ベクターウイルスタンパク質への外来免疫決定基の直接トランスポゾン媒介挿入による組換え型ウイルスワクチンの構築
本発明は、ベクターの標的タンパク質に挿入された外来ペプチドを含むキメラフラビウイルスベクターのようなウイルスベクター、これらのベクターを作製および使用する方法、ならびにベクターを含む組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ベクターウイルスタンパク質への外来免疫決定基の直接トランスポゾン媒介挿入による組換え型ウイルスワクチンの構築、ならびに対応する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ワクチン接種は、医学の最大の功績の一つであり、何百万人もの人々を破壊的な疾患の影響から救ってきた。ワクチンが広く用いられるようになる前は、感染疾患によって米国だけでも毎年何千人もの子供および成人が死亡し、世界中ではなお多くの人々が死亡した。ワクチン接種は、細菌、ウイルス、および他の病原体による感染症を予防または処置するために広く用いられている。死菌病原体、生弱毒化病原体、および不活化病原体サブユニットの投与が含まれる、いくつかの異なるアプローチがワクチン接種において用いられる。ウイルス感染症の場合、生ワクチンは、最も強力で持続的な保護免疫応答を付与することが見いだされている。
【０００３】
生弱毒化ワクチンは、感染した蚊およびマダニによって一般的に伝搬されるエンベロープを有する小さいプラス鎖RNAウイルスであるフラビウイルスに対して開発されている。フラビウイルス科のフラビウイルス属には、およそ70のウイルスが含まれ、その多くは黄熱病（YF）、デング熱（DEN）、日本脳炎（JE）、およびダニ媒介脳炎（TBE）ウイルスのように、主要なヒト病原体である（Burke and Monath, Fields Virology, 4th Ed.:1043-1126, 2001における論評）。
【０００４】
フラビウイルスに対するワクチンの開発において異なるアプローチが用いられている。黄熱病ウイルスの場合、たとえば二つのワクチン（黄熱病17Dおよびフランス神経向性ワクチン）が連続的継代により開発されている（Monath, "Yellow Fever," Plotkin and Orenstein, Vaccines, 3rd ed., Saunders, Philadelphia, pp. 815-879, 1999）。ワクチン接種において用いるためのフラビウイルスの弱毒化に対するもう一つのアプローチは、二つ（またはそれより多い）異なるフラビウイルスの成分が含まれるキメラフラビウイルスの構築を含む。そのようなキメラをどのように構築するかを理解するには、フラビウイルスゲノムの構造の説明を必要とする。
【０００５】
フラビウイルスタンパク質は、一つの長いオープンリーディングフレームの翻訳によってポリプロテインを生成し、次に宿主およびウイルスプロテアーゼの組み合わせによってポリプロテインの複雑な一連の翻訳後タンパク質分解切断が起こって、成熟ウイルスタンパク質を生成することによって産生される（Amberg et al., J. Virol. 73:8083-8094, 1999; Rice, "Flaviviridae," Virology, Fields (ed.), Raven-Lippincott, New York, 1995, Volume I, p. 937）。ウイルス構造タンパク質は、ポリプロテインにおいてC-prM-Eの順序で整列し、式中「C」はカプシドであり、「prM」はウイルスエンベロープ結合膜（M）タンパク質の前駆体であり、および「E」はエンベロープタンパク質である。これらのタンパク質はポリプロテインのN末端領域に存在するが、非構造タンパク質（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、およびNS5）は、ポリプロテインのC末端領域に存在する。
【０００６】
異なるフラビウイルスからの構造および非構造タンパク質が含まれるキメラフラビウイルスが作製されている。たとえば、いわゆるChimeriVax（商標）技術は、他のフラビウイルスのエンベロープタンパク質（prMおよびE）を送達するために、黄熱病17Dウイルスカプシドおよび非構造タンパク質を使用する（たとえば、Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999を参照されたい）。この技術は、デング熱、日本脳炎（JE）、西ナイル（WN）、およびセントルイス脳炎（SLE）ウイルスに対するワクチン候補体を作製するために用いられている（たとえば、Pugachev et al., New Generation Vaccines, 3rd ed., Levine et al., eds., Marcel Dekker, New York, Basel, pp. 559-571, 2004；Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999；Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999；Monath et al., Vaccine 17:1869-1882, 1999；Guirakhoo et al., J. Virol. 74:5477-5485, 2000；Arroyo et al., Trends Mol. Med. 7:350-354, 2001；Guirakhoo et al., J. Virol. 78:4761- 4775, 2004；Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004；Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003；Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004；およびPugachev et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 71 :639-645, 2004を参照されたい）。
【０００７】
ChimeriVax（商標）に基づくワクチンは、基質細胞における複製、マウスモデルにおける低い神経毒性、サルモデルにおける高い弱毒化、インビトロおよびインビボでの高い遺伝子および表現型安定性、蚊における不十分な複製（これは自然界での制御されない散布を予防するために重要である）、ならびに重篤な免疫後の副作用を示すことなく1回投与後のマウス、サル、およびヒトにおける頑健な保護免疫の誘導、のような特性に関して都合のよい特性を有することが示されている。実際に、SA14-14-2 JEウイルス（中国において用いられる生弱毒化JEワクチン）のprM-E遺伝子を含有するChimeriVax（商標）-JEワクチンウイルスは、前臨床ならびにフェーズIおよびフェーズII臨床試験において試験され、成功を収めた（Monath et al., Vaccine 20:1004-1018, 2002; Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003）。同様に、ChimeriVax（商標）-WNワクチン候補体について行われたフェーズI臨床試験も成功し、これは、弱毒化を増強するために3つの特異的アミノ酸変化がEタンパク質に組み込まれいる、西ナイルウイルス（NY99株）からのprM-E配列を含有する（Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004）。
【０００８】
キメラフラビウイルスが含まれるフラビウイルスの変異誘発のような、弱毒化に対する他のアプローチが行われている。これらのアプローチには、たとえばエンベロープタンパク質における置換の導入、3'-非翻訳領域内での欠失、およびカプシドタンパク質における欠失が含まれる。（そのような変異の例に関しては以下の参考文献を参照されたい：Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996；Mandl et al., J. Virol. 72:2132-2140, 1998；Durbin et al., AJTMH 65:405-413, 2001；Pletnev, Virology 282:288-300, 2001；Markoff et al., J. Virol. 76:3318-3328, 2002；Kofler et al., J. Virol. 76:3534-3543, 2002；Whitehead et al., J. Virol. 77:1653-1657, 2003；Pletnev et al., Virology 314:190-195, 2003；Pugachev et al., Int. J. Parasitol. 33:567-582, 2003；Bredenbeek et al., J. Gen. Virol. 84:1261-1268, 2003；米国特許第6,184,024 Bl号；WO 02/095075；WO 03/059384；WO 03/092592；WO 03/103571；WO 2004/045529；およびWO 2006/044857）。もう一つのアプローチにおいて、ChimeriVax（商標）-JEのエンベロープタンパク質Eを、トランスポゾンを用いて許容性挿入部位に関して探索した。このアプローチに従って、生存変異体ウイルスにおける挿入されたトランスポゾンを、所望の外来ペプチドに置換する（たとえば、WO 02/102828を参照されたい）。
【０００９】
Masonおよび共同研究者は最近、偽感染性ウイルス粒子（PIV）に基づくフラビウイルスワクチン（RepliVax）の構築に対する新しいアプローチを発表した（Mason et al., Virology 351 :432-443, 2006）。フラビウイルスPIVにおいて（これまでYF 17DおよびWNウイルスに関して記載した）、カプシドタンパク質遺伝子を、CのN末端の〜20個のコドンを占める5'環状化シグナル配列を除き、欠失する。PIVはCタンパク質がトランスに供給される細胞において繁殖する。後者は、子孫ウイルス（PIV）粒子へのPIVのパッケージングにとって必要である。細胞培養上清におけるパッケージングされたPIVを採取して、空のウイルス粒子の分泌と共に、T細胞反応のほぼ完全な工場（arsenal）により、強力な抗体反応を誘導する一ラウンドの複製ワクチンとして用いる。このアプローチの頑健性は、部分的にフラビウイルス（たとえば、YF 17D）およびこのようにPIVが樹状細胞に感染して、多数のTLR経路を活性化し、免疫応答を増強することができることによる（Palmer et al., J. Gen. Virol. 88:148-156, 2007；Querec et al., J.E.M. 203:413-424, 2006）。
【００１０】
フラビウイルス感染症に対するワクチンとして用いられるほかに、キメラフラビウイルスのようなフラビウイルスが、他の非フラビウイルス抗原を送達するためのベクターとして用いることについて提唱されている。そのような使用の一つの例において、外来ペプチドをYF17Dウイルスのエンベロープタンパク質Eに挿入するための合理的なアプローチは、低温電子顕微鏡によって解明されるフラビウイルス粒子の三次元構造を知ることと、Eタンパク質二量体の公知のX線構造を電子密度マップに適合させることとに基づいて記載された（Rey et al., Nature 375:291-298, 1995；Kuhn et al., Cell 108:717-725, 2002）。その融合後立体構造におけるEタンパク質三量体の三次元構造も同様に解明されている（Modis et al., Nature 427:313-319, 2004；Bressanelli et al., EMBO J. 23:728-738, 2004）。Gallerおよび共同研究者は、Eタンパク質二量体および三量体の3D構造を調べ、二量体化ドメインIIのfgループが二量体および三量体の両立体構造において溶媒に曝露されるべきであるという結論に達した。彼らはこのループを用いてマラリアの液性およびT細胞エピトープをYF17DウイルスのEタンパク質に挿入して、いくつかの生存変異体を回収した（Bonaldo et al., J. Virol. 79:8602-8613, 2005；Bonaldo et al., J. Mol. Biol. 315:873-885, 2002；WO 02/072835）。しかし、このアプローチを用いても、効率的なウイルス複製（Galler et alのデータのいくつかによって証明されるように）、免疫原性、および安定性に関して、選択された部位があらゆる望ましい外来ペプチドの挿入にとって許容性／最適であることは保証されない。さらに、このアプローチは、それに対する3D構造が不明であるウイルスタンパク質に応用可能ではない（たとえば、prM/M、NS1、およびフラビウイルスのほとんどの他のNSタンパク質）。
【００１１】
他のアプローチにおいて、外来免疫原性タンパク質／ペプチドを、ウイルスORFに遺伝子間挿入した場合に、フラビウイルスベクター内で発現させることができる。たとえば、Andinoおよび共同研究者らは、YF17Dポリプロテイン内のいくつかの位置、たとえばNS2B/NS1接合部において、ウイルスNS2B/NS3プロテアーゼ切断部位に隣接するモデルとしてのアミノ酸8個の抗腫瘍CTLエピトープを発現させようと試みた（McAllister et al., J. Virol. 74:9197-9205, 2000）。他の研究者らは、インフルエンザウイルスの免疫優性T細胞エピトープを発現させるためにNS2B/NS1部位を用いた（Barba-Spaeth et al., J. Exp. Med. 202:1179-1184, 2005）。Tao et al.は、YF17DウイルスにおけるNS2B-NS3接合部においてマラリア寄生虫のアミノ酸10個のCTLエピトープを発現させて、寄生虫のチャレンジからマウスを良好に保護することを証明した（Tao et al., J. Exp. Med. 201:201-209, 2005）。最近、本発明者らは、E/NS1接合部でインフルエンザのM2eペプチドを発現させ（米国特許出願第60/900,672号）、Bredenbeek et al.も同様に、E/NS1接合部でラッサウイルス糖タンパク質前駆体を発現させることに成功した（Bredenbeek et al., Virology 345:299-304, 2006）。他の遺伝子接合部も同様に用いることができる。他のアプローチにおいて、外来抗原は2シストロン性に発現されている（たとえば、3' UTRにおいて）。他のアプローチにおいて、一ラウンドフラビウイルスレプリコンが様々な病原体に対する組換え型ワクチン候補体として開発されており、組換え型レプリコンの免疫原性能が証明されている（Jones et al., Virology 331 :247-259, 2005；Molenkamp et al., J. Virol. 77:1644-1648, 2003；Westaway et al., Adv. Virus. Res. 59:99-140, 2003；Herd et al., Virology 319:237-248, 2004；Harvey et al., J. Virol. 77:7796-7803, 2003；Anraku et al., J. Virol. 76:3791-3799, 2002；Varnavski et al., J. Virol. 74:4394-4403, 2000）。レプリコンでは、prMおよびEエンベロープタンパク質遺伝子またはC-prM-E遺伝子が欠失している。したがって、これは細胞内で複製することができるが、ウイルス子孫を生成することができない（したがって、一ラウンド複製）。これを、prM-EまたはC-prM-E遺伝子がトランスに提供されるウイルス粒子にパッケージングすることができる。欠失の代わりに、関心対象外来抗原は、適切に挿入される。ワクチン接種後のRepliVaxの場合では、一ラウンドの複製が後に続き、周辺の細胞／組織にさらに伝搬することなく、発現された異種抗原に対する免疫応答が起こる。または、免疫は、裸のDNAまたはRNAの形でのレプリコンの接種によって達成されうる。他のアプローチにおいて、たとえば欠失したC遺伝子の代わりに、外来免疫原をRepliVax PIVにおいて発現させることができる（Mason et al., Virology 351 :432-443, 2006）。
【００１２】
インフルエンザの背景
インフルエンザ免疫原を本出願においてモデル抗原として用いた。インフルエンザウイルスは、世界中の急性呼吸器疾患の主な原因である。毎年の大流行は、米国だけでも100,000件より多い入院および20,000〜40,000人の死亡の原因である（Brammer et al., MMWR Surveill. Summ. 51 :1-10, 2002；Lui et al., Am. J. Public Health 77:712-6, 1987；Simonsen, Vaccine 17:S3-10, 1999；Thompson et al., JAMA 289:179-186, 2003）。世界中で、年間小児のおよそ20％および成人の5％がインフルエンザにより病気になる（Nicholson et al., Lancet 362:1733-1745, 2003）。歴史的に、インフルエンザAウイルスの三つのサブタイプ、すなわちH1N1、H2N2、およびH3N2がヒト集団において循環している。1968年以降、H1N1およびH3N2はほぼ独占的に循環してきた（Hilleman, Vaccine 20:3068-3087, 2002；Nicholson et al., Lancet 362:1733-1745, 2003；Palese et al., J. Clin. Invest. 110:9-13, 2002）。その唯一の認識されたサブタイプが存在するインフルエンザBウイルスも同様にヒトにおいて循環するが、一般的にインフルエンザAウイルスより軽度の疾患を引き起こす。現在の不活化ワクチンは、選択されたH1N1およびH3N2インフルエンザA株と一つのインフルエンザB株に基づいて三つの成分を含有する（Palese et al., J. Clin. Invest. 110:9-13, 2002）。1918年のH1N1の汎流行のような周期的な汎流行は、何百万人もの人々を殺すことができる。インフルエンザの専門家たちは、もう一つのインフルエンザの汎流行が不可避であり、差し迫っている可能性があることで一致している（Webby and Webster, Science 302:1519-1522, 2003）。H5N1型トリインフルエンザの現在の大流行は、記録上でも最大で、ヒトに対して非常に致死性の株によって引き起こされたが、破壊的な結末となる汎流行株になる可能性を有する（変異および／または遺伝子の再集合を通して）。もう一つの警告状況は、オランダで2003年に発生し、ここでは家禽産業従事者において小さいが非常に病原性の高いH7N7型トリインフルエンザの大流行が起こった。汎流行の脅威を引き起こす他のサブタイプは、H9およびH6型ウイルスである。H5およびH7ウイルスより毒性は低いが、いずれも過去10年の間に水鳥から家禽まで広がった。さらに、H9N2ウイルスはブタおよびヒトにおいて検出されている（Webby and Webster, Science 302:1519-1522, 2003）。過去数年の間のトリウイルスによって受けた大量の注意にもかかわらず、なおも従来のH1、H2、およびH3サブタイプウイルスは、新たな抗原的に遠縁である株の導入により、非常に毒性の高い株が出現しうることから、関心事となり続けている。たとえば、H2ウイルスは、1957年の「アジア」インフルエンザ汎流行の原因物質であり、野生のアヒルおよび家畜のアヒルにおいてなおも循環し続けていることから、高リスクカテゴリーに入る。
【００１３】
インフルエンザ疾患の予防および制御のための現在の戦略は、その年に循環する可能性が高いウイルス株に対する毎年のワクチン接種である。認可されたほとんどのインフルエンザワクチンは、ふ化鶏卵において産生されており、不活化された全ビリオンまたは部分的精製ウイルスサブユニットからなる（「スプリット」ワクチン）。これらのワクチンは、健常な成人において70〜90％有効である（Beyer et al., Vaccine 20:1340-1353, 2002）。しかし、疾患に対する有効性は高齢者では不良である。同様にふ化鶏卵において製造される生の弱毒化鼻腔内ワクチンが米国および以前のソビエト連邦において利用可能である（Treanor et al., In: New Generation Vaccines, 3rd edition. Edited by Levine, M.M. New York, Basel: Marcel Dekker; pp. 537-557, 2004）。米国のワクチン（Flumist（登録商標））は、インフルエンザワクチン接種の主な標的集団である、5歳未満の小児または55歳より高齢の人には承認されていない。免疫系によって認識される主要なインフルエンザ血液凝集素およびノイラミニダーゼタンパク質は、変異および再集合によって絶えず変化し続けていることから、ワクチン組成物は、その時に循環するウイルス株の抗原性特徴を反映するように毎年変更されなければならない。このように、現在のワクチンは、インフルエンザの季節の直前に毎年調製しなければならず、汎流行に備えて用いるために備蓄することができない。その上、製造のためにふ化鶏卵を用いることは、非常に非効率的である。各卵から産生される不活化ワクチンは、ヒト1人または2人分の用量に過ぎない。従来のワクチンに関する現在の製造上の制限は、病原体を含まない卵の十分な供給である。汎流行期の間でさえも、毎年のインフルエンザワクチンの十分量を産生するために、典型的に6ヶ月間が必要である（Gerdil, Vaccine 21 :1776-1779, 2003）。細胞培養においてインフルエンザワクチンを製造するためにいくつかの開発努力が進行中である。しかし、特に承認されていない細胞株の使用という、このアプローチにも関連する多くの難題が存在する。卵または細胞培養をワクチン産生のために用いるか否かによらず、逆遺伝学または遺伝的再集合法を使用して、それに対するワクチンを産生することが望ましい新しい循環するウイルス株を、製造のために十分な力価まで複製する株に転換させなければならない。従来のインフルエンザワクチンに関連するこれらの属性は全て、インフルエンザの汎流行に直面した場合に受け入れられない。
【００１４】
アデノウイルスまたはアルファウイルスベクターによって送達される組換え型血液凝集素（HA）またはHAに基づく新規インフルエンザワクチンの開発は、製造効率を改善しているが、毎年の遺伝的変動の問題および毎年ワクチンを再構築する要求に取り組んでいない。
【００１５】
要約すると、現在のインフルエンザワクチンに関して以下の難題が認識されている。
1．ワクチンとウイルス株のマッチが不良である場合の低い効能；生の低温適合ワクチンに関する年齢範囲の制限。
2．ウイルスにおける抗原性の変化に取り組むために毎年新しいワクチンを作製する必要性。
3．低い製造ワクチン収率。
4．製造のために適切な再集合ウイルスを構築するための時間。
5．汎流行時の需要を満たすためには不十分な製造能力。
6．不活化病原性ウイルスの大規模製造に関する生物学的懸念。
7．卵産物に対してアレルギーを示す、またはいくつかの生の低温適合ウイルスワクチンの場合の不十分な弱毒化によるワクチン接種者における副作用（Treanor et al., In: New Generation Vaccines, 3rd edition. Edited by Levine, M.M. New York, Basel: Marcel Dekker; pp. 537-557, 2004）。
【００１６】
インフルエンザワクチン学の「聖杯」は、全てのインフルエンザ株に対して広く、長く持続する保護免疫を誘発し、高収率および低費用で製造して備蓄することができるたった1つの産物となるであろう。
【００１７】
有効な従来のインフルエンザワクチンは全て、HAに対するウイルス中和抗体を誘発し、これは現在、保護に関する免疫的相関を表す。しかし、HAの抗原性は毎年変化する。最近、他のインフルエンザウイルスタンパク質がワクチン標的として注目を集めている。M2タンパク質、および特にM2のエクトドメイン（M2e）は、インフルエンザAウイルスにおいて高度に保存されている。初期と直近のヒトおよびトリM2e配列の本発明者らのアライメントを図9Aに示す（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU/htmlから）。自身において保存されるヒトインフルエンザウイルスのM2eドメインのみならず、トリウイルスM2e配列も同様に厳密に整列させる。最高レベルの配列保存はM2eのN末端部分に存在する。このように、M2eペプチドのN末端のアミノ酸13個（アライメントにおいて影をつけて示す）が、保護抗体の誘導の主な原因であることが示されていることは極めて注目に値する（Liu et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 35:141-146, 2003；Liu et al., Immunol. Lett. 93:131-136, 2004；Liu et al., Microbes. Infect. 7:171-177, 2005）。これは、万能インフルエンザAウイルスワクチンに関する概念および希望のもととなった。
【００１８】
M2eは、ウイルスの小さい表面タンパク質であるM2の外部アミノ酸23個の部分を表す。インフルエンザビリオンでは顕著ではないが、M2はウイルス感染細胞の表面に豊富に発現される。しかし、通常のインフルエンザウイルス感染の際に、または従来のワクチンによる免疫の際に、M2またはM2e決定基に対する抗体反応は非常に少ない。それにもかかわらず、M2タンパク質に対する非ウイルス中和モノクローナル抗体は、受動移入時にインフルエンザの致死的マウスモデルにおいて保護的であることが示された（Fan et al., Vaccine 22:2993-3003, 2004；Mozdzanowska et al., Vaccine 21 :2616-2626, 2003；Treanor et al., J. Virol. 64:1375-1377, 1990）。これらの結果に基づいて、M2およびその高度に保存されたM2eドメインは、インフルエンザAワクチン成分として多数のワクチン開発業者からかなりの関心を集めている。
【００１９】
M2またはM2eに対する抗体は、ウイルスを中和せず、むしろ症候性の疾患に対して保護するために十分に、効率的なウイルス複製を低減させる。M2によって誘発される保護機構は、NK細胞媒介抗体依存的細胞障害（ADCC）を伴うと考えられる。M2eエクトドメイン（主にIgG2aサブクラス）に対する抗体は、ウイルス感染細胞において表示されるエピトープを認識し、これはNK細胞による感染細胞の消失の運命を予め決定する（Jegerlehner et al., J. Immunol. 172:5598-1605, 2004）。M2によって誘発される免疫は無効ではないことから、感染後に限定的なウイルス複製が許容され、これは広いスペクトルの抗インフルエンザ免疫応答を刺激するために役立つ。理論的に、これによって、より長く、より強い免疫的記憶が起こり、同じウイルスまたは異種株とのその後の遭遇からよりよい保護が得られうると考えられる（Treanor et al., In: New Generation Vaccines, 3rd edition. Edited by Levine, M. M. New York, Basel: Marcel Dekker; pp. 537-557, 2004）。
【００２０】
Walter Fiersおよび共同研究者（Ghent University, Belgium）は、M2eに基づくワクチンの可能性を最初に証明した研究者らであった。彼らは、B型肝炎ウイルスコアタンパク質にM2e決定基を遺伝子融合させて、これを細菌において発現させて、B型肝炎ウイルスコア粒子（HBc）の表面にM2eを提示させた（Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004；Neirynck et al., Nat. Med. 5:1157-1163, 1999）。これらのHBc-M2e粒子は、マウスおよびフェレットにおいて免疫原性であることが示され、それぞれの種のインフルエンザウイルスチャレンジモデルにおいて保護的であることが示された。
【００２１】
もう一つの保存されたインフルエンザウイルスドメインは、HA前駆体タンパク質、HA0の成熟切断部位である。それの高レベルの保存（Macken et al., In: Osterhaus, A. D. M. E., Cox, N., and Hampson A. W. eds., Options for the control of influenza IV. Elsevier Science, Amsterdam, The Netherlands, p. 103-106, 2001）は、二つの機能的拘束による。第一に、配列は、二つの成熟HAサブユニット、HA1およびHA2を放出する宿主プロテアーゼにとって適した基質であり続けなければならない。第二に、HA2のN末端は、感染にとって重要である融合ペプチドを含有する（Lamb and Krug, In: Fields Virology. Fourth edition. Edited by Knipe, D. M., Howley, P.M., Griffin, D. E., et al. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins; pp. 1043-1126, 2001）。融合ペプチドは、インフルエンザAおよびBウイルスの双方において保存される。最近の報告において、Bianchiおよび共同研究者（Bianchi et al., J. Virol. 79:7380-7388, 2005）は、インフルエンザBウイルスの共役HA0切断ペプチドが、抗原的に遠縁であるインフルエンザBウイルス系列の致死的チャレンジに対してマウスにおいて保護免疫を誘発することを証明した。注目すべきことに、共役A/H3/HA0ペプチドも同様に、免疫したマウスをインフルエンザBチャレンジから保護した。-1位で厳密に保存されたArg（切断点の前の最後のHA1残基）および+3および+9 Phe残基（HA2の3番目および9番目の残基）は、モノクローナル抗体の結合にとって重要であった。このように、ペプチドの保存されたC末端部分が保護の原因であるように思われ、HA0切断ドメインに基づく万能A型およびB型ヒトインフルエンザウイルスワクチンを作製する可能性を示唆する。ヒト（H1、H2、H3、およびB）HA0と利用可能な全てのトリインフルエンザHA0配列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU/html）との本発明者らのアライメントによって、図9Bにおいて示されるコンセンサス配列（抗体結合および免疫原性にとって重要な領域は影をつけて示される）が得られた。
【００２２】
最近、様々なエピトープデータを捕獲する包括的オンラインデータベース（he Immune Epitope Database and Analysis Resources (IEDB)）（www.immuneepitope.org）が利用できるようになった。このデータベースを包括的に分析したところ、万能ワクチンを構築するためにも適しうる多くの交叉保護的インフルエンザエピトープが同定された（Bui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:246-251, 2007、および補足の表）。BおよびT細胞の有望なエピトープの双方が同定された（以下において本発明者らが用いたH3N2インフルエンザのHA保護的エピトープが含まれる）。ほとんどのB細胞エピトープは、立体構造であり、このように、かなりの大きさのエピトープである。しかし、たとえばChimeriVaxウイルスの分泌型タンパク質におけるそのようなより長いエピトープに関しても、本出願において記載される直接のランダム挿入アプローチによって、許容性部位を同定可能であるはずである。より短いインサートに関して本発明者らが見いだしたいくつかの高度に許容性である部位は、長いインサートに関して許容性となりうる（たとえば、ChimeriVax-JEのprMタンパク質において、以下を参照されたい）。
【００２３】
ペプチド共役体およびエピトープ表示粒子が含まれる様々なM2eサブユニットワクチンアプローチが追求されている。しかし、これらのアプローチは、これらの弱い免疫原の免疫原性を強化するために強力なアジュバントを必要とする。これは、M2e（およびおそらくHA0）の場合には特に重要である。提唱される保護機構（ADCC）のために、効能にとって高レベルの特異的抗体が必要である。正常な血清IgGは、保護の主なメディエーターであるNK細胞上のFc受容体に関して特異的（抗M2e）IgGと競合すると考えられる。このように、万能の汎流行インフルエンザワクチンに対するもう一つのアプローチを開発する必要がある。インフルエンザの医学的重要性に関する上記の記載、改善された万能インフルエンザワクチンの必要性、およびインフルエンザウイルスの適切なエピトープ／抗原を利用できることは、本出願において記載されたアプローチを用いて、それに対する新規ワクチンを作製することができる重要な病原体の一例を提供する。本出願において記載した方法は、以下に記載されるように、他の病原体に対する新規／改善されたワクチンの構築にも等しく応用可能となりうる。
【発明の概要】
【００２４】
本発明は、一つまたは複数の異種ペプチドをコードする一つまたは複数の核酸分子が含まれるウイルスゲノムを生成する方法を提供する。これらの方法は、以下の段階を含む：（i）一つまたは複数の標的ウイルス遺伝子を提供する段階（たとえば一つもしくは複数のシャトルベクター中に、または無傷のウイルスゲノムという状況において）；（ii）挿入部位を無作為に挿入するために、標的ウイルスゲノムを変異誘発に供する段階；および（iii）異種ペプチドをコードする核酸分子を、標的ウイルス遺伝子の変異誘発のランダム部位にライゲーションする段階。方法はさらに、以下の段階（iv）ウイルス複製を開始するためにゲノム核酸ライブラリーを細胞にトランスフェクトする段階の後に、（v）挿入されたペプチドの効率的な提示を可能にする生存（効率的に複製する）ウイルス組換え体を選択する段階を含みうる。一つまたは複数のシャトルベクターという状況において行われる場合、方法はさらに、異種ペプチドをコードする核酸分子ライブラリーが含まれる標的ウイルス遺伝子を、挿入を欠く対応するウイルス遺伝子の代わりに、標的ウイルス遺伝子が由来するウイルスゲノムに導入する段階を含みうる。
【００２５】
本発明の方法はまた、ウイルスゲノムを細胞（たとえば、Vero細胞）に導入することによって、ウイルスゲノムからウイルスベクターを生成する段階を含むと共に、細胞またはその上清からウイルスベクターを単離する段階を含む。さらに、本発明の方法に供される標的ウイルス遺伝子は、以前本発明の方法に供された（または他の手段によって挿入が導入されている）ウイルス、または挿入を欠くウイルスから得ることができる。
【００２６】
本発明の方法はまた、二つまたはそれより多い（たとえば2、3、4個またはそれより多い）標的ウイルス遺伝子が含まれる二つまたはそれより多いシャトルベクター（たとえば、2、3、4個またはそれより多く）を変異誘発に供する段階、および一つまたは複数の異種ペプチドをコードする核酸分子が含まれる二つまたはそれより多い（たとえば、2、3、4個またはそれより多い）標的ウイルス遺伝子を、挿入を欠く対応するウイルス遺伝子の代わりに、ウイルスゲノムに導入する段階を含みうる。
【００２７】
本発明の方法の変異誘発段階は、同時または連続的であるトランスポゾン変異誘発による標的ウイルス遺伝子への一つまたは複数のトランスプライマーの導入を含みうる。そのようなトランスプライマーを、エンドヌクレアーゼ消化によって除去することができ、異種ペプチドをコードする核酸分子を、制限エンドヌクレアーゼ消化部位でのライゲーションによって標的ウイルス遺伝子に導入することができる。さらに、本発明の方法は、変異標的ウイルス遺伝子のライブラリーの生成を含みうる。
【００２８】
本発明の方法に供されるウイルスゲノムは、キメラフラビウイルス、たとえば第一のフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質と、第二の異なるフラビウイルスのプレ膜タンパク質およびエンベロープタンパク質とが含まれるキメラフラビウイルスのようなフラビウイルスのゲノムとなりうる。そのような例において、第一および第二のフラビウイルスは、たとえば日本脳炎、デング-1、デング-2、デング-3、デング-4、黄熱病、マリーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、クンジン、ロシオ脳炎、イルヘウス、ダニ媒介脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポーワッサン、ネギシ、アブセットアローブ、ハンザローバア、アポイ、およびHyprウイルスからなる群より独立して選択することができる。さらに、無傷のフラビウイルスゲノムを本発明に供することができる（たとえば、YF17Dのような黄熱病ウイルスゲノム）。
【００２９】
本発明の方法の主題である標的ウイルス遺伝子は、たとえばエンベロープタンパク質、カプシドタンパク質、プレ膜タンパク質、NS1タンパク質、NS2Aタンパク質、NS2Bタンパク質、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、およびNS5タンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択することができる。
【００３０】
本発明の方法に従ってウイルスゲノムに導入される異種ペプチドには、一つまたは複数のワクチンエピトープ（たとえば、B細胞エピトープおよび／またはT細胞エピトープ）が含まれうる。エピトープは、ウイルス、細菌、または寄生虫病原体の抗原に由来しうる。たとえばエピトープは、インフルエンザウイルス（たとえば、ヒトまたはトリインフルエンザウイルス）に由来しうる。インフルエンザウイルスエピトープの場合、異種ペプチドには、たとえばインフルエンザM2eペプチドまたはインフルエンザ血液凝集素前駆体タンパク質切断部位（HA0）が含まれるペプチドが含まれうる。他の例において、エピトープは、腫瘍関連抗原またはアレルゲンに由来する。異種ペプチドを得てもよいさらなる供給源（たとえば、病原体）の例と共に、そのようなペプチドおよびエピトープの例を以下に提供する。
【００３１】
本発明にはまた、本明細書に記載の任意の方法によって生成されるウイルスゲノムまたはその相補体が含まれる。さらに、本発明には、そのようなウイルスゲノムによってコードされるウイルスベクター、そのようなウイルスベクターと薬学的に許容される担体または希釈剤とが含まれる薬学的組成物、およびそのような薬学的組成物を患者に投与する段階を含む、患者にペプチドを送達する方法が含まれる。そのような方法の一つの例において、ペプチドは抗原であり、投与は、抗原が由来する病原体または腫瘍に対して免疫応答を誘導するために行われる。
【００３２】
本発明にはまた、本明細書に記載の方法によって産生されたか否かによらず、カプシドタンパク質、プレ膜タンパク質、エンベロープタンパク質、NS1タンパク質、NS2Aタンパク質タンパク質、NS2Bタンパク質、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、およびNS5タンパク質からなる群より選択される一つまたは複数のタンパク質内に挿入された一つまたは複数の異種ペプチドが含まれるフラビウイルスベクターが含まれる。フラビウイルスは、たとえば黄熱病ウイルス（たとえば、YF17D）、またはキメラフラビウイルス（たとえば、第一のフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質と、第二の異なるフラビウイルスのプレ膜タンパク質およびエンベロープタンパク質とが含まれるキメラフラビウイルス）となりうる。キメラの第一および第二のフラビウイルスは、日本脳炎、デング-1、デング-2、デング-3、デング-4、黄熱病、マリーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、クンジン、ロシオ脳炎、イルヘウス、ダニ媒介脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポーワッサン、ネギシ、アブセットアローブ、ハンザローバア、アポイ、およびHyprウイルスからなる群より独立して選択することができる。
【００３３】
本発明にはさらに、本明細書において上記および他所で記載されたフラビウイルスベクターのゲノムに対応する核酸分子、またはその相補体；そのようなウイルスベクターと薬学的に許容される希釈剤または担体とが含まれる薬学的組成物と共に、そのような組成物を投与することによって患者にペプチドを送達する方法が含まれる。そのような方法の一つの例において、ペプチドは抗原であり、投与は、抗原が由来する病原体または腫瘍に対する免疫応答を誘導するために行われる。
【００３４】
具体的な例において、本発明には、非構造タンパク質1（NS1）のアミノ酸236〜237位の間に異種ペプチドの挿入が含まれる、本明細書において記載されるフラビウイルスベクターが含まれる。単独、または他の挿入（たとえば、NS1インサート）と共に存在しうるさらなる例は、ベクターのプレ膜タンパク質のアミノ末端領域における異種ペプチドの挿入が含まれるベクターである。この挿入は、たとえばカプシド／プレ膜タンパク質切断部位の前の-4位、-2位、もしくは-1位、またはプレ膜タンパク質の26位（またはその組み合わせ）に存在しうる。さらに、プレ膜タンパク質挿入には、任意でプレ膜タンパク質からペプチドの除去を容易にするタンパク質切断部位が含まれうる。
【００３５】
本発明のベクターに含まれうるペプチドの具体的例には、インフルエンザ（たとえば、ヒトまたはトリ）M2eペプチドまたはインフルエンザ（たとえば、ヒトまたはインフルエンザ）血液凝集素前駆体タンパク質切断部位（HA0）が含まれるペプチドが含まれる。これらは天然に存在する、またはコンセンサス配列となりうる。さらなる例を以下におよび本明細書において他所で提供する。さらに、ベクターには、複数の異種ペプチド、たとえば、ヒトおよびトリインフルエンザM2eペプチドが含まれうる。さらに、本発明のベクターには、本明細書において記載されるように、改善された特性（たとえば、改善された生育特徴）をベクターに提供できる一つまたは複数の第二の部位の適応が含まれうる。
【００３６】
本発明にはまた、本明細書において記載されるフラビウイルスベクターのゲノムに対応する核酸分子またはその相補体が含まれる。さらに、本発明には、ウイルスベクターが含まれる薬学的組成物が含まれる。組成物には、任意で一つまたは複数の薬学的に許容される担体または希釈剤が含まれうる。さらに、組成物には任意で、アジュバント（たとえば、アラムのようなアルミニウム化合物）が含まれうる。組成物はまた、凍結乾燥型で存在してもよい。
【００３７】
本明細書において記載される組成物の投与を含む、ペプチドを被験者（たとえば、ヒト患者のような患者、または家畜動物もしくは家禽のような動物）に送達する方法も同様に本発明に含まれる。一つの例において、方法は、抗原が由来する病原体または腫瘍に対する免疫応答を誘導するために行われる。他の例において、方法はサブユニットワクチンの投与を含む。これらの例において、フラビウイルスベクターおよびサブユニットワクチンは同時投与することができ、フラビウイルスベクターをプライミング量として投与してサブユニットワクチンを追加免疫量として投与することができ、またはサブユニットワクチンをプライミング量として投与してフラビウイルスベクターを追加免疫量として投与することができる。サブユニットワクチンには、たとえば異種ペプチド（たとえば、インフルエンザM2eペプチドまたはインフルエンザ血液凝集素前駆体タンパク質切断部位（HA0）が含まれるペプチド）とB型肝炎ウイルスコアタンパク質との融合体が含まれるB型肝炎ウイルスコア粒子が含まれうる。これらのペプチドは、本明細書において記載されるように、天然に存在すること、またはコンセンサス配列となることができる。
【００３８】
本発明にはまた、そのような挿入に対して許容性であると同定された部位に、関心対象ペプチドをコードする配列の挿入を含む（たとえば、本明細書において記載される方法を用いて）、本明細書において記載されるベクターを作製する方法が含まれる。これらのベクターは、フラビウイルスベクター（たとえば、黄熱病ベクターまたは本明細書において記載されるキメラフラビウイルス（たとえば、ChimeriVax（商標）-JEまたはChimeriVax（商標）-WN））となりうる。例示的な挿入部位には、NS1-236およびカプシド／プレ膜タンパク質切断部位の前の-4位、-2位、もしくは-1位、またはプレ膜タンパク質の26位が含まれる。
【００３９】
さらに、本発明には、たとえば本明細書において記載される任意のベクターを薬学的に許容される担体または希釈剤、一つまたは複数のアジュバント、および／または1つまたは複数のさらなる活性物質（たとえば、サブユニットワクチン）と混合することによって、薬学的組成物を作製する方法が含まれる。
【００４０】
本発明にはまた、本明細書において記載される予防法および治療法において用いるための薬剤を調製するために、本明細書に記載のウイルスベクター、核酸分子、およびペプチドの全てを用いることが含まれる。
【００４１】
本発明はいくつかの長所を提供する。たとえば、本発明において用いられる生ワクチンウイルス（たとえば、ChimeriVax（商標）、黄熱病ウイルス、または他の生ワクチンウイルス）は、小さいポリペプチド抗原分子（たとえば、インフルエンザM2eまたはHA0切断部位ペプチド）の送達に関して有意な利益を提供する。フラビウイルスに基づくベクターのような生きたベクターを用いる長所には、（i）ワクチン接種後の抗原量の拡大；（ii）アジュバントの必要がないこと；（iii）生得のおよび適応免疫応答の強い刺激（たとえば、YF17Dは、最も強力な公知の免疫原である）；（iv）ChimeriVax（商標）（YF17D）が樹状細胞およびマクロファージのような抗原提示細胞に感染できることにより、より好ましい抗原提示が可能であること；（v）一生涯の免疫を提供する1回接種ワクチンを得ることが可能であること；（vi）ChimeriVax（商標）ワクチンウイルスのエンベロープが容易に交換可能であり、異なる組換え型ワクチンの選択を与え、そのいくつかは、地理的に異なる領域における他のワクチンより適切である（地方病のフラビウイルスに対するワクチンが含まれる2種混合（dual）ワクチンを作製するため、または集団における抗ベクター免疫を回避するため）、または連続使用のために適切であること；（vii）連続使用の際の有害事象の機会を消失させるためまたは抗ベクター免疫の効果を最小限にするために、上記のパッケージングされた1ラウンド複製のレプリコンまたはPIVに完全な生フラビウイルスベクターを改変することが可能であること；（viii）一つの病原体（エピトープおよび他の発現された抗原が同じ病原体に属する場合）、または二つもしくはそれより多い病原体（エピトープおよび他の発現された抗原が異なる病原体に属する場合）に対してより頑健な免疫応答を得るために、本明細書において記載された直接ランダム変異誘発法を用いて挿入されたエピトープを、レプリコンまたはPIVにおいて遺伝子間、2シストロン性に、または欠失の代わりに発現された他の抗原と組み合わせることが可能であること；および（ix）低い製造コスト、が含まれる。
【００４２】
本発明によって提供されるさらなる長所は、本発明のキメラフラビウイルスベクターが、安全となるように十分に弱毒化されるが、なおもキメラにおけるタンパク質が由来する、特にペプチドがキメラに挿入されたフラビウイルスに対して保護的免疫を誘導できるという事実に関連する。さらなる安全性は、本発明において用いられたベクターのいくつかはキメラであり、このように、野生型に復帰する可能性がないという事実に由来する。本発明において用いられるベクターのさらなる長所は、ウイルス複製戦略が、宿主細胞におけるウイルスゲノムの組み込みを伴わず、重要な安全性基準を提供するように、フラビウイルスが細胞の細胞質において複製する点である。さらに、以下にさらに考察されるように、本発明の一つのベクターを用いて、一つの抗原からの多数のエピトープまたは複数の抗原に由来するエピトープを送達することができる。
【００４３】
さらなる長所は、本明細書において記載される直接のランダム挿入法によって、様々な他のエピトープ（NS1における挿入部位に関しては以下に例示される）と共に、より長いインサートを挿入するために直接用いることができる、ウイルスタンパク質において広い許容性の部位の同定が起こりうる点である。さらなる長所は、一つのフラビウイルスにおいて高度に許容性であることが見いだされたいくつかの挿入部位が、異なるフラビウイルスのタンパク質における構造／機能の保存により他のフラビウイルスにおいても等しく許容性となりうる点である。さらなる長所は、エピトープを有する組換え型フラビウイルスを、たとえばサブユニットワクチンのための追加免疫として、または組換え型ウイルス成分と共に投与されるたとえばサブユニットもしくは死菌ワクチン成分からなる混合ワクチンにおける相乗的成分のための追加免疫として用いることができ、それによって免疫応答の有意な増強が起こる点である（ACAM-Flu-Aサブユニットワクチンと共に混合したA25ウイルスに関しては以下に例示される）。さらに、記載のランダム挿入法は、たとえば構造タンパク質遺伝子がゲノムの3'末端に転移され、IRESエレメントの制御下でNS5の後で発現される改変TBEウイルスの場合のように、再配列されている任意のフラビウイルス（または欠損フラビウイルス）ゲノムに応用することができる（Orlinger et al., J Virol. 80:12197-208, 2006）。
【００４４】
本発明の他の特色および長所は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ウイルスprM、E、および／またはNS1糖タンパク質へのコンセンサスM2eペプチドのトランスポゾン媒介ランダム挿入によるChimeriVax（商標）-JE-fluウイルスの構築の略図。CおよびNS2A-NS5遺伝子はまた、この図において図示されるアプローチを用いて外来ペプチド（たとえば、T細胞エピトープ）の挿入のための標的となりうる。
【図２】prM/M、E、およびNS1遺伝子において無作為に挿入されたM2eペプチドを含有するChimeriVax（商標）-JE-fluプラスミドライブラリーの構築の略図。
【図３】抗体によるウイルスプラークの染色によって明らかにされるように、ChimeriVax（商標）-JEウイルスのNS1タンパク質内でのインフルエンザAウイルスコンセンサスM2e保護エピトープの発現を示す。35 mmウェルにおけるウイルスプラークを、感染後4日目に抗JEポリクローナル抗体（A）または抗M2eモノクローナル抗体（B）によって染色した。100 mmペトリ皿（数百個のウイルスプラークを含有する）におけるM2e陽性ウイルスプラークは、抗M2eモノクローナル抗体（C）によって染色した。
【図４】M2e MAbまたはJEポリクローナル抗体（表の左；最高力価を有するクローンを太字で示す）による染色によって決定した、選択された精製ChimeriVax（商標）-JE-NS1/M2eウイルスクローン（最後の精製段階後のP2レベルでの保存系統）の力価の分析結果を示す表および写真、ならびにクローンの一つの染色例（右の写真）である。結果は、クローンの純度を証明して、高い遺伝的安定性の証拠を提供する。
【図５】ChimeriVax（商標）-JEベクターウイルスのNS1遺伝子における正確な位置の略図であり、以下に記載される実験において用いられるクローンA25が含まれるウイルスクローンA11-A92のシークエンシングによって同定されたM2eインサートのヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。完全な105ヌクレオチドのインサートを強調する。両側にGG残基が隣接するM2eペプチド（柔軟性のために付加される）を枠で囲む。BstBI制限部位（TTCGAA）を下線で示す。トランスポゾンの作用により、インサートの前に存在する二つのウイルスアミノ酸残基（SV）がインサートの末端で重複された（二重下線）。
【図６】図6AはウイルスゲノムにおけるM2eインサートの位置を示すChimeriVax（商標）-JE-NS1/M2eウイルスのクローンA25の略図である。図6Bは、Vero細胞において10回継代したA25ウイルスのプラークのM2eおよびJE特異的抗体による染色を示す写真であり、インサートの極めて高い安定性を証明している。図6Cは、ChimeriVax（商標）-JEベクターウイルスと比較したP2およびP12継代でのA25ウイルスの生育曲線のグラフである。パネルDは、A25ウイルスまたはChimeriVax-JEベクターに感染し、抗JEまたは抗M2e抗体のいずれかによって染色した細胞の免疫蛍光の例であり、同様にA25ウイルスによるM2eエピトープの効率的な発現を図示する。
【図７】表5における免疫群2および3からのマウス血清の連続希釈プールに関する、54日目でのM2e特異的総IgG：ELISA OD450値を示すグラフである。
【図８】マウス適応A/PR/8/34インフルエンザウイルスのLD50の20倍量を55日目にINチャレンジ後の表5に示した免疫マウスの生存曲線のグラフである。
【図９】インフルエンザAウイルスの万能M2e（A）およびHA0（B）エピトープのアライメントの略図である。配列の最も必須の部分（たとえば、抗体結合にとって）を影をつけて示す。
【図１０】本明細書において記載されるランダム挿入アプローチを用いて作製することができる多重抗原構築物の例である。たとえばprM-E遺伝子の代わりにNAまたはHAを、たとえばNS1において無作為に挿入されたM2eエピトープを、たとえばNS3における免疫優性T細胞エピトープを、および遺伝子間部位の一つ（または複数）に挿入されたさらなる免疫原を発現する多重機構汎流行ワクチンとして、多数のインフルエンザAウイルス免疫原を発現するChimeriVax-JEレプリコン。2Aオートプロテアーゼ（EMCVまたはFMDVから）は、ポリプロテインの残りからNAを切断するであろう。または、NSタンパク質の翻訳を再び開始するために、2Aオートプロテアーゼの代わりにIRESエレメントを用いることができる。多様なエレメント（たとえば、2Aオートプロテアーゼ、ユビキチン、IRES、NA遺伝子の自律性AUG、またはウイルスプロテアーゼ切断部位）を用いて、丸印の部位でのNAのN末端を産生することができる。同様に、異なる病原体に由来する抗原を用いて、いくつかの病原体に対するワクチン構築物を作製することができる。
【図１１】ChimeriVax-JE/NS1-M2e RNAライブラリーをトランスフェクトして、ウイルスクローン間の競合をなくすために直ちに寒天を上層したVero細胞のMe2抗体染色ペトリ皿の例である。トランスフェクションのためのRNAを、プラスミドpUC-AR03-rM2eからのNS1-M2e遺伝子ライブラリーをpBSA-AR3-stopベクターにライゲーションすることによって得られたインビトロでライゲーションされたDNA鋳型において合成した。
【図１２】ChimeriVax-JEウイルスのEタンパク質におけるM2eペプチドの発現の成功を示す。挿入変異体の増殖巣をM2e MAbによって染色した。（A）6日目で染色した当初のアミノ酸35個のM2e含有インサートを有する変種（実験2）。（BおよびC）4日目に染色したアミノ酸17個のM2eおよび2個のGly残基に隣接されたアミノ酸17個のM2eをそれぞれ有する変種（実験3）。
【図１３】ChimeriVax-JEのNS1-236挿入部位で縦列に挿入されたヒトM2e＋トリM2eエピトープを示す。インサートの総サイズはアミノ酸56個。（A）A25ウイルスに加えたトリM2eエピトープの略図。（B）ウイルスの二つの変種の正確な配列：上のパネルは、トリM2eインサートにおける本来のコドンを用いて構築されたM2eヒト/M23トリウイルスの配列を示す（ヒトM2eを下線で示し；トリM2eを破線の下線で示す）。下のパネルは、トリM2eコドンがより高い遺伝的安定性のために縮重コドンに変化されたことを除き同じものを示す。（C）JEおよびM2e抗体によって染色したM2eヒト/M23トリウイルスのプラーク。
【図１４】ChimeriVax-JEウイルスが、M2eエピトープを用いて同定されたNS1-236挿入部位でHAタグ（インフルエンザH3）B/T細胞エピトープを容認することを示す。（A）回収された生存ウイルスのインサートの配列。（B）Vero細胞上のウイルスのプラークを抗HAタグMAb 12CA5によって染色する。
【図１５】フラビウイルスprM、E、およびNS1タンパク質における外来エピトープ発現の異なる様式を示す。
【図１６】prMタンパク質におけるM2eを有するChimeriVax-JE挿入変種を示す。（A）一つの実験において決定した、ChimeriVax-JEと比較したM1、M2、M3、M6およびM8クローンのプラークの例。（B）prM-M2eクローン対ChimeriVax-JEベクターの生育曲線。
【図１７】prMにおけるM2eインサートを有するChimeriVax-JEクローンの配列の略図である。Signal P3.0オンラインプログラムによって予測される最も可能性が高い起こりうるシグナラーゼ切断部位を示す。
【図１８】A25（ChimeriVax-JE/M2eNS1-236）ウイルスのChimeriVax-WN02類似体を示す。構築物およびプラークは、アガロースを上層した6日目に産生され、これをM2e MAbによって染色する。
【図１９】ChimeriVax-WN02/A25およびChimeriVax-WN02/A25適合ウイルスを示す。（A）A25プロトタイプウイルスおよびChimeriVax-WN02と比較した、メチルセルロースを上層して産生された5日目のプラーク精製ウイルス保存系統のプラーク。（B）Vero細胞の生育曲線、MOI 0.001。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
詳細な説明
本発明は、異種ペプチドが含まれるウイルスベクターを生成する方法、そのようなペプチドが含まれるウイルスベクター、たとえば導入されたペプチドが由来する病原体に対する免疫応答を誘導するために、ウイルスベクターを投与することによってこれらのペプチドを送達する方法、およびウイルスベクターが含まれる組成物を提供する。これらのウイルスベクター、ペプチド、方法、および組成物の詳細を以下に提供する。
【００４７】
本発明の中心的な特色は、標的病原体に対して強く長く持続する免疫を誘導する目的で、広範囲の病原性生物の免疫原性ペプチドを、感染細胞におけるそのようなペプチドの効率的な発現および免疫系に対する効率的な提示のために、生きた弱毒化ワクチンウイルスのタンパク質に無作為に挿入することによる、生の組換え型ワクチンの構築に関する。効率的な提示に関して、たとえばB細胞エピトープを表す外来ペプチドを、強い抗ペプチド抗体反応を刺激するために、感染細胞単独から分泌されるタンパク質（たとえば、フラビウイルスのNS1およびprMのアミノ末端部分）のようなウイルスタンパク質、またはウイルス粒子（フラビウイルスのMおよびEエンベロープタンパク質）に無作為に挿入する。T細胞エピトープが含まれるペプチドのようなペプチドを、感染細胞の内部で合成される非構造ウイルスタンパク質に無作為に挿入することができ、それによってMHC I/II複合体を通して免疫系に外来ペプチドを提示して強い細胞性免疫を誘導する。構造タンパク質への挿入も同様に、効率的なMHC媒介提示となりうる。
【００４８】
以下にさらに説明されるように、本発明に従うウイルス遺伝子への無作為な挿入によって、ほとんどの複製コンピテント組換え型ウイルス変種を選択することができ、それによって挿入されたペプチドの最高の免疫原性（最適なペプチド立体構造）および最高の発現安定性を提供する。同様に、以下に記載されるように、たとえば除去可能なトランスプライマーが含まれる市販のトランスポゾン媒介挿入系を、本発明の組換え体を構築するためのツールとして用いることができる。本発明のアプローチを、実験の例の章において以下に詳細に記載する。簡単に説明すると、これらの例において、A型インフルエンザ株において高度に保存されるインフルエンザウイルスのM2タンパク質のコンセンサスB細胞エピトープM2e（同様にT細胞エピトープを含有する）を、ChimeriVax（商標）-JEワクチンウイルスのNS1、prM/M、およびE遺伝子に挿入した。抗M2e抗体によって認識可能な、NS1、prMおよびEタンパク質内でM2eペプチドを発現する多数のウイルスクローンが観察され、いくつかを精製してインビトロ／インビボでさらに特徴付けした。さらに、以下にさらに記載されるように、NS1挿入は、ChimeriVax（商標）-JEという状況からChimeriVax（商標）-WNに転移された。
【００４９】
本発明の方法の要素は、トランスポゾンが所望の遺伝子（または複数の遺伝子）に一つまたは複数の制限部位を無作為に挿入するためのみに用いられるという事実である。次に、所望の外来ペプチドをコードするDNA断片を制限部位で遺伝子に組み入れる。次に、変異体遺伝子ライブラリーを完全なウイルスゲノム（RNAウイルスのcDNA）に組み入れた後、細胞をトランスフェクトして、異質なウイルス子孫を回収することができる。ウイルスは、その生存率および効率的な複製に干渉せずに、挿入部位がより適切である自己を「選ぶ」。十分に多数の変異体ウイルスクローンを迅速に選択した後、挿入されたペプチドに対して特異的な抗体を用いて高い抗原性に関して、動物を免疫して抗ペプチド免疫応答および／またはチャレンジからの保護を測定することによって高い免疫原性（適当なペプチド立体構造および免疫細胞への提示）に関して、ならびにたとえばインビトロまたはインビボで変異体ウイルスの多数の継代の間にペプチドの存在および発現をモニターすること、および組換え型ワクチンウイルス生物学的表現型に関して評価可能であるいかなる適合も明らかにするためのゲノムシークエンシングによって遺伝的安定性に関して試験する（たとえば、製造時のより高い収率、より高い遺伝的安定性、およびより高い免疫原性）。その結果、「最善の」ワクチンウイルス変種が同定される。このように、この「ウイルスに決定させる」アプローチは、実質的な利益を提供する。
【００５０】
本発明の基礎を提供するランダム挿入法の原理を図1に図示する。この例において、インフルエンザAのM2eペプチドを構造prM/MおよびEタンパク質、ならびに非構造NS1タンパク質に導入した。構造タンパク質はウイルス粒子の一部として細胞から放出され（prMのN末端部分も同様に分泌される可能性がある）、NS1は、感染細胞の表面に輸送されて、その一分画が剥離して細胞外を循環する。細胞外提示は、強い抗体反応にとって必須である。このように、M2eを提示するためにNS1タンパク質を用いることは、ペプチドが細胞表面に送達されて、インフルエンザウイルスのM2によって天然の状態を模倣し、これはM2媒介免疫のいくつかの局面にとって重要である可能性があることから、特に興味深い。prMおよびEタンパク質の提示は、ペプチドの多数のコピーがより強い免疫原であると思われるウイルス粒子の表面に提示されることから、より高い免疫応答に至る可能性がある。
【００５１】
制限部位（たとえば、PmeI部位）を最初に、たとえばNew England Biolabs (Beverly, MA)GPS-LS Tn7媒介変異誘発キットのような市販のキットを用いて、サブクローニングした標的遺伝子（各遺伝子分子あたり主に一つの部位、しかしこの頻度は望ましければ、たとえばさらなる変異誘発ラウンドによって変更させることができる）に無作為に組み入れる。次に、トランスポゾンのトランスプライマー部分を制限エンドヌクレアーゼ（たとえばPmeI）消化によって除去して、これをM2e DNAインサートに置換すると、変異体遺伝子プラスミドライブラリーが生成される。変異遺伝子分子のプールを、ChimeriVax（商標）-JEの完全長のcDNAにライゲーションする。DNA鋳型をインビトロで転写した後、細胞にRNA転写物をトランスフェクトさせる。生存子孫ウイルスの個々のクローンを単離して、M2eペプチドの存在、免疫原性、および遺伝的安定性に関して試験する。本実施例のさらなる詳細を以下の実験例の章に記載する。
【００５２】
上記の方法の変法において、変異誘発は、完全な無傷のウイルスゲノムという状況において（たとえば、プラスミドにおいてクローニングされたRNA含有ウイルスの完全長のcDNA、またはDNAウイルスの完全なゲノム分子）、またはいくつかのウイルス遺伝子を包含するDNA断片という状況において起こり、この後に生存挿入変異体を回収する。そのような例において、ウイルスは、特異的標的タンパク質内に外来ペプチドを挿入するために最も適切な位置を「選ぶ」のみならず、同様にゲノム全体またはゲノムの大きい断片内でコードされる最も適切な標的タンパク質を選ぶ。もう一つの変法において、細菌（たとえば、サルモネラ（salmonella）等）のような他のベクター生物の適切な遺伝子を同様にランダム挿入変異誘発に供した後に、ワクチンとして用いることができるその生物の組換え型変種を選択することができる。
【００５３】
本明細書において記載される方法のもう一つの変法において、複数のトランスポゾンを連続的または同時に用いて、複数の異なる免疫原性ペプチドを無作為に挿入するために、同じ標的遺伝子を変異誘発させた後に、一つの病原体（たとえば、免疫原性／保護性を増加するために）、またはいくつかの病原体（たとえば組み合わせワクチンを作製するために）の異なる外来抗原性決定基を有する生存ウイルスクローンを選択する。ランダム挿入法はまた、たとえば上記のように（たとえば、McAllister et al., J. Virol. 74:9197-205, 2000；Bredenbeek et al., Virology 345:299-304, 2006）、一つの病原体または異なる病原体のいくつかの抗原を発現するワクチン候補体を生成するために、一つのウイルス／ベクター生物において他の発現プラットフォームと組み合わせることができる。同様に、さらに発現されたタンパク質は、免疫刺激分子、たとえばそれによって組換え型ワクチンの増加した免疫原性／効能が得られる免疫応答の適切な分岐を刺激する様々な公知のサイトカインとなりうる。さらに、方法は、広い許容性のある挿入部位（たとえばNS1-236およびprMのN末端領域（たとえば、アミノ酸1〜5位））を同定するために用いることができる。さらに、選択された有望な組換え体をワクチンそのものとして用いることができ、またはプライミング剤もしくは追加免疫（異なる成分を連続して適用する場合）として、または相乗的なワクチン成分として（異なる成分を同時に接種する場合）他の（たとえばサブユニットもしくは死菌、または他の生）ワクチンと併用して用いることができる。
【００５４】
本明細書において記載される注目すべき方法の特色には、以下が含まれる：（i）プラスミドライブラリーの生成を促進するために切断可能な抗生物質耐性遺伝子を（エピトープインサートと共に）用いること（図2）；（ii）インサートを有しないウイルスの出現の機会を最小限にするために完全長のプラスミドクローン（ウイルスcDNA）の標的遺伝子への終止コドンまたはフレームシフトの導入（図2）；（iii）いかなる無インサートDNA鋳型も消失させるための、ランダム挿入を含有するプラスミドライブラリーのPmeI酵素による処置、または無インサートウイルス（E-タンパク質発現区画）と挿入変種との競合を最小限にするために、トランスフェクトした細胞もしくはトランスフェクションのために用いられるRNAの連続希釈を行うこと；（iv）および細胞単層の免疫染色と組み合わせたプラーク精製を用いるインサート含有ウイルスクローンの容易な単離。
【００５５】
ウイルスベクター
本発明において用いることができるキメラウイルスは、上記のように、構造タンパク質（または複数のタンパク質）が、第二のウイルスの対応する構造タンパク質（または複数のタンパク質）に置換されている第一のフラビウイルス（すなわち、骨格フラビウイルス）からなるChimeriVax（商標）ウイルスに基づくことができる。たとえば、キメラは、prMおよびEタンパク質が第二のフラビウイルスのprMおよびEタンパク質に置換されている第一のフラビウイルスからなりうる。
【００５６】
本発明において用いられるキメラウイルスは、ウイルスの任意の組み合わせから作製することができる。本発明において第一または第二のウイルスとして用いることができる特定のフラビウイルスの例には、日本脳炎、デング（血清型1〜4）、黄熱病、マリーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、クンジン、ロシオ脳炎、およびイルヘウス脳炎ウイルスのような蚊媒介性のフラビウイルス；中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポーワッサン、ネギシ、アブセットアローブ、ハンザローバア、アポイ、およびHyprウイルスのようなマダニ媒介性フラビウイルス；と共にヘパシウイルス属（たとえばC型肝炎）のウイルスが含まれる。
【００５７】
本発明において用いることができるキメラウイルスのタイプの具体的例は、prMおよびEタンパク質が、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、デングウイルスのようなもう一つのフラビウイルス、または上記に列記したものの1つのような他の任意のフラビウイルスのprMおよびEタンパク質に置換されている、ヒト黄熱病ウイルスワクチン株YF17Dである。たとえば、ブダペスト条約の約定の下でAmerican Type Culture Collection (ATCC)、Manassas, Virginia, U.S.A.に寄託され、1998年1月6日の寄託日を与えられた以下のキメラフラビウイルスを本発明において用いることができる：キメラ黄熱病17D/日本脳炎SA14-14-2ウイルス（YF/JE Al.3；ATCCアクセッション番号ATCC VR-2594）、およびキメラ黄熱病17D/デング2型ウイルス（YF/DEN-2；ATCCアクセッション番号ATCC VR-2593）。
【００５８】
本発明において用いることができるキメラウイルスを作製する詳細は、たとえばその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,962,708号および同6,696,281号；国際特許出願のWO 98/37911およびWO 01/39802；ならびにChambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999において提供される。さらに、これらのキメラウイルスには、上記のおよび本明細書において引用された参考文献において記載されるものような弱毒化変異が含まれうる（同様に、たとえば、WO 2003/103571；WO 2005/082020；WO 2004/045529；WO 2006/044857；WO 2006/116182を参照されたい）。本発明のウイルスを作製するために用いることができるウイルスに関する配列情報は、たとえば米国特許第6,962,708号において提供される（同様に、たとえばGenbankアクセッション番号NP_041726；CAA27332；AAK11279；P17763も参照されたい。注意：これらの配列は例示的であるに過ぎない。多数の他のフラビウイルス配列が当技術分野において公知であり、本発明において用いることができる）。さらなる例には、本明細書において配列の付表（Sequence Appendix）3（YF17D）として提供されるGenbankアクセッション番号NC_002031、本明細書において配列の付表4（JE-SA-14-14-2）として提供されるGenbankアクセッション番号AF315119、および本明細書において配列の付表5（西ナイルウイルス）として提供されるGenbankアクセッション番号AF196835が含まれる。この配列情報は例示的であるに過ぎず、本発明において用いることができる他の多くのフラビウイルス配列が存在する。さらに、これらの配列には、本明細書において（および引用される参考文献において）記載される変異が含まれ、本明細書において（および引用される参考文献において）記載されるキメラの中に含まれ、および／または本明細書において記載されるインサートが含まれる
【００５９】
本アプローチにおいてベクターとしてChimeriVax（商標）ワクチンを用いる長所において、主な長所は、エンベロープタンパク質（フラビウイルスに対する免疫、この場合は抗ベクター免疫の主な抗原性決定基である）を、同じ個体に連続的に適用することができる同じYF17D骨格を用いて容易に交換することができ、いくつかの異なるワクチンを構築することができる点である。さらに、異なる組換え型ChimeriVax（商標）挿入ワクチンは、異なるフラビウイルスが風土病である特異的地理的地域において、風土病のフラビウイルスともう一つの標的病原体に対する2種混合ワクチンとして用いるためにより適切であると決定されうる。たとえば、ChimeriVax（商標）-JE-インフルエンザワクチンは、JEが風土病であるアジアにおいて、JEおよびインフルエンザの双方から保護するためにより適切である可能性があり、YF17D-インフルエンザワクチンは、YFが風土病であるアフリカおよび南アメリカにおいてより適切である可能性があり、ChimeriVax（商標）-WN-インフルエンザは、WNウイルスが風土病である米国およびヨーロッパの一部および中東においてより適切である可能性があり、ならびにChimeriVax（商標）-デング-インフルエンザは、デングウイルスが存在する熱帯地域全体でより適切である可能性がある。
【００６０】
キメラフラビウイルスのほかに、非キメラフラビウイルスのような他のフラビウイルスを、本発明に従うベクターとして用いることができる。本発明において用いることができるそのようなベクターの例には、YF17Dのような生弱毒化ワクチン、および当初野生型アシビ株の弱毒化によって得られたYF17D株に由来するワクチン（Smithburn et al., "Yellow Fever Vaccination," World Health Organization, p. 238, 1956；Freestone, Plotkin et al. (eds.), Vaccines, 2nd edition, W.B. Saunders, Philadelphia, U.S.A., 1995）が含まれる。本発明において用いることができるウイルスが誘導されうるYF17D株の例は、YF17D-204（YF-VAX(登録商標), Sanofi-Pasteur, Swiftwater, PA, USA；Stamaril（登録商標）, Sanofi-Pasteur, Marcy-L'Etoile, France；ARILVAX（商標）, Chiron, Speke, Liverpool, UK；FLAVIMUN（登録商標）, Berna Biotech, Bern, Switzerland；YF17D-204 France（X15067, X15062）；YF17D-204, 234 US（Rice et al., Science 229:726-733, 1985)）であるが、用いることができるそのような株の他の例は、近縁のYF 17DD株（GenBankアクセッション番号U 17066）、YF17D-213（GenBankアクセッション番号U 17067）、およびGaller et al., Vaccines 16(9/10): 1024-1028, 1998によって記載される黄熱病ウイルス17DD株である。これらの株のほかに、ヒト患者のようなヒトにおいて許容可能に弱毒化されることが見いだされた任意の他の黄熱病ウイルスワクチン株を本発明において用いることができる。
【００６１】
キメラフラビウイルスおよび黄熱病ウイルス（たとえば、YF17Dワクチン）のような無傷のフラビウイルスのほかに、本発明の方法はまた、他の非フラビウイルス、生きた弱毒化ワクチンウイルス（RNAおよびDNA含有ウイルスの双方）についても用いることができる。そのようなワクチンウイルスの例には、麻疹、風疹、ベネズエラウマ脳脊髄炎（VEE）のウイルス、モノネガウイルス（ラブドウイルス、パラインフルエンザウイルス等）、およびDNAウイルスの弱毒化株（たとえば、ワクシニアウイルス、痘瘡ワクチン等）が含まれる。
【００６２】
さらに、上記で考察したように生きたウイルスのほかに、レプリコン骨格タンパク質（たとえば、NS1および他のNSタンパク質と共にC）において外来ペプチドを発現するパッケージングされたレプリコンを本発明において用いることができる。このアプローチは、同じ個体に適用することができる異なるワクチンを作製するために同じベクターを用いるために、または同じレプリコン構築物においていくつかの抗原を発現させるために、たとえば安全性を増加させるためにまたは抗ベクター免疫（エンベロープタンパク質に対する抗体反応を中和する）を最小限にするために望ましい可能性がある場合に用いることができる。そのような構築物の図解を図10に示す。一ラウンドレプリコンを構築するための技術は十分に確立されており、レプリコンの免疫原性能は証明されている（Jones et al., Virology 331:247-259, 2005；Molenkamp et al., J. Virol. 77:1644-1648, 2003；Westaway et al., Adv. Virus. Res. 59:99-140, 2003）。そのようなレプリコンの一例では、prMおよびEエンベロープタンパク質遺伝子のほとんどが欠失している。したがって、これは細胞内で複製できるが、ウイルス子孫を生成することができない（したがって、一ラウンド複製である）。これは、prM-E遺伝子がトランスに提供されている場合にウイルス粒子にパッケージングされうる。なお、細胞にそのようなパッケージングレプリコンを感染させると（たとえば、ワクチン接種の後）、周辺の細胞／組織にさらに広がることなく、一ラウンド複製が後に続く。さらに、無作為に挿入された免疫原性ペプチドを、PIV（たとえば、Mason et al., Virology 351 :432-443, 2006）および他の任意の欠損ウイルスワクチン構築物、全ベクターウイルス、再配列ウイルス（たとえば、Orlinger et al., J. Virol. 80:12197-12208, 2006）という状況において、およびPIV欠失等の代わりにさらなる抗原の遺伝子間での2シストロン性の発現により、他の抗原と組み合わせることができる。
【００６３】
異なる病原体からの保護エピトープを一つのウイルスにおいて組み合わせることができ、それによって3種混合（triple）、4種混合（quadruple）等のワクチンが得られる。同様に、非風土病フラビウイルスからのエンベロープを含有するChimeriVax（商標）変種を用いて、そうでなければ一定の地理的地域におけるワクチン接種の有効性を制限しうると考えられる天然の抗ベクター免疫のリスクを集団において回避することができる（たとえば、ChimeriVax（商標）-JEベクターを、JEが存在しない米国において用いてもよい）。
【００６４】
さらに、本発明には、本明細書において記載される方法によって作製されたか否かによらず、C、prM、E、NSl、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、およびNS5タンパク質からなる群より選択されるタンパク質において、本明細書において記載されるように一つまたは複数の異種ペプチドの挿入が含まれる、フラビウイルス（たとえば、YF17Dのような黄熱病ウイルス、および本明細書において記載されるようなキメラフラビウイルス）が含まれる。本明細書における実験例において記載されるprM、E、およびNS1に挿入するための方法は、他のフラビウイルスタンパク質（CおよびNS2A-NS5）と共に他のベクターウイルス、細菌等のタンパク質を変異させる方法を、正確に科学分野における当業者に教示する。CおよびNS2A-NS5フラビウイルスタンパク質は、主に細胞内で発現されることから（ウイルス粒子の一部でもあるCを例外として）、これらのタンパク質は、T細胞外来免疫学的エピトープを挿入するために最も適切となる可能性がある。しかし、全てではないがほとんどの細胞内ウイルスタンパク質に対してインビボで何らかの抗体反応が生成されることから、B細胞エピトープも同様に挿入することができる。
【００６５】
異種ペプチド
本発明のウイルスベクターは、予防的または治療的価値を有する任意のペプチドまたはタンパク質を送達するために用いることができる。たとえば、本発明のベクターは、フラビウイルスのエンベロープタンパク質、プレ膜タンパク質、カプシドタンパク質、および非構造タンパク質のようなウイルスタンパク質に挿入された任意のタンパク質に基づく抗原に対する免疫応答（予防的または治療的）を誘導するために用いることができる。
【００６６】
本発明のベクターにはそれぞれ、単一のエピトープが含まれうる。または、多数のエピトープを、一つの部位で（たとえば、異なるエピトープが、アミノ酸のポリグリシン鎖のように柔軟なリンカーによって分離されうるポリトープとして）、異なる部位で、またはその任意の組み合わせでベクターに挿入することができる。異なるエピトープは、一つの種の病原体に由来することができ、または異なる種および／または異なる属に由来しうる。ベクターには、多数のペプチド、たとえば本明細書において記載されるペプチドの多数のコピー、または本明細書において記載されるようなペプチドの組み合わせが含まれうる。例として、ベクターには、ヒトおよびトリM2eペプチド（および／またはそのコンセンサス配列）が含まれうる。
【００６７】
本発明において用いることができる抗原は、たとえばウイルス、細菌、および寄生虫のような感染物質に由来しうる。そのような感染物質の具体的例は、ヒトに感染するウイルス（たとえば、A、BおよびC株）と共にトリインフルエンザウイルスが含まれるインフルエンザウイルスである。インフルエンザウイルスからの抗原の例には、血液凝集素（HA、たとえばH1〜H16のいずれか一つ、またはそのサブユニット）（またはHAサブユニットHA1およびHA2）、ノイラミニダーゼ（NA；たとえばN1〜N9のいずれか一つ）、M2、M1、ヌクレオタンパク質（NP）、およびBタンパク質に由来する抗原が含まれる。たとえば、血液凝集素前駆体タンパク質切断部位（HA0）（A/H1株に関して
、A/H3株に関して
、およびインフルエンザB株に関して
）またはM2e
が含まれるペプチドを用いることができる。インフルエンザにおいて保存されているペプチドの他の例を本発明において用いることができ、これには：インフルエンザBにおいて保存されるNBeペプチド（コンセンサス配列
）；インフルエンザBのBM2タンパク質の細胞外ドメイン（コンセンサスMLEPFQ）；およびH5N1トリインフルエンザに由来するM2eペプチド
が含まれる。本発明において用いることができるインフルエンザペプチドと共にそのようなペプチドが由来しうるタンパク質（たとえば、断片化によって）のさらなる例は、その内容物が参照により本明細書に組み入れられる、US 2002/0165176、US 2003/0175290、US 2004/0055024、US 2004/0116664、US 2004/0219170、US 2004/0223976、US 2005/0042229、US 2005/0003349、US 2005/0009008、US 2005/0186621、米国特許第4,752,473号、米国特許第5,374,717号、米国特許第6,169,175号、米国特許第6,720,409号、米国特許第6,750,325号、米国特許第6,872,395号、WO 93/15763、WO 94/06468、WO 94/17826、WO 96/10631、WO 99/07839、WO 99/58658、WO 02/14478、WO 2003/102165、WO 2004/053091、WO 2005/055957、ならびに同封の配列の付表1および2（およびその中に引用される参考文献）において記載されている。さらに、インフルエンザの保存された免疫学的／保護的TおよびB細胞エピトープは、www.immuneepitope.orgデータベースから選択することができ、ここでは以下に記載されるように本発明者らが用いるH3N2ウイルスの一つのHAエピトープが含まれる、多くの有望な交叉保護的エピトープが最近同定されている（Bui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 104:246-251, 2007および補足の表）。本発明は、オンラインIEDBリソースからの任意のペプチドを使用することができ、たとえばBui et al., 前記に記載される保存されたBおよびT細胞エピトープが含まれるインフルエンザウイルスエピトープを用いることができる。
【００６８】
寄生虫（たとえば、マラリア）、他の病原性ウイルス（たとえば、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV；たとえばgag）、およびC型肝炎ウイルス（HCV））、ならびに細菌（たとえば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、およびヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori））のような他のヒト／獣医学病原体からの保護的エピトープも同様に、本発明のベクターに含まれうる。これらおよび他の病原体の様々な適切なエピトープを文献において容易に見いだすことができる。たとえば、異なるHPV遺伝子型に対して保護する広い交叉中和抗体を誘導する乳頭腫ウイルスL2タンパク質からの交叉保護性エピトープ／ペプチド、たとえばHPV16ウイルスのL2タンパク質のアミノ酸1〜88位、アミノ酸1〜200位、またはアミノ酸17〜36位のようなエピトープ／ペプチドが、Schillerおよび共同研究者によって同定されている（WO 2006/083984 Al；
）。本発明において用いることができるさらなる病原体と共にこれらの病原体からの抗原およびエピトープの例は、その内容物が参照により本明細書に組み入れられる、WO 2004/053091、WO 03/102165、WO 02/14478、およびUS 2003/0185854において提供される。
【００６９】
そこから抗原を得ることができる病原体のさらなる例を、以下の表1に記載し、そのような抗原の具体的例には、表2において記載される抗原が含まれる。さらに、本発明のベクターに挿入することができるエピトープの具体的例を表3に提供する。表3において注目されるように、本発明のベクターにおいて用いられるエピトープは、B細胞エピトープ（すなわち、中和エピトープ）またはT細胞エピトープ（すなわち、Tヘルパーおよび細胞障害性T細胞特異的エピトープ）となりうる。
【００７０】
本発明のベクターは、病原体に由来する抗原のほかに抗原を送達するために用いることができる。たとえば、ベクターは、癌に対する免疫治療法において用いるために腫瘍関連抗原を送達するために用いることができる。多数の腫瘍特異的抗原が当技術分野において公知であり、本発明に従って投与することができる。癌（および対応する腫瘍関連抗原）の例は以下の通りである：黒色腫（NY-ESO-1タンパク質（具体的にアミノ酸157-165位に存在するCTLエピトープ）、CAMEL、MART 1、gp100、チロシン関連タンパク質TRP1および2、ならびにMUCl）；腺癌（ErbB2タンパク質）；結腸直腸癌（17-1A、791Tgp72、および癌胎児抗原）；前立腺癌（PSAlおよびPSA3）。熱ショックタンパク質（hsp110）も同様にそのような抗原として用いることができる。
【００７１】
本発明のもう一つの例において、それに対する免疫応答が望ましいアレルギー誘導抗原のエピトープをコードする外因性のタンパク質を用いることができる。さらに、本発明のベクターには、抗原のようなペプチドを、ベクターが投与される被験者における特定の細胞（たとえば、リガンドに対する受容体が含まれる細胞）に送達するためにベクターを標的化するために用いられるリガンドが含まれうる。
【００７２】
本発明のベクターに挿入されるペプチドまたはタンパク質の大きさは、当業者によって適切であると決定されうるように、たとえば長さがアミノ酸3〜1000個、たとえば長さがアミノ酸5〜500個、10〜100個、20〜55個、25〜45個、または35〜40個の範囲となりうる。本明細書において他所で考察されるように、本明細書において記載されるアミノ末端プレ膜タンパク質挿入は、より長い挿入の可能性を提供する（以下を参照されたい）。さらに、本明細書において注目されるペプチドには、当業者によって適切であると決定されうるように、さらなる配列が含まれうる、または長さが低減されうる。本明細書において記載されるペプチドは、本明細書において示される本発明のベクターに存在しうる、または一つもしくは複数のアミノ酸（たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多いアミノ酸）の置換または欠失によって改変されうる。さらに、ペプチドはより長いペプチドという状況においてベクターに存在しうる。
【００７３】
本発明にはまた、異なる二つのキメラという状況において示されるように（以下を参照されたい）、たとえば、その中に多数の異なるペプチドを挿入することができるNS1-236のような広い許容性のある挿入部位の同定および使用が含まれる。さらに広い許容性の部位には、ChimeriVax（商標）-JEおよびChimeriVax（商標）-WN（以下を参照されたい）が含まれるキメラウイルスのprMのアミノ末端領域が含まれる。挿入は、そのようなウイルスにおいて1〜50位、たとえば1〜25位、1〜15位、1〜10位、または1〜5位の任意の一つまたは複数において作製してもよい。
【００７４】
さらに、本発明には、たとえば細胞（たとえば、Vero）培養によって得られる第二の部位の適応を同定および使用が含まれる。そのような適応は、複製の増加等のような利益を提供してもよい。他の状況において用いることができるそのような適応の具体的例を以下の実験例において記載する。
【００７５】
産生および投与
上記のウイルスは、当技術分野において標準的な方法を用いて作製することができる。たとえば、ウイルスのゲノムに対応するRNA分子を、初代細胞、ニワトリ胚、または二倍体細胞株に導入することができ、そこから（またはその上清から）子孫ウイルスを精製することができる。ウイルスを産生するために用いることができる他の方法は、Vero細胞のような異数体細胞を使用する（Yasumura et al., Nihon Rinsho 21 :1201-1215, 1963）。そのような方法の例において、ウイルスのゲノムに対応する核酸分子（たとえば、RNA分子）を異数体細胞に導入して、細胞が培養されていた培地からウイルスを回収して、回収されたウイルスをヌクレアーゼ（たとえば、Benzonase（商標）のようなDNAおよびRNAの双方を分解するエンドヌクレアーゼ；米国特許第5,173,418号）によって処置し、ヌクレアーゼ処置ウイルスを濃縮して（たとえば、分子量カットオフたとえば500 kDaを有するフィルターを用いる限外濾過を用いることによって）、および濃縮されたウイルスをワクチン接種の目的で製剤化する。この方法の詳細は、参照により本明細書に組み入れられる、WO 03/060088 A2において提供される。さらに、キメラウイルスを産生するための方法はキメラウイルス構築物の構築に対する参照において上記で引用した文献において記載されている。
【００７６】
本発明のベクターは、当業者によって容易に決定されうる量および方法を用いることによって投与される。キメラフラビウイルスおよび黄熱病ウイルスに基づくベクターの場合、ベクターは、たとえば感染したニワトリ胚組織の澄んだ懸濁液として、またはキメラ黄熱病ウイルスに感染した細胞培養から採取した液体として、黄熱病17Dワクチンと同じように投与および製剤化することができる。このように、本発明のベクターは、たとえば腹腔内、筋肉内、皮下、または皮内経路によって投与される、投与容量0.1〜1.0 mlにおいて100〜1,000,000感染単位（たとえば、プラーク形成単位、または組織培養感染用量）を含有する滅菌水溶液として製剤化することができる（皮内ワクチン接種アプローチに関する詳細に関してはWO 2004/0120964を参照されたい）。さらに、フラビウイルスは、口腔内経路のような粘膜経路を通してヒト宿主に感染することができる可能性があることから（Gresikova et al., "Tick-borne Encephalitis," The Arboviruses, Ecology and Epidemiology, Monath (ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1988, Volume IV, 177-203）、ベクターを粘膜経路によって投与することができる。
【００７７】
免疫法において用いる場合、ベクターは、特定の病原体による感染のリスクを有する成人または小児における一次予防物質として投与することができる。ベクターはまた、ペプチド抗原が由来する病原体に対する免疫応答を刺激することによって、感染した患者を処置するための二次物質としても用いることができる。たとえば、HPVのE6/E7タンパク質からのエピトープを発現する組換え体、または全E6/E7タンパク質を治療的HPVワクチンとして用いることができる。
【００７８】
ワクチン応用に関して、任意で当業者に公知のアジュバントを用いることができる。キメラベクターの免疫原性を増強するために用いることができるアジュバントには、たとえばリポソーム製剤、（たとえばQS21）、ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピッドA、またはポリホスファジンのような合成アジュバントが含まれる。これらのアジュバントは典型的に、不活化ワクチンに対する免疫応答を増強するために用いられるが、生ワクチンについても用いることができる。粘膜経路、たとえば口腔内を通して送達されるキメラベクターの場合、大腸菌の熱不安定毒素（LT）またはLTの変異誘導体のような粘膜アジュバントをアジュバントとして用いることができる。さらに、アジュバント活性を有するサイトカインをコードする遺伝子をベクターに挿入することができる。このように、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13、またはIL-5のようなサイトカインをコードする遺伝子を外来抗原遺伝子と共に挿入して、それによって増強された免疫応答が得られるワクチンを産生する、または細胞性、液性、もしくは粘膜反応により特異的に向けられる免疫を調節することができる。または、サイトカインを、周知である手段（たとえば、直接接種、裸のDNA、ウイルスベクターにおいて等）によって組換え型ワクチンウイルスから同時、または連続的に個々に送達することができる。
【００７９】
本発明のウイルスは、他のワクチン接種アプローチと併用して用いることができる。たとえば、同じまたは異なる抗原が含まれるサブユニットワクチンと併用してウイルスを投与することができる。本発明の併用法には、本発明のウイルスを他の型の抗原と同時投与することが含まれうる（たとえば、肝炎コアタンパク質（たとえば、大腸菌において産生された表面にM2eペプチドを含有するB型肝炎コア粒子）（HBc-M2e; Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004）が含まれるサブユニット型または送達媒体）。または、本発明のベクターは、本発明のベクターまたは他のアプローチのいずれかをプライミングとして用いた後に、他のアプローチを追加免疫として用いる、またはその逆を用いる、プライミング-追加免疫戦略において他のアプローチ（サブユニットまたはHBcアプローチのような）と併用して用いることができる。さらに、本発明には、プライミングおよび追加免疫物質の双方として本発明のベクターを使用するプライミング-追加免疫戦略が含まれる。
【００８０】
ワクチン応用のほかに、当業者が容易に理解できるように、本発明のベクターは、患者の細胞に治療的遺伝子産物を導入するための遺伝子治療法および癌治療において用いることができる。さらに、免疫学的エピトープを含有する組換え型ウイルス、たとえば本明細書において記載されるキメラまたは無傷のフラビウイルスを、組換え型アルファウイルスレプリコンと類似のように、サブユニットまたは生物全体の死菌ワクチンの効能を増強するためにプライミング-追加免疫養生法において用いることができる（US 2005/0208020 Al）。さらに、以下の本発明者らの結果のいくつかはまた、外来エピトープを含有するフラビウイルス（たとえばChimeriVax-JE/NS1-M2e）とサブユニットワクチン（たとえば、HBc-M2e）とを混合して同時に接種すると、両者の間に強い相乗効果が存在することを証明している。後に、アジュバントを必要とせず、新しい望ましい特色、たとえば免疫応答におけるTh1シフトを提供する新しい効率的な併用ワクチン製剤が得られる可能性がある。さらに、本明細書において記載されるように、外来エピトープをウイルス粒子（prM-Eにおいて）の表面に発現させることができるが、生ワクチンとして組換え型ウイルスを用いる代わりに、たとえばホルマリンを用いてウイルスを不活化させて、死菌ワクチンとして用いることができる。そのようなアプローチは、ベクターウイルスが、ヒト／動物に対して病原性となりうる野生型ウイルスである場合に特に応用可能となりうる。
【００８１】
実験例
以下の実験例は、ChimeriVax（商標）-JEと共にHAエピトープへのM2e配列の挿入を示す。配列をまた、ChimeriVax（商標）-WN構築物にも挿入した。本実施例において記載される方法はまた、配列を他のタンパク質に挿入するために、および他のペプチドを挿入するために、他のキメラフラビウイルスおよびウイルスに基づくベクター（たとえば、レプリコンおよびPIV）のような他のウイルスと共に、上記のような他のベクター生物についても用いることができる。
【００８２】
黄熱病17D（YF17D）生弱毒化ワクチン株は、ヒトにおいて過去60年の間使用されており、優れた安全性記録を有し、1用量の投与後に長く持続する免疫を提供する。上記で注目したように、ChimeriVax（商標）-JEは、YF17Dの一定の構造タンパク質（PrME）をコードする遺伝子が、遺伝的に弱毒化された日本脳炎（JE）ウイルスSA14-14-2の対応する遺伝子に置換されている生の弱毒化組換え型ワクチン株である。このキメラの細胞内複製の原因であるカプシドおよび全ての非構造（NS）遺伝子はいずれもYF17Dワクチン株に由来する。同様に、ChimeriVax（商標）-WNは、YF17DのprMおよびEタンパク質をコードする遺伝子が西ナイルウイルス株からの対応する遺伝子に置換されている、生の弱毒化組換え型ワクチン株である。そのようなキメラの例は、西ナイルウイルス株NY99-flamingo 382-99（GenBankアクセッション番号AF 196835）の配列を使用する。NY99-flamingo 382-99エンベロープ配列におけるChimeriVax（商標）-WN02と呼ばれるさらなる例において、107位のリジンがフェニルアラニンに置換され、316位のアラニンがバリンに置換され、および440位のリジンがアルギニンに置換されている。
【００８３】
この章は、図2において図示されるプラスミド構築段階を記載する。pBeloBac11低コピー数ベクターに基づくChimeriVax（商標）-JEウイルスの全cDNAを含有するpBSA単プラスミド構築物について構築を開始した。このプラスミドは、YFM5'3'SA14-14-2およびYF5.2SA14-14-2プラスミド（ChimeriVax（商標）-JEの当初の二つのプラスミド）のChimeriVax（商標）-JE特異的cDNA部分を（SP6プロモーターと共に）1低コピー数ベクターpBeloBac11（New England Biolabs, Beverly, MA）にアセンブルすることによって構築された。プラスミドは、遺伝子のサブクローニングに都合のよいいくつかの独特の制限部位を含有する（図2における右上のプラスミドダイアグラムにおいてウイルスゲノムを上に示す）。prM、E、およびNS1遺伝子のサブクローニングのために用いられるさらなる制限部位SphI、NsiIおよびEagIを、サイレント部位特異的変異誘発によってpBSAプラスミドに導入した（図2における段階1〜3）。
【００８４】
三つの標的遺伝子をpUC18プラスミドベクター（段階6）にサブクローニングして、得られたプラスミドをTn7トランスポゾン（段階7）を用いて無作為に変異させた。形質転換された大腸菌を、クロラムフェニコールの存在下で生育させ（クロラムフェニコール耐性遺伝子はトランスポゾンの除去可能なトランスプライマーによってコードされる）、多数の細菌コロニーによって代表される三つの変異プラスミドライブラリーを調製した。変異体プラスミドライブラリーの調製の際に、それぞれのライブラリーにおけるコロニー数は、関心対象の外来インサート（M2eのようなペプチドをコードする）がその後標的遺伝子のあらゆるヌクレオチド後に確実に組み入れられるように、変異DNA配列におけるヌクレオチド数より少なくとも3倍高かった。各ライブラリーにおけるコロニー数を図2に示す。変異prM、E、およびNS1遺伝子ライブラリーをpUC18ベクター（段階8）にサブクローニングして、トランスプライマーをPmeI消化によって除去して、再ライゲーションすると（段階9）、各遺伝子分子において独特のPmeI部位を含有する15ヌクレオチドのランダムインサートのみが後に残る。M2eの挿入を促進するために、M2eおよびカナマイシン耐性遺伝子を含有するSmaI-SmaIカセットを最初にアセンブルした（段階4〜5）。Kanr遺伝子を、操作された隣接BstBI部位での消化によってこのカセットから除去することができる。カセットを段階9からのライブラリーにおけるPmeI部位に挿入して、新しいM2e含有ライブラリーの選択は、Kanの存在下で細菌を生育させることによって達成される（段階12）。構築において用いた本来のヒトインフルエンザA M2eコンセンサス配列、
を、ペプチドの抗原性／免疫原性に影響を及ぼさないいかなる望ましくないS-S架橋も回避するために、二つのCys残基がSerに変化して、二つのGly残基が柔軟性のために両側に付加された
という点において改変した。BstBIによる消化によってランダムM2eインサートを含有する得られた遺伝子ライブラリーからKanr遺伝子を除去した（段階13）。
【００８５】
一つのアプローチにおいて（図2におけるアプローチA）、M2eがウイルスprM、E、およびNS1遺伝子に無作為に挿入されたChimeriVax（商標）-JE-flu鋳型cDNAライブラリーを産生するために、段階9からの変異体遺伝子ライブラリー（ランダムPmeI部位を含有する）を、段階1〜3からの改変pBSAプラスミドにクローニングする。しかし、本発明者らが最初に段階10からのpBSA-AR3-rPmeIライブラリーにM2e/Kanrカセットを挿入しようと試みたところ、Kanの存在下で生育させた得られたpBSA-AR3-rM2e/Kanライブラリーにおける細菌クローン数は低かった（段階11）。それにもかかわらず、このアプローチによって、任意の免疫原性エピトープ（たとえば、マラリア寄生虫、TB、ウイルス病原体等からの）を含有するライブラリーを迅速に構築することができる。
【００８６】
もう一つのアプローチ（アプローチB）において、終止コドン／フレームシフト改変を最初に、サブクローニングしたprM、E、およびNS1遺伝子に導入し（段階14）、ウイルスにとって致死的な変異を含有する改変された遺伝子をpBSA-AR1-3プラスミドに導入した（段階15）。これは、最終的なChimeriVax（商標）-JE-flu鋳型ライブラリーにおいて混入する非変異体鋳型が一定比率存在することにより、細胞のトランスフェクション後に非変異体ChimeriVax（商標）-JEが出現する可能性を消失させるために行った。ChimeriVax（商標）-JE-fluウイルスに関する最終的な完全長の鋳型ライブラリーは、段階15からのライブラリーにおける標的遺伝子断片を段階13からのランダムM2eインサートを含有する断片に置換することによって得た（段階16）。
【００８７】
NS1にコンセンサスM2e配列が無作為に挿入されたChimeriVax（商標）-JEウイルスを産生するために、pBSA-AR3-rM2eプラスミドライブラリーをXhoIによって直線化して（XhoI部位はウイルスcDNAの末端に存在する）、SP6 RNAポリメラーゼによってインビトロで転写した（SP6プロモーターはウイルスcDNAの上流に存在する）後、Vero細胞のトランスフェクションを行った。トランスフェクション後3〜6日目の細胞障害効果が最初に検出可能または明白となった場合にウイルス子孫を採取した。採取した試料におけるウイルス力価を、全てのプラークを検出するためにマウス高免疫抗JE腹水（ATCC）を用いる、またはMabによって認識可能なM2eペプチドを発現するプラークのみを検出するために、インフルエンザM2eエピトープに対する市販のモノクローナル抗体（Mab）14C2を用いる、メタノール固定単層の染色によるプラークアッセイ法（メチルセルロース重層）によって決定した。全体的な力価は、7 log10 pfu/ml過剰であった。M2e陽性プラークは、容易に検出可能でり、総プラークの0.4％まで示した（図3Aおよび3B）。これらのM2e陽性プラークのいくつかは、M2e陰性プラークと同じ大きさであり、有効なウイルス複製を示している。総プラークの大部分はM2e陰性であり、これはNS1におけるランダム位置のいくつかでの挿入が不安定であるために、トランスフェクション後まもなく非変異体ChimeriVax（商標）-JEウイルスが出現したためであると考えられる。または、インサートは、存在するが抗体に近づけない可能性がある。
【００８８】
いくつかの技術を用いて個々の陽性ウイルスクローンを単離することができる。本発明者らは、プラーク精製をMAb染色（イムノフォーカスアッセイ法）と組み合わせた。このアッセイ法において、ウイルスの連続希釈液によって感染させたVero細胞にアガロースを上層した。5日目、アガロースを除去して、細胞の単層（たとえば、ペトリ皿において；図3C）をメタノールによって固定して、MAbによって染色する。次にアガロースをペトリ皿と整列させて、陽性M2eプラークに対応するゲルの部分を採取して凍結する。または、細胞単層をメタノール固定を行わずにMabによって染色した。陽性プラークにおける細胞を注意深くプラスチックから掻き取って凍結した。この技法を用いて候補ウイルスクローンほぼ80個が単離されており、さらに1〜2ラウンドのプラーク精製によってさらに精製する。本発明者らが用いたもう一つの方法は、起こりうる最高希釈（理想的には一つの陽性ウイルス粒子に感染した）で陽性ウェルを同定するために、ウイルスの最終希釈、細胞上清の採取、および96ウェルプレートにおける細胞単層のMAbによる染色と組み合わせた。この方法によって、候補クローン37個が得られた。さらなる分析により、これらの一つが純粋なクローンであるように思われるが、残りはなおもM2e陰性ウイルスと混合していることが証明された。
【００８９】
次に、十分に多数のM2e陽性クローン（たとえば、50〜100個）を、マウス血清における抗M2e抗体力価（たとえば、総IgG/IgMまたはアイソタイプIgG1/IgG2抗体を測定するために合成M2eペプチドを用いるELISA）と共にインビトロADCC試験における活性を測定するために、利用可能な動物モデルおよび方法を用いて、マウス（および／またはフェレット）において免疫原性に関して、および野生型インフルエンザウイルスのチャレンジに対する保護効能（長期間保護を含む）に関して試験することができる。遺伝的安定性を、細胞培養（またはインビボ）におけるウイルスの連続継代の後にイムノフォーカスアッセイ法および／またはシークエンシングによって評価することができる。
【００９０】
さらなる開発において、トランスフェクション後に回収されたウイルスから開始する3〜4回のプラーク精製段階の最後の後に、クローン13個のウイルス保存系統をVero細胞における2回の増幅継代によって産生した。これらの増幅された試料をP2研究用ウイルス保存系統と命名した（精製後2回継代）。保存系統の力価は、2.6×106〜1.0×107 pfu/mLの範囲であることが決定された。重要なことに、M2e MAbおよびJE HIAFの双方による染色は、ほぼ同一の力価を産生し（図4）、ウイルス保存系統が純粋であったことを示している。さらに、この結果は、組換え型ウイルスの遺伝的安定性に関する最初の証拠であった。ウイルスが純粋または安定でなければ、非変異体ChimeriVax（商標）-JEウイルスがM2e発現組換え体より速く生育するであろうが、これは明らかに当てはまらなかった。さらに、ウイルスプラークの効率的なM2e染色が、細胞のメタノール固定を行う場合（細胞内および表面タンパク質を検出する）およびメタノール固定を行わない場合（表面タンパク質のみを検出する）の双方について観察された。このように、予想されるようにM2eペプチドを含有するNS1タンパク質は、感染細胞の表面に通常輸送されるが、同様に分泌される可能性も最も高かった。したがって、NS1は、エピトープの効率的な表面／細胞外提示を可能にし、これはインビボでの頑健な抗M2e抗体反応の誘導にとって非常に望ましい。
【００９１】
クローン13個のNS1遺伝子（図4におけるA11〜A92）をシークエンシングして、そのM2eインサートの位置を決定した。驚くべきことに、アミノ酸35個のインサートはクローン13個全てにおいて正確に同じ部位に、すなわちウイルスNS1アミノ酸残基236位と237位の間のChimeriVax（商標）-JEウイルスゲノムのヌクレオチド3190位の後の、NS1タンパク質のC末端半分に存在することが見いだされた。インサートおよび周辺のNS1ヌクレオチドおよびアミノ酸残基の正確な配列を図5に示す。
【００９２】
13個全てのクローンにおいてインサートが同じ位置に存在する最も可能性が高い説明は、CPEが観察されるVero細胞のトランスフェクション後6日までに採取されたウイルスからクローンがプラーク精製されたことである。異なる最初の変種（異なる位置でインサートを有する）間の競合が、採取する前のウイルス複製の間に起こり、一つの変種がウイルス集団において優勢となる可能性がある。したがって、採取したクローン13個は、一つの挿入変種を示した。
【００９３】
変種間の競合の問題を克服するために、さらなるクローンを、トランスフェクションの直後に行ったプラーク採取によって調製することができる（たとえば、必要であればより免疫原性の高いワクチン候補体を発見するために）。この後のアプローチにおいて、Vero細胞に、インビトロで合成したRNAをトランスフェクトさせて、アガロースを直ちに上層した後、M2e抗体による細胞の染色およびアガロースからの陽性クローンの採取を行った。本発明者らは、インビトロでpBSA-AR3プラスミドライブラリーを転写することによって（図2）、またはプラスミドpUC-AR03-rM2e（pBSA-AR3ライブラリーより代表的であることが見いだされた）からのNS1-M2e遺伝子ライブラリーのpBSA-AR3-stopベクターへのインビトロライゲーションによって産生された、トランスフェクションのためのRNA転写物を用いてこれを試みた（図2）。アガロースの重層を、4〜5日目に除去して、細胞の単層をM2e MAbによって染色した。様々な大きさの多数の陽性ウイルス増殖巣が観察された。インビトロDNAライゲーション段階を用いて得られたRNAをトランスフェクトしたVero細胞の染色されたペトリ皿の例を、図11に示す。いくつかのより大きい陽性プラークに対応するアガロースの部分を採取した後、さらなるラウンドのプラーク精製によってさらに精製した。興味深いことに、新規変種をシークエンシングしたところ、それらはA25ウイルスと同じM2e挿入位置を有した。これによって、NS1タンパク質における非常に許容性のある部位としてNS1-236が同定され、これは非常に効率よく複製する挿入変種体を生じ、最大のプラークを産生する。それにもかかわらず、図11における増殖巣の様々な大きさから判断すると、M2eインサートが、NS1内の異なる位置で介在することは明確であるように思われる。中間または小さいプラークを形成するいくつかのより効率の低い複製変種は、実際的な価値があるように思われる。
【００９４】
本発明者らはまた、A25クローンのM2eインサートの末端に存在するBstBI制限部位（図5）を用いて、このNS1位置で第二のインフルエンザ保護的エピトープを付加した。たとえば、本発明者らは、柔軟性のために（図13Aにおいて略図で示される）2×Glyリンカーによって隣接されたH5N1トリインフルエンザからのM2eエピトープを組み入れて、生存ウイルスを得た。このように後者の挿入変異体は、ヒトインフルエンザM2eの後にトリインフルエンザM2eの縦列を含有する。このウイルスは、ヒトインフルエンザA株およびトリインフルエンザの双方から集団を保護することができる万能ワクチンとなりうると考えられる。この構築において、A25ウイルスからのヒトM2eインサートを有するNS1遺伝子を最初に、逆遺伝学によってChimeriVax-JE感染クローンにクローニングした。次に、二つのアニーリングしたリン酸化オリゴヌクレオチドからなる二本鎖DNA断片をBstBI部位でクローニングすることによって、トリM2e配列を付加した。M2eヒト/M2eトリウイルスの二つのバージョンを構築し、すなわち一つのバージョンはH5N1インフルエンザの本来のM2e配列（最後から2番目のCysがSerに変化していることを除く。図13Bの上のパネルに示した配列）であり、他の一つは、上流のヒトM2e配列（図13Bにおいて下のパネルに示される配列）とのヌクレオチド配列類似性を最小限にするために、本来のH5N1コドンが縮重コドンに置換されたバージョンであった。後者は、ヒトM2eおよびトリM2e配列の間での組換え型ウイルスにおける相同的組換えの機会を低減させるために行われ、これによってウイルスのより高い遺伝的安定性が得られるはずであった。構築されたウイルスのプラークをJEおよびM2e特異的抗体によって染色した（図13C）。プラークの大きさは、A25親ウイルスと比較していくぶん低減された。トランスフェクション後直ちに回収したP1ウイルスの力価は、妥当に高かった（〜5 log10 pfu/ml）。ウイルスはVero細胞においてさらに継代されていないが、P2での力価は、P1と比較してChimeriVax構築物に関して通常高いことから、P2およびその後の継代において、より高い力価が予想されうる。この実験は、より短いインサート（A25ウイルスにおけるアミノ酸35個のM2eエピトープ）を用いて、同定された挿入部位により長いインサート（この場合は、トランスポゾンからのいくつかの余分の残基を有する長さがアミノ酸56個）を組み入れることができることを明らかに示している。NS1-236挿入部位は、アミノ酸少なくとも56個のインサートを容認する。もう一つの重要な結論は、トリM2e配列をヒトM2e配列に付加すると、A25ウイルスと比較してNS1-236位置で全体的なインサート配列（およびおそらく構造）が変化した点である。これは、この挿入部位が広く許容性であるという第一の実験的証拠であった。
【００９５】
さらに、HA0インフルエンザAエピトープを類似の縦列でM2eと組み合わせることができる。HAタンパク質からのウイルス中和エピトープまたはCTLエピトープのような他のインフルエンザウイルスエピトープを、M2eと共に用いることが含まれる、この位置で（またはNS1もしくは他のウイルスタンパク質におけるいくつかの他の位置で類推によって）単独または様々な組み合わせで挿入することができる。
【００９６】
NS1-236挿入部位の広い許容性をさらに証明するために、様々なH3インフルエンザ株（Bui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:246-251, 2007）に対する保護を提供することができるインフルエンザH3ウイルスの
直線状の保護エピトープ（HAタグエピトープとも呼ばれる）をNS1-236残基の後に操作して、標準的な二プラスミド法を用いて組換え型ウイルスを生成した。エピトープは、柔軟性のために両側で二つのGly残基に隣接され、そのCys残基はSerに変化した。回収された生存ウイルスのインサート配列を図17Aに示す。ウイルス（Vero細胞）のプラークを抗HAタグMAb 12CA5（図14B）によって染色した。このように、M2eエピトープのランダム挿入によって見いだされるNS1-136挿入部位は、全く異なる配列を有するエピトープ（たとえば、HAタグ）によって許容される。M2e挿入と同様に、本実施例はまた、HAタグがB細胞と共にT細胞インフルエンザウイルスエピトープの双方を表すことから、B細胞エピトープのみならず、T細胞エピトープの挿入を証明する（Bui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:246-251, 2007）。
【００９７】
ChimeriVax（商標）-JE-NS1/M2eウイルスの細胞培養における遺伝的安定性、および生育の速度論
継代2（P2；プラーク精製3サイクルおよび増幅継代2回後に産生された研究用ウイルス保存系統）において7 log10 pfu/mLの最高力価を有するクローンA25ウイルス（図6、パネルA）のNS1遺伝子を、さらなる生物学的特徴付けのために用いた。M2eの効率的な発現を、M2e MAb（JE抗体と共に）によって特異的に染色したA25感染細胞の免疫蛍光によって図6Dにおいてさらに図示する。
【００９８】
ウイルスがインビトロで遺伝的に安定であるか否かを決定するために、これをワクチン産生に関して認定されるVero細胞において、推定MOI 0.001 pfu/mLでP12レベルまで10回継代した。P12ウイルスを、M2e MAbまたはJE HIAFによるイムノフォーカスアッセイ法において染色したところ、全てのプラークが双方の抗体によって染色され、8 log10 pfu/mLの同じ力価を生じた（図6B）。このことは、継代12でのウイルスがそのインサートを安定に維持することを証明した。
【００９９】
ウイルスが進行的により細胞障害性となり、P12レベルでのプラークはP2でのウイルスのプラークより大きいことから、何らかのVero細胞適合が継代の際に起こった。P12ウイルスプラークの平均直径は、ChimeriVax（商標）-JEベクターウイルスのそれと同等となった。P12ウイルスの完全なゲノムをシークエンシングしたところ、ヌクレオチド8個の変化が検出された（表4）。四つの変化によってアミノ酸置換が起こった：Eタンパク質において残基E-357でValからAla、NS4B-95においてMetからVal、およびM2eペプチドから直ちに上流の二つの置換（NS1-235でSerからLeu、、および残基linsにおいてPheからLeu）。後者の適合のいくつかは、プラークの大きさの増加およびよりよいウイルス複製の原因であったに違いない（以下を参照されたい）。これらの変化はいずれも、ChimeriVax（商標）-JEワクチンにおける弱毒化マーカーの復帰変異ではない（他の三つのクローンにおける変異、A11、A79、およびA88を同様にP12まで継代してシークエンシングしたところ、M2eインサートを安定に維持することが見いだされ、これも同様に表4に示す）。
【０１００】
P2およびP12レベルでのA25クローンの生育速度論をVero細胞におけるChimeriVax（商標）-JE親ベクターウイルスと比較した。一つの代表的な実験の結果（MOI 0.001）を図6Cに示す。P2ウイルスは効率よく生育するが、ChimeriVax（商標）-JEよりいくぶん遅く、ベクターウイルスと比較して1日遅れの6日目をピークとした。対照的に、P12ウイルスは、7 log10 pfu/mLの過剰量でChimeriVax（商標）-JEより高い力価で5日目をピークとした。P12ウイルスのより効率的な複製はMOI 0.1において顕著であった。このように、A25クローンは、Vero細胞において10回継代後により効率的に複製した。P12において見いだされた配列変化のいくつかは、組換え型ワクチンウイルスの高収率製造にとって有益となる可能性がある。
【０１０１】
ChimeriVax（商標）-JE/flu組換え体の免疫原性および保護的効能を分析するためのマウスモデルを確立するためのChimeriVax（商標）-JE-NS1/M2e A25ウイルスを用いる予備実験
任意のウイルスワクチンベクター、特に齧歯類が天然の宿主ではないもの（たとえば、YF、YF17Dの野生型プロトタイプの天然の宿主はサルおよびヒトである）に関して、関連するおよび有用な小動物モデルの確立は難しい。そのようなモデルでは、様々な形状で外来抗原を発現する多数の組換え型ウイルス構築物の相対的免疫原性を比較することが可能であるはずである。ChimeriVax（商標）-JE-NS1/M2eに関する最適な免疫経路を決定するためおよび免疫原性の予備的な証拠を得るために、5週齢のBalb/cマウス（N＝10）をA25クローンの5 log10 pfu/用量によって皮下（SC）または腹腔内（IP）に免疫した（それぞれ、1群および2群；表5）。陽性対照群3には、大腸菌において産生された表面にM2eペプチドを含有するB型肝炎コア粒子10 μg（HBc-M2e；Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004）の皮下用量をアラムアジュバントと共に投与した。この群を同様に20日目に追加免疫した。陰性対照群4および5をChimeriVax（商標）-JEベクター（5 log10 pfu）によって免疫するか、または偽免疫した（希釈体）。
【０１０２】
ウイルスを接種した群の個々の動物におけるウイルス血症を、1、3、7、9、および11日目に採取した血清において決定した。A25ウイルスはいずれの経路によっても検出可能なウイルス血症を引き起こさなかった。ChimeriVax（商標）-JEウイルスを接種した動物10匹中2匹が、低レベルウイルス血症（50および275 pfu/mL）を1日目のみに示したが、これは接種したウイルスを表した可能性が大きい。このように、A25ウイルスは、いずれの経路によっても顕著な全身感染症を引き起こすことができなかった。
【０１０３】
38日目に全ての動物から採血して、各群に関する血清のプールにおいて抗M2e抗体反応をELISAにおいて決定した。ウイルス免疫群において、低レベル反応は、総IgGおよびIgG2a力価が100であった（および検出可能なIgG1を示さなかった）2群（A25 IP）においてのみ検出されたが、3群（HBc-M2e SC/SC）における力価は予想通りに高く、総IgG、IgG1、およびIgG2aに関してそれぞれ218,700、218,700、および24,300であった。この理由から、1、2および4群を40日目にそれぞれのウイルスの5 log10 pfuによって追加免疫して；1群はSCによって追加免疫したが、他の群はIPによって追加免疫した（5群にはまた、希釈剤のIP用量を投与した）。2週間後（54日目）、動物から再度採血して、血清のプールにおいてM2e抗体反応を測定した（表5）。A25ウイルスの追加免疫によって、2群（A25 IP/IP）において抗体力価の劇的な増加が起こった。この群における総IgG力価は、2,700まで約30倍増加した。3群（HBc-M2e）において、総IgG力価は72,900であった。総IgGに関する450 nmでのODの読み取りを、図7において2群および3群に関して図示する。重要なことに、HBc-M2e免疫によって主にIgG1反応が起こるが、A25ウイルスによって誘導されたほぼ全ての抗体がIgG2aサブクラスの抗体であった（表5）。IgG2a抗体はADCCの主なメディエータであり、これはインフルエンザ感染症に対するM2e誘導保護の主な機構であると考えられている。このように、ChimeriVax（商標）-JE/flu組換え体の免疫原性を測定するための効率的なマウスモデルは、IP免疫後のIP追加免疫に依存して確立されている。
【０１０４】
55日目に、動物に高用量のLD50の20倍量のマウス適合A/PR/8/34インフルエンザウイルスを鼻腔内に（IN）チャレンジした。この用量は、HBc-M2e試験において用いられたLD50の4倍量の標準的なチャレンジ用量と比較して5倍高い。この予備実験において、本発明者らは、M2eをChimeriVax（商標）-JEウイルスベクターによって送達した場合に、免疫後のM2e抗体力価がより低い場合であっても、HBc-M2e免疫と比較してより効率的な保護が可能であるかという疑問に答えるために故意に高用量を選択した。理論的に、これは、抗原提示細胞の非特異的ウイルス刺激、CTL反応（M2eペプチドはCTLエピトープを含有する）、頑健なT細胞の助けの誘導と共に、生得の免疫の何らかの機構のためであると考えられる。チャレンジ後の生存曲線を図8に示す。予想されるように、チャレンジ用量を投与すると、HBc-M2e免疫動物の生存は不完全であった（50％）。A25ウイルスをIP/IPによって免疫した2群において生存した動物2匹は、二つのA25-免疫群において最高のM2e抗体力価を有した（20％生存）。1群（A25 SC/SC）では動物1匹が生存した。陰性対照群4および5における動物は全て死亡した。これらのデータから、保護レベルとM2e抗体力価の間には、動物が組換え型ウイルスまたはサブユニットワクチンによって免疫されたか否かによらず、明確な相関があるように思われる。しかし、ウイルスによってマウスに送達されたM2eの実際のμg量は不明であり、これはこのモデルにおけるウイルスの限定的な複製により非常に低かった可能性があることから、上記の機構のいくつかは、A25免疫において役割を有する可能性があることに注意すべきである。この局面は、より効率的な末梢的なウイルス複製が予想されるハムスターモデルにおいて取り組むことができる。霊長類／ヒトにおいてChimeriVax（商標）-JE（と共に他のChimeriVax（商標）およびYF 17Dワクチン）は、〜2 log10 pfu/Mlのピークウイルス血症力価で比較的効率的な全身感染症を引き起こす。このように、比較的低用量のウイルスの1回接種後に、頑健なM2e反応およびインフルエンザに対する保護が予想される。
【０１０５】
A25ウイルスを用いるマウス実験2
より若い4週齢のマウス（二つの販売元から）およびA25ウイルスのより高いIP用量（7 log10 pfu/ml）を用いて、A25ウイルスに関してさらなるマウス実験を行った。実験デザインを表6に示す。ほとんどの群において、A25 P2ウイルス保存系統を用いた（これは前回の実験においても用いた）。この実験にはまた、上記のVero細胞適合A25 P12ウイルスを接種した1群（#5）が含まれた。陰性対照は、ChimeriVax-JEおよび希釈剤（2、4、および7群）であった。陽性対照Taconicマウスには、アラムアジュバントと混合したHBc-M2e粒子（Acam-Flu-Aと呼ばれる）をSC接種した。Jacksonマウス群において、A25ウイルスとAcam-Flu-Aの間の相乗効果を試験するために二つの群を作製した。8群にはIP経路によってアジュバントなしAcam-Flu-Aのみを投与し、9群にはA29と混合したAcam-Flu-Aを同様にIP投与した。マウスを全て、初回接種後1ヶ月目に追加免疫して、59日目に、M2e特異的抗体力価（総IgG、およびIgG1、IgG2a、IgG2b、およびIgG3タイプ）を、各群に関して個々の血清（総IgGに関して）、または血清のプール（IgGアイソタイプに関して）においてELISAによって決定した。M2e特異的総IgG力価も同様に30日目（追加免疫前）に決定した。ELISA力価を表7に示す。GMT値を、個々の血清において決定した総IgGに関して与える。データは、A25免疫動物が有意により高いM2eペプチド特異的抗体力価を有したことを除き、前回のマウス実験と一致した。ほとんどのA25およびAcam-Flu-A接種動物は、初回投与後に30日目に血清変換した。59日目に（追加免疫後〜1ヶ月）、A25およびAcam-Flu-A群の動物は全て血清陽性であり、総IgG力価は30日目と比較して劇的に増加した。予想されるように、Acam-Flu-A／アラムアジュバント免疫（3群）によって、主にTh2型の反応が起こり、IgG1力価は他のIgGアイソタイプと比較して最高であった。A25による免疫（1、5、および6群）によって、より高いIgG2a力価に関連する主にTh1型の反応が起こり、これはADCC機構によるM2e媒介保護にとって望ましい型である。同様にADCCに関係しているIgG2bおよびIgG3抗体が検出された（Jegerlehner et al., J. Immunol. 172:5598-5605, 2004）。このこともまた、ChimeriVax-JEのNS1-236部位に挿入されたM2eエピトープの高い免疫原性を証明した。
【０１０６】
この実験における重要な知見は、Acam-Flu-AをA25ウイルスと同時接種すると、Acam-Flu-AまたはA25ウイルス単独の接種と比較して、抗M2e抗体反応が有意に増加したことであった（表7において、9群を8および6群と比較して）。59日目に、総IgG GMTは9および8群に関してそれぞれ、95,940および35,050であった（比例した差は30日目においてさらにより顕著であった）。このように、同時接種の強い相乗効果が観察された。その上、Acam-Flu-A単独はほとんどTh1型反応を誘導したが（IgGl、IgG2a、IgG2b、およびIgG3の力価はそれぞれ、72,900、8,100、300、および900）、Acam-Flu-AとA25ウイルスを同時接種すると、IgG1のより低い比率によって証明されるように明白なTh2シフトが起こり、他の抗体アイソタイプの有意により高い比率が得られた（IgGl、IgG2a、IgG2b、およびIgG3の力価はそれぞれ、72,900、72,900、8,100、および8,100）。A25接種単独では中等度の免疫応答が得られたことから（Jackson balb/cマウスにおいて、表7における6群を参照されたい）、相乗効果は、同時接種動物においてA25ウイルスによる抗原（M2e）量の増加のみに帰因することはできない。これらの効果はまた、たとえば接種部位における樹状細胞における、ウイルスの複製のアジュバント効果による可能性があった。そのようなアジュバント効果はアルファウイルスレプリコンに関して報告されている（Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:3722-3727, 2006；Hidmark et al., J. Virol. 80:7100-7110, 2006）。
【０１０７】
ChimeriVax-JEのEタンパク質に無作為に挿入されたM2eの発現
M2eが、ウイルス粒子の表面においてChimeriVax-JEベクターのEタンパク質に無作為に挿入されて発現されうるか否かを決定するために三つの実験を行った。第一の実験において、pBSA-AR2-rM2eプラスミドライブラリーにおいてSP6 RNAポリメラーゼによってRNAを合成した（図2における段階16）。lipofectamineを用いて、Vero細胞にRNAをトランスフェクトした。採取された細胞上清には非変異体ウイルスプラークのみが観察され、これは、M2e MAbによって染色されなかった。おそらく、NS1におけるランダム挿入の場合と同様に、M2eインサートを有しないウイルスが、Eにおける不安定な位置での挿入により急速に出現して、優勢となった。第二の実験において、E-M2e遺伝子ライブラリーをNsiIおよびKasIによってpUCAR02-rM2eから抽出して（図2における段階13）、インビトロでpBSA-AR2stopベクターにライゲーションした（図2、段階15）。ライゲーション産物をXhoIによって直線化して、インビトロで転写した。Vero細胞を合成RNAによって電気穿孔処理して、トランスフェクトした細胞浮遊液を連続希釈して（非変異体とM2e陽性ウイルスとの干渉を低減するため）、細胞希釈液をペトリ皿に播種した。細胞単層が確実にコンフルエントとなるように、トランスフェクト細胞のより高い希釈液を播種した培養皿に、非トランスフェクトVero細胞を加えた。接着後、細胞単層に寒天を重層した。単層をM2e Mabによって6日後に染色すると（アガロース重層の除去後）、より高いトランスフェクト細胞希釈液において（1：4および1：8）いくつかの陽性増殖巣が観察された。増殖巣の一例を図12Aに示す。増殖巣の数およびその大きさはNS1-M2eライブラリーのトランスフェクションについて観察されたもののいくつかと比較して小さく、このことはNS1と比較して、長さがアミノ酸35個のインサート（pUC-AR02-rM2eにおいて用いられる；図5と同じ）をEタンパク質に挿入することがより難しい可能性があることを示している。第三の実験において、二つの相補的リン酸化プライマーをアニーリングすることによって、より短いM2eインサート（SLLTEVETPIRNEWGSR）を産生した。インサートのヌクレオチド配列は以下のとおりである。
【０１０８】
同じインサートであるが柔軟性のために二つの余分のGlyリンカー残基を両側に含有するインサート（全長アミノ酸21個）を同様に産生した。第二のインサートのヌクレオチド配列は以下の通りである。
【０１０９】
二つのインサートをトランスプライマーの代わりにpUC-AR02-rTn7enrライブラリー（段階8、図2）の平滑PmeI部位にライゲーションした。ベクタープラスミドDNAをライゲーションの前に脱リン酸化した。二つの新しいプラスミドライブラリーpUC-AR2-17M2eおよびpUC-AR2-17gM2eをそれぞれ産生した。二つのライブラリーのNsiI-KasIインサートをpBSA-AR2stopベクターにトランスフェクトすると、pBSA-AR2-17M2eおよびpBSA-AR2-17gM2e完全長ライブラリーが得られ、これらをインビトロ転写のために用いた。後者の二つのライブラリーをまず、PmeIによって消化して、インサートを含有しないいかなる完全長の鋳型DNA分子も消失させた（インサート含有分子において、インサートの両側のPmeIクローニング部位は切除される）。次にそれらをXhoIによって直線化して、SP6 RNAポリメラーゼによって転写した。Vero細胞を転写物によって電気穿孔処理して、ペトリ皿に希釈せずに播種して、細胞が接着した後アガロースを重層した。無インサートウイルスによる干渉を回避するために、単層をM2e Mabによって早期に、トランスフェクション後4日目に染色した。〜100個までの小さい増殖巣が二つのトランスフェクションにおいて観察された。そのような増殖巣の例を、Eタンパク質におけるアミノ酸17個のM2eインサート、およびGG-アミノ酸17個-GGインサートを含有するChimeriVax-JEウイルスに関してそれぞれ、図12AおよびBに示す。このように、アミノ酸35個のインサートをアミノ酸17または21個に短縮することによって、組換え型ウイルスの回収は有意に増加したように思われる。観察されたM2e陽性変種のいくつかは、単離された後、妥当に良好に複製することが可能である。必要であれば、より効率的に複製する変種をさらなるトランスフェクションから単離することができる。さらに、生育を改善するいくつかの第二の部位の変異が起こることを予想して、ゆっくり複製する変種を、たとえばVero細胞において連続継代することができる。本実施例は、Eタンパク質に外来免疫学的エピトープを無作為に挿入する可能性を明らかに証明する。
【０１１０】
ChimeriVax-JEベクターウイルスのprMタンパク質におけるM2eエピトープのランダム挿入
ウイルス糖タンパク質（prM、E、またはNS1）における異なる発現様式を図15に図示する。Eタンパク質に挿入されたエピトープはウイルス粒子の表面に提示され（180コピー）、したがって最も免疫原性であると予想されうる。NS1タンパク質における発現は、挿入されたエピトープを感染細胞の表面に送達すると共に、分泌されたNS1オリゴマーに細胞外に送達する。後者の様式の免疫原性が高いことは上記の実験例において証明されたが、この場合はEにおける発現と比較してより低い可能性がある（いくつかのエピトープにとってなおも十分に高い、たとえばウイルス中和抗体エピトープは、インフルエンザのM2eのような非中和エピトープと比較してかなり強い保護を提供する）。prMにおける発現によって、フラビウイルス粒子の成熟プロセスにおけるフリンによるprMの不完全な切断という公知の現象により、ウイルス粒子表面の部分的提示が起こり、フリン切断によって生成されたprMの分泌されたN末端部分内でさらなる細胞外提示が起こると考えられる。この発現様式はまた、非常に免疫原性であり、NS1における発現より免疫原性が強いと予想される。エピトープを成熟Mタンパク質（prMのC末端部分）に挿入することができる場合、エピトープ分子は全て、Eにおける発現と同様に、ウイルス粒子（180コピー）の表面に提示される可能性がある。
【０１１１】
M2eエピトープ（インサートの全長はアミノ酸35個）をSphI部位とNsiI部位（SphIは、prM遺伝子の開始から上流に位置する）の間のChimeriVax-JEのprMに挿入するために、pBSA-AR1-rM2eプラスミドライブラリーを構築した（図2）。このライブラリーの代表的なものは、コロニー〜105個であった。これをインビトロ転写のための鋳型として用いて、得られたRNA転写物を用いてlipofectamineによってVero細胞単層をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞にアガロースを重層して、細胞単層を5〜6日目にM2e MAbによって染色した。M2e陽性プラークを観察した。陽性プラークに対応するM2e陽性ウイルスクローンを、アガロース重層から採取して、さらなるプラーク精製ラウンドにおいてさらに精製した後、2回増幅継代を行って、M1、M2、M3、M6、およびM8と呼ばれる純粋なウイルス保存系統5個を調製した。
【０１１２】
新しい組換え型クローンは全て、M2eおよびJE抗体によって効率的に染色されたが、ChimeriVax-JEベクターウイルスプラークはJE抗体のみによって染色された。標準的なプラークアッセイ法（メチルセルロース重層）において5日目に染色されたプラークの例を図16Aに示す。M1、M2、およびM3挿入変異体のプラークはChimeriVax-JEと比較して大きかったが、M6およびM8クローンのプラークはより小さかった（プラークの大きさにおけるこの差は、アガロース重層下ではより顕著であった）。このように、M1-3クローンはベクターウイルスと比較してインビトロでよりよく複製することが可能であった。このことを生育曲線実験において確認した（図16B）。M1-3クローンは、ChimeriVax-JEより速やかに生育してより高いピーク力価を産生したが、M6およびM7の力価はわずかに低かった。
【０１１３】
挿入の位置をクローンにおいてシークエンシングによって決定した。結果を図17に示す。興味深いことに、M2eインサートは、クローンM1、M2、およびM3においてChimeriVax-JEウイルスのJE特異的prMのちょうどN末端であるが、異なるアミノ酸で付加された。クローンM6およびM8における位置は同じであった（ウイルスORFにおける147位のPro残基の後；またはprM-26）。ChimeriVax-JEウイルスにおいて、prMのN末端（MKLS....）は宿主細胞のシグナラーゼ切断によって形成される（図17）。クローンM1、M2、およびM3においてそれぞれ、インサートをJE prMの開始から上流の4、1、および2アミノ酸残基に組み入れた。このように、これらのウイルスにおいて、変異体prMのN末端は、M2eペプチド配列を含有して、その後に本来のprM配列の前に4、1、または2ウイルス残基が続き、その後にprM配列が続く。変異体における新しいシグナラーゼ切断部位を、二つの異なるアルゴリズムを用いて一般的なSignalP 3.0オンラインプログラムによって予測した（図17に示す）。M1クローンにおいて、起こりうる二つの切断は、M2eの一つまたは三つのN末端アミノ酸を除去する可能性がある。M2において、強く予測されるように、一つの切断によって、N末端Glyの後に完全なM2e配列が続くことが起こるであろう。M3において、N末端はM2と同じであるか、またはM2e残基の三つがもう一つの起こりうる切断によって切断される可能性がある。三つのクローンのプラークがM2e MAbによって効率的に染色されたという事実は、M1およびM3における切断がM2e残基の消失が最小で起こったことを示唆する。重要なことに、M1-3クローンに関して予測されるシグナラーゼ切断可能性は、ChimeriVax-JEと比較して高かった（たとえば、M2クローンに関して0.387対ChimeriVax-JEに関して0.073）。これは、M1-3ウイルスがChimeriVax-JEの親より良好に生育する理由を説明する可能性がある。
【０１１４】
このように、prMタンパク質は、様々な位置での挿入、特にそのN末端残基での挿入に関して非常に許容性である。記載の結果（より大きいプラーク、Vero細胞におけるより効率的な複製、M1-3クローンにおけるより高い予測シグナラーゼ切断可能性）に基づいて、本発明者らは、フラビウイルス粒子のアセンブリにとって重要でないように思われるprMのN末端が、広い許容性のある挿入部位であり、長いインサート（たとえば、アミノ酸50、100、200、400個等）が含まれる様々な他のインサートを認容するであろうと考える。このように、本発明者らは、この位置で、HIV gag、HPV 16 L2タンパク質の最初の200残基までを含むペプチド、インフルエンザHA1、および完全長のHA（長さがアミノ酸〜550個）を挿入している。これらは、N末端もしくはprM（M1-3クローンにおけるM2eの場合と同様に）に融合した、またはベクターウイルスprM配列の前にさらなるシグナル、適切なプロテアーゼ切断部位、もしくはオートプロテアーゼの組み込みによってprMから切断される異種配列を含有するように設計される。
【０１１５】
A25ウイルスのChimeriVax-WN類似体の構築（NS1-236でM2e挿入を有するChimeriVax-JE）
ChimeriVax-JEウイルスは、上記のA25ウイルスと共に、マウスにおいて効率よく複製しない（たとえば、検出可能な接種後ウイルス血症を生じない）。それにもかかわらず、ChimeriVax-JEはヒトにおいてよりよく複製し（〜2 log10 pfu/mlウイルス血症）（Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003）、このようにA25ウイルスはヒトにおいて高いM2e抗体反応を誘導して、それらをインフルエンザ感染から保護することができるであろう。本発明者らは最近、ChimeriVax-WNウイルス（WN02ヒトワクチン型；WO2004/045529）が、ハムスター（〜3 log10 pfu/mlウイルス血症）（WO 2006/116182 A1）と共に、ヒトにおいても（〜2 log10 pfu/mlウイルス血症）非常に良好に複製することを証明した（Monath et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:6694-6699, 2006）。より頑健なモデル（ハムスターにおけるChimeriVax-WN02対マウスにおけるChimeriVax-JE）を用いてChimeriVaxウイルスのNS1-236部位で発現されたM2eエピトープによる保護のさらなる証拠を得るために、A25ウイルスのChimeriVax-WN02/M2eNS1-236類似体を構築した。完全長のChimeriVax-JE cDNAを含有するpBSAプラスミドにおけるJE特異的prM-E遺伝子を、標準的なクローニング技術を用いてChimeriVax-WN02ウイルスのprM-E遺伝子に置換した。これによって、pBWN02プラスミドが得られた（図18）。A25ウイルスからのM2eインサートを有するNS1遺伝子（M2e配列からのすぐ上流で二つのVero細胞適応を有するまたは有しない。表4）をpBWN02にクローニングした。得られた二つのプラスミドをインビトロで転写して、Vero細胞にRNA転写物をトランスフェクトして、寒天を上層した。非常に大きいプラークが6日目に観察され、これはM2e MAbによって染色された（図18、下のパネル）。
【０１１６】
二つのバージョンのChimeriVax-WN02/M2eNS1-236、すなわちWN02/A25およびWN02/A25adaptを一度プラーク精製して、クローニングしたウイルスの保存系統をVero細胞におけるさらなる増幅によって調製した。ChimeriVax-WN02およびChimeriVax-JEと比較したプラークの例を図19Aに示す。Vero細胞における新しいウイルスの生育曲線を図19Bに示す。WN02/A25ウイルスは、ChimeriVax-WN02より生育がいくぶん弱かった（ピーク力価はそれぞれ、〜7.5 log10 pfu/ml対〜8.7 log10 pfu/ml）。適合させたA25ウイルスと同様に（図6Cを参照されたい）、WN02/A25adaptバージョン（M2e配列から上流の二つのアミノ酸変化を有する）は、良好に生育し、ChimeriVax-WN02とほぼ同様に生育した。このように、ChimeriVax-JEのNS1タンパク質に当初導入された挿入は、ChimeriVax-WN02ワクチンウイルスに首尾よく転移された。A25ウイルスにおいて当初観察された二つの細胞培養適合は、WN02/A25ウイルスの生育を増強した。
【０１１７】
結論
結論すると、本発明者らは、インフルエンザAに対する非常に有効な万能ワクチンを生成する目的で、インフルエンザAウイルスのコンセンサスM2e保護エピトープを無作為に挿入するために、ChimeriVax（商標）-JEワクチンウイルスのprM/M、E、およびNS1遺伝子のトランスポゾン媒介変異誘発を行うことに成功した。方法の実現可能性は、prMおよびNS1タンパク質において抗M2e抗体によって認識可能な、インサートを含有する多数のウイルス変異体を急速に産生する段階、およびM2eペプチドをEタンパク質に挿入する段階によって証明された。本発明者らはまた、ChimeriVax（商標）-JE-NS1/M2eウイルスのA25クローンおよびChimeriVax（商標）-JE-prM/M2eウイルスのいくつかのクローンがVero細胞において効率よく複製すること、およびこれらのウイルスにおけるM2e挿入部位が同定されたことを示した。同様に、本発明者らは、A25ウイルスがインビトロで低MOI継代10回の間M2eインサートを維持したことから、A25ウイルスが遺伝的に安定であることを示した。本発明の直接のランダム変異誘発アプローチによって同定されたいくつかの挿入部位は、NS1-236位置を用いて例示されたように、インサートの大きさおよび配列の双方に関して広い許容性となりうる。M2e挿入を有するNS1遺伝子をChimeriVax-JEからChimeriVax-WNに転移させることによる本発明者らの実験において例示されるように、一つのフラビウイルスにおいて見いだされる許容性挿入部位を他のフラビウイルスにおいて用いることができる。さらに、マウスにおける免疫原性の分析に関して有効なIPプライミング／IP追加免疫モデルの確立に成功し、一つの挿入変種の高い免疫原性が証明された。IP接種後が含まれるマウスにおける検出不能な末梢的な複製にもかかわらず、ウイルスは、非常に免疫原性であり、主にIgG2a M2e抗体を誘導し、これはM2e免疫によるADCC媒介保護に関して非常に望ましい。本発明者らの実験におけるもう一つの新規発見は、M2eペプチドを発現するウイルス組換え体をサブユニットM2eに基づくワクチン候補体と同時接種した場合の強い相乗効果であった。
【０１１８】
上記で考察したように、本明細書において記載される方法は、他の全てのChimeriVax（商標）標的タンパク質と共に、YF17Dもしくは他の非フラビウイルス生ワクチンが含まれるベクターとしての他の生ワクチンウイルス、または非ウイルスベクター生物に応用可能である。このアプローチを用いて、ヒトの公衆衛生および獣医学的にとって重要な広範囲の病原体に対して組換え型ワクチンを構築することができる。
【０１１９】
構築段階の概要された配列（図2）は変化しうるが、なおも本発明の範囲内であることに注意すべきである。同様に、Tn7以外のトランスポゾンを、ランダム制限部位または外来エピトープのランダム挿入のために用いてもよい。後者と共に、ランダム挿入のためにPmeI以外の制限部位を用いること、もしくは任意の構築段階で異なる選択マーカーを用いること、または生きている変異体ウイルスを単離するために、もしくはインビトロおよびインビボでウイルスを特徴付けするために任意の異なる方法を用いること（たとえば、ウイルス感染細胞からの上清を用いるELISA、または陽性細胞を単離するための細胞ソーティング等）等は、本発明の意味を変化させない。
【０１２０】
（表１）エピトープ／抗原／ペプチドが由来しうる病原体の例の一覧
ウイルス：
フラビウイルス科
黄熱病ウイルス
日本脳炎ウイルス
デング熱ウイルス、1型、2型、3型および4型
西ナイルウイルス
ダニ媒介脳炎ウイルス
C型肝炎ウイルス（たとえば、遺伝子型1a、1b、2a、2b、2c、3a、4a、4b、4c、および4d）
パポウイルス科：
乳頭腫ウイルス
レトロウイルス科
ヒト免疫不全ウイルス、I型
ヒト免疫不全ウイルス、II型
サル免疫不全ウイルス
ヒトTリンパ球向性ウイルス、I型およびII型
ヘプナウイルス科
B型肝炎ウイルス
ピコルナウイルス科
A型肝炎ウイルス
ライノウイルス
ポリオウイルス
ヘルペスウイルス科
単純ヘルペスウイルス、I型
単純ヘルペスウイルス、II型
サイトメガロウイルス
エプスタイン-バーウイルス
水痘-帯状疱疹ウイルス
トガウイルス科
アルファウイルス
風疹ウイルス
パラミクソウイルス科：
呼吸器合胞体ウイルス
パラインフルエンザウイルス
麻疹ウイルス
ムンプスウイルス
オルトミクソウイルス科
インフルエンザウイルス
フィロウイルス科
マルブルクウイルス
エボラウイルス
ロトウイルス科：
ロタウイルス
コロナウイルス科
コロナウイルス
アデノウイルス科
アデノウイルス
ラブドウイルス科
狂犬病ウイルス
細菌：
腸毒素産生性大腸菌（E. coli）
腸病原性大腸菌
カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）
ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）
チフス菌（Salmonella typhi）
コレラ菌（Vibrio cholerae）
クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）
クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）
化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）
百日咳菌（Bordetella pertussis）
髄膜炎菌（Neisseria meningitides）
淋菌（Neisseria gonorrhoea）
レジオネラ・ニューモフィラ菌（Legionella neumophilus）
クラミジア種
ヘモフィルス種
赤痢菌種
寄生虫：
プラスモディウム種
住血吸虫種
トリパノソーマ種
トキソプラズマ種
クリプトスポリジウム種
ニューモシスティス種
リーシュマニア種
【０１２１】
（表２）列記のウイルスからの選択された抗原の例
【０１２２】
（表３）列記のウイルス／抗原からのBおよびT細胞エピトープの例
【０１２３】
（表４）ChimeriVax-JE-NS1/M2eウイルスのクローンA25、ならびにクローンA11、A79、およびA88の遺伝的安定性
ウイルスの全ゲノムをP12遺伝的安定性継代でシークエンシングした。ヌクレオチドの変化／異種遺伝子型およびアミノ酸変化を示す。
1 NS1におけるインサートの位置およびヌクレオチド／アミノ酸の番号付けを図5に示す。
【０１２４】
（表５）54日目でのBalb/cマウスにおけるM2e抗体反応（1、2、4、および5群の追加免疫後2週間）1
1 ウイルスに関して免疫量および追加免疫量は5 log10 pfuであり；HBc-M2eに関して、用量は粒子10μg+アラムであった。
2 3群は20日目で追加免疫したが、1、2、4および5群は40日目で追加免疫した。
【０１２５】
（表６）A25ウイルスを用いるマウス実験#2の設計（二つの販売元からの4週齢雌性balb/cマウス）
ELISA抗体力価を59日目に決定した（追加免疫後約1ヶ月）。
【０１２６】
（表７）実験2のマウスにおけるM2e特異的抗体反応
【０１２７】
上記で引用した全ての参考文献の内容物は、参照により本明細書に組み入れられる。「一つの（a）」および「その（the）」のような本明細書における単数形の使用は、本文がそうではないことを示している場合を除き、対応する複数形を示すことを除外しない。このように、たとえば特許請求の範囲が「一つの」フラビウイルスの投与を示している場合、これもまた、そうでないことを明記している場合を除き、複数のフラビウイルスの投与を含むと解釈することができる。他の態様は添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ベクターウイルスタンパク質への外来免疫決定基の直接トランスポゾン媒介挿入による組換え型ウイルスワクチンの構築、ならびに対応する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ワクチン接種は、医学の最大の功績の一つであり、何百万人もの人々を破壊的な疾患の影響から救ってきた。ワクチンが広く用いられるようになる前は、感染疾患によって米国だけでも毎年何千人もの子供および成人が死亡し、世界中ではなお多くの人々が死亡した。ワクチン接種は、細菌、ウイルス、および他の病原体による感染症を予防または処置するために広く用いられている。死菌病原体、生弱毒化病原体、および不活化病原体サブユニットの投与が含まれる、いくつかの異なるアプローチがワクチン接種において用いられる。ウイルス感染症の場合、生ワクチンは、最も強力で持続的な保護免疫応答を付与することが見いだされている。
【０００３】
生弱毒化ワクチンは、感染した蚊およびマダニによって一般的に伝搬されるエンベロープを有する小さいプラス鎖RNAウイルスであるフラビウイルスに対して開発されている。フラビウイルス科のフラビウイルス属には、およそ70のウイルスが含まれ、その多くは黄熱病（YF）、デング熱（DEN）、日本脳炎（JE）、およびダニ媒介脳炎（TBE）ウイルスのように、主要なヒト病原体である（Burke and Monath, Fields Virology, 4th Ed.:1043-1126, 2001における論評）。
【０００４】
フラビウイルスに対するワクチンの開発において異なるアプローチが用いられている。黄熱病ウイルスの場合、たとえば二つのワクチン（黄熱病17Dおよびフランス神経向性ワクチン）が連続的継代により開発されている（Monath, "Yellow Fever," Plotkin and Orenstein, Vaccines, 3rd ed., Saunders, Philadelphia, pp. 815-879, 1999）。ワクチン接種において用いるためのフラビウイルスの弱毒化に対するもう一つのアプローチは、二つ（またはそれより多い）異なるフラビウイルスの成分が含まれるキメラフラビウイルスの構築を含む。そのようなキメラをどのように構築するかを理解するには、フラビウイルスゲノムの構造の説明を必要とする。
【０００５】
フラビウイルスタンパク質は、一つの長いオープンリーディングフレームの翻訳によってポリプロテインを生成し、次に宿主およびウイルスプロテアーゼの組み合わせによってポリプロテインの複雑な一連の翻訳後タンパク質分解切断が起こって、成熟ウイルスタンパク質を生成することによって産生される（Amberg et al., J. Virol. 73:8083-8094, 1999; Rice, "Flaviviridae," Virology, Fields (ed.), Raven-Lippincott, New York, 1995, Volume I, p. 937）。ウイルス構造タンパク質は、ポリプロテインにおいてC-prM-Eの順序で整列し、式中「C」はカプシドであり、「prM」はウイルスエンベロープ結合膜（M）タンパク質の前駆体であり、および「E」はエンベロープタンパク質である。これらのタンパク質はポリプロテインのN末端領域に存在するが、非構造タンパク質（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、およびNS5）は、ポリプロテインのC末端領域に存在する。
【０００６】
異なるフラビウイルスからの構造および非構造タンパク質が含まれるキメラフラビウイルスが作製されている。たとえば、いわゆるChimeriVax（商標）技術は、他のフラビウイルスのエンベロープタンパク質（prMおよびE）を送達するために、黄熱病17Dウイルスカプシドおよび非構造タンパク質を使用する（たとえば、Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999を参照されたい）。この技術は、デング熱、日本脳炎（JE）、西ナイル（WN）、およびセントルイス脳炎（SLE）ウイルスに対するワクチン候補体を作製するために用いられている（たとえば、Pugachev et al., New Generation Vaccines, 3rd ed., Levine et al., eds., Marcel Dekker, New York, Basel, pp. 559-571, 2004；Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999；Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999；Monath et al., Vaccine 17:1869-1882, 1999；Guirakhoo et al., J. Virol. 74:5477-5485, 2000；Arroyo et al., Trends Mol. Med. 7:350-354, 2001；Guirakhoo et al., J. Virol. 78:4761- 4775, 2004；Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004；Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003；Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004；およびPugachev et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 71 :639-645, 2004を参照されたい）。
【０００７】
ChimeriVax（商標）に基づくワクチンは、基質細胞における複製、マウスモデルにおける低い神経毒性、サルモデルにおける高い弱毒化、インビトロおよびインビボでの高い遺伝子および表現型安定性、蚊における不十分な複製（これは自然界での制御されない散布を予防するために重要である）、ならびに重篤な免疫後の副作用を示すことなく1回投与後のマウス、サル、およびヒトにおける頑健な保護免疫の誘導、のような特性に関して都合のよい特性を有することが示されている。実際に、SA14-14-2 JEウイルス（中国において用いられる生弱毒化JEワクチン）のprM-E遺伝子を含有するChimeriVax（商標）-JEワクチンウイルスは、前臨床ならびにフェーズIおよびフェーズII臨床試験において試験され、成功を収めた（Monath et al., Vaccine 20:1004-1018, 2002; Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003）。同様に、ChimeriVax（商標）-WNワクチン候補体について行われたフェーズI臨床試験も成功し、これは、弱毒化を増強するために3つの特異的アミノ酸変化がEタンパク質に組み込まれいる、西ナイルウイルス（NY99株）からのprM-E配列を含有する（Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004）。
【０００８】
キメラフラビウイルスが含まれるフラビウイルスの変異誘発のような、弱毒化に対する他のアプローチが行われている。これらのアプローチには、たとえばエンベロープタンパク質における置換の導入、3'-非翻訳領域内での欠失、およびカプシドタンパク質における欠失が含まれる。（そのような変異の例に関しては以下の参考文献を参照されたい：Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996；Mandl et al., J. Virol. 72:2132-2140, 1998；Durbin et al., AJTMH 65:405-413, 2001；Pletnev, Virology 282:288-300, 2001；Markoff et al., J. Virol. 76:3318-3328, 2002；Kofler et al., J. Virol. 76:3534-3543, 2002；Whitehead et al., J. Virol. 77:1653-1657, 2003；Pletnev et al., Virology 314:190-195, 2003；Pugachev et al., Int. J. Parasitol. 33:567-582, 2003；Bredenbeek et al., J. Gen. Virol. 84:1261-1268, 2003；米国特許第6,184,024 Bl号；WO 02/095075；WO 03/059384；WO 03/092592；WO 03/103571；WO 2004/045529；およびWO 2006/044857）。もう一つのアプローチにおいて、ChimeriVax（商標）-JEのエンベロープタンパク質Eを、トランスポゾンを用いて許容性挿入部位に関して探索した。このアプローチに従って、生存変異体ウイルスにおける挿入されたトランスポゾンを、所望の外来ペプチドに置換する（たとえば、WO 02/102828を参照されたい）。
【０００９】
Masonおよび共同研究者は最近、偽感染性ウイルス粒子（PIV）に基づくフラビウイルスワクチン（RepliVax）の構築に対する新しいアプローチを発表した（Mason et al., Virology 351 :432-443, 2006）。フラビウイルスPIVにおいて（これまでYF 17DおよびWNウイルスに関して記載した）、カプシドタンパク質遺伝子を、CのN末端の〜20個のコドンを占める5'環状化シグナル配列を除き、欠失する。PIVはCタンパク質がトランスに供給される細胞において繁殖する。後者は、子孫ウイルス（PIV）粒子へのPIVのパッケージングにとって必要である。細胞培養上清におけるパッケージングされたPIVを採取して、空のウイルス粒子の分泌と共に、T細胞反応のほぼ完全な工場（arsenal）により、強力な抗体反応を誘導する一ラウンドの複製ワクチンとして用いる。このアプローチの頑健性は、部分的にフラビウイルス（たとえば、YF 17D）およびこのようにPIVが樹状細胞に感染して、多数のTLR経路を活性化し、免疫応答を増強することができることによる（Palmer et al., J. Gen. Virol. 88:148-156, 2007；Querec et al., J.E.M. 203:413-424, 2006）。
【００１０】
フラビウイルス感染症に対するワクチンとして用いられるほかに、キメラフラビウイルスのようなフラビウイルスが、他の非フラビウイルス抗原を送達するためのベクターとして用いることについて提唱されている。そのような使用の一つの例において、外来ペプチドをYF17Dウイルスのエンベロープタンパク質Eに挿入するための合理的なアプローチは、低温電子顕微鏡によって解明されるフラビウイルス粒子の三次元構造を知ることと、Eタンパク質二量体の公知のX線構造を電子密度マップに適合させることとに基づいて記載された（Rey et al., Nature 375:291-298, 1995；Kuhn et al., Cell 108:717-725, 2002）。その融合後立体構造におけるEタンパク質三量体の三次元構造も同様に解明されている（Modis et al., Nature 427:313-319, 2004；Bressanelli et al., EMBO J. 23:728-738, 2004）。Gallerおよび共同研究者は、Eタンパク質二量体および三量体の3D構造を調べ、二量体化ドメインIIのfgループが二量体および三量体の両立体構造において溶媒に曝露されるべきであるという結論に達した。彼らはこのループを用いてマラリアの液性およびT細胞エピトープをYF17DウイルスのEタンパク質に挿入して、いくつかの生存変異体を回収した（Bonaldo et al., J. Virol. 79:8602-8613, 2005；Bonaldo et al., J. Mol. Biol. 315:873-885, 2002；WO 02/072835）。しかし、このアプローチを用いても、効率的なウイルス複製（Galler et alのデータのいくつかによって証明されるように）、免疫原性、および安定性に関して、選択された部位があらゆる望ましい外来ペプチドの挿入にとって許容性／最適であることは保証されない。さらに、このアプローチは、それに対する3D構造が不明であるウイルスタンパク質に応用可能ではない（たとえば、prM/M、NS1、およびフラビウイルスのほとんどの他のNSタンパク質）。
【００１１】
他のアプローチにおいて、外来免疫原性タンパク質／ペプチドを、ウイルスORFに遺伝子間挿入した場合に、フラビウイルスベクター内で発現させることができる。たとえば、Andinoおよび共同研究者らは、YF17Dポリプロテイン内のいくつかの位置、たとえばNS2B/NS1接合部において、ウイルスNS2B/NS3プロテアーゼ切断部位に隣接するモデルとしてのアミノ酸8個の抗腫瘍CTLエピトープを発現させようと試みた（McAllister et al., J. Virol. 74:9197-9205, 2000）。他の研究者らは、インフルエンザウイルスの免疫優性T細胞エピトープを発現させるためにNS2B/NS1部位を用いた（Barba-Spaeth et al., J. Exp. Med. 202:1179-1184, 2005）。Tao et al.は、YF17DウイルスにおけるNS2B-NS3接合部においてマラリア寄生虫のアミノ酸10個のCTLエピトープを発現させて、寄生虫のチャレンジからマウスを良好に保護することを証明した（Tao et al., J. Exp. Med. 201:201-209, 2005）。最近、本発明者らは、E/NS1接合部でインフルエンザのM2eペプチドを発現させ（米国特許出願第60/900,672号）、Bredenbeek et al.も同様に、E/NS1接合部でラッサウイルス糖タンパク質前駆体を発現させることに成功した（Bredenbeek et al., Virology 345:299-304, 2006）。他の遺伝子接合部も同様に用いることができる。他のアプローチにおいて、外来抗原は2シストロン性に発現されている（たとえば、3' UTRにおいて）。他のアプローチにおいて、一ラウンドフラビウイルスレプリコンが様々な病原体に対する組換え型ワクチン候補体として開発されており、組換え型レプリコンの免疫原性能が証明されている（Jones et al., Virology 331 :247-259, 2005；Molenkamp et al., J. Virol. 77:1644-1648, 2003；Westaway et al., Adv. Virus. Res. 59:99-140, 2003；Herd et al., Virology 319:237-248, 2004；Harvey et al., J. Virol. 77:7796-7803, 2003；Anraku et al., J. Virol. 76:3791-3799, 2002；Varnavski et al., J. Virol. 74:4394-4403, 2000）。レプリコンでは、prMおよびEエンベロープタンパク質遺伝子またはC-prM-E遺伝子が欠失している。したがって、これは細胞内で複製することができるが、ウイルス子孫を生成することができない（したがって、一ラウンド複製）。これを、prM-EまたはC-prM-E遺伝子がトランスに提供されるウイルス粒子にパッケージングすることができる。欠失の代わりに、関心対象外来抗原は、適切に挿入される。ワクチン接種後のRepliVaxの場合では、一ラウンドの複製が後に続き、周辺の細胞／組織にさらに伝搬することなく、発現された異種抗原に対する免疫応答が起こる。または、免疫は、裸のDNAまたはRNAの形でのレプリコンの接種によって達成されうる。他のアプローチにおいて、たとえば欠失したC遺伝子の代わりに、外来免疫原をRepliVax PIVにおいて発現させることができる（Mason et al., Virology 351 :432-443, 2006）。
【００１２】
インフルエンザの背景
インフルエンザ免疫原を本出願においてモデル抗原として用いた。インフルエンザウイルスは、世界中の急性呼吸器疾患の主な原因である。毎年の大流行は、米国だけでも100,000件より多い入院および20,000〜40,000人の死亡の原因である（Brammer et al., MMWR Surveill. Summ. 51 :1-10, 2002；Lui et al., Am. J. Public Health 77:712-6, 1987；Simonsen, Vaccine 17:S3-10, 1999；Thompson et al., JAMA 289:179-186, 2003）。世界中で、年間小児のおよそ20％および成人の5％がインフルエンザにより病気になる（Nicholson et al., Lancet 362:1733-1745, 2003）。歴史的に、インフルエンザAウイルスの三つのサブタイプ、すなわちH1N1、H2N2、およびH3N2がヒト集団において循環している。1968年以降、H1N1およびH3N2はほぼ独占的に循環してきた（Hilleman, Vaccine 20:3068-3087, 2002；Nicholson et al., Lancet 362:1733-1745, 2003；Palese et al., J. Clin. Invest. 110:9-13, 2002）。その唯一の認識されたサブタイプが存在するインフルエンザBウイルスも同様にヒトにおいて循環するが、一般的にインフルエンザAウイルスより軽度の疾患を引き起こす。現在の不活化ワクチンは、選択されたH1N1およびH3N2インフルエンザA株と一つのインフルエンザB株に基づいて三つの成分を含有する（Palese et al., J. Clin. Invest. 110:9-13, 2002）。1918年のH1N1の汎流行のような周期的な汎流行は、何百万人もの人々を殺すことができる。インフルエンザの専門家たちは、もう一つのインフルエンザの汎流行が不可避であり、差し迫っている可能性があることで一致している（Webby and Webster, Science 302:1519-1522, 2003）。H5N1型トリインフルエンザの現在の大流行は、記録上でも最大で、ヒトに対して非常に致死性の株によって引き起こされたが、破壊的な結末となる汎流行株になる可能性を有する（変異および／または遺伝子の再集合を通して）。もう一つの警告状況は、オランダで2003年に発生し、ここでは家禽産業従事者において小さいが非常に病原性の高いH7N7型トリインフルエンザの大流行が起こった。汎流行の脅威を引き起こす他のサブタイプは、H9およびH6型ウイルスである。H5およびH7ウイルスより毒性は低いが、いずれも過去10年の間に水鳥から家禽まで広がった。さらに、H9N2ウイルスはブタおよびヒトにおいて検出されている（Webby and Webster, Science 302:1519-1522, 2003）。過去数年の間のトリウイルスによって受けた大量の注意にもかかわらず、なおも従来のH1、H2、およびH3サブタイプウイルスは、新たな抗原的に遠縁である株の導入により、非常に毒性の高い株が出現しうることから、関心事となり続けている。たとえば、H2ウイルスは、1957年の「アジア」インフルエンザ汎流行の原因物質であり、野生のアヒルおよび家畜のアヒルにおいてなおも循環し続けていることから、高リスクカテゴリーに入る。
【００１３】
インフルエンザ疾患の予防および制御のための現在の戦略は、その年に循環する可能性が高いウイルス株に対する毎年のワクチン接種である。認可されたほとんどのインフルエンザワクチンは、ふ化鶏卵において産生されており、不活化された全ビリオンまたは部分的精製ウイルスサブユニットからなる（「スプリット」ワクチン）。これらのワクチンは、健常な成人において70〜90％有効である（Beyer et al., Vaccine 20:1340-1353, 2002）。しかし、疾患に対する有効性は高齢者では不良である。同様にふ化鶏卵において製造される生の弱毒化鼻腔内ワクチンが米国および以前のソビエト連邦において利用可能である（Treanor et al., In: New Generation Vaccines, 3rd edition. Edited by Levine, M.M. New York, Basel: Marcel Dekker; pp. 537-557, 2004）。米国のワクチン（Flumist（登録商標））は、インフルエンザワクチン接種の主な標的集団である、5歳未満の小児または55歳より高齢の人には承認されていない。免疫系によって認識される主要なインフルエンザ血液凝集素およびノイラミニダーゼタンパク質は、変異および再集合によって絶えず変化し続けていることから、ワクチン組成物は、その時に循環するウイルス株の抗原性特徴を反映するように毎年変更されなければならない。このように、現在のワクチンは、インフルエンザの季節の直前に毎年調製しなければならず、汎流行に備えて用いるために備蓄することができない。その上、製造のためにふ化鶏卵を用いることは、非常に非効率的である。各卵から産生される不活化ワクチンは、ヒト1人または2人分の用量に過ぎない。従来のワクチンに関する現在の製造上の制限は、病原体を含まない卵の十分な供給である。汎流行期の間でさえも、毎年のインフルエンザワクチンの十分量を産生するために、典型的に6ヶ月間が必要である（Gerdil, Vaccine 21 :1776-1779, 2003）。細胞培養においてインフルエンザワクチンを製造するためにいくつかの開発努力が進行中である。しかし、特に承認されていない細胞株の使用という、このアプローチにも関連する多くの難題が存在する。卵または細胞培養をワクチン産生のために用いるか否かによらず、逆遺伝学または遺伝的再集合法を使用して、それに対するワクチンを産生することが望ましい新しい循環するウイルス株を、製造のために十分な力価まで複製する株に転換させなければならない。従来のインフルエンザワクチンに関連するこれらの属性は全て、インフルエンザの汎流行に直面した場合に受け入れられない。
【００１４】
アデノウイルスまたはアルファウイルスベクターによって送達される組換え型血液凝集素（HA）またはHAに基づく新規インフルエンザワクチンの開発は、製造効率を改善しているが、毎年の遺伝的変動の問題および毎年ワクチンを再構築する要求に取り組んでいない。
【００１５】
要約すると、現在のインフルエンザワクチンに関して以下の難題が認識されている。
1．ワクチンとウイルス株のマッチが不良である場合の低い効能；生の低温適合ワクチンに関する年齢範囲の制限。
2．ウイルスにおける抗原性の変化に取り組むために毎年新しいワクチンを作製する必要性。
3．低い製造ワクチン収率。
4．製造のために適切な再集合ウイルスを構築するための時間。
5．汎流行時の需要を満たすためには不十分な製造能力。
6．不活化病原性ウイルスの大規模製造に関する生物学的懸念。
7．卵産物に対してアレルギーを示す、またはいくつかの生の低温適合ウイルスワクチンの場合の不十分な弱毒化によるワクチン接種者における副作用（Treanor et al., In: New Generation Vaccines, 3rd edition. Edited by Levine, M.M. New York, Basel: Marcel Dekker; pp. 537-557, 2004）。
【００１６】
インフルエンザワクチン学の「聖杯」は、全てのインフルエンザ株に対して広く、長く持続する保護免疫を誘発し、高収率および低費用で製造して備蓄することができるたった1つの産物となるであろう。
【００１７】
有効な従来のインフルエンザワクチンは全て、HAに対するウイルス中和抗体を誘発し、これは現在、保護に関する免疫的相関を表す。しかし、HAの抗原性は毎年変化する。最近、他のインフルエンザウイルスタンパク質がワクチン標的として注目を集めている。M2タンパク質、および特にM2のエクトドメイン（M2e）は、インフルエンザAウイルスにおいて高度に保存されている。初期と直近のヒトおよびトリM2e配列の本発明者らのアライメントを図9Aに示す（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU/htmlから）。自身において保存されるヒトインフルエンザウイルスのM2eドメインのみならず、トリウイルスM2e配列も同様に厳密に整列させる。最高レベルの配列保存はM2eのN末端部分に存在する。このように、M2eペプチドのN末端のアミノ酸13個（アライメントにおいて影をつけて示す）が、保護抗体の誘導の主な原因であることが示されていることは極めて注目に値する（Liu et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 35:141-146, 2003；Liu et al., Immunol. Lett. 93:131-136, 2004；Liu et al., Microbes. Infect. 7:171-177, 2005）。これは、万能インフルエンザAウイルスワクチンに関する概念および希望のもととなった。
【００１８】
M2eは、ウイルスの小さい表面タンパク質であるM2の外部アミノ酸23個の部分を表す。インフルエンザビリオンでは顕著ではないが、M2はウイルス感染細胞の表面に豊富に発現される。しかし、通常のインフルエンザウイルス感染の際に、または従来のワクチンによる免疫の際に、M2またはM2e決定基に対する抗体反応は非常に少ない。それにもかかわらず、M2タンパク質に対する非ウイルス中和モノクローナル抗体は、受動移入時にインフルエンザの致死的マウスモデルにおいて保護的であることが示された（Fan et al., Vaccine 22:2993-3003, 2004；Mozdzanowska et al., Vaccine 21 :2616-2626, 2003；Treanor et al., J. Virol. 64:1375-1377, 1990）。これらの結果に基づいて、M2およびその高度に保存されたM2eドメインは、インフルエンザAワクチン成分として多数のワクチン開発業者からかなりの関心を集めている。
【００１９】
M2またはM2eに対する抗体は、ウイルスを中和せず、むしろ症候性の疾患に対して保護するために十分に、効率的なウイルス複製を低減させる。M2によって誘発される保護機構は、NK細胞媒介抗体依存的細胞障害（ADCC）を伴うと考えられる。M2eエクトドメイン（主にIgG2aサブクラス）に対する抗体は、ウイルス感染細胞において表示されるエピトープを認識し、これはNK細胞による感染細胞の消失の運命を予め決定する（Jegerlehner et al., J. Immunol. 172:5598-1605, 2004）。M2によって誘発される免疫は無効ではないことから、感染後に限定的なウイルス複製が許容され、これは広いスペクトルの抗インフルエンザ免疫応答を刺激するために役立つ。理論的に、これによって、より長く、より強い免疫的記憶が起こり、同じウイルスまたは異種株とのその後の遭遇からよりよい保護が得られうると考えられる（Treanor et al., In: New Generation Vaccines, 3rd edition. Edited by Levine, M. M. New York, Basel: Marcel Dekker; pp. 537-557, 2004）。
【００２０】
Walter Fiersおよび共同研究者（Ghent University, Belgium）は、M2eに基づくワクチンの可能性を最初に証明した研究者らであった。彼らは、B型肝炎ウイルスコアタンパク質にM2e決定基を遺伝子融合させて、これを細菌において発現させて、B型肝炎ウイルスコア粒子（HBc）の表面にM2eを提示させた（Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004；Neirynck et al., Nat. Med. 5:1157-1163, 1999）。これらのHBc-M2e粒子は、マウスおよびフェレットにおいて免疫原性であることが示され、それぞれの種のインフルエンザウイルスチャレンジモデルにおいて保護的であることが示された。
【００２１】
もう一つの保存されたインフルエンザウイルスドメインは、HA前駆体タンパク質、HA0の成熟切断部位である。それの高レベルの保存（Macken et al., In: Osterhaus, A. D. M. E., Cox, N., and Hampson A. W. eds., Options for the control of influenza IV. Elsevier Science, Amsterdam, The Netherlands, p. 103-106, 2001）は、二つの機能的拘束による。第一に、配列は、二つの成熟HAサブユニット、HA1およびHA2を放出する宿主プロテアーゼにとって適した基質であり続けなければならない。第二に、HA2のN末端は、感染にとって重要である融合ペプチドを含有する（Lamb and Krug, In: Fields Virology. Fourth edition. Edited by Knipe, D. M., Howley, P.M., Griffin, D. E., et al. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins; pp. 1043-1126, 2001）。融合ペプチドは、インフルエンザAおよびBウイルスの双方において保存される。最近の報告において、Bianchiおよび共同研究者（Bianchi et al., J. Virol. 79:7380-7388, 2005）は、インフルエンザBウイルスの共役HA0切断ペプチドが、抗原的に遠縁であるインフルエンザBウイルス系列の致死的チャレンジに対してマウスにおいて保護免疫を誘発することを証明した。注目すべきことに、共役A/H3/HA0ペプチドも同様に、免疫したマウスをインフルエンザBチャレンジから保護した。-1位で厳密に保存されたArg（切断点の前の最後のHA1残基）および+3および+9 Phe残基（HA2の3番目および9番目の残基）は、モノクローナル抗体の結合にとって重要であった。このように、ペプチドの保存されたC末端部分が保護の原因であるように思われ、HA0切断ドメインに基づく万能A型およびB型ヒトインフルエンザウイルスワクチンを作製する可能性を示唆する。ヒト（H1、H2、H3、およびB）HA0と利用可能な全てのトリインフルエンザHA0配列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU/html）との本発明者らのアライメントによって、図9Bにおいて示されるコンセンサス配列（抗体結合および免疫原性にとって重要な領域は影をつけて示される）が得られた。
【００２２】
最近、様々なエピトープデータを捕獲する包括的オンラインデータベース（he Immune Epitope Database and Analysis Resources (IEDB)）（www.immuneepitope.org）が利用できるようになった。このデータベースを包括的に分析したところ、万能ワクチンを構築するためにも適しうる多くの交叉保護的インフルエンザエピトープが同定された（Bui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:246-251, 2007、および補足の表）。BおよびT細胞の有望なエピトープの双方が同定された（以下において本発明者らが用いたH3N2インフルエンザのHA保護的エピトープが含まれる）。ほとんどのB細胞エピトープは、立体構造であり、このように、かなりの大きさのエピトープである。しかし、たとえばChimeriVaxウイルスの分泌型タンパク質におけるそのようなより長いエピトープに関しても、本出願において記載される直接のランダム挿入アプローチによって、許容性部位を同定可能であるはずである。より短いインサートに関して本発明者らが見いだしたいくつかの高度に許容性である部位は、長いインサートに関して許容性となりうる（たとえば、ChimeriVax-JEのprMタンパク質において、以下を参照されたい）。
【００２３】
ペプチド共役体およびエピトープ表示粒子が含まれる様々なM2eサブユニットワクチンアプローチが追求されている。しかし、これらのアプローチは、これらの弱い免疫原の免疫原性を強化するために強力なアジュバントを必要とする。これは、M2e（およびおそらくHA0）の場合には特に重要である。提唱される保護機構（ADCC）のために、効能にとって高レベルの特異的抗体が必要である。正常な血清IgGは、保護の主なメディエーターであるNK細胞上のFc受容体に関して特異的（抗M2e）IgGと競合すると考えられる。このように、万能の汎流行インフルエンザワクチンに対するもう一つのアプローチを開発する必要がある。インフルエンザの医学的重要性に関する上記の記載、改善された万能インフルエンザワクチンの必要性、およびインフルエンザウイルスの適切なエピトープ／抗原を利用できることは、本出願において記載されたアプローチを用いて、それに対する新規ワクチンを作製することができる重要な病原体の一例を提供する。本出願において記載した方法は、以下に記載されるように、他の病原体に対する新規／改善されたワクチンの構築にも等しく応用可能となりうる。
【発明の概要】
【００２４】
本発明は、一つまたは複数の異種ペプチドをコードする一つまたは複数の核酸分子が含まれるウイルスゲノムを生成する方法を提供する。これらの方法は、以下の段階を含む：（i）一つまたは複数の標的ウイルス遺伝子を提供する段階（たとえば一つもしくは複数のシャトルベクター中に、または無傷のウイルスゲノムという状況において）；（ii）挿入部位を無作為に挿入するために、標的ウイルスゲノムを変異誘発に供する段階；および（iii）異種ペプチドをコードする核酸分子を、標的ウイルス遺伝子の変異誘発のランダム部位にライゲーションする段階。方法はさらに、以下の段階（iv）ウイルス複製を開始するためにゲノム核酸ライブラリーを細胞にトランスフェクトする段階の後に、（v）挿入されたペプチドの効率的な提示を可能にする生存（効率的に複製する）ウイルス組換え体を選択する段階を含みうる。一つまたは複数のシャトルベクターという状況において行われる場合、方法はさらに、異種ペプチドをコードする核酸分子ライブラリーが含まれる標的ウイルス遺伝子を、挿入を欠く対応するウイルス遺伝子の代わりに、標的ウイルス遺伝子が由来するウイルスゲノムに導入する段階を含みうる。
【００２５】
本発明の方法はまた、ウイルスゲノムを細胞（たとえば、Vero細胞）に導入することによって、ウイルスゲノムからウイルスベクターを生成する段階を含むと共に、細胞またはその上清からウイルスベクターを単離する段階を含む。さらに、本発明の方法に供される標的ウイルス遺伝子は、以前本発明の方法に供された（または他の手段によって挿入が導入されている）ウイルス、または挿入を欠くウイルスから得ることができる。
【００２６】
本発明の方法はまた、二つまたはそれより多い（たとえば2、3、4個またはそれより多い）標的ウイルス遺伝子が含まれる二つまたはそれより多いシャトルベクター（たとえば、2、3、4個またはそれより多く）を変異誘発に供する段階、および一つまたは複数の異種ペプチドをコードする核酸分子が含まれる二つまたはそれより多い（たとえば、2、3、4個またはそれより多い）標的ウイルス遺伝子を、挿入を欠く対応するウイルス遺伝子の代わりに、ウイルスゲノムに導入する段階を含みうる。
【００２７】
本発明の方法の変異誘発段階は、同時または連続的であるトランスポゾン変異誘発による標的ウイルス遺伝子への一つまたは複数のトランスプライマーの導入を含みうる。そのようなトランスプライマーを、エンドヌクレアーゼ消化によって除去することができ、異種ペプチドをコードする核酸分子を、制限エンドヌクレアーゼ消化部位でのライゲーションによって標的ウイルス遺伝子に導入することができる。さらに、本発明の方法は、変異標的ウイルス遺伝子のライブラリーの生成を含みうる。
【００２８】
本発明の方法に供されるウイルスゲノムは、キメラフラビウイルス、たとえば第一のフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質と、第二の異なるフラビウイルスのプレ膜タンパク質およびエンベロープタンパク質とが含まれるキメラフラビウイルスのようなフラビウイルスのゲノムとなりうる。そのような例において、第一および第二のフラビウイルスは、たとえば日本脳炎、デング-1、デング-2、デング-3、デング-4、黄熱病、マリーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、クンジン、ロシオ脳炎、イルヘウス、ダニ媒介脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポーワッサン、ネギシ、アブセットアローブ、ハンザローバア、アポイ、およびHyprウイルスからなる群より独立して選択することができる。さらに、無傷のフラビウイルスゲノムを本発明に供することができる（たとえば、YF17Dのような黄熱病ウイルスゲノム）。
【００２９】
本発明の方法の主題である標的ウイルス遺伝子は、たとえばエンベロープタンパク質、カプシドタンパク質、プレ膜タンパク質、NS1タンパク質、NS2Aタンパク質、NS2Bタンパク質、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、およびNS5タンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択することができる。
【００３０】
本発明の方法に従ってウイルスゲノムに導入される異種ペプチドには、一つまたは複数のワクチンエピトープ（たとえば、B細胞エピトープおよび／またはT細胞エピトープ）が含まれうる。エピトープは、ウイルス、細菌、または寄生虫病原体の抗原に由来しうる。たとえばエピトープは、インフルエンザウイルス（たとえば、ヒトまたはトリインフルエンザウイルス）に由来しうる。インフルエンザウイルスエピトープの場合、異種ペプチドには、たとえばインフルエンザM2eペプチドまたはインフルエンザ血液凝集素前駆体タンパク質切断部位（HA0）が含まれるペプチドが含まれうる。他の例において、エピトープは、腫瘍関連抗原またはアレルゲンに由来する。異種ペプチドを得てもよいさらなる供給源（たとえば、病原体）の例と共に、そのようなペプチドおよびエピトープの例を以下に提供する。
【００３１】
本発明にはまた、本明細書に記載の任意の方法によって生成されるウイルスゲノムまたはその相補体が含まれる。さらに、本発明には、そのようなウイルスゲノムによってコードされるウイルスベクター、そのようなウイルスベクターと薬学的に許容される担体または希釈剤とが含まれる薬学的組成物、およびそのような薬学的組成物を患者に投与する段階を含む、患者にペプチドを送達する方法が含まれる。そのような方法の一つの例において、ペプチドは抗原であり、投与は、抗原が由来する病原体または腫瘍に対して免疫応答を誘導するために行われる。
【００３２】
本発明にはまた、本明細書に記載の方法によって産生されたか否かによらず、カプシドタンパク質、プレ膜タンパク質、エンベロープタンパク質、NS1タンパク質、NS2Aタンパク質タンパク質、NS2Bタンパク質、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、およびNS5タンパク質からなる群より選択される一つまたは複数のタンパク質内に挿入された一つまたは複数の異種ペプチドが含まれるフラビウイルスベクターが含まれる。フラビウイルスは、たとえば黄熱病ウイルス（たとえば、YF17D）、またはキメラフラビウイルス（たとえば、第一のフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質と、第二の異なるフラビウイルスのプレ膜タンパク質およびエンベロープタンパク質とが含まれるキメラフラビウイルス）となりうる。キメラの第一および第二のフラビウイルスは、日本脳炎、デング-1、デング-2、デング-3、デング-4、黄熱病、マリーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、クンジン、ロシオ脳炎、イルヘウス、ダニ媒介脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポーワッサン、ネギシ、アブセットアローブ、ハンザローバア、アポイ、およびHyprウイルスからなる群より独立して選択することができる。
【００３３】
本発明にはさらに、本明細書において上記および他所で記載されたフラビウイルスベクターのゲノムに対応する核酸分子、またはその相補体；そのようなウイルスベクターと薬学的に許容される希釈剤または担体とが含まれる薬学的組成物と共に、そのような組成物を投与することによって患者にペプチドを送達する方法が含まれる。そのような方法の一つの例において、ペプチドは抗原であり、投与は、抗原が由来する病原体または腫瘍に対する免疫応答を誘導するために行われる。
【００３４】
具体的な例において、本発明には、非構造タンパク質1（NS1）のアミノ酸236〜237位の間に異種ペプチドの挿入が含まれる、本明細書において記載されるフラビウイルスベクターが含まれる。単独、または他の挿入（たとえば、NS1インサート）と共に存在しうるさらなる例は、ベクターのプレ膜タンパク質のアミノ末端領域における異種ペプチドの挿入が含まれるベクターである。この挿入は、たとえばカプシド／プレ膜タンパク質切断部位の前の-4位、-2位、もしくは-1位、またはプレ膜タンパク質の26位（またはその組み合わせ）に存在しうる。さらに、プレ膜タンパク質挿入には、任意でプレ膜タンパク質からペプチドの除去を容易にするタンパク質切断部位が含まれうる。
【００３５】
本発明のベクターに含まれうるペプチドの具体的例には、インフルエンザ（たとえば、ヒトまたはトリ）M2eペプチドまたはインフルエンザ（たとえば、ヒトまたはインフルエンザ）血液凝集素前駆体タンパク質切断部位（HA0）が含まれるペプチドが含まれる。これらは天然に存在する、またはコンセンサス配列となりうる。さらなる例を以下におよび本明細書において他所で提供する。さらに、ベクターには、複数の異種ペプチド、たとえば、ヒトおよびトリインフルエンザM2eペプチドが含まれうる。さらに、本発明のベクターには、本明細書において記載されるように、改善された特性（たとえば、改善された生育特徴）をベクターに提供できる一つまたは複数の第二の部位の適応が含まれうる。
【００３６】
本発明にはまた、本明細書において記載されるフラビウイルスベクターのゲノムに対応する核酸分子またはその相補体が含まれる。さらに、本発明には、ウイルスベクターが含まれる薬学的組成物が含まれる。組成物には、任意で一つまたは複数の薬学的に許容される担体または希釈剤が含まれうる。さらに、組成物には任意で、アジュバント（たとえば、アラムのようなアルミニウム化合物）が含まれうる。組成物はまた、凍結乾燥型で存在してもよい。
【００３７】
本明細書において記載される組成物の投与を含む、ペプチドを被験者（たとえば、ヒト患者のような患者、または家畜動物もしくは家禽のような動物）に送達する方法も同様に本発明に含まれる。一つの例において、方法は、抗原が由来する病原体または腫瘍に対する免疫応答を誘導するために行われる。他の例において、方法はサブユニットワクチンの投与を含む。これらの例において、フラビウイルスベクターおよびサブユニットワクチンは同時投与することができ、フラビウイルスベクターをプライミング量として投与してサブユニットワクチンを追加免疫量として投与することができ、またはサブユニットワクチンをプライミング量として投与してフラビウイルスベクターを追加免疫量として投与することができる。サブユニットワクチンには、たとえば異種ペプチド（たとえば、インフルエンザM2eペプチドまたはインフルエンザ血液凝集素前駆体タンパク質切断部位（HA0）が含まれるペプチド）とB型肝炎ウイルスコアタンパク質との融合体が含まれるB型肝炎ウイルスコア粒子が含まれうる。これらのペプチドは、本明細書において記載されるように、天然に存在すること、またはコンセンサス配列となることができる。
【００３８】
本発明にはまた、そのような挿入に対して許容性であると同定された部位に、関心対象ペプチドをコードする配列の挿入を含む（たとえば、本明細書において記載される方法を用いて）、本明細書において記載されるベクターを作製する方法が含まれる。これらのベクターは、フラビウイルスベクター（たとえば、黄熱病ベクターまたは本明細書において記載されるキメラフラビウイルス（たとえば、ChimeriVax（商標）-JEまたはChimeriVax（商標）-WN））となりうる。例示的な挿入部位には、NS1-236およびカプシド／プレ膜タンパク質切断部位の前の-4位、-2位、もしくは-1位、またはプレ膜タンパク質の26位が含まれる。
【００３９】
さらに、本発明には、たとえば本明細書において記載される任意のベクターを薬学的に許容される担体または希釈剤、一つまたは複数のアジュバント、および／または1つまたは複数のさらなる活性物質（たとえば、サブユニットワクチン）と混合することによって、薬学的組成物を作製する方法が含まれる。
【００４０】
本発明にはまた、本明細書において記載される予防法および治療法において用いるための薬剤を調製するために、本明細書に記載のウイルスベクター、核酸分子、およびペプチドの全てを用いることが含まれる。
【００４１】
本発明はいくつかの長所を提供する。たとえば、本発明において用いられる生ワクチンウイルス（たとえば、ChimeriVax（商標）、黄熱病ウイルス、または他の生ワクチンウイルス）は、小さいポリペプチド抗原分子（たとえば、インフルエンザM2eまたはHA0切断部位ペプチド）の送達に関して有意な利益を提供する。フラビウイルスに基づくベクターのような生きたベクターを用いる長所には、（i）ワクチン接種後の抗原量の拡大；（ii）アジュバントの必要がないこと；（iii）生得のおよび適応免疫応答の強い刺激（たとえば、YF17Dは、最も強力な公知の免疫原である）；（iv）ChimeriVax（商標）（YF17D）が樹状細胞およびマクロファージのような抗原提示細胞に感染できることにより、より好ましい抗原提示が可能であること；（v）一生涯の免疫を提供する1回接種ワクチンを得ることが可能であること；（vi）ChimeriVax（商標）ワクチンウイルスのエンベロープが容易に交換可能であり、異なる組換え型ワクチンの選択を与え、そのいくつかは、地理的に異なる領域における他のワクチンより適切である（地方病のフラビウイルスに対するワクチンが含まれる2種混合（dual）ワクチンを作製するため、または集団における抗ベクター免疫を回避するため）、または連続使用のために適切であること；（vii）連続使用の際の有害事象の機会を消失させるためまたは抗ベクター免疫の効果を最小限にするために、上記のパッケージングされた1ラウンド複製のレプリコンまたはPIVに完全な生フラビウイルスベクターを改変することが可能であること；（viii）一つの病原体（エピトープおよび他の発現された抗原が同じ病原体に属する場合）、または二つもしくはそれより多い病原体（エピトープおよび他の発現された抗原が異なる病原体に属する場合）に対してより頑健な免疫応答を得るために、本明細書において記載された直接ランダム変異誘発法を用いて挿入されたエピトープを、レプリコンまたはPIVにおいて遺伝子間、2シストロン性に、または欠失の代わりに発現された他の抗原と組み合わせることが可能であること；および（ix）低い製造コスト、が含まれる。
【００４２】
本発明によって提供されるさらなる長所は、本発明のキメラフラビウイルスベクターが、安全となるように十分に弱毒化されるが、なおもキメラにおけるタンパク質が由来する、特にペプチドがキメラに挿入されたフラビウイルスに対して保護的免疫を誘導できるという事実に関連する。さらなる安全性は、本発明において用いられたベクターのいくつかはキメラであり、このように、野生型に復帰する可能性がないという事実に由来する。本発明において用いられるベクターのさらなる長所は、ウイルス複製戦略が、宿主細胞におけるウイルスゲノムの組み込みを伴わず、重要な安全性基準を提供するように、フラビウイルスが細胞の細胞質において複製する点である。さらに、以下にさらに考察されるように、本発明の一つのベクターを用いて、一つの抗原からの多数のエピトープまたは複数の抗原に由来するエピトープを送達することができる。
【００４３】
さらなる長所は、本明細書において記載される直接のランダム挿入法によって、様々な他のエピトープ（NS1における挿入部位に関しては以下に例示される）と共に、より長いインサートを挿入するために直接用いることができる、ウイルスタンパク質において広い許容性の部位の同定が起こりうる点である。さらなる長所は、一つのフラビウイルスにおいて高度に許容性であることが見いだされたいくつかの挿入部位が、異なるフラビウイルスのタンパク質における構造／機能の保存により他のフラビウイルスにおいても等しく許容性となりうる点である。さらなる長所は、エピトープを有する組換え型フラビウイルスを、たとえばサブユニットワクチンのための追加免疫として、または組換え型ウイルス成分と共に投与されるたとえばサブユニットもしくは死菌ワクチン成分からなる混合ワクチンにおける相乗的成分のための追加免疫として用いることができ、それによって免疫応答の有意な増強が起こる点である（ACAM-Flu-Aサブユニットワクチンと共に混合したA25ウイルスに関しては以下に例示される）。さらに、記載のランダム挿入法は、たとえば構造タンパク質遺伝子がゲノムの3'末端に転移され、IRESエレメントの制御下でNS5の後で発現される改変TBEウイルスの場合のように、再配列されている任意のフラビウイルス（または欠損フラビウイルス）ゲノムに応用することができる（Orlinger et al., J Virol. 80:12197-208, 2006）。
【００４４】
本発明の他の特色および長所は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ウイルスprM、E、および／またはNS1糖タンパク質へのコンセンサスM2eペプチドのトランスポゾン媒介ランダム挿入によるChimeriVax（商標）-JE-fluウイルスの構築の略図。CおよびNS2A-NS5遺伝子はまた、この図において図示されるアプローチを用いて外来ペプチド（たとえば、T細胞エピトープ）の挿入のための標的となりうる。
【図２】prM/M、E、およびNS1遺伝子において無作為に挿入されたM2eペプチドを含有するChimeriVax（商標）-JE-fluプラスミドライブラリーの構築の略図。
【図３】抗体によるウイルスプラークの染色によって明らかにされるように、ChimeriVax（商標）-JEウイルスのNS1タンパク質内でのインフルエンザAウイルスコンセンサスM2e保護エピトープの発現を示す。35 mmウェルにおけるウイルスプラークを、感染後4日目に抗JEポリクローナル抗体（A）または抗M2eモノクローナル抗体（B）によって染色した。100 mmペトリ皿（数百個のウイルスプラークを含有する）におけるM2e陽性ウイルスプラークは、抗M2eモノクローナル抗体（C）によって染色した。
【図４】M2e MAbまたはJEポリクローナル抗体（表の左；最高力価を有するクローンを太字で示す）による染色によって決定した、選択された精製ChimeriVax（商標）-JE-NS1/M2eウイルスクローン（最後の精製段階後のP2レベルでの保存系統）の力価の分析結果を示す表および写真、ならびにクローンの一つの染色例（右の写真）である。結果は、クローンの純度を証明して、高い遺伝的安定性の証拠を提供する。
【図５】ChimeriVax（商標）-JEベクターウイルスのNS1遺伝子における正確な位置の略図であり、以下に記載される実験において用いられるクローンA25が含まれるウイルスクローンA11-A92のシークエンシングによって同定されたM2eインサートのヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。完全な105ヌクレオチドのインサートを強調する。両側にGG残基が隣接するM2eペプチド（柔軟性のために付加される）を枠で囲む。BstBI制限部位（TTCGAA）を下線で示す。トランスポゾンの作用により、インサートの前に存在する二つのウイルスアミノ酸残基（SV）がインサートの末端で重複された（二重下線）。
【図６】図6AはウイルスゲノムにおけるM2eインサートの位置を示すChimeriVax（商標）-JE-NS1/M2eウイルスのクローンA25の略図である。図6Bは、Vero細胞において10回継代したA25ウイルスのプラークのM2eおよびJE特異的抗体による染色を示す写真であり、インサートの極めて高い安定性を証明している。図6Cは、ChimeriVax（商標）-JEベクターウイルスと比較したP2およびP12継代でのA25ウイルスの生育曲線のグラフである。パネルDは、A25ウイルスまたはChimeriVax-JEベクターに感染し、抗JEまたは抗M2e抗体のいずれかによって染色した細胞の免疫蛍光の例であり、同様にA25ウイルスによるM2eエピトープの効率的な発現を図示する。
【図７】表5における免疫群2および3からのマウス血清の連続希釈プールに関する、54日目でのM2e特異的総IgG：ELISA OD450値を示すグラフである。
【図８】マウス適応A/PR/8/34インフルエンザウイルスのLD50の20倍量を55日目にINチャレンジ後の表5に示した免疫マウスの生存曲線のグラフである。
【図９】インフルエンザAウイルスの万能M2e（A）およびHA0（B）エピトープのアライメントの略図である。配列の最も必須の部分（たとえば、抗体結合にとって）を影をつけて示す。
【図１０】本明細書において記載されるランダム挿入アプローチを用いて作製することができる多重抗原構築物の例である。たとえばprM-E遺伝子の代わりにNAまたはHAを、たとえばNS1において無作為に挿入されたM2eエピトープを、たとえばNS3における免疫優性T細胞エピトープを、および遺伝子間部位の一つ（または複数）に挿入されたさらなる免疫原を発現する多重機構汎流行ワクチンとして、多数のインフルエンザAウイルス免疫原を発現するChimeriVax-JEレプリコン。2Aオートプロテアーゼ（EMCVまたはFMDVから）は、ポリプロテインの残りからNAを切断するであろう。または、NSタンパク質の翻訳を再び開始するために、2Aオートプロテアーゼの代わりにIRESエレメントを用いることができる。多様なエレメント（たとえば、2Aオートプロテアーゼ、ユビキチン、IRES、NA遺伝子の自律性AUG、またはウイルスプロテアーゼ切断部位）を用いて、丸印の部位でのNAのN末端を産生することができる。同様に、異なる病原体に由来する抗原を用いて、いくつかの病原体に対するワクチン構築物を作製することができる。
【図１１】ChimeriVax-JE/NS1-M2e RNAライブラリーをトランスフェクトして、ウイルスクローン間の競合をなくすために直ちに寒天を上層したVero細胞のMe2抗体染色ペトリ皿の例である。トランスフェクションのためのRNAを、プラスミドpUC-AR03-rM2eからのNS1-M2e遺伝子ライブラリーをpBSA-AR3-stopベクターにライゲーションすることによって得られたインビトロでライゲーションされたDNA鋳型において合成した。
【図１２】ChimeriVax-JEウイルスのEタンパク質におけるM2eペプチドの発現の成功を示す。挿入変異体の増殖巣をM2e MAbによって染色した。（A）6日目で染色した当初のアミノ酸35個のM2e含有インサートを有する変種（実験2）。（BおよびC）4日目に染色したアミノ酸17個のM2eおよび2個のGly残基に隣接されたアミノ酸17個のM2eをそれぞれ有する変種（実験3）。
【図１３】ChimeriVax-JEのNS1-236挿入部位で縦列に挿入されたヒトM2e＋トリM2eエピトープを示す。インサートの総サイズはアミノ酸56個。（A）A25ウイルスに加えたトリM2eエピトープの略図。（B）ウイルスの二つの変種の正確な配列：上のパネルは、トリM2eインサートにおける本来のコドンを用いて構築されたM2eヒト/M23トリウイルスの配列を示す（ヒトM2eを下線で示し；トリM2eを破線の下線で示す）。下のパネルは、トリM2eコドンがより高い遺伝的安定性のために縮重コドンに変化されたことを除き同じものを示す。（C）JEおよびM2e抗体によって染色したM2eヒト/M23トリウイルスのプラーク。
【図１４】ChimeriVax-JEウイルスが、M2eエピトープを用いて同定されたNS1-236挿入部位でHAタグ（インフルエンザH3）B/T細胞エピトープを容認することを示す。（A）回収された生存ウイルスのインサートの配列。（B）Vero細胞上のウイルスのプラークを抗HAタグMAb 12CA5によって染色する。
【図１５】フラビウイルスprM、E、およびNS1タンパク質における外来エピトープ発現の異なる様式を示す。
【図１６】prMタンパク質におけるM2eを有するChimeriVax-JE挿入変種を示す。（A）一つの実験において決定した、ChimeriVax-JEと比較したM1、M2、M3、M6およびM8クローンのプラークの例。（B）prM-M2eクローン対ChimeriVax-JEベクターの生育曲線。
【図１７】prMにおけるM2eインサートを有するChimeriVax-JEクローンの配列の略図である。Signal P3.0オンラインプログラムによって予測される最も可能性が高い起こりうるシグナラーゼ切断部位を示す。
【図１８】A25（ChimeriVax-JE/M2eNS1-236）ウイルスのChimeriVax-WN02類似体を示す。構築物およびプラークは、アガロースを上層した6日目に産生され、これをM2e MAbによって染色する。
【図１９】ChimeriVax-WN02/A25およびChimeriVax-WN02/A25適合ウイルスを示す。（A）A25プロトタイプウイルスおよびChimeriVax-WN02と比較した、メチルセルロースを上層して産生された5日目のプラーク精製ウイルス保存系統のプラーク。（B）Vero細胞の生育曲線、MOI 0.001。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
詳細な説明
本発明は、異種ペプチドが含まれるウイルスベクターを生成する方法、そのようなペプチドが含まれるウイルスベクター、たとえば導入されたペプチドが由来する病原体に対する免疫応答を誘導するために、ウイルスベクターを投与することによってこれらのペプチドを送達する方法、およびウイルスベクターが含まれる組成物を提供する。これらのウイルスベクター、ペプチド、方法、および組成物の詳細を以下に提供する。
【００４７】
本発明の中心的な特色は、標的病原体に対して強く長く持続する免疫を誘導する目的で、広範囲の病原性生物の免疫原性ペプチドを、感染細胞におけるそのようなペプチドの効率的な発現および免疫系に対する効率的な提示のために、生きた弱毒化ワクチンウイルスのタンパク質に無作為に挿入することによる、生の組換え型ワクチンの構築に関する。効率的な提示に関して、たとえばB細胞エピトープを表す外来ペプチドを、強い抗ペプチド抗体反応を刺激するために、感染細胞単独から分泌されるタンパク質（たとえば、フラビウイルスのNS1およびprMのアミノ末端部分）のようなウイルスタンパク質、またはウイルス粒子（フラビウイルスのMおよびEエンベロープタンパク質）に無作為に挿入する。T細胞エピトープが含まれるペプチドのようなペプチドを、感染細胞の内部で合成される非構造ウイルスタンパク質に無作為に挿入することができ、それによってMHC I/II複合体を通して免疫系に外来ペプチドを提示して強い細胞性免疫を誘導する。構造タンパク質への挿入も同様に、効率的なMHC媒介提示となりうる。
【００４８】
以下にさらに説明されるように、本発明に従うウイルス遺伝子への無作為な挿入によって、ほとんどの複製コンピテント組換え型ウイルス変種を選択することができ、それによって挿入されたペプチドの最高の免疫原性（最適なペプチド立体構造）および最高の発現安定性を提供する。同様に、以下に記載されるように、たとえば除去可能なトランスプライマーが含まれる市販のトランスポゾン媒介挿入系を、本発明の組換え体を構築するためのツールとして用いることができる。本発明のアプローチを、実験の例の章において以下に詳細に記載する。簡単に説明すると、これらの例において、A型インフルエンザ株において高度に保存されるインフルエンザウイルスのM2タンパク質のコンセンサスB細胞エピトープM2e（同様にT細胞エピトープを含有する）を、ChimeriVax（商標）-JEワクチンウイルスのNS1、prM/M、およびE遺伝子に挿入した。抗M2e抗体によって認識可能な、NS1、prMおよびEタンパク質内でM2eペプチドを発現する多数のウイルスクローンが観察され、いくつかを精製してインビトロ／インビボでさらに特徴付けした。さらに、以下にさらに記載されるように、NS1挿入は、ChimeriVax（商標）-JEという状況からChimeriVax（商標）-WNに転移された。
【００４９】
本発明の方法の要素は、トランスポゾンが所望の遺伝子（または複数の遺伝子）に一つまたは複数の制限部位を無作為に挿入するためのみに用いられるという事実である。次に、所望の外来ペプチドをコードするDNA断片を制限部位で遺伝子に組み入れる。次に、変異体遺伝子ライブラリーを完全なウイルスゲノム（RNAウイルスのcDNA）に組み入れた後、細胞をトランスフェクトして、異質なウイルス子孫を回収することができる。ウイルスは、その生存率および効率的な複製に干渉せずに、挿入部位がより適切である自己を「選ぶ」。十分に多数の変異体ウイルスクローンを迅速に選択した後、挿入されたペプチドに対して特異的な抗体を用いて高い抗原性に関して、動物を免疫して抗ペプチド免疫応答および／またはチャレンジからの保護を測定することによって高い免疫原性（適当なペプチド立体構造および免疫細胞への提示）に関して、ならびにたとえばインビトロまたはインビボで変異体ウイルスの多数の継代の間にペプチドの存在および発現をモニターすること、および組換え型ワクチンウイルス生物学的表現型に関して評価可能であるいかなる適合も明らかにするためのゲノムシークエンシングによって遺伝的安定性に関して試験する（たとえば、製造時のより高い収率、より高い遺伝的安定性、およびより高い免疫原性）。その結果、「最善の」ワクチンウイルス変種が同定される。このように、この「ウイルスに決定させる」アプローチは、実質的な利益を提供する。
【００５０】
本発明の基礎を提供するランダム挿入法の原理を図1に図示する。この例において、インフルエンザAのM2eペプチドを構造prM/MおよびEタンパク質、ならびに非構造NS1タンパク質に導入した。構造タンパク質はウイルス粒子の一部として細胞から放出され（prMのN末端部分も同様に分泌される可能性がある）、NS1は、感染細胞の表面に輸送されて、その一分画が剥離して細胞外を循環する。細胞外提示は、強い抗体反応にとって必須である。このように、M2eを提示するためにNS1タンパク質を用いることは、ペプチドが細胞表面に送達されて、インフルエンザウイルスのM2によって天然の状態を模倣し、これはM2媒介免疫のいくつかの局面にとって重要である可能性があることから、特に興味深い。prMおよびEタンパク質の提示は、ペプチドの多数のコピーがより強い免疫原であると思われるウイルス粒子の表面に提示されることから、より高い免疫応答に至る可能性がある。
【００５１】
制限部位（たとえば、PmeI部位）を最初に、たとえばNew England Biolabs (Beverly, MA)GPS-LS Tn7媒介変異誘発キットのような市販のキットを用いて、サブクローニングした標的遺伝子（各遺伝子分子あたり主に一つの部位、しかしこの頻度は望ましければ、たとえばさらなる変異誘発ラウンドによって変更させることができる）に無作為に組み入れる。次に、トランスポゾンのトランスプライマー部分を制限エンドヌクレアーゼ（たとえばPmeI）消化によって除去して、これをM2e DNAインサートに置換すると、変異体遺伝子プラスミドライブラリーが生成される。変異遺伝子分子のプールを、ChimeriVax（商標）-JEの完全長のcDNAにライゲーションする。DNA鋳型をインビトロで転写した後、細胞にRNA転写物をトランスフェクトさせる。生存子孫ウイルスの個々のクローンを単離して、M2eペプチドの存在、免疫原性、および遺伝的安定性に関して試験する。本実施例のさらなる詳細を以下の実験例の章に記載する。
【００５２】
上記の方法の変法において、変異誘発は、完全な無傷のウイルスゲノムという状況において（たとえば、プラスミドにおいてクローニングされたRNA含有ウイルスの完全長のcDNA、またはDNAウイルスの完全なゲノム分子）、またはいくつかのウイルス遺伝子を包含するDNA断片という状況において起こり、この後に生存挿入変異体を回収する。そのような例において、ウイルスは、特異的標的タンパク質内に外来ペプチドを挿入するために最も適切な位置を「選ぶ」のみならず、同様にゲノム全体またはゲノムの大きい断片内でコードされる最も適切な標的タンパク質を選ぶ。もう一つの変法において、細菌（たとえば、サルモネラ（salmonella）等）のような他のベクター生物の適切な遺伝子を同様にランダム挿入変異誘発に供した後に、ワクチンとして用いることができるその生物の組換え型変種を選択することができる。
【００５３】
本明細書において記載される方法のもう一つの変法において、複数のトランスポゾンを連続的または同時に用いて、複数の異なる免疫原性ペプチドを無作為に挿入するために、同じ標的遺伝子を変異誘発させた後に、一つの病原体（たとえば、免疫原性／保護性を増加するために）、またはいくつかの病原体（たとえば組み合わせワクチンを作製するために）の異なる外来抗原性決定基を有する生存ウイルスクローンを選択する。ランダム挿入法はまた、たとえば上記のように（たとえば、McAllister et al., J. Virol. 74:9197-205, 2000；Bredenbeek et al., Virology 345:299-304, 2006）、一つの病原体または異なる病原体のいくつかの抗原を発現するワクチン候補体を生成するために、一つのウイルス／ベクター生物において他の発現プラットフォームと組み合わせることができる。同様に、さらに発現されたタンパク質は、免疫刺激分子、たとえばそれによって組換え型ワクチンの増加した免疫原性／効能が得られる免疫応答の適切な分岐を刺激する様々な公知のサイトカインとなりうる。さらに、方法は、広い許容性のある挿入部位（たとえばNS1-236およびprMのN末端領域（たとえば、アミノ酸1〜5位））を同定するために用いることができる。さらに、選択された有望な組換え体をワクチンそのものとして用いることができ、またはプライミング剤もしくは追加免疫（異なる成分を連続して適用する場合）として、または相乗的なワクチン成分として（異なる成分を同時に接種する場合）他の（たとえばサブユニットもしくは死菌、または他の生）ワクチンと併用して用いることができる。
【００５４】
本明細書において記載される注目すべき方法の特色には、以下が含まれる：（i）プラスミドライブラリーの生成を促進するために切断可能な抗生物質耐性遺伝子を（エピトープインサートと共に）用いること（図2）；（ii）インサートを有しないウイルスの出現の機会を最小限にするために完全長のプラスミドクローン（ウイルスcDNA）の標的遺伝子への終止コドンまたはフレームシフトの導入（図2）；（iii）いかなる無インサートDNA鋳型も消失させるための、ランダム挿入を含有するプラスミドライブラリーのPmeI酵素による処置、または無インサートウイルス（E-タンパク質発現区画）と挿入変種との競合を最小限にするために、トランスフェクトした細胞もしくはトランスフェクションのために用いられるRNAの連続希釈を行うこと；（iv）および細胞単層の免疫染色と組み合わせたプラーク精製を用いるインサート含有ウイルスクローンの容易な単離。
【００５５】
ウイルスベクター
本発明において用いることができるキメラウイルスは、上記のように、構造タンパク質（または複数のタンパク質）が、第二のウイルスの対応する構造タンパク質（または複数のタンパク質）に置換されている第一のフラビウイルス（すなわち、骨格フラビウイルス）からなるChimeriVax（商標）ウイルスに基づくことができる。たとえば、キメラは、prMおよびEタンパク質が第二のフラビウイルスのprMおよびEタンパク質に置換されている第一のフラビウイルスからなりうる。
【００５６】
本発明において用いられるキメラウイルスは、ウイルスの任意の組み合わせから作製することができる。本発明において第一または第二のウイルスとして用いることができる特定のフラビウイルスの例には、日本脳炎、デング（血清型1〜4）、黄熱病、マリーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、クンジン、ロシオ脳炎、およびイルヘウス脳炎ウイルスのような蚊媒介性のフラビウイルス；中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポーワッサン、ネギシ、アブセットアローブ、ハンザローバア、アポイ、およびHyprウイルスのようなマダニ媒介性フラビウイルス；と共にヘパシウイルス属（たとえばC型肝炎）のウイルスが含まれる。
【００５７】
本発明において用いることができるキメラウイルスのタイプの具体的例は、prMおよびEタンパク質が、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、デングウイルスのようなもう一つのフラビウイルス、または上記に列記したものの1つのような他の任意のフラビウイルスのprMおよびEタンパク質に置換されている、ヒト黄熱病ウイルスワクチン株YF17Dである。たとえば、ブダペスト条約の約定の下でAmerican Type Culture Collection (ATCC)、Manassas, Virginia, U.S.A.に寄託され、1998年1月6日の寄託日を与えられた以下のキメラフラビウイルスを本発明において用いることができる：キメラ黄熱病17D/日本脳炎SA14-14-2ウイルス（YF/JE Al.3；ATCCアクセッション番号ATCC VR-2594）、およびキメラ黄熱病17D/デング2型ウイルス（YF/DEN-2；ATCCアクセッション番号ATCC VR-2593）。
【００５８】
本発明において用いることができるキメラウイルスを作製する詳細は、たとえばその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,962,708号および同6,696,281号；国際特許出願のWO 98/37911およびWO 01/39802；ならびにChambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999において提供される。さらに、これらのキメラウイルスには、上記のおよび本明細書において引用された参考文献において記載されるものような弱毒化変異が含まれうる（同様に、たとえば、WO 2003/103571；WO 2005/082020；WO 2004/045529；WO 2006/044857；WO 2006/116182を参照されたい）。本発明のウイルスを作製するために用いることができるウイルスに関する配列情報は、たとえば米国特許第6,962,708号において提供される（同様に、たとえばGenbankアクセッション番号NP_041726；CAA27332；AAK11279；P17763も参照されたい。注意：これらの配列は例示的であるに過ぎない。多数の他のフラビウイルス配列が当技術分野において公知であり、本発明において用いることができる）。さらなる例には、本明細書において配列の付表（Sequence Appendix）3（YF17D）として提供されるGenbankアクセッション番号NC_002031、本明細書において配列の付表4（JE-SA-14-14-2）として提供されるGenbankアクセッション番号AF315119、および本明細書において配列の付表5（西ナイルウイルス）として提供されるGenbankアクセッション番号AF196835が含まれる。この配列情報は例示的であるに過ぎず、本発明において用いることができる他の多くのフラビウイルス配列が存在する。さらに、これらの配列には、本明細書において（および引用される参考文献において）記載される変異が含まれ、本明細書において（および引用される参考文献において）記載されるキメラの中に含まれ、および／または本明細書において記載されるインサートが含まれる
【００５９】
本アプローチにおいてベクターとしてChimeriVax（商標）ワクチンを用いる長所において、主な長所は、エンベロープタンパク質（フラビウイルスに対する免疫、この場合は抗ベクター免疫の主な抗原性決定基である）を、同じ個体に連続的に適用することができる同じYF17D骨格を用いて容易に交換することができ、いくつかの異なるワクチンを構築することができる点である。さらに、異なる組換え型ChimeriVax（商標）挿入ワクチンは、異なるフラビウイルスが風土病である特異的地理的地域において、風土病のフラビウイルスともう一つの標的病原体に対する2種混合ワクチンとして用いるためにより適切であると決定されうる。たとえば、ChimeriVax（商標）-JE-インフルエンザワクチンは、JEが風土病であるアジアにおいて、JEおよびインフルエンザの双方から保護するためにより適切である可能性があり、YF17D-インフルエンザワクチンは、YFが風土病であるアフリカおよび南アメリカにおいてより適切である可能性があり、ChimeriVax（商標）-WN-インフルエンザは、WNウイルスが風土病である米国およびヨーロッパの一部および中東においてより適切である可能性があり、ならびにChimeriVax（商標）-デング-インフルエンザは、デングウイルスが存在する熱帯地域全体でより適切である可能性がある。
【００６０】
キメラフラビウイルスのほかに、非キメラフラビウイルスのような他のフラビウイルスを、本発明に従うベクターとして用いることができる。本発明において用いることができるそのようなベクターの例には、YF17Dのような生弱毒化ワクチン、および当初野生型アシビ株の弱毒化によって得られたYF17D株に由来するワクチン（Smithburn et al., "Yellow Fever Vaccination," World Health Organization, p. 238, 1956；Freestone, Plotkin et al. (eds.), Vaccines, 2nd edition, W.B. Saunders, Philadelphia, U.S.A., 1995）が含まれる。本発明において用いることができるウイルスが誘導されうるYF17D株の例は、YF17D-204（YF-VAX(登録商標), Sanofi-Pasteur, Swiftwater, PA, USA；Stamaril（登録商標）, Sanofi-Pasteur, Marcy-L'Etoile, France；ARILVAX（商標）, Chiron, Speke, Liverpool, UK；FLAVIMUN（登録商標）, Berna Biotech, Bern, Switzerland；YF17D-204 France（X15067, X15062）；YF17D-204, 234 US（Rice et al., Science 229:726-733, 1985)）であるが、用いることができるそのような株の他の例は、近縁のYF 17DD株（GenBankアクセッション番号U 17066）、YF17D-213（GenBankアクセッション番号U 17067）、およびGaller et al., Vaccines 16(9/10): 1024-1028, 1998によって記載される黄熱病ウイルス17DD株である。これらの株のほかに、ヒト患者のようなヒトにおいて許容可能に弱毒化されることが見いだされた任意の他の黄熱病ウイルスワクチン株を本発明において用いることができる。
【００６１】
キメラフラビウイルスおよび黄熱病ウイルス（たとえば、YF17Dワクチン）のような無傷のフラビウイルスのほかに、本発明の方法はまた、他の非フラビウイルス、生きた弱毒化ワクチンウイルス（RNAおよびDNA含有ウイルスの双方）についても用いることができる。そのようなワクチンウイルスの例には、麻疹、風疹、ベネズエラウマ脳脊髄炎（VEE）のウイルス、モノネガウイルス（ラブドウイルス、パラインフルエンザウイルス等）、およびDNAウイルスの弱毒化株（たとえば、ワクシニアウイルス、痘瘡ワクチン等）が含まれる。
【００６２】
さらに、上記で考察したように生きたウイルスのほかに、レプリコン骨格タンパク質（たとえば、NS1および他のNSタンパク質と共にC）において外来ペプチドを発現するパッケージングされたレプリコンを本発明において用いることができる。このアプローチは、同じ個体に適用することができる異なるワクチンを作製するために同じベクターを用いるために、または同じレプリコン構築物においていくつかの抗原を発現させるために、たとえば安全性を増加させるためにまたは抗ベクター免疫（エンベロープタンパク質に対する抗体反応を中和する）を最小限にするために望ましい可能性がある場合に用いることができる。そのような構築物の図解を図10に示す。一ラウンドレプリコンを構築するための技術は十分に確立されており、レプリコンの免疫原性能は証明されている（Jones et al., Virology 331:247-259, 2005；Molenkamp et al., J. Virol. 77:1644-1648, 2003；Westaway et al., Adv. Virus. Res. 59:99-140, 2003）。そのようなレプリコンの一例では、prMおよびEエンベロープタンパク質遺伝子のほとんどが欠失している。したがって、これは細胞内で複製できるが、ウイルス子孫を生成することができない（したがって、一ラウンド複製である）。これは、prM-E遺伝子がトランスに提供されている場合にウイルス粒子にパッケージングされうる。なお、細胞にそのようなパッケージングレプリコンを感染させると（たとえば、ワクチン接種の後）、周辺の細胞／組織にさらに広がることなく、一ラウンド複製が後に続く。さらに、無作為に挿入された免疫原性ペプチドを、PIV（たとえば、Mason et al., Virology 351 :432-443, 2006）および他の任意の欠損ウイルスワクチン構築物、全ベクターウイルス、再配列ウイルス（たとえば、Orlinger et al., J. Virol. 80:12197-12208, 2006）という状況において、およびPIV欠失等の代わりにさらなる抗原の遺伝子間での2シストロン性の発現により、他の抗原と組み合わせることができる。
【００６３】
異なる病原体からの保護エピトープを一つのウイルスにおいて組み合わせることができ、それによって3種混合（triple）、4種混合（quadruple）等のワクチンが得られる。同様に、非風土病フラビウイルスからのエンベロープを含有するChimeriVax（商標）変種を用いて、そうでなければ一定の地理的地域におけるワクチン接種の有効性を制限しうると考えられる天然の抗ベクター免疫のリスクを集団において回避することができる（たとえば、ChimeriVax（商標）-JEベクターを、JEが存在しない米国において用いてもよい）。
【００６４】
さらに、本発明には、本明細書において記載される方法によって作製されたか否かによらず、C、prM、E、NSl、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、およびNS5タンパク質からなる群より選択されるタンパク質において、本明細書において記載されるように一つまたは複数の異種ペプチドの挿入が含まれる、フラビウイルス（たとえば、YF17Dのような黄熱病ウイルス、および本明細書において記載されるようなキメラフラビウイルス）が含まれる。本明細書における実験例において記載されるprM、E、およびNS1に挿入するための方法は、他のフラビウイルスタンパク質（CおよびNS2A-NS5）と共に他のベクターウイルス、細菌等のタンパク質を変異させる方法を、正確に科学分野における当業者に教示する。CおよびNS2A-NS5フラビウイルスタンパク質は、主に細胞内で発現されることから（ウイルス粒子の一部でもあるCを例外として）、これらのタンパク質は、T細胞外来免疫学的エピトープを挿入するために最も適切となる可能性がある。しかし、全てではないがほとんどの細胞内ウイルスタンパク質に対してインビボで何らかの抗体反応が生成されることから、B細胞エピトープも同様に挿入することができる。
【００６５】
異種ペプチド
本発明のウイルスベクターは、予防的または治療的価値を有する任意のペプチドまたはタンパク質を送達するために用いることができる。たとえば、本発明のベクターは、フラビウイルスのエンベロープタンパク質、プレ膜タンパク質、カプシドタンパク質、および非構造タンパク質のようなウイルスタンパク質に挿入された任意のタンパク質に基づく抗原に対する免疫応答（予防的または治療的）を誘導するために用いることができる。
【００６６】
本発明のベクターにはそれぞれ、単一のエピトープが含まれうる。または、多数のエピトープを、一つの部位で（たとえば、異なるエピトープが、アミノ酸のポリグリシン鎖のように柔軟なリンカーによって分離されうるポリトープとして）、異なる部位で、またはその任意の組み合わせでベクターに挿入することができる。異なるエピトープは、一つの種の病原体に由来することができ、または異なる種および／または異なる属に由来しうる。ベクターには、多数のペプチド、たとえば本明細書において記載されるペプチドの多数のコピー、または本明細書において記載されるようなペプチドの組み合わせが含まれうる。例として、ベクターには、ヒトおよびトリM2eペプチド（および／またはそのコンセンサス配列）が含まれうる。
【００６７】
本発明において用いることができる抗原は、たとえばウイルス、細菌、および寄生虫のような感染物質に由来しうる。そのような感染物質の具体的例は、ヒトに感染するウイルス（たとえば、A、BおよびC株）と共にトリインフルエンザウイルスが含まれるインフルエンザウイルスである。インフルエンザウイルスからの抗原の例には、血液凝集素（HA、たとえばH1〜H16のいずれか一つ、またはそのサブユニット）（またはHAサブユニットHA1およびHA2）、ノイラミニダーゼ（NA；たとえばN1〜N9のいずれか一つ）、M2、M1、ヌクレオタンパク質（NP）、およびBタンパク質に由来する抗原が含まれる。たとえば、血液凝集素前駆体タンパク質切断部位（HA0）（A/H1株に関して
、A/H3株に関して
、およびインフルエンザB株に関して
）またはM2e
が含まれるペプチドを用いることができる。インフルエンザにおいて保存されているペプチドの他の例を本発明において用いることができ、これには：インフルエンザBにおいて保存されるNBeペプチド（コンセンサス配列
）；インフルエンザBのBM2タンパク質の細胞外ドメイン（コンセンサスMLEPFQ）；およびH5N1トリインフルエンザに由来するM2eペプチド
が含まれる。本発明において用いることができるインフルエンザペプチドと共にそのようなペプチドが由来しうるタンパク質（たとえば、断片化によって）のさらなる例は、その内容物が参照により本明細書に組み入れられる、US 2002/0165176、US 2003/0175290、US 2004/0055024、US 2004/0116664、US 2004/0219170、US 2004/0223976、US 2005/0042229、US 2005/0003349、US 2005/0009008、US 2005/0186621、米国特許第4,752,473号、米国特許第5,374,717号、米国特許第6,169,175号、米国特許第6,720,409号、米国特許第6,750,325号、米国特許第6,872,395号、WO 93/15763、WO 94/06468、WO 94/17826、WO 96/10631、WO 99/07839、WO 99/58658、WO 02/14478、WO 2003/102165、WO 2004/053091、WO 2005/055957、ならびに同封の配列の付表1および2（およびその中に引用される参考文献）において記載されている。さらに、インフルエンザの保存された免疫学的／保護的TおよびB細胞エピトープは、www.immuneepitope.orgデータベースから選択することができ、ここでは以下に記載されるように本発明者らが用いるH3N2ウイルスの一つのHAエピトープが含まれる、多くの有望な交叉保護的エピトープが最近同定されている（Bui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 104:246-251, 2007および補足の表）。本発明は、オンラインIEDBリソースからの任意のペプチドを使用することができ、たとえばBui et al., 前記に記載される保存されたBおよびT細胞エピトープが含まれるインフルエンザウイルスエピトープを用いることができる。
【００６８】
寄生虫（たとえば、マラリア）、他の病原性ウイルス（たとえば、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV；たとえばgag）、およびC型肝炎ウイルス（HCV））、ならびに細菌（たとえば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、およびヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori））のような他のヒト／獣医学病原体からの保護的エピトープも同様に、本発明のベクターに含まれうる。これらおよび他の病原体の様々な適切なエピトープを文献において容易に見いだすことができる。たとえば、異なるHPV遺伝子型に対して保護する広い交叉中和抗体を誘導する乳頭腫ウイルスL2タンパク質からの交叉保護性エピトープ／ペプチド、たとえばHPV16ウイルスのL2タンパク質のアミノ酸1〜88位、アミノ酸1〜200位、またはアミノ酸17〜36位のようなエピトープ／ペプチドが、Schillerおよび共同研究者によって同定されている（WO 2006/083984 Al；
）。本発明において用いることができるさらなる病原体と共にこれらの病原体からの抗原およびエピトープの例は、その内容物が参照により本明細書に組み入れられる、WO 2004/053091、WO 03/102165、WO 02/14478、およびUS 2003/0185854において提供される。
【００６９】
そこから抗原を得ることができる病原体のさらなる例を、以下の表1に記載し、そのような抗原の具体的例には、表2において記載される抗原が含まれる。さらに、本発明のベクターに挿入することができるエピトープの具体的例を表3に提供する。表3において注目されるように、本発明のベクターにおいて用いられるエピトープは、B細胞エピトープ（すなわち、中和エピトープ）またはT細胞エピトープ（すなわち、Tヘルパーおよび細胞障害性T細胞特異的エピトープ）となりうる。
【００７０】
本発明のベクターは、病原体に由来する抗原のほかに抗原を送達するために用いることができる。たとえば、ベクターは、癌に対する免疫治療法において用いるために腫瘍関連抗原を送達するために用いることができる。多数の腫瘍特異的抗原が当技術分野において公知であり、本発明に従って投与することができる。癌（および対応する腫瘍関連抗原）の例は以下の通りである：黒色腫（NY-ESO-1タンパク質（具体的にアミノ酸157-165位に存在するCTLエピトープ）、CAMEL、MART 1、gp100、チロシン関連タンパク質TRP1および2、ならびにMUCl）；腺癌（ErbB2タンパク質）；結腸直腸癌（17-1A、791Tgp72、および癌胎児抗原）；前立腺癌（PSAlおよびPSA3）。熱ショックタンパク質（hsp110）も同様にそのような抗原として用いることができる。
【００７１】
本発明のもう一つの例において、それに対する免疫応答が望ましいアレルギー誘導抗原のエピトープをコードする外因性のタンパク質を用いることができる。さらに、本発明のベクターには、抗原のようなペプチドを、ベクターが投与される被験者における特定の細胞（たとえば、リガンドに対する受容体が含まれる細胞）に送達するためにベクターを標的化するために用いられるリガンドが含まれうる。
【００７２】
本発明のベクターに挿入されるペプチドまたはタンパク質の大きさは、当業者によって適切であると決定されうるように、たとえば長さがアミノ酸3〜1000個、たとえば長さがアミノ酸5〜500個、10〜100個、20〜55個、25〜45個、または35〜40個の範囲となりうる。本明細書において他所で考察されるように、本明細書において記載されるアミノ末端プレ膜タンパク質挿入は、より長い挿入の可能性を提供する（以下を参照されたい）。さらに、本明細書において注目されるペプチドには、当業者によって適切であると決定されうるように、さらなる配列が含まれうる、または長さが低減されうる。本明細書において記載されるペプチドは、本明細書において示される本発明のベクターに存在しうる、または一つもしくは複数のアミノ酸（たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多いアミノ酸）の置換または欠失によって改変されうる。さらに、ペプチドはより長いペプチドという状況においてベクターに存在しうる。
【００７３】
本発明にはまた、異なる二つのキメラという状況において示されるように（以下を参照されたい）、たとえば、その中に多数の異なるペプチドを挿入することができるNS1-236のような広い許容性のある挿入部位の同定および使用が含まれる。さらに広い許容性の部位には、ChimeriVax（商標）-JEおよびChimeriVax（商標）-WN（以下を参照されたい）が含まれるキメラウイルスのprMのアミノ末端領域が含まれる。挿入は、そのようなウイルスにおいて1〜50位、たとえば1〜25位、1〜15位、1〜10位、または1〜5位の任意の一つまたは複数において作製してもよい。
【００７４】
さらに、本発明には、たとえば細胞（たとえば、Vero）培養によって得られる第二の部位の適応を同定および使用が含まれる。そのような適応は、複製の増加等のような利益を提供してもよい。他の状況において用いることができるそのような適応の具体的例を以下の実験例において記載する。
【００７５】
産生および投与
上記のウイルスは、当技術分野において標準的な方法を用いて作製することができる。たとえば、ウイルスのゲノムに対応するRNA分子を、初代細胞、ニワトリ胚、または二倍体細胞株に導入することができ、そこから（またはその上清から）子孫ウイルスを精製することができる。ウイルスを産生するために用いることができる他の方法は、Vero細胞のような異数体細胞を使用する（Yasumura et al., Nihon Rinsho 21 :1201-1215, 1963）。そのような方法の例において、ウイルスのゲノムに対応する核酸分子（たとえば、RNA分子）を異数体細胞に導入して、細胞が培養されていた培地からウイルスを回収して、回収されたウイルスをヌクレアーゼ（たとえば、Benzonase（商標）のようなDNAおよびRNAの双方を分解するエンドヌクレアーゼ；米国特許第5,173,418号）によって処置し、ヌクレアーゼ処置ウイルスを濃縮して（たとえば、分子量カットオフたとえば500 kDaを有するフィルターを用いる限外濾過を用いることによって）、および濃縮されたウイルスをワクチン接種の目的で製剤化する。この方法の詳細は、参照により本明細書に組み入れられる、WO 03/060088 A2において提供される。さらに、キメラウイルスを産生するための方法はキメラウイルス構築物の構築に対する参照において上記で引用した文献において記載されている。
【００７６】
本発明のベクターは、当業者によって容易に決定されうる量および方法を用いることによって投与される。キメラフラビウイルスおよび黄熱病ウイルスに基づくベクターの場合、ベクターは、たとえば感染したニワトリ胚組織の澄んだ懸濁液として、またはキメラ黄熱病ウイルスに感染した細胞培養から採取した液体として、黄熱病17Dワクチンと同じように投与および製剤化することができる。このように、本発明のベクターは、たとえば腹腔内、筋肉内、皮下、または皮内経路によって投与される、投与容量0.1〜1.0 mlにおいて100〜1,000,000感染単位（たとえば、プラーク形成単位、または組織培養感染用量）を含有する滅菌水溶液として製剤化することができる（皮内ワクチン接種アプローチに関する詳細に関してはWO 2004/0120964を参照されたい）。さらに、フラビウイルスは、口腔内経路のような粘膜経路を通してヒト宿主に感染することができる可能性があることから（Gresikova et al., "Tick-borne Encephalitis," The Arboviruses, Ecology and Epidemiology, Monath (ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1988, Volume IV, 177-203）、ベクターを粘膜経路によって投与することができる。
【００７７】
免疫法において用いる場合、ベクターは、特定の病原体による感染のリスクを有する成人または小児における一次予防物質として投与することができる。ベクターはまた、ペプチド抗原が由来する病原体に対する免疫応答を刺激することによって、感染した患者を処置するための二次物質としても用いることができる。たとえば、HPVのE6/E7タンパク質からのエピトープを発現する組換え体、または全E6/E7タンパク質を治療的HPVワクチンとして用いることができる。
【００７８】
ワクチン応用に関して、任意で当業者に公知のアジュバントを用いることができる。キメラベクターの免疫原性を増強するために用いることができるアジュバントには、たとえばリポソーム製剤、（たとえばQS21）、ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピッドA、またはポリホスファジンのような合成アジュバントが含まれる。これらのアジュバントは典型的に、不活化ワクチンに対する免疫応答を増強するために用いられるが、生ワクチンについても用いることができる。粘膜経路、たとえば口腔内を通して送達されるキメラベクターの場合、大腸菌の熱不安定毒素（LT）またはLTの変異誘導体のような粘膜アジュバントをアジュバントとして用いることができる。さらに、アジュバント活性を有するサイトカインをコードする遺伝子をベクターに挿入することができる。このように、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13、またはIL-5のようなサイトカインをコードする遺伝子を外来抗原遺伝子と共に挿入して、それによって増強された免疫応答が得られるワクチンを産生する、または細胞性、液性、もしくは粘膜反応により特異的に向けられる免疫を調節することができる。または、サイトカインを、周知である手段（たとえば、直接接種、裸のDNA、ウイルスベクターにおいて等）によって組換え型ワクチンウイルスから同時、または連続的に個々に送達することができる。
【００７９】
本発明のウイルスは、他のワクチン接種アプローチと併用して用いることができる。たとえば、同じまたは異なる抗原が含まれるサブユニットワクチンと併用してウイルスを投与することができる。本発明の併用法には、本発明のウイルスを他の型の抗原と同時投与することが含まれうる（たとえば、肝炎コアタンパク質（たとえば、大腸菌において産生された表面にM2eペプチドを含有するB型肝炎コア粒子）（HBc-M2e; Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004）が含まれるサブユニット型または送達媒体）。または、本発明のベクターは、本発明のベクターまたは他のアプローチのいずれかをプライミングとして用いた後に、他のアプローチを追加免疫として用いる、またはその逆を用いる、プライミング-追加免疫戦略において他のアプローチ（サブユニットまたはHBcアプローチのような）と併用して用いることができる。さらに、本発明には、プライミングおよび追加免疫物質の双方として本発明のベクターを使用するプライミング-追加免疫戦略が含まれる。
【００８０】
ワクチン応用のほかに、当業者が容易に理解できるように、本発明のベクターは、患者の細胞に治療的遺伝子産物を導入するための遺伝子治療法および癌治療において用いることができる。さらに、免疫学的エピトープを含有する組換え型ウイルス、たとえば本明細書において記載されるキメラまたは無傷のフラビウイルスを、組換え型アルファウイルスレプリコンと類似のように、サブユニットまたは生物全体の死菌ワクチンの効能を増強するためにプライミング-追加免疫養生法において用いることができる（US 2005/0208020 Al）。さらに、以下の本発明者らの結果のいくつかはまた、外来エピトープを含有するフラビウイルス（たとえばChimeriVax-JE/NS1-M2e）とサブユニットワクチン（たとえば、HBc-M2e）とを混合して同時に接種すると、両者の間に強い相乗効果が存在することを証明している。後に、アジュバントを必要とせず、新しい望ましい特色、たとえば免疫応答におけるTh1シフトを提供する新しい効率的な併用ワクチン製剤が得られる可能性がある。さらに、本明細書において記載されるように、外来エピトープをウイルス粒子（prM-Eにおいて）の表面に発現させることができるが、生ワクチンとして組換え型ウイルスを用いる代わりに、たとえばホルマリンを用いてウイルスを不活化させて、死菌ワクチンとして用いることができる。そのようなアプローチは、ベクターウイルスが、ヒト／動物に対して病原性となりうる野生型ウイルスである場合に特に応用可能となりうる。
【００８１】
実験例
以下の実験例は、ChimeriVax（商標）-JEと共にHAエピトープへのM2e配列の挿入を示す。配列をまた、ChimeriVax（商標）-WN構築物にも挿入した。本実施例において記載される方法はまた、配列を他のタンパク質に挿入するために、および他のペプチドを挿入するために、他のキメラフラビウイルスおよびウイルスに基づくベクター（たとえば、レプリコンおよびPIV）のような他のウイルスと共に、上記のような他のベクター生物についても用いることができる。
【００８２】
黄熱病17D（YF17D）生弱毒化ワクチン株は、ヒトにおいて過去60年の間使用されており、優れた安全性記録を有し、1用量の投与後に長く持続する免疫を提供する。上記で注目したように、ChimeriVax（商標）-JEは、YF17Dの一定の構造タンパク質（PrME）をコードする遺伝子が、遺伝的に弱毒化された日本脳炎（JE）ウイルスSA14-14-2の対応する遺伝子に置換されている生の弱毒化組換え型ワクチン株である。このキメラの細胞内複製の原因であるカプシドおよび全ての非構造（NS）遺伝子はいずれもYF17Dワクチン株に由来する。同様に、ChimeriVax（商標）-WNは、YF17DのprMおよびEタンパク質をコードする遺伝子が西ナイルウイルス株からの対応する遺伝子に置換されている、生の弱毒化組換え型ワクチン株である。そのようなキメラの例は、西ナイルウイルス株NY99-flamingo 382-99（GenBankアクセッション番号AF 196835）の配列を使用する。NY99-flamingo 382-99エンベロープ配列におけるChimeriVax（商標）-WN02と呼ばれるさらなる例において、107位のリジンがフェニルアラニンに置換され、316位のアラニンがバリンに置換され、および440位のリジンがアルギニンに置換されている。
【００８３】
この章は、図2において図示されるプラスミド構築段階を記載する。pBeloBac11低コピー数ベクターに基づくChimeriVax（商標）-JEウイルスの全cDNAを含有するpBSA単プラスミド構築物について構築を開始した。このプラスミドは、YFM5'3'SA14-14-2およびYF5.2SA14-14-2プラスミド（ChimeriVax（商標）-JEの当初の二つのプラスミド）のChimeriVax（商標）-JE特異的cDNA部分を（SP6プロモーターと共に）1低コピー数ベクターpBeloBac11（New England Biolabs, Beverly, MA）にアセンブルすることによって構築された。プラスミドは、遺伝子のサブクローニングに都合のよいいくつかの独特の制限部位を含有する（図2における右上のプラスミドダイアグラムにおいてウイルスゲノムを上に示す）。prM、E、およびNS1遺伝子のサブクローニングのために用いられるさらなる制限部位SphI、NsiIおよびEagIを、サイレント部位特異的変異誘発によってpBSAプラスミドに導入した（図2における段階1〜3）。
【００８４】
三つの標的遺伝子をpUC18プラスミドベクター（段階6）にサブクローニングして、得られたプラスミドをTn7トランスポゾン（段階7）を用いて無作為に変異させた。形質転換された大腸菌を、クロラムフェニコールの存在下で生育させ（クロラムフェニコール耐性遺伝子はトランスポゾンの除去可能なトランスプライマーによってコードされる）、多数の細菌コロニーによって代表される三つの変異プラスミドライブラリーを調製した。変異体プラスミドライブラリーの調製の際に、それぞれのライブラリーにおけるコロニー数は、関心対象の外来インサート（M2eのようなペプチドをコードする）がその後標的遺伝子のあらゆるヌクレオチド後に確実に組み入れられるように、変異DNA配列におけるヌクレオチド数より少なくとも3倍高かった。各ライブラリーにおけるコロニー数を図2に示す。変異prM、E、およびNS1遺伝子ライブラリーをpUC18ベクター（段階8）にサブクローニングして、トランスプライマーをPmeI消化によって除去して、再ライゲーションすると（段階9）、各遺伝子分子において独特のPmeI部位を含有する15ヌクレオチドのランダムインサートのみが後に残る。M2eの挿入を促進するために、M2eおよびカナマイシン耐性遺伝子を含有するSmaI-SmaIカセットを最初にアセンブルした（段階4〜5）。Kanr遺伝子を、操作された隣接BstBI部位での消化によってこのカセットから除去することができる。カセットを段階9からのライブラリーにおけるPmeI部位に挿入して、新しいM2e含有ライブラリーの選択は、Kanの存在下で細菌を生育させることによって達成される（段階12）。構築において用いた本来のヒトインフルエンザA M2eコンセンサス配列、
を、ペプチドの抗原性／免疫原性に影響を及ぼさないいかなる望ましくないS-S架橋も回避するために、二つのCys残基がSerに変化して、二つのGly残基が柔軟性のために両側に付加された
という点において改変した。BstBIによる消化によってランダムM2eインサートを含有する得られた遺伝子ライブラリーからKanr遺伝子を除去した（段階13）。
【００８５】
一つのアプローチにおいて（図2におけるアプローチA）、M2eがウイルスprM、E、およびNS1遺伝子に無作為に挿入されたChimeriVax（商標）-JE-flu鋳型cDNAライブラリーを産生するために、段階9からの変異体遺伝子ライブラリー（ランダムPmeI部位を含有する）を、段階1〜3からの改変pBSAプラスミドにクローニングする。しかし、本発明者らが最初に段階10からのpBSA-AR3-rPmeIライブラリーにM2e/Kanrカセットを挿入しようと試みたところ、Kanの存在下で生育させた得られたpBSA-AR3-rM2e/Kanライブラリーにおける細菌クローン数は低かった（段階11）。それにもかかわらず、このアプローチによって、任意の免疫原性エピトープ（たとえば、マラリア寄生虫、TB、ウイルス病原体等からの）を含有するライブラリーを迅速に構築することができる。
【００８６】
もう一つのアプローチ（アプローチB）において、終止コドン／フレームシフト改変を最初に、サブクローニングしたprM、E、およびNS1遺伝子に導入し（段階14）、ウイルスにとって致死的な変異を含有する改変された遺伝子をpBSA-AR1-3プラスミドに導入した（段階15）。これは、最終的なChimeriVax（商標）-JE-flu鋳型ライブラリーにおいて混入する非変異体鋳型が一定比率存在することにより、細胞のトランスフェクション後に非変異体ChimeriVax（商標）-JEが出現する可能性を消失させるために行った。ChimeriVax（商標）-JE-fluウイルスに関する最終的な完全長の鋳型ライブラリーは、段階15からのライブラリーにおける標的遺伝子断片を段階13からのランダムM2eインサートを含有する断片に置換することによって得た（段階16）。
【００８７】
NS1にコンセンサスM2e配列が無作為に挿入されたChimeriVax（商標）-JEウイルスを産生するために、pBSA-AR3-rM2eプラスミドライブラリーをXhoIによって直線化して（XhoI部位はウイルスcDNAの末端に存在する）、SP6 RNAポリメラーゼによってインビトロで転写した（SP6プロモーターはウイルスcDNAの上流に存在する）後、Vero細胞のトランスフェクションを行った。トランスフェクション後3〜6日目の細胞障害効果が最初に検出可能または明白となった場合にウイルス子孫を採取した。採取した試料におけるウイルス力価を、全てのプラークを検出するためにマウス高免疫抗JE腹水（ATCC）を用いる、またはMabによって認識可能なM2eペプチドを発現するプラークのみを検出するために、インフルエンザM2eエピトープに対する市販のモノクローナル抗体（Mab）14C2を用いる、メタノール固定単層の染色によるプラークアッセイ法（メチルセルロース重層）によって決定した。全体的な力価は、7 log10 pfu/ml過剰であった。M2e陽性プラークは、容易に検出可能でり、総プラークの0.4％まで示した（図3Aおよび3B）。これらのM2e陽性プラークのいくつかは、M2e陰性プラークと同じ大きさであり、有効なウイルス複製を示している。総プラークの大部分はM2e陰性であり、これはNS1におけるランダム位置のいくつかでの挿入が不安定であるために、トランスフェクション後まもなく非変異体ChimeriVax（商標）-JEウイルスが出現したためであると考えられる。または、インサートは、存在するが抗体に近づけない可能性がある。
【００８８】
いくつかの技術を用いて個々の陽性ウイルスクローンを単離することができる。本発明者らは、プラーク精製をMAb染色（イムノフォーカスアッセイ法）と組み合わせた。このアッセイ法において、ウイルスの連続希釈液によって感染させたVero細胞にアガロースを上層した。5日目、アガロースを除去して、細胞の単層（たとえば、ペトリ皿において；図3C）をメタノールによって固定して、MAbによって染色する。次にアガロースをペトリ皿と整列させて、陽性M2eプラークに対応するゲルの部分を採取して凍結する。または、細胞単層をメタノール固定を行わずにMabによって染色した。陽性プラークにおける細胞を注意深くプラスチックから掻き取って凍結した。この技法を用いて候補ウイルスクローンほぼ80個が単離されており、さらに1〜2ラウンドのプラーク精製によってさらに精製する。本発明者らが用いたもう一つの方法は、起こりうる最高希釈（理想的には一つの陽性ウイルス粒子に感染した）で陽性ウェルを同定するために、ウイルスの最終希釈、細胞上清の採取、および96ウェルプレートにおける細胞単層のMAbによる染色と組み合わせた。この方法によって、候補クローン37個が得られた。さらなる分析により、これらの一つが純粋なクローンであるように思われるが、残りはなおもM2e陰性ウイルスと混合していることが証明された。
【００８９】
次に、十分に多数のM2e陽性クローン（たとえば、50〜100個）を、マウス血清における抗M2e抗体力価（たとえば、総IgG/IgMまたはアイソタイプIgG1/IgG2抗体を測定するために合成M2eペプチドを用いるELISA）と共にインビトロADCC試験における活性を測定するために、利用可能な動物モデルおよび方法を用いて、マウス（および／またはフェレット）において免疫原性に関して、および野生型インフルエンザウイルスのチャレンジに対する保護効能（長期間保護を含む）に関して試験することができる。遺伝的安定性を、細胞培養（またはインビボ）におけるウイルスの連続継代の後にイムノフォーカスアッセイ法および／またはシークエンシングによって評価することができる。
【００９０】
さらなる開発において、トランスフェクション後に回収されたウイルスから開始する3〜4回のプラーク精製段階の最後の後に、クローン13個のウイルス保存系統をVero細胞における2回の増幅継代によって産生した。これらの増幅された試料をP2研究用ウイルス保存系統と命名した（精製後2回継代）。保存系統の力価は、2.6×106〜1.0×107 pfu/mLの範囲であることが決定された。重要なことに、M2e MAbおよびJE HIAFの双方による染色は、ほぼ同一の力価を産生し（図4）、ウイルス保存系統が純粋であったことを示している。さらに、この結果は、組換え型ウイルスの遺伝的安定性に関する最初の証拠であった。ウイルスが純粋または安定でなければ、非変異体ChimeriVax（商標）-JEウイルスがM2e発現組換え体より速く生育するであろうが、これは明らかに当てはまらなかった。さらに、ウイルスプラークの効率的なM2e染色が、細胞のメタノール固定を行う場合（細胞内および表面タンパク質を検出する）およびメタノール固定を行わない場合（表面タンパク質のみを検出する）の双方について観察された。このように、予想されるようにM2eペプチドを含有するNS1タンパク質は、感染細胞の表面に通常輸送されるが、同様に分泌される可能性も最も高かった。したがって、NS1は、エピトープの効率的な表面／細胞外提示を可能にし、これはインビボでの頑健な抗M2e抗体反応の誘導にとって非常に望ましい。
【００９１】
クローン13個のNS1遺伝子（図4におけるA11〜A92）をシークエンシングして、そのM2eインサートの位置を決定した。驚くべきことに、アミノ酸35個のインサートはクローン13個全てにおいて正確に同じ部位に、すなわちウイルスNS1アミノ酸残基236位と237位の間のChimeriVax（商標）-JEウイルスゲノムのヌクレオチド3190位の後の、NS1タンパク質のC末端半分に存在することが見いだされた。インサートおよび周辺のNS1ヌクレオチドおよびアミノ酸残基の正確な配列を図5に示す。
【００９２】
13個全てのクローンにおいてインサートが同じ位置に存在する最も可能性が高い説明は、CPEが観察されるVero細胞のトランスフェクション後6日までに採取されたウイルスからクローンがプラーク精製されたことである。異なる最初の変種（異なる位置でインサートを有する）間の競合が、採取する前のウイルス複製の間に起こり、一つの変種がウイルス集団において優勢となる可能性がある。したがって、採取したクローン13個は、一つの挿入変種を示した。
【００９３】
変種間の競合の問題を克服するために、さらなるクローンを、トランスフェクションの直後に行ったプラーク採取によって調製することができる（たとえば、必要であればより免疫原性の高いワクチン候補体を発見するために）。この後のアプローチにおいて、Vero細胞に、インビトロで合成したRNAをトランスフェクトさせて、アガロースを直ちに上層した後、M2e抗体による細胞の染色およびアガロースからの陽性クローンの採取を行った。本発明者らは、インビトロでpBSA-AR3プラスミドライブラリーを転写することによって（図2）、またはプラスミドpUC-AR03-rM2e（pBSA-AR3ライブラリーより代表的であることが見いだされた）からのNS1-M2e遺伝子ライブラリーのpBSA-AR3-stopベクターへのインビトロライゲーションによって産生された、トランスフェクションのためのRNA転写物を用いてこれを試みた（図2）。アガロースの重層を、4〜5日目に除去して、細胞の単層をM2e MAbによって染色した。様々な大きさの多数の陽性ウイルス増殖巣が観察された。インビトロDNAライゲーション段階を用いて得られたRNAをトランスフェクトしたVero細胞の染色されたペトリ皿の例を、図11に示す。いくつかのより大きい陽性プラークに対応するアガロースの部分を採取した後、さらなるラウンドのプラーク精製によってさらに精製した。興味深いことに、新規変種をシークエンシングしたところ、それらはA25ウイルスと同じM2e挿入位置を有した。これによって、NS1タンパク質における非常に許容性のある部位としてNS1-236が同定され、これは非常に効率よく複製する挿入変種体を生じ、最大のプラークを産生する。それにもかかわらず、図11における増殖巣の様々な大きさから判断すると、M2eインサートが、NS1内の異なる位置で介在することは明確であるように思われる。中間または小さいプラークを形成するいくつかのより効率の低い複製変種は、実際的な価値があるように思われる。
【００９４】
本発明者らはまた、A25クローンのM2eインサートの末端に存在するBstBI制限部位（図5）を用いて、このNS1位置で第二のインフルエンザ保護的エピトープを付加した。たとえば、本発明者らは、柔軟性のために（図13Aにおいて略図で示される）2×Glyリンカーによって隣接されたH5N1トリインフルエンザからのM2eエピトープを組み入れて、生存ウイルスを得た。このように後者の挿入変異体は、ヒトインフルエンザM2eの後にトリインフルエンザM2eの縦列を含有する。このウイルスは、ヒトインフルエンザA株およびトリインフルエンザの双方から集団を保護することができる万能ワクチンとなりうると考えられる。この構築において、A25ウイルスからのヒトM2eインサートを有するNS1遺伝子を最初に、逆遺伝学によってChimeriVax-JE感染クローンにクローニングした。次に、二つのアニーリングしたリン酸化オリゴヌクレオチドからなる二本鎖DNA断片をBstBI部位でクローニングすることによって、トリM2e配列を付加した。M2eヒト/M2eトリウイルスの二つのバージョンを構築し、すなわち一つのバージョンはH5N1インフルエンザの本来のM2e配列（最後から2番目のCysがSerに変化していることを除く。図13Bの上のパネルに示した配列）であり、他の一つは、上流のヒトM2e配列（図13Bにおいて下のパネルに示される配列）とのヌクレオチド配列類似性を最小限にするために、本来のH5N1コドンが縮重コドンに置換されたバージョンであった。後者は、ヒトM2eおよびトリM2e配列の間での組換え型ウイルスにおける相同的組換えの機会を低減させるために行われ、これによってウイルスのより高い遺伝的安定性が得られるはずであった。構築されたウイルスのプラークをJEおよびM2e特異的抗体によって染色した（図13C）。プラークの大きさは、A25親ウイルスと比較していくぶん低減された。トランスフェクション後直ちに回収したP1ウイルスの力価は、妥当に高かった（〜5 log10 pfu/ml）。ウイルスはVero細胞においてさらに継代されていないが、P2での力価は、P1と比較してChimeriVax構築物に関して通常高いことから、P2およびその後の継代において、より高い力価が予想されうる。この実験は、より短いインサート（A25ウイルスにおけるアミノ酸35個のM2eエピトープ）を用いて、同定された挿入部位により長いインサート（この場合は、トランスポゾンからのいくつかの余分の残基を有する長さがアミノ酸56個）を組み入れることができることを明らかに示している。NS1-236挿入部位は、アミノ酸少なくとも56個のインサートを容認する。もう一つの重要な結論は、トリM2e配列をヒトM2e配列に付加すると、A25ウイルスと比較してNS1-236位置で全体的なインサート配列（およびおそらく構造）が変化した点である。これは、この挿入部位が広く許容性であるという第一の実験的証拠であった。
【００９５】
さらに、HA0インフルエンザAエピトープを類似の縦列でM2eと組み合わせることができる。HAタンパク質からのウイルス中和エピトープまたはCTLエピトープのような他のインフルエンザウイルスエピトープを、M2eと共に用いることが含まれる、この位置で（またはNS1もしくは他のウイルスタンパク質におけるいくつかの他の位置で類推によって）単独または様々な組み合わせで挿入することができる。
【００９６】
NS1-236挿入部位の広い許容性をさらに証明するために、様々なH3インフルエンザ株（Bui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:246-251, 2007）に対する保護を提供することができるインフルエンザH3ウイルスの
直線状の保護エピトープ（HAタグエピトープとも呼ばれる）をNS1-236残基の後に操作して、標準的な二プラスミド法を用いて組換え型ウイルスを生成した。エピトープは、柔軟性のために両側で二つのGly残基に隣接され、そのCys残基はSerに変化した。回収された生存ウイルスのインサート配列を図17Aに示す。ウイルス（Vero細胞）のプラークを抗HAタグMAb 12CA5（図14B）によって染色した。このように、M2eエピトープのランダム挿入によって見いだされるNS1-136挿入部位は、全く異なる配列を有するエピトープ（たとえば、HAタグ）によって許容される。M2e挿入と同様に、本実施例はまた、HAタグがB細胞と共にT細胞インフルエンザウイルスエピトープの双方を表すことから、B細胞エピトープのみならず、T細胞エピトープの挿入を証明する（Bui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:246-251, 2007）。
【００９７】
ChimeriVax（商標）-JE-NS1/M2eウイルスの細胞培養における遺伝的安定性、および生育の速度論
継代2（P2；プラーク精製3サイクルおよび増幅継代2回後に産生された研究用ウイルス保存系統）において7 log10 pfu/mLの最高力価を有するクローンA25ウイルス（図6、パネルA）のNS1遺伝子を、さらなる生物学的特徴付けのために用いた。M2eの効率的な発現を、M2e MAb（JE抗体と共に）によって特異的に染色したA25感染細胞の免疫蛍光によって図6Dにおいてさらに図示する。
【００９８】
ウイルスがインビトロで遺伝的に安定であるか否かを決定するために、これをワクチン産生に関して認定されるVero細胞において、推定MOI 0.001 pfu/mLでP12レベルまで10回継代した。P12ウイルスを、M2e MAbまたはJE HIAFによるイムノフォーカスアッセイ法において染色したところ、全てのプラークが双方の抗体によって染色され、8 log10 pfu/mLの同じ力価を生じた（図6B）。このことは、継代12でのウイルスがそのインサートを安定に維持することを証明した。
【００９９】
ウイルスが進行的により細胞障害性となり、P12レベルでのプラークはP2でのウイルスのプラークより大きいことから、何らかのVero細胞適合が継代の際に起こった。P12ウイルスプラークの平均直径は、ChimeriVax（商標）-JEベクターウイルスのそれと同等となった。P12ウイルスの完全なゲノムをシークエンシングしたところ、ヌクレオチド8個の変化が検出された（表4）。四つの変化によってアミノ酸置換が起こった：Eタンパク質において残基E-357でValからAla、NS4B-95においてMetからVal、およびM2eペプチドから直ちに上流の二つの置換（NS1-235でSerからLeu、、および残基linsにおいてPheからLeu）。後者の適合のいくつかは、プラークの大きさの増加およびよりよいウイルス複製の原因であったに違いない（以下を参照されたい）。これらの変化はいずれも、ChimeriVax（商標）-JEワクチンにおける弱毒化マーカーの復帰変異ではない（他の三つのクローンにおける変異、A11、A79、およびA88を同様にP12まで継代してシークエンシングしたところ、M2eインサートを安定に維持することが見いだされ、これも同様に表4に示す）。
【０１００】
P2およびP12レベルでのA25クローンの生育速度論をVero細胞におけるChimeriVax（商標）-JE親ベクターウイルスと比較した。一つの代表的な実験の結果（MOI 0.001）を図6Cに示す。P2ウイルスは効率よく生育するが、ChimeriVax（商標）-JEよりいくぶん遅く、ベクターウイルスと比較して1日遅れの6日目をピークとした。対照的に、P12ウイルスは、7 log10 pfu/mLの過剰量でChimeriVax（商標）-JEより高い力価で5日目をピークとした。P12ウイルスのより効率的な複製はMOI 0.1において顕著であった。このように、A25クローンは、Vero細胞において10回継代後により効率的に複製した。P12において見いだされた配列変化のいくつかは、組換え型ワクチンウイルスの高収率製造にとって有益となる可能性がある。
【０１０１】
ChimeriVax（商標）-JE/flu組換え体の免疫原性および保護的効能を分析するためのマウスモデルを確立するためのChimeriVax（商標）-JE-NS1/M2e A25ウイルスを用いる予備実験
任意のウイルスワクチンベクター、特に齧歯類が天然の宿主ではないもの（たとえば、YF、YF17Dの野生型プロトタイプの天然の宿主はサルおよびヒトである）に関して、関連するおよび有用な小動物モデルの確立は難しい。そのようなモデルでは、様々な形状で外来抗原を発現する多数の組換え型ウイルス構築物の相対的免疫原性を比較することが可能であるはずである。ChimeriVax（商標）-JE-NS1/M2eに関する最適な免疫経路を決定するためおよび免疫原性の予備的な証拠を得るために、5週齢のBalb/cマウス（N＝10）をA25クローンの5 log10 pfu/用量によって皮下（SC）または腹腔内（IP）に免疫した（それぞれ、1群および2群；表5）。陽性対照群3には、大腸菌において産生された表面にM2eペプチドを含有するB型肝炎コア粒子10 μg（HBc-M2e；Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004）の皮下用量をアラムアジュバントと共に投与した。この群を同様に20日目に追加免疫した。陰性対照群4および5をChimeriVax（商標）-JEベクター（5 log10 pfu）によって免疫するか、または偽免疫した（希釈体）。
【０１０２】
ウイルスを接種した群の個々の動物におけるウイルス血症を、1、3、7、9、および11日目に採取した血清において決定した。A25ウイルスはいずれの経路によっても検出可能なウイルス血症を引き起こさなかった。ChimeriVax（商標）-JEウイルスを接種した動物10匹中2匹が、低レベルウイルス血症（50および275 pfu/mL）を1日目のみに示したが、これは接種したウイルスを表した可能性が大きい。このように、A25ウイルスは、いずれの経路によっても顕著な全身感染症を引き起こすことができなかった。
【０１０３】
38日目に全ての動物から採血して、各群に関する血清のプールにおいて抗M2e抗体反応をELISAにおいて決定した。ウイルス免疫群において、低レベル反応は、総IgGおよびIgG2a力価が100であった（および検出可能なIgG1を示さなかった）2群（A25 IP）においてのみ検出されたが、3群（HBc-M2e SC/SC）における力価は予想通りに高く、総IgG、IgG1、およびIgG2aに関してそれぞれ218,700、218,700、および24,300であった。この理由から、1、2および4群を40日目にそれぞれのウイルスの5 log10 pfuによって追加免疫して；1群はSCによって追加免疫したが、他の群はIPによって追加免疫した（5群にはまた、希釈剤のIP用量を投与した）。2週間後（54日目）、動物から再度採血して、血清のプールにおいてM2e抗体反応を測定した（表5）。A25ウイルスの追加免疫によって、2群（A25 IP/IP）において抗体力価の劇的な増加が起こった。この群における総IgG力価は、2,700まで約30倍増加した。3群（HBc-M2e）において、総IgG力価は72,900であった。総IgGに関する450 nmでのODの読み取りを、図7において2群および3群に関して図示する。重要なことに、HBc-M2e免疫によって主にIgG1反応が起こるが、A25ウイルスによって誘導されたほぼ全ての抗体がIgG2aサブクラスの抗体であった（表5）。IgG2a抗体はADCCの主なメディエータであり、これはインフルエンザ感染症に対するM2e誘導保護の主な機構であると考えられている。このように、ChimeriVax（商標）-JE/flu組換え体の免疫原性を測定するための効率的なマウスモデルは、IP免疫後のIP追加免疫に依存して確立されている。
【０１０４】
55日目に、動物に高用量のLD50の20倍量のマウス適合A/PR/8/34インフルエンザウイルスを鼻腔内に（IN）チャレンジした。この用量は、HBc-M2e試験において用いられたLD50の4倍量の標準的なチャレンジ用量と比較して5倍高い。この予備実験において、本発明者らは、M2eをChimeriVax（商標）-JEウイルスベクターによって送達した場合に、免疫後のM2e抗体力価がより低い場合であっても、HBc-M2e免疫と比較してより効率的な保護が可能であるかという疑問に答えるために故意に高用量を選択した。理論的に、これは、抗原提示細胞の非特異的ウイルス刺激、CTL反応（M2eペプチドはCTLエピトープを含有する）、頑健なT細胞の助けの誘導と共に、生得の免疫の何らかの機構のためであると考えられる。チャレンジ後の生存曲線を図8に示す。予想されるように、チャレンジ用量を投与すると、HBc-M2e免疫動物の生存は不完全であった（50％）。A25ウイルスをIP/IPによって免疫した2群において生存した動物2匹は、二つのA25-免疫群において最高のM2e抗体力価を有した（20％生存）。1群（A25 SC/SC）では動物1匹が生存した。陰性対照群4および5における動物は全て死亡した。これらのデータから、保護レベルとM2e抗体力価の間には、動物が組換え型ウイルスまたはサブユニットワクチンによって免疫されたか否かによらず、明確な相関があるように思われる。しかし、ウイルスによってマウスに送達されたM2eの実際のμg量は不明であり、これはこのモデルにおけるウイルスの限定的な複製により非常に低かった可能性があることから、上記の機構のいくつかは、A25免疫において役割を有する可能性があることに注意すべきである。この局面は、より効率的な末梢的なウイルス複製が予想されるハムスターモデルにおいて取り組むことができる。霊長類／ヒトにおいてChimeriVax（商標）-JE（と共に他のChimeriVax（商標）およびYF 17Dワクチン）は、〜2 log10 pfu/Mlのピークウイルス血症力価で比較的効率的な全身感染症を引き起こす。このように、比較的低用量のウイルスの1回接種後に、頑健なM2e反応およびインフルエンザに対する保護が予想される。
【０１０５】
A25ウイルスを用いるマウス実験2
より若い4週齢のマウス（二つの販売元から）およびA25ウイルスのより高いIP用量（7 log10 pfu/ml）を用いて、A25ウイルスに関してさらなるマウス実験を行った。実験デザインを表6に示す。ほとんどの群において、A25 P2ウイルス保存系統を用いた（これは前回の実験においても用いた）。この実験にはまた、上記のVero細胞適合A25 P12ウイルスを接種した1群（#5）が含まれた。陰性対照は、ChimeriVax-JEおよび希釈剤（2、4、および7群）であった。陽性対照Taconicマウスには、アラムアジュバントと混合したHBc-M2e粒子（Acam-Flu-Aと呼ばれる）をSC接種した。Jacksonマウス群において、A25ウイルスとAcam-Flu-Aの間の相乗効果を試験するために二つの群を作製した。8群にはIP経路によってアジュバントなしAcam-Flu-Aのみを投与し、9群にはA29と混合したAcam-Flu-Aを同様にIP投与した。マウスを全て、初回接種後1ヶ月目に追加免疫して、59日目に、M2e特異的抗体力価（総IgG、およびIgG1、IgG2a、IgG2b、およびIgG3タイプ）を、各群に関して個々の血清（総IgGに関して）、または血清のプール（IgGアイソタイプに関して）においてELISAによって決定した。M2e特異的総IgG力価も同様に30日目（追加免疫前）に決定した。ELISA力価を表7に示す。GMT値を、個々の血清において決定した総IgGに関して与える。データは、A25免疫動物が有意により高いM2eペプチド特異的抗体力価を有したことを除き、前回のマウス実験と一致した。ほとんどのA25およびAcam-Flu-A接種動物は、初回投与後に30日目に血清変換した。59日目に（追加免疫後〜1ヶ月）、A25およびAcam-Flu-A群の動物は全て血清陽性であり、総IgG力価は30日目と比較して劇的に増加した。予想されるように、Acam-Flu-A／アラムアジュバント免疫（3群）によって、主にTh2型の反応が起こり、IgG1力価は他のIgGアイソタイプと比較して最高であった。A25による免疫（1、5、および6群）によって、より高いIgG2a力価に関連する主にTh1型の反応が起こり、これはADCC機構によるM2e媒介保護にとって望ましい型である。同様にADCCに関係しているIgG2bおよびIgG3抗体が検出された（Jegerlehner et al., J. Immunol. 172:5598-5605, 2004）。このこともまた、ChimeriVax-JEのNS1-236部位に挿入されたM2eエピトープの高い免疫原性を証明した。
【０１０６】
この実験における重要な知見は、Acam-Flu-AをA25ウイルスと同時接種すると、Acam-Flu-AまたはA25ウイルス単独の接種と比較して、抗M2e抗体反応が有意に増加したことであった（表7において、9群を8および6群と比較して）。59日目に、総IgG GMTは9および8群に関してそれぞれ、95,940および35,050であった（比例した差は30日目においてさらにより顕著であった）。このように、同時接種の強い相乗効果が観察された。その上、Acam-Flu-A単独はほとんどTh1型反応を誘導したが（IgGl、IgG2a、IgG2b、およびIgG3の力価はそれぞれ、72,900、8,100、300、および900）、Acam-Flu-AとA25ウイルスを同時接種すると、IgG1のより低い比率によって証明されるように明白なTh2シフトが起こり、他の抗体アイソタイプの有意により高い比率が得られた（IgGl、IgG2a、IgG2b、およびIgG3の力価はそれぞれ、72,900、72,900、8,100、および8,100）。A25接種単独では中等度の免疫応答が得られたことから（Jackson balb/cマウスにおいて、表7における6群を参照されたい）、相乗効果は、同時接種動物においてA25ウイルスによる抗原（M2e）量の増加のみに帰因することはできない。これらの効果はまた、たとえば接種部位における樹状細胞における、ウイルスの複製のアジュバント効果による可能性があった。そのようなアジュバント効果はアルファウイルスレプリコンに関して報告されている（Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:3722-3727, 2006；Hidmark et al., J. Virol. 80:7100-7110, 2006）。
【０１０７】
ChimeriVax-JEのEタンパク質に無作為に挿入されたM2eの発現
M2eが、ウイルス粒子の表面においてChimeriVax-JEベクターのEタンパク質に無作為に挿入されて発現されうるか否かを決定するために三つの実験を行った。第一の実験において、pBSA-AR2-rM2eプラスミドライブラリーにおいてSP6 RNAポリメラーゼによってRNAを合成した（図2における段階16）。lipofectamineを用いて、Vero細胞にRNAをトランスフェクトした。採取された細胞上清には非変異体ウイルスプラークのみが観察され、これは、M2e MAbによって染色されなかった。おそらく、NS1におけるランダム挿入の場合と同様に、M2eインサートを有しないウイルスが、Eにおける不安定な位置での挿入により急速に出現して、優勢となった。第二の実験において、E-M2e遺伝子ライブラリーをNsiIおよびKasIによってpUCAR02-rM2eから抽出して（図2における段階13）、インビトロでpBSA-AR2stopベクターにライゲーションした（図2、段階15）。ライゲーション産物をXhoIによって直線化して、インビトロで転写した。Vero細胞を合成RNAによって電気穿孔処理して、トランスフェクトした細胞浮遊液を連続希釈して（非変異体とM2e陽性ウイルスとの干渉を低減するため）、細胞希釈液をペトリ皿に播種した。細胞単層が確実にコンフルエントとなるように、トランスフェクト細胞のより高い希釈液を播種した培養皿に、非トランスフェクトVero細胞を加えた。接着後、細胞単層に寒天を重層した。単層をM2e Mabによって6日後に染色すると（アガロース重層の除去後）、より高いトランスフェクト細胞希釈液において（1：4および1：8）いくつかの陽性増殖巣が観察された。増殖巣の一例を図12Aに示す。増殖巣の数およびその大きさはNS1-M2eライブラリーのトランスフェクションについて観察されたもののいくつかと比較して小さく、このことはNS1と比較して、長さがアミノ酸35個のインサート（pUC-AR02-rM2eにおいて用いられる；図5と同じ）をEタンパク質に挿入することがより難しい可能性があることを示している。第三の実験において、二つの相補的リン酸化プライマーをアニーリングすることによって、より短いM2eインサート（SLLTEVETPIRNEWGSR）を産生した。インサートのヌクレオチド配列は以下のとおりである。
【０１０８】
同じインサートであるが柔軟性のために二つの余分のGlyリンカー残基を両側に含有するインサート（全長アミノ酸21個）を同様に産生した。第二のインサートのヌクレオチド配列は以下の通りである。
【０１０９】
二つのインサートをトランスプライマーの代わりにpUC-AR02-rTn7enrライブラリー（段階8、図2）の平滑PmeI部位にライゲーションした。ベクタープラスミドDNAをライゲーションの前に脱リン酸化した。二つの新しいプラスミドライブラリーpUC-AR2-17M2eおよびpUC-AR2-17gM2eをそれぞれ産生した。二つのライブラリーのNsiI-KasIインサートをpBSA-AR2stopベクターにトランスフェクトすると、pBSA-AR2-17M2eおよびpBSA-AR2-17gM2e完全長ライブラリーが得られ、これらをインビトロ転写のために用いた。後者の二つのライブラリーをまず、PmeIによって消化して、インサートを含有しないいかなる完全長の鋳型DNA分子も消失させた（インサート含有分子において、インサートの両側のPmeIクローニング部位は切除される）。次にそれらをXhoIによって直線化して、SP6 RNAポリメラーゼによって転写した。Vero細胞を転写物によって電気穿孔処理して、ペトリ皿に希釈せずに播種して、細胞が接着した後アガロースを重層した。無インサートウイルスによる干渉を回避するために、単層をM2e Mabによって早期に、トランスフェクション後4日目に染色した。〜100個までの小さい増殖巣が二つのトランスフェクションにおいて観察された。そのような増殖巣の例を、Eタンパク質におけるアミノ酸17個のM2eインサート、およびGG-アミノ酸17個-GGインサートを含有するChimeriVax-JEウイルスに関してそれぞれ、図12AおよびBに示す。このように、アミノ酸35個のインサートをアミノ酸17または21個に短縮することによって、組換え型ウイルスの回収は有意に増加したように思われる。観察されたM2e陽性変種のいくつかは、単離された後、妥当に良好に複製することが可能である。必要であれば、より効率的に複製する変種をさらなるトランスフェクションから単離することができる。さらに、生育を改善するいくつかの第二の部位の変異が起こることを予想して、ゆっくり複製する変種を、たとえばVero細胞において連続継代することができる。本実施例は、Eタンパク質に外来免疫学的エピトープを無作為に挿入する可能性を明らかに証明する。
【０１１０】
ChimeriVax-JEベクターウイルスのprMタンパク質におけるM2eエピトープのランダム挿入
ウイルス糖タンパク質（prM、E、またはNS1）における異なる発現様式を図15に図示する。Eタンパク質に挿入されたエピトープはウイルス粒子の表面に提示され（180コピー）、したがって最も免疫原性であると予想されうる。NS1タンパク質における発現は、挿入されたエピトープを感染細胞の表面に送達すると共に、分泌されたNS1オリゴマーに細胞外に送達する。後者の様式の免疫原性が高いことは上記の実験例において証明されたが、この場合はEにおける発現と比較してより低い可能性がある（いくつかのエピトープにとってなおも十分に高い、たとえばウイルス中和抗体エピトープは、インフルエンザのM2eのような非中和エピトープと比較してかなり強い保護を提供する）。prMにおける発現によって、フラビウイルス粒子の成熟プロセスにおけるフリンによるprMの不完全な切断という公知の現象により、ウイルス粒子表面の部分的提示が起こり、フリン切断によって生成されたprMの分泌されたN末端部分内でさらなる細胞外提示が起こると考えられる。この発現様式はまた、非常に免疫原性であり、NS1における発現より免疫原性が強いと予想される。エピトープを成熟Mタンパク質（prMのC末端部分）に挿入することができる場合、エピトープ分子は全て、Eにおける発現と同様に、ウイルス粒子（180コピー）の表面に提示される可能性がある。
【０１１１】
M2eエピトープ（インサートの全長はアミノ酸35個）をSphI部位とNsiI部位（SphIは、prM遺伝子の開始から上流に位置する）の間のChimeriVax-JEのprMに挿入するために、pBSA-AR1-rM2eプラスミドライブラリーを構築した（図2）。このライブラリーの代表的なものは、コロニー〜105個であった。これをインビトロ転写のための鋳型として用いて、得られたRNA転写物を用いてlipofectamineによってVero細胞単層をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞にアガロースを重層して、細胞単層を5〜6日目にM2e MAbによって染色した。M2e陽性プラークを観察した。陽性プラークに対応するM2e陽性ウイルスクローンを、アガロース重層から採取して、さらなるプラーク精製ラウンドにおいてさらに精製した後、2回増幅継代を行って、M1、M2、M3、M6、およびM8と呼ばれる純粋なウイルス保存系統5個を調製した。
【０１１２】
新しい組換え型クローンは全て、M2eおよびJE抗体によって効率的に染色されたが、ChimeriVax-JEベクターウイルスプラークはJE抗体のみによって染色された。標準的なプラークアッセイ法（メチルセルロース重層）において5日目に染色されたプラークの例を図16Aに示す。M1、M2、およびM3挿入変異体のプラークはChimeriVax-JEと比較して大きかったが、M6およびM8クローンのプラークはより小さかった（プラークの大きさにおけるこの差は、アガロース重層下ではより顕著であった）。このように、M1-3クローンはベクターウイルスと比較してインビトロでよりよく複製することが可能であった。このことを生育曲線実験において確認した（図16B）。M1-3クローンは、ChimeriVax-JEより速やかに生育してより高いピーク力価を産生したが、M6およびM7の力価はわずかに低かった。
【０１１３】
挿入の位置をクローンにおいてシークエンシングによって決定した。結果を図17に示す。興味深いことに、M2eインサートは、クローンM1、M2、およびM3においてChimeriVax-JEウイルスのJE特異的prMのちょうどN末端であるが、異なるアミノ酸で付加された。クローンM6およびM8における位置は同じであった（ウイルスORFにおける147位のPro残基の後；またはprM-26）。ChimeriVax-JEウイルスにおいて、prMのN末端（MKLS....）は宿主細胞のシグナラーゼ切断によって形成される（図17）。クローンM1、M2、およびM3においてそれぞれ、インサートをJE prMの開始から上流の4、1、および2アミノ酸残基に組み入れた。このように、これらのウイルスにおいて、変異体prMのN末端は、M2eペプチド配列を含有して、その後に本来のprM配列の前に4、1、または2ウイルス残基が続き、その後にprM配列が続く。変異体における新しいシグナラーゼ切断部位を、二つの異なるアルゴリズムを用いて一般的なSignalP 3.0オンラインプログラムによって予測した（図17に示す）。M1クローンにおいて、起こりうる二つの切断は、M2eの一つまたは三つのN末端アミノ酸を除去する可能性がある。M2において、強く予測されるように、一つの切断によって、N末端Glyの後に完全なM2e配列が続くことが起こるであろう。M3において、N末端はM2と同じであるか、またはM2e残基の三つがもう一つの起こりうる切断によって切断される可能性がある。三つのクローンのプラークがM2e MAbによって効率的に染色されたという事実は、M1およびM3における切断がM2e残基の消失が最小で起こったことを示唆する。重要なことに、M1-3クローンに関して予測されるシグナラーゼ切断可能性は、ChimeriVax-JEと比較して高かった（たとえば、M2クローンに関して0.387対ChimeriVax-JEに関して0.073）。これは、M1-3ウイルスがChimeriVax-JEの親より良好に生育する理由を説明する可能性がある。
【０１１４】
このように、prMタンパク質は、様々な位置での挿入、特にそのN末端残基での挿入に関して非常に許容性である。記載の結果（より大きいプラーク、Vero細胞におけるより効率的な複製、M1-3クローンにおけるより高い予測シグナラーゼ切断可能性）に基づいて、本発明者らは、フラビウイルス粒子のアセンブリにとって重要でないように思われるprMのN末端が、広い許容性のある挿入部位であり、長いインサート（たとえば、アミノ酸50、100、200、400個等）が含まれる様々な他のインサートを認容するであろうと考える。このように、本発明者らは、この位置で、HIV gag、HPV 16 L2タンパク質の最初の200残基までを含むペプチド、インフルエンザHA1、および完全長のHA（長さがアミノ酸〜550個）を挿入している。これらは、N末端もしくはprM（M1-3クローンにおけるM2eの場合と同様に）に融合した、またはベクターウイルスprM配列の前にさらなるシグナル、適切なプロテアーゼ切断部位、もしくはオートプロテアーゼの組み込みによってprMから切断される異種配列を含有するように設計される。
【０１１５】
A25ウイルスのChimeriVax-WN類似体の構築（NS1-236でM2e挿入を有するChimeriVax-JE）
ChimeriVax-JEウイルスは、上記のA25ウイルスと共に、マウスにおいて効率よく複製しない（たとえば、検出可能な接種後ウイルス血症を生じない）。それにもかかわらず、ChimeriVax-JEはヒトにおいてよりよく複製し（〜2 log10 pfu/mlウイルス血症）（Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003）、このようにA25ウイルスはヒトにおいて高いM2e抗体反応を誘導して、それらをインフルエンザ感染から保護することができるであろう。本発明者らは最近、ChimeriVax-WNウイルス（WN02ヒトワクチン型；WO2004/045529）が、ハムスター（〜3 log10 pfu/mlウイルス血症）（WO 2006/116182 A1）と共に、ヒトにおいても（〜2 log10 pfu/mlウイルス血症）非常に良好に複製することを証明した（Monath et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:6694-6699, 2006）。より頑健なモデル（ハムスターにおけるChimeriVax-WN02対マウスにおけるChimeriVax-JE）を用いてChimeriVaxウイルスのNS1-236部位で発現されたM2eエピトープによる保護のさらなる証拠を得るために、A25ウイルスのChimeriVax-WN02/M2eNS1-236類似体を構築した。完全長のChimeriVax-JE cDNAを含有するpBSAプラスミドにおけるJE特異的prM-E遺伝子を、標準的なクローニング技術を用いてChimeriVax-WN02ウイルスのprM-E遺伝子に置換した。これによって、pBWN02プラスミドが得られた（図18）。A25ウイルスからのM2eインサートを有するNS1遺伝子（M2e配列からのすぐ上流で二つのVero細胞適応を有するまたは有しない。表4）をpBWN02にクローニングした。得られた二つのプラスミドをインビトロで転写して、Vero細胞にRNA転写物をトランスフェクトして、寒天を上層した。非常に大きいプラークが6日目に観察され、これはM2e MAbによって染色された（図18、下のパネル）。
【０１１６】
二つのバージョンのChimeriVax-WN02/M2eNS1-236、すなわちWN02/A25およびWN02/A25adaptを一度プラーク精製して、クローニングしたウイルスの保存系統をVero細胞におけるさらなる増幅によって調製した。ChimeriVax-WN02およびChimeriVax-JEと比較したプラークの例を図19Aに示す。Vero細胞における新しいウイルスの生育曲線を図19Bに示す。WN02/A25ウイルスは、ChimeriVax-WN02より生育がいくぶん弱かった（ピーク力価はそれぞれ、〜7.5 log10 pfu/ml対〜8.7 log10 pfu/ml）。適合させたA25ウイルスと同様に（図6Cを参照されたい）、WN02/A25adaptバージョン（M2e配列から上流の二つのアミノ酸変化を有する）は、良好に生育し、ChimeriVax-WN02とほぼ同様に生育した。このように、ChimeriVax-JEのNS1タンパク質に当初導入された挿入は、ChimeriVax-WN02ワクチンウイルスに首尾よく転移された。A25ウイルスにおいて当初観察された二つの細胞培養適合は、WN02/A25ウイルスの生育を増強した。
【０１１７】
結論
結論すると、本発明者らは、インフルエンザAに対する非常に有効な万能ワクチンを生成する目的で、インフルエンザAウイルスのコンセンサスM2e保護エピトープを無作為に挿入するために、ChimeriVax（商標）-JEワクチンウイルスのprM/M、E、およびNS1遺伝子のトランスポゾン媒介変異誘発を行うことに成功した。方法の実現可能性は、prMおよびNS1タンパク質において抗M2e抗体によって認識可能な、インサートを含有する多数のウイルス変異体を急速に産生する段階、およびM2eペプチドをEタンパク質に挿入する段階によって証明された。本発明者らはまた、ChimeriVax（商標）-JE-NS1/M2eウイルスのA25クローンおよびChimeriVax（商標）-JE-prM/M2eウイルスのいくつかのクローンがVero細胞において効率よく複製すること、およびこれらのウイルスにおけるM2e挿入部位が同定されたことを示した。同様に、本発明者らは、A25ウイルスがインビトロで低MOI継代10回の間M2eインサートを維持したことから、A25ウイルスが遺伝的に安定であることを示した。本発明の直接のランダム変異誘発アプローチによって同定されたいくつかの挿入部位は、NS1-236位置を用いて例示されたように、インサートの大きさおよび配列の双方に関して広い許容性となりうる。M2e挿入を有するNS1遺伝子をChimeriVax-JEからChimeriVax-WNに転移させることによる本発明者らの実験において例示されるように、一つのフラビウイルスにおいて見いだされる許容性挿入部位を他のフラビウイルスにおいて用いることができる。さらに、マウスにおける免疫原性の分析に関して有効なIPプライミング／IP追加免疫モデルの確立に成功し、一つの挿入変種の高い免疫原性が証明された。IP接種後が含まれるマウスにおける検出不能な末梢的な複製にもかかわらず、ウイルスは、非常に免疫原性であり、主にIgG2a M2e抗体を誘導し、これはM2e免疫によるADCC媒介保護に関して非常に望ましい。本発明者らの実験におけるもう一つの新規発見は、M2eペプチドを発現するウイルス組換え体をサブユニットM2eに基づくワクチン候補体と同時接種した場合の強い相乗効果であった。
【０１１８】
上記で考察したように、本明細書において記載される方法は、他の全てのChimeriVax（商標）標的タンパク質と共に、YF17Dもしくは他の非フラビウイルス生ワクチンが含まれるベクターとしての他の生ワクチンウイルス、または非ウイルスベクター生物に応用可能である。このアプローチを用いて、ヒトの公衆衛生および獣医学的にとって重要な広範囲の病原体に対して組換え型ワクチンを構築することができる。
【０１１９】
構築段階の概要された配列（図2）は変化しうるが、なおも本発明の範囲内であることに注意すべきである。同様に、Tn7以外のトランスポゾンを、ランダム制限部位または外来エピトープのランダム挿入のために用いてもよい。後者と共に、ランダム挿入のためにPmeI以外の制限部位を用いること、もしくは任意の構築段階で異なる選択マーカーを用いること、または生きている変異体ウイルスを単離するために、もしくはインビトロおよびインビボでウイルスを特徴付けするために任意の異なる方法を用いること（たとえば、ウイルス感染細胞からの上清を用いるELISA、または陽性細胞を単離するための細胞ソーティング等）等は、本発明の意味を変化させない。
【０１２０】
（表１）エピトープ／抗原／ペプチドが由来しうる病原体の例の一覧
ウイルス：
フラビウイルス科
黄熱病ウイルス
日本脳炎ウイルス
デング熱ウイルス、1型、2型、3型および4型
西ナイルウイルス
ダニ媒介脳炎ウイルス
C型肝炎ウイルス（たとえば、遺伝子型1a、1b、2a、2b、2c、3a、4a、4b、4c、および4d）
パポウイルス科：
乳頭腫ウイルス
レトロウイルス科
ヒト免疫不全ウイルス、I型
ヒト免疫不全ウイルス、II型
サル免疫不全ウイルス
ヒトTリンパ球向性ウイルス、I型およびII型
ヘプナウイルス科
B型肝炎ウイルス
ピコルナウイルス科
A型肝炎ウイルス
ライノウイルス
ポリオウイルス
ヘルペスウイルス科
単純ヘルペスウイルス、I型
単純ヘルペスウイルス、II型
サイトメガロウイルス
エプスタイン-バーウイルス
水痘-帯状疱疹ウイルス
トガウイルス科
アルファウイルス
風疹ウイルス
パラミクソウイルス科：
呼吸器合胞体ウイルス
パラインフルエンザウイルス
麻疹ウイルス
ムンプスウイルス
オルトミクソウイルス科
インフルエンザウイルス
フィロウイルス科
マルブルクウイルス
エボラウイルス
ロトウイルス科：
ロタウイルス
コロナウイルス科
コロナウイルス
アデノウイルス科
アデノウイルス
ラブドウイルス科
狂犬病ウイルス
細菌：
腸毒素産生性大腸菌（E. coli）
腸病原性大腸菌
カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）
ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）
チフス菌（Salmonella typhi）
コレラ菌（Vibrio cholerae）
クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）
クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）
化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）
百日咳菌（Bordetella pertussis）
髄膜炎菌（Neisseria meningitides）
淋菌（Neisseria gonorrhoea）
レジオネラ・ニューモフィラ菌（Legionella neumophilus）
クラミジア種
ヘモフィルス種
赤痢菌種
寄生虫：
プラスモディウム種
住血吸虫種
トリパノソーマ種
トキソプラズマ種
クリプトスポリジウム種
ニューモシスティス種
リーシュマニア種
【０１２１】
（表２）列記のウイルスからの選択された抗原の例
【０１２２】
（表３）列記のウイルス／抗原からのBおよびT細胞エピトープの例
【０１２３】
（表４）ChimeriVax-JE-NS1/M2eウイルスのクローンA25、ならびにクローンA11、A79、およびA88の遺伝的安定性
ウイルスの全ゲノムをP12遺伝的安定性継代でシークエンシングした。ヌクレオチドの変化／異種遺伝子型およびアミノ酸変化を示す。
1 NS1におけるインサートの位置およびヌクレオチド／アミノ酸の番号付けを図5に示す。
【０１２４】
（表５）54日目でのBalb/cマウスにおけるM2e抗体反応（1、2、4、および5群の追加免疫後2週間）1
1 ウイルスに関して免疫量および追加免疫量は5 log10 pfuであり；HBc-M2eに関して、用量は粒子10μg+アラムであった。
2 3群は20日目で追加免疫したが、1、2、4および5群は40日目で追加免疫した。
【０１２５】
（表６）A25ウイルスを用いるマウス実験#2の設計（二つの販売元からの4週齢雌性balb/cマウス）
ELISA抗体力価を59日目に決定した（追加免疫後約1ヶ月）。
【０１２６】
（表７）実験2のマウスにおけるM2e特異的抗体反応
【０１２７】
上記で引用した全ての参考文献の内容物は、参照により本明細書に組み入れられる。「一つの（a）」および「その（the）」のような本明細書における単数形の使用は、本文がそうではないことを示している場合を除き、対応する複数形を示すことを除外しない。このように、たとえば特許請求の範囲が「一つの」フラビウイルスの投与を示している場合、これもまた、そうでないことを明記している場合を除き、複数のフラビウイルスの投与を含むと解釈することができる。他の態様は添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、異種ペプチドをコードする核酸分子を含むウイルスゲノムを生成するための方法：
（i）標的ウイルス遺伝子を提供する段階；
（ii）標的ウイルス遺伝子を変異誘発に供する段階；および
（iii）異種ペプチドをコードする核酸分子を標的ウイルス遺伝子の変異誘発部位にライゲーションする段階。
【請求項２】
以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
（iv）ウイルス複製を開始するためにゲノム核酸ライブラリーを細胞にトランスフェクトする段階；および
（v）生存ウイルス組換え体を選択する段階。
【請求項３】
標的ウイルス遺伝子がシャトルベクター中に提供され、かつ
標的ウイルス遺伝子の変異誘発部位への異種ペプチドをコードする核酸分子のライゲーション後に、方法が、挿入を含むウイルスゲノムを生成するために、挿入を欠く対応するウイルス遺伝子の代わりに、標的ウイルス遺伝子が由来するウイルスゲノムに変異標的ウイルス遺伝子を導入する段階をさらに含む、
請求項1記載の方法。
【請求項４】
シャトルベクターが、二つまたはそれより多い標的ウイルス遺伝子を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
標的ウイルス遺伝子が無傷のウイルスゲノムという状況で提供され、かつ
方法が挿入を含むウイルスゲノムを生成する、
請求項1記載の方法。
【請求項６】
挿入を含むウイルスゲノムを細胞に導入することによって、挿入を含むウイルスゲノムからウイルスベクターを生成する段階をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞またはその上清からウイルスベクターを単離する段階をさらに含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
二つまたはそれより多い標的ウイルス遺伝子を含む二つまたはそれより多いシャトルベクターを、変異誘発に供する段階、および
挿入を含むウイルスゲノムを生成するために、挿入を欠く対応するウイルス遺伝子の代わりに、標的遺伝子が由来するウイルスゲノムに、一つまたは複数の異種ペプチドをコードする核酸分子を含む二つまたはそれより多い標的ウイルス遺伝子を導入する段階
を含む、請求項3記載の方法。
【請求項９】
変異誘発段階が、トランスポゾン変異誘発による標的ウイルス遺伝子への一つまたは複数のトランスプライマーの導入を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
一つまたは複数のトランスプライマーがエンドヌクレアーゼ消化によって除去され、異種ペプチドをコードする核酸分子が、制限エンドヌクレアーゼ消化部位でのライゲーションによって標的ウイルス遺伝子に導入される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
変異標的ウイルス遺伝子のライブラリーの生成をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
標的ウイルス遺伝子が、本方法に再度供される前に、請求項1記載の方法によって導入される挿入を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスゲノムがフラビウイルスのゲノムである、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
フラビウイルスがキメラフラビウイルスである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
キメラフラビウイルスが、第一のフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質、ならびに第二の異なるフラビウイルスのプレ膜タンパク質およびエンベロープタンパク質を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
第一および第二のフラビウイルスが、日本脳炎、デング-1、デング-2、デング-3、デング-4、黄熱病、マリーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、クンジン、ロシオ脳炎、イルヘウス、ダニ媒介脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポーワッサン、ネギシ、アブセットアローブ、ハンザローバア、アポイ、およびHyprウイルスからなる群より独立して選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
標的ウイルス遺伝子が、エンベロープタンパク質、カプシドタンパク質、プレ膜タンパク質、NS1、NS2Aタンパク質、NS2Bタンパク質、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、およびNS5タンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
異種ペプチドがワクチンエピトープを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
ワクチンエピトープがB細胞エピトープまたはT細胞エピトープである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
エピトープがウイルス病原体、細菌病原体、寄生虫病原体、アレルゲン、または腫瘍関連抗原の抗原に由来する、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
ウイルス病原体がインフルエンザウイルスである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
異種ペプチドが、インフルエンザM2eペプチドまたはインフルエンザ血液凝集素前駆体タンパク質切断部位（HA0）を含むペプチドを含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
インフルエンザウイルスが、トリまたはヒトインフルエンザウイルスである、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
ウイルスゲノムが複数の異種ペプチドをコードする核酸分子を含み、異種ペプチドがヒトおよびトリインフルエンザM2eペプチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
請求項1〜24に記載の方法のいずれか一つによって生成されたウイルスゲノム、またはその相補体。
【請求項２６】
請求項25記載のウイルスゲノムによってコードされるウイルスベクター。
【請求項２７】
カプシドタンパク質、プレ膜タンパク質、エンベロープタンパク質、NS1タンパク質、NS2Aタンパク質、NS2Bタンパク質、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、およびNS5タンパク質からなる群より選択されるタンパク質内に挿入された異種ペプチドを含む、フラビウイルスベクター。
【請求項２８】
フラビウイルスが黄熱病ウイルスである、請求項27記載のフラビウイルスベクター。
【請求項２９】
フラビウイルスがキメラフラビウイルスである、請求項27記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３０】
キメラフラビウイルスが、第一のフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質、ならびに第二の異なるフラビウイルスのプレ膜タンパク質およびエンベロープタンパク質を含む、請求項29記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３１】
第一および第二のフラビウイルスが、日本脳炎、デング-1、デング-2、デング-3、デング-4、黄熱病、マリーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、クンジン、ロシオ脳炎、イルヘウス、ダニ媒介脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポーワッサン、ネギシ、アブセットアローブ、ハンザローバア、アポイ、およびHyprウイルスからなる群より独立して選択される、請求項30記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３２】
非構造タンパク質1（NS1）のアミノ酸236位と237位の間に異種ペプチドの挿入を含む、請求項27〜31のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３３】
ベクターのプレ膜タンパク質のアミノ末端領域において異種ペプチドの挿入を含む、請求項27〜32のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３４】
異種ペプチドが、カプシド／プレ膜タンパク質切断部位の前の-4位、-2位、もしくは-1位に、またはプレ膜タンパク質の26位に挿入される、請求項33記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３５】
プレ膜タンパク質からのペプチドの除去を促進するタンパク質分解切断部位をさらに含む、請求項33または34記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３６】
異種ペプチドが、インフルエンザM2eペプチドまたはインフルエンザ血液凝集素前駆体タンパク質切断部位（HA0）を含むペプチドを含む、請求項27〜35のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３７】
インフルエンザウイルスが、トリインフルエンザウイルスまたはヒトインフルエンザウイルスである、請求項36記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３８】
ウイルスゲノムが複数の異種ペプチドをコードする核酸分子を含み、異種ペプチドがヒトおよびトリインフルエンザM2eペプチドを含む、請求項27〜37のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３９】
一つまたは複数の第二の部位適応をさらに含む、請求項27〜38のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクター。
【請求項４０】
請求項27〜39のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクターのゲノムに対応する核酸分子、またはその相補体。
【請求項４１】
請求項27〜39のいずれか一項に記載のウイルスベクターを含む薬学的組成物。
【請求項４２】
薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、請求項41記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
アジュバントをさらに含む、請求項41または42記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
アジュバントがアルミニウム化合物を含む、請求項43記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
アルミニウム化合物がアラムである、請求項44記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
請求項41〜45のいずれか一項記載の組成物を患者に投与する段階を含む、患者にペプチドを送達する方法。
【請求項４７】
ペプチドが抗原であり、抗原が由来する病原体または腫瘍に対する免疫応答を誘導するために、投与が行われる、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
サブユニットワクチンの投与をさらに含む、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
フラビウイルスベクターおよびサブユニットワクチンが同時投与されるか、
フラビウイルスベクターがプライミング用量として投与されて、サブユニットワクチンが追加免疫用量で投与されるか、または
サブユニットワクチンがプライミング用量として投与されて、フラビウイルスベクターが追加免疫用量で投与される、
請求項48記載の方法。
【請求項５０】
サブユニットワクチンが、異種ペプチドとB型肝炎ウイルスコアタンパク質との融合体を含むB型肝炎ウイルスコア粒子を含む、請求項48または請求項49記載の方法。
【請求項５１】
融合した異種ペプチドが、インフルエンザM2eペプチドまたはインフルエンザ血液凝集素前駆体タンパク質切断部位（HA0）を含むペプチドを含む、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
異種ペプチドまたはペプチド供給源が、表および配列の付表（sequence appendices）を含む本明細書において他所で記載されるものから選択される、請求項27〜39のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクター、請求項40記載の核酸分子、請求項41〜45のいずれか一項に記載の薬学的組成物、請求項25記載のウイルスゲノム、請求項26記載のウイルスベクター、または請求項1〜24もしくは46〜51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
関心対象ペプチドをコードする配列を、挿入に関して許容性である部位にフラビウイルスに挿入する段階を含む、ウイルスベクターを作製する方法。
【請求項５４】
ウイルスベクターがフラビウイルスまたはキメラフラビウイルスを含む、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
挿入がウイルスベクターのNS1-236位、またはベクターのプレ膜タンパク質のアミノ末端部分で行われる、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
アミノ末端挿入が、カプシド／プレ膜タンパク質切断部位の前の-4位、-2位、もしくは-1位、またはプレ膜タンパク質の26位である、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
請求項27〜39のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクターを薬学的に許容される担体または希釈剤、アジュバント、および／またはさらなる活性物質と混合する段階を含む、薬学的組成物を作製する方法。
【請求項１】
以下の段階を含む、異種ペプチドをコードする核酸分子を含むウイルスゲノムを生成するための方法：
（i）標的ウイルス遺伝子を提供する段階；
（ii）標的ウイルス遺伝子を変異誘発に供する段階；および
（iii）異種ペプチドをコードする核酸分子を標的ウイルス遺伝子の変異誘発部位にライゲーションする段階。
【請求項２】
以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
（iv）ウイルス複製を開始するためにゲノム核酸ライブラリーを細胞にトランスフェクトする段階；および
（v）生存ウイルス組換え体を選択する段階。
【請求項３】
標的ウイルス遺伝子がシャトルベクター中に提供され、かつ
標的ウイルス遺伝子の変異誘発部位への異種ペプチドをコードする核酸分子のライゲーション後に、方法が、挿入を含むウイルスゲノムを生成するために、挿入を欠く対応するウイルス遺伝子の代わりに、標的ウイルス遺伝子が由来するウイルスゲノムに変異標的ウイルス遺伝子を導入する段階をさらに含む、
請求項1記載の方法。
【請求項４】
シャトルベクターが、二つまたはそれより多い標的ウイルス遺伝子を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
標的ウイルス遺伝子が無傷のウイルスゲノムという状況で提供され、かつ
方法が挿入を含むウイルスゲノムを生成する、
請求項1記載の方法。
【請求項６】
挿入を含むウイルスゲノムを細胞に導入することによって、挿入を含むウイルスゲノムからウイルスベクターを生成する段階をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞またはその上清からウイルスベクターを単離する段階をさらに含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
二つまたはそれより多い標的ウイルス遺伝子を含む二つまたはそれより多いシャトルベクターを、変異誘発に供する段階、および
挿入を含むウイルスゲノムを生成するために、挿入を欠く対応するウイルス遺伝子の代わりに、標的遺伝子が由来するウイルスゲノムに、一つまたは複数の異種ペプチドをコードする核酸分子を含む二つまたはそれより多い標的ウイルス遺伝子を導入する段階
を含む、請求項3記載の方法。
【請求項９】
変異誘発段階が、トランスポゾン変異誘発による標的ウイルス遺伝子への一つまたは複数のトランスプライマーの導入を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
一つまたは複数のトランスプライマーがエンドヌクレアーゼ消化によって除去され、異種ペプチドをコードする核酸分子が、制限エンドヌクレアーゼ消化部位でのライゲーションによって標的ウイルス遺伝子に導入される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
変異標的ウイルス遺伝子のライブラリーの生成をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
標的ウイルス遺伝子が、本方法に再度供される前に、請求項1記載の方法によって導入される挿入を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスゲノムがフラビウイルスのゲノムである、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
フラビウイルスがキメラフラビウイルスである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
キメラフラビウイルスが、第一のフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質、ならびに第二の異なるフラビウイルスのプレ膜タンパク質およびエンベロープタンパク質を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
第一および第二のフラビウイルスが、日本脳炎、デング-1、デング-2、デング-3、デング-4、黄熱病、マリーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、クンジン、ロシオ脳炎、イルヘウス、ダニ媒介脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポーワッサン、ネギシ、アブセットアローブ、ハンザローバア、アポイ、およびHyprウイルスからなる群より独立して選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
標的ウイルス遺伝子が、エンベロープタンパク質、カプシドタンパク質、プレ膜タンパク質、NS1、NS2Aタンパク質、NS2Bタンパク質、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、およびNS5タンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
異種ペプチドがワクチンエピトープを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
ワクチンエピトープがB細胞エピトープまたはT細胞エピトープである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
エピトープがウイルス病原体、細菌病原体、寄生虫病原体、アレルゲン、または腫瘍関連抗原の抗原に由来する、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
ウイルス病原体がインフルエンザウイルスである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
異種ペプチドが、インフルエンザM2eペプチドまたはインフルエンザ血液凝集素前駆体タンパク質切断部位（HA0）を含むペプチドを含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
インフルエンザウイルスが、トリまたはヒトインフルエンザウイルスである、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
ウイルスゲノムが複数の異種ペプチドをコードする核酸分子を含み、異種ペプチドがヒトおよびトリインフルエンザM2eペプチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
請求項1〜24に記載の方法のいずれか一つによって生成されたウイルスゲノム、またはその相補体。
【請求項２６】
請求項25記載のウイルスゲノムによってコードされるウイルスベクター。
【請求項２７】
カプシドタンパク質、プレ膜タンパク質、エンベロープタンパク質、NS1タンパク質、NS2Aタンパク質、NS2Bタンパク質、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、およびNS5タンパク質からなる群より選択されるタンパク質内に挿入された異種ペプチドを含む、フラビウイルスベクター。
【請求項２８】
フラビウイルスが黄熱病ウイルスである、請求項27記載のフラビウイルスベクター。
【請求項２９】
フラビウイルスがキメラフラビウイルスである、請求項27記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３０】
キメラフラビウイルスが、第一のフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質、ならびに第二の異なるフラビウイルスのプレ膜タンパク質およびエンベロープタンパク質を含む、請求項29記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３１】
第一および第二のフラビウイルスが、日本脳炎、デング-1、デング-2、デング-3、デング-4、黄熱病、マリーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、クンジン、ロシオ脳炎、イルヘウス、ダニ媒介脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポーワッサン、ネギシ、アブセットアローブ、ハンザローバア、アポイ、およびHyprウイルスからなる群より独立して選択される、請求項30記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３２】
非構造タンパク質1（NS1）のアミノ酸236位と237位の間に異種ペプチドの挿入を含む、請求項27〜31のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３３】
ベクターのプレ膜タンパク質のアミノ末端領域において異種ペプチドの挿入を含む、請求項27〜32のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３４】
異種ペプチドが、カプシド／プレ膜タンパク質切断部位の前の-4位、-2位、もしくは-1位に、またはプレ膜タンパク質の26位に挿入される、請求項33記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３５】
プレ膜タンパク質からのペプチドの除去を促進するタンパク質分解切断部位をさらに含む、請求項33または34記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３６】
異種ペプチドが、インフルエンザM2eペプチドまたはインフルエンザ血液凝集素前駆体タンパク質切断部位（HA0）を含むペプチドを含む、請求項27〜35のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３７】
インフルエンザウイルスが、トリインフルエンザウイルスまたはヒトインフルエンザウイルスである、請求項36記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３８】
ウイルスゲノムが複数の異種ペプチドをコードする核酸分子を含み、異種ペプチドがヒトおよびトリインフルエンザM2eペプチドを含む、請求項27〜37のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクター。
【請求項３９】
一つまたは複数の第二の部位適応をさらに含む、請求項27〜38のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクター。
【請求項４０】
請求項27〜39のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクターのゲノムに対応する核酸分子、またはその相補体。
【請求項４１】
請求項27〜39のいずれか一項に記載のウイルスベクターを含む薬学的組成物。
【請求項４２】
薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、請求項41記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
アジュバントをさらに含む、請求項41または42記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
アジュバントがアルミニウム化合物を含む、請求項43記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
アルミニウム化合物がアラムである、請求項44記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
請求項41〜45のいずれか一項記載の組成物を患者に投与する段階を含む、患者にペプチドを送達する方法。
【請求項４７】
ペプチドが抗原であり、抗原が由来する病原体または腫瘍に対する免疫応答を誘導するために、投与が行われる、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
サブユニットワクチンの投与をさらに含む、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
フラビウイルスベクターおよびサブユニットワクチンが同時投与されるか、
フラビウイルスベクターがプライミング用量として投与されて、サブユニットワクチンが追加免疫用量で投与されるか、または
サブユニットワクチンがプライミング用量として投与されて、フラビウイルスベクターが追加免疫用量で投与される、
請求項48記載の方法。
【請求項５０】
サブユニットワクチンが、異種ペプチドとB型肝炎ウイルスコアタンパク質との融合体を含むB型肝炎ウイルスコア粒子を含む、請求項48または請求項49記載の方法。
【請求項５１】
融合した異種ペプチドが、インフルエンザM2eペプチドまたはインフルエンザ血液凝集素前駆体タンパク質切断部位（HA0）を含むペプチドを含む、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
異種ペプチドまたはペプチド供給源が、表および配列の付表（sequence appendices）を含む本明細書において他所で記載されるものから選択される、請求項27〜39のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクター、請求項40記載の核酸分子、請求項41〜45のいずれか一項に記載の薬学的組成物、請求項25記載のウイルスゲノム、請求項26記載のウイルスベクター、または請求項1〜24もしくは46〜51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
関心対象ペプチドをコードする配列を、挿入に関して許容性である部位にフラビウイルスに挿入する段階を含む、ウイルスベクターを作製する方法。
【請求項５４】
ウイルスベクターがフラビウイルスまたはキメラフラビウイルスを含む、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
挿入がウイルスベクターのNS1-236位、またはベクターのプレ膜タンパク質のアミノ末端部分で行われる、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
アミノ末端挿入が、カプシド／プレ膜タンパク質切断部位の前の-4位、-2位、もしくは-1位、またはプレ膜タンパク質の26位である、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
請求項27〜39のいずれか一項に記載のフラビウイルスベクターを薬学的に許容される担体または希釈剤、アジュバント、および／またはさらなる活性物質と混合する段階を含む、薬学的組成物を作製する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公表番号】特表２００９−５４３５５４（Ｐ２００９−５４３５５４Ａ）
【公表日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１９５６４（Ｐ２００９−５１９５６４）
【出願日】平成１９年７月１６日（２００７．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１６０７８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３６１４６
【国際公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（５０３３８９３８９）サノフィ パスツール バイオロジクス カンパニー (17)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１６日（２００７．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１６０７８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３６１４６
【国際公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（５０３３８９３８９）サノフィ パスツール バイオロジクス カンパニー (17)
【Ｆターム（参考）】
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