ベクターとして鳥類ヘルペスウイルスを用いた鳥類用組換え生ワクチン
【課題】鳥類ヘルペスウィルスをベクターとして有する鳥類用組換え生ワクチン
【解決手段】ＣＭＶ即時初期プロモータの制御下に、ＯＲＦ ＵＬ５５のＡＴＧと隣接する繰り返し領域を有するＵLの接合点との間の領域に挿入された、鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコードし且つ発現する塩基配列を少なくとも１つ含む鳥類用組換え生ワクチンと、異なる配列が挿入されたワクチンを少なくとも２種含む混合物または混合用の多価ワクチン製剤。ベクターはマレック病ウィルス（ＭＤＶおよびＨＶＴ）、感染性喉頭器官炎ウィルスＩＬＴＶおよびアヒルのヘルペスウィルスからなる群の中から選択するのが好ましい。
【解決手段】ＣＭＶ即時初期プロモータの制御下に、ＯＲＦ ＵＬ５５のＡＴＧと隣接する繰り返し領域を有するＵLの接合点との間の領域に挿入された、鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコードし且つ発現する塩基配列を少なくとも１つ含む鳥類用組換え生ワクチンと、異なる配列が挿入されたワクチンを少なくとも２種含む混合物または混合用の多価ワクチン製剤。ベクターはマレック病ウィルス（ＭＤＶおよびＨＶＴ）、感染性喉頭器官炎ウィルスＩＬＴＶおよびアヒルのヘルペスウィルスからなる群の中から選択するのが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組み換えによって鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコードし且つ発現する少なくとも１つの塩基配列をワクチンを接種した動物が病原物質から効果的に保護される免疫を獲得するような条件で挿入した、鳥類ヘルペスウィルス、特にマレック病(Marek's disease) ウィルス(MDV) 、特に HVTウィルス（七面鳥のヘルペスウィルス）をベースとした鳥類用の組換え生ワクチンに関するものである。
本発明は感染性喉頭器官炎ウィルス(ILTV)およびアヒルのヘルペスウィルスにも適用される。
【背景技術】
【０００２】
鳥類の病原物質、特にマレック病ウィルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）、感染性喉頭器官炎ウィルス（ＩＬＴＶ）、ガンボロ病ウィルス（感染性滑液嚢炎ウィルスＩＢＤＶ）、感染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）および鳥類の貧血症ウィルス（ＣＡＶ）を含む病原性ウィルスに対して鳥類に予防接種を行うための鳥類の組換え生ベクターは既にいくつか提案されている。
そのために用いられる生ベクターはアヴィポックスウィルス(avipox viruses)特に、鶏痘ウィルス（下記特許文献１、下記非特許文献１、２)、血清型が２および３のマレック病ウィルス(ＨＶＴ)(下記特許文献２〜５、下記非特許文献４〜６）またはＩＬＴＶおよび鳥類のアデノウィルスである。
【特許文献１】欧州特許第0,517,292 号公報
【非特許文献１】H. G. Heine 達、 Arch. Virol. 1993. 131. 277-292
【非特許文献２】D.B. Boyle達, Veterinary Microbiology 1994. 41. 173-181
【非特許文献３】C.D. Bayliss達, Arch. Virol. 1991. 120. 193-205
【特許文献２】国際特許第WO-A-87 04463 号公報
【特許文献３】国際特許第WO-A-89 01040 号公報
【特許文献４】国際特許第WO-A-93-25665 号公報
【特許文献５】欧州特許第 513,921号公報
【非特許文献４】J. McMillen, Poultry Condemnation Meeting, 1994年10月, 359-363
【非特許文献５】P.J.A. Sondermeijer 達, Vaccine 1993. 11. 349-357
【非特許文献６】R.W. Morgan 達, Avian Diseases 1992. 36. 858-870、 1993, 37, 1032-1040
【０００３】
これらのウィルスを予防接種に使用した場合、特定の事例でかなりの防御効果が示されることが稀にはあるが、これらの組換えウィルスによって誘導される防御レベルは変化し易く、一般には弱いか、部分的なものである。
鳥類用組み換え生ワクチンによる予防の中で最も困難なものはガンボロ病ウィルスまたはIBDVウィルスである。すなわちこれらの病気に対しては従来の不活化または弱毒化生ワクチンが効果的であるが、組換え生ワクチンで適当な効果を示すものはない。
カンボロ病ウィルスのゲノムは二重鎖ＲＮＡで構成されており、その最大断片（断片Ａ）は115kDaのポリプロテインをコードする。このポリプロテインはさらに３つの蛋白質VP2(41kDa)、VP4(28kDa)、VP3(32kDa)に分裂する。VP4 は115kDaのポリプロテインの成熟に関与するプロテアーゼであると言われている。VP2 とVP4 との間の分裂箇所については大体の位置しか分かっていない(下記非特許文献７)。蛋白質VP2 は中和抗体を出す免疫源であり、ガンボロ病に対する防御を誘導する。
【非特許文献７】M. Jagadish, J. Virol. 1988, 62, 1084-1087
【０００４】
免疫原性のIBDV蛋白質をコードする遺伝子を各種の生ベクターに挿入する方法は既に提案されている：欧州特許第 517,292号（VP2 またはポリプロテインをコードする配列をアヴィポックスに挿入);上記の非特許文献１〜３ (ＶＰ２を鶏痘に）。
マレック病ウィルスも既に提案されている：下記特許文献６、７（ｇＣ、ＴＫ、ＰＲ１，ＰＲ２の各種挿入部位）、下記特許文献８（ＰＲ２）、下記特許文献９（ＵＳ３）、下記特許文献１０、下記特許文献１１（ＢａｍＨＩ＃１６および＃１９）および下記特許文献１２（ＵＳ３）。下記非特許文献８は ＨＶＴゲノムにレトロウィルスを組み込むための組み込み部位の数を決定しており、これらの部位はＢａｍＨＩ制限酵素断片Ｆ、ＡおよびＩ上に位置している。
【特許文献６】国際特許第WO-A-90 02802号公報
【特許文献７】国際特許第WO-A-90/02803号公報
【特許文献８】フランス国特許出願第90/03105号公報
【特許文献９】国際特許第WO-A-９０／１１１４６号公報
【特許文献１０】国際特許第ＷＯ−Ａ−８７／０４４６３号公報
【特許文献１１】国際特許第ＷＯ−Ａ−８９／０１０４０号公報
【特許文献１２】国際特許第ＷＯ−Ａ−９３／２５６５５号公報
【非特許文献８】R.J. Isfort 達(Virology 1994. 203. 125-133
【０００５】
一般に市販のものを含む各種プロモータは従来技術の各種構成で利用されている。すなわちPRV gXプロモータ、HCMV IE （ヒトのCMV 即時初期）プロモータ、ヘルペス単純ウィルスのα−４プロモータ、FPV P.E/L プロモータ（鶏痘プロモータ)(下記非特許文献９)、ＲＳＶ(Rous sarcomavirus)のＬＴＲ 配列に由来する痘疹ウィルスのＰ７．５ (下記非特許文献１０)およびｐ１１ (下記非特許文献１１）プロモータ、ＳＶ４０の初期プロモータ、さらにＭＤＶまたはＨＶＴプロモータ、例えばｇＢ、ｇＣ、ＴＫ、ＲＲ２などの遺伝子のプロモータがあるが、一貫したパターンは現れていない。特にＨＶＴにおける構成の場合。いくつかのプロモータ配列は組換えＨＶＴまたはＭＤＶベクターの複製を禁止する(下記非特許文献１２および下記非特許文献１３)。上記プロモータのいくつか、例えばＳＶ４０、ＬＴＲＲＳＶおよびＰＲＶｇＸは、マレックウィルスのいくつかの遺伝子本来のプロモータ、特に血清タイプ３と同様に何らかの効力を示す。
【非特許文献９】H.Heine et al., Arch. Virol. 1993. 131. 277-292
【非特許文献１０】C. Bayliss et al., Arch. Virol. 1991. 120. 193-205
【非特許文献１１】D. Boyle et al., Vet. Microb. 1994.41. 173-181
【非特許文献１２】D. R. Marshall et al.,J. Vir. Meth. 1992. 40. 195-204
【非特許文献１３】Virology1993. 195. 638-648
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＥＶＴベクターに鳥類の免疫原、特にＩＢＤＶの蛋白質ＶＰ２をコードする配列を少なくとも１つ挿入したものをベースとする組換え生ワクチンを開発することにある。
ＶＰ２をコードする配列を組み込んだワクチンは動物をガンボロ病から十分に防御することができ、死亡およびファブリシウス滑液嚢炎から守ることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の対象は、ベクターとして鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコードし且つ発現する塩基配列を少なくとも１つ含む鳥類ヘルペスウィルスを含む鳥類用組換え生ワクチンであり、上記塩基配列は、即時初期ＣＭＶプロモータの制御下に、ＯＲＦ ＵＬ５５のＡＴＧと隣接する繰り返し領域を有するＵLの接合点との間の領域に挿入されている。
この挿入領域はＨＶＴではＢａｍＨＩ断片Ｉに相当し、ＭＤＶではＢａｍＨＩ断片Ｋ＋Ｈに相当する。このことはブックマスター(A. E. Buckmaster)の下記文献１４に記載されている。
【非特許文献１４】J. Gen. Virol.1988. 69. 2033-2042)
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明による鳥類用ヘルペスウィルスはマレック病ウィルス、特に HVT、感染性喉頭器官炎ウィルスＩＬＴＶ、アヒルのヘルペスウィルスであるのが好ましく、マレック病ウィルス、特に、ＨＶＴウィルスが好ましい。
ＨＶＴのＢａｍＨＩ制限断片Ｉは複数のＯＲＦと３個の遺伝子間領域とを有し、さらに本発明の挿入領域として複数の好ましい挿入領域、好ましくは３つの遺伝子間領域１、２および３とＯＲＦ ＵＬ５５とを含んでいる。
挿入領域への挿入とは、欠失を伴わない挿入、遺伝子間領域の複数の塩基を欠失させて行う挿入、ＯＲＦを完全または部分的に欠失させて行う挿入あるいは欠失させずに行う挿入を意味する。
ＣＭＶ即時初期プロモータ（ＣＭＶ immediate early promoter, ＩＥ)とは例に挙げた断片およびそれと同じプロモータ活性を保持するサブ断片を意味する。
ＣＭＶＩＥプロモータはヒトのプロモータ（ＨＣＭＶＩＥ）またはネズミのプロモータ（ＭＣＭＶＩＥ）あるいは由来の異なるＣＭＶＩＥプロモータ、例えばラットまたはモルモット由来のプロモータにすることができる。
【０００９】
マレックベクターに挿入され、発現される塩基配列は鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドすなわち本発明で実現される好適な条件のもとで発現された時に、予防接種をした動物が病原物質から効果的に防御されるような免疫を獲得できるようなポリペプチドをコードする任意の配列にすることができる。従って、所定の病気の対象となる抗原をコードする塩基配列を本発明の条件下で挿入することができる。
本発明の組換え体は、卵の状態での予防接種や生後１日目のヒナの予防接種、さらに大きなヒナや成鳥の予防接種で使用することができる。
本発明は特にＩＢＤＶウィルスのＶＰ２ポリペプチドを適切にコードする塩基配列の挿入に使用することができる。これによって得られる組換え生ワクチンはマレック病に対する防御に加えてガンボロ病に対して完全に防御できる。必要な場合には、別のＩＢＤＶ抗原、例えばＶＰ３やポリプロテインＶＰ２＋ＶＰ４＋ＶＰ３などをコードする配列を挿入することもできるが、これらの挿入は好ましくない。
【００１０】
ガンボロ病に対する組換えワクチンは１回の投与量当り10〜104pfuの濃度で与えるのが好ましい。
本発明の他の好ましいケースはマレック病ウィルスの抗原をコードする塩基配列、特にｇＢ、ｇＣ、ｇＤおよびｇＨ＋ｇＬ遺伝子（特許文献７）、ニューカッスル病ウィルスの抗原をコードする塩基配列、特にＦおよびＨＮ遺伝子、感染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ） の抗原をコードする塩基配列、特にＳおよびＭ遺伝子 （非特許文献１５、非特許文献１６）、鳥類の貧血症ウィルス（ＣＡＶ） の抗原をコードする塩基配列、特にＶＰ１（５２ｋＤａ）＋ＶＰ２（２４ｋＤ） （非特許文献１７）および感染性喉頭器官炎ウィルス（ＩＬＴＶ）の抗原をコードする塩基配列、特にｇＢ（特許文献６）、ｇＣ、ｇＤおよびｇＨ＋ｇＬを挿入したものである。
【非特許文献１５】M. Binns et al., J. Gen. Virol. 1985. 66. 719-726
【非特許文献１６】M. Boursnell et al., Virus Research 1984. 1. 303-313
【非特許文献１７】N.H.M.Noteborn et al., J. Virol. 1991. 65. 3131-3139
【００１１】
投与量はガンボロワクチンで確認されたものと同じにするのが好ましい。
本発明の有利な展開は、ＣＭＶＩＥプロモータを別のプロモータにヘッドツーテイル(Head-to-tail)の向きで連結し、２つの塩基配列は一方はＣＭＶ ＩＥのプロモータの制御下に挿入し、もう一方は該プロモータに連結されたプロモータの制御下に挿入しきるようにすることである。この構成はＣＭＶ ＩＥプロモータ、特にそのエンハンサー部分によって連結されたプロモータによって誘導される転写が活性化されるという点で特筆すべきものである。連結されるプロモータとして好ましいものはマレック1.8 RNA プロモータであり、その転写活性はこれらの条件下で4.4倍になることが分かっている。
本発明の典型的なケースは、ＣＭＶＩＥの制御下にＩＢＤＶ ＶＰ２をコードする配列を含み、別のプロモータの制御下にもう１つの鳥類疾患の抗原、特に上記のものをコードする塩基配列を含むワクチンである。
【００１２】
由来の異なるCMV IEプロモータをヘッドツーテイルの向きに並べることも可能である。
特に、マレック病、ニューカッスル病、感染性喉頭器官炎、感染性気管支炎および鳥類の貧血症に対するワクチンについては、1.8RNAプロモータをＣＭＶＩＥプロモータの代わりに単独で使用することもできる。
本発明の他の対象は、異なる病原体に由来する異なる配列を挿入された上記定義の組換え生ワクチンを少なくとも２種含む、混合物または混合用の多価ワクチン製剤にある。
本発明は、さらに、上記定義の組換え生ワクチンまたは多価ワクチン製剤を投与する鳥類の予防接種法に関するものである。本発明は特に卵の状態での予防接種、生後１日またはそれ以上のヒナおよび成鳥の予防接種を行うための方法を対象にする。
【００１３】
以下、図を参照して非限定的な実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。
図は遺伝子間部位での構成図と配列のリストである。
遺伝子間部位での構成用配列リスト
配列 NO.１ ＨＶＴＢａｍＨＩ断片Ｉの配列
配列 NO.２ オリゴヌクレオチドEL102
配列 NO.３ オリゴヌクレオチドEL161
配列 NO.４ オリゴヌクレオチドEL147
配列 NO.５ オリゴヌクレオチドEL162
配列 NO.６ オリゴヌクレオチドEL154
配列 NO.７ オリゴヌクレオチドEL163
配列 NO.８ オリゴヌクレオチドEL164
配列 NO.９ オリゴヌクレオチドEL165
配列 NO. 10 オリゴヌクレオチドEL132
【００１４】
配列 NO. 11 オリゴヌクレオチドEL133
配列 NO. 12 オリゴヌクレオチドMB070
配列 NO. 13 オリゴヌクレオチドMB071
配列 NO. 14 オリゴヌクレオチドCD001
配列 NO. 15 オリゴヌクレオチドCD002
配列 NO. 16 オリゴヌクレオチドCD003
配列 NO. 17 オリゴヌクレオチドCD004
配列 NO. 18 NDV HV遺伝子の配列
配列 NO. 19 オリゴヌクレオチドEL071
配列 NO. 20 オリゴヌクレオチドEL073
【００１５】
配列 NO. 21 オリゴヌクレオチドEL074
配列 NO. 22 オリゴヌクレオチドEL075
配列 NO. 23 オリゴヌクレオチドEL076
配列 NO. 24 オリゴヌクレオチドEL077
配列 NO. 25 ＭＤＶ１．８−ｋｂｐＲＮＡプロモータの配列
配列 NO. 26 オリゴヌクレオチドMB047
配列 NO. 27 オリゴヌクレオチドMB048
配列 NO. 28 オリゴヌクレオチドMB072
【実施例】
【００１６】
全てのプラスミドの作製はサムブルック(Sambrook)達の Molecular Cloning:
A Laboratory Manual.第２版、Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring
Harbor. New York. 1989) に記載の分子生物学の標準的手法で行った。本発明で使用した全ての制限酵素断片はジェネクリーン(Geneclean) キット (BIO 101 Inc. La Jolla, CA)を用いて単離した。
親ウィルスとして使用したウィルスは七面鳥ヘルペスウィルス（ＨＶＴ）のＦＣ１２６株で、地域家禽研究所 (Regional Poultry Research Laboratory USDA, East Lansing, Michigan)のウィッタ博士が２３週齢の七面鳥群から単離されたものである(下記非特許文献１８)。このウィルスの培養条件は特許文献８（フランス国特許出願第90/03105号公報）に記載のものを用いた。
【非特許文献１８】Writter R. L. et. al., Am. J. Vet. Res. 1970.31. 525-538
【００１７】
実施例１
マレック病ウィルスからのＤＮＡ抽出
７日目にMDV のRB1B株を用いて攻撃したニワトリから感染14日後に血液の全量を注射器を用いて抗凝結物質（100IU/mlのヘパリン溶液）上に回収した。次いでこの血液を室温で15分間、30ｇで遠心分離した。軟膜と供に血漿を除去し、無菌のPBS を用いて最終量が10mlとなるように希釈した。150 ｇで15分間遠心分離した後、細胞ペレットを２％の牛胎児血清(FCS) を含む199 培地（ギブコ−BRL カタログ番号042-01183M）２mlに再懸濁した。
次に、感染させたリンパ球の全ＤＮＡをR. Morgan 達の方法 (Avian Diseases1990. 34. 345-351)に従って抽出した。これはPCR 試験の鋳型として直接使用することができる。MDV ウィルスのゲノム断片をクローニングするために、RB1B株をCEF 上で培養し、リー(Lee Y.)達の方法(J. Gen. Virol. 1980. 51. 245-253)に従って精製したウィルス粒からウィルスのＤＮＡを調製した。
【００１８】
実施例２
ＭＣＭＶウィルス（マウスのサイトメガロウィルス）のゲノムＤＮＡの調製
米国タイプカルチャーコレクション(Type Culture Collection, Rockville,
Maryland, USA)からＭＣＭＶウィルスのSmith 株を入手した(ATCC No. VR-194) 。このウィルスをBalb/Cマウスの胎児細胞上で培養し、このウィルスのウィルスＤＮＡをエベリング達(Ebeling A. et al., J. Virol. 1983. 47. 421-433)の方法で精製した。
【００１９】
実施例３
トランスフェクション試験のためのHVT ウィルスのゲノムＤＮＡの調製
トランスフェクション試験に用いるウィルスＤＮＡはモルガン(R.Morgan)達のAvian Diseases. 1990. 34. 345-351 に記載の方法でHVT ウィルスのＦＣ１２６株に感染させた二次培養ＣＥＣ（ＣＥＣＩＩ）から調製した。
【００２０】
実施例４
ＢａｍＨＩ断片Ｉの説明
ＨＶＴウィルスＦＣ１２６株の5.8-kbpのＢａｍＨＩ断片Ｉ (Igarashi T. et al., J.Gen. Virol. 1989. 70. 1789-1804)を Genecleanを用いて単離し、ベクターpBS-SK+ のBamHI 部位にクローニングしてプラスミドpEL037を作製した。この断片の配列の全体(5838bp)Ｈ確定している（図１〜４、配列 NO.１）。この配列では６個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ)が同定されている。これらのORF によってコードされる可能性のある蛋白質を研究した結果、これらの蛋白質のいくつかが他のαヘルペスウィルス内に存在するＯＲＦによってコードされる蛋白質との間に相同性を示すことが明らかになった。第１番目のＯＲＦ（ＯＲＦ１）(配列 NO.１の676 〜1209の位置) はＨＳＶ−１ＵＬ５５のＯＲＦ、ＥＨＶ−１ 遺伝子４のＯＲＦおよびＶＺＶ遺伝子５のＯＲＦとの間に相同性を示し、178 アミノ酸(aa)の理論上の蛋白質ＨＶＴＵＬ５５をコードする。ＯＲＦ２は配列 NO.１の1941〜1387の位置にあって ＯＲＦＥＨＶ−１遺伝子３によってコードされる蛋白質と相同な185aa の蛋白質をコードする。 ＯＲＦ３は不完全である。これは配列 NO.１の5838〜3573の位置にあってＭＤＶのＯＲＦ２１との間に相同性を示す(Ross No. et al. Virus Genes. 1993. 7. 33-51) 。この配列で同定される他３つの ＯＲＦすなわちＯＲＦ４ (1403 〜1957まで)(185aa の蛋白質）、ＯＲＦ５（3081〜2287まで)(265aa の蛋白質）およびＯＲＦ６（不完全；479 〜１まで）は、配列ライブラリー中に相同なものを持たない。ＨＶＴウィルスのＢａｍＨＩ断片Ｉのゲノムは外部遺伝子の発現のためのカセットの挿入部位として使用可能な遺伝子間領域が３箇所存在する構成をしている。
【００２１】
遺伝子間領域（遺伝子間領域１）は ＯＲＦＵＬ５５とＯＲＦＨＶＴ遺伝子３との間に存在する。第２の遺伝子間領域（遺伝子間領域２）はＯＲＦＨＶＴ遺伝子３と２６５−ａａＯＲＦとの間に存在する。第３の遺伝子間領域（遺伝子間領域３）は２６５−ａａＯＲＦとＯＲＦ２１との間に存在する。これら３つの領域は、得られた組換えＨＶＴウィルスのin vivoでの複製に影響を与えずに、発現カセットの挿入のために使用することができる。
以下、この遺伝子間領域１、２および３のためのドナープラスミドの作製例を説明する。
【００２２】
実施例５
遺伝子間領域１用のドナープラスミドの作製
プラスミド ｐＥＬ０３７をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとで処理して、2672-bp と2163-bp のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を単離した。これらの断片を予めＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで処理したベクターｐＢＳ−ＳＫ＋に導入して 5167bp のプラスミドｐＥＬ０３９と、6104bpのプラスミド ｐＥＬ０４０とをそれぞれ得た。プラスミドｐＥＬ０３９（図５）をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで処理して997bp のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片（断片Ａ）を得た。
下記のオリゴヌクレオチドおよび鋳型ｐＥＬ０３９を用いてＰＣＲにより420-bpの断片を作製した：
EL102 （配列 NO.２） 5'CATTATAAGACCAACGTGCGAGTC 3'
EL161 （配列 NO.３） 5'GTTCACGTCGACAATTATTTTATTTAATAAC 3'
この断片を ＰｓｔＩとＳａｌＩとで処理して250-bpのＰｓｔＩ−ＳａｌＩ断片（断片Ｂ）を単離した。断片ＡおよびＢを予めＢａｍＨＩとＳａｌＩとで処理したベクターｐＢＳＩＩ−ＳＫ＋（ストラタジーン社）に導入して4160-bpのプラスミドｐＥＬ０７７（図６）を得た。プラスミドｐＥＬ０３９をＢｓｔＢＩおよびＳｃａＩで処理して（ブラントエンドを有する）475-bpのＢｓｔＢＩ−ＳｃａＩ断片（断片Ｃ）を単離した。
【００２３】
下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pEL039を用いて715-bpのＰＣＲ断片を作製する：
EL147 （配列 NO.４）
5'AAGATAATGGGCTCCCGCTGTTC 3'
EL162 （配列 NO.５）
5' TAATTGTCGACCCCGGGGAATTCGTTTAATGTTAGTTTATTC 3'
この断片をＢｓｔＢＩとＳａｌＩとで処理して465-bpのＢｓｔＢＩ−ＳａｌＩ断片（断片Ｄ）を単離した。断片Ｃおよび断片Ｄを予めＡｐａＩで処理してクレノーポリメラーゼで修復した後、ＳａｌＩで処理したプラスミッドｐＥＬ０７７に導入して5082-bpのプラスミドｐＥＬ０７９（図７）を得た。このプラスミドは遺伝子間部位１にＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ−ＳａｌＩポリリンカーを含んでいる。
【００２４】
実施例６
遺伝子間領域２のためのドナープラスミドの作製
プラスミドｐＥＬ０３９（実施例５）をＢｓｔＢＩおよびＰｓｔＩで処理して715-bpのＢｓｔＢＩ−ＰｓｔＩ断片（断片Ａ）を単離した。
下記オリゴヌクレオチドと鋳型pEL039を用いてＰＣＲを行って500-bpのＰＣＲ断片を作製した：
EL154 （配列 NO.６） 5'GAAATGCAAACTAACATTATTGTC 3'
EL163 （配列 NO.７） 5'GTGTAAATAGTCGACAATATAGATAACGGGC 3'
この断片をＢｓｔＢＩ とＳａｌＩとで処理し、430-bpのＢｓｔＢＩ−ＳａｌＩ断片（断片Ｂ）を単離した。断片ＡとＢを予めＰｓｔＩとＳａｌＩとで処理したベクターｐＢＳＩＩ−ＳＫ＋に導入して4081-bp のプラスミドｐＢＬ０７６（図８）を得た。
【００２５】
下記オリゴヌクレオチドと鋳型ｐＥＬ０３９とを用いて565-bpのＰＣＲ断片を作製した：
EL164 （配列 NO.８）
5'CTATATTGTCGACCCCGGGGAATTCATCGACATGATTAAATAC 3'
EL165 （配列 NO.９）
5' CAATGAAGAAATATTTTCTTTGTTCCTTGAAATGC 3'
この断片をＳａｌＩおよびＳｓｐＩとで処理して535-bpのＳａｌＩ−ＳｓｐＩ 断片を単離した。この断片を、あらかじめＡｐａＩで処理してクレノーポリメラーゼで修復後にＳａｌＩで処理したプラスミドｐＥＬ０７６に導入して、4598-bpのプラスミドｐＥＬ０７８（図９）を作製した。このプラスミドは、遺伝子間領域２にＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ−ＳａｌＩ ポリリンカーを含んでいる。
【００２６】
実施例７
遺伝子間領域３のためのドナープラスミドの作製
プラスミドpEL040（実施例５参照）をNcoIとSphIで処理して1468-bp のNcoI-SphI 断片を単離した。この断片を予めNcoIとSphIで処理したプラスミドpUC BM20（ベーリンガーマンハイム、カタログ番号1219235 ）に導入して4182-bp のプラスミドpEL054（図10）を作製した。プラスミドpEL040をEcoRI およびSphIで処理して614-bpのEcoRI-SphI断片を単離した。この断片を予めEcoRI とSphIとで処理したプラスミドpUC BM20に導入して3263-bp のプラスミド pEL055 （図11）を得た。プラスミド pEL055 をEcoRI で処理し、クレノーポリメラーゼを用いて修復し、それをつなぎ、HindIII で処理し、クレノーポリメラーゼで修復し、最後にそれをつないで3279-bp のプラスミドpEL062（図12）を得た。プラスミドpEL054をNcoIとSalIとで処理して1492-bp のNcoI-SalI 断片（断片Ａ）を単離した。
下記２種類のオリゴヌクレオチドを互いにハイブリダイズさせて24-bp のSalI-SphI 断片（断片Ｂ）を得た：
【００２７】
EL132 （配列 NO. 10) 5' CCGAATTCATATAAGCTTACGTG 3'
EL133 （配列 NO. 11) 5' TCGACACGTAAGCTTATATGAATTCGGCATG 3'
断片ＡとＢを予め NcoI と SphI とで処理したプラスミドpEL062に導入して、4787-bp のプラスミドpEL066（図13）を得た。このプラスミドは遺伝子間領域３にEcoRI-HindIII-SalIポリリンカーを含んでいる。
【００２８】
実施例８
ドナープラスミドpEL090の作製とvHVT16の単離
BamHI-HindIII カセット状のIBDV VP2遺伝子を含むプラスミドpEL004（＝フランス国特許出願第92/013109 号に記載のプラスミド pGH004 に等しい）を BamHIとXbaIとで処理して1140-bp のBamHI-XbaI断片（切り出されたVP2 遺伝子）を単離した。この断片を予めXbaIおよびBamHI で処理したベクターpBS-SK+ にクローニングして4052-bp のプラスミドpEL022（図14）を得た。このベクターpBS-SK+
をEcoRV とXbaIとで処理し、次いでそれをつないでpBS-SK+ （変性されたもの）を得た。プラスミドpEL004をKpnIとHindIII で処理して、完全なIBDV VP2を含有する1387-bp のKpnI-HindIII断片を単離した。この断片を予めKpnIとHindIII で処理したベクターpBS-SK* にクローニングして 4292bp のプラスミドpEL023（図15）を得た。プラスミドpEL022をBamHI およびNotIで処理して1122-bp のBamHI-NotI断片（断片Ａ）を単離した。
【００２９】
プラスミドpEL023をBamHI とNotIとで処理して333-bpのBamHI-NotI断片を単離した（断片Ｂ）。断片ＡとＢを予め NotI で処理してアルカリホスファターゼで処理したベクターpBS-SK+ に導入して4369-bp のプラスミドpEL024（図16）を得た。プラスミドpEL024をNcoIで処理して1145-bp のNotI-NotI 断片を単離した。この断片を予め NotI で処理したプラスミドpCMVβ（クロンテック カタログ番号6177-1）に導入して 5096-bpのプラスミド pEL026 （図18）を得た。プラスミドpEL026を EcoRI、SalIおよびXmnIで処理して 2428-bpのEcoRI-SalI断片を単離した。この断片を予め EcoRIおよび SalI で処理したプラスミドpEL079（実施例５）に導入して、7514-bp のプラスミドpEL090（図19）を得た。このプラスミドによって、HCMV-IE/IBDV VP2発現カセットをHVT ウィルスの遺伝子間部位１に挿入することが可能となる。
【００３０】
24時間培養した初代 CEF細胞を１μｇの直鎖状プラスミドpEL090＋５μｇのHVT ウィルスDNA を 300μｌのOptiMEM 培地（ギブコ BRL カタログ番号041-01985H）に入れたものと、100 μｇのLipofectAMINE を300 μｌの培地に希釈したものとの混合物（混合物の最終量は600 μｌ）を用いて感染させた。この600 μｌを３ml（最終量）の培地に希釈して３×106 のCECI上に播いた。混合物を細胞と接触させた状態で５時間保ち、その後取り除いて５mlの培養培地で置き換える。その後細胞を37℃で３日間培養し、その後プロナーゼ処理して、新鮮なCECII と混合し（３：１で混合）、さらに再び96ウェルのプレート１個に播く。このプレートを３日間培養し、その後細胞をプロナーゼ処理し、新鮮なCEFII と混合し、再び２枚の96ウェルプレートに播く（元の１つのウェルから２つの姉妹ウェルを得る）。
【００３１】
96−ウェルプレートを細胞変性効果が見られるようになるまで培養した。72時間培養後、２枚の96−ウェルプレートのうち一方を95％のアセトン中で30分間固定し、抗VP2 モノクロナル抗体を用いて間接蛍光抗体(IIF) 反応を行い、蛋白質VP2 を発現するプラークを調べた。IIF で陽性のプラークを示すカップの「シスターカップ」をプロナーゼ処理し、新鮮なCEFII と混合し、限定的な希釈で96ウェルのプレートに塗布した。３日間培養後、細胞変性効果を示したカップをプロナーセ処理し、CEF IIと混合して、再び96−ウェルのプレートに播いた（元の１つのウェルから２つの姉妹ウェルを得る）。３日後、蛋白質VP2 を発現しているプラークを、再び、前回と同様IIF によって２つのシスタープレートのうち一方について試験した。
【００３２】
一般に、連続４回の単離サイクル（カップの回収、再播付け、IIF によるモニタリング、シスターカップの継代培養等) を行うことによって子孫全てが特異的な蛍光を示す組換えウィルスを得ることができる。抗VP2 モノクロナル抗体を用いたIIF によって100 ％の陽性プラークを与えるウィルスプラークをvHVT16と命名した。この組換えウィルスのゲノムＤＮＡについて適当なオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡプローブを用いた標準的なＰＣＲおよびサザンブロット法によって分子レベルでの特徴付けを行った。
【００３３】
実施例９
ドナープラスミドpEL091の作製と、vHVT17の単離
プラスミドpCMVβ（図17）をSalIとSmaIで処理してlacZ遺伝子並びにVS40ウィルスの後期遺伝子のポリアデニレーションシグナルを含む3679-bp のSalI-SmaI
断片を単離した。この断片を予めSalIとEcoRV とで処理したベクターpBS-SK+ に挿入して6625-bp のプラスミドpCD002（図20）を得た。このプラスミドはlacZレポータ遺伝子を含むが、この遺伝子の下流に位置するプロモータはない。実施例２に従ってMCMVウィルスのウィルスゲノムＤＮＡを調製し、PstIで処理して2285-bp のPstI-PstI 断片を得た。この断片を予めPstIで処理したアルカリホスファターゼで処理したベクター pBS-SK+にクローニングしてプラスミド pCD004 を得た。プラスミドpCD004をHpaIとPstIで処理して1389-bp のHpa-PstI断片を得た。この断片はネズミのサイトメガロウィルス(MCMV)の即時初期遺伝子のプロモータ／アクチベータ領域を含む(Dorsch-Hasler K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.1985. 82. 8325-8329 、WO-A-87/03905 号）。この断片を予めPstIとSmaIとで処理したプラスミド pCD002 にクローニングして8007-bp のプラスミドpCD009（図21）を得た。
【００３４】
下記２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行って２本鎖のオリゴヌクレオチドを作製した：
MB070 （配列 NO. 12)
5' CGAATTCACTAGTGTGTGTCTGCAGGCGGCCGCGTGTGTGTCGACGGTAC 3'
MB071 （配列 NO. 13)
5' CGTCGACACACACGCGGCCGCCTGCAGACACACACTAGTGAATTCGAGCT 3'
【００３５】
この２本鎖オリゴヌクレオチドを予めKpnIとSacIで処理したベクターpBS-SK+
に導入してプラスミドpEL067を得た。
プラスミド pCD009 を PstI と SpeI で処理して1396-bp のPstI-SpeI 断片を単離した。この断片を予めPstIとSpeIとで処理したプラスミドpEL067に導入して4297-bp のプラスミドpEL068（図22）を得た。プラスミド pEL026 （実施例８参照）をHindIII およびSalIで処理して235-bpのHindIII-SalI断片（断片Ｂ）を単離した。断片ＡとＢを同時に予めNotIとSalIで処理したプラスミドpEL068に導入して 5908-bpプラスミドpEL070（図23）を得た。プラスミド pEL070 を EcoRI、SalIおよびXmnIで処理して3035-bp のEcoRI-SalI断片を単離した。この断片を予めEcoRI とSalIで処理したプラスミドpEL079（実施例５参照）に導入して 9109-bpのプラスミドpEL091（図24）を得た。このプラスミドによってHVT ウィルスの遺伝子間部位１にMCMV-IE/IBDV VP2発現カセットを挿入することが可能になる。プラスミドpEL091およびHVT ウィルスのゲノムＤＮＡを用いて実施例８に記載の同時形質転換(cotransfection)を行って組換え体vHVT17の単離および精製を行った。
【００３６】
実施例10
ドナープラスミドpEL092の作製およびvHVT18の単離
MDV gB遺伝子を含む MDVウィルス RB1B 株のゲノムＤＮＡの3.9-kbp のEcoRI-SalI断片〔この配列はロス(Ross N.) 達が開示している (J. Gen. Virol. 1989.70. 1789-1804)〕を予めEcoRI とSalIで処理したベクターpUC13 に導入してプラスミドpCD007を得た。このプラスミドを SacI およびXhoIで処理して2260-bp のSacI-XhoI 断片（gB遺伝子の中央部位＝断片Ａ）を単離した。
下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pCD007を用いてＰＣＲを行いて222-bpのＰＣＲ断片を作製した：
CD001 （配列 NO. 14)
5'GACTGGTACCGCGGCCGCATGCACTTTTTAGGCGGAATTG 3'
CD002 （配列 NO. 15)
5'TTCGGGACATTTTCGCGG 3'
この断片をKpnIとXbaIで処理して190-bpのkpnI-XbaI 断片（gB遺伝子の５’末端＝断片Ｂ）を単離した。
下記オリゴヌクレオチドと鋳型pCD007とを用いて195-bpのＰＣＲ断片を作製した：
CD003 （配列 NO. 16)
5' TATATGGCGTTAGTCTCC 3'
CD003 （配列 NO. 17)
5' TTGCGAGCTCGCGGCCGCTTATTACACAGCATCATCTTCTG 3'
【００３７】
この断片をSacIとSacII で処理して162-bpのSacI-SacII断片（gB遺伝子の３’末端＝断片Ｃ）を単離した。断片Ａ、ＢおよびＣを同時に予めKpnIおよびSacIで処理したベクターpBS-SK+ に導入して5485-bp のプラスミドpCD011（図25）を得た。プラスミドpCD011をNotIで処理して2608-bp のNotI-NotI 断片（MDV gB遺伝子全体）を単離した。この断片を予めNotIで処理してアルカリホスファターゼで処理したプラスミドpCMVβに導入して6299-bp のプラスミドpCD020（図26）を得た（このプラスミドではlacZ遺伝子がMDV gB遺伝子に置き代っている）。プラスミドpCD020をEcoRI とSalIで処理して3648-bp のEcoRI-SalI断片を得た。この断片を予めEcoRI とSalIとで処理したプラスミドpEL079（実施例５参照）に導入して8718-bp のプラスミドpEL092（図27）を得た。このプラスミドによって、HVT
ウィルスの遺伝子間部位１にHCMV-IE/MDV gB発現カセットを挿入することが可能となる。
プラスミドpEL092とHVT ウィルスのゲノムＤＮＡを用いて実施例８に記載の同時形質転換(cotransfection)を行って組換え体vHVT18の単離・精製をした。
【００３８】
実施例11
ドナープラスミドpEL093の作製と、vHVT19の単離
テイラー達の方法(Taylor J. et al., J. Virol. 1990. 64. 1441-1450) に従ってニューカッスル病ウィルス(NDV) テキサス株のゲノムに対して相補的なＤＮＡのライブラリーを作製した。フュージョン遺伝子(F) の末端、赤血球凝集素ノイラミニダーゼ(HN)遺伝子の全体およびポリメラーゼ用の遺伝子の開始点を含むpBR322クローンをpHN01 として同定した。このクローン内に存在するNDV HN遺伝子の配列を図28、29（配列 NO. 18)に示す。プラスミドpHN01 をSphIおよびXbaIで処理して2520-bp のSpaI-XbaI 断片を単離した。この断片を予めSpaIとXbaIで処理したベクターpUC19 に導入して5192-bp のプラスミドpHN02 を得た。プラスミドpHN02 をClaIとPstIで処理して700-bpのClaI-PstI 断片（断片Ａ）を単離した。
【００３９】
下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pHN02 を用いてＰＣＲを行って270-bpのＰＣＲ断片を作製した：
EL071 （配列 NO. 19) 5'CAGACCAAGCTTCTTAAATCCC 3'
EL073 （配列 NO. 20) 5'GTATTCGGGACAATGC 3'
この断片をHindIII とPstIで処理して220-bpのHindIII-PstI断片（断片Ｂ）を単離した。断片Ａと断片Ｂを同時に予め ClaI および HindIIIで処理したベクターpBS-SK+ に導入して3872-bp のプラスミドpEL028（図30) を得た。プラスミドpHN02 をBsphI とClaIで処理して 425-bp のBsphI-ClaI断片（断片Ｃ）を単離した。下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pHN02 を用いて425-bpのＰＣＲ断片を作製した：
EL074 （配列 NO. 21)
5' GTGACATCACTAGCGTCATCC 3'
EL075 （配列 NO. 22)
5' CCGCATCATCAGCGGCCGCGATCGGTCATGGACAGT 3'
【００４０】
この断片をBsphI とNotIで処理して390-bpのBsphI-NotI断片（断片Ｄ）を単離した。断片ＣおよびＤを同時に予めClaIおよびNotIで処理したベクターpBS-SK+
に導入して3727-bp のプラスミドpEL029bis （図31）を得た。プラスミドpEL028をClaIとSacII で処理して960-bpのClaI-SacII断片（断片Ｅ）を単離した。プラスミドpEL029bis をClaIとNotIで処理して820-bpのClaI-NotI 断片（断片Ｆ）を得た。断片ＥとＦを同時に予めNotIとSacIで処理したベクターpBS-SK+ に導入して4745-bp のプラスミドpEL030（図32）を得た。プラスミドpEL030をNotIで処理して1780bpのNotI-NotI 断片（NDV HN遺伝子の全体）を単離した。この断片を、lacZの代わりに予めNotIで処理してアルカリホスファターゼで処理したプラスミド pCMV βに導入して5471-bp のプラスミドpEL032（図33）を得た。プラスミドpEL032をEcoRI とClaIで処理して1636-bp のEcoRI-ClaI断片（断片Ｇ）を単離した。プラスミドpEL032をClaIとSalIで処理して1182-bp のClaI-SalI 断片（断片Ｈ）を単離した。断片ＧおよびＨを予めEcoRI とSalIとで処理したプラスミドpEL079（実施例５参照）に導入して7890-bp のプラスミドpEL093（図34) を得た。このプラスミドによってHVT ウィルスの遺伝子間部位１にHCMV-IE/NDV HNを挿入することが可能となる。
プラスミドpEL093とHVT ウィルスのゲノムＤＮＡを用いて実施例８に記載の同時形質転換を行って組換え体vHVT19の単離・精製を行った。
【００４１】
実施例12
ドナープラスミドpEL094の作製と、vHVT20の単離
ニューカッスル病ウィルスのゲノムに相補的なＤＮＡのライブラリー（実施例11参照）に由来するフュージョン遺伝子(F) の全体を含むクローンをpNDV81とした。このプラスミドは公知であり、このクローン中に存在するNDV F 遺伝子の配列は既に発表されている(Taylor J. et al. J. Virol. 1990. 64. 1441-1450)。プラスミドpNDV81をNarIとPstIで処理して1870-bp のNarI-PstI 断片（断片Ａ）を単離した。下記オリゴヌクレオチドと鋳型pNDV81を用いてＰＣＲを行って160-bpの断片を作製した：
EL076 （配列 NO. 23)
5'TGACCCTGTCTGGGATGA 3'
EL077 （配列 NO. 24)
5'GGATCCCGGTCGACACATTGCGGCCGCAAGATGGGC 3'
【００４２】
この断片をPstIとSalIで処理して130bp のPstI-SalI 断片（断片Ｂ）を単離した。断片Ａと断片Ｂを同時に予めClaIおよびSalIで処理したベクターpBS-SK+ に導入して4846-bp のプラスミドpEL033（図35）を得た。プラスミドpEL033をNotIで処理して1935-bp のNotI-NotI 断片（Ｆ遺伝子全体）を単離した。この断片を予めNotIで処理してアルカリホスファターゼで処理したプラスミドpCMBβに導入して5624-bp のプラスミドpEL034（lacZ遺伝子がNDV F 遺伝子で置き換えられている）を得た（図36）。プラスミド pEL034 をEcoRI とKpnIで処理して866-bpのEcoRI-KpnI断片（断片Ｃ）を単離した。プラスミドpEL034をKpnIとSalIで処理して2114-bp のKpnI-SalI 断片（断片Ｄ）を単離した。断片Ｃと断片Ｄを同時に予めEcoRI およびSalIで処理したプラスミドpEL079（実施例５参照）に導入して、8043-bp のプラスミドpEL094（図37）を得た。このプラスミドによって、HVT ウィルスの遺伝子間部位１にHCMV-IE/NDV F の発現カセットを挿入することが可能となる。
プラスミドpEL094と HVTウィルスのゲノムＤＮＡを用いて実施例８に記載の同時形質転換を行って組換え体vHVT20の単離・精製を行った。
【００４３】
実施例13
ドナープラスミドpEL095の作製と、vHVT21の単離
MDV の1.8-kbp RNA 遺伝子の上流に位置する配列はブラドレー達によって報告されている（Bradley G. et al., J. Virol. 1989. 63. 2534-2542)(図38および配列 NO. 25)。下記オリゴヌクレオチドを用いてMDV のRB1B株に感染したニワトリから得られるリンパ球から抽出したＤＮＡについてＰＣＲ増幅を行った：
MB047 （配列 NO. 26)
5' GGTCTACTAGTATTGGACTCTGGTGCGAACGC 3'
MB048 （配列 NO. 27)
5' GTCCAGAATTCGCGAAGAGAGAAGGAACCTC 3'
得られた163-bpのＰＣＲ断片をEcoRI とSpeIで処理した後、予めEcoRI とSpeIで処理したプラスミドpCD002（実施例９参照）に導入して6774-bp のプラスミドpBS002（図39）を得た。プラスミドpBS002は lacZ 遺伝子の上流にクローニングされたMDV の1.8-kbp RNA 遺伝子のプロモータを含んでいる。
【００４４】
下記オリゴヌクレオチドと鋳型pBS002を用いてＰＣＲを行った：
MB047 （配列 NO. 26)および
MB072 （配列 NO. 28)
5' GTGTCCTGCAGTCGCGAAGAGAGAAGGAACCTC 3'
得られたＰＣＲ断片をPstIとSpeIで処理して200bp のPstI-SpeI 断片を単離した。この断片を予め PstI およびSpeIで処理したプラスミドpEL067（実施例９参照）に導入してプラスミドpEL069（図40）を得た。プラスミドpCD007（実施例10参照）をEcoRI およびXbaIで処理して2670-bp のEcoRI-XbaI断片（断片Ａ）を単離した。プラスミドpCD011（実施例10参照）を NotI およびXbaIで処理して180-bpのNotI-XbaI 断片（断片Ｂ）を単離した。プラスミドpEL069をNotIとSpeIで処理して180-bpのNotI-SpeI 断片（断片Ｃ）を単離した。
【００４５】
断片Ａ、ＢおよびＣを同時に予めEcoRI とSpeIで処理したプラスミド pEL067
（実施例９）に導入して5939-bp のプラスミドpEL080（図41）を得た。プラスミドpEL070（実施例９）をKpnIとSpeIで処理して1345-bp のKpnI-SpeI 断片（断片Ｄ）を単離した。プラスミド pEL070 も KpnI とSalIで処理して1658-bp のKpnI-SalI 断片（断片Ｅ）を単離した。断片ＤおよびＥを一緒に予めSalIとSpeIで処理したプラスミド pEL080 に導入して8938-bp のプラスミドpEL081（図42）を得た。プラスミドpEL081をEcoRI とSalIで処理して6066-bp のEcoRI-SalI断片を得た。この断片を予めEcoRI とSalIとで処理したプラスミド pEL079 （実施例５参照）に導入して最終的に11139-bpのプラスミドpEL095（図43を得た）。このプラスミドによってHVT ウィルスの遺伝子間部位１にVP2/HCMV-IE//1.8-kbp RNA/MDVgBの二重発現カセットを挿入することが可能となる。
プラスミドpEL095とHVT ウィルスのゲノムＤＮＡを用いて実施例８に記載の同時形質転換を行って組換え体vHVT21の単離・精製を行った。
【００４６】
実施例14
ドナープラスミドpEL098の作製とvHVT24の単離
プラスミドpEL080（実施例13参照）をEcoRI とSalIで処理して3040-bp のEcoRI-SalI断片（1.8-kbp RNA/MDV gBカセット）を単離した。この断片を予めEcoRI
とSalIで処理したプラスミドpEL079（実施例５参照）に導入して8140-bp のプラスミドpEL098（図44）を得た。このプラスミドによってHVT ウィルスの遺伝子間部位１に1.8-kbp RNA/MDV gBのカセットを挿入することが可能となる。
プラスミドpEL098とHVT ウィルスのゲノムＤＮＡを用いて実施例８に記載の同時形質転換を行って組換え体vHVT21の単離・精製を行った。
【００４７】
実施例15
HVT ウィルスの遺伝子間部位１にIBV M およびS の発現カセットを挿入するためのドナープラスミドの作製
発現カセット（HCMV-IE またはMCMV-IE プロモータあるいはMCMV-IE//1.8-kbpRNA 二重プロモータの制御下に置かれた遺伝子）を遺伝子間部位１に挿入するための上記方法に従って、鳥類の感染性気管支炎ウィルス(IBV) の膜(M) 蛋白質またはスパイク(S) 蛋白質を高レベルで発現する組換えHVT ウィルスを作製することができる。IBVS遺伝子がHCMV-IE プロモータまたはMCMV-IE プロモータの制御下にある構成あるいはIBV M およびIBV S 遺伝子がMCMV-IE/1.8-kbp RNA 二重プロモータと一緒に遺伝子間部位１に挿入され、Ｍ遺伝子が1.8-kbp RNA プロモータの制御下にあり、Ｓ遺伝子がMCMV-IE プロモータの制御下にあるような構成にすることができる。この構成では1.8-kbp RNA プロモータがMCMV-IE プロモータのアクチベータ領域によって活性化される。
【００４８】
実施例16
遺伝子間部位２および３に挿入された外部遺伝子を有する組換えHVT ウィルスの作製
遺伝子間部位２および３に外部遺伝子発現のためのカセットが挿入された組換えHVT ウィルスを実施例８〜14に記載の方法に従って作製したが、特異的なドナープラスミドを作製するために実施例８〜14で用いたプラスミドpEL079に代えてプラスミドpEL078（遺伝子間部位２）およびpEL066（遺伝子間部位３）をそれぞれ使用した。
【００４９】
実施例17
本発明のワクチンの調製
本発明のワクチンは当業者には周知の任意の標準的な方法、例えばローラボトル培養で調製することができる。ニワトリの初期の胚細胞 200×106を植えつけ
たローラボトル（175 cm2）を37℃で24時間培養した後、ボトルに105pfu/ml の
力価を有する組み換えHVT ウィルスのウィルス溶液１mlを接種した。37℃で４日間培養後、上澄み液を除去してトリプシン／ヴェルセン溶液で細胞を剥がし、その後に回収する。次いで、感染した細胞を遠心分離する。上澄みを除去し、凍結乾燥安定剤（例えばSPGAスクロース、リン酸塩、グルタメート、アルブミン）を含む溶液20mlに再懸濁する。次いで、この混合物を超音波処理し、１ml画分ずつバイヤルに分配して最後に凍結乾燥する。必要な場合にはワクチンを凍結乾燥でなく分配後に凍結させることもできる。
【００５０】
実施例18
本発明で得られたガンボロ病ウィルスのVP2 蛋白質を発現する組換えウィルスを用いて生後１日のヒナに筋肉注射で免疫処理した。このヒナに対して生後21日後にガンボロ病のウィルスを用いて攻撃（病原菌投与）した。攻撃から11日後、ワクチン処理された群とワクチン未処理の対照群との間で死亡とファブリシウス滑液嚢炎とを比較して防御効果を評価した。このワクチン処理／攻撃プロトコルの結果、本発明のワクチンは高レベルの防御を示すことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】HVT BamHI 断片I
【図２】HVT BamHI 断片I のつづき
【図３】HVT BamHI 断片I のつづき
【図４】HVT BamHI 断片I のつづき
【図５】プラスミドpEL039
【図６】プラスミドpEL077
【図７】プラスミドpEL079
【図８】プラスミドpEL076
【図９】プラスミドpEL078
【図１０】プラスミドpEL054
【図１１】プラスミドpEL055
【図１２】プラスミドpEL062
【図１３】プラスミドpEL066
【図１４】プラスミドpEL022
【図１５】プラスミドpEL023
【図１６】プラスミドpEL024
【図１７】プラスミドpCMVβ
【図１８】プラスミドpEL026
【図１９】プラスミドpEL090
【図２０】プラスミドpCD002
【図２１】プラスミドpCD009
【図２２】プラスミドpEL068
【図２３】プラスミドpEL070
【図２４】プラスミドpEL091
【図２５】プラスミドpCD011
【図２６】プラスミドpCD020
【図２７】プラスミドpEL092
【図２８】NDV HN 遺伝子の配列
【図２９】NDV HN 遺伝子の配列のつづき
【図３０】プラスミドpEL028
【図３１】プラスミドpEL029bis
【図３２】プラスミドpEL030
【図３３】プラスミドpEL032
【図３４】プラスミドpEL093
【図３５】プラスミドpEL033
【図３６】プラスミドpEL034
【図３７】プラスミドpEL094
【図３８】MDV 1.8-kbp RNA プロモータの配列
【図３９】プラスミドpBS002
【図４０】プラスミドpEL069
【図４１】プラスミドpEL080
【図４２】プラスミドpEL081
【図４３】プラスミドpEL095
【図４４】プラスミドpEL098
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組み換えによって鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコードし且つ発現する少なくとも１つの塩基配列をワクチンを接種した動物が病原物質から効果的に保護される免疫を獲得するような条件で挿入した、鳥類ヘルペスウィルス、特にマレック病(Marek's disease) ウィルス(MDV) 、特に HVTウィルス（七面鳥のヘルペスウィルス）をベースとした鳥類用の組換え生ワクチンに関するものである。
本発明は感染性喉頭器官炎ウィルス(ILTV)およびアヒルのヘルペスウィルスにも適用される。
【背景技術】
【０００２】
鳥類の病原物質、特にマレック病ウィルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）、感染性喉頭器官炎ウィルス（ＩＬＴＶ）、ガンボロ病ウィルス（感染性滑液嚢炎ウィルスＩＢＤＶ）、感染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）および鳥類の貧血症ウィルス（ＣＡＶ）を含む病原性ウィルスに対して鳥類に予防接種を行うための鳥類の組換え生ベクターは既にいくつか提案されている。
そのために用いられる生ベクターはアヴィポックスウィルス(avipox viruses)特に、鶏痘ウィルス（下記特許文献１、下記非特許文献１、２)、血清型が２および３のマレック病ウィルス(ＨＶＴ)(下記特許文献２〜５、下記非特許文献４〜６）またはＩＬＴＶおよび鳥類のアデノウィルスである。
【特許文献１】欧州特許第0,517,292 号公報
【非特許文献１】H. G. Heine 達、 Arch. Virol. 1993. 131. 277-292
【非特許文献２】D.B. Boyle達, Veterinary Microbiology 1994. 41. 173-181
【非特許文献３】C.D. Bayliss達, Arch. Virol. 1991. 120. 193-205
【特許文献２】国際特許第WO-A-87 04463 号公報
【特許文献３】国際特許第WO-A-89 01040 号公報
【特許文献４】国際特許第WO-A-93-25665 号公報
【特許文献５】欧州特許第 513,921号公報
【非特許文献４】J. McMillen, Poultry Condemnation Meeting, 1994年10月, 359-363
【非特許文献５】P.J.A. Sondermeijer 達, Vaccine 1993. 11. 349-357
【非特許文献６】R.W. Morgan 達, Avian Diseases 1992. 36. 858-870、 1993, 37, 1032-1040
【０００３】
これらのウィルスを予防接種に使用した場合、特定の事例でかなりの防御効果が示されることが稀にはあるが、これらの組換えウィルスによって誘導される防御レベルは変化し易く、一般には弱いか、部分的なものである。
鳥類用組み換え生ワクチンによる予防の中で最も困難なものはガンボロ病ウィルスまたはIBDVウィルスである。すなわちこれらの病気に対しては従来の不活化または弱毒化生ワクチンが効果的であるが、組換え生ワクチンで適当な効果を示すものはない。
カンボロ病ウィルスのゲノムは二重鎖ＲＮＡで構成されており、その最大断片（断片Ａ）は115kDaのポリプロテインをコードする。このポリプロテインはさらに３つの蛋白質VP2(41kDa)、VP4(28kDa)、VP3(32kDa)に分裂する。VP4 は115kDaのポリプロテインの成熟に関与するプロテアーゼであると言われている。VP2 とVP4 との間の分裂箇所については大体の位置しか分かっていない(下記非特許文献７)。蛋白質VP2 は中和抗体を出す免疫源であり、ガンボロ病に対する防御を誘導する。
【非特許文献７】M. Jagadish, J. Virol. 1988, 62, 1084-1087
【０００４】
免疫原性のIBDV蛋白質をコードする遺伝子を各種の生ベクターに挿入する方法は既に提案されている：欧州特許第 517,292号（VP2 またはポリプロテインをコードする配列をアヴィポックスに挿入);上記の非特許文献１〜３ (ＶＰ２を鶏痘に）。
マレック病ウィルスも既に提案されている：下記特許文献６、７（ｇＣ、ＴＫ、ＰＲ１，ＰＲ２の各種挿入部位）、下記特許文献８（ＰＲ２）、下記特許文献９（ＵＳ３）、下記特許文献１０、下記特許文献１１（ＢａｍＨＩ＃１６および＃１９）および下記特許文献１２（ＵＳ３）。下記非特許文献８は ＨＶＴゲノムにレトロウィルスを組み込むための組み込み部位の数を決定しており、これらの部位はＢａｍＨＩ制限酵素断片Ｆ、ＡおよびＩ上に位置している。
【特許文献６】国際特許第WO-A-90 02802号公報
【特許文献７】国際特許第WO-A-90/02803号公報
【特許文献８】フランス国特許出願第90/03105号公報
【特許文献９】国際特許第WO-A-９０／１１１４６号公報
【特許文献１０】国際特許第ＷＯ−Ａ−８７／０４４６３号公報
【特許文献１１】国際特許第ＷＯ−Ａ−８９／０１０４０号公報
【特許文献１２】国際特許第ＷＯ−Ａ−９３／２５６５５号公報
【非特許文献８】R.J. Isfort 達(Virology 1994. 203. 125-133
【０００５】
一般に市販のものを含む各種プロモータは従来技術の各種構成で利用されている。すなわちPRV gXプロモータ、HCMV IE （ヒトのCMV 即時初期）プロモータ、ヘルペス単純ウィルスのα−４プロモータ、FPV P.E/L プロモータ（鶏痘プロモータ)(下記非特許文献９)、ＲＳＶ(Rous sarcomavirus)のＬＴＲ 配列に由来する痘疹ウィルスのＰ７．５ (下記非特許文献１０)およびｐ１１ (下記非特許文献１１）プロモータ、ＳＶ４０の初期プロモータ、さらにＭＤＶまたはＨＶＴプロモータ、例えばｇＢ、ｇＣ、ＴＫ、ＲＲ２などの遺伝子のプロモータがあるが、一貫したパターンは現れていない。特にＨＶＴにおける構成の場合。いくつかのプロモータ配列は組換えＨＶＴまたはＭＤＶベクターの複製を禁止する(下記非特許文献１２および下記非特許文献１３)。上記プロモータのいくつか、例えばＳＶ４０、ＬＴＲＲＳＶおよびＰＲＶｇＸは、マレックウィルスのいくつかの遺伝子本来のプロモータ、特に血清タイプ３と同様に何らかの効力を示す。
【非特許文献９】H.Heine et al., Arch. Virol. 1993. 131. 277-292
【非特許文献１０】C. Bayliss et al., Arch. Virol. 1991. 120. 193-205
【非特許文献１１】D. Boyle et al., Vet. Microb. 1994.41. 173-181
【非特許文献１２】D. R. Marshall et al.,J. Vir. Meth. 1992. 40. 195-204
【非特許文献１３】Virology1993. 195. 638-648
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＥＶＴベクターに鳥類の免疫原、特にＩＢＤＶの蛋白質ＶＰ２をコードする配列を少なくとも１つ挿入したものをベースとする組換え生ワクチンを開発することにある。
ＶＰ２をコードする配列を組み込んだワクチンは動物をガンボロ病から十分に防御することができ、死亡およびファブリシウス滑液嚢炎から守ることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の対象は、ベクターとして鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコードし且つ発現する塩基配列を少なくとも１つ含む鳥類ヘルペスウィルスを含む鳥類用組換え生ワクチンであり、上記塩基配列は、即時初期ＣＭＶプロモータの制御下に、ＯＲＦ ＵＬ５５のＡＴＧと隣接する繰り返し領域を有するＵLの接合点との間の領域に挿入されている。
この挿入領域はＨＶＴではＢａｍＨＩ断片Ｉに相当し、ＭＤＶではＢａｍＨＩ断片Ｋ＋Ｈに相当する。このことはブックマスター(A. E. Buckmaster)の下記文献１４に記載されている。
【非特許文献１４】J. Gen. Virol.1988. 69. 2033-2042)
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明による鳥類用ヘルペスウィルスはマレック病ウィルス、特に HVT、感染性喉頭器官炎ウィルスＩＬＴＶ、アヒルのヘルペスウィルスであるのが好ましく、マレック病ウィルス、特に、ＨＶＴウィルスが好ましい。
ＨＶＴのＢａｍＨＩ制限断片Ｉは複数のＯＲＦと３個の遺伝子間領域とを有し、さらに本発明の挿入領域として複数の好ましい挿入領域、好ましくは３つの遺伝子間領域１、２および３とＯＲＦ ＵＬ５５とを含んでいる。
挿入領域への挿入とは、欠失を伴わない挿入、遺伝子間領域の複数の塩基を欠失させて行う挿入、ＯＲＦを完全または部分的に欠失させて行う挿入あるいは欠失させずに行う挿入を意味する。
ＣＭＶ即時初期プロモータ（ＣＭＶ immediate early promoter, ＩＥ)とは例に挙げた断片およびそれと同じプロモータ活性を保持するサブ断片を意味する。
ＣＭＶＩＥプロモータはヒトのプロモータ（ＨＣＭＶＩＥ）またはネズミのプロモータ（ＭＣＭＶＩＥ）あるいは由来の異なるＣＭＶＩＥプロモータ、例えばラットまたはモルモット由来のプロモータにすることができる。
【０００９】
マレックベクターに挿入され、発現される塩基配列は鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドすなわち本発明で実現される好適な条件のもとで発現された時に、予防接種をした動物が病原物質から効果的に防御されるような免疫を獲得できるようなポリペプチドをコードする任意の配列にすることができる。従って、所定の病気の対象となる抗原をコードする塩基配列を本発明の条件下で挿入することができる。
本発明の組換え体は、卵の状態での予防接種や生後１日目のヒナの予防接種、さらに大きなヒナや成鳥の予防接種で使用することができる。
本発明は特にＩＢＤＶウィルスのＶＰ２ポリペプチドを適切にコードする塩基配列の挿入に使用することができる。これによって得られる組換え生ワクチンはマレック病に対する防御に加えてガンボロ病に対して完全に防御できる。必要な場合には、別のＩＢＤＶ抗原、例えばＶＰ３やポリプロテインＶＰ２＋ＶＰ４＋ＶＰ３などをコードする配列を挿入することもできるが、これらの挿入は好ましくない。
【００１０】
ガンボロ病に対する組換えワクチンは１回の投与量当り10〜104pfuの濃度で与えるのが好ましい。
本発明の他の好ましいケースはマレック病ウィルスの抗原をコードする塩基配列、特にｇＢ、ｇＣ、ｇＤおよびｇＨ＋ｇＬ遺伝子（特許文献７）、ニューカッスル病ウィルスの抗原をコードする塩基配列、特にＦおよびＨＮ遺伝子、感染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ） の抗原をコードする塩基配列、特にＳおよびＭ遺伝子 （非特許文献１５、非特許文献１６）、鳥類の貧血症ウィルス（ＣＡＶ） の抗原をコードする塩基配列、特にＶＰ１（５２ｋＤａ）＋ＶＰ２（２４ｋＤ） （非特許文献１７）および感染性喉頭器官炎ウィルス（ＩＬＴＶ）の抗原をコードする塩基配列、特にｇＢ（特許文献６）、ｇＣ、ｇＤおよびｇＨ＋ｇＬを挿入したものである。
【非特許文献１５】M. Binns et al., J. Gen. Virol. 1985. 66. 719-726
【非特許文献１６】M. Boursnell et al., Virus Research 1984. 1. 303-313
【非特許文献１７】N.H.M.Noteborn et al., J. Virol. 1991. 65. 3131-3139
【００１１】
投与量はガンボロワクチンで確認されたものと同じにするのが好ましい。
本発明の有利な展開は、ＣＭＶＩＥプロモータを別のプロモータにヘッドツーテイル(Head-to-tail)の向きで連結し、２つの塩基配列は一方はＣＭＶ ＩＥのプロモータの制御下に挿入し、もう一方は該プロモータに連結されたプロモータの制御下に挿入しきるようにすることである。この構成はＣＭＶ ＩＥプロモータ、特にそのエンハンサー部分によって連結されたプロモータによって誘導される転写が活性化されるという点で特筆すべきものである。連結されるプロモータとして好ましいものはマレック1.8 RNA プロモータであり、その転写活性はこれらの条件下で4.4倍になることが分かっている。
本発明の典型的なケースは、ＣＭＶＩＥの制御下にＩＢＤＶ ＶＰ２をコードする配列を含み、別のプロモータの制御下にもう１つの鳥類疾患の抗原、特に上記のものをコードする塩基配列を含むワクチンである。
【００１２】
由来の異なるCMV IEプロモータをヘッドツーテイルの向きに並べることも可能である。
特に、マレック病、ニューカッスル病、感染性喉頭器官炎、感染性気管支炎および鳥類の貧血症に対するワクチンについては、1.8RNAプロモータをＣＭＶＩＥプロモータの代わりに単独で使用することもできる。
本発明の他の対象は、異なる病原体に由来する異なる配列を挿入された上記定義の組換え生ワクチンを少なくとも２種含む、混合物または混合用の多価ワクチン製剤にある。
本発明は、さらに、上記定義の組換え生ワクチンまたは多価ワクチン製剤を投与する鳥類の予防接種法に関するものである。本発明は特に卵の状態での予防接種、生後１日またはそれ以上のヒナおよび成鳥の予防接種を行うための方法を対象にする。
【００１３】
以下、図を参照して非限定的な実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。
図は遺伝子間部位での構成図と配列のリストである。
遺伝子間部位での構成用配列リスト
配列 NO.１ ＨＶＴＢａｍＨＩ断片Ｉの配列
配列 NO.２ オリゴヌクレオチドEL102
配列 NO.３ オリゴヌクレオチドEL161
配列 NO.４ オリゴヌクレオチドEL147
配列 NO.５ オリゴヌクレオチドEL162
配列 NO.６ オリゴヌクレオチドEL154
配列 NO.７ オリゴヌクレオチドEL163
配列 NO.８ オリゴヌクレオチドEL164
配列 NO.９ オリゴヌクレオチドEL165
配列 NO. 10 オリゴヌクレオチドEL132
【００１４】
配列 NO. 11 オリゴヌクレオチドEL133
配列 NO. 12 オリゴヌクレオチドMB070
配列 NO. 13 オリゴヌクレオチドMB071
配列 NO. 14 オリゴヌクレオチドCD001
配列 NO. 15 オリゴヌクレオチドCD002
配列 NO. 16 オリゴヌクレオチドCD003
配列 NO. 17 オリゴヌクレオチドCD004
配列 NO. 18 NDV HV遺伝子の配列
配列 NO. 19 オリゴヌクレオチドEL071
配列 NO. 20 オリゴヌクレオチドEL073
【００１５】
配列 NO. 21 オリゴヌクレオチドEL074
配列 NO. 22 オリゴヌクレオチドEL075
配列 NO. 23 オリゴヌクレオチドEL076
配列 NO. 24 オリゴヌクレオチドEL077
配列 NO. 25 ＭＤＶ１．８−ｋｂｐＲＮＡプロモータの配列
配列 NO. 26 オリゴヌクレオチドMB047
配列 NO. 27 オリゴヌクレオチドMB048
配列 NO. 28 オリゴヌクレオチドMB072
【実施例】
【００１６】
全てのプラスミドの作製はサムブルック(Sambrook)達の Molecular Cloning:
A Laboratory Manual.第２版、Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring
Harbor. New York. 1989) に記載の分子生物学の標準的手法で行った。本発明で使用した全ての制限酵素断片はジェネクリーン(Geneclean) キット (BIO 101 Inc. La Jolla, CA)を用いて単離した。
親ウィルスとして使用したウィルスは七面鳥ヘルペスウィルス（ＨＶＴ）のＦＣ１２６株で、地域家禽研究所 (Regional Poultry Research Laboratory USDA, East Lansing, Michigan)のウィッタ博士が２３週齢の七面鳥群から単離されたものである(下記非特許文献１８)。このウィルスの培養条件は特許文献８（フランス国特許出願第90/03105号公報）に記載のものを用いた。
【非特許文献１８】Writter R. L. et. al., Am. J. Vet. Res. 1970.31. 525-538
【００１７】
実施例１
マレック病ウィルスからのＤＮＡ抽出
７日目にMDV のRB1B株を用いて攻撃したニワトリから感染14日後に血液の全量を注射器を用いて抗凝結物質（100IU/mlのヘパリン溶液）上に回収した。次いでこの血液を室温で15分間、30ｇで遠心分離した。軟膜と供に血漿を除去し、無菌のPBS を用いて最終量が10mlとなるように希釈した。150 ｇで15分間遠心分離した後、細胞ペレットを２％の牛胎児血清(FCS) を含む199 培地（ギブコ−BRL カタログ番号042-01183M）２mlに再懸濁した。
次に、感染させたリンパ球の全ＤＮＡをR. Morgan 達の方法 (Avian Diseases1990. 34. 345-351)に従って抽出した。これはPCR 試験の鋳型として直接使用することができる。MDV ウィルスのゲノム断片をクローニングするために、RB1B株をCEF 上で培養し、リー(Lee Y.)達の方法(J. Gen. Virol. 1980. 51. 245-253)に従って精製したウィルス粒からウィルスのＤＮＡを調製した。
【００１８】
実施例２
ＭＣＭＶウィルス（マウスのサイトメガロウィルス）のゲノムＤＮＡの調製
米国タイプカルチャーコレクション(Type Culture Collection, Rockville,
Maryland, USA)からＭＣＭＶウィルスのSmith 株を入手した(ATCC No. VR-194) 。このウィルスをBalb/Cマウスの胎児細胞上で培養し、このウィルスのウィルスＤＮＡをエベリング達(Ebeling A. et al., J. Virol. 1983. 47. 421-433)の方法で精製した。
【００１９】
実施例３
トランスフェクション試験のためのHVT ウィルスのゲノムＤＮＡの調製
トランスフェクション試験に用いるウィルスＤＮＡはモルガン(R.Morgan)達のAvian Diseases. 1990. 34. 345-351 に記載の方法でHVT ウィルスのＦＣ１２６株に感染させた二次培養ＣＥＣ（ＣＥＣＩＩ）から調製した。
【００２０】
実施例４
ＢａｍＨＩ断片Ｉの説明
ＨＶＴウィルスＦＣ１２６株の5.8-kbpのＢａｍＨＩ断片Ｉ (Igarashi T. et al., J.Gen. Virol. 1989. 70. 1789-1804)を Genecleanを用いて単離し、ベクターpBS-SK+ のBamHI 部位にクローニングしてプラスミドpEL037を作製した。この断片の配列の全体(5838bp)Ｈ確定している（図１〜４、配列 NO.１）。この配列では６個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ)が同定されている。これらのORF によってコードされる可能性のある蛋白質を研究した結果、これらの蛋白質のいくつかが他のαヘルペスウィルス内に存在するＯＲＦによってコードされる蛋白質との間に相同性を示すことが明らかになった。第１番目のＯＲＦ（ＯＲＦ１）(配列 NO.１の676 〜1209の位置) はＨＳＶ−１ＵＬ５５のＯＲＦ、ＥＨＶ−１ 遺伝子４のＯＲＦおよびＶＺＶ遺伝子５のＯＲＦとの間に相同性を示し、178 アミノ酸(aa)の理論上の蛋白質ＨＶＴＵＬ５５をコードする。ＯＲＦ２は配列 NO.１の1941〜1387の位置にあって ＯＲＦＥＨＶ−１遺伝子３によってコードされる蛋白質と相同な185aa の蛋白質をコードする。 ＯＲＦ３は不完全である。これは配列 NO.１の5838〜3573の位置にあってＭＤＶのＯＲＦ２１との間に相同性を示す(Ross No. et al. Virus Genes. 1993. 7. 33-51) 。この配列で同定される他３つの ＯＲＦすなわちＯＲＦ４ (1403 〜1957まで)(185aa の蛋白質）、ＯＲＦ５（3081〜2287まで)(265aa の蛋白質）およびＯＲＦ６（不完全；479 〜１まで）は、配列ライブラリー中に相同なものを持たない。ＨＶＴウィルスのＢａｍＨＩ断片Ｉのゲノムは外部遺伝子の発現のためのカセットの挿入部位として使用可能な遺伝子間領域が３箇所存在する構成をしている。
【００２１】
遺伝子間領域（遺伝子間領域１）は ＯＲＦＵＬ５５とＯＲＦＨＶＴ遺伝子３との間に存在する。第２の遺伝子間領域（遺伝子間領域２）はＯＲＦＨＶＴ遺伝子３と２６５−ａａＯＲＦとの間に存在する。第３の遺伝子間領域（遺伝子間領域３）は２６５−ａａＯＲＦとＯＲＦ２１との間に存在する。これら３つの領域は、得られた組換えＨＶＴウィルスのin vivoでの複製に影響を与えずに、発現カセットの挿入のために使用することができる。
以下、この遺伝子間領域１、２および３のためのドナープラスミドの作製例を説明する。
【００２２】
実施例５
遺伝子間領域１用のドナープラスミドの作製
プラスミド ｐＥＬ０３７をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとで処理して、2672-bp と2163-bp のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を単離した。これらの断片を予めＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで処理したベクターｐＢＳ−ＳＫ＋に導入して 5167bp のプラスミドｐＥＬ０３９と、6104bpのプラスミド ｐＥＬ０４０とをそれぞれ得た。プラスミドｐＥＬ０３９（図５）をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで処理して997bp のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片（断片Ａ）を得た。
下記のオリゴヌクレオチドおよび鋳型ｐＥＬ０３９を用いてＰＣＲにより420-bpの断片を作製した：
EL102 （配列 NO.２） 5'CATTATAAGACCAACGTGCGAGTC 3'
EL161 （配列 NO.３） 5'GTTCACGTCGACAATTATTTTATTTAATAAC 3'
この断片を ＰｓｔＩとＳａｌＩとで処理して250-bpのＰｓｔＩ−ＳａｌＩ断片（断片Ｂ）を単離した。断片ＡおよびＢを予めＢａｍＨＩとＳａｌＩとで処理したベクターｐＢＳＩＩ−ＳＫ＋（ストラタジーン社）に導入して4160-bpのプラスミドｐＥＬ０７７（図６）を得た。プラスミドｐＥＬ０３９をＢｓｔＢＩおよびＳｃａＩで処理して（ブラントエンドを有する）475-bpのＢｓｔＢＩ−ＳｃａＩ断片（断片Ｃ）を単離した。
【００２３】
下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pEL039を用いて715-bpのＰＣＲ断片を作製する：
EL147 （配列 NO.４）
5'AAGATAATGGGCTCCCGCTGTTC 3'
EL162 （配列 NO.５）
5' TAATTGTCGACCCCGGGGAATTCGTTTAATGTTAGTTTATTC 3'
この断片をＢｓｔＢＩとＳａｌＩとで処理して465-bpのＢｓｔＢＩ−ＳａｌＩ断片（断片Ｄ）を単離した。断片Ｃおよび断片Ｄを予めＡｐａＩで処理してクレノーポリメラーゼで修復した後、ＳａｌＩで処理したプラスミッドｐＥＬ０７７に導入して5082-bpのプラスミドｐＥＬ０７９（図７）を得た。このプラスミドは遺伝子間部位１にＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ−ＳａｌＩポリリンカーを含んでいる。
【００２４】
実施例６
遺伝子間領域２のためのドナープラスミドの作製
プラスミドｐＥＬ０３９（実施例５）をＢｓｔＢＩおよびＰｓｔＩで処理して715-bpのＢｓｔＢＩ−ＰｓｔＩ断片（断片Ａ）を単離した。
下記オリゴヌクレオチドと鋳型pEL039を用いてＰＣＲを行って500-bpのＰＣＲ断片を作製した：
EL154 （配列 NO.６） 5'GAAATGCAAACTAACATTATTGTC 3'
EL163 （配列 NO.７） 5'GTGTAAATAGTCGACAATATAGATAACGGGC 3'
この断片をＢｓｔＢＩ とＳａｌＩとで処理し、430-bpのＢｓｔＢＩ−ＳａｌＩ断片（断片Ｂ）を単離した。断片ＡとＢを予めＰｓｔＩとＳａｌＩとで処理したベクターｐＢＳＩＩ−ＳＫ＋に導入して4081-bp のプラスミドｐＢＬ０７６（図８）を得た。
【００２５】
下記オリゴヌクレオチドと鋳型ｐＥＬ０３９とを用いて565-bpのＰＣＲ断片を作製した：
EL164 （配列 NO.８）
5'CTATATTGTCGACCCCGGGGAATTCATCGACATGATTAAATAC 3'
EL165 （配列 NO.９）
5' CAATGAAGAAATATTTTCTTTGTTCCTTGAAATGC 3'
この断片をＳａｌＩおよびＳｓｐＩとで処理して535-bpのＳａｌＩ−ＳｓｐＩ 断片を単離した。この断片を、あらかじめＡｐａＩで処理してクレノーポリメラーゼで修復後にＳａｌＩで処理したプラスミドｐＥＬ０７６に導入して、4598-bpのプラスミドｐＥＬ０７８（図９）を作製した。このプラスミドは、遺伝子間領域２にＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ−ＳａｌＩ ポリリンカーを含んでいる。
【００２６】
実施例７
遺伝子間領域３のためのドナープラスミドの作製
プラスミドpEL040（実施例５参照）をNcoIとSphIで処理して1468-bp のNcoI-SphI 断片を単離した。この断片を予めNcoIとSphIで処理したプラスミドpUC BM20（ベーリンガーマンハイム、カタログ番号1219235 ）に導入して4182-bp のプラスミドpEL054（図10）を作製した。プラスミドpEL040をEcoRI およびSphIで処理して614-bpのEcoRI-SphI断片を単離した。この断片を予めEcoRI とSphIとで処理したプラスミドpUC BM20に導入して3263-bp のプラスミド pEL055 （図11）を得た。プラスミド pEL055 をEcoRI で処理し、クレノーポリメラーゼを用いて修復し、それをつなぎ、HindIII で処理し、クレノーポリメラーゼで修復し、最後にそれをつないで3279-bp のプラスミドpEL062（図12）を得た。プラスミドpEL054をNcoIとSalIとで処理して1492-bp のNcoI-SalI 断片（断片Ａ）を単離した。
下記２種類のオリゴヌクレオチドを互いにハイブリダイズさせて24-bp のSalI-SphI 断片（断片Ｂ）を得た：
【００２７】
EL132 （配列 NO. 10) 5' CCGAATTCATATAAGCTTACGTG 3'
EL133 （配列 NO. 11) 5' TCGACACGTAAGCTTATATGAATTCGGCATG 3'
断片ＡとＢを予め NcoI と SphI とで処理したプラスミドpEL062に導入して、4787-bp のプラスミドpEL066（図13）を得た。このプラスミドは遺伝子間領域３にEcoRI-HindIII-SalIポリリンカーを含んでいる。
【００２８】
実施例８
ドナープラスミドpEL090の作製とvHVT16の単離
BamHI-HindIII カセット状のIBDV VP2遺伝子を含むプラスミドpEL004（＝フランス国特許出願第92/013109 号に記載のプラスミド pGH004 に等しい）を BamHIとXbaIとで処理して1140-bp のBamHI-XbaI断片（切り出されたVP2 遺伝子）を単離した。この断片を予めXbaIおよびBamHI で処理したベクターpBS-SK+ にクローニングして4052-bp のプラスミドpEL022（図14）を得た。このベクターpBS-SK+
をEcoRV とXbaIとで処理し、次いでそれをつないでpBS-SK+ （変性されたもの）を得た。プラスミドpEL004をKpnIとHindIII で処理して、完全なIBDV VP2を含有する1387-bp のKpnI-HindIII断片を単離した。この断片を予めKpnIとHindIII で処理したベクターpBS-SK* にクローニングして 4292bp のプラスミドpEL023（図15）を得た。プラスミドpEL022をBamHI およびNotIで処理して1122-bp のBamHI-NotI断片（断片Ａ）を単離した。
【００２９】
プラスミドpEL023をBamHI とNotIとで処理して333-bpのBamHI-NotI断片を単離した（断片Ｂ）。断片ＡとＢを予め NotI で処理してアルカリホスファターゼで処理したベクターpBS-SK+ に導入して4369-bp のプラスミドpEL024（図16）を得た。プラスミドpEL024をNcoIで処理して1145-bp のNotI-NotI 断片を単離した。この断片を予め NotI で処理したプラスミドpCMVβ（クロンテック カタログ番号6177-1）に導入して 5096-bpのプラスミド pEL026 （図18）を得た。プラスミドpEL026を EcoRI、SalIおよびXmnIで処理して 2428-bpのEcoRI-SalI断片を単離した。この断片を予め EcoRIおよび SalI で処理したプラスミドpEL079（実施例５）に導入して、7514-bp のプラスミドpEL090（図19）を得た。このプラスミドによって、HCMV-IE/IBDV VP2発現カセットをHVT ウィルスの遺伝子間部位１に挿入することが可能となる。
【００３０】
24時間培養した初代 CEF細胞を１μｇの直鎖状プラスミドpEL090＋５μｇのHVT ウィルスDNA を 300μｌのOptiMEM 培地（ギブコ BRL カタログ番号041-01985H）に入れたものと、100 μｇのLipofectAMINE を300 μｌの培地に希釈したものとの混合物（混合物の最終量は600 μｌ）を用いて感染させた。この600 μｌを３ml（最終量）の培地に希釈して３×106 のCECI上に播いた。混合物を細胞と接触させた状態で５時間保ち、その後取り除いて５mlの培養培地で置き換える。その後細胞を37℃で３日間培養し、その後プロナーゼ処理して、新鮮なCECII と混合し（３：１で混合）、さらに再び96ウェルのプレート１個に播く。このプレートを３日間培養し、その後細胞をプロナーゼ処理し、新鮮なCEFII と混合し、再び２枚の96ウェルプレートに播く（元の１つのウェルから２つの姉妹ウェルを得る）。
【００３１】
96−ウェルプレートを細胞変性効果が見られるようになるまで培養した。72時間培養後、２枚の96−ウェルプレートのうち一方を95％のアセトン中で30分間固定し、抗VP2 モノクロナル抗体を用いて間接蛍光抗体(IIF) 反応を行い、蛋白質VP2 を発現するプラークを調べた。IIF で陽性のプラークを示すカップの「シスターカップ」をプロナーゼ処理し、新鮮なCEFII と混合し、限定的な希釈で96ウェルのプレートに塗布した。３日間培養後、細胞変性効果を示したカップをプロナーセ処理し、CEF IIと混合して、再び96−ウェルのプレートに播いた（元の１つのウェルから２つの姉妹ウェルを得る）。３日後、蛋白質VP2 を発現しているプラークを、再び、前回と同様IIF によって２つのシスタープレートのうち一方について試験した。
【００３２】
一般に、連続４回の単離サイクル（カップの回収、再播付け、IIF によるモニタリング、シスターカップの継代培養等) を行うことによって子孫全てが特異的な蛍光を示す組換えウィルスを得ることができる。抗VP2 モノクロナル抗体を用いたIIF によって100 ％の陽性プラークを与えるウィルスプラークをvHVT16と命名した。この組換えウィルスのゲノムＤＮＡについて適当なオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡプローブを用いた標準的なＰＣＲおよびサザンブロット法によって分子レベルでの特徴付けを行った。
【００３３】
実施例９
ドナープラスミドpEL091の作製と、vHVT17の単離
プラスミドpCMVβ（図17）をSalIとSmaIで処理してlacZ遺伝子並びにVS40ウィルスの後期遺伝子のポリアデニレーションシグナルを含む3679-bp のSalI-SmaI
断片を単離した。この断片を予めSalIとEcoRV とで処理したベクターpBS-SK+ に挿入して6625-bp のプラスミドpCD002（図20）を得た。このプラスミドはlacZレポータ遺伝子を含むが、この遺伝子の下流に位置するプロモータはない。実施例２に従ってMCMVウィルスのウィルスゲノムＤＮＡを調製し、PstIで処理して2285-bp のPstI-PstI 断片を得た。この断片を予めPstIで処理したアルカリホスファターゼで処理したベクター pBS-SK+にクローニングしてプラスミド pCD004 を得た。プラスミドpCD004をHpaIとPstIで処理して1389-bp のHpa-PstI断片を得た。この断片はネズミのサイトメガロウィルス(MCMV)の即時初期遺伝子のプロモータ／アクチベータ領域を含む(Dorsch-Hasler K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.1985. 82. 8325-8329 、WO-A-87/03905 号）。この断片を予めPstIとSmaIとで処理したプラスミド pCD002 にクローニングして8007-bp のプラスミドpCD009（図21）を得た。
【００３４】
下記２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行って２本鎖のオリゴヌクレオチドを作製した：
MB070 （配列 NO. 12)
5' CGAATTCACTAGTGTGTGTCTGCAGGCGGCCGCGTGTGTGTCGACGGTAC 3'
MB071 （配列 NO. 13)
5' CGTCGACACACACGCGGCCGCCTGCAGACACACACTAGTGAATTCGAGCT 3'
【００３５】
この２本鎖オリゴヌクレオチドを予めKpnIとSacIで処理したベクターpBS-SK+
に導入してプラスミドpEL067を得た。
プラスミド pCD009 を PstI と SpeI で処理して1396-bp のPstI-SpeI 断片を単離した。この断片を予めPstIとSpeIとで処理したプラスミドpEL067に導入して4297-bp のプラスミドpEL068（図22）を得た。プラスミド pEL026 （実施例８参照）をHindIII およびSalIで処理して235-bpのHindIII-SalI断片（断片Ｂ）を単離した。断片ＡとＢを同時に予めNotIとSalIで処理したプラスミドpEL068に導入して 5908-bpプラスミドpEL070（図23）を得た。プラスミド pEL070 を EcoRI、SalIおよびXmnIで処理して3035-bp のEcoRI-SalI断片を単離した。この断片を予めEcoRI とSalIで処理したプラスミドpEL079（実施例５参照）に導入して 9109-bpのプラスミドpEL091（図24）を得た。このプラスミドによってHVT ウィルスの遺伝子間部位１にMCMV-IE/IBDV VP2発現カセットを挿入することが可能になる。プラスミドpEL091およびHVT ウィルスのゲノムＤＮＡを用いて実施例８に記載の同時形質転換(cotransfection)を行って組換え体vHVT17の単離および精製を行った。
【００３６】
実施例10
ドナープラスミドpEL092の作製およびvHVT18の単離
MDV gB遺伝子を含む MDVウィルス RB1B 株のゲノムＤＮＡの3.9-kbp のEcoRI-SalI断片〔この配列はロス(Ross N.) 達が開示している (J. Gen. Virol. 1989.70. 1789-1804)〕を予めEcoRI とSalIで処理したベクターpUC13 に導入してプラスミドpCD007を得た。このプラスミドを SacI およびXhoIで処理して2260-bp のSacI-XhoI 断片（gB遺伝子の中央部位＝断片Ａ）を単離した。
下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pCD007を用いてＰＣＲを行いて222-bpのＰＣＲ断片を作製した：
CD001 （配列 NO. 14)
5'GACTGGTACCGCGGCCGCATGCACTTTTTAGGCGGAATTG 3'
CD002 （配列 NO. 15)
5'TTCGGGACATTTTCGCGG 3'
この断片をKpnIとXbaIで処理して190-bpのkpnI-XbaI 断片（gB遺伝子の５’末端＝断片Ｂ）を単離した。
下記オリゴヌクレオチドと鋳型pCD007とを用いて195-bpのＰＣＲ断片を作製した：
CD003 （配列 NO. 16)
5' TATATGGCGTTAGTCTCC 3'
CD003 （配列 NO. 17)
5' TTGCGAGCTCGCGGCCGCTTATTACACAGCATCATCTTCTG 3'
【００３７】
この断片をSacIとSacII で処理して162-bpのSacI-SacII断片（gB遺伝子の３’末端＝断片Ｃ）を単離した。断片Ａ、ＢおよびＣを同時に予めKpnIおよびSacIで処理したベクターpBS-SK+ に導入して5485-bp のプラスミドpCD011（図25）を得た。プラスミドpCD011をNotIで処理して2608-bp のNotI-NotI 断片（MDV gB遺伝子全体）を単離した。この断片を予めNotIで処理してアルカリホスファターゼで処理したプラスミドpCMVβに導入して6299-bp のプラスミドpCD020（図26）を得た（このプラスミドではlacZ遺伝子がMDV gB遺伝子に置き代っている）。プラスミドpCD020をEcoRI とSalIで処理して3648-bp のEcoRI-SalI断片を得た。この断片を予めEcoRI とSalIとで処理したプラスミドpEL079（実施例５参照）に導入して8718-bp のプラスミドpEL092（図27）を得た。このプラスミドによって、HVT
ウィルスの遺伝子間部位１にHCMV-IE/MDV gB発現カセットを挿入することが可能となる。
プラスミドpEL092とHVT ウィルスのゲノムＤＮＡを用いて実施例８に記載の同時形質転換(cotransfection)を行って組換え体vHVT18の単離・精製をした。
【００３８】
実施例11
ドナープラスミドpEL093の作製と、vHVT19の単離
テイラー達の方法(Taylor J. et al., J. Virol. 1990. 64. 1441-1450) に従ってニューカッスル病ウィルス(NDV) テキサス株のゲノムに対して相補的なＤＮＡのライブラリーを作製した。フュージョン遺伝子(F) の末端、赤血球凝集素ノイラミニダーゼ(HN)遺伝子の全体およびポリメラーゼ用の遺伝子の開始点を含むpBR322クローンをpHN01 として同定した。このクローン内に存在するNDV HN遺伝子の配列を図28、29（配列 NO. 18)に示す。プラスミドpHN01 をSphIおよびXbaIで処理して2520-bp のSpaI-XbaI 断片を単離した。この断片を予めSpaIとXbaIで処理したベクターpUC19 に導入して5192-bp のプラスミドpHN02 を得た。プラスミドpHN02 をClaIとPstIで処理して700-bpのClaI-PstI 断片（断片Ａ）を単離した。
【００３９】
下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pHN02 を用いてＰＣＲを行って270-bpのＰＣＲ断片を作製した：
EL071 （配列 NO. 19) 5'CAGACCAAGCTTCTTAAATCCC 3'
EL073 （配列 NO. 20) 5'GTATTCGGGACAATGC 3'
この断片をHindIII とPstIで処理して220-bpのHindIII-PstI断片（断片Ｂ）を単離した。断片Ａと断片Ｂを同時に予め ClaI および HindIIIで処理したベクターpBS-SK+ に導入して3872-bp のプラスミドpEL028（図30) を得た。プラスミドpHN02 をBsphI とClaIで処理して 425-bp のBsphI-ClaI断片（断片Ｃ）を単離した。下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pHN02 を用いて425-bpのＰＣＲ断片を作製した：
EL074 （配列 NO. 21)
5' GTGACATCACTAGCGTCATCC 3'
EL075 （配列 NO. 22)
5' CCGCATCATCAGCGGCCGCGATCGGTCATGGACAGT 3'
【００４０】
この断片をBsphI とNotIで処理して390-bpのBsphI-NotI断片（断片Ｄ）を単離した。断片ＣおよびＤを同時に予めClaIおよびNotIで処理したベクターpBS-SK+
に導入して3727-bp のプラスミドpEL029bis （図31）を得た。プラスミドpEL028をClaIとSacII で処理して960-bpのClaI-SacII断片（断片Ｅ）を単離した。プラスミドpEL029bis をClaIとNotIで処理して820-bpのClaI-NotI 断片（断片Ｆ）を得た。断片ＥとＦを同時に予めNotIとSacIで処理したベクターpBS-SK+ に導入して4745-bp のプラスミドpEL030（図32）を得た。プラスミドpEL030をNotIで処理して1780bpのNotI-NotI 断片（NDV HN遺伝子の全体）を単離した。この断片を、lacZの代わりに予めNotIで処理してアルカリホスファターゼで処理したプラスミド pCMV βに導入して5471-bp のプラスミドpEL032（図33）を得た。プラスミドpEL032をEcoRI とClaIで処理して1636-bp のEcoRI-ClaI断片（断片Ｇ）を単離した。プラスミドpEL032をClaIとSalIで処理して1182-bp のClaI-SalI 断片（断片Ｈ）を単離した。断片ＧおよびＨを予めEcoRI とSalIとで処理したプラスミドpEL079（実施例５参照）に導入して7890-bp のプラスミドpEL093（図34) を得た。このプラスミドによってHVT ウィルスの遺伝子間部位１にHCMV-IE/NDV HNを挿入することが可能となる。
プラスミドpEL093とHVT ウィルスのゲノムＤＮＡを用いて実施例８に記載の同時形質転換を行って組換え体vHVT19の単離・精製を行った。
【００４１】
実施例12
ドナープラスミドpEL094の作製と、vHVT20の単離
ニューカッスル病ウィルスのゲノムに相補的なＤＮＡのライブラリー（実施例11参照）に由来するフュージョン遺伝子(F) の全体を含むクローンをpNDV81とした。このプラスミドは公知であり、このクローン中に存在するNDV F 遺伝子の配列は既に発表されている(Taylor J. et al. J. Virol. 1990. 64. 1441-1450)。プラスミドpNDV81をNarIとPstIで処理して1870-bp のNarI-PstI 断片（断片Ａ）を単離した。下記オリゴヌクレオチドと鋳型pNDV81を用いてＰＣＲを行って160-bpの断片を作製した：
EL076 （配列 NO. 23)
5'TGACCCTGTCTGGGATGA 3'
EL077 （配列 NO. 24)
5'GGATCCCGGTCGACACATTGCGGCCGCAAGATGGGC 3'
【００４２】
この断片をPstIとSalIで処理して130bp のPstI-SalI 断片（断片Ｂ）を単離した。断片Ａと断片Ｂを同時に予めClaIおよびSalIで処理したベクターpBS-SK+ に導入して4846-bp のプラスミドpEL033（図35）を得た。プラスミドpEL033をNotIで処理して1935-bp のNotI-NotI 断片（Ｆ遺伝子全体）を単離した。この断片を予めNotIで処理してアルカリホスファターゼで処理したプラスミドpCMBβに導入して5624-bp のプラスミドpEL034（lacZ遺伝子がNDV F 遺伝子で置き換えられている）を得た（図36）。プラスミド pEL034 をEcoRI とKpnIで処理して866-bpのEcoRI-KpnI断片（断片Ｃ）を単離した。プラスミドpEL034をKpnIとSalIで処理して2114-bp のKpnI-SalI 断片（断片Ｄ）を単離した。断片Ｃと断片Ｄを同時に予めEcoRI およびSalIで処理したプラスミドpEL079（実施例５参照）に導入して、8043-bp のプラスミドpEL094（図37）を得た。このプラスミドによって、HVT ウィルスの遺伝子間部位１にHCMV-IE/NDV F の発現カセットを挿入することが可能となる。
プラスミドpEL094と HVTウィルスのゲノムＤＮＡを用いて実施例８に記載の同時形質転換を行って組換え体vHVT20の単離・精製を行った。
【００４３】
実施例13
ドナープラスミドpEL095の作製と、vHVT21の単離
MDV の1.8-kbp RNA 遺伝子の上流に位置する配列はブラドレー達によって報告されている（Bradley G. et al., J. Virol. 1989. 63. 2534-2542)(図38および配列 NO. 25)。下記オリゴヌクレオチドを用いてMDV のRB1B株に感染したニワトリから得られるリンパ球から抽出したＤＮＡについてＰＣＲ増幅を行った：
MB047 （配列 NO. 26)
5' GGTCTACTAGTATTGGACTCTGGTGCGAACGC 3'
MB048 （配列 NO. 27)
5' GTCCAGAATTCGCGAAGAGAGAAGGAACCTC 3'
得られた163-bpのＰＣＲ断片をEcoRI とSpeIで処理した後、予めEcoRI とSpeIで処理したプラスミドpCD002（実施例９参照）に導入して6774-bp のプラスミドpBS002（図39）を得た。プラスミドpBS002は lacZ 遺伝子の上流にクローニングされたMDV の1.8-kbp RNA 遺伝子のプロモータを含んでいる。
【００４４】
下記オリゴヌクレオチドと鋳型pBS002を用いてＰＣＲを行った：
MB047 （配列 NO. 26)および
MB072 （配列 NO. 28)
5' GTGTCCTGCAGTCGCGAAGAGAGAAGGAACCTC 3'
得られたＰＣＲ断片をPstIとSpeIで処理して200bp のPstI-SpeI 断片を単離した。この断片を予め PstI およびSpeIで処理したプラスミドpEL067（実施例９参照）に導入してプラスミドpEL069（図40）を得た。プラスミドpCD007（実施例10参照）をEcoRI およびXbaIで処理して2670-bp のEcoRI-XbaI断片（断片Ａ）を単離した。プラスミドpCD011（実施例10参照）を NotI およびXbaIで処理して180-bpのNotI-XbaI 断片（断片Ｂ）を単離した。プラスミドpEL069をNotIとSpeIで処理して180-bpのNotI-SpeI 断片（断片Ｃ）を単離した。
【００４５】
断片Ａ、ＢおよびＣを同時に予めEcoRI とSpeIで処理したプラスミド pEL067
（実施例９）に導入して5939-bp のプラスミドpEL080（図41）を得た。プラスミドpEL070（実施例９）をKpnIとSpeIで処理して1345-bp のKpnI-SpeI 断片（断片Ｄ）を単離した。プラスミド pEL070 も KpnI とSalIで処理して1658-bp のKpnI-SalI 断片（断片Ｅ）を単離した。断片ＤおよびＥを一緒に予めSalIとSpeIで処理したプラスミド pEL080 に導入して8938-bp のプラスミドpEL081（図42）を得た。プラスミドpEL081をEcoRI とSalIで処理して6066-bp のEcoRI-SalI断片を得た。この断片を予めEcoRI とSalIとで処理したプラスミド pEL079 （実施例５参照）に導入して最終的に11139-bpのプラスミドpEL095（図43を得た）。このプラスミドによってHVT ウィルスの遺伝子間部位１にVP2/HCMV-IE//1.8-kbp RNA/MDVgBの二重発現カセットを挿入することが可能となる。
プラスミドpEL095とHVT ウィルスのゲノムＤＮＡを用いて実施例８に記載の同時形質転換を行って組換え体vHVT21の単離・精製を行った。
【００４６】
実施例14
ドナープラスミドpEL098の作製とvHVT24の単離
プラスミドpEL080（実施例13参照）をEcoRI とSalIで処理して3040-bp のEcoRI-SalI断片（1.8-kbp RNA/MDV gBカセット）を単離した。この断片を予めEcoRI
とSalIで処理したプラスミドpEL079（実施例５参照）に導入して8140-bp のプラスミドpEL098（図44）を得た。このプラスミドによってHVT ウィルスの遺伝子間部位１に1.8-kbp RNA/MDV gBのカセットを挿入することが可能となる。
プラスミドpEL098とHVT ウィルスのゲノムＤＮＡを用いて実施例８に記載の同時形質転換を行って組換え体vHVT21の単離・精製を行った。
【００４７】
実施例15
HVT ウィルスの遺伝子間部位１にIBV M およびS の発現カセットを挿入するためのドナープラスミドの作製
発現カセット（HCMV-IE またはMCMV-IE プロモータあるいはMCMV-IE//1.8-kbpRNA 二重プロモータの制御下に置かれた遺伝子）を遺伝子間部位１に挿入するための上記方法に従って、鳥類の感染性気管支炎ウィルス(IBV) の膜(M) 蛋白質またはスパイク(S) 蛋白質を高レベルで発現する組換えHVT ウィルスを作製することができる。IBVS遺伝子がHCMV-IE プロモータまたはMCMV-IE プロモータの制御下にある構成あるいはIBV M およびIBV S 遺伝子がMCMV-IE/1.8-kbp RNA 二重プロモータと一緒に遺伝子間部位１に挿入され、Ｍ遺伝子が1.8-kbp RNA プロモータの制御下にあり、Ｓ遺伝子がMCMV-IE プロモータの制御下にあるような構成にすることができる。この構成では1.8-kbp RNA プロモータがMCMV-IE プロモータのアクチベータ領域によって活性化される。
【００４８】
実施例16
遺伝子間部位２および３に挿入された外部遺伝子を有する組換えHVT ウィルスの作製
遺伝子間部位２および３に外部遺伝子発現のためのカセットが挿入された組換えHVT ウィルスを実施例８〜14に記載の方法に従って作製したが、特異的なドナープラスミドを作製するために実施例８〜14で用いたプラスミドpEL079に代えてプラスミドpEL078（遺伝子間部位２）およびpEL066（遺伝子間部位３）をそれぞれ使用した。
【００４９】
実施例17
本発明のワクチンの調製
本発明のワクチンは当業者には周知の任意の標準的な方法、例えばローラボトル培養で調製することができる。ニワトリの初期の胚細胞 200×106を植えつけ
たローラボトル（175 cm2）を37℃で24時間培養した後、ボトルに105pfu/ml の
力価を有する組み換えHVT ウィルスのウィルス溶液１mlを接種した。37℃で４日間培養後、上澄み液を除去してトリプシン／ヴェルセン溶液で細胞を剥がし、その後に回収する。次いで、感染した細胞を遠心分離する。上澄みを除去し、凍結乾燥安定剤（例えばSPGAスクロース、リン酸塩、グルタメート、アルブミン）を含む溶液20mlに再懸濁する。次いで、この混合物を超音波処理し、１ml画分ずつバイヤルに分配して最後に凍結乾燥する。必要な場合にはワクチンを凍結乾燥でなく分配後に凍結させることもできる。
【００５０】
実施例18
本発明で得られたガンボロ病ウィルスのVP2 蛋白質を発現する組換えウィルスを用いて生後１日のヒナに筋肉注射で免疫処理した。このヒナに対して生後21日後にガンボロ病のウィルスを用いて攻撃（病原菌投与）した。攻撃から11日後、ワクチン処理された群とワクチン未処理の対照群との間で死亡とファブリシウス滑液嚢炎とを比較して防御効果を評価した。このワクチン処理／攻撃プロトコルの結果、本発明のワクチンは高レベルの防御を示すことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】HVT BamHI 断片I
【図２】HVT BamHI 断片I のつづき
【図３】HVT BamHI 断片I のつづき
【図４】HVT BamHI 断片I のつづき
【図５】プラスミドpEL039
【図６】プラスミドpEL077
【図７】プラスミドpEL079
【図８】プラスミドpEL076
【図９】プラスミドpEL078
【図１０】プラスミドpEL054
【図１１】プラスミドpEL055
【図１２】プラスミドpEL062
【図１３】プラスミドpEL066
【図１４】プラスミドpEL022
【図１５】プラスミドpEL023
【図１６】プラスミドpEL024
【図１７】プラスミドpCMVβ
【図１８】プラスミドpEL026
【図１９】プラスミドpEL090
【図２０】プラスミドpCD002
【図２１】プラスミドpCD009
【図２２】プラスミドpEL068
【図２３】プラスミドpEL070
【図２４】プラスミドpEL091
【図２５】プラスミドpCD011
【図２６】プラスミドpCD020
【図２７】プラスミドpEL092
【図２８】NDV HN 遺伝子の配列
【図２９】NDV HN 遺伝子の配列のつづき
【図３０】プラスミドpEL028
【図３１】プラスミドpEL029bis
【図３２】プラスミドpEL030
【図３３】プラスミドpEL032
【図３４】プラスミドpEL093
【図３５】プラスミドpEL033
【図３６】プラスミドpEL034
【図３７】プラスミドpEL094
【図３８】MDV 1.8-kbp RNA プロモータの配列
【図３９】プラスミドpBS002
【図４０】プラスミドpEL069
【図４１】プラスミドpEL080
【図４２】プラスミドpEL081
【図４３】プラスミドpEL095
【図４４】プラスミドpEL098
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＭＶ即時初期プロモータの制御下に、ＯＲＦ ＵＬ５５のＡＴＧと隣接する繰り返し領域を有するＵLの接合点との間の領域に挿入された、鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコードし且つ発現する塩基配列を少なくとも１つ含む鳥類ヘルペスウィルスをベクターとして有する鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項２】
ベクターがマレック病ウィルス（ＭＤＶおよびＨＶＴ）、感染性喉頭器官炎ウィルスＩＬＴＶおよびアヒルのヘルペスウィルスからなる群の中から選択される請求項１に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項３】
ベクターがＨＶＴウィルスであり、ＢａｍＨＩ断片Ｉに挿入される請求項２に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項４】
遺伝子間領域１、２および３またはＢａｍＨＩ断片のＯＲＦ ＵＬ５５に挿入される請求項３に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項５】
ＣＭＶ即時初期プロモータがヒトのプロモータＨＣＭＶ ＩＥまたはネズミのプロモータＭＣＭＶ ＩＥである請求項１〜４のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項６】
ＣＭＶ即時初期プロモータの制御下に挿入される塩基配列がガンボロ病の抗原、マレック病の抗原、ニューカッスル病の抗原、感染性気管支炎の抗原、感染性喉頭器官炎の抗原および鳥類の貧血症の抗原より成る群の中から選択される抗原をコードする塩基配列である請求項１〜５のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項７】
ＣＭＶ即時初期プロモータの制御下に挿入される塩基配列がＩＢＤＶウィルスのポリペプチドＶＰ２をコードする塩基配列である請求項１〜６のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項８】
ＣＭＶ即時初期プロモータにヘッドツーテイル状に連結された他のプロモータを含み、２つの塩基配列が一方はＣＭＶ即時初期プロモータの制御下に、もう一方は該プロモータと組み合わせて使用されるプロモータの制御下に、それぞれ挿入領域に挿入される請求項１〜７のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項９】
組み合せて使用されるプロモータがマレックの１．８ＲＮＡプロモータである請求項８に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項１０】
ＣＭＶ即時初期プロモータの制御下に挿入される塩基配列がＩＢＤＶウィルスのポリペプチドＶＰ２をコードする塩基配列であり、組み合わせて使用されるプロモータの制御下に挿入される塩基配列が別の鳥類疾患の抗原をコードする塩基配列である請求項８または９に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項１１】
別の鳥類疾患の抗原をコードする塩基配列がマレック病の抗原、ニューカッスル病の抗原、感染性気管支炎の抗原、感染性喉頭器官炎の抗原および鳥類の貧血症の抗原より成る群の中から選択される請求項１０に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項１２】
組み合わせて使用されるプロモータが由来の異なるＣＭＶ即時初期プロモータである請求項８に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項１３】
挿入される塩基配列が下記遺伝子：
１） ガンボロ病ウィルスのＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ２＋ＶＰ４＋ＶＰ３、
２） マレック病ウィルスのｇＢ、ｇＣ、ｇＤ及びｇＨ＋ｇＬ、
３） 鳥類の貧血症ウィルスのＶＰ１（５２ｋＤａ）＋ＶＰ２（２４ｋＤａ）、
４） 感染性気管支炎ウィルスのＳおよびＭ、
５） 感染性喉頭気管炎ウィルスのｇＢ、ｇＣ、ｇＤおよびｇＨ＋ｇＬ
をコードする配列の群の中より選択される請求項１〜１２のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項１４】
ＣＶＭ即時初期プロモータの代わりに１．８ＲＮＡプロモータを使用する請求項１〜６のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項１５】
異なる配列が挿入された請求項１〜１４のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチンを少なくとも２種含む混合物または混合用の多価ワクチン製剤。
【請求項１６】
挿入される異なる塩基配列が異なる病原体に由来する請求項１５に記載の多価ワクチン製剤。
【請求項１】
ＣＭＶ即時初期プロモータの制御下に、ＯＲＦ ＵＬ５５のＡＴＧと隣接する繰り返し領域を有するＵLの接合点との間の領域に挿入された、鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコードし且つ発現する塩基配列を少なくとも１つ含む鳥類ヘルペスウィルスをベクターとして有する鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項２】
ベクターがマレック病ウィルス（ＭＤＶおよびＨＶＴ）、感染性喉頭器官炎ウィルスＩＬＴＶおよびアヒルのヘルペスウィルスからなる群の中から選択される請求項１に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項３】
ベクターがＨＶＴウィルスであり、ＢａｍＨＩ断片Ｉに挿入される請求項２に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項４】
遺伝子間領域１、２および３またはＢａｍＨＩ断片のＯＲＦ ＵＬ５５に挿入される請求項３に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項５】
ＣＭＶ即時初期プロモータがヒトのプロモータＨＣＭＶ ＩＥまたはネズミのプロモータＭＣＭＶ ＩＥである請求項１〜４のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項６】
ＣＭＶ即時初期プロモータの制御下に挿入される塩基配列がガンボロ病の抗原、マレック病の抗原、ニューカッスル病の抗原、感染性気管支炎の抗原、感染性喉頭器官炎の抗原および鳥類の貧血症の抗原より成る群の中から選択される抗原をコードする塩基配列である請求項１〜５のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項７】
ＣＭＶ即時初期プロモータの制御下に挿入される塩基配列がＩＢＤＶウィルスのポリペプチドＶＰ２をコードする塩基配列である請求項１〜６のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項８】
ＣＭＶ即時初期プロモータにヘッドツーテイル状に連結された他のプロモータを含み、２つの塩基配列が一方はＣＭＶ即時初期プロモータの制御下に、もう一方は該プロモータと組み合わせて使用されるプロモータの制御下に、それぞれ挿入領域に挿入される請求項１〜７のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項９】
組み合せて使用されるプロモータがマレックの１．８ＲＮＡプロモータである請求項８に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項１０】
ＣＭＶ即時初期プロモータの制御下に挿入される塩基配列がＩＢＤＶウィルスのポリペプチドＶＰ２をコードする塩基配列であり、組み合わせて使用されるプロモータの制御下に挿入される塩基配列が別の鳥類疾患の抗原をコードする塩基配列である請求項８または９に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項１１】
別の鳥類疾患の抗原をコードする塩基配列がマレック病の抗原、ニューカッスル病の抗原、感染性気管支炎の抗原、感染性喉頭器官炎の抗原および鳥類の貧血症の抗原より成る群の中から選択される請求項１０に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項１２】
組み合わせて使用されるプロモータが由来の異なるＣＭＶ即時初期プロモータである請求項８に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項１３】
挿入される塩基配列が下記遺伝子：
１） ガンボロ病ウィルスのＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ２＋ＶＰ４＋ＶＰ３、
２） マレック病ウィルスのｇＢ、ｇＣ、ｇＤ及びｇＨ＋ｇＬ、
３） 鳥類の貧血症ウィルスのＶＰ１（５２ｋＤａ）＋ＶＰ２（２４ｋＤａ）、
４） 感染性気管支炎ウィルスのＳおよびＭ、
５） 感染性喉頭気管炎ウィルスのｇＢ、ｇＣ、ｇＤおよびｇＨ＋ｇＬ
をコードする配列の群の中より選択される請求項１〜１２のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項１４】
ＣＶＭ即時初期プロモータの代わりに１．８ＲＮＡプロモータを使用する請求項１〜６のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
【請求項１５】
異なる配列が挿入された請求項１〜１４のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチンを少なくとも２種含む混合物または混合用の多価ワクチン製剤。
【請求項１６】
挿入される異なる塩基配列が異なる病原体に由来する請求項１５に記載の多価ワクチン製剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【公開番号】特開２００７−１２６４６５（Ｐ２００７−１２６４６５Ａ）
【公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３２９２４５（Ｐ２００６−３２９２４５）
【出願日】平成１８年１２月６日（２００６．１２．６）
【分割の表示】特願平７−３５５０２０の分割
【原出願日】平成７年１２月２８日（１９９５．１２．２８）
【出願人】（５０３３６５６５９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月６日（２００６．１２．６）
【分割の表示】特願平７−３５５０２０の分割
【原出願日】平成７年１２月２８日（１９９５．１２．２８）
【出願人】（５０３３６５６５９）
【Ｆターム（参考）】
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