ヘモグロビン濃度測定装置
【課題】従来におけるヘモグロビン濃度を測定する方法は種々存在するが、光学的手法ではレンズや回折格子などの光学系部品による大型化、免疫学的手法では測定の煩雑さが問題であった。
【解決手段】本発明によれば、ヘモグロビン濃度を電気化学的手法である交流インピーダンス測定によって求めることができ、装置の小型化が可能である。さらに、同一検体を用いてヘモグロビン濃度を交流インピーダンス測定によって求め、糖化ヘモグロビン濃度を酵素電極法を用いた定電位測定による電流を求めることによって、世界的に糖尿病検査指標として用いているＨｂＡ１ｃを電気化学的に求めることができる。このように、レンズや回折格子を使用しないため装置の小型化が可能で免疫法のように測定の煩雑さも少なく、小型で安定した高精度なヘモグロビン濃度測定装置或いはＨｂＡ１ｃ測定装置を実現することができる。
【解決手段】本発明によれば、ヘモグロビン濃度を電気化学的手法である交流インピーダンス測定によって求めることができ、装置の小型化が可能である。さらに、同一検体を用いてヘモグロビン濃度を交流インピーダンス測定によって求め、糖化ヘモグロビン濃度を酵素電極法を用いた定電位測定による電流を求めることによって、世界的に糖尿病検査指標として用いているＨｂＡ１ｃを電気化学的に求めることができる。このように、レンズや回折格子を使用しないため装置の小型化が可能で免疫法のように測定の煩雑さも少なく、小型で安定した高精度なヘモグロビン濃度測定装置或いはＨｂＡ１ｃ測定装置を実現することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中のヘモグロビン濃度を電気化学的に測定するためのヘモグロビン濃度測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビンは、赤血球の中に９０％以上の割合で存在する鉄蛋白質でα２β２構造の４量体である。
４つのサブユニットは、1個のヘムを含み中心の鉄に酸素が可逆的に結合する。
このヘモグロビンは赤血球が肺から受け取った酸素と結合し、全身に運搬する役割を担っており、酸素運搬能は全血液中のヘモグロビン量で決定される。
そのため、血液中のヘモグロビン濃度を調べることは貧血などの病態を診断するために赤血球数や全血液量に対する赤血球の占める割合を表すヘマトクリット値、赤血球形態観察などの検査と合わせて現在も多く用いられている。
【０００３】
ヘモグロビン濃度の測定方法としては、検体としての血液を専用試薬に含まれるシアン化カリウムと反応させ、生成したシアンメトヘモグロビンを分光学的に測定するシアンメトヘモグロビン法がある。
このシアンメトヘモグロビンは、５４０ｎｍにピークを持つ分光特性をもっており、この波長での吸光度を求めてヘモグロビン濃度を算出するものである。
この他にも、アジドメトヘモグロビン法、ラウリルスルホン酸ナトリウム法などがあるが、国際標準として普及しているシアンメトヘモグロビン法が最も広く用いられている。
また、ヘモグロビン量が赤血球数に比例することを利用して自動血球計数器で測定する方法なども用いられている。
【０００４】
一方、血液を電気化学的な測定手法により解析し、血液及び血漿のインピーダンスからヘマトクリット値を求めるヘマトクリット測定装置が特許文献１に開示されている。
これは、赤血球が膜骨格蛋白質で裏打ちされた脂質二重膜に覆われており、これがコンデンサの性質を有すること、また血漿には周波数依存性がほとんどないことから両者の周波数特性を調べることによって血球量に比例した容量値が求められるという原理に基づいた測定方法である。
【０００５】
特許文献１中に、血漿のインピーダンスは、数ＫＨｚ〜２００ＭＨｚにわたりほぼ一定値を示し血漿成分のインピーダンスはこの周波数範囲で依存性をほとんど持たないとの記載がある。
これに対して、血液のインピーダンスは１００ＫＨｚ〜１０ＭＨｚの周波数範囲で大きく減少することが示されている。
【０００６】
次に上記以外の診断でヘモグロビン量を求める例について述べる。
前述した例は、貧血などの病態を診断することを目的としたヘモグロビン量或いはヘマトクリット値を単独で測定する場合である。
それに対して糖尿病の検査指標に血液中の総ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の割合を表すヘモグロビンエーワンシー（以下、ＨｂＡ１ｃと記述する）がある。
糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンのβ鎖末端のバリンのアミノ基にグルコースが非酵素的に結合したものである。
ＨｂＡ１ｃの値は、過去１ヶ月程度の血糖コントロール状況を把握するものとして有用であることが示されており、現在は一般的に糖尿病の診断に用いられている。
【０００７】
ＨｂＡ１ｃの測定は、抗凝固剤入り全血を用いて、溶血させるとともにヘモグロビンを変性安定化させる。
未変性のヘモグロビンは、酸素と結合した状態や未結合の状態になっており状態が不安定だったり検出の妨害となるためヘモグロビンを変性させることによって安定化させる。
次に変性した状態で総ヘモグロビン量を測定し、不安定型糖化ヘモグロビンを除去する。
その後、安定型糖化ヘモグロビン量を測定し、最終的に総ヘモグロビン量に対する安定型糖化ヘモグロビンの割合であるＨｂＡ１ｃを求める。
測定方法は、分光学的手法や免疫学的手法が用いられるが現在はラテックス凝集法と呼ばれる免疫学的手法が主流となっている。
【特許文献１】特開昭６３−１３３０６２号公報（３頁、第３図）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、ヘモグロビン量を測定する方法の多種性やその必要性が理解できるが、光学的手法ではレンズや回折格子などの光学系部品による大型化、免疫学的手法ではその煩雑さが問題となる。
また酵素電極法を用いて、糖化アミノ酸を検出する酸化酵素は発見されているが、酵素電極法を用いて総ヘモグロビン量を測定する方法がなく装置小型化の障壁になっている。
ヘマトクリット値もヘモグロビン量にほぼ比例した数値として表されることが知られているが、前述した特許文献１に開示されている方法は、あくまでヘマトクリット値を求める手法であり、正確な総ヘモグロビン量の定量はできない。
仮に、ヘマトクリット値から数値補正できたにしても測定周波数範囲が〜２００ＭＨｚと広いため装置としての小型化は困難である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明のヘモグロビン濃度測定装置は次のような構成を採用する。
【００１０】
血液中のヘモグロビン濃度を電気化学的に求めるヘモグロビン濃度測定装置であって、電極系と電極系に直流信号を印加する直流電位制御手段と直流信号に交流信号を重畳させる交流信号制御手段と、直流信号に重畳させる交流信号を入力信号として、逐次変化する電位と電流を測定し、インピーダンスを求める周波数応答解析手段と周波数応答解析手段で求めたインピーダンスからヘモグロビン濃度を算出するヘモグロビン濃度算出手段とを有する。
【００１１】
検体となる血液中のヘモグロビンは、血液を溶血および変性させ、メトヘモグロビン化することが好ましい。
【００１２】
交流信号制御手段は、直流信号に対して交流信号が振幅し重畳することが好ましい。
【００１３】
周波数応答解析手段は、直流信号に重畳して連続的に変化する周波数ごとの交流信号を入力信号として得られる電位と電流を求め、各周波数ごとのインピーダンスを求めることが好ましい。
ヘモグロビン濃度を測定し、ヘモグロビン濃度を測定した同一血液から得られた溶血および変性後の糖化ヘモグロビンとフルクトシルアミンオキシダーゼとを反応させ、定電位測定から得られる電流から糖化ヘモグロビン濃度を求め、ヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビン濃度とからヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の割合を求めることが好ましい。
溶血および変性後の糖化ヘモグロビンとフルクトシルアミンオキシダーゼとを反応させ
る前に、溶血および変性させた血液をプロテアーゼと反応させることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のヘモグロビン濃度測定装置は、電極系と電極系に直流信号を印加する直流電位制御手段と直流信号に交流信号を重畳させる交流信号制御手段と、直流信号に重畳させる交流信号を入力信号として、逐次変化する電位と電流を測定し、インピーダンスを求める周波数応答解析手段と周波数応答解析手段で求めたインピーダンスからヘモグロビン濃度を算出するヘモグロビン濃度算出手段とを有する。
本発明の構成によれば、ヘモグロビン濃度を電気化学的に求めることができ、従来の分光学的手法で用いられてきた光学部品を必要としないため分析器の小型化が図れる。
さらに、ヘモグロビン濃度を電気化学的に求めることができるので、酵素電極法を利用してヘモグロビン濃度を求め、糖化ヘモグロビン濃度も同時に測定することによって、電気化学的手法を用いて糖尿病検査指標であり、ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の割合であるＨｂＡ１ｃを求めることができるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、図面を用いて本発明の実施形態におけるヘモグロビン濃度測定装置の構成について説明する。
図１は、本発明のヘモグロビン濃度測定装置の構成を示した概略図である。
１は電極系、２は直流電位制御手段、３は交流信号制御手段、４は周波数応答解析手段、５はヘモグロビン濃度算出手段、６は表示手段である。
電極系１は、作用極１０、対極１１、参照極１２から構成されている３電極式の電気化学センサである。
【００１６】
電極系１を構成する各電極は、例えばポリエチレンテレフタレート（Ｐｏｌｙ Ｅｔｈｙ−ｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔａｌａｔｅ：ＰＥＴ 以下、ＰＥＴと記述する）にスクリーン印刷技術によって印刷された導電性インクで形成されている。
ここでは、作用極１０はカーボン微粒子とバインダと溶剤とからなるカーボンペーストを主原料とする導電性インクで印刷され、印刷後、約１２０℃で３０分程度の加熱工程を経て溶剤を揮発させ形成した電極であり、対極１１と参照極１２は銀と塩化銀が任意割合で混合された微粒子とバインダと溶剤とからなる銀／塩化銀ペーストを主原料とする導電性インクで印刷され、印刷後は、カーボンインクと同様に加熱工程を経て溶剤を揮発させ形成した電極である。
【００１７】
この電極系１を構成する参照極１２を基準電位として、作用極１０での電極反応の結果生じる電流を対極１１で計測する。
【００１８】
次に電気化学における交流インピーダンス測定方法について説明する。
電気化学における交流インピーダンス測定は、通常行われる直流電位信号に微小な正弦波交流信号を重畳した電位を対象電極に印加して、印加した電位と得られた電流応答の交流成分からインピーダンスと位相差を求めて電極反応を解析する手法である。
一般的に電気回路解析において伝達関数を求める場合、入力に微小信号を与えることで線形解析を行うことができる。
電極反応においては、本質的に電位と電流の関係は非線形であるが、この場合も直流電位に微小交流信号を重畳させることで本来の電極反応に影響を与えることなく線形解析が可能で、詳細な電極反応を解析することができる。
現在では、交流インピーダンス測定方法を用いて、二次電池や燃料電池の電極反応や腐蝕についての解析が行われている。
【００１９】
図２は、交流インピーダンス測定を行うための装置構成を示したものである。
図２に示す内容は、図１に示した直流電位制御手段２、交流信号制御手段３、周波数応答解析手段４を具体的に示したものである。
電極系１及びその構成は、図１と同一符号を示しているので省略する。
７はポテンショスタット、８は周波数応答解析器、９はコンピュータである。
図１の直流電位制御手段２がポテンショスタット７に対応し、図１の交流信号制御手段３と周波数応答解析手段４が周波数応答解析器８に対応する。
上記機器は、コンピュータ９によって制御することができる。
周波数応答解析器８は、水晶発振器を基準信号とする正弦波発振回路を備え、自動的に周波数を挿引し入力信号と得られた電位信号と電流信号の大きさからインピーダンスと位相を計算する。
図２のように電極系１における電位と電流がポテンショスタット７で制御され、ポテンショスタット７が周波数応答解析器８に接続されている。
周波数応答解析器８は、水晶発振器を基準信号とする正弦波発振回路を備え、その信号はポテンショスタット７に出力され、自動的に周波数を挿引し入力信号と得られた電位信号と電流信号の正弦波応答から各周波数におけるインピーダンスと位相を計算する。
ここでは、コンピュータ９により周波数応答解析器８とポテンショスタット７を制御することができる。
今回用いた周波数応答解析器の周波数測定範囲は、１０ｍＨｚ〜２０ＫＨｚである。
【００２０】
測定は、例えば直流電位を中心にして交流振幅数十ｍＶを重畳した電位を参照極を基準にして作用極に印加し、設定周波数範囲の高周波側から低周波数側に１桁５点の対数挿引とする。積分回数は、高周波側で１０回、１０Ｈｚ以下の低周波側では１回とした。
使用した周波数応答解析器に内蔵される演算器は、デジタルフーリエ積分器を用いているが、Ｓ／Ｎ比をよくするために高周波領域では、積分回数を増加し低周波領域では積分回数を減少させ効率のよい測定を行い、測定系が不変性を満足するようにした。
【００２１】
入力信号と得られた信号から求めたインピーダンスは、その実数成分を横軸に、負の虚数成分を縦軸にプロットする複素インピーダンスプロットで表す。
この複素インピーダンスプロットは周波数情報がないため、横軸に周波数の対数、縦軸に合成インピーダンスと位相差をプロットするボードプロットも用いる。
比較的低周波の領域では、電位と電流との間には位相差がなくインピーダンスは近似的に抵抗成分のみとなり、複素インピーダンスプロットでは実数軸付近に描かれる。
周波数を高くしていくと、測定系の容量成分の影響が顕著になりインピーダンスは減少し、理想的にはあるインピーダンスを直径とする半円弧を描く。
最も単純な界面反応に基づくインピーダンスＺは、数１で表される。
【数１】
Ｒｓｏｌは溶液抵抗で高周波数側で実数軸と交差する点、Ｒｃｔは電荷移動抵抗で半円弧の直径、ｆは周波数、Ｃｄｌは電気二重層容量で半円弧の頂点の周波数から求めることができる。
【００２２】
電荷移動抵抗が小さいほど電極表面反応が起こりやすく、その時の複素インピーダンスプロットの円弧は小さくなる。
しかし、実際の測定系では円弧の歪みや完全な円弧を描かないなどの現象が起こる。
高周波側の歪みは、主に測定系の配線などに起因する浮遊インピーダンスの影響、低周波側の歪みは電極表面の任意物質の吸着の影響などを受けることが原因である。
解析はこれらのことも考慮して行う必要がある。
【００２３】
次に本発明の検出対象であるヘモグロビン濃度の基準値について述べる。
ヘモグロビン濃度は、血液単位容積あたりのヘモグロビン量として表し、一般男性が１３．８〜１７．５ｇ／ｄｌ、一般女性が１２．０〜１５．５ｇ／ｄｌが基準値とされている。
【００２４】
このようにして、予めヘモグロビン濃度と電気化学的に求めたインピーダンスとの関係から検量線を求めておけば、未知のヘモグロビン濃度を検量線から導き表示装置に表示させることができる。
【実施例１】
【００２５】
次に、本発明の実施例１について具体的に説明する。
まず検体とする血液は、シリンジにより採血した静脈血もしくはディスポージャブルの採血針を用いて指尖血を採血する。
シリンジによる採血は、健康診断などの生化学検査で一般的であり、ディスポージャブルの採血針は糖尿病患者向けの小型自己血糖測定器などで広く普及しているものである。
採血した血液は、抗凝固剤としてヘパリン入りの容器に移し軽く転倒混和する。
抗凝固剤は、ヘパリンの代わりにエチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｎｄ Ｉａ
ｍｉｎｅｔｅｔｒａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ＥＤＴＡ）を用いてもよい。
【００２６】
次に、実際の測定用検体を調整する。
通常、体内を流れる血液は赤血球内の還元酵素であるＭｅｔ−Ｈｂ ｒｅｄｕｃｔａｓｅＧ６ＰＤにより常に還元されており、健常人では９９％が酸化ヘモグロビンで二酸化炭素と結合したメトヘモグロビンは１％程度にすぎない。
しかし、採血後は時間とともに酸化ヘモグロビンは不安定となり、酸素が脱離したりメトヘモグロビン化したりその状態が変動する。
メトヘモグロビン化は、数２のように表される。
【数２】
そこで、すべてのヘモグロビンを安定化させるために溶血用試薬により溶血させ、さらにヘモグロビン構造を変性させる。
溶血変性用試薬は、２０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液ｐＨ７．４に０．９％のテトラデシトリメチルアンモニウムブロマイド（ＴＴＡＢ）との混合液を用いた。
この場合の血液希釈率は１００倍とした。
溶血変性用試薬と血液を混合後、約５分程度静置状態で保持する。
これにより溶血及び変性は完了し、その後２〜８℃で保存する。この状態で２４時間は安定状態を保持することができる。
このように調整した測定用検体を用いた測定は、安定状態である時間内に行う。
【００２７】
使用する電気化学センサは、作用極１０と対極１１と参照極１２からなる３電極式のセンサを用いた。
各電極は、ポリエチレンテレフタレート（Ｐｏｌｙ Ｅｔｈｙ−ｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔａｌａｔｅ：ＰＥＴ 以下、ＰＥＴと記述する）にスクリーン印刷技術によって印刷された導電性インクで形成されている。
作用極１０はカーボン微粒子とバインダと溶剤とからなるカーボンペーストを主原料とする導電性インクで印刷され、印刷後、約１２０℃で３０分程度の加熱工程を経て溶剤を揮発させ形成した電極であり、対極１１と参照極１２は銀と塩化銀が任意割合で混合された微粒子とバインダと溶剤とからなる銀／塩化銀ペーストを主原料とする導電性インクで印刷され、印刷後は、カーボンインクと同様に加熱工程を経て溶剤を揮発させ形成した電極である。
測定は、参照極１２を基準電位として作用極１０での電極反応の結果生じる電流を対極１１で計測する。
【００２８】
各電極表面は界面活性剤として、予め０．１％のポリオキシエチレンソルビタンモノオ
レイト（以下、Ｔｗｅｅｎ８０と記述する）を塗布し、２５℃で３０分の送風乾燥を実施した。
この処理により、印刷直後は疎水的である電極表面を親水的に改質することができ、有効電極面積が増加し反応電流が増加する。
上記表面処理が完了した測定対象センサは、湿潤箱にセットして測定中は対象溶液が乾燥しないようにした。
【００２９】
前述した溶血変性用試薬と血液との混合水溶液２０μｌを作用極１０、対極１１及び参照極１２すべてを浸漬するように滴下する。
電極表面と混合水溶液との親和性を考慮し、滴下１分後に測定を開始する。
【００３０】
ヘモグロビン濃度は一般男性１３．８ｇ／ｄｌ〜１７．５ｇ／ｄｌ、一般女性１２．０ｇ／ｄｌ〜１５．５ｇ／ｄｌであることから、一般男性の基準値平均１５．６５ｇ／ｄｌを１とすると０．８８〜１．１２の範囲ということになる。
これから、今回測定に用いた対象水溶液濃度は、溶血変性用試薬と血液を１００倍希釈したものを１として０．６〜１．０の濃度になるようにリン酸緩衝液で希釈した溶液を用意した。
【００３１】
測定は、直流電位＋２５ｍＶに交流振幅±２０ｍＶを重畳させ印加し、周波数２０ＫＨｚ〜１０ｍＨｚまで一桁５点の対数挿引で行った。
積分回数は、１０Ｈｚよりも高周波では１０回、１０Ｈｚ以下では１回とした。
この条件で測定時間は、１０分程度で終了する。
【００３２】
図３は、測定で得られた水溶液の合成インピーダンスを横軸に実数成分ＲｅＺ、縦軸に虚数成分ＩｍＺをプロットした複素インピーダンスプロットを示したものである。
この図３は、一般的にナイキスト線図と呼ばれるものである。
図３中の各々の曲線は、溶血変性用試薬と血液を１００倍希釈したものを１とした場合にさらにリン酸緩衝液で希釈した正規化ヘモグロビン濃度を示しており、曲線６１は濃度０．６、曲線６２は０．７、曲線６３は０．８、曲線６４は０．９、曲線６５は１を表す。
【００３３】
図４は、横軸に周波数を対数で表し、縦軸に合成インピーダンスと入力信号と出力信号との位相差をプロットしたものでボード線図と呼ばれるものである。
図４中の各々の曲線は、溶血変性用試薬と血液を１００倍希釈したものを１とした場合にさらにリン酸緩衝液で希釈した正規化ヘモグロビン濃度について測定した合成インピーダンスと位相を示しており、曲線７１は濃度０．６、曲線７２は０．８、曲線７３は１の合成インピーダンスを示し、曲線８１は濃度０．６、曲線８２は０．８、曲線８３は１の
位相差を表す。
ナイキスト線図に対して、周波数情報が得られるので両方のプロットから考察するのが一般的である。
【００３４】
図３及び図４から、高周波側ではヘモグロビン濃度に対する依存性は認められないが、低周波側での合成インピーダンス変化がヘモグロビン濃度に対して依存していることが判る。
図５は、周波数０．１Ｈｚの時の合成インピーダンスを正規化ヘモグロビン濃度に対してプロットした図である。
さらに図６は、非線形性を示すリアクタンス成分（虚数成分）のみに着目し、横軸に正規化ヘモグロビン濃度、縦軸にリアクタンス成分として周波数１００ｍＨｚにおけるインピーダンスの虚数成分をプロットした図である。
【００３５】
一般に高周波側の曲線の歪みは測定系の浮遊インピーダンス成分の影響、低周波側の歪みは電極表面への物質吸着であると言われている。
本測定結果の低周波側の曲線の歪みは、非線形性を示す電極反応が電荷移動抵抗の違いとして現れていると考えられ、ヘモグロビン濃度が高いほど電極表面でのヘモグロビンに起因するタンパク質の吸着があるものと考えられる。
血液を溶血変性試薬と混合することによって、数式２のようにＦｅ２価からＦｅ３価のメトヘモグロビン化して安定し、さらに４つのユニットをもつヘモグロビンの構造が完全に崩れ独立もしくは変性によって交流信号に応答しやすくなっているものと考えられる。
設定した直流電位に対して、交流振幅を負側にのみに振幅させると、ヘモグロビンの濃度依存性は認められないことから、電極表面への吸着と脱離を検出するものと言える。
【００３６】
図７は、横軸に正規化ヘモグロビン濃度、縦軸に電極反応時の電荷移動抵抗が各濃度で一定になるときの周波数をプロットしたものである。
図７中の曲線９１が合成インピーダンス１００Ω、曲線９２が２００Ωを示している。このように種々の情報がヘモグロビン濃度と相関があることが判る。
電荷移動過程における電流応答は本来非線形を示す。そのため、入力振幅を意図的に歪ませるために±１００ｍＶの振幅を与えると、その出力はより高調波成分が顕著になり、ヘモグロビン濃度に対する依存性が明確になった。
【実施例２】
【００３７】
このようにヘモグロビン濃度が電気化学的に測定できると、代表的な糖尿病検査指標であり、ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の割合であるＨｂＡ１ｃを電気化学的手法によって測定することができる。
次にＨｂＡ１ｃの測定方法について説明する。
ＨｂＡ１ｃは、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端アミノ酸のバリンのアミノ基にグルコースのアルデヒド基がシッフ塩基を形成して結合し、その後アマドリ転移を受けてケトアミンとなった糖化タンパクである。
この糖化タンパクは、過去１〜２ヶ月の平均血糖を反映することから糖尿病患者の血糖コントロール指標として現在多くの臨床現場で利用されている。
一般的な測定は、高速液体クロマトグラフ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）法、ラテックス凝集法や免疫阻害比濁法などの免疫法が利用されている。
しかし、ＨＰＬＣ法は自動分析機用であり、免疫法では光学的手法により検出するため装置が大型化しやすい。
【００３８】
一方、糖化ヘモグロビンを直接検出する酵素は現存していない。
しかし、分子量の大きいヘモグロビンをプロテアーゼで分解し、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端
アミノ酸のバリンのアミノ基に結合して糖化されたタンパクに反応する酵素はフルクトシルアミンオキシダーゼとして現存する。
【００３９】
そこで、ヘモグロビン濃度を測定する電極系と糖化ヘモグロビン濃度を測定する電極系を分割して各々を別個に測定した後に、ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の割合を計算すればすべてを電気化学的手法によってＨｂＡ１ｃを検出することができる。
具体的には、ヘモグロビン濃度を交流インピーダンス測定によって予め求めておいたヘモグロビン濃度と合成インピーダンスもしくはリアクタンス成分による検量線から測定し、
糖化ヘモグロビン濃度を酵素電極を用いた定電位測定によって求める。
【００４０】
図８は、電気化学的手法によってＨｂＡ１ｃを求めるための概略図を示したものである。
１６は血液前処理手段、１７はタンパク質分解手段、１は電極系、１０は作用極、１１は対極、１２は参照極、２は直流電位制御手段、３は交流信号制御手段、４は周波数応答解析手段、５はヘモグロビン濃度算出手段である。
さらに１８は第２の電極系、１３は第２の作用極、１４は第２の対極、１５は第２の参照極、１９は電流測定手段、２０は糖化ヘモグロビン濃度算出手段、２１はＨｂＡ１ｃ算出手段、６は表示手段である。
電極系１及び第２の電極系２の表面は、予め界面活性剤である０．１％のｔｗｅｅｎ８０を塗布して２５℃で３０分乾燥した。
【００４１】
実施例１と同様に、静脈血或いは指尖全血を一定量採血して抗凝固剤入りの容器で軽く転倒混和する。
ここで、すべてのヘモグロビンを安定化させるために溶血用試薬により溶血させ、さらにヘモグロビン構造を変性させる。
溶血変性用試薬は、２０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液ｐＨ７．４に０．９％のテトラデシトリメチルアンモニウムブロマイド（ＴＴＡＢ）との混合液を用いた。
この場合の血液希釈率は１００倍とした。
溶血変性用試薬と血液を混合後、約５分程度静置状態で保持することで、溶血及び変性は完了する。
【００４２】
まず、図８の上段に示したヘモグロビン濃度の測定について述べる。
前述した溶血変性用試薬と血液との混合水溶液２０μｌを作用極１０、対極１１及び参照極１２すべてが浸漬するように滴下する。
電極表面と混合水溶液との親和性を考慮し、滴下１分後に測定を開始する。
【００４３】
測定は、直流電位＋２５ｍＶに振幅±１００ｍＶを重畳させ印加し、周波数２０ＫＨｚ〜１０ｍＨｚまで一桁５点の対数挿引で行った。
積分回数は、１０Ｈｚよりも高周波では１０回、１０Ｈｚ以下では１回とした。
この条件で測定時間は、１０分程度で終了する。
【００４４】
ヘモグロビン濃度に対して、低周波側の合成インピーダンス例えば、測定周波数０．１Ｈｚの時の合成インピーダンスを求める。
或いは、ヘモグロビン濃度に対するリアクタンス成分を求める。
または、ヘモグロビン濃度に対する電極反応時の電荷移動抵抗が各濃度で一定になるときの周波数を求める。
例えば、合成インピーダンス１００Ω、或いは２００Ωになる時の測定周波数を求めるなど、ヘモグロビン濃度と相関のある測定値から求めた検量線に従って未知のヘモグロビ
ン濃度を求める。
【００４５】
次に図８の下段に示した糖化ヘモグロビン濃度の測定について述べる。
前述した血液前処理手段１６で調整した溶血変性用試薬と血液との混合水溶液をタンパク質分解手段１７でヘモグロビンをプロテアーゼによる多段分解を利用してアミノ酸に分解する。
ここでは、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−ｔｙｐｅ８を５０Ｕ／μｌ用いて３７℃で１５分間静置処理した。
この処理によって、糖化アミノ酸の酸化酵素であるフルクトシルアミンオキジダーゼ（以後、ＦＡＯＤと記述する）ＦＡＯＤ反応基質が生成される。
【００４６】
第２の電極系１８は糖化アミノ酸の酸化酵素であるＦＡＯＤとメディエータであるメトキシＰＭＳ（以後、ｍＰＭＳと記述する）を水溶性高分子に混合し塗布２５℃で乾燥した。
水溶性高分子は、カルボキシメチルセルロース（以後、ＣＭＣと記述する）とし、純水希釈した１％濃度のものを用いた。
ＦＡＯＤは１Ｕ／ｍｌ、ｍＰＭＳは２ｍＭになるように調整した。
さらに、ＦＡＯＤの安定化剤としてトレハロース５ｍＭを添加した。
これによって、第２の電極系の各電極表面は酵素とメディエータが包含されたＣＭＣで被覆された状態になっており、これが酵素電極となる。
【００４７】
酵素とメディエータが包含されたＣＭＣ溶液は、３μｌを第２の電極系２に滴下して、２５℃で３０分乾燥させる。
ＣＭＣが湿度の影響を受けないように、乾燥後は窒素封入で保管する。
【００４８】
プロテアーゼ処理によって生成されたＦＡＯＤ反応基質を含む水溶液を第２の電極系のすべての電極が浸漬するように２０μｌを滴下する。
滴下３分後に、第２の参照極に対して第２の作用極が＋２５ｍＶになるように電位を印加し測定１００秒後の電流値を電流測定手段１９によって求める。
印加電位＋２５ｍＶは、ｍＰＭＳの酸化電位に基づいて決定した値である。
糖化ヘモグロビン算出手段２０では予めＦＡＯＤ反応基質の濃度に対する反応電流値から検量線を求めておき、未知の濃度の糖化ヘモグロビン濃度を求めることができる。
【００４９】
ヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビン濃度が求まれば、ＨｂＡ１ｃは、ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の割合であるので計算によって％で求めることができる。
ＨｂＡ１ｃの基準値は、４．３％〜５．８％で、６．５％以上だと糖尿病と判定される。
このように、同じ検体を用いてヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビン濃度を電気化学的に測定することができ光学系を使用しない小型な装置も実現できる。
【００５０】
さらに本実施例では、ＰＥＴ材にスクリーン印刷で作製したセンサにおいて、作用極にカーボンペースト、対極と参照極に銀と塩化銀が任意割合で混合されたペーストを用いた例を説明したが、センサの電極に用いる材料が変わっても本発明が有効であることは言うまでもない。
血液前処理方法は、今回の方法に限定するものではなく、ヘモグロビンが経時的に変化がなく安定した状態にあればよい。
また、酵素と電子受容体の種類を変えた場合においても本発明が有効であることは明白である。
【００５１】
従来におけるヘモグロビン量を測定する方法は種々存在するが、光学的手法ではレンズや回折格子などの光学系部品による大型化、免疫学的手法では測定の煩雑さが問題であった。また酵素電極法を用いて、糖化アミノ酸を検出する酸化酵素は発見されているが、酵素電極法を用いてヘモグロビン濃度を測定する方法がなく糖尿病検査指標であるＨｂＡ１ｃの測定ができず、また装置小型化の障壁になっていた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によれば、ヘモグロビン濃度を電気化学的手法である交流インピーダンス測定によって求めることができ、装置の小型化が可能である。
さらに、同一検体を用いて、ヘモグロビン濃度を交流インピーダンス測定によって求め、糖化ヘモグロビン濃度を酵素電極法を用いた定電位測定による電流を求めることによって、世界的に糖尿病検査指標として用いているＨｂＡ１ｃを電気化学的に求めることができる。
レンズや回折格子を使用しないため装置の小型化が可能で免疫法のように測定の煩雑さも少なく、小型で安定した高精度なヘモグロビン濃度測定装置を実現することができ、本発明を用いることの効果は非常に高い。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明のヘモグロビン濃度測定装置を示す概略図である。
【図２】本発明のヘモグロビン濃度測定装置における周波数応答解析を示す図である。
【図３】本発明のヘモグロビン濃度測定装置における測定結果を示す図である。
【図４】本発明のヘモグロビン濃度測定装置における測定結果を示す図である。
【図５】本発明のヘモグロビン濃度測定装置における測定結果を示す図である。
【図６】本発明のヘモグロビン濃度測定装置における測定結果を示す図である。
【図７】本発明のヘモグロビン濃度測定装置における測定結果を示す図である。
【図８】本発明の実施例２を示す概略図である。
【符号の説明】
【００５４】
１ 電極系
２ 直流電位制御手段
３ 交流信号制御手段
４ 周波数応答解析手段
１０ 作用極
１１ 対極
１２ 参照極
１３ 第２の作用極
１４ 第２の対極
１５ 第２の参照極
１６ 血液前処理手段
１７ タンパク質分解手段
１８ 第２の電極系
１９ 電流測定手段
２０ 糖化ヘモグロビン算出手段
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中のヘモグロビン濃度を電気化学的に測定するためのヘモグロビン濃度測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビンは、赤血球の中に９０％以上の割合で存在する鉄蛋白質でα２β２構造の４量体である。
４つのサブユニットは、1個のヘムを含み中心の鉄に酸素が可逆的に結合する。
このヘモグロビンは赤血球が肺から受け取った酸素と結合し、全身に運搬する役割を担っており、酸素運搬能は全血液中のヘモグロビン量で決定される。
そのため、血液中のヘモグロビン濃度を調べることは貧血などの病態を診断するために赤血球数や全血液量に対する赤血球の占める割合を表すヘマトクリット値、赤血球形態観察などの検査と合わせて現在も多く用いられている。
【０００３】
ヘモグロビン濃度の測定方法としては、検体としての血液を専用試薬に含まれるシアン化カリウムと反応させ、生成したシアンメトヘモグロビンを分光学的に測定するシアンメトヘモグロビン法がある。
このシアンメトヘモグロビンは、５４０ｎｍにピークを持つ分光特性をもっており、この波長での吸光度を求めてヘモグロビン濃度を算出するものである。
この他にも、アジドメトヘモグロビン法、ラウリルスルホン酸ナトリウム法などがあるが、国際標準として普及しているシアンメトヘモグロビン法が最も広く用いられている。
また、ヘモグロビン量が赤血球数に比例することを利用して自動血球計数器で測定する方法なども用いられている。
【０００４】
一方、血液を電気化学的な測定手法により解析し、血液及び血漿のインピーダンスからヘマトクリット値を求めるヘマトクリット測定装置が特許文献１に開示されている。
これは、赤血球が膜骨格蛋白質で裏打ちされた脂質二重膜に覆われており、これがコンデンサの性質を有すること、また血漿には周波数依存性がほとんどないことから両者の周波数特性を調べることによって血球量に比例した容量値が求められるという原理に基づいた測定方法である。
【０００５】
特許文献１中に、血漿のインピーダンスは、数ＫＨｚ〜２００ＭＨｚにわたりほぼ一定値を示し血漿成分のインピーダンスはこの周波数範囲で依存性をほとんど持たないとの記載がある。
これに対して、血液のインピーダンスは１００ＫＨｚ〜１０ＭＨｚの周波数範囲で大きく減少することが示されている。
【０００６】
次に上記以外の診断でヘモグロビン量を求める例について述べる。
前述した例は、貧血などの病態を診断することを目的としたヘモグロビン量或いはヘマトクリット値を単独で測定する場合である。
それに対して糖尿病の検査指標に血液中の総ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の割合を表すヘモグロビンエーワンシー（以下、ＨｂＡ１ｃと記述する）がある。
糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンのβ鎖末端のバリンのアミノ基にグルコースが非酵素的に結合したものである。
ＨｂＡ１ｃの値は、過去１ヶ月程度の血糖コントロール状況を把握するものとして有用であることが示されており、現在は一般的に糖尿病の診断に用いられている。
【０００７】
ＨｂＡ１ｃの測定は、抗凝固剤入り全血を用いて、溶血させるとともにヘモグロビンを変性安定化させる。
未変性のヘモグロビンは、酸素と結合した状態や未結合の状態になっており状態が不安定だったり検出の妨害となるためヘモグロビンを変性させることによって安定化させる。
次に変性した状態で総ヘモグロビン量を測定し、不安定型糖化ヘモグロビンを除去する。
その後、安定型糖化ヘモグロビン量を測定し、最終的に総ヘモグロビン量に対する安定型糖化ヘモグロビンの割合であるＨｂＡ１ｃを求める。
測定方法は、分光学的手法や免疫学的手法が用いられるが現在はラテックス凝集法と呼ばれる免疫学的手法が主流となっている。
【特許文献１】特開昭６３−１３３０６２号公報（３頁、第３図）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、ヘモグロビン量を測定する方法の多種性やその必要性が理解できるが、光学的手法ではレンズや回折格子などの光学系部品による大型化、免疫学的手法ではその煩雑さが問題となる。
また酵素電極法を用いて、糖化アミノ酸を検出する酸化酵素は発見されているが、酵素電極法を用いて総ヘモグロビン量を測定する方法がなく装置小型化の障壁になっている。
ヘマトクリット値もヘモグロビン量にほぼ比例した数値として表されることが知られているが、前述した特許文献１に開示されている方法は、あくまでヘマトクリット値を求める手法であり、正確な総ヘモグロビン量の定量はできない。
仮に、ヘマトクリット値から数値補正できたにしても測定周波数範囲が〜２００ＭＨｚと広いため装置としての小型化は困難である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明のヘモグロビン濃度測定装置は次のような構成を採用する。
【００１０】
血液中のヘモグロビン濃度を電気化学的に求めるヘモグロビン濃度測定装置であって、電極系と電極系に直流信号を印加する直流電位制御手段と直流信号に交流信号を重畳させる交流信号制御手段と、直流信号に重畳させる交流信号を入力信号として、逐次変化する電位と電流を測定し、インピーダンスを求める周波数応答解析手段と周波数応答解析手段で求めたインピーダンスからヘモグロビン濃度を算出するヘモグロビン濃度算出手段とを有する。
【００１１】
検体となる血液中のヘモグロビンは、血液を溶血および変性させ、メトヘモグロビン化することが好ましい。
【００１２】
交流信号制御手段は、直流信号に対して交流信号が振幅し重畳することが好ましい。
【００１３】
周波数応答解析手段は、直流信号に重畳して連続的に変化する周波数ごとの交流信号を入力信号として得られる電位と電流を求め、各周波数ごとのインピーダンスを求めることが好ましい。
ヘモグロビン濃度を測定し、ヘモグロビン濃度を測定した同一血液から得られた溶血および変性後の糖化ヘモグロビンとフルクトシルアミンオキシダーゼとを反応させ、定電位測定から得られる電流から糖化ヘモグロビン濃度を求め、ヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビン濃度とからヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の割合を求めることが好ましい。
溶血および変性後の糖化ヘモグロビンとフルクトシルアミンオキシダーゼとを反応させ
る前に、溶血および変性させた血液をプロテアーゼと反応させることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のヘモグロビン濃度測定装置は、電極系と電極系に直流信号を印加する直流電位制御手段と直流信号に交流信号を重畳させる交流信号制御手段と、直流信号に重畳させる交流信号を入力信号として、逐次変化する電位と電流を測定し、インピーダンスを求める周波数応答解析手段と周波数応答解析手段で求めたインピーダンスからヘモグロビン濃度を算出するヘモグロビン濃度算出手段とを有する。
本発明の構成によれば、ヘモグロビン濃度を電気化学的に求めることができ、従来の分光学的手法で用いられてきた光学部品を必要としないため分析器の小型化が図れる。
さらに、ヘモグロビン濃度を電気化学的に求めることができるので、酵素電極法を利用してヘモグロビン濃度を求め、糖化ヘモグロビン濃度も同時に測定することによって、電気化学的手法を用いて糖尿病検査指標であり、ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の割合であるＨｂＡ１ｃを求めることができるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、図面を用いて本発明の実施形態におけるヘモグロビン濃度測定装置の構成について説明する。
図１は、本発明のヘモグロビン濃度測定装置の構成を示した概略図である。
１は電極系、２は直流電位制御手段、３は交流信号制御手段、４は周波数応答解析手段、５はヘモグロビン濃度算出手段、６は表示手段である。
電極系１は、作用極１０、対極１１、参照極１２から構成されている３電極式の電気化学センサである。
【００１６】
電極系１を構成する各電極は、例えばポリエチレンテレフタレート（Ｐｏｌｙ Ｅｔｈｙ−ｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔａｌａｔｅ：ＰＥＴ 以下、ＰＥＴと記述する）にスクリーン印刷技術によって印刷された導電性インクで形成されている。
ここでは、作用極１０はカーボン微粒子とバインダと溶剤とからなるカーボンペーストを主原料とする導電性インクで印刷され、印刷後、約１２０℃で３０分程度の加熱工程を経て溶剤を揮発させ形成した電極であり、対極１１と参照極１２は銀と塩化銀が任意割合で混合された微粒子とバインダと溶剤とからなる銀／塩化銀ペーストを主原料とする導電性インクで印刷され、印刷後は、カーボンインクと同様に加熱工程を経て溶剤を揮発させ形成した電極である。
【００１７】
この電極系１を構成する参照極１２を基準電位として、作用極１０での電極反応の結果生じる電流を対極１１で計測する。
【００１８】
次に電気化学における交流インピーダンス測定方法について説明する。
電気化学における交流インピーダンス測定は、通常行われる直流電位信号に微小な正弦波交流信号を重畳した電位を対象電極に印加して、印加した電位と得られた電流応答の交流成分からインピーダンスと位相差を求めて電極反応を解析する手法である。
一般的に電気回路解析において伝達関数を求める場合、入力に微小信号を与えることで線形解析を行うことができる。
電極反応においては、本質的に電位と電流の関係は非線形であるが、この場合も直流電位に微小交流信号を重畳させることで本来の電極反応に影響を与えることなく線形解析が可能で、詳細な電極反応を解析することができる。
現在では、交流インピーダンス測定方法を用いて、二次電池や燃料電池の電極反応や腐蝕についての解析が行われている。
【００１９】
図２は、交流インピーダンス測定を行うための装置構成を示したものである。
図２に示す内容は、図１に示した直流電位制御手段２、交流信号制御手段３、周波数応答解析手段４を具体的に示したものである。
電極系１及びその構成は、図１と同一符号を示しているので省略する。
７はポテンショスタット、８は周波数応答解析器、９はコンピュータである。
図１の直流電位制御手段２がポテンショスタット７に対応し、図１の交流信号制御手段３と周波数応答解析手段４が周波数応答解析器８に対応する。
上記機器は、コンピュータ９によって制御することができる。
周波数応答解析器８は、水晶発振器を基準信号とする正弦波発振回路を備え、自動的に周波数を挿引し入力信号と得られた電位信号と電流信号の大きさからインピーダンスと位相を計算する。
図２のように電極系１における電位と電流がポテンショスタット７で制御され、ポテンショスタット７が周波数応答解析器８に接続されている。
周波数応答解析器８は、水晶発振器を基準信号とする正弦波発振回路を備え、その信号はポテンショスタット７に出力され、自動的に周波数を挿引し入力信号と得られた電位信号と電流信号の正弦波応答から各周波数におけるインピーダンスと位相を計算する。
ここでは、コンピュータ９により周波数応答解析器８とポテンショスタット７を制御することができる。
今回用いた周波数応答解析器の周波数測定範囲は、１０ｍＨｚ〜２０ＫＨｚである。
【００２０】
測定は、例えば直流電位を中心にして交流振幅数十ｍＶを重畳した電位を参照極を基準にして作用極に印加し、設定周波数範囲の高周波側から低周波数側に１桁５点の対数挿引とする。積分回数は、高周波側で１０回、１０Ｈｚ以下の低周波側では１回とした。
使用した周波数応答解析器に内蔵される演算器は、デジタルフーリエ積分器を用いているが、Ｓ／Ｎ比をよくするために高周波領域では、積分回数を増加し低周波領域では積分回数を減少させ効率のよい測定を行い、測定系が不変性を満足するようにした。
【００２１】
入力信号と得られた信号から求めたインピーダンスは、その実数成分を横軸に、負の虚数成分を縦軸にプロットする複素インピーダンスプロットで表す。
この複素インピーダンスプロットは周波数情報がないため、横軸に周波数の対数、縦軸に合成インピーダンスと位相差をプロットするボードプロットも用いる。
比較的低周波の領域では、電位と電流との間には位相差がなくインピーダンスは近似的に抵抗成分のみとなり、複素インピーダンスプロットでは実数軸付近に描かれる。
周波数を高くしていくと、測定系の容量成分の影響が顕著になりインピーダンスは減少し、理想的にはあるインピーダンスを直径とする半円弧を描く。
最も単純な界面反応に基づくインピーダンスＺは、数１で表される。
【数１】
Ｒｓｏｌは溶液抵抗で高周波数側で実数軸と交差する点、Ｒｃｔは電荷移動抵抗で半円弧の直径、ｆは周波数、Ｃｄｌは電気二重層容量で半円弧の頂点の周波数から求めることができる。
【００２２】
電荷移動抵抗が小さいほど電極表面反応が起こりやすく、その時の複素インピーダンスプロットの円弧は小さくなる。
しかし、実際の測定系では円弧の歪みや完全な円弧を描かないなどの現象が起こる。
高周波側の歪みは、主に測定系の配線などに起因する浮遊インピーダンスの影響、低周波側の歪みは電極表面の任意物質の吸着の影響などを受けることが原因である。
解析はこれらのことも考慮して行う必要がある。
【００２３】
次に本発明の検出対象であるヘモグロビン濃度の基準値について述べる。
ヘモグロビン濃度は、血液単位容積あたりのヘモグロビン量として表し、一般男性が１３．８〜１７．５ｇ／ｄｌ、一般女性が１２．０〜１５．５ｇ／ｄｌが基準値とされている。
【００２４】
このようにして、予めヘモグロビン濃度と電気化学的に求めたインピーダンスとの関係から検量線を求めておけば、未知のヘモグロビン濃度を検量線から導き表示装置に表示させることができる。
【実施例１】
【００２５】
次に、本発明の実施例１について具体的に説明する。
まず検体とする血液は、シリンジにより採血した静脈血もしくはディスポージャブルの採血針を用いて指尖血を採血する。
シリンジによる採血は、健康診断などの生化学検査で一般的であり、ディスポージャブルの採血針は糖尿病患者向けの小型自己血糖測定器などで広く普及しているものである。
採血した血液は、抗凝固剤としてヘパリン入りの容器に移し軽く転倒混和する。
抗凝固剤は、ヘパリンの代わりにエチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｎｄ Ｉａ
ｍｉｎｅｔｅｔｒａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ＥＤＴＡ）を用いてもよい。
【００２６】
次に、実際の測定用検体を調整する。
通常、体内を流れる血液は赤血球内の還元酵素であるＭｅｔ−Ｈｂ ｒｅｄｕｃｔａｓｅＧ６ＰＤにより常に還元されており、健常人では９９％が酸化ヘモグロビンで二酸化炭素と結合したメトヘモグロビンは１％程度にすぎない。
しかし、採血後は時間とともに酸化ヘモグロビンは不安定となり、酸素が脱離したりメトヘモグロビン化したりその状態が変動する。
メトヘモグロビン化は、数２のように表される。
【数２】
そこで、すべてのヘモグロビンを安定化させるために溶血用試薬により溶血させ、さらにヘモグロビン構造を変性させる。
溶血変性用試薬は、２０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液ｐＨ７．４に０．９％のテトラデシトリメチルアンモニウムブロマイド（ＴＴＡＢ）との混合液を用いた。
この場合の血液希釈率は１００倍とした。
溶血変性用試薬と血液を混合後、約５分程度静置状態で保持する。
これにより溶血及び変性は完了し、その後２〜８℃で保存する。この状態で２４時間は安定状態を保持することができる。
このように調整した測定用検体を用いた測定は、安定状態である時間内に行う。
【００２７】
使用する電気化学センサは、作用極１０と対極１１と参照極１２からなる３電極式のセンサを用いた。
各電極は、ポリエチレンテレフタレート（Ｐｏｌｙ Ｅｔｈｙ−ｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔａｌａｔｅ：ＰＥＴ 以下、ＰＥＴと記述する）にスクリーン印刷技術によって印刷された導電性インクで形成されている。
作用極１０はカーボン微粒子とバインダと溶剤とからなるカーボンペーストを主原料とする導電性インクで印刷され、印刷後、約１２０℃で３０分程度の加熱工程を経て溶剤を揮発させ形成した電極であり、対極１１と参照極１２は銀と塩化銀が任意割合で混合された微粒子とバインダと溶剤とからなる銀／塩化銀ペーストを主原料とする導電性インクで印刷され、印刷後は、カーボンインクと同様に加熱工程を経て溶剤を揮発させ形成した電極である。
測定は、参照極１２を基準電位として作用極１０での電極反応の結果生じる電流を対極１１で計測する。
【００２８】
各電極表面は界面活性剤として、予め０．１％のポリオキシエチレンソルビタンモノオ
レイト（以下、Ｔｗｅｅｎ８０と記述する）を塗布し、２５℃で３０分の送風乾燥を実施した。
この処理により、印刷直後は疎水的である電極表面を親水的に改質することができ、有効電極面積が増加し反応電流が増加する。
上記表面処理が完了した測定対象センサは、湿潤箱にセットして測定中は対象溶液が乾燥しないようにした。
【００２９】
前述した溶血変性用試薬と血液との混合水溶液２０μｌを作用極１０、対極１１及び参照極１２すべてを浸漬するように滴下する。
電極表面と混合水溶液との親和性を考慮し、滴下１分後に測定を開始する。
【００３０】
ヘモグロビン濃度は一般男性１３．８ｇ／ｄｌ〜１７．５ｇ／ｄｌ、一般女性１２．０ｇ／ｄｌ〜１５．５ｇ／ｄｌであることから、一般男性の基準値平均１５．６５ｇ／ｄｌを１とすると０．８８〜１．１２の範囲ということになる。
これから、今回測定に用いた対象水溶液濃度は、溶血変性用試薬と血液を１００倍希釈したものを１として０．６〜１．０の濃度になるようにリン酸緩衝液で希釈した溶液を用意した。
【００３１】
測定は、直流電位＋２５ｍＶに交流振幅±２０ｍＶを重畳させ印加し、周波数２０ＫＨｚ〜１０ｍＨｚまで一桁５点の対数挿引で行った。
積分回数は、１０Ｈｚよりも高周波では１０回、１０Ｈｚ以下では１回とした。
この条件で測定時間は、１０分程度で終了する。
【００３２】
図３は、測定で得られた水溶液の合成インピーダンスを横軸に実数成分ＲｅＺ、縦軸に虚数成分ＩｍＺをプロットした複素インピーダンスプロットを示したものである。
この図３は、一般的にナイキスト線図と呼ばれるものである。
図３中の各々の曲線は、溶血変性用試薬と血液を１００倍希釈したものを１とした場合にさらにリン酸緩衝液で希釈した正規化ヘモグロビン濃度を示しており、曲線６１は濃度０．６、曲線６２は０．７、曲線６３は０．８、曲線６４は０．９、曲線６５は１を表す。
【００３３】
図４は、横軸に周波数を対数で表し、縦軸に合成インピーダンスと入力信号と出力信号との位相差をプロットしたものでボード線図と呼ばれるものである。
図４中の各々の曲線は、溶血変性用試薬と血液を１００倍希釈したものを１とした場合にさらにリン酸緩衝液で希釈した正規化ヘモグロビン濃度について測定した合成インピーダンスと位相を示しており、曲線７１は濃度０．６、曲線７２は０．８、曲線７３は１の合成インピーダンスを示し、曲線８１は濃度０．６、曲線８２は０．８、曲線８３は１の
位相差を表す。
ナイキスト線図に対して、周波数情報が得られるので両方のプロットから考察するのが一般的である。
【００３４】
図３及び図４から、高周波側ではヘモグロビン濃度に対する依存性は認められないが、低周波側での合成インピーダンス変化がヘモグロビン濃度に対して依存していることが判る。
図５は、周波数０．１Ｈｚの時の合成インピーダンスを正規化ヘモグロビン濃度に対してプロットした図である。
さらに図６は、非線形性を示すリアクタンス成分（虚数成分）のみに着目し、横軸に正規化ヘモグロビン濃度、縦軸にリアクタンス成分として周波数１００ｍＨｚにおけるインピーダンスの虚数成分をプロットした図である。
【００３５】
一般に高周波側の曲線の歪みは測定系の浮遊インピーダンス成分の影響、低周波側の歪みは電極表面への物質吸着であると言われている。
本測定結果の低周波側の曲線の歪みは、非線形性を示す電極反応が電荷移動抵抗の違いとして現れていると考えられ、ヘモグロビン濃度が高いほど電極表面でのヘモグロビンに起因するタンパク質の吸着があるものと考えられる。
血液を溶血変性試薬と混合することによって、数式２のようにＦｅ２価からＦｅ３価のメトヘモグロビン化して安定し、さらに４つのユニットをもつヘモグロビンの構造が完全に崩れ独立もしくは変性によって交流信号に応答しやすくなっているものと考えられる。
設定した直流電位に対して、交流振幅を負側にのみに振幅させると、ヘモグロビンの濃度依存性は認められないことから、電極表面への吸着と脱離を検出するものと言える。
【００３６】
図７は、横軸に正規化ヘモグロビン濃度、縦軸に電極反応時の電荷移動抵抗が各濃度で一定になるときの周波数をプロットしたものである。
図７中の曲線９１が合成インピーダンス１００Ω、曲線９２が２００Ωを示している。このように種々の情報がヘモグロビン濃度と相関があることが判る。
電荷移動過程における電流応答は本来非線形を示す。そのため、入力振幅を意図的に歪ませるために±１００ｍＶの振幅を与えると、その出力はより高調波成分が顕著になり、ヘモグロビン濃度に対する依存性が明確になった。
【実施例２】
【００３７】
このようにヘモグロビン濃度が電気化学的に測定できると、代表的な糖尿病検査指標であり、ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の割合であるＨｂＡ１ｃを電気化学的手法によって測定することができる。
次にＨｂＡ１ｃの測定方法について説明する。
ＨｂＡ１ｃは、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端アミノ酸のバリンのアミノ基にグルコースのアルデヒド基がシッフ塩基を形成して結合し、その後アマドリ転移を受けてケトアミンとなった糖化タンパクである。
この糖化タンパクは、過去１〜２ヶ月の平均血糖を反映することから糖尿病患者の血糖コントロール指標として現在多くの臨床現場で利用されている。
一般的な測定は、高速液体クロマトグラフ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）法、ラテックス凝集法や免疫阻害比濁法などの免疫法が利用されている。
しかし、ＨＰＬＣ法は自動分析機用であり、免疫法では光学的手法により検出するため装置が大型化しやすい。
【００３８】
一方、糖化ヘモグロビンを直接検出する酵素は現存していない。
しかし、分子量の大きいヘモグロビンをプロテアーゼで分解し、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端
アミノ酸のバリンのアミノ基に結合して糖化されたタンパクに反応する酵素はフルクトシルアミンオキシダーゼとして現存する。
【００３９】
そこで、ヘモグロビン濃度を測定する電極系と糖化ヘモグロビン濃度を測定する電極系を分割して各々を別個に測定した後に、ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の割合を計算すればすべてを電気化学的手法によってＨｂＡ１ｃを検出することができる。
具体的には、ヘモグロビン濃度を交流インピーダンス測定によって予め求めておいたヘモグロビン濃度と合成インピーダンスもしくはリアクタンス成分による検量線から測定し、
糖化ヘモグロビン濃度を酵素電極を用いた定電位測定によって求める。
【００４０】
図８は、電気化学的手法によってＨｂＡ１ｃを求めるための概略図を示したものである。
１６は血液前処理手段、１７はタンパク質分解手段、１は電極系、１０は作用極、１１は対極、１２は参照極、２は直流電位制御手段、３は交流信号制御手段、４は周波数応答解析手段、５はヘモグロビン濃度算出手段である。
さらに１８は第２の電極系、１３は第２の作用極、１４は第２の対極、１５は第２の参照極、１９は電流測定手段、２０は糖化ヘモグロビン濃度算出手段、２１はＨｂＡ１ｃ算出手段、６は表示手段である。
電極系１及び第２の電極系２の表面は、予め界面活性剤である０．１％のｔｗｅｅｎ８０を塗布して２５℃で３０分乾燥した。
【００４１】
実施例１と同様に、静脈血或いは指尖全血を一定量採血して抗凝固剤入りの容器で軽く転倒混和する。
ここで、すべてのヘモグロビンを安定化させるために溶血用試薬により溶血させ、さらにヘモグロビン構造を変性させる。
溶血変性用試薬は、２０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液ｐＨ７．４に０．９％のテトラデシトリメチルアンモニウムブロマイド（ＴＴＡＢ）との混合液を用いた。
この場合の血液希釈率は１００倍とした。
溶血変性用試薬と血液を混合後、約５分程度静置状態で保持することで、溶血及び変性は完了する。
【００４２】
まず、図８の上段に示したヘモグロビン濃度の測定について述べる。
前述した溶血変性用試薬と血液との混合水溶液２０μｌを作用極１０、対極１１及び参照極１２すべてが浸漬するように滴下する。
電極表面と混合水溶液との親和性を考慮し、滴下１分後に測定を開始する。
【００４３】
測定は、直流電位＋２５ｍＶに振幅±１００ｍＶを重畳させ印加し、周波数２０ＫＨｚ〜１０ｍＨｚまで一桁５点の対数挿引で行った。
積分回数は、１０Ｈｚよりも高周波では１０回、１０Ｈｚ以下では１回とした。
この条件で測定時間は、１０分程度で終了する。
【００４４】
ヘモグロビン濃度に対して、低周波側の合成インピーダンス例えば、測定周波数０．１Ｈｚの時の合成インピーダンスを求める。
或いは、ヘモグロビン濃度に対するリアクタンス成分を求める。
または、ヘモグロビン濃度に対する電極反応時の電荷移動抵抗が各濃度で一定になるときの周波数を求める。
例えば、合成インピーダンス１００Ω、或いは２００Ωになる時の測定周波数を求めるなど、ヘモグロビン濃度と相関のある測定値から求めた検量線に従って未知のヘモグロビ
ン濃度を求める。
【００４５】
次に図８の下段に示した糖化ヘモグロビン濃度の測定について述べる。
前述した血液前処理手段１６で調整した溶血変性用試薬と血液との混合水溶液をタンパク質分解手段１７でヘモグロビンをプロテアーゼによる多段分解を利用してアミノ酸に分解する。
ここでは、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−ｔｙｐｅ８を５０Ｕ／μｌ用いて３７℃で１５分間静置処理した。
この処理によって、糖化アミノ酸の酸化酵素であるフルクトシルアミンオキジダーゼ（以後、ＦＡＯＤと記述する）ＦＡＯＤ反応基質が生成される。
【００４６】
第２の電極系１８は糖化アミノ酸の酸化酵素であるＦＡＯＤとメディエータであるメトキシＰＭＳ（以後、ｍＰＭＳと記述する）を水溶性高分子に混合し塗布２５℃で乾燥した。
水溶性高分子は、カルボキシメチルセルロース（以後、ＣＭＣと記述する）とし、純水希釈した１％濃度のものを用いた。
ＦＡＯＤは１Ｕ／ｍｌ、ｍＰＭＳは２ｍＭになるように調整した。
さらに、ＦＡＯＤの安定化剤としてトレハロース５ｍＭを添加した。
これによって、第２の電極系の各電極表面は酵素とメディエータが包含されたＣＭＣで被覆された状態になっており、これが酵素電極となる。
【００４７】
酵素とメディエータが包含されたＣＭＣ溶液は、３μｌを第２の電極系２に滴下して、２５℃で３０分乾燥させる。
ＣＭＣが湿度の影響を受けないように、乾燥後は窒素封入で保管する。
【００４８】
プロテアーゼ処理によって生成されたＦＡＯＤ反応基質を含む水溶液を第２の電極系のすべての電極が浸漬するように２０μｌを滴下する。
滴下３分後に、第２の参照極に対して第２の作用極が＋２５ｍＶになるように電位を印加し測定１００秒後の電流値を電流測定手段１９によって求める。
印加電位＋２５ｍＶは、ｍＰＭＳの酸化電位に基づいて決定した値である。
糖化ヘモグロビン算出手段２０では予めＦＡＯＤ反応基質の濃度に対する反応電流値から検量線を求めておき、未知の濃度の糖化ヘモグロビン濃度を求めることができる。
【００４９】
ヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビン濃度が求まれば、ＨｂＡ１ｃは、ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の割合であるので計算によって％で求めることができる。
ＨｂＡ１ｃの基準値は、４．３％〜５．８％で、６．５％以上だと糖尿病と判定される。
このように、同じ検体を用いてヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビン濃度を電気化学的に測定することができ光学系を使用しない小型な装置も実現できる。
【００５０】
さらに本実施例では、ＰＥＴ材にスクリーン印刷で作製したセンサにおいて、作用極にカーボンペースト、対極と参照極に銀と塩化銀が任意割合で混合されたペーストを用いた例を説明したが、センサの電極に用いる材料が変わっても本発明が有効であることは言うまでもない。
血液前処理方法は、今回の方法に限定するものではなく、ヘモグロビンが経時的に変化がなく安定した状態にあればよい。
また、酵素と電子受容体の種類を変えた場合においても本発明が有効であることは明白である。
【００５１】
従来におけるヘモグロビン量を測定する方法は種々存在するが、光学的手法ではレンズや回折格子などの光学系部品による大型化、免疫学的手法では測定の煩雑さが問題であった。また酵素電極法を用いて、糖化アミノ酸を検出する酸化酵素は発見されているが、酵素電極法を用いてヘモグロビン濃度を測定する方法がなく糖尿病検査指標であるＨｂＡ１ｃの測定ができず、また装置小型化の障壁になっていた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によれば、ヘモグロビン濃度を電気化学的手法である交流インピーダンス測定によって求めることができ、装置の小型化が可能である。
さらに、同一検体を用いて、ヘモグロビン濃度を交流インピーダンス測定によって求め、糖化ヘモグロビン濃度を酵素電極法を用いた定電位測定による電流を求めることによって、世界的に糖尿病検査指標として用いているＨｂＡ１ｃを電気化学的に求めることができる。
レンズや回折格子を使用しないため装置の小型化が可能で免疫法のように測定の煩雑さも少なく、小型で安定した高精度なヘモグロビン濃度測定装置を実現することができ、本発明を用いることの効果は非常に高い。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明のヘモグロビン濃度測定装置を示す概略図である。
【図２】本発明のヘモグロビン濃度測定装置における周波数応答解析を示す図である。
【図３】本発明のヘモグロビン濃度測定装置における測定結果を示す図である。
【図４】本発明のヘモグロビン濃度測定装置における測定結果を示す図である。
【図５】本発明のヘモグロビン濃度測定装置における測定結果を示す図である。
【図６】本発明のヘモグロビン濃度測定装置における測定結果を示す図である。
【図７】本発明のヘモグロビン濃度測定装置における測定結果を示す図である。
【図８】本発明の実施例２を示す概略図である。
【符号の説明】
【００５４】
１ 電極系
２ 直流電位制御手段
３ 交流信号制御手段
４ 周波数応答解析手段
１０ 作用極
１１ 対極
１２ 参照極
１３ 第２の作用極
１４ 第２の対極
１５ 第２の参照極
１６ 血液前処理手段
１７ タンパク質分解手段
１８ 第２の電極系
１９ 電流測定手段
２０ 糖化ヘモグロビン算出手段
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極系と該電極系に直流信号を印加する直流電位制御手段と該直流信号に交流信号を重畳させる交流信号制御手段と、前記直流信号に重畳させる交流信号を入力信号として、逐次変化する電位と電流を測定し、インピーダンスを求める周波数応答解析手段と該周波数応答解析手段で求めたインピーダンスからヘモグロビン濃度を算出するヘモグロビン濃度算出手段とを有するヘモグロビン濃度測定装置。
【請求項２】
前記ヘモグロビンは、血液を溶血および変性させ、メトヘモグロビン化することを特徴とする請求項１に記載のヘモグロビン濃度測定装置。
【請求項３】
前記周波数応答解析手段は、前記直流信号に重畳して連続的に変化する周波数ごとの交流信号を入力信号として得られる電位と電流を求め、前記周波数ごとのインピーダンスを求めることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のヘモグロビン濃度測定装置。
【請求項４】
前記ヘモグロビン濃度を測定し、前記ヘモグロビン濃度を測定した同一血液から得られた溶血および変性後の糖化ヘモグロビンとフルクトシルアミンオキシダーゼとを反応させ、定電位測定から得られる電流から糖化ヘモグロビン濃度を求め、前記ヘモグロビン濃度と前記糖化ヘモグロビン濃度とからヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の割合を求めることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のヘモグロビン濃度測定装置。
【請求項５】
前記溶血および変性後の糖化ヘモグロビンとフルクトシルアミンオキシダーゼとを反応させる前に、溶血および変性させた血液をプロテアーゼと反応させることを特徴とする請求項４に記載のヘモグロビン濃度測定装置。
【請求項１】
電極系と該電極系に直流信号を印加する直流電位制御手段と該直流信号に交流信号を重畳させる交流信号制御手段と、前記直流信号に重畳させる交流信号を入力信号として、逐次変化する電位と電流を測定し、インピーダンスを求める周波数応答解析手段と該周波数応答解析手段で求めたインピーダンスからヘモグロビン濃度を算出するヘモグロビン濃度算出手段とを有するヘモグロビン濃度測定装置。
【請求項２】
前記ヘモグロビンは、血液を溶血および変性させ、メトヘモグロビン化することを特徴とする請求項１に記載のヘモグロビン濃度測定装置。
【請求項３】
前記周波数応答解析手段は、前記直流信号に重畳して連続的に変化する周波数ごとの交流信号を入力信号として得られる電位と電流を求め、前記周波数ごとのインピーダンスを求めることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のヘモグロビン濃度測定装置。
【請求項４】
前記ヘモグロビン濃度を測定し、前記ヘモグロビン濃度を測定した同一血液から得られた溶血および変性後の糖化ヘモグロビンとフルクトシルアミンオキシダーゼとを反応させ、定電位測定から得られる電流から糖化ヘモグロビン濃度を求め、前記ヘモグロビン濃度と前記糖化ヘモグロビン濃度とからヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の割合を求めることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のヘモグロビン濃度測定装置。
【請求項５】
前記溶血および変性後の糖化ヘモグロビンとフルクトシルアミンオキシダーゼとを反応させる前に、溶血および変性させた血液をプロテアーゼと反応させることを特徴とする請求項４に記載のヘモグロビン濃度測定装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００８−７６１４３（Ｐ２００８−７６１４３Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５４０９９（Ｐ２００６−２５４０９９）
【出願日】平成１８年９月２０日（２００６．９．２０）
【出願人】（０００００１９６０）シチズンホールディングス株式会社 (1,939)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２０日（２００６．９．２０）
【出願人】（０００００１９６０）シチズンホールディングス株式会社 (1,939)
【Ｆターム（参考）】
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