ペプチドイメージング剤
本発明は、インビボでの光学イメージングのために適した標識ｃＭｅｔ結合ペプチドに関する。かかるペプチドは、赤色乃至近赤外領域でのイメージングに適した光学レポーター基で標識されている。また、医薬品組成物及びキット、並びに特に病気進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は結腸直腸癌（ＣＲＣ）の治療のモニタリングで使用するためのインビボイメージング方法も開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボでの光学イメージングのために適した標識ｃＭｅｔ結合ペプチドに関する。かかるペプチドは、赤色乃至近赤外領域でのイメージングのために適した光学レポーター基で標識されている。また、特に結腸直腸癌（ＣＲＣ）の診断で使用するためのインビボイメージング方法も開示される。
【背景技術】
【０００２】
国際公開第２００５／０３０２６６号には、結腸直腸癌（ＣＲＣ）の早期診断に対する医学的ニーズが存在することが開示されている。国際公開第２００５／０３０２６６号は、ＣＲＣで異常に発現される生物学的標的に対して親和性を有する光学イメージング用造影剤を開示している。生物学的標的は、ＣＯＸ−２、β−カテニン、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、各種キナーゼ、Ｈｅｒ−２、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、サイクリン、Ｐ５３、チミジル酸シンターゼ、ＶＥＧＦレセプター、ＥＧＦレセプター、Ｋ−ラス、腺腫性結腸ポリポーシスタンパク質、カテプシンＢ、ｕＰＡＲ、ｃＭｅｔ、ムチン及びガストリンレセプターから選択される。好ましいかかる標的（７頁１１〜１２行目）は、ｃＭｅｔ、ＭＭＰ−１４、ＣＯＸ−２、β−カテニン及びカテプシンＢであると言われている。国際公開第２００５／０３０２６６号のベクターは、ペプチド、ペプトイド部分、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、脂質関連化合物又は伝統的な有機薬物様小分子であり得る。レポーター部分は、好ましくは、電磁スペクトルの紫外部分から赤外部分までの波長領域の光と相互作用する色素である。
【０００３】
散乱因子（ＳＦ）としても知られる肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は、治癒や血管形成のような各種の生理学的過程に関与する成長因子である。ＨＧＦとその高親和性レセプター（ｃＭｅｔ）との相互作用は、腫瘍の成長、浸潤及び転移に関係している。
【０００４】
Ｋｎｕｄｓｅｎ ｅｔ ａｌは、イメージング及び治療への応用可能性と共に、前立腺癌におけるＨＧＦ及びｃＭｅｔの役割を総説している［Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，９１，３１−６７（２００４）］。診断及び治療用の標識抗ｍｅｔ抗体は、国際公開第０３／０５７１５５号に記載されている。
【０００５】
国際公開第２００４／０７８７７８号は、ｃＭｅｔ又はｃＭｅｔ及びＨＧＦを含む複合体と結合するポリペプチド又は多量体ペプチド構築物を開示している。約１０の異なるペプチド構造クラスが記載されている。国際公開第２００４／０７８７７８号には、インビトロ及びインビボ用途のための検出可能な標識或いは治療用途のための薬物でペプチドを標識できることが開示されている。検出可能な標識は、酵素、蛍光化合物、光学色素、常磁性金属イオン、超音波造影剤又は放射性核種であり得る。国際公開第２００４／０７８７７８号の好ましい標識は放射性核種又は常磁性金属であると述べられており、最も好ましくは金属キレーターでキレート化された金属からなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００５／０３０２６６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０５７１５５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／０７８７７８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００６／０８２４３４号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００５／０５８３７１号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００５／０４４３１３号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００６／１１５６３３号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｎｕｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９１，３１−６７（２００４）．
【非特許文献２】Ｂｅｒｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５１，１６９９−１７１２（２００３）．
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、インビボ光学イメージングのために適したイメージング剤であって、ｃＭｅｔ結合環状ペプチドと、５００〜１２００ｎｍの緑色乃至近赤外波長を有する光を用いて哺乳動物体のインビボイメージングを行うために適した光学レポーターイメージング成分とを含んでなるイメージング剤を提供する。ｃＭｅｔ結合環状ペプチドは、国際公開第２００４／０７８７７８号のペプチド構造クラスの１つに関係していて、ｃＭｅｔに対して最適の結合親和性を有する。これらのペプチドは、国際公開第２００４／０７８７７８号に記載されているように、ファージディスプレイから導かれ、ｃＭｅｔに対する親和性及びＨＧＦとの競合の欠如によって選択された。本発明のｃＭＢＰ結合ペプチドは、好ましくはその末端の少なくとも一方が代謝阻害基（ＭIG）で保護されている。これはインビボ用途にとって重要な考慮事項であり、さもないと内在酵素及びペプチダーゼがペプチダーゼを急速に代謝させ、その結果としてｃＭｅｔ結合親和性の喪失、したがってインビボでの選択的標的化の喪失を招く。
【０００９】
本発明は、インビボでｃＭｅｔ結合ペプチドを使用する最良の方法は他のイメージングモダリティー（例えば、核、ＭＲＩ又は超音波）と違って光学レポーターの使用を必要とすることを教示すると共に、好ましい光学イメージングレポーターも提供する。緑色乃至近赤外領域（５００〜１２００ｎｍの波長を有する光）が好ましいが、これはその領域がヘモグロビン、ポルフィリン類、メラニン及びコラーゲンのような内在組織及び物質と最小のスペクトルオーバーラップを有するからである［Ｌｉｃｈａ，Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）］。自発蛍光に寄与する他の重要な物質はＮＡＤＨ、ＦＡＤ及びエラスチンである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
第１の態様では、本発明は次の式Ｉのコンジュゲートを含んでなるイメージング剤を提供する。
【００１１】
【化１】
式中、
Ｚ1はｃＭＢＰのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭIGであり、
Ｚ2はｃＭＢＰのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢc（式中、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）又はＭIGであり、
ｃＭＢＰは、以下のアミノ酸配列（配列番号１）を含む１７〜３０アミノ酸のｃＭｅｔ結合環状ペプチドであり、
Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
（式中、Ｘ1はＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＴｙｒであり、Ｘ2はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｓｎであり、Ｘ3はＴｈｒ又はＡｒｇであり、Ｘ4はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ5はＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ6はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｃｙｓa-dの各々はシステイン残基であって、残基ａ及びｂ並びに残部ｃ及びｄは環化して２つの独立したジスルフィド結合を形成している。）
ＭIGは、ｃＭＢＰペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基からなる代謝阻害基であり、
Ｌは式−（Ａ）m−（式中、Ａは独立に−ＣＲ2−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ2−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ2ＮＲ−、−ＮＲＳＯ2−、−ＣＲ2ＯＣＲ2−、−ＣＲ2ＳＣＲ2−、−ＣＲ2ＮＲＣＲ2−、Ｃ4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基又はＣ3-12ヘテロアリーレン基、或いはアミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4アルケニル、Ｃ2-4アルキニル、Ｃ1-4アルコキシアルキル及びＣ1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。）の合成リンカー基であり、
ｎは０又は１の値を有する整数であり、
ＩＭは、６００〜１２００ｎｍの緑色乃至近赤外波長を有する光を用いて哺乳動物体のインビボイメージングを行うために適した光学レポーターイメージング成分である。
【００１２】
「イメージング剤」という用語は、哺乳動物体のインビボイメージングを行うために適した化合物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒト被験体である。イメージングは侵襲的（例えば、手術中検査又は内視鏡検査）であってもよいし、或いは非侵襲的であってもよい。好ましいイメージング方法は内視鏡検査である。式Ｉのコンジュゲートはインビボイメージングのために適するが、インビトロ用途（例えば、生物学的試料中のｃＭｅｔを定量するアッセイ又は組織試料中のｃＭｅｔの可視化）も有し得る。好ましくは、イメージング剤はインビボイメージングのために使用される。
【００１３】
Ｚ1基は、最後のアミノ酸残基のアミン基を置換する。したがって、Ｚ1がＨである場合、ｃＭＢＰのアミノ末端は最後のアミノ酸残基の遊離ＮＨ2基で終わる。Ｚ2基は、最後のアミノ酸残基のカルボニル基を置換する。したがって、Ｚ2がＯＨである場合、ｃＭＢＰのカルボキシ末端は最後のアミノ酸残基の遊離ＣＯ2Ｈ基で終わり、Ｚ2がＯＢcである場合、末端カルボキシ基はＣＯ2Ｂc基としてイオン化される。
【００１４】
「代謝阻害基」（ＭIG）という用語は、アミノ末端（Ｚ1）又はカルボキシ末端（Ｚ2）におけるｃＭＢＰペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基を意味する。かかる基は当業者にとって公知であり、ペプチドのアミン末端については、好適にはＮ−アシル化基−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＲG（式中、アシル基−（Ｃ＝Ｏ）ＲGはＣ1-6アルキル基及びＣ3-10アリール基から選択されるＲGを有する。）から選択されるか、或いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位からなる。好適なＰＥＧ基は、リンカー基（Ｌ）に関して下記に記載される。好ましいかかるＰＥＧ基は、式ＩＡ又はＩＢのバイオモディファイアーである。好ましいかかるアミノ末端ＭIGは、アセチル、ベンジルオキシカルボニル又はトリフルオロアセチルであり、最も好ましくはアセチルである。
【００１５】
ペプチドのカルボキシ末端についての好適な代謝阻害基には、カルボキサミド、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、アミノアルコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位がある。ｃＭＢＰペプチドのカルボキシ末端アミノ酸残基についての好適なＭIG基は、アミノ酸残基の末端アミンがＣ1-4アルキル基（好ましくはメチル基）でＮ−アルキル化されている場合である。好ましいかかるＭIG基はカルボキサミド又はＰＥＧであり、最も好ましいかかる基はカルボキサミドである。
【００１６】
式Ｉは、−（Ｌ）n［ＩＭ］部分がＺ1、Ｚ2又はｃＭＢＰの任意適宜の位置に結合し得ることを表している。Ｚ1又はＺ2に関しては、Ｚ1／Ｚ2のいずれかがＭIGである場合、−（Ｌ）n［ＩＭ］部分はＭIG基に結合し得る。Ｚ1がＨ又はＺ2がＯＨである場合、Ｚ1又はＺ2位置における−（Ｌ）n［ＩＭ］部分の結合は、それぞれ式［ＩＭ］−（Ｌ）n−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2又はＺ1−［ｃＭＢＰ］−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物を与える。いずれかのペプチド末端におけるｃＭＢＰの代謝の阻害は、−（Ｌ）n［ＩＭ］部分をこのように結合することでも達成できるが、−（Ｌ）n［ＩＭ］は本発明のＭIGの定義範囲外である。
【００１７】
式Ｉの−（Ｌ）n−部分は、ＩＭの任意適宜の位置に結合し得る。−（Ｌ）n−部分は、ＩＭの既存の置換基に取って代わるか、或いはＩＭの既存の置換基に共有結合する。−（Ｌ）n−部分は、好ましくはＩＭのカルボキシアルキル置換基を介して結合する。
【００１８】
「ｃＭｅｔ結合環状ペプチド（ｃＭＢＰ）」という用語は、ｃＭｅｔとしても知られる肝細胞成長因子（ＨＧＦ）高親和性レセプター（ｃＭｅｔ又は肝細胞成長因子レセプター）に結合するペプチドを意味する。本発明の好適なｃＭＢＰ無ペプチドは、ｃＭｅｔ／ＨＧＦ複合体のｃＭｅｔに関して約２０ｎＭ未満の見掛けＫＤを有している。ｃＭＢＰペプチドはプロリン残基を含み、かかる残基は主鎖アミド結合のシス／トランス異性化を示し得ることが知られている。本発明のｃＭＢＰペプチドは、任意のかかる異性体を含んでいる。
【００１９】
「生体適合性陽イオン」（Ｂc）という用語は、イオン化して負に帯電した基と共に塩を形成する正に帯電した対イオンを意味する。この場合、前記正に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳動物体（特に人体）への投与に適している。好適な生体適合性陽イオンの例には、アルカリ金属であるナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属であるカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンがある。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。
【００２０】
「アミノ酸」という用語は、Ｌ−又はＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）或いはアミノ酸模倣体を意味し、これらは天然のもの又は純粋に合成由来のものであってよく、光学的に純粋なもの（即ち、単一の鏡像異性体、したがってキラルなもの）であるか、或いは鏡像異性体の混合物であってよい。本明細書中では、アミノ酸に関する通常の三文字略語又は一文字略語が使用される。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋なものである。「アミノ酸模倣体」という用語は、アイソスター（即ち、天然化合物の立体構造及び電子構造を模倣するように設計されたもの）である天然アミノ酸の合成類似体を意味する。かかるアイソスターは当業者にとって公知であり、特に限定されないが、デプシペプチド、レトロ−インベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカン又は１，５−二置換テトラゾールを含む［Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２４，１３７（１９８５）を参照されたい］。
【００２１】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合（即ち、１つのアミノ酸のアミンを別のアミノ酸のカルボキシルに連結するアミド結合）によって連結された（上記に定義するような）２以上のアミノ酸を含む化合物を意味する。「ペプチド模倣体」又は「模倣体」という用語は、ペプチド又はタンパク質の生物学的活性を模倣するが、化学的性質がペプチド的でない（即ち、いかなるペプチド結合（つまり、アミノ酸間のアミド結合）も含まない）生物学的活性化合物をいう。ここでは、ペプチド模倣体という用語は広い意味で使用され、性質が完全にはペプチド的でない分子（例えば、プソイドペプチド、セミペプチド及びペプトイド）を包含する。
【００２２】
「光学レポーターイメージング成分」（ＩＭ）という用語は、緑色乃至近赤外波長（５００〜１２００ｎｍ、好ましくは６００〜１０００ｎｍ）を有する光を用いる光学イメージング方法で直接又は間接に検出できる蛍光色素又は発色団を意味する。
【００２３】
式Ｉのリンカー基−（Ａ）m−の役割の１つは、ＩＭをｃＭＢＰペプチドの活性部位から遠ざけることにあると想定されている。これが特に重要であるのは、イメージング成分が比較的バルキーである場合、酵素との相互作用が損なわれないようにするためである。これは、バルキーな基が活性部位から離れて位置する自由を与えるたわみ性（例えば、単純アルキル鎖）及び／又はＩＭを活性部位から離すように向ける剛性（例えば、シクロアルキル又はアリールスペーサー）を組み合わせることで達成できる。リンカー基の性質はまた、イメージング剤の生体分布を調整するためにも使用できる。即ち、例えばリンカー中にエーテル基を導入することは、血漿タンパク質結合を最小限に抑えるために役立つ。−（Ａ）m−がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位又は１〜１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖からなる場合、リンカー基はインビボでイメージング剤の薬物動態及び血中クリアランス速度を調整するために機能し得る。かかる「バイオモディファイアー」リンカー基は、バックグラウンド組織（例えば、筋肉又は肝臓）及び／又は血液からのイメージング剤のクリアランスを促進することで、バックグラウンド妨害を少なくして一層良好な診断画像を与えることができる。バイオモディファイアーリンカー基はまた、特定の排出経路（例えば、肝臓経由ではなく腎臓経由の排出）を有利にするためにも使用できる。
【００２４】
「糖」という用語は、単糖、二糖又は三糖を意味する。好適な糖には、グルコース、ガラクトース、マルトース、マンノース及びラクトースがある。任意には、アミノ酸への容易なカップリングを可能にするように糖を官能化することができる。即ち、例えばアミノ酸のグルコサミン誘導体は、ペプチド結合を介して他のアミノ酸に結合させることができる。（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社から商業的に入手できる）アスパラギンのグルコサミン誘導体はこれの一例である。
【００２５】
【化２】
好ましい特徴
イメージング剤の分子量は、好適には８０００ダルトン以下である。好ましくは、分子量は２８００〜６０００ダルトンの範囲内にあり、最も好ましくは３０００〜４５００ダルトンの範囲内にあり、３２００〜４０００ダルトンが特に好ましい。
【００２６】
本発明の好ましいイメージング剤は、両ペプチド末端がＭIG基によって保護されている。即ち、好ましくはＺ1及びＺ2が共にＭIGであり、これらは通常異なっている。上述の通り、Ｚ1／Ｚ2のいずれかが任意には−（Ｌ）n［ＩＭ］に等しくてよい。このようにして両ペプチド末端を保護することは、インビボイメージング剤用途にとって重要である。さもないと、急速な代謝の結果としてｃＭｅｔに対する選択的結合親和性の喪失が予想されるからである。Ｚ1及びＺ2が共にＭIGである場合、好ましくはＺ1はアセチルであり、Ｚ2は第一アミドである。最も好ましくは、Ｚ1はアセチルであり、Ｚ2は第一アミドであり、−（Ｌ）n［ＩＭ］部分はｃＭＢＰのリシン残基のε−アミン側鎖に結合している。
【００２７】
本発明の好ましいｃＭＢＰペプチドは、ｃＭｅｔ／ＨＧＦに対するｃＭｅｔの結合に関して（蛍光偏光アッセイ測定結果に基づいて）約１０ｎＭ未満のＫDを有し、最も好ましくは１〜５ｎＭの範囲内のＫDを有し、３ｎＭ未満が理想的である。
【００２８】
下記のように、式ＩのｃＭＢＰのペプチド配列（配列番号１）は１７量体のペプチド配列であり、これが主としてｃＭｅｔに対する選択的結合の原因をなす。
【００２９】
Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
（配列番号１）
本発明のｃＭＢＰペプチドが１７を超えるアミノ酸残基を含む場合、残りのアミノ酸はシステインは別にして任意のアミノ酸であり得る。追加の保護されないシステイン残基は、定義されたＣｙｓa−Ｃｙｓb及びＣｙｓc−Ｃｙｓdジスルフィドブリッジの不要のスクランブリングを引き起こすことがある。追加のペプチドは、好ましくは−（Ｌ）n［ＩＭ］部分の容易なコンジュゲーションのために適した側鎖を有する１以上のアミノ酸残基を含んでいる。好適なかかる残基としては、アミン官能化−（Ｌ）n［ＩＭ］基とのコンジュゲーションのためにはＡｓｐ又はＧｌｕ残基、或いはカルボキシ又は活性エステル官能化−（Ｌ）n［ＩＭ］基とのコンジュゲーションのためにはＬｙｓ残基がある。−（Ｌ）n［ＩＭ］のコンジュゲーションのためのアミノ酸残基は、好適にはｃＭＢＰペプチドの１７量体結合領域（配列番号１）から離れて位置しており、好ましくはＣ末端又はＮ末端に位置している。好ましくは、コンジュゲーションのためのアミノ酸残基はＬｙｓ残基である。
【００３０】
既知のアミノ酸置換体フェニルアラニン及びナフチルアラニンによる配列番号１のトリプトファン残基の置換を評価した。しかし、ｃＭｅｔ親和性の喪失が見出され、これはトリプトファン残基は活性のために重要であることを示唆している。
【００３１】
ｃＭＢＰペプチドは、さらにＮ末端セリン残基を含んで１８量体（配列番号２）を与えることが好ましい。
【００３２】
Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−
Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
（配列番号２）
配列番号１又は好ましくは配列番号２に加えて、ｃＭＢＰは最も好ましくはさらに下記のいずれかを含んでいる。
（ｉ）ｃＭＢＰペプチドのＣ−又はＮ−ペプチド末端の４アミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、−（Ｌ）nＩＭが前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基のカルボキシル側鎖に結合してアミド結合を与えるアミン基で官能化されている。
（ii）ｃＭＢＰペプチドのＣ−又はＮ−ペプチド末端の４アミノ酸残基中にＬｙｓ残基を含み、−（Ｌ）nＩＭが前記Ｌｙｓ残基のε−アミン側鎖に結合してアミド結合を与えるカルボキシル基で官能化されている。
【００３３】
好ましいｃＭＢＰペプチドは、下記の２２量体アミノ酸配列（配列番号３）を含んでいる。
【００３４】
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（配列番号３）
本発明のｃＭＢＰペプチドは、好ましくはＸ3がＡｒｇに等しい。
【００３５】
ｃＭＢＰペプチドは好ましくは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に加えて、さらに−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号４）、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号５）及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−（配列番号６）から選択されるリンカーペプチドをＮ末端又はＣ末端に含んでいる。リンカーペプチドのＬｙｓ残基は、−（Ｌ）n［ＩＭ］部分のコンジュゲーションのために最も好ましい位置である。特に好ましいｃＭＢＰペプチドは配列番号３を配列番号４のリンカーペプチドと共に含み、下記の２６量体アミノ酸配列（配列番号７）を有している。
【００３６】
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｔｙｒ−Ｃｙｓc−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号７）
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７のｃＭＢＰペプチドでは、好ましくはＺ1＝Ｚ2＝IGであり、最も好ましくはＺ1＝アセチルかつＺ2＝第一アミドである。
【００３７】
−（Ｌ）n［ＩＭ］部分は、好適にはＺ1又はＺ2のいずれかに結合しているか、或いは配列番号１のｃＭｅｔ結合配列と異なるｃＭＢＰペプチドのアミノ酸残基に結合している。好ましいアミノ酸残基及びコンジュゲーション部位は上述した通りである。−（Ｌ）n［ＩＭ］部分がＺ1又はＺ2に結合している場合、Ｎ末端又はＣ末端へのコンジュゲーションによってＺ1又はＺ2に置き換わり、そのようにしてインビボ代謝を阻止することができる。
【００３８】
好ましいＩＭ基は広範な非局在化電子系を有するものであって、例えば、シアニン類、メロシアニン類、インドシアニン類、フタロシアニン類、ナフタロシアニン類、トリフェニルメチン類、ポルフィリン類、ピリリウム色素、チアピリリウム色素、スクアリリウム色素、クロコニウム色素、アズレニウム色素、インドアニリン類、ベンゾフェノキサジニウム色素、ベンゾチアフェノチアジニウム色素、アントラキノン類、ナフトキノン類、インダスレン類、フタロイルアクリドン類、トリスフェノキノン類、アゾ色素、分子内及び分子間電荷移動色素及び色素錯体、トロポン類、テトラジン類、ビス（ジチオレン）錯体、ビス（ベンゼン−ジチオレート）錯体、インドアニリン色素、ビス（Ｓ，Ｏ−ジチオレン）錯体である。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び異なる吸収／発光特性を有するＧＦＰの変種のような蛍光タンパク質も有用である。特定の状況においてはある種の希土類金属（例えば、ユウロピウム、サマリウム、テルビウム又はジスプロシウム）の錯体が使用され、蛍光ナノ結晶（量子ドット）についても同様である。
【００３９】
使用できる発色団の具体例には、フルオレセイン、スルホローダミン１０１（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１９、インドシアニングリーン、Ｃｙ２、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、テトラメチルローダミン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０がある。シアニン色素が特に好ましい。Ｌｉｃｈａ ｅｔ ａｌはインビボ光学イメージング用の色素及び色素コンジュゲートを総説している［Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５７，１０８７−１１０８（２００５）］。
【００４０】
発蛍光団である好ましいシアニン色素は、次の式ＩＩのものである。
【００４１】
【化３】
式中、
各Ｘ′は独立に−Ｃ（ＣＨ3）2、−Ｓ−、−Ｏ−及び−Ｃ［（ＣＨ2）aＣＨ3］［（ＣＨ2）bＭ］−（式中、ａは０〜５の値を有する整数であり、ｂは１〜５の値を有する整数であり、ＭはＧ基であるか、或いはＳＯ3Ｍ1及びＨから選択される。）から選択され、
各Ｙ′は独立にＨ、−ＣＨ2ＮＨ2、−ＳＯ3Ｍ1、−ＣＨ2ＣＯＯＭ1、−ＮＣＳ及びＦからなる群から選択される１〜４の基を表し、Ｙ′基は芳香環の任意の位置に位置しており、
Ｑ′は独立にＨ、ＳＯ3Ｍ1、ＮＨ2、ＣＯＯＭ1、アンモニウム、エステル基、ベンジル及びＧ基からなる群から選択され、
Ｍ1はＨ又はＢcであり、
ｌは１〜３の整数であり、
ｍは１〜５の整数であり、
Ｘ′、Ｙ′及びＱ′の少なくとも１つはＧ基からなり、
ＧはｃＭＢＰペプチドへの結合のために適した反応基又は官能基である。
【００４２】
Ｇ基はｃＭＢＰペプチドの相補的な基と反応して、シアニン色素発蛍光団とｃＭＢＰペプチドとの間に共有結合を形成する。Ｇはペプチドの相補的な官能基と反応し得る反応基であってもよいし、或いは別法としてｃＭＢＰペプチドのと反応し得る官能基を含んでいてもよい。反応基及び官能基の例には、活性エステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン、ホスホラミダイト、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボン酸及びチオホスフェートがある。好ましくは、Ｇは活性エステルである。
【００４３】
「活性化エステル」又は「活性エステル」という用語は、良好な脱離基であり、したがってアミンのような求核性化合物との一層容易な反応を可能にするように設計された関連カルボン酸のエステル誘導体を意味する。好適な活性エステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェノール、ペンタフルオロチオフェノール、ｐ−ニトロフェノール、ヒドロキシベンゾトリアゾール及びＰｙＢＯＰ（即ち、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）である。好ましい活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はペンタフルオロフェノールエステル、特にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００４４】
式ＩＩの好ましい実施形態では、
各Ｘ′は−Ｃ（ＣＨ3）2−及び−Ｃ（ＣＨ3）［（ＣＨ2）4Ｍ］−（式中、ＭはＧ基又はＳＯ3Ｍ1である。）から選択され、
各Ｙ′はＳＯ3Ｍ1、Ｈ又は１〜４のＦ原子を表し、
各Ｑ′はＧ基及びＳＯ3Ｍ1から選択され、
ｌは好ましくは２であり、
ｍは好ましくは３、４又は５であり、
Ｘ′又はＱ′がＧ基である場合、最も好ましくはスクシンイミジルエステルである。
【００４５】
特に好ましいシアニン色素は、次の式ＩＩＩのものである。
【００４６】
【化４】
式中、
Ｒ1及びＲ2は独立にＨ又はＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1はＨ又はＢcである。）であって、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方はＳＯ3Ｍ1であり、
Ｒ3及びＲ4は独立にＣ1-4アルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は独立にＲa基（式中、ＲaはＣ1-4アルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル又は−（ＣＨ2）kＳＯ3Ｍ1であり、ｋは３又は４の値を有する整数である。）であるが、
シアニン色素がＲ1、Ｒ2及びＲa基に合計１〜４個のＳＯ3Ｍ1置換基を有することを条件とする。
【００４７】
好ましい式ＩＩＩの色素は、ｃＭＢＰへのコンジュゲーションを容易にするため、１以上のＣ1-6カルボキシアルキル基が存在するように選択される。
【００４８】
好ましい式ＩＩＩの個別色素を表１にまとめて示す。
【００４９】
【表１】
特に好ましい式ＩＩの色素はＣｙ５**及びＡｌｅｘａ６４７であり、Ｃｙ５**が理想的である。
【００５０】
合成リンカー基（Ｌ）が存在する場合、好ましくは［ＩＭ］及びＺ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2へのコンジュゲーションを容易にする末端官能基を含む。Ｌが１〜１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖を含む場合、アミノ酸残基は好ましくはグリシン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びセリンから選択される。ＬがＰＥＧ部分を含む場合、好ましくは式ＩＡ又は式ＩＢの単分散ＰＥＧ様構造のオリゴマー化で導かれる単位を含む。
【００５１】
【化５】
式ＩＡの１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸。式中、ｐは１〜１０の整数である。別法として、式ＩＢのプロピオン酸誘導体に基づくＰＥＧ様構造も使用できる。
【００５２】
【化６】
式中、ｐは式ＩＡに関して定義した通りであり、ｑは３〜１５の整数である。式ＩＢ中、ｐは好ましくは１又は２であり、ｑは好ましくは５〜１２である。
【００５３】
リンカー基がＰＥＧ又はペプチド鎖を含まない場合、好ましいＬ基は、２〜１０の原子、最も好ましくは２〜５の原子、特に好ましくは２又は３の原子を含む−（Ａ）m−部分を構成する結合原子の主鎖を有している。２つの原子を含む最小リンカー基主鎖は、いかなる望ましくない相互作用も最小限に抑えられるようにイメージング成分を十分に引き離すという利点を与える。
【００５４】
式Ｉ中、ｎは好ましくは０又は１であり、最も好ましくは０である（即ち、いかなるリンカー基も存在しない）。
【００５５】
本発明の好ましいイメージング剤は、次の式ＩＶを有する。
【００５６】
【化７】
式中、−（Ｌ）n［ＩＭ］基はＬｙｓ残基のε−アミノ基に結合している。好ましい式ＩＶのイメージング剤では、ＭIG（Ｎ末端Ａｌａ）はアセチルに等しく、ＭIG（Ｃ末端Ｌｙｓ）は第一アミドに等しい。式ＩＶ中、ｎは好ましくはゼロであり、ＩＭはシアニン色素、最も好ましくは式ＩＩのシアニン色素である。特に好ましい式ＩＶのイメージング剤では、ＩＭ＝Ｃｙ５**又はＡｌｅｘａ６４７であり、理想的にはＩＭ＝Ｃｙ５**である。
【００５７】
本発明の式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドは、
（ｉ）所望のｃＭＢＰペプチドと同じペプチド配列を有し、Ｃｙｓa及びＣｙｓbが保護されておらず、Ｃｙｓc及びＣｙｓd残基がチオール保護基を有する線状ペプチドの固相ペプチド合成を行う段階、
（ii）段階（ｉ）からのペプチドを塩基水溶液で処理することで、Ｃｙｓa及びＣｙｓbを連結する第１のジスルフィド結合を有する単環式ペプチドを得る段階、並びに
（iii）Ｃｙｓc及びＣｙｓdのチオール保護基を除去して環化することで、Ｃｙｓc及びＣｙｓdを連結する第２のジスルフィド結合を有する所望の二環式ペプチド生成物Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2を得る段階
を含んでなる製造方法によって得ることができる。
【００５８】
「保護基」という用語は、望ましくない化学反応を阻止又は抑制するが、分子の残部を変質させない程度に温和な条件下で問題の官能基から脱離させ得るのに十分な反応性を有するように設計された基を意味する。脱保護後には所望の生成物が得られる。アミン保護基は当業者にとって公知であり、好適にはＢｏｃ（ここでＢｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである。）、Ｆｍｏｃ（ここでＦｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニルである。）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［即ち、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］及びＮｐｙｓ（即ち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）から選択される。好適なチオール保護基は、Ｔｒｔ（トリチル）、Ａｃｍ（アセトアミドメチル）、ｔ−Ｂｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、メトキシベンジル、メチルベンジル及びＮｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）である。さらに他の保護基の使用は、‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９１）に記載されている。好ましいアミン保護基はＢｏｃ及びＦｍｏｃであり、最も好ましくはＢｏｃである。好ましいチオール保護基はＴｒｔ及びＡｃｍである。
【００５９】
例１及び例２は一層具体的な詳細を示している。固相ペプチド合成法のさらなる詳細は、Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ ａｎｄ Ｅ．Ｇｉｒａｌｄ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されている。ｃＭＢＰペプチドは不活性雰囲気下で最もよく貯蔵され、フリーザー内に保存される。溶液として使用する場合、ジスルフィドブリッジのスクランブリングを生じるリスクがあるので、７より高いｐＨは避けるのが最もよい。
【００６０】
イメージング剤は、第３の態様に関して（下記に）記載されるようにして製造できる。
【００６１】
第２の態様では、本発明は、第１の態様のイメージング剤を哺乳動物への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬品組成物を提供する。
【００６２】
「生体適合性キャリヤー」は、組成物が生理学的に許容され得るようにして（即ち、毒性又は過度の不快感なしに哺乳動物体に投与できるようにして）イメージング剤を懸濁又は溶解できる流体（特に液体）である。生体適合性キャリヤーは、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、（有利には注射用の最終生成物が等張性になるように平衡させ得る）食塩水のような水溶液、或いは１種以上の張度調整物質（例えば、生体適合性対イオンを有する血漿陽イオンの塩）、糖（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。好ましくは、生体適合性キャリヤー媒質はパイロジェンフリー注射用水又は等張食塩水である。
【００６３】
イメージング剤及び生体適合性キャリヤーはそれぞれ、注射器又はカニューレによる溶液の追加及び抜取りを許しながら、無菌保全性及び／又は放射能安全性の維持、さらに任意には不活性ヘッドスペースガス（例えば、窒素又はアルゴン）の維持を可能にする密封容器からなる適当なバイアル又は容器に入れた状態で供給される。好ましいかかる容器は、気密クロージャーを（通例はアルミニウムからなる）オーバーシールと共にクリンプ加工した隔壁密封バイアルである。クロージャーは、無菌保全性を維持しながら皮下注射針による１回又は数回の穿刺に適したもの（例えば、クリンプ加工した隔壁シールクロージャー）である。かかる容器は、（例えば、ヘッドスペースガスの変更又は溶液のガス抜きのために）所望される場合にはクロージャーが真空に耐え得ると共に、酸素又は水蒸気のような外部大気ガスの侵入を許すことなしに減圧のような圧力変化にも耐え得るという追加の利点を有している。
【００６４】
好ましい複数用量容器は、複数の患者用量を含む（例えば、容積１０〜３０ｃｍ3の）単一のバルクバイアルからなり、したがって臨床的状況に合わせて製剤の実用寿命中に様々な時間間隔で１回分の患者用量を臨床グレードの注射器に抜き取ることができる。予備充填注射器は１回分のヒト用量又は「単位用量」を含むように設計され、したがって好ましくは臨床用に適した使い捨て注射器又は他の注射器である。本発明の医薬品組成物は、好ましくは１人の患者用に適した用量を有し、上述したような適当な注射器又は容器に入れて供給される。
【００６５】
かかる医薬品組成物は、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤、フィラー、安定剤又は重量オスモル濃度調整剤のような追加賦形剤を任意に含むことができる。「抗菌防腐剤」という用語は、潜在的に有害な微生物（例えば、細菌、酵母又はかび）の増殖を阻止する薬剤を意味する。抗菌防腐剤はまた、使用する用量に応じて多少の殺菌性を示すこともある。本発明の抗菌防腐剤の主な役割は、医薬品組成物中におけるこのような微生物の増殖を阻止することである。しかし、抗菌防腐剤は、投与に先立って前記組成物を製造するために使用されるキットの１種以上の成分中における潜在的に有害な微生物の増殖を阻止するためにも任意に使用できる。好適な抗菌防腐剤には、パラベン類（即ち、メチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン或いはこれらの混合物）、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。好ましい抗菌防腐剤はパラベン類である。
【００６６】
「ｐＨ調整剤」という用語は、組成物のｐＨがヒト又は哺乳動物への投与のために許容し得る範囲（およそｐＨ４．０〜１０．５）内にあることを保証するために有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。好適なかかるｐＨ調整剤には、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ［即ち、トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン］のような薬学的に許容し得る緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような薬学的に許容し得る塩基がある。組成物をキットの形態で使用する場合には、ｐＨ調整剤を任意には独立のバイアル又は容器に入れて供給することができ、その結果としてキットのユーザーは多段操作の一部としてｐＨを調整することができる。
【００６７】
「フィラー」という用語は、製造及び凍結乾燥中における材料の取扱いを容易にすることができる薬学的に許容し得る増量剤を意味する。好適なフィラーには、塩化ナトリウムのような無機塩、及びスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性糖又は糖アルコールがある。
【００６８】
第２の態様の医薬品組成物は、無菌製造条件下で（即ち、クリーンルーム内で）製造して所望の無菌で非発熱性の生成物を得ることができる。基本構成部分、特に関連する試薬並びにイメージング剤に接触する装置部品（例えば、バイアル）は無菌であることが好ましい。かかる構成部分及び試薬は、無菌濾過或いは（例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は（例えば、エチレンオキシドによる）化学処理を用いる）終末滅菌をはじめとする、当技術分野で公知の方法によって滅菌できる。一部の構成部分を予め滅菌しておけば、最小数の操作を実施すれば済むので好ましい。しかし、予防策として、医薬品組成物の製造における最終段階として少なくとも無菌濾過段階を含めることが好ましい。
【００６９】
第２の態様の医薬品組成物は、任意には第４の態様に関して下記に記載するようなキットから製造される。
【００７０】
第３の態様では、本発明は、第１の態様のイメージング剤の製造方法であって、
（ｉ）Ｚ1がＨでありかつＺ2がＭIGである式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ1−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がＺ1位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（ii）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、ｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４アミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ1−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がｃＭＢＰペプチドの前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基の位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（iii）Ｚ1がＭIGであり、Ｚ3がＺ2基又は活性化エステルであり、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ3のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ2−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がＺ2位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階、及び
（iv）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、かつｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４アミノ酸残基中にＬｙｓを含む式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ1−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がｃＭＢＰペプチドのＬｙｓ残基の位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階
の１つを含んでなり、式中のＺ1、ｃＭＢＰ、Ｚ2、ＭIG、Ｌ、ｎ及びＩＭは（上記に）第１の態様で定義した通りであり、Ｚ3はＺ2基又は活性化エステルであり、Ｙ1はカルボン酸、活性化エステル、イソチオシアネート基又はチオシアネート基であり、Ｙ2はアミン基である、方法を提供する。
【００７１】
「活性化エステル」又は「活性エステル」という用語及びその好ましい実施形態は、上述した通りである。Ｙ2は好ましくは第一又は第二アミン基であり、最も好ましくは第一アミン基である。
【００７２】
化合物Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2では、好ましくはＺ1及びＺ2が共にＭIGに等しい。好ましいｃＭＢＰペプチド及びＺ1／Ｚ2基は第１の態様で記載した通りである。詳しくは、第１の態様のｃＭＢＰペプチドに関して記載した通り、ｃＭＢＰペプチドはコンジュゲーションを容易にするためにＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ残基を含むことが好ましい。段階（iv）に記載した通り、ｃＭＢＰペプチドはＬｙｓ残基を含むことが特に好ましい。
【００７３】
Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2の製法は、（上記に）第１の実施形態で記載されている。Ｚ3が活性エステルであるＺ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ3ペプチドは、Ｚ２がＯＨ又は生体適合性陽イオン（Ｂc）であるＺ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2から通常の方法によって製造できる。
【００７４】
ペプチドへのコンジュゲーションに適するように官能化された光学レポーター色素（ＩＭ）は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ社、Ｄｙｏｍｉｃｓ社、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社などから商業的に入手できる。かかる色素の多くはＮＨＳエステルとして入手できる。
【００７５】
好適な光学レポーター（ＩＭ）、特に色素をアミノ酸及びタンパク質に結合させる方法は、Ｌｉｃｈａ（上記参照）並びにＦｌａｎａｇａｎ ｅｔ ａｌ［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，８，７５１−７５６（１９９７）］、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ［ｉｂｉｄ，１３，６０５−６１０（２００２）］及びＺａｈｅｅｒ［Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，１（４），３５４−３６４（２００２）］によって記載されている。リンカー基（Ｌ）をｃＭＢＰペプチドに結合させる方法は、色素のみを結合させる方法（上記参照）と類似の化学作用を使用し、当技術分野で公知である。
【００７６】
第４の態様では、本発明は、第２の態様の医薬品組成物を製造するためのキットであって、当該キットは第１の態様のイメージング剤を無菌固体形態で含んでいて、第２の態様の生体適合性キャリヤーの無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の医薬品組成物が得られるキットを提供する。
【００７７】
その場合、コンジュゲート及び上述したような他の任意賦形剤は、凍結乾燥粉末として適当なバイアル又は容器に入れて供給できる。イメージング剤は、次いで所望の生体適合性キャリヤーを用いて再構成することで、哺乳動物への投与が可能な無菌で非発熱性の形態の医薬品組成物を与えるように設計されている。
【００７８】
イメージング剤の好ましい無菌固体形態は凍結乾燥固体である。無菌固体形態は、好ましくは医薬品組成物に関して（上記に）記載したような医薬品用容器に入れて供給される。キットを凍結乾燥する場合、配合物は糖類（好ましくはマンニトール、マルトース及びトリシン）から選択される凍結保護剤を任意に含むことができる。
【００７９】
第５の態様では、本発明は、哺乳動物体のインビボ光学イメージング方法であって、第１の態様のイメージング剤又は第２の態様の医薬品組成物を用いてインビボでのｃＭｅｔの過剰発現部位又は局在部位の画像を得ることを含んでなる方法を提供する。
【００８０】
「光学イメージング」という用語は、赤色乃至近赤外領域（波長６００〜１２００ｎｍ）内の光との相互作用に基づいて、病気の検出、ステージング又は診断、病気進展の追跡、或いは病気治療の追跡のための画像を形成する任意の方法を意味する。光学イメージングはさらに、いかなる装置も使用しない直接可視化並びに各種スコープ、カテーテル及び光学イメージング装置（例えば、断層撮影表示用のコンピューター支援ハードウェア）のような装置の使用を伴う直接可視化のためのあらゆる方法を包含する。かかるモダリティ及び測定技法には、特に限定されないが、ルミネセンスイメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光学コヒーレンス断層撮影、透過率イメージング、時間分解透過率イメージング、共焦点イメージング、非線形顕微鏡検査、光音響イメージング、音響光学イメージング、スペクトル分析、反射スペクトル分析、干渉分析、コヒーレンス干渉分析、拡散光学断層撮影及び蛍光媒介拡散光学断層撮影（連続波、時間ドメイン及び周波数ドメインシステム）、並びに光の散乱、吸光、偏光、ルミネセンス、蛍光寿命、量子収量及び消光の測定がある。これらの技法のさらなる詳細は、Ｔｕａｎ Ｖｏ−Ｄｉｎｈ（編）：“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”（２００３），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＣＣ、Ｍｙｃｅｋ ＆ Ｐｏｇｕｅ（編）：“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”（２００３），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｓｐｌｉｎｔｅｒ ＆ Ｈｏｐｐｅｒ：“Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ”（２００７），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＣＣに示されている。
【００８１】
緑色乃至近赤外領域の光は、好ましくは６００〜１０００ｎｍの波長を有する。光学イメージング方法は、好ましくは蛍光内視鏡検査である。第５の態様の哺乳動物体は、好ましくは人体である。イメージング剤の好ましい実施形態は、第１の態様に関して（上記に）記載した通りである。特に、蛍光色素を使用することが好ましい。
【００８２】
第５の態様の方法では、イメージング剤又は医薬品組成物は、好ましくは前記哺乳動物体に予め投与されている。「予め投与されている」とは、臨床医の関与の下でイメージング剤を例えば静脈内注射によって患者に投与する段階がイメージングに先立って既に実施されていることを意味する。この実施形態は、ｃＭｅｔが関係している哺乳動物体の病態のインビボ診断イメージング用の診断薬を製造するための、第１の実施形態のコンジュゲートの使用を含んでいる。
【００８３】
第５の態様の好ましい光学イメージング方法は、蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）である。ＦＲＩでは、本発明のイメージング剤を診断すべき被験体に投与し、次いで被験体の組織表面を励起光（通常は連続波（ＣＷ）励起）で照明する。光はレポーター分子（ＩＭ）を励起する。励起光によって生じるイメージング剤からの蛍光を、蛍光検出器を用いて検出する。好ましくは、戻る光を濾光することで蛍光成分を（単独に又は部分的に）分離する。蛍光から画像を形成する。通常、最小限の処理が実施され（寿命、量子収量などの光学パラメーターを計算するためのプロセッサーは使用されない）、画像は蛍光強度をマップする。イメージング剤は、病気領域に集中して高い蛍光強度を生み出すように設計されている。したがって、病気領域は蛍光強度画像中に正のコントラストを生み出す。画像は好ましくはＣＣＤカメラ又はチップを用いて得られ、そうすればリアルタイムイメージングが可能である。
【００８４】
励起用の波長は、使用する色素の種類に応じて変化する。励起光を発生するための装置は、レーザー（例えば、イオンレーザー、色素レーザー又は半導体レーザー）、ハロゲン光源或いはキセノン光源のような通常の励起光源であり得る。任意には、各種の光学フィルターを用いて最適の励起波長を得ることができる。
【００８５】
好ましいＦＲＩ方法は下記の段階を含んでなる。即ち、
（ｉ）哺乳動物体内の検査対象組織表面を励起光で照明する段階、
（ii）イメージング成分（ＩＭ）の励起によって生じるイメージング剤からの蛍光を蛍光検出器を用いて検出する段階、
（iii）蛍光検出器によって検出された光を任意に濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（iv）段階（ii）又は段階（iii）の蛍光から前記検査対象組織表面の画像を形成する段階
を含んでなる。段階（ｉ）では、励起光は好ましくは連続波（ＣＷ）の性質を有する。段階（iii）では、検出される光は好ましくは濾光される。特に好ましいＦＲＩ方法は蛍光内視鏡検査である。
【００８６】
第５の態様の別のイメージング方法は、ＦＤＰＭ（周波数ドメイン光子移動）を使用する。これは、組織内におけるＩＭの検出深度が大きいことが重要である場合、連続波（ＣＷ）方法に比べて利点を有する［Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］。かかる周波数／時間ドメインイメージングのためには、ＩＭが画像化すべき病変の組織深度及び使用する計装のタイプに応じて変調できる蛍光特性を有するならば有利である。
【００８７】
ＦＤＰＭ方法は下記のようなものである。即ち、
（ａ）不均質組成を有する前記哺乳動物体の光散乱性生体組織を、所定の経時変動強度を有する光源からの光に暴露してイメージング剤を励起する段階であって、組織が励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記暴露に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応する複数の値をプロセッサーで確定することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルが組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことで組織の画像を生成する段階
を含んでなる。
【００８８】
段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくはイメージング剤の取込みに対応し、好ましくはさらにイメージング剤の投与前における組織の吸着係数及び散乱係数に対応する複数の量のマッピングを含む。段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくは蛍光寿命、蛍光量子効率、蛍光収量及びイメージング剤取込みの１以上に対応する。蛍光特性は、好ましくは発光強度に無関係であり、またイメージング剤濃度に無関係である。
【００８９】
段階（ｃ）の定量化は、好ましくは、（ｉ）値の推定値を設定し、（ii）推定値の関数として計算発光を求め、（iii）計算発光を前記検出段階の発光と比較して誤差を求め、（iv）誤差の関数として蛍光特性の修正推定値を得ることを含む。定量化は、好ましくは組織の多重光散乱挙動をモデル化する数学的関係から値を求めることを含む。第１のオプションの方法は、好ましくはさらに、前記蛍光特性の変動を検出することでインビボでの組織の代謝特性をモニターすることを含む。
【００９０】
第５の態様の光学イメージングは、好ましくは結腸直腸癌（ＣＲＣ）の管理を容易にするために使用される。「ＣＲＣの管理」という用語は、病気進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は治療のモニタリングでの使用を意味する。好適な光学イメージング方法のさらなる詳細は、Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ ｅｔ ａｌ［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］によって総説されている。
【００９１】
第６の態様では、本発明は、哺乳動物体の病気進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は結腸直腸癌（ＣＲＣ）の治療のモニタリングを行う方法であって、第５の態様のインビボ光学イメージング方法を含んでなる方法を提供する。
【実施例】
【００９２】
以下に詳述する非限定的な実施例によって本発明を例証する。実施例１は、本発明のｃＭＢＰペプチド（化合物１）の合成法を示す。実施例２は、化合物１のペプチド配列がスクランブルされている、陰性対照としての関連ペプチドの合成法を示す。実施例３は、本発明の好ましい色素であるシアニン色素Ｃｙ５**の合成法を示す。実施例４は、Ｃｙ５**の活性エステルの合成法を示す。実施例５は、ペプチド（ｃＭＢＰペプチド及び対照）に対する本発明のシアニン色素のコンジュゲーションを示す。化合物３波７をこのようにして比較した。実施例６は、インビトロでｃＭｅｔに対するペプチドの親和性を測定する方法を示す。結果は、光学レポーターイメージング成分（シアニン色素）が結合している場合でも、結合は選択的であることを示している。実施例７は、癌の動物モデルにおける化合物５及び化合物７のインビボ試験に関するデータを示す。化合物５については優れた腫瘍
／バックグラウンド比がみられたのに対し、化合物７（陰性対照）は腫瘍とバックグラウンドとを識別しなかった。
【００９３】
略語
通常の一文字又は三文字アミノ酸略語を使用する。
Ａｃｍ： アセトアミドメチル
ＡＣＮ（又はＭｅＣＮ）：アセトニトリル
Ｂｏｃ： ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ： ジクロロメタン
ＤＭＦ： ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ： ジメチルスルホキシド
Ｆｍｏｃ： ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＢＴＵ： Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチ ルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＰＬＣ： 高速液体クロマトグラフィー
ＨＳＰｙＵ： Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチレン
ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＮＨＳ： Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド
ＮＭＭ： Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＰ： １−メチル−２−ピロリジノン
Ｐｂｆ： ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン５−スルホニ ル
ＰＢＳ： リン酸塩緩衝食塩水
ｔＢｕ： ｔ−ブチル
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ： トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ： トリチル
【００９４】
【表２】
例１
【００９５】
例１：化合物１の合成
段階（ａ）：保護前駆体線状ペプチドの合成
前駆体線状ペプチドは下記の構造を有している。
【００９６】
Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2。
【００９７】
０．１ｍｍｏｌのＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｎｏｖａｇｅｌ樹脂から出発するＦｍｏｃ化学を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３３Ａペプチド合成機上でペプチジル樹脂Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ψMe,Meｐｒｏ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ポリマーをアセンブルした。カップリング段階では、（ＨＢＴＵを用いて）予備活性化した過剰量の１ｍｍｏｌアミノ酸を適用した。Ｇｌｕ−Ｔｈｒプソイドプロリン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ０５−２０−１１２２）を配列中に組み込んだ。樹脂を窒素バブラー装置に移し、無水酢酸（１ｍｍｏｌ）及びＮＭＭ（１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した溶液で６０分間処理した。濾過によって無水物溶液を除去し、樹脂をＤＣＭで洗浄してから窒素流下で乾燥した。
【００９８】
樹脂からのペプチド切断及び側鎖保護基の同時除去は、２．５％のＴＩＳ、２．５％の４−チオクレゾール及び２．５％の水を含むＴＦＡ（１０ｍＬ）中で２時間と３０分間実施した。樹脂を濾過によって取り除き、ＴＦＡを真空中で除去し、残留物にジエチルエーテルを添加した。生じた沈殿をジエチルエーテルで洗浄し、空気乾燥することで、２６４ｍｇの粗ペプチドを得た。
【００９９】
分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３０分）により粗ペプチドを精製することで、純粋な化合物１の線状前駆体１００ｍｇを得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：６．５４分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１４６４．６、ＭＨ22+実測値：１４６５．１）。
【０１００】
段階（ｂ）：単環式Ｃｙｓ４−１６ジスルフィドブリッジの形成
Ｃｙｓ４−１６；Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2。
【０１０１】
段階（ａ）からの線状前駆体（１００ｍｇ）を５％ＤＭＳＯ／水（２００ｍＬ）に溶解し、アンモニアを用いて溶液をｐＨ６に調整した。反応混合物を５日間撹拌した。次いで、ＴＦＡを用いて溶液をｐＨ２に調整し、大部分の溶媒を真空中での蒸発によって除去した。生成物の精製のため、残留物（４０ｍＬ）を分取ＨＰＬＣカラム上に少しずつ注入した。
【０１０２】
分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂを１０分間、次いで４０分で０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：４４分）により残留物を精製することで、純粋な化合物１の単環式前駆体７２ｍｇを得た。
【０１０３】
（異性体Ｐ１乃至Ｐ３の混合物としての）純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：５．３７分（Ｐ１）、５．６１分（Ｐ２）、６．０５分（Ｐ３））によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１４６３．６、ＭＨ22+実測値：１４６４．１（Ｐ１）、１４６４．４（Ｐ２）、１４６４．３（Ｐ３））。
【０１０４】
段階（ｃ）：第２のＣｙｓ６−１４ジスルフィドブリッジの形成（化合物１）
段階（ｂ）からの単環式前駆体（７２ｍｇ）を窒素ブランケット下で７５％ＡｃＯＨ／水（７２ｍＬ）に溶解した。１Ｍ ＨＣｌ（７．２ｍＬ）及びＡｃＯＨ中の０．０５Ｍ Ｉ2（４．８ｍＬ）をその順序で添加し、混合物を４５分間撹拌した。１Ｍアスコルビン酸（１ｍＬ）を添加して無色の混合物を得た。大部分の溶媒を真空中で蒸発させ、残留物（１８ｍＬ）を水／０．１％ＴＦＡ（４ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１０５】
分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂを１０分間、次いで４０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：４３〜５３分）により残留物を精製することで、５２ｍｇの純粋な化合物１を得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：６．５４分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１３９１．５、ＭＨ22+実測値：１３９２．５）。
例２
【０１０６】
例２：化合物２の合成
Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2。
【０１０７】
化合物２は、化合物１のペプチド配列がスクランブルされた陰性対照である。
【０１０８】
段階（ａ）：保護前駆体線状ペプチドの合成
０．１ｍｍｏｌのＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｎｏｖａｇｅｌ樹脂から出発するＦｍｏｃ化学を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３３Ａペプチド合成機上でペプチジル樹脂Ｈ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ψMe,Meｐｒｏ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ポリマーをアセンブルした。カップリング段階では、（ＨＢＴＵを用いて）予備活性化した過剰量の１ｍｍｏｌアミノ酸を適用した。Ｔｙｒ−Ｓｅｒプソイドプロリン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ０５−２０−１０１４）を配列中に組み込んだ。樹脂を窒素バブラー装置に移し、無水酢酸（１ｍｍｏｌ）及びＮＭＭ（１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した溶液で６０分間処理した。濾過によって無水物溶液を除去し、樹脂をＤＣＭで洗浄してから窒素流下で乾燥した。
【０１０９】
樹脂からのペプチド切断及び側鎖保護基の同時除去は、２．５％のＴＩＳ、２．５％の４−チオクレゾール及び２．５％の水を含むＴＦＡ（１０ｍＬ）中で２時間と１０分間実施した。樹脂を濾過によって取り除き、ＴＦＡを真空中で除去し、残留物にジエチルエーテルを添加した。生じた沈殿をジエチルエーテルで洗浄し、空気乾燥することで、２６４ｍｇの粗ペプチドを得た。
【０１１０】
分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：５０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×５０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３４．１分）により粗ペプチドを精製することで、２００ｍＬのＡＣＮ／水に溶解された純粋なＤＸ−１６６２陰性対照線状前駆体を得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：５分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．６ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ２０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３．５２分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１４６４．６、ＭＨ22+実測値：１４６４．９）。
【０１１１】
段階（ｂ）：単環式Ｃｙｓ４−１６ジスルフィドブリッジの形成
Ｃｙｓ４−１６；Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2。
【０１１２】
段階（ａ）からの陰性対照線状前駆体溶液（２００ｍＬ、４．３．１参照）にＤＭＳＯ（１０ｍＬ）を添加し、アンモニアを用いて溶液をｐＨ７に調整した。反応混合物を４０℃で１８時間加熱し、次いで６０℃で６０分間加熱した。ＴＦＡを用いて溶液をｐＨ２に調整し、ＡＣＮを真空中での蒸発によって除去した。残留物を分取ＨＰＬＣによる精製に付した。
【０１１３】
分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂを５分間、次いで６０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：５０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×５０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：２９．６分）により残留物を精製することで、１００ｍＬのＡＣＮ／水中に純粋な陰性対照単環式前駆体を得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：５分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．６ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ２０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３．４６分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１４６３．６、ＭＨ22+実測値：１４６３．７）。
【０１１４】
段階（ｃ）：第２のＣｙｓ６−１４ジスルフィドブリッジの形成（化合物２）
Ｃｙｓ４−１６，６−１４；Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2。
【０１１５】
段階（ｂ）からの陰性対照単環式前駆体溶液（１００ｍＬ）をＡｃＯＨ（１００ｍＬ）で希釈した。アルゴンブランケット下で１Ｍ ＨＣｌ（５ｍＬ）及びＡｃＯＨ中の０．０５Ｍ Ｉ2（７ｍＬ）をその順序で添加し、混合物を２０分間撹拌した。１Ｍアスコルビン酸（１ｍＬ）を添加して無色の混合物を得た。大部分の溶媒を真空中で蒸発させ、残留物（３０ｍＬ）を水／０．１％ＴＦＡ（１００ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１１６】
分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂを１０分間、次いで６０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：５０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×５０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３２．８分）により残留物を精製することで、３０ｍｇの純粋な化合物２を得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：６．５４分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１３９１．５、ＭＨ22+実測値：１３９２．５）。
例３
【０１１７】
例３：シアニン色素２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（Ｃｙ５**）の合成
【０１１８】
【化８】
（３ａ）５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸
【０１１９】
【化９】
水素化ナトリウム（鉱油中６０％ＮａＨの１２．０ｇ）のＤＭＦ（１００ｍｌ）懸濁液に、氷浴で冷却しながらエチル２−メチルアセトアセテート（５０ｇ）のＤＭＦ（２５ｍｌ）溶液を１時間かけて滴下した（内部温度０〜４℃）。この混合物を撹拌しながら４５分間放置して周囲温度まで温めた後に再冷却した。次いで、１，４−ブタンスルトン（４５ｇ）のＤＭＦ（２５ｍｌ）溶液を１５分かけて滴下した。最終混合物を６０℃で１８時間加熱した。溶媒を回転蒸発によって除去し、残留物を水とジエチルエーテルとの間に分配させた。水性層を集め、新鮮なジエチルエーテルで洗浄し、回転蒸発させて粘着性の泡状物を得た。この中間体を水（１００ｍｌ）に溶解し、撹拌しながら水酸化ナトリウム（１７．８ｇ）を１５分かけて添加した。混合物を９０℃で１８時間加熱した。冷却した反応混合物を濃塩酸（約４０ｍｌ）の添加で約ｐＨ２に調整した。溶液を回転蒸発させ、真空下で乾燥した。黄色の固体を、２％の塩酸を含むエタノール（３×１５０ｍｌ）で洗浄した。エタノール溶液を濾過し、回転蒸発させ、真空下で乾燥して黄色の固体を得た。収量７０ｇ。
【０１２０】
（３ｂ）２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸二カリウム塩
【０１２１】
【化１０】
４−ヒドラジノベンゼンスルホン酸（４０ｇ）、（３ａからの）５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸（６０ｇ）及び酢酸（５００ｍｌ）を混合し、還流させながら６時間加熱した。溶媒を濾過し、回転蒸発させ、真空下で乾燥した。固体をメタノール（１Ｌ）に溶解した。これに水酸化カリウムの２Ｍメタノール溶液（３００ｍｌ）を添加した。混合物を３時間撹拌し、次いで回転蒸発を用いて溶媒の体積を５０％減少させた。得られた沈殿を濾別し、メタノールで洗浄し、真空下で乾燥した。収量６０ｇ。ＭＳ（ＬＣＭＳ）：ＭＨ+ ３６２。正確な質量：実測値３６２．０７２９。ＭＨ+＝Ｃ14Ｈ20ＮＯ6Ｓ2はｍ／ｚ ３６２．０７３２（−０．８ｐｐｍ）を要求する。
【０１２２】
（３ｃ）２，３−ジメチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート二カリウム塩
【０１２３】
【化１１】
（３bからの）２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸（６０ｇ）を１，４−ブタンスルトン（１８０ｇ）及びテトラメチレンスルホン（１４６ｍｌ）と共に１４０℃で１６時間加熱した。得られた赤色固体をジエチルエーテルで洗浄し、粉砕して粉末にし、真空下で乾燥した。収量６０ｇ。
【０１２４】
（３ｄ）ＴＦＡ塩としてのＣｙ５**
１−（５′−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチル−インドリウムブロミド−５−スルホン酸Ｋ+塩（２．７ｇ）、マロンアルデヒドビス（フェニルイミン）一塩酸塩（９６０ｍｇ）、無水酢酸（３６ｍｌ）及び酢酸（１８ｍｌ）を１２０℃で１時間加熱して暗赤褐色の溶液を得た。反応混合物を周囲温度に冷却した。（３ｃからの）２，３−ジメチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（８．１ｇ）及び酢酸カリウム（４．５ｇ）を混合物に添加し、混合物を周囲温度で１８時間撹拌した。得られた青色の溶液を酢酸エチルを用いて沈殿させ、真空下で乾燥した。粗色素を液体クロマトグラフィー（ＲＰＣ18、水＋０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ勾配）によって精製した。主色素ピークを含む画分を集め、プールし、真空下で蒸発させることで、２ｇの標記化合物を得た。ＵＶ／Ｖｉｓ（水＋０．１％ＴＦＡ）：６５０ｎｍ。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ+ ８８７．１。ＭＨ+＝Ｃ38Ｈ50Ｎ2Ｏ14Ｓ4はｍ／ｚ ８８７．１を要求する。
例４
【０１２５】
例４：２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−｛６−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−６−オキソヘキシル｝−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネートジイソプロピルエチルアミン塩（Ｃｙ５**のＮＨＳエステル）の合成
【０１２６】
【化１２】
Ｃｙ５**（例３、１０ｍｇ）を無水ＤＭＳＯ（３ｍｌ）に溶解し、これにＨＳＰｙＵ（２０ｍｇ）及びＮ，Ｎ′−ジイソプロピルエチルアミン（８０μｌ）を添加した。得られた溶液を３時間混合したところ、ＴＬＣ（ＲＰＣ１８、水／ＭｅＣＮ）が反応の完了を示した。酢酸エチル／ジエチルエーテル中での沈殿によって色素を単離し、濾別し、酢酸エチルで洗浄し、真空下で乾燥した。ＵＶ／Ｖｉｓ（水）６５０ｎｍ。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＨ+ ９８３．５。ＭＨ+＝Ｃ42Ｈ53Ｎ3Ｏ16Ｓ4はｍ／ｚ ９８４．１６を要求する。
例５
【０１２７】
例５：色素のコンジュゲーション、化合物３〜７の合成
Ｃｙｓ４−１６，６−１４；Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｃｙ５）−ＮＨ2（化合物３）。
【０１２８】
化合物１（１０ｍｇ）、ＮＭＭ（４μＬ）及びＣｙ５ ＮＨＳエステル（５．７ｍｇ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＰＡ１５１０４）をＮＭＰ（１ｍＬ）に溶解し、反応混合物を７時間撹拌した。次いで、反応混合物を５％ＡＣＮ／水（８ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１２９】
分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で５〜５０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＨＣＯＯＨ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＨＣＯＯＨ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３５．５分）により粗ペプチドを精製することで、８．１ｍｇの純粋な化合物３を得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で５〜５０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：８．１５分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１７１０．６、ＭＨ22+実測値：１７１１．０）。
【０１３０】
同様にして化合物４を製造し、エレクトロスプレー質量分析法で分析した（ＭＨ22+計算値：１７１０．６、ＭＨ22+実測値：１７１０．９）。
【０１３１】
他の色素−ペプチドコンジュゲート（化合物５〜７）を類似の方法で製造した。Ａｌｅ
ｘａ６４７はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社（Ａ２０１０６）から購入した。
化合物５（ＭＨ22+計算値：１８２５．７、ＭＨ22+実測値：１８２５．９）。
化合物６（ＭＨ22+計算値：１８１１．７、ＭＨ22+実測値：１８１２．０）。
化合物７（ＭＨ22+計算値：１８２５．７、ＭＨ22+実測値：１８２６．２）。
例６
【０１３２】
例６：インビトロ蛍光偏光アッセイ
蛍光偏光アッセイの原理を簡単に述べれば、以下の通りである。
【０１３３】
単色光が水平偏光フィルターを通過し、試料中の蛍光分子を励起する。垂直偏光面内に正しく配向した分子のみが光を吸収し、励起され、次いで光を放出する。放出された光を垂直面内及び水平面内で測定する。異方性値（Ａ）は、下記の式に従った光強度の比である。
【０１３４】
【数１】
蛍光異方性測定は、ｅｘ６４６／ｅｍ６７８ｎｍでＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ蛍光偏光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社、米国）を使用しながら、３８４ウェルマイクロプレート中において結合緩衝液（ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）中１０μＬの体積で実施した。色素標識ペプチドの濃度を一定（２０ｎＭ）に保つと共に、ヒト又はマウスｃＭｅｔ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）或いはＳｅｍａｐｈｏｒｉｎ ６Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）の濃度を０〜１５０ｎＭの範囲内で変化させた。結合混合物をマイクロプレート中において３０℃で１０分間平衡させた。観察された異方性の変化を下記の式に当てはめた。
【０１３５】
【数２】
式中、ｒobsは観察された異方性であり、ｒfreeは遊離ペプチドの異方性であり、ｒboundは結合ペプチドの異方性であり、ＫDは解離定数であり、ｃＭｅｔは総ｃＭｅｔ濃度であり、Ｐは総色素標識ペプチド濃度である。この式は、合成ペプチド及びレセプターが溶液中において１：１の化学量論比で可逆複合体を形成することを仮定している。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて非線形回帰によりデータ当てはめを行うことでＫD値（一部位結合）を得た。
【０１３６】
ヒト及びマウスｃＭｅｔ（Ｆｃキメラ）に対する結合に関して化合物３及び化合物４を試験した。結果は、ヒトｃＭｅｔに対する化合物３の結合に関して３±１ｎＭのＫDを示した。ヒトｃＭｅｔに対する化合物４の結合は存在しなかった。さらに、化合物３及び化合物４は試験範囲内ではマウスｃＭｅｔに対する結合を示さなかった。同じ方法を用いて、化合物５はヒトｃＭｅｔに関して１．１ｎＭのＫDを有することが判明した。
例７
【０１３７】
例７：化合物５及び化合物７のインビボ試験
（ａ）動物モデル
この試験では５４頭の雌ＢＡＬＢ ｃ／Ａヌード（Ｂｏｍ）マウスを使用した。動物の使用は地方倫理委員会によって承認された。ＢＡＬＢ ｃ／Ａヌードは、他のヌードマウス系統に比べてヒト腫瘍に対し高い生着率を有する、同系交配された免疫無防備状態のマウス系統である。マウスは到着時に４週齢であり、試験の開始時には約２０グラムの体重を有していた。動物は、ＨＥＰＡ濾過空気を備えた個別換気ケージ（ＩＶＣ、Ｓｃａｎｂｕｒ ＢＫ社）内に収容した。動物は、“Ｒａｔ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ ｎｒ．３ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ”飼料（Ｓｃａｎｂｕｒ ＢＫ社）及び１ｍＭのモル濃度にＨＣｌを添加して酸性化した水道水（ｐＨ３．０）に随意にアクセスできた。
【０１３８】
結腸癌ＨＣＴ−１５はヒト結腸癌腫から導かれ、Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ［Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，２１，４０９−４１７（２００４）］によればｃＭｅｔを発現することが報告されている。この細胞株は、ヌードマウスに皮下接種した場合に腫瘍を形成することが判明した［Ｆｌａｔｍａｒｋ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４０，１５９３−１５９８（２００４）］。
【０１３９】
ＨＣＴ−１５細胞を増殖させ、１０％血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ ＃Ｒ０８８３）中で皮下接種用に準備した。継代数４（Ｐ４）で保存株を作成し、５％ＤＭＳＯを含む培地中における３×１０7細胞／バイアルの量を液体窒素中で凍結して貯蔵した。移植当日、細胞を３７℃の水浴中で急速に解凍し（約２分間）、洗浄し、ＰＢＳ／２％血清中に再懸濁した（１２００ｒｐｍで１０分間の遠心）。投与用注射器中に細胞を吸引する際には、常にバイアル内の細胞を完全に混合してから行った。動物に軽いガス麻酔をかけながら、ファインボア注射針（２５Ｇ）を用いて０．１ｍｌの量の細胞懸濁液を肩及び背中に皮下注射した。次いで、動物をケージに戻し、腫瘍を１３〜１７日間増殖させた。動物には、５日以上の順化期間を置いてから接種処置を施した。
【０１４０】
（ｂ）処置
すべての試験物質は、凍結乾燥粉末からＰＢＳを用いて再構成した。白色プリンター用紙の小さな堆積物をイメージ化してフラットフィールド画像を得、これを用いて照明の不均一性を補正した。物理的に固定しながら、試験物質を外側尾静脈に静脈内注射した。注射量は０．１ｍｌであり、これは動物１頭当たり試験物質１ｎｍｏｌの用量に相当している。注射後、動物をケージに戻した。イメージングの直後、動物を頸部脱臼によって殺した。限られた数の動物（ｎ＝１〜６）における皮膚及び筋肉組織へのウォッシュアウト率の比較に基づき、各試験物質に関する最適イメージング時点を推定した。化合物３及び化合物４に関するイメージング時点は注射後１２０分であった。各動物に関し、皮下で増殖した腫瘍を死後に切除した。１つの腫瘍のへりから、厚さ約１．６ｍｍかつ直径約３〜４ｍｍの薄いスライスを切り取った。次いで、腫瘍スライスを同じ動物の正常結腸領域を背景にしてイメージ化した。
【０１４１】
（ｃ）イメージング
イメージングは、光源を用いてレポーターを励起しかつ濾光系を用いて蛍光成分を抽出するように改造した臨床用腹腔鏡を通して行った。レポーター分子の励起のためには６３５ｎｍレーザーを使用した。検出器としてはＨａｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ ＥＲＧ ＣＣＤカメラを使用した。カメラは利得０の２×２ビンニングモードで動作させた。結腸イメージング用の標準露光時間は１０秒であった。システム較正測定結果によれば、動物イメージングシステムを用いた場合の１０秒の露光時間は、臨床的に適切な光源、視野及び組織表面までの距離を用いた場合の４０ミリ秒の露光に相当している。画像中の強度分布は、システム較正データにより、照明の不均一性について補正した。腫瘍上に位置する検査対象領域及び正常結腸バックグラウンドから標的／バックグラウンド比を計算した。レシーバー動作特性分析のために使用する標準的なスコアリングシステムを用いて画像を目視評価した。
【０１４２】
（ｄ）結果
化合物５は１．４６：１の腫瘍／正常比を有しており、同一の色素を含む対応したスクランブルド対照ペプチド（化合物７）は１．０４：１の比を有していた。化合物５は容易に確認できる腫瘍を示したのに対し、化合物７ではバックグラウンドに対して何も識別できなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボでの光学イメージングのために適した標識ｃＭｅｔ結合ペプチドに関する。かかるペプチドは、赤色乃至近赤外領域でのイメージングのために適した光学レポーター基で標識されている。また、特に結腸直腸癌（ＣＲＣ）の診断で使用するためのインビボイメージング方法も開示される。
【背景技術】
【０００２】
国際公開第２００５／０３０２６６号には、結腸直腸癌（ＣＲＣ）の早期診断に対する医学的ニーズが存在することが開示されている。国際公開第２００５／０３０２６６号は、ＣＲＣで異常に発現される生物学的標的に対して親和性を有する光学イメージング用造影剤を開示している。生物学的標的は、ＣＯＸ−２、β−カテニン、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、各種キナーゼ、Ｈｅｒ−２、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、サイクリン、Ｐ５３、チミジル酸シンターゼ、ＶＥＧＦレセプター、ＥＧＦレセプター、Ｋ−ラス、腺腫性結腸ポリポーシスタンパク質、カテプシンＢ、ｕＰＡＲ、ｃＭｅｔ、ムチン及びガストリンレセプターから選択される。好ましいかかる標的（７頁１１〜１２行目）は、ｃＭｅｔ、ＭＭＰ−１４、ＣＯＸ−２、β−カテニン及びカテプシンＢであると言われている。国際公開第２００５／０３０２６６号のベクターは、ペプチド、ペプトイド部分、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、脂質関連化合物又は伝統的な有機薬物様小分子であり得る。レポーター部分は、好ましくは、電磁スペクトルの紫外部分から赤外部分までの波長領域の光と相互作用する色素である。
【０００３】
散乱因子（ＳＦ）としても知られる肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は、治癒や血管形成のような各種の生理学的過程に関与する成長因子である。ＨＧＦとその高親和性レセプター（ｃＭｅｔ）との相互作用は、腫瘍の成長、浸潤及び転移に関係している。
【０００４】
Ｋｎｕｄｓｅｎ ｅｔ ａｌは、イメージング及び治療への応用可能性と共に、前立腺癌におけるＨＧＦ及びｃＭｅｔの役割を総説している［Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，９１，３１−６７（２００４）］。診断及び治療用の標識抗ｍｅｔ抗体は、国際公開第０３／０５７１５５号に記載されている。
【０００５】
国際公開第２００４／０７８７７８号は、ｃＭｅｔ又はｃＭｅｔ及びＨＧＦを含む複合体と結合するポリペプチド又は多量体ペプチド構築物を開示している。約１０の異なるペプチド構造クラスが記載されている。国際公開第２００４／０７８７７８号には、インビトロ及びインビボ用途のための検出可能な標識或いは治療用途のための薬物でペプチドを標識できることが開示されている。検出可能な標識は、酵素、蛍光化合物、光学色素、常磁性金属イオン、超音波造影剤又は放射性核種であり得る。国際公開第２００４／０７８７７８号の好ましい標識は放射性核種又は常磁性金属であると述べられており、最も好ましくは金属キレーターでキレート化された金属からなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００５／０３０２６６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０５７１５５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／０７８７７８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００６／０８２４３４号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００５／０５８３７１号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００５／０４４３１３号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００６／１１５６３３号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｎｕｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９１，３１−６７（２００４）．
【非特許文献２】Ｂｅｒｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５１，１６９９−１７１２（２００３）．
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、インビボ光学イメージングのために適したイメージング剤であって、ｃＭｅｔ結合環状ペプチドと、５００〜１２００ｎｍの緑色乃至近赤外波長を有する光を用いて哺乳動物体のインビボイメージングを行うために適した光学レポーターイメージング成分とを含んでなるイメージング剤を提供する。ｃＭｅｔ結合環状ペプチドは、国際公開第２００４／０７８７７８号のペプチド構造クラスの１つに関係していて、ｃＭｅｔに対して最適の結合親和性を有する。これらのペプチドは、国際公開第２００４／０７８７７８号に記載されているように、ファージディスプレイから導かれ、ｃＭｅｔに対する親和性及びＨＧＦとの競合の欠如によって選択された。本発明のｃＭＢＰ結合ペプチドは、好ましくはその末端の少なくとも一方が代謝阻害基（ＭIG）で保護されている。これはインビボ用途にとって重要な考慮事項であり、さもないと内在酵素及びペプチダーゼがペプチダーゼを急速に代謝させ、その結果としてｃＭｅｔ結合親和性の喪失、したがってインビボでの選択的標的化の喪失を招く。
【０００９】
本発明は、インビボでｃＭｅｔ結合ペプチドを使用する最良の方法は他のイメージングモダリティー（例えば、核、ＭＲＩ又は超音波）と違って光学レポーターの使用を必要とすることを教示すると共に、好ましい光学イメージングレポーターも提供する。緑色乃至近赤外領域（５００〜１２００ｎｍの波長を有する光）が好ましいが、これはその領域がヘモグロビン、ポルフィリン類、メラニン及びコラーゲンのような内在組織及び物質と最小のスペクトルオーバーラップを有するからである［Ｌｉｃｈａ，Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）］。自発蛍光に寄与する他の重要な物質はＮＡＤＨ、ＦＡＤ及びエラスチンである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
第１の態様では、本発明は次の式Ｉのコンジュゲートを含んでなるイメージング剤を提供する。
【００１１】
【化１】
式中、
Ｚ1はｃＭＢＰのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭIGであり、
Ｚ2はｃＭＢＰのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢc（式中、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）又はＭIGであり、
ｃＭＢＰは、以下のアミノ酸配列（配列番号１）を含む１７〜３０アミノ酸のｃＭｅｔ結合環状ペプチドであり、
Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
（式中、Ｘ1はＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＴｙｒであり、Ｘ2はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｓｎであり、Ｘ3はＴｈｒ又はＡｒｇであり、Ｘ4はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ5はＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ6はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｃｙｓa-dの各々はシステイン残基であって、残基ａ及びｂ並びに残部ｃ及びｄは環化して２つの独立したジスルフィド結合を形成している。）
ＭIGは、ｃＭＢＰペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基からなる代謝阻害基であり、
Ｌは式−（Ａ）m−（式中、Ａは独立に−ＣＲ2−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ2−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ2ＮＲ−、−ＮＲＳＯ2−、−ＣＲ2ＯＣＲ2−、−ＣＲ2ＳＣＲ2−、−ＣＲ2ＮＲＣＲ2−、Ｃ4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基又はＣ3-12ヘテロアリーレン基、或いはアミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4アルケニル、Ｃ2-4アルキニル、Ｃ1-4アルコキシアルキル及びＣ1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。）の合成リンカー基であり、
ｎは０又は１の値を有する整数であり、
ＩＭは、６００〜１２００ｎｍの緑色乃至近赤外波長を有する光を用いて哺乳動物体のインビボイメージングを行うために適した光学レポーターイメージング成分である。
【００１２】
「イメージング剤」という用語は、哺乳動物体のインビボイメージングを行うために適した化合物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒト被験体である。イメージングは侵襲的（例えば、手術中検査又は内視鏡検査）であってもよいし、或いは非侵襲的であってもよい。好ましいイメージング方法は内視鏡検査である。式Ｉのコンジュゲートはインビボイメージングのために適するが、インビトロ用途（例えば、生物学的試料中のｃＭｅｔを定量するアッセイ又は組織試料中のｃＭｅｔの可視化）も有し得る。好ましくは、イメージング剤はインビボイメージングのために使用される。
【００１３】
Ｚ1基は、最後のアミノ酸残基のアミン基を置換する。したがって、Ｚ1がＨである場合、ｃＭＢＰのアミノ末端は最後のアミノ酸残基の遊離ＮＨ2基で終わる。Ｚ2基は、最後のアミノ酸残基のカルボニル基を置換する。したがって、Ｚ2がＯＨである場合、ｃＭＢＰのカルボキシ末端は最後のアミノ酸残基の遊離ＣＯ2Ｈ基で終わり、Ｚ2がＯＢcである場合、末端カルボキシ基はＣＯ2Ｂc基としてイオン化される。
【００１４】
「代謝阻害基」（ＭIG）という用語は、アミノ末端（Ｚ1）又はカルボキシ末端（Ｚ2）におけるｃＭＢＰペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基を意味する。かかる基は当業者にとって公知であり、ペプチドのアミン末端については、好適にはＮ−アシル化基−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＲG（式中、アシル基−（Ｃ＝Ｏ）ＲGはＣ1-6アルキル基及びＣ3-10アリール基から選択されるＲGを有する。）から選択されるか、或いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位からなる。好適なＰＥＧ基は、リンカー基（Ｌ）に関して下記に記載される。好ましいかかるＰＥＧ基は、式ＩＡ又はＩＢのバイオモディファイアーである。好ましいかかるアミノ末端ＭIGは、アセチル、ベンジルオキシカルボニル又はトリフルオロアセチルであり、最も好ましくはアセチルである。
【００１５】
ペプチドのカルボキシ末端についての好適な代謝阻害基には、カルボキサミド、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、アミノアルコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位がある。ｃＭＢＰペプチドのカルボキシ末端アミノ酸残基についての好適なＭIG基は、アミノ酸残基の末端アミンがＣ1-4アルキル基（好ましくはメチル基）でＮ−アルキル化されている場合である。好ましいかかるＭIG基はカルボキサミド又はＰＥＧであり、最も好ましいかかる基はカルボキサミドである。
【００１６】
式Ｉは、−（Ｌ）n［ＩＭ］部分がＺ1、Ｚ2又はｃＭＢＰの任意適宜の位置に結合し得ることを表している。Ｚ1又はＺ2に関しては、Ｚ1／Ｚ2のいずれかがＭIGである場合、−（Ｌ）n［ＩＭ］部分はＭIG基に結合し得る。Ｚ1がＨ又はＺ2がＯＨである場合、Ｚ1又はＺ2位置における−（Ｌ）n［ＩＭ］部分の結合は、それぞれ式［ＩＭ］−（Ｌ）n−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2又はＺ1−［ｃＭＢＰ］−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物を与える。いずれかのペプチド末端におけるｃＭＢＰの代謝の阻害は、−（Ｌ）n［ＩＭ］部分をこのように結合することでも達成できるが、−（Ｌ）n［ＩＭ］は本発明のＭIGの定義範囲外である。
【００１７】
式Ｉの−（Ｌ）n−部分は、ＩＭの任意適宜の位置に結合し得る。−（Ｌ）n−部分は、ＩＭの既存の置換基に取って代わるか、或いはＩＭの既存の置換基に共有結合する。−（Ｌ）n−部分は、好ましくはＩＭのカルボキシアルキル置換基を介して結合する。
【００１８】
「ｃＭｅｔ結合環状ペプチド（ｃＭＢＰ）」という用語は、ｃＭｅｔとしても知られる肝細胞成長因子（ＨＧＦ）高親和性レセプター（ｃＭｅｔ又は肝細胞成長因子レセプター）に結合するペプチドを意味する。本発明の好適なｃＭＢＰ無ペプチドは、ｃＭｅｔ／ＨＧＦ複合体のｃＭｅｔに関して約２０ｎＭ未満の見掛けＫＤを有している。ｃＭＢＰペプチドはプロリン残基を含み、かかる残基は主鎖アミド結合のシス／トランス異性化を示し得ることが知られている。本発明のｃＭＢＰペプチドは、任意のかかる異性体を含んでいる。
【００１９】
「生体適合性陽イオン」（Ｂc）という用語は、イオン化して負に帯電した基と共に塩を形成する正に帯電した対イオンを意味する。この場合、前記正に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳動物体（特に人体）への投与に適している。好適な生体適合性陽イオンの例には、アルカリ金属であるナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属であるカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンがある。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。
【００２０】
「アミノ酸」という用語は、Ｌ−又はＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）或いはアミノ酸模倣体を意味し、これらは天然のもの又は純粋に合成由来のものであってよく、光学的に純粋なもの（即ち、単一の鏡像異性体、したがってキラルなもの）であるか、或いは鏡像異性体の混合物であってよい。本明細書中では、アミノ酸に関する通常の三文字略語又は一文字略語が使用される。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋なものである。「アミノ酸模倣体」という用語は、アイソスター（即ち、天然化合物の立体構造及び電子構造を模倣するように設計されたもの）である天然アミノ酸の合成類似体を意味する。かかるアイソスターは当業者にとって公知であり、特に限定されないが、デプシペプチド、レトロ−インベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカン又は１，５−二置換テトラゾールを含む［Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２４，１３７（１９８５）を参照されたい］。
【００２１】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合（即ち、１つのアミノ酸のアミンを別のアミノ酸のカルボキシルに連結するアミド結合）によって連結された（上記に定義するような）２以上のアミノ酸を含む化合物を意味する。「ペプチド模倣体」又は「模倣体」という用語は、ペプチド又はタンパク質の生物学的活性を模倣するが、化学的性質がペプチド的でない（即ち、いかなるペプチド結合（つまり、アミノ酸間のアミド結合）も含まない）生物学的活性化合物をいう。ここでは、ペプチド模倣体という用語は広い意味で使用され、性質が完全にはペプチド的でない分子（例えば、プソイドペプチド、セミペプチド及びペプトイド）を包含する。
【００２２】
「光学レポーターイメージング成分」（ＩＭ）という用語は、緑色乃至近赤外波長（５００〜１２００ｎｍ、好ましくは６００〜１０００ｎｍ）を有する光を用いる光学イメージング方法で直接又は間接に検出できる蛍光色素又は発色団を意味する。
【００２３】
式Ｉのリンカー基−（Ａ）m−の役割の１つは、ＩＭをｃＭＢＰペプチドの活性部位から遠ざけることにあると想定されている。これが特に重要であるのは、イメージング成分が比較的バルキーである場合、酵素との相互作用が損なわれないようにするためである。これは、バルキーな基が活性部位から離れて位置する自由を与えるたわみ性（例えば、単純アルキル鎖）及び／又はＩＭを活性部位から離すように向ける剛性（例えば、シクロアルキル又はアリールスペーサー）を組み合わせることで達成できる。リンカー基の性質はまた、イメージング剤の生体分布を調整するためにも使用できる。即ち、例えばリンカー中にエーテル基を導入することは、血漿タンパク質結合を最小限に抑えるために役立つ。−（Ａ）m−がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位又は１〜１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖からなる場合、リンカー基はインビボでイメージング剤の薬物動態及び血中クリアランス速度を調整するために機能し得る。かかる「バイオモディファイアー」リンカー基は、バックグラウンド組織（例えば、筋肉又は肝臓）及び／又は血液からのイメージング剤のクリアランスを促進することで、バックグラウンド妨害を少なくして一層良好な診断画像を与えることができる。バイオモディファイアーリンカー基はまた、特定の排出経路（例えば、肝臓経由ではなく腎臓経由の排出）を有利にするためにも使用できる。
【００２４】
「糖」という用語は、単糖、二糖又は三糖を意味する。好適な糖には、グルコース、ガラクトース、マルトース、マンノース及びラクトースがある。任意には、アミノ酸への容易なカップリングを可能にするように糖を官能化することができる。即ち、例えばアミノ酸のグルコサミン誘導体は、ペプチド結合を介して他のアミノ酸に結合させることができる。（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社から商業的に入手できる）アスパラギンのグルコサミン誘導体はこれの一例である。
【００２５】
【化２】
好ましい特徴
イメージング剤の分子量は、好適には８０００ダルトン以下である。好ましくは、分子量は２８００〜６０００ダルトンの範囲内にあり、最も好ましくは３０００〜４５００ダルトンの範囲内にあり、３２００〜４０００ダルトンが特に好ましい。
【００２６】
本発明の好ましいイメージング剤は、両ペプチド末端がＭIG基によって保護されている。即ち、好ましくはＺ1及びＺ2が共にＭIGであり、これらは通常異なっている。上述の通り、Ｚ1／Ｚ2のいずれかが任意には−（Ｌ）n［ＩＭ］に等しくてよい。このようにして両ペプチド末端を保護することは、インビボイメージング剤用途にとって重要である。さもないと、急速な代謝の結果としてｃＭｅｔに対する選択的結合親和性の喪失が予想されるからである。Ｚ1及びＺ2が共にＭIGである場合、好ましくはＺ1はアセチルであり、Ｚ2は第一アミドである。最も好ましくは、Ｚ1はアセチルであり、Ｚ2は第一アミドであり、−（Ｌ）n［ＩＭ］部分はｃＭＢＰのリシン残基のε−アミン側鎖に結合している。
【００２７】
本発明の好ましいｃＭＢＰペプチドは、ｃＭｅｔ／ＨＧＦに対するｃＭｅｔの結合に関して（蛍光偏光アッセイ測定結果に基づいて）約１０ｎＭ未満のＫDを有し、最も好ましくは１〜５ｎＭの範囲内のＫDを有し、３ｎＭ未満が理想的である。
【００２８】
下記のように、式ＩのｃＭＢＰのペプチド配列（配列番号１）は１７量体のペプチド配列であり、これが主としてｃＭｅｔに対する選択的結合の原因をなす。
【００２９】
Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
（配列番号１）
本発明のｃＭＢＰペプチドが１７を超えるアミノ酸残基を含む場合、残りのアミノ酸はシステインは別にして任意のアミノ酸であり得る。追加の保護されないシステイン残基は、定義されたＣｙｓa−Ｃｙｓb及びＣｙｓc−Ｃｙｓdジスルフィドブリッジの不要のスクランブリングを引き起こすことがある。追加のペプチドは、好ましくは−（Ｌ）n［ＩＭ］部分の容易なコンジュゲーションのために適した側鎖を有する１以上のアミノ酸残基を含んでいる。好適なかかる残基としては、アミン官能化−（Ｌ）n［ＩＭ］基とのコンジュゲーションのためにはＡｓｐ又はＧｌｕ残基、或いはカルボキシ又は活性エステル官能化−（Ｌ）n［ＩＭ］基とのコンジュゲーションのためにはＬｙｓ残基がある。−（Ｌ）n［ＩＭ］のコンジュゲーションのためのアミノ酸残基は、好適にはｃＭＢＰペプチドの１７量体結合領域（配列番号１）から離れて位置しており、好ましくはＣ末端又はＮ末端に位置している。好ましくは、コンジュゲーションのためのアミノ酸残基はＬｙｓ残基である。
【００３０】
既知のアミノ酸置換体フェニルアラニン及びナフチルアラニンによる配列番号１のトリプトファン残基の置換を評価した。しかし、ｃＭｅｔ親和性の喪失が見出され、これはトリプトファン残基は活性のために重要であることを示唆している。
【００３１】
ｃＭＢＰペプチドは、さらにＮ末端セリン残基を含んで１８量体（配列番号２）を与えることが好ましい。
【００３２】
Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−
Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
（配列番号２）
配列番号１又は好ましくは配列番号２に加えて、ｃＭＢＰは最も好ましくはさらに下記のいずれかを含んでいる。
（ｉ）ｃＭＢＰペプチドのＣ−又はＮ−ペプチド末端の４アミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、−（Ｌ）nＩＭが前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基のカルボキシル側鎖に結合してアミド結合を与えるアミン基で官能化されている。
（ii）ｃＭＢＰペプチドのＣ−又はＮ−ペプチド末端の４アミノ酸残基中にＬｙｓ残基を含み、−（Ｌ）nＩＭが前記Ｌｙｓ残基のε−アミン側鎖に結合してアミド結合を与えるカルボキシル基で官能化されている。
【００３３】
好ましいｃＭＢＰペプチドは、下記の２２量体アミノ酸配列（配列番号３）を含んでいる。
【００３４】
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（配列番号３）
本発明のｃＭＢＰペプチドは、好ましくはＸ3がＡｒｇに等しい。
【００３５】
ｃＭＢＰペプチドは好ましくは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に加えて、さらに−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号４）、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号５）及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−（配列番号６）から選択されるリンカーペプチドをＮ末端又はＣ末端に含んでいる。リンカーペプチドのＬｙｓ残基は、−（Ｌ）n［ＩＭ］部分のコンジュゲーションのために最も好ましい位置である。特に好ましいｃＭＢＰペプチドは配列番号３を配列番号４のリンカーペプチドと共に含み、下記の２６量体アミノ酸配列（配列番号７）を有している。
【００３６】
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｔｙｒ−Ｃｙｓc−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号７）
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７のｃＭＢＰペプチドでは、好ましくはＺ1＝Ｚ2＝IGであり、最も好ましくはＺ1＝アセチルかつＺ2＝第一アミドである。
【００３７】
−（Ｌ）n［ＩＭ］部分は、好適にはＺ1又はＺ2のいずれかに結合しているか、或いは配列番号１のｃＭｅｔ結合配列と異なるｃＭＢＰペプチドのアミノ酸残基に結合している。好ましいアミノ酸残基及びコンジュゲーション部位は上述した通りである。−（Ｌ）n［ＩＭ］部分がＺ1又はＺ2に結合している場合、Ｎ末端又はＣ末端へのコンジュゲーションによってＺ1又はＺ2に置き換わり、そのようにしてインビボ代謝を阻止することができる。
【００３８】
好ましいＩＭ基は広範な非局在化電子系を有するものであって、例えば、シアニン類、メロシアニン類、インドシアニン類、フタロシアニン類、ナフタロシアニン類、トリフェニルメチン類、ポルフィリン類、ピリリウム色素、チアピリリウム色素、スクアリリウム色素、クロコニウム色素、アズレニウム色素、インドアニリン類、ベンゾフェノキサジニウム色素、ベンゾチアフェノチアジニウム色素、アントラキノン類、ナフトキノン類、インダスレン類、フタロイルアクリドン類、トリスフェノキノン類、アゾ色素、分子内及び分子間電荷移動色素及び色素錯体、トロポン類、テトラジン類、ビス（ジチオレン）錯体、ビス（ベンゼン−ジチオレート）錯体、インドアニリン色素、ビス（Ｓ，Ｏ−ジチオレン）錯体である。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び異なる吸収／発光特性を有するＧＦＰの変種のような蛍光タンパク質も有用である。特定の状況においてはある種の希土類金属（例えば、ユウロピウム、サマリウム、テルビウム又はジスプロシウム）の錯体が使用され、蛍光ナノ結晶（量子ドット）についても同様である。
【００３９】
使用できる発色団の具体例には、フルオレセイン、スルホローダミン１０１（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１９、インドシアニングリーン、Ｃｙ２、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、テトラメチルローダミン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０がある。シアニン色素が特に好ましい。Ｌｉｃｈａ ｅｔ ａｌはインビボ光学イメージング用の色素及び色素コンジュゲートを総説している［Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５７，１０８７−１１０８（２００５）］。
【００４０】
発蛍光団である好ましいシアニン色素は、次の式ＩＩのものである。
【００４１】
【化３】
式中、
各Ｘ′は独立に−Ｃ（ＣＨ3）2、−Ｓ−、−Ｏ−及び−Ｃ［（ＣＨ2）aＣＨ3］［（ＣＨ2）bＭ］−（式中、ａは０〜５の値を有する整数であり、ｂは１〜５の値を有する整数であり、ＭはＧ基であるか、或いはＳＯ3Ｍ1及びＨから選択される。）から選択され、
各Ｙ′は独立にＨ、−ＣＨ2ＮＨ2、−ＳＯ3Ｍ1、−ＣＨ2ＣＯＯＭ1、−ＮＣＳ及びＦからなる群から選択される１〜４の基を表し、Ｙ′基は芳香環の任意の位置に位置しており、
Ｑ′は独立にＨ、ＳＯ3Ｍ1、ＮＨ2、ＣＯＯＭ1、アンモニウム、エステル基、ベンジル及びＧ基からなる群から選択され、
Ｍ1はＨ又はＢcであり、
ｌは１〜３の整数であり、
ｍは１〜５の整数であり、
Ｘ′、Ｙ′及びＱ′の少なくとも１つはＧ基からなり、
ＧはｃＭＢＰペプチドへの結合のために適した反応基又は官能基である。
【００４２】
Ｇ基はｃＭＢＰペプチドの相補的な基と反応して、シアニン色素発蛍光団とｃＭＢＰペプチドとの間に共有結合を形成する。Ｇはペプチドの相補的な官能基と反応し得る反応基であってもよいし、或いは別法としてｃＭＢＰペプチドのと反応し得る官能基を含んでいてもよい。反応基及び官能基の例には、活性エステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン、ホスホラミダイト、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボン酸及びチオホスフェートがある。好ましくは、Ｇは活性エステルである。
【００４３】
「活性化エステル」又は「活性エステル」という用語は、良好な脱離基であり、したがってアミンのような求核性化合物との一層容易な反応を可能にするように設計された関連カルボン酸のエステル誘導体を意味する。好適な活性エステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェノール、ペンタフルオロチオフェノール、ｐ−ニトロフェノール、ヒドロキシベンゾトリアゾール及びＰｙＢＯＰ（即ち、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）である。好ましい活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はペンタフルオロフェノールエステル、特にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００４４】
式ＩＩの好ましい実施形態では、
各Ｘ′は−Ｃ（ＣＨ3）2−及び−Ｃ（ＣＨ3）［（ＣＨ2）4Ｍ］−（式中、ＭはＧ基又はＳＯ3Ｍ1である。）から選択され、
各Ｙ′はＳＯ3Ｍ1、Ｈ又は１〜４のＦ原子を表し、
各Ｑ′はＧ基及びＳＯ3Ｍ1から選択され、
ｌは好ましくは２であり、
ｍは好ましくは３、４又は５であり、
Ｘ′又はＱ′がＧ基である場合、最も好ましくはスクシンイミジルエステルである。
【００４５】
特に好ましいシアニン色素は、次の式ＩＩＩのものである。
【００４６】
【化４】
式中、
Ｒ1及びＲ2は独立にＨ又はＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1はＨ又はＢcである。）であって、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方はＳＯ3Ｍ1であり、
Ｒ3及びＲ4は独立にＣ1-4アルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は独立にＲa基（式中、ＲaはＣ1-4アルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル又は−（ＣＨ2）kＳＯ3Ｍ1であり、ｋは３又は４の値を有する整数である。）であるが、
シアニン色素がＲ1、Ｒ2及びＲa基に合計１〜４個のＳＯ3Ｍ1置換基を有することを条件とする。
【００４７】
好ましい式ＩＩＩの色素は、ｃＭＢＰへのコンジュゲーションを容易にするため、１以上のＣ1-6カルボキシアルキル基が存在するように選択される。
【００４８】
好ましい式ＩＩＩの個別色素を表１にまとめて示す。
【００４９】
【表１】
特に好ましい式ＩＩの色素はＣｙ５**及びＡｌｅｘａ６４７であり、Ｃｙ５**が理想的である。
【００５０】
合成リンカー基（Ｌ）が存在する場合、好ましくは［ＩＭ］及びＺ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2へのコンジュゲーションを容易にする末端官能基を含む。Ｌが１〜１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖を含む場合、アミノ酸残基は好ましくはグリシン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びセリンから選択される。ＬがＰＥＧ部分を含む場合、好ましくは式ＩＡ又は式ＩＢの単分散ＰＥＧ様構造のオリゴマー化で導かれる単位を含む。
【００５１】
【化５】
式ＩＡの１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸。式中、ｐは１〜１０の整数である。別法として、式ＩＢのプロピオン酸誘導体に基づくＰＥＧ様構造も使用できる。
【００５２】
【化６】
式中、ｐは式ＩＡに関して定義した通りであり、ｑは３〜１５の整数である。式ＩＢ中、ｐは好ましくは１又は２であり、ｑは好ましくは５〜１２である。
【００５３】
リンカー基がＰＥＧ又はペプチド鎖を含まない場合、好ましいＬ基は、２〜１０の原子、最も好ましくは２〜５の原子、特に好ましくは２又は３の原子を含む−（Ａ）m−部分を構成する結合原子の主鎖を有している。２つの原子を含む最小リンカー基主鎖は、いかなる望ましくない相互作用も最小限に抑えられるようにイメージング成分を十分に引き離すという利点を与える。
【００５４】
式Ｉ中、ｎは好ましくは０又は１であり、最も好ましくは０である（即ち、いかなるリンカー基も存在しない）。
【００５５】
本発明の好ましいイメージング剤は、次の式ＩＶを有する。
【００５６】
【化７】
式中、−（Ｌ）n［ＩＭ］基はＬｙｓ残基のε−アミノ基に結合している。好ましい式ＩＶのイメージング剤では、ＭIG（Ｎ末端Ａｌａ）はアセチルに等しく、ＭIG（Ｃ末端Ｌｙｓ）は第一アミドに等しい。式ＩＶ中、ｎは好ましくはゼロであり、ＩＭはシアニン色素、最も好ましくは式ＩＩのシアニン色素である。特に好ましい式ＩＶのイメージング剤では、ＩＭ＝Ｃｙ５**又はＡｌｅｘａ６４７であり、理想的にはＩＭ＝Ｃｙ５**である。
【００５７】
本発明の式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドは、
（ｉ）所望のｃＭＢＰペプチドと同じペプチド配列を有し、Ｃｙｓa及びＣｙｓbが保護されておらず、Ｃｙｓc及びＣｙｓd残基がチオール保護基を有する線状ペプチドの固相ペプチド合成を行う段階、
（ii）段階（ｉ）からのペプチドを塩基水溶液で処理することで、Ｃｙｓa及びＣｙｓbを連結する第１のジスルフィド結合を有する単環式ペプチドを得る段階、並びに
（iii）Ｃｙｓc及びＣｙｓdのチオール保護基を除去して環化することで、Ｃｙｓc及びＣｙｓdを連結する第２のジスルフィド結合を有する所望の二環式ペプチド生成物Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2を得る段階
を含んでなる製造方法によって得ることができる。
【００５８】
「保護基」という用語は、望ましくない化学反応を阻止又は抑制するが、分子の残部を変質させない程度に温和な条件下で問題の官能基から脱離させ得るのに十分な反応性を有するように設計された基を意味する。脱保護後には所望の生成物が得られる。アミン保護基は当業者にとって公知であり、好適にはＢｏｃ（ここでＢｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである。）、Ｆｍｏｃ（ここでＦｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニルである。）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［即ち、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］及びＮｐｙｓ（即ち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）から選択される。好適なチオール保護基は、Ｔｒｔ（トリチル）、Ａｃｍ（アセトアミドメチル）、ｔ−Ｂｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、メトキシベンジル、メチルベンジル及びＮｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）である。さらに他の保護基の使用は、‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９１）に記載されている。好ましいアミン保護基はＢｏｃ及びＦｍｏｃであり、最も好ましくはＢｏｃである。好ましいチオール保護基はＴｒｔ及びＡｃｍである。
【００５９】
例１及び例２は一層具体的な詳細を示している。固相ペプチド合成法のさらなる詳細は、Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ ａｎｄ Ｅ．Ｇｉｒａｌｄ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されている。ｃＭＢＰペプチドは不活性雰囲気下で最もよく貯蔵され、フリーザー内に保存される。溶液として使用する場合、ジスルフィドブリッジのスクランブリングを生じるリスクがあるので、７より高いｐＨは避けるのが最もよい。
【００６０】
イメージング剤は、第３の態様に関して（下記に）記載されるようにして製造できる。
【００６１】
第２の態様では、本発明は、第１の態様のイメージング剤を哺乳動物への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬品組成物を提供する。
【００６２】
「生体適合性キャリヤー」は、組成物が生理学的に許容され得るようにして（即ち、毒性又は過度の不快感なしに哺乳動物体に投与できるようにして）イメージング剤を懸濁又は溶解できる流体（特に液体）である。生体適合性キャリヤーは、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、（有利には注射用の最終生成物が等張性になるように平衡させ得る）食塩水のような水溶液、或いは１種以上の張度調整物質（例えば、生体適合性対イオンを有する血漿陽イオンの塩）、糖（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。好ましくは、生体適合性キャリヤー媒質はパイロジェンフリー注射用水又は等張食塩水である。
【００６３】
イメージング剤及び生体適合性キャリヤーはそれぞれ、注射器又はカニューレによる溶液の追加及び抜取りを許しながら、無菌保全性及び／又は放射能安全性の維持、さらに任意には不活性ヘッドスペースガス（例えば、窒素又はアルゴン）の維持を可能にする密封容器からなる適当なバイアル又は容器に入れた状態で供給される。好ましいかかる容器は、気密クロージャーを（通例はアルミニウムからなる）オーバーシールと共にクリンプ加工した隔壁密封バイアルである。クロージャーは、無菌保全性を維持しながら皮下注射針による１回又は数回の穿刺に適したもの（例えば、クリンプ加工した隔壁シールクロージャー）である。かかる容器は、（例えば、ヘッドスペースガスの変更又は溶液のガス抜きのために）所望される場合にはクロージャーが真空に耐え得ると共に、酸素又は水蒸気のような外部大気ガスの侵入を許すことなしに減圧のような圧力変化にも耐え得るという追加の利点を有している。
【００６４】
好ましい複数用量容器は、複数の患者用量を含む（例えば、容積１０〜３０ｃｍ3の）単一のバルクバイアルからなり、したがって臨床的状況に合わせて製剤の実用寿命中に様々な時間間隔で１回分の患者用量を臨床グレードの注射器に抜き取ることができる。予備充填注射器は１回分のヒト用量又は「単位用量」を含むように設計され、したがって好ましくは臨床用に適した使い捨て注射器又は他の注射器である。本発明の医薬品組成物は、好ましくは１人の患者用に適した用量を有し、上述したような適当な注射器又は容器に入れて供給される。
【００６５】
かかる医薬品組成物は、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤、フィラー、安定剤又は重量オスモル濃度調整剤のような追加賦形剤を任意に含むことができる。「抗菌防腐剤」という用語は、潜在的に有害な微生物（例えば、細菌、酵母又はかび）の増殖を阻止する薬剤を意味する。抗菌防腐剤はまた、使用する用量に応じて多少の殺菌性を示すこともある。本発明の抗菌防腐剤の主な役割は、医薬品組成物中におけるこのような微生物の増殖を阻止することである。しかし、抗菌防腐剤は、投与に先立って前記組成物を製造するために使用されるキットの１種以上の成分中における潜在的に有害な微生物の増殖を阻止するためにも任意に使用できる。好適な抗菌防腐剤には、パラベン類（即ち、メチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン或いはこれらの混合物）、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。好ましい抗菌防腐剤はパラベン類である。
【００６６】
「ｐＨ調整剤」という用語は、組成物のｐＨがヒト又は哺乳動物への投与のために許容し得る範囲（およそｐＨ４．０〜１０．５）内にあることを保証するために有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。好適なかかるｐＨ調整剤には、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ［即ち、トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン］のような薬学的に許容し得る緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような薬学的に許容し得る塩基がある。組成物をキットの形態で使用する場合には、ｐＨ調整剤を任意には独立のバイアル又は容器に入れて供給することができ、その結果としてキットのユーザーは多段操作の一部としてｐＨを調整することができる。
【００６７】
「フィラー」という用語は、製造及び凍結乾燥中における材料の取扱いを容易にすることができる薬学的に許容し得る増量剤を意味する。好適なフィラーには、塩化ナトリウムのような無機塩、及びスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性糖又は糖アルコールがある。
【００６８】
第２の態様の医薬品組成物は、無菌製造条件下で（即ち、クリーンルーム内で）製造して所望の無菌で非発熱性の生成物を得ることができる。基本構成部分、特に関連する試薬並びにイメージング剤に接触する装置部品（例えば、バイアル）は無菌であることが好ましい。かかる構成部分及び試薬は、無菌濾過或いは（例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は（例えば、エチレンオキシドによる）化学処理を用いる）終末滅菌をはじめとする、当技術分野で公知の方法によって滅菌できる。一部の構成部分を予め滅菌しておけば、最小数の操作を実施すれば済むので好ましい。しかし、予防策として、医薬品組成物の製造における最終段階として少なくとも無菌濾過段階を含めることが好ましい。
【００６９】
第２の態様の医薬品組成物は、任意には第４の態様に関して下記に記載するようなキットから製造される。
【００７０】
第３の態様では、本発明は、第１の態様のイメージング剤の製造方法であって、
（ｉ）Ｚ1がＨでありかつＺ2がＭIGである式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ1−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がＺ1位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（ii）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、ｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４アミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ1−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がｃＭＢＰペプチドの前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基の位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（iii）Ｚ1がＭIGであり、Ｚ3がＺ2基又は活性化エステルであり、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ3のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ2−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がＺ2位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階、及び
（iv）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、かつｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４アミノ酸残基中にＬｙｓを含む式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ1−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がｃＭＢＰペプチドのＬｙｓ残基の位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階
の１つを含んでなり、式中のＺ1、ｃＭＢＰ、Ｚ2、ＭIG、Ｌ、ｎ及びＩＭは（上記に）第１の態様で定義した通りであり、Ｚ3はＺ2基又は活性化エステルであり、Ｙ1はカルボン酸、活性化エステル、イソチオシアネート基又はチオシアネート基であり、Ｙ2はアミン基である、方法を提供する。
【００７１】
「活性化エステル」又は「活性エステル」という用語及びその好ましい実施形態は、上述した通りである。Ｙ2は好ましくは第一又は第二アミン基であり、最も好ましくは第一アミン基である。
【００７２】
化合物Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2では、好ましくはＺ1及びＺ2が共にＭIGに等しい。好ましいｃＭＢＰペプチド及びＺ1／Ｚ2基は第１の態様で記載した通りである。詳しくは、第１の態様のｃＭＢＰペプチドに関して記載した通り、ｃＭＢＰペプチドはコンジュゲーションを容易にするためにＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ残基を含むことが好ましい。段階（iv）に記載した通り、ｃＭＢＰペプチドはＬｙｓ残基を含むことが特に好ましい。
【００７３】
Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2の製法は、（上記に）第１の実施形態で記載されている。Ｚ3が活性エステルであるＺ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ3ペプチドは、Ｚ２がＯＨ又は生体適合性陽イオン（Ｂc）であるＺ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2から通常の方法によって製造できる。
【００７４】
ペプチドへのコンジュゲーションに適するように官能化された光学レポーター色素（ＩＭ）は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ社、Ｄｙｏｍｉｃｓ社、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社などから商業的に入手できる。かかる色素の多くはＮＨＳエステルとして入手できる。
【００７５】
好適な光学レポーター（ＩＭ）、特に色素をアミノ酸及びタンパク質に結合させる方法は、Ｌｉｃｈａ（上記参照）並びにＦｌａｎａｇａｎ ｅｔ ａｌ［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，８，７５１−７５６（１９９７）］、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ［ｉｂｉｄ，１３，６０５−６１０（２００２）］及びＺａｈｅｅｒ［Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，１（４），３５４−３６４（２００２）］によって記載されている。リンカー基（Ｌ）をｃＭＢＰペプチドに結合させる方法は、色素のみを結合させる方法（上記参照）と類似の化学作用を使用し、当技術分野で公知である。
【００７６】
第４の態様では、本発明は、第２の態様の医薬品組成物を製造するためのキットであって、当該キットは第１の態様のイメージング剤を無菌固体形態で含んでいて、第２の態様の生体適合性キャリヤーの無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の医薬品組成物が得られるキットを提供する。
【００７７】
その場合、コンジュゲート及び上述したような他の任意賦形剤は、凍結乾燥粉末として適当なバイアル又は容器に入れて供給できる。イメージング剤は、次いで所望の生体適合性キャリヤーを用いて再構成することで、哺乳動物への投与が可能な無菌で非発熱性の形態の医薬品組成物を与えるように設計されている。
【００７８】
イメージング剤の好ましい無菌固体形態は凍結乾燥固体である。無菌固体形態は、好ましくは医薬品組成物に関して（上記に）記載したような医薬品用容器に入れて供給される。キットを凍結乾燥する場合、配合物は糖類（好ましくはマンニトール、マルトース及びトリシン）から選択される凍結保護剤を任意に含むことができる。
【００７９】
第５の態様では、本発明は、哺乳動物体のインビボ光学イメージング方法であって、第１の態様のイメージング剤又は第２の態様の医薬品組成物を用いてインビボでのｃＭｅｔの過剰発現部位又は局在部位の画像を得ることを含んでなる方法を提供する。
【００８０】
「光学イメージング」という用語は、赤色乃至近赤外領域（波長６００〜１２００ｎｍ）内の光との相互作用に基づいて、病気の検出、ステージング又は診断、病気進展の追跡、或いは病気治療の追跡のための画像を形成する任意の方法を意味する。光学イメージングはさらに、いかなる装置も使用しない直接可視化並びに各種スコープ、カテーテル及び光学イメージング装置（例えば、断層撮影表示用のコンピューター支援ハードウェア）のような装置の使用を伴う直接可視化のためのあらゆる方法を包含する。かかるモダリティ及び測定技法には、特に限定されないが、ルミネセンスイメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光学コヒーレンス断層撮影、透過率イメージング、時間分解透過率イメージング、共焦点イメージング、非線形顕微鏡検査、光音響イメージング、音響光学イメージング、スペクトル分析、反射スペクトル分析、干渉分析、コヒーレンス干渉分析、拡散光学断層撮影及び蛍光媒介拡散光学断層撮影（連続波、時間ドメイン及び周波数ドメインシステム）、並びに光の散乱、吸光、偏光、ルミネセンス、蛍光寿命、量子収量及び消光の測定がある。これらの技法のさらなる詳細は、Ｔｕａｎ Ｖｏ−Ｄｉｎｈ（編）：“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”（２００３），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＣＣ、Ｍｙｃｅｋ ＆ Ｐｏｇｕｅ（編）：“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”（２００３），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｓｐｌｉｎｔｅｒ ＆ Ｈｏｐｐｅｒ：“Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ”（２００７），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＣＣに示されている。
【００８１】
緑色乃至近赤外領域の光は、好ましくは６００〜１０００ｎｍの波長を有する。光学イメージング方法は、好ましくは蛍光内視鏡検査である。第５の態様の哺乳動物体は、好ましくは人体である。イメージング剤の好ましい実施形態は、第１の態様に関して（上記に）記載した通りである。特に、蛍光色素を使用することが好ましい。
【００８２】
第５の態様の方法では、イメージング剤又は医薬品組成物は、好ましくは前記哺乳動物体に予め投与されている。「予め投与されている」とは、臨床医の関与の下でイメージング剤を例えば静脈内注射によって患者に投与する段階がイメージングに先立って既に実施されていることを意味する。この実施形態は、ｃＭｅｔが関係している哺乳動物体の病態のインビボ診断イメージング用の診断薬を製造するための、第１の実施形態のコンジュゲートの使用を含んでいる。
【００８３】
第５の態様の好ましい光学イメージング方法は、蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）である。ＦＲＩでは、本発明のイメージング剤を診断すべき被験体に投与し、次いで被験体の組織表面を励起光（通常は連続波（ＣＷ）励起）で照明する。光はレポーター分子（ＩＭ）を励起する。励起光によって生じるイメージング剤からの蛍光を、蛍光検出器を用いて検出する。好ましくは、戻る光を濾光することで蛍光成分を（単独に又は部分的に）分離する。蛍光から画像を形成する。通常、最小限の処理が実施され（寿命、量子収量などの光学パラメーターを計算するためのプロセッサーは使用されない）、画像は蛍光強度をマップする。イメージング剤は、病気領域に集中して高い蛍光強度を生み出すように設計されている。したがって、病気領域は蛍光強度画像中に正のコントラストを生み出す。画像は好ましくはＣＣＤカメラ又はチップを用いて得られ、そうすればリアルタイムイメージングが可能である。
【００８４】
励起用の波長は、使用する色素の種類に応じて変化する。励起光を発生するための装置は、レーザー（例えば、イオンレーザー、色素レーザー又は半導体レーザー）、ハロゲン光源或いはキセノン光源のような通常の励起光源であり得る。任意には、各種の光学フィルターを用いて最適の励起波長を得ることができる。
【００８５】
好ましいＦＲＩ方法は下記の段階を含んでなる。即ち、
（ｉ）哺乳動物体内の検査対象組織表面を励起光で照明する段階、
（ii）イメージング成分（ＩＭ）の励起によって生じるイメージング剤からの蛍光を蛍光検出器を用いて検出する段階、
（iii）蛍光検出器によって検出された光を任意に濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（iv）段階（ii）又は段階（iii）の蛍光から前記検査対象組織表面の画像を形成する段階
を含んでなる。段階（ｉ）では、励起光は好ましくは連続波（ＣＷ）の性質を有する。段階（iii）では、検出される光は好ましくは濾光される。特に好ましいＦＲＩ方法は蛍光内視鏡検査である。
【００８６】
第５の態様の別のイメージング方法は、ＦＤＰＭ（周波数ドメイン光子移動）を使用する。これは、組織内におけるＩＭの検出深度が大きいことが重要である場合、連続波（ＣＷ）方法に比べて利点を有する［Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］。かかる周波数／時間ドメインイメージングのためには、ＩＭが画像化すべき病変の組織深度及び使用する計装のタイプに応じて変調できる蛍光特性を有するならば有利である。
【００８７】
ＦＤＰＭ方法は下記のようなものである。即ち、
（ａ）不均質組成を有する前記哺乳動物体の光散乱性生体組織を、所定の経時変動強度を有する光源からの光に暴露してイメージング剤を励起する段階であって、組織が励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記暴露に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応する複数の値をプロセッサーで確定することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルが組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことで組織の画像を生成する段階
を含んでなる。
【００８８】
段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくはイメージング剤の取込みに対応し、好ましくはさらにイメージング剤の投与前における組織の吸着係数及び散乱係数に対応する複数の量のマッピングを含む。段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくは蛍光寿命、蛍光量子効率、蛍光収量及びイメージング剤取込みの１以上に対応する。蛍光特性は、好ましくは発光強度に無関係であり、またイメージング剤濃度に無関係である。
【００８９】
段階（ｃ）の定量化は、好ましくは、（ｉ）値の推定値を設定し、（ii）推定値の関数として計算発光を求め、（iii）計算発光を前記検出段階の発光と比較して誤差を求め、（iv）誤差の関数として蛍光特性の修正推定値を得ることを含む。定量化は、好ましくは組織の多重光散乱挙動をモデル化する数学的関係から値を求めることを含む。第１のオプションの方法は、好ましくはさらに、前記蛍光特性の変動を検出することでインビボでの組織の代謝特性をモニターすることを含む。
【００９０】
第５の態様の光学イメージングは、好ましくは結腸直腸癌（ＣＲＣ）の管理を容易にするために使用される。「ＣＲＣの管理」という用語は、病気進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は治療のモニタリングでの使用を意味する。好適な光学イメージング方法のさらなる詳細は、Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ ｅｔ ａｌ［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］によって総説されている。
【００９１】
第６の態様では、本発明は、哺乳動物体の病気進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は結腸直腸癌（ＣＲＣ）の治療のモニタリングを行う方法であって、第５の態様のインビボ光学イメージング方法を含んでなる方法を提供する。
【実施例】
【００９２】
以下に詳述する非限定的な実施例によって本発明を例証する。実施例１は、本発明のｃＭＢＰペプチド（化合物１）の合成法を示す。実施例２は、化合物１のペプチド配列がスクランブルされている、陰性対照としての関連ペプチドの合成法を示す。実施例３は、本発明の好ましい色素であるシアニン色素Ｃｙ５**の合成法を示す。実施例４は、Ｃｙ５**の活性エステルの合成法を示す。実施例５は、ペプチド（ｃＭＢＰペプチド及び対照）に対する本発明のシアニン色素のコンジュゲーションを示す。化合物３波７をこのようにして比較した。実施例６は、インビトロでｃＭｅｔに対するペプチドの親和性を測定する方法を示す。結果は、光学レポーターイメージング成分（シアニン色素）が結合している場合でも、結合は選択的であることを示している。実施例７は、癌の動物モデルにおける化合物５及び化合物７のインビボ試験に関するデータを示す。化合物５については優れた腫瘍
／バックグラウンド比がみられたのに対し、化合物７（陰性対照）は腫瘍とバックグラウンドとを識別しなかった。
【００９３】
略語
通常の一文字又は三文字アミノ酸略語を使用する。
Ａｃｍ： アセトアミドメチル
ＡＣＮ（又はＭｅＣＮ）：アセトニトリル
Ｂｏｃ： ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ： ジクロロメタン
ＤＭＦ： ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ： ジメチルスルホキシド
Ｆｍｏｃ： ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＢＴＵ： Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチ ルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＰＬＣ： 高速液体クロマトグラフィー
ＨＳＰｙＵ： Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチレン
ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＮＨＳ： Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド
ＮＭＭ： Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＰ： １−メチル−２−ピロリジノン
Ｐｂｆ： ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン５−スルホニ ル
ＰＢＳ： リン酸塩緩衝食塩水
ｔＢｕ： ｔ−ブチル
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ： トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ： トリチル
【００９４】
【表２】
例１
【００９５】
例１：化合物１の合成
段階（ａ）：保護前駆体線状ペプチドの合成
前駆体線状ペプチドは下記の構造を有している。
【００９６】
Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2。
【００９７】
０．１ｍｍｏｌのＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｎｏｖａｇｅｌ樹脂から出発するＦｍｏｃ化学を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３３Ａペプチド合成機上でペプチジル樹脂Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ψMe,Meｐｒｏ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ポリマーをアセンブルした。カップリング段階では、（ＨＢＴＵを用いて）予備活性化した過剰量の１ｍｍｏｌアミノ酸を適用した。Ｇｌｕ−Ｔｈｒプソイドプロリン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ０５−２０−１１２２）を配列中に組み込んだ。樹脂を窒素バブラー装置に移し、無水酢酸（１ｍｍｏｌ）及びＮＭＭ（１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した溶液で６０分間処理した。濾過によって無水物溶液を除去し、樹脂をＤＣＭで洗浄してから窒素流下で乾燥した。
【００９８】
樹脂からのペプチド切断及び側鎖保護基の同時除去は、２．５％のＴＩＳ、２．５％の４−チオクレゾール及び２．５％の水を含むＴＦＡ（１０ｍＬ）中で２時間と３０分間実施した。樹脂を濾過によって取り除き、ＴＦＡを真空中で除去し、残留物にジエチルエーテルを添加した。生じた沈殿をジエチルエーテルで洗浄し、空気乾燥することで、２６４ｍｇの粗ペプチドを得た。
【００９９】
分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３０分）により粗ペプチドを精製することで、純粋な化合物１の線状前駆体１００ｍｇを得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：６．５４分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１４６４．６、ＭＨ22+実測値：１４６５．１）。
【０１００】
段階（ｂ）：単環式Ｃｙｓ４−１６ジスルフィドブリッジの形成
Ｃｙｓ４−１６；Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2。
【０１０１】
段階（ａ）からの線状前駆体（１００ｍｇ）を５％ＤＭＳＯ／水（２００ｍＬ）に溶解し、アンモニアを用いて溶液をｐＨ６に調整した。反応混合物を５日間撹拌した。次いで、ＴＦＡを用いて溶液をｐＨ２に調整し、大部分の溶媒を真空中での蒸発によって除去した。生成物の精製のため、残留物（４０ｍＬ）を分取ＨＰＬＣカラム上に少しずつ注入した。
【０１０２】
分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂを１０分間、次いで４０分で０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：４４分）により残留物を精製することで、純粋な化合物１の単環式前駆体７２ｍｇを得た。
【０１０３】
（異性体Ｐ１乃至Ｐ３の混合物としての）純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：５．３７分（Ｐ１）、５．６１分（Ｐ２）、６．０５分（Ｐ３））によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１４６３．６、ＭＨ22+実測値：１４６４．１（Ｐ１）、１４６４．４（Ｐ２）、１４６４．３（Ｐ３））。
【０１０４】
段階（ｃ）：第２のＣｙｓ６−１４ジスルフィドブリッジの形成（化合物１）
段階（ｂ）からの単環式前駆体（７２ｍｇ）を窒素ブランケット下で７５％ＡｃＯＨ／水（７２ｍＬ）に溶解した。１Ｍ ＨＣｌ（７．２ｍＬ）及びＡｃＯＨ中の０．０５Ｍ Ｉ2（４．８ｍＬ）をその順序で添加し、混合物を４５分間撹拌した。１Ｍアスコルビン酸（１ｍＬ）を添加して無色の混合物を得た。大部分の溶媒を真空中で蒸発させ、残留物（１８ｍＬ）を水／０．１％ＴＦＡ（４ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１０５】
分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂを１０分間、次いで４０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：４３〜５３分）により残留物を精製することで、５２ｍｇの純粋な化合物１を得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：６．５４分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１３９１．５、ＭＨ22+実測値：１３９２．５）。
例２
【０１０６】
例２：化合物２の合成
Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2。
【０１０７】
化合物２は、化合物１のペプチド配列がスクランブルされた陰性対照である。
【０１０８】
段階（ａ）：保護前駆体線状ペプチドの合成
０．１ｍｍｏｌのＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｎｏｖａｇｅｌ樹脂から出発するＦｍｏｃ化学を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３３Ａペプチド合成機上でペプチジル樹脂Ｈ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ψMe,Meｐｒｏ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ポリマーをアセンブルした。カップリング段階では、（ＨＢＴＵを用いて）予備活性化した過剰量の１ｍｍｏｌアミノ酸を適用した。Ｔｙｒ−Ｓｅｒプソイドプロリン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ０５−２０−１０１４）を配列中に組み込んだ。樹脂を窒素バブラー装置に移し、無水酢酸（１ｍｍｏｌ）及びＮＭＭ（１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した溶液で６０分間処理した。濾過によって無水物溶液を除去し、樹脂をＤＣＭで洗浄してから窒素流下で乾燥した。
【０１０９】
樹脂からのペプチド切断及び側鎖保護基の同時除去は、２．５％のＴＩＳ、２．５％の４−チオクレゾール及び２．５％の水を含むＴＦＡ（１０ｍＬ）中で２時間と１０分間実施した。樹脂を濾過によって取り除き、ＴＦＡを真空中で除去し、残留物にジエチルエーテルを添加した。生じた沈殿をジエチルエーテルで洗浄し、空気乾燥することで、２６４ｍｇの粗ペプチドを得た。
【０１１０】
分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：５０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×５０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３４．１分）により粗ペプチドを精製することで、２００ｍＬのＡＣＮ／水に溶解された純粋なＤＸ−１６６２陰性対照線状前駆体を得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：５分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．６ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ２０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３．５２分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１４６４．６、ＭＨ22+実測値：１４６４．９）。
【０１１１】
段階（ｂ）：単環式Ｃｙｓ４−１６ジスルフィドブリッジの形成
Ｃｙｓ４−１６；Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2。
【０１１２】
段階（ａ）からの陰性対照線状前駆体溶液（２００ｍＬ、４．３．１参照）にＤＭＳＯ（１０ｍＬ）を添加し、アンモニアを用いて溶液をｐＨ７に調整した。反応混合物を４０℃で１８時間加熱し、次いで６０℃で６０分間加熱した。ＴＦＡを用いて溶液をｐＨ２に調整し、ＡＣＮを真空中での蒸発によって除去した。残留物を分取ＨＰＬＣによる精製に付した。
【０１１３】
分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂを５分間、次いで６０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：５０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×５０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：２９．６分）により残留物を精製することで、１００ｍＬのＡＣＮ／水中に純粋な陰性対照単環式前駆体を得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：５分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．６ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ２０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３．４６分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１４６３．６、ＭＨ22+実測値：１４６３．７）。
【０１１４】
段階（ｃ）：第２のＣｙｓ６−１４ジスルフィドブリッジの形成（化合物２）
Ｃｙｓ４−１６，６−１４；Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2。
【０１１５】
段階（ｂ）からの陰性対照単環式前駆体溶液（１００ｍＬ）をＡｃＯＨ（１００ｍＬ）で希釈した。アルゴンブランケット下で１Ｍ ＨＣｌ（５ｍＬ）及びＡｃＯＨ中の０．０５Ｍ Ｉ2（７ｍＬ）をその順序で添加し、混合物を２０分間撹拌した。１Ｍアスコルビン酸（１ｍＬ）を添加して無色の混合物を得た。大部分の溶媒を真空中で蒸発させ、残留物（３０ｍＬ）を水／０．１％ＴＦＡ（１００ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１１６】
分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂを１０分間、次いで６０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：５０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×５０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３２．８分）により残留物を精製することで、３０ｍｇの純粋な化合物２を得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：６．５４分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１３９１．５、ＭＨ22+実測値：１３９２．５）。
例３
【０１１７】
例３：シアニン色素２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（Ｃｙ５**）の合成
【０１１８】
【化８】
（３ａ）５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸
【０１１９】
【化９】
水素化ナトリウム（鉱油中６０％ＮａＨの１２．０ｇ）のＤＭＦ（１００ｍｌ）懸濁液に、氷浴で冷却しながらエチル２−メチルアセトアセテート（５０ｇ）のＤＭＦ（２５ｍｌ）溶液を１時間かけて滴下した（内部温度０〜４℃）。この混合物を撹拌しながら４５分間放置して周囲温度まで温めた後に再冷却した。次いで、１，４−ブタンスルトン（４５ｇ）のＤＭＦ（２５ｍｌ）溶液を１５分かけて滴下した。最終混合物を６０℃で１８時間加熱した。溶媒を回転蒸発によって除去し、残留物を水とジエチルエーテルとの間に分配させた。水性層を集め、新鮮なジエチルエーテルで洗浄し、回転蒸発させて粘着性の泡状物を得た。この中間体を水（１００ｍｌ）に溶解し、撹拌しながら水酸化ナトリウム（１７．８ｇ）を１５分かけて添加した。混合物を９０℃で１８時間加熱した。冷却した反応混合物を濃塩酸（約４０ｍｌ）の添加で約ｐＨ２に調整した。溶液を回転蒸発させ、真空下で乾燥した。黄色の固体を、２％の塩酸を含むエタノール（３×１５０ｍｌ）で洗浄した。エタノール溶液を濾過し、回転蒸発させ、真空下で乾燥して黄色の固体を得た。収量７０ｇ。
【０１２０】
（３ｂ）２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸二カリウム塩
【０１２１】
【化１０】
４−ヒドラジノベンゼンスルホン酸（４０ｇ）、（３ａからの）５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸（６０ｇ）及び酢酸（５００ｍｌ）を混合し、還流させながら６時間加熱した。溶媒を濾過し、回転蒸発させ、真空下で乾燥した。固体をメタノール（１Ｌ）に溶解した。これに水酸化カリウムの２Ｍメタノール溶液（３００ｍｌ）を添加した。混合物を３時間撹拌し、次いで回転蒸発を用いて溶媒の体積を５０％減少させた。得られた沈殿を濾別し、メタノールで洗浄し、真空下で乾燥した。収量６０ｇ。ＭＳ（ＬＣＭＳ）：ＭＨ+ ３６２。正確な質量：実測値３６２．０７２９。ＭＨ+＝Ｃ14Ｈ20ＮＯ6Ｓ2はｍ／ｚ ３６２．０７３２（−０．８ｐｐｍ）を要求する。
【０１２２】
（３ｃ）２，３−ジメチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート二カリウム塩
【０１２３】
【化１１】
（３bからの）２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸（６０ｇ）を１，４−ブタンスルトン（１８０ｇ）及びテトラメチレンスルホン（１４６ｍｌ）と共に１４０℃で１６時間加熱した。得られた赤色固体をジエチルエーテルで洗浄し、粉砕して粉末にし、真空下で乾燥した。収量６０ｇ。
【０１２４】
（３ｄ）ＴＦＡ塩としてのＣｙ５**
１−（５′−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチル−インドリウムブロミド−５−スルホン酸Ｋ+塩（２．７ｇ）、マロンアルデヒドビス（フェニルイミン）一塩酸塩（９６０ｍｇ）、無水酢酸（３６ｍｌ）及び酢酸（１８ｍｌ）を１２０℃で１時間加熱して暗赤褐色の溶液を得た。反応混合物を周囲温度に冷却した。（３ｃからの）２，３−ジメチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（８．１ｇ）及び酢酸カリウム（４．５ｇ）を混合物に添加し、混合物を周囲温度で１８時間撹拌した。得られた青色の溶液を酢酸エチルを用いて沈殿させ、真空下で乾燥した。粗色素を液体クロマトグラフィー（ＲＰＣ18、水＋０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ勾配）によって精製した。主色素ピークを含む画分を集め、プールし、真空下で蒸発させることで、２ｇの標記化合物を得た。ＵＶ／Ｖｉｓ（水＋０．１％ＴＦＡ）：６５０ｎｍ。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ+ ８８７．１。ＭＨ+＝Ｃ38Ｈ50Ｎ2Ｏ14Ｓ4はｍ／ｚ ８８７．１を要求する。
例４
【０１２５】
例４：２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−｛６−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−６−オキソヘキシル｝−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネートジイソプロピルエチルアミン塩（Ｃｙ５**のＮＨＳエステル）の合成
【０１２６】
【化１２】
Ｃｙ５**（例３、１０ｍｇ）を無水ＤＭＳＯ（３ｍｌ）に溶解し、これにＨＳＰｙＵ（２０ｍｇ）及びＮ，Ｎ′−ジイソプロピルエチルアミン（８０μｌ）を添加した。得られた溶液を３時間混合したところ、ＴＬＣ（ＲＰＣ１８、水／ＭｅＣＮ）が反応の完了を示した。酢酸エチル／ジエチルエーテル中での沈殿によって色素を単離し、濾別し、酢酸エチルで洗浄し、真空下で乾燥した。ＵＶ／Ｖｉｓ（水）６５０ｎｍ。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＨ+ ９８３．５。ＭＨ+＝Ｃ42Ｈ53Ｎ3Ｏ16Ｓ4はｍ／ｚ ９８４．１６を要求する。
例５
【０１２７】
例５：色素のコンジュゲーション、化合物３〜７の合成
Ｃｙｓ４−１６，６−１４；Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｃｙ５）−ＮＨ2（化合物３）。
【０１２８】
化合物１（１０ｍｇ）、ＮＭＭ（４μＬ）及びＣｙ５ ＮＨＳエステル（５．７ｍｇ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＰＡ１５１０４）をＮＭＰ（１ｍＬ）に溶解し、反応混合物を７時間撹拌した。次いで、反応混合物を５％ＡＣＮ／水（８ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１２９】
分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で５〜５０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＨＣＯＯＨ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＨＣＯＯＨ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３５．５分）により粗ペプチドを精製することで、８．１ｍｇの純粋な化合物３を得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で５〜５０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：８．１５分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１７１０．６、ＭＨ22+実測値：１７１１．０）。
【０１３０】
同様にして化合物４を製造し、エレクトロスプレー質量分析法で分析した（ＭＨ22+計算値：１７１０．６、ＭＨ22+実測値：１７１０．９）。
【０１３１】
他の色素−ペプチドコンジュゲート（化合物５〜７）を類似の方法で製造した。Ａｌｅ
ｘａ６４７はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社（Ａ２０１０６）から購入した。
化合物５（ＭＨ22+計算値：１８２５．７、ＭＨ22+実測値：１８２５．９）。
化合物６（ＭＨ22+計算値：１８１１．７、ＭＨ22+実測値：１８１２．０）。
化合物７（ＭＨ22+計算値：１８２５．７、ＭＨ22+実測値：１８２６．２）。
例６
【０１３２】
例６：インビトロ蛍光偏光アッセイ
蛍光偏光アッセイの原理を簡単に述べれば、以下の通りである。
【０１３３】
単色光が水平偏光フィルターを通過し、試料中の蛍光分子を励起する。垂直偏光面内に正しく配向した分子のみが光を吸収し、励起され、次いで光を放出する。放出された光を垂直面内及び水平面内で測定する。異方性値（Ａ）は、下記の式に従った光強度の比である。
【０１３４】
【数１】
蛍光異方性測定は、ｅｘ６４６／ｅｍ６７８ｎｍでＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ蛍光偏光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社、米国）を使用しながら、３８４ウェルマイクロプレート中において結合緩衝液（ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）中１０μＬの体積で実施した。色素標識ペプチドの濃度を一定（２０ｎＭ）に保つと共に、ヒト又はマウスｃＭｅｔ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）或いはＳｅｍａｐｈｏｒｉｎ ６Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）の濃度を０〜１５０ｎＭの範囲内で変化させた。結合混合物をマイクロプレート中において３０℃で１０分間平衡させた。観察された異方性の変化を下記の式に当てはめた。
【０１３５】
【数２】
式中、ｒobsは観察された異方性であり、ｒfreeは遊離ペプチドの異方性であり、ｒboundは結合ペプチドの異方性であり、ＫDは解離定数であり、ｃＭｅｔは総ｃＭｅｔ濃度であり、Ｐは総色素標識ペプチド濃度である。この式は、合成ペプチド及びレセプターが溶液中において１：１の化学量論比で可逆複合体を形成することを仮定している。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて非線形回帰によりデータ当てはめを行うことでＫD値（一部位結合）を得た。
【０１３６】
ヒト及びマウスｃＭｅｔ（Ｆｃキメラ）に対する結合に関して化合物３及び化合物４を試験した。結果は、ヒトｃＭｅｔに対する化合物３の結合に関して３±１ｎＭのＫDを示した。ヒトｃＭｅｔに対する化合物４の結合は存在しなかった。さらに、化合物３及び化合物４は試験範囲内ではマウスｃＭｅｔに対する結合を示さなかった。同じ方法を用いて、化合物５はヒトｃＭｅｔに関して１．１ｎＭのＫDを有することが判明した。
例７
【０１３７】
例７：化合物５及び化合物７のインビボ試験
（ａ）動物モデル
この試験では５４頭の雌ＢＡＬＢ ｃ／Ａヌード（Ｂｏｍ）マウスを使用した。動物の使用は地方倫理委員会によって承認された。ＢＡＬＢ ｃ／Ａヌードは、他のヌードマウス系統に比べてヒト腫瘍に対し高い生着率を有する、同系交配された免疫無防備状態のマウス系統である。マウスは到着時に４週齢であり、試験の開始時には約２０グラムの体重を有していた。動物は、ＨＥＰＡ濾過空気を備えた個別換気ケージ（ＩＶＣ、Ｓｃａｎｂｕｒ ＢＫ社）内に収容した。動物は、“Ｒａｔ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ ｎｒ．３ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ”飼料（Ｓｃａｎｂｕｒ ＢＫ社）及び１ｍＭのモル濃度にＨＣｌを添加して酸性化した水道水（ｐＨ３．０）に随意にアクセスできた。
【０１３８】
結腸癌ＨＣＴ−１５はヒト結腸癌腫から導かれ、Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ［Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，２１，４０９−４１７（２００４）］によればｃＭｅｔを発現することが報告されている。この細胞株は、ヌードマウスに皮下接種した場合に腫瘍を形成することが判明した［Ｆｌａｔｍａｒｋ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４０，１５９３−１５９８（２００４）］。
【０１３９】
ＨＣＴ−１５細胞を増殖させ、１０％血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ ＃Ｒ０８８３）中で皮下接種用に準備した。継代数４（Ｐ４）で保存株を作成し、５％ＤＭＳＯを含む培地中における３×１０7細胞／バイアルの量を液体窒素中で凍結して貯蔵した。移植当日、細胞を３７℃の水浴中で急速に解凍し（約２分間）、洗浄し、ＰＢＳ／２％血清中に再懸濁した（１２００ｒｐｍで１０分間の遠心）。投与用注射器中に細胞を吸引する際には、常にバイアル内の細胞を完全に混合してから行った。動物に軽いガス麻酔をかけながら、ファインボア注射針（２５Ｇ）を用いて０．１ｍｌの量の細胞懸濁液を肩及び背中に皮下注射した。次いで、動物をケージに戻し、腫瘍を１３〜１７日間増殖させた。動物には、５日以上の順化期間を置いてから接種処置を施した。
【０１４０】
（ｂ）処置
すべての試験物質は、凍結乾燥粉末からＰＢＳを用いて再構成した。白色プリンター用紙の小さな堆積物をイメージ化してフラットフィールド画像を得、これを用いて照明の不均一性を補正した。物理的に固定しながら、試験物質を外側尾静脈に静脈内注射した。注射量は０．１ｍｌであり、これは動物１頭当たり試験物質１ｎｍｏｌの用量に相当している。注射後、動物をケージに戻した。イメージングの直後、動物を頸部脱臼によって殺した。限られた数の動物（ｎ＝１〜６）における皮膚及び筋肉組織へのウォッシュアウト率の比較に基づき、各試験物質に関する最適イメージング時点を推定した。化合物３及び化合物４に関するイメージング時点は注射後１２０分であった。各動物に関し、皮下で増殖した腫瘍を死後に切除した。１つの腫瘍のへりから、厚さ約１．６ｍｍかつ直径約３〜４ｍｍの薄いスライスを切り取った。次いで、腫瘍スライスを同じ動物の正常結腸領域を背景にしてイメージ化した。
【０１４１】
（ｃ）イメージング
イメージングは、光源を用いてレポーターを励起しかつ濾光系を用いて蛍光成分を抽出するように改造した臨床用腹腔鏡を通して行った。レポーター分子の励起のためには６３５ｎｍレーザーを使用した。検出器としてはＨａｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ ＥＲＧ ＣＣＤカメラを使用した。カメラは利得０の２×２ビンニングモードで動作させた。結腸イメージング用の標準露光時間は１０秒であった。システム較正測定結果によれば、動物イメージングシステムを用いた場合の１０秒の露光時間は、臨床的に適切な光源、視野及び組織表面までの距離を用いた場合の４０ミリ秒の露光に相当している。画像中の強度分布は、システム較正データにより、照明の不均一性について補正した。腫瘍上に位置する検査対象領域及び正常結腸バックグラウンドから標的／バックグラウンド比を計算した。レシーバー動作特性分析のために使用する標準的なスコアリングシステムを用いて画像を目視評価した。
【０１４２】
（ｄ）結果
化合物５は１．４６：１の腫瘍／正常比を有しており、同一の色素を含む対応したスクランブルド対照ペプチド（化合物７）は１．０４：１の比を有していた。化合物５は容易に確認できる腫瘍を示したのに対し、化合物７ではバックグラウンドに対して何も識別できなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式Ｉのコンジュゲートを含んでなるイメージング剤。
【化１】
式中、
Ｚ1はｃＭＢＰのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭIGであり、
Ｚ2はｃＭＢＰのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢc（式中、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）又はＭIGであり、
ｃＭＢＰは、下記のアミノ酸配列（配列番号１）を含む１７〜３０のアミノ酸のｃＭｅｔ結合環状ペプチドであり、
Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
（式中、Ｘ1はＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＴｙｒであり、Ｘ2はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｓｎであり、Ｘ3はＴｈｒ又はＡｒｇであり、Ｘ4はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ5はＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ6はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｃｙｓa-dの各々はシステイン残基であって、残基ａ及びｂ並びに残部ｃ及びｄは環化して２つの独立したジスルフィド結合を形成している。）
ＭIGは、ペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基からなる代謝阻害基であり、
Ｌは式−（Ａ）m−（式中、Ａは独立に−ＣＲ2−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ2−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ2ＮＲ−、−ＮＲＳＯ2−、−ＣＲ2ＯＣＲ2−、−ＣＲ2ＳＣＲ2−、−ＣＲ2ＮＲＣＲ2−、Ｃ4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基又はＣ3-12ヘテロアリーレン基、或いはアミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4アルケニル、Ｃ2-4アルキニル、Ｃ1-4アルコキシアルキル及びＣ1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。）の合成リンカー基であり、
ｎは０又は１の値を有する整数であり、
ＩＭは、６００〜１２００ｎｍの緑色乃至近赤外波長を有する光を用いて哺乳動物体のインビボイメージングを行うために適した光学レポーターイメージング成分である。
【請求項２】
配列番号１に加えて、ｃＭＢＰがさらにＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４アミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、−（Ｌ）nＩＭが前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基のカルボキシル側鎖に結合してアミド結合を与えるアミン基で官能化されている、請求項１記載のイメージング剤。
【請求項３】
配列番号１に加えて、ｃＭＢＰがさらにＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４アミノ酸残基中にＬｙｓ残基を含み、−（Ｌ）nＩＭが前記Ｌｙｓ残基のε−アミン側鎖に結合してアミド結合を与えるカルボキシル基で官能化されている、請求項１又は請求項２記載のイメージング剤。
【請求項４】
ｃＭＢＰが下記配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のイメージング剤。
Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−
Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6（配列番号２）
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（配列番号３）
【請求項５】
Ｘ3がＡｒｇである、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２又は配列番号３に加えて、ｃＭＢＰがさらに−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号４）、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号５）及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−（配列番号６）から選択されるリンカーペプチドをＮ末端又はＣ末端に含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項７】
ｃＭＢＰが下記のアミノ酸配列（配列番号７）を有する、請求項６記載のイメージング剤。
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｔｙｒ−Ｃｙｓc−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
【請求項８】
Ｚ1及びＺ2の両方が独立にＭIGである、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項９】
Ｚ1がアセチルであり、Ｚ2が第一アミドである、請求項８記載のイメージング剤。
【請求項１０】
ｎが０である、請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項１１】
ＩＭが６００〜１０００ｎｍの範囲内に吸収極大を有する色素である、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項１２】
ＩＭがシアニン色素である、請求項１１記載のイメージング剤。
【請求項１３】
シアニン色素が次の式ＩＩＩを有する、請求項１２記載のイメージング剤。
【化２】
式中、
Ｒ1及びＲ2は独立にＨ又はＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1はＨ又はＢcである。）であって、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方はＳＯ3Ｍ1であり、
Ｒ3及びＲ4独立にＣ1-4アルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は独立にＲa基（式中、ＲaはＣ1-4アルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル又は−（ＣＨ2）kＳＯ3Ｍ1であり、ｋは３又は４の値を有する整数である。）であるが、
シアニン色素がＲ1、Ｒ2及びＲa基に合計１〜４個のＳＯ3Ｍ1置換基を有することを条件とする。
【請求項１４】
ｃＭＢＰが請求項７で定義した通りであり、Ｚ1及びＺ2が請求項９で定義した通りであり、ＩＭが請求項３及び請求項１３で定義した通りである、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項１５】
請求項１乃至請求項１４のいずれか１項に記載のイメージング剤を、哺乳動物への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬品組成物。
【請求項１６】
１人の患者用に適した用量を有し、適当な注射器又は容器に入れて供給される、請求項１５記載の医薬品組成物。
【請求項１７】
請求項１乃至請求項１４記載のイメージング剤の製造方法であって、
（ｉ）Ｚ1がＨでありかつＺ2がＭIGである式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ1−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がＺ1位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（ii）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、ｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４アミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ1−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がｃＭＢＰペプチドの前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基の位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（iii）Ｚ1がＭIGであり、Ｚ3がＺ2基又は活性化エステルであり、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ3のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ2−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がＺ2位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階、及び
（iv）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、かつｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４アミノ酸残基中にＬｙｓを含む式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ1−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がｃＭＢＰペプチドのＬｙｓ残基の位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階
の１つを含んでなり、式中のＺ1、ｃＭＢＰ、Ｚ2、ＭIG、Ｌ、ｎ及びＩＭは請求項１で定義した通りであり、Ｚ3はＺ2基又は活性化エステルであり、Ｙ1はカルボン酸、活性化エステル、イソチオシアネート基又はチオシアネート基であり、Ｙ2はアミン基である、方法。
【請求項１８】
段階（iv）の反応が使用される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１５又は請求項１６記載の医薬品組成物を製造するためのキットであって、当該キットは請求項１乃至請求項１４記載のイメージング剤を無菌固体形態で含んでいて、請求項１５又は請求項１６記載の生体適合性キャリヤーの無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の医薬品組成物が得られる、キット。
【請求項２０】
無菌固体形態が凍結乾燥固体である、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
哺乳動物体のインビボ光学イメージング方法であって、請求項１乃至請求項１４記載のイメージング剤或いは請求項１５又は請求項１６記載の医薬品組成物を用いてインビボでのｃＭｅｔの過剰発現部位又は局在部位の画像を得ることを含んでなる方法。
【請求項２２】
請求項１乃至請求項１４記載のイメージング剤或いは請求項１５又は請求項１６記載の医薬品組成物が前記哺乳動物体に予め投与されている、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法であって、
（ｉ）哺乳動物体内の検査対象組織表面を励起光で照明する段階、
（ii）イメージング成分（ＩＭ）の励起によって生じるイメージング剤からの蛍光を蛍光検出器を用いて検出する段階、
（iii）蛍光検出器によって検出された光を任意に濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（iv）段階（ii）又は段階（iii）の蛍光から前記検査対象組織表面の画像を形成する段階
を含んでなる方法。
【請求項２４】
段階（ｉ）の励起光が連続波（ＣＷ）の性質を有する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項２２記載の方法であって、
（ａ）不均質組成を有する前記哺乳動物体の光散乱性生体組織を、所定の経時変動強度を有する光源からの光に暴露してイメージング剤を励起する段階であって、組織が励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記暴露に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応する複数の値をプロセッサーで確定することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルが組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことで組織の画像を生成する段階
を含んでなる方法。
【請求項２６】
光学イメージング方法が蛍光内視鏡検査からなる、請求項２１乃至請求項２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
インビボ光学イメージングが、病気進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は結腸直腸癌（ＣＲＣ）の治療のモニタリングを支援するために使用される、請求項２１乃至請求項２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物体の病気進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は結腸直腸癌（ＣＲＣ）の治療のモニタリングを行う方法であって、請求項２１乃至請求項２６のいずれか１項に記載のインビボ光学イメージング方法を含んでなる方法。
【請求項１】
次の式Ｉのコンジュゲートを含んでなるイメージング剤。
【化１】
式中、
Ｚ1はｃＭＢＰのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭIGであり、
Ｚ2はｃＭＢＰのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢc（式中、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）又はＭIGであり、
ｃＭＢＰは、下記のアミノ酸配列（配列番号１）を含む１７〜３０のアミノ酸のｃＭｅｔ結合環状ペプチドであり、
Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
（式中、Ｘ1はＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＴｙｒであり、Ｘ2はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｓｎであり、Ｘ3はＴｈｒ又はＡｒｇであり、Ｘ4はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ5はＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ6はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｃｙｓa-dの各々はシステイン残基であって、残基ａ及びｂ並びに残部ｃ及びｄは環化して２つの独立したジスルフィド結合を形成している。）
ＭIGは、ペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基からなる代謝阻害基であり、
Ｌは式−（Ａ）m−（式中、Ａは独立に−ＣＲ2−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ2−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ2ＮＲ−、−ＮＲＳＯ2−、−ＣＲ2ＯＣＲ2−、−ＣＲ2ＳＣＲ2−、−ＣＲ2ＮＲＣＲ2−、Ｃ4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基又はＣ3-12ヘテロアリーレン基、或いはアミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4アルケニル、Ｃ2-4アルキニル、Ｃ1-4アルコキシアルキル及びＣ1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。）の合成リンカー基であり、
ｎは０又は１の値を有する整数であり、
ＩＭは、６００〜１２００ｎｍの緑色乃至近赤外波長を有する光を用いて哺乳動物体のインビボイメージングを行うために適した光学レポーターイメージング成分である。
【請求項２】
配列番号１に加えて、ｃＭＢＰがさらにＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４アミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、−（Ｌ）nＩＭが前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基のカルボキシル側鎖に結合してアミド結合を与えるアミン基で官能化されている、請求項１記載のイメージング剤。
【請求項３】
配列番号１に加えて、ｃＭＢＰがさらにＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４アミノ酸残基中にＬｙｓ残基を含み、−（Ｌ）nＩＭが前記Ｌｙｓ残基のε−アミン側鎖に結合してアミド結合を与えるカルボキシル基で官能化されている、請求項１又は請求項２記載のイメージング剤。
【請求項４】
ｃＭＢＰが下記配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のイメージング剤。
Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−
Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6（配列番号２）
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（配列番号３）
【請求項５】
Ｘ3がＡｒｇである、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２又は配列番号３に加えて、ｃＭＢＰがさらに−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号４）、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号５）及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−（配列番号６）から選択されるリンカーペプチドをＮ末端又はＣ末端に含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項７】
ｃＭＢＰが下記のアミノ酸配列（配列番号７）を有する、請求項６記載のイメージング剤。
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｔｙｒ−Ｃｙｓc−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
【請求項８】
Ｚ1及びＺ2の両方が独立にＭIGである、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項９】
Ｚ1がアセチルであり、Ｚ2が第一アミドである、請求項８記載のイメージング剤。
【請求項１０】
ｎが０である、請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項１１】
ＩＭが６００〜１０００ｎｍの範囲内に吸収極大を有する色素である、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項１２】
ＩＭがシアニン色素である、請求項１１記載のイメージング剤。
【請求項１３】
シアニン色素が次の式ＩＩＩを有する、請求項１２記載のイメージング剤。
【化２】
式中、
Ｒ1及びＲ2は独立にＨ又はＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1はＨ又はＢcである。）であって、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方はＳＯ3Ｍ1であり、
Ｒ3及びＲ4独立にＣ1-4アルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は独立にＲa基（式中、ＲaはＣ1-4アルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル又は−（ＣＨ2）kＳＯ3Ｍ1であり、ｋは３又は４の値を有する整数である。）であるが、
シアニン色素がＲ1、Ｒ2及びＲa基に合計１〜４個のＳＯ3Ｍ1置換基を有することを条件とする。
【請求項１４】
ｃＭＢＰが請求項７で定義した通りであり、Ｚ1及びＺ2が請求項９で定義した通りであり、ＩＭが請求項３及び請求項１３で定義した通りである、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項１５】
請求項１乃至請求項１４のいずれか１項に記載のイメージング剤を、哺乳動物への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬品組成物。
【請求項１６】
１人の患者用に適した用量を有し、適当な注射器又は容器に入れて供給される、請求項１５記載の医薬品組成物。
【請求項１７】
請求項１乃至請求項１４記載のイメージング剤の製造方法であって、
（ｉ）Ｚ1がＨでありかつＺ2がＭIGである式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ1−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がＺ1位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（ii）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、ｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４アミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ1−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がｃＭＢＰペプチドの前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基の位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（iii）Ｚ1がＭIGであり、Ｚ3がＺ2基又は活性化エステルであり、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ3のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ2−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がＺ2位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階、及び
（iv）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、かつｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４アミノ酸残基中にＬｙｓを含む式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のｃＭＢＰペプチドを式Ｙ1−（Ｌ）n−［ＩＭ］の化合物と反応させることで、［ＩＭ］がｃＭＢＰペプチドのＬｙｓ残基の位置に結合した式Ｉのイメージング剤を得る段階
の１つを含んでなり、式中のＺ1、ｃＭＢＰ、Ｚ2、ＭIG、Ｌ、ｎ及びＩＭは請求項１で定義した通りであり、Ｚ3はＺ2基又は活性化エステルであり、Ｙ1はカルボン酸、活性化エステル、イソチオシアネート基又はチオシアネート基であり、Ｙ2はアミン基である、方法。
【請求項１８】
段階（iv）の反応が使用される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１５又は請求項１６記載の医薬品組成物を製造するためのキットであって、当該キットは請求項１乃至請求項１４記載のイメージング剤を無菌固体形態で含んでいて、請求項１５又は請求項１６記載の生体適合性キャリヤーの無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の医薬品組成物が得られる、キット。
【請求項２０】
無菌固体形態が凍結乾燥固体である、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
哺乳動物体のインビボ光学イメージング方法であって、請求項１乃至請求項１４記載のイメージング剤或いは請求項１５又は請求項１６記載の医薬品組成物を用いてインビボでのｃＭｅｔの過剰発現部位又は局在部位の画像を得ることを含んでなる方法。
【請求項２２】
請求項１乃至請求項１４記載のイメージング剤或いは請求項１５又は請求項１６記載の医薬品組成物が前記哺乳動物体に予め投与されている、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法であって、
（ｉ）哺乳動物体内の検査対象組織表面を励起光で照明する段階、
（ii）イメージング成分（ＩＭ）の励起によって生じるイメージング剤からの蛍光を蛍光検出器を用いて検出する段階、
（iii）蛍光検出器によって検出された光を任意に濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（iv）段階（ii）又は段階（iii）の蛍光から前記検査対象組織表面の画像を形成する段階
を含んでなる方法。
【請求項２４】
段階（ｉ）の励起光が連続波（ＣＷ）の性質を有する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項２２記載の方法であって、
（ａ）不均質組成を有する前記哺乳動物体の光散乱性生体組織を、所定の経時変動強度を有する光源からの光に暴露してイメージング剤を励起する段階であって、組織が励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記暴露に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応する複数の値をプロセッサーで確定することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルが組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことで組織の画像を生成する段階
を含んでなる方法。
【請求項２６】
光学イメージング方法が蛍光内視鏡検査からなる、請求項２１乃至請求項２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
インビボ光学イメージングが、病気進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は結腸直腸癌（ＣＲＣ）の治療のモニタリングを支援するために使用される、請求項２１乃至請求項２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物体の病気進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は結腸直腸癌（ＣＲＣ）の治療のモニタリングを行う方法であって、請求項２１乃至請求項２６のいずれか１項に記載のインビボ光学イメージング方法を含んでなる方法。
【公表番号】特表２０１０−５２６８５９（Ｐ２０１０−５２６８５９Ａ）
【公表日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０７９８２（Ｐ２０１０−５０７９８２）
【出願日】平成２０年５月１６日（２００８．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１６９６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３９２０７
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（３９６０１９３８７）ジーイー・ヘルスケア・アクスイェ・セルスカプ (82)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１６日（２００８．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１６９６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３９２０７
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（３９６０１９３８７）ジーイー・ヘルスケア・アクスイェ・セルスカプ (82)
【Ｆターム（参考）】
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