ペニシリン結合タンパク質の発現及びその抗生物質のハイスループット検出への応用
【課題】細菌から完全長クラスＡ型ペニシリン結合タンパク質を発現及び精製するための方法、及び該タンパク質を用いた抗生物質のハイスループットスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】細菌のゲノムＤＮＡから完全長ペニシリン結合タンパク質のＤＮＡ配列を増幅させ、ＤＮＡ配列をベクターにクローニングし、ホスト細胞内でＤＮＡ配列を発現させて完全長ペニシリン結合タンパク質を得て、タンパク質を界面活性剤で可溶化し、タンパク質を精製する、完全長クラスＡ型ペニシリン結合タンパク質を精製する方法。
【解決手段】細菌のゲノムＤＮＡから完全長ペニシリン結合タンパク質のＤＮＡ配列を増幅させ、ＤＮＡ配列をベクターにクローニングし、ホスト細胞内でＤＮＡ配列を発現させて完全長ペニシリン結合タンパク質を得て、タンパク質を界面活性剤で可溶化し、タンパク質を精製する、完全長クラスＡ型ペニシリン結合タンパク質を精製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌から完全長クラスＡ型ペニシリン結合タンパク質を発現及び精製するための方法に関する。本発明は抗生物質のハイスループットスクリーニング法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Staphylococcus aureus、Streptococcus pneumoniae及びEnterococcus faecalis等の多くの一般的な病原菌は今や多剤耐性となって公衆衛生問題として浮上してきており、新しい抗生物質が医療において求められているが、いまだもってそのニーズは満たされていない。
【０００３】
抗菌剤の開発においては、細菌細胞壁又はペプチドグリカン合成経路がターゲットであった（Silver LL (2003) Curr Opin Microbiol 6:431-438）。ペプチドグリカンの合成は幾つかの段階から成り、脂質Ｉ及び脂質ＩＩの合成、それに続く脂質ＩＩの最終トランスグリコシル化とペプチド転移によるペプチドグリカンの形成を含む（Ostash B, Walker S (2005) Curr Opin Chem Biol 9:459-466）。現在の抗生物質の多くがペプチド転移をターゲットとしたβ−ラクタム誘導体である。トランスグリコシル化プロセスを阻害する医薬品は未だ開発されていない。トランスグリコシラーゼ（ＴＧ）について唯一知られている強力な阻害剤はモエノマイシン複合体（フラボマイシン）であり、モエノマイシンＡ（図１Ａ、Ｍｏｅ Ａ、１）、Ａ１２、Ｃｌ、Ｃ３及びＣ４が含まれる（Zehl M, Pittenauer E, Rizzi A, Allmaier G (2006) Amer Soc Mass Spec 17:1081-1090）。中でも、Ｍｏｅ Ａがそのファミリーで最も豊富な薬剤である（Eichorn P, Aga DS (2005) Rapid Commun Mass Spectrom 19:2179-2186）。その特異な抗菌特性は化学者にモエノマイシンフラグメントと誘導体の合成を促すこととなった（Adachi M, Zhang Y, Leimkuhler C, Sun B, LaTour JV, Kahne DE (2006) J Am Chem Soc 128:14012-14013; Welzel P (2005) Chem Rev 105:4610-4660; Welzel P (2007) Angew Chem Int Ed Engl 46:4825-4829）。モエノマイシンＡの最初の全合成はつい最近Kahneとその同僚によって成された（Taylor TG, Li X, Oberthur M, Zhu W, Kahne DE (2006) J Am Chem Soc 128:15084-15085）。その生合成経路もまた解明されている（Ostash B, Saghatelian A, Walker S (2007) Chem Biol 14:257-267）。しかしながら、その生物学的利用能の低さから、フラボマイシンだけが動物飼料における成長促進抗生物質として利用されている（Butaye P, Devriese LA, Haesebrouck F (2003) Clin Microbiol Rev 16:175-188）。
【０００４】
トランスグリコシル化は主に二機能性クラスＡ型ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）によって触媒されている（Macheboeuf P, Contreras-Martel C, Job V, Dideberg O, Dessen A (2006) FEMS Microbiol Rev 30:673-691）。ＰＢＰはＮ−アセチルグルコサミン−Ｎ−アセチルムラミル−ペンタペプチドの重合及びペンタペプチド間の架橋による細胞壁の最終形成段階に関わる主要酵素であることから、抗生物質の発見にとって重要なターゲットの１つであると考えられている。これらの膜に固定された酵素は３つの別個のタンパク質ドメイン、つまりそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって膜貫通（Transmembrane:TM）ドメイン、トランスグリコシラーゼドメイン（Transglycosilyase:TG）、トランスペプチダーゼ（Transpeptidase:TP）ドメインから成る。S.aureusから得たＰＢＰ２細胞外ドメインと（Lovering AL, de Castro LH, D. Lim D, Strynadka NC (2007) Science 315:1402-1405）及びA.aeolicusから得たＰＢＰ１ａのトランスグリコシラーゼドメイン（Yuan Y, Barrett D, Zhang Y, Kahne D, Sliz P, Walker S (2007) Proc Natl Acad Sci 104:5348-5353）の近年のＸ線結晶構造は、触媒作用におけるＰＢＰの膜貫通ドメインの役割についての情報は欠けているものの、細胞壁ペプチドグリカン重合の説得力のあるメカニズムについて非常に貴重な知見をもたらした。ＰＢＰの膜貫通ドメインは、モエノマイシンの脂質部分又は脂質ＩＩと相互作用するのではないかと推測されている（Ye XY, Lo MC, Brunner L, Walker D, Kahne D, Walker S (2001) J Am Chem Soc 123:3155-3156; Anikin A, Buchynskyy A, Kempin U, Stembera K, Welzel P, Lantzsch G (1999) Angew Chem Int Ed 38:3703-3707）。
【０００５】
クラスＡ型ＰＢＰの特性解析及びＴＧ阻害剤の同定には機能性ＰＢＰ及び重合用の基質としての脂質ＩＩを必要とする。脂質ＩＩの入手には限界があることから、阻害剤の開発のみならず酵素の研究が阻まれていた。脂質ＩＩの不足を解消するために、ＴＧ阻害剤を探すためのスクリーニング方法の多くは主にモエノマイシンに頼っている（Di Guilmi AM. Dessen A, Dideberg O, Vernet T (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:63-75）。モエノマイシン活性に基づいて、ＳＰＲアッセイ（Stembera K, Vogel S, Buchynskyy A, Ayala JA, Welzel P (2002) Chembiochem 3:559-565）又は放射性アッセイ（Vollmer W, Holtje J-V (2000) Antimicrob Agents Chemother 44:1181-1185; Jha RK, de Sousa SM (2006) J Biomol Screen 11:1005-1014; Ravishankar S, Kumar VP, Chandrakala B, Jha RK, Solapure SM, de Sousa SM (2005) Antimicrob Agents Chemother 49:1410-1418; Chandrakala B, Shandil RK, Mehra U, Ravishankar S, Kaur P, Usha V, Joe B, deSousa SM (2004) Antimicrob Agents Chemother 48:30-40）を用いたロースループット阻害剤スクリーニング法が開発された。そのため、ハイスループットスクリーニングに適したＴＧ活性アッセイプラットフォームが阻害剤の同定に望ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は細菌から完全長クラスＡ型ペニシリン結合タンパク質を発現及び精製するための方法を提供するものであり、
（ａ）細菌のゲノムＤＮＡから完全長ペニシリン結合タンパク質のＤＮＡ配列を増幅させ、
（ｂ）ＤＮＡ配列をベクターにクローニングし、
（ｃ）ホスト細胞内でＤＮＡ配列を発現させて完全長ペニシリン結合タンパク質を得て、
（ｄ）タンパク質を界面活性剤で可溶化し、
（ｅ）タンパク質を精製することを含み、
界面活性剤はｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−テトラデシルホスホクロリン、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン−Ｎ−オキシド、３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート又はα−［４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル］−ｗ−ヒドロキシ−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）である。
【０００７】
ある好ましい実施形態において、細菌はEscherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Streptococcus pneumoniae、Shigella flexneri、Haemophilus influenzae、Helicobacter pylori、Citrobacter freundii、Bordetella pertussi、Staphylococcus aureus (MRSA Mu50)、Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa、Clostridium difficile、Enterococcus faecium、Enterococcus faecalis、Salmonella enterica又はNeisseria gonorrhoeaeである。
【０００８】
好ましくは、完全長クラスＡ型ペニシリン結合タンパク質の精製に使用する界面活性剤はｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである。
【０００９】
加えて、完全長タンパク質は３つのドメインを含み、Ｎ末端からＣ末端に向かって膜貫通ドメイン、トランスグリコシラーゼドメイン、トランスペプチダーゼドメインである。
【００１０】
本発明は抗生物質のハイスループットスクリーニング法を更に提供し、この方法は
（ａ）スクリーニングの候補を用意し、
（ｂ）蛍光モエノマイシンと膜貫通ドメインとトランスグリコシラーゼドメインを含むクラスＡ型ペニシリン結合タンパク質で蛍光異方性測定を実行し、
（ｃ）蛍光異方性値とＫＤ値を計算し、
（ｄ）トランスグリコシラーゼ阻害剤のＫＩ及びＩＣ５０値を計算し、
（ｅ）阻害剤の最低阻害濃度を求めることを含み、
ＫＤはモエノマイシンとタンパク質との間の解離定数であり、ＫＩは阻害剤とタンパク質との間の解離定数であり、ＩＣ５０は細菌の増殖を半分に阻害するのに必要な阻害濃度であり、最低阻害濃度とは細胞の増殖を防止する阻害剤の最低濃度である。
【００１１】
ある実施形態において、抗生物質はトランスグリコシラーゼ阻害剤であり、好ましくは（Ｚ）−５−（４−ブロモフェニル）−３−（（５−ニトロフラン−２−イル）メチレン）フラン−２（３Ｈ）−オン、（Ｚ）−１，３−ジフェニル−４−（２−（チアゾール−２−イル）ヒドラゾノ−１Ｈ−ピラゾール−５（４Ｈ）−オン、（Ｅ）−４−（２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）プロプ−１−エニル）安息香酸である。
【００１２】
ある好ましい実施形態において、タンパク質は３つのドメインを含み、Ｎ末端からＣ末端に向かって膜貫通ドメイン、トランスグリコシラーゼドメイン、トランスペプチダーゼドメインである。
【００１３】
本発明において、蛍光プローブとして使用するモエノマイシンは、蛍光異方性に基づいたアッセイの実行時にペニシリン結合タンパク質に結合する。
【００１４】
その他の好ましい実施形態において、本発明の方法でスクリーニングされたヒット化合物であるところの抗生物質はEscherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Streptococcus pneumoniae、Shigella flexneri、Haemophilus influenzae、Helicobacter pylori、Citrobacter freundii、Bordetella pertussi、Staphylococcus aureus (MRSA Mu50)、Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa、Clostridium difficile、Enterococcus faecium、Enterococcus faecalis、Salmonella enterica又はNeisseria gonorrhoeaeである細菌の増殖を阻害する。
【００１５】
好ましい実施形態において、細菌はE.faecalis又はS.aureusである。
【００１６】
以下の実施例は非限定的であり、本発明の多様な態様と特徴を表しているにすぎない。
【実施例１】
【００１７】
完全長ペニシリン結合タンパク質の発現
E.coliのＰＢＰ１ｂ変異体の発現と精製
E.coli（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０２９１９）からの完全長ＰＢＰ１ｂをゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＥＴベクター（ＥＭＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社。サンディエゴ、カリフォルニア州）にクローニングし、Ｎ末端（Ｈｉｓ）６タグで発現させた。ＢＬ２１（ＤＥ３）E.coliホスト細胞を３７℃で６００ｎｍでのＯＤが０．６に達するまで増殖させ、タンパク質発現を１ｍＭのＩＰＴＧで３時間に亘って誘発させた。細胞ペレットをｐＨ８．０の２０ｍＭのトリス、３００ｍＭのＮａＣｌに再懸濁させ、マイクロフルイダイザ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、ニュートン、マサチューセッツ州、米国）で粉砕した。組み換え完全長膜タンパク質の可溶化と精製を様々な界面活性剤を用いてテストし（Ａｎａｔｒａｃｅ社、マウミー、オハイオ州、米国）、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−テトラデシルホスホクロリン、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン−Ｎ−オキシド、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（α−［４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル］−ｗ−ヒドロキシ−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）が含まれる。中でも、ＤＤＭ（ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）は完全長ＰＢＰ１ｂを可溶化し、かつそのモエノマイシン結合活性を維持させることが判明した。従って、完全長ＰＢＰ１ｂを２０ｍＭのＤＤＭで可溶化させ、１ｍＭのＤＤＭの存在下で製造業者の指示に従ってニッケルキレート化クロマトグラフィで精製した。
【００１８】
ＰＢＰ１ｂのドメインは膜貫通ドメイン（ＴＭ、残基６４−８７）、トランスグリコシラーゼドメイン（ＴＧ、残基１９５−４０９）、トランスペプチダーゼ（ＴＰ、残基４４４−７３６）として定義した。ヌクレオチドプライマはＴＧ＋ＴＰ（残基８８−８４４）、ＴＭ＋ＴＧ（残基１−４０９）、ＴＧ（残基１９５−４０９）、及びＴＰ（残基４４４−７３６）を含有するそれぞれの変異体を増幅するように設計された。増幅物は発現と精製のためにｐＥＴベクターへとクローニングした。変異体ＴＭ＋ＴＧを得るための手順は完全長タンパク質の調製について記載したとおりである。ＴＧ＋ＴＰ、ＴＧ及びＴＰの変異体については、１３ｍＭのｎ−テトラデシルホスホクロリン（Ａｎａｔｒａｃｅ社）をタンパク質の抽出に、０．２５ｍＭのものをニッケルキレート化クロマトグラフィに用いた。界面活性剤を１ｍＭのＤＤＭに交換し、アミコンウルトラフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）を用いて濃縮した。
【００１９】
１６の細菌株からの組み換え完全長二機能性ＰＢＰの発現及び精製
完全長二機能性ＰＢＰのホモログを、E.coliからのＰＢＰ１ｂタンパク質配列（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０２９１９）を用いてＢＬＡＳＴでＮＣＢＩデータベースでの同定を行った（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。トランスグリコシラーゼモチーフと活性部位の存在を確認するため、Ｊａｌｖｉｅｗプログラム（４）をＭＵＳＣＬＥ多重アラインメントアルゴリズム（５）と共に用いて配列をアラインし、アラインされた出力（図２）をＥＳＰｒｉｐｔ（６）を用いて作成した。明確にするため、以下の残基はアライメントから除外した：Ｂｐｅ（B. pertussis）：３５４−４４３、Ｎｇｏ（N. gonorrhoeae）：３３１−４１６、Ｂｓｕ（B. subtilis）：６１５−６４３、７３５−７８７、７９７−８３５、及び８９７−９１４、及びＣｄｉ（C. difficile）：２６７−３２２及び８０４−８４２。
【００２０】
個々のＰＢＰの発現のために、ゲノムＤＮＡをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、マナサス、ヴァージニア州、米国）から購入した。Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Streptococcus pneumoniae、Shigella flexneri、Haemophilus influenzae、Helicobacter pylori、Citrobacter freundii、Bordetella pertussi、Staphylococcus aureus (MRSA Mu50)、Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa、Clostridium difficile、Enterococcus faecium、Enterococcus faecalis、Salmonella enterica及びNeisseria gonorrhoeaeを含む１６の細菌からの完全長遺伝子の組み換えタンパク質を完全長E.coliのＰＢＰ１ｂについて記載したものと同じプロトコルを用いて調製した。その殆どは８０％より高い純度で得ることができ（図３）、結合実験のために使用可能である。
【実施例２】
【００２１】
抗生物質のハイスループット検出
材料及び方法
表面プラズモン共鳴検出
精製したＰＢＰ及びその変異体をＣＭ３チップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）上に約１５００〜２０００ＲＵまでアミン結合法を用いて固定化した。次にチップを異なる濃度のモエノマイシンＡ（０−２０００ｎＭ）に通した。固定化及びデータ収集をＢＩＡｃｏｒｅＴ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）を用いて２５℃で行った。
【００２２】
蛍光異方性測定
蛍光異方性測定を４８８ｎｍレーザを備えたレーザ蛍光分析装置（ＩｓｏＣｙｔｅ、Ｂｌｕｅｓｈｉｆｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、サニーヴェール、カリフォルニア州、米国）を用いて３８４ウェルプレートのウェルで３回行った。各種バッファ、塩、ｐＨ値、及び二価陽イオン（Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｃｏ＋＋）を蛍光異方性測定にむけて最適化した。ＫＤ及びＫＩは１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０の１０ｍＭのトリスにおいて求めた。走査の焦点は、検出の障害とならないようにプレート底部の上方であった。データ分析はプロプライエタリ・ソフトウェアであるＢｌｕｅＩｍａｇｅ（Ｂｌｕｅｓｈｉｆｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて行った。蛍光異方性値（Ａ）は方程式：Ａ＝ (Ｉ平行Ｇ＊Ｉ垂直)／（Ｉ平行＋２Ｇ＊Ｉ垂直)を用いて計算し、Ｉ平行は励起光に平行な放射光の蛍光強度であり、Ｉ垂直は励起光に対して垂直な放射光の蛍光強度であり、Ｇは機器バイアスを修正するためのゲーティングファクタである。Ｇファクタは各回ごとにプローブだけのウェルを基準異方性として用いて実験的に求めた。
【００２３】
直接結合アッセイからのＫＤ値の測定
直接結合アッセイにおいて、初期条件にはｐＨ８．０、１０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ中の４０μｌの１００ｎＭのＦ−Ｍｏｅが含まれた。少量のＰＢＰ原液を添加した後、５分間の平衡後に異方性の変化を測定した。直接滴定はリガンド（Ｌ）とレセプタ（Ｒ）との単純な結合平衡に沿うものとみなす（Ｒ＋ＬＳ⇔ＲＬＳでＫＤ＝Ｒ・ＬＳ／ＲＬＳ）。データをＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて［方程式１ＫＤ］にフィットさせ、ＫＤ（３）を求めた。
（Ａ測定−Ａ最低）／（Ａ最高−Ａ最低）＝（ＫＤ＋ＬＳＴ＋ＲＴ）−［ＫＤ＋ＬＳＴ＋ＲＴ］２−４・ＬＳＴ・ＲＴ］１／２ ［方程式１］
であり、Ａ測定は観察された異方性、Ａ最低は最低異方性、Ａ最高は最高異方性、ＬＳＴはＦ−Ｍｏｅの総濃度、ＲＴはＰＢＰの総濃度、ＫＤはリガンド（Ｆ−Ｍｏｅ）とレセプタ（ＰＢＰ）との間の解離定数である。報告値は４回の平均である。
【００２４】
ＫＩ及びＩＣ５０値の競合置換アッセイによる測定
競合置換において、初期条件にはｐＨ８．０、１０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌｌ中の４０μｌの１００ｎＭのＦ−Ｍｏｅ、１０μｇ／ｍｌのH.pyloriのＰＢＰ１ａが含まれた。化合物原液のアリコートを添加し、５分間の平衡の後、異方性をモニタした。置換アッセイによって得られたデータを用いて、完全競合結合モデル（ＲＬ＋ＬＳ⇔KLＲ＋ＬＳ＋Ｌ⇔KDＲＬＳ＋Ｌ）（３）を用いて阻害剤の阻害定数（ＫＩ）とＩＣ５０値を計算した。ＫＩ値は総阻害剤濃度（Ｃ）を結合／遊離Ｆ−Ｍｏｅのモル比に対してプロットし、得られた曲線を［方程式２］にフィットさせることで求めた。
Ｃ＝［（ＫＩ／ＫＤ＊Ｘ）＋１］［ＲＴ−（ＬＳＴ＊Ｘ）／（Ｘ＋１）−ＫＤ＊Ｘ］ ［方程式２］
Ｘ＝結合／遊離＝（Ａ測定−Ａ最低）／（Ａ最高−Ａ測定）
ここでＡ測定は化合物の特定濃度（Ｃ）で観察された異方性、Ａ最低は最低異方性、Ａ最高は最高異方性、ＬＳＴはＦ−Ｍｏｅの総濃度、ＲＴはＰＢＰ１ａの総濃度、ＫＤはリガンド（Ｆ−Ｍｏｅ）とレセプタ（ＰＢＰ）との間の解離定数、ＫＩは阻害剤とＰＢＰ１ａとの間の解離定数である。報告値は４回の平均である。
【００２５】
ＩＣ５０を求めるために、結合蛍光プローブの割合を競合物濃度（Ｃ）の対数値に対してプロットする。得られたＳ次型曲線を［方程式３］を用いてフィットさせると、ＩＣ５０値が得られる。
（Ａ測定−Ａ最低）／（Ａ最高−Ａ最低）＝１／（１＋１０＾（（Ｃ−ｌｏｇ（ＩＣ５０））＊傾き） ［方程式３］
ここでＡ測定は化合物の特定濃度（Ｃ）で観察された異方性であり、Ａ最低は最低異方性、Ａ最高は最高異方性である。
【００２６】
ＴＧ阻害剤のハイスループットスクリーニング
ＦＡアッセイを購入した５００００個の小分子（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）と我々が所有するコレクションのうちの７０００個に対してのスクリーニングに使用した。化合物を９６ウェルプレート（Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏ、Ｔｅｃａｎ Ｓｃｈｗｅｉｚ ＡＧ社、マネドルフ、スイス）に、次に３８４ウェルプレートへとマルチディスペンサ（Ｌａｂｃｙｔｅ社、サニーヴェール、カリフォルニア州、米国）を用いて移し、スクリーニング用の化合物のプレートを準備した。最終容量４０μｌ、ｐＨ８．０の１００ｎＭのＦ−Ｍｏｅ、１０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ中のH.pyloriのＰＢＰ１ａ（１０μｇ／ｍｌ）を３８４ウェルプレートに加えた（Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏ１５０、Ｔｅｃａｎ社）。２ｍＭ化合物原液の１μｌをマルチディスペンサ（Ｌａｂｃｙｔｅ社）を用いてウェルに加えた。各プレートの最後２つのカラムはコントロールである１０μＭのモエノマイシンと２．５％のＤＭＳＯにそれぞれ用いた。３０分の培養後、蛍光異方性における変化をＩｓｏｃｙｔｅ（Ｂｌｕｅｓｈｉｆｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて求めた。コントロールの異方性値と比較して７５％より高い低下を示したヒット化合物を更に調べるために選択した。
【００２７】
最低阻害濃度（minimal inhibitory concentration:MIC）の測定
試験化合物の最低阻害濃度（ＭＩＣ）をＮＣＣＬＳ基準に従って求めた。実験は血液を加えた（Streptococcus pneumonia）又は加えていない（Bacillus subtilis、Enterococcus faecalis、Staphylococcus aureus）ミュラー・ヒルトン培養液での二倍希釈を用いて９６ウェルマイクロタイタープレートで行った。５ｘ１０５細胞／ｍｌで指数関数的に増殖する細胞を様々な濃度の試験化合物で培養した。１８〜２４時間に亘る３７℃での培養後、細菌の増殖を防止する化合物の最低濃度としてＭＩＣを求めた。
【００２８】
結果
クラスＡ型ペニシリン結合タンパク質へのモエノマイシン結合のドメイン要件（二機能性トランスグリコシラーゼ）
E.coliからのＰＢＰ１ｂの異なるドメインを含むタンパク質構築物を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いたモエノマイシン結合活性測定用に発現、適した界面活性剤を用いて精製した（実施例１）。５つのE.coliのＰＢＰ１ｂ変異体を発現、精製した：膜貫通ドメイン、トランスグリコシラーゼドメイン及びトランスペプチダーゼドメインを含む完全長タンパク質（ＴＭ＋ＴＧ＋ＴＰ）、（２）ＴＧ＋ＴＰ、（３）ＴＭ＋ＴＧ、（４）ＴＧ及び（５）ＴＰ（図１Ｂ）。ターゲットタンパク質をセンサーチップ上に固定化した後、異なる濃度のモエノマイシンを表面に通し、結合親和性を求めた。図１Ｂに図示されるように、膜貫通ドメインを有していないＰＢＰ（ＴＧ＋ＴＰ）のモエノマイシン結合活性は完全長ＰＢＰ１ｂの結合活性と比較すると約５倍低かった。その一方で、ＴＭ＋ＴＧの結合活性は完全長タンパク質の結合活性と同様である。結果は、膜貫通ドメインがモエノマイシン結合において重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。完全長タンパク質のモエノマイシン結合親和性は４．４ｘ１０−７Ｍと求められており、ＴＧ反応についての阻害能と同様であった（Stembera K, Vogel S, Buchynskyy A, Ayala JA, Welzel P (2002) Chembiochem 3:559-565）。我々は、ＳＰＲ分析でのモエノマイシンＡのＣ２５脂質の非特異的な結合を憂慮していたが、ＴＰ変異体をコントロール用のタンパク質として用い、求められたモエノマイシンのＰＢＰ１ｂ変異体に対しての結合親和性が顕著であり特異的なものであることが確認された。切断ＰＢＰ１ｂ変異体を使用した結合実験は、ＴＭ＋ＰＧ変異体の結合親和性が完全長タンパク質の結合親和性と同様であることを更に示した。Ｍｏｅ Ａ結合におけるＴＭドメインの役割が、ＴＧ＋ＴＰ変異体の結合能が完全長ＰＢＰ１ｂのものと比較して５倍も低下したという観察結果から示された（図１Ｂ）。
【００２９】
モエノマイシンのＰＢＰ結合活性と最低阻害濃度（ＭＩＣ）の相関関係
膜貫通ドメインはモエノマイシン結合に大きく関与することから、モエノマイシン結合の研究のために１６のグラム陰性及びグラム陽性細菌（表１）からの完全長ＰＢＰの準備に着手した。クラスＡ型ＰＢＰの遺伝子はＮＣＢＩデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いて同定し、この全てがＴＧ及びＴＰモチーフを有していることが確認された（Barrett DS, Chen L, Litterman NK, Walker S (2004) Biochemistry 43:12375; Di Guilmi AM, Dessen A, Dideberg O, Vernet T (2003) J Bacteriol 185:1650-1658）（図２）。ターゲット遺伝子を個々の細菌種のそれぞれのゲノムＤＮＡから増幅して発現ベクターにクローニングし、E.coliホストを用いて組み換えタンパク質を産生させた。精製したタンパク質の酵素活性は脂質ＩＩ重合によって確認され（データ提示せず）、モエノマイシン結合はＳＰＲで測定した。表１に示されるように、異なる種から得たＰＢＰ間には様々な定常状態親和性（ＫＤ）値が見えられたが、測定されたＫＤ値は全て１０−７Ｍの範囲内に収まり、トランスグリコシル化プロセスについて報告された阻害濃度に近い（Stembera K, Vogel S, Buchynskyy A, Ayala JA, Welzel P (2002) Chembiochem 3:559-565）。興味深いことに、テストしたグラム陽性細菌の中でも、E.faecalisとS.aureusのＰＢＰのＫＤ値はＭＩＣ値と相関関係にあり、ＰＢＰのモエノマイシン結合部位がこれらの種に対しての抗生物質の開発にとってよいターゲットとなり得ることを示唆している。
【００３０】
表１
１６の細菌株についての抗菌活性とモエノマイシンのＰＢＰ結合親和性との相関関係
＊1 異なる細菌種に対してのモエノマイシンのＭＩＣ。
＊2 文献から得たモエノマイシンのＭＩＣ値。
＊3 個々の細菌株から得たクラスＡ型ＰＢＰ遺伝子の配列ＩＤ。クラスＡ型ＰＢＰのホモログをＢＬＡＳＴを用いてＮＣＢＩデータベースで同定した。
＊4 ＳＰＲを用いてのＰＢＰホモログとモエノマイシンのＫＤ。平均値を示す。
＊5 本発明のＦＡに基づいたアッセイを用いて得たＰＢＰホモログとモエノマイシンとのＫＤ。
【００３１】
トランスグリコシラーゼ阻害剤についての蛍光異方性に基づいたアッセイの開発
完全長タンパク質をモエノマイシン結合研究に使用できるとの結論に基づいて、蛍光異方性（ＦＡ）に基づいたアッセイを設計し、ＴＧに対しての小分子の結合親和性をモニタした。複雑な結晶構造（Lovering AL, de Castro LH, D. Lim D, Strynadka NC (2007) Science 315:1402-1405）及び構造・活性関係（Welzel P (2005) Chem Rev 105:4610-4660）についての従来の研究は、化合物１から２への変性（図４Ａ）は結合と抗菌性を劇的に低下させることはないことを示唆した。更に、２のアミノ部分により、結合研究用のモエノマイシン型のプローブとしてのいずれのフルオロフォアとの共役が可能となる（Buchynskyy A, Kempin U, Vogel S, Hennig L, Findeisen M, Muller D, Giesa S, Knoll H, Welzel P (2002) Eur J Org Chem 7:1149-1162; Donnerstag A, Marzian S, Muller D, Welzel P (1995) Tetrahedron 51:1931-1940）。実際、化合物２は基本条件下で即座にフルオレセイン（６−カルボキシフルオレセイン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）に結合して蛍光プローブ３を生成した（Ｆ−Ｍｏｅ、図４Ｂ）。ＦＡアッセイで使用の蛍光プローブについての主な懸念の１つはプローブそれ自体、つまりフルオロフォア又は構造変性のいずれかがターゲットタンパク質と小分子との結合を阻害することである。従って、Ｍｏｅ ＡのＰＢＰ結合親和性及び蛍光プローブをＳＰＲを用いて比較した。求めた定常状態親和性（ＫＤ）値はＭｏｅ Ａ及びＦ−Ｍｏｅについて同様であった（４．４ｘ１０−７対５．２ｘ１０−７Ｍ）（図４Ｃ及び４Ｄ）。この結果によりＦ−ＭｏｅがＦＡに基づいたＰＢＰ結合アッセイに有用な有効蛍光プローブであることが確認された。
【００３２】
Ｆ−Ｍｏｅの異方性はE.coliのＰＢＰ１ｂとの培養により著しく上昇し、これはＦ−Ｍｏｅ−ＰＢＰ１ｂ複合体の形成によるものと思われる（図５Ａ）。対照的に、Ｆ−Ｍｏｅの異方性は、１００μＭまで、ウシ血清アルブミンとの培養では変化しなかった（データ提示せず）。タンパク質濃縮物を、異方性変化の用量依存性を確立するために更に滴定に供した。Ｆ−Ｍｏｅについての推定解離定数（ＫＤ）はE.coliのＰＢＰ１ｂにおいてはサブミクロモル範囲にあった（図５Ａ）。しかしながら、E.coliのＰＢＰ１ｂを用いたＦＡアッセイの信号対雑音比は不十分であり、最高異方性は０．１２０である。従って、異なるクラスＡ型ＰＢＰをスクリーニングしてアッセイを改良した。試験したホモログ全てにおいて、Helicobacter pyloriのＰＢＰ１ａを用いたＦＡアッセイが２５＋／−１４ｎＭの最適な信号対雑音比を出し、異方性はＦ−Ｍｏｅへの結合時に０．０１８から０．２へと上昇した（図５Ｂ）。阻害剤スクリーニング用のアッセイを開発するために、Ｆ−ＭｏｅをH.pyloriのＰＢＰ１ａと予備培養し、次に様々な濃度の無標識のＭｏｅ Ａとの競合に供した。Ｍｏｅ Ａの濃度が上昇するにつれて異方性の低下が観察され、ＫＩ（阻害定数）とＩＣ５０値はそれぞれ０．４７＋／−０．１０μＭと０．３６μＭとなった（図５Ｃ）。この結果により、ＦＡアッセイがＰＢＰのモエノマイシン結合ポケットからプローブを競合的に置換する阻害剤をスクリーニングすることが実証された。
【００３３】
トランスグリコシラーゼ阻害剤のハイスループットスクリーニング
幾つかのモエノマイシン類似体（２、４、５）を調製してＦＡに基づいたアッセイの信頼性を評価した。表２に示されるように、これらのモエノマイシン類似体のＦＡに基づいたアッセイで求めた異なる結合親和性（ＩＣ５０値）は、発表された論文のものに類似している（Marzian S, Happel M, Wagner U, Muller D, Welzel P, Fehlhaber HW, Stark A, Schutz HJ, Markus A, Limbert M, van Heijenoort Y, van Heijenoort J (1994) Tetrahedron 50:5299-5308）。モエノマイシンＡから２への変性によりＴＧ結合親和性は若干低下した。８炭素スペーサを介した２の二量体化により、ＰＢＰ結合能と抗菌性の双方が２より２倍上昇した４が得られたが、４はそれでもＭｏｅ Ａ（１）よりも強度が低い。より顕著には、Ｃ２５脂質部分を有していない化合物５はＦ−Ｍｏｅプローブ３を置換することがほとんどできず、これはモエノマイシンの疎水性部分が完全長ＰＢＰ１ｂへの結合に不可欠であることを示している。阻害能の順序がＭＩＣ値の順序と一致していることは注目に値する（表２）。
【００３４】
表２
選択されたヒット化合物のＴＧ活性の阻害と抗菌性測定
＊1 化合物２、４、５はモエノマイシン誘導体である。化合物６〜８はハイスループットスクリーニングでスクリーニングされたヒット化合物である。
＊2 ＩＣ５０値は図５Ａで図示の蛍光異方性アッセイを用いて求められた。
＊3 異なる細菌種に対してのモエノマイシンのＭＩＣを「材料と方法」で記載したように求めた。ＡＴＣＣはアメリカンタイプカルチャーコレクションの略。
【００３５】
モエノマイシン及びその類似体はグラム陽性細菌に対してよく効くものの、その薬物動態特性の悪さによりＴＧ阻害剤開発において新たなリード化合物が必要とされている。ＨＴＳフォーマットでの効率的かつ経済的なＴＧアッセイは、新規のＴＧ阻害剤の同定に役立つと思われる。
【００３６】
ＦＡアッセイを用いて５０μＭでＭｏｅＡ誘導体（図６）と共に５７０００個の小分子のコレクションをスクリーニングした。モエノマイシン１μＭでのアッセイをハイコントロール、２．５％ＤＭＳＯでのアッセイをローコントロールとした。ウシ血清アルブミン等のその他のタンパク質もコントロールとして含めることで、異方性の上昇が非特異的な結合によるものでないことを確認した。ハイスループットスクリーニングのロバスト性を評価するための０から１の範囲の統計パラメータであるＺ´値（Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR (1999) J Biomol Screen 4:67-73）を１００を越える個々の実験から０．８９５と求めた。スクリーニングでヒットした１１の少なくとも７５％の阻害を示した化合物を、ＰＢＰ結合に関して抗菌性アッセイとＩＣ５０値の測定を含め更に研究するため選び出した（図７Ａ）。中でも、２つのモエノマイシン類似体（２及び４）及び３つの小分子（化合物６、７及び８）が抗菌性とＴＧ結合阻害活性の双方を有していると確認された（表２）。化合物６、７、８はそれぞれ（Ｚ）−５−（４−ブロモフェニル）−３−（（５−ニトロフラン−２−イル）メチレン）フラン−２（３Ｈ）−オン（Ｚ）−１，３−ジフェニル−４−（２−（チアゾール−２−イル）ヒドラゾノ−１Ｈ−ピラゾール−５−（４Ｈ）−オン；（Ｅ）−４−（２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン―２―イル）プロプ−１−エニル）安息香酸である。
【００３７】
本発明のＦＡに基づいたアッセイを用いて、０．８９５のＺ´値で０．０２％のヒット率が得られ、これはこのアッセイを膨大な化合物ライブラリから可能性のあるヒット化合物を迅速に同定するためのロバストな一次スクリーニングとして使用可能なことを示唆している。選択したヒット化合物を抗菌性アッセイ又は脂質ＩＩ重合活性分析を用いて更にスクリーニングし、リード化合物を同定する。全ての蛍光を利用したアッセイと同様に、本発明のＦＡに基づいたアッセイは蛍光化合物についてＴＧ阻害活性を求めるのに使用することはできない。しかしながら、ＦＡに基づいたＰＢＰ結合アッセイは新規の抗菌剤の発見に非常に強力なＨＴＳアッセイであることが実証された。
【００３８】
本発明を当業者がそれを実践するのに十分な詳細さでもって説明、例示してきたが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく様々な代替、改変、改良が可能であることは明白である。
【００３９】
本発明が目的を達成し、本来備えているもののみならず、記載の結果と利点を得るに十分に適合されていることを当業者は容易に理解するものである。その改変及びその他の使用は他の当業者の想定内である。これらの改変は本発明の精神の範囲に含まれ、請求項の範囲によって定められる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】モエノマイシンによるトランスグリコシラーゼの阻害と切断されたＰＢＰ変異体の結合親和性を示す。（Ａ）モエノマイシンＡ（１）が細菌細胞壁の合成におけるトランスグリコシル化工程を阻害している。（Ｂ）モエノマイシンの結合の研究に使用したＰＢＰ変異体の概略図である。完全長ＰＢＰ（ＴＭ＋ＴＧ＋ＴＰ）はE.coliのＰＢＰ１ｂ（Ｐ０２９１９）のアミノ酸残基１−８４４を含有している。ＴＧ＋ＴＰ（残基８８−８４４）、ＴＭ＋ＴＧ（残基１−４０９）、ＴＧ（残基１９５−４０９）及びＴＰ（残基４４４−７３６）は完全長ＰＢＰ１ｂの一部を含む切断変異体である。これらの変異体のモエノマイシン結合定数（ＫＤ）はＳＰＲを用いて求めた。
【図２】１６の細菌株から得た完全長二機能性ＰＢＰの配列アラインメントを示す。本研究で使用した１６の完全長ＰＢＰ配列をＪａｌｖｉｅｗログラムを用いてアラインし、図はＥＳＰｒｉｐｔを用いて作成した。保存した残基について、同一の残基の場合は背景を濃い灰色、似た残基は灰色でそれぞれ囲んだ。灰色の星印はＴＧの場合モチーフ：EDxxFxxHxxG、GxSTxTQQ、RKxxE、KxxILxxYxN、及びRxxVL、ＴＰの場合はモチーフSxxK、SxN及びKTGを示す。下線のついた星印は触媒残基を記している。アラインされた配列の順番は表１と図３の順番と同一である。
【図３】１６の細菌種から得たクラスＡ型ＰＢＰの精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。各レーンは５μｇのタンパク質を含有し、ＭはｋＤａ単位での分子量マーカーを示す。１：Bordetella pertussisからのＰＢＰ１ａ、２：Citrobacter freundiiからのＰＢＰ１ｂ、３：Escherichia coliからのＰＢＰ１ｂ、４：Haemophilus influenzaeからのＰＢＰ１ｂ、５：Helicobacter pyloriからのＰＢＰ１ａ、６：Klebsiella pneumoniaeからのＰＢＰ１ｂ、７：Neisseria gonorrhoeaeからのＰＢＰ１、８：Pseudomonas aeruginosaからのＰＢＰ１ｂ、９：Salmonella entericaからのＰＢＰ１ｂ、１０：Shigella flexneriからのＰＢＰ２、１１：Bacillus subtilisからのＰＢＰ１ａ／１ｂ、１２：Clostridium difficileからのＰＢＰ、１３：Enterococcus faecalisからのＰＢＰ２ａ、１４：Enterococcus faeciumからのＰＢＰ１、１５：Staphylococcus aureusからのＰＢＰ２、１６：Streptococcus pneumoniaeからのＰＢＰ１ｂ。
【図４】トランスグリコシラーゼについての新規の蛍光異方性アッセイの設計。（Ａ、Ｂ）変性モエノマイシンＡ（２）及びフルオレセインで標識したモエノマイシンＦ−Ｍｏｅ（３）の化学構造。（Ｃ、Ｄ）モエノマイシンＡ（Ｃ）とＦ−Ｍｏｅ（Ｄ）のE.coliのＰＢＰ１ｂに対しての結合活性のＳＰＲ分析。固定化したE.coliのＰＢＰ１ｂへのモエノマイシン結合についての反応を示している。データは、挿入したグラフで図示されるように、定常状態での親和性を用いて分析し、１：１の相互作用モデルへとフィットさせた。Ｘ軸と点線の切片から推定したＫＤ値はＭｏｅ Ａ及びＦ−Ｍｏｅについてそれぞれ４．４ｘ１０−７Ｍ及び５．１６１ｘ１０−７Ｍであった。
【図５】トランスグリコシラーゼについてのハイスループットＦＡアッセイの開発。（Ａ）E.coliのＰＢＰ１ｂがＦ−Ｍｏｅに結合すると、蛍光異方性において濃度依存性の変化が観察された。（Ｂ）Helicobacter pyloriのＰＢＰ１ａでの改善されたＦＡアッセイ。H.pyloriのＰＢＰ１ａを用いて同様に濃度依存性の蛍光異方性変化を行った。最大異方性値は０．２であった。（Ｃ）様々な濃度の無標識モエノマイシンによるＰＢＰ１ａ結合Ｆ−Ｍｏｅ複合体の置換を示す。蛍光異方性における変化は［（Ａ測定−Ａ最低）／（Ａ最高−Ａ最低）ｘ１００％］と定義する。ＫＤ及びＩＣ５０値を実施例２に記載したように計算した。
【図６】モエノマイシン誘導体の化学構造を図示する（４及び５）。
【図７】クラスＡ型ＰＢＰを用いたＴＧ阻害剤としての小分子のスクリーニングを示す。（Ａ）ＦＡアッセイを用いたＴＧ阻害剤のハイスループットスクリーニングのスキーム。タンパク質構造の画像はＰＤＢ ＩＤ ２ＯＬＶ（１２）から作成した。（Ｂ）ハイスループットスクリーニングでヒットした化合物の化学構造。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌から完全長クラスＡ型ペニシリン結合タンパク質を発現及び精製するための方法に関する。本発明は抗生物質のハイスループットスクリーニング法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Staphylococcus aureus、Streptococcus pneumoniae及びEnterococcus faecalis等の多くの一般的な病原菌は今や多剤耐性となって公衆衛生問題として浮上してきており、新しい抗生物質が医療において求められているが、いまだもってそのニーズは満たされていない。
【０００３】
抗菌剤の開発においては、細菌細胞壁又はペプチドグリカン合成経路がターゲットであった（Silver LL (2003) Curr Opin Microbiol 6:431-438）。ペプチドグリカンの合成は幾つかの段階から成り、脂質Ｉ及び脂質ＩＩの合成、それに続く脂質ＩＩの最終トランスグリコシル化とペプチド転移によるペプチドグリカンの形成を含む（Ostash B, Walker S (2005) Curr Opin Chem Biol 9:459-466）。現在の抗生物質の多くがペプチド転移をターゲットとしたβ−ラクタム誘導体である。トランスグリコシル化プロセスを阻害する医薬品は未だ開発されていない。トランスグリコシラーゼ（ＴＧ）について唯一知られている強力な阻害剤はモエノマイシン複合体（フラボマイシン）であり、モエノマイシンＡ（図１Ａ、Ｍｏｅ Ａ、１）、Ａ１２、Ｃｌ、Ｃ３及びＣ４が含まれる（Zehl M, Pittenauer E, Rizzi A, Allmaier G (2006) Amer Soc Mass Spec 17:1081-1090）。中でも、Ｍｏｅ Ａがそのファミリーで最も豊富な薬剤である（Eichorn P, Aga DS (2005) Rapid Commun Mass Spectrom 19:2179-2186）。その特異な抗菌特性は化学者にモエノマイシンフラグメントと誘導体の合成を促すこととなった（Adachi M, Zhang Y, Leimkuhler C, Sun B, LaTour JV, Kahne DE (2006) J Am Chem Soc 128:14012-14013; Welzel P (2005) Chem Rev 105:4610-4660; Welzel P (2007) Angew Chem Int Ed Engl 46:4825-4829）。モエノマイシンＡの最初の全合成はつい最近Kahneとその同僚によって成された（Taylor TG, Li X, Oberthur M, Zhu W, Kahne DE (2006) J Am Chem Soc 128:15084-15085）。その生合成経路もまた解明されている（Ostash B, Saghatelian A, Walker S (2007) Chem Biol 14:257-267）。しかしながら、その生物学的利用能の低さから、フラボマイシンだけが動物飼料における成長促進抗生物質として利用されている（Butaye P, Devriese LA, Haesebrouck F (2003) Clin Microbiol Rev 16:175-188）。
【０００４】
トランスグリコシル化は主に二機能性クラスＡ型ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）によって触媒されている（Macheboeuf P, Contreras-Martel C, Job V, Dideberg O, Dessen A (2006) FEMS Microbiol Rev 30:673-691）。ＰＢＰはＮ−アセチルグルコサミン−Ｎ−アセチルムラミル−ペンタペプチドの重合及びペンタペプチド間の架橋による細胞壁の最終形成段階に関わる主要酵素であることから、抗生物質の発見にとって重要なターゲットの１つであると考えられている。これらの膜に固定された酵素は３つの別個のタンパク質ドメイン、つまりそのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって膜貫通（Transmembrane:TM）ドメイン、トランスグリコシラーゼドメイン（Transglycosilyase:TG）、トランスペプチダーゼ（Transpeptidase:TP）ドメインから成る。S.aureusから得たＰＢＰ２細胞外ドメインと（Lovering AL, de Castro LH, D. Lim D, Strynadka NC (2007) Science 315:1402-1405）及びA.aeolicusから得たＰＢＰ１ａのトランスグリコシラーゼドメイン（Yuan Y, Barrett D, Zhang Y, Kahne D, Sliz P, Walker S (2007) Proc Natl Acad Sci 104:5348-5353）の近年のＸ線結晶構造は、触媒作用におけるＰＢＰの膜貫通ドメインの役割についての情報は欠けているものの、細胞壁ペプチドグリカン重合の説得力のあるメカニズムについて非常に貴重な知見をもたらした。ＰＢＰの膜貫通ドメインは、モエノマイシンの脂質部分又は脂質ＩＩと相互作用するのではないかと推測されている（Ye XY, Lo MC, Brunner L, Walker D, Kahne D, Walker S (2001) J Am Chem Soc 123:3155-3156; Anikin A, Buchynskyy A, Kempin U, Stembera K, Welzel P, Lantzsch G (1999) Angew Chem Int Ed 38:3703-3707）。
【０００５】
クラスＡ型ＰＢＰの特性解析及びＴＧ阻害剤の同定には機能性ＰＢＰ及び重合用の基質としての脂質ＩＩを必要とする。脂質ＩＩの入手には限界があることから、阻害剤の開発のみならず酵素の研究が阻まれていた。脂質ＩＩの不足を解消するために、ＴＧ阻害剤を探すためのスクリーニング方法の多くは主にモエノマイシンに頼っている（Di Guilmi AM. Dessen A, Dideberg O, Vernet T (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:63-75）。モエノマイシン活性に基づいて、ＳＰＲアッセイ（Stembera K, Vogel S, Buchynskyy A, Ayala JA, Welzel P (2002) Chembiochem 3:559-565）又は放射性アッセイ（Vollmer W, Holtje J-V (2000) Antimicrob Agents Chemother 44:1181-1185; Jha RK, de Sousa SM (2006) J Biomol Screen 11:1005-1014; Ravishankar S, Kumar VP, Chandrakala B, Jha RK, Solapure SM, de Sousa SM (2005) Antimicrob Agents Chemother 49:1410-1418; Chandrakala B, Shandil RK, Mehra U, Ravishankar S, Kaur P, Usha V, Joe B, deSousa SM (2004) Antimicrob Agents Chemother 48:30-40）を用いたロースループット阻害剤スクリーニング法が開発された。そのため、ハイスループットスクリーニングに適したＴＧ活性アッセイプラットフォームが阻害剤の同定に望ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は細菌から完全長クラスＡ型ペニシリン結合タンパク質を発現及び精製するための方法を提供するものであり、
（ａ）細菌のゲノムＤＮＡから完全長ペニシリン結合タンパク質のＤＮＡ配列を増幅させ、
（ｂ）ＤＮＡ配列をベクターにクローニングし、
（ｃ）ホスト細胞内でＤＮＡ配列を発現させて完全長ペニシリン結合タンパク質を得て、
（ｄ）タンパク質を界面活性剤で可溶化し、
（ｅ）タンパク質を精製することを含み、
界面活性剤はｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−テトラデシルホスホクロリン、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン−Ｎ−オキシド、３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート又はα−［４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル］−ｗ−ヒドロキシ−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）である。
【０００７】
ある好ましい実施形態において、細菌はEscherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Streptococcus pneumoniae、Shigella flexneri、Haemophilus influenzae、Helicobacter pylori、Citrobacter freundii、Bordetella pertussi、Staphylococcus aureus (MRSA Mu50)、Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa、Clostridium difficile、Enterococcus faecium、Enterococcus faecalis、Salmonella enterica又はNeisseria gonorrhoeaeである。
【０００８】
好ましくは、完全長クラスＡ型ペニシリン結合タンパク質の精製に使用する界面活性剤はｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである。
【０００９】
加えて、完全長タンパク質は３つのドメインを含み、Ｎ末端からＣ末端に向かって膜貫通ドメイン、トランスグリコシラーゼドメイン、トランスペプチダーゼドメインである。
【００１０】
本発明は抗生物質のハイスループットスクリーニング法を更に提供し、この方法は
（ａ）スクリーニングの候補を用意し、
（ｂ）蛍光モエノマイシンと膜貫通ドメインとトランスグリコシラーゼドメインを含むクラスＡ型ペニシリン結合タンパク質で蛍光異方性測定を実行し、
（ｃ）蛍光異方性値とＫＤ値を計算し、
（ｄ）トランスグリコシラーゼ阻害剤のＫＩ及びＩＣ５０値を計算し、
（ｅ）阻害剤の最低阻害濃度を求めることを含み、
ＫＤはモエノマイシンとタンパク質との間の解離定数であり、ＫＩは阻害剤とタンパク質との間の解離定数であり、ＩＣ５０は細菌の増殖を半分に阻害するのに必要な阻害濃度であり、最低阻害濃度とは細胞の増殖を防止する阻害剤の最低濃度である。
【００１１】
ある実施形態において、抗生物質はトランスグリコシラーゼ阻害剤であり、好ましくは（Ｚ）−５−（４−ブロモフェニル）−３−（（５−ニトロフラン−２−イル）メチレン）フラン−２（３Ｈ）−オン、（Ｚ）−１，３−ジフェニル−４−（２−（チアゾール−２−イル）ヒドラゾノ−１Ｈ−ピラゾール−５（４Ｈ）−オン、（Ｅ）−４−（２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）プロプ−１−エニル）安息香酸である。
【００１２】
ある好ましい実施形態において、タンパク質は３つのドメインを含み、Ｎ末端からＣ末端に向かって膜貫通ドメイン、トランスグリコシラーゼドメイン、トランスペプチダーゼドメインである。
【００１３】
本発明において、蛍光プローブとして使用するモエノマイシンは、蛍光異方性に基づいたアッセイの実行時にペニシリン結合タンパク質に結合する。
【００１４】
その他の好ましい実施形態において、本発明の方法でスクリーニングされたヒット化合物であるところの抗生物質はEscherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Streptococcus pneumoniae、Shigella flexneri、Haemophilus influenzae、Helicobacter pylori、Citrobacter freundii、Bordetella pertussi、Staphylococcus aureus (MRSA Mu50)、Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa、Clostridium difficile、Enterococcus faecium、Enterococcus faecalis、Salmonella enterica又はNeisseria gonorrhoeaeである細菌の増殖を阻害する。
【００１５】
好ましい実施形態において、細菌はE.faecalis又はS.aureusである。
【００１６】
以下の実施例は非限定的であり、本発明の多様な態様と特徴を表しているにすぎない。
【実施例１】
【００１７】
完全長ペニシリン結合タンパク質の発現
E.coliのＰＢＰ１ｂ変異体の発現と精製
E.coli（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０２９１９）からの完全長ＰＢＰ１ｂをゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＥＴベクター（ＥＭＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社。サンディエゴ、カリフォルニア州）にクローニングし、Ｎ末端（Ｈｉｓ）６タグで発現させた。ＢＬ２１（ＤＥ３）E.coliホスト細胞を３７℃で６００ｎｍでのＯＤが０．６に達するまで増殖させ、タンパク質発現を１ｍＭのＩＰＴＧで３時間に亘って誘発させた。細胞ペレットをｐＨ８．０の２０ｍＭのトリス、３００ｍＭのＮａＣｌに再懸濁させ、マイクロフルイダイザ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、ニュートン、マサチューセッツ州、米国）で粉砕した。組み換え完全長膜タンパク質の可溶化と精製を様々な界面活性剤を用いてテストし（Ａｎａｔｒａｃｅ社、マウミー、オハイオ州、米国）、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−テトラデシルホスホクロリン、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン−Ｎ−オキシド、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（α−［４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル］−ｗ−ヒドロキシ−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）が含まれる。中でも、ＤＤＭ（ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）は完全長ＰＢＰ１ｂを可溶化し、かつそのモエノマイシン結合活性を維持させることが判明した。従って、完全長ＰＢＰ１ｂを２０ｍＭのＤＤＭで可溶化させ、１ｍＭのＤＤＭの存在下で製造業者の指示に従ってニッケルキレート化クロマトグラフィで精製した。
【００１８】
ＰＢＰ１ｂのドメインは膜貫通ドメイン（ＴＭ、残基６４−８７）、トランスグリコシラーゼドメイン（ＴＧ、残基１９５−４０９）、トランスペプチダーゼ（ＴＰ、残基４４４−７３６）として定義した。ヌクレオチドプライマはＴＧ＋ＴＰ（残基８８−８４４）、ＴＭ＋ＴＧ（残基１−４０９）、ＴＧ（残基１９５−４０９）、及びＴＰ（残基４４４−７３６）を含有するそれぞれの変異体を増幅するように設計された。増幅物は発現と精製のためにｐＥＴベクターへとクローニングした。変異体ＴＭ＋ＴＧを得るための手順は完全長タンパク質の調製について記載したとおりである。ＴＧ＋ＴＰ、ＴＧ及びＴＰの変異体については、１３ｍＭのｎ−テトラデシルホスホクロリン（Ａｎａｔｒａｃｅ社）をタンパク質の抽出に、０．２５ｍＭのものをニッケルキレート化クロマトグラフィに用いた。界面活性剤を１ｍＭのＤＤＭに交換し、アミコンウルトラフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）を用いて濃縮した。
【００１９】
１６の細菌株からの組み換え完全長二機能性ＰＢＰの発現及び精製
完全長二機能性ＰＢＰのホモログを、E.coliからのＰＢＰ１ｂタンパク質配列（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０２９１９）を用いてＢＬＡＳＴでＮＣＢＩデータベースでの同定を行った（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。トランスグリコシラーゼモチーフと活性部位の存在を確認するため、Ｊａｌｖｉｅｗプログラム（４）をＭＵＳＣＬＥ多重アラインメントアルゴリズム（５）と共に用いて配列をアラインし、アラインされた出力（図２）をＥＳＰｒｉｐｔ（６）を用いて作成した。明確にするため、以下の残基はアライメントから除外した：Ｂｐｅ（B. pertussis）：３５４−４４３、Ｎｇｏ（N. gonorrhoeae）：３３１−４１６、Ｂｓｕ（B. subtilis）：６１５−６４３、７３５−７８７、７９７−８３５、及び８９７−９１４、及びＣｄｉ（C. difficile）：２６７−３２２及び８０４−８４２。
【００２０】
個々のＰＢＰの発現のために、ゲノムＤＮＡをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、マナサス、ヴァージニア州、米国）から購入した。Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Streptococcus pneumoniae、Shigella flexneri、Haemophilus influenzae、Helicobacter pylori、Citrobacter freundii、Bordetella pertussi、Staphylococcus aureus (MRSA Mu50)、Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa、Clostridium difficile、Enterococcus faecium、Enterococcus faecalis、Salmonella enterica及びNeisseria gonorrhoeaeを含む１６の細菌からの完全長遺伝子の組み換えタンパク質を完全長E.coliのＰＢＰ１ｂについて記載したものと同じプロトコルを用いて調製した。その殆どは８０％より高い純度で得ることができ（図３）、結合実験のために使用可能である。
【実施例２】
【００２１】
抗生物質のハイスループット検出
材料及び方法
表面プラズモン共鳴検出
精製したＰＢＰ及びその変異体をＣＭ３チップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）上に約１５００〜２０００ＲＵまでアミン結合法を用いて固定化した。次にチップを異なる濃度のモエノマイシンＡ（０−２０００ｎＭ）に通した。固定化及びデータ収集をＢＩＡｃｏｒｅＴ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）を用いて２５℃で行った。
【００２２】
蛍光異方性測定
蛍光異方性測定を４８８ｎｍレーザを備えたレーザ蛍光分析装置（ＩｓｏＣｙｔｅ、Ｂｌｕｅｓｈｉｆｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、サニーヴェール、カリフォルニア州、米国）を用いて３８４ウェルプレートのウェルで３回行った。各種バッファ、塩、ｐＨ値、及び二価陽イオン（Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｃｏ＋＋）を蛍光異方性測定にむけて最適化した。ＫＤ及びＫＩは１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０の１０ｍＭのトリスにおいて求めた。走査の焦点は、検出の障害とならないようにプレート底部の上方であった。データ分析はプロプライエタリ・ソフトウェアであるＢｌｕｅＩｍａｇｅ（Ｂｌｕｅｓｈｉｆｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて行った。蛍光異方性値（Ａ）は方程式：Ａ＝ (Ｉ平行Ｇ＊Ｉ垂直)／（Ｉ平行＋２Ｇ＊Ｉ垂直)を用いて計算し、Ｉ平行は励起光に平行な放射光の蛍光強度であり、Ｉ垂直は励起光に対して垂直な放射光の蛍光強度であり、Ｇは機器バイアスを修正するためのゲーティングファクタである。Ｇファクタは各回ごとにプローブだけのウェルを基準異方性として用いて実験的に求めた。
【００２３】
直接結合アッセイからのＫＤ値の測定
直接結合アッセイにおいて、初期条件にはｐＨ８．０、１０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ中の４０μｌの１００ｎＭのＦ−Ｍｏｅが含まれた。少量のＰＢＰ原液を添加した後、５分間の平衡後に異方性の変化を測定した。直接滴定はリガンド（Ｌ）とレセプタ（Ｒ）との単純な結合平衡に沿うものとみなす（Ｒ＋ＬＳ⇔ＲＬＳでＫＤ＝Ｒ・ＬＳ／ＲＬＳ）。データをＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて［方程式１ＫＤ］にフィットさせ、ＫＤ（３）を求めた。
（Ａ測定−Ａ最低）／（Ａ最高−Ａ最低）＝（ＫＤ＋ＬＳＴ＋ＲＴ）−［ＫＤ＋ＬＳＴ＋ＲＴ］２−４・ＬＳＴ・ＲＴ］１／２ ［方程式１］
であり、Ａ測定は観察された異方性、Ａ最低は最低異方性、Ａ最高は最高異方性、ＬＳＴはＦ−Ｍｏｅの総濃度、ＲＴはＰＢＰの総濃度、ＫＤはリガンド（Ｆ−Ｍｏｅ）とレセプタ（ＰＢＰ）との間の解離定数である。報告値は４回の平均である。
【００２４】
ＫＩ及びＩＣ５０値の競合置換アッセイによる測定
競合置換において、初期条件にはｐＨ８．０、１０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌｌ中の４０μｌの１００ｎＭのＦ−Ｍｏｅ、１０μｇ／ｍｌのH.pyloriのＰＢＰ１ａが含まれた。化合物原液のアリコートを添加し、５分間の平衡の後、異方性をモニタした。置換アッセイによって得られたデータを用いて、完全競合結合モデル（ＲＬ＋ＬＳ⇔KLＲ＋ＬＳ＋Ｌ⇔KDＲＬＳ＋Ｌ）（３）を用いて阻害剤の阻害定数（ＫＩ）とＩＣ５０値を計算した。ＫＩ値は総阻害剤濃度（Ｃ）を結合／遊離Ｆ−Ｍｏｅのモル比に対してプロットし、得られた曲線を［方程式２］にフィットさせることで求めた。
Ｃ＝［（ＫＩ／ＫＤ＊Ｘ）＋１］［ＲＴ−（ＬＳＴ＊Ｘ）／（Ｘ＋１）−ＫＤ＊Ｘ］ ［方程式２］
Ｘ＝結合／遊離＝（Ａ測定−Ａ最低）／（Ａ最高−Ａ測定）
ここでＡ測定は化合物の特定濃度（Ｃ）で観察された異方性、Ａ最低は最低異方性、Ａ最高は最高異方性、ＬＳＴはＦ−Ｍｏｅの総濃度、ＲＴはＰＢＰ１ａの総濃度、ＫＤはリガンド（Ｆ−Ｍｏｅ）とレセプタ（ＰＢＰ）との間の解離定数、ＫＩは阻害剤とＰＢＰ１ａとの間の解離定数である。報告値は４回の平均である。
【００２５】
ＩＣ５０を求めるために、結合蛍光プローブの割合を競合物濃度（Ｃ）の対数値に対してプロットする。得られたＳ次型曲線を［方程式３］を用いてフィットさせると、ＩＣ５０値が得られる。
（Ａ測定−Ａ最低）／（Ａ最高−Ａ最低）＝１／（１＋１０＾（（Ｃ−ｌｏｇ（ＩＣ５０））＊傾き） ［方程式３］
ここでＡ測定は化合物の特定濃度（Ｃ）で観察された異方性であり、Ａ最低は最低異方性、Ａ最高は最高異方性である。
【００２６】
ＴＧ阻害剤のハイスループットスクリーニング
ＦＡアッセイを購入した５００００個の小分子（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）と我々が所有するコレクションのうちの７０００個に対してのスクリーニングに使用した。化合物を９６ウェルプレート（Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏ、Ｔｅｃａｎ Ｓｃｈｗｅｉｚ ＡＧ社、マネドルフ、スイス）に、次に３８４ウェルプレートへとマルチディスペンサ（Ｌａｂｃｙｔｅ社、サニーヴェール、カリフォルニア州、米国）を用いて移し、スクリーニング用の化合物のプレートを準備した。最終容量４０μｌ、ｐＨ８．０の１００ｎＭのＦ−Ｍｏｅ、１０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ中のH.pyloriのＰＢＰ１ａ（１０μｇ／ｍｌ）を３８４ウェルプレートに加えた（Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏ１５０、Ｔｅｃａｎ社）。２ｍＭ化合物原液の１μｌをマルチディスペンサ（Ｌａｂｃｙｔｅ社）を用いてウェルに加えた。各プレートの最後２つのカラムはコントロールである１０μＭのモエノマイシンと２．５％のＤＭＳＯにそれぞれ用いた。３０分の培養後、蛍光異方性における変化をＩｓｏｃｙｔｅ（Ｂｌｕｅｓｈｉｆｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて求めた。コントロールの異方性値と比較して７５％より高い低下を示したヒット化合物を更に調べるために選択した。
【００２７】
最低阻害濃度（minimal inhibitory concentration:MIC）の測定
試験化合物の最低阻害濃度（ＭＩＣ）をＮＣＣＬＳ基準に従って求めた。実験は血液を加えた（Streptococcus pneumonia）又は加えていない（Bacillus subtilis、Enterococcus faecalis、Staphylococcus aureus）ミュラー・ヒルトン培養液での二倍希釈を用いて９６ウェルマイクロタイタープレートで行った。５ｘ１０５細胞／ｍｌで指数関数的に増殖する細胞を様々な濃度の試験化合物で培養した。１８〜２４時間に亘る３７℃での培養後、細菌の増殖を防止する化合物の最低濃度としてＭＩＣを求めた。
【００２８】
結果
クラスＡ型ペニシリン結合タンパク質へのモエノマイシン結合のドメイン要件（二機能性トランスグリコシラーゼ）
E.coliからのＰＢＰ１ｂの異なるドメインを含むタンパク質構築物を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いたモエノマイシン結合活性測定用に発現、適した界面活性剤を用いて精製した（実施例１）。５つのE.coliのＰＢＰ１ｂ変異体を発現、精製した：膜貫通ドメイン、トランスグリコシラーゼドメイン及びトランスペプチダーゼドメインを含む完全長タンパク質（ＴＭ＋ＴＧ＋ＴＰ）、（２）ＴＧ＋ＴＰ、（３）ＴＭ＋ＴＧ、（４）ＴＧ及び（５）ＴＰ（図１Ｂ）。ターゲットタンパク質をセンサーチップ上に固定化した後、異なる濃度のモエノマイシンを表面に通し、結合親和性を求めた。図１Ｂに図示されるように、膜貫通ドメインを有していないＰＢＰ（ＴＧ＋ＴＰ）のモエノマイシン結合活性は完全長ＰＢＰ１ｂの結合活性と比較すると約５倍低かった。その一方で、ＴＭ＋ＴＧの結合活性は完全長タンパク質の結合活性と同様である。結果は、膜貫通ドメインがモエノマイシン結合において重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。完全長タンパク質のモエノマイシン結合親和性は４．４ｘ１０−７Ｍと求められており、ＴＧ反応についての阻害能と同様であった（Stembera K, Vogel S, Buchynskyy A, Ayala JA, Welzel P (2002) Chembiochem 3:559-565）。我々は、ＳＰＲ分析でのモエノマイシンＡのＣ２５脂質の非特異的な結合を憂慮していたが、ＴＰ変異体をコントロール用のタンパク質として用い、求められたモエノマイシンのＰＢＰ１ｂ変異体に対しての結合親和性が顕著であり特異的なものであることが確認された。切断ＰＢＰ１ｂ変異体を使用した結合実験は、ＴＭ＋ＰＧ変異体の結合親和性が完全長タンパク質の結合親和性と同様であることを更に示した。Ｍｏｅ Ａ結合におけるＴＭドメインの役割が、ＴＧ＋ＴＰ変異体の結合能が完全長ＰＢＰ１ｂのものと比較して５倍も低下したという観察結果から示された（図１Ｂ）。
【００２９】
モエノマイシンのＰＢＰ結合活性と最低阻害濃度（ＭＩＣ）の相関関係
膜貫通ドメインはモエノマイシン結合に大きく関与することから、モエノマイシン結合の研究のために１６のグラム陰性及びグラム陽性細菌（表１）からの完全長ＰＢＰの準備に着手した。クラスＡ型ＰＢＰの遺伝子はＮＣＢＩデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いて同定し、この全てがＴＧ及びＴＰモチーフを有していることが確認された（Barrett DS, Chen L, Litterman NK, Walker S (2004) Biochemistry 43:12375; Di Guilmi AM, Dessen A, Dideberg O, Vernet T (2003) J Bacteriol 185:1650-1658）（図２）。ターゲット遺伝子を個々の細菌種のそれぞれのゲノムＤＮＡから増幅して発現ベクターにクローニングし、E.coliホストを用いて組み換えタンパク質を産生させた。精製したタンパク質の酵素活性は脂質ＩＩ重合によって確認され（データ提示せず）、モエノマイシン結合はＳＰＲで測定した。表１に示されるように、異なる種から得たＰＢＰ間には様々な定常状態親和性（ＫＤ）値が見えられたが、測定されたＫＤ値は全て１０−７Ｍの範囲内に収まり、トランスグリコシル化プロセスについて報告された阻害濃度に近い（Stembera K, Vogel S, Buchynskyy A, Ayala JA, Welzel P (2002) Chembiochem 3:559-565）。興味深いことに、テストしたグラム陽性細菌の中でも、E.faecalisとS.aureusのＰＢＰのＫＤ値はＭＩＣ値と相関関係にあり、ＰＢＰのモエノマイシン結合部位がこれらの種に対しての抗生物質の開発にとってよいターゲットとなり得ることを示唆している。
【００３０】
表１
１６の細菌株についての抗菌活性とモエノマイシンのＰＢＰ結合親和性との相関関係
＊1 異なる細菌種に対してのモエノマイシンのＭＩＣ。
＊2 文献から得たモエノマイシンのＭＩＣ値。
＊3 個々の細菌株から得たクラスＡ型ＰＢＰ遺伝子の配列ＩＤ。クラスＡ型ＰＢＰのホモログをＢＬＡＳＴを用いてＮＣＢＩデータベースで同定した。
＊4 ＳＰＲを用いてのＰＢＰホモログとモエノマイシンのＫＤ。平均値を示す。
＊5 本発明のＦＡに基づいたアッセイを用いて得たＰＢＰホモログとモエノマイシンとのＫＤ。
【００３１】
トランスグリコシラーゼ阻害剤についての蛍光異方性に基づいたアッセイの開発
完全長タンパク質をモエノマイシン結合研究に使用できるとの結論に基づいて、蛍光異方性（ＦＡ）に基づいたアッセイを設計し、ＴＧに対しての小分子の結合親和性をモニタした。複雑な結晶構造（Lovering AL, de Castro LH, D. Lim D, Strynadka NC (2007) Science 315:1402-1405）及び構造・活性関係（Welzel P (2005) Chem Rev 105:4610-4660）についての従来の研究は、化合物１から２への変性（図４Ａ）は結合と抗菌性を劇的に低下させることはないことを示唆した。更に、２のアミノ部分により、結合研究用のモエノマイシン型のプローブとしてのいずれのフルオロフォアとの共役が可能となる（Buchynskyy A, Kempin U, Vogel S, Hennig L, Findeisen M, Muller D, Giesa S, Knoll H, Welzel P (2002) Eur J Org Chem 7:1149-1162; Donnerstag A, Marzian S, Muller D, Welzel P (1995) Tetrahedron 51:1931-1940）。実際、化合物２は基本条件下で即座にフルオレセイン（６−カルボキシフルオレセイン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）に結合して蛍光プローブ３を生成した（Ｆ−Ｍｏｅ、図４Ｂ）。ＦＡアッセイで使用の蛍光プローブについての主な懸念の１つはプローブそれ自体、つまりフルオロフォア又は構造変性のいずれかがターゲットタンパク質と小分子との結合を阻害することである。従って、Ｍｏｅ ＡのＰＢＰ結合親和性及び蛍光プローブをＳＰＲを用いて比較した。求めた定常状態親和性（ＫＤ）値はＭｏｅ Ａ及びＦ−Ｍｏｅについて同様であった（４．４ｘ１０−７対５．２ｘ１０−７Ｍ）（図４Ｃ及び４Ｄ）。この結果によりＦ−ＭｏｅがＦＡに基づいたＰＢＰ結合アッセイに有用な有効蛍光プローブであることが確認された。
【００３２】
Ｆ−Ｍｏｅの異方性はE.coliのＰＢＰ１ｂとの培養により著しく上昇し、これはＦ−Ｍｏｅ−ＰＢＰ１ｂ複合体の形成によるものと思われる（図５Ａ）。対照的に、Ｆ−Ｍｏｅの異方性は、１００μＭまで、ウシ血清アルブミンとの培養では変化しなかった（データ提示せず）。タンパク質濃縮物を、異方性変化の用量依存性を確立するために更に滴定に供した。Ｆ−Ｍｏｅについての推定解離定数（ＫＤ）はE.coliのＰＢＰ１ｂにおいてはサブミクロモル範囲にあった（図５Ａ）。しかしながら、E.coliのＰＢＰ１ｂを用いたＦＡアッセイの信号対雑音比は不十分であり、最高異方性は０．１２０である。従って、異なるクラスＡ型ＰＢＰをスクリーニングしてアッセイを改良した。試験したホモログ全てにおいて、Helicobacter pyloriのＰＢＰ１ａを用いたＦＡアッセイが２５＋／−１４ｎＭの最適な信号対雑音比を出し、異方性はＦ−Ｍｏｅへの結合時に０．０１８から０．２へと上昇した（図５Ｂ）。阻害剤スクリーニング用のアッセイを開発するために、Ｆ−ＭｏｅをH.pyloriのＰＢＰ１ａと予備培養し、次に様々な濃度の無標識のＭｏｅ Ａとの競合に供した。Ｍｏｅ Ａの濃度が上昇するにつれて異方性の低下が観察され、ＫＩ（阻害定数）とＩＣ５０値はそれぞれ０．４７＋／−０．１０μＭと０．３６μＭとなった（図５Ｃ）。この結果により、ＦＡアッセイがＰＢＰのモエノマイシン結合ポケットからプローブを競合的に置換する阻害剤をスクリーニングすることが実証された。
【００３３】
トランスグリコシラーゼ阻害剤のハイスループットスクリーニング
幾つかのモエノマイシン類似体（２、４、５）を調製してＦＡに基づいたアッセイの信頼性を評価した。表２に示されるように、これらのモエノマイシン類似体のＦＡに基づいたアッセイで求めた異なる結合親和性（ＩＣ５０値）は、発表された論文のものに類似している（Marzian S, Happel M, Wagner U, Muller D, Welzel P, Fehlhaber HW, Stark A, Schutz HJ, Markus A, Limbert M, van Heijenoort Y, van Heijenoort J (1994) Tetrahedron 50:5299-5308）。モエノマイシンＡから２への変性によりＴＧ結合親和性は若干低下した。８炭素スペーサを介した２の二量体化により、ＰＢＰ結合能と抗菌性の双方が２より２倍上昇した４が得られたが、４はそれでもＭｏｅ Ａ（１）よりも強度が低い。より顕著には、Ｃ２５脂質部分を有していない化合物５はＦ−Ｍｏｅプローブ３を置換することがほとんどできず、これはモエノマイシンの疎水性部分が完全長ＰＢＰ１ｂへの結合に不可欠であることを示している。阻害能の順序がＭＩＣ値の順序と一致していることは注目に値する（表２）。
【００３４】
表２
選択されたヒット化合物のＴＧ活性の阻害と抗菌性測定
＊1 化合物２、４、５はモエノマイシン誘導体である。化合物６〜８はハイスループットスクリーニングでスクリーニングされたヒット化合物である。
＊2 ＩＣ５０値は図５Ａで図示の蛍光異方性アッセイを用いて求められた。
＊3 異なる細菌種に対してのモエノマイシンのＭＩＣを「材料と方法」で記載したように求めた。ＡＴＣＣはアメリカンタイプカルチャーコレクションの略。
【００３５】
モエノマイシン及びその類似体はグラム陽性細菌に対してよく効くものの、その薬物動態特性の悪さによりＴＧ阻害剤開発において新たなリード化合物が必要とされている。ＨＴＳフォーマットでの効率的かつ経済的なＴＧアッセイは、新規のＴＧ阻害剤の同定に役立つと思われる。
【００３６】
ＦＡアッセイを用いて５０μＭでＭｏｅＡ誘導体（図６）と共に５７０００個の小分子のコレクションをスクリーニングした。モエノマイシン１μＭでのアッセイをハイコントロール、２．５％ＤＭＳＯでのアッセイをローコントロールとした。ウシ血清アルブミン等のその他のタンパク質もコントロールとして含めることで、異方性の上昇が非特異的な結合によるものでないことを確認した。ハイスループットスクリーニングのロバスト性を評価するための０から１の範囲の統計パラメータであるＺ´値（Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR (1999) J Biomol Screen 4:67-73）を１００を越える個々の実験から０．８９５と求めた。スクリーニングでヒットした１１の少なくとも７５％の阻害を示した化合物を、ＰＢＰ結合に関して抗菌性アッセイとＩＣ５０値の測定を含め更に研究するため選び出した（図７Ａ）。中でも、２つのモエノマイシン類似体（２及び４）及び３つの小分子（化合物６、７及び８）が抗菌性とＴＧ結合阻害活性の双方を有していると確認された（表２）。化合物６、７、８はそれぞれ（Ｚ）−５−（４−ブロモフェニル）−３−（（５−ニトロフラン−２−イル）メチレン）フラン−２（３Ｈ）−オン（Ｚ）−１，３−ジフェニル−４−（２−（チアゾール−２−イル）ヒドラゾノ−１Ｈ−ピラゾール−５−（４Ｈ）−オン；（Ｅ）−４−（２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン―２―イル）プロプ−１−エニル）安息香酸である。
【００３７】
本発明のＦＡに基づいたアッセイを用いて、０．８９５のＺ´値で０．０２％のヒット率が得られ、これはこのアッセイを膨大な化合物ライブラリから可能性のあるヒット化合物を迅速に同定するためのロバストな一次スクリーニングとして使用可能なことを示唆している。選択したヒット化合物を抗菌性アッセイ又は脂質ＩＩ重合活性分析を用いて更にスクリーニングし、リード化合物を同定する。全ての蛍光を利用したアッセイと同様に、本発明のＦＡに基づいたアッセイは蛍光化合物についてＴＧ阻害活性を求めるのに使用することはできない。しかしながら、ＦＡに基づいたＰＢＰ結合アッセイは新規の抗菌剤の発見に非常に強力なＨＴＳアッセイであることが実証された。
【００３８】
本発明を当業者がそれを実践するのに十分な詳細さでもって説明、例示してきたが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく様々な代替、改変、改良が可能であることは明白である。
【００３９】
本発明が目的を達成し、本来備えているもののみならず、記載の結果と利点を得るに十分に適合されていることを当業者は容易に理解するものである。その改変及びその他の使用は他の当業者の想定内である。これらの改変は本発明の精神の範囲に含まれ、請求項の範囲によって定められる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】モエノマイシンによるトランスグリコシラーゼの阻害と切断されたＰＢＰ変異体の結合親和性を示す。（Ａ）モエノマイシンＡ（１）が細菌細胞壁の合成におけるトランスグリコシル化工程を阻害している。（Ｂ）モエノマイシンの結合の研究に使用したＰＢＰ変異体の概略図である。完全長ＰＢＰ（ＴＭ＋ＴＧ＋ＴＰ）はE.coliのＰＢＰ１ｂ（Ｐ０２９１９）のアミノ酸残基１−８４４を含有している。ＴＧ＋ＴＰ（残基８８−８４４）、ＴＭ＋ＴＧ（残基１−４０９）、ＴＧ（残基１９５−４０９）及びＴＰ（残基４４４−７３６）は完全長ＰＢＰ１ｂの一部を含む切断変異体である。これらの変異体のモエノマイシン結合定数（ＫＤ）はＳＰＲを用いて求めた。
【図２】１６の細菌株から得た完全長二機能性ＰＢＰの配列アラインメントを示す。本研究で使用した１６の完全長ＰＢＰ配列をＪａｌｖｉｅｗログラムを用いてアラインし、図はＥＳＰｒｉｐｔを用いて作成した。保存した残基について、同一の残基の場合は背景を濃い灰色、似た残基は灰色でそれぞれ囲んだ。灰色の星印はＴＧの場合モチーフ：EDxxFxxHxxG、GxSTxTQQ、RKxxE、KxxILxxYxN、及びRxxVL、ＴＰの場合はモチーフSxxK、SxN及びKTGを示す。下線のついた星印は触媒残基を記している。アラインされた配列の順番は表１と図３の順番と同一である。
【図３】１６の細菌種から得たクラスＡ型ＰＢＰの精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。各レーンは５μｇのタンパク質を含有し、ＭはｋＤａ単位での分子量マーカーを示す。１：Bordetella pertussisからのＰＢＰ１ａ、２：Citrobacter freundiiからのＰＢＰ１ｂ、３：Escherichia coliからのＰＢＰ１ｂ、４：Haemophilus influenzaeからのＰＢＰ１ｂ、５：Helicobacter pyloriからのＰＢＰ１ａ、６：Klebsiella pneumoniaeからのＰＢＰ１ｂ、７：Neisseria gonorrhoeaeからのＰＢＰ１、８：Pseudomonas aeruginosaからのＰＢＰ１ｂ、９：Salmonella entericaからのＰＢＰ１ｂ、１０：Shigella flexneriからのＰＢＰ２、１１：Bacillus subtilisからのＰＢＰ１ａ／１ｂ、１２：Clostridium difficileからのＰＢＰ、１３：Enterococcus faecalisからのＰＢＰ２ａ、１４：Enterococcus faeciumからのＰＢＰ１、１５：Staphylococcus aureusからのＰＢＰ２、１６：Streptococcus pneumoniaeからのＰＢＰ１ｂ。
【図４】トランスグリコシラーゼについての新規の蛍光異方性アッセイの設計。（Ａ、Ｂ）変性モエノマイシンＡ（２）及びフルオレセインで標識したモエノマイシンＦ−Ｍｏｅ（３）の化学構造。（Ｃ、Ｄ）モエノマイシンＡ（Ｃ）とＦ−Ｍｏｅ（Ｄ）のE.coliのＰＢＰ１ｂに対しての結合活性のＳＰＲ分析。固定化したE.coliのＰＢＰ１ｂへのモエノマイシン結合についての反応を示している。データは、挿入したグラフで図示されるように、定常状態での親和性を用いて分析し、１：１の相互作用モデルへとフィットさせた。Ｘ軸と点線の切片から推定したＫＤ値はＭｏｅ Ａ及びＦ−Ｍｏｅについてそれぞれ４．４ｘ１０−７Ｍ及び５．１６１ｘ１０−７Ｍであった。
【図５】トランスグリコシラーゼについてのハイスループットＦＡアッセイの開発。（Ａ）E.coliのＰＢＰ１ｂがＦ−Ｍｏｅに結合すると、蛍光異方性において濃度依存性の変化が観察された。（Ｂ）Helicobacter pyloriのＰＢＰ１ａでの改善されたＦＡアッセイ。H.pyloriのＰＢＰ１ａを用いて同様に濃度依存性の蛍光異方性変化を行った。最大異方性値は０．２であった。（Ｃ）様々な濃度の無標識モエノマイシンによるＰＢＰ１ａ結合Ｆ−Ｍｏｅ複合体の置換を示す。蛍光異方性における変化は［（Ａ測定−Ａ最低）／（Ａ最高−Ａ最低）ｘ１００％］と定義する。ＫＤ及びＩＣ５０値を実施例２に記載したように計算した。
【図６】モエノマイシン誘導体の化学構造を図示する（４及び５）。
【図７】クラスＡ型ＰＢＰを用いたＴＧ阻害剤としての小分子のスクリーニングを示す。（Ａ）ＦＡアッセイを用いたＴＧ阻害剤のハイスループットスクリーニングのスキーム。タンパク質構造の画像はＰＤＢ ＩＤ ２ＯＬＶ（１２）から作成した。（Ｂ）ハイスループットスクリーニングでヒットした化合物の化学構造。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗生物質のハイスループットスクリーニング方法であり、
（ａ）スクリーニングの候補を用意し、
（ｂ）蛍光モエノマイシンと膜貫通ドメインとトランスグリコシラーゼドメインを含むクラスＡ型ペニシリン結合タンパク質で蛍光異方性測定を実行し、
（ｃ）蛍光異方性値とＫＤ値を計算し、
（ｄ）トランスグリコシラーゼ阻害剤のＫＩ及びＩＣ５０値を計算し、
（ｅ）阻害剤の最低阻害濃度を求めることを含み、
ＫＤはモエノマイシンとタンパク質との間の解離定数であり、ＫＩは阻害剤とタンパク質との間の解離定数であり、ＩＣ５０は細菌の増殖を半分に阻害するのに必要な阻害濃度であり、最低阻害濃度とは細胞の増殖を防止する阻害剤の最低濃度である方法。
【請求項２】
抗生物質がトランスグリコシラーゼ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トランスグリコシラーゼ阻害剤が（Ｚ）−５−（４−ブロモフェニル）−３−（（５−ニトロフラン−２−イル）メチレン）フラン−２（３Ｈ）−オン、（Ｚ）−１，３−ジフェニル−４−（２−（チアゾール−２−イル）ヒドラゾノ−１Ｈ−ピラゾール−５（４Ｈ）−オン、（Ｅ）−４−（２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）プロプ−１−エニル）安息香酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質がＮ末端からＣ末端に向かって膜貫通、トランスグリコシラーゼ、トランスペプチダーゼの３つのドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
モエノマイシンがペニシリン結合タンパク質に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗生物質が細菌の増殖を阻害し、細菌がEscherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Streptococcus pneumoniae、Shigella flexneri、Haemophilus influenzae、Helicobacter pylori、Citrobacter freundii、Bordetella pertussi、Staphylococcus aureus (MRSA Mu50)、Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa、Clostridium difficile、Enterococcus faecium、Enterococcus faecalis、Salmonella enterica又はNeisseria gonorrhoeaeである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細菌がE.faecalis又はS.aureusである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記クラスＡ型ペニシリン結合タンパク質が以下の手段によって得られることを特徴とする、請求項１記載の方法。
（ａ）細菌のゲノムＤＮＡから完全長ペニシリン結合タンパク質のＤＮＡ配列を増幅させ、
（ｂ）ＤＮＡ配列をベクターにクローニングし、
（ｃ）ホスト細胞内でＤＮＡ配列を発現させて完全長ペニシリン結合タンパク質を得て、
（ｄ）タンパク質を界面活性剤で可溶化し、
（ｅ）タンパク質を精製することを含み、
界面活性剤がｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−テトラデシルホスホクロリン、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン−Ｎ−オキシド、３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート又はα−［４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル］−ｗ−ヒドロキシ−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）である。
【請求項９】
細菌がEscherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Streptococcus pneumoniae、Shigella flexneri、Haemophilus influenzae、Helicobacter pylori、Citrobacter freundii、Bordetella pertussi、Staphylococcus aureus (MRSA Mu50)、Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa、Clostridium difficile、Enterococcus faecium、Enterococcus faecalis、Salmonella enterica又はNeisseria gonorrhoeaeである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
界面活性剤がｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質がＮ末端からＣ末端に向かって膜貫通、トランスグリコシラーゼ、トランスペプチダーゼの３つのドメインを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１】
抗生物質のハイスループットスクリーニング方法であり、
（ａ）スクリーニングの候補を用意し、
（ｂ）蛍光モエノマイシンと膜貫通ドメインとトランスグリコシラーゼドメインを含むクラスＡ型ペニシリン結合タンパク質で蛍光異方性測定を実行し、
（ｃ）蛍光異方性値とＫＤ値を計算し、
（ｄ）トランスグリコシラーゼ阻害剤のＫＩ及びＩＣ５０値を計算し、
（ｅ）阻害剤の最低阻害濃度を求めることを含み、
ＫＤはモエノマイシンとタンパク質との間の解離定数であり、ＫＩは阻害剤とタンパク質との間の解離定数であり、ＩＣ５０は細菌の増殖を半分に阻害するのに必要な阻害濃度であり、最低阻害濃度とは細胞の増殖を防止する阻害剤の最低濃度である方法。
【請求項２】
抗生物質がトランスグリコシラーゼ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トランスグリコシラーゼ阻害剤が（Ｚ）−５−（４−ブロモフェニル）−３−（（５−ニトロフラン−２−イル）メチレン）フラン−２（３Ｈ）−オン、（Ｚ）−１，３−ジフェニル−４−（２−（チアゾール−２−イル）ヒドラゾノ−１Ｈ−ピラゾール−５（４Ｈ）−オン、（Ｅ）−４−（２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）プロプ−１−エニル）安息香酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質がＮ末端からＣ末端に向かって膜貫通、トランスグリコシラーゼ、トランスペプチダーゼの３つのドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
モエノマイシンがペニシリン結合タンパク質に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗生物質が細菌の増殖を阻害し、細菌がEscherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Streptococcus pneumoniae、Shigella flexneri、Haemophilus influenzae、Helicobacter pylori、Citrobacter freundii、Bordetella pertussi、Staphylococcus aureus (MRSA Mu50)、Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa、Clostridium difficile、Enterococcus faecium、Enterococcus faecalis、Salmonella enterica又はNeisseria gonorrhoeaeである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細菌がE.faecalis又はS.aureusである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記クラスＡ型ペニシリン結合タンパク質が以下の手段によって得られることを特徴とする、請求項１記載の方法。
（ａ）細菌のゲノムＤＮＡから完全長ペニシリン結合タンパク質のＤＮＡ配列を増幅させ、
（ｂ）ＤＮＡ配列をベクターにクローニングし、
（ｃ）ホスト細胞内でＤＮＡ配列を発現させて完全長ペニシリン結合タンパク質を得て、
（ｄ）タンパク質を界面活性剤で可溶化し、
（ｅ）タンパク質を精製することを含み、
界面活性剤がｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−テトラデシルホスホクロリン、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン−Ｎ−オキシド、３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート又はα−［４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル］−ｗ−ヒドロキシ−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）である。
【請求項９】
細菌がEscherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Streptococcus pneumoniae、Shigella flexneri、Haemophilus influenzae、Helicobacter pylori、Citrobacter freundii、Bordetella pertussi、Staphylococcus aureus (MRSA Mu50)、Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa、Clostridium difficile、Enterococcus faecium、Enterococcus faecalis、Salmonella enterica又はNeisseria gonorrhoeaeである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
界面活性剤がｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質がＮ末端からＣ末端に向かって膜貫通、トランスグリコシラーゼ、トランスペプチダーゼの３つのドメインを含む、請求項８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−２２９５２８（Ｐ２０１１−２２９５２８Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０２３０６（Ｐ２０１１−１０２３０６）
【出願日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【分割の表示】特願２００８−１７８１８７（Ｐ２００８−１７８１８７）の分割
【原出願日】平成２０年７月８日（２００８．７．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 刊行物名 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ 巻数 １０５ 第２ 発行年月日 ２００８年１月１５日
【出願人】（５０５００８０２８）中央研究院 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【分割の表示】特願２００８−１７８１８７（Ｐ２００８−１７８１８７）の分割
【原出願日】平成２０年７月８日（２００８．７．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 刊行物名 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ 巻数 １０５ 第２ 発行年月日 ２００８年１月１５日
【出願人】（５０５００８０２８）中央研究院 (4)
【Ｆターム（参考）】
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