ペグ修飾ハイドロキシアパタイト及びそれを基材とする医薬とその製造方法
【課題】ハイドロキシアパタイト粒子表面をポリエチレングリコール誘導体で修飾することにより、安全性の高い、新たな機能を有するＰＥＧ修飾ＨＡＰと、それを用いる用途とその製造方法を提供する。
【解決手段】粒径が５０μｍ〜１０ｎｍのハイドロキシアパタイトが、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体と−Ｏ（ＣＯ）で結合されていて、炭素含量が１０〜０．１％の物質であり、また、該物質と医薬品有効成分又は医薬品添加物とからなり、該医薬品有効成分の重量比が１〜３０％の物質であり、該物質は、粒径５０μｍ〜１０ｎｍのハイドロキシアパタイトと、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体の活性エステルとを無水有機溶媒中で処理して得られる。
【解決手段】粒径が５０μｍ〜１０ｎｍのハイドロキシアパタイトが、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体と−Ｏ（ＣＯ）で結合されていて、炭素含量が１０〜０．１％の物質であり、また、該物質と医薬品有効成分又は医薬品添加物とからなり、該医薬品有効成分の重量比が１〜３０％の物質であり、該物質は、粒径５０μｍ〜１０ｎｍのハイドロキシアパタイトと、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体の活性エステルとを無水有機溶媒中で処理して得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
薬物を担持させる微粒子は、そのサイズを調製することで、又は微粒子を適当に修飾することで、剤形的には、経口、静脈注、皮下注、経肺、経鼻に有効に利用し得る。また、機能的には、薬物の肝臓、肺又は炎症部位等への選択的デリバリー、放出制御、いやな味のマスキング又は腸管吸収の改善等に有効に利用し得る。
このような微粒子としては、リポゾーム、高分子ミセル、プロトスフィア（登録商標）、樹脂又はシリカゲル、ゼオライト、ハイドロキシアパタイト等の無機パーテイクル（無機マイクロスフィア、ナノスフィア）が知られている。本発明は、ハイドロキシアパタイト表面をポリエチレングリコール（以下、ペグ又はＰＥＧと略記する）で修飾した新規ペグ修飾ハイドロキシアパタイト（以下、ＰＥＧ修飾ＨＡＰと略記する）及びその用途と製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロキシアパタイト（以下、ＨＡＰと略記する）は、骨や歯の基本成分であり、生体親和性が高く、糖やタンパク質を吸着しやすい性質がある。そのため、ＨＡＰは、骨や歯の補填材料等の医療用基材、カラム充填材、薬物輸送担体、あるいは細胞培養基盤として幅広く利用されている。こうしたＨＡＰの特性をさらに生かすために、その表面を機能性高分子や生理活性物質で化学修飾させることが求められている。しかしながら、その足がかりとなるＨＡＰ表面の水酸基は、反応性が低く、機能性高分子や生理活性物質等の有機化合物を均一に結合させることが難しい。
【０００３】
アパタイト粒子の化学修飾については、ナノアパタイト粒子にヘキサメチレンジイソシアネートを用いてポリエチレングリコールを結合させた、Liu Qiugらの報告がある（Biomaterials (1998), 19(11-12), 1067-1072）。また、古薗らは、アパタイト粒子にアミノ基を持つシランカップリング剤を結合させ、カルボン酸とアミノ基との縮合反応によりポリアクリル酸を介してシリコーンシートと結合した経皮デバイスの開発に成功している（J Biomed Mater Res. (2001), 56(1),9-16）。さらに、田中らは、２種類以上の官能基を有するシランカップリング剤やイソシアネート化合物を用いて、ＨＡＰ多孔体表面に反応性の高い有機官能基を導入し、該ＨＡＰ多孔体表面に有機物質を共有結合させることに成功し、これがクロマトグラフ用カラム充填剤、ＤＤＳ担体、イオン交換媒体、細胞培養基盤、インプラント等として幅広く利用できることを示した（特開２００３−３４２０１１号公報）。
【０００４】
しかしこれらは、いずれもその調製過程でバイファンクショナルなリンカー試薬を用いるため、ハイドロキシアパタイト粒子同士の架橋結合が必然的に避けられず、この架橋ハイドロキシアパタイト粒子が、副生成物として混在する問題点がある。また、反応性の高いシランカップリング剤やイソシアネート化合物を使用しているため、残存するこれら反応性官能基の安全性も問題と考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Biomaterials (1998), 19(11-12), 1067-1072
【非特許文献２】J Biomed Mater Res. (2001), 56(1),9-16
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−３４２０１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、バイファンクショナルリンカーを用いず、ハイドロキシアパタイト粒子表面をポリエチレングリコール誘導体で修飾することにより、安全性の高い、新たな機能を有するＰＥＧ修飾ＨＡＰを提供し、加えてそれを利用する用途とその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明者らは、鋭意検討した結果、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体を用いてＨＡＰの表面にポリエチレングリコールを−Ｏ（ＣＯ）で結合導入することに成功した。さらに、該新規ＰＥＧ修飾ＨＡＰに、各種医薬をローデイングさせたドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）は、剤形的には、経口、静脈注、皮下注、経肺、経鼻に、有効に利用し得ること、及び薬物の肝臓、肺又は炎症部位等への選択的デリバリー、放出制御、いやな味のマスキング又は腸管吸収の改善等に有効に応用できることを見出した。
【０００９】
このＰＥＧ修飾ＨＡＰは、アパタイト固有の高い機械的強度と各種物質吸着能を維持すると共に、血中滞留性等の特性を併せ持つことが期待できる。そのため、ＤＤＳ担体を始め、クロマトグラフ用カラム充填剤、イオン交換媒体、細胞培養基盤、インプラント等として幅広く利用し得る。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２３）を提供するものである。
（１）
粒径が５０μｍ〜１０ｎｍのハイドロキシアパタイトと、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体からなる混合物であって、炭素含量が１０〜０．１％の物質。
（２）
粒径が５０μｍ〜１０ｎｍのハイドロキシアパタイトが、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体と−Ｏ（ＣＯ）で結合されていて、炭素含量が１０〜０．１％の物質。
【００１１】
（３）
請求項１記載の物質及び医薬品有効成分からなり、医薬品有効成分の重量比が１〜３０％の物質、又は、請求項１記載の物質及び医薬品有効成分および医薬品添加物からなり、医薬品有効成分の重量比が１〜３０％の物質。
（４）
請求項２記載の物質及び医薬品有効成分からなり、医薬品有効成分の重量比が１〜３０％の物質、又は、請求項２記載の物質及び医薬品有効成分および医薬品添加物からなり、医薬品有効成分の重量比が１〜３０％の物質。
【００１２】
（５）
請求項３又４記載の物質から調製される医薬品。
（６）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がｓｉＲＮＡ、アプタマー、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド又は蛋白質であるところの請求項３又は４記載の物質。
（７）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がクラリスロマイシンであるところの請求項３又は４記載の物質。
（８）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がイトラコナゾールであるところの請求項３又は４記載の物質。
（９）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がｓｉＲＮＡであるところの請求項３又は４記載の物質。
【００１３】
（１０）
サブミクロンサイズのハイドロキシアパタイトと、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体の活性エステルを無水有機溶媒中で処理してサブミクロンサイズの請求項１又は２記載の物質を得る方法。
（１１）
サブミクロンサイズの請求項１又は２記載の物質と医薬有効成分又は医薬添加物を有機溶媒中で処理して請求項３又は４記載の物質を得る方法。
【００１４】
（１２）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がカンデサルタンであるところの請求項３又は４記載の物質。
（１３）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がカンデサルタンシレキセチルであるところの請求項３又は４記載の物質。
（１４）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分が、配列が
5'-GUGAAGUCAACAUGCCUGCTT-3'（配列番号１）
5'-GCAGGCAUGUUGACUUCACTT-3'（配列番号２）
である二重螺旋のｓｉＲＮＡであるところの請求項３又は４記載の物質。
（１５）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分が、配列が
5'-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3'（配列番号３）
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3'（配列番号４）
である二重螺旋のｓｉＲＮＡであるところの請求項３又は４記載の物質。
【００１５】
（１６）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がエトポシドであるところの請求項３又は４記載の物質。
（１７）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がメシル酸ネルフィナビルであるところの請求項３又は４記載の物質。
（１８）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がシンバスタチンであるところの請求項３又は４記載の物質。
（１９）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分が７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシンであるところの請求項３又は４記載の物質。
【００１６】
（２０）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がパクリタキセルであるところの請求項３又は４記載の物質。
（２１）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がメシル酸サキナビルであるところの請求項３又は４記載の物質。
（２２）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がインスリンであるところの請求項３又は４記載の物質。
（２３）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がブロモクリプチンメシル酸塩であるところの請求項３又は４記載の物質。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、次のような効果を奏することができる。
（１） 難溶性の医薬物質であっても、本発明のＰＥＧ修飾ＨＡＰを基材に用いることで、可溶性物質のように取り扱うことができ、体内への薬物投与が容易となり、さらに体内血中滞留性の向上が図られる
（２） ＨＡＰ表面をＰＥＧ化することで、ＨＡＰ粒子同士の凝集を防止することができる。
（３） 表面をＰＥＧ化したＨＡＰを基材に用いることで、有効成分をローディングしたＨＡＰ粒子についても、粒子同士の凝集を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１のＰＥＧ修飾ＨＡＰの粒度分布を示すグラフ。
【図２】実施例２のＰＥＧ修飾ＨＡＰとクラリスロマイシンとからなる医薬の粒度分布を示すグラフ。
【図３】実施例３のＰＥＧ修飾ＨＡＰとイトラコナゾールとからなる医薬の粒度分布を示すグラフ。
【図４】実施例４のｓｉＲＮＡコーティングＰＥＧ修飾ＨＡＰの蛍光顕微鏡写真（×１０００）で、（ａ）フルオレセイン標識ｓｉＲＮＡコーティング品、（ｂ）ローダミン標識ｓｉＲＮＡコーティング品。
【図５】実施例１８の結果のカンデサルタンの時間（分）による溶出濃度を示すグラフ。
【図６】実施例１９の結果のラットに静脈注射後のプラズマ中の時間（時）による濃度変化を示すグラフ。
【図７】実施例２０の結果のラットに経口投与後のプラズマ中の時間（時）による濃度変化を示すグラフ。
【図８】実施例２１の結果のラットに静脈注射後のプラズマ中の時間（時）による濃度変化を示すグラフ。
【図９】実施例２２の結果のラットに経口投与後のプラズマ中の時間（時）による濃度変化を示すグラフ。
【図１０】実施例２３の結果のＡ５４９細胞に対する細胞毒性を示すグラフ。
【図１１】実施例２４の結果のＡ５４９細胞へのトランスフェクション試験の４時間経過後の細胞の蛍光顕微鏡写真。
【図１２】実施例２６の結果のレーザー共焦点顕微鏡写真。
【図１３】実施例２７の結果のレーザー共焦点顕微鏡写真。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、バイファンクショナルリンカーを用いず、モノファンクショナルポリエチレングリコール誘導体でハイドロキシアパタイト粒子表面にポリエチレングリコール誘導体を結合させて得られた、安全性の高い、新たな機能を有するＰＥＧ修飾ＨＡＰ及びその用途と製造方法に関する。
ＰＥＧ修飾に付されるＨＡＰは、多数の細孔（気孔）を有するＨＡＰ固体であっても良いし、気孔率のあまり高くないＨＡＰでも良い。
【００２０】
ＨＡＰは、一般組成をＣａ５（ＰＯ４）３ＯＨ、とする化合物であり、その反応の非化学量論性によって、ＣａＨＰＯ４ 、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、ＣａＰ４Ｏ１１、Ｃａ（ＰＯ３）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２Ｈ２Ｏなどリン酸カルシウムと称される１群の化合物を含む。また、ＨＡＰは、Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨ、又はＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２の組成式で示される化合物を基本成分とするもので、Ｃａ成分の一部分は、Ｓｒ、Ｂａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ａｌ、Ｙ、Ｌａ、Ｎａ、Ｋ、Ｈなどから選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、（ＰＯ４）成分の一部分が、ＶＯ４、ＢＯ３、ＳＯ４、ＣＯ３、ＳｉＯ４等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。更に、（ＯＨ）成分の一部分が、Ｆ、Ｃｌ、Ｏ、ＣＯ３等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、これらの各成分の一部が欠陥となっていてもよい。生体骨中のアパタイトのＰＯ４及びＯＨ成分の一部は、通常ＣＯ３に置換されているため、本複合生体材料の製造中、大気中からのＣＯ３の混入と各成分への一部置換（０〜１０質量％程度）があってもよい。
【００２１】
なお、ＨＡＰは、通常の微結晶・非晶質並びに結晶体の他に、同型固溶体、置換型固溶体、侵入型固溶体であってもよく、非量子論的欠陥を含むものであってもよい。また、この「ＨＡＰ」中、カルシウム及びリンの原子比（Ｃａ／Ｐ）は１．３〜１．８の範囲内にあることが好ましく、特に１．５〜１．７がより好ましい。原子比が１．３〜１．８の範囲内にあると、生成物中のアパタイト（リン酸カルシウム化合物）の組成と結晶構造が、脊椎動物の骨の中に存在するアパタイトと類似の組成と構造をとりうるため、生体親和性がより高くなるからである。
ＰＥＧ修飾に付されるＨＡＰは、公知の方法で調製することが出来るが、市販のもの、例えばＡｌｄｒｉｃｈ社製Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ, ｎａｎｏｐｏｗｄｅｒを利用しても良い。
【００２２】
本発明で用いられる「モノファンクショナルポリエチレングリコール誘導体」としては、市販の高純度一官能性活性化ＰＥＧ修飾剤を用いたがこれに限定するものではない。ＰＥＧ部分を直鎖にするか分枝にするか、又はＰＥＧ部分の分子量等は、目的に応じて任意に選択調節できる。
修飾時の反応溶媒は、無水有機溶媒、特にジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、ジメチルスルホキサイド(ＤＭＳＯ)、酢酸、アセトン、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)、酢酸エチル、ジクロロメタンが使用できるが、特に医薬品の残留溶媒ガイドラインに記すクラス２〜３のジメチルスルホキサイド(ＤＭＳＯ)、アセトンが好ましい。反応温度は、氷冷下から１００℃、反応時間は２〜７２時間、「モノファンクショナルポリエチレングリコール誘導体」は、ＨＡＰ１ｇあたり大過剰（１〜０．１ｇ）を用いた。反応終了後、残存する過剰の「モノファンクショナルポリエチレングリコール誘導体」及び副生成物のＮ‐ヒドロキシスクシンイミドを反応に使用した有機溶媒で洗浄ろ過して除き、不溶物を減圧下乾燥して、ＰＥＧ修飾ＨＡＰを得た。ＰＥＧ修飾ＨＡＰの炭素含量は、ＰＥＧ修飾試薬量を調節することで０．１〜１０％で調節できるが、特に１〜３％前後が好ましい。
【００２３】
本発明のＰＥＧ修飾ＨＡＰは、医薬品有効成分を吸着させることで、ＤＤＳ担体として利用することができる。ＨＡＰ又はＰＥＧは生体適合性が高いため、生体内への薬物送達にも安心して利用できる（Ｊ Ｍａｔｅｒ Ｓｃｉ. (２０００), １１(２),６７‐７２）。
標的器官に特異的なリガンドを結合させれば、より確実に目的とする器官に薬剤を送達することも可能となる。また、医薬品有効成分が難水溶性で注射製剤が不可能又は腸管吸収の悪い場合、サブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰに医薬品有効成分を吸着させることで、間接的に医薬品有効成分をサブミクロンサイズに調整でき、注射製剤の開発及び経口吸収改善に広く応用できる。さらに、サブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰに医薬品有効成分としてＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白質等を吸着させた物質は、それら医薬品有効成分の有望なＤＤＳとして応用可能である。
【００２４】
ＰＥＧ修飾ＨＡＰと医薬品有効成分又は医薬品添加物とからなる物質は以下の方法で調製した。医薬品有効成分又は医薬品添加物を医薬品の残留溶媒ガイドラインに記すクラス２〜３のＤＭＳＯ、エタノール（ＥｔＯＨ）、アセトン等の溶媒に溶解させ、これに重量比で９０％比のＰＥＧ修飾ＨＡＰを加え、室温下超音波処理後、この懸濁液全量を凍結乾燥又は減圧下溶媒留去して、請求項記載の物質を得た。医薬品有効成分又は医薬品添加物のＰＥＧ修飾ＨＡＰに対する搭載率は、医薬品有効成分又は医薬品添加物にも依存するが１〜３０％で調製できる。特に１０％前後が好ましい。
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰの調製〕
（１）ＰＥＧ修飾ＨＡＰの調製
ハイドロキシアパタイト−ナノパウダー〔Ａｌｄｒｉｃｈ ６７７４１８〕２００ｍｇのアセトン２０ｍｌ懸濁液に、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)修飾剤（ＮＯＦ社製 ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ‐０２０ＣＳ）２００ｍｇを加え、３０分間超音波（周波数２８ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を照射した。この懸濁液を室温にて１８時間攪拌後、遠心分離（９０００×ｇ, ２０℃,３０分間）し、上清をデカンテーションにて除去した。沈殿物をアセトンにて２回洗浄（２０ｍｌ×２）した後、減圧下、５０℃にて１８時間乾燥し、ＰＥＧ修飾ＨＡＰ １５８ｍｇを白色粉末として得た。
【００２６】
（２）残留溶媒、及びＰＥＧ修飾率の測定
調製したＰＥＧ修飾ＨＡＰ中の残留溶媒をガスクロマトグラフ(ＧＣ)法で、ＰＥＧ修飾率としてＣＨＮ元素分析法で炭素含量を定量した結果を以下に示す。
残留溶媒（アセトン）濃度：< １００μｇ／ｇ
炭素含量：２．０１％
＜ＧＣ分析条件＞
装置：ＨＰ‐５８９０ＩＩシステム （Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ製）
カラム：ＤＢ‐６２４ ７５ｍｍ×０．５３ ｍｍ 膜厚０．３μｍ
カラム温度：４０℃ → ２６０℃
キャリアガス：ヘリウム ７ ｐｓｉ
検出器：水素炎イオン検出器(ＦＩＤ) ２５０℃
＜ＣＨＮ元素分析条件＞
機器：ｖａｒｉｏ ＥＬ ＩＩＩ （Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ ＡｎａｌｙｓｅｎｓｙｓｔｅｍｅＧｍｂＨ）
燃焼炉温度：９５０℃
還元炉温度：５００℃
ヘリウム流量：２００ ｍｌ／ｍｉｎ
酸素流量：３０ ｍｌ／ｍｉｎ
燃焼時間：９０ ｓｅｃ
【００２７】
（３）粒子径分布測定
調製したＰＥＧ修飾ＨＡＰ １ｍｇをミリＱ水 (１５ｍｌ)に懸濁し、超音波（周波数２８ ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を５分間照射した後、粒子経測定を行った。[測定機器：ＨＯＲＩＢＡ レーザー回折／散乱式粒子径分布測定装置 ＬＡ‐９５０] 結果を図１に示す。
【実施例２】
【００２８】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとクラリスロマイシンからなる物質の調製〕
（１）ＰＥＧ修飾ＨＡＰとクラリスロマイシンからなる物質の調製
ＰＥＧ修飾ＨＡＰ(１００ｍｇ)にクラリスロマイシン(８ｍｇ)のＤＭＳＯ(２ｍｌ)溶液を加えた後、超音波（周波数２８ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を２分間照射した。この懸濁液を凍結乾燥し、白色粉末 １０８．６ ｍｇを得た。これを更に減圧下、５０℃にて３６時間乾燥し目的物１０８．１ｍｇを白色粉末として得た。
【００２９】
（２）薬物吸着率の測定
本品１０ｍｇにアセトニトリル １ｍｌを加え、超音波（周波数２８ ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を５分間照射した。この懸濁液を遠心分離（９０００×ｇ， ２０℃， ３分間）し、上清を更に０．２２μｍのフィルターにてろ過しＨＰＬＣ用サンプルとした。ＨＰＬＣ分析より、本品１０ｍｇ中にクラリスロマイシン０．７４ｍｇが含有されていることを確認した。吸着率：７．４％（ｗ／ｗ）
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
機器：Waters Alliance 2695 Separations Module, Waters 2487 Dual λAbsorbance Detector
カラム：Atlantis dC18， particle size ３．０μｍ， ３．９ ｍｍ×１００ｍｍ(Waters)
移動層：Ａ : ０．６７ ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素カリウム試液 Ｂ : アセトニトリル。
Ａ：Ｂ＝６５：３５（ｖ／ｖ）
流速：１．０ ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２１０ ｎｍ
Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ：７．１ ｍｉｎ
【００３０】
（３）粒子径分布測定
本品１ｍｇをミリＱ水 (１５ｍｌ)に懸濁し、超音波（周波数２８ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を５分間照射した後、粒子計測定を行った。結果を図２に示す。
【実施例３】
【００３１】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとイトラコナゾールからなる物質の調製〕
（１）組成物の調製
ＰＥＧ修飾ＨＡＰ(３００ｍｇ)にイトラコナゾール(２４ｍｇ)のＤＭＳＯ(４．８ｍｌ)溶液を加えた後、超音波（周波数２８ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を２分間照射した。この懸濁液を凍結乾燥し、白色粉末３２４．３ｍｇを得た。これをミリＱ水(１５ｍｌ)に懸濁後、コンドロイチン硫酸ナトリウム水溶液 [１０ｍｇ／ｍｌ] (０．３ｍｌ)を添加し、超音波（周波数２８ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を２分間照射した。この懸濁液を凍結乾燥し白色粉末３２２．６ｍｇ得た。
【００３２】
（２）薬物吸着率の測定
本品１０ｍｇにアセトニトリル１ｍｌを加え、超音波（周波数２８ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を５分間照射した。この懸濁液を遠心分離（９０００×ｇ, ２０℃, ３分間）し、上清を更に０．２２μmのフィルターでろ過し、ＨＰＬＣ用サンプルとした。ＨＰＬＣ分析
より、本品１０ｍｇ中にイトラコナゾール０．７４ｍｇが含有されていることを確認した。吸着率：７．４％（ｗ／ｗ）
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
機器：Waters Alliance 2695 Separations Module， Waters 2487 Dual λAbsorbance Detector
カラム：XBridge C18, particle size ３．５μｍ, ４．６ ｍｍ×１００ｍｍ(Waters)
移動層：Ａ：０．２％ ジイソプロピルアミン-メタノール溶液 Ｂ：０．５％ 酢酸アンモニウム水溶液。 Ａ：Ｂ=４：１（ｖ／ｖ）
流速：０．９ ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２６３ ｎｍ
Retention time：３．０ ｍｉｎ
【００３３】
（３）粒子径分布測定
本品１ｍｇをミリＱ水 (１５ｍｌ)に懸濁し、超音波（周波数２８ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を５分間照射した後、粒子計測定を行った。結果を図３に示す。
【実施例４】
【００３４】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとｓｉＲＮＡからなる物質の調製〕
（１） ＰＥＧ修飾ＨＡＰと蛍光標識ｓｉＲＮＡからなる物質の調製
ＰＥＧ修飾ＨＡＰ６ｍｇを量り取り、純水１０ｍｌを加えた。混合液を乳化・分散機へ移し、１６０００ｒｐｍで１分間処理し、均一な懸濁液を得た。懸濁液３ｍｌに対し、１０ｍｇ／ｍｌ 蛍光標識ｓｉＲＮＡ水溶液１８μｌを加え、十分混合した。
（２） 蛍光顕微鏡観察
本品３ｍｌにグリセリン６ｍｌを加えた。蛍光顕微鏡にてサンプルの観察を行った。蛍光励起波長は、フルオレセイン標識品は４９０ｎｍ、ローダミン標識品は５５０ｎｍに設定した。結果を図４に示す。
（３） 結果
蛍光顕微鏡観察より、ｓｉＲＮＡはＰＥＧ修飾ＨＡＰ表面にコーティングされていることがわかった。
【実施例５】
【００３５】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとイトラコナゾールからなる物質をラットに投与した際の血中動態試験〕
（１） 試験目的
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとイトラコナゾールからなる物質を、ラットに静脈内及び経口投与し血中濃度の推移を確認し、バイオアベイラビリテイーを算出した。
（２） 被験物質
（１）静脈内投与用
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとイトラコナゾールからなる物質の水性懸濁液
保存条件：遮光・室温保存
（２）経口投与用
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとイトラコナゾールからなる物質の水性懸濁液
保存条件：遮光・室温保存
（３） 動物
・ 動物種：ラット，系統：ＳＤ，性別：雄
・ 例数：ｎ＝３
投与時週齢：7週齢
・ 投与時摂餌条件：非絶食
・ 投与量：静脈内投与； ５ ｍｇ／2 ｍｌ／ｋｇ(２７Ｇ注射針
を使用して静注)
経口投与； １２ ｍｇ／４．８ ｍｌ／ｋｇ
【００３６】
（４） 採血
血漿採取時点：投与後０．５，２，６，１８，２４，４８，１６８時間
血漿採取：尾静脈からヘパリンナトリウム処理した毛細管を用いて血液約０．５ ｍｌを採取する。
血液を遠心分離（１２０００ ｒｐｍ，４℃，３分間）して得られた血漿は、測定まで−２０℃で凍結保存した。
（５） 症状観察：一般状態の観察のみ実施し、特定部位及び特定組織の観察は実施していない。
（６） 血漿中濃度の測定
分析方法
・ 測定対象：イトラコナゾール
・ 標準物質：イトラコナゾール
保存条件：冷暗所
・ 内標準物質：ロラタジン
保存条件：冷暗所
・ 分析条件：ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ
【００３７】
（７） ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件
カラム：CAPCELL PAK C18 MG II, ５０ｍｍ×４．６ｍｍ id, ５ｍｍ(資生堂)
移動層：Ａ : ２ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム Ｂ : アセトニトリル。
Ａ:Ｂ=３５：６５（ｖ／ｖ）
流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ
イオン源：ＡＰＣＩ
極性：正イオン
検出イオン：ｍ／ｚ705.1, 392.1（イトラコナゾール）
ｍ／ｚ383.5, 337.2[ Ｉ．Ｓ．（インターナルスタンダード）]
（８） 前処理
・ 検量線試料及び測定用試料にＩ．Ｓ.溶液１００μｌを加え、攪拌した。ブランク試料にはアセトニトリル１００μｌを加え、攪拌した。
・ アセトニトリル７００μｌを加え、攪拌した。
・ 約１２０００×ｇで１０分間(４℃)遠心分離した。
・ 上清５μｌをＬＣ／ＭＳ／ＭＳに注入した。
【００３８】
（９） 結果
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとイトラコナゾールからなる物質の０．５〜２４時間でのバイオアベイラビリテイーは、約５７％と高い腸管吸収改善効果がみられた。（表１）
同時に行った市販イトリゾール注及びイトリゾールカプセル５０の血中動態インビボ試験結果から、経口イトリゾールカプセル５０のイトリゾール注に対する０．５〜４８時間でのバイオアベイラビリテイーは約３９％であった。
この結果から、サブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰと難水溶性医薬とからなる物質が、新規注射製剤として及び高い経口吸収を示す優れた経口製剤とし有用であることが示された。
【００３９】
【表１】
【実施例６】
【００４０】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとクラリスロマイシンからなる物質をラットに投与した際の血中動態試験〕
（１） 試験目的
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとクラリスロマイシンからなる物質を、ラットに静脈内及び皮下投与し血中濃度の推移を確認した。
（２） 被験物質
（1）静脈内投与用
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとクラリスロマイシンからなる物質の水性懸濁液
保存条件：遮光・室温保存
（2）皮下投与用
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとクラリスロマイシンからなる物質の水性懸濁液
保存条件：遮光・室温保存
（３）動物
・ 動物種：ラット，系統：ＳＤ，性別：雄
・ 例数：ｎ＝３
投与時週齢：７週齢
・ 投与時摂餌条件：非絶食
・ 投与量：静脈内投与； １ ｍｇ／ｍｌ／ｋｇ（２７Ｇ注射針を使用して静注）
皮下投与； ２ ｍｇ／２ ｍＬ／ｋｇ（２７Ｇ注射針を使用して皮下注）
【００４１】
（４） 採血
血漿採取時点：投与後０．５，２，６，１２，２４，４８，１６８時間
血漿採取：尾静脈からヘパリンナトリウム処理したパスツールピペットを用いて血液約０．５ ｍｌを採取する。
血液を遠心分離（８０００×ｇ，４℃，３分間）して得られた血漿は、測定まで−２０℃で凍結保存した。
（５） 症状観察：一般状態の観察のみ実施し、特定部位及び特定組織の観察は実施していない。
（６） 血漿中濃度の測定
分析方法
・ 測定対象：クラリスロマイシン
・ 標準物質：クラリスロマイシン
保存条件：冷暗所
・ 内標準物質：エリスロマイシンＢ
保存条件：冷暗所
・ 分析条件：ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ
【００４２】
（７） ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件
カラム：Atlantis dC18 ３ｍｍ, ４．６ｍｍ ID x ７５ｍｍ(ウオーターズ)
ガードカラム：Atlantis dC18 ３ｍｍ, ４．６ｍｍ ID x ２０ｍｍ(ウオーターズ)
移動層：Ａ: ２０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム Ｂ : アセトニトリル。
Ａ:Ｂ=５５：４５（ｖ／ｖ），流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ
イオン源：ESI
極性：正イオン
検出イオン：m/z748.6, 158.2（クラリスロマイシン）
m/z718.6, 158.3[ I.S.（インターナルスタンダード）]
（８） 前処理
１． 検量線試料、ブランク試料及び測定用試料に５％(ｗ／ｖ)炭酸ナトリウム２００μｌ及び酢酸エチル４μｌを添加した。
２． 室温で約１５分間振とうした後、約１８００ x ｇ、室温、１０分間で遠心分離した。
３． 上清(有機層)を１３ｍｌポリプロピレン製(ｐ．ｐ．)チューブに移した。
４． 上清を窒素気流下濃縮乾固（４０度Ｃ、約３０分）した。
５． 残渣に再溶解溶液１ｍｌを添加後、攪拌した。
６． １０μｌをＬＣ／ＭＳ／ＭＳに注入した。
【００４３】
（９） 結果
表２に示すように、サブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰと難水溶性医薬クラリスロマイシンとからなる物質が、新規注射製剤（２７Ｇ注射針を使用して静注及び皮下注可能）として有用であることが示された。
【表２】
【実施例７】
【００４４】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：7.4 %(w/w)
【実施例８】
【００４５】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンシレキセチルからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：6.3 %(w/w)
【実施例９】
【００４６】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰと
5'-GUGAAGUCAACAUGCCUGCTT-3'（配列番号１）
5'-GCAGGCAUGUUGACUUCACTT-3'（配列番号２）
からなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例４と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
蛍光分析法により確認した。吸着率：20 %(w/w)
【実施例１０】
【００４７】
［ＰＥＧ修飾ＨＡＰと
5'-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3'（配列番号３）
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3'（配列番号４）
からなる物質の調製］
（１） 組成物の調製
実施例４と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
蛍光分析法により確認した。吸着率：20 %(w/w)
【実施例１１】
【００４８】
［ＰＥＧ修飾ＨＡＰとエトポシドからなる物質の調製］
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：8.0 %(w/w)
【実施例１２】
【００４９】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとメシル酸ネルフィナビルからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：7.4 %(w/w)
【実施例１３】
【００５０】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとシンバスタチンからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：7.9 %(w/w)
【実施例１４】
【００５１】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰと7-エチル-10-ヒドロキシ-カンプトテシンからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：6.8 %(w/w)
【実施例１５】
【００５２】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとパクリタキセルからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：7.4 %(w/w)
【実施例１６】
【００５３】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとメシル酸サキナビルからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：8.0 %(w/w)
【実施例１７】
【００５４】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとインスリンからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例４と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：12.7 %(w/w)
【実施例１８】
【００５５】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンからなる物質のパドル法による溶出試験〕
（結果）
図５は、カンデサルタンの時間（分）による溶出濃度を示すグラフである。
図５に示すように、カンデサルタン医薬品原薬からのカンデサルタンの溶出は、およそ一時間を要するのに比べ、ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンからなる物質からのカンデサルタンの溶出は早く、およそ５分で完了した。
【実施例１９】
【００５６】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンからなる物質をラットにi.v.（静脈注射）投与した際の血中動態試験〕
（結果）
図６は、ラットに静脈注射後のプラズマ（血漿）中の時間（時）による濃度変化を示すグラフである。
図６に示すように、サブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰと難水溶性医薬カンデサルタンからなる物質が、新規注射製剤（27G注射針を使用して静注及び皮下注可能）として有用であることが示された。
【実施例２０】
【００５７】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンからなる物質をラットにpo.（経口）投与した際の血中動態試験〕
（結果）
図７は、ラッドに経口投与後のプラズマ中の時間（時）による濃度変化を示すグラフである。
図７に示すように、ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンからなる物質は、市販のブロプレス（登録商標）-タブレット錠に匹敵する経口吸収性を示した。
【実施例２１】
【００５８】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンシレキセチルからなる物質をラットにi.v.投与した際の血中動態試験〕
（結果）
図８は、ラットに静脈注射後のプラズマ中の時間（時）による濃度変化を示すグラフである。
図８に示すように、サブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰと難水溶性医薬カンデサルタンシレキセチルからなる物質が、新規注射製剤（27G注射針を使用して静注及び皮下注可能）として有用であることが示された。
【実施例２２】
【００５９】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンシレキセチルからなる物質をラットにpo.投与した際の血中動態試験〕
（結果）
図９は、ラットに経口投与後のプラズマ中の時間（時）による濃度変化を示すグラフである。
図９に示すように、ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンシレキセチルからなる物質は、市販のブロプレス-タブレット錠のおよそ１．５倍の経口吸収性を示した。
【実施例２３】
【００６０】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰと
5'-GUGAAGUCAACAUGCCUGCTT-3'（配列番号１）
5'-GCAGGCAUGUUGACUUCACTT-3'（配列番号２）
からなる物質のin vitro細胞毒性評価試験〕
（結果）
図１０は、Ａ５４９細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
図１０中、Ａに示すように、ＰＥＧ修飾ＨＡＰと
5'-GUGAAGUCAACAUGCCUGCTT-3'（配列番号１）
5'-GCAGGCAUGUUGACUUCACTT-3'（配列番号２）
からなる物質は、Ａ５４９ヒト肺癌細胞に対しおよそ５０％細胞生存率を示した。図１０中Ｃに示すポジテイブコントロール(株式会社同仁化学研究所製HilyMaxを使用)に匹敵する強い効果を示した。一方図１０中、Ｂに示すネガテイブコントロールでは、およそ７０％細胞生存率を示した。
【実施例２４】
【００６１】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰと
蛍光ラベル化5'-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3'（配列番号３）
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3'（配列番号４）
からなる物質のＡ５４９細胞へのトランスフェクション試験と蛍光顕微鏡観察〕
（結果）
Ａ５４９ヒト肺癌細胞に、ＰＥＧ修飾ＨＡＰと
蛍光ラベル化5'-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3'（配列番号３）
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3'（配列番号４）
からなる物質を添加後、４時間経過後の細胞の蛍光顕微鏡写真を図１１に示す。
【実施例２５】
【００６２】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとエトポシドからなる物質をラットにi.v.投与した際の動態試験〕
（結果）
表３に示すようにサブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰと難水溶性医薬エトポシドからなる物質は市販のエトポシド注射薬（ベプシド注）と比較し、エトポシドが肝臓に高く集積することが認められた。
【００６３】
【表３】
【実施例２６】
【００６４】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとシンバスタチンからなる物質の顕微鏡観察〕
（結果）
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとシンバスタチンからなる物質のレーザー共焦点顕微鏡写真を図１２に示す。粒径のそろったサブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰとシンバスタチンからなる物質粒子がブラウン運動している様子が観察された。
【実施例２７】
【００６５】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとメシル酸ネルフィナビルからなる物質の顕微鏡観察〕
（結果）
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとメシル酸ネルフィナビルからなる物質のレーザー共焦点顕微鏡写真を図１３に示す。粒径のそろったサブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰとメシル酸ネルフィナビルからなる物質粒子がブラウン運動している様子が観察された。
【実施例２８】
【００６６】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとブロモクリプチンメシル酸塩からなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：4.2 %(w/w)
【技術分野】
【０００１】
薬物を担持させる微粒子は、そのサイズを調製することで、又は微粒子を適当に修飾することで、剤形的には、経口、静脈注、皮下注、経肺、経鼻に有効に利用し得る。また、機能的には、薬物の肝臓、肺又は炎症部位等への選択的デリバリー、放出制御、いやな味のマスキング又は腸管吸収の改善等に有効に利用し得る。
このような微粒子としては、リポゾーム、高分子ミセル、プロトスフィア（登録商標）、樹脂又はシリカゲル、ゼオライト、ハイドロキシアパタイト等の無機パーテイクル（無機マイクロスフィア、ナノスフィア）が知られている。本発明は、ハイドロキシアパタイト表面をポリエチレングリコール（以下、ペグ又はＰＥＧと略記する）で修飾した新規ペグ修飾ハイドロキシアパタイト（以下、ＰＥＧ修飾ＨＡＰと略記する）及びその用途と製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロキシアパタイト（以下、ＨＡＰと略記する）は、骨や歯の基本成分であり、生体親和性が高く、糖やタンパク質を吸着しやすい性質がある。そのため、ＨＡＰは、骨や歯の補填材料等の医療用基材、カラム充填材、薬物輸送担体、あるいは細胞培養基盤として幅広く利用されている。こうしたＨＡＰの特性をさらに生かすために、その表面を機能性高分子や生理活性物質で化学修飾させることが求められている。しかしながら、その足がかりとなるＨＡＰ表面の水酸基は、反応性が低く、機能性高分子や生理活性物質等の有機化合物を均一に結合させることが難しい。
【０００３】
アパタイト粒子の化学修飾については、ナノアパタイト粒子にヘキサメチレンジイソシアネートを用いてポリエチレングリコールを結合させた、Liu Qiugらの報告がある（Biomaterials (1998), 19(11-12), 1067-1072）。また、古薗らは、アパタイト粒子にアミノ基を持つシランカップリング剤を結合させ、カルボン酸とアミノ基との縮合反応によりポリアクリル酸を介してシリコーンシートと結合した経皮デバイスの開発に成功している（J Biomed Mater Res. (2001), 56(1),9-16）。さらに、田中らは、２種類以上の官能基を有するシランカップリング剤やイソシアネート化合物を用いて、ＨＡＰ多孔体表面に反応性の高い有機官能基を導入し、該ＨＡＰ多孔体表面に有機物質を共有結合させることに成功し、これがクロマトグラフ用カラム充填剤、ＤＤＳ担体、イオン交換媒体、細胞培養基盤、インプラント等として幅広く利用できることを示した（特開２００３−３４２０１１号公報）。
【０００４】
しかしこれらは、いずれもその調製過程でバイファンクショナルなリンカー試薬を用いるため、ハイドロキシアパタイト粒子同士の架橋結合が必然的に避けられず、この架橋ハイドロキシアパタイト粒子が、副生成物として混在する問題点がある。また、反応性の高いシランカップリング剤やイソシアネート化合物を使用しているため、残存するこれら反応性官能基の安全性も問題と考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Biomaterials (1998), 19(11-12), 1067-1072
【非特許文献２】J Biomed Mater Res. (2001), 56(1),9-16
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−３４２０１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、バイファンクショナルリンカーを用いず、ハイドロキシアパタイト粒子表面をポリエチレングリコール誘導体で修飾することにより、安全性の高い、新たな機能を有するＰＥＧ修飾ＨＡＰを提供し、加えてそれを利用する用途とその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明者らは、鋭意検討した結果、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体を用いてＨＡＰの表面にポリエチレングリコールを−Ｏ（ＣＯ）で結合導入することに成功した。さらに、該新規ＰＥＧ修飾ＨＡＰに、各種医薬をローデイングさせたドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）は、剤形的には、経口、静脈注、皮下注、経肺、経鼻に、有効に利用し得ること、及び薬物の肝臓、肺又は炎症部位等への選択的デリバリー、放出制御、いやな味のマスキング又は腸管吸収の改善等に有効に応用できることを見出した。
【０００９】
このＰＥＧ修飾ＨＡＰは、アパタイト固有の高い機械的強度と各種物質吸着能を維持すると共に、血中滞留性等の特性を併せ持つことが期待できる。そのため、ＤＤＳ担体を始め、クロマトグラフ用カラム充填剤、イオン交換媒体、細胞培養基盤、インプラント等として幅広く利用し得る。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２３）を提供するものである。
（１）
粒径が５０μｍ〜１０ｎｍのハイドロキシアパタイトと、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体からなる混合物であって、炭素含量が１０〜０．１％の物質。
（２）
粒径が５０μｍ〜１０ｎｍのハイドロキシアパタイトが、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体と−Ｏ（ＣＯ）で結合されていて、炭素含量が１０〜０．１％の物質。
【００１１】
（３）
請求項１記載の物質及び医薬品有効成分からなり、医薬品有効成分の重量比が１〜３０％の物質、又は、請求項１記載の物質及び医薬品有効成分および医薬品添加物からなり、医薬品有効成分の重量比が１〜３０％の物質。
（４）
請求項２記載の物質及び医薬品有効成分からなり、医薬品有効成分の重量比が１〜３０％の物質、又は、請求項２記載の物質及び医薬品有効成分および医薬品添加物からなり、医薬品有効成分の重量比が１〜３０％の物質。
【００１２】
（５）
請求項３又４記載の物質から調製される医薬品。
（６）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がｓｉＲＮＡ、アプタマー、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド又は蛋白質であるところの請求項３又は４記載の物質。
（７）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がクラリスロマイシンであるところの請求項３又は４記載の物質。
（８）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がイトラコナゾールであるところの請求項３又は４記載の物質。
（９）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がｓｉＲＮＡであるところの請求項３又は４記載の物質。
【００１３】
（１０）
サブミクロンサイズのハイドロキシアパタイトと、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体の活性エステルを無水有機溶媒中で処理してサブミクロンサイズの請求項１又は２記載の物質を得る方法。
（１１）
サブミクロンサイズの請求項１又は２記載の物質と医薬有効成分又は医薬添加物を有機溶媒中で処理して請求項３又は４記載の物質を得る方法。
【００１４】
（１２）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がカンデサルタンであるところの請求項３又は４記載の物質。
（１３）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がカンデサルタンシレキセチルであるところの請求項３又は４記載の物質。
（１４）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分が、配列が
5'-GUGAAGUCAACAUGCCUGCTT-3'（配列番号１）
5'-GCAGGCAUGUUGACUUCACTT-3'（配列番号２）
である二重螺旋のｓｉＲＮＡであるところの請求項３又は４記載の物質。
（１５）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分が、配列が
5'-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3'（配列番号３）
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3'（配列番号４）
である二重螺旋のｓｉＲＮＡであるところの請求項３又は４記載の物質。
【００１５】
（１６）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がエトポシドであるところの請求項３又は４記載の物質。
（１７）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がメシル酸ネルフィナビルであるところの請求項３又は４記載の物質。
（１８）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がシンバスタチンであるところの請求項３又は４記載の物質。
（１９）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分が７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシンであるところの請求項３又は４記載の物質。
【００１６】
（２０）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がパクリタキセルであるところの請求項３又は４記載の物質。
（２１）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がメシル酸サキナビルであるところの請求項３又は４記載の物質。
（２２）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がインスリンであるところの請求項３又は４記載の物質。
（２３）
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がブロモクリプチンメシル酸塩であるところの請求項３又は４記載の物質。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、次のような効果を奏することができる。
（１） 難溶性の医薬物質であっても、本発明のＰＥＧ修飾ＨＡＰを基材に用いることで、可溶性物質のように取り扱うことができ、体内への薬物投与が容易となり、さらに体内血中滞留性の向上が図られる
（２） ＨＡＰ表面をＰＥＧ化することで、ＨＡＰ粒子同士の凝集を防止することができる。
（３） 表面をＰＥＧ化したＨＡＰを基材に用いることで、有効成分をローディングしたＨＡＰ粒子についても、粒子同士の凝集を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１のＰＥＧ修飾ＨＡＰの粒度分布を示すグラフ。
【図２】実施例２のＰＥＧ修飾ＨＡＰとクラリスロマイシンとからなる医薬の粒度分布を示すグラフ。
【図３】実施例３のＰＥＧ修飾ＨＡＰとイトラコナゾールとからなる医薬の粒度分布を示すグラフ。
【図４】実施例４のｓｉＲＮＡコーティングＰＥＧ修飾ＨＡＰの蛍光顕微鏡写真（×１０００）で、（ａ）フルオレセイン標識ｓｉＲＮＡコーティング品、（ｂ）ローダミン標識ｓｉＲＮＡコーティング品。
【図５】実施例１８の結果のカンデサルタンの時間（分）による溶出濃度を示すグラフ。
【図６】実施例１９の結果のラットに静脈注射後のプラズマ中の時間（時）による濃度変化を示すグラフ。
【図７】実施例２０の結果のラットに経口投与後のプラズマ中の時間（時）による濃度変化を示すグラフ。
【図８】実施例２１の結果のラットに静脈注射後のプラズマ中の時間（時）による濃度変化を示すグラフ。
【図９】実施例２２の結果のラットに経口投与後のプラズマ中の時間（時）による濃度変化を示すグラフ。
【図１０】実施例２３の結果のＡ５４９細胞に対する細胞毒性を示すグラフ。
【図１１】実施例２４の結果のＡ５４９細胞へのトランスフェクション試験の４時間経過後の細胞の蛍光顕微鏡写真。
【図１２】実施例２６の結果のレーザー共焦点顕微鏡写真。
【図１３】実施例２７の結果のレーザー共焦点顕微鏡写真。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、バイファンクショナルリンカーを用いず、モノファンクショナルポリエチレングリコール誘導体でハイドロキシアパタイト粒子表面にポリエチレングリコール誘導体を結合させて得られた、安全性の高い、新たな機能を有するＰＥＧ修飾ＨＡＰ及びその用途と製造方法に関する。
ＰＥＧ修飾に付されるＨＡＰは、多数の細孔（気孔）を有するＨＡＰ固体であっても良いし、気孔率のあまり高くないＨＡＰでも良い。
【００２０】
ＨＡＰは、一般組成をＣａ５（ＰＯ４）３ＯＨ、とする化合物であり、その反応の非化学量論性によって、ＣａＨＰＯ４ 、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、ＣａＰ４Ｏ１１、Ｃａ（ＰＯ３）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２Ｈ２Ｏなどリン酸カルシウムと称される１群の化合物を含む。また、ＨＡＰは、Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨ、又はＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２の組成式で示される化合物を基本成分とするもので、Ｃａ成分の一部分は、Ｓｒ、Ｂａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ａｌ、Ｙ、Ｌａ、Ｎａ、Ｋ、Ｈなどから選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、（ＰＯ４）成分の一部分が、ＶＯ４、ＢＯ３、ＳＯ４、ＣＯ３、ＳｉＯ４等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。更に、（ＯＨ）成分の一部分が、Ｆ、Ｃｌ、Ｏ、ＣＯ３等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、これらの各成分の一部が欠陥となっていてもよい。生体骨中のアパタイトのＰＯ４及びＯＨ成分の一部は、通常ＣＯ３に置換されているため、本複合生体材料の製造中、大気中からのＣＯ３の混入と各成分への一部置換（０〜１０質量％程度）があってもよい。
【００２１】
なお、ＨＡＰは、通常の微結晶・非晶質並びに結晶体の他に、同型固溶体、置換型固溶体、侵入型固溶体であってもよく、非量子論的欠陥を含むものであってもよい。また、この「ＨＡＰ」中、カルシウム及びリンの原子比（Ｃａ／Ｐ）は１．３〜１．８の範囲内にあることが好ましく、特に１．５〜１．７がより好ましい。原子比が１．３〜１．８の範囲内にあると、生成物中のアパタイト（リン酸カルシウム化合物）の組成と結晶構造が、脊椎動物の骨の中に存在するアパタイトと類似の組成と構造をとりうるため、生体親和性がより高くなるからである。
ＰＥＧ修飾に付されるＨＡＰは、公知の方法で調製することが出来るが、市販のもの、例えばＡｌｄｒｉｃｈ社製Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ, ｎａｎｏｐｏｗｄｅｒを利用しても良い。
【００２２】
本発明で用いられる「モノファンクショナルポリエチレングリコール誘導体」としては、市販の高純度一官能性活性化ＰＥＧ修飾剤を用いたがこれに限定するものではない。ＰＥＧ部分を直鎖にするか分枝にするか、又はＰＥＧ部分の分子量等は、目的に応じて任意に選択調節できる。
修飾時の反応溶媒は、無水有機溶媒、特にジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、ジメチルスルホキサイド(ＤＭＳＯ)、酢酸、アセトン、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)、酢酸エチル、ジクロロメタンが使用できるが、特に医薬品の残留溶媒ガイドラインに記すクラス２〜３のジメチルスルホキサイド(ＤＭＳＯ)、アセトンが好ましい。反応温度は、氷冷下から１００℃、反応時間は２〜７２時間、「モノファンクショナルポリエチレングリコール誘導体」は、ＨＡＰ１ｇあたり大過剰（１〜０．１ｇ）を用いた。反応終了後、残存する過剰の「モノファンクショナルポリエチレングリコール誘導体」及び副生成物のＮ‐ヒドロキシスクシンイミドを反応に使用した有機溶媒で洗浄ろ過して除き、不溶物を減圧下乾燥して、ＰＥＧ修飾ＨＡＰを得た。ＰＥＧ修飾ＨＡＰの炭素含量は、ＰＥＧ修飾試薬量を調節することで０．１〜１０％で調節できるが、特に１〜３％前後が好ましい。
【００２３】
本発明のＰＥＧ修飾ＨＡＰは、医薬品有効成分を吸着させることで、ＤＤＳ担体として利用することができる。ＨＡＰ又はＰＥＧは生体適合性が高いため、生体内への薬物送達にも安心して利用できる（Ｊ Ｍａｔｅｒ Ｓｃｉ. (２０００), １１(２),６７‐７２）。
標的器官に特異的なリガンドを結合させれば、より確実に目的とする器官に薬剤を送達することも可能となる。また、医薬品有効成分が難水溶性で注射製剤が不可能又は腸管吸収の悪い場合、サブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰに医薬品有効成分を吸着させることで、間接的に医薬品有効成分をサブミクロンサイズに調整でき、注射製剤の開発及び経口吸収改善に広く応用できる。さらに、サブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰに医薬品有効成分としてＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白質等を吸着させた物質は、それら医薬品有効成分の有望なＤＤＳとして応用可能である。
【００２４】
ＰＥＧ修飾ＨＡＰと医薬品有効成分又は医薬品添加物とからなる物質は以下の方法で調製した。医薬品有効成分又は医薬品添加物を医薬品の残留溶媒ガイドラインに記すクラス２〜３のＤＭＳＯ、エタノール（ＥｔＯＨ）、アセトン等の溶媒に溶解させ、これに重量比で９０％比のＰＥＧ修飾ＨＡＰを加え、室温下超音波処理後、この懸濁液全量を凍結乾燥又は減圧下溶媒留去して、請求項記載の物質を得た。医薬品有効成分又は医薬品添加物のＰＥＧ修飾ＨＡＰに対する搭載率は、医薬品有効成分又は医薬品添加物にも依存するが１〜３０％で調製できる。特に１０％前後が好ましい。
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰの調製〕
（１）ＰＥＧ修飾ＨＡＰの調製
ハイドロキシアパタイト−ナノパウダー〔Ａｌｄｒｉｃｈ ６７７４１８〕２００ｍｇのアセトン２０ｍｌ懸濁液に、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)修飾剤（ＮＯＦ社製 ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ‐０２０ＣＳ）２００ｍｇを加え、３０分間超音波（周波数２８ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を照射した。この懸濁液を室温にて１８時間攪拌後、遠心分離（９０００×ｇ, ２０℃,３０分間）し、上清をデカンテーションにて除去した。沈殿物をアセトンにて２回洗浄（２０ｍｌ×２）した後、減圧下、５０℃にて１８時間乾燥し、ＰＥＧ修飾ＨＡＰ １５８ｍｇを白色粉末として得た。
【００２６】
（２）残留溶媒、及びＰＥＧ修飾率の測定
調製したＰＥＧ修飾ＨＡＰ中の残留溶媒をガスクロマトグラフ(ＧＣ)法で、ＰＥＧ修飾率としてＣＨＮ元素分析法で炭素含量を定量した結果を以下に示す。
残留溶媒（アセトン）濃度：< １００μｇ／ｇ
炭素含量：２．０１％
＜ＧＣ分析条件＞
装置：ＨＰ‐５８９０ＩＩシステム （Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ製）
カラム：ＤＢ‐６２４ ７５ｍｍ×０．５３ ｍｍ 膜厚０．３μｍ
カラム温度：４０℃ → ２６０℃
キャリアガス：ヘリウム ７ ｐｓｉ
検出器：水素炎イオン検出器(ＦＩＤ) ２５０℃
＜ＣＨＮ元素分析条件＞
機器：ｖａｒｉｏ ＥＬ ＩＩＩ （Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ ＡｎａｌｙｓｅｎｓｙｓｔｅｍｅＧｍｂＨ）
燃焼炉温度：９５０℃
還元炉温度：５００℃
ヘリウム流量：２００ ｍｌ／ｍｉｎ
酸素流量：３０ ｍｌ／ｍｉｎ
燃焼時間：９０ ｓｅｃ
【００２７】
（３）粒子径分布測定
調製したＰＥＧ修飾ＨＡＰ １ｍｇをミリＱ水 (１５ｍｌ)に懸濁し、超音波（周波数２８ ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を５分間照射した後、粒子経測定を行った。[測定機器：ＨＯＲＩＢＡ レーザー回折／散乱式粒子径分布測定装置 ＬＡ‐９５０] 結果を図１に示す。
【実施例２】
【００２８】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとクラリスロマイシンからなる物質の調製〕
（１）ＰＥＧ修飾ＨＡＰとクラリスロマイシンからなる物質の調製
ＰＥＧ修飾ＨＡＰ(１００ｍｇ)にクラリスロマイシン(８ｍｇ)のＤＭＳＯ(２ｍｌ)溶液を加えた後、超音波（周波数２８ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を２分間照射した。この懸濁液を凍結乾燥し、白色粉末 １０８．６ ｍｇを得た。これを更に減圧下、５０℃にて３６時間乾燥し目的物１０８．１ｍｇを白色粉末として得た。
【００２９】
（２）薬物吸着率の測定
本品１０ｍｇにアセトニトリル １ｍｌを加え、超音波（周波数２８ ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を５分間照射した。この懸濁液を遠心分離（９０００×ｇ， ２０℃， ３分間）し、上清を更に０．２２μｍのフィルターにてろ過しＨＰＬＣ用サンプルとした。ＨＰＬＣ分析より、本品１０ｍｇ中にクラリスロマイシン０．７４ｍｇが含有されていることを確認した。吸着率：７．４％（ｗ／ｗ）
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
機器：Waters Alliance 2695 Separations Module, Waters 2487 Dual λAbsorbance Detector
カラム：Atlantis dC18， particle size ３．０μｍ， ３．９ ｍｍ×１００ｍｍ(Waters)
移動層：Ａ : ０．６７ ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素カリウム試液 Ｂ : アセトニトリル。
Ａ：Ｂ＝６５：３５（ｖ／ｖ）
流速：１．０ ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２１０ ｎｍ
Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ：７．１ ｍｉｎ
【００３０】
（３）粒子径分布測定
本品１ｍｇをミリＱ水 (１５ｍｌ)に懸濁し、超音波（周波数２８ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を５分間照射した後、粒子計測定を行った。結果を図２に示す。
【実施例３】
【００３１】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとイトラコナゾールからなる物質の調製〕
（１）組成物の調製
ＰＥＧ修飾ＨＡＰ(３００ｍｇ)にイトラコナゾール(２４ｍｇ)のＤＭＳＯ(４．８ｍｌ)溶液を加えた後、超音波（周波数２８ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を２分間照射した。この懸濁液を凍結乾燥し、白色粉末３２４．３ｍｇを得た。これをミリＱ水(１５ｍｌ)に懸濁後、コンドロイチン硫酸ナトリウム水溶液 [１０ｍｇ／ｍｌ] (０．３ｍｌ)を添加し、超音波（周波数２８ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を２分間照射した。この懸濁液を凍結乾燥し白色粉末３２２．６ｍｇ得た。
【００３２】
（２）薬物吸着率の測定
本品１０ｍｇにアセトニトリル１ｍｌを加え、超音波（周波数２８ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を５分間照射した。この懸濁液を遠心分離（９０００×ｇ, ２０℃, ３分間）し、上清を更に０．２２μmのフィルターでろ過し、ＨＰＬＣ用サンプルとした。ＨＰＬＣ分析
より、本品１０ｍｇ中にイトラコナゾール０．７４ｍｇが含有されていることを確認した。吸着率：７．４％（ｗ／ｗ）
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
機器：Waters Alliance 2695 Separations Module， Waters 2487 Dual λAbsorbance Detector
カラム：XBridge C18, particle size ３．５μｍ, ４．６ ｍｍ×１００ｍｍ(Waters)
移動層：Ａ：０．２％ ジイソプロピルアミン-メタノール溶液 Ｂ：０．５％ 酢酸アンモニウム水溶液。 Ａ：Ｂ=４：１（ｖ／ｖ）
流速：０．９ ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２６３ ｎｍ
Retention time：３．０ ｍｉｎ
【００３３】
（３）粒子径分布測定
本品１ｍｇをミリＱ水 (１５ｍｌ)に懸濁し、超音波（周波数２８ｋＨｚ、出力１００Ｗ）を５分間照射した後、粒子計測定を行った。結果を図３に示す。
【実施例４】
【００３４】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとｓｉＲＮＡからなる物質の調製〕
（１） ＰＥＧ修飾ＨＡＰと蛍光標識ｓｉＲＮＡからなる物質の調製
ＰＥＧ修飾ＨＡＰ６ｍｇを量り取り、純水１０ｍｌを加えた。混合液を乳化・分散機へ移し、１６０００ｒｐｍで１分間処理し、均一な懸濁液を得た。懸濁液３ｍｌに対し、１０ｍｇ／ｍｌ 蛍光標識ｓｉＲＮＡ水溶液１８μｌを加え、十分混合した。
（２） 蛍光顕微鏡観察
本品３ｍｌにグリセリン６ｍｌを加えた。蛍光顕微鏡にてサンプルの観察を行った。蛍光励起波長は、フルオレセイン標識品は４９０ｎｍ、ローダミン標識品は５５０ｎｍに設定した。結果を図４に示す。
（３） 結果
蛍光顕微鏡観察より、ｓｉＲＮＡはＰＥＧ修飾ＨＡＰ表面にコーティングされていることがわかった。
【実施例５】
【００３５】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとイトラコナゾールからなる物質をラットに投与した際の血中動態試験〕
（１） 試験目的
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとイトラコナゾールからなる物質を、ラットに静脈内及び経口投与し血中濃度の推移を確認し、バイオアベイラビリテイーを算出した。
（２） 被験物質
（１）静脈内投与用
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとイトラコナゾールからなる物質の水性懸濁液
保存条件：遮光・室温保存
（２）経口投与用
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとイトラコナゾールからなる物質の水性懸濁液
保存条件：遮光・室温保存
（３） 動物
・ 動物種：ラット，系統：ＳＤ，性別：雄
・ 例数：ｎ＝３
投与時週齢：7週齢
・ 投与時摂餌条件：非絶食
・ 投与量：静脈内投与； ５ ｍｇ／2 ｍｌ／ｋｇ(２７Ｇ注射針
を使用して静注)
経口投与； １２ ｍｇ／４．８ ｍｌ／ｋｇ
【００３６】
（４） 採血
血漿採取時点：投与後０．５，２，６，１８，２４，４８，１６８時間
血漿採取：尾静脈からヘパリンナトリウム処理した毛細管を用いて血液約０．５ ｍｌを採取する。
血液を遠心分離（１２０００ ｒｐｍ，４℃，３分間）して得られた血漿は、測定まで−２０℃で凍結保存した。
（５） 症状観察：一般状態の観察のみ実施し、特定部位及び特定組織の観察は実施していない。
（６） 血漿中濃度の測定
分析方法
・ 測定対象：イトラコナゾール
・ 標準物質：イトラコナゾール
保存条件：冷暗所
・ 内標準物質：ロラタジン
保存条件：冷暗所
・ 分析条件：ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ
【００３７】
（７） ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件
カラム：CAPCELL PAK C18 MG II, ５０ｍｍ×４．６ｍｍ id, ５ｍｍ(資生堂)
移動層：Ａ : ２ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム Ｂ : アセトニトリル。
Ａ:Ｂ=３５：６５（ｖ／ｖ）
流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ
イオン源：ＡＰＣＩ
極性：正イオン
検出イオン：ｍ／ｚ705.1, 392.1（イトラコナゾール）
ｍ／ｚ383.5, 337.2[ Ｉ．Ｓ．（インターナルスタンダード）]
（８） 前処理
・ 検量線試料及び測定用試料にＩ．Ｓ.溶液１００μｌを加え、攪拌した。ブランク試料にはアセトニトリル１００μｌを加え、攪拌した。
・ アセトニトリル７００μｌを加え、攪拌した。
・ 約１２０００×ｇで１０分間(４℃)遠心分離した。
・ 上清５μｌをＬＣ／ＭＳ／ＭＳに注入した。
【００３８】
（９） 結果
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとイトラコナゾールからなる物質の０．５〜２４時間でのバイオアベイラビリテイーは、約５７％と高い腸管吸収改善効果がみられた。（表１）
同時に行った市販イトリゾール注及びイトリゾールカプセル５０の血中動態インビボ試験結果から、経口イトリゾールカプセル５０のイトリゾール注に対する０．５〜４８時間でのバイオアベイラビリテイーは約３９％であった。
この結果から、サブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰと難水溶性医薬とからなる物質が、新規注射製剤として及び高い経口吸収を示す優れた経口製剤とし有用であることが示された。
【００３９】
【表１】
【実施例６】
【００４０】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとクラリスロマイシンからなる物質をラットに投与した際の血中動態試験〕
（１） 試験目的
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとクラリスロマイシンからなる物質を、ラットに静脈内及び皮下投与し血中濃度の推移を確認した。
（２） 被験物質
（1）静脈内投与用
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとクラリスロマイシンからなる物質の水性懸濁液
保存条件：遮光・室温保存
（2）皮下投与用
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとクラリスロマイシンからなる物質の水性懸濁液
保存条件：遮光・室温保存
（３）動物
・ 動物種：ラット，系統：ＳＤ，性別：雄
・ 例数：ｎ＝３
投与時週齢：７週齢
・ 投与時摂餌条件：非絶食
・ 投与量：静脈内投与； １ ｍｇ／ｍｌ／ｋｇ（２７Ｇ注射針を使用して静注）
皮下投与； ２ ｍｇ／２ ｍＬ／ｋｇ（２７Ｇ注射針を使用して皮下注）
【００４１】
（４） 採血
血漿採取時点：投与後０．５，２，６，１２，２４，４８，１６８時間
血漿採取：尾静脈からヘパリンナトリウム処理したパスツールピペットを用いて血液約０．５ ｍｌを採取する。
血液を遠心分離（８０００×ｇ，４℃，３分間）して得られた血漿は、測定まで−２０℃で凍結保存した。
（５） 症状観察：一般状態の観察のみ実施し、特定部位及び特定組織の観察は実施していない。
（６） 血漿中濃度の測定
分析方法
・ 測定対象：クラリスロマイシン
・ 標準物質：クラリスロマイシン
保存条件：冷暗所
・ 内標準物質：エリスロマイシンＢ
保存条件：冷暗所
・ 分析条件：ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ
【００４２】
（７） ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件
カラム：Atlantis dC18 ３ｍｍ, ４．６ｍｍ ID x ７５ｍｍ(ウオーターズ)
ガードカラム：Atlantis dC18 ３ｍｍ, ４．６ｍｍ ID x ２０ｍｍ(ウオーターズ)
移動層：Ａ: ２０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム Ｂ : アセトニトリル。
Ａ:Ｂ=５５：４５（ｖ／ｖ），流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ
イオン源：ESI
極性：正イオン
検出イオン：m/z748.6, 158.2（クラリスロマイシン）
m/z718.6, 158.3[ I.S.（インターナルスタンダード）]
（８） 前処理
１． 検量線試料、ブランク試料及び測定用試料に５％(ｗ／ｖ)炭酸ナトリウム２００μｌ及び酢酸エチル４μｌを添加した。
２． 室温で約１５分間振とうした後、約１８００ x ｇ、室温、１０分間で遠心分離した。
３． 上清(有機層)を１３ｍｌポリプロピレン製(ｐ．ｐ．)チューブに移した。
４． 上清を窒素気流下濃縮乾固（４０度Ｃ、約３０分）した。
５． 残渣に再溶解溶液１ｍｌを添加後、攪拌した。
６． １０μｌをＬＣ／ＭＳ／ＭＳに注入した。
【００４３】
（９） 結果
表２に示すように、サブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰと難水溶性医薬クラリスロマイシンとからなる物質が、新規注射製剤（２７Ｇ注射針を使用して静注及び皮下注可能）として有用であることが示された。
【表２】
【実施例７】
【００４４】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：7.4 %(w/w)
【実施例８】
【００４５】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンシレキセチルからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：6.3 %(w/w)
【実施例９】
【００４６】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰと
5'-GUGAAGUCAACAUGCCUGCTT-3'（配列番号１）
5'-GCAGGCAUGUUGACUUCACTT-3'（配列番号２）
からなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例４と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
蛍光分析法により確認した。吸着率：20 %(w/w)
【実施例１０】
【００４７】
［ＰＥＧ修飾ＨＡＰと
5'-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3'（配列番号３）
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3'（配列番号４）
からなる物質の調製］
（１） 組成物の調製
実施例４と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
蛍光分析法により確認した。吸着率：20 %(w/w)
【実施例１１】
【００４８】
［ＰＥＧ修飾ＨＡＰとエトポシドからなる物質の調製］
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：8.0 %(w/w)
【実施例１２】
【００４９】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとメシル酸ネルフィナビルからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：7.4 %(w/w)
【実施例１３】
【００５０】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとシンバスタチンからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：7.9 %(w/w)
【実施例１４】
【００５１】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰと7-エチル-10-ヒドロキシ-カンプトテシンからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：6.8 %(w/w)
【実施例１５】
【００５２】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとパクリタキセルからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：7.4 %(w/w)
【実施例１６】
【００５３】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとメシル酸サキナビルからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：8.0 %(w/w)
【実施例１７】
【００５４】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとインスリンからなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例４と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：12.7 %(w/w)
【実施例１８】
【００５５】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンからなる物質のパドル法による溶出試験〕
（結果）
図５は、カンデサルタンの時間（分）による溶出濃度を示すグラフである。
図５に示すように、カンデサルタン医薬品原薬からのカンデサルタンの溶出は、およそ一時間を要するのに比べ、ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンからなる物質からのカンデサルタンの溶出は早く、およそ５分で完了した。
【実施例１９】
【００５６】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンからなる物質をラットにi.v.（静脈注射）投与した際の血中動態試験〕
（結果）
図６は、ラットに静脈注射後のプラズマ（血漿）中の時間（時）による濃度変化を示すグラフである。
図６に示すように、サブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰと難水溶性医薬カンデサルタンからなる物質が、新規注射製剤（27G注射針を使用して静注及び皮下注可能）として有用であることが示された。
【実施例２０】
【００５７】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンからなる物質をラットにpo.（経口）投与した際の血中動態試験〕
（結果）
図７は、ラッドに経口投与後のプラズマ中の時間（時）による濃度変化を示すグラフである。
図７に示すように、ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンからなる物質は、市販のブロプレス（登録商標）-タブレット錠に匹敵する経口吸収性を示した。
【実施例２１】
【００５８】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンシレキセチルからなる物質をラットにi.v.投与した際の血中動態試験〕
（結果）
図８は、ラットに静脈注射後のプラズマ中の時間（時）による濃度変化を示すグラフである。
図８に示すように、サブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰと難水溶性医薬カンデサルタンシレキセチルからなる物質が、新規注射製剤（27G注射針を使用して静注及び皮下注可能）として有用であることが示された。
【実施例２２】
【００５９】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンシレキセチルからなる物質をラットにpo.投与した際の血中動態試験〕
（結果）
図９は、ラットに経口投与後のプラズマ中の時間（時）による濃度変化を示すグラフである。
図９に示すように、ＰＥＧ修飾ＨＡＰとカンデサルタンシレキセチルからなる物質は、市販のブロプレス-タブレット錠のおよそ１．５倍の経口吸収性を示した。
【実施例２３】
【００６０】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰと
5'-GUGAAGUCAACAUGCCUGCTT-3'（配列番号１）
5'-GCAGGCAUGUUGACUUCACTT-3'（配列番号２）
からなる物質のin vitro細胞毒性評価試験〕
（結果）
図１０は、Ａ５４９細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
図１０中、Ａに示すように、ＰＥＧ修飾ＨＡＰと
5'-GUGAAGUCAACAUGCCUGCTT-3'（配列番号１）
5'-GCAGGCAUGUUGACUUCACTT-3'（配列番号２）
からなる物質は、Ａ５４９ヒト肺癌細胞に対しおよそ５０％細胞生存率を示した。図１０中Ｃに示すポジテイブコントロール(株式会社同仁化学研究所製HilyMaxを使用)に匹敵する強い効果を示した。一方図１０中、Ｂに示すネガテイブコントロールでは、およそ７０％細胞生存率を示した。
【実施例２４】
【００６１】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰと
蛍光ラベル化5'-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3'（配列番号３）
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3'（配列番号４）
からなる物質のＡ５４９細胞へのトランスフェクション試験と蛍光顕微鏡観察〕
（結果）
Ａ５４９ヒト肺癌細胞に、ＰＥＧ修飾ＨＡＰと
蛍光ラベル化5'-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3'（配列番号３）
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3'（配列番号４）
からなる物質を添加後、４時間経過後の細胞の蛍光顕微鏡写真を図１１に示す。
【実施例２５】
【００６２】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとエトポシドからなる物質をラットにi.v.投与した際の動態試験〕
（結果）
表３に示すようにサブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰと難水溶性医薬エトポシドからなる物質は市販のエトポシド注射薬（ベプシド注）と比較し、エトポシドが肝臓に高く集積することが認められた。
【００６３】
【表３】
【実施例２６】
【００６４】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとシンバスタチンからなる物質の顕微鏡観察〕
（結果）
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとシンバスタチンからなる物質のレーザー共焦点顕微鏡写真を図１２に示す。粒径のそろったサブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰとシンバスタチンからなる物質粒子がブラウン運動している様子が観察された。
【実施例２７】
【００６５】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとメシル酸ネルフィナビルからなる物質の顕微鏡観察〕
（結果）
ＰＥＧ修飾ＨＡＰとメシル酸ネルフィナビルからなる物質のレーザー共焦点顕微鏡写真を図１３に示す。粒径のそろったサブミクロンサイズのＰＥＧ修飾ＨＡＰとメシル酸ネルフィナビルからなる物質粒子がブラウン運動している様子が観察された。
【実施例２８】
【００６６】
〔ＰＥＧ修飾ＨＡＰとブロモクリプチンメシル酸塩からなる物質の調製〕
（１） 組成物の調製
実施例２又は実施例３と類似の方法により調製した。
（２） 薬物吸着率の測定
実施例２又は実施例３と類似の方法により確認した。吸着率：4.2 %(w/w)
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒径が５０μｍ〜１０ｎｍのハイドロキシアパタイトと、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体からなり、炭素含量が１０〜０．１％の物質。
【請求項２】
粒径が５０μｍ〜１０ｎｍのハイドロキシアパタイトが、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体と−Ｏ（ＣＯ）で結合されていて、炭素含量が１０〜０．１％の物質。
【請求項３】
請求項１記載の物質及び医薬品有効成分又は医薬品添加物からなり、医薬品有効成分の重量比が１〜３０％の物質。
【請求項４】
請求項２記載の物質及び医薬品有効成分又は医薬品添加物からなり、医薬品有効成分の重量比が１〜３０％の物質。
【請求項５】
請求項３又４記載の物質から調製される医薬品。
【請求項６】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がｓｉＲＮＡ、アプタマー、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド又は蛋白質であるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項７】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がクラリスロマイシンであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項８】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がイトラコナゾールであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項９】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がｓｉＲＮＡであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１０】
サブミクロンサイズのハイドロキシアパタイトと、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体の活性エステルを無水有機溶媒中で処理してサブミクロンサイズの請求項１又は２記載の物質を得る方法。
【請求項１１】
サブミクロンサイズの請求項１又は２記載の物質と医薬有効成分又は医薬添加物を有機溶媒中で処理して請求項３又は４記載の物質を得る方法。
【請求項１２】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がカンデサルタンであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１３】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がカンデサルタンシレキセチルであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１４】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分が
5'-GUGAAGUCAACAUGCCUGCTT-3'（配列番号１）
5'-GCAGGCAUGUUGACUUCACTT-3'（配列番号２）
であるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１５】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分が
5'-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3'（配列番号３）
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3'（配列番号４）
であるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１６】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がエトポシドであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１７】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がメシル酸ネルフィナビルであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１８】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がシンバスタチンであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１９】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分が７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシンであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項２０】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がパクリタキセルであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項２１】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がメシル酸サキナビルであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項２２】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がインスリンであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項２３】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がブロモクリプチンメシル酸塩であるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１】
粒径が５０μｍ〜１０ｎｍのハイドロキシアパタイトと、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体からなり、炭素含量が１０〜０．１％の物質。
【請求項２】
粒径が５０μｍ〜１０ｎｍのハイドロキシアパタイトが、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体と−Ｏ（ＣＯ）で結合されていて、炭素含量が１０〜０．１％の物質。
【請求項３】
請求項１記載の物質及び医薬品有効成分又は医薬品添加物からなり、医薬品有効成分の重量比が１〜３０％の物質。
【請求項４】
請求項２記載の物質及び医薬品有効成分又は医薬品添加物からなり、医薬品有効成分の重量比が１〜３０％の物質。
【請求項５】
請求項３又４記載の物質から調製される医薬品。
【請求項６】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がｓｉＲＮＡ、アプタマー、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド又は蛋白質であるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項７】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がクラリスロマイシンであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項８】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がイトラコナゾールであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項９】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がｓｉＲＮＡであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１０】
サブミクロンサイズのハイドロキシアパタイトと、末端官能基としてカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体の活性エステルを無水有機溶媒中で処理してサブミクロンサイズの請求項１又は２記載の物質を得る方法。
【請求項１１】
サブミクロンサイズの請求項１又は２記載の物質と医薬有効成分又は医薬添加物を有機溶媒中で処理して請求項３又は４記載の物質を得る方法。
【請求項１２】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がカンデサルタンであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１３】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がカンデサルタンシレキセチルであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１４】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分が
5'-GUGAAGUCAACAUGCCUGCTT-3'（配列番号１）
5'-GCAGGCAUGUUGACUUCACTT-3'（配列番号２）
であるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１５】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分が
5'-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3'（配列番号３）
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3'（配列番号４）
であるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１６】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がエトポシドであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１７】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がメシル酸ネルフィナビルであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１８】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がシンバスタチンであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項１９】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分が７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシンであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項２０】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がパクリタキセルであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項２１】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がメシル酸サキナビルであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項２２】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がインスリンであるところの請求項３又は４記載の物質。
【請求項２３】
請求項３又は４記載の医薬品有効成分がブロモクリプチンメシル酸塩であるところの請求項３又は４記載の物質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図４】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図４】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１０−１８７７２（Ｐ２０１０−１８７７２Ａ）
【公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１３５８５（Ｐ２００９−１３５８５）
【出願日】平成２１年１月２３日（２００９．１．２３）
【出願人】（００００００２３９）株式会社荏原製作所 (1,477)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２３日（２００９．１．２３）
【出願人】（００００００２３９）株式会社荏原製作所 (1,477)
【Ｆターム（参考）】
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