ヘルペスウイルスを用いた癌処置のための組成物および方法
【課題】複製非必須遺伝子が不活化されたヘルペスウイルス、およびこれを利用した治療薬を提供する。
【解決手段】ＵＬまたはＵＳ領域に存在するＵＳ３またはＵＬ５６遺伝子を含む、複製非必須遺伝子が不活化されたヘルペスウイルス（好ましくは、単純ヘルペスウイルス、より好ましくは単純ヘルペスウイルス−１または単純ヘルペスウイルス−２）。および、該ウイルスを利用した、腫瘍および感染性疾患を含む種々の疾患または障害を処置するための方法、組成物およびその使用。また、プロドラッグを活性化するための方法、組成物およびその使用。
【解決手段】ＵＬまたはＵＳ領域に存在するＵＳ３またはＵＬ５６遺伝子を含む、複製非必須遺伝子が不活化されたヘルペスウイルス（好ましくは、単純ヘルペスウイルス、より好ましくは単純ヘルペスウイルス−１または単純ヘルペスウイルス−２）。および、該ウイルスを利用した、腫瘍および感染性疾患を含む種々の疾患または障害を処置するための方法、組成物およびその使用。また、プロドラッグを活性化するための方法、組成物およびその使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規単純ヘルペスウイルス（以下、本明細書においてＨＳＶと略すことがある）の構築物に関する。より詳細には、本発明は、新規ヘルペスウイルス構築物を用いた種々の疾患または障害（例えば、がん、細菌感染症、ウイルス感染症など）の処置、治療または予防のための方法、使用および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘルペスウイルスが歴史に記されるのは紀元前の古代ギリシア時代にさかのぼる。ヘルペスウイルスは、初めて感染した後に発症する例は少なく、長期間、ウイルスは神経節などに潜伏する。ヒトの免疫能が低下すると、ウイルスが活性化され増殖し発症する。この際、ヘルペスウイルスは、皮膚、性器、眼球、神経などと、広い範囲の組織を標的とする。血液中にウイルスを中和する抗体が存在していても症状が現れることが多いことから、発症に細胞性免疫能の低下が関与していると考えられている。
【０００３】
ヒトに感染するヘルペスウイルスには、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−２）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）、ヒトヘルペスウイルス−８（ＨＨＶ−８）などが包含される。
【０００４】
ＨＳＶ−１は、初感染症状として、歯肉口内炎、顔面ヘルペスを呈し、回帰感染症状として、口唇ヘルペス、角膜結膜炎ヘルペス、ヘルペス脳炎を呈する。ＨＳＶ−１の潜伏感染部位は、おもに三叉神経節である。ＨＳＶ−２は、初感染症状として、性器ヘルペスを呈し、回帰感染症状として、性器ヘルペス、新生児ヘルペスを呈する。ＨＳＶ−２の潜伏感染部位は、おもに仙骨部神経節である。ＶＺＶは、初感染症状として水痘を呈し、回帰感染症状として水痘、帯状疱疹を呈する。ＶＺＶの潜伏感染部位は、おもに脊椎後根神経節である。ＥＢＶは、無症状であるか、または初感染症状として伝染性単核症を呈し、回帰感染症状としてバーキットリンパ腫、鼻咽腔がんを呈する。ＥＢＶの潜伏感染部位は、おもにＢリンパ球である。ＨＣＭＶは、初感染症状としては無症状であるが、回帰感染症状として肺炎、巨細胞封入体症などを呈する。ＨＣＭＶの潜伏感染部位は、おもにマクロファージ、造血前駆細胞とみられる。ＨＨＶ−６は、初感染症状として突発性発疹を呈し、回帰感染症状として突発性発疹（肺炎）を呈する。ＨＨＶ−６の潜伏感染部位は、マクロファージ、造血前駆細胞と見られる。ＨＨＶ−７は、初感染症状として突発性発疹を呈する。ＨＨＶ−７の潜伏感染部位はおもにＴリンパ球である。ＨＨＶ−８は、初感染症状としては無症状であるが、回帰感染症状としてカポジ肉腫、ＰＥＬ、キャッスルマン病を呈する。ＨＨＶ−８の潜伏感染部位はおもにＢリンパ球である。このようにヘルペスウイルスに起因する感染は非常に多岐にわたる。
【０００５】
ヒトのヘルペスウイルスワクチンの中で成功したのは水痘ウイルス弱毒化生ワクチンのみである（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ、２：１２８８，１９７４）。しかし、この弱毒化生ウイルスは、偶然にもたらされたものであり水痘ウイルスが他のヘルペスウイルスと異なりウイルス血症により全身感染を起こすため液性免疫の有効性が高いという特性に基づくという特性に基づく。従って、実質的には、ヘルペスウイルスに対するワクチンとして普遍的に利用可能に有効なものはいまだない。
【０００６】
ＨＳＶはヒトに感染するヘルペスウイルスの中でも代表的な例である。ＨＳＶによる感染は、粘膜のウイルス接種から、あるいはウイルスが表皮の破れから皮膚の中に入ることにより生じる。大抵の一次感染は幼児期に起こり、ほとんどの子供は一次感染から急速に回復する。しかし、感染している付添人から、一般的にはＨＳＶ感染した母親から、新生児がＨＳＶに感染した場合、より具体的には誕生時に新生児が産道で陰部疱疹に出合うときに、ＨＳＶの感染が重症を引き起こす。例えば、播種性新生児疱疹感染が、肝炎等を引き起こし、新生児を死に至らしめる場合もある。
【０００７】
ＨＳＶが体内にいったん獲得されると、ＨＳＶは生涯身体中に保持される。感染の潜状期間は、ＨＳＶは知覚神経節のニューロン中に局在化され（顔の病変の場合には、通常三叉神経節が関係する）、感染者は無徴候である。しかし、月経、日光もしくは冷風への過剰暴露、下垂体もしくは副腎ホルモン、アレルギー反応、または熱のごとき多くの刺激によって、ＨＳＶが活動状態となる。活動状態となったＨＳＶは複製して、宿主細胞の機構を乗っ取り、感染性の成熟ウイルス粒子を作り、そして細胞死を引き起こす。かかる再発性の攻撃により引き起こされる病気は、口、顔および性器に現れることが最も多い。例えば、再発性のＨＳＶによる角膜炎は失明の主要な原因とされている。また、ＨＳＶの性器感染は頻繁に起こり、ＨＳＶに起因する性感染症（例えば、陰部ヘルペス）が顕著な羅病率で発症する。より具体的には、かかる再発性の攻撃により引き起こされる再発性ＨＳＶ誘導性疾病としては、例えば口唇疱疹（通常「熱性疱疹」または「コールドソアス（ｃｏｌｄ ｓｏｒｅｓ）」と呼ばれる唇上の障害）、歯肉口内炎（ロおよび歯肉が小胞でおおわれ、それが破れて潰瘍となる）、咽頭炎、扁桃炎、角結膜炎（角膜炎または眼の角膜の炎症で、樹状潰瘍へと進行し、最終的には角膜の瘢痕化をもたらし、盲目となる）および陰部疱疹を含む粘膜皮膚病などが挙げられる。稀には、ＨＳＶ感染は脳炎、疱疹性湿疹、外傷性庖疹および肝炎を引き起こすことがある。
【０００８】
単純ヘルペスウイルス２型（本明細書において以下、ＨＳＶ−２ということがある）は、生殖器で皮膚粘膜感染を誘導する。感染後、ウイルスは知覚神経節において維持され、活性化された後、再発性ＨＳＶ感染を引き起こす（Ｐｒｉｃｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｗａｌｚ，Ｍ．Ａ．，Ｗｏｈｌｅｎｂｅｒｇ，Ｃ．，ａｎｄ Ｎｏｔｋｉｎｓ，Ａ．Ｌ．（１９７５）．Ｌａｔｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｎｓｏｒｙ ｇａｎｇｌｉａ ｗｉｔｈ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ： ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １８８，９３８−９４０）。動物モデルを用いたＨＳＶ−２感染に対する免疫反応は、多くの研究者によって幅広く研究されている。
【０００９】
主要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）はランゲルハンス細胞（ＬＣ）を含む樹状細胞（ＤＣ）であり、膣におけるマクロファージ（Ｍφ）およびＢ細胞の細胞数は少ないことが報告されている（Ｐａｒｒ，Ｍ．Ｂ．，ａｎｄ Ｐａｒｒ，Ｅ．Ｌ．（１９９１）．Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｖａｇｉｎａ ａｎｄ ｃｅｒｖｉｘ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４４：４９１−４９８，；Ｎａｎｄｉ，Ｄ．，ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．（１９９３）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｅｓ ａｎｄ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｖａｇｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｒｅｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，３３２−３３８）。
【００１０】
Ｔ細胞は細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）として重要な役割を果たしており、ＨＳＶ−２感染に対する抗ウィルス性サイトカインを生産することが報告されている（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ，Ｎ．，ａｎｄ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｉ．（１９９５）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｆｅｍａｌｅ ｇｅｎｉｔａｌ ｔｒａｃｔ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｇｅｎｉｔａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１２，４８１−４８９．；Ｐａｒｒ，Ｍ．Ｂ．，ａｎｄ Ｐａｒｒ，Ｅ．Ｌ．（１９９８）．Ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｖａｇｉｎａ ｉｓ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｂｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，２６７７−２６８５．； Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ．Ｎ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｉ．，ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，Ｎ．（１９９８）．Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｇｉｎａｌ ｍｕｃｏｓａｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｏｒｙ ｇａｇｌｉａ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｍｉｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，６０９３−６１００）。
【００１１】
複製能力欠損変異株は広域スペクトルの免疫反応を誘導できることが知られている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｌ．Ａ．，Ｄａ Ｃｏｓｔａ，Ｘ．Ｊ．，ａｎｄ Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．（１９９８）．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｍｕｃｏｓａｌ ａｎｄ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＨＳＶ−２ ｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｇｅｎｉｔａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４３，１７８−１８７．；ＭｃＬｅａｎ，Ｃ．Ｓ．，Ｎｉ Ｃｈａｌｌａｎａｉｎ，Ｄ．，Ｄｕｎｃａｎ，Ｉ．，Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌ，Ｍ．Ｅ．Ｇ．，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｒ．，ａｎｄ Ｉｎｇｌｉｓ，Ｓ．Ｃ．（１９９６）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ｍｕｃｏｓａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｎ ｗｉｔｈ ａ ＤＩＳＣ ＨＳＶ−１ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ １４，９８７−９９２）。
【００１２】
ＨＳＶ−２弱毒系統を感染させると、ＨＳＶ−２特異的Ｔ細胞１型（Ｔｈ１）様ＣＤ４＋細胞の膣への流入が引き起こされることが知られている（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ．Ｎ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｄ，Ｉ．，ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，Ｎ．（１９９８）．Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｇｉｎａｌ ｍｕｃｏｓａｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｏｒｙ ｇａｎｇｌｉａ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｍｉｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，６０９３−６１００）。
【００１３】
しかしながら、病理学において、ＨＳＶに特異的なウイルス遺伝子の役割と免疫反応の関係の詳細については、まだ完全には明らかになっていない。
【００１４】
このように、ヘルペスウイルスに起因する疾患または障害に対しては、決定的な予防法、治療法に欠けるのが現状である。
【００１５】
癌に対する治療としては、現在一般に、外科的切除、化学療法、放射線療法等が行われている。しかしながら、これらの治療法が充分な効果を奏さない癌も存在し、例えば、進行膵癌または進行卵巣癌では未だ充分な予後を得るには至っていない。特に腹膜播種の存在する進行膵癌または進行卵巣癌では、外科的切除による予後は期待できない。
【００１６】
このため、癌に対する新たな治療方法として、遺伝子治療が試みられている。癌に対する遺伝子治療としては、（１）アンチセンスまたはリボザイムを用いて癌遺伝子を抑制するか、または、癌抑制遺伝子を導入して腫瘍細胞の増殖を抑制する方法、（２）代謝毒性遺伝子（自殺遺伝子）を導入して腫瘍細胞を自殺に追いやる方法、（３）導入遺伝子により抗腫瘍免疫を強化する方法、（４）化学療法の効果を向上させるために多剤耐性遺伝子を用いて骨髄幹細胞を保護する方法等が検討されている。
【００１７】
上記（２）の方法として、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼを自殺遺伝子として用いる方法が知られている。癌細胞に単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼを導入した後、ガンシクロビルを投与すると、ガンシクロビルは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼによってリン酸化され活性型となり、癌細胞のＤＮＡポリメラーゼを阻害する。このため、癌細胞に単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼを導入することにより、癌細胞の増殖を抑制することができ、ひいては癌細胞を死滅させることも可能となる。
【００１８】
単純ヘルペスウイルスは病原性ウイルスであるので、野生型のものをそのまま癌の治療に使用することはできない。このため、単純ヘルペスウイルスを弱毒化して癌の治療に用いることが研究されている（ＷＯ９６／３９８４１）。
【００１９】
このため、癌に対する新たな治療方法として、遺伝子治療が試みられている。そのような遺伝子治療の一つとしては、代謝毒性遺伝子（自殺遺伝子）を導入して腫瘍細胞を自殺に追いやる方法が挙げられ、より具体的には単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼを自殺遺伝子として用いる方法が知られている。
【００２０】
上記に示したように、単純ヘルペスウイルス（例えば複製能力のあるヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１））のようなヘルペスウイルスは、腫瘍細胞の破壊を媒介することがあることから、遺伝子操作した複製可能なＨＳＶ−１ウイルスベクターの使用が、抗腫瘍治療に関連して検討されている。
【００２１】
このようなＨＳＶ−１ウイルスベクターとしては、γ３４．５遺伝子（γ３４．５）を欠損し、神経毒性が低下したγ３４．５欠損株が用いられて一定の抗腫瘍効果を示されている。しかし、γ３４．５欠損株は実用化には至っていない。
【００２２】
本発明者らは、以前よりＨＳＶ−２のＵＳ２をコードする遺伝子（以下、ＵＳ２遺伝子と略称する）およびＵＳ３をコードする遺伝子（以下、ＵＳ３遺伝子と略称する）に着目し、ＵＳ２欠損変異体またはＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体を用いて病理学的な役割を調べ、ＵＳ２およびＵＳ３遺伝子はともに細胞培養でのウイルス複製に必ずしも必要でなく、ＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体は非常に弱毒化されていることが明らかにした（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｙａｍａｄａ，Ｙ．，Ｋｕｒａｃｈｉ，Ｒ．，ａｎｄ Ｄａｉｋｏｋｕ，Ｔ．（１９９２）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＵＳ３ ｌａｃ Ｚ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０，２５６−２６８．；Ｄａｉｋｏｋｕ，Ｔ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｙ．，Ｔｓｕｒｕｍｉ，Ｔ．，Ｍａｅｎｏ，Ｋ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．（１９９３）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＵＳ３ ｇｅｎｅ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７，６８５−６９４．；Ｊｉａｎｇ，Ｙ−Ｈ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．，Ｇｏｓｈｉｍａ，Ｆ．，Ｄａｉｋｏｋｕ．Ｔ．，Ｏｓｈｉｍａ，Ｓ．，Ｗａｄａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．（１９９８）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ （ＨＳＶ−２） ＵＳ２ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ ａ ＵＳ２−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＨＳＶ−２ ｍｕｔａｎｔ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９，２７７７−２７８４）。
【００２３】
また、マウスモデルを用いて行った性器ヘルペスに関する以前の研究から、感染初期の段階ではＨＳＶ−１ＫＯＳ株感染とは異なり、強毒なＨＳＶ−２ １８６株を膣内感染させると、膣内で活性化されたＴ細胞を効果的に増加させることも、ＡＰＣ（抗原提示細胞）の急速な増加も誘導できないことが明らかとなった（Ｉｎａｇａｋｉ−Ｏｈａｒａ Ｋ，Ｄａｉｋｏｋｕ Ｔ，Ｇｏｓｈｉｍａ Ｆ，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ Ｙ．Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｈｉｇｈｌｙ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｇｅｎｉｔａｌ ｈｅｒｐｅｓ．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．２０００； １４５（１０）： １９８９−２００２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
従って、本発明は、特性の改変されたヘルペスウイルス構築物またはその使用もしくはそれを使用する方法を提供することによって、ヘルペスウイルスに関連する疾患または障害あるいはその他の疾患または障害を処置または予防することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
発明の要旨
本発明は、複製非必須遺伝子が不活化されたヘルペスウイルスを提供する。より詳細には、ＵＬおよび／またはＵＳ領域に存在する複製非必須遺伝子が不活化されたヘルペスウイルスを提供する。また、本発明は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子が不活化されたヘルペスウイルスを提供する。より好ましくは、この複製非必須遺伝子は、ＵＳ３および／またはＵＬ５６を含む。好ましくは、このヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスであり得、より好ましくは単純ヘルペスウイルス−１または単純ヘルペスウイルス−２であり得る。本発明により、腫瘍および感染性疾患を含む種々の疾患または障害を処置するための方法、組成物および使用が提供される。本発明はまた、プロドラッグを活性化するための方法、組成物および使用が提供される。
【００２６】
一つの局面において、本発明は、少なくとも１つの複製非必須遺伝子が不活化されている、ヘルペスウイルスを提供する。
【００２７】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する。
【００２８】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは単純ヘルペスウイルスであり、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００２９】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【００３０】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００３１】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ５６またはＵＳ３を含む。
【００３２】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ３９およびＵＬ４０を含む。
【００３３】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ３９およびＵＬ５６を含む。
【００３４】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２およびＵＳ３を含む。
【００３５】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ５６を含む。
【００３６】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３を含む。
【００３７】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、少なくとも２つが不活化されている。
【００３８】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子のうち２つ目以降は、ＲＬ１、ＲＬ２、ＯＲＦＰ，ＯＲＦＯ、ＲＬ３、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬｌ３、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２０．５、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４３．５、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ１．５、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００３９】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、外来性の自殺遺伝子をさらに含む。
【００４０】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、カルボキシエステラーゼ遺伝子をさらに含む。
【００４１】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、癌細胞選択性を有する。
【００４２】
一つの実施形態において、上記不活化は、上記複製非必須遺伝子の配列において、少なくとも１ヌクレオチドの置換、付加、欠失または改変を含む。
【００４３】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【００４４】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【００４５】
別の局面において、本発明の薬学的組成物は、少なくとも１つのヘルペスの複製非必須遺伝子が不活化されている、ヘルペスウイルス；および薬学的に受容可能なキャリア、を含む。
【００４６】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する。
【００４７】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される、からなる群より選択される。
【００４８】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【００４９】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００５０】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ５６またはＵＳ３を含む。
【００５１】
一つの実施形態において、上記不活化は、上記複製非必須遺伝子の配列において、少なくとも１ヌクレオチドの置換、付加、欠失または改変を含む。
【００５２】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子の配列において、翻訳を停止するシグナルが挿入されている。
【００５３】
一つの実施形態において、上記翻訳を停止するシグナルは、ポリアデニル化シグナルである。
【００５４】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【００５５】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【００５６】
一つの実施形態において、上記組成物は、弱毒化ヘルペスウイルスが活性型に変換しうるプロドラッグをさらに含む。
【００５７】
一つの実施形態において、上記プロドラッグは、ガンシクロビル、アシクロビル、タキソールおよびカンプトテシンからなる群より選択されるものを含む。
【００５８】
一つの実施形態において、上記組成物は、腫瘍処置のためである。
【００５９】
一つの実施形態において、上記組成物は、少なくとも１つの腫瘍処置のための薬剤をさらに含む。
【００６０】
一つの実施形態において、上記組成物は、上記ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグの抗癌作用増強のためである。
【００６１】
一つの実施形態において、上記組成物は、感染性疾患の処置のためである。
【００６２】
一つの実施形態において、上記感染性疾患は、ヘルペスウイルスに起因する。
【００６３】
一つの実施形態において、上記組成物は、上記感染性疾患の病因因子に由来する遺伝子を含む。
【００６４】
一つの実施形態において、上記組成物は、Ｌ１ＢＲ１を含有する。
【００６５】
一つの実施形態において、上記組成物は、ワクチンの形態をとる。
【００６６】
一つの実施形態において、上記組成物は、ヘルペスウイルス感染により惹起される疾患または障害の処置または予防治療剤であることを特徴とする。
【００６７】
一つの実施形態において、上記組成物は、上記ヘルペスウイルス感染により惹起される疾患は、性感染症である。
【００６８】
一つの実施形態において、上記組成物は、感染性疾患を処置または予防するためである。
【００６９】
一つの実施形態において、上記組成物は、上記感染性疾患の病因因子を含む。
【００７０】
一つの実施形態において、上記感染性疾患の病因因子は、ウイルスまたは細菌性である。
【００７１】
一つの実施形態において、上記感染性疾患の病因因子は、ＨＩＶ、インフルエンザウイルスおよびロタウイルスからなる群より選択される。
【００７２】
別の局面において、本発明の、感染性疾患または腫瘍を処置または予防するための方法は、、そのような処置または予防を必要とする被検体に、少なくとも１つのヘルペスの複製非必須遺伝子が不活化されている、ヘルペスウイルスおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を投与する工程、を包含する。
【００７３】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する。
【００７４】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００７５】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【００７６】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００７７】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３またはＵＬ５６を含む。
【００７８】
一つの実施形態において、上記不活化は、上記複製非必須遺伝子の配列において、少なくとも１ヌクレオチドの置換、付加、欠失または改変を含む。
【００７９】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【００８０】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【００８１】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグを投与する工程をさらに包含する。
【００８２】
一つの実施形態において、上記プロドラッグは、ガンシクロビル、アシクロビル、タキソールおよびカンプトテシンからなる群より選択される少なくとも一つを含む。
【００８３】
一つの実施形態において、上記方法は、少なくとも１つの腫瘍処置のための薬剤をさらに投与する工程を包含する。
【００８４】
一つの実施形態において、上記方法は、少なくとも１つの感染性疾患処置のための薬剤をさらに投与する工程を包含する。
【００８５】
一つの実施形態において、上記腫瘍は、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、膀胱癌、尿管癌、大腸癌、皮膚癌、悪性メラノーマ、骨肉腫、頭頚部の扁平上皮癌および胃癌からなる群より選択される。
【００８６】
別の局面において、本発明の、ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグの抗癌作用増強方法は、上記抗癌作用増強を必要とする被検体に、少なくとも１つのヘルペスの複製非必須遺伝子が不活化されている、ヘルペスウイルスおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を投与する工程、を包含する。
【００８７】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する。
【００８８】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００８９】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【００９０】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００９１】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３またはＵＬ５６を含む。
【００９２】
一つの実施形態において、上記プロドラッグは、ガンシクロビル、アシクロビル、タキソールおよびカンプトテシンからなる群より選択される一つを含む。
【００９３】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【００９４】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【００９５】
別の局面において、本発明の、ヘルペスウイルス感染の重篤度またはヘルペスウイルス感染率を減少させる方法は、そのような処置または予防を必要とする被検体に、少なくとも１つのヘルペスの複製非必須遺伝子が不活化されている、ヘルペスウイルスを含む、ワクチンを投与する工程、を包含する。
【００９６】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する、項目７０に記載の方法。
【００９７】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００９８】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【００９９】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【０１００】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３またはＵＬ５６を含む。
【０１０１】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【０１０２】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【０１０３】
別の局面において、本発明の、腫瘍を処置または予防するための薬学的組成物を製造するための、ヘルペスウイルスの使用では、上記ヘルペスウイルスは、少なくとも１つのヘルペスの複製非必須遺伝子が不活化されている。
【０１０４】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する。
【０１０５】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【０１０６】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【０１０７】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【０１０８】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３またはＵＬ５６を含む、項目７８に記載の使用。
【０１０９】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【０１１０】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【０１１１】
別の局面において、本発明の、ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグの抗癌作用増強のための薬学的組成物を製造するための、ヘルペスウイルスの使用では、上記ヘルペスウイルスは、少なくとも１つのヘルペスの複製非必須遺伝子が不活化されている。
【０１１２】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する。
【０１１３】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【０１１４】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【０１１５】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【０１１６】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３またはＵＬ５６を含む。
【０１１７】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【０１１８】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【０１１９】
別の局面において、本発明の、ヘルペスウイルス感染の重篤度および／またはヘルペスウイルス感染率を減少させるための薬学的組成物を製造するための、ヘルペスウイルスの使用では、上記ヘルペスウイルスは、少なくとも１つのヘルペスの複製非必須遺伝子が不活化されている。
【０１２０】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する。
【０１２１】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【０１２２】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【０１２３】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【０１２４】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３またはＵＬ５６を含む。
【０１２５】
一つの実施形態において、上記薬学的組成物は、ワクチンである。
【０１２６】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【０１２７】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２８】
以下、発明の実施の形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。本明細書において引用される文献または特許もしくは特許出願は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０１２９】
本明細書において、「ヘルペスウイルス」とは、ウイルスの一科であるヘルペスウイルス科に属する任意のウイルスをいう。ヘルペスウイルスは、コアタンパクのまわりに分子量80〜150×10６ダルトンの複鎖線状DNAが162個のカプソメアを含み、潜伏感染を特徴とする。ウイルス粒子は直径約100〜200nmの球状であり、エンベロープ中には直径100nm前後の正二十面体状のカプシドがある。ゲノムは二本鎖DNAであり、そのサイズは，例えば単純ヘルペスウイルス１型が152260塩基対であり、EBウイルスが172282塩基対であり、サイトメガロウイルスが229400基塩対である。細胞核内で増殖し、フォイルゲン反応陽性の封入体をつくる。自然宿主、実験動物の皮膚および粘膜などの上皮細胞、中枢神経組織などでよく増殖する．３亜科があり所属ウイルスは次のとおりである：アルファヘルペスウイルス亜科:ヒトヘルペスウイルス−１(単純ヘルペスウイルス１型；ＨＳＶ−１)、ヒトヘルペスウイルス−２(単純ヘルペスウイルス２型；ＨＳＶ−２）、アラートンウイルス（Ａｌｌｅｒｔｏｎ ｖｉｒｕｓ）、Ｂウイルス（Ｂ ｖｉｒｕｓ）、ウシ乳頭炎ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｍａｍｍｉｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＢＭＶ）、ネコ鼻腔気管炎ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｌａｒｙｎｇｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＩＬＴ ｖｉｒｕｓ）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）など；ベータヘルペスウイルス亜科:サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）、など；ガンマヘルペスウイルス亜科:ヒトヘルペスウイルス−４（ＨＨＶ−４）、ヒトヘルペスウイルス−８（ＨＨＶ−８）、EBウイルス（ＥＢＶ）、マレック病ウイルスなど。好ましくは、本発明のウイルス構築物は、アルファヘルペスウイルス亜科に由来する。
【０１３０】
本明細書において、「単純ヘルペスウイルス」または「ＨＳＶ」とは、ヘルペスウイルス科アルファヘルペスウイルス亜科シンプレックスウイルス属に属する任意のウイルスをいう。単純ヘルペスウイルスは、直径１００−２００ｍｍの大きさで、最外層にはウイルス糖タンパク質を含むエンベロープをもち、その中に正２０面体のカプシドを含む。カプシドとはエンベロープとの間には、テグメントと名づけられる構造体が存在し、多数のウイルスタンパク質が含まれる。カプシドの中心部（コア）には２本鎖線状ＤＮＡ（約１５万基塩基対）が存在する。ゲノムＤＮＡには、少なくとも７４種類の遺伝子が存在し、その半数は、培養細胞での増殖に必須ではない複製非必須遺伝子（アクセサリー遺伝子）である。ゲノムＤＮＡの複製、カプシドの形成は、核内で行われ、ＤＮＡを含んだカプシドは核内膜から出芽することにより核内から細胞質へと輸送される。ＨＳＶとしては、代表的に、１型（ＨＳＶ−１）および２型（ＨＳＶ−２）と名づけられた２つの密接に関連するウイルス種がある。本発明においては、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の変異体を用いてもよい。場合によってはＨＳＶ−２を用いるのが好ましい。本明細書において、「弱毒化ＨＳＶ」とは、改変などによって毒性が減少しているＨＳＶをいう。
【０１３１】
本明細書において、「複製非必須遺伝子」または「アクセサリー遺伝子」とは、本明細書において互換的に用いられ、その遺伝子を欠損しても、ウイルスの増殖性が維持されるものをいう。好ましくは、そのような遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在し、ゲノムＤＮＡ上に一つしかない遺伝子から構成される。そのような遺伝子としては、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のような単純ヘルペスウイルスでは、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１、ＵＳ１２などが挙げられるがそれらに限定されない。他のヘルペスウイルスでは、上記遺伝子に相当する遺伝子が不活化の対象とされ得る。
【０１３２】
１つの実施形態において、複数の複製非必須遺伝子が不活化される場合、２つ目以降の不活化される遺伝子としては、ＲＬ１、ＲＬ２、ＯＲＦＰ，ＯＲＦＯ、ＲＬ３、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬｌ３、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２０．５、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４３．５、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ１．５、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１、ＵＳ１２などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３３】
好ましい実施形態において、本発明において不活化される遺伝子としては、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子が挙げられる。理論に束縛されることは望まないが、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子を不活化することにより、安全性が飛躍的に伸び得、および／またはヒトへの特異性が顕著に高くなり得る。そのようなＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子としては、例えば、ＵＬ２、ＵＬ１２、ＵＬ２３、ＵＬ３９、ＵＬ４０およびＵＬ５０以外の遺伝子などが挙げられる。より好ましくは、そのようなＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＳ領域またはＵＬ領域に存在する。したがって、好ましいＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２を包含するがそれらに限定されない。
【０１３４】
本発明の弱毒化ＨＳＶは、癌細胞において優位に増殖し得る、癌細胞選択性を有していることが好ましい。
【０１３５】
１つまたは２つ以上のアクセサリー遺伝子が不活化されている弱毒化ＨＳＶとしては、例えば、ＵＬ３９またはＵＬ４０が不活化されているものを挙げることができ、なかでも、ＵＬ３９またはＵＬ４０と、１つまたは２つ以上の他のアクセサリー遺伝子とが不活化されているものが好ましい。
【０１３６】
ＵＬ３９またはＵＬ４０が不活化されている弱毒化ＨＳＶは、この遺伝子にコードされておりＤＮＡ合成に必要なリボヌクレオチドレダクターゼを宿主に依存しなければならない。このため、ＵＬ３９またはＵＬ４０が不活化されている弱毒化ＨＳＶを癌患者に接種すると、増殖が盛んな癌細胞において優位に増殖させることができる。このような弱毒化ＨＳＶに感染された癌細胞は、ウイルスが保有する様々なタンパク質の細胞障害作用によって増殖が抑制され、更には死滅してしまうこともある。
【０１３７】
ＵＬ３９またはＵＬ４０に加えて、１つまたは２つ以上の他のアクセサリー遺伝子が不活化されていると、癌細胞における優位の増殖性を維持しうるとともに宿主に対する病原性を更に減弱することができる。
【０１３８】
ＵＬ３９またはＵＬ４０と、１つまたは２つ以上の他のアクセサリー遺伝子とが不活化されている弱毒化ＨＳＶとしては、例えば、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ５５およびＵＬ５６が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＬ２が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＳ３が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ２およびＵＳ３が不活性されている弱毒化ＨＳＶ等を挙げることができる。
【０１３９】
ＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ５５およびＵＬ５６が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、またはＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＬ２が不活化されている弱毒化ＨＳＶは、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）のみが不活化されている弱毒化ＨＳＶよりも、更に、高い安全性を有する。一方、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＳ３が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、またはＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ２およびＵＳ３が不活化されている弱毒化ＨＳＶは、高い癌細胞選択性に加えて癌細胞のアポトーシスを引き起こす機能を併せ持つことができる。
【０１４０】
別の実施形態では、ＵＳ３および／またはＵＬ５６が不活化されているＨＳＶが提供される。
【０１４１】
本明細書において、遺伝子が「不活化」されるとは、その遺伝子の少なくとも１つの機能が損なわれているか、または好ましくは実質的に消失していることをいう。不活化する方法としては特に限定されず、例えば、以下の公知の方法を挙げることができる。
【０１４２】
かかる改変としては、例えばＨＳＶ複製非必須遺伝子（例えば、ＵＳ３遺伝子）が翻訳されないような処理（例えば、発現しないようにプロモーターを改変すること）、またはＨＳＶ遺伝子のうち特定の複製非必須遺伝子（例えば、ＵＳ３遺伝子）を組換え（例えば、他の配列の挿入、一部の配列の切除、塩基の修飾、塩基の置換等）、該組換えられた遺伝子が翻訳されるとＵＳ３とは異なるタンパクが発現する改変（例えば、他のアミノ酸配列の挿入、一部の配列の切除、アミノ酸の置換など）などが挙げられる。
【０１４３】
上記遺伝子組換え体を作製するための遺伝子組換え処理としては、特に限定されない。例えば、特定の複製非必須遺伝子（例えば、ＵＳ３遺伝子）の全部または一部を欠損させる処理、特定の複製非必須遺伝子の全部または一部を置換させる処理、特定の複製非必須遺伝子の一部を逆位させる処理、ＵＳ３遺伝子の一部を重複させる処理、特定の複製非必須遺伝子の一部を転座させる処理、特定の複製非必須遺伝子に遺伝子断片を挿入しその特定の複製非必須遺伝子を中断させる処理などが挙げられる。中でも、特定の複製非必須遺伝子の全部または一部を欠損させる処理、特定の複製非必須遺伝子の全部または一部を置換させる処理、または特定の複製非必須遺伝子に遺伝子断片を挿入しその特定の複製非必須遺伝子を中断させる処理が好ましい。特に、特定の複製非必須遺伝子に遺伝子断片を挿入し特定の複製非必須遺伝子を中断させる処理がより好ましく、挿入する他の遺伝子には、翻訳を停止させるシグナルが含有されていることがさらに好ましい。翻訳を停止させるシグナルとしては、中でもＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルが好ましい。
【０１４４】
本明細書において、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、互換的に用いられ、一連のアミノ酸からなる高分子をいう。アミノ酸は、炭素原子にカルボキシル基およびアミノ基を有する有機分子をいう。本明細書において好ましくは、アミノ酸は、天然に存在する２０種類のアミノ酸であるがこれらに限定されない。
【０１４５】
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【０１４６】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【０１４７】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【０１４８】
本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４９】
本明細書において、「非保存的置換」とは、上記のような保存的置換ではない置換をいい、それにより、タンパク質の機能の改変が生じ得る。非保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ間での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５０】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【０１５１】
本明細書において使用されるポリペプチドをコードする核酸分子は、同一または類似の機能を発揮することを目的とする場合、発現されるポリペプチドが本発明のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、このポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような核酸分子を作製する方法は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
【０１５２】
本発明において、機能を改変、好ましくは不活化することを目的とする場合、発現されるポリペプチドが本発明において利用されるポリペプチドと実質的に異なる、好ましくは消失した活性を有するように、その核酸の配列の一部が欠失または置換され得、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。
【０１５３】
本明細書において「発現可能なように組み込まれる」とは、例えば下記に示すようなプロモーター配列の下流に目的とする自殺遺伝子が組み込まれることをいう。
【０１５４】
このような本発明の弱毒化ＨＳＶは、例えば、プロモーター配列およびターミネーター配列が組み込まれ、アクセサリー遺伝子が不活化されたＨＳＶベクターを用い、プロモーター配列の下流に上記外来性の自殺遺伝子を挿入することにより得ることができる。
【０１５５】
プロモーターとしては、腫瘍細胞中でプロモーターとして機能するものであれば特に限定されないが、腫瘍特異的プロモーターまたはＨＳＶ由来プロモーターが好ましい。そのようなプロモーターとしては、本発明の実施に有用なプロモーターの例としては（特にヒトに対する遺伝子ワクチンの製造において）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（ＨＩＶ長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターのような）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶ前初期プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）からのプロモーター類、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子からのプロモーター類が挙げられるが、これらに制限されるわけではない。
【０１５６】
腫瘍細胞特異的プロモーターは特定の細胞型かまたは腫瘍細胞において選択的にまたは高レベルに誘導されるプロモーターを含み、例えばＣＥＡ、ＡＦＰなどの癌胎児性タンパク質プロモーター、チロシナーゼプロモーター、アルブミンプロモーター、ストレス誘発性ＧＲＰ７８／Ｂｉｐプロモーターなどを挙げることができる。
【０１５７】
ＨＳＶ由来プロモーターとしては、例えばＨＳＶ初期タンパク質ＵＬ２９プロモーター、ＨＳＶ ＵＬ３９プロモーターなどを挙げることができる。
【０１５８】
本発明の実施に有用なポリアデニル化シグナルの例としては（特にヒトに対する遺伝子ワクチンの製造において）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに制限されるわけではない。特に、ｐＣＥＰ４プラスミド中に存在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと称される）が使用される。
【０１５９】
ＤＮＡ発現に必要とされる制御エレメントに加え、他のエレメントもＤＮＡ分子に含まれているであろう。本明細書において使用されるＨＳＶ由来プロモーターは、さらにエンハンサー有していてもよい。そのような追加のエレメントにはエンハンサーが含まれる。エンハンサーは：ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶからのエンハンサーのようなウイルスエンハンサーからなる群より選択されるであろうが、それらに制限されるわけではない。
【０１６０】
遺伝子構築物を染色体外に維持するためおよび細胞中で構築物の多数のコピーを生成するために、構築物は哺乳類複製起点とともに提供できる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）からのプラスミドｐＣＥＰ４およびｐＲＥＰ４はエプスタインバーウイルス複製起点および組込みなしで高コピーエピソーム複製を生み出す核抗原ＥＢ ＮＡ−１コード領域を含んでいる。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質をコードしているｃＤＮＡがｐＣＤＮＡ３内へ挿入される。
【０１６１】
いくつかの好適な態様において、標的タンパク質、免疫調節タンパク質、およびそのうえにそのような標的タンパク質に対する免疫応答をさらに促進するタンパク質のための遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子が送達される。そのような遺伝子の例はα−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のようなサイトカインおよびリンホカインをコードしているものである。いくつかの態様において、ＧＭ−ＣＳＦの遺伝子が免疫化組成物で使用される遺伝子構築物に含まれていることが好適である。
【０１６２】
タンパク質産生を最大にするため、構築物が投与される細胞内での遺伝子発現に適した制御配列が選択され得る。さらに、細胞内で最も効率的に転写されるコドンが選択され得る。当業者は細胞内で機能的であるＤＮＡ構築物を周知技術に基づいて容易に製造することができる。
【０１６３】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変異誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【０１６４】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｗｉｌｅｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら （１９８７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
【０１６５】
遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【０１６６】
本明細書では塩基配列の同一性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
【０１６７】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。
【０１６８】
「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号２，４または６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。記載の相同性は、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
【０１６９】
「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。
【０１７０】
本明細書において、「アミノ酸」は、上述のように天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸は、当該分野において周知である。
【０１７１】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドは、当該分野において周知である。
【０１７２】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。本明細書では、生物学的活性としては、重金属に結合する活性および細胞膜のような疎水性部分に結合する能力が挙げられる。
【０１７３】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。本明細書において、核酸分子の「ホモログ（種相同体）」とは、参照核酸分子のヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子をいう。ホモログは、代表的には、参照核酸分子と、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをいう。本発明の核酸分子についていう場合、「ホモログ」とは、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列と相同性を有する核酸配列を有する核酸分子であって、その生物学的機能が本発明のプロモーターと同一または類似する核酸分子をいう。従って、「ホモログ」と「改変体」とは一部重複する概念である。従って、「ホモログ」は、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのようなホモログを取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。
【０１７４】
本明細書において、ウイルス構築物を細胞などに導入することが必要である場合、ウイルス構築物の導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換などが挙げられる（例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）。
【０１７５】
本明細書において、薬学的（医薬）組成物は、好ましくは、本発明のヘルペスウイルスおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的組成物は、宿主に有効であればその形態はどのようなものでもよく、例えば、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、カプレット剤、丸剤、液剤、トローチ剤、バッカル錠、舌下錠、膣錠、エリキシル剤、シロップ剤、リモナーデ剤、懸濁剤、乳剤、エアゾール剤、注射剤、注入剤、噴霧剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、坐剤などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、ワクチンのような形態にした注射剤として本発明は提供される。本発明はまた、徐放剤とすることもできる。本発明はまた、ＤＤＳ技術用いることもできる。
【０１７６】
好ましくは、本発明の薬学的組成物において、ヘルペスウイルスは、少なくとも１０３、好ましくは、少なくとも２×１０３、少なくとも５×１０３、少なくとも１０４、少なくとも２×１０４、少なくとも５×１０４、少なくとも１０５、少なくとも２×１０５、少なくとも５×１０５、少なくとも１０６、少なくとも２×１０６、少なくとも５×１０６、少なくとも１０７、少なくとも２×１０７、少なくとも５×１０７、少なくとも１０８、少なくとも２×１０８、少なくとも５×１０８、少なくとも１０９、少なくとも２×１０９、少なくとも５×１０９、少なくとも１０１０、または少なくとも１０１０を超えて存在する。適切な量は、使用する状況に応じて変動し、当業者であれば、組成物中に存在する活性成分の状態、医薬に使用する場合は、患者の状態、患者の疾患の状態、投与経路、投与形態、投与中の患者の状態をモニターすることなどにより応じて適宜決定することができる。
【０１７７】
薬学的に受容可能なキャリアとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、安定剤、コーティング剤、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクルおよび／または薬学的アジュバント。
【０１７８】
本発明の組成物が薬学的組成物として用いられる場合は、さらなる医薬成分として、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない成分がその薬学的組成物に含有され得る：
中枢神経系用薬（例えば、全身麻酔剤、催眠鎮静剤、抗不安剤、抗てんかん剤、解熱鎮痛消炎剤、興奮剤、覚せい剤、抗パーキンソン剤、精神神経用剤、総合感冒剤、その他の中枢神経系用薬など）；
末梢神経用剤（例えば、局所麻酔剤、骨格筋弛緩剤、自律神経剤、鎮けい剤など）；
感覚器官用薬（例えば、眼科用剤、耳鼻科用剤、鎮暈剤など）；
循環器官用薬（例えば、、強心剤、不整脈用剤、利尿剤、血圧降下剤、血管収縮剤、血管拡張剤、高脂血症用剤、その他の循環器官用薬など）；
呼吸器官用薬（例えば、呼吸促進剤、鎮咳剤、去痰剤、鎮咳去痰剤、気管支拡張剤、含嗽剤など）；
消化器官用薬（例えば、止瀉剤、整腸剤、消化性潰瘍用剤、健胃消化剤、制酸剤、下剤、浣腸剤、利胆剤、その他の消化器官用薬など）；
ホルモン剤（例えば、脳下垂体ホルモン剤、唾液腺ホルモン剤、甲状腺、副甲状腺ホルモン剤、蛋白同化ステロイド剤、副腎ホルモン剤、男性ホルモン剤、卵胞、．黄体ホルモン剤、混合ホルモン剤、その他のホルモン剤など）；
泌尿生殖器官および肛門用薬（例えば、泌尿器官用剤、生殖器官用剤、子宮収縮剤、痔疾用剤、他の泌尿生殖器管、肛門用薬など）；
外皮用薬（例えば、外皮用殺菌消毒剤、創傷保護剤、化膿性疾患用剤、鎮痛．鎮痒．収斂．消炎剤、寄生性皮膚疾患用剤、皮膚軟化剤、毛髪用剤、その他の外皮用剤など）；
歯科口腔用剤；
その他の個々の器官系用薬；
ビタミン剤（例えば、ビタミンＡ剤、ビタミンＤ剤、ビタミンＢ剤、ビタミンＣ剤、ビタミンＥ剤、ビタミンＫ剤、混合ビタミン剤、その他のビタミン剤など）；
滋養強壮薬（例えば、カルシウム剤、無機質製剤、糖類剤、蛋白アミノ酸製剤、臓器製剤、乳幼児用剤、その他の滋養強壮剤など）；
血液および体液用薬（例えば、血液代用剤、止血剤、血液凝固阻止剤、その他の血液．体液用剤など）；
人工透析用薬（例えば、人工腎臓透析用剤、腹膜透析用剤など）；
その他の代謝性医薬品（例えば、臓疾患用剤、解毒剤、習慣性中毒用剤、痛風治療剤、酵素製剤、糖尿病用剤、他に分類されない代謝性薬など）；
細胞賦活用剤（例えば、クロロフィル製剤、色素製剤、その他の細胞賦活用剤など）；
腫瘍用薬（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質製剤、抗腫瘍性植物成分製剤、その他の腫瘍用剤など）；
放射性医薬品；
アレルギー用薬（例えば、抗ヒスタミン剤、刺激療法剤、非特異性免疫原製剤、その他のアレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、生薬、漢方製剤、その他の生薬漢方処方に基づく製剤など）；
抗生物質製剤（例えば、グラム陽性菌に作用するもの、グラム陰性菌に作用するもの、グラム陽性マイコプラズマに作用するもの、グラム陰性マイコプラズマに作用するもの、グラム陽性リケッチアに作用もの、グラム陰性リケッチアに作用するもの、抗酸菌に作用するもの、カビに作用するもの、その他の抗生物質製剤など）；
化学療法剤（例えば、サルファ剤、抗結核剤、合成抗菌剤、抗ウィルス剤、その他の化学療法剤など）；
生物学的製剤（例えば、ワクチン類、トキソイド類、抗毒素．抗レプトスピラ血清、血液製剤類、生物学的試験用製剤類、その他の生物学的製剤、抗原虫剤、駆虫剤など）；
調剤用薬（例えば、賦形剤、軟膏基剤、溶解剤、矯味矯臭剤、着色剤、その他の調剤用剤など）；
診断用薬（例えば、Ｘ腺造影剤、機能検査用試薬、その他の診断用薬）；
公衆衛生用薬（例えば、防腐剤）；
体外診断用医薬品（例えば、細菌学的検査用薬など）；
分類されない治療を主目的としない薬剤；ならびに
麻薬（例えば、あへんアルカロイド系麻薬、コカアルカロイド系製剤、合成麻薬など）。
【０１７９】
本発明の薬学的組成物は、日本薬局方、米国薬局方、その他対応する他の国の薬局方、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照することによって、当業者は容易に製造することができる。
【０１８０】
本発明は、薬学的組成物として処方される場合、非経口的に投与され得る。あるいは、その組成物は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明における使用のための治療組成物は、発熱物質を含まない、経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な水溶液は、ｐＨ、等張性、安定性などに相当な注意を払うことを条件として、当該分野の技術を用いて調製され得る。
【０１８１】
好ましい実施形態では、本発明のＨＳＶまたはそれを含む薬学的組成物は接種形態で投与され得る。本発明の弱毒化ＨＳＶを含む薬学的組成物の接種形態としては特に限定されず、公知の形態を用いることができるが、通常好ましくは、水溶液または懸濁液からなる注射剤として患者に接種される。前記注射剤には、輸液および栄養補充液なども含まれる。
【０１８２】
上記注射剤は、本発明の弱毒化ＨＳＶの他に、通常用いられる添加剤を含有していてもよい。前記添加剤としては特に限定されず、必要に応じて界面活性剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、無痛化剤、安定剤などの成分を配合することができる。界面活性剤としては例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、セスキオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸グリセリン、ラウロマクロゴールなど；乳化剤としては例えば、アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウムなど；懸濁剤としては例えば、モノステアリン酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロースなど；保存剤としては例えば、フェノール、硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノールなど；無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトールなど、安定剤としては例えば、クエン酸、酢酸、酒石酸、コハク酸などの緩衝剤、プロピレングリコール、ジエチリン、亜硫酸塩、アスコルビン酸、ロンガリットなどが挙げられる。
【０１８３】
また、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油脂、エチルオレイン酸などの有機エステルなど、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、弱毒化ＨＳＶの効果を強化する免疫賦活剤などを添加することもできる。
【０１８４】
本発明において、上記注射剤の製造方法は特に限定されず、通常用いられる装置および方法によることができる。注射剤は調製した後、フィルター濾過による除菌を行ってもよいし、必要ならば凍結乾燥などを行って、常法により皮下・筋肉内、静脈内、腫瘍内、腹腔内、気管内、膀胱内、腸内、直腸内、口内、眼内、動脈内などへ注射剤、点滴注射剤により注入される。
【０１８５】
また、上記注射剤は、注射直前に溶液に溶解するか、または懸濁するのに適する固形物に調製されてもよい。
【０１８６】
本発明の弱毒化ＨＳＶを含む薬学的組成物の、個々の場合における正確な投与量は、例えば投与方法、投与される患者の個体差、疾患の種類、投与するときの患者の状態などによっても異なるため一概にはいえないが、例えば注射剤としてヒトに投与する場合は、成人の場合約０．０１ｎｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ程度の弱毒化ＨＳＶを１日１〜数回に分げて投与できる。好ましくは、投与は、患者の状態をモニターしながら適宜調整され得る。
【０１８７】
本発明の弱毒化ＨＳＶとプロドラッグとを併用する場合は、公知方法に従って使用することができ、プロドラッグの投与経路、投与量は公知の方法に従って行うことができる。プロドラッグは、本発明の弱毒化ＨＳＶと同時に、または交互に使用することができる。
【０１８８】
本発明はまた、好ましくは、ワクチン形態で投与され得る。ワクチンとは、ある種の疾患（例えば、伝染病、感染症など）の予防（または治療）のため使用される抗原の諸形態（例えば、タンパク質、ＤＮＡ）をいう。感染、伝播、流行などの諸形式にしたがい、生きた弱毒病原体（生ワクチンｌｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ）、不活化病原体（またはその一部）、病原体代謝物（毒素、毒素の不活化物すなわちトキソイドなど）、ＤＮＡワクチンなどが使用される．ワクチン接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）により生物（ヒト・家畜・媒介動物）の体内に能動的につくられる免疫（体液性免疫、細胞性免疫、または両者）が病原体の感染、伝播、流行などを阻止する。
【０１８９】
本発明に係るワクチンの剤形は特に問わず、また、その製造も当該分野で用いられている自体公知の方法に従ってよい。本発明に係るワクチンは、上記ＨＳＶ遺伝子組換え体を含む生ワクチンとするのが好ましい。また、本発明に係るワクチンは、種々のアジュバントを含む乳濁液としてもよい。アジュバントは、上記ＨＳＶ遺伝子組換え体のみを投与した場合よりも、少ない量のＨＳＶ遺伝子組換え体を用いて、少ない投与量で、持続する高レベルの免疫性を持続させるのを助けるものである。アジュバントの例には、フロインドのアジュバント（完全または不完全）、アジュバント６５（落下生油、マンナイドモノオレエートおよびアルミニウムモノステアレートを含む）、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはミョウバンのごとき鉱物ゲルがある。ヒトおよび食用動物のためのワクチンには、アジュバント６５を用いるのが好ましい。また、商業的動物用ワクチンには、鉱物ゲルを用いるのが好ましい。
【０１９０】
本発明に係るワクチンには、上記アジュバントの他に例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を含有させてもよい。
【０１９１】
本発明に係るワクチンの投与経路は、特に限定されないが、非経ロ的に投与することが好ましい。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内の投与が挙げられる。
【０１９２】
本発明に係るワクチンの１回の投与量は、投与の目的がＨＳＶ感染より惹起される病気の予防であるか治療であるかにより、また感染が初感染か再感染かにより、さらに患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。再感染により惹起される病気の治療を目的とする場合、本発明に係るワクチンの投与量は、体重１ｋｇあたり約０．０１ｎｇ〜１０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１ｎｇ〜１ｍｇ／ｋｇ程度であり得る。
【０１９３】
本発明に係るワクチンの投与回数は、上記のような種々の条件により異なるので、一概には言えないが、日単位から週単位の間隔で繰り返して投与するのが好ましい。中でも、約２〜４週間程度の間隔で、数回、好ましくは約１〜２回程度投与するのが好ましい。疾患症候学または抗体価を用いる基本的な検査により疾患の状態をモニターしながら投与回数（投与時間）を決定するのがより好ましい。
【０１９４】
本明細書において、「疾患または障害」とは、本発明のウイルス構築物が有効である疾患または障害をいう。そのような疾患または障害としては、例えば、ヘルペスウイルスに関連する疾患または障害（例えば、歯肉口内炎、顔面ヘルペス、口唇ヘルペス、角膜結膜炎ヘルペス、ヘルペス脳炎、性器ヘルペス、新生児ヘルペス、水痘、帯状疱疹、伝染性単核症、バーキットリンパ腫、鼻咽腔がん、肺炎、巨細胞封入体症、突発性発疹、肺炎、カポジ肉腫、ＰＥＬ、キャッスルマン病）、がん（例えば、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、膀胱癌、尿道癌、大腸癌、皮膚癌、悪性メラノーマ、骨肉腫、頭頚部の扁平上皮癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、リンパ腫、肝癌、中皮腫、黒色腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽細胞腫、上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、神経髄芽細胞腫、線維肉腫、扁平上皮細胞癌、神経外胚葉細胞癌、甲状腺腫瘍、下垂体腫瘍、または類表皮癌腫など）、他の疾患または障害（例えば、他のウイルス（例えば、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ロタウイルスなど）または細菌（例えば、百日咳菌、ジフテリア菌、破傷風菌など）に起因する疾患または障害）、原核生物（例えば、淋菌、リステリアおよび赤痢菌など）および真核生物体（例えば、単細胞病原性生物体および多細胞寄生虫など）などが挙げられる。
【０１９５】
従って、本発明の単純ヘルペスウイルスおよび組成物は、上述のようながんを予防または治療するために用いることができる。好ましくは、進行性の膵臓癌、卵巣などの外科的切除、化学療法が困難な腹膜播種が存在するもの、固形腫瘍に対して用いられ得る。本発明は一つまたはそれ以上の癌のいくつかの形に対して個体を免疫するためにも使用され得るが、本発明は特定の癌が発現しやすい人または以前に癌を発病し、従って再発しやすい人のような個体を予防的に免疫するのにも利用され得る。遺伝学および技術ならびに疫学の発展は、個体における癌発生の可能性および危険事前評価の決定を可能にしている。遺伝子スクリーニングおよび／または家族健康履歴を用いて、特定の個人がいくつかの型の癌のどれか一つを発生する可能性を予測することが可能である。
【０１９６】
本発明の弱毒化ＨＳＶを含む薬学的組成物は、弱毒化ＨＳＶが効果を発揮する量を、適当な医薬用の担体その他の補助剤と組み合わせて常法により製剤化することで得ることができる。ここでいう「効果を発揮する量」または「有効量」とは、有効成分の種類、使用形態などにより異なるために一概にはいえないが、副作用が少なく目的とする効果を発揮する量が好ましい。
【０１９７】
本発明の弱毒化ＨＳＶを含む薬学的組成物の接種形態としては特に限定されず、公知の形態を用いることができるが、通常好ましくは、水溶液または懸濁液からなる注射剤として患者に接種される。前記注射剤には、輸液および栄養補充液なども含まれる。
【０１９８】
上記注射剤は、本発明の弱毒化ＨＳＶの他に、通常用いられる添加剤を含有していてもよい。前記添加剤としては特に限定されず、必要に応じて界面活性剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、無痛化剤、安定剤などの成分を配合することができる。界面活性剤としては例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、セスキオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸グリセリン、ラウロマクロゴールなど；乳化剤としては例えば、アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウムなど；懸濁剤としては例えば、モノステアリン酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロースなど；保存剤としては例えば、フェノール、硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノールなど；無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトールなど、安定剤としては例えば、クエン酸、酢酸、酒石酸、コハク酸などの緩衝剤、プロピレングリコール、ジエチリン、亜硫酸塩、アスコルビン酸、ロンガリットなどが挙げられる。
【０１９９】
また、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油脂、エチルオレイン酸などの有機エステルなど、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、弱毒化ＨＳＶの効果を強化する免疫賦活剤などを添加することもできる。
【０２００】
本発明において、上記注射剤の製造方法は特に限定されず、通常用いられる装置および方法によることができる。注射剤は調製した後、フィルター濾過による除菌を行ってもよいし、必要ならば凍結乾燥などを行って、常法により皮下・筋肉内、静脈内、腫瘍内、腹腔内、気管内、膀胱内、腸内、直腸内、口内、眼内、動脈内などへ注射剤、点滴注射剤により注入される。
【０２０１】
また、上記注射剤は、注射直前に溶液に溶解するか、または懸濁するのに適する固形物に調製されてもよい。
【０２０２】
本発明の弱毒化ＨＳＶを含む薬学的組成物の、個々の場合における正確な投与量は、例えば投与方法、投与される患者の個体差、疾患の種類、投与するときの患者の状態などによっても異なるため一概にはいえないが、例えば注射剤としてヒトに投与する場合は、成人の場合約０．０１ｎｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ程度の弱毒化ＨＳＶを１日１〜数回に分げて投与できる。
【０２０３】
本発明の弱毒化ＨＳＶとプロドラッグとを併用する場合は、公知方法に従って使用することができ、プロドラッグの投与経路、投与量は公知の方法に従って行うことができる。プロドラッグは、本発明の弱毒化ＨＳＶと同時に、または交互に使用することができる。
【０２０４】
本明細書において、「プロドラッグ」とは、そのままの形では不活性であるが，生体内で薬物代謝酵素によって化学的変化をうけてはじめて活性を示すような薬物をいう（例えば、がんの化学療法剤として用いられるプリンおよびピリミジン誘導体）。本明細書において好ましいプロドラッグは、ガンシクロビル、アシクロビル、タキソール、カンプトテシン、グアニンヌクレオシド誘導体などが挙げられる。本発明における好ましいプロドラッグとしては、本発明において用いられる弱毒化ＨＳＶが含有している自殺遺伝子によって活性型に変換されるプロドラッグである。
【０２０５】
本明細書において、「自殺遺伝子」とは、発現すると、自己を殺傷することができる遺伝子をいい、代表的には、代謝毒性遺伝子が挙げられる。本明細書では、自殺遺伝子をウイルス構築物に導入して腫瘍細胞を自殺に追いやる方法が挙げられ、より具体的には単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼを導入し得る。
【０２０６】
本明細書において、「癌細胞選択性を有する」とは、正常細胞における増殖速度よりも、癌細胞における増殖速度の方が勝ることを意味する。
【０２０７】
本発明はまた、免疫調節タンパク質とともに提供され得る。本明細書において、「免疫調節タンパク質」とは、免疫応答を促進および／または調節するタンパク質および核酸分子発現産物をいう。従って、好ましい実施形態において、免疫調節タンパク質は免疫療法剤としてまたはワクチン中の成分として送達され得る。
【０２０８】
免疫調節タンパク質にはケモカイン、接着分子、サイトカイン、共刺激分子、増殖因子およびレセプター分子が含まれる。免疫調節タンパク質であるケモカインにはＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥｓ、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１が含まれる。接着分子にはセレクチンファミリー構成物、ムチン様分子、インテグリンファミリー構成物およびイムノグロブリンスーパーファミリー構成物が含まれる。セレクチンファミリー構成物にはＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンが含まれる。ムチン様分子はセレクチンファミリー構成物のリガンドである。ムチン様分子にはＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１が含まれる。インテグリンファミリーの構成物にはＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５が含まれる。イムノグロブリンスーパーファミリー構成物にはＰＥＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ類（ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３）、ＣＤ２およびＬＦＡ−３が含まれる。サイトカインにはＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＩＬ−１８の変異体（タンパク質の前形には存在するが成熟形態には存在しない最初の約３５アミノ酸残基の欠失を含む）が含まれる。共刺激分子にはＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）が含まれる。増殖因子には血管増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子および血管内皮細胞増殖因子が含まれる。レセプター分子にはＦａｓ致死遺伝子発現産物、腫瘍壊死因子ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６が含まれる。カスパーゼ（ＩＣＥ）もまた、本発明の組成物に存在し得る。
【０２０９】
本発明のある実施形態では、免疫調節タンパク質は核酸分子（それは細胞に取り込まれた場合、発現されて免疫調節タンパク質を発現する）を投与することにより送達される。本発明のいくつかの態様では、免疫調節タンパク質はタンパク質それ自身を投与することにより送達される。本発明のいくつかの態様では、免疫調節タンパク質は核酸かまたはタンパク質を投与することにより送達される。本発明のある実施形態では、免疫調節タンパク質は核酸およびタンパク質を同時に投与することにより送達される。
【０２１０】
本発明のいくつかの実施形態では、上述の免疫調節タンパク質（タンパク質またはタンパク質をコードしている核酸分子として）は組成物またはさもなくばワクチン組成物とともに補給物として投与される。ここで、ワクチンは、サブユニット、不活化ワクチン、弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組換え体ワクチン、核酸またはＤＮＡワクチンのいずれかである。弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組換え体ワクチン、または核酸またはＤＮＡワクチンの場合、免疫調節タンパク質はこれらのワクチンの核酸分子によりコードされる。
【０２１１】
本明細書において、ヘルペスウイルス以外の病因因子（例えば、ウイルス（例えば、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ロタウイルスなど）または細菌）を処置または予防するための組成物（例えば、ワクチン）が提供される。そのような組成物は、本発明の弱毒化ヘルペスウイルスに外来遺伝子としてその病因因子の遺伝子を少なくとも１つ含む。含まれる外来遺伝子は、全長が好ましいが、免疫を惹起し得るエピトープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。本明細書において、「エピトープ」とは、構造の明らかな抗原決定基をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。エピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。
【０２１２】
そのような外来遺伝子としては、例えば、ＨＩＶの場合、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１７マトリクスタンパク質、ｐ２４カプシドタンパク質、逆転写酵素（ＨＩＶ ｐｏｌ）、ｔａｔ ｒｅｖなどが挙げられるがそれらに限定されない。ロタウイルスの場合、ＶＰ４、ＶＰ６、およびＶＰ７などが挙げられるがそれらに限定されない。インフルエンザウイルスの場合、ＨＡ、ＮＡ、およびＮＰなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２１３】
免疫調節タンパク質は細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘導および促進し、および／または抗体応答を誘導および促進し、および／またはＴ細胞増殖応答を誘導および促進するのに有用である。
【０２１４】
ＣＴＬ応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、細胞内病原体に対する、または自己免疫疾患または癌に関して、ワクチンとともにまたはその一部として投与された場合に特に有用である。ＣＴＬ応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組換え体ワクチン、および核酸／ＤＮＡワクチンとともに投与された場合に特に有用である。もしくは、ＣＴＬ応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、癌または細胞内感染を患っている患者に投与される免疫療法剤として有用である。ＣＴＬ応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は免疫無防備状態の患者に投与された場合に有用である。
【０２１５】
本明細書において、対象となる疾患の宿主は、ヘルペスウイルスが感染し得る動物であればどの動物でもよく、例えば、霊長類（例えば、サル、ヒト）、ウシ（肉牛、乳牛）、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、ニワトリなどが挙げられる。好ましくは、その宿主は、霊長類であり、より好ましくは、ヒトである。
【０２１６】
本明細書において、対象となる宿主の年齢は、ヘルペスウイルスが感染し得る年齢であれば、どのような年齢でもよく、例えば、高齢者、成人、小児、乳児、胎児などが挙げられる。
【０２１７】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、複製非必須遺伝子が不活化されたヘルペスウイルスを提供する。より詳細には、本発明は、ＵＬまたはＵＳ領域に存在する複製非必須遺伝子が不活化されたヘルペスウイルスを提供する。従来、inverted repeat領域の遺伝子を改変することによって特性が改変されたヘルペスウイルスが利用されていたが、臨床レベルでヘルペスウイルスに起因する疾患またはがんに有効なものが提供されているとはいえない。従って、ＵＬまたはＵＳ領域に存在する複製非必須遺伝子を不活化することによって、所望の特性（例えば、弱毒化、癌細胞への選択性、宿主（例えば、ヒト）への安全性の上昇など）を得ることができたことにより従来技術にない有利な有用性が提供される。
【０２１８】
１つの実施形態において、本発明に係るワクチンは、ＵＳ３を発現しないＨＳＶ遺伝子組換え体を含有することを特徴とする。かかる組換え体としては、例えばＨＳＶ遺伝子のうちＵＳ３遺伝子が翻訳されないよう処理が施されている遺伝子組換え体、またはＨＳＶ遺伝子のうちＵＳ３遺伝子を組換え、該組換えられた遺伝子が翻訳されるとＵＳ３とは異なるタンパクが発現する遺伝子組換え体などが挙げられる。
【０２１９】
上記遺伝子組換え体を作製するための遺伝子組換え処理としては、特に限定されない。例えば、ＵＳ３遺伝子の全部または一部を欠損させる処理、ＵＳ３遺伝子の全部または一部を置換させる処理、ＵＳ３遺伝子の一部を逆位させる処理、ＵＳ３遺伝子の一部を重複させる処理、ＵＳ３遺伝子の一部を転座させる処理、ＵＳ３遺伝子に遺伝子断片を挿入しＵＳ３遺伝子を中断させる処理などが挙げられる。中でも、ＵＳ３遺伝子の全部または一部を欠損させる処理、ＵＳ３遺伝子の全部または一部を置換させる処理、またはＵＳ３遺伝子に遺伝子断片を挿入しＵＳ３遺伝子を中断させる処理が好ましい。特に、ＵＳ３遺伝子に遺伝子断片を挿入しＵＳ３遣伝子を中断させる処理がより好ましく、挿入する他の遺伝子には、翻訳を停止させるシグナルが含有されていることがさらに好ましい。翻訳を停止させるシグナルとしては、中でもＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルが好ましい。
【０２２０】
上記遺伝子組換え処理は、当該分野で十分確立されているので、それにしたがって容易に行うことができる。例えば、市販の実験書、例えば、１９８２年発行のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９年発行のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ等に記載された方法に従って容易に行うことができる。
【０２２１】
本発明で用いる「ＵＳ３を発現しないＨＳＶ遺伝子組換え体」としては、Ｌ１ＢＲ１が挙げられる。Ｌ１ＢＲ１は、ＨＳＶ−２ １８６株を用いて作製される。その作製方法を、図１０を用いて以下に説明する。
【０２２２】
ＨＳＶ−２ １８６株の遺伝子を、地図単位を付して図１０のＡに示した。また、同株のＨｉｎｄ ＩＩＩの切断地図を図１０のＢに示した。図１０のＣおよびＤから明らかなように、ＵＳ３遺伝子は、ＵＳ領域である９．６ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｌ断片（図１０のＢ）中に存在する。また、ＵＳ領域の塩基情報から、９．６ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｌ断片中のＢｇｌ ＩＩによる切断部位（図１０Ｃ中のＧ）はＵＳ３遺伝子中に含まれている（図１０のＣおよびＤ）。そこで、このＢｇｌ ＩＩによる切断部位を利用してＵＳ３遺伝子を不活化させ、ＵＳ３欠損ＨＳＶを作製する。
【０２２３】
なお、ＨＳＶ−２ １８６株のＢａｍ ＨＩ、Ｘｂａ Ｉ、Ｂａｌ ＩＩによる制限エンドヌクレアーゼ切断パターン（図１０のＣ）は、ＨＳＶ−２種ＨＧ５２株と一致していることは公知である（ＭｃＧｅｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。
【０２２４】
より具体的には、ＨＳＶ−２ １８６株の遺伝子から、４．８ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｘｂａ Ｉ断片を前クローニングする。前クローニングの方法は、例えば、ｐＬＨＸなどのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのような公知のクローニングベクターを用いて自体公知の方法に従って行えばよい。
【０２２５】
次いで、上記前クローニングされたＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｘｂａ Ｉ断片をＢｇｌ ＩＩで消化し、１４４３ｂｐの読み取り枠を、５’末端から２１５残基のところで切断する。切断された部分に、図１０のＥで示される４．３ｋｂの遺伝子断片を挿入する。図１０のＥで示される遺伝子断片は、具体的には５’末端にＨＳＶ−１β８プロモーターおよび３’末端にＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルを融合させたｌａｃ Ｚコードしている遺伝子をふくむ４．３ｋｂのＢａｍ ＨＩ断片である。ＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルによって、ｌａｃ Ｚ遺伝子の翻訳が停止する（Ｓｐａｅｔｅ ａｎｄ Ｍｏｃａｒｓｋｉ，１９８５；Ｈｏ ａｎｄ Ｍｏｃａｒｓｋｉ，１９８８）。
【０２２６】
このようにして得られたｌａｃ Ｚ遺伝子により中断されているＵＳ３遺伝子を有する遺伝子、すなわち図１０のＣで示される遺伝子断片の「Ｇ」の位置に、Ｅで示される遺伝子断片が挿入された遺伝子を公知の方法でクローニングする。なお、公知のクローニングベクターであるｐＬＨＸに、かかる遺伝子を挿入した遺伝子組換え体をｐＨＺＬ１と称する。
【０２２７】
ついで、感染性のＨＳＶ−２ １８６株の完全ＤＮＡおよびｌａｃ Ｚ遺伝子により中断されているＵＳ３遺伝子を含有する線状ｐＨＺＬ１のＤＮＡをベロ細胞にコトランスフェクション（同時細胞導入）する。同時に導入された２種のＤＮＡが組換えを起こし、ベロ細胞中でＨＳＶ遺伝子組換え体が増殖する。ｌａｃ Ｚ遺伝子により中断されているＵＳ３遺伝子を含有するＨＳＶ遺伝子組換え体は、Ｘｇａｌ染色によるプラークの色で選択することができる。すなわち、ｌａｃ Ｚ遺伝子はβ−ガラクトシダーゼをコードしており、ＨＳＶ遺伝子組換え体ｌａｃ Ｚ遺伝子が含まれていると、β−ガラクトシダーゼが発現し、かかる酵素によりβ−ガラクトシダーゼの基質であるＸｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）が濃青色の分解産物を生じるので、青色のプラークを選択すれぱｌａｃ Ｚ遺伝子を含有するＨＳＶ遺伝子組換え体を選択することができる。選択された遺伝子組換え体のうち１つを６回プラーク精製し、ベロ細胞中で増殖させて、Ｌ１ＢＲ１を作製する。
【０２２８】
上記遺伝子組換え体であるＬ１ＢＲ１が、ＵＳ３遺伝子を中断するようｌａｃ Ｚ遺伝子を含んでいるかどうかを調べるためには、野生型ＨＳＶ−２ １８６株の遺伝子と比較すればよい。具体的には、Ｌ１ＢＲ１遺伝子を制限酵素処理し、プローブとしてＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｌ断片中の１．６ｋｂのＢａｍ ＨＩ断片を用いてサザンブロットハイブリダイゼーション分析を行う。野生型ＨＳＶ−２ １８６株の遺伝子も同様の処理を行う。その結果、野生型遺伝子で観察される１．６ｋｂの断片が、Ｌ１ＢＲ１遺伝子で喪失していれば、ＵＳ３遺伝子を中断するようｌａｃ Ｚ遺伝子を含んでいることが確認できる。
【０２２９】
本発明の弱毒化ＨＳＶは、癌細胞において優位に増殖しうる、癌細胞選択性を有していることが好ましい。
【０２３０】
別の実施形態において、１つまたは２つ以上のアクセサリー遺伝子が不活化されている弱毒化ＨＳＶとしては、例えば、ＵＬ３９またはＵＬ４０が不活化されているものを挙げることができ、なかでも、ＵＬ３９またはＵＬ４０と、１つまたは２つ以上の他のアクセサリー遺伝子とが不活化されているものが好ましい。
【０２３１】
ＵＬ３９またはＵＬ４０が不活化されている弱毒化ＨＳＶは、この遺伝子にコードされておりＤＮＡ合成に必要なリボヌクレオチドレダクターゼを宿主に依存しなければならない。このため、ＵＬ３９またはＵＬ４０が不活化されている弱毒化ＨＳＶを癌患者に接種すると、増殖が盛んな癌細胞において優位に増殖させることができる。このような弱毒化ＨＳＶに感染された癌細胞は、ウイルスが保有する様々なタンパク質の細胞障害作用によって増殖が抑制され、更には死滅してしまうこともある。
【０２３２】
ＵＬ３９またはＵＬ４０に加えて、１つまたは２つ以上の他のアクセサリー遺伝子が不活化されていると、癌細胞における優位の増殖性を維持しうるとともに宿主に対する病原性を更に減弱することができる。
【０２３３】
ＵＬ３９またはＵＬ４０と、１つまたは２つ以上の他のアクセサリー遺伝子とが不活化されている弱毒化ＨＳＶとしては、例えば、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ５５およびＵＬ５６が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＬ２が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＳ３が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ２およびＵＳ３が不活性されている弱毒化ＨＳＶ等を挙げることができる。
【０２３４】
ＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ５５およびＵＬ５６が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、またはＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＬ２が不活化されている弱毒化ＨＳＶは、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）のみが不活化されている弱毒化ＨＳＶよりも、さらに高い安全性を有する。一方、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＳ３が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、またはＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ２およびＵＳ３が不活化されている弱毒化ＨＳＶは、高い癌細胞選択性に加えて癌細胞のアポトーシスを引き起こす機能を併せ持つことができる。
【０２３５】
本発明に係るワクチンは、上記したようなＨＳＶより惹起される病気の予防治療剤として有用である。特に、本発明に係るワクチンは、ＨＳＶに起因する性感染症（例えば、陰部ヘルペス）の予防治療剤として有用である。
【０２３６】
本発明に係るワクチンを投与することにより、ＨＳＶ感染の重篤度および／またはＨＳＶ感染率を減少させることができる。
【０２３７】
後述する実施例からも明らかなように、本発明に係るワクチンに含まれるＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体は、Ｆａｓ＋単核細胞数を増加させ、また樹状細胞、貪食細胞およびＴ細胞を急速に活性化させる。さらに、該組換え体は、抗ウイルス性サイトカインであるＩＬ−１２を増加させ、またＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）をも増加させ、その刺激によりＴｈ１細胞が活性化され、細胞性免疫が活性化される。このように、ＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体を含有する本発明に係るワクチンを投与することにより、ＨＳＶ感染に対する免疫機能が賦活され、上述のようにＨＳＶ感染の重篤度および／またはＨＳＶ感染率を減少させることができる。
【０２３８】
最近、単純ヘルペスウイルス１型（以下、ＨＳＶ−１という）およびＨＳＶ−２のＵＳ３遺伝子は感染細胞におけるアポトーシス阻害に必要であることが示されている（Ｌｅｏｐａｒｄｉ，Ｒ．，Ｖａｎ Ｓａｎｔ，ａｎｄ Ｒｏｉｚｍａｎ Ｂ．（１９９７）． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４，７８９１−７８９６．；Ａｓａｎｏ，Ｓ．，Ｈｏｎｄａ，Ｔ．，Ｇｏｓｈｉｍａ，Ｆ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｄ．，Ｍｉｙａｋｅ，Ｙ．，Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．（１９９９）． Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０，５１−５６）。したがって、ＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体は、感染細胞のアポトーシス阻害を引き起こさないという利点も有する。すなわち、ＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体を投与した場合は、感染細胞が直ちにアポトーシスを起こし、ＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体の過剰増殖を抑制できるとともに、アポトーシスした感染細胞が抗原提示の役割を果たし、ＨＳＶ感染に対する免疫賦活化がより一層増強される。
【０２３９】
別の実施形態において、本発明に係る弱毒化単純ヘルペスウイルス（以下弱毒化ＨＳＶともいう）は、複製非必須遺伝子のうち、ＵＳ３遺伝子、および／または病原性関連遺伝子であるとされるＵＬ５６遺伝子のＤＮＡ塩基配列の一部あるいは全部が欠損、あるいは塩基配列の置換、修飾もしくは挿入などによって不活化されたものが用いられる。また、ＵＳ３遺伝子および／またはＵＬ５６遺伝子の転写を制御することにより不活化させたものも用いることができる。
【０２４０】
本発明で用いられる１つの好ましい弱毒化ＨＳＶはＨＦ株より採取されたクローンの一つであるクローン１０（ＭＮＯ１０）であり、該クローンはヘルペスウイルスのゲノム上１１６５１５〜１２０３４６の位置に３８３２ｂｐの欠失が存在し、ＵＬ５６の全１９７アミノ酸のＮ末端側１３６アミノ酸、およびその上流を欠いている。ＭＮＯ１０は、名古屋大学医学部病態制御研究施設ウイルス感染研究部門において、特許法によって要求されている該菌の保存および分譲が保証されており、容易に入手することができる。
【０２４１】
本発明に係る弱毒化ＨＳＶは、ＨＳＶ−１を用いて作製されたものでもよく、あるいはＨＳＶ−２を用いて作製されたものであってもよい。
【０２４２】
弱毒化ＨＳＶのＵＳ３および／またはＵＬ５６遺伝子を不活化する方法としては特に限定されず、例えば他の配列の挿入、一部の配列の切除、塩基の修飾、塩基の置換などの公知の方法を挙げることができる。
【０２４３】
ＵＳ３遺伝子および／またはＵＬ５６遺伝子が不活化することにより、本発明の弱毒化ＨＳＶを癌細胞において優位に増殖させることができる。さらに標的とする癌細胞において自殺遺伝子を効率的に発現させることができ、ひいては抗癌作用をより効果的に作用させることができる。
【０２４４】
本発明のＵＳ３遺伝子および／またはＵＬ５６遺伝子が不活化されている弱毒化単純ヘルペスウイルスは、当該ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグと組み合わせ、または組み合わせずに単独で癌の治療に使用される。
【０２４５】
本発明の弱毒化ＨＳＶは、好ましい実施形態において、チミジンキナーゼ遺伝子を含有していることから、プロドラッグであるガンシクロビルを投与すると、ガンシクロビルがチミジンキナーゼによってリン酸化され活性型となり、弱毒化ＨＳＶは、癌細胞のＤＮＡポリメラーゼとともに、ＤＮＡ中に取り込まれてＤＮＡ合成、ＤＮＡ依存性ＲＮＡ合成を阻害する。このような働きを行う遺伝子を自殺遺伝子とよび、本発明においては上記のチミジンキナーゼ遺伝子の他に、外来性の自殺遺伝子を発現可能なように組み込んでもよい。
【０２４６】
上記外来性の自殺遺伝子としては、プロドラッグを活性型に変換することができるものであれば特に限定されず、例えばシトシンデアミナーゼ遺伝子、大腸菌ｇｐｔ遺伝子、大腸菌ｄｅｏＤ遺伝子、カルボキシエステラーゼ遺伝子などを挙げることができる。
【０２４７】
別の好ましい実施形態では、本発明は、ＵＳ３欠損ＨＳＶ−２ウイルスを提供する。
【０２４８】
本発明は、ワクチン組成物（ＤＮＡワクチン、弱毒化生ワクチンおよび組換え体ワクチンを含む）の一部として個体の細胞へ遺伝子構築物を送達する工程を包含する、個体を免疫化する改良された方法を提供する。遺伝子構築物は免疫調節タンパク質をコードしおよびそれが発現を達成するためにワクチン中で機能できる制御配列へ作動可能なように連結されているヌクレオチド配列を包含する。改良されたワクチンは高められた細胞性免疫応答を生じる。
【０２４９】
本発明のＵＳ３および／またはＵＬ５６が不活化されている弱毒化単純ヘルペスウイルスは、当該ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグと組み合わせ、または組み合わせずに単独で癌の治療に使用される。
【０２５０】
プロドラッグとしては、例えばガンシクロビル、アシクロビル、タキソール、カンプトテシンなどが挙げられる。本発明におげる好ましいプロドラッグとしては、本発明において用いられる弱毒化ＨＳＶが含有している自殺遺伝子によって活性型に変換されるプロドラッグである。
【０２５１】
本発明の弱毒化ＨＳＶはチミジンキナーゼ遺伝子を含有していることから、プロドラッグであるガンシクロビルを投与すると、ガンシクロビルがチミジンキナーゼによってリン酸化され活性型となり、さらに弱毒化ＨＳＶは、癌細胞のＤＮＡポリメラーゼとともに、ＤＮＡ中に取り込まれてＤＮＡ合成、ＤＮＡ依存性ＲＮＡ合成を阻害する。このような働きを行う遺伝子を自殺遺伝子とよび、本発明においては上記のチミジンキナーゼ遺伝子の他に、外来性の自殺遺伝子を発現可能なよ
上記外来性の自殺遺伝子としては、プロドラッグを活性型に変換することができるものであれば特に限定されず、例えばシトシンデアミナーゼ遺伝子、大腸菌ｇｐｔ遺伝子、大腸菌ｄｅｏＤ遺伝子、カルボキシエステラーゼ遺伝子などを挙げることができる。
実施例
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。なお、％は、特に断りのない限り重量％を示す。
【実施例】
【０２５２】
（実施例１ 弱毒化ＨＳＶ（ＵＬ３９不活化ＨＳＶ）の作製）
ＨＳＶ−１のＵＬ３９遺伝子を含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）ヘクローニングし、そのオープンリーディングフレームを分割する形でｌａｃＺカセット（ＨＳＶ ＵＬ３９プロモーターを５’端に、大腸菌のｌａｃＺ遺伝子とＳＶ４０のｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌをその下流に有するＤＮＡ断片）を挿入したＤＮＡを作製した。このＤＮＡと、感染細胞より調製した感染性ＨＳＶ ＤＮＡとを細胞にトランスフェクトし、その３日後に産生されてきたウイルスを採取した。その中でＸ−ｇａｌ存在下にて青色に染色されるプラークを採取し、更に３回プラーククローニングを行った後、Ｖｅｒｏ細胞で増殖させストックとした。この変異株に対してＳｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ等を行い、ＵＬ３９が不活化されていることを確認した。
【０２５３】
（実施例２：ＤＮＡ複製に関しない遺伝子の不活化弱毒化ＨＳＶであるＵＬ３９およびＵＬ５６不活化ＨＳＶ（Ｈｈ）の作製）
ＵＬ５６遺伝子を含む領域が欠損しているＨＳＶ−１由来の株ＨＦを用意する（名古屋大学医学部Ｉｓｏｍｕｒａ Ｓｈｉｎ博士から入手した）。この株は野生株に比べ、マウスにおける腹腔接種での病原性が著しく低く、かつ、感染細胞に細胞融合を起こす。上記のＵＬ３９欠損ウイルスとＨＦ株とをＶｅｒｏ細胞に混合感染させ、子ウイルスの中から細胞融合を起こし、かつ、Ｘ−ｇａｌ存在下で青色プラークを作るウイルスを採取した。クローニングした後、ＰＣＲ、塩基配列の決定およびＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにより、ＵＬ３９およびＵＬ５６に欠損があることを確認した。
【０２５４】
（実施例３：ＵＬ３９不活化ＨＳＶにカルボキシエラスターゼが組み込まれた株の作製）
ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子のプロモーターをもつヒトカルボキシエステラーゼ遺伝子をｌａｃＺ遺伝子（オープンリーディングフレーム）を分割する形で挿入したＤＮＡを作製した。このＤＮＡとｌａｃＺを持つＵＬ３９不活化ウイルス由来の感染性ＤＮＡをＶｅｒｏ細胞にトランスフェクトし、産生されてくるウイルスを採取した。Ｘ−ｇａｌ存在下で無色のプラークを作るウイルスを採取し、プラーククローニングを行い、第一次ストックとした。第一次ストックとして得られた各々のクローンについて、感染細胞標本を作製し、タッグ抗体を用いて蛍光抗体法を行い、陽性のクローンに関して第二次ストックを作製した。最終的に得られたクローンについて、感染細胞におけるカルボキシエステラーゼ活性の誘導を確認した。
【０２５５】
（実施例４：ＵＬ５６不活化ＨＳＶ−１の分離）
ＵＬ５６遺伝子を含む領域を欠損しているＨＳＶ−１ウイルスをＨＦ株から分離した。このＨＳＶ−１ ＨＦ株由来クローン１０（ＭＮＯ１０：名古屋大学医学部病態制御研究施設ウイルス感染研究部門にて保管）は、ＰＣＲ、塩基配列の決定およびウエスタン分析を行うことにより、ＵＬ５６遺伝子が欠損していることを確認した。
【０２５６】
（実施例５：多核巨細胞を形成する能力を有する弱毒化ＨＳＶ（ＨＲ５２２）の作製）
実施例１で作製したＵＬ３９弱毒化ＨＳＶと、実施例４で分離したＵＬ５６遺伝子を含む領域を欠損しているＨＳＶ−１ ＨＦ株由来クローン１０とをベロ細胞（理化学研究所細胞バンク、つくば、茨城、日本）に混合感染し、ＵＬ３９弱毒化ＨＳＶのマーカーであるＸ−ｇａｌの存在下で青いプラークを作る能力と、ＨＦ ＭＮＯ１０のマーカーである多核巨細胞を形成する能力の両方を持つクローンを選択した。確認のために、表現型により分離した。ＬａｃＺを発現し（ＲＲ−を意味する）、感染細胞に多核巨細胞を形成する特徴を有するものを分離した。この混合感染により得られたクローンをＨＲ５２２と命名した。
【０２５７】
（実施例６ 弱毒化ＨＳＶを用いた癌治療）
エ一テル麻酔下に各群１０匹のヌードマウス（雌性、６週齢）の腹腔内にヒト卵巣癌由来のＳＷ１９９０を１×１０７ずつ膵近傍により注入し移植した。移植後７日目および１２日目に腹腔内にＵＬ３９不活化ＨＳＶまたはＨＲ５２２を１×１０７ＰＦＵ／１匹ずつ、それぞれ２群に注入した。ＵＬ３９不活化ＨＳＶまたはＨＲ５２２接種後１０日目（即ち、移植後１７日目および２２日目）に、ＵＬ３９不活化ＨＳＶ接種群およびＨＲ５２２接種群のうちのそれぞれ１群に、０．４ｍｇ／１匹のガンシクロビルを投与した。それぞれの群の生存率を移植後６０日目まで観察し、結果を図１に示した。
【０２５８】
図１に示された結果より、ＵＬ３９不活化ＨＳＶおよびＨＲ５２２を接種することにより、ヌードマウスの生存期間が延長することが明らかとなった。また、さらに、ガンシクロビルを投与することによって生存期間がより一層延長することが明らかとなった。なかでも、ＨＲ５２２接種＋ガンシクロビル投与群の生存率が高かった。
【０２５９】
（実施例７ 弱毒化ＨＳＶと公知の抗ガン剤との比較）
エーテル麻酔下に各群１０匹のヌードマウス（雌性、６週齢）の腹腔内にヒト卵巣癌由来のＳＷｌ９９０を１×１０７ずつ膵近傍により注入し移植した。移植後７日目および１２日目に、それぞれ１群ずつ、腹腔内にＵＬ３９不活化ＨＳＶもしくはＨＲ５２２を５×１０７ＰＦＵ／１匹ずつ注入するか、または、公知の抗ガン剤としてタキソールを０、４ｍｇ／１匹投与した。それぞれの群の生存率を移植後６０日目まで観察し、結果を図２に示した。
【０２６０】
図２に示された結果より、ＵＬ３９不活化ＨＳＶおよびＨＲ５２２を接種した群の方が、タキソールを投与した群より生存期間が延長することが明らかとなった。
【０２６１】
（実施例８ ＵＳ３欠損ウイルスの作製）
（マウスおよびウイルス）
雌のＢＡＬＢ／ｃマウスは日本ＳＬＣ（浜松、日本）から購入し、処置開始時には生後８〜１０週間であった。すべてのマウスをゲージに収容し、画一的に推奨されているガイドラインに沿って扱った。「Ｄａｉｋｏｋｕ，Ｔ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｙ．，Ｔｓｕｒｕｍｉ，Ｔ．，Ｍａｅｎｏ，Ｋ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．（１９９３）． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７，６８５−６９４．」に記載されている方法でＵＳ３を発現しないＨＳＶ−２ １８６の遺伝子組換え体を作製した（以下、Ｌ１ＢＲ１と称する）。また、比較例として、ＨＳＶ−２ １８６野生株（以下単に１８６野生株という）およびＵＳ２欠損変異体であるＹＹ２を用いた。かかる３種のウイルスをベロ細胞中で生育させ、使用するまで−８０℃で保管した。ウイルス感染価はベロ細胞で測定し、プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌで表わす。
【０２６２】
（ＨＳＶ感染方法）
「Ｐａｒｒ，Ｍ．Ｂ．，Ｋｅｐｐｌｅ，Ｌ．，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｍ．Ｒ．，Ｄｒｅｗ．Ｍ．Ｄ．Ｂｏｚｚｏｌａ，Ｊ．Ｊ．，ａｎｄ Ｐａｒｒ，Ｅ．Ｒ．（１９９４）． Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７０，３６９−３８０．」、および「Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ．Ｎ．，ａｎｄ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｉ．（１９９７）． Ｖｉｒｏｌ．２２９，２５９−２６８．」に記載された方法によって、マウスの膣内にウイルス接種した。ウイルス接種前に、すみやかにプロゲステロン優勢段階で発情周期を連動させるため、すべてのマウスにβ−エストラジオール １７−シピノサイト（β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ １７−ｃｙｐｉｏｎａｔｅ）（以下、Ｅと略す）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を０．１μｇ／マウス、および翌日以降はデポープロペラ（Ｄｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａ）（以下、ＤＰと略す。）（Ｓｉｇｍａ）２ｍｇ／マウスを皮下注射した。ＤＰ投与の５日後、ぺントバルビタール（ｐｅｎｔｂａｒｂｉｔａｌ）ナトリウムをガーゼで塗布し、マウスを麻痩させ、１８６野生株、ＹＹ２またはＬ１ＢＲ１の懸濁液２０μｌを用いて、それぞれのウイルスを膣内に感染させた。
【０２６３】
（ウイルス感染価測定法）
ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を膣にピペットで移すことで膣損傷（ｖａｇｉｎａｌ ｒａｖａｇｅ）を生じさせ、その後、「Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ．Ｎ．，ａｎｄ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｉ．（１９９７）． Ｖｉｒｏｌ．２２９，２５９−２６８．」に記載された方法に従って、ベロ細胞単分子層上でのプラーク形成による感染価の測定まで−８０℃で貯蔵した。
【０２６４】
（膣内での細胞調製）
膣由来のＭＮＣ（単核細胞）およびＥＣ（上皮細胞）は、「Ｒａｋａｓｚ，Ｅ．，Ｈａｇｅｎ．Ｍ．，Ｓａｎｄｏｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ｌｙｎｃｈ，Ｒ．Ｇ．（１９９７）．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，１６１−１６７」に記載の方法に改変を加えた「Ｉｎａｇａｋｉ−Ｏｈａｒａ，Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．，Ｓａｋａｉ，Ｔ，，Ｌｙｎｃｈ，Ｄ，Ｈ．，ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｋａｉ．Ｙ，（１９９７）．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７７，４２１−４２９．」に記載の方法に従い得た。手短に、致死性の麻酔後膣をマウスから切除し、２ｍｍ断片に切断し、４Ｕ／ｍｌＤＮａｓｅＩ含有ハンクス平衡塩溶液で３７℃６０分間インキュベートした。振盪後、懐死組織片を取り除くために細胞懸濁液をナイロンウールカラムに通し、単細胞の懸濁液を得た。通過細胞を２０分間２０℃で６００×ｇの遠心力で４０％／７５％あるいは２５％／４０％の不連続なＰｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）勾配で遠心分離した。ＭＮＣおよびＥＣはそれぞれ４０％／７５％および２５％／４０％のインターフェイスから集められた。タイムコース間でのＨＳＶ感染後、毎日５匹のマウスから単離された細胞を下記の実験のためにプールした。
【０２６５】
（フローサイトメトリー法）
細胞は、「Ｉｎａｇａｋｉ−Ｏｈａｒａ，Ｋ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｎ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．，Ｓａｋａｉ，Ｔ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｈｉｒｏｍａｔｓｕ，Ｋ．，Ａｗａｙａ，Ａ．，ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｋａｉ，Ｙ，（１９９６）。Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１，３０−４０．」に記載された方法により染色した。本発明で使用されたモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入され、下記にそれを記す；ＦＩＴＣ−抱合型抗ＣＤ３ ｍＡｂ（１４５−２ Ｃ１１）、抗ＣＤ１１ｂ ｍＡｂ（Ｍ１／７０）、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（３／２３）、抗ＩＡｄｍＡｂ（ＡＭＳ−３２．１）、ＰＥ−抱合型抗ＣＤ４ｍＡｂ（ＲＭ４−５）、抗ＣＤ４５／Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂ（ＭＲ１）、ピオチン抱合型抗ＣＤ８αｍＡｂ（５３−６．７）。染色細胞はＥＰＩＣＳ ＸＬフローサイトメトリーによって分析した（ＣＯＵＬＴＡＲ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）。
【０２６６】
（組織学的分析法）
マウスは致死的に麻痺させ、４％のホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で固定した。膣壁、子宮および直腸は矢状に切断してブロック状にし、パラフィンに埋め込んだ。次に、３μｍの厚さのパラフィン断片をヘアマトキシリン（ｈｅａｍａｔｏｘｙｌｉｎ）−エオシン染色で組織学的に調べ、ウサギのＨＳＶ−２抗血清を用いて、「Ｋｕｒａｃｈｉ，Ｒ．，Ｄａｉｋｏｋｕ，Ｔ．，Ｔｓｕｒｕｍｉ，Ｔ．，Ｍａｅｎｏ，Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｋｕｒａｔａ，Ｔ．（１９９３）．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．１３３，２５９−２７３」に記載した方法に従って免疫組織化学的に分析した。手短に脱パラフィン処理を行った後、断片を０．０２（ｖ／ｖ）％塩化カルシウムおよび０．２５（ｖ／ｖ）％トリプシン（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）含有ＰＢＳで３０分間３７℃処理し、０．３容量％の過酸化水素メタノール溶液に３０分間浸した。断片を４℃で夜通し、抗ＨＳＶ−２抗血清と反応させた。ビオチン化された抗ウサギＩｇＧ（ＤＡＫＯ、日本，東京，日本）を加えて３７℃３０分間、続いて３７℃で３０分間、ペルオキシダーゼ抱合型ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ日本）を加えて反応させた。ペルオキシダーゼ反応は０．０２％ジアミノベンジジン（ケミカル同仁、熊本、日本）および０．０１５％過酸化水素含有の０．０５Ｍトリス緩衝液（ＰＨ７．６）の中で行った。細胞核は２％のメチルグリーン（Ｃｈｒｏｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，ドイツ）で対比染色した。
【０２６７】
（ＥＬＩＳＡによる膣洗浄液でのサイトカイン測定）
膣洗浄液は毎日、感染後に集められた。膣洗浄液内のサイトカイン内容物は、メーカーの説明書に従って、マウスのＩＦＮ−γ、ＩＬ−４（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，カナダ）およびＩＬ−１２を用いてＥＬＩＳＡ法による測定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，イギリス）を用いて分析した。
【０２６８】
（統計分析）
誤差の重要度を決定するために、ｔ−検定を用いた。０．０５未満のｐ値は、誤差が有意であるとみなした。
【０２６９】
（１８６野生株、ＹＹ２（ＵＳ２欠損１８６株）またはＬ１ＢＲ１（ＵＳ３欠損１８６株）によって誘導された生殖器の病変と死亡率）
病原性に関するＵＳ２およびＵＳ３欠損の効果を測定するために、ＹＹ２あるいはＬ１ＢＲ１のそれぞれ２０，０００ＰＦＵをマウスの膣内に感染させた。図３は膣感染後の、マウスの代表的な外観を示している。ＹＹ２を感染させたマウスの性器は、接種後（ｐｏｓｔ−ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ；ｐ．ｉ．）５日目に１８６野生株を感染させたマウスと同様に著しく膨張し始めた。一方、Ｌ１ＢＲ１感染させたマウスでは膣炎症の兆候はほとんどみられなかった。生存率は図４に示している。１８６野生株あるいはＹＹ２を感染させたマウスはすべて、膣内接種後１０日以内に死亡した。対照的に、Ｌ１ＢＲ１を感染させたすべてのマウスは接種後（ｐ．ｉ．）３週間でも生き残った。
【０２７０】
（膣からのウイルスのクリアランス）
膣粘膜からのウイルスクリアランス率を比較するために、１８６野生株、ＹＹ２あるいはＬ１ＢＲ１を膣内感染させた後にウイルスの滴定を測定した（図５）。それらのマウスのウイルス滴定濃度は急速に増加し、接種後（ｐ．ｉ．）１日で最大レベルに達した。ＹＹ２およびＬ１ＢＲ１感染マウスにおける滴定濃度は５日目まで徐々に下がり、Ｌ１ＢＲ１感染マウスでは５日目以降に急激に下がった。１８６野生株感染マウスにおける滴定濃度は３日目まではよく保たれていたが、その後緩やかに低下した。
【０２７１】
（膣の組織病理学的変化）
膣および子宮の病理学的変化は接種後（ｐ．ｉ．）１、３、５および７日目で犠牲となったマウスすべてにおいて調べられた。すべてのマウスにおいて、ウイルス感染は１日目に膣壁の扁平上皮細胞上皮組織で観察された（図６Ａ、Ｂ、Ｃ）。組織学的な分析により、巨大多核細胞および核内封入体は扁平上皮細胞で見られ、ＨＳＶ−２抗原もまた、これらの細胞で検出された（図６Ｄ、Ｅ、Ｆ）。３日目までには病変に有意義な変化は観察されなかった。今回、ウイルス感染は外陰部および皮膚の扁平上皮細胞上皮組織まで拡大し、１８６野生株およびＹＹ２を感染させたマウスの上皮下組織における神経叢に達した。しかしながら、そのようなウイルスの拡散はＬ１ＢＲ１感染マウスでは観察されなかった。代わりに、単核細胞の著しい上皮下への浸透が接種後（ｐ．ｉ．）５日目に観察された（図６Ｇ、Ｈ、Ｉ）。
【０２７２】
（膣における細胞反応）
次に、膣から単離された単核細胞（ＭＮＣ）数を測定した。図７Ａに示されるように、Ｌ１ＢＲ１感染マウスのＭＮＣ数は５日目まで増加し、その後、急速に減少した。しかしながら、１８６野生株あるいはＹＹ２感染マウスでは、ＭＮＣ数は１日目には増加したが、その後は増加せず、接種後（ｐ．ｉ．）３日目に緩やかな減少が観察された。この特異的な反応動態は、膣壁の組織学的変化に非常に関連している。これらの結果から、１８６野生株あるいはＹＹ２に感染したマウスにおけるウイルスクリアランスの遅延が、高い致死率をもたらすことがわかる。
【０２７３】
（Ｆａｓ抗原の発現レベル測定）
図７Ｂに示されているように、Ｌ１ＢＲ１感染マウス中のＦａｓ＋細胞数は５日目までは、１８６野生株あるいはＹＹ２感染マウス中のＦａｓ＋細胞数より多めに増加した。Ｆａｓ＋細胞の大部分はＭＨＣクラスＩＩ抗原、Ｉ−Ａｄ（データは示されていない）に陽性であった。これは、Ｌ１ＢＲ１感染マウスにおけるＦａｓ＋膣ＥＣ数が、感染初期の段階で１８６野生株あるいはＹＹ２感染マウスよりも著しく多いことが分かる。
【０２７４】
（膣におけるＡＰＣおよびＴ細胞出現の反応動態測定）
図８からも明らかなように、ＣＤ４０およびＣＤ１１ｂは、ＤＣおよびＭφそれぞれに対する代表マーカーとして用いた。Ｌ１ＢＲ１感染マウスのＣＤ４０＋細胞数は急速に増加し、実験を通じて１８６野生株あるいはＹＹ２感染マウスよりも一貫して多かった。３日目にはＣＤ１１ｂ＋細胞の数はわずかに増加したのみであったが、５日目にはＬ１ＢＲ１感染マウスで著しい増加が観察された。Ｔ細胞に関しては、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４０Ｌ＋およびＦａｓ＋Ｔ細胞数は５日目に最大限のレベルに達したが、その後減退した。ＣＤ４０ＬはＦａｓと同様に活性化されたＴ細胞で発現された。Ｌ１ＢＲ１感染マウス中のＦａｓ＋およびＣＤ４０Ｌ＋細胞数は、１８６野生株あるいはＹＹ２感染マウスにおけるＦａｓ＋およびＣＤ４０Ｌ＋細胞数よりもはるかに多かった。それらもまた、５日目には最大レベルに適した。この結果から、膣でのＡＰＣおよびＴ細胞の誘導／活性は１８６野生株あるいはＹＹ２感染マウスに比べると、Ｌ１ＢＲ１感染マウスではより急速で、大きいことが示された。
【０２７５】
（膣洗浄液中のサイトカイン分泌）
サイトカインの生産は、ウイルス性病原体から宿主を保護するのに必要である。そこで、２日目にＥＬＩＳＡでサイトカインの生産レベルを調べた結果、ＩＬ−１２生産の増加が検出され、２日目および４日目においてＩＬ−１２生産は１８６野生株あるいはＹＹ２感染マウスよりも、Ｌ１ＢＲ１感染マウスでのほうで著しく高かった（図９）。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４はそれぞれＴｈ１とＴｈ２の代表サイトカインである。生産パターンは、ＩＦＮ−γではＬＩＢＲ１感染マウスが１８６野生株感染マウスよりも４日目で有意に高かった。一方、Ｌ１ＢＲ１感染マウスにおけるＩＬ−４生産レベルは、１８６野生株感染マウスよりも低くなる傾向にあった。ＹＹ２感染マウスにおげる両方のサイトカインの生産パターンとレベルは、１８６野生株感染マウスで観察されたものと類似していた。これらの結果から、Ｔｈ１に偏向したサイトカイン生産はＬ１ＢＲ１感染マウスで誘導されるということが分かる。
【０２７６】
本発明に係るワクチンに含有されているＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝手組換え体は非常に弱毒化されており、生物に接種しても、感染の徴候を全く示さない、またはほんの少しの徴候しか示さない。それにも関わらず、ＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体は、感染者の体内においてＨＳＶ感染に対する免疫機能を活性化させることができる。したがって、ＨＳＶ感染の重篤度および／またはＨＳＶ感染率を減少させ、ＨＳＶ感染より惹起される病気を予防および／または治療することができる。さらに、ＵＳ３遺伝子はウイルス複製に必ずしも必要でないことからかかるＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体が接種した生物の体内で増殖することにより、ＨＳＶ感染に対する免疫活性を長期間に渡って持続させることができる。
【０２７７】
（実施例９ ＨＦ株クローン１０（ＭＮＯ１０）およびＵＬ３９不活化ＨＳＶの抗腫瘍作用の比較）
エーテル麻酔下に各群１０匹のＣ３Ｈマウス（生後６週齢）の腹腔内にＣ３Ｈマウス由来の腫瘍細胞株ＮｆＳａＹ８３を１×１０７細胞／１匹ずつ注入し移植した。移植後、７日目にそれぞれ１群ずつ腹腔内にＵＬ３９不活化ウイルスまたはＨＦ株クローン１０（ＵＬ５６欠損ウイルス）を１×１０７ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）／１匹ずつ注入した。ＵＬ３９不活化ウイルスを注入した群にのみ、さらに移植１２日目に２回目の注入を行い、生残日数を比較した。癌細胞のみを接種した群のマウスをコントロールとし、結果は図１１に示す。
【０２７８】
図１１に示された結果より、１３日目までは、いずれの群でも生存率は１００％を示していた。その後、ＵＬ３９不活化ウイルスを２回接種した場合であっても、ＨＦ株クローン１０を１回接種した群のほうが生存期間が延長することが明らかになった。
【０２７９】
（実施例１０ ＨＦ（ＭＮＯ１０）の連続投与による効果）
エーテル麻酔下に各群１０匹のＣ３Ｈマウス（生後６週齢）の腹腔内にＣ３Ｈマウス由来の腫瘍細胞株ＮｆＳａ Ｙ８３を５×１０６細胞／１匹ずつ注入し移植した。移植後、１群については７日目、８日目および９日目と３日間連続で腹腔内にＨＦ株（ＵＬ５６欠損ウイルス）を１×１０７ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）／１匹ずつ注入し、生残日数を比較した。癌細胞のみを接種した群のマウスをコントロールとし、結果は図１２に示す。
【０２８０】
図１２に示された結果より、１７日目までは、どちらの群でも生存率は１００％を示していた。その後、ウイルスを連続投与することにより、生存日数はさらに延長されることがわかった。
【０２８１】
（実施例１１）
本発明の弱毒化ＨＳＶ（ＭＮＯ１０）１×１０７ｐｆｕ、ブドウ糖１．８ｇ、クエン酸ナトリウム０．０６ｇを注射用水８０ｍｌに溶解し、さらに水酸化ナトリウムを加えてｐＨ６．３に調製後、注射用水で全量を１００ｍＬにメスアップした。次に、この溶液を濾過した後、ガス透過性プラスチック容器（ＰＰ製）に５００ｍＬ充填した。この容器を１１６℃で１４分間高圧蒸気滅菌を行った後、該容器を二次包材（酸化アルミ蒸着フィルム）で包装し、真空包装または窒素ガス封入し、注射剤を得た。
【０２８２】
本発明のＵＬ５６が不活化されている弱毒化ＨＳＶを用いると、１回のみの投与であっても、弱毒化ＨＳＶであるＵＬ３９不活化ウイルスを投与した場合よりも高い延命効果を得ることができる。すなわち、弱毒化ＨＳＶ株が連続的に投与されることになる。
【０２８３】
さらに、本発明の弱毒化ＨＳＶを連続投与することにより、さらに高い延命効果を得ることができ、悪性腫瘍治療用の薬学的組成物に有用であることが実証された。
【０２８４】
（実施例１２：ＵＳ３欠損ＨＳＶ−２ウイルスおよびＵＳ３およびＵＬ５６不活化ＨＳＶ（ＨＬ）の抗腫瘍作用）
次に、ＵＳ３欠損ＨＳＶ−２ウイルスおよびＵＳ３およびＵＬ５６不活化ＨＳＶ（ＨＬ）の抗腫瘍作用について調べた。
【０２８５】
（用いたウイルス）
本実施例において使用されるウイルスは以下のとおりであり、その構造は図１３に示される。
１）ＨＳＶ−２ ＵＳ３Δ（Ｌ１ＢＲ１）
ＨＳＶ−２の野生株（１８６株）からＵＳ３遺伝子をｌａｃＺカセットの挿入により不活化した変異ウイルス。このウイルスは、実施例８に記載されるように作製した。
２）ＨＳＶ ＨＬ
ＨＳＶ−１ ＨＦと、ＨＳＶ−２ ＵＳ３Δの組換えウイルスである。Ｌ領域は、おもにＨＳＶ−１ ＨＦ由来であり、Ｓ領域は、ＨＳＶ−２由来である。作製は、上記ウイルス２種を混合感染し、細胞融合を形成し、かつ、Ｘ−ｇａｌ存在下で青いプラークを生成するウイルスを分離することによって行った。その後ＰＣＲにて遺伝子を構成を確認した。ＨＬウイルスは、ＵＳ３およびＵＬ５６の遺伝子欠損を有する。
３）ＨＳＶ−１ ＵＬ３９不活化ＨＳＶ
上記実施例において使用されたものを同様にコントロールとして使用した。
【０２８６】
（マウス）
エーテル麻酔下に各群１０匹のＣ３Ｈマウス（生後６週齢）の背部および頸部にＣ３Ｈマウス由来の腫瘍細胞株ＮｆＳａｋを１×１０７細胞／１匹ずつ注入し移植した。移植後、７日目に１群ずつ、背部に腫瘍細胞を注入したマウスにはＨＳＶ−２ ＵＳ３Δを１×１０７ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）／１匹、またはコントロールとしてＰＢＳを注入し、ならびに頸部に腫瘍細胞を注入したマウスにはＨＬおよびＨｒＲ３を１×１０７ｐｆｕ／１匹ずつ、およびコントロールとしてＰＢＳを注入し、生残日数を比較した。以下の表および図１４および１５に示す。
【０２８７】
表 Ｍｅｌａｎｏｍａ固形腫瘍（背部）に対するＨＳＶ−２ ＵＳ３Δの作用
（生存数（率））
Ｃｏｎｔｒｏｌ （ＰＢＳ接種）
Ｄａｙ１−１６ ５／５（１００％）
Ｄａｙ１７ ４／５
Ｄａｙ２４ ２／５
Ｄａｙ２５ １／５
Ｄａｙ３７ ０／５（０％）
ＨＳＶ−２ ＵＳ３Δ接種群
Ｄａｙ１−２６ ５／５（１００％）
Ｄａｙ２７ ４／５
Ｄａｙ３２ ３／５
Ｄａｙ４２ ２／５
Ｄａｙ６０ ２／５（４０％）
ＮｆＳａｋ固形腫瘍（頸部）に対するＨＳＶの作用
生存数（率）
Ｃｏｎｔｒｏｌ （ＰＢＳ接種）
Ｄａｙ１−２２ ５／５（１００％）
Ｄａｙ２３ ４／５
Ｄａｙ２５ ３／５
Ｄａｙ３０ ２／５
Ｄａｙ３１ ０／５（０％）
ＨＬ接種群
Ｄａｙ１−２７ ７／７（１００％）
Ｄａｙ２８ ６／７
Ｄａｙ３０ ５／７
Ｄａｙ３２ ４／７
Ｄａｙ６０ ４／７（５７％）
ＨＳＶ−１ ＵＬ３９不活化ＨＳＶ接種群
Ｄａｙ１−２３ ７／７（１００％）
Ｄａｙ２４ ６／７
Ｄａｙ２５ ５／７
Ｄａｙ３４ ４／７
Ｄａｙ３５ ３／７
Ｄａｙ３６ ２／７
Ｄａｙ６０ ２／７（２８％）
本発明のＵＳ３が不活化されているＨＳＶを用いると、１回のみの投与であっても、よりも高い延命効果を得ることができることが実証された。
【０２８８】
（実施例１３：Ｈｈの抗腫瘍効果）
次に、ＵＬ３９およびＵＬ５６不活化ＨＳＶ（Ｈｈ）を用いて抗腫瘍効果を実証した。
【０２８９】
対象動物として、各群６〜７匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）を使用した。腫瘍としては癌腫Ｃｏｌｏｎ２６（名古屋大学医学部外科学Ｈａｙａｓｈｉ Ｓｈｕｊｉ博士より入手；大腸癌由来の細胞株；ＢＡＬＢ／ｃ由来）を使用した。この腫瘍細胞Ｃｏｌｏｎ２６を５×１０６細胞／１匹にて腹腔内に接種した。ウイルスとして、実施例２で調製したＨＳＶ−１ Ｈｈを用い、対象群としてＰＢＳ接種を行った。
【０２９０】
（形式１）
腫瘍細胞を接種後、７日目に１×１０７ｐｆｕを腹腔内に接種し、生存曲線をコントロール群（ＰＢＳ接種）とを比較した。結果を以下に示す。
【０２９１】
表 Ｈｈの抗腫瘍効果
抗腫瘍接種後日数 １５日 ３０日 ４５日 ６０日 ７５日
Ｈｈ接種群 ６／６ ５／６ ４／６ ４／６ ４／６
コントロール群 ６／６ ５／６ ４／６ ２／６ ２／６
（形式２）
腫瘍接種後、８日、９日および１０日後、３日連続で、１×１０７ｐｆｕのウイルス（Ｈｈ）を３回連続で接種し、生存曲線をコントロール群と比較した。結果を以下の表に示す。
【０２９２】
表 ３回連続投与の効果
抗腫瘍接種後日数 ３０日 ４５日 ６０日
Ｈｈ接種群 ７／７ ７／７ ７／７
コントロール群 ５／７ ４／７ ２／７
以上に示すように、Ｈｈはコントロール群に比較して顕著な抗腫瘍効果を示した。特に、安全性を著しく高めたＨｈでも３回摂取によって１００％生存した。また、これらの生存マウスに１×１０７細胞のＣｏｌｏｎ２６で再びｃｈａｌｌｅｎｇｅしたところ、１００％の生存率を示した。これは、抗腫瘍免疫が成立していることを実証する。
【０２９３】
（実施例１４：Ｌ１ＢＲ１）
この実施例では、実施例９で調製したＵＳ３を発現しないＨＳＶ−２ １８６の遺伝子組換え体を用いて固形腫瘍に対する効果を実証した。
【０２９４】
各群５匹の雌性Ｃ３Ｈ／Ｈｅ（６週齢）を対象動物として使用した。腫瘍としては、上記実施例において使用されるＮｆＳａＹ８３を用いた。
【０２９５】
背部の毛をそり落とした後、ＮｆＳａを１．２５×１０６細胞／０．１ｍｌで背部に接種した。
【０２９６】
腫瘍細胞の接種後、Ｌ１ＢＲ１（１×１０７細胞ｐｆｕ／０．１ｍｌ）を３回、腫瘍部に直接０．１ｍｌ接種した。
【０２９７】
評価は、生残数、腫瘍サイズ（体積）の変化を目安に行った。結果を以下の表に示す。
【０２９８】
表 腫瘍接種後の腫瘍サイズ体積（ｍｍ３）の推移（１匹ごとに示す）
１０日目 ２０日目 ３０日目 ４０日目 ５０日目
Ｌ１ＢＲ１ ５ ＜５ ＜５ ＜５ ＜５
接種群 ９ ５４ １５０ ５４５ 死
＜５ ＜５ ＜５ ＜５ ＜５
２４ ＜５ ＜５ ＜５ ＜５
１３ ＜５ ＜５ ＜５ ＜５
生残数 ５／５ ５／５ ５／５ ５／５ ４／５
コントロール ２１ １８６ １２１０ 死
群 ４２ ４１９ 死
７３ ４２０ 死
４２ １６１ １３４６ ４３００ 死
１４２ ２６６ ４８６ 死
生残数 ５／５ ５／５ ３／５ １／５ ０／５
上記のように、Ｌ１ＢＲ１（ＵＳ欠損ＨＳＶ−２）は、固形腫瘍に対しても優れた抗腫瘍効果を示した。
【０２９９】
（実施例１５：ＨＩＶ治療のための弱毒化ＨＳＶの利用）
次に、本発明の弱毒化ＨＳＶを利用して他の疾患を処置または予防することができることを実証する。
【０３００】
ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子のプロモーターを上流に配置し、その下流にエンベロープタンパク質であるＨＩＶ ｇｐ１２０をコードする拡散配列を配置したものを、ｌａｃＺ遺伝子（オープンリーディングフレーム）を分割する形で挿入したＤＮＡを作製する。
【０３０１】
次に、このＤＮＡと実施例５で作製した弱毒化ＨＳＶ（ＨＲ５２２）を持つＵＬ５６およびＵＬ３９の両方が不活化されているウイルス由来の感染性ＤＮＡをＶｅｒｏ細胞にトランスフェクトし、産生されてくるウイルスを採取する。
【０３０２】
Ｘ−ｇａｌ存在下で無色のプラークを作るウイルスを採取し、プラーククローニングを行い、第一次ストックとする。第一次ストックとして得られた各々のクローンについて、感染細胞標本を作製し、タッグ抗体を用いて蛍光抗体法を行い、陽性のクローンに関して第二次ストックを作製する。最終的に得られたクローンについて、市販の抗ｇｐ１２０抗体を用いてドットブロッティングを行って、ｇｐ１２０の存在について確認する。ｇｐ１２０陽性の株を以下の実験に用いる。
【０３０３】
次に、ＨＩＶ ｇｐ１２０を発現した弱毒化ＨＳＶを、ＨＩＶに感染するおそれのあるヒトの予防および／またはＨＩＶに感染したヒトの処置に使用することができる。そして、その効果は、従来の薬物治療よりも有利であり得る。
【０３０４】
上記ＨＩＶ抗原としては、ｇｐ１２０のほかに、ｇｐ４１、ｇｐ１７マトリクスタンパク質、ｐ２４カプシドタンパク質、逆転写酵素（ＨＩＶ ｐｏｌ）、ｔａｔ ｒｅｖなどを使用することができる。
【０３０５】
したがって、本発明の弱毒化ＨＳＶは、ヘルペスウイルスに関連する感染因子以外の感染症にも有効であることが実証される。
【産業上の利用可能性】
【０３０６】
本発明により、種々の疾患（例えば、感染性疾患またはがん）に対する有効な治療法が提供された。本発明は、従来有効な処置方法がなかったヘルペスウイルス関連の疾患、腫瘍などに対して副作用の少ない、持続的な効果を有する効果を提供する。これらのことは、格別の効果といえる。また、本発明の処置方法のために使用する組成物、ウイルス構築物、キット、医薬などを製造することには、産業上の利用可能性が十分ある。本発明は、医師以外に、例えば、製薬企業などが業として本発明の組成物などを生産することができることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にあると考えられる。本発明の方法もまた、純粋な医療目的の治療方法に加え、事業目的の治験そのものとして有用であることから、産業上の利用可能性がある。また、本発明の治療方法を間接的または直接的に実施することが、医療業周辺の産業において利用する可能性が十分考えられることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にある。
【図面の簡単な説明】
【０３０７】
【図１】図１は、本発明の弱毒化ＨＳＶを接種したことによる癌治療の効果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の弱毒化ＨＳＶと公知の抗ガン剤との癌治療効果を比較したグラフである。
【図３】図３は、Ｅ／ＤＰ処理後１８６野生株、ＹＹ２野生株あるいはＬ１ＢＲ１のそれぞれ２Ｘ１０４ｐｆｕで膣内感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスの臨床的特徴を示す。写真は膣内感染後７日目に撮ったものである。
【図４】図４は、１８６野生株、ＹＹ２野生株あるいはＬ１ＢＲ１のそれぞれ２×１０４ＰＦＵで膣内感染させたマウスの生存率を示す。それぞれの場合の試験数はｎ＝７である。なお、図中の黒丸は１８６野生株を、白抜きの四角はＹＹ２野生株を、白抜きの丸はＬ１ＢＲ１をそれぞれ感染させた場合を示す。
【図５】図５は、１８６野生株、ＹＹ２野生株あるいはＬＩＢＲｌをそれぞれ感染させたマウスの膣からのウイルスクリアランスを示す。０日目における膣洗浄液は、１８６野生株、ＹＹ２あるいはＬ１ＢＲ１のそれぞれ２×１０４ｐｆｕで膣内感染させた後２時間後に採取した。３つの独立した実験の値は±標準偏差（ＳＤ）で表している。なお、図中の黒丸は１８６野生株を、白抜きの四角はＹＹ２野生株を、白抜きの丸はＬ１ＢＲ１をそれぞれ感染させた場合を示す。また、図中の＊＊は、１８６野生株感染マウスにおける値と比較した場合の有意差がｐ＜０．００１であったことを示す。図中の＊は、上記有意差がｐ＜０．０１であったことを示す。
【図６】図６は、Ａ〜Ｆは、実施例において組織学的免疫組織化学的検討に用いたＢＡＬＢ／ｃマウスの膣粘膜を示す。ＡおよびＤは、模擬感染させたマウスの膣粘膜、ＢおよびＥは１８６野生株感染マウスの膣粘膜、ＣおよびＦはＬ１ＢＲ１感染マウスの膣粘膜を示す。
【０３０８】
Ｇ、Ｈ、Ｉは、接種後５日目における、１８６野生株（Ｇ）、ＹＹ２野生株（Ｈ）およびＬ１ＢＲ１（Ｉ）感染マウスの膣壁の組織学的変化を示す。なお、Ａ〜Ｉは倍率１００倍で見た場合の顕微鏡写真である。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、ＨおよびＩは、ヘマトキシリン（ｈｅａｍａｔｏｘｙｌｉｎ）−エオシン（ｅｏｓｉｎ）染色をもちいて染色したものである。Ｄ、ＥおよびＦはＨＳＶ抗原を検出したものである。
【図７】図７では、Ａは、１８６野生株、ＹＹ２野生株あるいはＬ１ＢＲ１における膣ＭＮＣの数を示す。膣ＭＮＣの数は、それぞれのウイルスを感染させたマウスから集められた生存可能な細胞数をトリパンブルーで染色された細胞数によって測定した。なお、図中の黒丸は１８６野生株を、白抜きの四角はＹＹ２野生株を、白抜きの丸はＬ１ＢＲ１をそれぞれ感染させた場合を示す。
【０３０９】
Ｂは、膣ＥＣで発現するＦａｓの動態を示す。１８６野生株、ＹＹ２野生株あるいはＬ１ＢＲ１感染マウスから単離された膣ＥＣを抗Ｆａｓ ｍＡｂで染色した。
【図８】図８は、ＨＳＶ感染マウスから単離された膣ＭＮＣを、ＡＰＣ検出のためにＣＤ１１ｂおよびＣＤ４０で染色し、Ｔ細胞検出には標示ｍＡｂで染色したものを示す。３つの独立した実験の値は±標準偏差（ＳＤ）で表されている。図中の＊＊は、１８６野生株感染マウスにおける値と比較した場合の有意差がＰ＜０．００１であったことを示す。図中の＊は、上記有意差がＰ＜０．０１であったことを示す。
【図９】図９は、膣洗浄液におけるサイトカイン生成量を示す。膣洗浄液は０，２，４日目の１８６野生株、ＹＹ２野生株あるいはＬ１ＢＲ１感染マウスから集められた。ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定された。３つの独立した実験の値は±標準偏差（ＳＤ）で表されている。図中の＊＊は、１８６野生株感染マウスの値と比較した場合の有意差がＰ＜０．０５であったことを示す。図中の＊は、上記有意差がＰ＜０．０１であったことを示す。
【図１０】図１０において、Ａは、ＨＳＶ−２の遺伝子の模式図である。該模式図には、地図単位を示した。
【０３１０】
Ｂは、ＨＶＳ−２ １８６株のＨｉｎｄ ＩＩＩの切断地図である。
【０３１１】
Ｃは、本発明に関係のある制限酵素部位（制限エンドヌクレアーゼ切断部位）の地図上の位置を示す。なお、図中のＨは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる制限酵素部位を示し、Ｂは、Ｂａｍ ＨＩによる制限酵素部位を示し、ＧはＢａｌ ＩＩによる制限酵素部位を示し、Ｘは、Ｘｂａ Ｉによる制限酵素部位を示し、
Ｄは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔであるｐＬＨＸで前クローニングされた４．８ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｘｂａ Ｉ断片におけるＵＳ３遺伝子の位置を示す。
【０３１２】
Ｅは、５’末端にＨＳＶ−１β８プロモーターおよび３’末端にＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルを融合させたｌａｃ Ｚをコードしている遺伝子をふくむ４．３ｋｂのＢａｍ ＨＩ断片を示す。かかる４．３ｋｂのＢａｍ ＨＩ断片は、ｐＬＨＸのＢａｌ ＩＩによる制限酵素部位に挿入され、遺伝子組換え体ｐＨＺＬ１が作製される。
【図１１】図１１は、ＵＬ５６欠損ＨＳＶ（ＨＦ株；ＭＮＯ１０）またはＵＬ３９不活化ＨＳＶを接種した場合の生存日数を比較した図である。図中、白抜き菱形はコントロールを、黒四角はＵＬ３９不活化ＨＳＶを１回のみ投与したものを、白抜き三角はＵＬ３９不活化ＨＳＶを２回投与したものを、そしてばつ印はＲＦ株を１回のみ投与したものを示す。
【図１２】図１２は、ＵＬ５６欠損ＨＳＶ（ＭＮＯ１０）の連続投与した場合の生存日数を示した図である。図中、黒菱形はコントロールを、白抜き三角はＨＦ株を連続投与したものを示す。そのときの体重変化も示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、実施例９で用いたゲノム構造を示す図である。Ｌ１ＢＲ１は、ＨＳＶ−２においてＵＳ３遺伝子を不活化したものである。ＨＦは、ＨＳＶ−１においてＵＬ５６遺伝子を不活化させたものである。ＨＬは、Ｌ１ＢＲ１とＨＦとをハイブリッドしたものである。Ｌ領域は、ＨＳＶ−１であり、Ｓ領域は、ＨＳＶ−２であり、ＵＬ５６およびＵＳ３の両方が欠損している。ゲノム構造は下のＰＣＲ結果から推定した。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、実施例１３で用いたゲノム構造を示す図である。ＨＦは、ＨＳＶ−１においてＵＬ５６遺伝子を不活化させたものである。Ｈｈは、ＵＬ３９およびＵＬ５６遺伝子が不活化されたＨＳＶ−１である。ＵＬ３９不活化ＨＳＶは、ＵＬ３９遺伝子が不活化されたＨＳＶ−１である。変異塩基の表も示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ＨＦの不活化の詳細な説明図である。
【図１３Ｄ】図１３Ｄには、ＴＲＬとＵＬ領域との間に挿入されたＵＬ５６周辺の遺伝子配列が示される。
【図１３Ｅ】図１３Ｅには、ＴＲＬとＵＬ領域との間に挿入されたＵＬ５２周辺の遺伝子配列が示される。
【図１３Ｆ】図１３Ｆには、もともとあるＵＬ５６の周辺の遺伝子配列が示される。
【図１４】図１４は、ＵＳ３遺伝子を不活化したＨＳＶ−２の抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ＵＬ５６遺伝子を不活化したＨＳＶ−２の抗腫瘍効果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規単純ヘルペスウイルス（以下、本明細書においてＨＳＶと略すことがある）の構築物に関する。より詳細には、本発明は、新規ヘルペスウイルス構築物を用いた種々の疾患または障害（例えば、がん、細菌感染症、ウイルス感染症など）の処置、治療または予防のための方法、使用および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘルペスウイルスが歴史に記されるのは紀元前の古代ギリシア時代にさかのぼる。ヘルペスウイルスは、初めて感染した後に発症する例は少なく、長期間、ウイルスは神経節などに潜伏する。ヒトの免疫能が低下すると、ウイルスが活性化され増殖し発症する。この際、ヘルペスウイルスは、皮膚、性器、眼球、神経などと、広い範囲の組織を標的とする。血液中にウイルスを中和する抗体が存在していても症状が現れることが多いことから、発症に細胞性免疫能の低下が関与していると考えられている。
【０００３】
ヒトに感染するヘルペスウイルスには、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−２）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）、ヒトヘルペスウイルス−８（ＨＨＶ−８）などが包含される。
【０００４】
ＨＳＶ−１は、初感染症状として、歯肉口内炎、顔面ヘルペスを呈し、回帰感染症状として、口唇ヘルペス、角膜結膜炎ヘルペス、ヘルペス脳炎を呈する。ＨＳＶ−１の潜伏感染部位は、おもに三叉神経節である。ＨＳＶ−２は、初感染症状として、性器ヘルペスを呈し、回帰感染症状として、性器ヘルペス、新生児ヘルペスを呈する。ＨＳＶ−２の潜伏感染部位は、おもに仙骨部神経節である。ＶＺＶは、初感染症状として水痘を呈し、回帰感染症状として水痘、帯状疱疹を呈する。ＶＺＶの潜伏感染部位は、おもに脊椎後根神経節である。ＥＢＶは、無症状であるか、または初感染症状として伝染性単核症を呈し、回帰感染症状としてバーキットリンパ腫、鼻咽腔がんを呈する。ＥＢＶの潜伏感染部位は、おもにＢリンパ球である。ＨＣＭＶは、初感染症状としては無症状であるが、回帰感染症状として肺炎、巨細胞封入体症などを呈する。ＨＣＭＶの潜伏感染部位は、おもにマクロファージ、造血前駆細胞とみられる。ＨＨＶ−６は、初感染症状として突発性発疹を呈し、回帰感染症状として突発性発疹（肺炎）を呈する。ＨＨＶ−６の潜伏感染部位は、マクロファージ、造血前駆細胞と見られる。ＨＨＶ−７は、初感染症状として突発性発疹を呈する。ＨＨＶ−７の潜伏感染部位はおもにＴリンパ球である。ＨＨＶ−８は、初感染症状としては無症状であるが、回帰感染症状としてカポジ肉腫、ＰＥＬ、キャッスルマン病を呈する。ＨＨＶ−８の潜伏感染部位はおもにＢリンパ球である。このようにヘルペスウイルスに起因する感染は非常に多岐にわたる。
【０００５】
ヒトのヘルペスウイルスワクチンの中で成功したのは水痘ウイルス弱毒化生ワクチンのみである（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ、２：１２８８，１９７４）。しかし、この弱毒化生ウイルスは、偶然にもたらされたものであり水痘ウイルスが他のヘルペスウイルスと異なりウイルス血症により全身感染を起こすため液性免疫の有効性が高いという特性に基づくという特性に基づく。従って、実質的には、ヘルペスウイルスに対するワクチンとして普遍的に利用可能に有効なものはいまだない。
【０００６】
ＨＳＶはヒトに感染するヘルペスウイルスの中でも代表的な例である。ＨＳＶによる感染は、粘膜のウイルス接種から、あるいはウイルスが表皮の破れから皮膚の中に入ることにより生じる。大抵の一次感染は幼児期に起こり、ほとんどの子供は一次感染から急速に回復する。しかし、感染している付添人から、一般的にはＨＳＶ感染した母親から、新生児がＨＳＶに感染した場合、より具体的には誕生時に新生児が産道で陰部疱疹に出合うときに、ＨＳＶの感染が重症を引き起こす。例えば、播種性新生児疱疹感染が、肝炎等を引き起こし、新生児を死に至らしめる場合もある。
【０００７】
ＨＳＶが体内にいったん獲得されると、ＨＳＶは生涯身体中に保持される。感染の潜状期間は、ＨＳＶは知覚神経節のニューロン中に局在化され（顔の病変の場合には、通常三叉神経節が関係する）、感染者は無徴候である。しかし、月経、日光もしくは冷風への過剰暴露、下垂体もしくは副腎ホルモン、アレルギー反応、または熱のごとき多くの刺激によって、ＨＳＶが活動状態となる。活動状態となったＨＳＶは複製して、宿主細胞の機構を乗っ取り、感染性の成熟ウイルス粒子を作り、そして細胞死を引き起こす。かかる再発性の攻撃により引き起こされる病気は、口、顔および性器に現れることが最も多い。例えば、再発性のＨＳＶによる角膜炎は失明の主要な原因とされている。また、ＨＳＶの性器感染は頻繁に起こり、ＨＳＶに起因する性感染症（例えば、陰部ヘルペス）が顕著な羅病率で発症する。より具体的には、かかる再発性の攻撃により引き起こされる再発性ＨＳＶ誘導性疾病としては、例えば口唇疱疹（通常「熱性疱疹」または「コールドソアス（ｃｏｌｄ ｓｏｒｅｓ）」と呼ばれる唇上の障害）、歯肉口内炎（ロおよび歯肉が小胞でおおわれ、それが破れて潰瘍となる）、咽頭炎、扁桃炎、角結膜炎（角膜炎または眼の角膜の炎症で、樹状潰瘍へと進行し、最終的には角膜の瘢痕化をもたらし、盲目となる）および陰部疱疹を含む粘膜皮膚病などが挙げられる。稀には、ＨＳＶ感染は脳炎、疱疹性湿疹、外傷性庖疹および肝炎を引き起こすことがある。
【０００８】
単純ヘルペスウイルス２型（本明細書において以下、ＨＳＶ−２ということがある）は、生殖器で皮膚粘膜感染を誘導する。感染後、ウイルスは知覚神経節において維持され、活性化された後、再発性ＨＳＶ感染を引き起こす（Ｐｒｉｃｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｗａｌｚ，Ｍ．Ａ．，Ｗｏｈｌｅｎｂｅｒｇ，Ｃ．，ａｎｄ Ｎｏｔｋｉｎｓ，Ａ．Ｌ．（１９７５）．Ｌａｔｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｎｓｏｒｙ ｇａｎｇｌｉａ ｗｉｔｈ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ： ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １８８，９３８−９４０）。動物モデルを用いたＨＳＶ−２感染に対する免疫反応は、多くの研究者によって幅広く研究されている。
【０００９】
主要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）はランゲルハンス細胞（ＬＣ）を含む樹状細胞（ＤＣ）であり、膣におけるマクロファージ（Ｍφ）およびＢ細胞の細胞数は少ないことが報告されている（Ｐａｒｒ，Ｍ．Ｂ．，ａｎｄ Ｐａｒｒ，Ｅ．Ｌ．（１９９１）．Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｖａｇｉｎａ ａｎｄ ｃｅｒｖｉｘ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４４：４９１−４９８，；Ｎａｎｄｉ，Ｄ．，ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．（１９９３）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｅｓ ａｎｄ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｖａｇｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｒｅｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，３３２−３３８）。
【００１０】
Ｔ細胞は細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）として重要な役割を果たしており、ＨＳＶ−２感染に対する抗ウィルス性サイトカインを生産することが報告されている（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ，Ｎ．，ａｎｄ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｉ．（１９９５）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｆｅｍａｌｅ ｇｅｎｉｔａｌ ｔｒａｃｔ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｇｅｎｉｔａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１２，４８１−４８９．；Ｐａｒｒ，Ｍ．Ｂ．，ａｎｄ Ｐａｒｒ，Ｅ．Ｌ．（１９９８）．Ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｖａｇｉｎａ ｉｓ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｂｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，２６７７−２６８５．； Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ．Ｎ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｉ．，ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，Ｎ．（１９９８）．Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｇｉｎａｌ ｍｕｃｏｓａｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｏｒｙ ｇａｇｌｉａ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｍｉｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，６０９３−６１００）。
【００１１】
複製能力欠損変異株は広域スペクトルの免疫反応を誘導できることが知られている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｌ．Ａ．，Ｄａ Ｃｏｓｔａ，Ｘ．Ｊ．，ａｎｄ Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．（１９９８）．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｍｕｃｏｓａｌ ａｎｄ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＨＳＶ−２ ｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｇｅｎｉｔａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４３，１７８−１８７．；ＭｃＬｅａｎ，Ｃ．Ｓ．，Ｎｉ Ｃｈａｌｌａｎａｉｎ，Ｄ．，Ｄｕｎｃａｎ，Ｉ．，Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌ，Ｍ．Ｅ．Ｇ．，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｒ．，ａｎｄ Ｉｎｇｌｉｓ，Ｓ．Ｃ．（１９９６）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ｍｕｃｏｓａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｎ ｗｉｔｈ ａ ＤＩＳＣ ＨＳＶ−１ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ １４，９８７−９９２）。
【００１２】
ＨＳＶ−２弱毒系統を感染させると、ＨＳＶ−２特異的Ｔ細胞１型（Ｔｈ１）様ＣＤ４＋細胞の膣への流入が引き起こされることが知られている（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ．Ｎ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｄ，Ｉ．，ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，Ｎ．（１９９８）．Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｇｉｎａｌ ｍｕｃｏｓａｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｏｒｙ ｇａｎｇｌｉａ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｍｉｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，６０９３−６１００）。
【００１３】
しかしながら、病理学において、ＨＳＶに特異的なウイルス遺伝子の役割と免疫反応の関係の詳細については、まだ完全には明らかになっていない。
【００１４】
このように、ヘルペスウイルスに起因する疾患または障害に対しては、決定的な予防法、治療法に欠けるのが現状である。
【００１５】
癌に対する治療としては、現在一般に、外科的切除、化学療法、放射線療法等が行われている。しかしながら、これらの治療法が充分な効果を奏さない癌も存在し、例えば、進行膵癌または進行卵巣癌では未だ充分な予後を得るには至っていない。特に腹膜播種の存在する進行膵癌または進行卵巣癌では、外科的切除による予後は期待できない。
【００１６】
このため、癌に対する新たな治療方法として、遺伝子治療が試みられている。癌に対する遺伝子治療としては、（１）アンチセンスまたはリボザイムを用いて癌遺伝子を抑制するか、または、癌抑制遺伝子を導入して腫瘍細胞の増殖を抑制する方法、（２）代謝毒性遺伝子（自殺遺伝子）を導入して腫瘍細胞を自殺に追いやる方法、（３）導入遺伝子により抗腫瘍免疫を強化する方法、（４）化学療法の効果を向上させるために多剤耐性遺伝子を用いて骨髄幹細胞を保護する方法等が検討されている。
【００１７】
上記（２）の方法として、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼを自殺遺伝子として用いる方法が知られている。癌細胞に単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼを導入した後、ガンシクロビルを投与すると、ガンシクロビルは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼによってリン酸化され活性型となり、癌細胞のＤＮＡポリメラーゼを阻害する。このため、癌細胞に単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼを導入することにより、癌細胞の増殖を抑制することができ、ひいては癌細胞を死滅させることも可能となる。
【００１８】
単純ヘルペスウイルスは病原性ウイルスであるので、野生型のものをそのまま癌の治療に使用することはできない。このため、単純ヘルペスウイルスを弱毒化して癌の治療に用いることが研究されている（ＷＯ９６／３９８４１）。
【００１９】
このため、癌に対する新たな治療方法として、遺伝子治療が試みられている。そのような遺伝子治療の一つとしては、代謝毒性遺伝子（自殺遺伝子）を導入して腫瘍細胞を自殺に追いやる方法が挙げられ、より具体的には単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼを自殺遺伝子として用いる方法が知られている。
【００２０】
上記に示したように、単純ヘルペスウイルス（例えば複製能力のあるヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１））のようなヘルペスウイルスは、腫瘍細胞の破壊を媒介することがあることから、遺伝子操作した複製可能なＨＳＶ−１ウイルスベクターの使用が、抗腫瘍治療に関連して検討されている。
【００２１】
このようなＨＳＶ−１ウイルスベクターとしては、γ３４．５遺伝子（γ３４．５）を欠損し、神経毒性が低下したγ３４．５欠損株が用いられて一定の抗腫瘍効果を示されている。しかし、γ３４．５欠損株は実用化には至っていない。
【００２２】
本発明者らは、以前よりＨＳＶ−２のＵＳ２をコードする遺伝子（以下、ＵＳ２遺伝子と略称する）およびＵＳ３をコードする遺伝子（以下、ＵＳ３遺伝子と略称する）に着目し、ＵＳ２欠損変異体またはＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体を用いて病理学的な役割を調べ、ＵＳ２およびＵＳ３遺伝子はともに細胞培養でのウイルス複製に必ずしも必要でなく、ＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体は非常に弱毒化されていることが明らかにした（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｙａｍａｄａ，Ｙ．，Ｋｕｒａｃｈｉ，Ｒ．，ａｎｄ Ｄａｉｋｏｋｕ，Ｔ．（１９９２）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＵＳ３ ｌａｃ Ｚ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０，２５６−２６８．；Ｄａｉｋｏｋｕ，Ｔ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｙ．，Ｔｓｕｒｕｍｉ，Ｔ．，Ｍａｅｎｏ，Ｋ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．（１９９３）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＵＳ３ ｇｅｎｅ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７，６８５−６９４．；Ｊｉａｎｇ，Ｙ−Ｈ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．，Ｇｏｓｈｉｍａ，Ｆ．，Ｄａｉｋｏｋｕ．Ｔ．，Ｏｓｈｉｍａ，Ｓ．，Ｗａｄａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．（１９９８）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ （ＨＳＶ−２） ＵＳ２ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ ａ ＵＳ２−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＨＳＶ−２ ｍｕｔａｎｔ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９，２７７７−２７８４）。
【００２３】
また、マウスモデルを用いて行った性器ヘルペスに関する以前の研究から、感染初期の段階ではＨＳＶ−１ＫＯＳ株感染とは異なり、強毒なＨＳＶ−２ １８６株を膣内感染させると、膣内で活性化されたＴ細胞を効果的に増加させることも、ＡＰＣ（抗原提示細胞）の急速な増加も誘導できないことが明らかとなった（Ｉｎａｇａｋｉ−Ｏｈａｒａ Ｋ，Ｄａｉｋｏｋｕ Ｔ，Ｇｏｓｈｉｍａ Ｆ，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ Ｙ．Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｈｉｇｈｌｙ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｇｅｎｉｔａｌ ｈｅｒｐｅｓ．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．２０００； １４５（１０）： １９８９−２００２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
従って、本発明は、特性の改変されたヘルペスウイルス構築物またはその使用もしくはそれを使用する方法を提供することによって、ヘルペスウイルスに関連する疾患または障害あるいはその他の疾患または障害を処置または予防することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
発明の要旨
本発明は、複製非必須遺伝子が不活化されたヘルペスウイルスを提供する。より詳細には、ＵＬおよび／またはＵＳ領域に存在する複製非必須遺伝子が不活化されたヘルペスウイルスを提供する。また、本発明は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子が不活化されたヘルペスウイルスを提供する。より好ましくは、この複製非必須遺伝子は、ＵＳ３および／またはＵＬ５６を含む。好ましくは、このヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスであり得、より好ましくは単純ヘルペスウイルス−１または単純ヘルペスウイルス−２であり得る。本発明により、腫瘍および感染性疾患を含む種々の疾患または障害を処置するための方法、組成物および使用が提供される。本発明はまた、プロドラッグを活性化するための方法、組成物および使用が提供される。
【００２６】
一つの局面において、本発明は、少なくとも１つの複製非必須遺伝子が不活化されている、ヘルペスウイルスを提供する。
【００２７】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する。
【００２８】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは単純ヘルペスウイルスであり、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００２９】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【００３０】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００３１】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ５６またはＵＳ３を含む。
【００３２】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ３９およびＵＬ４０を含む。
【００３３】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ３９およびＵＬ５６を含む。
【００３４】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２およびＵＳ３を含む。
【００３５】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ５６を含む。
【００３６】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３を含む。
【００３７】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、少なくとも２つが不活化されている。
【００３８】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子のうち２つ目以降は、ＲＬ１、ＲＬ２、ＯＲＦＰ，ＯＲＦＯ、ＲＬ３、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬｌ３、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２０．５、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４３．５、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ１．５、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００３９】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、外来性の自殺遺伝子をさらに含む。
【００４０】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、カルボキシエステラーゼ遺伝子をさらに含む。
【００４１】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、癌細胞選択性を有する。
【００４２】
一つの実施形態において、上記不活化は、上記複製非必須遺伝子の配列において、少なくとも１ヌクレオチドの置換、付加、欠失または改変を含む。
【００４３】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【００４４】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【００４５】
別の局面において、本発明の薬学的組成物は、少なくとも１つのヘルペスの複製非必須遺伝子が不活化されている、ヘルペスウイルス；および薬学的に受容可能なキャリア、を含む。
【００４６】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する。
【００４７】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される、からなる群より選択される。
【００４８】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【００４９】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００５０】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ５６またはＵＳ３を含む。
【００５１】
一つの実施形態において、上記不活化は、上記複製非必須遺伝子の配列において、少なくとも１ヌクレオチドの置換、付加、欠失または改変を含む。
【００５２】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子の配列において、翻訳を停止するシグナルが挿入されている。
【００５３】
一つの実施形態において、上記翻訳を停止するシグナルは、ポリアデニル化シグナルである。
【００５４】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【００５５】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【００５６】
一つの実施形態において、上記組成物は、弱毒化ヘルペスウイルスが活性型に変換しうるプロドラッグをさらに含む。
【００５７】
一つの実施形態において、上記プロドラッグは、ガンシクロビル、アシクロビル、タキソールおよびカンプトテシンからなる群より選択されるものを含む。
【００５８】
一つの実施形態において、上記組成物は、腫瘍処置のためである。
【００５９】
一つの実施形態において、上記組成物は、少なくとも１つの腫瘍処置のための薬剤をさらに含む。
【００６０】
一つの実施形態において、上記組成物は、上記ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグの抗癌作用増強のためである。
【００６１】
一つの実施形態において、上記組成物は、感染性疾患の処置のためである。
【００６２】
一つの実施形態において、上記感染性疾患は、ヘルペスウイルスに起因する。
【００６３】
一つの実施形態において、上記組成物は、上記感染性疾患の病因因子に由来する遺伝子を含む。
【００６４】
一つの実施形態において、上記組成物は、Ｌ１ＢＲ１を含有する。
【００６５】
一つの実施形態において、上記組成物は、ワクチンの形態をとる。
【００６６】
一つの実施形態において、上記組成物は、ヘルペスウイルス感染により惹起される疾患または障害の処置または予防治療剤であることを特徴とする。
【００６７】
一つの実施形態において、上記組成物は、上記ヘルペスウイルス感染により惹起される疾患は、性感染症である。
【００６８】
一つの実施形態において、上記組成物は、感染性疾患を処置または予防するためである。
【００６９】
一つの実施形態において、上記組成物は、上記感染性疾患の病因因子を含む。
【００７０】
一つの実施形態において、上記感染性疾患の病因因子は、ウイルスまたは細菌性である。
【００７１】
一つの実施形態において、上記感染性疾患の病因因子は、ＨＩＶ、インフルエンザウイルスおよびロタウイルスからなる群より選択される。
【００７２】
別の局面において、本発明の、感染性疾患または腫瘍を処置または予防するための方法は、、そのような処置または予防を必要とする被検体に、少なくとも１つのヘルペスの複製非必須遺伝子が不活化されている、ヘルペスウイルスおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を投与する工程、を包含する。
【００７３】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する。
【００７４】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００７５】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【００７６】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００７７】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３またはＵＬ５６を含む。
【００７８】
一つの実施形態において、上記不活化は、上記複製非必須遺伝子の配列において、少なくとも１ヌクレオチドの置換、付加、欠失または改変を含む。
【００７９】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【００８０】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【００８１】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグを投与する工程をさらに包含する。
【００８２】
一つの実施形態において、上記プロドラッグは、ガンシクロビル、アシクロビル、タキソールおよびカンプトテシンからなる群より選択される少なくとも一つを含む。
【００８３】
一つの実施形態において、上記方法は、少なくとも１つの腫瘍処置のための薬剤をさらに投与する工程を包含する。
【００８４】
一つの実施形態において、上記方法は、少なくとも１つの感染性疾患処置のための薬剤をさらに投与する工程を包含する。
【００８５】
一つの実施形態において、上記腫瘍は、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、膀胱癌、尿管癌、大腸癌、皮膚癌、悪性メラノーマ、骨肉腫、頭頚部の扁平上皮癌および胃癌からなる群より選択される。
【００８６】
別の局面において、本発明の、ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグの抗癌作用増強方法は、上記抗癌作用増強を必要とする被検体に、少なくとも１つのヘルペスの複製非必須遺伝子が不活化されている、ヘルペスウイルスおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を投与する工程、を包含する。
【００８７】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する。
【００８８】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００８９】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【００９０】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００９１】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３またはＵＬ５６を含む。
【００９２】
一つの実施形態において、上記プロドラッグは、ガンシクロビル、アシクロビル、タキソールおよびカンプトテシンからなる群より選択される一つを含む。
【００９３】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【００９４】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【００９５】
別の局面において、本発明の、ヘルペスウイルス感染の重篤度またはヘルペスウイルス感染率を減少させる方法は、そのような処置または予防を必要とする被検体に、少なくとも１つのヘルペスの複製非必須遺伝子が不活化されている、ヘルペスウイルスを含む、ワクチンを投与する工程、を包含する。
【００９６】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する、項目７０に記載の方法。
【００９７】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【００９８】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【００９９】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【０１００】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３またはＵＬ５６を含む。
【０１０１】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【０１０２】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【０１０３】
別の局面において、本発明の、腫瘍を処置または予防するための薬学的組成物を製造するための、ヘルペスウイルスの使用では、上記ヘルペスウイルスは、少なくとも１つのヘルペスの複製非必須遺伝子が不活化されている。
【０１０４】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する。
【０１０５】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【０１０６】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【０１０７】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【０１０８】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３またはＵＬ５６を含む、項目７８に記載の使用。
【０１０９】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【０１１０】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【０１１１】
別の局面において、本発明の、ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグの抗癌作用増強のための薬学的組成物を製造するための、ヘルペスウイルスの使用では、上記ヘルペスウイルスは、少なくとも１つのヘルペスの複製非必須遺伝子が不活化されている。
【０１１２】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する。
【０１１３】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【０１１４】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【０１１５】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【０１１６】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３またはＵＬ５６を含む。
【０１１７】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【０１１８】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【０１１９】
別の局面において、本発明の、ヘルペスウイルス感染の重篤度および／またはヘルペスウイルス感染率を減少させるための薬学的組成物を製造するための、ヘルペスウイルスの使用では、上記ヘルペスウイルスは、少なくとも１つのヘルペスの複製非必須遺伝子が不活化されている。
【０１２０】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在する。
【０１２１】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【０１２２】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子である。
【０１２３】
一つの実施形態において、上記ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２からなる群より選択される。
【０１２４】
一つの実施形態において、上記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３またはＵＬ５６を含む。
【０１２５】
一つの実施形態において、上記薬学的組成物は、ワクチンである。
【０１２６】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスを改変したものである。
【０１２７】
一つの実施形態において、上記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２８】
以下、発明の実施の形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。本明細書において引用される文献または特許もしくは特許出願は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０１２９】
本明細書において、「ヘルペスウイルス」とは、ウイルスの一科であるヘルペスウイルス科に属する任意のウイルスをいう。ヘルペスウイルスは、コアタンパクのまわりに分子量80〜150×10６ダルトンの複鎖線状DNAが162個のカプソメアを含み、潜伏感染を特徴とする。ウイルス粒子は直径約100〜200nmの球状であり、エンベロープ中には直径100nm前後の正二十面体状のカプシドがある。ゲノムは二本鎖DNAであり、そのサイズは，例えば単純ヘルペスウイルス１型が152260塩基対であり、EBウイルスが172282塩基対であり、サイトメガロウイルスが229400基塩対である。細胞核内で増殖し、フォイルゲン反応陽性の封入体をつくる。自然宿主、実験動物の皮膚および粘膜などの上皮細胞、中枢神経組織などでよく増殖する．３亜科があり所属ウイルスは次のとおりである：アルファヘルペスウイルス亜科:ヒトヘルペスウイルス−１(単純ヘルペスウイルス１型；ＨＳＶ−１)、ヒトヘルペスウイルス−２(単純ヘルペスウイルス２型；ＨＳＶ−２）、アラートンウイルス（Ａｌｌｅｒｔｏｎ ｖｉｒｕｓ）、Ｂウイルス（Ｂ ｖｉｒｕｓ）、ウシ乳頭炎ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｍａｍｍｉｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＢＭＶ）、ネコ鼻腔気管炎ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｌａｒｙｎｇｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＩＬＴ ｖｉｒｕｓ）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）など；ベータヘルペスウイルス亜科:サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）、など；ガンマヘルペスウイルス亜科:ヒトヘルペスウイルス−４（ＨＨＶ−４）、ヒトヘルペスウイルス−８（ＨＨＶ−８）、EBウイルス（ＥＢＶ）、マレック病ウイルスなど。好ましくは、本発明のウイルス構築物は、アルファヘルペスウイルス亜科に由来する。
【０１３０】
本明細書において、「単純ヘルペスウイルス」または「ＨＳＶ」とは、ヘルペスウイルス科アルファヘルペスウイルス亜科シンプレックスウイルス属に属する任意のウイルスをいう。単純ヘルペスウイルスは、直径１００−２００ｍｍの大きさで、最外層にはウイルス糖タンパク質を含むエンベロープをもち、その中に正２０面体のカプシドを含む。カプシドとはエンベロープとの間には、テグメントと名づけられる構造体が存在し、多数のウイルスタンパク質が含まれる。カプシドの中心部（コア）には２本鎖線状ＤＮＡ（約１５万基塩基対）が存在する。ゲノムＤＮＡには、少なくとも７４種類の遺伝子が存在し、その半数は、培養細胞での増殖に必須ではない複製非必須遺伝子（アクセサリー遺伝子）である。ゲノムＤＮＡの複製、カプシドの形成は、核内で行われ、ＤＮＡを含んだカプシドは核内膜から出芽することにより核内から細胞質へと輸送される。ＨＳＶとしては、代表的に、１型（ＨＳＶ−１）および２型（ＨＳＶ−２）と名づけられた２つの密接に関連するウイルス種がある。本発明においては、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の変異体を用いてもよい。場合によってはＨＳＶ−２を用いるのが好ましい。本明細書において、「弱毒化ＨＳＶ」とは、改変などによって毒性が減少しているＨＳＶをいう。
【０１３１】
本明細書において、「複製非必須遺伝子」または「アクセサリー遺伝子」とは、本明細書において互換的に用いられ、その遺伝子を欠損しても、ウイルスの増殖性が維持されるものをいう。好ましくは、そのような遺伝子は、ＵＬ領域またはＵＳ領域に存在し、ゲノムＤＮＡ上に一つしかない遺伝子から構成される。そのような遺伝子としては、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のような単純ヘルペスウイルスでは、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１、ＵＳ１２などが挙げられるがそれらに限定されない。他のヘルペスウイルスでは、上記遺伝子に相当する遺伝子が不活化の対象とされ得る。
【０１３２】
１つの実施形態において、複数の複製非必須遺伝子が不活化される場合、２つ目以降の不活化される遺伝子としては、ＲＬ１、ＲＬ２、ＯＲＦＰ，ＯＲＦＯ、ＲＬ３、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬｌ３、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２０．５、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４３．５、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ１．５、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１、ＵＳ１２などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３３】
好ましい実施形態において、本発明において不活化される遺伝子としては、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子が挙げられる。理論に束縛されることは望まないが、ＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子を不活化することにより、安全性が飛躍的に伸び得、および／またはヒトへの特異性が顕著に高くなり得る。そのようなＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子としては、例えば、ＵＬ２、ＵＬ１２、ＵＬ２３、ＵＬ３９、ＵＬ４０およびＵＬ５０以外の遺伝子などが挙げられる。より好ましくは、そのようなＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＳ領域またはＵＬ領域に存在する。したがって、好ましいＤＮＡおよびデオキシヌクレオチド代謝に関与しない遺伝子は、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ７、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２４、ＵＬ３５、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５１、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ８．５、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２を包含するがそれらに限定されない。
【０１３４】
本発明の弱毒化ＨＳＶは、癌細胞において優位に増殖し得る、癌細胞選択性を有していることが好ましい。
【０１３５】
１つまたは２つ以上のアクセサリー遺伝子が不活化されている弱毒化ＨＳＶとしては、例えば、ＵＬ３９またはＵＬ４０が不活化されているものを挙げることができ、なかでも、ＵＬ３９またはＵＬ４０と、１つまたは２つ以上の他のアクセサリー遺伝子とが不活化されているものが好ましい。
【０１３６】
ＵＬ３９またはＵＬ４０が不活化されている弱毒化ＨＳＶは、この遺伝子にコードされておりＤＮＡ合成に必要なリボヌクレオチドレダクターゼを宿主に依存しなければならない。このため、ＵＬ３９またはＵＬ４０が不活化されている弱毒化ＨＳＶを癌患者に接種すると、増殖が盛んな癌細胞において優位に増殖させることができる。このような弱毒化ＨＳＶに感染された癌細胞は、ウイルスが保有する様々なタンパク質の細胞障害作用によって増殖が抑制され、更には死滅してしまうこともある。
【０１３７】
ＵＬ３９またはＵＬ４０に加えて、１つまたは２つ以上の他のアクセサリー遺伝子が不活化されていると、癌細胞における優位の増殖性を維持しうるとともに宿主に対する病原性を更に減弱することができる。
【０１３８】
ＵＬ３９またはＵＬ４０と、１つまたは２つ以上の他のアクセサリー遺伝子とが不活化されている弱毒化ＨＳＶとしては、例えば、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ５５およびＵＬ５６が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＬ２が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＳ３が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ２およびＵＳ３が不活性されている弱毒化ＨＳＶ等を挙げることができる。
【０１３９】
ＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ５５およびＵＬ５６が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、またはＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＬ２が不活化されている弱毒化ＨＳＶは、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）のみが不活化されている弱毒化ＨＳＶよりも、更に、高い安全性を有する。一方、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＳ３が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、またはＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ２およびＵＳ３が不活化されている弱毒化ＨＳＶは、高い癌細胞選択性に加えて癌細胞のアポトーシスを引き起こす機能を併せ持つことができる。
【０１４０】
別の実施形態では、ＵＳ３および／またはＵＬ５６が不活化されているＨＳＶが提供される。
【０１４１】
本明細書において、遺伝子が「不活化」されるとは、その遺伝子の少なくとも１つの機能が損なわれているか、または好ましくは実質的に消失していることをいう。不活化する方法としては特に限定されず、例えば、以下の公知の方法を挙げることができる。
【０１４２】
かかる改変としては、例えばＨＳＶ複製非必須遺伝子（例えば、ＵＳ３遺伝子）が翻訳されないような処理（例えば、発現しないようにプロモーターを改変すること）、またはＨＳＶ遺伝子のうち特定の複製非必須遺伝子（例えば、ＵＳ３遺伝子）を組換え（例えば、他の配列の挿入、一部の配列の切除、塩基の修飾、塩基の置換等）、該組換えられた遺伝子が翻訳されるとＵＳ３とは異なるタンパクが発現する改変（例えば、他のアミノ酸配列の挿入、一部の配列の切除、アミノ酸の置換など）などが挙げられる。
【０１４３】
上記遺伝子組換え体を作製するための遺伝子組換え処理としては、特に限定されない。例えば、特定の複製非必須遺伝子（例えば、ＵＳ３遺伝子）の全部または一部を欠損させる処理、特定の複製非必須遺伝子の全部または一部を置換させる処理、特定の複製非必須遺伝子の一部を逆位させる処理、ＵＳ３遺伝子の一部を重複させる処理、特定の複製非必須遺伝子の一部を転座させる処理、特定の複製非必須遺伝子に遺伝子断片を挿入しその特定の複製非必須遺伝子を中断させる処理などが挙げられる。中でも、特定の複製非必須遺伝子の全部または一部を欠損させる処理、特定の複製非必須遺伝子の全部または一部を置換させる処理、または特定の複製非必須遺伝子に遺伝子断片を挿入しその特定の複製非必須遺伝子を中断させる処理が好ましい。特に、特定の複製非必須遺伝子に遺伝子断片を挿入し特定の複製非必須遺伝子を中断させる処理がより好ましく、挿入する他の遺伝子には、翻訳を停止させるシグナルが含有されていることがさらに好ましい。翻訳を停止させるシグナルとしては、中でもＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルが好ましい。
【０１４４】
本明細書において、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、互換的に用いられ、一連のアミノ酸からなる高分子をいう。アミノ酸は、炭素原子にカルボキシル基およびアミノ基を有する有機分子をいう。本明細書において好ましくは、アミノ酸は、天然に存在する２０種類のアミノ酸であるがこれらに限定されない。
【０１４５】
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【０１４６】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【０１４７】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【０１４８】
本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４９】
本明細書において、「非保存的置換」とは、上記のような保存的置換ではない置換をいい、それにより、タンパク質の機能の改変が生じ得る。非保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ間での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５０】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【０１５１】
本明細書において使用されるポリペプチドをコードする核酸分子は、同一または類似の機能を発揮することを目的とする場合、発現されるポリペプチドが本発明のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、このポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような核酸分子を作製する方法は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
【０１５２】
本発明において、機能を改変、好ましくは不活化することを目的とする場合、発現されるポリペプチドが本発明において利用されるポリペプチドと実質的に異なる、好ましくは消失した活性を有するように、その核酸の配列の一部が欠失または置換され得、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。
【０１５３】
本明細書において「発現可能なように組み込まれる」とは、例えば下記に示すようなプロモーター配列の下流に目的とする自殺遺伝子が組み込まれることをいう。
【０１５４】
このような本発明の弱毒化ＨＳＶは、例えば、プロモーター配列およびターミネーター配列が組み込まれ、アクセサリー遺伝子が不活化されたＨＳＶベクターを用い、プロモーター配列の下流に上記外来性の自殺遺伝子を挿入することにより得ることができる。
【０１５５】
プロモーターとしては、腫瘍細胞中でプロモーターとして機能するものであれば特に限定されないが、腫瘍特異的プロモーターまたはＨＳＶ由来プロモーターが好ましい。そのようなプロモーターとしては、本発明の実施に有用なプロモーターの例としては（特にヒトに対する遺伝子ワクチンの製造において）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（ＨＩＶ長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターのような）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶ前初期プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）からのプロモーター類、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子からのプロモーター類が挙げられるが、これらに制限されるわけではない。
【０１５６】
腫瘍細胞特異的プロモーターは特定の細胞型かまたは腫瘍細胞において選択的にまたは高レベルに誘導されるプロモーターを含み、例えばＣＥＡ、ＡＦＰなどの癌胎児性タンパク質プロモーター、チロシナーゼプロモーター、アルブミンプロモーター、ストレス誘発性ＧＲＰ７８／Ｂｉｐプロモーターなどを挙げることができる。
【０１５７】
ＨＳＶ由来プロモーターとしては、例えばＨＳＶ初期タンパク質ＵＬ２９プロモーター、ＨＳＶ ＵＬ３９プロモーターなどを挙げることができる。
【０１５８】
本発明の実施に有用なポリアデニル化シグナルの例としては（特にヒトに対する遺伝子ワクチンの製造において）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに制限されるわけではない。特に、ｐＣＥＰ４プラスミド中に存在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと称される）が使用される。
【０１５９】
ＤＮＡ発現に必要とされる制御エレメントに加え、他のエレメントもＤＮＡ分子に含まれているであろう。本明細書において使用されるＨＳＶ由来プロモーターは、さらにエンハンサー有していてもよい。そのような追加のエレメントにはエンハンサーが含まれる。エンハンサーは：ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶからのエンハンサーのようなウイルスエンハンサーからなる群より選択されるであろうが、それらに制限されるわけではない。
【０１６０】
遺伝子構築物を染色体外に維持するためおよび細胞中で構築物の多数のコピーを生成するために、構築物は哺乳類複製起点とともに提供できる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）からのプラスミドｐＣＥＰ４およびｐＲＥＰ４はエプスタインバーウイルス複製起点および組込みなしで高コピーエピソーム複製を生み出す核抗原ＥＢ ＮＡ−１コード領域を含んでいる。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質をコードしているｃＤＮＡがｐＣＤＮＡ３内へ挿入される。
【０１６１】
いくつかの好適な態様において、標的タンパク質、免疫調節タンパク質、およびそのうえにそのような標的タンパク質に対する免疫応答をさらに促進するタンパク質のための遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子が送達される。そのような遺伝子の例はα−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のようなサイトカインおよびリンホカインをコードしているものである。いくつかの態様において、ＧＭ−ＣＳＦの遺伝子が免疫化組成物で使用される遺伝子構築物に含まれていることが好適である。
【０１６２】
タンパク質産生を最大にするため、構築物が投与される細胞内での遺伝子発現に適した制御配列が選択され得る。さらに、細胞内で最も効率的に転写されるコドンが選択され得る。当業者は細胞内で機能的であるＤＮＡ構築物を周知技術に基づいて容易に製造することができる。
【０１６３】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変異誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【０１６４】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｗｉｌｅｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら （１９８７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
【０１６５】
遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【０１６６】
本明細書では塩基配列の同一性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
【０１６７】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。
【０１６８】
「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号２，４または６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。記載の相同性は、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
【０１６９】
「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。
【０１７０】
本明細書において、「アミノ酸」は、上述のように天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸は、当該分野において周知である。
【０１７１】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドは、当該分野において周知である。
【０１７２】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。本明細書では、生物学的活性としては、重金属に結合する活性および細胞膜のような疎水性部分に結合する能力が挙げられる。
【０１７３】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。本明細書において、核酸分子の「ホモログ（種相同体）」とは、参照核酸分子のヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子をいう。ホモログは、代表的には、参照核酸分子と、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをいう。本発明の核酸分子についていう場合、「ホモログ」とは、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列と相同性を有する核酸配列を有する核酸分子であって、その生物学的機能が本発明のプロモーターと同一または類似する核酸分子をいう。従って、「ホモログ」と「改変体」とは一部重複する概念である。従って、「ホモログ」は、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのようなホモログを取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。
【０１７４】
本明細書において、ウイルス構築物を細胞などに導入することが必要である場合、ウイルス構築物の導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換などが挙げられる（例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）。
【０１７５】
本明細書において、薬学的（医薬）組成物は、好ましくは、本発明のヘルペスウイルスおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的組成物は、宿主に有効であればその形態はどのようなものでもよく、例えば、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、カプレット剤、丸剤、液剤、トローチ剤、バッカル錠、舌下錠、膣錠、エリキシル剤、シロップ剤、リモナーデ剤、懸濁剤、乳剤、エアゾール剤、注射剤、注入剤、噴霧剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、坐剤などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、ワクチンのような形態にした注射剤として本発明は提供される。本発明はまた、徐放剤とすることもできる。本発明はまた、ＤＤＳ技術用いることもできる。
【０１７６】
好ましくは、本発明の薬学的組成物において、ヘルペスウイルスは、少なくとも１０３、好ましくは、少なくとも２×１０３、少なくとも５×１０３、少なくとも１０４、少なくとも２×１０４、少なくとも５×１０４、少なくとも１０５、少なくとも２×１０５、少なくとも５×１０５、少なくとも１０６、少なくとも２×１０６、少なくとも５×１０６、少なくとも１０７、少なくとも２×１０７、少なくとも５×１０７、少なくとも１０８、少なくとも２×１０８、少なくとも５×１０８、少なくとも１０９、少なくとも２×１０９、少なくとも５×１０９、少なくとも１０１０、または少なくとも１０１０を超えて存在する。適切な量は、使用する状況に応じて変動し、当業者であれば、組成物中に存在する活性成分の状態、医薬に使用する場合は、患者の状態、患者の疾患の状態、投与経路、投与形態、投与中の患者の状態をモニターすることなどにより応じて適宜決定することができる。
【０１７７】
薬学的に受容可能なキャリアとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、安定剤、コーティング剤、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクルおよび／または薬学的アジュバント。
【０１７８】
本発明の組成物が薬学的組成物として用いられる場合は、さらなる医薬成分として、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない成分がその薬学的組成物に含有され得る：
中枢神経系用薬（例えば、全身麻酔剤、催眠鎮静剤、抗不安剤、抗てんかん剤、解熱鎮痛消炎剤、興奮剤、覚せい剤、抗パーキンソン剤、精神神経用剤、総合感冒剤、その他の中枢神経系用薬など）；
末梢神経用剤（例えば、局所麻酔剤、骨格筋弛緩剤、自律神経剤、鎮けい剤など）；
感覚器官用薬（例えば、眼科用剤、耳鼻科用剤、鎮暈剤など）；
循環器官用薬（例えば、、強心剤、不整脈用剤、利尿剤、血圧降下剤、血管収縮剤、血管拡張剤、高脂血症用剤、その他の循環器官用薬など）；
呼吸器官用薬（例えば、呼吸促進剤、鎮咳剤、去痰剤、鎮咳去痰剤、気管支拡張剤、含嗽剤など）；
消化器官用薬（例えば、止瀉剤、整腸剤、消化性潰瘍用剤、健胃消化剤、制酸剤、下剤、浣腸剤、利胆剤、その他の消化器官用薬など）；
ホルモン剤（例えば、脳下垂体ホルモン剤、唾液腺ホルモン剤、甲状腺、副甲状腺ホルモン剤、蛋白同化ステロイド剤、副腎ホルモン剤、男性ホルモン剤、卵胞、．黄体ホルモン剤、混合ホルモン剤、その他のホルモン剤など）；
泌尿生殖器官および肛門用薬（例えば、泌尿器官用剤、生殖器官用剤、子宮収縮剤、痔疾用剤、他の泌尿生殖器管、肛門用薬など）；
外皮用薬（例えば、外皮用殺菌消毒剤、創傷保護剤、化膿性疾患用剤、鎮痛．鎮痒．収斂．消炎剤、寄生性皮膚疾患用剤、皮膚軟化剤、毛髪用剤、その他の外皮用剤など）；
歯科口腔用剤；
その他の個々の器官系用薬；
ビタミン剤（例えば、ビタミンＡ剤、ビタミンＤ剤、ビタミンＢ剤、ビタミンＣ剤、ビタミンＥ剤、ビタミンＫ剤、混合ビタミン剤、その他のビタミン剤など）；
滋養強壮薬（例えば、カルシウム剤、無機質製剤、糖類剤、蛋白アミノ酸製剤、臓器製剤、乳幼児用剤、その他の滋養強壮剤など）；
血液および体液用薬（例えば、血液代用剤、止血剤、血液凝固阻止剤、その他の血液．体液用剤など）；
人工透析用薬（例えば、人工腎臓透析用剤、腹膜透析用剤など）；
その他の代謝性医薬品（例えば、臓疾患用剤、解毒剤、習慣性中毒用剤、痛風治療剤、酵素製剤、糖尿病用剤、他に分類されない代謝性薬など）；
細胞賦活用剤（例えば、クロロフィル製剤、色素製剤、その他の細胞賦活用剤など）；
腫瘍用薬（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質製剤、抗腫瘍性植物成分製剤、その他の腫瘍用剤など）；
放射性医薬品；
アレルギー用薬（例えば、抗ヒスタミン剤、刺激療法剤、非特異性免疫原製剤、その他のアレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、生薬、漢方製剤、その他の生薬漢方処方に基づく製剤など）；
抗生物質製剤（例えば、グラム陽性菌に作用するもの、グラム陰性菌に作用するもの、グラム陽性マイコプラズマに作用するもの、グラム陰性マイコプラズマに作用するもの、グラム陽性リケッチアに作用もの、グラム陰性リケッチアに作用するもの、抗酸菌に作用するもの、カビに作用するもの、その他の抗生物質製剤など）；
化学療法剤（例えば、サルファ剤、抗結核剤、合成抗菌剤、抗ウィルス剤、その他の化学療法剤など）；
生物学的製剤（例えば、ワクチン類、トキソイド類、抗毒素．抗レプトスピラ血清、血液製剤類、生物学的試験用製剤類、その他の生物学的製剤、抗原虫剤、駆虫剤など）；
調剤用薬（例えば、賦形剤、軟膏基剤、溶解剤、矯味矯臭剤、着色剤、その他の調剤用剤など）；
診断用薬（例えば、Ｘ腺造影剤、機能検査用試薬、その他の診断用薬）；
公衆衛生用薬（例えば、防腐剤）；
体外診断用医薬品（例えば、細菌学的検査用薬など）；
分類されない治療を主目的としない薬剤；ならびに
麻薬（例えば、あへんアルカロイド系麻薬、コカアルカロイド系製剤、合成麻薬など）。
【０１７９】
本発明の薬学的組成物は、日本薬局方、米国薬局方、その他対応する他の国の薬局方、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照することによって、当業者は容易に製造することができる。
【０１８０】
本発明は、薬学的組成物として処方される場合、非経口的に投与され得る。あるいは、その組成物は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明における使用のための治療組成物は、発熱物質を含まない、経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な水溶液は、ｐＨ、等張性、安定性などに相当な注意を払うことを条件として、当該分野の技術を用いて調製され得る。
【０１８１】
好ましい実施形態では、本発明のＨＳＶまたはそれを含む薬学的組成物は接種形態で投与され得る。本発明の弱毒化ＨＳＶを含む薬学的組成物の接種形態としては特に限定されず、公知の形態を用いることができるが、通常好ましくは、水溶液または懸濁液からなる注射剤として患者に接種される。前記注射剤には、輸液および栄養補充液なども含まれる。
【０１８２】
上記注射剤は、本発明の弱毒化ＨＳＶの他に、通常用いられる添加剤を含有していてもよい。前記添加剤としては特に限定されず、必要に応じて界面活性剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、無痛化剤、安定剤などの成分を配合することができる。界面活性剤としては例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、セスキオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸グリセリン、ラウロマクロゴールなど；乳化剤としては例えば、アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウムなど；懸濁剤としては例えば、モノステアリン酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロースなど；保存剤としては例えば、フェノール、硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノールなど；無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトールなど、安定剤としては例えば、クエン酸、酢酸、酒石酸、コハク酸などの緩衝剤、プロピレングリコール、ジエチリン、亜硫酸塩、アスコルビン酸、ロンガリットなどが挙げられる。
【０１８３】
また、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油脂、エチルオレイン酸などの有機エステルなど、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、弱毒化ＨＳＶの効果を強化する免疫賦活剤などを添加することもできる。
【０１８４】
本発明において、上記注射剤の製造方法は特に限定されず、通常用いられる装置および方法によることができる。注射剤は調製した後、フィルター濾過による除菌を行ってもよいし、必要ならば凍結乾燥などを行って、常法により皮下・筋肉内、静脈内、腫瘍内、腹腔内、気管内、膀胱内、腸内、直腸内、口内、眼内、動脈内などへ注射剤、点滴注射剤により注入される。
【０１８５】
また、上記注射剤は、注射直前に溶液に溶解するか、または懸濁するのに適する固形物に調製されてもよい。
【０１８６】
本発明の弱毒化ＨＳＶを含む薬学的組成物の、個々の場合における正確な投与量は、例えば投与方法、投与される患者の個体差、疾患の種類、投与するときの患者の状態などによっても異なるため一概にはいえないが、例えば注射剤としてヒトに投与する場合は、成人の場合約０．０１ｎｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ程度の弱毒化ＨＳＶを１日１〜数回に分げて投与できる。好ましくは、投与は、患者の状態をモニターしながら適宜調整され得る。
【０１８７】
本発明の弱毒化ＨＳＶとプロドラッグとを併用する場合は、公知方法に従って使用することができ、プロドラッグの投与経路、投与量は公知の方法に従って行うことができる。プロドラッグは、本発明の弱毒化ＨＳＶと同時に、または交互に使用することができる。
【０１８８】
本発明はまた、好ましくは、ワクチン形態で投与され得る。ワクチンとは、ある種の疾患（例えば、伝染病、感染症など）の予防（または治療）のため使用される抗原の諸形態（例えば、タンパク質、ＤＮＡ）をいう。感染、伝播、流行などの諸形式にしたがい、生きた弱毒病原体（生ワクチンｌｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ）、不活化病原体（またはその一部）、病原体代謝物（毒素、毒素の不活化物すなわちトキソイドなど）、ＤＮＡワクチンなどが使用される．ワクチン接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）により生物（ヒト・家畜・媒介動物）の体内に能動的につくられる免疫（体液性免疫、細胞性免疫、または両者）が病原体の感染、伝播、流行などを阻止する。
【０１８９】
本発明に係るワクチンの剤形は特に問わず、また、その製造も当該分野で用いられている自体公知の方法に従ってよい。本発明に係るワクチンは、上記ＨＳＶ遺伝子組換え体を含む生ワクチンとするのが好ましい。また、本発明に係るワクチンは、種々のアジュバントを含む乳濁液としてもよい。アジュバントは、上記ＨＳＶ遺伝子組換え体のみを投与した場合よりも、少ない量のＨＳＶ遺伝子組換え体を用いて、少ない投与量で、持続する高レベルの免疫性を持続させるのを助けるものである。アジュバントの例には、フロインドのアジュバント（完全または不完全）、アジュバント６５（落下生油、マンナイドモノオレエートおよびアルミニウムモノステアレートを含む）、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはミョウバンのごとき鉱物ゲルがある。ヒトおよび食用動物のためのワクチンには、アジュバント６５を用いるのが好ましい。また、商業的動物用ワクチンには、鉱物ゲルを用いるのが好ましい。
【０１９０】
本発明に係るワクチンには、上記アジュバントの他に例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を含有させてもよい。
【０１９１】
本発明に係るワクチンの投与経路は、特に限定されないが、非経ロ的に投与することが好ましい。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内の投与が挙げられる。
【０１９２】
本発明に係るワクチンの１回の投与量は、投与の目的がＨＳＶ感染より惹起される病気の予防であるか治療であるかにより、また感染が初感染か再感染かにより、さらに患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。再感染により惹起される病気の治療を目的とする場合、本発明に係るワクチンの投与量は、体重１ｋｇあたり約０．０１ｎｇ〜１０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１ｎｇ〜１ｍｇ／ｋｇ程度であり得る。
【０１９３】
本発明に係るワクチンの投与回数は、上記のような種々の条件により異なるので、一概には言えないが、日単位から週単位の間隔で繰り返して投与するのが好ましい。中でも、約２〜４週間程度の間隔で、数回、好ましくは約１〜２回程度投与するのが好ましい。疾患症候学または抗体価を用いる基本的な検査により疾患の状態をモニターしながら投与回数（投与時間）を決定するのがより好ましい。
【０１９４】
本明細書において、「疾患または障害」とは、本発明のウイルス構築物が有効である疾患または障害をいう。そのような疾患または障害としては、例えば、ヘルペスウイルスに関連する疾患または障害（例えば、歯肉口内炎、顔面ヘルペス、口唇ヘルペス、角膜結膜炎ヘルペス、ヘルペス脳炎、性器ヘルペス、新生児ヘルペス、水痘、帯状疱疹、伝染性単核症、バーキットリンパ腫、鼻咽腔がん、肺炎、巨細胞封入体症、突発性発疹、肺炎、カポジ肉腫、ＰＥＬ、キャッスルマン病）、がん（例えば、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、膀胱癌、尿道癌、大腸癌、皮膚癌、悪性メラノーマ、骨肉腫、頭頚部の扁平上皮癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、リンパ腫、肝癌、中皮腫、黒色腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽細胞腫、上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、神経髄芽細胞腫、線維肉腫、扁平上皮細胞癌、神経外胚葉細胞癌、甲状腺腫瘍、下垂体腫瘍、または類表皮癌腫など）、他の疾患または障害（例えば、他のウイルス（例えば、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ロタウイルスなど）または細菌（例えば、百日咳菌、ジフテリア菌、破傷風菌など）に起因する疾患または障害）、原核生物（例えば、淋菌、リステリアおよび赤痢菌など）および真核生物体（例えば、単細胞病原性生物体および多細胞寄生虫など）などが挙げられる。
【０１９５】
従って、本発明の単純ヘルペスウイルスおよび組成物は、上述のようながんを予防または治療するために用いることができる。好ましくは、進行性の膵臓癌、卵巣などの外科的切除、化学療法が困難な腹膜播種が存在するもの、固形腫瘍に対して用いられ得る。本発明は一つまたはそれ以上の癌のいくつかの形に対して個体を免疫するためにも使用され得るが、本発明は特定の癌が発現しやすい人または以前に癌を発病し、従って再発しやすい人のような個体を予防的に免疫するのにも利用され得る。遺伝学および技術ならびに疫学の発展は、個体における癌発生の可能性および危険事前評価の決定を可能にしている。遺伝子スクリーニングおよび／または家族健康履歴を用いて、特定の個人がいくつかの型の癌のどれか一つを発生する可能性を予測することが可能である。
【０１９６】
本発明の弱毒化ＨＳＶを含む薬学的組成物は、弱毒化ＨＳＶが効果を発揮する量を、適当な医薬用の担体その他の補助剤と組み合わせて常法により製剤化することで得ることができる。ここでいう「効果を発揮する量」または「有効量」とは、有効成分の種類、使用形態などにより異なるために一概にはいえないが、副作用が少なく目的とする効果を発揮する量が好ましい。
【０１９７】
本発明の弱毒化ＨＳＶを含む薬学的組成物の接種形態としては特に限定されず、公知の形態を用いることができるが、通常好ましくは、水溶液または懸濁液からなる注射剤として患者に接種される。前記注射剤には、輸液および栄養補充液なども含まれる。
【０１９８】
上記注射剤は、本発明の弱毒化ＨＳＶの他に、通常用いられる添加剤を含有していてもよい。前記添加剤としては特に限定されず、必要に応じて界面活性剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、無痛化剤、安定剤などの成分を配合することができる。界面活性剤としては例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、セスキオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸グリセリン、ラウロマクロゴールなど；乳化剤としては例えば、アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウムなど；懸濁剤としては例えば、モノステアリン酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロースなど；保存剤としては例えば、フェノール、硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノールなど；無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトールなど、安定剤としては例えば、クエン酸、酢酸、酒石酸、コハク酸などの緩衝剤、プロピレングリコール、ジエチリン、亜硫酸塩、アスコルビン酸、ロンガリットなどが挙げられる。
【０１９９】
また、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油脂、エチルオレイン酸などの有機エステルなど、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、弱毒化ＨＳＶの効果を強化する免疫賦活剤などを添加することもできる。
【０２００】
本発明において、上記注射剤の製造方法は特に限定されず、通常用いられる装置および方法によることができる。注射剤は調製した後、フィルター濾過による除菌を行ってもよいし、必要ならば凍結乾燥などを行って、常法により皮下・筋肉内、静脈内、腫瘍内、腹腔内、気管内、膀胱内、腸内、直腸内、口内、眼内、動脈内などへ注射剤、点滴注射剤により注入される。
【０２０１】
また、上記注射剤は、注射直前に溶液に溶解するか、または懸濁するのに適する固形物に調製されてもよい。
【０２０２】
本発明の弱毒化ＨＳＶを含む薬学的組成物の、個々の場合における正確な投与量は、例えば投与方法、投与される患者の個体差、疾患の種類、投与するときの患者の状態などによっても異なるため一概にはいえないが、例えば注射剤としてヒトに投与する場合は、成人の場合約０．０１ｎｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ程度の弱毒化ＨＳＶを１日１〜数回に分げて投与できる。
【０２０３】
本発明の弱毒化ＨＳＶとプロドラッグとを併用する場合は、公知方法に従って使用することができ、プロドラッグの投与経路、投与量は公知の方法に従って行うことができる。プロドラッグは、本発明の弱毒化ＨＳＶと同時に、または交互に使用することができる。
【０２０４】
本明細書において、「プロドラッグ」とは、そのままの形では不活性であるが，生体内で薬物代謝酵素によって化学的変化をうけてはじめて活性を示すような薬物をいう（例えば、がんの化学療法剤として用いられるプリンおよびピリミジン誘導体）。本明細書において好ましいプロドラッグは、ガンシクロビル、アシクロビル、タキソール、カンプトテシン、グアニンヌクレオシド誘導体などが挙げられる。本発明における好ましいプロドラッグとしては、本発明において用いられる弱毒化ＨＳＶが含有している自殺遺伝子によって活性型に変換されるプロドラッグである。
【０２０５】
本明細書において、「自殺遺伝子」とは、発現すると、自己を殺傷することができる遺伝子をいい、代表的には、代謝毒性遺伝子が挙げられる。本明細書では、自殺遺伝子をウイルス構築物に導入して腫瘍細胞を自殺に追いやる方法が挙げられ、より具体的には単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼを導入し得る。
【０２０６】
本明細書において、「癌細胞選択性を有する」とは、正常細胞における増殖速度よりも、癌細胞における増殖速度の方が勝ることを意味する。
【０２０７】
本発明はまた、免疫調節タンパク質とともに提供され得る。本明細書において、「免疫調節タンパク質」とは、免疫応答を促進および／または調節するタンパク質および核酸分子発現産物をいう。従って、好ましい実施形態において、免疫調節タンパク質は免疫療法剤としてまたはワクチン中の成分として送達され得る。
【０２０８】
免疫調節タンパク質にはケモカイン、接着分子、サイトカイン、共刺激分子、増殖因子およびレセプター分子が含まれる。免疫調節タンパク質であるケモカインにはＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥｓ、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１が含まれる。接着分子にはセレクチンファミリー構成物、ムチン様分子、インテグリンファミリー構成物およびイムノグロブリンスーパーファミリー構成物が含まれる。セレクチンファミリー構成物にはＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンが含まれる。ムチン様分子はセレクチンファミリー構成物のリガンドである。ムチン様分子にはＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１が含まれる。インテグリンファミリーの構成物にはＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５が含まれる。イムノグロブリンスーパーファミリー構成物にはＰＥＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ類（ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３）、ＣＤ２およびＬＦＡ−３が含まれる。サイトカインにはＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＩＬ−１８の変異体（タンパク質の前形には存在するが成熟形態には存在しない最初の約３５アミノ酸残基の欠失を含む）が含まれる。共刺激分子にはＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）が含まれる。増殖因子には血管増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子および血管内皮細胞増殖因子が含まれる。レセプター分子にはＦａｓ致死遺伝子発現産物、腫瘍壊死因子ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６が含まれる。カスパーゼ（ＩＣＥ）もまた、本発明の組成物に存在し得る。
【０２０９】
本発明のある実施形態では、免疫調節タンパク質は核酸分子（それは細胞に取り込まれた場合、発現されて免疫調節タンパク質を発現する）を投与することにより送達される。本発明のいくつかの態様では、免疫調節タンパク質はタンパク質それ自身を投与することにより送達される。本発明のいくつかの態様では、免疫調節タンパク質は核酸かまたはタンパク質を投与することにより送達される。本発明のある実施形態では、免疫調節タンパク質は核酸およびタンパク質を同時に投与することにより送達される。
【０２１０】
本発明のいくつかの実施形態では、上述の免疫調節タンパク質（タンパク質またはタンパク質をコードしている核酸分子として）は組成物またはさもなくばワクチン組成物とともに補給物として投与される。ここで、ワクチンは、サブユニット、不活化ワクチン、弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組換え体ワクチン、核酸またはＤＮＡワクチンのいずれかである。弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組換え体ワクチン、または核酸またはＤＮＡワクチンの場合、免疫調節タンパク質はこれらのワクチンの核酸分子によりコードされる。
【０２１１】
本明細書において、ヘルペスウイルス以外の病因因子（例えば、ウイルス（例えば、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ロタウイルスなど）または細菌）を処置または予防するための組成物（例えば、ワクチン）が提供される。そのような組成物は、本発明の弱毒化ヘルペスウイルスに外来遺伝子としてその病因因子の遺伝子を少なくとも１つ含む。含まれる外来遺伝子は、全長が好ましいが、免疫を惹起し得るエピトープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。本明細書において、「エピトープ」とは、構造の明らかな抗原決定基をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。エピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。
【０２１２】
そのような外来遺伝子としては、例えば、ＨＩＶの場合、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１７マトリクスタンパク質、ｐ２４カプシドタンパク質、逆転写酵素（ＨＩＶ ｐｏｌ）、ｔａｔ ｒｅｖなどが挙げられるがそれらに限定されない。ロタウイルスの場合、ＶＰ４、ＶＰ６、およびＶＰ７などが挙げられるがそれらに限定されない。インフルエンザウイルスの場合、ＨＡ、ＮＡ、およびＮＰなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２１３】
免疫調節タンパク質は細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘導および促進し、および／または抗体応答を誘導および促進し、および／またはＴ細胞増殖応答を誘導および促進するのに有用である。
【０２１４】
ＣＴＬ応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、細胞内病原体に対する、または自己免疫疾患または癌に関して、ワクチンとともにまたはその一部として投与された場合に特に有用である。ＣＴＬ応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組換え体ワクチン、および核酸／ＤＮＡワクチンとともに投与された場合に特に有用である。もしくは、ＣＴＬ応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は、癌または細胞内感染を患っている患者に投与される免疫療法剤として有用である。ＣＴＬ応答を誘導および促進する免疫調節タンパク質は免疫無防備状態の患者に投与された場合に有用である。
【０２１５】
本明細書において、対象となる疾患の宿主は、ヘルペスウイルスが感染し得る動物であればどの動物でもよく、例えば、霊長類（例えば、サル、ヒト）、ウシ（肉牛、乳牛）、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、ニワトリなどが挙げられる。好ましくは、その宿主は、霊長類であり、より好ましくは、ヒトである。
【０２１６】
本明細書において、対象となる宿主の年齢は、ヘルペスウイルスが感染し得る年齢であれば、どのような年齢でもよく、例えば、高齢者、成人、小児、乳児、胎児などが挙げられる。
【０２１７】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、複製非必須遺伝子が不活化されたヘルペスウイルスを提供する。より詳細には、本発明は、ＵＬまたはＵＳ領域に存在する複製非必須遺伝子が不活化されたヘルペスウイルスを提供する。従来、inverted repeat領域の遺伝子を改変することによって特性が改変されたヘルペスウイルスが利用されていたが、臨床レベルでヘルペスウイルスに起因する疾患またはがんに有効なものが提供されているとはいえない。従って、ＵＬまたはＵＳ領域に存在する複製非必須遺伝子を不活化することによって、所望の特性（例えば、弱毒化、癌細胞への選択性、宿主（例えば、ヒト）への安全性の上昇など）を得ることができたことにより従来技術にない有利な有用性が提供される。
【０２１８】
１つの実施形態において、本発明に係るワクチンは、ＵＳ３を発現しないＨＳＶ遺伝子組換え体を含有することを特徴とする。かかる組換え体としては、例えばＨＳＶ遺伝子のうちＵＳ３遺伝子が翻訳されないよう処理が施されている遺伝子組換え体、またはＨＳＶ遺伝子のうちＵＳ３遺伝子を組換え、該組換えられた遺伝子が翻訳されるとＵＳ３とは異なるタンパクが発現する遺伝子組換え体などが挙げられる。
【０２１９】
上記遺伝子組換え体を作製するための遺伝子組換え処理としては、特に限定されない。例えば、ＵＳ３遺伝子の全部または一部を欠損させる処理、ＵＳ３遺伝子の全部または一部を置換させる処理、ＵＳ３遺伝子の一部を逆位させる処理、ＵＳ３遺伝子の一部を重複させる処理、ＵＳ３遺伝子の一部を転座させる処理、ＵＳ３遺伝子に遺伝子断片を挿入しＵＳ３遺伝子を中断させる処理などが挙げられる。中でも、ＵＳ３遺伝子の全部または一部を欠損させる処理、ＵＳ３遺伝子の全部または一部を置換させる処理、またはＵＳ３遺伝子に遺伝子断片を挿入しＵＳ３遺伝子を中断させる処理が好ましい。特に、ＵＳ３遺伝子に遺伝子断片を挿入しＵＳ３遣伝子を中断させる処理がより好ましく、挿入する他の遺伝子には、翻訳を停止させるシグナルが含有されていることがさらに好ましい。翻訳を停止させるシグナルとしては、中でもＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルが好ましい。
【０２２０】
上記遺伝子組換え処理は、当該分野で十分確立されているので、それにしたがって容易に行うことができる。例えば、市販の実験書、例えば、１９８２年発行のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９年発行のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ等に記載された方法に従って容易に行うことができる。
【０２２１】
本発明で用いる「ＵＳ３を発現しないＨＳＶ遺伝子組換え体」としては、Ｌ１ＢＲ１が挙げられる。Ｌ１ＢＲ１は、ＨＳＶ−２ １８６株を用いて作製される。その作製方法を、図１０を用いて以下に説明する。
【０２２２】
ＨＳＶ−２ １８６株の遺伝子を、地図単位を付して図１０のＡに示した。また、同株のＨｉｎｄ ＩＩＩの切断地図を図１０のＢに示した。図１０のＣおよびＤから明らかなように、ＵＳ３遺伝子は、ＵＳ領域である９．６ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｌ断片（図１０のＢ）中に存在する。また、ＵＳ領域の塩基情報から、９．６ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｌ断片中のＢｇｌ ＩＩによる切断部位（図１０Ｃ中のＧ）はＵＳ３遺伝子中に含まれている（図１０のＣおよびＤ）。そこで、このＢｇｌ ＩＩによる切断部位を利用してＵＳ３遺伝子を不活化させ、ＵＳ３欠損ＨＳＶを作製する。
【０２２３】
なお、ＨＳＶ−２ １８６株のＢａｍ ＨＩ、Ｘｂａ Ｉ、Ｂａｌ ＩＩによる制限エンドヌクレアーゼ切断パターン（図１０のＣ）は、ＨＳＶ−２種ＨＧ５２株と一致していることは公知である（ＭｃＧｅｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。
【０２２４】
より具体的には、ＨＳＶ−２ １８６株の遺伝子から、４．８ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｘｂａ Ｉ断片を前クローニングする。前クローニングの方法は、例えば、ｐＬＨＸなどのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのような公知のクローニングベクターを用いて自体公知の方法に従って行えばよい。
【０２２５】
次いで、上記前クローニングされたＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｘｂａ Ｉ断片をＢｇｌ ＩＩで消化し、１４４３ｂｐの読み取り枠を、５’末端から２１５残基のところで切断する。切断された部分に、図１０のＥで示される４．３ｋｂの遺伝子断片を挿入する。図１０のＥで示される遺伝子断片は、具体的には５’末端にＨＳＶ−１β８プロモーターおよび３’末端にＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルを融合させたｌａｃ Ｚコードしている遺伝子をふくむ４．３ｋｂのＢａｍ ＨＩ断片である。ＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルによって、ｌａｃ Ｚ遺伝子の翻訳が停止する（Ｓｐａｅｔｅ ａｎｄ Ｍｏｃａｒｓｋｉ，１９８５；Ｈｏ ａｎｄ Ｍｏｃａｒｓｋｉ，１９８８）。
【０２２６】
このようにして得られたｌａｃ Ｚ遺伝子により中断されているＵＳ３遺伝子を有する遺伝子、すなわち図１０のＣで示される遺伝子断片の「Ｇ」の位置に、Ｅで示される遺伝子断片が挿入された遺伝子を公知の方法でクローニングする。なお、公知のクローニングベクターであるｐＬＨＸに、かかる遺伝子を挿入した遺伝子組換え体をｐＨＺＬ１と称する。
【０２２７】
ついで、感染性のＨＳＶ−２ １８６株の完全ＤＮＡおよびｌａｃ Ｚ遺伝子により中断されているＵＳ３遺伝子を含有する線状ｐＨＺＬ１のＤＮＡをベロ細胞にコトランスフェクション（同時細胞導入）する。同時に導入された２種のＤＮＡが組換えを起こし、ベロ細胞中でＨＳＶ遺伝子組換え体が増殖する。ｌａｃ Ｚ遺伝子により中断されているＵＳ３遺伝子を含有するＨＳＶ遺伝子組換え体は、Ｘｇａｌ染色によるプラークの色で選択することができる。すなわち、ｌａｃ Ｚ遺伝子はβ−ガラクトシダーゼをコードしており、ＨＳＶ遺伝子組換え体ｌａｃ Ｚ遺伝子が含まれていると、β−ガラクトシダーゼが発現し、かかる酵素によりβ−ガラクトシダーゼの基質であるＸｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）が濃青色の分解産物を生じるので、青色のプラークを選択すれぱｌａｃ Ｚ遺伝子を含有するＨＳＶ遺伝子組換え体を選択することができる。選択された遺伝子組換え体のうち１つを６回プラーク精製し、ベロ細胞中で増殖させて、Ｌ１ＢＲ１を作製する。
【０２２８】
上記遺伝子組換え体であるＬ１ＢＲ１が、ＵＳ３遺伝子を中断するようｌａｃ Ｚ遺伝子を含んでいるかどうかを調べるためには、野生型ＨＳＶ−２ １８６株の遺伝子と比較すればよい。具体的には、Ｌ１ＢＲ１遺伝子を制限酵素処理し、プローブとしてＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｌ断片中の１．６ｋｂのＢａｍ ＨＩ断片を用いてサザンブロットハイブリダイゼーション分析を行う。野生型ＨＳＶ−２ １８６株の遺伝子も同様の処理を行う。その結果、野生型遺伝子で観察される１．６ｋｂの断片が、Ｌ１ＢＲ１遺伝子で喪失していれば、ＵＳ３遺伝子を中断するようｌａｃ Ｚ遺伝子を含んでいることが確認できる。
【０２２９】
本発明の弱毒化ＨＳＶは、癌細胞において優位に増殖しうる、癌細胞選択性を有していることが好ましい。
【０２３０】
別の実施形態において、１つまたは２つ以上のアクセサリー遺伝子が不活化されている弱毒化ＨＳＶとしては、例えば、ＵＬ３９またはＵＬ４０が不活化されているものを挙げることができ、なかでも、ＵＬ３９またはＵＬ４０と、１つまたは２つ以上の他のアクセサリー遺伝子とが不活化されているものが好ましい。
【０２３１】
ＵＬ３９またはＵＬ４０が不活化されている弱毒化ＨＳＶは、この遺伝子にコードされておりＤＮＡ合成に必要なリボヌクレオチドレダクターゼを宿主に依存しなければならない。このため、ＵＬ３９またはＵＬ４０が不活化されている弱毒化ＨＳＶを癌患者に接種すると、増殖が盛んな癌細胞において優位に増殖させることができる。このような弱毒化ＨＳＶに感染された癌細胞は、ウイルスが保有する様々なタンパク質の細胞障害作用によって増殖が抑制され、更には死滅してしまうこともある。
【０２３２】
ＵＬ３９またはＵＬ４０に加えて、１つまたは２つ以上の他のアクセサリー遺伝子が不活化されていると、癌細胞における優位の増殖性を維持しうるとともに宿主に対する病原性を更に減弱することができる。
【０２３３】
ＵＬ３９またはＵＬ４０と、１つまたは２つ以上の他のアクセサリー遺伝子とが不活化されている弱毒化ＨＳＶとしては、例えば、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ５５およびＵＬ５６が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＬ２が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＳ３が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ２およびＵＳ３が不活性されている弱毒化ＨＳＶ等を挙げることができる。
【０２３４】
ＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ５５およびＵＬ５６が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、またはＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＬ２が不活化されている弱毒化ＨＳＶは、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）のみが不活化されている弱毒化ＨＳＶよりも、さらに高い安全性を有する。一方、ＵＬ３９（またはＵＬ４０）およびＵＳ３が不活化されている弱毒化ＨＳＶ、またはＵＬ３９（またはＵＬ４０）、ＵＬ２およびＵＳ３が不活化されている弱毒化ＨＳＶは、高い癌細胞選択性に加えて癌細胞のアポトーシスを引き起こす機能を併せ持つことができる。
【０２３５】
本発明に係るワクチンは、上記したようなＨＳＶより惹起される病気の予防治療剤として有用である。特に、本発明に係るワクチンは、ＨＳＶに起因する性感染症（例えば、陰部ヘルペス）の予防治療剤として有用である。
【０２３６】
本発明に係るワクチンを投与することにより、ＨＳＶ感染の重篤度および／またはＨＳＶ感染率を減少させることができる。
【０２３７】
後述する実施例からも明らかなように、本発明に係るワクチンに含まれるＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体は、Ｆａｓ＋単核細胞数を増加させ、また樹状細胞、貪食細胞およびＴ細胞を急速に活性化させる。さらに、該組換え体は、抗ウイルス性サイトカインであるＩＬ−１２を増加させ、またＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）をも増加させ、その刺激によりＴｈ１細胞が活性化され、細胞性免疫が活性化される。このように、ＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体を含有する本発明に係るワクチンを投与することにより、ＨＳＶ感染に対する免疫機能が賦活され、上述のようにＨＳＶ感染の重篤度および／またはＨＳＶ感染率を減少させることができる。
【０２３８】
最近、単純ヘルペスウイルス１型（以下、ＨＳＶ−１という）およびＨＳＶ−２のＵＳ３遺伝子は感染細胞におけるアポトーシス阻害に必要であることが示されている（Ｌｅｏｐａｒｄｉ，Ｒ．，Ｖａｎ Ｓａｎｔ，ａｎｄ Ｒｏｉｚｍａｎ Ｂ．（１９９７）． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４，７８９１−７８９６．；Ａｓａｎｏ，Ｓ．，Ｈｏｎｄａ，Ｔ．，Ｇｏｓｈｉｍａ，Ｆ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｄ．，Ｍｉｙａｋｅ，Ｙ．，Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．（１９９９）． Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０，５１−５６）。したがって、ＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体は、感染細胞のアポトーシス阻害を引き起こさないという利点も有する。すなわち、ＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体を投与した場合は、感染細胞が直ちにアポトーシスを起こし、ＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体の過剰増殖を抑制できるとともに、アポトーシスした感染細胞が抗原提示の役割を果たし、ＨＳＶ感染に対する免疫賦活化がより一層増強される。
【０２３９】
別の実施形態において、本発明に係る弱毒化単純ヘルペスウイルス（以下弱毒化ＨＳＶともいう）は、複製非必須遺伝子のうち、ＵＳ３遺伝子、および／または病原性関連遺伝子であるとされるＵＬ５６遺伝子のＤＮＡ塩基配列の一部あるいは全部が欠損、あるいは塩基配列の置換、修飾もしくは挿入などによって不活化されたものが用いられる。また、ＵＳ３遺伝子および／またはＵＬ５６遺伝子の転写を制御することにより不活化させたものも用いることができる。
【０２４０】
本発明で用いられる１つの好ましい弱毒化ＨＳＶはＨＦ株より採取されたクローンの一つであるクローン１０（ＭＮＯ１０）であり、該クローンはヘルペスウイルスのゲノム上１１６５１５〜１２０３４６の位置に３８３２ｂｐの欠失が存在し、ＵＬ５６の全１９７アミノ酸のＮ末端側１３６アミノ酸、およびその上流を欠いている。ＭＮＯ１０は、名古屋大学医学部病態制御研究施設ウイルス感染研究部門において、特許法によって要求されている該菌の保存および分譲が保証されており、容易に入手することができる。
【０２４１】
本発明に係る弱毒化ＨＳＶは、ＨＳＶ−１を用いて作製されたものでもよく、あるいはＨＳＶ−２を用いて作製されたものであってもよい。
【０２４２】
弱毒化ＨＳＶのＵＳ３および／またはＵＬ５６遺伝子を不活化する方法としては特に限定されず、例えば他の配列の挿入、一部の配列の切除、塩基の修飾、塩基の置換などの公知の方法を挙げることができる。
【０２４３】
ＵＳ３遺伝子および／またはＵＬ５６遺伝子が不活化することにより、本発明の弱毒化ＨＳＶを癌細胞において優位に増殖させることができる。さらに標的とする癌細胞において自殺遺伝子を効率的に発現させることができ、ひいては抗癌作用をより効果的に作用させることができる。
【０２４４】
本発明のＵＳ３遺伝子および／またはＵＬ５６遺伝子が不活化されている弱毒化単純ヘルペスウイルスは、当該ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグと組み合わせ、または組み合わせずに単独で癌の治療に使用される。
【０２４５】
本発明の弱毒化ＨＳＶは、好ましい実施形態において、チミジンキナーゼ遺伝子を含有していることから、プロドラッグであるガンシクロビルを投与すると、ガンシクロビルがチミジンキナーゼによってリン酸化され活性型となり、弱毒化ＨＳＶは、癌細胞のＤＮＡポリメラーゼとともに、ＤＮＡ中に取り込まれてＤＮＡ合成、ＤＮＡ依存性ＲＮＡ合成を阻害する。このような働きを行う遺伝子を自殺遺伝子とよび、本発明においては上記のチミジンキナーゼ遺伝子の他に、外来性の自殺遺伝子を発現可能なように組み込んでもよい。
【０２４６】
上記外来性の自殺遺伝子としては、プロドラッグを活性型に変換することができるものであれば特に限定されず、例えばシトシンデアミナーゼ遺伝子、大腸菌ｇｐｔ遺伝子、大腸菌ｄｅｏＤ遺伝子、カルボキシエステラーゼ遺伝子などを挙げることができる。
【０２４７】
別の好ましい実施形態では、本発明は、ＵＳ３欠損ＨＳＶ−２ウイルスを提供する。
【０２４８】
本発明は、ワクチン組成物（ＤＮＡワクチン、弱毒化生ワクチンおよび組換え体ワクチンを含む）の一部として個体の細胞へ遺伝子構築物を送達する工程を包含する、個体を免疫化する改良された方法を提供する。遺伝子構築物は免疫調節タンパク質をコードしおよびそれが発現を達成するためにワクチン中で機能できる制御配列へ作動可能なように連結されているヌクレオチド配列を包含する。改良されたワクチンは高められた細胞性免疫応答を生じる。
【０２４９】
本発明のＵＳ３および／またはＵＬ５６が不活化されている弱毒化単純ヘルペスウイルスは、当該ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグと組み合わせ、または組み合わせずに単独で癌の治療に使用される。
【０２５０】
プロドラッグとしては、例えばガンシクロビル、アシクロビル、タキソール、カンプトテシンなどが挙げられる。本発明におげる好ましいプロドラッグとしては、本発明において用いられる弱毒化ＨＳＶが含有している自殺遺伝子によって活性型に変換されるプロドラッグである。
【０２５１】
本発明の弱毒化ＨＳＶはチミジンキナーゼ遺伝子を含有していることから、プロドラッグであるガンシクロビルを投与すると、ガンシクロビルがチミジンキナーゼによってリン酸化され活性型となり、さらに弱毒化ＨＳＶは、癌細胞のＤＮＡポリメラーゼとともに、ＤＮＡ中に取り込まれてＤＮＡ合成、ＤＮＡ依存性ＲＮＡ合成を阻害する。このような働きを行う遺伝子を自殺遺伝子とよび、本発明においては上記のチミジンキナーゼ遺伝子の他に、外来性の自殺遺伝子を発現可能なよ
上記外来性の自殺遺伝子としては、プロドラッグを活性型に変換することができるものであれば特に限定されず、例えばシトシンデアミナーゼ遺伝子、大腸菌ｇｐｔ遺伝子、大腸菌ｄｅｏＤ遺伝子、カルボキシエステラーゼ遺伝子などを挙げることができる。
実施例
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。なお、％は、特に断りのない限り重量％を示す。
【実施例】
【０２５２】
（実施例１ 弱毒化ＨＳＶ（ＵＬ３９不活化ＨＳＶ）の作製）
ＨＳＶ−１のＵＬ３９遺伝子を含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）ヘクローニングし、そのオープンリーディングフレームを分割する形でｌａｃＺカセット（ＨＳＶ ＵＬ３９プロモーターを５’端に、大腸菌のｌａｃＺ遺伝子とＳＶ４０のｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌをその下流に有するＤＮＡ断片）を挿入したＤＮＡを作製した。このＤＮＡと、感染細胞より調製した感染性ＨＳＶ ＤＮＡとを細胞にトランスフェクトし、その３日後に産生されてきたウイルスを採取した。その中でＸ−ｇａｌ存在下にて青色に染色されるプラークを採取し、更に３回プラーククローニングを行った後、Ｖｅｒｏ細胞で増殖させストックとした。この変異株に対してＳｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ等を行い、ＵＬ３９が不活化されていることを確認した。
【０２５３】
（実施例２：ＤＮＡ複製に関しない遺伝子の不活化弱毒化ＨＳＶであるＵＬ３９およびＵＬ５６不活化ＨＳＶ（Ｈｈ）の作製）
ＵＬ５６遺伝子を含む領域が欠損しているＨＳＶ−１由来の株ＨＦを用意する（名古屋大学医学部Ｉｓｏｍｕｒａ Ｓｈｉｎ博士から入手した）。この株は野生株に比べ、マウスにおける腹腔接種での病原性が著しく低く、かつ、感染細胞に細胞融合を起こす。上記のＵＬ３９欠損ウイルスとＨＦ株とをＶｅｒｏ細胞に混合感染させ、子ウイルスの中から細胞融合を起こし、かつ、Ｘ−ｇａｌ存在下で青色プラークを作るウイルスを採取した。クローニングした後、ＰＣＲ、塩基配列の決定およびＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにより、ＵＬ３９およびＵＬ５６に欠損があることを確認した。
【０２５４】
（実施例３：ＵＬ３９不活化ＨＳＶにカルボキシエラスターゼが組み込まれた株の作製）
ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子のプロモーターをもつヒトカルボキシエステラーゼ遺伝子をｌａｃＺ遺伝子（オープンリーディングフレーム）を分割する形で挿入したＤＮＡを作製した。このＤＮＡとｌａｃＺを持つＵＬ３９不活化ウイルス由来の感染性ＤＮＡをＶｅｒｏ細胞にトランスフェクトし、産生されてくるウイルスを採取した。Ｘ−ｇａｌ存在下で無色のプラークを作るウイルスを採取し、プラーククローニングを行い、第一次ストックとした。第一次ストックとして得られた各々のクローンについて、感染細胞標本を作製し、タッグ抗体を用いて蛍光抗体法を行い、陽性のクローンに関して第二次ストックを作製した。最終的に得られたクローンについて、感染細胞におけるカルボキシエステラーゼ活性の誘導を確認した。
【０２５５】
（実施例４：ＵＬ５６不活化ＨＳＶ−１の分離）
ＵＬ５６遺伝子を含む領域を欠損しているＨＳＶ−１ウイルスをＨＦ株から分離した。このＨＳＶ−１ ＨＦ株由来クローン１０（ＭＮＯ１０：名古屋大学医学部病態制御研究施設ウイルス感染研究部門にて保管）は、ＰＣＲ、塩基配列の決定およびウエスタン分析を行うことにより、ＵＬ５６遺伝子が欠損していることを確認した。
【０２５６】
（実施例５：多核巨細胞を形成する能力を有する弱毒化ＨＳＶ（ＨＲ５２２）の作製）
実施例１で作製したＵＬ３９弱毒化ＨＳＶと、実施例４で分離したＵＬ５６遺伝子を含む領域を欠損しているＨＳＶ−１ ＨＦ株由来クローン１０とをベロ細胞（理化学研究所細胞バンク、つくば、茨城、日本）に混合感染し、ＵＬ３９弱毒化ＨＳＶのマーカーであるＸ−ｇａｌの存在下で青いプラークを作る能力と、ＨＦ ＭＮＯ１０のマーカーである多核巨細胞を形成する能力の両方を持つクローンを選択した。確認のために、表現型により分離した。ＬａｃＺを発現し（ＲＲ−を意味する）、感染細胞に多核巨細胞を形成する特徴を有するものを分離した。この混合感染により得られたクローンをＨＲ５２２と命名した。
【０２５７】
（実施例６ 弱毒化ＨＳＶを用いた癌治療）
エ一テル麻酔下に各群１０匹のヌードマウス（雌性、６週齢）の腹腔内にヒト卵巣癌由来のＳＷ１９９０を１×１０７ずつ膵近傍により注入し移植した。移植後７日目および１２日目に腹腔内にＵＬ３９不活化ＨＳＶまたはＨＲ５２２を１×１０７ＰＦＵ／１匹ずつ、それぞれ２群に注入した。ＵＬ３９不活化ＨＳＶまたはＨＲ５２２接種後１０日目（即ち、移植後１７日目および２２日目）に、ＵＬ３９不活化ＨＳＶ接種群およびＨＲ５２２接種群のうちのそれぞれ１群に、０．４ｍｇ／１匹のガンシクロビルを投与した。それぞれの群の生存率を移植後６０日目まで観察し、結果を図１に示した。
【０２５８】
図１に示された結果より、ＵＬ３９不活化ＨＳＶおよびＨＲ５２２を接種することにより、ヌードマウスの生存期間が延長することが明らかとなった。また、さらに、ガンシクロビルを投与することによって生存期間がより一層延長することが明らかとなった。なかでも、ＨＲ５２２接種＋ガンシクロビル投与群の生存率が高かった。
【０２５９】
（実施例７ 弱毒化ＨＳＶと公知の抗ガン剤との比較）
エーテル麻酔下に各群１０匹のヌードマウス（雌性、６週齢）の腹腔内にヒト卵巣癌由来のＳＷｌ９９０を１×１０７ずつ膵近傍により注入し移植した。移植後７日目および１２日目に、それぞれ１群ずつ、腹腔内にＵＬ３９不活化ＨＳＶもしくはＨＲ５２２を５×１０７ＰＦＵ／１匹ずつ注入するか、または、公知の抗ガン剤としてタキソールを０、４ｍｇ／１匹投与した。それぞれの群の生存率を移植後６０日目まで観察し、結果を図２に示した。
【０２６０】
図２に示された結果より、ＵＬ３９不活化ＨＳＶおよびＨＲ５２２を接種した群の方が、タキソールを投与した群より生存期間が延長することが明らかとなった。
【０２６１】
（実施例８ ＵＳ３欠損ウイルスの作製）
（マウスおよびウイルス）
雌のＢＡＬＢ／ｃマウスは日本ＳＬＣ（浜松、日本）から購入し、処置開始時には生後８〜１０週間であった。すべてのマウスをゲージに収容し、画一的に推奨されているガイドラインに沿って扱った。「Ｄａｉｋｏｋｕ，Ｔ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｙ．，Ｔｓｕｒｕｍｉ，Ｔ．，Ｍａｅｎｏ，Ｋ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．（１９９３）． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７，６８５−６９４．」に記載されている方法でＵＳ３を発現しないＨＳＶ−２ １８６の遺伝子組換え体を作製した（以下、Ｌ１ＢＲ１と称する）。また、比較例として、ＨＳＶ−２ １８６野生株（以下単に１８６野生株という）およびＵＳ２欠損変異体であるＹＹ２を用いた。かかる３種のウイルスをベロ細胞中で生育させ、使用するまで−８０℃で保管した。ウイルス感染価はベロ細胞で測定し、プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌで表わす。
【０２６２】
（ＨＳＶ感染方法）
「Ｐａｒｒ，Ｍ．Ｂ．，Ｋｅｐｐｌｅ，Ｌ．，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｍ．Ｒ．，Ｄｒｅｗ．Ｍ．Ｄ．Ｂｏｚｚｏｌａ，Ｊ．Ｊ．，ａｎｄ Ｐａｒｒ，Ｅ．Ｒ．（１９９４）． Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７０，３６９−３８０．」、および「Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ．Ｎ．，ａｎｄ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｉ．（１９９７）． Ｖｉｒｏｌ．２２９，２５９−２６８．」に記載された方法によって、マウスの膣内にウイルス接種した。ウイルス接種前に、すみやかにプロゲステロン優勢段階で発情周期を連動させるため、すべてのマウスにβ−エストラジオール １７−シピノサイト（β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ １７−ｃｙｐｉｏｎａｔｅ）（以下、Ｅと略す）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を０．１μｇ／マウス、および翌日以降はデポープロペラ（Ｄｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａ）（以下、ＤＰと略す。）（Ｓｉｇｍａ）２ｍｇ／マウスを皮下注射した。ＤＰ投与の５日後、ぺントバルビタール（ｐｅｎｔｂａｒｂｉｔａｌ）ナトリウムをガーゼで塗布し、マウスを麻痩させ、１８６野生株、ＹＹ２またはＬ１ＢＲ１の懸濁液２０μｌを用いて、それぞれのウイルスを膣内に感染させた。
【０２６３】
（ウイルス感染価測定法）
ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を膣にピペットで移すことで膣損傷（ｖａｇｉｎａｌ ｒａｖａｇｅ）を生じさせ、その後、「Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ．Ｎ．，ａｎｄ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｉ．（１９９７）． Ｖｉｒｏｌ．２２９，２５９−２６８．」に記載された方法に従って、ベロ細胞単分子層上でのプラーク形成による感染価の測定まで−８０℃で貯蔵した。
【０２６４】
（膣内での細胞調製）
膣由来のＭＮＣ（単核細胞）およびＥＣ（上皮細胞）は、「Ｒａｋａｓｚ，Ｅ．，Ｈａｇｅｎ．Ｍ．，Ｓａｎｄｏｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ｌｙｎｃｈ，Ｒ．Ｇ．（１９９７）．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，１６１−１６７」に記載の方法に改変を加えた「Ｉｎａｇａｋｉ−Ｏｈａｒａ，Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．，Ｓａｋａｉ，Ｔ，，Ｌｙｎｃｈ，Ｄ，Ｈ．，ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｋａｉ．Ｙ，（１９９７）．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７７，４２１−４２９．」に記載の方法に従い得た。手短に、致死性の麻酔後膣をマウスから切除し、２ｍｍ断片に切断し、４Ｕ／ｍｌＤＮａｓｅＩ含有ハンクス平衡塩溶液で３７℃６０分間インキュベートした。振盪後、懐死組織片を取り除くために細胞懸濁液をナイロンウールカラムに通し、単細胞の懸濁液を得た。通過細胞を２０分間２０℃で６００×ｇの遠心力で４０％／７５％あるいは２５％／４０％の不連続なＰｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）勾配で遠心分離した。ＭＮＣおよびＥＣはそれぞれ４０％／７５％および２５％／４０％のインターフェイスから集められた。タイムコース間でのＨＳＶ感染後、毎日５匹のマウスから単離された細胞を下記の実験のためにプールした。
【０２６５】
（フローサイトメトリー法）
細胞は、「Ｉｎａｇａｋｉ−Ｏｈａｒａ，Ｋ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｎ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．，Ｓａｋａｉ，Ｔ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｈｉｒｏｍａｔｓｕ，Ｋ．，Ａｗａｙａ，Ａ．，ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｋａｉ，Ｙ，（１９９６）。Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１，３０−４０．」に記載された方法により染色した。本発明で使用されたモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入され、下記にそれを記す；ＦＩＴＣ−抱合型抗ＣＤ３ ｍＡｂ（１４５−２ Ｃ１１）、抗ＣＤ１１ｂ ｍＡｂ（Ｍ１／７０）、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（３／２３）、抗ＩＡｄｍＡｂ（ＡＭＳ−３２．１）、ＰＥ−抱合型抗ＣＤ４ｍＡｂ（ＲＭ４−５）、抗ＣＤ４５／Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂ（ＭＲ１）、ピオチン抱合型抗ＣＤ８αｍＡｂ（５３−６．７）。染色細胞はＥＰＩＣＳ ＸＬフローサイトメトリーによって分析した（ＣＯＵＬＴＡＲ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）。
【０２６６】
（組織学的分析法）
マウスは致死的に麻痺させ、４％のホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で固定した。膣壁、子宮および直腸は矢状に切断してブロック状にし、パラフィンに埋め込んだ。次に、３μｍの厚さのパラフィン断片をヘアマトキシリン（ｈｅａｍａｔｏｘｙｌｉｎ）−エオシン染色で組織学的に調べ、ウサギのＨＳＶ−２抗血清を用いて、「Ｋｕｒａｃｈｉ，Ｒ．，Ｄａｉｋｏｋｕ，Ｔ．，Ｔｓｕｒｕｍｉ，Ｔ．，Ｍａｅｎｏ，Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｋｕｒａｔａ，Ｔ．（１９９３）．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．１３３，２５９−２７３」に記載した方法に従って免疫組織化学的に分析した。手短に脱パラフィン処理を行った後、断片を０．０２（ｖ／ｖ）％塩化カルシウムおよび０．２５（ｖ／ｖ）％トリプシン（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）含有ＰＢＳで３０分間３７℃処理し、０．３容量％の過酸化水素メタノール溶液に３０分間浸した。断片を４℃で夜通し、抗ＨＳＶ−２抗血清と反応させた。ビオチン化された抗ウサギＩｇＧ（ＤＡＫＯ、日本，東京，日本）を加えて３７℃３０分間、続いて３７℃で３０分間、ペルオキシダーゼ抱合型ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ日本）を加えて反応させた。ペルオキシダーゼ反応は０．０２％ジアミノベンジジン（ケミカル同仁、熊本、日本）および０．０１５％過酸化水素含有の０．０５Ｍトリス緩衝液（ＰＨ７．６）の中で行った。細胞核は２％のメチルグリーン（Ｃｈｒｏｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，ドイツ）で対比染色した。
【０２６７】
（ＥＬＩＳＡによる膣洗浄液でのサイトカイン測定）
膣洗浄液は毎日、感染後に集められた。膣洗浄液内のサイトカイン内容物は、メーカーの説明書に従って、マウスのＩＦＮ−γ、ＩＬ−４（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，カナダ）およびＩＬ−１２を用いてＥＬＩＳＡ法による測定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，イギリス）を用いて分析した。
【０２６８】
（統計分析）
誤差の重要度を決定するために、ｔ−検定を用いた。０．０５未満のｐ値は、誤差が有意であるとみなした。
【０２６９】
（１８６野生株、ＹＹ２（ＵＳ２欠損１８６株）またはＬ１ＢＲ１（ＵＳ３欠損１８６株）によって誘導された生殖器の病変と死亡率）
病原性に関するＵＳ２およびＵＳ３欠損の効果を測定するために、ＹＹ２あるいはＬ１ＢＲ１のそれぞれ２０，０００ＰＦＵをマウスの膣内に感染させた。図３は膣感染後の、マウスの代表的な外観を示している。ＹＹ２を感染させたマウスの性器は、接種後（ｐｏｓｔ−ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ；ｐ．ｉ．）５日目に１８６野生株を感染させたマウスと同様に著しく膨張し始めた。一方、Ｌ１ＢＲ１感染させたマウスでは膣炎症の兆候はほとんどみられなかった。生存率は図４に示している。１８６野生株あるいはＹＹ２を感染させたマウスはすべて、膣内接種後１０日以内に死亡した。対照的に、Ｌ１ＢＲ１を感染させたすべてのマウスは接種後（ｐ．ｉ．）３週間でも生き残った。
【０２７０】
（膣からのウイルスのクリアランス）
膣粘膜からのウイルスクリアランス率を比較するために、１８６野生株、ＹＹ２あるいはＬ１ＢＲ１を膣内感染させた後にウイルスの滴定を測定した（図５）。それらのマウスのウイルス滴定濃度は急速に増加し、接種後（ｐ．ｉ．）１日で最大レベルに達した。ＹＹ２およびＬ１ＢＲ１感染マウスにおける滴定濃度は５日目まで徐々に下がり、Ｌ１ＢＲ１感染マウスでは５日目以降に急激に下がった。１８６野生株感染マウスにおける滴定濃度は３日目まではよく保たれていたが、その後緩やかに低下した。
【０２７１】
（膣の組織病理学的変化）
膣および子宮の病理学的変化は接種後（ｐ．ｉ．）１、３、５および７日目で犠牲となったマウスすべてにおいて調べられた。すべてのマウスにおいて、ウイルス感染は１日目に膣壁の扁平上皮細胞上皮組織で観察された（図６Ａ、Ｂ、Ｃ）。組織学的な分析により、巨大多核細胞および核内封入体は扁平上皮細胞で見られ、ＨＳＶ−２抗原もまた、これらの細胞で検出された（図６Ｄ、Ｅ、Ｆ）。３日目までには病変に有意義な変化は観察されなかった。今回、ウイルス感染は外陰部および皮膚の扁平上皮細胞上皮組織まで拡大し、１８６野生株およびＹＹ２を感染させたマウスの上皮下組織における神経叢に達した。しかしながら、そのようなウイルスの拡散はＬ１ＢＲ１感染マウスでは観察されなかった。代わりに、単核細胞の著しい上皮下への浸透が接種後（ｐ．ｉ．）５日目に観察された（図６Ｇ、Ｈ、Ｉ）。
【０２７２】
（膣における細胞反応）
次に、膣から単離された単核細胞（ＭＮＣ）数を測定した。図７Ａに示されるように、Ｌ１ＢＲ１感染マウスのＭＮＣ数は５日目まで増加し、その後、急速に減少した。しかしながら、１８６野生株あるいはＹＹ２感染マウスでは、ＭＮＣ数は１日目には増加したが、その後は増加せず、接種後（ｐ．ｉ．）３日目に緩やかな減少が観察された。この特異的な反応動態は、膣壁の組織学的変化に非常に関連している。これらの結果から、１８６野生株あるいはＹＹ２に感染したマウスにおけるウイルスクリアランスの遅延が、高い致死率をもたらすことがわかる。
【０２７３】
（Ｆａｓ抗原の発現レベル測定）
図７Ｂに示されているように、Ｌ１ＢＲ１感染マウス中のＦａｓ＋細胞数は５日目までは、１８６野生株あるいはＹＹ２感染マウス中のＦａｓ＋細胞数より多めに増加した。Ｆａｓ＋細胞の大部分はＭＨＣクラスＩＩ抗原、Ｉ−Ａｄ（データは示されていない）に陽性であった。これは、Ｌ１ＢＲ１感染マウスにおけるＦａｓ＋膣ＥＣ数が、感染初期の段階で１８６野生株あるいはＹＹ２感染マウスよりも著しく多いことが分かる。
【０２７４】
（膣におけるＡＰＣおよびＴ細胞出現の反応動態測定）
図８からも明らかなように、ＣＤ４０およびＣＤ１１ｂは、ＤＣおよびＭφそれぞれに対する代表マーカーとして用いた。Ｌ１ＢＲ１感染マウスのＣＤ４０＋細胞数は急速に増加し、実験を通じて１８６野生株あるいはＹＹ２感染マウスよりも一貫して多かった。３日目にはＣＤ１１ｂ＋細胞の数はわずかに増加したのみであったが、５日目にはＬ１ＢＲ１感染マウスで著しい増加が観察された。Ｔ細胞に関しては、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４０Ｌ＋およびＦａｓ＋Ｔ細胞数は５日目に最大限のレベルに達したが、その後減退した。ＣＤ４０ＬはＦａｓと同様に活性化されたＴ細胞で発現された。Ｌ１ＢＲ１感染マウス中のＦａｓ＋およびＣＤ４０Ｌ＋細胞数は、１８６野生株あるいはＹＹ２感染マウスにおけるＦａｓ＋およびＣＤ４０Ｌ＋細胞数よりもはるかに多かった。それらもまた、５日目には最大レベルに適した。この結果から、膣でのＡＰＣおよびＴ細胞の誘導／活性は１８６野生株あるいはＹＹ２感染マウスに比べると、Ｌ１ＢＲ１感染マウスではより急速で、大きいことが示された。
【０２７５】
（膣洗浄液中のサイトカイン分泌）
サイトカインの生産は、ウイルス性病原体から宿主を保護するのに必要である。そこで、２日目にＥＬＩＳＡでサイトカインの生産レベルを調べた結果、ＩＬ−１２生産の増加が検出され、２日目および４日目においてＩＬ−１２生産は１８６野生株あるいはＹＹ２感染マウスよりも、Ｌ１ＢＲ１感染マウスでのほうで著しく高かった（図９）。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４はそれぞれＴｈ１とＴｈ２の代表サイトカインである。生産パターンは、ＩＦＮ−γではＬＩＢＲ１感染マウスが１８６野生株感染マウスよりも４日目で有意に高かった。一方、Ｌ１ＢＲ１感染マウスにおけるＩＬ−４生産レベルは、１８６野生株感染マウスよりも低くなる傾向にあった。ＹＹ２感染マウスにおげる両方のサイトカインの生産パターンとレベルは、１８６野生株感染マウスで観察されたものと類似していた。これらの結果から、Ｔｈ１に偏向したサイトカイン生産はＬ１ＢＲ１感染マウスで誘導されるということが分かる。
【０２７６】
本発明に係るワクチンに含有されているＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝手組換え体は非常に弱毒化されており、生物に接種しても、感染の徴候を全く示さない、またはほんの少しの徴候しか示さない。それにも関わらず、ＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体は、感染者の体内においてＨＳＶ感染に対する免疫機能を活性化させることができる。したがって、ＨＳＶ感染の重篤度および／またはＨＳＶ感染率を減少させ、ＨＳＶ感染より惹起される病気を予防および／または治療することができる。さらに、ＵＳ３遺伝子はウイルス複製に必ずしも必要でないことからかかるＵＳ３欠損ＨＳＶ遺伝子組換え体が接種した生物の体内で増殖することにより、ＨＳＶ感染に対する免疫活性を長期間に渡って持続させることができる。
【０２７７】
（実施例９ ＨＦ株クローン１０（ＭＮＯ１０）およびＵＬ３９不活化ＨＳＶの抗腫瘍作用の比較）
エーテル麻酔下に各群１０匹のＣ３Ｈマウス（生後６週齢）の腹腔内にＣ３Ｈマウス由来の腫瘍細胞株ＮｆＳａＹ８３を１×１０７細胞／１匹ずつ注入し移植した。移植後、７日目にそれぞれ１群ずつ腹腔内にＵＬ３９不活化ウイルスまたはＨＦ株クローン１０（ＵＬ５６欠損ウイルス）を１×１０７ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）／１匹ずつ注入した。ＵＬ３９不活化ウイルスを注入した群にのみ、さらに移植１２日目に２回目の注入を行い、生残日数を比較した。癌細胞のみを接種した群のマウスをコントロールとし、結果は図１１に示す。
【０２７８】
図１１に示された結果より、１３日目までは、いずれの群でも生存率は１００％を示していた。その後、ＵＬ３９不活化ウイルスを２回接種した場合であっても、ＨＦ株クローン１０を１回接種した群のほうが生存期間が延長することが明らかになった。
【０２７９】
（実施例１０ ＨＦ（ＭＮＯ１０）の連続投与による効果）
エーテル麻酔下に各群１０匹のＣ３Ｈマウス（生後６週齢）の腹腔内にＣ３Ｈマウス由来の腫瘍細胞株ＮｆＳａ Ｙ８３を５×１０６細胞／１匹ずつ注入し移植した。移植後、１群については７日目、８日目および９日目と３日間連続で腹腔内にＨＦ株（ＵＬ５６欠損ウイルス）を１×１０７ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）／１匹ずつ注入し、生残日数を比較した。癌細胞のみを接種した群のマウスをコントロールとし、結果は図１２に示す。
【０２８０】
図１２に示された結果より、１７日目までは、どちらの群でも生存率は１００％を示していた。その後、ウイルスを連続投与することにより、生存日数はさらに延長されることがわかった。
【０２８１】
（実施例１１）
本発明の弱毒化ＨＳＶ（ＭＮＯ１０）１×１０７ｐｆｕ、ブドウ糖１．８ｇ、クエン酸ナトリウム０．０６ｇを注射用水８０ｍｌに溶解し、さらに水酸化ナトリウムを加えてｐＨ６．３に調製後、注射用水で全量を１００ｍＬにメスアップした。次に、この溶液を濾過した後、ガス透過性プラスチック容器（ＰＰ製）に５００ｍＬ充填した。この容器を１１６℃で１４分間高圧蒸気滅菌を行った後、該容器を二次包材（酸化アルミ蒸着フィルム）で包装し、真空包装または窒素ガス封入し、注射剤を得た。
【０２８２】
本発明のＵＬ５６が不活化されている弱毒化ＨＳＶを用いると、１回のみの投与であっても、弱毒化ＨＳＶであるＵＬ３９不活化ウイルスを投与した場合よりも高い延命効果を得ることができる。すなわち、弱毒化ＨＳＶ株が連続的に投与されることになる。
【０２８３】
さらに、本発明の弱毒化ＨＳＶを連続投与することにより、さらに高い延命効果を得ることができ、悪性腫瘍治療用の薬学的組成物に有用であることが実証された。
【０２８４】
（実施例１２：ＵＳ３欠損ＨＳＶ−２ウイルスおよびＵＳ３およびＵＬ５６不活化ＨＳＶ（ＨＬ）の抗腫瘍作用）
次に、ＵＳ３欠損ＨＳＶ−２ウイルスおよびＵＳ３およびＵＬ５６不活化ＨＳＶ（ＨＬ）の抗腫瘍作用について調べた。
【０２８５】
（用いたウイルス）
本実施例において使用されるウイルスは以下のとおりであり、その構造は図１３に示される。
１）ＨＳＶ−２ ＵＳ３Δ（Ｌ１ＢＲ１）
ＨＳＶ−２の野生株（１８６株）からＵＳ３遺伝子をｌａｃＺカセットの挿入により不活化した変異ウイルス。このウイルスは、実施例８に記載されるように作製した。
２）ＨＳＶ ＨＬ
ＨＳＶ−１ ＨＦと、ＨＳＶ−２ ＵＳ３Δの組換えウイルスである。Ｌ領域は、おもにＨＳＶ−１ ＨＦ由来であり、Ｓ領域は、ＨＳＶ−２由来である。作製は、上記ウイルス２種を混合感染し、細胞融合を形成し、かつ、Ｘ−ｇａｌ存在下で青いプラークを生成するウイルスを分離することによって行った。その後ＰＣＲにて遺伝子を構成を確認した。ＨＬウイルスは、ＵＳ３およびＵＬ５６の遺伝子欠損を有する。
３）ＨＳＶ−１ ＵＬ３９不活化ＨＳＶ
上記実施例において使用されたものを同様にコントロールとして使用した。
【０２８６】
（マウス）
エーテル麻酔下に各群１０匹のＣ３Ｈマウス（生後６週齢）の背部および頸部にＣ３Ｈマウス由来の腫瘍細胞株ＮｆＳａｋを１×１０７細胞／１匹ずつ注入し移植した。移植後、７日目に１群ずつ、背部に腫瘍細胞を注入したマウスにはＨＳＶ−２ ＵＳ３Δを１×１０７ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）／１匹、またはコントロールとしてＰＢＳを注入し、ならびに頸部に腫瘍細胞を注入したマウスにはＨＬおよびＨｒＲ３を１×１０７ｐｆｕ／１匹ずつ、およびコントロールとしてＰＢＳを注入し、生残日数を比較した。以下の表および図１４および１５に示す。
【０２８７】
表 Ｍｅｌａｎｏｍａ固形腫瘍（背部）に対するＨＳＶ−２ ＵＳ３Δの作用
（生存数（率））
Ｃｏｎｔｒｏｌ （ＰＢＳ接種）
Ｄａｙ１−１６ ５／５（１００％）
Ｄａｙ１７ ４／５
Ｄａｙ２４ ２／５
Ｄａｙ２５ １／５
Ｄａｙ３７ ０／５（０％）
ＨＳＶ−２ ＵＳ３Δ接種群
Ｄａｙ１−２６ ５／５（１００％）
Ｄａｙ２７ ４／５
Ｄａｙ３２ ３／５
Ｄａｙ４２ ２／５
Ｄａｙ６０ ２／５（４０％）
ＮｆＳａｋ固形腫瘍（頸部）に対するＨＳＶの作用
生存数（率）
Ｃｏｎｔｒｏｌ （ＰＢＳ接種）
Ｄａｙ１−２２ ５／５（１００％）
Ｄａｙ２３ ４／５
Ｄａｙ２５ ３／５
Ｄａｙ３０ ２／５
Ｄａｙ３１ ０／５（０％）
ＨＬ接種群
Ｄａｙ１−２７ ７／７（１００％）
Ｄａｙ２８ ６／７
Ｄａｙ３０ ５／７
Ｄａｙ３２ ４／７
Ｄａｙ６０ ４／７（５７％）
ＨＳＶ−１ ＵＬ３９不活化ＨＳＶ接種群
Ｄａｙ１−２３ ７／７（１００％）
Ｄａｙ２４ ６／７
Ｄａｙ２５ ５／７
Ｄａｙ３４ ４／７
Ｄａｙ３５ ３／７
Ｄａｙ３６ ２／７
Ｄａｙ６０ ２／７（２８％）
本発明のＵＳ３が不活化されているＨＳＶを用いると、１回のみの投与であっても、よりも高い延命効果を得ることができることが実証された。
【０２８８】
（実施例１３：Ｈｈの抗腫瘍効果）
次に、ＵＬ３９およびＵＬ５６不活化ＨＳＶ（Ｈｈ）を用いて抗腫瘍効果を実証した。
【０２８９】
対象動物として、各群６〜７匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）を使用した。腫瘍としては癌腫Ｃｏｌｏｎ２６（名古屋大学医学部外科学Ｈａｙａｓｈｉ Ｓｈｕｊｉ博士より入手；大腸癌由来の細胞株；ＢＡＬＢ／ｃ由来）を使用した。この腫瘍細胞Ｃｏｌｏｎ２６を５×１０６細胞／１匹にて腹腔内に接種した。ウイルスとして、実施例２で調製したＨＳＶ−１ Ｈｈを用い、対象群としてＰＢＳ接種を行った。
【０２９０】
（形式１）
腫瘍細胞を接種後、７日目に１×１０７ｐｆｕを腹腔内に接種し、生存曲線をコントロール群（ＰＢＳ接種）とを比較した。結果を以下に示す。
【０２９１】
表 Ｈｈの抗腫瘍効果
抗腫瘍接種後日数 １５日 ３０日 ４５日 ６０日 ７５日
Ｈｈ接種群 ６／６ ５／６ ４／６ ４／６ ４／６
コントロール群 ６／６ ５／６ ４／６ ２／６ ２／６
（形式２）
腫瘍接種後、８日、９日および１０日後、３日連続で、１×１０７ｐｆｕのウイルス（Ｈｈ）を３回連続で接種し、生存曲線をコントロール群と比較した。結果を以下の表に示す。
【０２９２】
表 ３回連続投与の効果
抗腫瘍接種後日数 ３０日 ４５日 ６０日
Ｈｈ接種群 ７／７ ７／７ ７／７
コントロール群 ５／７ ４／７ ２／７
以上に示すように、Ｈｈはコントロール群に比較して顕著な抗腫瘍効果を示した。特に、安全性を著しく高めたＨｈでも３回摂取によって１００％生存した。また、これらの生存マウスに１×１０７細胞のＣｏｌｏｎ２６で再びｃｈａｌｌｅｎｇｅしたところ、１００％の生存率を示した。これは、抗腫瘍免疫が成立していることを実証する。
【０２９３】
（実施例１４：Ｌ１ＢＲ１）
この実施例では、実施例９で調製したＵＳ３を発現しないＨＳＶ−２ １８６の遺伝子組換え体を用いて固形腫瘍に対する効果を実証した。
【０２９４】
各群５匹の雌性Ｃ３Ｈ／Ｈｅ（６週齢）を対象動物として使用した。腫瘍としては、上記実施例において使用されるＮｆＳａＹ８３を用いた。
【０２９５】
背部の毛をそり落とした後、ＮｆＳａを１．２５×１０６細胞／０．１ｍｌで背部に接種した。
【０２９６】
腫瘍細胞の接種後、Ｌ１ＢＲ１（１×１０７細胞ｐｆｕ／０．１ｍｌ）を３回、腫瘍部に直接０．１ｍｌ接種した。
【０２９７】
評価は、生残数、腫瘍サイズ（体積）の変化を目安に行った。結果を以下の表に示す。
【０２９８】
表 腫瘍接種後の腫瘍サイズ体積（ｍｍ３）の推移（１匹ごとに示す）
１０日目 ２０日目 ３０日目 ４０日目 ５０日目
Ｌ１ＢＲ１ ５ ＜５ ＜５ ＜５ ＜５
接種群 ９ ５４ １５０ ５４５ 死
＜５ ＜５ ＜５ ＜５ ＜５
２４ ＜５ ＜５ ＜５ ＜５
１３ ＜５ ＜５ ＜５ ＜５
生残数 ５／５ ５／５ ５／５ ５／５ ４／５
コントロール ２１ １８６ １２１０ 死
群 ４２ ４１９ 死
７３ ４２０ 死
４２ １６１ １３４６ ４３００ 死
１４２ ２６６ ４８６ 死
生残数 ５／５ ５／５ ３／５ １／５ ０／５
上記のように、Ｌ１ＢＲ１（ＵＳ欠損ＨＳＶ−２）は、固形腫瘍に対しても優れた抗腫瘍効果を示した。
【０２９９】
（実施例１５：ＨＩＶ治療のための弱毒化ＨＳＶの利用）
次に、本発明の弱毒化ＨＳＶを利用して他の疾患を処置または予防することができることを実証する。
【０３００】
ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子のプロモーターを上流に配置し、その下流にエンベロープタンパク質であるＨＩＶ ｇｐ１２０をコードする拡散配列を配置したものを、ｌａｃＺ遺伝子（オープンリーディングフレーム）を分割する形で挿入したＤＮＡを作製する。
【０３０１】
次に、このＤＮＡと実施例５で作製した弱毒化ＨＳＶ（ＨＲ５２２）を持つＵＬ５６およびＵＬ３９の両方が不活化されているウイルス由来の感染性ＤＮＡをＶｅｒｏ細胞にトランスフェクトし、産生されてくるウイルスを採取する。
【０３０２】
Ｘ−ｇａｌ存在下で無色のプラークを作るウイルスを採取し、プラーククローニングを行い、第一次ストックとする。第一次ストックとして得られた各々のクローンについて、感染細胞標本を作製し、タッグ抗体を用いて蛍光抗体法を行い、陽性のクローンに関して第二次ストックを作製する。最終的に得られたクローンについて、市販の抗ｇｐ１２０抗体を用いてドットブロッティングを行って、ｇｐ１２０の存在について確認する。ｇｐ１２０陽性の株を以下の実験に用いる。
【０３０３】
次に、ＨＩＶ ｇｐ１２０を発現した弱毒化ＨＳＶを、ＨＩＶに感染するおそれのあるヒトの予防および／またはＨＩＶに感染したヒトの処置に使用することができる。そして、その効果は、従来の薬物治療よりも有利であり得る。
【０３０４】
上記ＨＩＶ抗原としては、ｇｐ１２０のほかに、ｇｐ４１、ｇｐ１７マトリクスタンパク質、ｐ２４カプシドタンパク質、逆転写酵素（ＨＩＶ ｐｏｌ）、ｔａｔ ｒｅｖなどを使用することができる。
【０３０５】
したがって、本発明の弱毒化ＨＳＶは、ヘルペスウイルスに関連する感染因子以外の感染症にも有効であることが実証される。
【産業上の利用可能性】
【０３０６】
本発明により、種々の疾患（例えば、感染性疾患またはがん）に対する有効な治療法が提供された。本発明は、従来有効な処置方法がなかったヘルペスウイルス関連の疾患、腫瘍などに対して副作用の少ない、持続的な効果を有する効果を提供する。これらのことは、格別の効果といえる。また、本発明の処置方法のために使用する組成物、ウイルス構築物、キット、医薬などを製造することには、産業上の利用可能性が十分ある。本発明は、医師以外に、例えば、製薬企業などが業として本発明の組成物などを生産することができることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にあると考えられる。本発明の方法もまた、純粋な医療目的の治療方法に加え、事業目的の治験そのものとして有用であることから、産業上の利用可能性がある。また、本発明の治療方法を間接的または直接的に実施することが、医療業周辺の産業において利用する可能性が十分考えられることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にある。
【図面の簡単な説明】
【０３０７】
【図１】図１は、本発明の弱毒化ＨＳＶを接種したことによる癌治療の効果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の弱毒化ＨＳＶと公知の抗ガン剤との癌治療効果を比較したグラフである。
【図３】図３は、Ｅ／ＤＰ処理後１８６野生株、ＹＹ２野生株あるいはＬ１ＢＲ１のそれぞれ２Ｘ１０４ｐｆｕで膣内感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスの臨床的特徴を示す。写真は膣内感染後７日目に撮ったものである。
【図４】図４は、１８６野生株、ＹＹ２野生株あるいはＬ１ＢＲ１のそれぞれ２×１０４ＰＦＵで膣内感染させたマウスの生存率を示す。それぞれの場合の試験数はｎ＝７である。なお、図中の黒丸は１８６野生株を、白抜きの四角はＹＹ２野生株を、白抜きの丸はＬ１ＢＲ１をそれぞれ感染させた場合を示す。
【図５】図５は、１８６野生株、ＹＹ２野生株あるいはＬＩＢＲｌをそれぞれ感染させたマウスの膣からのウイルスクリアランスを示す。０日目における膣洗浄液は、１８６野生株、ＹＹ２あるいはＬ１ＢＲ１のそれぞれ２×１０４ｐｆｕで膣内感染させた後２時間後に採取した。３つの独立した実験の値は±標準偏差（ＳＤ）で表している。なお、図中の黒丸は１８６野生株を、白抜きの四角はＹＹ２野生株を、白抜きの丸はＬ１ＢＲ１をそれぞれ感染させた場合を示す。また、図中の＊＊は、１８６野生株感染マウスにおける値と比較した場合の有意差がｐ＜０．００１であったことを示す。図中の＊は、上記有意差がｐ＜０．０１であったことを示す。
【図６】図６は、Ａ〜Ｆは、実施例において組織学的免疫組織化学的検討に用いたＢＡＬＢ／ｃマウスの膣粘膜を示す。ＡおよびＤは、模擬感染させたマウスの膣粘膜、ＢおよびＥは１８６野生株感染マウスの膣粘膜、ＣおよびＦはＬ１ＢＲ１感染マウスの膣粘膜を示す。
【０３０８】
Ｇ、Ｈ、Ｉは、接種後５日目における、１８６野生株（Ｇ）、ＹＹ２野生株（Ｈ）およびＬ１ＢＲ１（Ｉ）感染マウスの膣壁の組織学的変化を示す。なお、Ａ〜Ｉは倍率１００倍で見た場合の顕微鏡写真である。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、ＨおよびＩは、ヘマトキシリン（ｈｅａｍａｔｏｘｙｌｉｎ）−エオシン（ｅｏｓｉｎ）染色をもちいて染色したものである。Ｄ、ＥおよびＦはＨＳＶ抗原を検出したものである。
【図７】図７では、Ａは、１８６野生株、ＹＹ２野生株あるいはＬ１ＢＲ１における膣ＭＮＣの数を示す。膣ＭＮＣの数は、それぞれのウイルスを感染させたマウスから集められた生存可能な細胞数をトリパンブルーで染色された細胞数によって測定した。なお、図中の黒丸は１８６野生株を、白抜きの四角はＹＹ２野生株を、白抜きの丸はＬ１ＢＲ１をそれぞれ感染させた場合を示す。
【０３０９】
Ｂは、膣ＥＣで発現するＦａｓの動態を示す。１８６野生株、ＹＹ２野生株あるいはＬ１ＢＲ１感染マウスから単離された膣ＥＣを抗Ｆａｓ ｍＡｂで染色した。
【図８】図８は、ＨＳＶ感染マウスから単離された膣ＭＮＣを、ＡＰＣ検出のためにＣＤ１１ｂおよびＣＤ４０で染色し、Ｔ細胞検出には標示ｍＡｂで染色したものを示す。３つの独立した実験の値は±標準偏差（ＳＤ）で表されている。図中の＊＊は、１８６野生株感染マウスにおける値と比較した場合の有意差がＰ＜０．００１であったことを示す。図中の＊は、上記有意差がＰ＜０．０１であったことを示す。
【図９】図９は、膣洗浄液におけるサイトカイン生成量を示す。膣洗浄液は０，２，４日目の１８６野生株、ＹＹ２野生株あるいはＬ１ＢＲ１感染マウスから集められた。ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定された。３つの独立した実験の値は±標準偏差（ＳＤ）で表されている。図中の＊＊は、１８６野生株感染マウスの値と比較した場合の有意差がＰ＜０．０５であったことを示す。図中の＊は、上記有意差がＰ＜０．０１であったことを示す。
【図１０】図１０において、Ａは、ＨＳＶ−２の遺伝子の模式図である。該模式図には、地図単位を示した。
【０３１０】
Ｂは、ＨＶＳ−２ １８６株のＨｉｎｄ ＩＩＩの切断地図である。
【０３１１】
Ｃは、本発明に関係のある制限酵素部位（制限エンドヌクレアーゼ切断部位）の地図上の位置を示す。なお、図中のＨは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる制限酵素部位を示し、Ｂは、Ｂａｍ ＨＩによる制限酵素部位を示し、ＧはＢａｌ ＩＩによる制限酵素部位を示し、Ｘは、Ｘｂａ Ｉによる制限酵素部位を示し、
Ｄは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔであるｐＬＨＸで前クローニングされた４．８ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｘｂａ Ｉ断片におけるＵＳ３遺伝子の位置を示す。
【０３１２】
Ｅは、５’末端にＨＳＶ−１β８プロモーターおよび３’末端にＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルを融合させたｌａｃ Ｚをコードしている遺伝子をふくむ４．３ｋｂのＢａｍ ＨＩ断片を示す。かかる４．３ｋｂのＢａｍ ＨＩ断片は、ｐＬＨＸのＢａｌ ＩＩによる制限酵素部位に挿入され、遺伝子組換え体ｐＨＺＬ１が作製される。
【図１１】図１１は、ＵＬ５６欠損ＨＳＶ（ＨＦ株；ＭＮＯ１０）またはＵＬ３９不活化ＨＳＶを接種した場合の生存日数を比較した図である。図中、白抜き菱形はコントロールを、黒四角はＵＬ３９不活化ＨＳＶを１回のみ投与したものを、白抜き三角はＵＬ３９不活化ＨＳＶを２回投与したものを、そしてばつ印はＲＦ株を１回のみ投与したものを示す。
【図１２】図１２は、ＵＬ５６欠損ＨＳＶ（ＭＮＯ１０）の連続投与した場合の生存日数を示した図である。図中、黒菱形はコントロールを、白抜き三角はＨＦ株を連続投与したものを示す。そのときの体重変化も示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、実施例９で用いたゲノム構造を示す図である。Ｌ１ＢＲ１は、ＨＳＶ−２においてＵＳ３遺伝子を不活化したものである。ＨＦは、ＨＳＶ−１においてＵＬ５６遺伝子を不活化させたものである。ＨＬは、Ｌ１ＢＲ１とＨＦとをハイブリッドしたものである。Ｌ領域は、ＨＳＶ−１であり、Ｓ領域は、ＨＳＶ−２であり、ＵＬ５６およびＵＳ３の両方が欠損している。ゲノム構造は下のＰＣＲ結果から推定した。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、実施例１３で用いたゲノム構造を示す図である。ＨＦは、ＨＳＶ−１においてＵＬ５６遺伝子を不活化させたものである。Ｈｈは、ＵＬ３９およびＵＬ５６遺伝子が不活化されたＨＳＶ−１である。ＵＬ３９不活化ＨＳＶは、ＵＬ３９遺伝子が不活化されたＨＳＶ−１である。変異塩基の表も示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ＨＦの不活化の詳細な説明図である。
【図１３Ｄ】図１３Ｄには、ＴＲＬとＵＬ領域との間に挿入されたＵＬ５６周辺の遺伝子配列が示される。
【図１３Ｅ】図１３Ｅには、ＴＲＬとＵＬ領域との間に挿入されたＵＬ５２周辺の遺伝子配列が示される。
【図１３Ｆ】図１３Ｆには、もともとあるＵＬ５６の周辺の遺伝子配列が示される。
【図１４】図１４は、ＵＳ３遺伝子を不活化したＨＳＶ−２の抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ＵＬ５６遺伝子を不活化したＨＳＶ−２の抗腫瘍効果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの複製非必須遺伝子が不活化されている、単純ヘルペスウイルスであるヘルペスウイルス。
【請求項２】
外来性の自殺遺伝子をさらに含む、請求項１に記載のヘルペスウイルス。
【請求項３】
カルボキシエステラーゼ遺伝子をさらに含む、請求項１に記載のヘルペスウイルス。
【請求項４】
癌細胞選択性を有する、請求項１に記載のヘルペスウイルス。
【請求項５】
前記不活化は、前記複製非必須遺伝子の配列における、少なくとも１ヌクレオチドの置換、付加、欠失または改変が含まれる、請求項１に記載のヘルペスウイルス。
【請求項６】
前記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである、請求項１に記載のヘルペスウイルス。
【請求項７】
前記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３を含む、請求項１に記載のヘルペスウイルス。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のヘルペスウイルスを含む、薬学的組成物。
【請求項９】
弱毒化ヘルペスウイルスが活性型に変換しうるプロドラッグをさらに含む、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記プロドラッグは、ガンシクロビル、アシクロビル、タキソールおよびカンプトテシンからなる群より選択されるものを含む、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
腫瘍処置のための、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つの腫瘍処置のための薬剤をさらに含む、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグの抗癌作用増強のための、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
感染性疾患を処置または予防するための、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
腫瘍を処置または予防するための薬学的組成物を製造するための、ヘルペスウイルスの使用であって、
該ヘルペスウイルスは、少なくとも１つの複製非必須遺伝子が不活化されている、使用。
【請求項１６】
前記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３を含む、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記薬学的組成物は、ワクチンである、請求項１５、１６または１７の使用。
【請求項１９】
ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグの抗癌作用増強のための薬学的組成物を製造するための、ヘルペスウイルスの使用であって、
該ヘルペスウイルスは、少なくとも１つの複製非必須遺伝子が不活化されている、使用。
【請求項２０】
前記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３を含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである、請求項１９または２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記薬学的組成物は、ワクチンである、請求項１９、２０または２１の使用。
【請求項１】
少なくとも１つの複製非必須遺伝子が不活化されている、単純ヘルペスウイルスであるヘルペスウイルス。
【請求項２】
外来性の自殺遺伝子をさらに含む、請求項１に記載のヘルペスウイルス。
【請求項３】
カルボキシエステラーゼ遺伝子をさらに含む、請求項１に記載のヘルペスウイルス。
【請求項４】
癌細胞選択性を有する、請求項１に記載のヘルペスウイルス。
【請求項５】
前記不活化は、前記複製非必須遺伝子の配列における、少なくとも１ヌクレオチドの置換、付加、欠失または改変が含まれる、請求項１に記載のヘルペスウイルス。
【請求項６】
前記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである、請求項１に記載のヘルペスウイルス。
【請求項７】
前記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３を含む、請求項１に記載のヘルペスウイルス。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のヘルペスウイルスを含む、薬学的組成物。
【請求項９】
弱毒化ヘルペスウイルスが活性型に変換しうるプロドラッグをさらに含む、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記プロドラッグは、ガンシクロビル、アシクロビル、タキソールおよびカンプトテシンからなる群より選択されるものを含む、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
腫瘍処置のための、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つの腫瘍処置のための薬剤をさらに含む、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグの抗癌作用増強のための、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
感染性疾患を処置または予防するための、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
腫瘍を処置または予防するための薬学的組成物を製造するための、ヘルペスウイルスの使用であって、
該ヘルペスウイルスは、少なくとも１つの複製非必須遺伝子が不活化されている、使用。
【請求項１６】
前記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３を含む、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記薬学的組成物は、ワクチンである、請求項１５、１６または１７の使用。
【請求項１９】
ヘルペスウイルスによって活性型に変換されるプロドラッグの抗癌作用増強のための薬学的組成物を製造するための、ヘルペスウイルスの使用であって、
該ヘルペスウイルスは、少なくとも１つの複製非必須遺伝子が不活化されている、使用。
【請求項２０】
前記複製非必須遺伝子は、ＵＳ３を含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を改変したものである、請求項１９または２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記薬学的組成物は、ワクチンである、請求項１９、２０または２１の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１３Ｆ】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１３Ｆ】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００９−５６９６（Ｐ２００９−５６９６Ａ）
【公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１４９９０７（Ｐ２００８−１４９９０７）
【出願日】平成２０年６月６日（２００８．６．６）
【分割の表示】特願２００２−５８９６９２（Ｐ２００２−５８９６９２）の分割
【原出願日】平成１４年５月９日（２００２．５．９）
【出願人】（３０１００４７４３）株式会社エムズサイエンス (8)
【出願人】（５０２２６８９００）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月６日（２００８．６．６）
【分割の表示】特願２００２−５８９６９２（Ｐ２００２−５８９６９２）の分割
【原出願日】平成１４年５月９日（２００２．５．９）
【出願人】（３０１００４７４３）株式会社エムズサイエンス (8)
【出願人】（５０２２６８９００）
【Ｆターム（参考）】
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