ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶
【課題】 Ｘ線結晶構造解析および阻害剤の設計等を可能とする高品質のペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶を提供する。
【解決手段】 肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインにアミノ酸変異を導入し、高品質で再現性良く得られるＰＢＰ２ｂの結晶を作製した。得られた結晶を用いて、多波長異常分散法（ＭＡＤ法）により分解能２．２Åの結晶構造解析に成功した。
【解決手段】 肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインにアミノ酸変異を導入し、高品質で再現性良く得られるＰＢＰ２ｂの結晶を作製した。得られた結晶を用いて、多波長異常分散法（ＭＡＤ法）により分解能２．２Åの結晶構造解析に成功した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｘ線結晶構造解析および阻害剤の設計等に利用するためのペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）は細菌における細胞壁を構成する構造ユニットであるムレインモノマーを基質として細胞壁ペプチドグリカンを組み立てる一連の酵素群であり、細菌のペプチドグリカンの重合および架橋反応に働く膜結合型のタンパク質である。肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）には６種類のＰＢＰが確認されているが、ペニシリン耐性肺炎連鎖球菌では主に３種類のＰＢＰ（ＰＢＰ１ａ、ＰＢＰ２ｘ、ＰＢＰ２ｂ）における変異がβ−ラクタム薬の感受性低下に関与している。特にペニシリン系薬剤およびカルバペネム系薬剤においては、耐性とＰＢＰ２ｂ変異との密接な関連が示唆されている。また、配列番号３に示されるＲ６株（ＡＴＣＣ４９６１９）由来ＰＢＰ２ｂにおいては、アミノ酸残基番号４３１のスレオニン、４３２のグルタミン、４５１のスレオニン、６２４のアラニンが各々リジン、ロイシン、アラニン、グリシンに置換された変異が薬剤耐性に重要であることが示唆されている（非特許文献１および特許文献１参照）。従って、ＰＢＰ２ｂはβ−ラクタム薬の耐性に重要な役割を果たしており、ＰＢＰ２ｂの立体構造をＸ線結晶構造解析により解明することは、耐性のメカニズムを説明するだけでなく、耐性菌に有効な新薬を創出する上でも非常に重要である。
【０００３】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来ＰＢＰ２ｂは、細胞内ドメイン、膜貫通領域、Ｎ末端ドメインおよびトランスペプチダーゼドメインから構成される膜結合型タンパク質であり、細胞内ドメインおよび膜貫通領域を除去し、膜結合機能を喪失させたＰＢＰ２ｂ可溶性部分の調製方法が明らかになっている（特許文献１および非特許文献２参照）。しかしながら、ＰＢＰ２ｂ可溶性部分からさらにＮ末端ドメインを除去したトランスペプチダーゼドメインの調製方法は未だ明らかとなっていない。また、膜結合型ＰＢＰ２ｂ、ＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインのいずれについても、結晶および結晶構造解析の報告はない。従って、Ｘ線結晶構造解析によりＰＢＰ２ｂの立体構造を決定し、効率的な阻害剤の設計を可能とする高品質のＰＢＰ２ｂ結晶の創出が望まれている。
【０００４】
一般にタンパク質のＮ末端、Ｃ末端やループ領域は構造が揺らいでいる場合があり、その際には複数のコンフォメーションを取り得ることから、タンパク質の揺らいでいる領域の除去やドメインの切り出しは均一のコンフォメーションから構成される高分解能のＸ線回折能を有する結晶を作製するために有効な手段である（非特許文献３参照）。その一つの方法としてプロテアーゼであるトリプシンを利用してタンパク質を限定分解する方法が知られている。トリプシンは表面に露出している塩基性アミノ酸であるリジンやアルギニン残基の直後を選択的に切断することにより、タンパク質の揺らいでいる領域を除去可能な場合がある。肺炎連鎖球菌ＰＢＰ１ａではトリプシン限定分解物において分解能２．６ÅのＸ線回折能を示す結晶が得られており、その際、トリプシン限定分解物の純度を確保しマイナー部位での切断を避けるため１箇所点変異を導入している（非特許文献４参照）。また、肺炎連鎖球菌ＰＢＰ１ｂではトリプシン限定分解物において分解能１．９ÅのＸ線回折能を示す結晶が得られており、その際、トリプシン限定分解物の純度を確保しマイナー部位での切断を避けるため３箇所点変異を導入している（非特許文献５参照）。しかしながら、トリプシン限定分解のパターンは個々のタンパク質に依存し、ＰＢＰ２ｂでは未だ明らかになっていないことから、点変異導入の必要性も含め結晶化に適したトリプシン限定分解物の作製には試行錯誤が必要である上、ＰＢＰ２ｂに対してトリプシン限定分解が有効な手段であるかも明らかではない。結晶化に適したＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインをトリプシン限定分解することにより新規に見出すことができれば、高品質の結晶を作製し、ＰＢＰ２ｂの立体構造を解明することに多いに貢献できると考えられる。
【０００５】
また、タンパク質の表面に露出しているグルタミン酸やリジン等の特定のアミノ酸残基に変異を導入し、タンパク質表面の性状を変化させることにより高品質の結晶を作製した報告も知られている（非特許文献６参照）。しかしながら、この方法は立体構造が既知のタンパク質においては有効であるが、ＰＢＰ２ｂのように立体構造が未知のタンパク質の場合には表面に露出している残基を正確に同定することができないため、理論に基づいて変異を導入することは困難である。立体構造が未知のタンパク質に対して表面の性状あるいはコンフォメーションを変化させるために変異を導入することは可能であるが、結晶化に適した変異であるかどうかについては、実際にタンパク質を調製し、結晶化スクリーニングを実施した後、Ｘ線回折実験で検証する必要があり、多大な試行錯誤を要する。さらに、作製した変異体の結晶化において、特定の試薬の添加が結晶化に有効であるかどうかを予想することも困難である。従って、ＰＢＰ２ｂにおいて、結晶化に適したアミノ酸変異の同定と結晶化に有効な試薬の組み合わせを見出すことができれば、高品質の結晶を作製し、ＰＢＰ２ｂの立体構造を解明することに多いに貢献できると考えられる。
【特許文献１】特許公開２００４−２９００７０号広報
【非特許文献１】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４８（６）２２４４−２２５０（２００４）
【非特許文献２】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４８（５）１８４８−１８５５（２００４）
【非特許文献３】ＢＩＯベンチャー ３（５）、３６−３９（２００３）
【非特許文献４】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５（４）６８４−６９６（２００６）
【非特許文献５】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０２（３）５７７−５８２（２００５）
【非特許文献６】Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １２（４）５２９−５３５（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまでＰＢＰ２ｂの結晶および結晶構造解析の報告はない。そのため、創薬において重要であるＰＢＰ２ｂの立体構造情報が存在せず効率的な阻害剤の設計が困難である。また、一般にトリプシン限定分解および適切なアミノ酸変異導入等により良質の結晶が得られる可能性があるが、ＰＢＰ２ｂへの適用はなく、Ｘ線結晶構造解析に適したＰＢＰ２ｂ結晶の製造方法は不明である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、結晶化に適したＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインを調製し、さらにアミノ酸変異を導入することにより、Ｘ線結晶構造解析を実施し効率的な阻害剤の設計等を可能とする高品質のＰＢＰ２ｂ結晶を提供することで上記課題を解決する。
【０００８】
本発明者は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインを調製し、膨大な数の結晶化条件探索の試行錯誤により再現性よく得られる結晶を取得した。さらに、薬剤耐性に関与するアミノ酸変異を導入することにより高品質で再現性よく得られるＰＢＰ２ｂの結晶を取得した。この結晶を用いて、多波長異常分散法（ＭＡＤ法）により分解能２．２Åの結晶構造解析に成功し、創薬研究に重要なＰＢＰ２ｂの立体構造を決定した。すなわち、本発明はＸ線結晶構造解析および阻害剤の設計等に利用するためのＰＢＰ２ｂ結晶に関する。ここで、ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分の結晶において、空間群はＦ２２２であり、格子定数はａ＝１７５±１８Å、ｂ＝１８６±１９Å、ｃ＝３６９±３７Å、α＝β＝γ＝９０°である。また、ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインの結晶において、空間群はＰ４３２１２であり、格子定数はａ＝８６±９Å、ｂ＝８６±９Å、ｃ＝１４３±１４Å、α＝β＝γ＝９０°である。さらに、ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインの結晶構造から、配列番号３におけるアミノ酸残基番号４３１に対応するスレオニンをリジンに置換する変異により導入したリジン残基の側鎖が結晶化剤として使用した硫酸塩と相互作用することで高品質の結晶が製造できることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を含有する。
（１）連鎖球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶。
（２）ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶。
（３）肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶。
（４）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂ可溶性部分から構成される（１）〜（３）のいずれか一項に記載の結晶。
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質から構成される（１）〜（４）のいずれか一項に記載の結晶。
（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質から構成される（１）〜（４）のいずれか一項に記載の結晶。
（７）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質から構成される（１）〜（４）のいずれか一項に記載の結晶。
（８）空間群がＦ２２２である（１）〜（７）のいずれか一項に記載の結晶。
（９）空間群がＦ２２２であり、格子定数がａ＝１７５±１８Å、ｂ＝１８６±１９Å、ｃ＝３６９±３７Å、α＝β＝γ＝９０°である（１）〜（７）のいずれか一項に記載の結晶。
（１０）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂトランスペプチダーゼドメインから構成される（１）〜（３）のいずれか一項に記載の結晶。
（１１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質から構成される（１）〜（４）、（１０）のいずれか一項に記載の結晶。
（１２）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質から構成される（１）〜（４）、（１０）のいずれか一項に記載の結晶。
（１３）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質から構成される（１）〜（４）、（１０）のいずれか一項に記載の結晶。
（１４）空間群がＰ４３２１２である（１）〜（４）、（１０）〜（１３）のいずれか一項に記載の結晶。
（１５）空間群がＰ４３２１２であり、格子定数がａ＝８６±９Å、ｂ＝８６±９Å、ｃ＝１４３±１４Å、α＝β＝γ＝９０°である（１）〜（４）、（１０）〜（１３）のいずれか一項に記載の結晶。
（１６）（１）〜（１５）のいずれか一項に記載の結晶であって、該結晶を構成するタンパク質中の少なくとも１つのメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されている結晶。
（１７）硫酸塩またはリン酸塩の存在下で成長する（１）〜（１６）のいずれか一項に記載の結晶。
（１８）硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウムまたはリン酸水素二カリウムの存在下で成長する（１）〜（１６）のいずれか一項に記載の結晶。
（１９）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（２０）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質。
（２１）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質。
（２２）肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶の製造方法であって、結晶化剤として硫酸塩またはリン酸塩を用いて結晶化することを特徴とする、（１）〜（１８）のいずれか一項に記載の結晶の製造方法。
（２３）結晶化剤として硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウムまたはリン酸水素二カリウムを用いることを特徴とする（２２）記載の製造方法。
（２４）配列番号３におけるアミノ酸残基番号４３１のスレオニンがリジンに置換されているアミノ酸変異を有することを特徴とする、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの可溶性部分またはトランスペプチダーゼドメインを調製する工程を含む、（２２）または（２３）記載の製造方法。
（２５）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を調製する工程を含む、（２２）〜（２４）のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＰＢＰ２ｂ結晶は高品質で再現性良く調製可能であるため、Ｘ線結晶構造解析に適しており、これまでに全く報告の無かったＰＢＰ２ｂの立体構造解析が初めて可能となった。本発明のＰＢＰ２ｂ結晶を利用することにより、ＰＢＰ２ｂを阻害する化合物の効率的な設計等に役立つ立体構造情報を取得できるため、創薬において極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜＜ＰＢＰ２ｂアミノ酸変異と可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメイン＞＞
本発明の結晶を構成するタンパク質は、連鎖球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、好ましくはストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、より好ましくは肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、さらに好ましくは肺炎連鎖球菌Ｒ６株（ＡＴＣＣ４９６１９）由来のタンパク質である。特に好ましくは、配列番号３に示されるアミノ酸残基番号４３１のスレオニン、４３２のグルタミン、４５１のスレオニン、６２４のアラニンが各々リジン、ロイシン、アラニン、グリシンに置換された変異体タンパク質であり、これらの変異は薬剤耐性菌の一部に存在する変異である。また、本発明において、「トランスペプチダーゼ」とは、細菌細胞壁の一つの成分であるペプチドグリカンの生合成の最終段階に関与し、ペプチドグリカン連鎖を構成しているＮ−アセチルムラミン酸から伸びるポリペプチド鎖の架橋を触媒する酵素を意味する。さらに、「トランスペプチダーゼドメイン」とは、上記ポリペプチド鎖を架橋する能力を有し、β−ラクタム薬との結合が可能であるタンパク質の構造単位である。本発明における「相同タンパク質」とは、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質である。ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＦＡＳＴＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８（１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｆａｓｔａ−ｊ．ｈｔｍｌ）においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値を示す。本発明における「改変タンパク質」とは、配列番号１または２で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質である。ここで、「置換、欠失、付加もしくは挿入」などの改変に係るアミノ酸の数は、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜６個である。
【００１２】
ＰＢＰ２ｂは、細胞内ドメイン、膜貫通領域、Ｎ末端ドメインおよびトランスペプチダーゼドメインから構成される膜結合型タンパク質である。ＰＢＰ２ｂ可溶性部分とは、細胞内ドメインおよび膜貫通領域を除去し、膜結合機能を喪失させたＰＢＰ２ｂである。ＰＢＰ２ｂ可溶性部分は由来となる株およびＮ末端が異なる種々のものが存在可能であるが、肺炎連鎖球菌Ｒ６株においては、好ましくは、配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基番号４３から６８５で構成される。ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインは、ＰＢＰ２ｂ可溶性部分からさらにＮ末端ドメインを除去することにより調製可能であり、除去する領域の違いにより種々のものが存在可能であるが、肺炎連鎖球菌Ｒ６株においては、配列番号３に示されるアミノ酸残基番号３１５から６８５で構成されるのが好ましいことをプロテアーゼであるトリプシンを用いた限定分解実験から見出せる。トランスペプチダーゼドメインの同定方法としては精製したＰＢＰ２ｂ可溶性部分を種々の濃度のトリプシン存在下で限定分解した試料の質量分析および生じた各断片のＮ末端アミノ酸配列分析により決定することができる。ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインはその領域のみを発現させることも可能であるが、好ましくは、ＰＢＰ２ｂ可溶性部分をトリプシン限定分解することにより調製することが望ましい。その際にマイナー部位での切断を回避するために、配列番号３に示されるアミノ酸残基番号２２９および５６１のリジン残基をグルタミンに置換する方法が有用であり、特に残基番号５６１のリジン残基をグルタミンに置換することが好ましい。なお、広義の解釈においては、ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインは膜結合機能を喪失させた可溶性タンパク質であるため、ＰＢＰ２ｂ可溶性部分に含有される。
【００１３】
＜＜ＰＢＰ２ｂ可溶性部分の発現＞＞
ＰＢＰ２ｂ可溶性部分は、それをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特にＤＮＡ発現ベクターの形態とし、それによって宿主細胞の形質転換を行い、その形質転換体を培養することによって得られる。このＤＮＡ分子は、ベクター分子にＰＢＰ２ｂ可溶性部分をコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることができる。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案して、ウィルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択することができる。例えば宿主細胞が大腸菌の場合はｐＵＣ、ｐＢＲ系のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐ系のプラスミドベクターが挙げられる。宿主細胞としては、宿主−ベクター系が確立されているものであれば利用可能であり、好ましくは大腸菌が挙げられる。宿主細胞の形質転換により得られた形質転換体は、適当な条件で培養し、得られた形質転換体の細胞抽出液を慣用の方法に従い回収することができる。ここで、ＰＢＰ２ｂ可溶性部分に付加的ポリペプチド、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはヒスチジン残基に富むポリペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を融合タンパク質として発現することも慣用の技術により可能である。
【００１４】
＜＜ＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインの精製＞＞
ＧＳＴを融合して大腸菌で発現させたＰＢＰ２ｂ可溶性部分は、グルタチオンを固定化したアフィニティーカラムを用いた慣用の技術により容易に精製が可能である。精製したＰＢＰ２ｂ可溶性部分を２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に対して透析した後、適当量のトリプシンを加え、室温で１〜２時間反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう加えることでＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインが得られる。添加するトリプシンの終濃度は典型的には０．１〜１ｍｇ／ｍＬであるが、ＰＢＰ２ｂ可溶性部分のタンパク質濃度に依存するため、好ましくは、毎回、少量での確認実験により決定する必要がある。ＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインは陰イオン交換カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、陽イオン交換カラム、ゲルろ過カラムを用いた一般的なクロマトグラフィーの手法を組み合わせて精製することが可能であり、配列番号３に示されるアミノ酸残基番号４３１のスレオニン、４３２のグルタミン、４５１のスレオニン、６２４のアラニンが各々リジン、ロイシン、アラニン、グリシンに置換された変異体においても同様に精製が可能である。
【００１５】
＜＜ＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインの結晶化＞＞
一般的に蛋白質の結晶化は容易ではない。結晶化できる条件が比較的容易に見出される場合もあるが、通常は種々の結晶化条件をスクリーニングしなければならない。さらに結晶化剤の濃度、ｐＨ、塩の種類と濃度、添加剤などの条件を最適化することによって、Ｘ線結晶構造解析に供することができる良質の結晶が得られる。また、いかなる条件でも結晶化しない蛋白質も存在すると考えられている。蛋白質の結晶が得られなければＸ線結晶構造解析を行うことができない。また、Ｘ線結晶構造解析に用いる蛋白質の結晶は、結晶であればいかなるものでも解析可能であるわけではない。実際にＸ線を照射した際に、高分解能の回折強度データが得られることが必要である。本発明におけるＰＢＰ２ｂ結晶化の方法は、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法、透析法などのいかなる方法を用いてもよいが、好ましくは蒸気拡散法であるハンギングドロップ法またはシッティングドロップ法が用いられる。また、シーディング法またはリザーバー溶液にオイルを重層することにより結晶核の形成および結晶成長をコントロールすることもできる。結晶化の温度は４℃〜２０℃が一般的であるが、本発明では好ましくは２０℃である。結晶化に用いるタンパク質としては、（１）配列番号４に示されるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分、（２）配列番号５に示されるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメイン、（３）配列番号１に示されるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分および（４）配列番号２に示されるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのいずれを用いても良いが、好ましくは（３）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分、より好ましくは（４）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインが用いられる。また、前記タンパク質中のメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されたセレノメチオニン置換体も同様に結晶化に用いられる。結晶化に用いる精製タンパク質の濃度は、４〜２０ｍｇ／ｍＬ程度であることが好ましい。そして、蛋白質溶液に結晶化剤、塩類、緩衝液、添加剤などを適当量加えて、結晶化を行う。本発明のＰＢＰ２ｂの結晶化に用いられる結晶化剤としては、硫酸アンモニウムなどの無機塩類、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子、イソプロパノールやエタノールなどの有機溶媒などが挙げられる。本発明においては、無機塩類を好ましく用いることができ、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウム等の硫酸塩もしくはリン酸水素二カリウム等のリン酸塩を特に好ましく用いることができる。また、必要に応じてポリエチレングリコールを組み合わせることも可能である。また、緩衝液としては、公知の緩衝液のいずれも用いることができる。さらに添加剤としては、種々の金属イオン、有機溶媒、還元剤等を用いることができる。セレノメチオニン置換体の場合には未置換体の場合における周辺の条件で結晶を作製できるが、セレン原子の酸化を抑制するためにジチオスレイトール等の還元剤を添加することが好ましい。各ＰＢＰ２ｂと好ましい結晶化剤の組み合わせについては次に示す通りである。
【００１６】
（１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分：
０．８−１．６Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ４．６
（２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体：
１．１−１．６Ｍ 硫酸アンモニウム、１５％ グリセロール、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９
（３−１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分：
１０−２０％ ポリエチレングリコール８０００、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．０
（３−２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体：
１８−２０％ ポリエチレングリコール８０００、０．３Ｍ 硫酸リチウム、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５、１０ｍＭ ジチオスレイトール
（４）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体：
１．１−１．５Ｍ 硫酸アンモニウム、１５％ グリセロール、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９−８．５、または、０．７−１．１Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液 ｐＨ ６．０−６．５
上記の条件で得られる結晶のうち、好ましいものは（３−１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分の結晶および（３−２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体結晶であり、特に好ましいものは（４）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶である。
【００１７】
＜＜ＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメイン結晶のＸ線回折強度データの収集＞＞
上記のようにして得られる結晶の外観、単位格子の種類・大きさなどはその結晶に固有のものであり、良質の結晶を用いれば、Ｘ線回折実験により高分解能の回折強度データを取得することができる。結晶を多価アルコールを含有する抗凍結溶液中に浸した後凍結させ、凍結状態でＸ線回折データを収集し、Ｘ線回折像を得る。ここで、多価アルコールとしては、スクロース、トレハロース、グリセロールなどが挙げられる。これらの中で特にグリセロールが好ましい。抗凍結溶液中の多価アルコールの濃度は、好ましくは１０％〜３０％である。Ｘ線を照射して回折強度データを取得するには、いかなるＸ線発生装置を用いることができるが、好ましくは、（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８などの第３世代の放射光施設を利用することができる。得られたＸ線回折強度データを処理することにより、結晶学的パラメータを特定することが可能である。前段落（３−１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分の結晶および（３−２）セレノメチオニン置換体結晶は、空間群がＦ２２２である。また、格子定数はａ＝１７５±１８Å、ｂ＝１８６±１９Å、ｃ＝３６９±３７Å、α＝β＝γ＝９０°であり、より好ましくはａ＝１７５±９Å、ｂ＝１８６±９Å、ｃ＝３６９±１９Å、α＝β＝γ＝９０°であり、さらに好ましくはａ＝１７５±２Å、ｂ＝１８６±２Å、ｃ＝３６９±４Å、α＝β＝γ＝９０°であり、特に好ましくはａ＝１７５±１Å、ｂ＝１８６±１Å、ｃ＝３６９±１Å、α＝β＝γ＝９０°である。また、（４）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶は空間群がＰ４３２１２であり、格子定数がａ＝８６±９Å、ｂ＝８６±９Å、ｃ＝１４３±１４Å、α＝β＝γ＝９０°であり、より好ましくはａ＝８６±４Å、ｂ＝８６±４Å、ｃ＝１４３±７Å、α＝β＝γ＝９０°であり、さらに好ましくはａ＝８６±１Å、ｂ＝８６±１Å、ｃ＝１４３±２Å、α＝β＝γ＝９０°であり、特に好ましくはａ＝８６±１Å、ｂ＝８６±１Å、ｃ＝１４３±１Å、α＝β＝γ＝９０°である。
【００１８】
＜＜ＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインの結晶構造の決定＞＞
上記のように得られたデータを用いてＰＢＰ２ｂの結晶構造の決定が可能となる。一般に位相決定には、分子置換法、重原子同型置換法、多波長異常分散法（ＭＡＤ法）などが用いられる。目的蛋白質に対する類縁蛋白質の立体構造が未知あるいは相同性が低い場合には、その立体構造を利用した分子置換法による構造解析が不可能であるため、ＰＢＰ２ｂ結晶構造の決定には、重原子同型置換法またはＭＡＤ法などが好ましく、より好ましくはセレノメチオニン置換体結晶を用いたＭＡＤ法が用いられる。特に好ましくは、前段落に記載した（４）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶を用いたＭＡＤ法であり、新規結晶構造決定が初めて可能となる。前段落（３−２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体結晶を用いた場合には、分解能がやや劣ることおよび非対称単位中の分子数が多いことによりＭＡＤ法による構造決定は困難であるが、（３−１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分の結晶を用いた場合も含め、構造決定したトランスペプチダーゼドメインの結晶構造をサーチモデルに利用する分子置換法により構造決定が可能となる。
【００１９】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は実施例によって限定されるものではない。また、各種ベクターの作製、蛋白質の発現等は、特に記載のない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ著，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ刊（２００１））などに記載の公知の手法に従って実施できる。
【実施例１】
【００２０】
＜＜肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂおよび変異体の可溶性部分の大腸菌発現ベクター構築＞＞
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質の大腸菌発現ベクター（ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔ）は特許公開２００４−２９００７０号広報に記載の方法により作製した。また、配列番号３に示されるアミノ酸残基番号４３１のスレオニン、４３２のグルタミン、４５１のスレオニン、６２４のアラニンが各々リジン、ロイシン、アラニン、グリシンに置換した変異体である、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のＧＳＴ融合タンパク質の大腸菌発現ベクター（ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７）についても同様に特許公開２００４−２９００７０号広報に記載の方法により作製した。
【実施例２】
【００２１】
＜＜Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂおよび変異体の可溶性部分の発現＞＞
ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔを大腸菌ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に、また、ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７を大腸菌ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に形質転換し得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＳＢ培地（１．２％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、２．４％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０７２Ｍ リン酸水素二カリウム、０．０２８Ｍ リン酸二水素カリウム）５Ｌ中で６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が１．０に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２８℃で２時間誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）４００ｍＬに懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム含有ＰＢＳ）に懸濁し、氷上で３０分インキュベートした。次に１分間の超音波処理を２回施し、細胞を破砕した。遠心分離（６０分間、１２０００ｒｐｍ）とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【実施例３】
【００２２】
＜＜Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体の発現＞＞
ＭＡＤ法によるＸ線結晶構造解析に使用する重原子誘導体結晶を作製するために、メチオニンの硫黄原子が重原子であるセレンに置換されたＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体のセレノメチオニン置換体の発現を試みた。実施例１記載の組み換えプラスミドｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７をメチオニン要求株である大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、アンピシリン耐性コロニーを取得した。得られた形質転換体は１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍＬにて、３７℃で一晩培養し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む４ＬのＬｅＭａｓｔｅｒ培地（組成は下記の表１に示す）に４０ｍＬ接種し、６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が０．５−０．８に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、３０℃で一晩誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）２２５ｍＬに懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム含有ＰＢＳ）に懸濁し、氷上で３０分インキュベートした。次に１分間の超音波処理を３回施し、細胞を破砕した。遠心分離（６０分間、１２０００ｒｐｍ）とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【００２３】
【表１】
【実施例４】
【００２４】
＜＜Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂおよび変異体の可溶性部分の精製＞＞
（１）アフィニティー精製
以下の精製操作は４℃で実施した。実施例２で調製した細胞抽出液を予めＰＢＳで平衡化したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）担体８０ｍＬにバッチ法で結合させた。これを担体の１０倍容量のＰＢＳで５回洗浄した後、担体容量と等量の溶出液（１０ｍＭ 還元型グルタチオン、５０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９）で３回溶出した。
【００２５】
（２）ＧＳＴタグの切断
上記（１）で精製したサンプルを１ｍｇ／ｍＬに希釈し、終濃度２．５ｕｎｉｔ／ｍＬのトロンビン（シグマ社製）を添加し、４℃で一晩反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。
【００２６】
（３）陰イオン交換カラムによる精製
上記（２）で得られたサンプルを陰イオン交換カラムであるＰＯＲＯＳ ＨＱ／２０（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製した。流速は１０ｍＬ／ｍｉｎであり、サンプルを３分割し、精製は３度実施した。平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９中の０−６００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１５カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ担体にアプライし、バッチ法によりＧＳＴタグを除去した。
【００２７】
（４）ハイドロキシアパタイトカラムによる精製
ハイドロキシアパタイトカラムは、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ＴＹＰＥ Ｉ ２０μｍ（バイオラッド社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量８ｍＬのカラムを作製した。次に、（３）で得られたサンプルを平衡化バッファー（５ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８）に対して透析しバッファー置換を実施した。サンプルを３分割し、精製は３度実施した。平衡化バッファーで平衡化したカラムに流速３ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５−２５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８の直線勾配（２０カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめた。
【００２８】
（５）ゲルろ過カラムによる精製
上記（４）で得られたサンプルを保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ３０ｋＤａ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）を用いて２ｍＬまで濃縮し、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．５、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。精製はサンプルを２等分し、２度に分けて実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な画分をまとめ、上記記載の限外ろ過膜を用いて１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。
【実施例５】
【００２９】
＜＜Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体の精製＞＞
（１）アフィニティー精製
以下の精製操作は４℃で実施した。アフィニティーカラムは、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量５０ｍＬのカラムを作製し、平衡化バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール含有ＰＢＳ）で平衡化した。そこへ実施例３で調製した細胞抽出液を流速２ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、５カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、溶出バッファー（５０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１０ｍＭ 還元型グルタチオン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、溶出画分を確認し、主要なフラクションをまとめて回収した。
【００３０】
（２）ＧＳＴタグの切断
上記（１）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）に対して透析した後、２倍量の透析バッファーを加えて希釈し、終濃度５ｕｎｉｔ／ｍＬのトロンビン（シグマ社製）を添加し、４℃で一晩反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。
【００３１】
（３）陰イオン交換カラムによる精製
上記（２）で得られたサンプルを陰イオン交換カラムであるＰＯＲＯＳ ＨＱ／２０（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製した。流速は１０ｍＬ／ｍｉｎであり、サンプルを３分割し、精製は３度実施した。平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ジチオスレイトール中の０−５００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１６カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ担体２ｍＬにアプライし、バッチ法によりＧＳＴタグを除去した。
【００３２】
（４）ハイドロキシアパタイトカラムによる精製
ハイドロキシアパタイトカラムは、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ＴＹＰＥ Ｉ ２０μｍ（バイオラッド社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量８ｍＬのカラムを作製した。次に、（３）で得られたサンプルを平衡化バッファー（５ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８、１ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化した脱塩カラムＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速７．５ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、バッファー置換を実施した。サンプルを３分割し、精製は３度実施した。平衡化バッファーで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに流速３ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、１ｍＭ ジチオスレイトール中の５−２５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８の直線勾配（２５カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめた。
【００３３】
（５）ゲルろ過カラムによる精製
上記（４）で得られたサンプルを保持分子量５００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ５０ｋＤａ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）を用いて１．７ｍＬまで濃縮し、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．５、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１０ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。精製はサンプルを２等分し、２度に分けて実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な画分をまとめ、上記記載の限外ろ過膜を用いて２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、終濃度０．０５ｍＭのＥＤＴＡを添加後、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。
【実施例６】
【００３４】
＜＜トランスペプチダーゼドメイン調製のための大腸菌発現系の構築＞＞
（１）トリプシン限定分解によるトランスペプチダーゼドメインの同定
実施例５で精製したＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトールでタンパク質終濃度０．４ｍｇ／ｍＬに希釈した。次に、希釈液１０μＬ、５ｍｇ／ｍＬ トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ ＴＰＣＫ ｔｒｅａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、Ｓｉｇｍａ社製）溶液１．６μＬ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液２μＬ、ＭｉｌｌｉＱ水６．４μＬを混合し、２６℃、１時間反応後、サンプルを２等分した。一方は終濃度１ｍＭ ＰＭＳＦおよび還元剤含有のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと等量混合し、３分間煮沸後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、主要なバンドを切り出しプロテインシークエンサーによりＮ末端アミノ酸配列を分析した。残りの一方は１０分の１量の１０％酢酸を加えた後、ＺｉｐＴｉｐＣ４（ミリポア社製）を用いて精製しＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置にて分子量を測定した。その結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量４１ｋ、２５ｋ、１９ｋ付近の主要なバンドおよび１２ｋ付近のマイナーなバンドが確認された。Ｎ末端アミノ酸配列の結果では、４１ｋ付近のバンドのＮ末端アミノ酸配列はＬＴＩ、１９ｋ付近のバンドはＧＥＩＹＤ、１２ｋ付近のバンドはＧＧＬＧＤ、ＴＧＴＧＥおよびＳＡＹＰＧの混合物であり、この内ＳＡＹＰＧの配列はトリプシン由来であった。質量分析では多数のピークが観測されたが、その中に分子量１８２８４、１８１５８、１３１５６のピークが存在しており、また、２３３００のピークはトリプシン由来であることが判明した。以上の結果から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの２５ｋのバンドはトリプシン由来、４１ｋのバンドは配列番号３に示されるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂにおいてはアミノ酸番号３１５〜６８５、１９ｋのバンドは６６〜２２８、６６〜２２９の混合物、１２ｋのバンドは５６２〜６８０、６２１〜６８５の混合物に対応することが判明した。トランスペプチダーゼドメインに存在する保存モチーフはアミノ酸番号３９１から始まるＳＶＶＫ、４４８から始まるＳＳＮ、６２０から始まるＫＴＧであることから、トランスペプチダーゼドメインとしてアミノ酸番号３１５〜６８５からなる領域を選択した。
【００３５】
（２）トリプシン限定分解時におけるマイナー部位での切断を回避するための点変異の導入
上記（１）においてトリプシン限定分解でのマイナー部位での切断箇所として配列番号３に示されるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂにおいてはアミノ酸番号５６１および６２０のリジン残基の直後が対応する。この内、アミノ酸番号６２０のリジンはトランスペプチダーゼドメインの保存モチーフに存在するため、変異を導入するのは好ましくないが、アミノ酸番号５６１のリジンは変異を導入することでトリプシン限定分解時におけるマイナー部位での切断を回避することができる。また、アミノ酸番号６６〜２２８、６６〜２２９の混合物からなる部分についてはトランスペプチダーゼドメインと相互作用している可能性が否定できなかったため、アミノ酸番号２２９のリジン残基についても変異を導入し、混合物生成を回避する方針とした。ここで、アミノ酸番号５６１および２２９のいずれについてもグルタミンへの変異を試みた。実施例１に記載のｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔおよびｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７を鋳型として、下記のプライマーを用い、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）で、添付の説明書の方法に従い、アミノ酸番号５６１の部位への変異を導入した。
【００３６】
２ｂ＿Ｒ６＿Ｋ５６１Ｑ＿５：５’−ＧＧＣＡＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＡＡＴＧＡＴＣＡＧＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＴＴＧ−３’（配列番号６）
２ｂ＿Ｒ６＿Ｋ５６１Ｑ＿３：５’−ＣＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＴＴＡＣＣＡＴＡＡＡＴＧＣＣ−３’（配列番号７）
【００３７】
次に下記のプライマーを用いて同様の手順に従い、さらにアミノ酸番号２２９の部位への変異を導入し、ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔ−２２９Ｑ−５６１ＱおよびｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７−２２９Ｑ−５６１Ｑを作製した。これらのプラスミドのＤＮＡ配列を確認し、各々配列番号４、配列番号１に記載のアミノ酸配列に目的の２箇所の点変異が導入されたＲ６株由来および変異体のＰＢＰ２ｂ可溶性部分をコードすることを確認した。
【００３８】
２ｂ＿Ｒ６＿Ｋ２２９Ｑ＿５：５’−ＣＴＧＧＣＡＴＴＡＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＴＧＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＴＧＧＡ−３’（配列番号８）
２ｂ＿Ｒ６＿Ｋ２２９Ｑ＿３：５’−ＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＣＡＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＴＡＣＴＡＡＴＧＣＣＡＧ−３’（配列番号９）
【実施例７】
【００３９】
＜＜Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂおよび変異体トランスペプチダーゼドメイン取得のための可溶性部分セレノメチオニン置換体の発現＞＞
実施例６で得られたｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔ−２２９Ｑ−５６１ＱおよびｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７−２２９Ｑ−５６１Ｑをメチオニン要求株である大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、アンピシリン耐性コロニーを取得した。得られた形質転換体は１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍＬにて、３７℃で一晩培養し、遠心分離機で集菌後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１００ｍｌのＬｅＭａｓｔｅｒ培地（組成は実施例３の表１に示す）で懸濁し、再度、遠心分離機によって集菌し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬｅＭａｓｔｅｒ培地１００ｍｌに再懸濁した。この懸濁液を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む４．８ＬのＬｅＭａｓｔｅｒ培地に４８ｍＬ接種し、６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が０．５−０．８に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、３０℃で４時間誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）２００ｍＬに懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム含有ＰＢＳ）に懸濁し、氷上で３０分インキュベートした。次に１分間の超音波処理を４回施し、細胞を破砕した。遠心分離（６０分間、１２０００ｒｐｍ）とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【実施例８】
【００４０】
＜＜Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂおよび変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の精製＞＞
（１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の精製
（１−１）アフィニティー精製
以下の精製操作は４℃で実施した。アフィニティーカラムは、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量５０ｍＬのカラムを作製し、平衡化バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール含有ＰＢＳ）で平衡化した。そこへ実施例７においてｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔ−２２９Ｑ−５６１Ｑを用いて調製した細胞抽出液を流速２ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、５カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、溶出バッファー（５ｕｎｉｔ／ｍＬトロンビン（シグマ社製）含有ＰＢＳ）を５０ｍＬアプライした段階でポンプを止めて１０℃で一晩反応させＧＳＴタグを切断した。平衡化バッファーを送り込んで溶出した後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶出画分を確認し、主要なフラクションをまとめて回収した。
【００４１】
（１−２）陰イオン交換カラムによる精製
上記（１−１）で得られたサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）に対して透析した後、陰イオン交換カラムであるＰＯＲＯＳ ＨＱ／２０（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製した。流速は１０ｍＬ／ｍｉｎであり、サンプルを４分割し、精製は４度実施した。平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール中の０−３００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１２カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめた。
【００４２】
（１−３）トリプシン限定分解
上記（１−２）で精製したＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分のセレノメチオニン置換体を２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール溶液に対して透析した後回収し、はじめに小スケールでのトリプシン限定分解の条件検討を実施した。回収液５μＬを０．１２５〜５ｍｇ／ｍＬのトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ ＴＰＣＫ ｔｒｅａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、Ｓｉｇｍａ社製）溶液と等量混合し、２４℃、２時間反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各濃度におけるトリプシン消化のパターンを確認し、トリプシンの添加量を終濃度０．１２５ｍｇ／ｍｌと決定し、残りの全サンプルのトリプシン限定分解を実施した。
【００４３】
（１−４）陰イオン交換カラムによる精製
上記（１−３）で得られたサンプルを陰イオン交換カラムであるＭｏｎｏＱ ＨＲ１０／１０（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、サンプルを４分割し、精製は４度実施した。平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール中の０−３００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１５カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめた。
【００４４】
（１−５）ハイドロキシアパタイトカラムによる精製
ハイドロキシアパタイトカラムは、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ＴＹＰＥ Ｉ ２０μｍ（バイオラッド社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量８ｍＬのカラムを作製した。次に、（１−４）で得られたサンプルを平衡化バッファー（５ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８、１ｍＭ ジチオスレイトール）に対して透析し、バッファー置換を実施した。サンプルを２分割し、精製は２度実施した。平衡化バッファーで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに流速３．５ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、１ｍＭ ジチオスレイトール中の５−２５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８の直線勾配（２５カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、非吸着画分をまとめた。
【００４５】
（１−６）ゲルろ過カラムによる精製
上記（１−５）で得られたサンプルを保持分子量１００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ １０ｋＤａ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）を用いて０．７５ｍＬまで濃縮し、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ８．０、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な画分をまとめ、上記記載の限外ろ過膜を用いて１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、分子量４１ｋ付近のバンドのみが確認され、１９ｋ付近のバンドについては除去されたことから、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体であることが示唆された。
【００４６】
（２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の精製
（２−１）アフィニティー精製
以下の精製操作は４℃で実施した。アフィニティーカラムは、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量５０ｍＬのカラムを作製し、平衡化バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール含有ＰＢＳ）で平衡化した。そこへ実施例７においてｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７−２２９Ｑ−５６１Ｑを用いて調製した細胞抽出液を流速２ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、５カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、溶出バッファー（５０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１０ｍＭ 還元型グルタチオン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶出画分を確認し、主要なフラクションをまとめて透析バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）に対して透析することでバッファー置換をした。次に、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ ＴＰＣＫ ｔｒｅａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、Ｓｉｇｍａ社製）を終濃度２．３μｇ／ｍＬの条件で添加し、２５℃で１時間反応させることでＧＳＴタグのみを切断し、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。
【００４７】
（２−２）陰イオン交換カラムによる精製
上記（２−１）で得られたサンプルを陰イオン交換カラムであるＭｏｎｏＱ ＨＲ１０／１０（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、サンプルを５分割し、精製は５度実施した。平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール中の０−２５０ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（８カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめた。
【００４８】
（２−３）トリプシン限定分解
上記（２−２）で精製したＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体を２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール溶液に対して透析した後回収し、はじめに小スケールでのトリプシン限定分解の条件検討を実施した。回収液９μＬに０．０３９〜１０ｍｇ／ｍＬのトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ ＴＰＣＫ ｔｒｅａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、Ｓｉｇｍａ社製）溶液１μＬを添加し、２５℃、１時間反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各濃度におけるトリプシン消化のパターンを確認し、トリプシンの添加量を終濃度０．１２５ｍｇ／ｍｌと決定し、残りの全サンプルのトリプシン限定分解を実施した。
【００４９】
（２−４）陰イオン交換カラムによる精製
上記（２−３）で得られたサンプルを陰イオン交換カラムであるＭｏｎｏＱ ＨＲ１０／１０（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、サンプルを４分割し、精製は４度実施した。平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール中の０−２５０ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１５カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめた。
【００５０】
（２−５）ハイドロキシアパタイトカラムによる精製
ハイドロキシアパタイトカラムは、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ＴＹＰＥ Ｉ ２０μｍ（バイオラッド社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量８ｍＬのカラムを作製した。次に、（２−４）で得られたサンプルを平衡化バッファー（５ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８、１ｍＭ ジチオスレイトール）に対して透析し、バッファー置換を実施した。サンプルを２分割し、精製は２度実施した。平衡化バッファーで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに流速３．５ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、非吸着画分を回収した。
【００５１】
（２−６）陽イオン交換カラムによる精製
上記（２−５）で得られたサンプルを平衡化バッファー（５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ ５．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール）に対して透析し、バッファー置換を実施した後、陽イオン交換カラムであるＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した。サンプルを２分割し、精製は２度実施した。平衡化バッファーで平衡化したカラムに流速４ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ ５．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール中の０−２００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１６カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより主要な溶出画分をまとめた。
【００５２】
（２−７）ゲルろ過カラムによる精製
上記（２−６）で得られたサンプルを保持分子量１００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ １０ｋＤａ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）を用いて１．２ｍＬまで濃縮し、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．９、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な画分をまとめ、上記記載の限外ろ過膜を用いて４．７ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは分子量４１ｋ付近のバンドのみが確認された。また、エレクトロスプレイイオン化法による質量分析装置により解析したところ、分子量３９８５１に主要なピークが確認されたことから、計算値で３９８４３の分子量を持つ、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体であることが確認された。
【実施例９】
【００５３】
＜＜ＰＢＰ２ｂの結晶化＞＞
（１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分の結晶化
Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分の結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例４で精製したタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）０．５μＬと結晶化剤（０．８−１．６Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ４．６）０．５μＬを混合し結晶化ドロップとし、リザーバー溶液として上記結晶化剤１００μＬ分注し密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内に静置すると数日で針状のクラスター結晶が得られた。０．８Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ４．６からなる結晶化剤を用いて得られた結晶の顕微鏡写真を図1に示す。
【００５４】
（２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶化
Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例８（１）で精製したタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）２．０μＬと結晶化剤（１．１−１．６Ｍ 硫酸アンモニウム、１５％ グリセロール、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９）２．０μＬをカバーガラス上で混合し結晶化ドロップとした。リザーバー溶液として上記結晶化剤５００μＬをＶＤＸプレート（ハンプトンリサーチ社製）のウェルに分注し、Ａｌ’ｓオイル（ハンプトンリサーチ社製）２５０μＬをリザーバー溶液の上に重層した。ウェルの淵に高真空グリースを塗り、カバーガラスをドロップが内側になるように被せ密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内に静置すると数日で針状のクラスター結晶が得られた。１．１Ｍ 硫酸アンモニウム、１５％ グリセロール、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９からなる結晶化剤を用いて得られた結晶の顕微鏡写真を図２に示す。
【００５５】
（３）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体の可溶性部分およびセレノメチオニン置換体の結晶化
（３−１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体の可溶性部分の結晶化
Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体の可溶性部分の結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例４で精製したタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１．０μＬと結晶化剤（１０−２０％ ポリエチレングリコール８０００、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．０）１．０μＬをカバーガラス上で混合し結晶化ドロップとした。リザーバー溶液として上記結晶化剤５００μＬをＶＤＸプレート（ハンプトンリサーチ社製）のウェルに分注した。ウェルの淵に高真空グリースを塗り、カバーガラスをドロップが内側になるように被せ密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内に静置すると数日で結晶が得られた。また、硫酸アンモニウムの代わりに硫酸リチウム、硫酸ナトリウムを用いた場合も同様に結晶が得られた。１０％ ポリエチレングリコール８０００、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．０からなる結晶化剤を用いて得られた結晶の顕微鏡写真を図３に示す。
【００５６】
（３−２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体の結晶化
Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分の結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例５で精製したタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１．０μＬと結晶化剤（１８−２０％ ポリエチレングリコール８０００、０．３Ｍ 硫酸リチウム、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５、１０ｍＭ ジチオスレイトール）１．０μＬをカバーガラス上で混合し結晶化ドロップとした。リザーバー溶液として上記結晶化剤５００μＬをＶＤＸプレート（ハンプトンリサーチ社製）のウェルに分注し、Ａｌ’ｓオイル（ハンプトンリサーチ社製）２００μＬをリザーバー溶液の上に重層した。ウェルの淵に高真空グリースを塗り、カバーガラスをドロップが内側になるように被せ密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内に静置すると数日で結晶が得られた。また、硫酸リチウムの代わりに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムを用いた場合も同様に結晶が得られた。１９％ ポリエチレングリコール８０００、０．３Ｍ 硫酸リチウム、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５、１０ｍＭ ジチオスレイトールからなる結晶化剤を用いて得られた結晶の顕微鏡写真を図４に示す。
【００５７】
（４）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶化
Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例８（２）で精製したタンパク質溶液（４．７ｍｇ／ｍＬ）０．４μＬと結晶化剤（１．１−１．５Ｍ 硫酸アンモニウム、１５％ グリセロール、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９−８．５）０．４μＬを混合し結晶化ドロップとし、リザーバー溶液として上記結晶化剤１００μＬ分注し密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内に静置すると数日で結晶が得られた。１．５Ｍ 硫酸アンモニウム、１５％ グリセロール、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５からなる結晶化剤を用いて得られた結晶の顕微鏡写真を図５に示す。また、硫酸アンモニウムの代わりに硫酸ナトリウムを用いた条件（０．７−１．１Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液 ｐＨ ６．０−６．５または０．１Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ５．５または０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．０−７．５またはトリス塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９−８．５）および硫酸マグネシウムを用いた条件（０．９−１．１Ｍ 硫酸マグネシウム、１−１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液 ｐＨ ６．５）でも同様の結晶が得られた。また、Ｎ−Ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｄ−ａｌａｎｙｌｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄを添加した条件でも同様の結晶が得られ、ハンギングドロップ蒸気拡散法においても同様の結晶が得られた。さらに、マイクロ・フリューディック技術を応用したＴＯＰＡＺ ４．９６スクリーニングチップ（フリューダイム社製）を用いた場合には結晶化剤として（ｉ）１Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム ｐＨ ４．６および（ｉｉ）１．５Ｍ リン酸水素二カリウムを用いた条件において外見上同様の結晶が得られた。
【実施例１０】
【００５８】
＜＜ＰＢＰ２ｂ結晶のＸ線回折強度データの収集＞＞
（１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体の可溶性部分の結晶
実施例９（３−１）において得られた結晶を３５％グリセロール含有の抗凍結剤溶液に移した後、−１７０℃の窒素ガス気流にて急速凍結した。これを（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８の創薬産業ビームラインＢＬ３２Ｂ２を利用しイメージングプレートを装備したＲ−ＡＸＩＳ Ｖ（リガク社製）を検出装置としてＸ線回折データを振動法にて測定した。Ｘ線の波長は１Å、振動角は１°／フレームであった。次に、回折強度データ処理プログラムＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ(リガク社製)を使用して、回折強度データを分解能３．５Åで処理した。その結果、空間群がＦ２２２であり、格子定数がａ＝１７５．４７Å、ｂ＝１８６．１６Å、ｃ＝３６８．５３Å、α＝β＝γ＝９０°であった。得られたデータのＣｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓは９９．９％、Ｒｍｅｒｇｅは９．４％であった。データ収集の結果を下記の表２にまとめた。
【００５９】
【表２】
【００６０】
（２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体結晶
実施例９（３−２）において得られた結晶を２０％グリセロール含有の抗凍結剤溶液に移した後、−１７０℃の窒素ガス気流にて急速凍結した。これを（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８の創薬産業ビームラインＢＬ３２Ｂ２を利用しイメージングプレートを装備したＲ−ＡＸＩＳ Ｖ（リガク社製）を検出装置としてＸ線回折データを振動法にて測定した。このとき、セレンの異常散乱効果を用いて構造解析を行うために、波長は０．９７９４７、０．９７８７９および０．９００００Åの３波長、即ち、吸収端のエッジ、ピーク、リモートの３カ所でＭＡＤデータを収集した。振動角は１°／フレームであった。次に、回折強度データ処理プログラムＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ(リガク社製)を使用して、回折強度データを分解能３．５Åで処理した。その結果、空間群がＦ２２２であり、格子定数がａ＝１７５．７５Å、ｂ＝１８６．２１Å、ｃ＝３６９．２１Å、α＝β＝γ＝９０°であった。データ収集の結果を下記の表３にまとめた。
【００６１】
【表３】
【００６２】
（３）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶
実施例９（４）において、１．５Ｍ 硫酸アンモニウム、１５％ グリセロール、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５からなる結晶化剤を用いて得られた結晶を２５％グリセロール含有の抗凍結剤溶液に移した後、−１７０℃の窒素ガス気流にて急速凍結した。これを（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８の創薬産業ビームラインＢＬ３２Ｂ２を利用しイメージングプレートを装備したＲ−ＡＸＩＳ Ｖ（リガク社製）を検出装置としてＸ線回折データを振動法にて測定した。このとき、セレンの異常散乱効果を用いて構造解析を行うために、波長は０．９７９４８、０．９７９０７および０．９００００Åの３波長、即ち、吸収端のエッジ、ピーク、リモートの３カ所でＭＡＤデータを収集した。振動角は１°／フレームであった。次に、回折強度データ処理プログラムＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ(リガク社製)を使用して、回折強度データを分解能２．４Åで処理した。その結果、空間群の候補がＰ４３２１２またはＰ４１２１２となったが、下記に示す実施例１１の解析結果からＰ４３２１２と判明した。格子定数はａ＝８６．３９Å、ｂ＝８６．３９Å、ｃ＝１４３．２７Å、α＝β＝γ＝９０°であり、データ収集の結果を下記の表４にまとめた。また、同様の手順で調製した結晶を（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８の構造生物学ＩビームラインＢＬ４１ＸＵを利用しＱｕａｎｔｕｍ３１５ＣＣＤカメラ（ＡＤＳＣ社製）を検出器としてＸ線回折データを振動法にて測定した。Ｘ線の波長は１Å、振動角は１°／フレームであり、回折強度データを２．２Åで処理した結果、空間群はＰ４３２１２、格子定数はａ＝８６．３４Å、ｂ＝８６．３４Å、ｃ＝１４３．４０Å、α＝β＝γ＝９０°であった。データ収集の結果を下記の表５にまとめた。また、実施例９（４）において、０．８Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液 ｐＨ ６．５からなる結晶化剤を用いてＮ−Ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｄ−ａｌａｎｙｌｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ存在下で得られた結晶を用いて、同様の条件でＸ線回折測定を実施したところ、空間群はＰ４３２１２、格子定数はａ＝８６．４１Å、ｂ＝８６．４１Å、ｃ＝１４３．９６Å、α＝β＝γ＝９０°であった。
【００６３】
【表４】
【００６４】
【表５】
【実施例１１】
【００６５】
＜＜ＰＢＰ２ｂの結晶構造決定＞＞
次に、プログラムＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｎｇｅｒ， Ｔ．Ｃ． ＆ Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ，Ｊ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ ５５，８４９−８６１（１９９９））を用いて、実施例１０の表４に示したＭＡＤデータを処理し、セレン原子の位置を決定し初期位相を計算した。位相の改良及び初期モデルの構築はプログラムＲＥＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ, Ｔ．Ｃ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ５６，９６５−９７２（２０００））を用いた。この際、空間群Ｐ４１２１２で処理した場合には妥当な電子密度が得られず、空間群Ｐ４３２１２で処理した場合においてタンパク質の明瞭の電子密度が得られたため、空間群をＰ４３２１２と決定した。次いで、プログラムＬａｆｉｒｅ（ＹＡＯ Ｍ．他、Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６２（２）、１８９−１９６（２００６））、プログラムＴｕｒｂｏ Ｆｒｏｄｏ（ＡＦＭＢ−ＣＮＲＳ製）、プログラムＲｅｆｍａｃ５（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ４（ｃｃｐ４））およびプログラムＣＮＸ（アクセルリス社製）を利用したモデルの構築および修正を繰り返し実施し、Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインの結晶構造を決定し、最終的には実施例１０の表５に示した高分解能のデータを用いて分解能２．２Åで構造精密化を実施した。本結晶の非対称単位中にはＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインが１分子存在していた。決定した結晶構造の正確さの指標であるＲ因子は、０．２０９であった。さらに、精密化の段階で計算に入れなかった全反射の５％に相当する構造因子から計算されるＲｆｒｅｅ因子は０．２３０であった。また、決定したＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインの構造を図６に示した。さらに、結晶中において、隣り合うＰＢＰ２ｂ分子の境界に存在する2回軸上に硫酸イオンが存在し、各ＰＢＰ２ｂ分子のリジン、アスパラギン残基の側鎖および水分子と水素結合を形成していた。結晶中において、分子間のパッキングに関与している硫酸イオン周辺の電子密度図とモデルを図７に示した。ここで、リジンは配列番号３に示されるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂの配列における４３１番目のスレオニンをリジンへ変異させた残基に対応しており、薬剤耐性に関与しているアミノ酸変異の導入と硫酸アンモニウム等の硫酸塩を結晶化剤として使用することを組み合わせることにより高品質の結晶が製造できることを見出した。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明のＰＢＰ２ｂ結晶は、Ｘ線結晶構造解析可能な新規な結晶であり、解析に成功した立体構造情報を利用することにより阻害剤の効率的な設計等が可能となり、新薬創出に活用できるため、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明のＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分の結晶の顕微鏡写真である。
【図２】本発明のＲ６株由来ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶の顕微鏡写真である。
【図３】本発明のＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分の結晶の顕微鏡写真である。
【図４】本発明のＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体結晶の顕微鏡写真である。
【図５】本発明のＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶の顕微鏡写真である。
【図６】決定したＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインの構造をリボン図で示す。
【図７】本発明のＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメイン結晶中において、分子間のパッキングに関与している硫酸イオン周辺の電子密度図とモデルを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｘ線結晶構造解析および阻害剤の設計等に利用するためのペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）は細菌における細胞壁を構成する構造ユニットであるムレインモノマーを基質として細胞壁ペプチドグリカンを組み立てる一連の酵素群であり、細菌のペプチドグリカンの重合および架橋反応に働く膜結合型のタンパク質である。肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）には６種類のＰＢＰが確認されているが、ペニシリン耐性肺炎連鎖球菌では主に３種類のＰＢＰ（ＰＢＰ１ａ、ＰＢＰ２ｘ、ＰＢＰ２ｂ）における変異がβ−ラクタム薬の感受性低下に関与している。特にペニシリン系薬剤およびカルバペネム系薬剤においては、耐性とＰＢＰ２ｂ変異との密接な関連が示唆されている。また、配列番号３に示されるＲ６株（ＡＴＣＣ４９６１９）由来ＰＢＰ２ｂにおいては、アミノ酸残基番号４３１のスレオニン、４３２のグルタミン、４５１のスレオニン、６２４のアラニンが各々リジン、ロイシン、アラニン、グリシンに置換された変異が薬剤耐性に重要であることが示唆されている（非特許文献１および特許文献１参照）。従って、ＰＢＰ２ｂはβ−ラクタム薬の耐性に重要な役割を果たしており、ＰＢＰ２ｂの立体構造をＸ線結晶構造解析により解明することは、耐性のメカニズムを説明するだけでなく、耐性菌に有効な新薬を創出する上でも非常に重要である。
【０００３】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来ＰＢＰ２ｂは、細胞内ドメイン、膜貫通領域、Ｎ末端ドメインおよびトランスペプチダーゼドメインから構成される膜結合型タンパク質であり、細胞内ドメインおよび膜貫通領域を除去し、膜結合機能を喪失させたＰＢＰ２ｂ可溶性部分の調製方法が明らかになっている（特許文献１および非特許文献２参照）。しかしながら、ＰＢＰ２ｂ可溶性部分からさらにＮ末端ドメインを除去したトランスペプチダーゼドメインの調製方法は未だ明らかとなっていない。また、膜結合型ＰＢＰ２ｂ、ＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインのいずれについても、結晶および結晶構造解析の報告はない。従って、Ｘ線結晶構造解析によりＰＢＰ２ｂの立体構造を決定し、効率的な阻害剤の設計を可能とする高品質のＰＢＰ２ｂ結晶の創出が望まれている。
【０００４】
一般にタンパク質のＮ末端、Ｃ末端やループ領域は構造が揺らいでいる場合があり、その際には複数のコンフォメーションを取り得ることから、タンパク質の揺らいでいる領域の除去やドメインの切り出しは均一のコンフォメーションから構成される高分解能のＸ線回折能を有する結晶を作製するために有効な手段である（非特許文献３参照）。その一つの方法としてプロテアーゼであるトリプシンを利用してタンパク質を限定分解する方法が知られている。トリプシンは表面に露出している塩基性アミノ酸であるリジンやアルギニン残基の直後を選択的に切断することにより、タンパク質の揺らいでいる領域を除去可能な場合がある。肺炎連鎖球菌ＰＢＰ１ａではトリプシン限定分解物において分解能２．６ÅのＸ線回折能を示す結晶が得られており、その際、トリプシン限定分解物の純度を確保しマイナー部位での切断を避けるため１箇所点変異を導入している（非特許文献４参照）。また、肺炎連鎖球菌ＰＢＰ１ｂではトリプシン限定分解物において分解能１．９ÅのＸ線回折能を示す結晶が得られており、その際、トリプシン限定分解物の純度を確保しマイナー部位での切断を避けるため３箇所点変異を導入している（非特許文献５参照）。しかしながら、トリプシン限定分解のパターンは個々のタンパク質に依存し、ＰＢＰ２ｂでは未だ明らかになっていないことから、点変異導入の必要性も含め結晶化に適したトリプシン限定分解物の作製には試行錯誤が必要である上、ＰＢＰ２ｂに対してトリプシン限定分解が有効な手段であるかも明らかではない。結晶化に適したＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインをトリプシン限定分解することにより新規に見出すことができれば、高品質の結晶を作製し、ＰＢＰ２ｂの立体構造を解明することに多いに貢献できると考えられる。
【０００５】
また、タンパク質の表面に露出しているグルタミン酸やリジン等の特定のアミノ酸残基に変異を導入し、タンパク質表面の性状を変化させることにより高品質の結晶を作製した報告も知られている（非特許文献６参照）。しかしながら、この方法は立体構造が既知のタンパク質においては有効であるが、ＰＢＰ２ｂのように立体構造が未知のタンパク質の場合には表面に露出している残基を正確に同定することができないため、理論に基づいて変異を導入することは困難である。立体構造が未知のタンパク質に対して表面の性状あるいはコンフォメーションを変化させるために変異を導入することは可能であるが、結晶化に適した変異であるかどうかについては、実際にタンパク質を調製し、結晶化スクリーニングを実施した後、Ｘ線回折実験で検証する必要があり、多大な試行錯誤を要する。さらに、作製した変異体の結晶化において、特定の試薬の添加が結晶化に有効であるかどうかを予想することも困難である。従って、ＰＢＰ２ｂにおいて、結晶化に適したアミノ酸変異の同定と結晶化に有効な試薬の組み合わせを見出すことができれば、高品質の結晶を作製し、ＰＢＰ２ｂの立体構造を解明することに多いに貢献できると考えられる。
【特許文献１】特許公開２００４−２９００７０号広報
【非特許文献１】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４８（６）２２４４−２２５０（２００４）
【非特許文献２】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４８（５）１８４８−１８５５（２００４）
【非特許文献３】ＢＩＯベンチャー ３（５）、３６−３９（２００３）
【非特許文献４】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５（４）６８４−６９６（２００６）
【非特許文献５】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０２（３）５７７−５８２（２００５）
【非特許文献６】Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １２（４）５２９−５３５（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまでＰＢＰ２ｂの結晶および結晶構造解析の報告はない。そのため、創薬において重要であるＰＢＰ２ｂの立体構造情報が存在せず効率的な阻害剤の設計が困難である。また、一般にトリプシン限定分解および適切なアミノ酸変異導入等により良質の結晶が得られる可能性があるが、ＰＢＰ２ｂへの適用はなく、Ｘ線結晶構造解析に適したＰＢＰ２ｂ結晶の製造方法は不明である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、結晶化に適したＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインを調製し、さらにアミノ酸変異を導入することにより、Ｘ線結晶構造解析を実施し効率的な阻害剤の設計等を可能とする高品質のＰＢＰ２ｂ結晶を提供することで上記課題を解決する。
【０００８】
本発明者は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインを調製し、膨大な数の結晶化条件探索の試行錯誤により再現性よく得られる結晶を取得した。さらに、薬剤耐性に関与するアミノ酸変異を導入することにより高品質で再現性よく得られるＰＢＰ２ｂの結晶を取得した。この結晶を用いて、多波長異常分散法（ＭＡＤ法）により分解能２．２Åの結晶構造解析に成功し、創薬研究に重要なＰＢＰ２ｂの立体構造を決定した。すなわち、本発明はＸ線結晶構造解析および阻害剤の設計等に利用するためのＰＢＰ２ｂ結晶に関する。ここで、ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分の結晶において、空間群はＦ２２２であり、格子定数はａ＝１７５±１８Å、ｂ＝１８６±１９Å、ｃ＝３６９±３７Å、α＝β＝γ＝９０°である。また、ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインの結晶において、空間群はＰ４３２１２であり、格子定数はａ＝８６±９Å、ｂ＝８６±９Å、ｃ＝１４３±１４Å、α＝β＝γ＝９０°である。さらに、ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインの結晶構造から、配列番号３におけるアミノ酸残基番号４３１に対応するスレオニンをリジンに置換する変異により導入したリジン残基の側鎖が結晶化剤として使用した硫酸塩と相互作用することで高品質の結晶が製造できることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を含有する。
（１）連鎖球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶。
（２）ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶。
（３）肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶。
（４）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂ可溶性部分から構成される（１）〜（３）のいずれか一項に記載の結晶。
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質から構成される（１）〜（４）のいずれか一項に記載の結晶。
（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質から構成される（１）〜（４）のいずれか一項に記載の結晶。
（７）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質から構成される（１）〜（４）のいずれか一項に記載の結晶。
（８）空間群がＦ２２２である（１）〜（７）のいずれか一項に記載の結晶。
（９）空間群がＦ２２２であり、格子定数がａ＝１７５±１８Å、ｂ＝１８６±１９Å、ｃ＝３６９±３７Å、α＝β＝γ＝９０°である（１）〜（７）のいずれか一項に記載の結晶。
（１０）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂトランスペプチダーゼドメインから構成される（１）〜（３）のいずれか一項に記載の結晶。
（１１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質から構成される（１）〜（４）、（１０）のいずれか一項に記載の結晶。
（１２）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質から構成される（１）〜（４）、（１０）のいずれか一項に記載の結晶。
（１３）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質から構成される（１）〜（４）、（１０）のいずれか一項に記載の結晶。
（１４）空間群がＰ４３２１２である（１）〜（４）、（１０）〜（１３）のいずれか一項に記載の結晶。
（１５）空間群がＰ４３２１２であり、格子定数がａ＝８６±９Å、ｂ＝８６±９Å、ｃ＝１４３±１４Å、α＝β＝γ＝９０°である（１）〜（４）、（１０）〜（１３）のいずれか一項に記載の結晶。
（１６）（１）〜（１５）のいずれか一項に記載の結晶であって、該結晶を構成するタンパク質中の少なくとも１つのメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されている結晶。
（１７）硫酸塩またはリン酸塩の存在下で成長する（１）〜（１６）のいずれか一項に記載の結晶。
（１８）硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウムまたはリン酸水素二カリウムの存在下で成長する（１）〜（１６）のいずれか一項に記載の結晶。
（１９）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（２０）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質。
（２１）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質。
（２２）肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶の製造方法であって、結晶化剤として硫酸塩またはリン酸塩を用いて結晶化することを特徴とする、（１）〜（１８）のいずれか一項に記載の結晶の製造方法。
（２３）結晶化剤として硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウムまたはリン酸水素二カリウムを用いることを特徴とする（２２）記載の製造方法。
（２４）配列番号３におけるアミノ酸残基番号４３１のスレオニンがリジンに置換されているアミノ酸変異を有することを特徴とする、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの可溶性部分またはトランスペプチダーゼドメインを調製する工程を含む、（２２）または（２３）記載の製造方法。
（２５）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を調製する工程を含む、（２２）〜（２４）のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＰＢＰ２ｂ結晶は高品質で再現性良く調製可能であるため、Ｘ線結晶構造解析に適しており、これまでに全く報告の無かったＰＢＰ２ｂの立体構造解析が初めて可能となった。本発明のＰＢＰ２ｂ結晶を利用することにより、ＰＢＰ２ｂを阻害する化合物の効率的な設計等に役立つ立体構造情報を取得できるため、創薬において極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜＜ＰＢＰ２ｂアミノ酸変異と可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメイン＞＞
本発明の結晶を構成するタンパク質は、連鎖球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、好ましくはストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、より好ましくは肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、さらに好ましくは肺炎連鎖球菌Ｒ６株（ＡＴＣＣ４９６１９）由来のタンパク質である。特に好ましくは、配列番号３に示されるアミノ酸残基番号４３１のスレオニン、４３２のグルタミン、４５１のスレオニン、６２４のアラニンが各々リジン、ロイシン、アラニン、グリシンに置換された変異体タンパク質であり、これらの変異は薬剤耐性菌の一部に存在する変異である。また、本発明において、「トランスペプチダーゼ」とは、細菌細胞壁の一つの成分であるペプチドグリカンの生合成の最終段階に関与し、ペプチドグリカン連鎖を構成しているＮ−アセチルムラミン酸から伸びるポリペプチド鎖の架橋を触媒する酵素を意味する。さらに、「トランスペプチダーゼドメイン」とは、上記ポリペプチド鎖を架橋する能力を有し、β−ラクタム薬との結合が可能であるタンパク質の構造単位である。本発明における「相同タンパク質」とは、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質である。ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＦＡＳＴＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８（１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｆａｓｔａ−ｊ．ｈｔｍｌ）においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値を示す。本発明における「改変タンパク質」とは、配列番号１または２で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質である。ここで、「置換、欠失、付加もしくは挿入」などの改変に係るアミノ酸の数は、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜６個である。
【００１２】
ＰＢＰ２ｂは、細胞内ドメイン、膜貫通領域、Ｎ末端ドメインおよびトランスペプチダーゼドメインから構成される膜結合型タンパク質である。ＰＢＰ２ｂ可溶性部分とは、細胞内ドメインおよび膜貫通領域を除去し、膜結合機能を喪失させたＰＢＰ２ｂである。ＰＢＰ２ｂ可溶性部分は由来となる株およびＮ末端が異なる種々のものが存在可能であるが、肺炎連鎖球菌Ｒ６株においては、好ましくは、配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基番号４３から６８５で構成される。ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインは、ＰＢＰ２ｂ可溶性部分からさらにＮ末端ドメインを除去することにより調製可能であり、除去する領域の違いにより種々のものが存在可能であるが、肺炎連鎖球菌Ｒ６株においては、配列番号３に示されるアミノ酸残基番号３１５から６８５で構成されるのが好ましいことをプロテアーゼであるトリプシンを用いた限定分解実験から見出せる。トランスペプチダーゼドメインの同定方法としては精製したＰＢＰ２ｂ可溶性部分を種々の濃度のトリプシン存在下で限定分解した試料の質量分析および生じた各断片のＮ末端アミノ酸配列分析により決定することができる。ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインはその領域のみを発現させることも可能であるが、好ましくは、ＰＢＰ２ｂ可溶性部分をトリプシン限定分解することにより調製することが望ましい。その際にマイナー部位での切断を回避するために、配列番号３に示されるアミノ酸残基番号２２９および５６１のリジン残基をグルタミンに置換する方法が有用であり、特に残基番号５６１のリジン残基をグルタミンに置換することが好ましい。なお、広義の解釈においては、ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインは膜結合機能を喪失させた可溶性タンパク質であるため、ＰＢＰ２ｂ可溶性部分に含有される。
【００１３】
＜＜ＰＢＰ２ｂ可溶性部分の発現＞＞
ＰＢＰ２ｂ可溶性部分は、それをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特にＤＮＡ発現ベクターの形態とし、それによって宿主細胞の形質転換を行い、その形質転換体を培養することによって得られる。このＤＮＡ分子は、ベクター分子にＰＢＰ２ｂ可溶性部分をコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることができる。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案して、ウィルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択することができる。例えば宿主細胞が大腸菌の場合はｐＵＣ、ｐＢＲ系のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐ系のプラスミドベクターが挙げられる。宿主細胞としては、宿主−ベクター系が確立されているものであれば利用可能であり、好ましくは大腸菌が挙げられる。宿主細胞の形質転換により得られた形質転換体は、適当な条件で培養し、得られた形質転換体の細胞抽出液を慣用の方法に従い回収することができる。ここで、ＰＢＰ２ｂ可溶性部分に付加的ポリペプチド、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはヒスチジン残基に富むポリペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を融合タンパク質として発現することも慣用の技術により可能である。
【００１４】
＜＜ＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインの精製＞＞
ＧＳＴを融合して大腸菌で発現させたＰＢＰ２ｂ可溶性部分は、グルタチオンを固定化したアフィニティーカラムを用いた慣用の技術により容易に精製が可能である。精製したＰＢＰ２ｂ可溶性部分を２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に対して透析した後、適当量のトリプシンを加え、室温で１〜２時間反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう加えることでＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインが得られる。添加するトリプシンの終濃度は典型的には０．１〜１ｍｇ／ｍＬであるが、ＰＢＰ２ｂ可溶性部分のタンパク質濃度に依存するため、好ましくは、毎回、少量での確認実験により決定する必要がある。ＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインは陰イオン交換カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、陽イオン交換カラム、ゲルろ過カラムを用いた一般的なクロマトグラフィーの手法を組み合わせて精製することが可能であり、配列番号３に示されるアミノ酸残基番号４３１のスレオニン、４３２のグルタミン、４５１のスレオニン、６２４のアラニンが各々リジン、ロイシン、アラニン、グリシンに置換された変異体においても同様に精製が可能である。
【００１５】
＜＜ＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインの結晶化＞＞
一般的に蛋白質の結晶化は容易ではない。結晶化できる条件が比較的容易に見出される場合もあるが、通常は種々の結晶化条件をスクリーニングしなければならない。さらに結晶化剤の濃度、ｐＨ、塩の種類と濃度、添加剤などの条件を最適化することによって、Ｘ線結晶構造解析に供することができる良質の結晶が得られる。また、いかなる条件でも結晶化しない蛋白質も存在すると考えられている。蛋白質の結晶が得られなければＸ線結晶構造解析を行うことができない。また、Ｘ線結晶構造解析に用いる蛋白質の結晶は、結晶であればいかなるものでも解析可能であるわけではない。実際にＸ線を照射した際に、高分解能の回折強度データが得られることが必要である。本発明におけるＰＢＰ２ｂ結晶化の方法は、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法、透析法などのいかなる方法を用いてもよいが、好ましくは蒸気拡散法であるハンギングドロップ法またはシッティングドロップ法が用いられる。また、シーディング法またはリザーバー溶液にオイルを重層することにより結晶核の形成および結晶成長をコントロールすることもできる。結晶化の温度は４℃〜２０℃が一般的であるが、本発明では好ましくは２０℃である。結晶化に用いるタンパク質としては、（１）配列番号４に示されるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分、（２）配列番号５に示されるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメイン、（３）配列番号１に示されるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分および（４）配列番号２に示されるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのいずれを用いても良いが、好ましくは（３）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分、より好ましくは（４）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインが用いられる。また、前記タンパク質中のメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されたセレノメチオニン置換体も同様に結晶化に用いられる。結晶化に用いる精製タンパク質の濃度は、４〜２０ｍｇ／ｍＬ程度であることが好ましい。そして、蛋白質溶液に結晶化剤、塩類、緩衝液、添加剤などを適当量加えて、結晶化を行う。本発明のＰＢＰ２ｂの結晶化に用いられる結晶化剤としては、硫酸アンモニウムなどの無機塩類、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子、イソプロパノールやエタノールなどの有機溶媒などが挙げられる。本発明においては、無機塩類を好ましく用いることができ、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウム等の硫酸塩もしくはリン酸水素二カリウム等のリン酸塩を特に好ましく用いることができる。また、必要に応じてポリエチレングリコールを組み合わせることも可能である。また、緩衝液としては、公知の緩衝液のいずれも用いることができる。さらに添加剤としては、種々の金属イオン、有機溶媒、還元剤等を用いることができる。セレノメチオニン置換体の場合には未置換体の場合における周辺の条件で結晶を作製できるが、セレン原子の酸化を抑制するためにジチオスレイトール等の還元剤を添加することが好ましい。各ＰＢＰ２ｂと好ましい結晶化剤の組み合わせについては次に示す通りである。
【００１６】
（１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分：
０．８−１．６Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ４．６
（２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体：
１．１−１．６Ｍ 硫酸アンモニウム、１５％ グリセロール、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９
（３−１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分：
１０−２０％ ポリエチレングリコール８０００、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．０
（３−２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体：
１８−２０％ ポリエチレングリコール８０００、０．３Ｍ 硫酸リチウム、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５、１０ｍＭ ジチオスレイトール
（４）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体：
１．１−１．５Ｍ 硫酸アンモニウム、１５％ グリセロール、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９−８．５、または、０．７−１．１Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液 ｐＨ ６．０−６．５
上記の条件で得られる結晶のうち、好ましいものは（３−１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分の結晶および（３−２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体結晶であり、特に好ましいものは（４）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶である。
【００１７】
＜＜ＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメイン結晶のＸ線回折強度データの収集＞＞
上記のようにして得られる結晶の外観、単位格子の種類・大きさなどはその結晶に固有のものであり、良質の結晶を用いれば、Ｘ線回折実験により高分解能の回折強度データを取得することができる。結晶を多価アルコールを含有する抗凍結溶液中に浸した後凍結させ、凍結状態でＸ線回折データを収集し、Ｘ線回折像を得る。ここで、多価アルコールとしては、スクロース、トレハロース、グリセロールなどが挙げられる。これらの中で特にグリセロールが好ましい。抗凍結溶液中の多価アルコールの濃度は、好ましくは１０％〜３０％である。Ｘ線を照射して回折強度データを取得するには、いかなるＸ線発生装置を用いることができるが、好ましくは、（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８などの第３世代の放射光施設を利用することができる。得られたＸ線回折強度データを処理することにより、結晶学的パラメータを特定することが可能である。前段落（３−１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分の結晶および（３−２）セレノメチオニン置換体結晶は、空間群がＦ２２２である。また、格子定数はａ＝１７５±１８Å、ｂ＝１８６±１９Å、ｃ＝３６９±３７Å、α＝β＝γ＝９０°であり、より好ましくはａ＝１７５±９Å、ｂ＝１８６±９Å、ｃ＝３６９±１９Å、α＝β＝γ＝９０°であり、さらに好ましくはａ＝１７５±２Å、ｂ＝１８６±２Å、ｃ＝３６９±４Å、α＝β＝γ＝９０°であり、特に好ましくはａ＝１７５±１Å、ｂ＝１８６±１Å、ｃ＝３６９±１Å、α＝β＝γ＝９０°である。また、（４）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶は空間群がＰ４３２１２であり、格子定数がａ＝８６±９Å、ｂ＝８６±９Å、ｃ＝１４３±１４Å、α＝β＝γ＝９０°であり、より好ましくはａ＝８６±４Å、ｂ＝８６±４Å、ｃ＝１４３±７Å、α＝β＝γ＝９０°であり、さらに好ましくはａ＝８６±１Å、ｂ＝８６±１Å、ｃ＝１４３±２Å、α＝β＝γ＝９０°であり、特に好ましくはａ＝８６±１Å、ｂ＝８６±１Å、ｃ＝１４３±１Å、α＝β＝γ＝９０°である。
【００１８】
＜＜ＰＢＰ２ｂ可溶性部分およびＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインの結晶構造の決定＞＞
上記のように得られたデータを用いてＰＢＰ２ｂの結晶構造の決定が可能となる。一般に位相決定には、分子置換法、重原子同型置換法、多波長異常分散法（ＭＡＤ法）などが用いられる。目的蛋白質に対する類縁蛋白質の立体構造が未知あるいは相同性が低い場合には、その立体構造を利用した分子置換法による構造解析が不可能であるため、ＰＢＰ２ｂ結晶構造の決定には、重原子同型置換法またはＭＡＤ法などが好ましく、より好ましくはセレノメチオニン置換体結晶を用いたＭＡＤ法が用いられる。特に好ましくは、前段落に記載した（４）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶を用いたＭＡＤ法であり、新規結晶構造決定が初めて可能となる。前段落（３−２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体結晶を用いた場合には、分解能がやや劣ることおよび非対称単位中の分子数が多いことによりＭＡＤ法による構造決定は困難であるが、（３−１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分の結晶を用いた場合も含め、構造決定したトランスペプチダーゼドメインの結晶構造をサーチモデルに利用する分子置換法により構造決定が可能となる。
【００１９】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は実施例によって限定されるものではない。また、各種ベクターの作製、蛋白質の発現等は、特に記載のない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ著，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ刊（２００１））などに記載の公知の手法に従って実施できる。
【実施例１】
【００２０】
＜＜肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂおよび変異体の可溶性部分の大腸菌発現ベクター構築＞＞
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質の大腸菌発現ベクター（ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔ）は特許公開２００４−２９００７０号広報に記載の方法により作製した。また、配列番号３に示されるアミノ酸残基番号４３１のスレオニン、４３２のグルタミン、４５１のスレオニン、６２４のアラニンが各々リジン、ロイシン、アラニン、グリシンに置換した変異体である、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のＧＳＴ融合タンパク質の大腸菌発現ベクター（ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７）についても同様に特許公開２００４−２９００７０号広報に記載の方法により作製した。
【実施例２】
【００２１】
＜＜Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂおよび変異体の可溶性部分の発現＞＞
ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔを大腸菌ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に、また、ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７を大腸菌ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に形質転換し得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＳＢ培地（１．２％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、２．４％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０７２Ｍ リン酸水素二カリウム、０．０２８Ｍ リン酸二水素カリウム）５Ｌ中で６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が１．０に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２８℃で２時間誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）４００ｍＬに懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム含有ＰＢＳ）に懸濁し、氷上で３０分インキュベートした。次に１分間の超音波処理を２回施し、細胞を破砕した。遠心分離（６０分間、１２０００ｒｐｍ）とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【実施例３】
【００２２】
＜＜Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体の発現＞＞
ＭＡＤ法によるＸ線結晶構造解析に使用する重原子誘導体結晶を作製するために、メチオニンの硫黄原子が重原子であるセレンに置換されたＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体のセレノメチオニン置換体の発現を試みた。実施例１記載の組み換えプラスミドｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７をメチオニン要求株である大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、アンピシリン耐性コロニーを取得した。得られた形質転換体は１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍＬにて、３７℃で一晩培養し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む４ＬのＬｅＭａｓｔｅｒ培地（組成は下記の表１に示す）に４０ｍＬ接種し、６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が０．５−０．８に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、３０℃で一晩誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）２２５ｍＬに懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム含有ＰＢＳ）に懸濁し、氷上で３０分インキュベートした。次に１分間の超音波処理を３回施し、細胞を破砕した。遠心分離（６０分間、１２０００ｒｐｍ）とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【００２３】
【表１】
【実施例４】
【００２４】
＜＜Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂおよび変異体の可溶性部分の精製＞＞
（１）アフィニティー精製
以下の精製操作は４℃で実施した。実施例２で調製した細胞抽出液を予めＰＢＳで平衡化したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）担体８０ｍＬにバッチ法で結合させた。これを担体の１０倍容量のＰＢＳで５回洗浄した後、担体容量と等量の溶出液（１０ｍＭ 還元型グルタチオン、５０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９）で３回溶出した。
【００２５】
（２）ＧＳＴタグの切断
上記（１）で精製したサンプルを１ｍｇ／ｍＬに希釈し、終濃度２．５ｕｎｉｔ／ｍＬのトロンビン（シグマ社製）を添加し、４℃で一晩反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。
【００２６】
（３）陰イオン交換カラムによる精製
上記（２）で得られたサンプルを陰イオン交換カラムであるＰＯＲＯＳ ＨＱ／２０（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製した。流速は１０ｍＬ／ｍｉｎであり、サンプルを３分割し、精製は３度実施した。平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９中の０−６００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１５カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ担体にアプライし、バッチ法によりＧＳＴタグを除去した。
【００２７】
（４）ハイドロキシアパタイトカラムによる精製
ハイドロキシアパタイトカラムは、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ＴＹＰＥ Ｉ ２０μｍ（バイオラッド社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量８ｍＬのカラムを作製した。次に、（３）で得られたサンプルを平衡化バッファー（５ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８）に対して透析しバッファー置換を実施した。サンプルを３分割し、精製は３度実施した。平衡化バッファーで平衡化したカラムに流速３ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５−２５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８の直線勾配（２０カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめた。
【００２８】
（５）ゲルろ過カラムによる精製
上記（４）で得られたサンプルを保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ３０ｋＤａ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）を用いて２ｍＬまで濃縮し、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．５、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。精製はサンプルを２等分し、２度に分けて実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な画分をまとめ、上記記載の限外ろ過膜を用いて１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。
【実施例５】
【００２９】
＜＜Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体の精製＞＞
（１）アフィニティー精製
以下の精製操作は４℃で実施した。アフィニティーカラムは、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量５０ｍＬのカラムを作製し、平衡化バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール含有ＰＢＳ）で平衡化した。そこへ実施例３で調製した細胞抽出液を流速２ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、５カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、溶出バッファー（５０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１０ｍＭ 還元型グルタチオン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、溶出画分を確認し、主要なフラクションをまとめて回収した。
【００３０】
（２）ＧＳＴタグの切断
上記（１）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）に対して透析した後、２倍量の透析バッファーを加えて希釈し、終濃度５ｕｎｉｔ／ｍＬのトロンビン（シグマ社製）を添加し、４℃で一晩反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。
【００３１】
（３）陰イオン交換カラムによる精製
上記（２）で得られたサンプルを陰イオン交換カラムであるＰＯＲＯＳ ＨＱ／２０（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製した。流速は１０ｍＬ／ｍｉｎであり、サンプルを３分割し、精製は３度実施した。平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ジチオスレイトール中の０−５００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１６カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ担体２ｍＬにアプライし、バッチ法によりＧＳＴタグを除去した。
【００３２】
（４）ハイドロキシアパタイトカラムによる精製
ハイドロキシアパタイトカラムは、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ＴＹＰＥ Ｉ ２０μｍ（バイオラッド社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量８ｍＬのカラムを作製した。次に、（３）で得られたサンプルを平衡化バッファー（５ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８、１ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化した脱塩カラムＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速７．５ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、バッファー置換を実施した。サンプルを３分割し、精製は３度実施した。平衡化バッファーで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに流速３ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、１ｍＭ ジチオスレイトール中の５−２５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８の直線勾配（２５カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめた。
【００３３】
（５）ゲルろ過カラムによる精製
上記（４）で得られたサンプルを保持分子量５００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ５０ｋＤａ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）を用いて１．７ｍＬまで濃縮し、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．５、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１０ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。精製はサンプルを２等分し、２度に分けて実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な画分をまとめ、上記記載の限外ろ過膜を用いて２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、終濃度０．０５ｍＭのＥＤＴＡを添加後、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。
【実施例６】
【００３４】
＜＜トランスペプチダーゼドメイン調製のための大腸菌発現系の構築＞＞
（１）トリプシン限定分解によるトランスペプチダーゼドメインの同定
実施例５で精製したＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトールでタンパク質終濃度０．４ｍｇ／ｍＬに希釈した。次に、希釈液１０μＬ、５ｍｇ／ｍＬ トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ ＴＰＣＫ ｔｒｅａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、Ｓｉｇｍａ社製）溶液１．６μＬ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液２μＬ、ＭｉｌｌｉＱ水６．４μＬを混合し、２６℃、１時間反応後、サンプルを２等分した。一方は終濃度１ｍＭ ＰＭＳＦおよび還元剤含有のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと等量混合し、３分間煮沸後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、主要なバンドを切り出しプロテインシークエンサーによりＮ末端アミノ酸配列を分析した。残りの一方は１０分の１量の１０％酢酸を加えた後、ＺｉｐＴｉｐＣ４（ミリポア社製）を用いて精製しＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置にて分子量を測定した。その結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量４１ｋ、２５ｋ、１９ｋ付近の主要なバンドおよび１２ｋ付近のマイナーなバンドが確認された。Ｎ末端アミノ酸配列の結果では、４１ｋ付近のバンドのＮ末端アミノ酸配列はＬＴＩ、１９ｋ付近のバンドはＧＥＩＹＤ、１２ｋ付近のバンドはＧＧＬＧＤ、ＴＧＴＧＥおよびＳＡＹＰＧの混合物であり、この内ＳＡＹＰＧの配列はトリプシン由来であった。質量分析では多数のピークが観測されたが、その中に分子量１８２８４、１８１５８、１３１５６のピークが存在しており、また、２３３００のピークはトリプシン由来であることが判明した。以上の結果から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの２５ｋのバンドはトリプシン由来、４１ｋのバンドは配列番号３に示されるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂにおいてはアミノ酸番号３１５〜６８５、１９ｋのバンドは６６〜２２８、６６〜２２９の混合物、１２ｋのバンドは５６２〜６８０、６２１〜６８５の混合物に対応することが判明した。トランスペプチダーゼドメインに存在する保存モチーフはアミノ酸番号３９１から始まるＳＶＶＫ、４４８から始まるＳＳＮ、６２０から始まるＫＴＧであることから、トランスペプチダーゼドメインとしてアミノ酸番号３１５〜６８５からなる領域を選択した。
【００３５】
（２）トリプシン限定分解時におけるマイナー部位での切断を回避するための点変異の導入
上記（１）においてトリプシン限定分解でのマイナー部位での切断箇所として配列番号３に示されるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂにおいてはアミノ酸番号５６１および６２０のリジン残基の直後が対応する。この内、アミノ酸番号６２０のリジンはトランスペプチダーゼドメインの保存モチーフに存在するため、変異を導入するのは好ましくないが、アミノ酸番号５６１のリジンは変異を導入することでトリプシン限定分解時におけるマイナー部位での切断を回避することができる。また、アミノ酸番号６６〜２２８、６６〜２２９の混合物からなる部分についてはトランスペプチダーゼドメインと相互作用している可能性が否定できなかったため、アミノ酸番号２２９のリジン残基についても変異を導入し、混合物生成を回避する方針とした。ここで、アミノ酸番号５６１および２２９のいずれについてもグルタミンへの変異を試みた。実施例１に記載のｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔおよびｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７を鋳型として、下記のプライマーを用い、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）で、添付の説明書の方法に従い、アミノ酸番号５６１の部位への変異を導入した。
【００３６】
２ｂ＿Ｒ６＿Ｋ５６１Ｑ＿５：５’−ＧＧＣＡＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＡＡＴＧＡＴＣＡＧＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＴＴＧ−３’（配列番号６）
２ｂ＿Ｒ６＿Ｋ５６１Ｑ＿３：５’−ＣＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＴＴＡＣＣＡＴＡＡＡＴＧＣＣ−３’（配列番号７）
【００３７】
次に下記のプライマーを用いて同様の手順に従い、さらにアミノ酸番号２２９の部位への変異を導入し、ｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔ−２２９Ｑ−５６１ＱおよびｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７−２２９Ｑ−５６１Ｑを作製した。これらのプラスミドのＤＮＡ配列を確認し、各々配列番号４、配列番号１に記載のアミノ酸配列に目的の２箇所の点変異が導入されたＲ６株由来および変異体のＰＢＰ２ｂ可溶性部分をコードすることを確認した。
【００３８】
２ｂ＿Ｒ６＿Ｋ２２９Ｑ＿５：５’−ＣＴＧＧＣＡＴＴＡＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＴＧＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＴＧＧＡ−３’（配列番号８）
２ｂ＿Ｒ６＿Ｋ２２９Ｑ＿３：５’−ＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＣＡＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＴＡＣＴＡＡＴＧＣＣＡＧ−３’（配列番号９）
【実施例７】
【００３９】
＜＜Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂおよび変異体トランスペプチダーゼドメイン取得のための可溶性部分セレノメチオニン置換体の発現＞＞
実施例６で得られたｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔ−２２９Ｑ−５６１ＱおよびｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７−２２９Ｑ−５６１Ｑをメチオニン要求株である大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、アンピシリン耐性コロニーを取得した。得られた形質転換体は１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍＬにて、３７℃で一晩培養し、遠心分離機で集菌後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１００ｍｌのＬｅＭａｓｔｅｒ培地（組成は実施例３の表１に示す）で懸濁し、再度、遠心分離機によって集菌し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬｅＭａｓｔｅｒ培地１００ｍｌに再懸濁した。この懸濁液を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む４．８ＬのＬｅＭａｓｔｅｒ培地に４８ｍＬ接種し、６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が０．５−０．８に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、３０℃で４時間誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）２００ｍＬに懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム含有ＰＢＳ）に懸濁し、氷上で３０分インキュベートした。次に１分間の超音波処理を４回施し、細胞を破砕した。遠心分離（６０分間、１２０００ｒｐｍ）とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【実施例８】
【００４０】
＜＜Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂおよび変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の精製＞＞
（１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の精製
（１−１）アフィニティー精製
以下の精製操作は４℃で実施した。アフィニティーカラムは、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量５０ｍＬのカラムを作製し、平衡化バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール含有ＰＢＳ）で平衡化した。そこへ実施例７においてｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｗｔ−２２９Ｑ−５６１Ｑを用いて調製した細胞抽出液を流速２ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、５カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、溶出バッファー（５ｕｎｉｔ／ｍＬトロンビン（シグマ社製）含有ＰＢＳ）を５０ｍＬアプライした段階でポンプを止めて１０℃で一晩反応させＧＳＴタグを切断した。平衡化バッファーを送り込んで溶出した後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶出画分を確認し、主要なフラクションをまとめて回収した。
【００４１】
（１−２）陰イオン交換カラムによる精製
上記（１−１）で得られたサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）に対して透析した後、陰イオン交換カラムであるＰＯＲＯＳ ＨＱ／２０（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製した。流速は１０ｍＬ／ｍｉｎであり、サンプルを４分割し、精製は４度実施した。平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール中の０−３００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１２カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめた。
【００４２】
（１−３）トリプシン限定分解
上記（１−２）で精製したＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分のセレノメチオニン置換体を２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール溶液に対して透析した後回収し、はじめに小スケールでのトリプシン限定分解の条件検討を実施した。回収液５μＬを０．１２５〜５ｍｇ／ｍＬのトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ ＴＰＣＫ ｔｒｅａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、Ｓｉｇｍａ社製）溶液と等量混合し、２４℃、２時間反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各濃度におけるトリプシン消化のパターンを確認し、トリプシンの添加量を終濃度０．１２５ｍｇ／ｍｌと決定し、残りの全サンプルのトリプシン限定分解を実施した。
【００４３】
（１−４）陰イオン交換カラムによる精製
上記（１−３）で得られたサンプルを陰イオン交換カラムであるＭｏｎｏＱ ＨＲ１０／１０（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、サンプルを４分割し、精製は４度実施した。平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール中の０−３００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１５カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめた。
【００４４】
（１−５）ハイドロキシアパタイトカラムによる精製
ハイドロキシアパタイトカラムは、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ＴＹＰＥ Ｉ ２０μｍ（バイオラッド社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量８ｍＬのカラムを作製した。次に、（１−４）で得られたサンプルを平衡化バッファー（５ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８、１ｍＭ ジチオスレイトール）に対して透析し、バッファー置換を実施した。サンプルを２分割し、精製は２度実施した。平衡化バッファーで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに流速３．５ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、１ｍＭ ジチオスレイトール中の５−２５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８の直線勾配（２５カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、非吸着画分をまとめた。
【００４５】
（１−６）ゲルろ過カラムによる精製
上記（１−５）で得られたサンプルを保持分子量１００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ １０ｋＤａ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）を用いて０．７５ｍＬまで濃縮し、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ８．０、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な画分をまとめ、上記記載の限外ろ過膜を用いて１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、分子量４１ｋ付近のバンドのみが確認され、１９ｋ付近のバンドについては除去されたことから、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体であることが示唆された。
【００４６】
（２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の精製
（２−１）アフィニティー精製
以下の精製操作は４℃で実施した。アフィニティーカラムは、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量５０ｍＬのカラムを作製し、平衡化バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール含有ＰＢＳ）で平衡化した。そこへ実施例７においてｐＧＥＸ／ＳｐＰＢＰ２ｂ−ｍｔ７−２２９Ｑ−５６１Ｑを用いて調製した細胞抽出液を流速２ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、５カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、溶出バッファー（５０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１０ｍＭ 還元型グルタチオン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶出画分を確認し、主要なフラクションをまとめて透析バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）に対して透析することでバッファー置換をした。次に、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ ＴＰＣＫ ｔｒｅａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、Ｓｉｇｍａ社製）を終濃度２．３μｇ／ｍＬの条件で添加し、２５℃で１時間反応させることでＧＳＴタグのみを切断し、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。
【００４７】
（２−２）陰イオン交換カラムによる精製
上記（２−１）で得られたサンプルを陰イオン交換カラムであるＭｏｎｏＱ ＨＲ１０／１０（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、サンプルを５分割し、精製は５度実施した。平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール中の０−２５０ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（８カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめた。
【００４８】
（２−３）トリプシン限定分解
上記（２−２）で精製したＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体を２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール溶液に対して透析した後回収し、はじめに小スケールでのトリプシン限定分解の条件検討を実施した。回収液９μＬに０．０３９〜１０ｍｇ／ｍＬのトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ ＴＰＣＫ ｔｒｅａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、Ｓｉｇｍａ社製）溶液１μＬを添加し、２５℃、１時間反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各濃度におけるトリプシン消化のパターンを確認し、トリプシンの添加量を終濃度０．１２５ｍｇ／ｍｌと決定し、残りの全サンプルのトリプシン限定分解を実施した。
【００４９】
（２−４）陰イオン交換カラムによる精製
上記（２−３）で得られたサンプルを陰イオン交換カラムであるＭｏｎｏＱ ＨＲ１０／１０（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、サンプルを４分割し、精製は４度実施した。平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール中の０−２５０ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１５カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめた。
【００５０】
（２−５）ハイドロキシアパタイトカラムによる精製
ハイドロキシアパタイトカラムは、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ＴＹＰＥ Ｉ ２０μｍ（バイオラッド社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量８ｍＬのカラムを作製した。次に、（２−４）で得られたサンプルを平衡化バッファー（５ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８、１ｍＭ ジチオスレイトール）に対して透析し、バッファー置換を実施した。サンプルを２分割し、精製は２度実施した。平衡化バッファーで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに流速３．５ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、非吸着画分を回収した。
【００５１】
（２−６）陽イオン交換カラムによる精製
上記（２−５）で得られたサンプルを平衡化バッファー（５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ ５．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール）に対して透析し、バッファー置換を実施した後、陽イオン交換カラムであるＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した。サンプルを２分割し、精製は２度実施した。平衡化バッファーで平衡化したカラムに流速４ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ ５．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール中の０−２００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１６カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより主要な溶出画分をまとめた。
【００５２】
（２−７）ゲルろ過カラムによる精製
上記（２−６）で得られたサンプルを保持分子量１００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ １０ｋＤａ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）を用いて１．２ｍＬまで濃縮し、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．９、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な画分をまとめ、上記記載の限外ろ過膜を用いて４．７ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは分子量４１ｋ付近のバンドのみが確認された。また、エレクトロスプレイイオン化法による質量分析装置により解析したところ、分子量３９８５１に主要なピークが確認されたことから、計算値で３９８４３の分子量を持つ、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体であることが確認された。
【実施例９】
【００５３】
＜＜ＰＢＰ２ｂの結晶化＞＞
（１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分の結晶化
Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分の結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例４で精製したタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）０．５μＬと結晶化剤（０．８−１．６Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ４．６）０．５μＬを混合し結晶化ドロップとし、リザーバー溶液として上記結晶化剤１００μＬ分注し密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内に静置すると数日で針状のクラスター結晶が得られた。０．８Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ４．６からなる結晶化剤を用いて得られた結晶の顕微鏡写真を図1に示す。
【００５４】
（２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶化
Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例８（１）で精製したタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）２．０μＬと結晶化剤（１．１−１．６Ｍ 硫酸アンモニウム、１５％ グリセロール、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９）２．０μＬをカバーガラス上で混合し結晶化ドロップとした。リザーバー溶液として上記結晶化剤５００μＬをＶＤＸプレート（ハンプトンリサーチ社製）のウェルに分注し、Ａｌ’ｓオイル（ハンプトンリサーチ社製）２５０μＬをリザーバー溶液の上に重層した。ウェルの淵に高真空グリースを塗り、カバーガラスをドロップが内側になるように被せ密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内に静置すると数日で針状のクラスター結晶が得られた。１．１Ｍ 硫酸アンモニウム、１５％ グリセロール、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９からなる結晶化剤を用いて得られた結晶の顕微鏡写真を図２に示す。
【００５５】
（３）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体の可溶性部分およびセレノメチオニン置換体の結晶化
（３−１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体の可溶性部分の結晶化
Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体の可溶性部分の結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例４で精製したタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１．０μＬと結晶化剤（１０−２０％ ポリエチレングリコール８０００、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．０）１．０μＬをカバーガラス上で混合し結晶化ドロップとした。リザーバー溶液として上記結晶化剤５００μＬをＶＤＸプレート（ハンプトンリサーチ社製）のウェルに分注した。ウェルの淵に高真空グリースを塗り、カバーガラスをドロップが内側になるように被せ密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内に静置すると数日で結晶が得られた。また、硫酸アンモニウムの代わりに硫酸リチウム、硫酸ナトリウムを用いた場合も同様に結晶が得られた。１０％ ポリエチレングリコール８０００、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．０からなる結晶化剤を用いて得られた結晶の顕微鏡写真を図３に示す。
【００５６】
（３−２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体の結晶化
Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分の結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例５で精製したタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１．０μＬと結晶化剤（１８−２０％ ポリエチレングリコール８０００、０．３Ｍ 硫酸リチウム、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５、１０ｍＭ ジチオスレイトール）１．０μＬをカバーガラス上で混合し結晶化ドロップとした。リザーバー溶液として上記結晶化剤５００μＬをＶＤＸプレート（ハンプトンリサーチ社製）のウェルに分注し、Ａｌ’ｓオイル（ハンプトンリサーチ社製）２００μＬをリザーバー溶液の上に重層した。ウェルの淵に高真空グリースを塗り、カバーガラスをドロップが内側になるように被せ密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内に静置すると数日で結晶が得られた。また、硫酸リチウムの代わりに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムを用いた場合も同様に結晶が得られた。１９％ ポリエチレングリコール８０００、０．３Ｍ 硫酸リチウム、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５、１０ｍＭ ジチオスレイトールからなる結晶化剤を用いて得られた結晶の顕微鏡写真を図４に示す。
【００５７】
（４）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶化
Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例８（２）で精製したタンパク質溶液（４．７ｍｇ／ｍＬ）０．４μＬと結晶化剤（１．１−１．５Ｍ 硫酸アンモニウム、１５％ グリセロール、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９−８．５）０．４μＬを混合し結晶化ドロップとし、リザーバー溶液として上記結晶化剤１００μＬ分注し密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内に静置すると数日で結晶が得られた。１．５Ｍ 硫酸アンモニウム、１５％ グリセロール、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５からなる結晶化剤を用いて得られた結晶の顕微鏡写真を図５に示す。また、硫酸アンモニウムの代わりに硫酸ナトリウムを用いた条件（０．７−１．１Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液 ｐＨ ６．０−６．５または０．１Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ５．５または０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．０−７．５またはトリス塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９−８．５）および硫酸マグネシウムを用いた条件（０．９−１．１Ｍ 硫酸マグネシウム、１−１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液 ｐＨ ６．５）でも同様の結晶が得られた。また、Ｎ−Ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｄ−ａｌａｎｙｌｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄを添加した条件でも同様の結晶が得られ、ハンギングドロップ蒸気拡散法においても同様の結晶が得られた。さらに、マイクロ・フリューディック技術を応用したＴＯＰＡＺ ４．９６スクリーニングチップ（フリューダイム社製）を用いた場合には結晶化剤として（ｉ）１Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム ｐＨ ４．６および（ｉｉ）１．５Ｍ リン酸水素二カリウムを用いた条件において外見上同様の結晶が得られた。
【実施例１０】
【００５８】
＜＜ＰＢＰ２ｂ結晶のＸ線回折強度データの収集＞＞
（１）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体の可溶性部分の結晶
実施例９（３−１）において得られた結晶を３５％グリセロール含有の抗凍結剤溶液に移した後、−１７０℃の窒素ガス気流にて急速凍結した。これを（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８の創薬産業ビームラインＢＬ３２Ｂ２を利用しイメージングプレートを装備したＲ−ＡＸＩＳ Ｖ（リガク社製）を検出装置としてＸ線回折データを振動法にて測定した。Ｘ線の波長は１Å、振動角は１°／フレームであった。次に、回折強度データ処理プログラムＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ(リガク社製)を使用して、回折強度データを分解能３．５Åで処理した。その結果、空間群がＦ２２２であり、格子定数がａ＝１７５．４７Å、ｂ＝１８６．１６Å、ｃ＝３６８．５３Å、α＝β＝γ＝９０°であった。得られたデータのＣｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓは９９．９％、Ｒｍｅｒｇｅは９．４％であった。データ収集の結果を下記の表２にまとめた。
【００５９】
【表２】
【００６０】
（２）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体結晶
実施例９（３−２）において得られた結晶を２０％グリセロール含有の抗凍結剤溶液に移した後、−１７０℃の窒素ガス気流にて急速凍結した。これを（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８の創薬産業ビームラインＢＬ３２Ｂ２を利用しイメージングプレートを装備したＲ−ＡＸＩＳ Ｖ（リガク社製）を検出装置としてＸ線回折データを振動法にて測定した。このとき、セレンの異常散乱効果を用いて構造解析を行うために、波長は０．９７９４７、０．９７８７９および０．９００００Åの３波長、即ち、吸収端のエッジ、ピーク、リモートの３カ所でＭＡＤデータを収集した。振動角は１°／フレームであった。次に、回折強度データ処理プログラムＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ(リガク社製)を使用して、回折強度データを分解能３．５Åで処理した。その結果、空間群がＦ２２２であり、格子定数がａ＝１７５．７５Å、ｂ＝１８６．２１Å、ｃ＝３６９．２１Å、α＝β＝γ＝９０°であった。データ収集の結果を下記の表３にまとめた。
【００６１】
【表３】
【００６２】
（３）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶
実施例９（４）において、１．５Ｍ 硫酸アンモニウム、１５％ グリセロール、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５からなる結晶化剤を用いて得られた結晶を２５％グリセロール含有の抗凍結剤溶液に移した後、−１７０℃の窒素ガス気流にて急速凍結した。これを（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８の創薬産業ビームラインＢＬ３２Ｂ２を利用しイメージングプレートを装備したＲ−ＡＸＩＳ Ｖ（リガク社製）を検出装置としてＸ線回折データを振動法にて測定した。このとき、セレンの異常散乱効果を用いて構造解析を行うために、波長は０．９７９４８、０．９７９０７および０．９００００Åの３波長、即ち、吸収端のエッジ、ピーク、リモートの３カ所でＭＡＤデータを収集した。振動角は１°／フレームであった。次に、回折強度データ処理プログラムＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ(リガク社製)を使用して、回折強度データを分解能２．４Åで処理した。その結果、空間群の候補がＰ４３２１２またはＰ４１２１２となったが、下記に示す実施例１１の解析結果からＰ４３２１２と判明した。格子定数はａ＝８６．３９Å、ｂ＝８６．３９Å、ｃ＝１４３．２７Å、α＝β＝γ＝９０°であり、データ収集の結果を下記の表４にまとめた。また、同様の手順で調製した結晶を（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８の構造生物学ＩビームラインＢＬ４１ＸＵを利用しＱｕａｎｔｕｍ３１５ＣＣＤカメラ（ＡＤＳＣ社製）を検出器としてＸ線回折データを振動法にて測定した。Ｘ線の波長は１Å、振動角は１°／フレームであり、回折強度データを２．２Åで処理した結果、空間群はＰ４３２１２、格子定数はａ＝８６．３４Å、ｂ＝８６．３４Å、ｃ＝１４３．４０Å、α＝β＝γ＝９０°であった。データ収集の結果を下記の表５にまとめた。また、実施例９（４）において、０．８Ｍ 硫酸ナトリウム、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液 ｐＨ ６．５からなる結晶化剤を用いてＮ−Ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｄ−ａｌａｎｙｌｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ存在下で得られた結晶を用いて、同様の条件でＸ線回折測定を実施したところ、空間群はＰ４３２１２、格子定数はａ＝８６．４１Å、ｂ＝８６．４１Å、ｃ＝１４３．９６Å、α＝β＝γ＝９０°であった。
【００６３】
【表４】
【００６４】
【表５】
【実施例１１】
【００６５】
＜＜ＰＢＰ２ｂの結晶構造決定＞＞
次に、プログラムＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｎｇｅｒ， Ｔ．Ｃ． ＆ Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ，Ｊ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ ５５，８４９−８６１（１９９９））を用いて、実施例１０の表４に示したＭＡＤデータを処理し、セレン原子の位置を決定し初期位相を計算した。位相の改良及び初期モデルの構築はプログラムＲＥＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ, Ｔ．Ｃ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ５６，９６５−９７２（２０００））を用いた。この際、空間群Ｐ４１２１２で処理した場合には妥当な電子密度が得られず、空間群Ｐ４３２１２で処理した場合においてタンパク質の明瞭の電子密度が得られたため、空間群をＰ４３２１２と決定した。次いで、プログラムＬａｆｉｒｅ（ＹＡＯ Ｍ．他、Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６２（２）、１８９−１９６（２００６））、プログラムＴｕｒｂｏ Ｆｒｏｄｏ（ＡＦＭＢ−ＣＮＲＳ製）、プログラムＲｅｆｍａｃ５（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ４（ｃｃｐ４））およびプログラムＣＮＸ（アクセルリス社製）を利用したモデルの構築および修正を繰り返し実施し、Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインの結晶構造を決定し、最終的には実施例１０の表５に示した高分解能のデータを用いて分解能２．２Åで構造精密化を実施した。本結晶の非対称単位中にはＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインが１分子存在していた。決定した結晶構造の正確さの指標であるＲ因子は、０．２０９であった。さらに、精密化の段階で計算に入れなかった全反射の５％に相当する構造因子から計算されるＲｆｒｅｅ因子は０．２３０であった。また、決定したＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインの構造を図６に示した。さらに、結晶中において、隣り合うＰＢＰ２ｂ分子の境界に存在する2回軸上に硫酸イオンが存在し、各ＰＢＰ２ｂ分子のリジン、アスパラギン残基の側鎖および水分子と水素結合を形成していた。結晶中において、分子間のパッキングに関与している硫酸イオン周辺の電子密度図とモデルを図７に示した。ここで、リジンは配列番号３に示されるＲ６株由来ＰＢＰ２ｂの配列における４３１番目のスレオニンをリジンへ変異させた残基に対応しており、薬剤耐性に関与しているアミノ酸変異の導入と硫酸アンモニウム等の硫酸塩を結晶化剤として使用することを組み合わせることにより高品質の結晶が製造できることを見出した。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明のＰＢＰ２ｂ結晶は、Ｘ線結晶構造解析可能な新規な結晶であり、解析に成功した立体構造情報を利用することにより阻害剤の効率的な設計等が可能となり、新薬創出に活用できるため、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明のＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ可溶性部分の結晶の顕微鏡写真である。
【図２】本発明のＲ６株由来ＰＢＰ２ｂトランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶の顕微鏡写真である。
【図３】本発明のＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分の結晶の顕微鏡写真である。
【図４】本発明のＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体可溶性部分のセレノメチオニン置換体結晶の顕微鏡写真である。
【図５】本発明のＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶の顕微鏡写真である。
【図６】決定したＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメインの構造をリボン図で示す。
【図７】本発明のＲ６株由来ＰＢＰ２ｂ変異体トランスペプチダーゼドメイン結晶中において、分子間のパッキングに関与している硫酸イオン周辺の電子密度図とモデルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
連鎖球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶。
【請求項２】
ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶。
【請求項３】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶。
【請求項４】
ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂ可溶性部分から構成される請求項１〜３のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質から構成される請求項１〜４のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質から構成される請求項１〜４のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質から構成される請求項１〜４のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項８】
空間群がＦ２２２である請求項１〜７のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項９】
空間群がＦ２２２であり、格子定数がａ＝１７５±１８Å、ｂ＝１８６±１９Å、ｃ＝３６９±３７Å、α＝β＝γ＝９０°である請求項１〜７のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１０】
ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂトランスペプチダーゼドメインから構成される請求項１〜３のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質から構成される請求項１〜４、１０のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質から構成される請求項１〜４、１０のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質から構成される請求項１〜４、１０のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１４】
空間群がＰ４３２１２である請求項１〜４、１０〜１３のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１５】
空間群がＰ４３２１２であり、格子定数がａ＝８６±９Å、ｂ＝８６±９Å、ｃ＝１４３±１４Å、α＝β＝γ＝９０°である請求項１〜４、１０〜１３のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の結晶であって、該結晶を構成するタンパク質中の少なくとも１つのメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されている結晶。
【請求項１７】
硫酸塩またはリン酸塩の存在下で成長する請求項１〜１６のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１８】
硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウムまたはリン酸水素二カリウムの存在下で成長する請求項１〜１６のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１９】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２０】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質。
【請求項２１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質。
【請求項２２】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶の製造方法であって、結晶化剤として硫酸塩またはリン酸塩を用いて結晶化することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の結晶の製造方法。
【請求項２３】
結晶化剤として硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウムまたはリン酸水素二カリウムを用いることを特徴とする、請求項２２記載の製造方法。
【請求項２４】
配列番号３におけるアミノ酸残基番号４３１のスレオニンがリジンに置換されているアミノ酸変異を有することを特徴とする、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの可溶性部分またはトランスペプチダーゼドメインを調製する工程を含む、請求項２２または２３記載の製造方法。
【請求項２５】
配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を調製する工程を含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１】
連鎖球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶。
【請求項２】
ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶。
【請求項３】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶。
【請求項４】
ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂ可溶性部分から構成される請求項１〜３のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質から構成される請求項１〜４のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質から構成される請求項１〜４のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質から構成される請求項１〜４のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項８】
空間群がＦ２２２である請求項１〜７のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項９】
空間群がＦ２２２であり、格子定数がａ＝１７５±１８Å、ｂ＝１８６±１９Å、ｃ＝３６９±３７Å、α＝β＝γ＝９０°である請求項１〜７のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１０】
ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂトランスペプチダーゼドメインから構成される請求項１〜３のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質から構成される請求項１〜４、１０のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質から構成される請求項１〜４、１０のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質から構成される請求項１〜４、１０のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１４】
空間群がＰ４３２１２である請求項１〜４、１０〜１３のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１５】
空間群がＰ４３２１２であり、格子定数がａ＝８６±９Å、ｂ＝８６±９Å、ｃ＝１４３±１４Å、α＝β＝γ＝９０°である請求項１〜４、１０〜１３のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の結晶であって、該結晶を構成するタンパク質中の少なくとも１つのメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されている結晶。
【請求項１７】
硫酸塩またはリン酸塩の存在下で成長する請求項１〜１６のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１８】
硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウムまたはリン酸水素二カリウムの存在下で成長する請求項１〜１６のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１９】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２０】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質。
【請求項２１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質。
【請求項２２】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの結晶の製造方法であって、結晶化剤として硫酸塩またはリン酸塩を用いて結晶化することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の結晶の製造方法。
【請求項２３】
結晶化剤として硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウムまたはリン酸水素二カリウムを用いることを特徴とする、請求項２２記載の製造方法。
【請求項２４】
配列番号３におけるアミノ酸残基番号４３１のスレオニンがリジンに置換されているアミノ酸変異を有することを特徴とする、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｂの可溶性部分またはトランスペプチダーゼドメインを調製する工程を含む、請求項２２または２３記載の製造方法。
【請求項２５】
配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を調製する工程を含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００９−１３７８４０（Ｐ２００９−１３７８４０Ａ）
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−９１４６２（Ｐ２００６−９１４６２）
【出願日】平成１８年３月２９日（２００６．３．２９）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２９日（２００６．３．２９）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
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