゾナンス（ｙ軸）の変化を図３Ｂに示す。このように、いずれのＨＡ結合性ペプチドも、その濃度に依存してＨＡ への結合量が増えていくことがわかった。
【００６９】
次に、上記の結果から、所定のペプチド濃度における各ＨＡ結合性ペプチドの結合性を比較した。図４Ａに、各ＨＡ結合性ペプチドのペプチド濃度１００μＭにおける、レゾナンス（ｙ軸）の時間（ｘ軸）経過に対する変化を示す。また、図４Ｂに、ペプチド濃度２００μＭにおいて、Ａ−１ ペプチドの結合量を 1 としたときのＨＡ結合性ペプチドのレゾナンスの相対値を示す。このように、各ペプチドはｓ−２ > ｅ−１> Ａ−１> pVIII の強さの順で、ＨＡに結合することがわかった。この結合の強さの順序は、各ＨＡ結合性ペプチドを発現するファージで測定した結合性の順序とも対応している。
【００７０】
以上の結果より、ｅ−１、ｓ−２は Ａ−１よりそれぞれ １．２倍、２．１倍強く ＨＡに結合することが分かり、アミノ酸が置換されたことによって、ペプチドの機能が向上したことが示唆された。ＨＡに対する結合量が少ないために、解離定数 Kd を求めることはできないが、本実験で固体化したリガンド量から理論的最大結合量を求めると２２８ＲＵであるため、例えばｓ−２の２００μＭ のときの結合量がこれのちょうど半分程度であることから、これらのペプチドの解離定数は１０−３〜１０−４Ｍ程度だと考えられる。
【００７１】
ＧＭ３キャスト膜を用いてＧＭ３−ＨＡ間相互作用の阻害評価をＥＬＩＳＡを用いて評価したところ（永田和宏・半田宏、「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法‐BIACOREを中心に」 シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社、１９９８年）、ペプチドＡ−１ は、ｍＭオーダーでＧＭ３に対するヘマグルチニンの結合を阻害した（H3 に対するＡ−１のＩＣ５０＝１．９ｍＭ）。また、ＨＡと遊離のシアリルラクトースとの結合定数はｍＭオーダーであることがＮＭＲによる評価から報告されている（α(2,3)-sialyllactose Ｋ０＝３．２ｍＭ）。従って、本実施例の結果は、Inoue によって報告されたペプチドの阻害定数とほぼ一致し、また、本実施例の結果は、Ａ−１の阻害定数あるいはシアリルラクトースで得られている結合定数と同じオーダーもしくは一桁小さいことから、これらのＨＡ結合性ペプチドは、ＨＡのリガンドである糖鎖の優れたアナログとなり得ることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の実施例において、ＥＬＩＳＡを用いて、Ａ−１とＨ３Ｇ−１とのヘマグルチニンに対する結合活性を比較したグラフである。
【図２】本発明の実施例において、ＥＬＩＳＡを用いて、配列番号２〜１８のアミノ酸配列を有するペプチドのヘマグルチニンに対する結合活性を、Ａ−１の結合活性と比較したグラフである。
【図３】（Ａ）は、本発明の実施例において、ｓ−２ ペプチドに関し、各濃度における時間（ｘ軸）とレゾナンス（ｙ軸）との関係を示した図であり、（Ｂ）は、本発明の実施例において、各ＨＡ結合性ペプチドに関し、所定の時間における濃度（ｘ軸）に対するレゾナンス（ｙ軸）の変化を示した図である。
【図４】（Ａ）は、本発明の実施例において、各ＨＡ結合性ペプチドのペプチド濃度１００μＭにおける、レゾナンス（ｙ軸）の時間（ｘ軸）経過に対する変化を示した図であり、（Ｂ）は、本発明の実施例において、各ＨＡ結合性ペプチドのペプチド濃度２００μＭにおける、Ａ−１ ペプチドの結合量を 1 としたときのＨＡ結合性ペプチドのレゾナンスの相対値を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘマグルチニンに結合するヘマグルチニン結合ペプチド、インフルエンザウイルスの感染を阻害するインフルエンザウイルス感染阻害剤、ヘマグルチニン結合ペプチドを含有するリポソーム、ヘマグルチニン結合ペプチドを含有するインフルエンザの治療薬及び予防薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルス膜にはヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ、シアリダーゼ）といった２種類のスパイク糖蛋白質が存在し、それぞれウイルスの感染成立及びウイルスの宿主細胞からの出芽に重要な役割を果たしている。前者のヘマグルチニンは、ヒトやその他の動物（ほ乳類、鳥類、は虫類、魚類、両生類等）といった宿主の細胞膜上に普遍的に存在するシアル酸含有糖鎖を受容体として認識してそれに特異的に結合し、インフルエンザウイルスの細胞内へのエンドサイトーシスを導く。一方、後者のノイラミニダーゼは、受容体破壊酵素であり、宿主細胞からウイルス粒子が出芽または遊離する際に、自らのまたは宿主細胞膜上のシアル酸残基を切断する役割を担っている。
【０００３】
インフルエンザウイルス感染の第１ステップに関与するヘマグルチニンには、極めて変異しやすい抗原決定領域（Ａ〜Ｅ）のアミノ酸配列の多様性に基づいて、種々の亜型が存在する。ヘマグルチニンの亜型間のアミノ酸配列の相同性は２５〜７５％であるため、抗原性を基にしたインフルエンザワクチンの開発は非常に困難である。一方、宿主細胞の受容体と結合するいわゆる受容体結合ポケット領域は、比較的変異が少なく、その三次元構造はよく保存されている（例えば、非特許文献１参照）。従って、インフルエンザウイルスの感染を防止するために、感染成立に寄与するヘマグルチニンに特異的に結合することによってその働きを阻害すれば、広くインフルエンザウイルスの感染防止に効果があることが期待され、そのような薬剤の開発が求められている。
例えば、ヘマグルチニンが宿主受容体のシアル酸含有糖鎖を認識して結合することに基づいて、ヘマグルチニンのその結合部位に特異的に結合する糖アナログをスクリーニングするという手法により、現在までに種々のヘマグルチニン結合性糖アナログが取得されている（例えば、非特許文献２〜５参照）。
そのほか、ヘマグルチニンの受容体糖鎖に対するモノクローナル抗体の抗原結合部位のもつ抗原性（イディオタイプ）に対する抗体（抗イディオタイプ抗体）を作成する手法もある。すなわち、これはヘマグルチニンの受容体となるシアル酸およびシアロ糖鎖の三次元構造に代えて、それと立体構造が類似する抗イディオタイプ抗体の超可変部のアミノ酸配列を作成し、宿主細胞のヘマグルチニン受容体に模擬させるというものである（例えば、非特許文献６参照）。 しかし、受容体結合ポケット領域は、比較的変異が少なく、その三次元構造はよく保存されているとは言え、これらのいずれもヘマグルチニンの亜型に特異的であり、また結合定数も高くない。従って、ヘマグルチニンの亜型に関わらずインフルエンザウイルス全般に働く薬剤の開発が待たれている。
【０００４】
そこで、ファージディスプレイ法を用いて、ヘマグルチニンに結合し、インフルエンザウイルスの感染を防止する１５merのオリゴペプチドがスクリーニングされ、１１種類（例えば、特許文献１参照）及び３種類（例えば、特許文献２及び非特許文献７参照）のオリゴペプチドが同定された（例えば、特許文献１参照）。
【非特許文献１】Y.Suzuki, Prog.Lipid.Res., 33, 429 (1994)
【非特許文献２】R.Roy, et al., J.Chem.Soc., Chem.Commun., 1869 (1993)
【非特許文献３】M.Mammen, et al., J.Med.Chem., 38,4179 (1995)
【非特許文献４】T.Sato, et al., Chem.Lett., 145 (1999)
【非特許文献５】M.ltzstein, et al., Nature, 363, 418 (1993)
【非特許文献６】鈴木康夫「ウイルス感染と糖鎖」、別冊日経サイエンス「糖鎖と細胞」,89-101頁, 1994年10月
【非特許文献７】T. Sato, et al., Peptide Science 2001, 329 (2002)
【特許文献１】国際公開ＷＯ００／５９９３２
【特許文献２】特開２００２−２８４７９８明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１及び２においてなされたスクリーニングに用いられたファージライブラリーのタイターは２．５ｘ１０８であり、アミノ酸１５merの総配列数である２０１５（＝３．３ｘ１０１９）には程遠く、それらのオリゴペプチドより、ヘマグルチニンに対する親和性の高いペプチドが存在することと考えられた。
【０００６】
そこで、本願発明は、より多くのペプチドをスクリーニングすることによって、さらにヘマグルチニンに対する親和性の高いペプチドを提供し、さらに、このようなヘマグルチニンに対する親和性の高いペプチドを用いた医薬組成物を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、特許文献１において得られたヘマグルチニン結合ペプチドＡＲＬＳＰＴＭＶＨＰＮＧＡＱＰ（ペプチドＡ−１：配列番号１）を基にして、このペプチドに複数の変異を有するペプチドを作製した。具体的には、このヘマグルチニン結合ペプチドをコードするＤＮＡに変異を導入するために、（１）オリゴヌクレオチドをＰＣＲで増幅する際、Taq ＤＮＡポリメラーゼの塩基取り込みエラーを利用したエラー・プローンＰＣＲ（error-prone PCR）を用いて変異を導入する方法（２）オリゴヌクレオチドを化学合成する際、本来とは異なるヌクレオチドを混合させておくことによって変異を導入する方法、の２通りの方法を用い、上記ヘマグルチニン結合ペプチドの変異ペプチドを有する２次ファージディスプレイ・ライブラリーを作製した。方法（１）によっては、ペプチド１個当たりの平均変異オリゴヌクレオチド数は２．４２個、平均アミノ酸置換数は１．２５個であり、方法（２）によっては、ペプチド１個当たりの平均変異オリゴヌクレオチド数は７．５個、平均アミノ酸置換数は５．０個であった。また、方法（１）によって作製したライブラリーのタイターは約５ｘ１０４であり、方法（２）によって作製したライブラリーのタイターは約１ｘ１０５であり、従って、２次ライブラリーの総タイター数は約１．５ｘ１０５となった。この２次ライブラリーを２次スクリーニングすると、１次スクリーニングも考慮して、２．５ｘ１０８ｘ１．５ｘ１０５＝約４ｘ１０１３のペプチドをスクリーニングしたことになる。このようにして、かなり大きなペプチドライブラリーをスクリーニングした結果、ＡＲＬＳＰＴＭＶＨＰＮＧＡＱＰ（配列番号１）よりヘマグルチニンのＨ１及びＨ３の両方に親和性の高いペプチドを得ることができ、本発明の完成に至った。
【０００８】
即ち、本発明にかかるヘマグルチニン結合ペプチドは、配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８のいずれかのアミノ酸配列を有する。また、配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８において、１〜数アミノ酸残基の置換・欠失・付加を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合ペプチドに比べ、ヘマグルチニンＨ１またはＨ３の少なくとも一方に対し、より高い結合活性を有するヘマグルチニン結合ペプチドであってもよい。また、アミノ酸配列
ｘＲＬ（Ｓ／Ｐ）ｘｘＭＶ（Ｈ／Ｒ）ｘｘｘｘＱｘ
を有し、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合ペプチドに比べ、ヘマグルチニンＨ１またはＨ３の少なくとも一方に対し、より高い結合活性を有するヘマグルチニン結合ペプチドであってもよい。
【０００９】
上記ヘマグルチニン結合ペプチドは、ヘマグルチニンＨ１及びＨ３の両方に結合することが好ましい。また、アルキル化または脂質化されていてもよい。
【００１０】
本発明にかかるインフルエンザウイルス感染阻害剤は、上記いずれかのヘマグルチニン結合ペプチドを有効成分として含有する。また、ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方の感染を阻害することが好ましい。また、インフルエンザウイルス感染阻害剤が含有するポリペプチドがアルキル化または脂質化されていてもよい。
【００１１】
本発明にかかるリポソームは、上記いずれかのヘマグルチニン結合ペプチドを含有する。このヘマグルチニン結合ペプチドはヘマグルチニンＨ１及びＨ３の両方に結合することが好ましい。また、このヘマグルチニン結合ペプチドはアルキル化または脂質化されていてもよい。
【００１２】
本発明にかかるインフルエンザ治療薬及びインフルエンザ予防薬は、上記いずれかのヘマグルチニン結合ペプチドを有効成分として含有する。また、ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方に効果を有することが好ましい。また、インフルエンザ治療薬及びインフルエンザ予防薬の含有するポリペプチドがアルキル化または脂質化されていることが好ましい。
【００１３】
本発明にかかるＤＮＡは、上記いずれかのヘマグルチニン結合ペプチドをコードする。また、本発明にかかる発現ベクターは、このＤＮＡを有する。また、本発明にかかる細胞は、この発現ベクターが導入され、上記いずれかのヘマグルチニン結合ペプチドを分泌する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、ヘマグルチニンに対する親和性の高いペプチドを提供し、さらに、このようなヘマグルチニンに対する親和性の高いペプチドを用いた医薬組成物を提供することができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１６】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１７】
＝＝ヘマグルチニン結合ペプチド＝＝
本明細書で用いられるヘマグルチニン結合タンパク質のアミノ酸配列を表１に示す。
【表１】
【００１８】
この中で、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドＡ−１は、これまで同定されたヘマグルチニン結合ペプチドのうち最も高い結合活性を有するが（特許文献１、特許文献２及び実施例参照）、配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、実施例に示すように、Ａ−１より、さらにヘマグルチニンに対する結合活性が高い。また、実施例に示すように、これら配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ヘマグルチニンＨ１及びＨ３の両方に結合する。
【００１９】
また、本発明にかかるヘマグルチニン結合タンパク質は、配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８において、１〜数アミノ酸残基の置換・欠失・付加を有するアミノ酸配列を有し、Ａ−１より、ヘマグルチニンに対し高い結合活性を有するペプチドであってもよい。
【００２０】
ここで、ヘマグルチニンに対するヘマグルチニン結合ペプチドの結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定することができるが、これに限らず、ＲＩＡ、ＥＩＡ、ウエスタン・ブロッティング、など、タンパク質間の相互作用を定量的に測定できる手法であればどんなものを用いて測定してもよい。
【００２１】
＝＝ヘマグルチニン結合ペプチドを含有する医薬組成物＝＝
インフルエンザウイルスが細胞に感染する際、インフルエンザウイルスの有するヘマグルチニンが、宿主細胞の受容体に特異的に結合し、その受容体を足場として、ウイルスが細胞に感染する。本発明のＨＡ結合性ペプチドは、そのヘマグルチニンに特異的に結合する。この結合により、ヘマグルチニンが宿主細胞受容体に結合することを妨げることができ、従って、インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染するのを阻害することができる。実際、これまでに阻害効果の有無を調べた全てのＨＡ結合性ペプチドは、ヘマグルチニンの宿主細胞への結合を阻害することができた（特許文献１及び２）。
【００２２】
このように、本発明のＨＡ結合性ペプチドは、インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染するのを阻害することができ、従って、インフルエンザに罹患した患者に投与することにより、体内でのインフルエンザウイルスの増殖を抑制することができる。また、インフルエンザ罹患前の健常人に予め投与しておくことにより、インフルエンザウイルスが体内に進入しても感染を防止することができる。
【００２３】
こうした医療用以外にも、本発明のＨＡ結合性ペプチドは、ヘマグルチニンを介して生じるインフルエンザウイルスの感染、及びそれに伴う種々の細胞機能や生命現象を解明するためのツールとして用いることもできる。
【００２４】
なお、本発明が対象とするインフルエンザウイルスは、ヘマグルチニンＨ１またはＨ３を有していれば、その型や由来を特に制限するものでなく、Ａ型、Ｂ型またはＣ型ないしはヒト分離型、ブタやウマ等の他の哺乳動物分離型または鳥類分離型等のいずれであってもよい。
【００２５】
以上のように、本発明のヘマグルチニン結合ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物として、インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染するのを阻害するためのインフルエンザウイルス感染阻害剤、インフルエンザに罹患した患者を治療するためのインフルエンザ治療剤、インフルエンザに罹患する前に予防的に投与するためのインフルエンザ予防剤などが考えられる。これらの医薬組成物は、有効成分としてのＨＡ結合性ペプチドと、必要に応じて薬学的に許容される担体とを含有する製剤として、インフルエンザウイルスに感染した患者に投与したり、感染前の健常人に予防的に投与したりすることができる。
【００２６】
ここで用いられる薬学的に許容される担体は、調製される医薬組成物の形態に応じて、慣用されている担体の中から適宜選択して用いることができる。例えば、医薬組成物が溶液形態として調製される場合、担体として、精製水（滅菌水）または生理学的緩衝液、グリコール、グリセロール、オリーブ油のような注射投与可能な有機エステルなどを使用することができる。また、この医薬組成物には、慣用的に用いられる安定剤、賦形剤などを含むことができる。
【００２７】
これらの医薬組成物の投与方法には特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾病の重篤度等に応じて適宜決定すればよいが、製剤形態としては、特に注射剤、点滴剤、噴霧剤（点鼻剤や吸入剤など）等の非経口投与形態が好ましい。その場合、特に注射剤や点滴剤として調製する場合は、必要に応じて塩溶液、ブドウ糖やアミノ酸等の通常の補液などと混合して静脈内、筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内に投与する。噴霧剤として調製する場合、例えば、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体として、乳糖、グリセリン等を使用してエアロゾル、ドライパウダー等に製剤化した噴霧剤を、口腔または気道粘膜へ噴霧することにより粘膜投与する。
【００２８】
また、これらの医薬組成物の１日当りの投与量は、投与する者の症状、年齢、体重、性別、治療期間、治療効果、投与方法などにより適宜変更しうるが、ＨＡ結合性ペプチドの量に換算して通常成人１日当り約０．００１〜１００ｍｇ程度の範囲から選ぶことができる。当該製剤は１日１回投与に限らず、数回に分けて投与してもよい。当該製剤は１日１回投与に限らず、数回に分けて投与してもよい。
【００２９】
これらの医薬組成物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、他の抗ウイルス剤、抗炎症剤や、症状を緩和する薬剤など）と組み合わせて使用してもよい。
【００３０】
＝＝ヘマグルチニン結合ペプチドの製造方法＝＝
本発明のヘマグルチニン結合ペプチドは、常法に従って、化学合成することにより製造できる。例えば、通常の液相法及び固相法によってペプチド合成することができる。より具体的には、上記アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法などを利用できる。
【００３１】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ(ジフェニルホスホリルアジド)法、ＤＣＣ＋添加物(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド等)、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種のペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えば ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
【００３２】
なお、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸及至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばＴｙｒの水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に例えばＡｒｇのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、２−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って行うことができる。
【００３３】
このように作製されたペプチドは、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、向流分配法等、ペプチド化学の分野で汎用されている常法に従って、適宜その精製を行うことができる。
【００３４】
別法として、上記ヘマグルチニン結合ペプチドをコードするＤＮＡを作製して発現ベクターに組み込み、培養細胞などの真核細胞または大腸菌などの原核細胞に導入し、そこで発現させたペプチドを精製してもよい。発現ベクターは、導入する宿主細胞に従って、適宜選択する。ペプチドをコードするＤＮＡの組み込みなどを含むベクターの構築、宿主細胞への導入、宿主細胞での発現、宿主細胞の抽出物の調製は、分子生物学的手法を用いて、常法に従って行うことができる。目的のペプチドは、その抽出物から、上記したペプチド化学の分野で汎用されている常法によって、精製することができる。
【００３５】
また、上記ヘマグルチニン結合ペプチドにタグ（例えば、Hisタグ、Flagタグ、GSTタグなど）を付加したペプチドをコードするＤＮＡを作製し、上記と同様に宿主細胞で発現させ、このタグを利用して、アフィニティカラム等で精製することもでき、その後タグのみを切断しペプチド部分のみを精製できるように発現ベクターを設計することもできる。さらに、最終的に、上記したペプチド化学の分野で汎用されている常法によって、ヘマグルチニン結合ペプチドを精製してもよい。
【００３６】
＝＝ＨＡ結合性ペプチドの化学修飾＝＝
上記本発明のＨＡ結合性ペプチドは、適宜に化学修飾することができる。例えば、アルキル化や脂質化（リン脂質化）等による化学修飾によって、ＨＡ結合性ペプチドの細胞親和性や組織親和性を増大させたり、血中半減期を延長させ薬理効果を増強をさせたりすることができる。
【００３７】
ＨＡ結合性ペプチドのアルキル化は、常法に従って行うことができる。例えば、上記ペプチド合成と同様に、脂肪酸とＨＡ結合性ペプチドのＮ末端アミノ基とのアミド結合形成反応により容易に行うことができる。脂肪酸としては、直鎖脂肪酸でも分枝鎖脂肪酸でもよく、また飽和脂肪酸でも不飽和脂肪酸でもよく、どんな脂肪酸でも広く使用できるが、特に、生体内に存在する脂肪酸を用いるのが好ましく、具体的にはラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸等の飽和脂肪酸；オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等の不飽和脂肪酸など、炭素数が１２〜２０程度の脂肪酸が挙げられる。
【００３８】
またアルキル化は、前記ペプチド合成と同様にして、アルキルアミンとＨＡ結合性ペプチドのＣ末端カルボキシル基とのアミド結合形成反応によっても行うことができる。アルキルアミンとしては、上記脂肪酸と同様に各種のアルキルアミンを用いることができるが、特に生体内に存在する脂肪鎖（炭素数が１２〜２０程度）を用いるのが好ましい。
【００３９】
ＨＡ結合性ペプチドの脂質化も常法に従って実施できる（例えば、New Current, 11(3), 15-20 (2000); Biochemica et Biophysica Acta., 1128, 44-49 (1992); FEBSLetters, 413, 177-180 (1997); J.Biol.Chem., 257, 286-288 (1982)等を参照）。例えば、各種リン脂質の２位水酸基或いは３位のリン酸基に対し、任意のスペーサーを介して、縮合法によってＨＡ結合性ペプチドに結合させることができる。必要によっては、ＨＡ結合性ペプチドのＮ端或いはＣ端に任意の長さ（通常数個）のシステインを含むアミノ酸配列を付加して、縮合に利用される反応性ＳＨ基をあらかじめ導入することもできる。ここで用いられるリン脂質には、特に制限はなく、例えば、上記脂肪酸からなる、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール等が使用できる。
【００４０】
なお、これらのアルキル化や脂質化された本発明のＨＡ結合性ペプチド（リポペプチド）は、リポソーム調製の際の脂質成分として利用することができる。その際、ＨＡ結合性ペプチドがリポソーム上に提示されることにより、ＨＡ結合性ペプチドは後述するリポソーム製剤として有効に利用できる。
【００４１】
＝＝ヘマグルチニン結合ペプチドを含有するリポソーム＝＝
本発明のＨＡ結合性ペプチドはリポソーム製剤として調製することができる。このリポソーム製剤においては、酸性リン脂質を膜構成成分とするか或いは中性リン脂質と酸性リン脂質とを膜構成成分とするリポソームに、本発明のＨＡ結合性ペプチドが保持されている。
【００４２】
膜構成成分としての酸性リン脂質としては、例えば、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、卵黄ホスファチジルグリセロール（卵黄ＰＧ）、水添卵黄ホスファチジルグリセロール等の天然または合成ホスファチジルグリセロール類（ＰＧ）およびジラウロイルホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）；ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレオイルホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）、大豆ホスファチジルイノシトール（大豆ＰＩ）、水添大豆ホスファチジルイノシトール等の天然または合成ホスファチジルイノシトール類（ＰＩ）などを用いることができる。これらの酸性リン脂質は一種単独でまたは二種以上混合して使用することができる。
【００４３】
また、中性リン脂質としては、例えば、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、水添大豆ホスファチジルコリン、水添卵黄ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、パルミトイルステアリイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）等の天然または合成ホスファチジルコリン類（ＰＣ）、大豆ホスファチジルエタノールアミン、卵黄ホスファチジルエタノールアミン、水添大豆ホスファチジルエタノールアミン、水添卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ミリストイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＰＥ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等の天然または合成ホスファチジルエタノールアミン類（ＰＥ）等を用いることができる。これらの中性リン脂質は、一種単独でまたは二種以上混合して使用することができる。
【００４４】
上記リポソーム膜は、上記酸性リン脂質を単独で構成成分として用いるかまたは上記中性リン脂質と酸性リン脂質とを併用して、常法に従い形成される。ここで酸性リン脂質の併用割合は、リポソーム膜構成成分中に約０．１〜１００モル％程度、好ましくは約１〜９０モル％、より好ましくは約１０〜５０モル％程度とするのがよい。
【００４５】
リポソームの調製に当たっては、さらに、例えばコレステロールなどを添加することができる。このコレステロールの添加によってリン脂質の流動性を調整し、リポソームの調製をより簡便にすることができる。このコレステロールは、通常リン脂質に対して等量まで添加できるが、特に０．５〜１倍量で添加されるのが好ましい。
【００４６】
リポソームを調製する際、脂質化ＨＡ結合性ペプチドと酸性リン脂質との分子数の割合は、ペプチド１に対して酸性リン脂質が０．５〜１００程度、好ましくは１〜６０程度、より好ましくは１．５〜２０程度とするのがよい。
【００４７】
このような脂質を用いて、例えば多重層リポソーム（ＭＬＶ）を次のようにして調製する。まず、脂質を有機溶媒（クロロホルム、エーテル等）に溶解した後、丸底フラスコに入れ、窒素気流下または減圧下で有機溶媒を除去し、フラスコ底部に脂質の薄膜をつくる。この場合、さらに減圧下でデシケーター中に放置することによって有機溶媒を完全に除去することもできる。次いで、脂質化ＨＡ結合性ペプチドの水溶液を脂質薄膜上に加えて脂質を水和させることによって乳濁色のリポソーム懸濁液が得られる。
【００４８】
また、大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）は、ホスファチジルセリンの小さな一枚膜リポソームにＣａ２＋を添加し、融合させてシリンダー状のシートとした後、キレート剤であるＥＤＴＡを添加しＣａ２＋を除去する方法 （Biochim. Biophys. Acta394, 483-491, 1975）やエーテルに溶解した脂質を約６０℃の水溶液中に注入し、エーテルを蒸発させる方法（Biochim. Biophys. Acta 443, 629-634, 1976）により作ることができる。
【００４９】
また、作製されたリポソーム懸濁液にペプチドの水溶液を加えることでペプチド組み込みリポソームを作製できる。
【００５０】
これらの調製法のほかに、フレンチプレス法により粒子径の小さなリポソームを調製することもできる（FEBS lett. 99, 210-214, 1979）。また大沢らによって報告されているリポソームへの保持効率の高い凍結乾燥法（Chem. Pharm. Bull. 32, 2442-2445, 1984）と凍結融解法（Chem. Pharm. Bull. 33, 2916-2923,1985）を利用することもできる。
【００５１】
このように調製されたリポソームに含まれる脂質化ＨＡ結合性ペプチドの割合は、全脂質中、数モル％から数十モル％程度であればよく、５〜２０モル％程度であるのが好ましいが、通常は５モル％程度でもあってもよい。
【００５２】
さらに、こうして調製されたリポソームは、透析法（J. Pharm. Sci. 71, 806-812,1982）やポリカーボネート膜を用いたろ過法（Biochim. Biophys. Acta 557, 9-23, 1979；Biochim. Biophys. Acta 601, 559-571, 1980）により、粒子径を一定にすることができる。また調製されたリポソーム溶液から、リポソーム内に保持されなかった脂質化ＨＡ結合性ペプチドを除くためには、透析法、ゲルろ過法、遠心分離法を利用することができる（リポソーム．"脂質の化学"[日本生化学会編、生化学実験講座３]、東京化学同人、1974）。更にまた透析膜を用いてリポソームを濃縮することも可能である。
【００５３】
このようにして調製されるリポソーム分散液には、製剤設計上必要な添加剤として、防腐剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、吸収促進剤等の各種の公知物質を適宜配合することができ、また必要に応じてこれらの添加物を含む液または水で希釈することもできる。上記添加剤の具体例としては、防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、パラベン類（メチルパラベン、エチルパラベン等）、チメロサール等の真菌および細菌に有効な防腐剤を、等張化剤としてはＤ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−キシリトール、グリセリン、ブドウ糖、マルトース、庶糖、プロピレングリコール等の多価アルコール類や塩化ナトリウム等の電解質類を、また安定化剤としてはトコフェロール、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、システイン等をそれぞれ用いることができる。
【００５４】
また、本発明のＨＡ結合性ペプチドからなる上記リポソームの内部には、例えば抗ウイルス剤等の他の薬剤を更に封入させて、リポソーム製剤とすることも可能である。
【００５５】
リポソーム製剤の製造は、具体的には例えばウッドレら（Long Circulating Liposomes: old drugs, New therapeutics., M.C. Woodle, G.Storm,Eds: Springer-Verlag Berlin (1998)）またはナンバら（Liposomal applications to cancer therapy, Y.Namba, N.Oku, J.Bioact.Compat.Polymers, 8, 158-177 (1993)）の文献に記載される方法に従って調製することができる。
【００５６】
上記リポソーム製剤中のＨＡ結合性ペプチドの量としては、特に限定されず、広範囲に適宜選択されるが、通常組成物中０．０００２〜０．２（ｗ／ｖ％）程度、好ましくは０．００１〜０．１（ｗ／ｖ％）程度とするのがよい。
【００５７】
＝＝他の形態を有する医薬組成物＝＝
配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８を有するヘマグルチニン結合ペプチドを投与する代わりに、これらのペプチドをヒト細胞で発現できる発現ベクターを投与してもよい。ベクターは、プラスミドでもウイルスベクターでもよいが、ヒト細胞で挿入遺伝子を発現できるプロモーターを有する必要がある。投与形態としては、ＤＮＡをそのまま投与しても、このＤＮＡを含むウイルスを感染させても、このＤＮＡを含む細胞を移植してもよい。ウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルスなど、特に限定されないが、体内で細胞に感染し、ヘマグルチニン結合ペプチドを発現し、分泌できるようにするのが好ましい。また、細胞を移植する場合も、ヘマグルチニン結合ペプチドを発現し、分泌できるようにベクターが構築されているのが好ましい。発現したペプチドを分泌させるためには、例えば、ヘマグルチニン結合ペプチドのＮ端側にシグナルペプチドが融合した融合ペプチドを発現させるようにベクターを構築すればよいが、分泌させるための方法は必ずしもこれに限定されない。
【実施例１】
【００５８】
まず、西、佐谷らの報告（Nishi T., Saya H., et al., FEBS Lett, 399, 237-240 (1996)）で使用されたファージディスプレイシステムを用い、配列番号１〜１８の各アミノ酸配列を有するペプチドを外殻表面に提示する繊維状ファージｆｄを作製した。即ち、これらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（表１参照）を外殻タンパク質ｐIII遺伝子のＮ末端部分に相当する領域に遺伝子組み換えの手法を用いて挿入すると、この挿入ＤＮＡにコードされた１５残基のアミノ酸配列からなるペプチドをファージ外殻表面に発現するように、ファージＤＮＡを構築することができる。K91Kanの宿主菌を用い、常法により、これらの各ファージを増幅し、ファージ溶液を作製した。
【００５９】
次に、配列番号２〜１８の各アミノ酸配列を表面に提示するこれらのファージのヘマグルチニン（ＨＡ）に対する結合性をＥＬＩＳＡで調べた。なお、プレートに固定するヘマグルチニンとして、Ａ型のＨ１亜型であるA/PR/8/34(Ｈ１Ｎ１)のエーテル抽出物、及びＡ型のＨ３亜型であるA/武漢/359/95(Ｈ３Ｎ２)のエーテル抽出物を用いた。以下、具体的な手順を述べる。
【００６０】
まず、９６穴カルボプレート（SUMILON社製）に結合したカルボキシル基を活性化させるため、プレートの各ウエルに、ＥＤＣ（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide）およびＮ−ヒドロキシスクシイミドの等量混合液６０μlを添加して、１０分放置した。
【００６１】
次に、活性化プレートにヘマグルチニンを固定するため、各ウエルを５０ｍＭ ＴＢＳ緩衝液（pH7.6）で６回洗浄し、Ｈ１Ｎ１溶液（７０μl/ml）またはＨ３Ｎ２溶液（７０μl/ml）を１００μl 添加した。２時間放置した後、５０ｍＭ ＴＢＳ緩衝液（pH7.6）で６回洗浄し、１ｍＭエタノールアミン水溶液を１００μl添加した。１０分放置した後、再度５０ｍＭ ＴＢＳ緩衝液（pH7.6）で６回洗浄した。
【００６２】
ヘマグルチニンを固定したプレートに各ファージクローン溶液を５０μl（１ｘ１０１０pfu含有）添加し、室温で２時間放置した。各ウエルをＴＢＳＴ（TBS/5% Tween20）で５回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴで希釈した抗fdファージ抗体（シグマ社；１０００倍希釈で使用）を１００μl添加し、室温で１時間放置した。各ウエルをＴＢＳＴ（TBS/5% Tween20）で５回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴで希釈したＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（シグマ社；１０００倍希釈）を１００μl添加し、室温で１時間放置した。各ウエルをＴＢＳＴ（TBS/5% Tween20）で５回洗浄後、基質としてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液を１００μl添加し、１０〜１５分放置した。３ＮＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸収を測定し、結合活性とした。
【００６３】
なお、コントロールとして、上記記載の１次ファージディスプレイ・ライブラリー及び２次ファージディスプレイ・ライブラリー、及びＡ−１の結合活性と比較した。Ａ−１は、これまで同定されたヘマグルチニン結合ペプチド（特許文献１及び２参照）に比べ、同等の結合活性を有する。（一例として、図１に、同様にして測定したＨ３Ｇ−１の結合活性との比較を示す。）そこで、配列番号２〜１８のアミノ酸配列を有するペプチドの結合活性を、ここでは、Ａ−１のＨ１Ｎ１とＨ３Ｎ２各々に対する結合活性を１として全データを標準化し、グラフにした（図２）。この図２のグラフから、ｅ−４とｅ−７以外のペプチドは、両者のヘマグルチニンに対し、Ａ−１より強い結合活性を示すことがわかった。特にｓ−２はＡ−１に比べ約３倍もの強い結合活性を示した。なお、上記各ライブラリーは、Ａ−１の数分の一の活性しか示さなかった。
【００６４】
以上より、配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８を有するポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合ペプチドより、ヘマグルチニンに対し高い結合活性を有するペプチドであって、本発明の一つの目的である医薬組成物として有用であると考えられる。
【００６５】
なお、これらの配列は、共通配列（コンセンサス配列）として
ｘＲＬ（Ｓ／Ｐ）ｘｘＭＶ（Ｈ／Ｒ）ｘｘｘｘＱｘ
を有するので、この共通配列をもつペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合ペプチドより、ヘマグルチニンに対し高い結合活性を有すると考えられる。
【実施例２】
【００６６】
実施例１で行ったＥＬＩＳＡにおいて、特にヘマグルチニン（ＨＡ）に対する結合性の高かったｓ−２ およびｅ−１の配列を持つペプチドを化学合成し（東レ株式会社に依頼）、ペプチドだけの状態でＨＡ に対する結合性を評価した。本実施例で用いたペプチド及びそのアミノ酸配列を表２に示す。
【表２】
【００６７】
これらのHA 結合性ペプチドを用いて、以下のように、ＨＡ固定化膜に対する結合性を評価した。実施例１のプレートと同様にSensor Chip CM5 (Biacore, BR-1000-14) にＨ３Ｎ２を固定化し、これに対するペプチドの結合性を Biacore装置（Biacore社） によって評価を行った。具体的には、各ペプチドに対し、時間を追ってレゾナンスがどのように変化するかを、複数のペプチド濃度で測定した。
【００６８】
まず、ｓ−２ ペプチドに関し、各濃度における時間（ｘ軸）とレゾナンス（ｙ軸）との関係を図３Ａに示す。そして、同様の実験を各ＨＡ結合性ペプチドで行い、所定の時間における濃度（ｘ軸）に対するレゾナンス（ｙ軸）の変化を図３Ｂに示す。このように、いずれのＨＡ結合性ペプチドも、その濃度に依存してＨＡ への結合量が増えていくことがわかった。
【００６９】
次に、上記の結果から、所定のペプチド濃度における各ＨＡ結合性ペプチドの結合性を比較した。図４Ａに、各ＨＡ結合性ペプチドのペプチド濃度１００μＭにおける、レゾナンス（ｙ軸）の時間（ｘ軸）経過に対する変化を示す。また、図４Ｂに、ペプチド濃度２００μＭにおいて、Ａ−１ ペプチドの結合量を 1 としたときのＨＡ結合性ペプチドのレゾナンスの相対値を示す。このように、各ペプチドはｓ−２ > ｅ−１> Ａ−１> pVIII の強さの順で、ＨＡに結合することがわかった。この結合の強さの順序は、各ＨＡ結合性ペプチドを発現するファージで測定した結合性の順序とも対応している。
【００７０】
以上の結果より、ｅ−１、ｓ−２は Ａ−１よりそれぞれ １．２倍、２．１倍強く ＨＡに結合することが分かり、アミノ酸が置換されたことによって、ペプチドの機能が向上したことが示唆された。ＨＡに対する結合量が少ないために、解離定数 Kd を求めることはできないが、本実験で固体化したリガンド量から理論的最大結合量を求めると２２８ＲＵであるため、例えばｓ−２の２００μＭ のときの結合量がこれのちょうど半分程度であることから、これらのペプチドの解離定数は１０−３〜１０−４Ｍ程度だと考えられる。
【００７１】
ＧＭ３キャスト膜を用いてＧＭ３−ＨＡ間相互作用の阻害評価をＥＬＩＳＡを用いて評価したところ（永田和宏・半田宏、「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法‐BIACOREを中心に」 シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社、１９９８年）、ペプチドＡ−１ は、ｍＭオーダーでＧＭ３に対するヘマグルチニンの結合を阻害した（H3 に対するＡ−１のＩＣ５０＝１．９ｍＭ）。また、ＨＡと遊離のシアリルラクトースとの結合定数はｍＭオーダーであることがＮＭＲによる評価から報告されている（α(2,3)-sialyllactose Ｋ０＝３．２ｍＭ）。従って、本実施例の結果は、Inoue によって報告されたペプチドの阻害定数とほぼ一致し、また、本実施例の結果は、Ａ−１の阻害定数あるいはシアリルラクトースで得られている結合定数と同じオーダーもしくは一桁小さいことから、これらのＨＡ結合性ペプチドは、ＨＡのリガンドである糖鎖の優れたアナログとなり得ることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の実施例において、ＥＬＩＳＡを用いて、Ａ−１とＨ３Ｇ−１とのヘマグルチニンに対する結合活性を比較したグラフである。
【図２】本発明の実施例において、ＥＬＩＳＡを用いて、配列番号２〜１８のアミノ酸配列を有するペプチドのヘマグルチニンに対する結合活性を、Ａ−１の結合活性と比較したグラフである。
【図３】（Ａ）は、本発明の実施例において、ｓ−２ ペプチドに関し、各濃度における時間（ｘ軸）とレゾナンス（ｙ軸）との関係を示した図であり、（Ｂ）は、本発明の実施例において、各ＨＡ結合性ペプチドに関し、所定の時間における濃度（ｘ軸）に対するレゾナンス（ｙ軸）の変化を示した図である。
【図４】（Ａ）は、本発明の実施例において、各ＨＡ結合性ペプチドのペプチド濃度１００μＭにおける、レゾナンス（ｙ軸）の時間（ｘ軸）経過に対する変化を示した図であり、（Ｂ）は、本発明の実施例において、各ＨＡ結合性ペプチドのペプチド濃度２００μＭにおける、Ａ−１ ペプチドの結合量を 1 としたときのＨＡ結合性ペプチドのレゾナンスの相対値を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８のいずれかのアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合ペプチド。
【請求項２】
配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８において、１〜数アミノ酸残基の置換・欠失・付加を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合ペプチドに比べ、ヘマグルチニンＨ１またはＨ３の少なくとも一方に対し、より高い結合活性を有するヘマグルチニン結合ペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列
ｘＲＬ（Ｓ／Ｐ）ｘｘＭＶ（Ｈ／Ｒ）ｘｘｘｘＱｘ
を有し、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合ペプチドに比べ、ヘマグルチニンＨ１またはＨ３の少なくとも一方に対し、より高い結合活性を有するヘマグルチニン結合ペプチド。
【請求項４】
ヘマグルチニンＨ１及びＨ３の両方に結合することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチド。
【請求項５】
アルキル化または脂質化されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチド。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチドを有効成分として含有するインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項７】
ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方の感染を阻害する請求項６に記載のインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項８】
前記ポリペプチドがアルキル化または脂質化されていることを特徴とする請求項６に記載のインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチドを含有するリポソーム。
【請求項１０】
前記ヘマグルチニン結合ペプチドがヘマグルチニンＨ１及びＨ３の両方に結合することを特徴とする請求項９に記載のリポソーム。
【請求項１１】
前記ヘマグルチニン結合ペプチドがアルキル化または脂質化されていることを特徴とする請求項９に記載のリポソーム。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチドを有効成分として含有するインフルエンザ治療薬。
【請求項１３】
ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方に効果を有する請求項１２に記載のインフルエンザ治療薬。
【請求項１４】
前記ポリペプチドがアルキル化または脂質化されていることを特徴とする請求項１２に記載のインフルエンザ治療薬。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチドを有効成分として含有するインフルエンザ予防薬。
【請求項１６】
ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方に効果を有する請求項１５に記載のインフルエンザ予防薬。
【請求項１７】
前記ポリペプチドがアルキル化または脂質化されていることを特徴とする請求項１５に記載のインフルエンザ予防薬。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１８に記載のＤＮＡを有する発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の発現ベクターが導入され、請求項１または２に記載のヘマグルチニン結合ペプチドを分泌する細胞。
【請求項１】
配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８のいずれかのアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合ペプチド。
【請求項２】
配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８において、１〜数アミノ酸残基の置換・欠失・付加を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合ペプチドに比べ、ヘマグルチニンＨ１またはＨ３の少なくとも一方に対し、より高い結合活性を有するヘマグルチニン結合ペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列
ｘＲＬ（Ｓ／Ｐ）ｘｘＭＶ（Ｈ／Ｒ）ｘｘｘｘＱｘ
を有し、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合ペプチドに比べ、ヘマグルチニンＨ１またはＨ３の少なくとも一方に対し、より高い結合活性を有するヘマグルチニン結合ペプチド。
【請求項４】
ヘマグルチニンＨ１及びＨ３の両方に結合することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチド。
【請求項５】
アルキル化または脂質化されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチド。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチドを有効成分として含有するインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項７】
ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方の感染を阻害する請求項６に記載のインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項８】
前記ポリペプチドがアルキル化または脂質化されていることを特徴とする請求項６に記載のインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチドを含有するリポソーム。
【請求項１０】
前記ヘマグルチニン結合ペプチドがヘマグルチニンＨ１及びＨ３の両方に結合することを特徴とする請求項９に記載のリポソーム。
【請求項１１】
前記ヘマグルチニン結合ペプチドがアルキル化または脂質化されていることを特徴とする請求項９に記載のリポソーム。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチドを有効成分として含有するインフルエンザ治療薬。
【請求項１３】
ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方に効果を有する請求項１２に記載のインフルエンザ治療薬。
【請求項１４】
前記ポリペプチドがアルキル化または脂質化されていることを特徴とする請求項１２に記載のインフルエンザ治療薬。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチドを有効成分として含有するインフルエンザ予防薬。
【請求項１６】
ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方に効果を有する請求項１５に記載のインフルエンザ予防薬。
【請求項１７】
前記ポリペプチドがアルキル化または脂質化されていることを特徴とする請求項１５に記載のインフルエンザ予防薬。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１８に記載のＤＮＡを有する発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の発現ベクターが導入され、請求項１または２に記載のヘマグルチニン結合ペプチドを分泌する細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−１０１７０９（Ｐ２００６−１０１７０９Ａ）
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２８９０７４（Ｐ２００４−２８９０７４）
【出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（５０４３２２４７１）株式会社グライコメディクス (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（５０４３２２４７１）株式会社グライコメディクス (4)
【Ｆターム（参考）】
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