ペプチドの多種多様なファミリーのメンバーとしての、遺伝的パッケージの提示ライブラリーを構築する方法
【課題】ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを集合的に提示するライブラリーの構築において有用な方法、およびこの方法を使用して生成されるライブラリーが提供する。
【解決手段】一本鎖核酸を選択された位置で切断する方法に関し、この切断された核酸は、ライブラリーの遺伝的パッケージ上に提示されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を少なくとも部分的にコードする。この遺伝的パッケージは、糸状ファージまたはファージミドである。このようなスクリーニングによって同定されるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が提供される。また発現に有害であり得る任意の配列が、クローニングおよび提示の前に、増幅されたＤＮＡから除去される。
【解決手段】一本鎖核酸を選択された位置で切断する方法に関し、この切断された核酸は、ライブラリーの遺伝的パッケージ上に提示されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を少なくとも部分的にコードする。この遺伝的パッケージは、糸状ファージまたはファージミドである。このようなスクリーニングによって同定されるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が提供される。また発現に有害であり得る任意の配列が、クローニングおよび提示の前に、増幅されたＤＮＡから除去される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメ
ンバーを提示し、そしてこのファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提
示する、遺伝的パッケージのライブラリーを構築することに関する。好ましい実
施形態では、提示されるポリペプチドはヒトＦａｂである。
【０００２】
より詳細には、本発明は、一本鎖核酸を選択された位置で切断する方法に関し
、この切断された核酸は、本発明のライブラリーの遺伝的パッケージ上に提示さ
れたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を少なくとも部分的にコードする
。好ましい実施形態では、この遺伝的パッケージは、糸状ファージまたはファー
ジミドである。
【０００３】
本発明はさらに、有用なペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を提示する
遺伝的パッケージのライブラリーをスクリーニングする方法、ならびにこのよう
なスクリーニングによって同定されたペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質
に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提
示し、そしてこのファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示する、遺
伝的パッケージのライブラリーを調製することは現在、当該分野において一般的
な方法である。多くの通常のライブラリーでは、提示されるペプチド、ポリペプ
チドまたはタンパク質は、抗体に関連する。しばしば、これらはＦａｂまたは単
鎖抗体である。
【０００５】
一般に、提示されるべきファミリーのメンバーをコードするＤＮＡは、クロー
ニングされて遺伝的パッケージの表面に所望のメンバーを提示するように使用さ
れる前に増幅されなければならない。このような増幅は代表的に、正方向プライ
マーおよび逆方向プライマーを利用する。
【０００６】
このようなプライマーは、増幅されるべきＤＮＡに対してネイティブな配列に
対して相補的であり得るか、またはそのＤＮＡの５’末端もしくは３’末端に結
合したオリゴヌクレオチドに対して相補的であり得る。増幅されるべきＤＮＡに
対してネイティブである配列に相補的であるプライマーは、提示されるべきファ
ミリーのメンバーを偏らせるという点で不利である。ネイティブなＤＮＡ中にこ
のプライマーに対して実質的に相補的である配列を含むメンバーのみが増幅され
る。そうでないメンバーはこのファミリーから存在しなくなる。増幅されるメン
バーについては、プライマー領域内の何らかの多様性が抑制される。
【０００７】
例えば、特許文献１では、使用されるプライマーは、抗体遺伝子のＶＨ領域の５’末端に存在する。これは、ネイティブなＤＮＡ中の、単一種内で「充分によく保存された」と呼ばれる配列領域にアニーリングする。このようなプライマーは、増幅されるメンバーを、この「保存された」領域を有するメンバーに偏らせる。この領域内の何らかの多様性は失われる。
【０００８】
ヒトの抗体遺伝子が、ＶおよびＪ、またはＶ、ＤおよびＪの組合せ選択、続い
て体細胞変異を含むプロセスを通して生じることが一般に受け入れられている。
大部分の多様性は相補性決定領域（ＣＤＲ）に生じるが、多様性はまた、より保
存されたフレームワーク領域（ＦＲ）において生じ、そしてこの多様性の少なく
ともいくつかは、抗原（Ａｇ）に対する特異的結合を付与または増強する。その
結果、ライブラリーは、可能な限り多くのＣＤＲおよびＦＲ多様性を含むべきで
ある。
【０００９】
コードするペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の遺伝的パッケージ上で
の提示のために、増幅されたＤＮＡをクローニングするために、ＤＮＡは、ベク
ターへの連結のために適切な末端を生じるように切断されなければならない。こ
のような切断は一般に、プライマーに保有された制限エンドヌクレアーゼ認識部
位を用いてもたらされる。ＲＮＡの逆転写から生成されるＤＮＡの５’末端にプ
ライマーが存在する場合、このような制限処理は、増幅されたＤＮＡ中に有害な
５’非翻訳領域を残す。これらの領域は、クローニングされた遺伝子の発現を妨
害し、従って、これらによってコードされるペプチド、ポリペプチドおよびタン
パク質の提示を妨害する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】欧州特許第３６８，６８４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明の目的は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリ
ーのメンバーを提示し、そしてこのファミリーの多様性の少なくとも一部を集合
的に提示する、遺伝的パッケージのライブラリーを構築するための新規方法を提
供することである。これらの方法は、増幅のために用いられるプライマーに相補
的であるネイティブな配列を含むＤＮＡには偏っていない。これらの方法はまた
、発現に有害であり得る任意の配列が、クローニングおよび提示の前に、増幅さ
れたＤＮＡから除去されることを可能にする。
【００１２】
本発明の別の目的は、一本鎖核酸配列を所望の位置で切断するための方法を提
供することであり、この方法は、以下の工程を包含する：
（ｉ）この核酸を一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、この
オリゴヌクレオチドは、切断が所望される領域においてこの核酸に機能的に相補
的であり、そしてその核酸中の相補体とともに、制限処理の際に所望の位置での
核酸の切断をもたらす制限エンドヌクレアーゼ認識部位を形成する配列を含む、
工程；および
（ｉｉ）この核酸のみを、この核酸とこのオリゴヌクレオチドとの相補によっ
て形成された認識部位で切断する工程；
接触工程および切断工程は、実質的に一本鎖形態の核酸を維持するに充分な温度
で行われ、このオリゴヌクレオチドは、二本の鎖が会合し、その結果、選択され
た温度および所望の位置で切断が生じ得るのを可能にするに充分に大きな領域に
わたってこの核酸に対して機能的に相補的であり、そして切断は、選択された温
度で活性である制限エンドヌクレアーゼを用いて行われる。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、一本鎖核酸配列を所望の位置で切断するための代替
的な方法を提供することであり、この方法は以下の工程を包含する：
（ｉ）この核酸を部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であ
って、このオリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される領域において
この核酸に機能的に相補的であり、そしてこのオリゴヌクレオチドの二本鎖領域
は、ＩＩ−Ｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、その切断部位は、この
認識部位から既知の距離に位置する、工程；および
（ｉｉ）この核酸のみを、この核酸とこのオリゴヌクレオチドの一本鎖領域と
の相補によって形成された切断部位で切断する工程；
接触工程および切断工程は、実質的に一本鎖形態の核酸を維持するに充分な温度
で行われ、このオリゴヌクレオチドは、二本の鎖が会合し、その結果、選択され
た温度および所望の位置で切断が生じ得るのを可能にするに充分に大きな領域に
わたってこの核酸に対して機能的に相補的であり、そして切断は、選択された温
度で活性である制限エンドヌクレアーゼを用いて行われる。
【００１４】
本発明の別の目的は、ＤＮＡの多様なファミリーのメンバーを含み、そしてこ
のファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に含む、ＤＮＡ分子を捕獲する
方法を提供することである。一本鎖形態のこれらのＤＮＡ分子は、本発明の方法
のうちの１つによって切断されている。この方法は、このファミリーの個々の一
本鎖ＤＮＡメンバーを、部分的に二重鎖のＤＮＡ複合体に連結することを含む。
この方法は以下の工程を包含する：
（ｉ）制限エンドヌクレアーゼで切断された一本鎖核酸配列を、部分的に二本
鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、このオリゴヌクレオチドの
一本鎖領域は、切断後に残る領域においてこの核酸に対して機能的に相補的であ
り、このオリゴヌクレオチドの二本鎖領域は、切断後に残っている配列を、発現
に適切なリーディングフレームに戻すために必要な任意の配列を含み、そしてこ
れらの配列の５’側に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、工程；および
（ｉｉ）この部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド配列のみを、この部分的に
二本鎖のオリゴヌクレオチドの二本鎖領域内に含まれる制限エンドヌクレアーゼ
認識部位で切断する工程。
【００１５】
本発明の別の目的は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファ
ミリーを提示し、そしてこのファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提
示する、ライブラリーを、上記の方法およびＤＮＡを用いて調製することである
。
【００１６】
本発明の目的は、これらのライブラリーをスクリーニングして、有用なペプチ
ド、ポリペプチドおよびタンパク質を同定し、そしてこれらの物質をヒトの治療
において使用することである。たとえば、本発明は以下を提供する：
（項目１） 一本鎖核酸配列を所望の位置で切断するための方法であって、
該方法は、以下の工程：
（ｉ）該核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オ
リゴヌクレオチドは、切断が所望される領域において該核酸に対して機能的に相
補的であり、そして制限の際に該核酸の該所望の位置での切断を生じる制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位を、その補体を用いて該核酸中に形成する配列を含む、
工程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの相補性によって形成される該認
識部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含し、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持
するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該
温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするた
めに十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択さ
れた温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、
方法。
（項目２） 一本鎖核酸配列を所望の位置で切断するための方法であって、
該方法は、以下の工程：
（ｉ）該核酸を、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であ
って、該オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される該領域において
該核酸に対して機能的に相補的であり、そして該オリゴヌクレオチドの二本鎖領
域は、ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、該切断部位は、該認
識部位から既知の距離に位置する、工程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの該一本鎖領域の相補性によって
形成されるＩＩ型−Ｓ切断部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含し、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持
するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該
温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするた
めに十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択さ
れた温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、
方法。
（項目３） 遺伝的パッケージの表面上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する方法であって、改善が、提示されるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の少なくとも一部が、
以下の工程：
（ｉ）核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オリ
ゴヌクレオチドは、切断が所望される領域において該核酸に対して機能的に相補
的であり、そして制限の際に該核酸の所望の位置での切断を生じる制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位を、その補体を用いて該核酸中に形成する配列を含む、工程
；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの相補性によって形成される該認
識部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含する方法によって所望の位置で切断される該核酸によって、少なくとも一
部がコードされることを特徴とし、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実
質的に一本鎖形態で維持するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチド
は、切断が選択された該温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の
鎖の会合を可能にするために十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的
であり、そして該選択された温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用し
て、該切断が行われる、方法。
（項目４） 遺伝的パッケージの表面上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する方法であって、改善が、提示されるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、以下の工程：
（ｉ）該核酸を、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であ
って、該オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される領域において該
核酸に対して機能的に相補的であり、該オリゴヌクレオチドの該二本鎖領域は、
ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、該切断部位は、該認識部位
から既知の距離に位置する、工程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの該一本鎖領域の相補性によって
形成されるＩＩ型−Ｓ切断部位で、該核酸を単独で切断する工程；
によって所望の位置で切断される核酸を含むＤＮＡ配列によってコードされるこ
とを特徴とし、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で
維持するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択され
た該温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にす
るために十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選
択された温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われ
る、方法。
（項目５） 遺伝的パッケージの表面上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する方法であって、
該方法は、以下の工程：
（ｉ）該多種多様なファミリーのメンバーの少なくとも一部をコードする核酸
の収集物を調製する工程；
（ｉｉ）該核酸を一本鎖にする工程；
（ｉｉｉ）以下の工程：
（ａ）該核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該
オリゴヌクレオチドは、切断が所望される領域において該核酸に対して機能的に
相補的であり、そして制限の際に該核酸の所望の位置での切断を生じる制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位を、その補体を用いて該核酸中に形成する配列を含む、
工程；および
（ｂ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの相補性によって形成される該認
識部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含する方法によって、所望の位置で該一本鎖核酸を切断する工程であって
、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するため
に十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度およ
び該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分
大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度
で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、工程；な
らびに
（ｉｖ）該遺伝的パッケージの該表面上の該切断された核酸によって少なくと
も一部がコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の該ファミリー
のメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの該多様性の少なくとも一
部を提示する工程、
を包含する、方法。
（項目６） 遺伝的パッケージの表面上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する方法であって、
該方法は、以下の工程：
（ｉ）該多種多様なファミリーのメンバーの少なくとも一部をコードする核酸
の収集物を調製する工程；
（ｉｉ）該核酸を一本鎖にする工程；
（ｉｉｉ）以下の工程：
（ａ）該核酸を、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程で
あって、該オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される領域において
該核酸に対して機能的に相補的であり、該オリゴヌクレオチドの該二本鎖領域は
、ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、該切断部位は、該認識部
位から既知の距離に位置する、工程；および
（ｂ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの該一本鎖領域の相補性によって
形成されるＩＩ型−Ｓ切断部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含する方法によって、所望の位置で該一本鎖核酸を切断する工程であって
、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するため
に十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度およ
び該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分
大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度
で活性である切断エンドヌクレアーゼを使用して、該制限が行われる、工程；な
らびに；
（ｉｖ）該遺伝的パッケージの該表面上の該切断された核酸によって少なくと
も一部がコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の該ファミリー
のメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部
を提示する工程、
を包含する、方法。
（項目７） ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示する遺伝的パッケージの収集物を含に、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示するライブラリーであって、該ライブラリーは、項目３、４、５または６に記載の方法を使用して作製される、ライブラリー。
（項目８） ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの少なくとも一部を提示する遺伝的パッケージの収集物を含むライブラリーであって、該提示されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、以下の工程：
（ｉ）該核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オ
リゴヌクレオチドは、切断が所望される領域において該核酸に対して機能的に相
補的であり、そして制限の際に該核酸の所望の位置での切断を生じる制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位を、その補体を用いて該核酸中に形成する配列を含む、工
程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの相補性によって形成される該認
識部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含する方法によって、所望の位置で一本鎖核酸配列を切断することによって
生成される配列の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列によってコードされ、該接触
工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するために十分な
温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度および該所望
の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分大きな領
域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度で活性で
ある制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、ライブラリー。
（項目９） ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該提示されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する遺伝的パッケージの収集物を含むライブラリーであって、該提示されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、以下の工程：
（ｉ）該核酸を、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であ
って、該オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される領域において該
核酸に対して機能的に相補的であり、該オリゴヌクレオチドの該二本鎖領域は、
ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、該切断部位は、該核酸の該
切断が所望される該認識部位から既知の距離に位置する、工程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの該一本鎖領域の相補性によって
形成されるＩＩ型−Ｓ切断部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含する方法によって、所望の位置で一本鎖核酸配列を切断することによって
生成される配列の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列によってコードされ、該接触
工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するために十分な
温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度および該所望
の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分大きな領
域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度で活性で
ある制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、ライブラリー。
（項目１０） 前記核酸が、免疫グロブリンの少なくとも一部をコードする、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１） 前記免疫グロブリンが、Ｆａｂまたは単鎖Ｆｖを含む、請求項１０に記載の方法。
（項目１２） 前記免疫グロブリンが、重鎖の少なくとも部分を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
（項目１３） 前記重鎖の少なくとも一部がヒトである、項目１２に記載の方法。
（項目１４） 前記免疫グロブリンが、ＦＲ１の少なくとも一部を含む、
項目１０または１１に記載の方法。
（項目１５） 前記ＦＲ１の少なくとも一部がヒトである、項目１４に記載の方法。
（項目１６） 前記免疫グロブリンが、軽鎖の少なくとも一部を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
（項目１７） 前記軽鎖の少なくとも一部がヒトである、項目１６に記載の方法。
（項目１８） 前記核酸配列の少なくとも一部が、少なくとも１つの自己免疫疾患および／または癌に罹患した患者由来である、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９） 前記自己免疫疾患が、狼瘡、エリテマトーデス、全身性硬化症、慢性関節リウマチ、抗リン脂質症候群、または脈管炎からなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０） 前記核酸の少なくとも一部が、末梢血球、骨髄細胞、脾臓細胞またはリンパ節細胞からなる群から単離される、項目１８に記載の方法。
（項目２１） さらに、核酸の増幅工程を、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間、工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）との間、または工程（ｉｉｉ）と工程（ｉｖ）との間に包含する、項目５または６に記載の方法。
（項目２２） 前記増幅工程が、ｇｅｎｅＲＡＣＥＴＭを使用する、請求項２１に記載の方法。
（項目２３） 前記温度が、４５℃と７５℃との間である、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４） 前記温度が、５０℃と６０℃との間である、項目２３に記載の方法。
（項目２５） 前記温度が、５５℃と６０℃との間である、項目２４に記載の方法。
（項目２６） 前記一本鎖オリゴヌクレオチドの長さが、１７塩基と３０塩基との間である、項目１、３、５または８に記載の方法。
（項目２７） 前記一本鎖オリゴヌクレオチドの長さが、１８塩基と２４塩基との間である、項目２６に記載の方法。
（項目２８） 前記制限エンドヌクレアーゼが、ＭａｅＩＩＩ、Ｔｓｐ４５１、ＨｐｈＩ、ＢｓａＪＩ、ＡｌｕＩ、ＢｌｐＩ、ＤｄｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＭｓｌＩ、ＢｓｉＥＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、ＨａｅＩＩＩ、Ｂｓｔ４ＣＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＭｌｙＩ、ＰｌｅＩ、ＭｎｌＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＢｓｍＡＩ、ＢｐｍＩ、ＸｍｎＩ、またはＳａｃＩからなる群から選択される、
項目１、３、５または８に記載の方法。
（項目２９） 前記制限エンドヌクレアーゼが、Ｂｓｔ４ＣＩ、ＴａａＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＢｌｐＩ、ＨｐｙＣＨ４ＶまたはＭｓｌＩを含む群から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖領域の長さが、１４塩基と２２塩基との間である、項目２、４、６または９に記載の方法。
（項目３１） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖領域の長さが、１４塩基と１７塩基との間である、項目３０に記載の方法。
（項目３２） 前記オリゴヌクレオチドの前記一本鎖領域の長さが、１８塩基と２０塩基との間である、項目３１に記載の方法。
（項目３３） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記二本鎖領域の長さが、幹およびそのパリンドロームによって形成される１０塩基対と１４塩基対との間である、項目２、４、６または９に記載の方法。
（項目３４） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドが、前記幹と前記パリンドロームとの間に、３〜８塩基のループを含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５） 前記ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼが、ＡａｒＩＣＡＣ、ＡｃｅＩＩＩ、Ｂｂｒ７Ｉ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、Ｂｃｅ８３１、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｉＩ、ＢｉｎＩ、ＢｓｃＡＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＧｓｕＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＰｌｅＩ、ＲｌｅＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｓｐＤ５Ｉ、Ｓｔｈｌ３２Ｉ、ＳｔｓＩ、ＴａｑＩＩ、Ｔｔｈ１１１ＩＩ、またはＵｂａＰＩを含む群から選択される、請求項２、４、６または９に記載の方法。
（項目３６） 前記ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼが、ＦｏｋＩである、項目３５に記載の方法。
（項目３７） ベクターにクローニングするための一本鎖核酸を調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）制限エンドヌクレアーゼで切断された一本鎖核酸配列を、部分的に二本
鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オリゴヌクレオチドの一
本鎖領域は、切断の後に残る領域において該核酸と機能的に相補的であり、該オ
リゴヌクレオチドの該二本鎖領域は、発現のために切断後に残る配列を適切かつ
本来のリーディングフレームに戻すのに必要とされる任意の配列を含み、そして
これらの配列の制限エンドヌクレアーゼ認識部位５’を含む、工程；および
（ｉｉ）該部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの該二本鎖領域内に含まれる
該制限エンドヌクレアーゼ認識部位で、単独で該部分的に二本鎖のオリゴヌクレ
オチド配列を切断する工程、
を包含する、方法。
（項目３８） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖部分の長さが、２塩基と１５塩基との間である、項目３７に記載の方法。
（項目３９） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖部分の長さが、７塩基と１０塩基との間である、項目３８に記載の方法。
（項目４０） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記二本鎖部分の長さが、１２塩基対と１００塩基対との間である、項目３７に記載の方法。
（項目４１） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記二本鎖部分の長さが、２０塩基対と１００塩基対との間である、項目４０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＶＨ配列に特異的なプライマーを用いることなくＶＨ遺伝子を増幅するために用いられ得る種々の方法の模式図である。
【図２】図２は、ＶＬ配列を用いることなくＶＬ遺伝子を増幅するために用いられ得る種々の方法の模式図である。
【図３】図３は、実施例２からの切断されたκＤＮＡのゲル分析を示す。
【図４】図４は、実施例２からの切断されたκＤＮＡのゲル分析を示す。
【図５】図５は、実施例２からの増幅されたκＤＮＡのゲル分析を示す。
【図６】図６は、実施例２からの、ゲル精製された増幅されたκＤＮＡを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（用語）
この出願では、以下の用語および略号を用いる：
センス鎖：通常記載されるように、ｄｓ ＤＮＡの上の鎖（ｕｐｐｅｒ ｓｔ
ｒａｎｄ）。センス鎖では、５’−ＡＴＧ−３’はＭｅｔをコードする。
【００１９】
アンチセンス鎖：通常記載されるように、ｄｓ ＤＮＡの下の鎖（ｌｏｗｅｒ
ｓｔｒａｎｄ）。アンチセンス鎖では、３’−ＴＡＣ−５’は、センス鎖にお
けるＭｅｔコドンに対応する。
【００２０】
正方向（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー：「正方向」プライマーは、センス鎖の
一部に対して相補的であり、そして新たなアンチセンス鎖分子の合成を開始する
。「正方向プライマー」および「下の鎖のプライマー」は等価である。
【００２１】
逆方向（ｂａｃｋｗａｒｄ）プライマー：「逆方向」プライマーは、アンチセ
ンス鎖の一部に対して相補的であり、そして新たなセンス鎖分子の合成を開始す
る。「逆方向プライマー」および「上の鎖のプライマー」は等価である。
【００２２】
塩基：塩基は、コドンおよび塩基による遺伝子内のそれらの位置として、ベク
ターまたは遺伝子のいずれかにおけるそれらの位置によって特定される。例えば
、「８９．１」は、コドン８９の最初の塩基であり、８９．２は、コドン８９の
二番目の塩基である。
【００２３】
Ｓｖ：ストレプトアビジン。
【００２４】
Ａｐ：アンピシリン。
【００２５】
ａｐＲ：アンピシリン耐性を付与する遺伝子。
【００２６】
ＲＥ：制限エンドヌクレアーゼ。
【００２７】
ＵＲＥ：一般的な制限エンドヌクレアーゼ。
【００２８】
機能的に相補的：２つの配列が、選択された条件下でアニールするように十分
に相補的である。
【００２９】
ＲＥＲＳ：制限エンドヌクレアーゼ認識部位。
【００３０】
ＡＡ：アミノ酸。
【００３１】
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応。
【００３２】
ＧＬＧ：生殖系列遺伝子。
【００３３】
Ａｂ：抗体：免疫グロブリン。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメイン
に相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質をカバーする。この定義内
の抗体のいくつかの例は、特に、免疫グロブリンンアイソタイプならびにＦａｂ
、Ｆ（ａｂ１）２、ｓｃｆｖ、Ｆｖ、ｄＡｂおよびＦｄフラグメント。
【００３４】
Ｆａｂ：Ａｂの軽鎖および重鎖の部分を含む二鎖分子。
【００３５】
ｓｃＦｖ：ＶＨ：：リンカー：：ＶＬまたはＶＬ：：リンカーＶＨのいずれか
を含む単鎖Ａｂ。
【００３６】
ｗ．ｔ．：野生型。
【００３７】
ＨＣ：重鎖。
【００３８】
ＬＣ：軽鎖。
【００３９】
ＶＫ：κ軽鎖の可変領域。
【００４０】
ＶＨ：重鎖の可変領域。
【００４１】
ＶＬ：λ軽鎖の可変領域。
【００４２】
本願において、参照される全ての参考文献は、参考として詳細に援用される。
【００４３】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の方法において有用である核酸配列（すなわち、本発明の遺伝子パッケ
ージに関して示される、少なくとも一部の個々のペプチド、ポリペプチドおよび
タンパク質）は、天然に存在する配列、合成配列またはその組み合わせであり得
る。これらは、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。好ましい実施形態
において、核酸は抗体をコードする。最も好ましくは、これらはＦａｂをコード
する。
【００４４】
本発明において有用な核酸は、天然に多様性であり、合成多様性は、これらの
天然に多様性のメンバーに導入され得るか、またはこの多様性は、全体的に合成
であり得る。例えば、合成多様性は、抗体遺伝子の１つ以上のＣＤＲに導入され
得る。
【００４５】
合成多様性は、例えば、ＴＲＩＭ技術（米国特許第５，８６９，６４４号）の
使用を介して作製され得る。ＴＲＩＭ技術は、変化される位置で、どのアミノ酸
型が可能で、そしてどんな割合でかを正確に制御することが可能である。ＴＲＩ
Ｍ技術において、多様化されるコドンは、三ヌクレオチドの混合物を使用して合
成される。これは、任意の組のアミノ酸型が、任意の位置に含まれるのを可能に
する。
【００４６】
多様化されたＤＮＡを作製するために使用され得る別の代替法は、混合オリゴ
ヌクレオチド合成である。ＴＲＩＭ技術を用いて、ＡｌａおよびＴｒｐが可能で
あり得る。混合オリゴヌクレオチド合成を用いて、ＡｌａおよびＴｒｐを含む混
合物はまた、ＳｅｒおよびＧｌｙもまた必然的に含む。変性された位置において
可能なアミノ酸型は、抗体の構造、または他のペプチド、ファミリーのポリペプ
チドまたはタンパク質、生殖系列遺伝子において観察された多様性、頻繁に観察
される観察された体細胞変異、および変性の所望の領域および型を参照して選択
される。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態において、ファミリーのペプチド、ポリペプチドま
たはタンパク質の少なくとも１つのＣＤＲまたは他の領域の核酸配列は、ｍＲＮ
Ａからの逆転写によって生成されたｃＤＮＡである。より好ましくは、ｍＲＮＡ
は、関連遺伝子の天然に多様性の組のメンバーを発現する末梢血液細胞、骨髄細
胞、脾臓細胞またはリンパ節細胞（例えば、Ｂリンパ球細胞またはプラズマ細胞
）から得られ得る。より好ましくは、ｍＲＮＡは、抗体の多様なファミリーをコ
ードする。最も好ましくは、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの自己免疫障害または
癌に罹患する患者から得られる。好ましくは、自己免疫疾患（例えば、全身性エ
リテマトーデス、全身性硬化症、慢性関節リウマチ、抗リン脂質症候群および脈
管炎）の高い多様性を含むｍＲＮＡが使用される。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態において、ｃＤＮＡは、逆転写を使用してｍＲＮＡ
から生成される。この好ましい実施形態において、ｍＲＮＡは、細胞から分離さ
れ、標準的な方法を使用して分解され、その結果、全長（すなわち、キャップさ
れた）ｍＲＮＡのみが残る。次いで、キャップは除去され、そしてｃＤＮＡを生
成するために逆転写が使用される。
【００４９】
第１（アンチセンス）鎖の逆転写は、任意の適切なプライマーを用いて任意の
様式で行なわれ得る。例えば、ＨＪ ｄｅ Ｈａａｒｄら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４（２６）：１８２１８
−３０（１９９９）を参照のこと。ｍＲＮＡが抗体をコードする本発明の好まし
い実施形態において、抗体遺伝子の定常領域に相補的なプライマーが使用され得
る。これらのプライマーは有用である。なぜなら、これらは、抗体のサブクラス
に対して偏りを生じないためである。別の実施例において、ポリｄＴプライマー
が使用され得る（そして重鎖遺伝子に対して好ましくあり得る）。あるいは、プ
ライマーに相補的な配列は、アンチセンス鎖の末端に付加され得る。
【００５０】
本発明の１つの好ましい実施形態において、逆転写プライマーは、ビオチン化
プライマーであり得、従って、ｃＤＮＡ産物がストレプトアビジン（Ｓｖ）ビー
ズに固定されるのを可能にする。固定化はまた、ａ）遊離アミノ基、ｂ）チオー
ル、ｃ）カルボン酸、またはｄ）不溶性媒体の既知のパートナーに対して強力な
結合を形成するように反応し得るＤＮＡにおいて見出されない別の基、のうちの
１つを用いて５’末端において標識されたプライマーを使用して行なわれ得る。
例えば、遊離アミン（好ましくは、主にアミン）が、ＤＮＡプライマーの５’末
端において提供される場合、このアミンは、標準的なアミド形成化学を使用して
、ポリマービーズ上のカルボン酸と反応され得る。このような好ましい固定が、
逆転写の間に使用される場合、上方鎖ＲＮＡは、固定の前または後に、周知の酵
素（例えば、ＲＮＡｓｅＨおよびＲＮＡｓｅＡの組み合わせ）を使用して分解さ
れる。
【００５１】
本発明において有用な核酸配列は、一般に、これらがコードするペプチド、ポ
リペプチド、またはタンパク質を表示するために使用される前に増幅される。増
幅の前に、一本鎖ＤＮＡは、前に記載された方法のいずれかを使用して切断され
得る。あるいは、一本鎖ＤＮＡは増幅され得、次いで、これらの方法のうちの１
つを使用して切断される。
【００５２】
核酸配列を増幅するための周知の方法のいずれかが、このような増幅のために
使用され得る。多様性を最大化し、偏らせない方法が好ましい。核酸配列が、抗
体遺伝子に由来する本発明の好ましい実施形態において、本発明は、好ましくは
、重鎖および軽鎖遺伝子の定常領域中のプライマーならびにセンス鎖の５’末端
に付加された合成配列に対するプライマーを利用する。このような合成配列にお
けるプライミングは、抗体遺伝子の可変領域内の配列の使用を回避する。これら
の可変領域プライミング部位は、まれなサブクラスのいずれかであるか、または
プライミング部位において変異されたＶ遺伝子に対する偏りを生じる。この偏り
は、プライマー領域内の多様性の抑制に部分的に起因し、そして多数の変異がプ
ライマーに相補的な領域中に存在する場合のプライミングの欠如に部分的に起因
する。本発明において開示された方法は、特定のＶ遺伝子型についての増幅され
た抗体遺伝子の集団を偏らせない利点を有する。
【００５３】
合成配列は、ＤＮＡ配列を共に連結させるために周知の種々の方法によってＤ
ＮＡ鎖の５’末端に付加され得る。ＲＴキャップ伸長ＣａｐＥｘｔｅｎｔｉｏｎ
は、１つの好ましい方法である。
【００５４】
ＲＴキャップ伸長（Ｓｍａｒｔ ＲＣＲ（ＴＭ）に由来する）において、短い
重複（上方鎖プライマー（ＵＳＰ−ＧＧＧ）における５’−．．．ＧＧＧ−３’
は、下方鎖における３’−ＣＣＣ．．．．５’を補完する）および逆転写酵素を
使用して、上方鎖プライマーの逆相補体が、下方鎖に付加される。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態において、上方鎖および下方鎖プライマーはまた、
ａ）遊離アミノ基、ｂ）チオール、ｃ）カルボン酸、またはｄ）不溶性媒体の既
知のパートナーに対して強力な結合を形成するように反応し得るＤＮＡにおいて
見出されない別の基、のうちの１つを用いて、５’末端においてビオチン化また
は標識され得る。次いで、これらは、増幅後の標識された鎖を固定するために使
用され得る。固定されたＤＮＡは、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
【００５６】
図１は、ＶＨ遺伝子の増幅の概略図を示す。図１、パネルＡは、第１の下方鎖
の３’ＵＴＲプライミング合成のポリｄＴ領域に特異的なプライマーを示す。定
常領域において結合するプライマーもまた、適切である。パネルＢは、ｍＲＮＡ
に相補的でない３つのＣによって、その３’末端において伸長した下方鎖を示す
。パネルＣは、３’末端のＣＣＣにハイブリダイズする３つのＧＧＧにおける合
成上方鎖プライマーのアニーリング、および合成プライマー配列の逆相補体によ
る下方鎖を伸長する逆転写の伸長の結果を示す。パネルＤは、パネルＣの合成プ
ライマーの５’末端を複製する５’ビオチン化合成上方鎖プライマーおよび定常
ドメインの部分に相補的な下方鎖プライマーを使用するＰＣＲ増幅の結果を示す
。パネルＥは、５’ビオチン化上方鎖プライマーを使用することによって得られ
た固定二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡを示す。
【００５７】
図２は、ＶＬ遺伝子の増幅のための同様の概略図を示す。図２、パネルＡは、
第１の下方鎖の３’末端プライミング合成の領域またはその近くの定常領域に特
異的なプライマーを示す。ポリｄＴ領域において結合するプライマーはまた、適
切である。パネルＢは、ｍＲＮＡに相補的でない３つのＣによって、その３’末
端において伸長した下方鎖を示す。パネルＣは、３’末端のＣＣＣにハイブリダ
イズする３つのＧＧＧにおける合成上方鎖プライマーのアニーリング、および合
成プライマー配列の逆相補体による下方鎖を伸長する逆転写の伸長の結果を示す
。パネルＤは、パネルＣの合成プライマーの５’末端を複製する５’ビオチン化
合成上方鎖プライマーおよび定常ドメインの部分に相補的な下方鎖プライマーを
使用するＰＣＲ増幅の結果を示す。下方鎖プライマーはまた、有用な制限エンド
ヌクレアーゼ部位（例えば、ＡｓｃＩ）を含む。パネルＥは、５’ビオチン化上
方鎖プライマーを使用することによって得られた固定ｄｓ ｃＤＮＡを示す。
【００５８】
図１および２において、各Ｖ遺伝子は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および分泌
シグナル（これには可変領域が続き、これには定常領域が続き、これには３’非
翻訳領域（これは、代表的にはポリＡで終わる）が続く）からなる。逆転写のた
めの最初のプライマーは、定常領域または３’ＵＴＲのポリＡセグメントに対し
て相補的であり得る。ヒト重鎖遺伝子については、１５Ｔプライマーが好ましい
。逆転写酵素は、新しく合成されたＤＮＡの３’末端にいくつかのＣ残基を付加
する。ＲＴキャップ伸長は、この特徴を利用する。逆転写反応は、第１に、下方
鎖プライマーのみと作動される。約１時間後、プライマーは、ＧＧＧ（ＵＳＰ−
ＧＧＧ）で終了し、そして多くのＲＴａｓｅが添加される。これは、下方鎖ｃＤ
ＮＡが、ＵＳＰ−ＧＧＧの逆相補体によって最終ＧＧＧまで伸長されることを引
き起こす。付加された合成配列の部分に同一な１つのプライマーおよびセンス鎖
の３’末端における既知の配列の領域に相補的な第２のプライマーを使用して、
全てのＶ遺伝子は、それらのＶ遺伝子サブクラスに関わらず、増幅される。
【００５９】
増幅後、本発明のＤＮＡは、一本鎖とされる。例えば、この鎖は、ビオチン化
プライマーを使用すること、ストレプトアビジン樹脂上のビオチン化産物を捕獲
することによって、ＤＮＡを変成することによって、および相補的な鎖を洗い流
すことによって、分離され得る。捕獲されたＤＮＡのどの末端が望まれているか
に依存して、上方（センス）鎖または下方（アンチセンス）鎖のいずれかを固定
することを選択する。
【００６０】
これらのＤＮＡによって（少なくとも部分的に）コードされるポリペプチド、
ポリペプチドまたはタンパク質の表示を行なうために、遺伝子パッケージへのク
ローニングのための一本鎖増幅ＤＮＡを調製し、クローニングおよび発現のため
に適切な末端を提供するように操作されなければならない。詳細には、任意の５
’非翻訳領域および最小のシグナル配列が除去され、そしてインフレームで、表
示宿主において機能する適切なシグナル配列によって置換され得る。さらに、可
変ドメイン（抗体遺伝子における）の部分は、除去され、そして合成多様性を含
む合成セグメントによって置換される。他の遺伝子ファミリーの多様性は、同様
に、合成多様性を用いて拡大され得る。
【００６１】
本発明の方法に従って、クローニングのための一本鎖増幅ＤＮＡを操作するた
めの２つの方法が存在する。第１の方法は、以下の工程：
（ｉ）核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドとを接触させる工程であって、オリゴ
ヌクレオチドが、切断が望ましい領域における核酸に機能的に相補的であり、そ
して制限が核酸の切断を所望の位置で生じる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を
形成する核酸中にその相補体を有する配列を含む、工程；および
（ｉｉ）核酸およびオリゴヌクレオチドの補完によって形成された認識部位の
みで核酸を切断する工程；
を包含し、接触および切断工程は、実質的に一本鎖形態で核酸を維持するのに十
分な温度で行なわれ、オリゴヌクレオチドは、切断が選択された温度および所望
の位置で生じ得るように、２つの鎖が会合するのを可能にするのに十分に大きい
領域にわたって核酸と機能的に相補的であり、そして切断は、選択された温度で
活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して行なわれる。
【００６２】
この第１の方法において、短いオリゴヌクレオチドを、１本鎖ＤＮＡにアニー
ルさせ、現在の局部的なＤＮＡの２本鎖領域内に形成される制限エンドヌクレア
ーゼ認識部位を切断し得る。特に、１本鎖ＤＮＡの実質的な画分の同じ位置に生
じる認識部位は同一である。
【００６３】
抗体遺伝子に関して、これは、生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）配列のカタログ
を用いてなされ得る。例えば、「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａ
ｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ／ｏｋ．ｈｔｍｌ．」
を参照のこと。アップデータは、表題「Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ」の下でこのサイト
から獲得され得る。他のファミリーに関して、類似の比較が存在し、そして切断
のための適切な領域を選択するために、および多様性を維持するために用いられ
得る。
【００６４】
例えば、表１９５は、５１の公知のヒトＶＨ生殖系列遺伝子のＦＲ３領域のＤ
ＮＡ配列を示す。この領域において、この遺伝子は、表２００に示される制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位を含む。同じ部位で生殖系列遺伝子の大画分を切断す
る制限エンドヌクレアーゼは、種々の部位で切断するエンドヌクレアーゼ以上に
好ましい。さらに、１本鎖ＤＮＡ上で短いオリゴヌクレオチドが結合する領域（
例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位のいずれかの側面の約１０塩基）内に
制限エンドヌクレアーゼのための１つのみの部位が存在することが好ましい。
【００６５】
ＦＲ３における下流を切断する酵素もまた、より好ましい。なぜならば、それ
は、フレームワークにおける少数の変異を捕捉するからである。このことは、い
くつかの場合、有利であり得る。しかし、フレームワークの変異が存在し、そし
て抗体結合を付与しそして増強することが周知である。本発明は、適切な制限部
位の選択により、ＦＲ３の多様性の全てまたは一部を捕捉することを可能とする
。従って、この方法はまた、広範囲の多様性を捕捉することを可能とする。
【００６６】
最後に、本発明の方法において、約４５℃と約７５℃との間で活性な制限エン
ドヌクレアーゼが用いられる。好ましくは、５０℃以上で活性な酵素、より好ま
しくは、約５５℃で活性な酵素が用いられる。このような温度は、核酸配列が、
実質的に１本鎖形態で切断されることを維持する。
【００６７】
表２００に示される、単一の位置で重鎖ＦＲ３生殖系列遺伝子の多くを切断す
る酵素として、以下が挙げられる：ＭａｅＩＩＩ（２４＠４）、Ｔｓｐ４５Ｉ（
２１＠４）、ＨｐｈＩ（４４＠５）、ＢｓａＪＩ（２３＠６５）、ＡｌｕＩ（２
３＠４７）、ＢｌｐＩ（２１＠４８）、ＤｄｅＩ（２９＠５８）、ＢｇｌＩＩ（
１０＠６１）、ＭｓｌＩ（４４＠７２）、ＢｓｉＥＩ（２３＠７４）、ＥａｅＩ
（２３＠７４）、ＥａｇＩ（２３＠７４）、ＨａｅＩＩＩ（２５＠７５）、Ｂｓ
ｔ４ＣＩ（５１＠８６）、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ（５１＠８６）、ＨｉｎｆＩ（３
８＠２）、ＭｌｙＩ（１８＠２）、ＰｌｅＩ（１８＠２）、ＭｎｌＩ（３１＠６
７）、ＨｐｙＣＨ４Ｖ（２１＠４４）、ＢｓｍＡＩ（１６＠１１）、ＢｐｍＩ（
１９＠１２）、ＸｍｎＩ（１２＠３０）、およびＳａｃＩ（１１＠５１）（使用
される表記は、例えば、ＢｓｍＡＩが、ＦＲ３の塩基１１で開始する制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位で１６のＦＲ３生殖系列遺伝子を切断することを意味する
）。
【００６８】
ＦＲ３におけるヒト重鎖の切断について、好ましい制限エンドヌクレアーゼは
、以下のようなものである：Ｂｓｔ４ＣＩ（またはＴａａＩもしくはＨｐｙＣＨ
４ＩＩＩ）、ＢｌｐＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、およびＭｓｌＩ。ＡＣＮＧＴ（Ｂｓｔ
４ＣＩ、ＴａａＩ、およびＨｐｙＣＨ４ＩＩＩのための制限エンドヌクレアーゼ
認識部位）は、全てのヒトＦＲ３生殖系列遺伝子において一致する部位に見出さ
れるため、これらの酵素の１つは、重鎖ＣＤＲ３の多様性の捕捉のために最も好
ましい。ＢｌｐＩおよびＨｐｙＣＨ４Ｖは相補的である。ＢｌｐＩは、ＶＨ１お
よびＶＨ４ファミリーのほとんどのメンバーを切断し、ＨｐｙＣＨ４Ｖは、ＶＨ
３、ＶＨ５、ＶＨ６、およびＶＨ７のファミリーのほとんどのメンバーを切断す
る。両方の酵素ともＶＨ２を切断しないが、これは非常に小さいファミリーであ
り、３つのメンバーを含むのみである。従って、これらの酵素はまた、本発明の
方法の好ましい実施形態において用いられ得る。
【００６９】
制限エンドヌクレアーゼＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、Ｂｓｔ４ＣＩ、およびＴａａＩ
は全て、５’―ＡＣｎＧＴ―３’を認識し、そしてｎの後の上方のストランドＤ
ＮＡおよびｎに相補的な塩基の前の下方ストランドＤＮＡを切断する。これは、
ヒト重鎖上でのこの方法のために最も好ましい制限エンドヌクレアーゼ認識部位
である。なぜならば、それは、全ての生殖系列遺伝子において見出されるからで
ある。さらに、制限エンドヌクレアーゼ認識領域（ＡＣｎＧＴ）は、表２０６に
示されるような、チロシンコドン（ｔａｙ）およびそれに続くシステインコドン
（ｔｇｙ）の第２および第３の塩基に適合する。これらのコドン（特に、成熟抗
体遺伝子におけるシステイン）は、高度に保存されている。
【００７０】
表２５０Ｅは、長さ２２塩基（長さ２０の最後の１つを除く）の別個のオリゴ
ヌクレオチドを示す。表２５５Ｃは、１６１７の実際の重鎖抗体遺伝子の分析を
示す。これらの中で、１５１１つはこの部位を有し、そして４つの不適合内で候
補オリゴヌクレオチドの１つに適合する。８つのオリゴヌクレオチドが、ほとん
どの適合の原因であり、表２５０Ｆ．１．に示す。８つのオリゴヌクレオチドは
非常に類似しており、その結果、満足のいく切断が、温度、ｐＨ、塩分などを調
整することにより、１つのみのオリゴヌクレオチド（例えば、Ｈ４３．７７．９
７．１−０２＃１）を用いて達成されるようである。１つまたは２つのオリゴヌ
クレオチドは、生殖系列遺伝子配列がごくわずかしか異ならない場合であっても
、そして特に切断される制限エンドヌクレアーゼ認識領域付近でごくわずかしか
異ならない場合、同様に満足し得る。表２５５Ｄは、８つの選択されたオリゴヌ
クレオチドのみを用いた、１６１７つの実際の重鎖抗体遺伝子の反復分析を示す
。これは、１４６３つの配列が、４つの不適合内で少なくとも１つのオリゴヌク
レオチドで適合すること、および期待するような部位を有することを示す。７つ
の配列のみが、この領域内に第２のＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ
認識領域を有する。
【００７１】
適切な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を選択する別の説明は、ヒト重鎖のＦ
Ｒ１における切断に関する。ＦＲ１における切断は、重鎖のＣＤＲの多様性全体
の捕捉を可能にする。
【００７２】
ヒト重鎖ＦＲ１についての生殖系列遺伝子を表２１７に示す。表２２０は、ヒ
ト生殖系列遺伝子ＦＲ１において見出される制限エンドヌクレアーゼ認識部位を
示す。好まし部位は、ＢｓｇＩ（ＧＴＧＣＡＧ；３９＠４）、ＢｓｏＦＩ（ＧＣ
ｎｇｃ；４３＠６、１１＠９、２＠３、１＠１２）、ＴｓｅＩ（Ｇｃｗｇｃ；４
３＠６、１１＠９、２＠３、１＠１２）、ＭｓｐＡｌＩ（ＣＭＧｃｋｇ；４６＠
７、２＠１）、ＰｖｕＩＩ（ＣＡＧｃｔｇ；４６＠７、２＠１）、ＡｌｕＩ（Ａ
Ｇｃｔ；４８＠８２＠２）、ＤｄｅＩ（Ｃｔｎａｇ；２２＠５２、９＠４８）、
ＨｐｈＩ（ｔｃａｃｃ；２２＠８０）、ＢｓｓＫＩ（Ｎｃｃｎｇｇ；３５＠３９
、２＠４０）、ＢｓａＪＩ（Ｃｃｎｎｇｇ；３２＠４０、２＠４１）、ＢｓｔＮ
Ｉ（ＣＣｗｇｇ；３３＠４０）、ＳｃｒＦＩ（ＣＣｎｇｇ；３５＠４０、２＠４
１）、Ｅｃｏ０１０９Ｉ（ＲＧｇｎｃｃｙ；２２＠４６、１１＠４３）、Ｓａｕ
９６Ｉ（Ｇｇｎｃｃ；２３＠４７、１１＠４４）、ＡｖａＩＩ（Ｇｇｗｃｃ；２
３＠４７、４＠４４）、ＰｐｕＭＩ（ＲＧｇｗｃｃｙ；２２＠４６、４＠４３）
、ＢｓｍＦＩ（ｇｔｃｃｃ；２０＠４８）、ＨｉｎｆＩ（Ｇａｎｔｃ；３４＠１
６、２１＠５６、２１＠７７）、ＴｆｉＩ（２１＠７７）、ＭｌｙＩ（ＧＡＧＴ
Ｃ；３４＠１６）、ＭｌｙＩ（ｇａｃｔｃ；２１＠５６）、およびＡｌｗＮＩ（
ＣＡＧｎｎｎｃｔｇ；２２＠６８）である。より好ましい部位は、ＭｓｐＡＩお
よびＰｖｕＩＩである。ＭｓｐＡＩおよびＰｖｕＩＩは、７〜１２での４６つの
部位および１〜６での２つの部位を有する。両方の部位での切断を回避するため
に、１〜６での部位を完全に覆わないオリゴヌクレオチドが用いられる。従って
、ＤＮＡは、その部位で切断されない。本発明者らは、ＰｖｕＩＩ部位を超えて
３、４、または５塩基延びるＤＮＡが効果的に切断され得ることを示した。
【００７３】
適切な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を選択する別の説明は、ヒトκ軽鎖の
ＦＲ１における切断に関する。表３００は、ヒトκＦＲ１生殖系列を示し、そし
て表３０２は、一致する部位で実質的に多くのヒトκＦＲ１生殖系列遺伝子にお
いて見出される制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示す。列挙される制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位の中で、ＢｓｍＡＩおよびＰｆｌＦＩが最も好ましい酵素
である。ＢｓｍＡＩ部位は、４０の生殖系列遺伝子の中の３５において塩基１８
にて見出される。ＰｆｌＦＩ部位は、４０の生殖系列遺伝子の中の３５において
塩基１２にて見出される。
【００７４】
適切な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を選択する別の例は、ヒトλ軽鎖のＦ
Ｒ１における切断に関する。表４００は、３１の公知のヒトλＦＲ１生殖系列遺
伝子配列を示す。表４０５は、ヒトλＦＲ１生殖系列遺伝子において見出される
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示す。ＨｉｎｆＩおよびＤｄｅＩが、ＦＲ１
におけるヒトλ鎖を切断するための最も好ましい制限エンドヌクレアーゼである
。
【００７５】
切断のための１つかまたは複数の適切な部位が選択された後に、１つ以上の短
いオリゴヌクレオチドが、１つかまたは組み合わせて、選択された認識部位を機
能的に補うために調製される。このオリゴヌクレオチドはまた、増幅された遺伝
子の大部分において認識部位に隣接する配列を含む。この隣接配列は、この配列
が、選択された部位に特異的な制限エンドヌクレアーゼにより切断されるのに十
分に、１本鎖ＤＮＡにアニールすることを可能にする。
【００７６】
このオリゴヌクレオチドの実際の長さおよび配列は、認識部位ならびに接触お
よび切断のために用いられる状態に依存する。この長さは、オリゴヌクレオチド
が、２つのストランドが結合し、その結果、選択された温度および所望の位置の
みでの切断が生じるのに十分大きな領域にわたって、１本鎖ＤＮＡに機能的に相
補性であるために十分でなければならない。
【００７７】
代表的に、本発明の好ましい方法のオリゴヌクレオチドは、約１７〜約３０ヌ
クレオチド長である。約１７塩基未満では、アニーリングが弱すぎ、そして３０
塩基より上では、特異性の喪失が存在し得る。好ましい長さは、１８〜２４塩基
である。
【００７８】
この長さのオリゴヌクレオチドは、生殖系列遺伝子の同一の相補体である必要
はない。むしろ、生じる数個の不適合が寛容され得る。しかし、好ましくは、１
〜３の不適合のみが許容される。このような不適合は、１本鎖ＤＮＡに対するこ
のオリゴヌクレオチドのアニーリングに逆に影響しない。従って、この２つのＤ
ＮＡは、機能的に相補性であると呼ばれる。
【００７９】
クローニングのために本発明の増幅した１本鎖ＤＮＡを操作するための第２の
方法は、以下の工程を包含する：
（ｉ）核酸と部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドを接触される工程であっ
て、このオリゴヌクレオチドの１本鎖領域が、切断が所望される領域においてこ
の核酸に機能的に相補的であり、そしてこのオリゴヌクレオチドの２本鎖領域が
、ＩＩ−Ｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、それらの切断部位が、認
識部位から既知の距離で配置される、工程；および
（ｉｉ）核酸とオリゴヌクレオチドの１本鎖領域との補完により形成される
切断部位のみでこの核酸を切断する工程。
接触工程および切断工程は、この核酸を実質的に１本鎖形態で維持するために十
分な温度にて実施され、オリゴヌクレオチドは、２つのストランドが結合し、そ
の結果、選択された温度および所望の位置で切断が生じ得るのに十分に大きな領
域にわたってこの核酸に対して機能的に相補性であり、そして切断は、選択され
た温度で活性な制限エンドヌクレアーゼを用いて実施される。
【００８０】
この第２の方法は、ユニバーサル制限エンドヌクレアーゼ（「ＵＲＥ」）を用
いる。ＵＲＥは、部分的に２本鎖オリゴヌクレオチドである。１本鎖部分または
ＵＲＥの重複は、１本鎖ＤＮＡにおいて切断されるためにこの配列に対して機能
的に相補性であるＤＮＡアダプターからなる。２本鎖部分は、ＩＩ−Ｓ型制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位でからなる。
【００８１】
本発明のＵＲＥ方法は、特異的かつ正確であり、そして相補領域においていく
つか（例えば、１〜３）の不適合を寛容し得る（すなわち、それはその領域に対
して機能的に相補性である）。さらに、ＵＲＥが用いられる条件が調整され、そ
の結果、増幅されるほとんどの遺伝子が切断され、それらの遺伝子から生成され
るライブラリー中の偏りを減少させ得る。
【００８２】
１本鎖ＤＮＡアダプターの配列またはＵＲＥの重複部分は、代表的に、約１４
〜２２塩基からなる。しかし、より長いかまたはより短いアダプターが用いられ
得る。大きさは、アダプターが１本鎖ＤＮＡの機能的な相補体と結合する能力、
ならびにＩＩ−Ｓ型酵素を用いてこのＤＮＡを切断するために用いられる温度に
てＵＲＥと１本鎖ＤＮＡを接触させるために用いられる温度に依存する。アダプ
ターは、２つのストランドが結合し、その結果、選択された温度および所望の位
置で切断が生じ得るのに十分に大きな領域にわたって１本鎖ＤＮＡに対して機能
的に相補性でなければならない。本発明者らは、１４〜１７塩基長、より好まし
くは１８〜２０塩基長の１本鎖部分または重複部分を好む。
【００８３】
ＵＲＥを用いて切断のために選択される部位は、好ましくは、増幅されたＤＮ
Ａのファミリーにおいて実質的に保存される部位である。本発明の第１の切断方
法と比較する場合、これらの部位は、エンドヌクレアーゼ認識部位である必要が
ない。しかし、第１の方法のように、選択される部位は、ネイティブのＤＮＡに
存在するというよりも合成性であり得る。このような部位は、公知の抗体または
遺伝子の他のファミリーの配列に関する参照により選択され得る。例えば、多く
の生殖系列遺伝子の配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．
ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ／ｏｋ．ｈｔｍｌにて報告
されている。例えば、１つの好ましい部位は、ＦＲ３の末端付近（コドン８９〜
コドン９３の第２の塩基）で生じる。ＣＤＲ３は、コドン９５で開始する。
【００８４】
７９のヒト重鎖遺伝子の配列もまた、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌ
ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅ２／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌにて利用
可能である。このサイトは、本発明の方法に従うＵＲＥ切断のための適切な配列
を同定するために用いられ得る。例えば、表８Ｂを参照のこと。
【００８５】
最も好ましくは、１つ以上の配列が、これらのサイトまたは他の利用可能な配
列情報を用いて同定される。これらの配列は、共に、増幅されたＤＮＡの実質的
な画分に存在する。例えば、複数の配列が、生殖系列遺伝子における公知の多様
性または頻度の高い体細胞変異を可能にするために用いられ得る。合成性の変性
配列もまた、用いられ得る。好ましくは、２〜３の不適合のみを有する試験され
た遺伝子の少なくとも６５％において生じる配列が、選択される。
【００８６】
次いで、ＵＲＥ１本鎖アダプターまたは重複は、選択される領域に相補性であ
るように作製される。ＵＲＥを使用する条件は、経験的に決定される。これらの
条件は、２〜３の不適合のみを有する機能的に相補性の配列を含むＤＮＡの切断
を可能にするが、このような配列を欠くＤＮＡの切断を可能にしない。
【００８７】
上記のように、ＵＲＥの二本鎖部分として、ＩＩ−Ｓ型エンドヌクレアーゼ認
識部位が挙げられる。一本鎖ＤＮＡを実質的にその形態で保持し、そして一本鎖
ＤＮＡが所望される部位で切断されるのを可能にするために、ＵＲＥの一本鎖Ｄ
ＮＡアダプター部分が十分な長さでアニーリングすることを可能にするのに必要
な温度で活性な任意のＩＩ−Ｓ型酵素が使用され得る。
【００８８】
本発明のＵＲＥ方法での使用のための好ましいＩＩ−Ｓ型酵素は、一本鎖ＤＮ
Ａの非対称的な切断を提供する。とりわけ、表８００にこれらの酵素を列挙する
。もっとも好ましいＩＩ−Ｓ型酵素が、ＦｏｋＩである。
【００８９】
好ましいＦｏｋＩを含むＵＲＥが使用される場合、切断を起こすためのいくつ
かの条件を使用することが好ましい：
１）酵素を活性化するための標的ＤＮＡ全体のＵＲＥの発現が存在するべきで
ある。標的ＤＮＡに対して等モル量しか存在しないＵＲＥは、ｓｓＤＮＡの少な
い切断を生じる。なぜなら、利用可能な活性な酵素の量は限られているからであ
る。
【００９０】
２）アクチベーターを使用してＦｏｋＩ酵素の一部を活性化し、切断を生じる
ことなく二量体化させ得る。適切なアクチベーターの例を、表５１０に示す。
【００９１】
３）切断の制限は、４５℃〜７５℃の間の温度、好ましくは５０℃より高い温
度、そして最も好ましくは５５℃より高い温度で実施される。
【００９２】
先行技術で使用されているＵＲＥは、１４の塩基の一本鎖セグメント、１０の
塩基のステム（ＦｏｋＩ部位を含む）、それに続く１０塩基のステムのパリンド
ロームを含んだ。このようなＵＲＥを本発明の本方法で使用し得るが、本発明の
好ましいＵＲＥはまた、セグメントを含むＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ認識
部位の間の３〜８塩基（１つのループ）のセグメントも含む。好ましい実施形態
において、ステム（ＦｏｋＩ部位を含む）およびそのパリンドロームはまた、１
０塩基よりも長い。好ましくは、これらは、１０〜１４塩基長である。これらの
「ロリポップ（ｌｏｌｌｉｐｏｐ）」ＵＲＥアダプターの例を表５に示す。
【００９３】
ＵＲＥを使用して、一本鎖ＤＮＡを切断する１つの例としては、ヒト重鎖のＦ
Ｒ３領域が挙げられる。表５０８は、示されるＵＲＥ認識配列を有する８４０の
全長成熟ヒト重鎖の分析を示す。大部分（７１８／８４０＝０．８５）は、５つ
のＵＲＥ（ＶＨＳ８８１−１．１、ＶＨＳ８８１−１．２、ＶＨＳ８８１−２．
１、ＶＨＳ８８１−４．１、およびＶＨＳ８８１−９．１）を使用して、２以下
のミスマッチを認識される。これらのそれぞれは、生殖系列の遺伝子に相補的な
２０塩基のアダプター配列、ＦｏｋＩ部位を含む１０塩基のステムセグメント、
５つの塩基ループ、および第一のステムセグメントの逆の相補体を有する。これ
らのアダプターを、単独でまたは組合せて一本鎖アンチセンス重鎖ＤＮＡにアニ
ーリングし、そして例えば、アクチベーターＦＯＫＩａｃｔの存在下でＦｏｋＩ
を用いて処理することによって、指示された位置でアンチセンス鎖の切断を生じ
る。
【００９４】
ＵＲＥを使用して一本鎖ＤＮＡを切断する別の例としては、ヒトκ軽鎖のＦＲ
１領域が挙げられる。表５１２は、４つの示された１９塩基のプローブ配列によ
る一致についての１８２の全長ヒトκ鎖の分析を示す。９６％の配列は、２以下
のミスマッチを有するプローブの１つと一致する。表５１２に示されるＵＲＥア
ダプターは、κ鎖のセンス鎖の切断のためである。従って、アダプター配列は、
生殖系列の遺伝子配列の逆の相補体である。ＵＲＥは、１０塩基のステム、５塩
基のループ、ステムの逆の相補体およびその相補配列から構成される。ループは
、ここではＴＴＧＴＴを示すが、他の配列が使用され得る。その機能は、ロリポ
ップ単量体の形成が二量体化よりも好まれるように、ステムのパリンドロームを
妨げることである。表５１２はまた、センス鎖が切断される場所を示している。
【００９５】
ＵＲＥを使用して一本鎖ＤＮＡを切断する別の例としては、ヒトλ軽鎖が挙げ
られる。表５１５は、４つの示された１９塩基のプローブを一致させるための１
２８のヒトλ軽鎖の分析を示している。３以下のミスマッチを有し、１２８のう
ちの８８（６９％）の鎖がプローブの１つと一致する。表５１５はまた、これら
のプローブに対応するＵＲＥアダプターを示している。これらのアダプターを、
λ鎖の上側の鎖ｓｓＤＮＡにアニーリングし、そしてＦＯＫＩａｃｔの存在下、
４５℃またはそれより高い温度で、ＦｏｋＩで処理することによって、これらの
鎖の特異的かつ正確な切断が生じる。
【００９６】
第一の方法の短いオリゴヌクレオチド配列および第二の方法のＵＲＥが、一本
鎖ＤＮＡと接触する条件下で、経験的に決定され得る。この条件は、一本鎖ＤＮ
Ａが、実質的に一本鎖の形態で保持されるようでなければならない。より詳細に
は、これらの条件は、一本鎖ＤＮＡが、ループを形成しないような条件でなけれ
ばならず、このループは、それが関係するオリゴヌクレオチド配列もしくはＵＲ
Ｅを妨害し得るか、または選択的制限エンドヌクレアーゼによってループ自身が
切断の部位を提供し得る。
【００９７】
短いオリゴヌクレオチド（第一の方法）およびＵＲＥ（第二の方法）の効率お
よび特異性は、ＵＲＥアダプター／オリゴヌクレオチドならびに基質ＤＮＡの濃
度、温度、ｐＨ、金属イオン濃度、イオン強度、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏ
ｐｅ）（例えば、尿素およびホルムアミド）の濃度、制限エンドヌクレアーゼ（
例えば、ＦｏｋＩ）の濃度、および消化の時間を制御することによって調整され
得る。これらの条件は、以下を有する合成オリゴヌクレオチドを用いて最適化さ
れ得る：１）標的生殖系列遺伝子配列、２）成熟標的遺伝子配列、または３）幾
分関連する非標的配列。目標は、標的配列のほとんどを切断しかつ非標的の最小
量を切断することである。
【００９８】
本発明の好ましい実施形態において、一本鎖ＤＮＡは、４５℃〜７５℃の間の
温度を使用して、実質的に一本鎖ＤＮＡの形態で維持される。より好ましくは、
５０℃〜６０℃の間であり、最も好ましくは５５℃〜６０℃の間の温度が使用さ
れる。これらの温度は、ＤＮＡがオリゴヌクレオチドまたはＵＲＥと接触する場
合、および本発明の方法を使用してＤＮＡを切断する場合の両方で使用される。
【００９９】
本発明の２つの切断方法は、いくつかの利点を有する。第一の方法は、一本鎖
ＤＮＡのファミリーの個々のメンバーを、１つの実質的に保存されたエンドヌク
レアーゼ認識部位で単独に切断することを可能にする。この方法はまた、逆転写
または増幅プライマーに構築されるエンドヌクレアーゼ認識部位を必要としない
。ファミリー中の任意のネイティブな部位または合成部位が使用され得る。
【０１００】
第二の方法は、これらの利点の両方を有する。さらに、ＵＲＥの方法は、一本
鎖ＤＮＡが、天然に存在するか、または合成で構築されたエンドヌクレアーゼ認
識部位を有さない位置で切断されることを可能にする。
【０１０１】
最も重要なことは、両方の切断方法が、多様性を最大にするように５’および
３’プライマーの使用を可能にし、次いでクローニングおよびディスプレイの前
に所望でないか、または有害な配列を除去するような切断を可能にする。
【０１０２】
増幅されたＤＮＡを、本発明の方法の１つを使用して切断した後、このＤＮＡ
はクローニングのために調製される。これは、部分的に二重鎖の合成ＤＮＡアダ
プター（この末端配列は、特定の切断部位に基づいており、増幅されたＤＮＡは
、この部位で切断される）を使用することによってなされる。
【０１０３】
合成ＤＮＡは、切断された一本鎖ＤＮＡに連結される場合、ＤＮＡが、所望の
ペプチド、ポリペプチドまたは遺伝子パッケージの表面タンパク質をディスプレ
イするように正確なリーディングフレームに発現されることを可能にするように
設計される。好ましくは、アダプターの二本鎖部分は、ペプチド、ポリペプチド
または切断部位までのタンパク質のファミリーのアミノ酸配列の特徴をコードす
るいくつかのコドン配列を含む。ヒト重鎖について、好ましくは、３〜２３のフ
レームワークのアミノ酸を使用して、切断されたＤＮＡの発現に必要な配列を提
供する。
【０１０４】
好ましくは、アダプターの二本鎖部分は、約１２〜１００塩基長である。より
好ましくは、約２０〜１００塩基が使用される。アダプターの二本鎖領域はまた
、好ましくは、ＤＮＡを適切なディスプレイベクター（または多様性を保存する
ために使用されるレシピエントベクター）にクローニングするために有用な少な
くとも１つのエンドヌクレアーゼ認識部位を含む。このエンドヌクレアーゼ制限
部位は、ＤＮＡ配列を伸長するために使用される生殖系列遺伝子配列に対してネ
イティブであり得る。これはまた、ネイティブな生殖系列遺伝子配列に対して縮
重した配列を使用して構築され得る。または、これは全合成であり得る。
【０１０５】
アダプターの一本鎖部分は、一本鎖ＤＮＡにおける切断領域に相補的である。
このオーバーラップは、約２塩基〜約１５塩基までであり得る。オーバーラップ
がより長くなるにつれて、連結がより効率的になるようである。オーバーラップ
について好ましい長さは、７〜１０である。これは、領域における多様性が捕捉
され得るようにこの領域のいくつかのミスマッチを可能にする。
【０１０６】
一本鎖領域または部分的二重鎖のアダプターのオーバーラップが有利である。
なぜなら、これは、ＤＮＡが選択された部位で切断されることを可能にするが、
捕捉される他のフラグメントは切断されないからである。このようなフラグメン
トは、適切な抗体に折り畳まれず、そして非特異的粘着性であるらしい遺伝子コ
ード配列を有するライブラリーを汚染する。
【０１０７】
本発明の方法における部分的二重鎖のアダプターの使用の１つの例示としては
、このようなアダプターを上記のように、５’−ＡＣｎＧＴ−３’において、Ｈ
ｐｙＣＨ４ＩＩＩ、Ｂｓｔ４ＣＩまたはＴａａＩを使用して切断されるヒトＦＲ
３領域に連結する工程を包含する。
【０１０８】
表２５０Ｆ．２は、切断された下側の鎖であるＤＮＡに連結するためにアダプ
ターの二本鎖部分の下側の鎖を示している。ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ部位は、右（表
２０６に示されるような）に対して非常に遠いので、ＡｆｌＩＩ部位およびＸｂ
ａＩ部位を含む配列が、付加され得る。部分的に二重鎖のアダプターのこの下側
の鎖部分（Ｈ４３．ＸＡＥｘｔ）は、ＸｂａＩおよびＡｆｌＩＩ部位の両方を組
込む。アダプターの二重鎖部分の上側の鎖は、いずれの部位も有さない（Ｈ４３
．ＸＡＥｘｔのＸｂａＩおよびＡｆｌＩＩ部位に逆のセグメントにおける計画さ
れたミスマッチのため）が、Ｈ４３．ＸＡＥｘｔに非常に強固アニーリングする
。Ｈ４３ＡＥｘｔは、ＡｆｌＩＩ部位のみを含み、そして上側鎖Ｈ４３．ＡＢｒ
１およびＨ４３．ＡＢｒ２（これは、ＡｆｌＩＩ部位を破壊するために意図的な
変更を有する）とともに使用される。
【０１０９】
連結後に、所望の捕獲されたＤＮＡは、さらにＰＣＲ増幅され得、所望である
場合、好ましい実施形態において、抗体遺伝子の下流の定常領域に対するプライ
マー、およびアダプターの二本鎖領域の部分に対するプライマーを使用する。こ
れらのプライマーはまた、増幅されたＤＮＡのクローニングに使用するための制
限エンドヌクレアーゼ部位を保有する。
【０１１０】
部分的な二本鎖アダプターの一本鎖増幅ＤＮＡへの連結、およびおそらく増幅
の後、複合体ＤＮＡは、選択された５’側および３’側エンドヌクレアーゼ認識
部位で切断される。
【０１１１】
クローニングに有用な切断部位は、カセットが挿入されるファージまたはファ
ージミドおよび抗体遺伝子におけるその利用可能な部位に依存する。表１は、７
５のヒト軽鎖についての制限エンドヌクレアーゼのデータを提供する。表２は、
７９のヒト重鎖についての対応するデータを示す。各表において、エンドヌクレ
アーゼは、切断の頻度が増す順番で並べられている。これらの表において、Ｎｃ
ｈは、酵素によって切断される鎖の数であり、Ｎｓは、部位の数（いくつかの鎖
は１より多い部位を有する）である。
【０１１２】
この分析から、ＳｆｉＩ、ＮｏｔＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｐａＬＩおよびＡｓｃＩ
が非常に適切である。ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩは、好ましくは、重鎖ディスプレ
イセグメントを挿入するためのｐＣＥＳ１において使用される。ＡｐａＬＩおよ
びＡｓｃＩは、好ましくは、軽鎖ディスプレイセグメントを挿入するためにｐＣ
ＥＳ１において使用される。
【０１１３】
ＢｓｔＥＩＩ部位は、生殖系列ＪＨ遺伝子の９７％に生じる。再配列されたＶ
遺伝子において、重鎖遺伝子の５４／７９（６８％）のみが、ＢｓｔＥＩＩ部位
を含み、そしてこれらの７／６１が、２つの部位を含む。従って、４７／７９（
５９％）が、１つのＢｓｔＥＩＩ部位を含む。ＢｓｔＥＩＩを使用することの代
替策は、ＪＨ末端でのＵＲＥを介する切断、およびＣＨ１の部分をコードする合
成オリゴヌクレオチドへの連結である。
【０１１４】
本発明の方法を使用するＤＮＡ配列のファミリーを調製する１つの例として、
ヒトＣＤＲ３多様性を捕捉することが挙げられる。上記のように、種々の自己免
疫の患者からのｍＲＮＡは、ｃＤＮＡへ逆転写される。ｍＲＮＡが分解された後
、ｃＤＮＡを固定化し、そして短いオリゴヌクレオチドを使用してｃＤＮＡ上流
のＣＤＲ３を切断する。次いで、部分的に二重鎖の合成ＤＮＡアダプターは、Ｄ
ＮＡにアニーリングされ、そしてこのＤＮＡは、アダプターに対するプライマー
および定常領域（ＦＲ４の後）に対するプライマーを使用して増幅される。次い
で、ＤＮＡはＢｓｔＥＩＩ（ＦＲ４中）および部分的二本鎖アダプター（例えば
、ＸｂａＩおよびＡｆｌＩＩ（ＦＲ３中））に適切な制限エンドヌクレアーゼを
使用して切断される。次いで、ＤＮＡは合成ＶＨ骨格（例えば、３〜２３）に連
結される。
【０１１５】
ＵＲＥ方法を使用して切断された一本鎖ＤＮＡを調製する１つの例として、ヒ
トκ鎖が挙げられる。この鎖のセンス鎖の切断部位は、表５１２に示される。オ
リゴヌクレオチドｋａｐｅｘｔＵＲＥは、オリゴヌクレオチド（ｋａＢＲ０１Ｕ
Ｒ、ｋａＢＲ０２ＵＲ、ｋａＢＲ０３ＵＲ、およびｋａＢＲ０４ＵＲ）にアニー
リングされて部分的二重鎖ＤＮＡを形成する。次いで、このＤＮＡは、切断され
た可溶性のκ鎖に連結される。次いで、連結産物は、プライマーｋａｐｅｘｔＵ
ＲＥＰＣＲおよびＣＫＦｏｒｅＡｓｃ（これは、Ｃκ末端後のＡｓｃＩ部位に挿
入する）を使用して増幅される。次いで、この産物は、ＡｐａＬＩおよびＡｓｃ
Ｉを用いて切断され、そして同様にレシピエントベクターを切断するために連結
される。
【０１１６】
別の例としては、表５１５に示される切断が挙げられる。切断後、エクステン
ダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）（ＯＮ＿ＬａｍＥｘ１３３）オリゴヌクレオチドおよ
び４つのブリッジ（ｂｒｉｄｇｅ）オリゴヌクレオチド（ＯＮ＿ＬａｍＢ１−１
３３、ＯＮ＿ＬａｍＢ２−１３３、ＯＮ＿ＬａｍＢ３−１３３およびＯＮ＿Ｌａ
ｍＢ４−１３３）は、アニーリングされて部分的二重鎖ＤＮＡを形成する。この
ＤＮＡは、切断されたλ鎖センス鎖に連結される。連結後、ＤＮＡは、ＯＮ＿Ｌ
ａｍ１３３ＰＣＲおよびλ定常ドメインに特異的な前進プライマー（例えば、Ｃ
Ｌ２ＦｏｒｅＡｓｃまたはＣＬ７ＦｏｒｅＡｓｃ（表１３０））を用いて増幅さ
れる。
【０１１７】
ヒト重鎖において、ＦＲ４のほとんど全ての遺伝子は、ヒト重鎖Ｖ遺伝子の非
常に大きな画分中の定常位置で生じるＢｓｔＥＩＩ部位で切断され得る（下流、
すなわち、ＣＤＲ３のセンス鎖の３’末端へ向かって）。次いで、ＣＤＲ３の多
様性のみが捕捉される場合、ＦＲ３中の部位が、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の多様
性が所望される場合、ＦＲ２中の部位が、またはＣＤＲの多様性全てが所望され
る場合、ＦＲ１中の部位が必要である。これらの部位は、好ましくは、部分的二
重鎖のアダプターの一部として挿入される。
【０１１８】
本発明の好ましいプロセスは、軽鎖または重鎖のいずれかのクローニングを可
能にする部位を有するレシピエントベクターを提供することである。このような
ベクターは、周知であり、当該分野で広く使用される。本発明に従った好ましい
ファージ提示ベクターは、ファージＭＡＬＩＡ３である。これは、遺伝子ＩＩＩ
において提示する。ファージＭＡＬＩＡ３の配列を、表１２０Ａ（注釈付）およ
び表１２０Ｂ（要約）に示す。
【０１１９】
軽鎖または重鎖の選択された領域をコードするＤＮＡを、軽鎖または重鎖のい
ずれかを非常に稀にしか切断しないエンドヌクレアーゼを使用してベクターに移
入し得る。例えば、軽鎖は、ＡｐａＬＩおよびＡｓｃＩによって捕捉される。重
鎖遺伝子は、好ましくは、ＳｆｉＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、ＡｆｌＩＩ、Ｂｓｔ
ＥＩＩ、ＡｐａＩおよびＮｏｔＩ部位を有するレシピエントベクターにクローニ
ングされる。軽鎖は、好ましくは、ＡｐａＬＩ−ＡｓｃＩフラグメントとしてラ
イブラリー中に移される。重鎖は、好ましくは、ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩフラグメン
トとしてライブラリーに移される。
【０１２０】
最も好ましくは、この提示は、Ｍ１３ファージの誘導体の表面上に有される。
最も好ましいベクターは、Ｍ１３の全ての遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、および
提示カセットを含む。好ましいベクターは、遺伝子の多様なファミリーのメンバ
ーの導入および切除を可能にする制限部位をカセットとして提供される。好まし
いベクターは、ファージを増幅させるために使用される増殖条件下での再編成に
対して安定である。
【０１２１】
本発明の別の実施形態において、本発明の方法によって捕捉される多様性は、
ＩＩＩタンパク質上にペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を提示するファ
スミドベクター（例えば、ｐＣＥＳ１）において提示され得る。このようなベク
ターはまた、他のベクターまたはファージを使用する引き続く提示のための多様
性を保存するために使用され得る。
【０１２２】
別の実施形態において、提示の様式は、３つの可能性のあるアンカードメイン
に対する短いリンカーを介し得る。Ｍ１３ ＩＩＩ（「ＩＩＩスタンプ」）の最
終部分である１つのアンカードメイン、全長ＩＩＩ成熟タンパク質である第二の
アンカー、およびＭ１３ ＶＩＩＩ成熟タンパク質である第三のアンカー。
【０１２３】
ＩＩＩスタンプフラグメントは、ファージに構築するためのＭ１３ ＩＩＩを
十分に含むが、感染性の媒介に関するドメインを含まない。野生型のＩＩＩおよ
びＶＩＩＩタンパク質が存在することから、このファージは、抗体遺伝子を除去
しないようであるが、非常に低い増殖の利点のみを受けるこれらのセグメントを
欠失する。各々のアンカードメインのために、このＤＮＡは野生型のＡＡ配列を
コードするが、非常に高い程度で野生型のＤＮＡ配列とは異なる。これは、提示
アンカーと野生型遺伝子（これもまた存在する）との間の相同組換えの可能性を
非常に減少させる。
【０１２４】
最も好ましくは、本発明は、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性
遺伝子）および提示カセットを保有する完全なファージを使用する。野生型ｉｉ
ｉおよびｖｉｉｉ遺伝子が存在することから、野生型タンパク質もまた存在する
。この提示カセットは、調節可能なプロモーター（例えば、ＰＬａｃＺ）から転
写される。調節可能なプロモーターの使用は、対応する野生型コートタンパク質
に対する融合提示遺伝子の比を制御することを可能にする。この比は、ファージ
（またはファスミド）粒子当たりの提示融合の平均コピー数を決定する。
【０１２５】
本発明の別の局面は、糸状ファージ上にペプチド、ポリペプチドまたはタンパ
ク質（および特にＦａｂ）を提示する方法である。最も好ましい実施形態におい
て、この方法は、ＦＡＢを提示し、以下を包含する：
ａ）以下のエレメントをコードするＤＮＡの断片の送達を捕捉するカセットを得
る工程：
Ｐｒｅｇ：：ＲＢＳ１：：ＳＳ１：：ＶＬ：：ＣＬ：：停止：：ＲＢＳ２：：
ＳＳ２：：ＶＨ：：ＣＨ１：：リンカー：：アンカー：：停止：：、
ここで、Ｐｒｅｇは、調節可能なプロモーターであり、ＰＢＳ１は、第一のリボ
ソーム結合部位であり、ＳＳ１は、宿主株において作動可能なシグナル配列であ
り、ＶＬは、軽鎖可変領域の種々のセットのメンバーであり、ＣＬは、軽鎖定常
領域であり、停止は、１以上の停止コドンであり、ＰＢＳ２は、第二のリボソー
ム結合部位であり、ＳＳ２は、宿主株において作動可能な第二のシグナル配列で
あり、ＶＨは、重鎖可変領域の種々のセットのメンバーであり、ＣＨ１は、抗体
重鎖の第一の定常領域であり、リンカーは、１〜約５０残基のアミノ酸の配列で
あり、アンカーは、糸状ファージ粒子に構築されるタンパク質であり、そして停
止は、１以上の停止コドンの第二の例である；ならびに
ｂ）ファージの生存性を最大化し、そしてこのカセットまたはその部分の欠失の
可能性を最小化するためにファージゲノム内にカセットを配置する工程。
【０１２６】
上記の好ましいカセット中のアンカータンパク質をコードするＤＮＡは、同じ
（または密接に関連する）アミノ酸配列（ファージのコートタンパク質の１つに
見出されるような）をコードするが、別個のＤＮＡ配列を有するように設計され
る。これは、野生型遺伝子との望まない相同組換えを防止する。さらに、このカ
セットは、遺伝子間領域に配置されるべきである。提示カセットの配置および方
向は、ファージの挙動に影響し得る。
【０１２７】
本発明の１つの実施形態において、転写ターミネーターは、上記の提示カセッ
トの第二の停止（例えば、Ｔｒｐ）の後に配置され得る。これは、提示カセット
とファージ抗体提示ベクター（ＰＡＤＶ）中の他の遺伝子との間の相互作用を減
少させる。
【０１２８】
本発明の方法の別の実施形態において、このファージまたはファージミドは、
Ｆａｂ以外のタンパク質を、他のタンパク質遺伝子で置換することによって、上
記のＦａｂ部分を提示し得る。
【０１２９】
種々の宿主を、本発明の提示ファージまたはファージミドの増殖のために使用
し得る。このような宿主は、当該分野で周知である。好ましい実施形態において
、Ｆａｂが提示される場合、好ましい宿主は３０℃で増殖し、そしてＲｅｃＡ−
（望まない遺伝子組み換えを減少させるため）およびＥｎｄＡ−（ＲＦ ＤＮＡ
の回収を容易化するため）であり得る。エレクトロポレーションによって容易に
形質転換される宿主株もまた好ましい。
【０１３０】
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’は、これらの好ましさのほとんどを満足させるが
、３０℃ではあまり増殖しない。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’は、３８℃でゆっ
くりと増殖し、従って、許容可能な宿主である。ＴＧ−１はまた、中間宿主とし
てより好ましいが、ＲｅｃＡ＋およびＥｎｄＡ＋である。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｍ
ＲＦ’は、ライブラリーの最終構築の前の多様性を蓄積するために使用される中
間宿主としてより好ましい。
【０１３１】
提示後、本発明のライブラリーを、周知かつ慣用的に使用される技術を使用し
てスクリーニングし得る。次いで、選択されたペプチド、ポリペプチドまたはタ
ンパク質を、疾患を処置するために使用し得る。一般に、治療または薬学的組成
物における使用のためのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を、選択され
るライブラリーのメンバーから所望のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質
をコードするＤＮＡを単離することによって生成する。次いで、このＤＮＡを、
慣用的な方法において使用して、適切な宿主細胞、好ましくは、哺乳動物細胞（
例えば、ＣＨＯ細胞）においてコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタン
パク質を生成する。単離後、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を、単独
でか、または疾患を処置するための治療において薬学的に受容可能な組成物と共
に使用する。
【実施例】
【０１３２】
（実施例）
（実施例１：ＢｓｍＡＩを用いるκ鎖の捕捉）
ヒトκ鎖ｍＲＮＡのレパートリーを、種々の自己免疫疾患を有する患者の集団
から単離した総ＲＮＡまたはポリ（Ａ＋）ＲＮＡを仔ウシ腸ホスファターゼで処
理して、例えば、リボソームＲＮＡ、フラグメント化ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび
ゲノムＤＮＡを有する全ての分子から５’−リン酸を除去することによって調製
した。全長のｍＲＮＡ（保護的７−メチルキャップ構造を含む）は、影響されな
い。次いで、ＲＮＡを、タバコ酸ピロホスファターゼで処理して、５’−一リン
酸基を残して全長のｍＲＮＡからキャップ構造を除去する。
【０１３３】
全長のｍＲＮＡを、５’末端でアダプターによって改変し、次いで、逆転写し
、そしてＧｅｎｅｒＲＡＣＥＴＭ方法およびキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を
使用して増幅した。アダプターに相補的な５’ビオチン化プライマー、および構
築物の領域の一部に相補的な３’プライマーを使用した。
【０１３４】
上方の鎖の５’末端にビオチンを結合した約２マイクログラム（μｇ）のヒト
κ鎖（Ｉｇκ）遺伝子ＲＡＣＥ材料を、２００マイクロリットル（μＬ）のＳｅ
ｒａｄｙｎ磁気ビーズ上に固定した。下方の鎖を、２アリコートの２００μＬの
０．１Ｍ ＮａＯＨ（ｐＨ１３）で、第一のアリコートについて３分間、次いで
第二のアリコートについて３０秒間、ＤＮＡを洗浄することによって除去した。
これらのビーズを、２００μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）１００ｍＭ
ＮａＣｌで中和した。表５２５に示した短いオリゴヌクレオチドを、１００μ
ＬのＮＥＢ緩衝液２（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ジチオトレイトール ｐＨ７．９）中に４０倍モル
過剰に、乾燥ビーズに添加した。この混合物を、９５℃で５分間インキュベート
し、次いで、３０分かけて５５℃まで冷却した。過剰なオリゴヌクレオチドを、
ＮＥＢ緩衝液３（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ジチオトレイトール ｐＨ７．９）で２回洗浄して除
去した。１０単位のＢｓｍＡＩ（ＮＥＢ）を、ＮＥＢ緩衝液３に添加し、そして
５５℃で１時間インキュベートした。切断された下流のＤＮＡを、収集し、そし
てＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製カラムで精製した（図３および図４）。
【０１３５】
部分的に二本鎖のアダプターを、表５２５に示したオリゴヌクレオチドを使用
して調製した。このアダプターを、１０００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥ
Ｂ）と共に１００倍モル過剰に一本鎖ＤＮＡに添加し、そして１６℃で一晩イン
キュベートした。過剰なオリゴヌクレオチドを、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製カラ
ムで除去した。この連結材料を、表５２５に示したプライマーｋａｐＰＣＲｔ１
およびｋａｐｆｏｒを使用するＰＣＲによって、表５３０に示したプログラムで
１０サイクル増幅した。
【０１３６】
可溶性ＰＣＲ産物を、ゲルで泳動し、そして予測されるような約７００ｎのバ
ンドを示した（図５および図６）。このＤＮＡを、酵素ＡｐａＬＩおよびＡｓｃ
Ｉで切断し、ゲル精製し、そして同様に切断したベクターｐＣＥＳ１に連結した
。正確なサイズの挿入物の存在を、図１５に示したように、いくつかのクローン
でＰＣＲによってチェックした。
【０１３７】
表５００は、この手順によって捕捉されたκ軽鎖のＤＮＡ配列を示す。表５０
１は、この手順によって捕捉された第二の配列を示す。最も近い架橋配列は、配
列５’−ａｇｃｃａｃｃ−３’に相補的であったが、捕捉された配列は５’−Ｔ
ｇｃｃａｃｃ−３’と読め、これは、重複領域中にいくつかのミスマッチを寛容
したことを示す。
【０１３８】
（実施例２：Ｖ−３−２３ ＶＨフレームワークにおける合成ＣＤＲ１および
ＣＤＲ２の多様性の構築）
合成相補性決定基領域（ＣＤＲ）１および２の多様性を、二段階のプロセスで
３−２３ ＶＨフレームワークにおいて構築した：第一に、３−２３ ＶＨフレ
ームワークを含むベクターを構築し、次いで、合成ＣＤＲ１および２を、構築し
てこのベクター中にクローニングした。
【０１３９】
Ｖ３−２３フレームワークの構築のために、重複する８つのオリゴおよび２つ
のＰＣＲプライマー（表６００に示した長いオリゴヌクレオチド：ＴＯＰＦＲ１
Ａ、ＢＯＴＦＲ１Ｂ、ＢＯＴＦＲ２、ＢＯＴＦＲ３、Ｆ０６、ＢＯＴＦＲ４、Ｏ
Ｎ−ｖｇＣ１、およびＯＮ−ｖｇＣ２ならびにプライマー：ＳＦＰＲＥＭＴおよ
びＢＯＴＰＣＲＰＲＩＭ）を、Ｖ３２３ ＶＨのＧｅｎｂａｎｋの配列に基づい
て設計した。この設計は、表６００に示されるような、各々のフレームワークに
おける少なくとも１つの有用な制限部位を取り込んだ。表６００において、合成
された断片を太字として示し、重複する領域に下線を付し、そして各末端でのＰ
ＣＲプライマー領域に下線を付した。これら８つのオリゴの混合物を、２０μｌ
のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応中の２．５μＭの最終濃度で組み合わせ
た。このＰＣＲ混合物は、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０
．０２Ｕ Ｐｆｕ ＴｕｒｂｏＴＭＤＮＡポリメラーゼ、１Ｕ Ｑｉａｇｅｎ
ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、および１×Ｑｉａｇｅｎ
ＰＣＲ緩衝液を含んだ。このＰＣＲプログラムは、９４℃で３０秒、５５℃で３
０秒、および７２℃で３０秒の１０サイクルからなった。次いで、１００μｌ
ＰＣＲ反応における最初のＰＣＲからの１０倍希釈の２．５μｌを使用して、構
築されたＶ３−２３ ＤＮＡ配列を増幅した。このＰＣＲ反応は、２００μＭ
ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２Ｕ Ｐｆｕ ＴｕｒｂｏＴＭＤＮ
Ａポリメラーゼ、１Ｕ Ｑｉａｇｅｎ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ポ
リメラーゼ、１×Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ緩衝液、および１μＭの濃度での２つの
外側のプライマー（ＳＦＰＲＭＥＴおよびＢＯＴＰＣＲＰＲＩＭ）を含んだ。こ
のＰＣＲプログラムは、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で６０
秒の２３サイクルからなった。このＶ３−２３ ＶＨ ＤＮＡ配列を、設計し、
そしてＳｆｉＩおよびＢｓｔＥＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を使用してｐＣ
ＥＳ１（ファスミドベクター）にクローニングした（本明細書中で記載した全て
の制限酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍ
Ａによって供給され、そして製造業者の指示通りに使用した）。
【０１４０】
ＣＤＲ１／ＣＤＲ２多様性のクローニング前に、スタッファー（ｓｔｕｆｆｅ
ｒ）配列（表６１０および表６２０に示す）を、ｐＣＥＳ１に導入してＣＤＲ１
／ＣＤＲ２配列（ＢｓｐＥＩ制限酵素部位とＸｂａＩ制限酵素部位との間の９０
０塩基）およびＣＤＲ３配列（ＡｆｌＩＩとＢｓｔＥＩＩとの間の３５８塩基）
を置換した。新規のベクターは、ｐＣＥＳ５であり、そしてその配列を、表６２
０に与える。ＣＤＲの代わりにスタッファーを有することは、親配列がライブラ
リーにおいて過剰に提示される危険性を回避する。このＣＤＲ１−２スタッファ
ーは、ＢｇｌＩＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｃｌＩ、ＸｃｍＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩＩ
、ＨｐａＩおよびＨｉｎｃＩＩについての制限部位、ベクターｐＣＥＳ５内に独
自である、強調された領域を含む。ＣＤＲ３を置換するこのスタッファーは、独
自の制限エンドヌクレアーゼ部位、ＲｓｒＩＩを含む。このスタッファー配列は
、Ｅ．ｃｏｌｉのペニシリン遺伝子由来のフラグメントである。
【０１４１】
ＣＤＲ１およびＣＤＲ２多様性の構築のために、ＣＤＲ１／２および隣接領域
をコードする４つの重複オリゴヌクレオチド（表６００および表６３０に示した
ＯＮ−ｖｇＣ１、ＯＮ＿Ｂｒ１２、ＯＮ＿ＣＤ２Ｘｂａ、およびＯＮ−ｖｇＣ２
）を設計した。これら４つのオリゴの混合物を、４０μｌ ＰＣＲ反応物中２．
５μＭの最終濃度で組み合わせた。４つのオリゴのうち２つは、ＣＤＲ１および
ＣＤＲ２に位置する、変化させた配列を含んだ。このＰＣＲ混合物は、２００μ
Ｍ ｄＮＴＰ、２．５Ｕ Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、および
２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む１×Ｐｗｏ ＰＣＲ緩衝液を含んだ。このＰＣＲプロ
グラムは、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で６０秒の１０サイ
クルからなった。これは、１００μｌ ＰＣＲ反応物中の２．５μｌの混合物を
使用して、増幅されたＣＤＲ１／２ ＤＮＡ配列を構築した。このＰＣＲ反応物
は、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５Ｕ Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、２ｍＭ
ＭｇＳＯ４を含む１×Ｐｗｏ ＰＣＲ緩衝液、および１μＭの濃度で２つの外側
のプライマーを含んだ。このＰＣＲプログラムは、９４℃で３０秒、６０℃で３
０秒、および７２℃で６０秒の１０サイクルからなった。これらの変化された配
列を、消化し、そしてＣＤＲ１／２スタッファーの代わりにＶ３−２３フレーム
ワーク中にクローニングした。
【０１４２】
本発明者らは、約７×１０７の独立形質転換体を得た。この多様性に、本発明
者らは、ドナー集団または合成ＤＮＡのいずれかからＣＤＲ３多様性をクローニ
ングし得る。
【０１４３】
上記は、本発明の原理を例示するのみであり、そして本発明の範囲および精神
から逸脱することなく当業者によって種々の改変がなされ得ることが理解される。
【０１４４】
【表１−１】
【０１４５】
【表１−２】
【０１４６】
【表２−１】
【０１４７】
【表２−２】
【０１４８】
【表３−１】
【０１４９】
【表３−２】
【０１５０】
【表３−３】
【０１５１】
【表４−１】
【０１５２】
【表４−２】
【０１５３】
【表５】
【０１５４】
【表６−１】
【０１５５】
【表６−２】
【０１５６】
【表６−３】
【０１５７】
【表６−４】
【０１５８】
【表６−５】
【０１５９】
【表７−１】
【０１６０】
【表７−２】
【０１６１】
【表７−３】
【０１６２】
【表７−４】
【０１６３】
【表７−５】
【０１６４】
【表８】
【０１６５】
【表９−１】
【０１６６】
【表９−２】
【０１６７】
【表１０】
【０１６８】
【表１１−１】
【０１６９】
【表１１−２】
【０１７０】
【表１１−３】
【０１７１】
【表１１−４】
【０１７２】
【表１１−５】
【０１７３】
【表１１−６】
【０１７４】
【表１１−７】
【０１７５】
【表１１−８】
【０１７６】
【表１１−９】
【０１７７】
【表１１−１０】
【０１７８】
【表１１−１１】
【０１７９】
【表１１−１２】
【０１８０】
【表１１−１３】
【０１８１】
【表１１−１４】
【０１８２】
【表１１−１５】
【０１８３】
【表１１−１６】
【０１８４】
【表１１−１７】
【０１８５】
【表１１−１８】
【０１８６】
【表１２−１】
【０１８７】
【表１２−２】
【０１８８】
【表１２−３】
【０１８９】
【表１２−４】
【０１９０】
【表１２−５】
【０１９１】
【表１２−６】
【０１９２】
【表１２−７】
【０１９３】
【表１２−８】
【０１９４】
【表１２−９】
【０１９５】
【表１３】
【０１９６】
【表１４−１】
【０１９７】
【表１４−２】
【０１９８】
【表１４−３】
【０１９９】
【表１５−１】
【０２００】
【表１５−２】
【０２０１】
【表１５−３】
【０２０２】
【表１５−４】
【０２０３】
【表１５−５】
【０２０４】
【表１５−６】
【０２０５】
【表１５−７】
【０２０６】
【表１５−８】
【０２０７】
【表１５−９】
【０２０８】
【表１６−１】
【０２０９】
【表１６−２】
【０２１０】
【表１６−３】
【０２１１】
【表１６−４】
【０２１２】
【表１７】
【０２１３】
【表１８−１】
【０２１４】
【表１８−２】
【０２１５】
【表１８−３】
【０２１６】
【表１９−１】
【０２１７】
【表１９−２】
【０２１８】
【表１９−３】
【０２１９】
【表１９−４】
【０２２０】
【表１９−５】
【０２２１】
【表１９−６】
【０２２２】
【表１９−７】
【０２２３】
【表１９−８】
【０２２４】
【表２０−１】
【０２２５】
【表２０−２】
【０２２６】
【表２０−３】
【０２２７】
【表２１−１】
【０２２８】
【表２１−２】
【０２２９】
【表２１−３】
【０２３０】
【表２１−４】
【０２３１】
【表２１−５】
【０２３２】
【表２２−１】
【０２３３】
【表２２−２】
【０２３４】
【表２２−３】
【０２３５】
【表２３−１】
【０２３６】
【表２３−２】
【０２３７】
【表２３−３】
【０２３８】
【表２３−４】
【０２３９】
【表２３−５】
【０２４０】
【表２４−１】
【０２４１】
【表２４−２】
【０２４２】
【０２４３】
【表２５−１】
【０２４４】
【表２５−２】
【０２４５】
【表２６】
【０２４６】
【表２７−１】
【０２４７】
【表２７−２】
【０２４８】
【表２７−３】
【０２４９】
【表２７−４】
【０２５０】
【表２７−５】
【０２５１】
【表２７−６】
【０２５２】
【表２７−７】
【０２５３】
【表２７−８】
【０２５４】
【表２７−９】
【０２５５】
【表２７−１０】
【０２５６】
【表２７−１１】
【０２５７】
【表２７−１２】
【０２５８】
【表２７−１３】
【０２５９】
【表２７−１４】
【０２６０】
【表２８−１】
【０２６１】
【表２８−２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメ
ンバーを提示し、そしてこのファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提
示する、遺伝的パッケージのライブラリーを構築することに関する。好ましい実
施形態では、提示されるポリペプチドはヒトＦａｂである。
【０００２】
より詳細には、本発明は、一本鎖核酸を選択された位置で切断する方法に関し
、この切断された核酸は、本発明のライブラリーの遺伝的パッケージ上に提示さ
れたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を少なくとも部分的にコードする
。好ましい実施形態では、この遺伝的パッケージは、糸状ファージまたはファー
ジミドである。
【０００３】
本発明はさらに、有用なペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を提示する
遺伝的パッケージのライブラリーをスクリーニングする方法、ならびにこのよう
なスクリーニングによって同定されたペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質
に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提
示し、そしてこのファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示する、遺
伝的パッケージのライブラリーを調製することは現在、当該分野において一般的
な方法である。多くの通常のライブラリーでは、提示されるペプチド、ポリペプ
チドまたはタンパク質は、抗体に関連する。しばしば、これらはＦａｂまたは単
鎖抗体である。
【０００５】
一般に、提示されるべきファミリーのメンバーをコードするＤＮＡは、クロー
ニングされて遺伝的パッケージの表面に所望のメンバーを提示するように使用さ
れる前に増幅されなければならない。このような増幅は代表的に、正方向プライ
マーおよび逆方向プライマーを利用する。
【０００６】
このようなプライマーは、増幅されるべきＤＮＡに対してネイティブな配列に
対して相補的であり得るか、またはそのＤＮＡの５’末端もしくは３’末端に結
合したオリゴヌクレオチドに対して相補的であり得る。増幅されるべきＤＮＡに
対してネイティブである配列に相補的であるプライマーは、提示されるべきファ
ミリーのメンバーを偏らせるという点で不利である。ネイティブなＤＮＡ中にこ
のプライマーに対して実質的に相補的である配列を含むメンバーのみが増幅され
る。そうでないメンバーはこのファミリーから存在しなくなる。増幅されるメン
バーについては、プライマー領域内の何らかの多様性が抑制される。
【０００７】
例えば、特許文献１では、使用されるプライマーは、抗体遺伝子のＶＨ領域の５’末端に存在する。これは、ネイティブなＤＮＡ中の、単一種内で「充分によく保存された」と呼ばれる配列領域にアニーリングする。このようなプライマーは、増幅されるメンバーを、この「保存された」領域を有するメンバーに偏らせる。この領域内の何らかの多様性は失われる。
【０００８】
ヒトの抗体遺伝子が、ＶおよびＪ、またはＶ、ＤおよびＪの組合せ選択、続い
て体細胞変異を含むプロセスを通して生じることが一般に受け入れられている。
大部分の多様性は相補性決定領域（ＣＤＲ）に生じるが、多様性はまた、より保
存されたフレームワーク領域（ＦＲ）において生じ、そしてこの多様性の少なく
ともいくつかは、抗原（Ａｇ）に対する特異的結合を付与または増強する。その
結果、ライブラリーは、可能な限り多くのＣＤＲおよびＦＲ多様性を含むべきで
ある。
【０００９】
コードするペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の遺伝的パッケージ上で
の提示のために、増幅されたＤＮＡをクローニングするために、ＤＮＡは、ベク
ターへの連結のために適切な末端を生じるように切断されなければならない。こ
のような切断は一般に、プライマーに保有された制限エンドヌクレアーゼ認識部
位を用いてもたらされる。ＲＮＡの逆転写から生成されるＤＮＡの５’末端にプ
ライマーが存在する場合、このような制限処理は、増幅されたＤＮＡ中に有害な
５’非翻訳領域を残す。これらの領域は、クローニングされた遺伝子の発現を妨
害し、従って、これらによってコードされるペプチド、ポリペプチドおよびタン
パク質の提示を妨害する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】欧州特許第３６８，６８４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明の目的は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリ
ーのメンバーを提示し、そしてこのファミリーの多様性の少なくとも一部を集合
的に提示する、遺伝的パッケージのライブラリーを構築するための新規方法を提
供することである。これらの方法は、増幅のために用いられるプライマーに相補
的であるネイティブな配列を含むＤＮＡには偏っていない。これらの方法はまた
、発現に有害であり得る任意の配列が、クローニングおよび提示の前に、増幅さ
れたＤＮＡから除去されることを可能にする。
【００１２】
本発明の別の目的は、一本鎖核酸配列を所望の位置で切断するための方法を提
供することであり、この方法は、以下の工程を包含する：
（ｉ）この核酸を一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、この
オリゴヌクレオチドは、切断が所望される領域においてこの核酸に機能的に相補
的であり、そしてその核酸中の相補体とともに、制限処理の際に所望の位置での
核酸の切断をもたらす制限エンドヌクレアーゼ認識部位を形成する配列を含む、
工程；および
（ｉｉ）この核酸のみを、この核酸とこのオリゴヌクレオチドとの相補によっ
て形成された認識部位で切断する工程；
接触工程および切断工程は、実質的に一本鎖形態の核酸を維持するに充分な温度
で行われ、このオリゴヌクレオチドは、二本の鎖が会合し、その結果、選択され
た温度および所望の位置で切断が生じ得るのを可能にするに充分に大きな領域に
わたってこの核酸に対して機能的に相補的であり、そして切断は、選択された温
度で活性である制限エンドヌクレアーゼを用いて行われる。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、一本鎖核酸配列を所望の位置で切断するための代替
的な方法を提供することであり、この方法は以下の工程を包含する：
（ｉ）この核酸を部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であ
って、このオリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される領域において
この核酸に機能的に相補的であり、そしてこのオリゴヌクレオチドの二本鎖領域
は、ＩＩ−Ｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、その切断部位は、この
認識部位から既知の距離に位置する、工程；および
（ｉｉ）この核酸のみを、この核酸とこのオリゴヌクレオチドの一本鎖領域と
の相補によって形成された切断部位で切断する工程；
接触工程および切断工程は、実質的に一本鎖形態の核酸を維持するに充分な温度
で行われ、このオリゴヌクレオチドは、二本の鎖が会合し、その結果、選択され
た温度および所望の位置で切断が生じ得るのを可能にするに充分に大きな領域に
わたってこの核酸に対して機能的に相補的であり、そして切断は、選択された温
度で活性である制限エンドヌクレアーゼを用いて行われる。
【００１４】
本発明の別の目的は、ＤＮＡの多様なファミリーのメンバーを含み、そしてこ
のファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に含む、ＤＮＡ分子を捕獲する
方法を提供することである。一本鎖形態のこれらのＤＮＡ分子は、本発明の方法
のうちの１つによって切断されている。この方法は、このファミリーの個々の一
本鎖ＤＮＡメンバーを、部分的に二重鎖のＤＮＡ複合体に連結することを含む。
この方法は以下の工程を包含する：
（ｉ）制限エンドヌクレアーゼで切断された一本鎖核酸配列を、部分的に二本
鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、このオリゴヌクレオチドの
一本鎖領域は、切断後に残る領域においてこの核酸に対して機能的に相補的であ
り、このオリゴヌクレオチドの二本鎖領域は、切断後に残っている配列を、発現
に適切なリーディングフレームに戻すために必要な任意の配列を含み、そしてこ
れらの配列の５’側に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、工程；および
（ｉｉ）この部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド配列のみを、この部分的に
二本鎖のオリゴヌクレオチドの二本鎖領域内に含まれる制限エンドヌクレアーゼ
認識部位で切断する工程。
【００１５】
本発明の別の目的は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファ
ミリーを提示し、そしてこのファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提
示する、ライブラリーを、上記の方法およびＤＮＡを用いて調製することである
。
【００１６】
本発明の目的は、これらのライブラリーをスクリーニングして、有用なペプチ
ド、ポリペプチドおよびタンパク質を同定し、そしてこれらの物質をヒトの治療
において使用することである。たとえば、本発明は以下を提供する：
（項目１） 一本鎖核酸配列を所望の位置で切断するための方法であって、
該方法は、以下の工程：
（ｉ）該核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オ
リゴヌクレオチドは、切断が所望される領域において該核酸に対して機能的に相
補的であり、そして制限の際に該核酸の該所望の位置での切断を生じる制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位を、その補体を用いて該核酸中に形成する配列を含む、
工程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの相補性によって形成される該認
識部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含し、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持
するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該
温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするた
めに十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択さ
れた温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、
方法。
（項目２） 一本鎖核酸配列を所望の位置で切断するための方法であって、
該方法は、以下の工程：
（ｉ）該核酸を、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であ
って、該オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される該領域において
該核酸に対して機能的に相補的であり、そして該オリゴヌクレオチドの二本鎖領
域は、ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、該切断部位は、該認
識部位から既知の距離に位置する、工程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの該一本鎖領域の相補性によって
形成されるＩＩ型−Ｓ切断部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含し、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持
するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該
温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするた
めに十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択さ
れた温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、
方法。
（項目３） 遺伝的パッケージの表面上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する方法であって、改善が、提示されるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の少なくとも一部が、
以下の工程：
（ｉ）核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オリ
ゴヌクレオチドは、切断が所望される領域において該核酸に対して機能的に相補
的であり、そして制限の際に該核酸の所望の位置での切断を生じる制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位を、その補体を用いて該核酸中に形成する配列を含む、工程
；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの相補性によって形成される該認
識部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含する方法によって所望の位置で切断される該核酸によって、少なくとも一
部がコードされることを特徴とし、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実
質的に一本鎖形態で維持するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチド
は、切断が選択された該温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の
鎖の会合を可能にするために十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的
であり、そして該選択された温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用し
て、該切断が行われる、方法。
（項目４） 遺伝的パッケージの表面上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する方法であって、改善が、提示されるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、以下の工程：
（ｉ）該核酸を、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であ
って、該オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される領域において該
核酸に対して機能的に相補的であり、該オリゴヌクレオチドの該二本鎖領域は、
ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、該切断部位は、該認識部位
から既知の距離に位置する、工程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの該一本鎖領域の相補性によって
形成されるＩＩ型−Ｓ切断部位で、該核酸を単独で切断する工程；
によって所望の位置で切断される核酸を含むＤＮＡ配列によってコードされるこ
とを特徴とし、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で
維持するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択され
た該温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にす
るために十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選
択された温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われ
る、方法。
（項目５） 遺伝的パッケージの表面上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する方法であって、
該方法は、以下の工程：
（ｉ）該多種多様なファミリーのメンバーの少なくとも一部をコードする核酸
の収集物を調製する工程；
（ｉｉ）該核酸を一本鎖にする工程；
（ｉｉｉ）以下の工程：
（ａ）該核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該
オリゴヌクレオチドは、切断が所望される領域において該核酸に対して機能的に
相補的であり、そして制限の際に該核酸の所望の位置での切断を生じる制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位を、その補体を用いて該核酸中に形成する配列を含む、
工程；および
（ｂ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの相補性によって形成される該認
識部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含する方法によって、所望の位置で該一本鎖核酸を切断する工程であって
、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するため
に十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度およ
び該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分
大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度
で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、工程；な
らびに
（ｉｖ）該遺伝的パッケージの該表面上の該切断された核酸によって少なくと
も一部がコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の該ファミリー
のメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの該多様性の少なくとも一
部を提示する工程、
を包含する、方法。
（項目６） 遺伝的パッケージの表面上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する方法であって、
該方法は、以下の工程：
（ｉ）該多種多様なファミリーのメンバーの少なくとも一部をコードする核酸
の収集物を調製する工程；
（ｉｉ）該核酸を一本鎖にする工程；
（ｉｉｉ）以下の工程：
（ａ）該核酸を、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程で
あって、該オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される領域において
該核酸に対して機能的に相補的であり、該オリゴヌクレオチドの該二本鎖領域は
、ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、該切断部位は、該認識部
位から既知の距離に位置する、工程；および
（ｂ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの該一本鎖領域の相補性によって
形成されるＩＩ型−Ｓ切断部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含する方法によって、所望の位置で該一本鎖核酸を切断する工程であって
、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するため
に十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度およ
び該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分
大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度
で活性である切断エンドヌクレアーゼを使用して、該制限が行われる、工程；な
らびに；
（ｉｖ）該遺伝的パッケージの該表面上の該切断された核酸によって少なくと
も一部がコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の該ファミリー
のメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部
を提示する工程、
を包含する、方法。
（項目７） ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示する遺伝的パッケージの収集物を含に、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示するライブラリーであって、該ライブラリーは、項目３、４、５または６に記載の方法を使用して作製される、ライブラリー。
（項目８） ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの少なくとも一部を提示する遺伝的パッケージの収集物を含むライブラリーであって、該提示されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、以下の工程：
（ｉ）該核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オ
リゴヌクレオチドは、切断が所望される領域において該核酸に対して機能的に相
補的であり、そして制限の際に該核酸の所望の位置での切断を生じる制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位を、その補体を用いて該核酸中に形成する配列を含む、工
程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの相補性によって形成される該認
識部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含する方法によって、所望の位置で一本鎖核酸配列を切断することによって
生成される配列の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列によってコードされ、該接触
工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するために十分な
温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度および該所望
の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分大きな領
域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度で活性で
ある制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、ライブラリー。
（項目９） ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該提示されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する遺伝的パッケージの収集物を含むライブラリーであって、該提示されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、以下の工程：
（ｉ）該核酸を、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であ
って、該オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される領域において該
核酸に対して機能的に相補的であり、該オリゴヌクレオチドの該二本鎖領域は、
ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、該切断部位は、該核酸の該
切断が所望される該認識部位から既知の距離に位置する、工程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの該一本鎖領域の相補性によって
形成されるＩＩ型−Ｓ切断部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含する方法によって、所望の位置で一本鎖核酸配列を切断することによって
生成される配列の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列によってコードされ、該接触
工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するために十分な
温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度および該所望
の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分大きな領
域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度で活性で
ある制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、ライブラリー。
（項目１０） 前記核酸が、免疫グロブリンの少なくとも一部をコードする、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１） 前記免疫グロブリンが、Ｆａｂまたは単鎖Ｆｖを含む、請求項１０に記載の方法。
（項目１２） 前記免疫グロブリンが、重鎖の少なくとも部分を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
（項目１３） 前記重鎖の少なくとも一部がヒトである、項目１２に記載の方法。
（項目１４） 前記免疫グロブリンが、ＦＲ１の少なくとも一部を含む、
項目１０または１１に記載の方法。
（項目１５） 前記ＦＲ１の少なくとも一部がヒトである、項目１４に記載の方法。
（項目１６） 前記免疫グロブリンが、軽鎖の少なくとも一部を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
（項目１７） 前記軽鎖の少なくとも一部がヒトである、項目１６に記載の方法。
（項目１８） 前記核酸配列の少なくとも一部が、少なくとも１つの自己免疫疾患および／または癌に罹患した患者由来である、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９） 前記自己免疫疾患が、狼瘡、エリテマトーデス、全身性硬化症、慢性関節リウマチ、抗リン脂質症候群、または脈管炎からなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０） 前記核酸の少なくとも一部が、末梢血球、骨髄細胞、脾臓細胞またはリンパ節細胞からなる群から単離される、項目１８に記載の方法。
（項目２１） さらに、核酸の増幅工程を、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間、工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）との間、または工程（ｉｉｉ）と工程（ｉｖ）との間に包含する、項目５または６に記載の方法。
（項目２２） 前記増幅工程が、ｇｅｎｅＲＡＣＥＴＭを使用する、請求項２１に記載の方法。
（項目２３） 前記温度が、４５℃と７５℃との間である、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４） 前記温度が、５０℃と６０℃との間である、項目２３に記載の方法。
（項目２５） 前記温度が、５５℃と６０℃との間である、項目２４に記載の方法。
（項目２６） 前記一本鎖オリゴヌクレオチドの長さが、１７塩基と３０塩基との間である、項目１、３、５または８に記載の方法。
（項目２７） 前記一本鎖オリゴヌクレオチドの長さが、１８塩基と２４塩基との間である、項目２６に記載の方法。
（項目２８） 前記制限エンドヌクレアーゼが、ＭａｅＩＩＩ、Ｔｓｐ４５１、ＨｐｈＩ、ＢｓａＪＩ、ＡｌｕＩ、ＢｌｐＩ、ＤｄｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＭｓｌＩ、ＢｓｉＥＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、ＨａｅＩＩＩ、Ｂｓｔ４ＣＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＭｌｙＩ、ＰｌｅＩ、ＭｎｌＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＢｓｍＡＩ、ＢｐｍＩ、ＸｍｎＩ、またはＳａｃＩからなる群から選択される、
項目１、３、５または８に記載の方法。
（項目２９） 前記制限エンドヌクレアーゼが、Ｂｓｔ４ＣＩ、ＴａａＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＢｌｐＩ、ＨｐｙＣＨ４ＶまたはＭｓｌＩを含む群から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖領域の長さが、１４塩基と２２塩基との間である、項目２、４、６または９に記載の方法。
（項目３１） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖領域の長さが、１４塩基と１７塩基との間である、項目３０に記載の方法。
（項目３２） 前記オリゴヌクレオチドの前記一本鎖領域の長さが、１８塩基と２０塩基との間である、項目３１に記載の方法。
（項目３３） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記二本鎖領域の長さが、幹およびそのパリンドロームによって形成される１０塩基対と１４塩基対との間である、項目２、４、６または９に記載の方法。
（項目３４） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドが、前記幹と前記パリンドロームとの間に、３〜８塩基のループを含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５） 前記ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼが、ＡａｒＩＣＡＣ、ＡｃｅＩＩＩ、Ｂｂｒ７Ｉ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、Ｂｃｅ８３１、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｉＩ、ＢｉｎＩ、ＢｓｃＡＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＧｓｕＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＰｌｅＩ、ＲｌｅＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｓｐＤ５Ｉ、Ｓｔｈｌ３２Ｉ、ＳｔｓＩ、ＴａｑＩＩ、Ｔｔｈ１１１ＩＩ、またはＵｂａＰＩを含む群から選択される、請求項２、４、６または９に記載の方法。
（項目３６） 前記ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼが、ＦｏｋＩである、項目３５に記載の方法。
（項目３７） ベクターにクローニングするための一本鎖核酸を調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）制限エンドヌクレアーゼで切断された一本鎖核酸配列を、部分的に二本
鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オリゴヌクレオチドの一
本鎖領域は、切断の後に残る領域において該核酸と機能的に相補的であり、該オ
リゴヌクレオチドの該二本鎖領域は、発現のために切断後に残る配列を適切かつ
本来のリーディングフレームに戻すのに必要とされる任意の配列を含み、そして
これらの配列の制限エンドヌクレアーゼ認識部位５’を含む、工程；および
（ｉｉ）該部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの該二本鎖領域内に含まれる
該制限エンドヌクレアーゼ認識部位で、単独で該部分的に二本鎖のオリゴヌクレ
オチド配列を切断する工程、
を包含する、方法。
（項目３８） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖部分の長さが、２塩基と１５塩基との間である、項目３７に記載の方法。
（項目３９） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖部分の長さが、７塩基と１０塩基との間である、項目３８に記載の方法。
（項目４０） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記二本鎖部分の長さが、１２塩基対と１００塩基対との間である、項目３７に記載の方法。
（項目４１） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記二本鎖部分の長さが、２０塩基対と１００塩基対との間である、項目４０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＶＨ配列に特異的なプライマーを用いることなくＶＨ遺伝子を増幅するために用いられ得る種々の方法の模式図である。
【図２】図２は、ＶＬ配列を用いることなくＶＬ遺伝子を増幅するために用いられ得る種々の方法の模式図である。
【図３】図３は、実施例２からの切断されたκＤＮＡのゲル分析を示す。
【図４】図４は、実施例２からの切断されたκＤＮＡのゲル分析を示す。
【図５】図５は、実施例２からの増幅されたκＤＮＡのゲル分析を示す。
【図６】図６は、実施例２からの、ゲル精製された増幅されたκＤＮＡを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（用語）
この出願では、以下の用語および略号を用いる：
センス鎖：通常記載されるように、ｄｓ ＤＮＡの上の鎖（ｕｐｐｅｒ ｓｔ
ｒａｎｄ）。センス鎖では、５’−ＡＴＧ−３’はＭｅｔをコードする。
【００１９】
アンチセンス鎖：通常記載されるように、ｄｓ ＤＮＡの下の鎖（ｌｏｗｅｒ
ｓｔｒａｎｄ）。アンチセンス鎖では、３’−ＴＡＣ−５’は、センス鎖にお
けるＭｅｔコドンに対応する。
【００２０】
正方向（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー：「正方向」プライマーは、センス鎖の
一部に対して相補的であり、そして新たなアンチセンス鎖分子の合成を開始する
。「正方向プライマー」および「下の鎖のプライマー」は等価である。
【００２１】
逆方向（ｂａｃｋｗａｒｄ）プライマー：「逆方向」プライマーは、アンチセ
ンス鎖の一部に対して相補的であり、そして新たなセンス鎖分子の合成を開始す
る。「逆方向プライマー」および「上の鎖のプライマー」は等価である。
【００２２】
塩基：塩基は、コドンおよび塩基による遺伝子内のそれらの位置として、ベク
ターまたは遺伝子のいずれかにおけるそれらの位置によって特定される。例えば
、「８９．１」は、コドン８９の最初の塩基であり、８９．２は、コドン８９の
二番目の塩基である。
【００２３】
Ｓｖ：ストレプトアビジン。
【００２４】
Ａｐ：アンピシリン。
【００２５】
ａｐＲ：アンピシリン耐性を付与する遺伝子。
【００２６】
ＲＥ：制限エンドヌクレアーゼ。
【００２７】
ＵＲＥ：一般的な制限エンドヌクレアーゼ。
【００２８】
機能的に相補的：２つの配列が、選択された条件下でアニールするように十分
に相補的である。
【００２９】
ＲＥＲＳ：制限エンドヌクレアーゼ認識部位。
【００３０】
ＡＡ：アミノ酸。
【００３１】
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応。
【００３２】
ＧＬＧ：生殖系列遺伝子。
【００３３】
Ａｂ：抗体：免疫グロブリン。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメイン
に相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質をカバーする。この定義内
の抗体のいくつかの例は、特に、免疫グロブリンンアイソタイプならびにＦａｂ
、Ｆ（ａｂ１）２、ｓｃｆｖ、Ｆｖ、ｄＡｂおよびＦｄフラグメント。
【００３４】
Ｆａｂ：Ａｂの軽鎖および重鎖の部分を含む二鎖分子。
【００３５】
ｓｃＦｖ：ＶＨ：：リンカー：：ＶＬまたはＶＬ：：リンカーＶＨのいずれか
を含む単鎖Ａｂ。
【００３６】
ｗ．ｔ．：野生型。
【００３７】
ＨＣ：重鎖。
【００３８】
ＬＣ：軽鎖。
【００３９】
ＶＫ：κ軽鎖の可変領域。
【００４０】
ＶＨ：重鎖の可変領域。
【００４１】
ＶＬ：λ軽鎖の可変領域。
【００４２】
本願において、参照される全ての参考文献は、参考として詳細に援用される。
【００４３】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の方法において有用である核酸配列（すなわち、本発明の遺伝子パッケ
ージに関して示される、少なくとも一部の個々のペプチド、ポリペプチドおよび
タンパク質）は、天然に存在する配列、合成配列またはその組み合わせであり得
る。これらは、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。好ましい実施形態
において、核酸は抗体をコードする。最も好ましくは、これらはＦａｂをコード
する。
【００４４】
本発明において有用な核酸は、天然に多様性であり、合成多様性は、これらの
天然に多様性のメンバーに導入され得るか、またはこの多様性は、全体的に合成
であり得る。例えば、合成多様性は、抗体遺伝子の１つ以上のＣＤＲに導入され
得る。
【００４５】
合成多様性は、例えば、ＴＲＩＭ技術（米国特許第５，８６９，６４４号）の
使用を介して作製され得る。ＴＲＩＭ技術は、変化される位置で、どのアミノ酸
型が可能で、そしてどんな割合でかを正確に制御することが可能である。ＴＲＩ
Ｍ技術において、多様化されるコドンは、三ヌクレオチドの混合物を使用して合
成される。これは、任意の組のアミノ酸型が、任意の位置に含まれるのを可能に
する。
【００４６】
多様化されたＤＮＡを作製するために使用され得る別の代替法は、混合オリゴ
ヌクレオチド合成である。ＴＲＩＭ技術を用いて、ＡｌａおよびＴｒｐが可能で
あり得る。混合オリゴヌクレオチド合成を用いて、ＡｌａおよびＴｒｐを含む混
合物はまた、ＳｅｒおよびＧｌｙもまた必然的に含む。変性された位置において
可能なアミノ酸型は、抗体の構造、または他のペプチド、ファミリーのポリペプ
チドまたはタンパク質、生殖系列遺伝子において観察された多様性、頻繁に観察
される観察された体細胞変異、および変性の所望の領域および型を参照して選択
される。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態において、ファミリーのペプチド、ポリペプチドま
たはタンパク質の少なくとも１つのＣＤＲまたは他の領域の核酸配列は、ｍＲＮ
Ａからの逆転写によって生成されたｃＤＮＡである。より好ましくは、ｍＲＮＡ
は、関連遺伝子の天然に多様性の組のメンバーを発現する末梢血液細胞、骨髄細
胞、脾臓細胞またはリンパ節細胞（例えば、Ｂリンパ球細胞またはプラズマ細胞
）から得られ得る。より好ましくは、ｍＲＮＡは、抗体の多様なファミリーをコ
ードする。最も好ましくは、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの自己免疫障害または
癌に罹患する患者から得られる。好ましくは、自己免疫疾患（例えば、全身性エ
リテマトーデス、全身性硬化症、慢性関節リウマチ、抗リン脂質症候群および脈
管炎）の高い多様性を含むｍＲＮＡが使用される。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態において、ｃＤＮＡは、逆転写を使用してｍＲＮＡ
から生成される。この好ましい実施形態において、ｍＲＮＡは、細胞から分離さ
れ、標準的な方法を使用して分解され、その結果、全長（すなわち、キャップさ
れた）ｍＲＮＡのみが残る。次いで、キャップは除去され、そしてｃＤＮＡを生
成するために逆転写が使用される。
【００４９】
第１（アンチセンス）鎖の逆転写は、任意の適切なプライマーを用いて任意の
様式で行なわれ得る。例えば、ＨＪ ｄｅ Ｈａａｒｄら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４（２６）：１８２１８
−３０（１９９９）を参照のこと。ｍＲＮＡが抗体をコードする本発明の好まし
い実施形態において、抗体遺伝子の定常領域に相補的なプライマーが使用され得
る。これらのプライマーは有用である。なぜなら、これらは、抗体のサブクラス
に対して偏りを生じないためである。別の実施例において、ポリｄＴプライマー
が使用され得る（そして重鎖遺伝子に対して好ましくあり得る）。あるいは、プ
ライマーに相補的な配列は、アンチセンス鎖の末端に付加され得る。
【００５０】
本発明の１つの好ましい実施形態において、逆転写プライマーは、ビオチン化
プライマーであり得、従って、ｃＤＮＡ産物がストレプトアビジン（Ｓｖ）ビー
ズに固定されるのを可能にする。固定化はまた、ａ）遊離アミノ基、ｂ）チオー
ル、ｃ）カルボン酸、またはｄ）不溶性媒体の既知のパートナーに対して強力な
結合を形成するように反応し得るＤＮＡにおいて見出されない別の基、のうちの
１つを用いて５’末端において標識されたプライマーを使用して行なわれ得る。
例えば、遊離アミン（好ましくは、主にアミン）が、ＤＮＡプライマーの５’末
端において提供される場合、このアミンは、標準的なアミド形成化学を使用して
、ポリマービーズ上のカルボン酸と反応され得る。このような好ましい固定が、
逆転写の間に使用される場合、上方鎖ＲＮＡは、固定の前または後に、周知の酵
素（例えば、ＲＮＡｓｅＨおよびＲＮＡｓｅＡの組み合わせ）を使用して分解さ
れる。
【００５１】
本発明において有用な核酸配列は、一般に、これらがコードするペプチド、ポ
リペプチド、またはタンパク質を表示するために使用される前に増幅される。増
幅の前に、一本鎖ＤＮＡは、前に記載された方法のいずれかを使用して切断され
得る。あるいは、一本鎖ＤＮＡは増幅され得、次いで、これらの方法のうちの１
つを使用して切断される。
【００５２】
核酸配列を増幅するための周知の方法のいずれかが、このような増幅のために
使用され得る。多様性を最大化し、偏らせない方法が好ましい。核酸配列が、抗
体遺伝子に由来する本発明の好ましい実施形態において、本発明は、好ましくは
、重鎖および軽鎖遺伝子の定常領域中のプライマーならびにセンス鎖の５’末端
に付加された合成配列に対するプライマーを利用する。このような合成配列にお
けるプライミングは、抗体遺伝子の可変領域内の配列の使用を回避する。これら
の可変領域プライミング部位は、まれなサブクラスのいずれかであるか、または
プライミング部位において変異されたＶ遺伝子に対する偏りを生じる。この偏り
は、プライマー領域内の多様性の抑制に部分的に起因し、そして多数の変異がプ
ライマーに相補的な領域中に存在する場合のプライミングの欠如に部分的に起因
する。本発明において開示された方法は、特定のＶ遺伝子型についての増幅され
た抗体遺伝子の集団を偏らせない利点を有する。
【００５３】
合成配列は、ＤＮＡ配列を共に連結させるために周知の種々の方法によってＤ
ＮＡ鎖の５’末端に付加され得る。ＲＴキャップ伸長ＣａｐＥｘｔｅｎｔｉｏｎ
は、１つの好ましい方法である。
【００５４】
ＲＴキャップ伸長（Ｓｍａｒｔ ＲＣＲ（ＴＭ）に由来する）において、短い
重複（上方鎖プライマー（ＵＳＰ−ＧＧＧ）における５’−．．．ＧＧＧ−３’
は、下方鎖における３’−ＣＣＣ．．．．５’を補完する）および逆転写酵素を
使用して、上方鎖プライマーの逆相補体が、下方鎖に付加される。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態において、上方鎖および下方鎖プライマーはまた、
ａ）遊離アミノ基、ｂ）チオール、ｃ）カルボン酸、またはｄ）不溶性媒体の既
知のパートナーに対して強力な結合を形成するように反応し得るＤＮＡにおいて
見出されない別の基、のうちの１つを用いて、５’末端においてビオチン化また
は標識され得る。次いで、これらは、増幅後の標識された鎖を固定するために使
用され得る。固定されたＤＮＡは、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
【００５６】
図１は、ＶＨ遺伝子の増幅の概略図を示す。図１、パネルＡは、第１の下方鎖
の３’ＵＴＲプライミング合成のポリｄＴ領域に特異的なプライマーを示す。定
常領域において結合するプライマーもまた、適切である。パネルＢは、ｍＲＮＡ
に相補的でない３つのＣによって、その３’末端において伸長した下方鎖を示す
。パネルＣは、３’末端のＣＣＣにハイブリダイズする３つのＧＧＧにおける合
成上方鎖プライマーのアニーリング、および合成プライマー配列の逆相補体によ
る下方鎖を伸長する逆転写の伸長の結果を示す。パネルＤは、パネルＣの合成プ
ライマーの５’末端を複製する５’ビオチン化合成上方鎖プライマーおよび定常
ドメインの部分に相補的な下方鎖プライマーを使用するＰＣＲ増幅の結果を示す
。パネルＥは、５’ビオチン化上方鎖プライマーを使用することによって得られ
た固定二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡを示す。
【００５７】
図２は、ＶＬ遺伝子の増幅のための同様の概略図を示す。図２、パネルＡは、
第１の下方鎖の３’末端プライミング合成の領域またはその近くの定常領域に特
異的なプライマーを示す。ポリｄＴ領域において結合するプライマーはまた、適
切である。パネルＢは、ｍＲＮＡに相補的でない３つのＣによって、その３’末
端において伸長した下方鎖を示す。パネルＣは、３’末端のＣＣＣにハイブリダ
イズする３つのＧＧＧにおける合成上方鎖プライマーのアニーリング、および合
成プライマー配列の逆相補体による下方鎖を伸長する逆転写の伸長の結果を示す
。パネルＤは、パネルＣの合成プライマーの５’末端を複製する５’ビオチン化
合成上方鎖プライマーおよび定常ドメインの部分に相補的な下方鎖プライマーを
使用するＰＣＲ増幅の結果を示す。下方鎖プライマーはまた、有用な制限エンド
ヌクレアーゼ部位（例えば、ＡｓｃＩ）を含む。パネルＥは、５’ビオチン化上
方鎖プライマーを使用することによって得られた固定ｄｓ ｃＤＮＡを示す。
【００５８】
図１および２において、各Ｖ遺伝子は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および分泌
シグナル（これには可変領域が続き、これには定常領域が続き、これには３’非
翻訳領域（これは、代表的にはポリＡで終わる）が続く）からなる。逆転写のた
めの最初のプライマーは、定常領域または３’ＵＴＲのポリＡセグメントに対し
て相補的であり得る。ヒト重鎖遺伝子については、１５Ｔプライマーが好ましい
。逆転写酵素は、新しく合成されたＤＮＡの３’末端にいくつかのＣ残基を付加
する。ＲＴキャップ伸長は、この特徴を利用する。逆転写反応は、第１に、下方
鎖プライマーのみと作動される。約１時間後、プライマーは、ＧＧＧ（ＵＳＰ−
ＧＧＧ）で終了し、そして多くのＲＴａｓｅが添加される。これは、下方鎖ｃＤ
ＮＡが、ＵＳＰ−ＧＧＧの逆相補体によって最終ＧＧＧまで伸長されることを引
き起こす。付加された合成配列の部分に同一な１つのプライマーおよびセンス鎖
の３’末端における既知の配列の領域に相補的な第２のプライマーを使用して、
全てのＶ遺伝子は、それらのＶ遺伝子サブクラスに関わらず、増幅される。
【００５９】
増幅後、本発明のＤＮＡは、一本鎖とされる。例えば、この鎖は、ビオチン化
プライマーを使用すること、ストレプトアビジン樹脂上のビオチン化産物を捕獲
することによって、ＤＮＡを変成することによって、および相補的な鎖を洗い流
すことによって、分離され得る。捕獲されたＤＮＡのどの末端が望まれているか
に依存して、上方（センス）鎖または下方（アンチセンス）鎖のいずれかを固定
することを選択する。
【００６０】
これらのＤＮＡによって（少なくとも部分的に）コードされるポリペプチド、
ポリペプチドまたはタンパク質の表示を行なうために、遺伝子パッケージへのク
ローニングのための一本鎖増幅ＤＮＡを調製し、クローニングおよび発現のため
に適切な末端を提供するように操作されなければならない。詳細には、任意の５
’非翻訳領域および最小のシグナル配列が除去され、そしてインフレームで、表
示宿主において機能する適切なシグナル配列によって置換され得る。さらに、可
変ドメイン（抗体遺伝子における）の部分は、除去され、そして合成多様性を含
む合成セグメントによって置換される。他の遺伝子ファミリーの多様性は、同様
に、合成多様性を用いて拡大され得る。
【００６１】
本発明の方法に従って、クローニングのための一本鎖増幅ＤＮＡを操作するた
めの２つの方法が存在する。第１の方法は、以下の工程：
（ｉ）核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドとを接触させる工程であって、オリゴ
ヌクレオチドが、切断が望ましい領域における核酸に機能的に相補的であり、そ
して制限が核酸の切断を所望の位置で生じる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を
形成する核酸中にその相補体を有する配列を含む、工程；および
（ｉｉ）核酸およびオリゴヌクレオチドの補完によって形成された認識部位の
みで核酸を切断する工程；
を包含し、接触および切断工程は、実質的に一本鎖形態で核酸を維持するのに十
分な温度で行なわれ、オリゴヌクレオチドは、切断が選択された温度および所望
の位置で生じ得るように、２つの鎖が会合するのを可能にするのに十分に大きい
領域にわたって核酸と機能的に相補的であり、そして切断は、選択された温度で
活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して行なわれる。
【００６２】
この第１の方法において、短いオリゴヌクレオチドを、１本鎖ＤＮＡにアニー
ルさせ、現在の局部的なＤＮＡの２本鎖領域内に形成される制限エンドヌクレア
ーゼ認識部位を切断し得る。特に、１本鎖ＤＮＡの実質的な画分の同じ位置に生
じる認識部位は同一である。
【００６３】
抗体遺伝子に関して、これは、生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）配列のカタログ
を用いてなされ得る。例えば、「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａ
ｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ／ｏｋ．ｈｔｍｌ．」
を参照のこと。アップデータは、表題「Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ」の下でこのサイト
から獲得され得る。他のファミリーに関して、類似の比較が存在し、そして切断
のための適切な領域を選択するために、および多様性を維持するために用いられ
得る。
【００６４】
例えば、表１９５は、５１の公知のヒトＶＨ生殖系列遺伝子のＦＲ３領域のＤ
ＮＡ配列を示す。この領域において、この遺伝子は、表２００に示される制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位を含む。同じ部位で生殖系列遺伝子の大画分を切断す
る制限エンドヌクレアーゼは、種々の部位で切断するエンドヌクレアーゼ以上に
好ましい。さらに、１本鎖ＤＮＡ上で短いオリゴヌクレオチドが結合する領域（
例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位のいずれかの側面の約１０塩基）内に
制限エンドヌクレアーゼのための１つのみの部位が存在することが好ましい。
【００６５】
ＦＲ３における下流を切断する酵素もまた、より好ましい。なぜならば、それ
は、フレームワークにおける少数の変異を捕捉するからである。このことは、い
くつかの場合、有利であり得る。しかし、フレームワークの変異が存在し、そし
て抗体結合を付与しそして増強することが周知である。本発明は、適切な制限部
位の選択により、ＦＲ３の多様性の全てまたは一部を捕捉することを可能とする
。従って、この方法はまた、広範囲の多様性を捕捉することを可能とする。
【００６６】
最後に、本発明の方法において、約４５℃と約７５℃との間で活性な制限エン
ドヌクレアーゼが用いられる。好ましくは、５０℃以上で活性な酵素、より好ま
しくは、約５５℃で活性な酵素が用いられる。このような温度は、核酸配列が、
実質的に１本鎖形態で切断されることを維持する。
【００６７】
表２００に示される、単一の位置で重鎖ＦＲ３生殖系列遺伝子の多くを切断す
る酵素として、以下が挙げられる：ＭａｅＩＩＩ（２４＠４）、Ｔｓｐ４５Ｉ（
２１＠４）、ＨｐｈＩ（４４＠５）、ＢｓａＪＩ（２３＠６５）、ＡｌｕＩ（２
３＠４７）、ＢｌｐＩ（２１＠４８）、ＤｄｅＩ（２９＠５８）、ＢｇｌＩＩ（
１０＠６１）、ＭｓｌＩ（４４＠７２）、ＢｓｉＥＩ（２３＠７４）、ＥａｅＩ
（２３＠７４）、ＥａｇＩ（２３＠７４）、ＨａｅＩＩＩ（２５＠７５）、Ｂｓ
ｔ４ＣＩ（５１＠８６）、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ（５１＠８６）、ＨｉｎｆＩ（３
８＠２）、ＭｌｙＩ（１８＠２）、ＰｌｅＩ（１８＠２）、ＭｎｌＩ（３１＠６
７）、ＨｐｙＣＨ４Ｖ（２１＠４４）、ＢｓｍＡＩ（１６＠１１）、ＢｐｍＩ（
１９＠１２）、ＸｍｎＩ（１２＠３０）、およびＳａｃＩ（１１＠５１）（使用
される表記は、例えば、ＢｓｍＡＩが、ＦＲ３の塩基１１で開始する制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位で１６のＦＲ３生殖系列遺伝子を切断することを意味する
）。
【００６８】
ＦＲ３におけるヒト重鎖の切断について、好ましい制限エンドヌクレアーゼは
、以下のようなものである：Ｂｓｔ４ＣＩ（またはＴａａＩもしくはＨｐｙＣＨ
４ＩＩＩ）、ＢｌｐＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、およびＭｓｌＩ。ＡＣＮＧＴ（Ｂｓｔ
４ＣＩ、ＴａａＩ、およびＨｐｙＣＨ４ＩＩＩのための制限エンドヌクレアーゼ
認識部位）は、全てのヒトＦＲ３生殖系列遺伝子において一致する部位に見出さ
れるため、これらの酵素の１つは、重鎖ＣＤＲ３の多様性の捕捉のために最も好
ましい。ＢｌｐＩおよびＨｐｙＣＨ４Ｖは相補的である。ＢｌｐＩは、ＶＨ１お
よびＶＨ４ファミリーのほとんどのメンバーを切断し、ＨｐｙＣＨ４Ｖは、ＶＨ
３、ＶＨ５、ＶＨ６、およびＶＨ７のファミリーのほとんどのメンバーを切断す
る。両方の酵素ともＶＨ２を切断しないが、これは非常に小さいファミリーであ
り、３つのメンバーを含むのみである。従って、これらの酵素はまた、本発明の
方法の好ましい実施形態において用いられ得る。
【００６９】
制限エンドヌクレアーゼＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、Ｂｓｔ４ＣＩ、およびＴａａＩ
は全て、５’―ＡＣｎＧＴ―３’を認識し、そしてｎの後の上方のストランドＤ
ＮＡおよびｎに相補的な塩基の前の下方ストランドＤＮＡを切断する。これは、
ヒト重鎖上でのこの方法のために最も好ましい制限エンドヌクレアーゼ認識部位
である。なぜならば、それは、全ての生殖系列遺伝子において見出されるからで
ある。さらに、制限エンドヌクレアーゼ認識領域（ＡＣｎＧＴ）は、表２０６に
示されるような、チロシンコドン（ｔａｙ）およびそれに続くシステインコドン
（ｔｇｙ）の第２および第３の塩基に適合する。これらのコドン（特に、成熟抗
体遺伝子におけるシステイン）は、高度に保存されている。
【００７０】
表２５０Ｅは、長さ２２塩基（長さ２０の最後の１つを除く）の別個のオリゴ
ヌクレオチドを示す。表２５５Ｃは、１６１７の実際の重鎖抗体遺伝子の分析を
示す。これらの中で、１５１１つはこの部位を有し、そして４つの不適合内で候
補オリゴヌクレオチドの１つに適合する。８つのオリゴヌクレオチドが、ほとん
どの適合の原因であり、表２５０Ｆ．１．に示す。８つのオリゴヌクレオチドは
非常に類似しており、その結果、満足のいく切断が、温度、ｐＨ、塩分などを調
整することにより、１つのみのオリゴヌクレオチド（例えば、Ｈ４３．７７．９
７．１−０２＃１）を用いて達成されるようである。１つまたは２つのオリゴヌ
クレオチドは、生殖系列遺伝子配列がごくわずかしか異ならない場合であっても
、そして特に切断される制限エンドヌクレアーゼ認識領域付近でごくわずかしか
異ならない場合、同様に満足し得る。表２５５Ｄは、８つの選択されたオリゴヌ
クレオチドのみを用いた、１６１７つの実際の重鎖抗体遺伝子の反復分析を示す
。これは、１４６３つの配列が、４つの不適合内で少なくとも１つのオリゴヌク
レオチドで適合すること、および期待するような部位を有することを示す。７つ
の配列のみが、この領域内に第２のＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ
認識領域を有する。
【００７１】
適切な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を選択する別の説明は、ヒト重鎖のＦ
Ｒ１における切断に関する。ＦＲ１における切断は、重鎖のＣＤＲの多様性全体
の捕捉を可能にする。
【００７２】
ヒト重鎖ＦＲ１についての生殖系列遺伝子を表２１７に示す。表２２０は、ヒ
ト生殖系列遺伝子ＦＲ１において見出される制限エンドヌクレアーゼ認識部位を
示す。好まし部位は、ＢｓｇＩ（ＧＴＧＣＡＧ；３９＠４）、ＢｓｏＦＩ（ＧＣ
ｎｇｃ；４３＠６、１１＠９、２＠３、１＠１２）、ＴｓｅＩ（Ｇｃｗｇｃ；４
３＠６、１１＠９、２＠３、１＠１２）、ＭｓｐＡｌＩ（ＣＭＧｃｋｇ；４６＠
７、２＠１）、ＰｖｕＩＩ（ＣＡＧｃｔｇ；４６＠７、２＠１）、ＡｌｕＩ（Ａ
Ｇｃｔ；４８＠８２＠２）、ＤｄｅＩ（Ｃｔｎａｇ；２２＠５２、９＠４８）、
ＨｐｈＩ（ｔｃａｃｃ；２２＠８０）、ＢｓｓＫＩ（Ｎｃｃｎｇｇ；３５＠３９
、２＠４０）、ＢｓａＪＩ（Ｃｃｎｎｇｇ；３２＠４０、２＠４１）、ＢｓｔＮ
Ｉ（ＣＣｗｇｇ；３３＠４０）、ＳｃｒＦＩ（ＣＣｎｇｇ；３５＠４０、２＠４
１）、Ｅｃｏ０１０９Ｉ（ＲＧｇｎｃｃｙ；２２＠４６、１１＠４３）、Ｓａｕ
９６Ｉ（Ｇｇｎｃｃ；２３＠４７、１１＠４４）、ＡｖａＩＩ（Ｇｇｗｃｃ；２
３＠４７、４＠４４）、ＰｐｕＭＩ（ＲＧｇｗｃｃｙ；２２＠４６、４＠４３）
、ＢｓｍＦＩ（ｇｔｃｃｃ；２０＠４８）、ＨｉｎｆＩ（Ｇａｎｔｃ；３４＠１
６、２１＠５６、２１＠７７）、ＴｆｉＩ（２１＠７７）、ＭｌｙＩ（ＧＡＧＴ
Ｃ；３４＠１６）、ＭｌｙＩ（ｇａｃｔｃ；２１＠５６）、およびＡｌｗＮＩ（
ＣＡＧｎｎｎｃｔｇ；２２＠６８）である。より好ましい部位は、ＭｓｐＡＩお
よびＰｖｕＩＩである。ＭｓｐＡＩおよびＰｖｕＩＩは、７〜１２での４６つの
部位および１〜６での２つの部位を有する。両方の部位での切断を回避するため
に、１〜６での部位を完全に覆わないオリゴヌクレオチドが用いられる。従って
、ＤＮＡは、その部位で切断されない。本発明者らは、ＰｖｕＩＩ部位を超えて
３、４、または５塩基延びるＤＮＡが効果的に切断され得ることを示した。
【００７３】
適切な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を選択する別の説明は、ヒトκ軽鎖の
ＦＲ１における切断に関する。表３００は、ヒトκＦＲ１生殖系列を示し、そし
て表３０２は、一致する部位で実質的に多くのヒトκＦＲ１生殖系列遺伝子にお
いて見出される制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示す。列挙される制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位の中で、ＢｓｍＡＩおよびＰｆｌＦＩが最も好ましい酵素
である。ＢｓｍＡＩ部位は、４０の生殖系列遺伝子の中の３５において塩基１８
にて見出される。ＰｆｌＦＩ部位は、４０の生殖系列遺伝子の中の３５において
塩基１２にて見出される。
【００７４】
適切な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を選択する別の例は、ヒトλ軽鎖のＦ
Ｒ１における切断に関する。表４００は、３１の公知のヒトλＦＲ１生殖系列遺
伝子配列を示す。表４０５は、ヒトλＦＲ１生殖系列遺伝子において見出される
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示す。ＨｉｎｆＩおよびＤｄｅＩが、ＦＲ１
におけるヒトλ鎖を切断するための最も好ましい制限エンドヌクレアーゼである
。
【００７５】
切断のための１つかまたは複数の適切な部位が選択された後に、１つ以上の短
いオリゴヌクレオチドが、１つかまたは組み合わせて、選択された認識部位を機
能的に補うために調製される。このオリゴヌクレオチドはまた、増幅された遺伝
子の大部分において認識部位に隣接する配列を含む。この隣接配列は、この配列
が、選択された部位に特異的な制限エンドヌクレアーゼにより切断されるのに十
分に、１本鎖ＤＮＡにアニールすることを可能にする。
【００７６】
このオリゴヌクレオチドの実際の長さおよび配列は、認識部位ならびに接触お
よび切断のために用いられる状態に依存する。この長さは、オリゴヌクレオチド
が、２つのストランドが結合し、その結果、選択された温度および所望の位置の
みでの切断が生じるのに十分大きな領域にわたって、１本鎖ＤＮＡに機能的に相
補性であるために十分でなければならない。
【００７７】
代表的に、本発明の好ましい方法のオリゴヌクレオチドは、約１７〜約３０ヌ
クレオチド長である。約１７塩基未満では、アニーリングが弱すぎ、そして３０
塩基より上では、特異性の喪失が存在し得る。好ましい長さは、１８〜２４塩基
である。
【００７８】
この長さのオリゴヌクレオチドは、生殖系列遺伝子の同一の相補体である必要
はない。むしろ、生じる数個の不適合が寛容され得る。しかし、好ましくは、１
〜３の不適合のみが許容される。このような不適合は、１本鎖ＤＮＡに対するこ
のオリゴヌクレオチドのアニーリングに逆に影響しない。従って、この２つのＤ
ＮＡは、機能的に相補性であると呼ばれる。
【００７９】
クローニングのために本発明の増幅した１本鎖ＤＮＡを操作するための第２の
方法は、以下の工程を包含する：
（ｉ）核酸と部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドを接触される工程であっ
て、このオリゴヌクレオチドの１本鎖領域が、切断が所望される領域においてこ
の核酸に機能的に相補的であり、そしてこのオリゴヌクレオチドの２本鎖領域が
、ＩＩ−Ｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、それらの切断部位が、認
識部位から既知の距離で配置される、工程；および
（ｉｉ）核酸とオリゴヌクレオチドの１本鎖領域との補完により形成される
切断部位のみでこの核酸を切断する工程。
接触工程および切断工程は、この核酸を実質的に１本鎖形態で維持するために十
分な温度にて実施され、オリゴヌクレオチドは、２つのストランドが結合し、そ
の結果、選択された温度および所望の位置で切断が生じ得るのに十分に大きな領
域にわたってこの核酸に対して機能的に相補性であり、そして切断は、選択され
た温度で活性な制限エンドヌクレアーゼを用いて実施される。
【００８０】
この第２の方法は、ユニバーサル制限エンドヌクレアーゼ（「ＵＲＥ」）を用
いる。ＵＲＥは、部分的に２本鎖オリゴヌクレオチドである。１本鎖部分または
ＵＲＥの重複は、１本鎖ＤＮＡにおいて切断されるためにこの配列に対して機能
的に相補性であるＤＮＡアダプターからなる。２本鎖部分は、ＩＩ−Ｓ型制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位でからなる。
【００８１】
本発明のＵＲＥ方法は、特異的かつ正確であり、そして相補領域においていく
つか（例えば、１〜３）の不適合を寛容し得る（すなわち、それはその領域に対
して機能的に相補性である）。さらに、ＵＲＥが用いられる条件が調整され、そ
の結果、増幅されるほとんどの遺伝子が切断され、それらの遺伝子から生成され
るライブラリー中の偏りを減少させ得る。
【００８２】
１本鎖ＤＮＡアダプターの配列またはＵＲＥの重複部分は、代表的に、約１４
〜２２塩基からなる。しかし、より長いかまたはより短いアダプターが用いられ
得る。大きさは、アダプターが１本鎖ＤＮＡの機能的な相補体と結合する能力、
ならびにＩＩ−Ｓ型酵素を用いてこのＤＮＡを切断するために用いられる温度に
てＵＲＥと１本鎖ＤＮＡを接触させるために用いられる温度に依存する。アダプ
ターは、２つのストランドが結合し、その結果、選択された温度および所望の位
置で切断が生じ得るのに十分に大きな領域にわたって１本鎖ＤＮＡに対して機能
的に相補性でなければならない。本発明者らは、１４〜１７塩基長、より好まし
くは１８〜２０塩基長の１本鎖部分または重複部分を好む。
【００８３】
ＵＲＥを用いて切断のために選択される部位は、好ましくは、増幅されたＤＮ
Ａのファミリーにおいて実質的に保存される部位である。本発明の第１の切断方
法と比較する場合、これらの部位は、エンドヌクレアーゼ認識部位である必要が
ない。しかし、第１の方法のように、選択される部位は、ネイティブのＤＮＡに
存在するというよりも合成性であり得る。このような部位は、公知の抗体または
遺伝子の他のファミリーの配列に関する参照により選択され得る。例えば、多く
の生殖系列遺伝子の配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．
ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ／ｏｋ．ｈｔｍｌにて報告
されている。例えば、１つの好ましい部位は、ＦＲ３の末端付近（コドン８９〜
コドン９３の第２の塩基）で生じる。ＣＤＲ３は、コドン９５で開始する。
【００８４】
７９のヒト重鎖遺伝子の配列もまた、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌ
ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅ２／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌにて利用
可能である。このサイトは、本発明の方法に従うＵＲＥ切断のための適切な配列
を同定するために用いられ得る。例えば、表８Ｂを参照のこと。
【００８５】
最も好ましくは、１つ以上の配列が、これらのサイトまたは他の利用可能な配
列情報を用いて同定される。これらの配列は、共に、増幅されたＤＮＡの実質的
な画分に存在する。例えば、複数の配列が、生殖系列遺伝子における公知の多様
性または頻度の高い体細胞変異を可能にするために用いられ得る。合成性の変性
配列もまた、用いられ得る。好ましくは、２〜３の不適合のみを有する試験され
た遺伝子の少なくとも６５％において生じる配列が、選択される。
【００８６】
次いで、ＵＲＥ１本鎖アダプターまたは重複は、選択される領域に相補性であ
るように作製される。ＵＲＥを使用する条件は、経験的に決定される。これらの
条件は、２〜３の不適合のみを有する機能的に相補性の配列を含むＤＮＡの切断
を可能にするが、このような配列を欠くＤＮＡの切断を可能にしない。
【００８７】
上記のように、ＵＲＥの二本鎖部分として、ＩＩ−Ｓ型エンドヌクレアーゼ認
識部位が挙げられる。一本鎖ＤＮＡを実質的にその形態で保持し、そして一本鎖
ＤＮＡが所望される部位で切断されるのを可能にするために、ＵＲＥの一本鎖Ｄ
ＮＡアダプター部分が十分な長さでアニーリングすることを可能にするのに必要
な温度で活性な任意のＩＩ−Ｓ型酵素が使用され得る。
【００８８】
本発明のＵＲＥ方法での使用のための好ましいＩＩ−Ｓ型酵素は、一本鎖ＤＮ
Ａの非対称的な切断を提供する。とりわけ、表８００にこれらの酵素を列挙する
。もっとも好ましいＩＩ−Ｓ型酵素が、ＦｏｋＩである。
【００８９】
好ましいＦｏｋＩを含むＵＲＥが使用される場合、切断を起こすためのいくつ
かの条件を使用することが好ましい：
１）酵素を活性化するための標的ＤＮＡ全体のＵＲＥの発現が存在するべきで
ある。標的ＤＮＡに対して等モル量しか存在しないＵＲＥは、ｓｓＤＮＡの少な
い切断を生じる。なぜなら、利用可能な活性な酵素の量は限られているからであ
る。
【００９０】
２）アクチベーターを使用してＦｏｋＩ酵素の一部を活性化し、切断を生じる
ことなく二量体化させ得る。適切なアクチベーターの例を、表５１０に示す。
【００９１】
３）切断の制限は、４５℃〜７５℃の間の温度、好ましくは５０℃より高い温
度、そして最も好ましくは５５℃より高い温度で実施される。
【００９２】
先行技術で使用されているＵＲＥは、１４の塩基の一本鎖セグメント、１０の
塩基のステム（ＦｏｋＩ部位を含む）、それに続く１０塩基のステムのパリンド
ロームを含んだ。このようなＵＲＥを本発明の本方法で使用し得るが、本発明の
好ましいＵＲＥはまた、セグメントを含むＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ認識
部位の間の３〜８塩基（１つのループ）のセグメントも含む。好ましい実施形態
において、ステム（ＦｏｋＩ部位を含む）およびそのパリンドロームはまた、１
０塩基よりも長い。好ましくは、これらは、１０〜１４塩基長である。これらの
「ロリポップ（ｌｏｌｌｉｐｏｐ）」ＵＲＥアダプターの例を表５に示す。
【００９３】
ＵＲＥを使用して、一本鎖ＤＮＡを切断する１つの例としては、ヒト重鎖のＦ
Ｒ３領域が挙げられる。表５０８は、示されるＵＲＥ認識配列を有する８４０の
全長成熟ヒト重鎖の分析を示す。大部分（７１８／８４０＝０．８５）は、５つ
のＵＲＥ（ＶＨＳ８８１−１．１、ＶＨＳ８８１−１．２、ＶＨＳ８８１−２．
１、ＶＨＳ８８１−４．１、およびＶＨＳ８８１−９．１）を使用して、２以下
のミスマッチを認識される。これらのそれぞれは、生殖系列の遺伝子に相補的な
２０塩基のアダプター配列、ＦｏｋＩ部位を含む１０塩基のステムセグメント、
５つの塩基ループ、および第一のステムセグメントの逆の相補体を有する。これ
らのアダプターを、単独でまたは組合せて一本鎖アンチセンス重鎖ＤＮＡにアニ
ーリングし、そして例えば、アクチベーターＦＯＫＩａｃｔの存在下でＦｏｋＩ
を用いて処理することによって、指示された位置でアンチセンス鎖の切断を生じ
る。
【００９４】
ＵＲＥを使用して一本鎖ＤＮＡを切断する別の例としては、ヒトκ軽鎖のＦＲ
１領域が挙げられる。表５１２は、４つの示された１９塩基のプローブ配列によ
る一致についての１８２の全長ヒトκ鎖の分析を示す。９６％の配列は、２以下
のミスマッチを有するプローブの１つと一致する。表５１２に示されるＵＲＥア
ダプターは、κ鎖のセンス鎖の切断のためである。従って、アダプター配列は、
生殖系列の遺伝子配列の逆の相補体である。ＵＲＥは、１０塩基のステム、５塩
基のループ、ステムの逆の相補体およびその相補配列から構成される。ループは
、ここではＴＴＧＴＴを示すが、他の配列が使用され得る。その機能は、ロリポ
ップ単量体の形成が二量体化よりも好まれるように、ステムのパリンドロームを
妨げることである。表５１２はまた、センス鎖が切断される場所を示している。
【００９５】
ＵＲＥを使用して一本鎖ＤＮＡを切断する別の例としては、ヒトλ軽鎖が挙げ
られる。表５１５は、４つの示された１９塩基のプローブを一致させるための１
２８のヒトλ軽鎖の分析を示している。３以下のミスマッチを有し、１２８のう
ちの８８（６９％）の鎖がプローブの１つと一致する。表５１５はまた、これら
のプローブに対応するＵＲＥアダプターを示している。これらのアダプターを、
λ鎖の上側の鎖ｓｓＤＮＡにアニーリングし、そしてＦＯＫＩａｃｔの存在下、
４５℃またはそれより高い温度で、ＦｏｋＩで処理することによって、これらの
鎖の特異的かつ正確な切断が生じる。
【００９６】
第一の方法の短いオリゴヌクレオチド配列および第二の方法のＵＲＥが、一本
鎖ＤＮＡと接触する条件下で、経験的に決定され得る。この条件は、一本鎖ＤＮ
Ａが、実質的に一本鎖の形態で保持されるようでなければならない。より詳細に
は、これらの条件は、一本鎖ＤＮＡが、ループを形成しないような条件でなけれ
ばならず、このループは、それが関係するオリゴヌクレオチド配列もしくはＵＲ
Ｅを妨害し得るか、または選択的制限エンドヌクレアーゼによってループ自身が
切断の部位を提供し得る。
【００９７】
短いオリゴヌクレオチド（第一の方法）およびＵＲＥ（第二の方法）の効率お
よび特異性は、ＵＲＥアダプター／オリゴヌクレオチドならびに基質ＤＮＡの濃
度、温度、ｐＨ、金属イオン濃度、イオン強度、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏ
ｐｅ）（例えば、尿素およびホルムアミド）の濃度、制限エンドヌクレアーゼ（
例えば、ＦｏｋＩ）の濃度、および消化の時間を制御することによって調整され
得る。これらの条件は、以下を有する合成オリゴヌクレオチドを用いて最適化さ
れ得る：１）標的生殖系列遺伝子配列、２）成熟標的遺伝子配列、または３）幾
分関連する非標的配列。目標は、標的配列のほとんどを切断しかつ非標的の最小
量を切断することである。
【００９８】
本発明の好ましい実施形態において、一本鎖ＤＮＡは、４５℃〜７５℃の間の
温度を使用して、実質的に一本鎖ＤＮＡの形態で維持される。より好ましくは、
５０℃〜６０℃の間であり、最も好ましくは５５℃〜６０℃の間の温度が使用さ
れる。これらの温度は、ＤＮＡがオリゴヌクレオチドまたはＵＲＥと接触する場
合、および本発明の方法を使用してＤＮＡを切断する場合の両方で使用される。
【００９９】
本発明の２つの切断方法は、いくつかの利点を有する。第一の方法は、一本鎖
ＤＮＡのファミリーの個々のメンバーを、１つの実質的に保存されたエンドヌク
レアーゼ認識部位で単独に切断することを可能にする。この方法はまた、逆転写
または増幅プライマーに構築されるエンドヌクレアーゼ認識部位を必要としない
。ファミリー中の任意のネイティブな部位または合成部位が使用され得る。
【０１００】
第二の方法は、これらの利点の両方を有する。さらに、ＵＲＥの方法は、一本
鎖ＤＮＡが、天然に存在するか、または合成で構築されたエンドヌクレアーゼ認
識部位を有さない位置で切断されることを可能にする。
【０１０１】
最も重要なことは、両方の切断方法が、多様性を最大にするように５’および
３’プライマーの使用を可能にし、次いでクローニングおよびディスプレイの前
に所望でないか、または有害な配列を除去するような切断を可能にする。
【０１０２】
増幅されたＤＮＡを、本発明の方法の１つを使用して切断した後、このＤＮＡ
はクローニングのために調製される。これは、部分的に二重鎖の合成ＤＮＡアダ
プター（この末端配列は、特定の切断部位に基づいており、増幅されたＤＮＡは
、この部位で切断される）を使用することによってなされる。
【０１０３】
合成ＤＮＡは、切断された一本鎖ＤＮＡに連結される場合、ＤＮＡが、所望の
ペプチド、ポリペプチドまたは遺伝子パッケージの表面タンパク質をディスプレ
イするように正確なリーディングフレームに発現されることを可能にするように
設計される。好ましくは、アダプターの二本鎖部分は、ペプチド、ポリペプチド
または切断部位までのタンパク質のファミリーのアミノ酸配列の特徴をコードす
るいくつかのコドン配列を含む。ヒト重鎖について、好ましくは、３〜２３のフ
レームワークのアミノ酸を使用して、切断されたＤＮＡの発現に必要な配列を提
供する。
【０１０４】
好ましくは、アダプターの二本鎖部分は、約１２〜１００塩基長である。より
好ましくは、約２０〜１００塩基が使用される。アダプターの二本鎖領域はまた
、好ましくは、ＤＮＡを適切なディスプレイベクター（または多様性を保存する
ために使用されるレシピエントベクター）にクローニングするために有用な少な
くとも１つのエンドヌクレアーゼ認識部位を含む。このエンドヌクレアーゼ制限
部位は、ＤＮＡ配列を伸長するために使用される生殖系列遺伝子配列に対してネ
イティブであり得る。これはまた、ネイティブな生殖系列遺伝子配列に対して縮
重した配列を使用して構築され得る。または、これは全合成であり得る。
【０１０５】
アダプターの一本鎖部分は、一本鎖ＤＮＡにおける切断領域に相補的である。
このオーバーラップは、約２塩基〜約１５塩基までであり得る。オーバーラップ
がより長くなるにつれて、連結がより効率的になるようである。オーバーラップ
について好ましい長さは、７〜１０である。これは、領域における多様性が捕捉
され得るようにこの領域のいくつかのミスマッチを可能にする。
【０１０６】
一本鎖領域または部分的二重鎖のアダプターのオーバーラップが有利である。
なぜなら、これは、ＤＮＡが選択された部位で切断されることを可能にするが、
捕捉される他のフラグメントは切断されないからである。このようなフラグメン
トは、適切な抗体に折り畳まれず、そして非特異的粘着性であるらしい遺伝子コ
ード配列を有するライブラリーを汚染する。
【０１０７】
本発明の方法における部分的二重鎖のアダプターの使用の１つの例示としては
、このようなアダプターを上記のように、５’−ＡＣｎＧＴ−３’において、Ｈ
ｐｙＣＨ４ＩＩＩ、Ｂｓｔ４ＣＩまたはＴａａＩを使用して切断されるヒトＦＲ
３領域に連結する工程を包含する。
【０１０８】
表２５０Ｆ．２は、切断された下側の鎖であるＤＮＡに連結するためにアダプ
ターの二本鎖部分の下側の鎖を示している。ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ部位は、右（表
２０６に示されるような）に対して非常に遠いので、ＡｆｌＩＩ部位およびＸｂ
ａＩ部位を含む配列が、付加され得る。部分的に二重鎖のアダプターのこの下側
の鎖部分（Ｈ４３．ＸＡＥｘｔ）は、ＸｂａＩおよびＡｆｌＩＩ部位の両方を組
込む。アダプターの二重鎖部分の上側の鎖は、いずれの部位も有さない（Ｈ４３
．ＸＡＥｘｔのＸｂａＩおよびＡｆｌＩＩ部位に逆のセグメントにおける計画さ
れたミスマッチのため）が、Ｈ４３．ＸＡＥｘｔに非常に強固アニーリングする
。Ｈ４３ＡＥｘｔは、ＡｆｌＩＩ部位のみを含み、そして上側鎖Ｈ４３．ＡＢｒ
１およびＨ４３．ＡＢｒ２（これは、ＡｆｌＩＩ部位を破壊するために意図的な
変更を有する）とともに使用される。
【０１０９】
連結後に、所望の捕獲されたＤＮＡは、さらにＰＣＲ増幅され得、所望である
場合、好ましい実施形態において、抗体遺伝子の下流の定常領域に対するプライ
マー、およびアダプターの二本鎖領域の部分に対するプライマーを使用する。こ
れらのプライマーはまた、増幅されたＤＮＡのクローニングに使用するための制
限エンドヌクレアーゼ部位を保有する。
【０１１０】
部分的な二本鎖アダプターの一本鎖増幅ＤＮＡへの連結、およびおそらく増幅
の後、複合体ＤＮＡは、選択された５’側および３’側エンドヌクレアーゼ認識
部位で切断される。
【０１１１】
クローニングに有用な切断部位は、カセットが挿入されるファージまたはファ
ージミドおよび抗体遺伝子におけるその利用可能な部位に依存する。表１は、７
５のヒト軽鎖についての制限エンドヌクレアーゼのデータを提供する。表２は、
７９のヒト重鎖についての対応するデータを示す。各表において、エンドヌクレ
アーゼは、切断の頻度が増す順番で並べられている。これらの表において、Ｎｃ
ｈは、酵素によって切断される鎖の数であり、Ｎｓは、部位の数（いくつかの鎖
は１より多い部位を有する）である。
【０１１２】
この分析から、ＳｆｉＩ、ＮｏｔＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｐａＬＩおよびＡｓｃＩ
が非常に適切である。ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩは、好ましくは、重鎖ディスプレ
イセグメントを挿入するためのｐＣＥＳ１において使用される。ＡｐａＬＩおよ
びＡｓｃＩは、好ましくは、軽鎖ディスプレイセグメントを挿入するためにｐＣ
ＥＳ１において使用される。
【０１１３】
ＢｓｔＥＩＩ部位は、生殖系列ＪＨ遺伝子の９７％に生じる。再配列されたＶ
遺伝子において、重鎖遺伝子の５４／７９（６８％）のみが、ＢｓｔＥＩＩ部位
を含み、そしてこれらの７／６１が、２つの部位を含む。従って、４７／７９（
５９％）が、１つのＢｓｔＥＩＩ部位を含む。ＢｓｔＥＩＩを使用することの代
替策は、ＪＨ末端でのＵＲＥを介する切断、およびＣＨ１の部分をコードする合
成オリゴヌクレオチドへの連結である。
【０１１４】
本発明の方法を使用するＤＮＡ配列のファミリーを調製する１つの例として、
ヒトＣＤＲ３多様性を捕捉することが挙げられる。上記のように、種々の自己免
疫の患者からのｍＲＮＡは、ｃＤＮＡへ逆転写される。ｍＲＮＡが分解された後
、ｃＤＮＡを固定化し、そして短いオリゴヌクレオチドを使用してｃＤＮＡ上流
のＣＤＲ３を切断する。次いで、部分的に二重鎖の合成ＤＮＡアダプターは、Ｄ
ＮＡにアニーリングされ、そしてこのＤＮＡは、アダプターに対するプライマー
および定常領域（ＦＲ４の後）に対するプライマーを使用して増幅される。次い
で、ＤＮＡはＢｓｔＥＩＩ（ＦＲ４中）および部分的二本鎖アダプター（例えば
、ＸｂａＩおよびＡｆｌＩＩ（ＦＲ３中））に適切な制限エンドヌクレアーゼを
使用して切断される。次いで、ＤＮＡは合成ＶＨ骨格（例えば、３〜２３）に連
結される。
【０１１５】
ＵＲＥ方法を使用して切断された一本鎖ＤＮＡを調製する１つの例として、ヒ
トκ鎖が挙げられる。この鎖のセンス鎖の切断部位は、表５１２に示される。オ
リゴヌクレオチドｋａｐｅｘｔＵＲＥは、オリゴヌクレオチド（ｋａＢＲ０１Ｕ
Ｒ、ｋａＢＲ０２ＵＲ、ｋａＢＲ０３ＵＲ、およびｋａＢＲ０４ＵＲ）にアニー
リングされて部分的二重鎖ＤＮＡを形成する。次いで、このＤＮＡは、切断され
た可溶性のκ鎖に連結される。次いで、連結産物は、プライマーｋａｐｅｘｔＵ
ＲＥＰＣＲおよびＣＫＦｏｒｅＡｓｃ（これは、Ｃκ末端後のＡｓｃＩ部位に挿
入する）を使用して増幅される。次いで、この産物は、ＡｐａＬＩおよびＡｓｃ
Ｉを用いて切断され、そして同様にレシピエントベクターを切断するために連結
される。
【０１１６】
別の例としては、表５１５に示される切断が挙げられる。切断後、エクステン
ダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）（ＯＮ＿ＬａｍＥｘ１３３）オリゴヌクレオチドおよ
び４つのブリッジ（ｂｒｉｄｇｅ）オリゴヌクレオチド（ＯＮ＿ＬａｍＢ１−１
３３、ＯＮ＿ＬａｍＢ２−１３３、ＯＮ＿ＬａｍＢ３−１３３およびＯＮ＿Ｌａ
ｍＢ４−１３３）は、アニーリングされて部分的二重鎖ＤＮＡを形成する。この
ＤＮＡは、切断されたλ鎖センス鎖に連結される。連結後、ＤＮＡは、ＯＮ＿Ｌ
ａｍ１３３ＰＣＲおよびλ定常ドメインに特異的な前進プライマー（例えば、Ｃ
Ｌ２ＦｏｒｅＡｓｃまたはＣＬ７ＦｏｒｅＡｓｃ（表１３０））を用いて増幅さ
れる。
【０１１７】
ヒト重鎖において、ＦＲ４のほとんど全ての遺伝子は、ヒト重鎖Ｖ遺伝子の非
常に大きな画分中の定常位置で生じるＢｓｔＥＩＩ部位で切断され得る（下流、
すなわち、ＣＤＲ３のセンス鎖の３’末端へ向かって）。次いで、ＣＤＲ３の多
様性のみが捕捉される場合、ＦＲ３中の部位が、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の多様
性が所望される場合、ＦＲ２中の部位が、またはＣＤＲの多様性全てが所望され
る場合、ＦＲ１中の部位が必要である。これらの部位は、好ましくは、部分的二
重鎖のアダプターの一部として挿入される。
【０１１８】
本発明の好ましいプロセスは、軽鎖または重鎖のいずれかのクローニングを可
能にする部位を有するレシピエントベクターを提供することである。このような
ベクターは、周知であり、当該分野で広く使用される。本発明に従った好ましい
ファージ提示ベクターは、ファージＭＡＬＩＡ３である。これは、遺伝子ＩＩＩ
において提示する。ファージＭＡＬＩＡ３の配列を、表１２０Ａ（注釈付）およ
び表１２０Ｂ（要約）に示す。
【０１１９】
軽鎖または重鎖の選択された領域をコードするＤＮＡを、軽鎖または重鎖のい
ずれかを非常に稀にしか切断しないエンドヌクレアーゼを使用してベクターに移
入し得る。例えば、軽鎖は、ＡｐａＬＩおよびＡｓｃＩによって捕捉される。重
鎖遺伝子は、好ましくは、ＳｆｉＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、ＡｆｌＩＩ、Ｂｓｔ
ＥＩＩ、ＡｐａＩおよびＮｏｔＩ部位を有するレシピエントベクターにクローニ
ングされる。軽鎖は、好ましくは、ＡｐａＬＩ−ＡｓｃＩフラグメントとしてラ
イブラリー中に移される。重鎖は、好ましくは、ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩフラグメン
トとしてライブラリーに移される。
【０１２０】
最も好ましくは、この提示は、Ｍ１３ファージの誘導体の表面上に有される。
最も好ましいベクターは、Ｍ１３の全ての遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、および
提示カセットを含む。好ましいベクターは、遺伝子の多様なファミリーのメンバ
ーの導入および切除を可能にする制限部位をカセットとして提供される。好まし
いベクターは、ファージを増幅させるために使用される増殖条件下での再編成に
対して安定である。
【０１２１】
本発明の別の実施形態において、本発明の方法によって捕捉される多様性は、
ＩＩＩタンパク質上にペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を提示するファ
スミドベクター（例えば、ｐＣＥＳ１）において提示され得る。このようなベク
ターはまた、他のベクターまたはファージを使用する引き続く提示のための多様
性を保存するために使用され得る。
【０１２２】
別の実施形態において、提示の様式は、３つの可能性のあるアンカードメイン
に対する短いリンカーを介し得る。Ｍ１３ ＩＩＩ（「ＩＩＩスタンプ」）の最
終部分である１つのアンカードメイン、全長ＩＩＩ成熟タンパク質である第二の
アンカー、およびＭ１３ ＶＩＩＩ成熟タンパク質である第三のアンカー。
【０１２３】
ＩＩＩスタンプフラグメントは、ファージに構築するためのＭ１３ ＩＩＩを
十分に含むが、感染性の媒介に関するドメインを含まない。野生型のＩＩＩおよ
びＶＩＩＩタンパク質が存在することから、このファージは、抗体遺伝子を除去
しないようであるが、非常に低い増殖の利点のみを受けるこれらのセグメントを
欠失する。各々のアンカードメインのために、このＤＮＡは野生型のＡＡ配列を
コードするが、非常に高い程度で野生型のＤＮＡ配列とは異なる。これは、提示
アンカーと野生型遺伝子（これもまた存在する）との間の相同組換えの可能性を
非常に減少させる。
【０１２４】
最も好ましくは、本発明は、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性
遺伝子）および提示カセットを保有する完全なファージを使用する。野生型ｉｉ
ｉおよびｖｉｉｉ遺伝子が存在することから、野生型タンパク質もまた存在する
。この提示カセットは、調節可能なプロモーター（例えば、ＰＬａｃＺ）から転
写される。調節可能なプロモーターの使用は、対応する野生型コートタンパク質
に対する融合提示遺伝子の比を制御することを可能にする。この比は、ファージ
（またはファスミド）粒子当たりの提示融合の平均コピー数を決定する。
【０１２５】
本発明の別の局面は、糸状ファージ上にペプチド、ポリペプチドまたはタンパ
ク質（および特にＦａｂ）を提示する方法である。最も好ましい実施形態におい
て、この方法は、ＦＡＢを提示し、以下を包含する：
ａ）以下のエレメントをコードするＤＮＡの断片の送達を捕捉するカセットを得
る工程：
Ｐｒｅｇ：：ＲＢＳ１：：ＳＳ１：：ＶＬ：：ＣＬ：：停止：：ＲＢＳ２：：
ＳＳ２：：ＶＨ：：ＣＨ１：：リンカー：：アンカー：：停止：：、
ここで、Ｐｒｅｇは、調節可能なプロモーターであり、ＰＢＳ１は、第一のリボ
ソーム結合部位であり、ＳＳ１は、宿主株において作動可能なシグナル配列であ
り、ＶＬは、軽鎖可変領域の種々のセットのメンバーであり、ＣＬは、軽鎖定常
領域であり、停止は、１以上の停止コドンであり、ＰＢＳ２は、第二のリボソー
ム結合部位であり、ＳＳ２は、宿主株において作動可能な第二のシグナル配列で
あり、ＶＨは、重鎖可変領域の種々のセットのメンバーであり、ＣＨ１は、抗体
重鎖の第一の定常領域であり、リンカーは、１〜約５０残基のアミノ酸の配列で
あり、アンカーは、糸状ファージ粒子に構築されるタンパク質であり、そして停
止は、１以上の停止コドンの第二の例である；ならびに
ｂ）ファージの生存性を最大化し、そしてこのカセットまたはその部分の欠失の
可能性を最小化するためにファージゲノム内にカセットを配置する工程。
【０１２６】
上記の好ましいカセット中のアンカータンパク質をコードするＤＮＡは、同じ
（または密接に関連する）アミノ酸配列（ファージのコートタンパク質の１つに
見出されるような）をコードするが、別個のＤＮＡ配列を有するように設計され
る。これは、野生型遺伝子との望まない相同組換えを防止する。さらに、このカ
セットは、遺伝子間領域に配置されるべきである。提示カセットの配置および方
向は、ファージの挙動に影響し得る。
【０１２７】
本発明の１つの実施形態において、転写ターミネーターは、上記の提示カセッ
トの第二の停止（例えば、Ｔｒｐ）の後に配置され得る。これは、提示カセット
とファージ抗体提示ベクター（ＰＡＤＶ）中の他の遺伝子との間の相互作用を減
少させる。
【０１２８】
本発明の方法の別の実施形態において、このファージまたはファージミドは、
Ｆａｂ以外のタンパク質を、他のタンパク質遺伝子で置換することによって、上
記のＦａｂ部分を提示し得る。
【０１２９】
種々の宿主を、本発明の提示ファージまたはファージミドの増殖のために使用
し得る。このような宿主は、当該分野で周知である。好ましい実施形態において
、Ｆａｂが提示される場合、好ましい宿主は３０℃で増殖し、そしてＲｅｃＡ−
（望まない遺伝子組み換えを減少させるため）およびＥｎｄＡ−（ＲＦ ＤＮＡ
の回収を容易化するため）であり得る。エレクトロポレーションによって容易に
形質転換される宿主株もまた好ましい。
【０１３０】
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’は、これらの好ましさのほとんどを満足させるが
、３０℃ではあまり増殖しない。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’は、３８℃でゆっ
くりと増殖し、従って、許容可能な宿主である。ＴＧ−１はまた、中間宿主とし
てより好ましいが、ＲｅｃＡ＋およびＥｎｄＡ＋である。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｍ
ＲＦ’は、ライブラリーの最終構築の前の多様性を蓄積するために使用される中
間宿主としてより好ましい。
【０１３１】
提示後、本発明のライブラリーを、周知かつ慣用的に使用される技術を使用し
てスクリーニングし得る。次いで、選択されたペプチド、ポリペプチドまたはタ
ンパク質を、疾患を処置するために使用し得る。一般に、治療または薬学的組成
物における使用のためのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を、選択され
るライブラリーのメンバーから所望のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質
をコードするＤＮＡを単離することによって生成する。次いで、このＤＮＡを、
慣用的な方法において使用して、適切な宿主細胞、好ましくは、哺乳動物細胞（
例えば、ＣＨＯ細胞）においてコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタン
パク質を生成する。単離後、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を、単独
でか、または疾患を処置するための治療において薬学的に受容可能な組成物と共
に使用する。
【実施例】
【０１３２】
（実施例）
（実施例１：ＢｓｍＡＩを用いるκ鎖の捕捉）
ヒトκ鎖ｍＲＮＡのレパートリーを、種々の自己免疫疾患を有する患者の集団
から単離した総ＲＮＡまたはポリ（Ａ＋）ＲＮＡを仔ウシ腸ホスファターゼで処
理して、例えば、リボソームＲＮＡ、フラグメント化ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび
ゲノムＤＮＡを有する全ての分子から５’−リン酸を除去することによって調製
した。全長のｍＲＮＡ（保護的７−メチルキャップ構造を含む）は、影響されな
い。次いで、ＲＮＡを、タバコ酸ピロホスファターゼで処理して、５’−一リン
酸基を残して全長のｍＲＮＡからキャップ構造を除去する。
【０１３３】
全長のｍＲＮＡを、５’末端でアダプターによって改変し、次いで、逆転写し
、そしてＧｅｎｅｒＲＡＣＥＴＭ方法およびキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を
使用して増幅した。アダプターに相補的な５’ビオチン化プライマー、および構
築物の領域の一部に相補的な３’プライマーを使用した。
【０１３４】
上方の鎖の５’末端にビオチンを結合した約２マイクログラム（μｇ）のヒト
κ鎖（Ｉｇκ）遺伝子ＲＡＣＥ材料を、２００マイクロリットル（μＬ）のＳｅ
ｒａｄｙｎ磁気ビーズ上に固定した。下方の鎖を、２アリコートの２００μＬの
０．１Ｍ ＮａＯＨ（ｐＨ１３）で、第一のアリコートについて３分間、次いで
第二のアリコートについて３０秒間、ＤＮＡを洗浄することによって除去した。
これらのビーズを、２００μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）１００ｍＭ
ＮａＣｌで中和した。表５２５に示した短いオリゴヌクレオチドを、１００μ
ＬのＮＥＢ緩衝液２（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ジチオトレイトール ｐＨ７．９）中に４０倍モル
過剰に、乾燥ビーズに添加した。この混合物を、９５℃で５分間インキュベート
し、次いで、３０分かけて５５℃まで冷却した。過剰なオリゴヌクレオチドを、
ＮＥＢ緩衝液３（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ジチオトレイトール ｐＨ７．９）で２回洗浄して除
去した。１０単位のＢｓｍＡＩ（ＮＥＢ）を、ＮＥＢ緩衝液３に添加し、そして
５５℃で１時間インキュベートした。切断された下流のＤＮＡを、収集し、そし
てＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製カラムで精製した（図３および図４）。
【０１３５】
部分的に二本鎖のアダプターを、表５２５に示したオリゴヌクレオチドを使用
して調製した。このアダプターを、１０００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥ
Ｂ）と共に１００倍モル過剰に一本鎖ＤＮＡに添加し、そして１６℃で一晩イン
キュベートした。過剰なオリゴヌクレオチドを、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製カラ
ムで除去した。この連結材料を、表５２５に示したプライマーｋａｐＰＣＲｔ１
およびｋａｐｆｏｒを使用するＰＣＲによって、表５３０に示したプログラムで
１０サイクル増幅した。
【０１３６】
可溶性ＰＣＲ産物を、ゲルで泳動し、そして予測されるような約７００ｎのバ
ンドを示した（図５および図６）。このＤＮＡを、酵素ＡｐａＬＩおよびＡｓｃ
Ｉで切断し、ゲル精製し、そして同様に切断したベクターｐＣＥＳ１に連結した
。正確なサイズの挿入物の存在を、図１５に示したように、いくつかのクローン
でＰＣＲによってチェックした。
【０１３７】
表５００は、この手順によって捕捉されたκ軽鎖のＤＮＡ配列を示す。表５０
１は、この手順によって捕捉された第二の配列を示す。最も近い架橋配列は、配
列５’−ａｇｃｃａｃｃ−３’に相補的であったが、捕捉された配列は５’−Ｔ
ｇｃｃａｃｃ−３’と読め、これは、重複領域中にいくつかのミスマッチを寛容
したことを示す。
【０１３８】
（実施例２：Ｖ−３−２３ ＶＨフレームワークにおける合成ＣＤＲ１および
ＣＤＲ２の多様性の構築）
合成相補性決定基領域（ＣＤＲ）１および２の多様性を、二段階のプロセスで
３−２３ ＶＨフレームワークにおいて構築した：第一に、３−２３ ＶＨフレ
ームワークを含むベクターを構築し、次いで、合成ＣＤＲ１および２を、構築し
てこのベクター中にクローニングした。
【０１３９】
Ｖ３−２３フレームワークの構築のために、重複する８つのオリゴおよび２つ
のＰＣＲプライマー（表６００に示した長いオリゴヌクレオチド：ＴＯＰＦＲ１
Ａ、ＢＯＴＦＲ１Ｂ、ＢＯＴＦＲ２、ＢＯＴＦＲ３、Ｆ０６、ＢＯＴＦＲ４、Ｏ
Ｎ−ｖｇＣ１、およびＯＮ−ｖｇＣ２ならびにプライマー：ＳＦＰＲＥＭＴおよ
びＢＯＴＰＣＲＰＲＩＭ）を、Ｖ３２３ ＶＨのＧｅｎｂａｎｋの配列に基づい
て設計した。この設計は、表６００に示されるような、各々のフレームワークに
おける少なくとも１つの有用な制限部位を取り込んだ。表６００において、合成
された断片を太字として示し、重複する領域に下線を付し、そして各末端でのＰ
ＣＲプライマー領域に下線を付した。これら８つのオリゴの混合物を、２０μｌ
のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応中の２．５μＭの最終濃度で組み合わせ
た。このＰＣＲ混合物は、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０
．０２Ｕ Ｐｆｕ ＴｕｒｂｏＴＭＤＮＡポリメラーゼ、１Ｕ Ｑｉａｇｅｎ
ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、および１×Ｑｉａｇｅｎ
ＰＣＲ緩衝液を含んだ。このＰＣＲプログラムは、９４℃で３０秒、５５℃で３
０秒、および７２℃で３０秒の１０サイクルからなった。次いで、１００μｌ
ＰＣＲ反応における最初のＰＣＲからの１０倍希釈の２．５μｌを使用して、構
築されたＶ３−２３ ＤＮＡ配列を増幅した。このＰＣＲ反応は、２００μＭ
ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２Ｕ Ｐｆｕ ＴｕｒｂｏＴＭＤＮ
Ａポリメラーゼ、１Ｕ Ｑｉａｇｅｎ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ポ
リメラーゼ、１×Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ緩衝液、および１μＭの濃度での２つの
外側のプライマー（ＳＦＰＲＭＥＴおよびＢＯＴＰＣＲＰＲＩＭ）を含んだ。こ
のＰＣＲプログラムは、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で６０
秒の２３サイクルからなった。このＶ３−２３ ＶＨ ＤＮＡ配列を、設計し、
そしてＳｆｉＩおよびＢｓｔＥＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を使用してｐＣ
ＥＳ１（ファスミドベクター）にクローニングした（本明細書中で記載した全て
の制限酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍ
Ａによって供給され、そして製造業者の指示通りに使用した）。
【０１４０】
ＣＤＲ１／ＣＤＲ２多様性のクローニング前に、スタッファー（ｓｔｕｆｆｅ
ｒ）配列（表６１０および表６２０に示す）を、ｐＣＥＳ１に導入してＣＤＲ１
／ＣＤＲ２配列（ＢｓｐＥＩ制限酵素部位とＸｂａＩ制限酵素部位との間の９０
０塩基）およびＣＤＲ３配列（ＡｆｌＩＩとＢｓｔＥＩＩとの間の３５８塩基）
を置換した。新規のベクターは、ｐＣＥＳ５であり、そしてその配列を、表６２
０に与える。ＣＤＲの代わりにスタッファーを有することは、親配列がライブラ
リーにおいて過剰に提示される危険性を回避する。このＣＤＲ１−２スタッファ
ーは、ＢｇｌＩＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｃｌＩ、ＸｃｍＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩＩ
、ＨｐａＩおよびＨｉｎｃＩＩについての制限部位、ベクターｐＣＥＳ５内に独
自である、強調された領域を含む。ＣＤＲ３を置換するこのスタッファーは、独
自の制限エンドヌクレアーゼ部位、ＲｓｒＩＩを含む。このスタッファー配列は
、Ｅ．ｃｏｌｉのペニシリン遺伝子由来のフラグメントである。
【０１４１】
ＣＤＲ１およびＣＤＲ２多様性の構築のために、ＣＤＲ１／２および隣接領域
をコードする４つの重複オリゴヌクレオチド（表６００および表６３０に示した
ＯＮ−ｖｇＣ１、ＯＮ＿Ｂｒ１２、ＯＮ＿ＣＤ２Ｘｂａ、およびＯＮ−ｖｇＣ２
）を設計した。これら４つのオリゴの混合物を、４０μｌ ＰＣＲ反応物中２．
５μＭの最終濃度で組み合わせた。４つのオリゴのうち２つは、ＣＤＲ１および
ＣＤＲ２に位置する、変化させた配列を含んだ。このＰＣＲ混合物は、２００μ
Ｍ ｄＮＴＰ、２．５Ｕ Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、および
２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む１×Ｐｗｏ ＰＣＲ緩衝液を含んだ。このＰＣＲプロ
グラムは、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で６０秒の１０サイ
クルからなった。これは、１００μｌ ＰＣＲ反応物中の２．５μｌの混合物を
使用して、増幅されたＣＤＲ１／２ ＤＮＡ配列を構築した。このＰＣＲ反応物
は、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５Ｕ Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、２ｍＭ
ＭｇＳＯ４を含む１×Ｐｗｏ ＰＣＲ緩衝液、および１μＭの濃度で２つの外側
のプライマーを含んだ。このＰＣＲプログラムは、９４℃で３０秒、６０℃で３
０秒、および７２℃で６０秒の１０サイクルからなった。これらの変化された配
列を、消化し、そしてＣＤＲ１／２スタッファーの代わりにＶ３−２３フレーム
ワーク中にクローニングした。
【０１４２】
本発明者らは、約７×１０７の独立形質転換体を得た。この多様性に、本発明
者らは、ドナー集団または合成ＤＮＡのいずれかからＣＤＲ３多様性をクローニ
ングし得る。
【０１４３】
上記は、本発明の原理を例示するのみであり、そして本発明の範囲および精神
から逸脱することなく当業者によって種々の改変がなされ得ることが理解される。
【０１４４】
【表１−１】
【０１４５】
【表１−２】
【０１４６】
【表２−１】
【０１４７】
【表２−２】
【０１４８】
【表３−１】
【０１４９】
【表３−２】
【０１５０】
【表３−３】
【０１５１】
【表４−１】
【０１５２】
【表４−２】
【０１５３】
【表５】
【０１５４】
【表６−１】
【０１５５】
【表６−２】
【０１５６】
【表６−３】
【０１５７】
【表６−４】
【０１５８】
【表６−５】
【０１５９】
【表７−１】
【０１６０】
【表７−２】
【０１６１】
【表７−３】
【０１６２】
【表７−４】
【０１６３】
【表７−５】
【０１６４】
【表８】
【０１６５】
【表９−１】
【０１６６】
【表９−２】
【０１６７】
【表１０】
【０１６８】
【表１１−１】
【０１６９】
【表１１−２】
【０１７０】
【表１１−３】
【０１７１】
【表１１−４】
【０１７２】
【表１１−５】
【０１７３】
【表１１−６】
【０１７４】
【表１１−７】
【０１７５】
【表１１−８】
【０１７６】
【表１１−９】
【０１７７】
【表１１−１０】
【０１７８】
【表１１−１１】
【０１７９】
【表１１−１２】
【０１８０】
【表１１−１３】
【０１８１】
【表１１−１４】
【０１８２】
【表１１−１５】
【０１８３】
【表１１−１６】
【０１８４】
【表１１−１７】
【０１８５】
【表１１−１８】
【０１８６】
【表１２−１】
【０１８７】
【表１２−２】
【０１８８】
【表１２−３】
【０１８９】
【表１２−４】
【０１９０】
【表１２−５】
【０１９１】
【表１２−６】
【０１９２】
【表１２−７】
【０１９３】
【表１２−８】
【０１９４】
【表１２−９】
【０１９５】
【表１３】
【０１９６】
【表１４−１】
【０１９７】
【表１４−２】
【０１９８】
【表１４−３】
【０１９９】
【表１５−１】
【０２００】
【表１５−２】
【０２０１】
【表１５−３】
【０２０２】
【表１５−４】
【０２０３】
【表１５−５】
【０２０４】
【表１５−６】
【０２０５】
【表１５−７】
【０２０６】
【表１５−８】
【０２０７】
【表１５−９】
【０２０８】
【表１６−１】
【０２０９】
【表１６−２】
【０２１０】
【表１６−３】
【０２１１】
【表１６−４】
【０２１２】
【表１７】
【０２１３】
【表１８−１】
【０２１４】
【表１８−２】
【０２１５】
【表１８−３】
【０２１６】
【表１９−１】
【０２１７】
【表１９−２】
【０２１８】
【表１９−３】
【０２１９】
【表１９−４】
【０２２０】
【表１９−５】
【０２２１】
【表１９−６】
【０２２２】
【表１９−７】
【０２２３】
【表１９−８】
【０２２４】
【表２０−１】
【０２２５】
【表２０−２】
【０２２６】
【表２０−３】
【０２２７】
【表２１−１】
【０２２８】
【表２１−２】
【０２２９】
【表２１−３】
【０２３０】
【表２１−４】
【０２３１】
【表２１−５】
【０２３２】
【表２２−１】
【０２３３】
【表２２−２】
【０２３４】
【表２２−３】
【０２３５】
【表２３−１】
【０２３６】
【表２３−２】
【０２３７】
【表２３−３】
【０２３８】
【表２３−４】
【０２３９】
【表２３−５】
【０２４０】
【表２４−１】
【０２４１】
【表２４−２】
【０２４２】
【０２４３】
【表２５−１】
【０２４４】
【表２５−２】
【０２４５】
【表２６】
【０２４６】
【表２７−１】
【０２４７】
【表２７−２】
【０２４８】
【表２７−３】
【０２４９】
【表２７−４】
【０２５０】
【表２７−５】
【０２５１】
【表２７−６】
【０２５２】
【表２７−７】
【０２５３】
【表２７−８】
【０２５４】
【表２７−９】
【０２５５】
【表２７−１０】
【０２５６】
【表２７−１１】
【０２５７】
【表２７−１２】
【０２５８】
【表２７−１３】
【０２５９】
【表２７−１４】
【０２６０】
【表２８−１】
【０２６１】
【表２８−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載される発明。
【請求項１】
本明細書中に記載される発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１３５８９３（Ｐ２０１１−１３５８９３Ａ）
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−４４５２５（Ｐ２０１１−４４５２５）
【出願日】平成２３年３月１日（２０１１．３．１）
【分割の表示】特願２００１−５７７４６４（Ｐ２００１−５７７４６４）の分割
【原出願日】平成１３年４月１７日（２００１．４．１７）
【出願人】（５０２０２４１２２）ダイアックス コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４４５２５（Ｐ２０１１−４４５２５）
【出願日】平成２３年３月１日（２０１１．３．１）
【分割の表示】特願２００１−５７７４６４（Ｐ２００１−５７７４６４）の分割
【原出願日】平成１３年４月１７日（２００１．４．１７）
【出願人】（５０２０２４１２２）ダイアックス コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
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