ペプチドイメージング剤
本発明は、インビボでの光学イメージングのために適した標識ｃＭｅｔ結合ペプチドに関する。かかるペプチドは、赤色乃至近赤外領域でのイメージングに適したベンゾピリリウム色素で標識されている。また、医薬品組成物及びキット、並びに特に結腸直腸癌（ＣＲＣ）の検出、ステージング、診断、疾患進行のモニタリング又は治療のモニタリングで使用するためのインビボイメージング方法も開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボでの光学イメージングのために適した標識ｃＭｅｔ結合ペプチドに関する。かかるペプチドは、赤色乃至近赤外領域でのイメージングのために適した光学レポーター基で標識されている。また、特に結腸直腸癌（ＣＲＣ）の診断で使用するためのインビボイメージング方法も開示される。
【背景技術】
【０００２】
国際公開第２００５／０３０２６６号には、結腸直腸癌（ＣＲＣ）の早期診断に対する医学的ニーズが存在することが開示されている。国際公開第２００５／０３０２６６号は、ＣＲＣで異常に発現される生物学的標的に対して親和性を有する光学イメージング用造影剤を開示している。生物学的標的は、ＣＯＸ−２、β−カテニン、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、各種キナーゼ、Ｈｅｒ−２、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、サイクリン、Ｐ５３、チミジル酸シンターゼ、ＶＥＧＦレセプター、ＥＧＦレセプター、Ｋ−ラス、腺腫性結腸ポリポーシスタンパク質、カテプシンＢ、ｕＰＡＲ、ｃＭｅｔ、ムチン及びガストリンレセプターから選択される。好ましいかかる標的（７頁１１〜１２行目）は、ｃＭｅｔ、ＭＭＰ−１４、ＣＯＸ−２、β−カテニン及びカテプシンＢであると言われている。国際公開第２００５／０３０２６６号のベクターは、ペプチド、ペプトイド部分、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、脂質関連化合物又は伝統的な有機薬物様小分子であり得る。レポーター部分は、好ましくは、電磁スペクトルの紫外部分から赤外部分までの波長領域の光と相互作用する色素である。
【０００３】
散乱因子（ＳＦ）としても知られる肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は、創傷治癒や血管形成のような各種の生理学的過程に関与する成長因子である。ＨＧＦとその高親和性レセプター（ｃＭｅｔ）との相互作用は、腫瘍の成長、浸潤及び転移に関係している。
【０００４】
Ｋｎｕｄｓｅｎ他は、前立腺癌におけるＨＧＦ及びｃＭｅｔの役割を、イメージング及び治療への可能な関与を含めて総説している［Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，９１，３１−６７（２００４）］。診断及び治療用の標識抗ｍｅｔ抗体は、国際公開第０３／０５７１５５号に記載されている。
【０００５】
国際公開第２００４／０７８７７８号は、ｃＭｅｔ又はｃＭｅｔ及びＨＧＦを含む複合体と結合するポリペプチド又は多量体ペプチド構築物を開示している。約１０の異なるペプチド構造クラスが記載されている。国際公開第２００４／０７８７７８号には、インビトロ及びインビボ用途のための検出可能な標識或いは治療用途のための薬物でペプチドを標識できることが開示されている。検出可能な標識は、酵素、蛍光化合物、光学色素、常磁性金属イオン、超音波造影剤又は放射性核種であり得る。国際公開第２００４／０７８７７８号の好ましい標識は放射性核種又は常磁性金属であると述べられており、最も好ましくは金属キレーターでキレート化された金属からなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
国際公開第２００４／０７８７７８号パンフレット
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、インビボ光学イメージングのために適したイメージング剤であって、ｃＭｅｔ結合環状ペプチドと、６００〜１２００ｎｍの赤色乃至近赤外波長を有する光を用いて哺乳類の身体のインビボイメージングを行うために適したベンゾピリリウム色素とを含んでなるイメージング剤を提供する。
【０００８】
ｃＭｅｔ結合環状ペプチドは、国際公開第２００４／０７８７７８号のペプチド構造クラスの１つに関係していて、ｃＭｅｔに対して最適の結合親和性を有している。これらのペプチドは、国際公開第２００４／０７８７７８号に記載されているように、ファージディスプレイから導かれ、ｃＭｅｔに対する親和性及びＨＧＦとの競合の欠如によって選択された。本発明のｃＭＢＰ結合ペプチドは、好ましくはその末端の少なくとも一方が代謝阻害基（ＭIG）で保護されている。これはインビボ用途にとって重要な考慮事項である。さもないと、内在酵素及びペプチダーゼがーペプチドを急速に代謝させ、その結果としてｃＭｅｔ結合親和性の喪失、したがってインビボでの選択的標的化の喪失を招くことになる。
【０００９】
本発明は、表在性病変のインビボイメージングのためにｃＭｅｔ結合ペプチドを使用する最良の方法は他のイメージングモダリティー（例えば、核、ＭＲＩ又は超音波）と違って光学レポーターの使用を必要とすることを教示すると共に、好ましい光学イメージングレポーターも提供する。赤色乃至近赤外領域（６００〜１２００ｎｍの波長を有する光）が好ましいが、これはその領域がヘモグロビン、ポルフィリン類、メラニン及びコラーゲンのような内在性の組織及び物質と最小のスペクトルオーバーラップを有するからである［Ｌｉｃｈａ，Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）］。組織の自発蛍光に寄与する他の重要な物質はＮＡＤＨ、ＦＡＤ及びエラスチンである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
第１の態様では、本発明は下記式Ｉのコンジュゲートを含んでなるイメージング剤を提供する。
【００１１】
【化１】
【００１２】
式中、
Ｚ1はｃＭＢＰのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭIGであり、
Ｚ2はｃＭＢＰのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢc（式中、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）又はＭIGであり、
ｃＭＢＰは、下記のアミノ酸配列（配列番号１）を含む１７〜３０のアミノ酸のｃＭｅｔ結合環状ペプチドであり、
Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
（式中、Ｘ1はＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＴｙｒであり、Ｘ2はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｓｎであり、Ｘ3はＴｈｒ又はＡｒｇであり、Ｘ4はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ5はＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ6はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｃｙｓa-dの各々はシステイン残基であって、残基ａ及びｂ並びに残基ｃ及びｄは環化して２つの独立したジスルフィド結合を形成している。）
ＭIGは、ペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基である代謝阻害基であり、
Ｌは式−（Ａ）m−（式中、各Ａは独立に−ＣＲ2−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ2−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ2ＮＲ−、−ＮＲＳＯ2−、−ＣＲ2ＯＣＲ2−、−ＣＲ2ＳＣＲ2−、−ＣＲ2ＮＲＣＲ2−、Ｃ4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基又はＣ3-12ヘテロアリーレン基、或いはアミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4アルケニル、Ｃ2-4アルキニル、Ｃ1-4アルコキシアルキル及びＣ1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。）の合成リンカー基であり、
ｎは０又は１の値を有する整数であり、
ＢｚｐMは下記式ＩＩのベンゾピリリウム色素である。
【００１３】
【化２】
【００１４】
（式中、
Ｙ1は下記式Ｙa又はＹbの基であり、
【００１５】
【化３】
【００１６】
Ｒ1〜Ｒ4及びＲ9〜Ｒ13はＨ、−ＳＯ3Ｍ1（式中、各Ｍ1は独立にＨ又はＢcであり、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）、Ｈａｌ、Ｒa及びＣ3-12アリールから独立に選択され、
Ｒ5はＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル、Ｃ3-12アリールスルホニル又はＣｌであり、或いは任意にはＲ6、Ｒ14、Ｒ15又はＲ16の１つと共に五員又は六員の不飽和脂肪族環、不飽和ヘテロ脂肪族環又は芳香環を形成でき、
Ｒ6及びＲ16は独立にＲa基であり、
Ｒ7及びＲ8は独立にＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル又はＣ1-6ヒドロキシアルキルであり、或いは任意にはＲ9及び／又はＲ10の一方又は両方と共に五員又は六員のＮ含有複素環又はヘテロアリール環を形成でき、
Ｘは−ＣＲ14Ｒ15−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＮＲ16−又は−ＣＨ＝ＣＨ−（式中、Ｒ14〜Ｒ16は独立にＲa基である。）であり、
ＲaはＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル又はＣ1-6ヒドロキシアルキルであり、
ｗは１又は２であり、
Ｊは生体適合性陰イオンであり、
ＢｚｐMはＲ1〜Ｒ16基から選択される１以上のスルホン酸置換基を含むことを条件とする。）
「イメージング剤」という用語は、哺乳類の身体のインビボイメージングを行うために適した化合物を意味する。好ましくは、哺乳類はヒトの患者である。イメージングは侵襲的（例えば、手術中検査又は内視鏡検査）であってもよいし、或いは非侵襲的であってもよい。好ましいイメージング方法は内視鏡検査である。式Ｉのコンジュゲートはインビボイメージングのために適するが、それはインビトロ用途（例えば、生物学的試料中のｃＭｅｔを定量するアッセイ又は組織試料中のｃＭｅｔの可視化）も有し得る。好ましくは、イメージング剤はインビボ光学イメージングのために使用される。
【００１７】
「光学イメージング」という用語は、赤色乃至近赤外領域（波長６００〜１２００ｎｍ）の光との相互作用に基づいて、疾患の検出、ステージング又は診断、疾患進展の追跡或いは疾患治療の追跡のための画像を形成する任意の方法を意味する。光学イメージングはさらに、いかなる装置も使用しない直接可視化並びに各種スコープ、カテーテル及び光学イメージング装置（例えば、断層撮影表示用のコンピューター支援ハードウェア）のような装置の使用を伴う直接可視化のためのあらゆる方法を包含する。かかるモダリティ及び測定技法には、特に限定されないが、ルミネセンスイメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光学コヒーレンス断層撮影、透過率イメージング、時間分解透過率イメージング、共焦点イメージング、非線形顕微鏡検査、光音響イメージング、音響光学イメージング、スペクトル分析、反射スペクトル分析、干渉分析、コヒーレンス干渉分析、拡散光学断層撮影及び蛍光媒介拡散光学断層撮影（連続波、時間ドメイン及び周波数ドメインシステム）、並びに光の散乱、吸光、偏光、ルミネセンス、蛍光寿命、量子収量及び消光の測定がある。これらの技法のさらなる詳細は、Ｔｕａｎ Ｖｏ−Ｄｉｎｈ（編）：“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”（２００３），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＣＣ、Ｍｙｃｅｋ ＆ Ｐｏｇｕｅ（編）：“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”（２００３），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｓｐｌｉｎｔｅｒ ＆ Ｈｏｐｐｅｒ：“Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ”（２００７），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＣＣに示されている。
【００１８】
赤色乃至近赤外領域の光は、好ましくは６５０〜１０００ｎｍの波長を有する。光学イメージング方法は、好ましくは蛍光内視鏡検査である。
【００１９】
「コンジュゲート」という用語は、ｃＭＢＰ及びＢｚｐM色素が任意には（Ｌ）n基を介して共有結合により結合されていることを意味する。
【００２０】
Ｚ1基は、最後のアミノ酸残基のアミン基を置換する。したがって、Ｚ1がＨである場合、ｃＭＢＰのアミノ末端は最後のアミノ酸残基の遊離ＮＨ2基で終わる。Ｚ2基は、最後のアミノ酸残基のカルボニル基を置換する。したがって、Ｚ2がＯＨである場合、ｃＭＢＰのカルボキシ末端は最後のアミノ酸残基の遊離ＣＯ2Ｈ基で終わり、Ｚ2がＯＢcである場合、末端カルボキシ基はＣＯ2Ｂc基としてイオン化される。
【００２１】
「代謝阻害基」（ＭIG）という用語は、アミノ末端（Ｚ1）又はカルボキシ末端（Ｚ2）におけるｃＭＢＰペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基を意味する。かかる基は当業者にとって公知であり、ペプチドのアミン末端については、好適にはＮ−アシル化基−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＲG（式中、アシル基−（Ｃ＝Ｏ）ＲGはＣ1-6アルキル基及びＣ3-10アリール基から選択されるＲGを有するか、或いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位を含む。）から選択される。好適なＰＥＧ基は、リンカー基（Ｌ）に関して下記に記載される。好ましいかかるＰＥＧ基は、式ＩＡ又はＩＢのバイオモディファイアーである。好ましいかかるアミノ末端ＭIG基は、アセチル、ベンジルオキシカルボニル又はトリフルオロアセチルであり、最も好ましくはアセチルである。
【００２２】
ペプチドのカルボキシ末端についての好適な代謝阻害基には、カルボキサミド、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、アミノアルコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位がある。ｃＭＢＰペプチドのカルボキシ末端アミノ酸残基についての好適なＭIG基は、アミノ酸残基の末端アミンがＣ1-4アルキル基（好ましくはメチル基）でＮ−アルキル化されている場合である。好ましいかかるＭIG基はカルボキサミド又はＰＥＧであり、最も好ましいかかる基はカルボキサミドである。
【００２３】
式Ｉは、（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分がＺ1、Ｚ2又はｃＭＢＰのいずれかに結合し得ることを表している。Ｚ1又はＺ2に関しては、Ｚ1／Ｚ2のいずれかがＭIGである場合、（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分はＭIG基に結合し得る。Ｚ1がＨ又はＺ2がＯＨである場合、Ｚ1又はＺ2位置における（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分の結合は、それぞれ式［ＢｚｐM］−（Ｌ）n−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2又はＺ1−［ｃＭＢＰ］−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物を与える。いずれかのペプチド末端におけるｃＭＢＰの代謝阻害は、（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分をこのように結合することでも達成できるが、（Ｌ）n［ＢｚｐM］は本発明のＭIGの定義範囲外である。
【００２４】
式Ｉの−（Ｌ）n−部分は、式ＩＩのＢｚｐMの任意適宜の位置に結合し得る。−（Ｌ）n−部分は、既存の置換基（例えば、Ｒ1〜Ｒ16基の１つ）に取って代わるか、或いはＢｚｐMの既存の置換基に共有結合する。［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−部分は、好ましくはＢｚｐMの既存の置換基に共有結合する。
【００２５】
「ｃＭｅｔ結合環状ペプチド」（ｃＭＢＰ）という用語は、ｃＭｅｔ（ｃ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ、Ｍｅｔレセプター又は肝細胞成長因子レセプター）としても知られる肝細胞成長因子（ＨＧＦ）高親和性レセプターに結合するペプチドを意味する。本発明の好適なｃＭＢＰペプチドは、ｃＭｅｔ／ＨＧＦ複合体のｃＭｅｔに関して約２０ｎＭ未満の見掛けＫＤを有している。ｃＭＢＰペプチドはプロリン残基を含み、かかる残基は主鎖アミド結合のシス／トランス異性化を示し得ることが知られている。本発明のｃＭＢＰペプチドは、任意のかかる異性体を含んでいる。
【００２６】
「生体適合性陽イオン」（Ｂc）という用語は、イオン化して負に帯電した基と共に塩を形成する正に帯電した対イオンを意味する。この場合、前記正に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳類の身体（特に人体）への投与に適している。好適な生体適合性陽イオンの例には、アルカリ金属であるナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属であるカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンがある。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。「生体適合性陰イオン」（Ｊ）という用語は、イオン化して正に帯電した基（この場合にはインドリニウム基）と共に塩を形成する負に帯電した対イオンを意味する。この場合、前記負に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳類の身体（特に人体）への投与に適している。対イオン（Ｊ-）は、モル相当量で存在することでＢｚｐM色素上の正電荷をバランスさせる陰イオンを表す。電荷をバランスさせる量が存在する限り、陰イオン（Ｊ）は好適には単一又は複数の電荷を有する。陰イオンは好適には無機酸又は有機酸から導かれる。好適な陰イオンの例には、塩化物イオン又は臭化物イオンのようなハロゲン化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、クエン酸イオン、酢酸イオン、リン酸イオン及びホウ酸イオンがある。好ましい陰イオンは塩化物イオンである。
【００２７】
「アミノ酸」という用語は、Ｌ−又はＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）或いはアミノ酸模倣体を意味し、これらは天然のもの又は純粋に合成由来のものであってよく、光学的に純粋なもの（即ち、単一の鏡像異性体）、したがってキラルなものであるか、或いは鏡像異性体の混合物であってよい。本明細書中では、アミノ酸に関する通常の三文字略語又は一文字略語が使用される。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋なものである。「アミノ酸模倣体」という用語は、アイソスター（即ち、天然化合物の立体構造及び電子構造を模倣するように設計されたもの）である天然アミノ酸の合成類似体を意味する。かかるアイソスターは当業者にとって公知であり、特に限定されないが、デプシペプチド、レトロ−インベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカン又は１，５−二置換テトラゾールを包含する［Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２４，１３７（１９８５）を参照されたい］。
【００２８】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合（即ち、１つのアミノ酸のアミンを別のアミノ酸のカルボキシルに連結するアミド結合）によって連結された（上記に定義したような）２以上のアミノ酸を含む化合物を意味する。「ペプチド模倣体」又は「模倣体」という用語は、ペプチド又はタンパク質の生物学的活性を模倣するが、化学的性質がペプチド的でない（即ち、いかなるペプチド結合（つまり、アミノ酸間のアミド結合）も含まない）生物学的活性化合物をいう。ここでは、ペプチド模倣体という用語は広い意味で使用され、性質が完全にはペプチド的でない分子（例えば、プソイドペプチド、セミペプチド及びペプトイド）を包含する。
【００２９】
本発明の好適なイメージング剤は、ＢｚｐMが下記式ＩＩａ又は式ＩＩｂを有するものである。
【００３０】
【化４】
【００３１】
式中、Ｘ、ｗ、Ｒ1〜Ｒ13及びＪは式ＩＩに関して定義した通りである。
【００３２】
Ｒ5がＲ6／Ｒ14〜Ｒ16の１つと共に五員又は六員の不飽和脂肪族環、不飽和ヘテロ脂肪族環又は芳香環を形成する場合、好適なかかる芳香環には、フェニル、フラン、チアゾール、ピリジル、ピロール及びピラゾール環がある。好適な不飽和環は、少なくともＲ5が結合したＣ＝Ｃを含んでいる。
【００３３】
Ｒ7及び／又はＲ8がＲ9及び／又はＲ10の一方又は両方と共に五員又は六員のＮ含有複素環又はヘテロアリール環を形成する場合、好適なかかる環には、チアゾール、ピリジル、ピロール及びピラゾール環並びにこれらの部分水素化変種がある。好ましくは、ピリジル又はジヒドロピリジルである。
【００３４】
「スルホン酸置換基」という用語は、式−ＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1はＨ又はＢcであり、Ｂcは（上記に定義したような）生体適合性陽イオンである。）の置換基を意味する。−ＳＯ3Ｍ1置換基は炭素原子に共有結合され、炭素原子はアリール（即ち、Ｒ1又はＲ2が−ＳＯ3Ｍ1である場合のようなスルホアリール）又はアルキル（即ち、スルホアルキル基）であり得る。
【００３５】
式Ｉのリンカー基−（Ａ）m−の役割の１つは、ＢｚｐMをｃＭＢＰペプチドの結合部位から遠ざけることで結合部位との相互作用による立体障害を最小化することにあると想定されている。これは、バルキーな基が結合部位から離れて位置する自由を与えるたわみ性（例えば、単純アルキル鎖）及び／又はＢｚｐMを結合部位から離すように定位させる剛性（例えば、シクロアルキル又はアリールスペーサー）を組み合わせることで達成できる。リンカー基の性質はまた、イメージング剤の生体分布を調整するためにも使用できる。即ち、例えばリンカー中にエーテル基を導入することは、血漿タンパク質結合を最小限に抑えるために役立つ。−（Ａ）m−がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位又は１〜１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖からなる場合、リンカー基はインビボでイメージング剤の薬物動態及び血中クリアランス速度を調整するために機能し得る。かかる「バイオモディファイアー」リンカー基は、バックグラウンド組織（例えば、筋肉又は肝臓）及び／又は血液からのイメージング剤のクリアランスを促進することで、バックグラウンド妨害を少なくして一層良好な診断画像を与えることができる。バイオモディファイアーリンカー基はまた、特定の排泄経路（例えば、肝臓経由ではなく腎臓経由の排泄）を有利にするためにも使用できる。
【００３６】
「糖」という用語は、単糖、二糖又は三糖を意味する。好適な糖には、グルコース、ガラクトース、マルトース、マンノース及びラクトースがある。任意には、アミノ酸への容易なカップリングを可能にするように糖を官能化することができる。即ち、例えばアミノ酸のグルコサミン誘導体は、ペプチド結合を介して他のアミノ酸にコンジュゲートすることができる。（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社から商業的に入手できる）アスパラギンのグルコサミン誘導体はこれの一例である。
【００３７】
【化５】
【００３８】
好ましい特徴
イメージング剤の分子量は、好適には８０００ダルトン以下である。好ましくは、分子量は２８００〜６０００ダルトンの範囲内にあり、最も好ましくは３０００〜４５００ダルトンの範囲内にあり、３２００〜４０００ダルトンが特に好ましい。
【００３９】
本発明の好ましいイメージング剤は、両ペプチド末端がＭIG基によって保護されている。即ち、好ましくはＺ1及びＺ2が共にＭIGであり、これらは通常異なっている。上述の通り、Ｚ1／Ｚ2のいずれかが任意には−（Ｌ）n［ＢｚｐM］を表すことができる。このようにして両ペプチド末端を保護することは、インビボイメージング剤用途にとって重要である。さもないと、急速な代謝の結果としてｃＭｅｔに対する選択的結合親和性の喪失が予想されるからである。Ｚ1及びＺ2が共にＭIGである場合、好ましくはＺ1はアセチルであり、Ｚ2は第一アミドである。最も好ましくは、Ｚ1はアセチルであり、Ｚ2は第一アミドであり、−（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分はｃＭＢＰのリシン残基のε−アミン側鎖に結合している。
【００４０】
本発明の好ましいｃＭＢＰペプチドは、ｃＭｅｔに対する結合に関して（蛍光偏光アッセイ測定結果に基づいて）約１０ｎＭ未満、最も好ましくは５ｎＭ未満のＫDを有し、３ｎＭ未満が理想的である。
【００４１】
下記のように、式ＩのｃＭＢＰのペプチド配列（配列番号１）は１７量体ペプチド配列であり、これが主としてｃＭｅｔに対する選択的結合の原因をなす。
Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
本発明のｃＭＢＰペプチドが１７を超えるアミノ酸残基を含む場合、残りのアミノ酸はシステインは別にして任意のアミノ酸であり得る。追加の保護されないシステイン残基は、定義されたＣｙｓa−Ｃｙｓb及びＣｙｓc−Ｃｙｓdジスルフィドブリッジの不要のスクランブリングを引き起こすことがある。追加のペプチドは、好ましくは−（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分の容易なコンジュゲーションのために適した側鎖を有する１以上のアミノ酸残基を含んでいる。好適なかかる残基としては、アミン官能化−（Ｌ）nＢｚｐM基とのコンジュゲーションのためにはＡｓｐ又はＧｌｕ残基、或いはアミン官能化−（Ｌ）nＢｚｐM基とのコンジュゲーションのためにはＬｙｓ残基がある。−（Ｌ）n［ＢｚｐM］のコンジュゲーションのためのアミノ酸残基は、好適にはｃＭＢＰペプチドの１７量体結合領域（配列番号１）から離れて位置しており、好ましくはＣ末端又はＮ末端に位置している。好ましくは、コンジュゲーションのためのアミノ酸残基はＬｙｓ残基である。
【００４２】
既知のアミノ酸置換体フェニルアラニン及びナフチルアラニンによる配列番号１のトリプトファン残基の置換を評価した。しかし、ｃＭｅｔ親和性の喪失が見出され、これはトリプトファン残基が活性のために重要であることを示唆している。
【００４３】
ｃＭＢＰペプチドは、さらにＮ末端セリン残基を含んで１８量体（配列番号２）を与えることが好ましい。
Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−
Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
配列番号１又は好ましくは配列番号２に加えて、ｃＭＢＰは最も好ましくはさらに下記のいずれかを含んでいる。
（ｉ）Ｃ−又はＮ−ペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、−（Ｌ）nＢｚｐMは前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基のカルボキシル側鎖にコンジュゲートされてアミド結合を与えるアミン基で官能化されている。
（ｉｉ）Ｃ−又はＮ−ペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＬｙｓ残基を含み、−（Ｌ）nＢｚｐMは前記Ｌｙｓ残基のε−アミン側鎖にコンジュゲートされてアミド結合を与えるカルボキシル基で官能化されている。
【００４４】
好ましいｃＭＢＰペプチドは、下記の２２量体アミノ酸配列（配列番号３）を含んでいる。
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｇｌｙ−
Ｔｈｒ
本発明のｃＭＢＰペプチドは、好ましくはＸ3がＡｒｇに等しい。
【００４５】
ｃＭＢＰペプチドは好ましくは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に加えて、さらに−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号４）、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号５）及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−（配列番号６）から選択されるリンカーペプチドをＮ末端又はＣ末端に含んでいる。
【００４６】
リンカーペプチドのＬｙｓ残基は、−（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分のコンジュゲーションのために最も好ましい位置である。特に好ましいｃＭＢＰペプチドは配列番号３を配列番号４のリンカーペプチドと共に含み、下記の２６量体アミノ酸配列（配列番号７）を有している。
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｔｙｒ−Ｃｙｓc−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７のｃＭＢＰペプチドでは、好ましくはＺ1＝Ｚ2＝IGであり、最も好ましくはＺ1＝アセチルかつＺ2＝第一アミドである。
【００４７】
−（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分は、好適にはＺ1又はＺ2のいずれかに結合しているか、或いは配列番号１のｃＭｅｔ結合配列と異なるｃＭＢＰペプチドのアミノ酸残基に結合している。好ましいアミノ酸残基及びコンジュゲーション部位は上述した通りである。−（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分がＺ1又はＺ2に結合している場合、それはＮ末端又はＣ末端へのコンジュゲーションによってＺ1又はＺ2に取って代わり、そのようにしてインビボ代謝を阻止することができる。
【００４８】
式Ｉの［ＢｚｐM］−（Ｌ）n−部分は、好ましくは式ＩＩのＢｚｐMのＲ5、Ｒ6、Ｒ14、Ｒ15又はＲ16の位置、さらに好ましくはＲ6、Ｒ14、Ｒ15又はＲ16の位置、最も好ましくはＲ6、Ｒ14又はＲ15の位置に結合している。結合を容易にするため、関連するＲ5、Ｒ6、Ｒ14、Ｒ15又はＲ16置換基は好ましくはＣ1-6カルボキシアルキル、さらに好ましくはＣ3-6カルボキシアルキルである。
【００４９】
ベンゾピリリウム色素（ＢｚｐM）は、好ましくは２以上のスルホン酸置換基、さらに好ましくは２〜６のスルホン酸置換基、最も好ましくは２〜４のスルホン酸置換基を有する。好ましくは、スルホン酸置換基の少なくとも１つはＣ1-4スルホアルキル基である。かかるスルホアルキル基は、好ましくはＲ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ14、Ｒ15又はＲ16の位置にあり、さらに好ましくはＲ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ14又はＲ15の位置にあり、最も好ましくはＲ7及びＲ8の一方又は両方と共にＲ6の位置にある。式ＩＩのスルホアルキル基は、好ましくは式−（ＣＨ2）kＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1はＨ又はＢcであり、ｋは１〜４の値を有する整数であり、Ｂcは（上記に定義したような）生体適合性陽イオンである。）を有する。ｋは好ましくは３又は４である。
【００５０】
式ＩＩ中、ｗは好ましくは１である。Ｒ5は好ましくはＨ又はＣ1-4カルボキシアルキルであり、最も好ましくはＨである。Ｘは好ましくは−ＣＲ14Ｒ15−又は−ＮＲ16−であり、最も好ましくは−ＣＲ14Ｒ15−である。
【００５１】
好ましいＢｚｐM色素は下記式ＩＩＩを有する。
【００５２】
【化６】
【００５３】
式中、Ｙ1、Ｒ1〜Ｒ4、Ｒ6、Ｒ14、Ｒ15及びＪは式ＩＩに関して定義した通りである。
【００５４】
式ＩＩＩの好適な色素は、下記式ＩＩＩａ又はＩＩＩｂを有する。
【００５５】
【化７】
【００５６】
式ＩＩＩ、ＩＩＩａ及びＩＩＩｂの好ましいＲ1〜Ｒ4及びＲ6〜Ｒ13基は、式ＩＩａ及びＩＩｂに関して上記に定義した通りである。式ＩＩＩ、ＩＩＩａ及びＩＩＩｂ中、Ｒ14及びＲ15は好ましくは一方がＲb基でありかつ他方がＲc基であるように選択される。ＲbはＣ1-2アルキル、最も好ましくはメチルである。ＲcはＣ1-4アルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル又はＣ1-4スルホアルキル、好ましくはＣ3-6カルボキシアルキル又は−（ＣＨ2）kＳＯ3Ｍ1（式中、ｋは３又は４であるように選択される。）である。
【００５７】
好ましくは、式ＩＩＩの色素は、ｃＭＢＰへの容易な共有結合を可能にするためにＣ1-6カルボキシアルキル置換基を有する。
【００５８】
式ＩＩ又はＩＩＩ中、Ｒ7及び／又はＲ8がＲ9及び／又はＲ10の一方又は両方と共に五員又は六員のＮ含有複素環又はヘテロアリール環を形成する場合、好ましいかかる環はピリジル又はジヒドロピリジルである。Ｒ8基がＲ10と共に環化された好ましいかかるＹ1基は、下記式Ｙcを有する。
【００５９】
【化８】
【００６０】
Ｒ7及びＲ8基の両方が環化された好ましいかかるＹ1基は、下記式Ｙdを有する。
【００６１】
【化９】
【００６２】
式中、Ｒ7、Ｒ9及びＲ11〜Ｒ13は上記に定義した通りであり、各Ｅ1は独立にＨ又はＣ1-4アルキルである。
【００６３】
式Ｙc中、好ましくは下記の通りである。
各Ｘ1はＣＨ3であり、
Ｒ9＝Ｒ11＝Ｈであり、
Ｒ12はＨであり、
Ｒ12はＣＨ3又は−Ｃ（ＣＨ3）3、さらに好ましくは−Ｃ（ＣＨ3）3である。
【００６４】
式Ｙd中、好ましくは下記の通りである。
Ｒ9はＨであり、
Ｒ12はＨであり、
Ｒ12は好ましくはＣＨ3又は−Ｃ（ＣＨ3）3、さらに好ましくは−Ｃ（ＣＨ3）3である。
【００６５】
式ＩＩＩの−ＮＲ7Ｒ8基は下記のいずれかであることが好ましい。
（ｉ）この基は開鎖形態にある。即ち、Ｒ7／Ｒ8基はＲ9／Ｒ10の一方又は両方と共に環化されていない。好ましいかかるＲ7及びＲ8基は、Ｃ1-4アルキル及びＣ1-4スルホアルキルから独立に選択され、最も好ましくはエチル及びＣ3-4スルホアルキルから独立に選択される。
（ｉｉ）この基は環化されて、式Ｙc又はＹd、さらに好ましくは式Ｙcの環状Ｙ1置換基を生じる。
開鎖形態（ｉ）が最も好ましい。
【００６６】
式ＩＩＩの特に好ましい色素は、下記式ＩＩＩｃ、ＩＩＩｄ又はＩＩＩｅを有する。
【００６７】
【化１０】
【００６８】
式中、
Ｍ1は上記に定義した通りであり、
Ｒ17及びＲ18はＣ1-4アルキル及びＣ1-4スルホアルキルから独立に選択され、
Ｒ19はＨ又はＣ1-4アルキルであり、
Ｒ20はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｒ21はＣ1-4スルホアルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｒ22はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｅ2，Ｅ3及びＥ4は独立にＨ又はＣ1-4アルキルである。
式ＩＩＩｄ、ＩＩＩｅ及びＩＩＩｆの色素は、好ましくはＲ19〜Ｒ22の１以上がＣ1-4スルホアルキルであるように選択される。
【００６９】
式ＩＩＩｄの好ましい特定の色素は、次式のＤＹ−６３１及びＤＹ−６３３である。
【００７０】
【化１１】
【００７１】
式ＩＩＩｅの好ましい特定の色素は、次式のＤＹ−６５２である。
【００７２】
【化１２】
【００７３】
好ましい特定の色素はＤＹ−６３１及びＤＹ−６５２であり、ＤＹ−６５２が最も好ましい。
【００７４】
合成リンカー基（Ｌ）が存在する場合、それは好ましくは［ＢｚｐM］及びＺ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2へのコンジュゲーションを容易にする末端官能基を含む。Ｌが１〜１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖からなる場合、アミノ酸残基は好ましくはグリシン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びセリンから選択される。ＬがＰＥＧ部分からなる場合、それは好ましくは下記式Ｂｉｏ１又はＢｉｏ２の単分散ＰＥＧ様構造のオリゴマー化で導かれる単位を含む。
【００７５】
【化１３】
【００７６】
かかるＰＥＧ様構造は、式Ｂｉｏ１（式中、ｐは１〜１０の整数である。）の１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸であり得る。別法として、式Ｂｉｏ２のプロピオン酸誘導体に基づくＰＥＧ様構造も使用できる。
【００７７】
【化１４】
【００７８】
式中、ｐは式Ｂｉｏ１に関して定義した通りであり、ｑは３〜１５の整数である。式Ｂｉｏ２中、ｐは好ましくは１又は２であり、ｑは好ましくは５〜１２である。
【００７９】
リンカー基がＰＥＧ又はペプチド鎖からなっていない場合、好ましいＬ基は、２〜１０の原子、最も好ましくは２〜５の原子、特に好ましくは２又は３の原子を含む−（Ａ）m−部分を構成する結合原子の主鎖を有している。２つの原子を含む最小リンカー基主鎖は、いかなる望ましくない相互作用も最小限に抑えられるようにイメージング部分を十分に引き離すという利点を与える。
【００８０】
式Ｉ中、ｎは好ましくは０又は１であり、最も好ましくは０である（即ち、いかなるリンカー基も存在しない）。
【００８１】
本発明の好ましいイメージング剤は、下記式ＩＶを有する。
【００８２】
【化１５】
【００８３】
式中、（Ｌ）n［ＢｚｐM］基はＬｙｓ残基のε−アミノ基に結合している。式ＩＶの好ましいイメージング剤では、ＭIG（Ｎ末端Ａｌａ）はアセチルに等しく、ＭIG（Ｃ末端Ｌｙｓ）は第一アミドに等しい。式ＩＶ中、ｎは好ましくはゼロであり、ＢｚｐMは好ましくは式ＩＩＩａ又はＩＩＩｂを有し、さらに好ましくは式ＩＩＩｃ、ＩＩＩｄ又はＩＩＩｅを有し、最も好ましくは特定の色素ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３又はＤＹ−６５２である。式ＩＶ中、最も好ましい特定の色素はＤＹ−６５２である。
【００８４】
本発明の式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドは、
（ｉ）所望のｃＭＢＰペプチドと同じペプチド配列を有し、Ｃｙｓa及びＣｙｓbが保護されておらず、Ｃｙｓc及びＣｙｓd残基がチオール保護基を有する線状ペプチドの固相ペプチド合成を行う段階、
（ｉｉ）段階（ｉ）からのペプチドを塩基水溶液で処理することで、Ｃｙｓa及びＣｙｓbを連結する第１のジスルフィド結合を有する単環式ペプチドを得る段階、並びに
（ｉｉｉ）Ｃｙｓc及びＣｙｓdのチオール保護基を除去して環化することで、Ｃｙｓc及びＣｙｓdを連結する第２のジスルフィド結合を形成し、かくして所望の二環式ペプチド生成物Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2を得る段階
を含んでなる製造方法によって得ることができる。
【００８５】
「保護基」という用語は、望ましくない化学反応を阻止又は抑制するが、分子の残部を変質させない程度に温和な条件下で問題の官能基から脱離させ得るのに十分な反応性を有するように設計された基を意味する。脱保護後には所望の生成物が得られる。アミン保護基は当業者にとって公知であり、好適にはＢｏｃ（ここでＢｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである。）、Ｆｍｏｃ（ここでＦｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニルである。）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［即ち、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］及びＮｐｙｓ（即ち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）から選択される。好適なチオール保護基は、Ｔｒｔ（トリチル）、Ａｃｍ（アセトアミドメチル）、ｔ−Ｂｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、メトキシベンジル、メチルベンジル及びＮｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）である。さらに他の保護基の使用は、‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９１）に記載されている。好ましいアミン保護基はＢｏｃ及びＦｍｏｃであり、最も好ましくはＢｏｃである。好ましいアミン保護基はＴｒｔ及びＡｃｍである。
【００８６】
実施例１及び実施例２は一層具体的な詳細を示している。固相ペプチド合成法のさらなる詳細は、Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ ａｎｄ Ｅ．Ｇｉｒａｌｄ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されている。ｃＭＢＰペプチドは不活性雰囲気下で最もよく貯蔵され、フリーザー内に保存される。溶液として使用する場合、ジスルフィドブリッジのスクランブリングを生じるリスクがあるので、７より高いｐＨは避けるのが最もよい。
【００８７】
イメージング剤は、第３の態様に関して（下記に）記載されるようにして製造できる。
【００８８】
第２の態様では、本発明は、第１の態様のイメージング剤を哺乳類への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬品組成物を提供する。
【００８９】
「生体適合性キャリヤー」は、組成物が生理学的に許容され得るようにして（即ち、毒性又は過度の不快感なしに哺乳類の身体に投与できるようにして）イメージング剤を懸濁又は溶解できる流体（特に液体）である。生体適合性キャリヤーは、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、（有利には注射用の最終生成物が等張性になるように平衡させ得る）食塩水のような水溶液、或いは１種以上の張度調整物質（例えば、生体適合性対イオンを有する血漿陽イオンの塩）、糖（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。好ましくは、生体適合性キャリヤーはパイロジェンフリー注射用水又は等張食塩水である。
【００９０】
イメージング剤及び生体適合性キャリヤーはそれぞれ、注射器又はカニューレによる溶液の追加及び抜取りを許しながら、無菌保全性の維持、さらに任意には不活性ヘッドスペースガス（例えば、窒素又はアルゴン）の維持を可能にする密封容器からなる適当なバイアル又は容器に入れた状態で供給される。好ましいかかる容器は、気密蓋を（通例はアルミニウムからなる）オーバーシールと共にクリンプオン式セプタム封止バイアルである。蓋は、無菌保全性を維持しながら皮下注射針による１回又は数回の穿刺に適したもの（例えば、クリンプオン式セプタムシール蓋）である。かかる容器は、（例えば、ヘッドスペースガスの変更又は溶液のガス抜きのために）所望される場合には蓋が真空に耐え得ると共に、酸素又は水蒸気のような外部大気ガスの侵入を許すことなしに減圧のような圧力変化にも耐え得るという追加の利点を有している。
【００９１】
好ましい複数用量容器は、複数の患者用量を含む（例えば、容積１０〜３０ｃｍ3の）単一のバルクバイアルからなり、したがって臨床的状況に合わせて製剤の実用寿命中に様々な時間間隔で１回分の患者用量を臨床グレードの注射器中に抜き取ることができる。予備充填注射器は１回分のヒト用量又は「単位用量」を含むように設計され、したがって好ましくは臨床用に適した使い捨て注射器又は他の注射器である。本発明の医薬品組成物は、好ましくは１人の患者用に適した用量を有し、上述したような適当な注射器又は容器に入れて供給される。
【００９２】
かかる医薬品組成物は、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤、フィラー、安定剤又は重量オスモル濃度調整剤のような追加賦形剤を任意に含むことができる。「抗菌防腐剤」という用語は、潜在的に有害な微生物（例えば、細菌、酵母又はかび）の増殖を阻止する薬剤を意味する。抗菌防腐剤はまた、使用する用量に応じて多少の殺菌性を示すこともある。本発明の抗菌防腐剤の主な役割は、医薬品組成物中におけるこのような微生物の増殖を阻止することである。しかし、抗菌防腐剤は、任意には投与に先立って前記組成物を製造するために使用されるキットの１種以上の成分中における潜在的に有害な微生物の増殖を阻止するためにも使用できる。好適な抗菌防腐剤には、パラベン類（即ち、メチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン或いはこれらの混合物）、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。好ましい抗菌防腐剤はパラベン類である。
【００９３】
「ｐＨ調整剤」という用語は、組成物のｐＨがヒト又は哺乳類への投与のために許容し得る範囲（およそｐＨ４．０〜１０．５）内にあることを保証するために有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。好適なかかるｐＨ調整剤には、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ［即ち、トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン］のような薬学的に許容し得る緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような薬学的に許容し得る塩基がある。組成物をキットの形態で使用する場合には、ｐＨ調整剤を任意には独立のバイアル又は容器に入れて供給することができ、その結果としてキットのユーザーは多段操作の一部としてｐＨを調整することができる。
【００９４】
「フィラー」という用語は、製造及び凍結乾燥中における材料の取扱いを容易にすることができる薬学的に許容し得る増量剤を意味する。好適なフィラーには、塩化ナトリウムのような無機塩、及びスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性糖又は糖アルコールがある。
【００９５】
第２の態様の医薬品組成物は、無菌製造条件下で（即ち、クリーンルーム内で）製造して所望の無菌で非発熱性の生成物を得ることができる。基本構成部分、特に関連する試薬並びにイメージング剤に接触する装置部品（例えば、バイアル）は無菌であることが好ましい。かかる構成部分及び試薬は、無菌濾過或いは（例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は（例えば、エチレンオキシドによる）化学処理を用いる）終末滅菌をはじめとする、当技術分野で公知の方法によって滅菌できる。一部の構成部分を予め滅菌しておけば、最小数の操作を実施すれば済むので好ましい。しかし、予防策として、医薬品組成物の製造における最終段階として少なくとも無菌濾過段階を含めることが好ましい。
【００９６】
第２の態様の医薬品組成物は、任意には第４の態様に関して下記に記載するようなキットから製造される。
【００９７】
第３の態様では、本発明は、第１の態様のイメージング剤の製造方法であって、
（ｉ）Ｚ1がＨでありかつＺ2がＭIGである式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドを式Ｊ1−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがＺ1位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（ｉｉ）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、ｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドを式Ｊ2−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがｃＭＢＰペプチドの前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基の位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（ｉｉｉ）Ｚ1がＭIGであり、Ｚ3がＺ2基又は活性化エステルであり、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ3のペプチドを式Ｊ2−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがＺ2位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階、及び
（ｉｖ）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、かつｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＬｙｓを含む式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドを式Ｊ1−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがｃＭＢＰペプチドのＬｙｓ残基の位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階
の１つを含んでなり、式中のＺ1、ｃＭＢＰ、Ｚ2、ＭIG、Ｌ、ｎ及びＢｚｐMは第１の態様で定義した通りであり、Ｚ3はＺ2基又は活性化エステルであり、Ｊ1はカルボン酸、活性化エステル、イソチオシアネート基又はチオシアネート基であり、Ｊ2はアミン基である、方法を提供する。
【００９８】
「活性化エステル」又は「活性エステル」という用語は、良好な脱離基であり、したがってアミンのような求核性化合物との一層容易な反応を可能にするように設計されたカルボン酸のエステル誘導体を意味する。好適な活性エステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ペンタフルオロフェノール、ペンタフルオロチオフェノール、ｐ−ニトロフェノール及びヒドロキシベンゾトリアゾールである。好ましい活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はペンタフルオロフェノールエステルである。
【００９９】
Ｊ2は好ましくは第一又は第二アミン基であり、最も好ましくは第一アミン基である。
【０１００】
化合物Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2では、好ましくはＺ1及びＺ2が共にＭIGに等しい。好ましいｃＭＢＰペプチド及びＺ1／Ｚ2基は第１の態様で記載した通りである。詳しくは、第１の態様の好ましいｃＭＢＰペプチドに関して記載した通り、ｃＭＢＰペプチドはコンジュゲーションを容易にするためにＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ残基を含むことが好ましい。段階（ｉｖ）に記載した通り、ｃＭＢＰペプチドはＬｙｓ残基を含むことが特に好ましい。
【０１０１】
Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2の製法は、（上記に）第１の実施形態で記載されている。Ｚ3が活性エステルであるＺ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ3ペプチドは、Ｚ2がＯＨ又は生体適合性陽イオン（Ｂc）であるＺ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2から通常の方法によって製造できる。
【０１０２】
ｃＭＢＰとのコンジュゲーションのため、ＢｚｐMは好適には、ｃＭＢＰペプチドの相補基と反応して色素とｃＭＢＰペプチドとの間に共有結合を形成する反応基又は官能基（Ｇ）を含んでいる。Ｇはペプチドの相補的な官能基と反応し得る反応基（Ｑa）であり得るか、或いは別法としてｃＭＢＰペプチドの反応基と反応し得る官能基を含み得る。反応基及び官能基の例には、活性エステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハロゲン化物、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン、ホスホラミダイト、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボン酸及びチオホスフェートがある。好ましくは、Ｇは反応基（Ｑa）である。Ｑaは好ましくは活性エステルである。
【０１０３】
ｃＭＢＰへのコンジュゲーションに適するように官能化されたベンゾピリリウム色素（ＢｚｐM）は、Ｄｙｏｍｉｃｓ社（Ｄｙｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｗｉｎｚｅｒｌａｅｒ Ｓｔｒ．２Ａ、Ｄ−０７７４５ Ｊｅｎｅ、ドイツ、ｗｗｗ．ｄｙｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）から商業的に入手できる。この場合、反応基（Ｑa）はＮＨＳエステル、マレイミド、アミノ又はカルボン酸である。ベンゾピリリウム色素の合成のために適した前駆体は、米国特許第５４０５９７６号に記載されたようにして製造することもできる。光学レポーター色素をアミノ酸及びペプチドにコンジュゲートする方法は、Ｌｉｃｈａ［Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５７，１０８７−１１０８（２００５）］並びにＦｌａｎａｇａｎ他［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，８，７５１−７５６（１９９７）］、Ｌｉｎ他［ｉｂｉｄ，１３，６０５−６１０（２００２）］及びＺａｈｅｅｒ［Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，１（４），３５４−３６４（２００２）］によって記載されている。リンカー基（Ｌ）をｃＭＢＰペプチドにコンジュゲートする方法は、色素のみをコンジュゲートする方法（上記参照）と類似の化学作用を使用し、当技術分野で公知である。
【０１０４】
第４の態様では、本発明は、第２の態様の医薬品組成物を製造するためのキットであって、当該キットは第１の態様のイメージング剤を無菌固体形態で含んでいて、第２の態様の生体適合性キャリヤーの無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の医薬品組成物が得られるキットを提供する。
【０１０５】
その場合、イメージング剤及び上述したような他の任意賦形剤は、凍結乾燥粉末として適当なバイアル又は容器に入れて供給できる。イメージング剤は、次いで所望の生体適合性キャリヤーを用いて再構成することで、哺乳類への投与が可能な無菌で非発熱性の形態の医薬品組成物を与えるように設計されている。イメージング剤の好ましい無菌固体形態は凍結乾燥固体である。無菌固体形態は、好ましくは医薬品組成物に関して（上記に）記載したような医薬品用容器に入れて供給される。キットを凍結乾燥する場合、配合物は糖類（好ましくはマンニトール、マルトース及びトリシン）から選択される凍結保護剤を任意に含むことができる。
【０１０６】
第５の態様では、本発明は、哺乳類の身体のインビボ光学イメージング方法であって、第１の態様のイメージング剤又は第２の態様の医薬品組成物を用いてインビボでのｃＭｅｔの過剰発現部位又は局在部位の画像を得ることを含んでなる方法を提供する。
【０１０７】
「光学イメージング」という用語は、第１の態様（上記）の場合と同じ意味を有する。第５の態様の哺乳類の身体は、好ましくは人体である。イメージング剤の好ましい実施形態は、第１の態様に関して（上記に）記載した通りである。
【０１０８】
第５の態様の方法では、イメージング剤又は医薬品組成物は、好ましくは前記哺乳類の身体に予め投与されている。「予め投与されている」とは、臨床医の関与の下でイメージング剤を例えば静脈内注射によって患者に投与する段階がイメージングに先立って既に実施されていることを意味する。この実施形態は、ｃＭｅｔが関係している哺乳類の身体の疾患状態のインビボ光学イメージング用の診断剤を製造するための、第１の実施形態のコンジュゲートの使用を含んでいる。
【０１０９】
第５の態様の好ましい光学イメージング方法は、蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）である。ＦＲＩでは、本発明のイメージング剤を診断すべき被験体に投与し、次いで被験体の組織表面を励起光（通常は連続波（ＣＷ）励起）で照明する。光は色素（ＢｚｐM）を励起する。励起光によって生じるイメージング剤からの蛍光を、蛍光検出器を用いて検出する。好ましくは、戻る光を濾光することで蛍光成分を（単独に又は部分的に）分離する。蛍光から画像を形成する。通常、最小限の処理が実施され（寿命、量子収量などの光学パラメーターを計算するためのプロセッサーは使用されない）、画像は蛍光強度をマップする。イメージング剤は、疾患領域に集中して高い蛍光強度を生み出すように設計されている。したがって、疾患領域は蛍光強度画像中に正のコントラストを生み出す。画像は好ましくはＣＣＤカメラ又はチップを用いて取得される結果、リアルタイムイメージングが可能である。
【０１１０】
励起用の波長は、使用する色素の種類に応じて変化する。励起光を発生するための装置は、レーザー（例えば、イオンレーザー、色素レーザー又は半導体レーザー）、ハロゲン光源或いはキセノン光源のような通常の励起光源であり得る。任意には、各種の光学フィルターを用いて最適の励起波長を得ることができる。
【０１１１】
好ましいＦＲＩ方法は下記の段階を含んでなる。即ち、
（ｉ）哺乳類の身体内の検査対象組織表面を励起光で照明する段階、
（ｉｉ）色素（ＢｚｐM）の励起によって生じるイメージング剤からの蛍光を蛍光検出器を用いて検出する段階、
（ｉｉｉ）蛍光検出器によって検出された光を任意に濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（ｉｖ）段階（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の蛍光から前記検査対象組織表面の画像を形成する段階
を含んでいる。段階（ｉ）では、励起光は好ましくは連続波（ＣＷ）の性質を有する。段階（ｉｉｉ）では、検出される光は好ましくは濾光される。特に好ましいＦＲＩ方法は蛍光内視鏡検査である。
【０１１２】
第５の態様の別のイメージング方法は、ＦＤＰＭ（周波数ドメイン光子移動）を使用する。
これは、組織内におけるイメージング剤の検出深度が大きいことが重要である場合、連続波（ＣＷ）方法に比べて利点を有する［Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］。かかる周波数／時間ドメインイメージングのためには、ＢｚｐMが、画像化すべき病変の組織深度及び使用する計装のタイプに応じて変調できる蛍光特性を有するならば有利である。
【０１１３】
ＦＤＰＭ方法は下記のようなものである。即ち、
（ａ）不均質組成を有する前記哺乳類の身体の光散乱性生体組織を、所定の経時変動強度を有する光源からの光に暴露してイメージング剤を励起する段階であって、組織は励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記暴露に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応する複数の値をプロセッサーで確定することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルは組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことで組織の画像を生成する段階
を含んでいる。
【０１１４】
段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくはイメージング剤の取込みに対応し、好ましくはさらにイメージング剤の投与前における組織の吸着係数及び散乱係数に対応する複数の量のマッピングを含んでいる。段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくは蛍光寿命、蛍光量子効率、蛍光収量及びイメージング剤取込みの１以上に対応する。蛍光特性は、好ましくは発光強度に無関係であり、またイメージング剤濃度に無関係である。
【０１１５】
段階（ｃ）の定量化は、好ましくは、（ｉ）値の推定値を設定し、（ｉｉ）推定値の関数として計算発光を求め、（ｉｉｉ）計算発光を前記検出段階の発光と比較して誤差を求め、（ｉｖ）誤差の関数として蛍光特性の修正推定値を得ることを含んでいる。定量化は、好ましくは、組織の多重光散乱挙動をモデル化する数学的関係から値を求めることを含んでいる。第１のオプションの方法は、好ましくはさらに、前記蛍光特性の変動を検出することでインビボでの組織の代謝特性をモニターすることを含んでいる。
【０１１６】
第５の態様の光学イメージングは、好ましくは結腸直腸癌（ＣＲＣ）の管理を容易にするために使用される。「ＣＲＣの管理」という用語は、検出、ステージング、診断、疾患進行のモニタリング又は治療のモニタリングでの使用を意味する。好適な光学イメージング方法のさらなる詳細は、Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ他［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］によって総説されている。
【０１１７】
第６の態様では、本発明は、哺乳類の身体の結腸直腸癌（ＣＲＣ）の検出、ステージング、診断、疾患進行のモニタリング又は治療のモニタリングを行う方法であって、第４の態様のインビボ光学イメージング方法を含んでなる方法を提供する。
【実施例】
【０１１８】
以下に詳述する非限定的な実施例によって本発明を例証する。実施例１は、ｃＭｅｔに対して結合する生物学的標的化ペプチド（ペプチド１）の合成法を示している。実施例２は、本発明のＢｚｐM色素をペプチド（特にペプチド１）にコンジュゲートする方法を示している。実施例３は、本発明のペプチド１のペプチドコンジュゲートがｃＭｅｔに対する親和性を保有すること（即ち、コンジュゲートした色素が生物学的結合及び選択性を妨害しないこと）を実証するデータを示している。ヒト血清アルブミンに対する適切な低い結合及び血漿中での高い安定性が実証された。実施例４は、本発明のペプチドコンジュゲートが結腸直腸癌の動物モデルにおいて有用な腫瘍／バックグラウンド比を示すことを示している。実施例５は本発明の色素に関する予測ソフトウェアの使用を記載しており、本発明の色素がインビボで潜在的に危険な代謝産物を生じないことを実証している。実施例６は化合物６の毒性試験を記載しており、予想される臨床用量がいかなる薬物関連の副作用も生じることなく十分に許容されることを示している。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
ＤＹ−７５２はＤＹ−６５２と同じ環及び置換基パターンを有するが、ＤＹ−６５２のトリメチン結合の代わりにペンタメチン結合（即ち、ｗ＝２及びＲ5＝Ｈ）を有している。
【０１２１】
略語
通常の三文字及び一文字アミノ酸略語を使用する。
Ａｃｍ： アセトアミドメチル
ＡＣＮ： アセトニトリル
Ｂｏｃ： ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＭＦ： Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ： ジメチルスルホキシド
Ｆｍｏｃ： ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＣｌ： 塩酸
ＨＰＬＣ： 高速液体クロマトグラフィー
ＨＳＰｙＵ： Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレン ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
Ｉｌｅ： イソロイシン
ＬＣ−ＭＳ： 液体クロマトグラフィー質量分析法
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
ＮＨＳ： Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＮＭＭ： Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＰ： １−メチル−２−ピロリジノン
Ｐｂｆ： ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホ ニル
ＰＢＳ： リン酸塩緩衝食塩水
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
Ｔｒｔ： トリチル
ＴＳＴＵ： Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウ ロニウムテトラフルオロボレート
実施例１：ペプチド１の合成
下記の配列を有しかつ２つのＣｙｓ−Ｃｙｓ結合（Ｃｙｓ４−１６及びＣｙｓ６−１４）を有する２６量体二環式ペプチドを使用した。
Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2（「ペプチド１」）。
【０１２２】
【化１６】
【０１２３】
段階（ａ）：ペプチド１の保護線状前駆体の合成
前駆体線状ペプチドは下記の配列を有している。
Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−
Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
ＮＨ2。
【０１２４】
０．１ｍｍｏｌのＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｎｏｖａｇｅｌ樹脂から出発するＦｍｏｃ化学を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３３Ａペプチド合成機上でペプチジル樹脂Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ψMe,Meｐｒｏ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ポリマーをアセンブルした。カップリング段階では、（ＨＢＴＵを用いて）予備活性化した過剰量の１ｍｍｏｌアミノ酸を適用した。Ｇｌｕ−Ｔｈｒプソイドプロリン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ０５−２０−１１２２）を配列中に組み込んだ。樹脂を窒素バブラー装置に移し、無水酢酸（１ｍｍｏｌ）及びＮＭＭ（１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した溶液で６０分間処理した。濾過によって無水物溶液を除去し、樹脂をＤＣＭで洗浄してから窒素流下で乾燥した。
【０１２５】
２．５％のＴＩＳ、２．５％の４−チオクレゾール及び２．５％の水を含むＴＦＡ（１０ｍＬ）中で、側鎖保護基の除去及び樹脂からのペプチド切断を２時間３０分にわたり同時に実施した。樹脂を濾過によって取り除き、ＴＦＡを真空中で除去し、残留物にジエチルエーテルを添加した。生じた沈殿をジエチルエーテルで洗浄し、空気乾燥することで、２６４ｍｇの粗ペプチドを得た。
【０１２６】
粗ペプチドを分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３０分）によって精製することで、純粋なペプチド１の線状前駆体１００ｍｇを得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：６．５４分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１４６４．６、ＭＨ22+実測値：１４６５．１）。
【０１２７】
段階（ｂ）：Ｃｙｓ４−１６ジスルフィドブリッジの形成
Ｃｙｓ４−１６；Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2。
【０１２８】
段階（ａ）からの線状前駆体（１００ｍｇ）を５％ＤＭＳＯ／水（２００ｍＬ）に溶解し、アンモニアを用いて溶液をｐＨ６に調整した。反応混合物を５日間撹拌した。次いで、ＴＦＡを用いて溶液をｐＨ２に調整し、大部分の溶媒を真空中での蒸発によって除去した。生成物の精製のため、残留物（４０ｍＬ）を分取ＨＰＬＣカラム上に少しずつ注入した。
【０１２９】
残留物を分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂを１０分間、次いで４０分で０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：４４分）によって精製することで、純粋なペプチド１の単環式前駆体７２ｍｇを得た。（異性体Ｐ１乃至Ｐ３の混合物としての）純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：５．３７分（Ｐ１）、５．６１分（Ｐ２）、６．０５分（Ｐ３））によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１４６３．６、ＭＨ22+実測値：１４６４．１（Ｐ１）、１４６４．４（Ｐ２）、１４６４．３（Ｐ３））。
【０１３０】
段階（ｃ）：Ｃｙｓ６−１４ジスルフィドブリッジの形成（ペプチド１）
段階（ｂ）からの単環式前駆体（７２ｍｇ）を窒素ブランケット下で７５％ＡｃＯＨ／水（７２ｍＬ）に溶解した。１Ｍ ＨＣｌ（７．２ｍＬ）及びＡｃＯＨ中の０．０５Ｍ Ｉ2（４．８ｍＬ）をその順序で添加し、混合物を４５分間撹拌した。１Ｍアスコルビン酸（１ｍＬ）を添加して無色の混合物を得た。大部分の溶媒を真空中で蒸発させ、残留物（１８ｍＬ）を水／０．１％ＴＦＡ（４ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１３１】
残留物を分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂを１０分間、次いで４０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：４３〜５３分）によって精製することで、５２ｍｇの純粋なペプチド１を得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：６．５４分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１３９１．５、ＭＨ22+実測値：１３９２．５）。
【０１３２】
実施例２：ベンゾピリリウム色素のペプチドコンジュゲートの合成
一般コンジュゲーション方法
実施例１からのペプチド１（４ｍｇ、１．４μｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、ＢｚｐM ＮＨＳエステル（１ｍｇ、１μｍｏｌ）及びｓｙｍ−コリジン（８μＬ、６０μｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液を添加した。反応混合物を（マイクロ波支援により）６０℃で１時間加熱し、次いでＲＴで一晩放置した。次いで、反応混合物を２０％ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ（７ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１３３】
精製及び特性決定
粗ペプチドを分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ）によって精製することで、純粋な［ペプチド１］−ＢｚｐMコンジュゲートを得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：５分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．６ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ２０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した。製造した化合物を表３に示す。
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
実施例３：インビトロ蛍光偏光アッセイ
蛍光偏光アッセイを用いて、ｃＭｅｔ標的に対するイメージング剤の結合親和性並びに血漿タンパク質に関する結合特性を検査した。蛍光偏光法の原理を簡単に述べれば、以下の通りである。
【０１３６】
単色光が水平偏光フィルターを通過し、試料中の蛍光分子を励起する。垂直偏光面内に正しく配向した分子のみが光を吸収し、励起され、次いで光を放出する。放出された光を水平面内及び垂直面内で測定する。異方性値（Ａ）は、下記の式に従った光強度の比である。
【０１３７】
【数１】
【０１３８】
蛍光異方性測定は、Ｅｘ６３５／Ｅｍ６７８ｎｍでＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ蛍光偏光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社、米国）を使用しながら、３８４ウェルマイクロプレート中において結合緩衝液（ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）中１０μＬの体積で実施した。色素標識ペプチドの濃度を一定（５ｎＭ）に保つと共に、ヒトｃＭｅｔ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）の濃度を０〜２５０ｎＭの範囲内で変化させた。結合混合物をマイクロプレート中において３０℃で１０分間平衡させた。観察された異方性の変化を下記の式に当てはめた。
【０１３９】
【数２】
【０１４０】
式中、ｒobsは観察された異方性であり、ｒfreeは遊離ペプチドの異方性であり、ｒboundは結合ペプチドの異方性であり、ＫDは解離定数であり、ｃＭｅｔは総ｃＭｅｔ濃度であり、Ｐは総色素標識ペプチド濃度である。この式は、合成ペプチド及びレセプターが溶液中において１：１の化学量論比で可逆複合体を形成することを仮定している。ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェアを用いて非線形回帰によりデータ当てはめを行うことでＫD値（一部位結合）を得た。
【０１４１】
ヒトｃＭｅｔ（Ｆｃキメラ）に対する結合に関して化合物１乃至化合物６を試験した。結果は、ヒトｃＭｅｔに対するすべての試験化合物の結合に関するｎＭ単位のＫDを示している（表４参照）。
【０１４２】
偏光値の変化が小さいことはインビボ用途に適した低い結合性に関連しているので、偏光値の変化を用いてヒト血清アルブミンに対する化合物の結合度を評価した。血漿タンパク質結合度（ＰＰＢ）はＢｉａｃｏｒｅ測定によって確認した。血漿中でのイメージング剤の安定性は、マウス血漿中において３７℃で２時間インキュベートした後に残留する化合物の量を測定することで確認した。
【０１４３】
【表３】
【０１４４】
実施例４：化合物２〜６のインビボ試験
（ａ）動物モデル
この試験では雌のＢＡＬＢ ｃ／Ａヌード（Ｂｏｍ）マウスを使用した。動物の使用は地方倫理委員会によって承認された。ＢＡＬＢ ｃ／Ａヌードは、他のヌードマウス系統に比べてヒト腫瘍に対し高い生着率を有する、同系交配された免疫無防備状態のマウス系統である。マウスは到着時に８週齢であり、試験の開始時には約２０グラムの体重を有していた。動物は、ＨＥＰＡ濾過空気を備えた個別換気ケージ（ＩＶＣ、Ｓｃａｎｂｕｒ ＢＫ社）内に収容した。動物は、“Ｒａｔ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ ｎｒ．３ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ”飼料（Ｓｃａｎｂｕｒ ＢＫ社）及び１ｍＭのモル濃度にＨＣｌを添加して酸性化した水道水（ｐＨ３．０）に随意にアクセスできた。
【０１４５】
結腸癌細胞ＨＴ−２９はヒト結腸癌腫から導かれ、Ｚｅｎｇ他［Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，２１，４０９−４１７（２００４）］によればｃＭｅｔを発現することが報告されている。この細胞株は、ヌードマウスに皮下接種した場合に腫瘍を形成することが判明した［Ｆｌａｔｍａｒｋ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４０，１５９３−１５９８（２００４）］。
【０１４６】
１０％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＭｃＣｏｙ’ｓ ５ａ培地（Ｓｉｇｍａ ＃Ｍ８４０３）中でＨＴ−２９細胞を増殖させた。継代数４（Ｐ４）で保存株を作成し、５％ＤＭＳＯを含むそれぞれの培地中における１０7細胞／バイアルの量を液体窒素中で凍結して貯蔵した。移植当日、細胞を３７℃の水浴中で急速に解凍し（約２分間）、洗浄し、ＰＢＳ／２％血清中に再懸濁した（１２００ｒｐｍで１０分間の遠心）。投与用注射器中に細胞を吸引する際には、常にバイアル内の細胞を完全に混合してから行った。ファインボア注射針（２５Ｇ）を用いて０．１ｍｌの量の細胞懸濁液を肩及び背中に皮下注射した。次いで、動物をケージに戻し、腫瘍を１３〜１７日間増殖させた。動物には、５日以上の順化期間を置いてから接種処置を施した。
【０１４７】
（ｂ）処置
すべての試験物質は、凍結乾燥粉末からＰＢＳを用いて再構成した。白色プリンター用紙の小さな堆積物をイメージ化してフラットフィールド画像を得、これを用いて照明の不均一性を補正した。光学イメージング処置中の不動化のため、酸素をキャリヤーガスとするイソフルラン（通例１．３〜２％）により、動物を同軸オープンマスク内で軽い外科レベル麻酔に麻酔した。動物を麻酔している間に、外科用鉗子及び微小はさみを用いて腫瘍及び隣接する筋肉の部分から小さい皮膚片（３〜５ｍｍ）を取り除いた。これは、上方に位置する皮膚組織の妨害なしに腫瘍及び筋肉からの信号を測定するために行った。創傷は、液状の非蛍光性スプレー包帯（３Ｍ社、米国ミネソタ州）を適用することで覆った。
【０１４８】
動物下方の空気圧センサー及び直腸温度プローブを用いるＢｉｏＶｅｔシステム（ｍ２ｍ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，米国ニュージャージー州）によって動物の呼吸及び体温をモニターした。ＢｉｏＶｅｔシステムはまた、イメージング処置期間（２時間）中に正常体温を維持するため、加熱マットセットを用いて４０℃に外部加熱することを可能にした。造影剤投与のため、尾静脈中にＶｅｎｆｌｏｎカテーテルを配置した。各動物に１回の造影剤注射を施した。注射量は０．１ｍｌの試験化合物であり、その直後に０．２ｍｌの食塩水フラッシュを行った。注射の直前に蛍光画像を取得し、次いで２時間にわたり３０秒ごとに取得した。
【０１４９】
（ｃ）イメージング
イメージングは、光源を用いてレポーターを励起しかつ濾光系を用いて蛍光成分を抽出するように改造した臨床用腹腔鏡を通して実施した。レポーター分子の励起のためには６３５ｎｍレーザーを使用した。検出器としてはＨａｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ ＥＲＧ ＣＣＤカメラを使用した。カメラは利得０の２×２ビンニングモードで動作させた。結腸イメージング用の標準露光時間は４秒であった。画像中の強度分布は、システム較正データにより、照明の不均一性について補正した。露出腫瘍及び正常筋肉バックグラウンドの上方に位置する検査対象領域から標的／バックグラウンド比を計算した。
【０１５０】
（ｄ）結果
試験化合物は、下記の平均腫瘍：筋肉比を有していた（表５）。
【０１５１】
【表４】
【０１５２】
実施例５：代謝及び毒性予測
Ｌｈａｓａ Ｌｔｄ（２２−２３ Ｂｌｅｎｈｅｉｍ Ｔｅｒｒａｃｅ，Ｌｅｅｄｓ ＬＳ２ ９ＨＤ，英国）からソフトウェアツールＤｅｒｅｋ及びＭｅｔｅｏｒを入手した。Ｄｅｒｅｋは、既知の構造依存毒性に基づいて新しい化学的実在物の毒性を予測するために使用される。同様に、Ｍｅｔｅｏｒは新規化学物質から生じ得る代謝産物を予測する。両ツールは、化合物に関する公表データ及び未公表（だが確認済みの）データに基づいている。色素ＤＹ−６５２の化学構造を入力した。インビボでの潜在的に危険な代謝産物は予測されなかった。
【０１５３】
実施例６：化合物６の毒性試験
前臨床イメージング用量（５０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）の１００倍での化合物６の許容性を調べるため、限定急性用量毒性試験を行った。雄ラットに化合物を静脈内注射し、注射後（ｐ．ｉ．）１日目、１４日目、２１日目及び２８日目に屠殺した。検死時に、主要器官の肉眼的病理状態を検査し、以後の組織形態学的評価のために腎臓を中性緩衝ホルマリン中に採取した。注射直後には皮膚の弱い青色着色及び尿の中等度の青色着色が認められたが、注射後１日以内に消失した。検死時には、腎臓は注射後１日目で全般的に緑色であった。光学顕微鏡検査によれば、腎臓には化合物６に関連する所見は見られなかった。見られた他の小変化は偶発的なものであり、若い実験用ラット成体では普通のものであった。腎臓における血管の強い蛍光染色が注射後１日目に認められた。染色は注射後１４日目までに減少し、注射後２１日目には対照と識別できなかった。
【０１５４】
いずれの処理動物でも変性、壊死又は炎症の形跡は認められず、これは化合物の腎毒性が低いことを示唆している。予想される臨床用量の１００倍で雄ラットに化合物６を１回だけ静脈内投与することは、いかなる薬物関連の副作用も生じることなく十分に許容されるという結論が得られた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボでの光学イメージングのために適した標識ｃＭｅｔ結合ペプチドに関する。かかるペプチドは、赤色乃至近赤外領域でのイメージングのために適した光学レポーター基で標識されている。また、特に結腸直腸癌（ＣＲＣ）の診断で使用するためのインビボイメージング方法も開示される。
【背景技術】
【０００２】
国際公開第２００５／０３０２６６号には、結腸直腸癌（ＣＲＣ）の早期診断に対する医学的ニーズが存在することが開示されている。国際公開第２００５／０３０２６６号は、ＣＲＣで異常に発現される生物学的標的に対して親和性を有する光学イメージング用造影剤を開示している。生物学的標的は、ＣＯＸ−２、β−カテニン、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、各種キナーゼ、Ｈｅｒ−２、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、サイクリン、Ｐ５３、チミジル酸シンターゼ、ＶＥＧＦレセプター、ＥＧＦレセプター、Ｋ−ラス、腺腫性結腸ポリポーシスタンパク質、カテプシンＢ、ｕＰＡＲ、ｃＭｅｔ、ムチン及びガストリンレセプターから選択される。好ましいかかる標的（７頁１１〜１２行目）は、ｃＭｅｔ、ＭＭＰ−１４、ＣＯＸ−２、β−カテニン及びカテプシンＢであると言われている。国際公開第２００５／０３０２６６号のベクターは、ペプチド、ペプトイド部分、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、脂質関連化合物又は伝統的な有機薬物様小分子であり得る。レポーター部分は、好ましくは、電磁スペクトルの紫外部分から赤外部分までの波長領域の光と相互作用する色素である。
【０００３】
散乱因子（ＳＦ）としても知られる肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は、創傷治癒や血管形成のような各種の生理学的過程に関与する成長因子である。ＨＧＦとその高親和性レセプター（ｃＭｅｔ）との相互作用は、腫瘍の成長、浸潤及び転移に関係している。
【０００４】
Ｋｎｕｄｓｅｎ他は、前立腺癌におけるＨＧＦ及びｃＭｅｔの役割を、イメージング及び治療への可能な関与を含めて総説している［Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，９１，３１−６７（２００４）］。診断及び治療用の標識抗ｍｅｔ抗体は、国際公開第０３／０５７１５５号に記載されている。
【０００５】
国際公開第２００４／０７８７７８号は、ｃＭｅｔ又はｃＭｅｔ及びＨＧＦを含む複合体と結合するポリペプチド又は多量体ペプチド構築物を開示している。約１０の異なるペプチド構造クラスが記載されている。国際公開第２００４／０７８７７８号には、インビトロ及びインビボ用途のための検出可能な標識或いは治療用途のための薬物でペプチドを標識できることが開示されている。検出可能な標識は、酵素、蛍光化合物、光学色素、常磁性金属イオン、超音波造影剤又は放射性核種であり得る。国際公開第２００４／０７８７７８号の好ましい標識は放射性核種又は常磁性金属であると述べられており、最も好ましくは金属キレーターでキレート化された金属からなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
国際公開第２００４／０７８７７８号パンフレット
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、インビボ光学イメージングのために適したイメージング剤であって、ｃＭｅｔ結合環状ペプチドと、６００〜１２００ｎｍの赤色乃至近赤外波長を有する光を用いて哺乳類の身体のインビボイメージングを行うために適したベンゾピリリウム色素とを含んでなるイメージング剤を提供する。
【０００８】
ｃＭｅｔ結合環状ペプチドは、国際公開第２００４／０７８７７８号のペプチド構造クラスの１つに関係していて、ｃＭｅｔに対して最適の結合親和性を有している。これらのペプチドは、国際公開第２００４／０７８７７８号に記載されているように、ファージディスプレイから導かれ、ｃＭｅｔに対する親和性及びＨＧＦとの競合の欠如によって選択された。本発明のｃＭＢＰ結合ペプチドは、好ましくはその末端の少なくとも一方が代謝阻害基（ＭIG）で保護されている。これはインビボ用途にとって重要な考慮事項である。さもないと、内在酵素及びペプチダーゼがーペプチドを急速に代謝させ、その結果としてｃＭｅｔ結合親和性の喪失、したがってインビボでの選択的標的化の喪失を招くことになる。
【０００９】
本発明は、表在性病変のインビボイメージングのためにｃＭｅｔ結合ペプチドを使用する最良の方法は他のイメージングモダリティー（例えば、核、ＭＲＩ又は超音波）と違って光学レポーターの使用を必要とすることを教示すると共に、好ましい光学イメージングレポーターも提供する。赤色乃至近赤外領域（６００〜１２００ｎｍの波長を有する光）が好ましいが、これはその領域がヘモグロビン、ポルフィリン類、メラニン及びコラーゲンのような内在性の組織及び物質と最小のスペクトルオーバーラップを有するからである［Ｌｉｃｈａ，Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）］。組織の自発蛍光に寄与する他の重要な物質はＮＡＤＨ、ＦＡＤ及びエラスチンである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
第１の態様では、本発明は下記式Ｉのコンジュゲートを含んでなるイメージング剤を提供する。
【００１１】
【化１】
【００１２】
式中、
Ｚ1はｃＭＢＰのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭIGであり、
Ｚ2はｃＭＢＰのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢc（式中、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）又はＭIGであり、
ｃＭＢＰは、下記のアミノ酸配列（配列番号１）を含む１７〜３０のアミノ酸のｃＭｅｔ結合環状ペプチドであり、
Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
（式中、Ｘ1はＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＴｙｒであり、Ｘ2はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｓｎであり、Ｘ3はＴｈｒ又はＡｒｇであり、Ｘ4はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ5はＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ6はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｃｙｓa-dの各々はシステイン残基であって、残基ａ及びｂ並びに残基ｃ及びｄは環化して２つの独立したジスルフィド結合を形成している。）
ＭIGは、ペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基である代謝阻害基であり、
Ｌは式−（Ａ）m−（式中、各Ａは独立に−ＣＲ2−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ2−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ2ＮＲ−、−ＮＲＳＯ2−、−ＣＲ2ＯＣＲ2−、−ＣＲ2ＳＣＲ2−、−ＣＲ2ＮＲＣＲ2−、Ｃ4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基又はＣ3-12ヘテロアリーレン基、或いはアミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4アルケニル、Ｃ2-4アルキニル、Ｃ1-4アルコキシアルキル及びＣ1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。）の合成リンカー基であり、
ｎは０又は１の値を有する整数であり、
ＢｚｐMは下記式ＩＩのベンゾピリリウム色素である。
【００１３】
【化２】
【００１４】
（式中、
Ｙ1は下記式Ｙa又はＹbの基であり、
【００１５】
【化３】
【００１６】
Ｒ1〜Ｒ4及びＲ9〜Ｒ13はＨ、−ＳＯ3Ｍ1（式中、各Ｍ1は独立にＨ又はＢcであり、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）、Ｈａｌ、Ｒa及びＣ3-12アリールから独立に選択され、
Ｒ5はＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル、Ｃ3-12アリールスルホニル又はＣｌであり、或いは任意にはＲ6、Ｒ14、Ｒ15又はＲ16の１つと共に五員又は六員の不飽和脂肪族環、不飽和ヘテロ脂肪族環又は芳香環を形成でき、
Ｒ6及びＲ16は独立にＲa基であり、
Ｒ7及びＲ8は独立にＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル又はＣ1-6ヒドロキシアルキルであり、或いは任意にはＲ9及び／又はＲ10の一方又は両方と共に五員又は六員のＮ含有複素環又はヘテロアリール環を形成でき、
Ｘは−ＣＲ14Ｒ15−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＮＲ16−又は−ＣＨ＝ＣＨ−（式中、Ｒ14〜Ｒ16は独立にＲa基である。）であり、
ＲaはＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル又はＣ1-6ヒドロキシアルキルであり、
ｗは１又は２であり、
Ｊは生体適合性陰イオンであり、
ＢｚｐMはＲ1〜Ｒ16基から選択される１以上のスルホン酸置換基を含むことを条件とする。）
「イメージング剤」という用語は、哺乳類の身体のインビボイメージングを行うために適した化合物を意味する。好ましくは、哺乳類はヒトの患者である。イメージングは侵襲的（例えば、手術中検査又は内視鏡検査）であってもよいし、或いは非侵襲的であってもよい。好ましいイメージング方法は内視鏡検査である。式Ｉのコンジュゲートはインビボイメージングのために適するが、それはインビトロ用途（例えば、生物学的試料中のｃＭｅｔを定量するアッセイ又は組織試料中のｃＭｅｔの可視化）も有し得る。好ましくは、イメージング剤はインビボ光学イメージングのために使用される。
【００１７】
「光学イメージング」という用語は、赤色乃至近赤外領域（波長６００〜１２００ｎｍ）の光との相互作用に基づいて、疾患の検出、ステージング又は診断、疾患進展の追跡或いは疾患治療の追跡のための画像を形成する任意の方法を意味する。光学イメージングはさらに、いかなる装置も使用しない直接可視化並びに各種スコープ、カテーテル及び光学イメージング装置（例えば、断層撮影表示用のコンピューター支援ハードウェア）のような装置の使用を伴う直接可視化のためのあらゆる方法を包含する。かかるモダリティ及び測定技法には、特に限定されないが、ルミネセンスイメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光学コヒーレンス断層撮影、透過率イメージング、時間分解透過率イメージング、共焦点イメージング、非線形顕微鏡検査、光音響イメージング、音響光学イメージング、スペクトル分析、反射スペクトル分析、干渉分析、コヒーレンス干渉分析、拡散光学断層撮影及び蛍光媒介拡散光学断層撮影（連続波、時間ドメイン及び周波数ドメインシステム）、並びに光の散乱、吸光、偏光、ルミネセンス、蛍光寿命、量子収量及び消光の測定がある。これらの技法のさらなる詳細は、Ｔｕａｎ Ｖｏ−Ｄｉｎｈ（編）：“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”（２００３），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＣＣ、Ｍｙｃｅｋ ＆ Ｐｏｇｕｅ（編）：“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”（２００３），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｓｐｌｉｎｔｅｒ ＆ Ｈｏｐｐｅｒ：“Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ”（２００７），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＣＣに示されている。
【００１８】
赤色乃至近赤外領域の光は、好ましくは６５０〜１０００ｎｍの波長を有する。光学イメージング方法は、好ましくは蛍光内視鏡検査である。
【００１９】
「コンジュゲート」という用語は、ｃＭＢＰ及びＢｚｐM色素が任意には（Ｌ）n基を介して共有結合により結合されていることを意味する。
【００２０】
Ｚ1基は、最後のアミノ酸残基のアミン基を置換する。したがって、Ｚ1がＨである場合、ｃＭＢＰのアミノ末端は最後のアミノ酸残基の遊離ＮＨ2基で終わる。Ｚ2基は、最後のアミノ酸残基のカルボニル基を置換する。したがって、Ｚ2がＯＨである場合、ｃＭＢＰのカルボキシ末端は最後のアミノ酸残基の遊離ＣＯ2Ｈ基で終わり、Ｚ2がＯＢcである場合、末端カルボキシ基はＣＯ2Ｂc基としてイオン化される。
【００２１】
「代謝阻害基」（ＭIG）という用語は、アミノ末端（Ｚ1）又はカルボキシ末端（Ｚ2）におけるｃＭＢＰペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基を意味する。かかる基は当業者にとって公知であり、ペプチドのアミン末端については、好適にはＮ−アシル化基−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＲG（式中、アシル基−（Ｃ＝Ｏ）ＲGはＣ1-6アルキル基及びＣ3-10アリール基から選択されるＲGを有するか、或いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位を含む。）から選択される。好適なＰＥＧ基は、リンカー基（Ｌ）に関して下記に記載される。好ましいかかるＰＥＧ基は、式ＩＡ又はＩＢのバイオモディファイアーである。好ましいかかるアミノ末端ＭIG基は、アセチル、ベンジルオキシカルボニル又はトリフルオロアセチルであり、最も好ましくはアセチルである。
【００２２】
ペプチドのカルボキシ末端についての好適な代謝阻害基には、カルボキサミド、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、アミノアルコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位がある。ｃＭＢＰペプチドのカルボキシ末端アミノ酸残基についての好適なＭIG基は、アミノ酸残基の末端アミンがＣ1-4アルキル基（好ましくはメチル基）でＮ−アルキル化されている場合である。好ましいかかるＭIG基はカルボキサミド又はＰＥＧであり、最も好ましいかかる基はカルボキサミドである。
【００２３】
式Ｉは、（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分がＺ1、Ｚ2又はｃＭＢＰのいずれかに結合し得ることを表している。Ｚ1又はＺ2に関しては、Ｚ1／Ｚ2のいずれかがＭIGである場合、（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分はＭIG基に結合し得る。Ｚ1がＨ又はＺ2がＯＨである場合、Ｚ1又はＺ2位置における（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分の結合は、それぞれ式［ＢｚｐM］−（Ｌ）n−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2又はＺ1−［ｃＭＢＰ］−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物を与える。いずれかのペプチド末端におけるｃＭＢＰの代謝阻害は、（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分をこのように結合することでも達成できるが、（Ｌ）n［ＢｚｐM］は本発明のＭIGの定義範囲外である。
【００２４】
式Ｉの−（Ｌ）n−部分は、式ＩＩのＢｚｐMの任意適宜の位置に結合し得る。−（Ｌ）n−部分は、既存の置換基（例えば、Ｒ1〜Ｒ16基の１つ）に取って代わるか、或いはＢｚｐMの既存の置換基に共有結合する。［ＢＴＭ］−（Ｌ）n−部分は、好ましくはＢｚｐMの既存の置換基に共有結合する。
【００２５】
「ｃＭｅｔ結合環状ペプチド」（ｃＭＢＰ）という用語は、ｃＭｅｔ（ｃ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ、Ｍｅｔレセプター又は肝細胞成長因子レセプター）としても知られる肝細胞成長因子（ＨＧＦ）高親和性レセプターに結合するペプチドを意味する。本発明の好適なｃＭＢＰペプチドは、ｃＭｅｔ／ＨＧＦ複合体のｃＭｅｔに関して約２０ｎＭ未満の見掛けＫＤを有している。ｃＭＢＰペプチドはプロリン残基を含み、かかる残基は主鎖アミド結合のシス／トランス異性化を示し得ることが知られている。本発明のｃＭＢＰペプチドは、任意のかかる異性体を含んでいる。
【００２６】
「生体適合性陽イオン」（Ｂc）という用語は、イオン化して負に帯電した基と共に塩を形成する正に帯電した対イオンを意味する。この場合、前記正に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳類の身体（特に人体）への投与に適している。好適な生体適合性陽イオンの例には、アルカリ金属であるナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属であるカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンがある。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。「生体適合性陰イオン」（Ｊ）という用語は、イオン化して正に帯電した基（この場合にはインドリニウム基）と共に塩を形成する負に帯電した対イオンを意味する。この場合、前記負に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳類の身体（特に人体）への投与に適している。対イオン（Ｊ-）は、モル相当量で存在することでＢｚｐM色素上の正電荷をバランスさせる陰イオンを表す。電荷をバランスさせる量が存在する限り、陰イオン（Ｊ）は好適には単一又は複数の電荷を有する。陰イオンは好適には無機酸又は有機酸から導かれる。好適な陰イオンの例には、塩化物イオン又は臭化物イオンのようなハロゲン化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、クエン酸イオン、酢酸イオン、リン酸イオン及びホウ酸イオンがある。好ましい陰イオンは塩化物イオンである。
【００２７】
「アミノ酸」という用語は、Ｌ−又はＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）或いはアミノ酸模倣体を意味し、これらは天然のもの又は純粋に合成由来のものであってよく、光学的に純粋なもの（即ち、単一の鏡像異性体）、したがってキラルなものであるか、或いは鏡像異性体の混合物であってよい。本明細書中では、アミノ酸に関する通常の三文字略語又は一文字略語が使用される。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋なものである。「アミノ酸模倣体」という用語は、アイソスター（即ち、天然化合物の立体構造及び電子構造を模倣するように設計されたもの）である天然アミノ酸の合成類似体を意味する。かかるアイソスターは当業者にとって公知であり、特に限定されないが、デプシペプチド、レトロ−インベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカン又は１，５−二置換テトラゾールを包含する［Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２４，１３７（１９８５）を参照されたい］。
【００２８】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合（即ち、１つのアミノ酸のアミンを別のアミノ酸のカルボキシルに連結するアミド結合）によって連結された（上記に定義したような）２以上のアミノ酸を含む化合物を意味する。「ペプチド模倣体」又は「模倣体」という用語は、ペプチド又はタンパク質の生物学的活性を模倣するが、化学的性質がペプチド的でない（即ち、いかなるペプチド結合（つまり、アミノ酸間のアミド結合）も含まない）生物学的活性化合物をいう。ここでは、ペプチド模倣体という用語は広い意味で使用され、性質が完全にはペプチド的でない分子（例えば、プソイドペプチド、セミペプチド及びペプトイド）を包含する。
【００２９】
本発明の好適なイメージング剤は、ＢｚｐMが下記式ＩＩａ又は式ＩＩｂを有するものである。
【００３０】
【化４】
【００３１】
式中、Ｘ、ｗ、Ｒ1〜Ｒ13及びＪは式ＩＩに関して定義した通りである。
【００３２】
Ｒ5がＲ6／Ｒ14〜Ｒ16の１つと共に五員又は六員の不飽和脂肪族環、不飽和ヘテロ脂肪族環又は芳香環を形成する場合、好適なかかる芳香環には、フェニル、フラン、チアゾール、ピリジル、ピロール及びピラゾール環がある。好適な不飽和環は、少なくともＲ5が結合したＣ＝Ｃを含んでいる。
【００３３】
Ｒ7及び／又はＲ8がＲ9及び／又はＲ10の一方又は両方と共に五員又は六員のＮ含有複素環又はヘテロアリール環を形成する場合、好適なかかる環には、チアゾール、ピリジル、ピロール及びピラゾール環並びにこれらの部分水素化変種がある。好ましくは、ピリジル又はジヒドロピリジルである。
【００３４】
「スルホン酸置換基」という用語は、式−ＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1はＨ又はＢcであり、Ｂcは（上記に定義したような）生体適合性陽イオンである。）の置換基を意味する。−ＳＯ3Ｍ1置換基は炭素原子に共有結合され、炭素原子はアリール（即ち、Ｒ1又はＲ2が−ＳＯ3Ｍ1である場合のようなスルホアリール）又はアルキル（即ち、スルホアルキル基）であり得る。
【００３５】
式Ｉのリンカー基−（Ａ）m−の役割の１つは、ＢｚｐMをｃＭＢＰペプチドの結合部位から遠ざけることで結合部位との相互作用による立体障害を最小化することにあると想定されている。これは、バルキーな基が結合部位から離れて位置する自由を与えるたわみ性（例えば、単純アルキル鎖）及び／又はＢｚｐMを結合部位から離すように定位させる剛性（例えば、シクロアルキル又はアリールスペーサー）を組み合わせることで達成できる。リンカー基の性質はまた、イメージング剤の生体分布を調整するためにも使用できる。即ち、例えばリンカー中にエーテル基を導入することは、血漿タンパク質結合を最小限に抑えるために役立つ。−（Ａ）m−がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位又は１〜１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖からなる場合、リンカー基はインビボでイメージング剤の薬物動態及び血中クリアランス速度を調整するために機能し得る。かかる「バイオモディファイアー」リンカー基は、バックグラウンド組織（例えば、筋肉又は肝臓）及び／又は血液からのイメージング剤のクリアランスを促進することで、バックグラウンド妨害を少なくして一層良好な診断画像を与えることができる。バイオモディファイアーリンカー基はまた、特定の排泄経路（例えば、肝臓経由ではなく腎臓経由の排泄）を有利にするためにも使用できる。
【００３６】
「糖」という用語は、単糖、二糖又は三糖を意味する。好適な糖には、グルコース、ガラクトース、マルトース、マンノース及びラクトースがある。任意には、アミノ酸への容易なカップリングを可能にするように糖を官能化することができる。即ち、例えばアミノ酸のグルコサミン誘導体は、ペプチド結合を介して他のアミノ酸にコンジュゲートすることができる。（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社から商業的に入手できる）アスパラギンのグルコサミン誘導体はこれの一例である。
【００３７】
【化５】
【００３８】
好ましい特徴
イメージング剤の分子量は、好適には８０００ダルトン以下である。好ましくは、分子量は２８００〜６０００ダルトンの範囲内にあり、最も好ましくは３０００〜４５００ダルトンの範囲内にあり、３２００〜４０００ダルトンが特に好ましい。
【００３９】
本発明の好ましいイメージング剤は、両ペプチド末端がＭIG基によって保護されている。即ち、好ましくはＺ1及びＺ2が共にＭIGであり、これらは通常異なっている。上述の通り、Ｚ1／Ｚ2のいずれかが任意には−（Ｌ）n［ＢｚｐM］を表すことができる。このようにして両ペプチド末端を保護することは、インビボイメージング剤用途にとって重要である。さもないと、急速な代謝の結果としてｃＭｅｔに対する選択的結合親和性の喪失が予想されるからである。Ｚ1及びＺ2が共にＭIGである場合、好ましくはＺ1はアセチルであり、Ｚ2は第一アミドである。最も好ましくは、Ｚ1はアセチルであり、Ｚ2は第一アミドであり、−（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分はｃＭＢＰのリシン残基のε−アミン側鎖に結合している。
【００４０】
本発明の好ましいｃＭＢＰペプチドは、ｃＭｅｔに対する結合に関して（蛍光偏光アッセイ測定結果に基づいて）約１０ｎＭ未満、最も好ましくは５ｎＭ未満のＫDを有し、３ｎＭ未満が理想的である。
【００４１】
下記のように、式ＩのｃＭＢＰのペプチド配列（配列番号１）は１７量体ペプチド配列であり、これが主としてｃＭｅｔに対する選択的結合の原因をなす。
Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
本発明のｃＭＢＰペプチドが１７を超えるアミノ酸残基を含む場合、残りのアミノ酸はシステインは別にして任意のアミノ酸であり得る。追加の保護されないシステイン残基は、定義されたＣｙｓa−Ｃｙｓb及びＣｙｓc−Ｃｙｓdジスルフィドブリッジの不要のスクランブリングを引き起こすことがある。追加のペプチドは、好ましくは−（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分の容易なコンジュゲーションのために適した側鎖を有する１以上のアミノ酸残基を含んでいる。好適なかかる残基としては、アミン官能化−（Ｌ）nＢｚｐM基とのコンジュゲーションのためにはＡｓｐ又はＧｌｕ残基、或いはアミン官能化−（Ｌ）nＢｚｐM基とのコンジュゲーションのためにはＬｙｓ残基がある。−（Ｌ）n［ＢｚｐM］のコンジュゲーションのためのアミノ酸残基は、好適にはｃＭＢＰペプチドの１７量体結合領域（配列番号１）から離れて位置しており、好ましくはＣ末端又はＮ末端に位置している。好ましくは、コンジュゲーションのためのアミノ酸残基はＬｙｓ残基である。
【００４２】
既知のアミノ酸置換体フェニルアラニン及びナフチルアラニンによる配列番号１のトリプトファン残基の置換を評価した。しかし、ｃＭｅｔ親和性の喪失が見出され、これはトリプトファン残基が活性のために重要であることを示唆している。
【００４３】
ｃＭＢＰペプチドは、さらにＮ末端セリン残基を含んで１８量体（配列番号２）を与えることが好ましい。
Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−
Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
配列番号１又は好ましくは配列番号２に加えて、ｃＭＢＰは最も好ましくはさらに下記のいずれかを含んでいる。
（ｉ）Ｃ−又はＮ−ペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、−（Ｌ）nＢｚｐMは前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基のカルボキシル側鎖にコンジュゲートされてアミド結合を与えるアミン基で官能化されている。
（ｉｉ）Ｃ−又はＮ−ペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＬｙｓ残基を含み、−（Ｌ）nＢｚｐMは前記Ｌｙｓ残基のε−アミン側鎖にコンジュゲートされてアミド結合を与えるカルボキシル基で官能化されている。
【００４４】
好ましいｃＭＢＰペプチドは、下記の２２量体アミノ酸配列（配列番号３）を含んでいる。
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｇｌｙ−
Ｔｈｒ
本発明のｃＭＢＰペプチドは、好ましくはＸ3がＡｒｇに等しい。
【００４５】
ｃＭＢＰペプチドは好ましくは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に加えて、さらに−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号４）、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号５）及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−（配列番号６）から選択されるリンカーペプチドをＮ末端又はＣ末端に含んでいる。
【００４６】
リンカーペプチドのＬｙｓ残基は、−（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分のコンジュゲーションのために最も好ましい位置である。特に好ましいｃＭＢＰペプチドは配列番号３を配列番号４のリンカーペプチドと共に含み、下記の２６量体アミノ酸配列（配列番号７）を有している。
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｔｙｒ−Ｃｙｓc−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７のｃＭＢＰペプチドでは、好ましくはＺ1＝Ｚ2＝IGであり、最も好ましくはＺ1＝アセチルかつＺ2＝第一アミドである。
【００４７】
−（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分は、好適にはＺ1又はＺ2のいずれかに結合しているか、或いは配列番号１のｃＭｅｔ結合配列と異なるｃＭＢＰペプチドのアミノ酸残基に結合している。好ましいアミノ酸残基及びコンジュゲーション部位は上述した通りである。−（Ｌ）n［ＢｚｐM］部分がＺ1又はＺ2に結合している場合、それはＮ末端又はＣ末端へのコンジュゲーションによってＺ1又はＺ2に取って代わり、そのようにしてインビボ代謝を阻止することができる。
【００４８】
式Ｉの［ＢｚｐM］−（Ｌ）n−部分は、好ましくは式ＩＩのＢｚｐMのＲ5、Ｒ6、Ｒ14、Ｒ15又はＲ16の位置、さらに好ましくはＲ6、Ｒ14、Ｒ15又はＲ16の位置、最も好ましくはＲ6、Ｒ14又はＲ15の位置に結合している。結合を容易にするため、関連するＲ5、Ｒ6、Ｒ14、Ｒ15又はＲ16置換基は好ましくはＣ1-6カルボキシアルキル、さらに好ましくはＣ3-6カルボキシアルキルである。
【００４９】
ベンゾピリリウム色素（ＢｚｐM）は、好ましくは２以上のスルホン酸置換基、さらに好ましくは２〜６のスルホン酸置換基、最も好ましくは２〜４のスルホン酸置換基を有する。好ましくは、スルホン酸置換基の少なくとも１つはＣ1-4スルホアルキル基である。かかるスルホアルキル基は、好ましくはＲ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ14、Ｒ15又はＲ16の位置にあり、さらに好ましくはＲ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ14又はＲ15の位置にあり、最も好ましくはＲ7及びＲ8の一方又は両方と共にＲ6の位置にある。式ＩＩのスルホアルキル基は、好ましくは式−（ＣＨ2）kＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1はＨ又はＢcであり、ｋは１〜４の値を有する整数であり、Ｂcは（上記に定義したような）生体適合性陽イオンである。）を有する。ｋは好ましくは３又は４である。
【００５０】
式ＩＩ中、ｗは好ましくは１である。Ｒ5は好ましくはＨ又はＣ1-4カルボキシアルキルであり、最も好ましくはＨである。Ｘは好ましくは−ＣＲ14Ｒ15−又は−ＮＲ16−であり、最も好ましくは−ＣＲ14Ｒ15−である。
【００５１】
好ましいＢｚｐM色素は下記式ＩＩＩを有する。
【００５２】
【化６】
【００５３】
式中、Ｙ1、Ｒ1〜Ｒ4、Ｒ6、Ｒ14、Ｒ15及びＪは式ＩＩに関して定義した通りである。
【００５４】
式ＩＩＩの好適な色素は、下記式ＩＩＩａ又はＩＩＩｂを有する。
【００５５】
【化７】
【００５６】
式ＩＩＩ、ＩＩＩａ及びＩＩＩｂの好ましいＲ1〜Ｒ4及びＲ6〜Ｒ13基は、式ＩＩａ及びＩＩｂに関して上記に定義した通りである。式ＩＩＩ、ＩＩＩａ及びＩＩＩｂ中、Ｒ14及びＲ15は好ましくは一方がＲb基でありかつ他方がＲc基であるように選択される。ＲbはＣ1-2アルキル、最も好ましくはメチルである。ＲcはＣ1-4アルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル又はＣ1-4スルホアルキル、好ましくはＣ3-6カルボキシアルキル又は−（ＣＨ2）kＳＯ3Ｍ1（式中、ｋは３又は４であるように選択される。）である。
【００５７】
好ましくは、式ＩＩＩの色素は、ｃＭＢＰへの容易な共有結合を可能にするためにＣ1-6カルボキシアルキル置換基を有する。
【００５８】
式ＩＩ又はＩＩＩ中、Ｒ7及び／又はＲ8がＲ9及び／又はＲ10の一方又は両方と共に五員又は六員のＮ含有複素環又はヘテロアリール環を形成する場合、好ましいかかる環はピリジル又はジヒドロピリジルである。Ｒ8基がＲ10と共に環化された好ましいかかるＹ1基は、下記式Ｙcを有する。
【００５９】
【化８】
【００６０】
Ｒ7及びＲ8基の両方が環化された好ましいかかるＹ1基は、下記式Ｙdを有する。
【００６１】
【化９】
【００６２】
式中、Ｒ7、Ｒ9及びＲ11〜Ｒ13は上記に定義した通りであり、各Ｅ1は独立にＨ又はＣ1-4アルキルである。
【００６３】
式Ｙc中、好ましくは下記の通りである。
各Ｘ1はＣＨ3であり、
Ｒ9＝Ｒ11＝Ｈであり、
Ｒ12はＨであり、
Ｒ12はＣＨ3又は−Ｃ（ＣＨ3）3、さらに好ましくは−Ｃ（ＣＨ3）3である。
【００６４】
式Ｙd中、好ましくは下記の通りである。
Ｒ9はＨであり、
Ｒ12はＨであり、
Ｒ12は好ましくはＣＨ3又は−Ｃ（ＣＨ3）3、さらに好ましくは−Ｃ（ＣＨ3）3である。
【００６５】
式ＩＩＩの−ＮＲ7Ｒ8基は下記のいずれかであることが好ましい。
（ｉ）この基は開鎖形態にある。即ち、Ｒ7／Ｒ8基はＲ9／Ｒ10の一方又は両方と共に環化されていない。好ましいかかるＲ7及びＲ8基は、Ｃ1-4アルキル及びＣ1-4スルホアルキルから独立に選択され、最も好ましくはエチル及びＣ3-4スルホアルキルから独立に選択される。
（ｉｉ）この基は環化されて、式Ｙc又はＹd、さらに好ましくは式Ｙcの環状Ｙ1置換基を生じる。
開鎖形態（ｉ）が最も好ましい。
【００６６】
式ＩＩＩの特に好ましい色素は、下記式ＩＩＩｃ、ＩＩＩｄ又はＩＩＩｅを有する。
【００６７】
【化１０】
【００６８】
式中、
Ｍ1は上記に定義した通りであり、
Ｒ17及びＲ18はＣ1-4アルキル及びＣ1-4スルホアルキルから独立に選択され、
Ｒ19はＨ又はＣ1-4アルキルであり、
Ｒ20はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｒ21はＣ1-4スルホアルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｒ22はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｅ2，Ｅ3及びＥ4は独立にＨ又はＣ1-4アルキルである。
式ＩＩＩｄ、ＩＩＩｅ及びＩＩＩｆの色素は、好ましくはＲ19〜Ｒ22の１以上がＣ1-4スルホアルキルであるように選択される。
【００６９】
式ＩＩＩｄの好ましい特定の色素は、次式のＤＹ−６３１及びＤＹ−６３３である。
【００７０】
【化１１】
【００７１】
式ＩＩＩｅの好ましい特定の色素は、次式のＤＹ−６５２である。
【００７２】
【化１２】
【００７３】
好ましい特定の色素はＤＹ−６３１及びＤＹ−６５２であり、ＤＹ−６５２が最も好ましい。
【００７４】
合成リンカー基（Ｌ）が存在する場合、それは好ましくは［ＢｚｐM］及びＺ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2へのコンジュゲーションを容易にする末端官能基を含む。Ｌが１〜１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖からなる場合、アミノ酸残基は好ましくはグリシン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びセリンから選択される。ＬがＰＥＧ部分からなる場合、それは好ましくは下記式Ｂｉｏ１又はＢｉｏ２の単分散ＰＥＧ様構造のオリゴマー化で導かれる単位を含む。
【００７５】
【化１３】
【００７６】
かかるＰＥＧ様構造は、式Ｂｉｏ１（式中、ｐは１〜１０の整数である。）の１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸であり得る。別法として、式Ｂｉｏ２のプロピオン酸誘導体に基づくＰＥＧ様構造も使用できる。
【００７７】
【化１４】
【００７８】
式中、ｐは式Ｂｉｏ１に関して定義した通りであり、ｑは３〜１５の整数である。式Ｂｉｏ２中、ｐは好ましくは１又は２であり、ｑは好ましくは５〜１２である。
【００７９】
リンカー基がＰＥＧ又はペプチド鎖からなっていない場合、好ましいＬ基は、２〜１０の原子、最も好ましくは２〜５の原子、特に好ましくは２又は３の原子を含む−（Ａ）m−部分を構成する結合原子の主鎖を有している。２つの原子を含む最小リンカー基主鎖は、いかなる望ましくない相互作用も最小限に抑えられるようにイメージング部分を十分に引き離すという利点を与える。
【００８０】
式Ｉ中、ｎは好ましくは０又は１であり、最も好ましくは０である（即ち、いかなるリンカー基も存在しない）。
【００８１】
本発明の好ましいイメージング剤は、下記式ＩＶを有する。
【００８２】
【化１５】
【００８３】
式中、（Ｌ）n［ＢｚｐM］基はＬｙｓ残基のε−アミノ基に結合している。式ＩＶの好ましいイメージング剤では、ＭIG（Ｎ末端Ａｌａ）はアセチルに等しく、ＭIG（Ｃ末端Ｌｙｓ）は第一アミドに等しい。式ＩＶ中、ｎは好ましくはゼロであり、ＢｚｐMは好ましくは式ＩＩＩａ又はＩＩＩｂを有し、さらに好ましくは式ＩＩＩｃ、ＩＩＩｄ又はＩＩＩｅを有し、最も好ましくは特定の色素ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３又はＤＹ−６５２である。式ＩＶ中、最も好ましい特定の色素はＤＹ−６５２である。
【００８４】
本発明の式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドは、
（ｉ）所望のｃＭＢＰペプチドと同じペプチド配列を有し、Ｃｙｓa及びＣｙｓbが保護されておらず、Ｃｙｓc及びＣｙｓd残基がチオール保護基を有する線状ペプチドの固相ペプチド合成を行う段階、
（ｉｉ）段階（ｉ）からのペプチドを塩基水溶液で処理することで、Ｃｙｓa及びＣｙｓbを連結する第１のジスルフィド結合を有する単環式ペプチドを得る段階、並びに
（ｉｉｉ）Ｃｙｓc及びＣｙｓdのチオール保護基を除去して環化することで、Ｃｙｓc及びＣｙｓdを連結する第２のジスルフィド結合を形成し、かくして所望の二環式ペプチド生成物Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2を得る段階
を含んでなる製造方法によって得ることができる。
【００８５】
「保護基」という用語は、望ましくない化学反応を阻止又は抑制するが、分子の残部を変質させない程度に温和な条件下で問題の官能基から脱離させ得るのに十分な反応性を有するように設計された基を意味する。脱保護後には所望の生成物が得られる。アミン保護基は当業者にとって公知であり、好適にはＢｏｃ（ここでＢｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである。）、Ｆｍｏｃ（ここでＦｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニルである。）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［即ち、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］及びＮｐｙｓ（即ち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）から選択される。好適なチオール保護基は、Ｔｒｔ（トリチル）、Ａｃｍ（アセトアミドメチル）、ｔ−Ｂｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、メトキシベンジル、メチルベンジル及びＮｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）である。さらに他の保護基の使用は、‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９１）に記載されている。好ましいアミン保護基はＢｏｃ及びＦｍｏｃであり、最も好ましくはＢｏｃである。好ましいアミン保護基はＴｒｔ及びＡｃｍである。
【００８６】
実施例１及び実施例２は一層具体的な詳細を示している。固相ペプチド合成法のさらなる詳細は、Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ ａｎｄ Ｅ．Ｇｉｒａｌｄ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されている。ｃＭＢＰペプチドは不活性雰囲気下で最もよく貯蔵され、フリーザー内に保存される。溶液として使用する場合、ジスルフィドブリッジのスクランブリングを生じるリスクがあるので、７より高いｐＨは避けるのが最もよい。
【００８７】
イメージング剤は、第３の態様に関して（下記に）記載されるようにして製造できる。
【００８８】
第２の態様では、本発明は、第１の態様のイメージング剤を哺乳類への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬品組成物を提供する。
【００８９】
「生体適合性キャリヤー」は、組成物が生理学的に許容され得るようにして（即ち、毒性又は過度の不快感なしに哺乳類の身体に投与できるようにして）イメージング剤を懸濁又は溶解できる流体（特に液体）である。生体適合性キャリヤーは、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、（有利には注射用の最終生成物が等張性になるように平衡させ得る）食塩水のような水溶液、或いは１種以上の張度調整物質（例えば、生体適合性対イオンを有する血漿陽イオンの塩）、糖（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。好ましくは、生体適合性キャリヤーはパイロジェンフリー注射用水又は等張食塩水である。
【００９０】
イメージング剤及び生体適合性キャリヤーはそれぞれ、注射器又はカニューレによる溶液の追加及び抜取りを許しながら、無菌保全性の維持、さらに任意には不活性ヘッドスペースガス（例えば、窒素又はアルゴン）の維持を可能にする密封容器からなる適当なバイアル又は容器に入れた状態で供給される。好ましいかかる容器は、気密蓋を（通例はアルミニウムからなる）オーバーシールと共にクリンプオン式セプタム封止バイアルである。蓋は、無菌保全性を維持しながら皮下注射針による１回又は数回の穿刺に適したもの（例えば、クリンプオン式セプタムシール蓋）である。かかる容器は、（例えば、ヘッドスペースガスの変更又は溶液のガス抜きのために）所望される場合には蓋が真空に耐え得ると共に、酸素又は水蒸気のような外部大気ガスの侵入を許すことなしに減圧のような圧力変化にも耐え得るという追加の利点を有している。
【００９１】
好ましい複数用量容器は、複数の患者用量を含む（例えば、容積１０〜３０ｃｍ3の）単一のバルクバイアルからなり、したがって臨床的状況に合わせて製剤の実用寿命中に様々な時間間隔で１回分の患者用量を臨床グレードの注射器中に抜き取ることができる。予備充填注射器は１回分のヒト用量又は「単位用量」を含むように設計され、したがって好ましくは臨床用に適した使い捨て注射器又は他の注射器である。本発明の医薬品組成物は、好ましくは１人の患者用に適した用量を有し、上述したような適当な注射器又は容器に入れて供給される。
【００９２】
かかる医薬品組成物は、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤、フィラー、安定剤又は重量オスモル濃度調整剤のような追加賦形剤を任意に含むことができる。「抗菌防腐剤」という用語は、潜在的に有害な微生物（例えば、細菌、酵母又はかび）の増殖を阻止する薬剤を意味する。抗菌防腐剤はまた、使用する用量に応じて多少の殺菌性を示すこともある。本発明の抗菌防腐剤の主な役割は、医薬品組成物中におけるこのような微生物の増殖を阻止することである。しかし、抗菌防腐剤は、任意には投与に先立って前記組成物を製造するために使用されるキットの１種以上の成分中における潜在的に有害な微生物の増殖を阻止するためにも使用できる。好適な抗菌防腐剤には、パラベン類（即ち、メチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン或いはこれらの混合物）、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。好ましい抗菌防腐剤はパラベン類である。
【００９３】
「ｐＨ調整剤」という用語は、組成物のｐＨがヒト又は哺乳類への投与のために許容し得る範囲（およそｐＨ４．０〜１０．５）内にあることを保証するために有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。好適なかかるｐＨ調整剤には、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ［即ち、トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン］のような薬学的に許容し得る緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような薬学的に許容し得る塩基がある。組成物をキットの形態で使用する場合には、ｐＨ調整剤を任意には独立のバイアル又は容器に入れて供給することができ、その結果としてキットのユーザーは多段操作の一部としてｐＨを調整することができる。
【００９４】
「フィラー」という用語は、製造及び凍結乾燥中における材料の取扱いを容易にすることができる薬学的に許容し得る増量剤を意味する。好適なフィラーには、塩化ナトリウムのような無機塩、及びスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性糖又は糖アルコールがある。
【００９５】
第２の態様の医薬品組成物は、無菌製造条件下で（即ち、クリーンルーム内で）製造して所望の無菌で非発熱性の生成物を得ることができる。基本構成部分、特に関連する試薬並びにイメージング剤に接触する装置部品（例えば、バイアル）は無菌であることが好ましい。かかる構成部分及び試薬は、無菌濾過或いは（例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は（例えば、エチレンオキシドによる）化学処理を用いる）終末滅菌をはじめとする、当技術分野で公知の方法によって滅菌できる。一部の構成部分を予め滅菌しておけば、最小数の操作を実施すれば済むので好ましい。しかし、予防策として、医薬品組成物の製造における最終段階として少なくとも無菌濾過段階を含めることが好ましい。
【００９６】
第２の態様の医薬品組成物は、任意には第４の態様に関して下記に記載するようなキットから製造される。
【００９７】
第３の態様では、本発明は、第１の態様のイメージング剤の製造方法であって、
（ｉ）Ｚ1がＨでありかつＺ2がＭIGである式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドを式Ｊ1−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがＺ1位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（ｉｉ）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、ｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドを式Ｊ2−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがｃＭＢＰペプチドの前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基の位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（ｉｉｉ）Ｚ1がＭIGであり、Ｚ3がＺ2基又は活性化エステルであり、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ3のペプチドを式Ｊ2−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがＺ2位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階、及び
（ｉｖ）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、かつｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＬｙｓを含む式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドを式Ｊ1−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがｃＭＢＰペプチドのＬｙｓ残基の位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階
の１つを含んでなり、式中のＺ1、ｃＭＢＰ、Ｚ2、ＭIG、Ｌ、ｎ及びＢｚｐMは第１の態様で定義した通りであり、Ｚ3はＺ2基又は活性化エステルであり、Ｊ1はカルボン酸、活性化エステル、イソチオシアネート基又はチオシアネート基であり、Ｊ2はアミン基である、方法を提供する。
【００９８】
「活性化エステル」又は「活性エステル」という用語は、良好な脱離基であり、したがってアミンのような求核性化合物との一層容易な反応を可能にするように設計されたカルボン酸のエステル誘導体を意味する。好適な活性エステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ペンタフルオロフェノール、ペンタフルオロチオフェノール、ｐ−ニトロフェノール及びヒドロキシベンゾトリアゾールである。好ましい活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はペンタフルオロフェノールエステルである。
【００９９】
Ｊ2は好ましくは第一又は第二アミン基であり、最も好ましくは第一アミン基である。
【０１００】
化合物Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2では、好ましくはＺ1及びＺ2が共にＭIGに等しい。好ましいｃＭＢＰペプチド及びＺ1／Ｚ2基は第１の態様で記載した通りである。詳しくは、第１の態様の好ましいｃＭＢＰペプチドに関して記載した通り、ｃＭＢＰペプチドはコンジュゲーションを容易にするためにＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ残基を含むことが好ましい。段階（ｉｖ）に記載した通り、ｃＭＢＰペプチドはＬｙｓ残基を含むことが特に好ましい。
【０１０１】
Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2の製法は、（上記に）第１の実施形態で記載されている。Ｚ3が活性エステルであるＺ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ3ペプチドは、Ｚ2がＯＨ又は生体適合性陽イオン（Ｂc）であるＺ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2から通常の方法によって製造できる。
【０１０２】
ｃＭＢＰとのコンジュゲーションのため、ＢｚｐMは好適には、ｃＭＢＰペプチドの相補基と反応して色素とｃＭＢＰペプチドとの間に共有結合を形成する反応基又は官能基（Ｇ）を含んでいる。Ｇはペプチドの相補的な官能基と反応し得る反応基（Ｑa）であり得るか、或いは別法としてｃＭＢＰペプチドの反応基と反応し得る官能基を含み得る。反応基及び官能基の例には、活性エステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハロゲン化物、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン、ホスホラミダイト、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボン酸及びチオホスフェートがある。好ましくは、Ｇは反応基（Ｑa）である。Ｑaは好ましくは活性エステルである。
【０１０３】
ｃＭＢＰへのコンジュゲーションに適するように官能化されたベンゾピリリウム色素（ＢｚｐM）は、Ｄｙｏｍｉｃｓ社（Ｄｙｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｗｉｎｚｅｒｌａｅｒ Ｓｔｒ．２Ａ、Ｄ−０７７４５ Ｊｅｎｅ、ドイツ、ｗｗｗ．ｄｙｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）から商業的に入手できる。この場合、反応基（Ｑa）はＮＨＳエステル、マレイミド、アミノ又はカルボン酸である。ベンゾピリリウム色素の合成のために適した前駆体は、米国特許第５４０５９７６号に記載されたようにして製造することもできる。光学レポーター色素をアミノ酸及びペプチドにコンジュゲートする方法は、Ｌｉｃｈａ［Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５７，１０８７−１１０８（２００５）］並びにＦｌａｎａｇａｎ他［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，８，７５１−７５６（１９９７）］、Ｌｉｎ他［ｉｂｉｄ，１３，６０５−６１０（２００２）］及びＺａｈｅｅｒ［Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，１（４），３５４−３６４（２００２）］によって記載されている。リンカー基（Ｌ）をｃＭＢＰペプチドにコンジュゲートする方法は、色素のみをコンジュゲートする方法（上記参照）と類似の化学作用を使用し、当技術分野で公知である。
【０１０４】
第４の態様では、本発明は、第２の態様の医薬品組成物を製造するためのキットであって、当該キットは第１の態様のイメージング剤を無菌固体形態で含んでいて、第２の態様の生体適合性キャリヤーの無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の医薬品組成物が得られるキットを提供する。
【０１０５】
その場合、イメージング剤及び上述したような他の任意賦形剤は、凍結乾燥粉末として適当なバイアル又は容器に入れて供給できる。イメージング剤は、次いで所望の生体適合性キャリヤーを用いて再構成することで、哺乳類への投与が可能な無菌で非発熱性の形態の医薬品組成物を与えるように設計されている。イメージング剤の好ましい無菌固体形態は凍結乾燥固体である。無菌固体形態は、好ましくは医薬品組成物に関して（上記に）記載したような医薬品用容器に入れて供給される。キットを凍結乾燥する場合、配合物は糖類（好ましくはマンニトール、マルトース及びトリシン）から選択される凍結保護剤を任意に含むことができる。
【０１０６】
第５の態様では、本発明は、哺乳類の身体のインビボ光学イメージング方法であって、第１の態様のイメージング剤又は第２の態様の医薬品組成物を用いてインビボでのｃＭｅｔの過剰発現部位又は局在部位の画像を得ることを含んでなる方法を提供する。
【０１０７】
「光学イメージング」という用語は、第１の態様（上記）の場合と同じ意味を有する。第５の態様の哺乳類の身体は、好ましくは人体である。イメージング剤の好ましい実施形態は、第１の態様に関して（上記に）記載した通りである。
【０１０８】
第５の態様の方法では、イメージング剤又は医薬品組成物は、好ましくは前記哺乳類の身体に予め投与されている。「予め投与されている」とは、臨床医の関与の下でイメージング剤を例えば静脈内注射によって患者に投与する段階がイメージングに先立って既に実施されていることを意味する。この実施形態は、ｃＭｅｔが関係している哺乳類の身体の疾患状態のインビボ光学イメージング用の診断剤を製造するための、第１の実施形態のコンジュゲートの使用を含んでいる。
【０１０９】
第５の態様の好ましい光学イメージング方法は、蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）である。ＦＲＩでは、本発明のイメージング剤を診断すべき被験体に投与し、次いで被験体の組織表面を励起光（通常は連続波（ＣＷ）励起）で照明する。光は色素（ＢｚｐM）を励起する。励起光によって生じるイメージング剤からの蛍光を、蛍光検出器を用いて検出する。好ましくは、戻る光を濾光することで蛍光成分を（単独に又は部分的に）分離する。蛍光から画像を形成する。通常、最小限の処理が実施され（寿命、量子収量などの光学パラメーターを計算するためのプロセッサーは使用されない）、画像は蛍光強度をマップする。イメージング剤は、疾患領域に集中して高い蛍光強度を生み出すように設計されている。したがって、疾患領域は蛍光強度画像中に正のコントラストを生み出す。画像は好ましくはＣＣＤカメラ又はチップを用いて取得される結果、リアルタイムイメージングが可能である。
【０１１０】
励起用の波長は、使用する色素の種類に応じて変化する。励起光を発生するための装置は、レーザー（例えば、イオンレーザー、色素レーザー又は半導体レーザー）、ハロゲン光源或いはキセノン光源のような通常の励起光源であり得る。任意には、各種の光学フィルターを用いて最適の励起波長を得ることができる。
【０１１１】
好ましいＦＲＩ方法は下記の段階を含んでなる。即ち、
（ｉ）哺乳類の身体内の検査対象組織表面を励起光で照明する段階、
（ｉｉ）色素（ＢｚｐM）の励起によって生じるイメージング剤からの蛍光を蛍光検出器を用いて検出する段階、
（ｉｉｉ）蛍光検出器によって検出された光を任意に濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（ｉｖ）段階（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の蛍光から前記検査対象組織表面の画像を形成する段階
を含んでいる。段階（ｉ）では、励起光は好ましくは連続波（ＣＷ）の性質を有する。段階（ｉｉｉ）では、検出される光は好ましくは濾光される。特に好ましいＦＲＩ方法は蛍光内視鏡検査である。
【０１１２】
第５の態様の別のイメージング方法は、ＦＤＰＭ（周波数ドメイン光子移動）を使用する。
これは、組織内におけるイメージング剤の検出深度が大きいことが重要である場合、連続波（ＣＷ）方法に比べて利点を有する［Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］。かかる周波数／時間ドメインイメージングのためには、ＢｚｐMが、画像化すべき病変の組織深度及び使用する計装のタイプに応じて変調できる蛍光特性を有するならば有利である。
【０１１３】
ＦＤＰＭ方法は下記のようなものである。即ち、
（ａ）不均質組成を有する前記哺乳類の身体の光散乱性生体組織を、所定の経時変動強度を有する光源からの光に暴露してイメージング剤を励起する段階であって、組織は励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記暴露に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応する複数の値をプロセッサーで確定することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルは組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことで組織の画像を生成する段階
を含んでいる。
【０１１４】
段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくはイメージング剤の取込みに対応し、好ましくはさらにイメージング剤の投与前における組織の吸着係数及び散乱係数に対応する複数の量のマッピングを含んでいる。段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくは蛍光寿命、蛍光量子効率、蛍光収量及びイメージング剤取込みの１以上に対応する。蛍光特性は、好ましくは発光強度に無関係であり、またイメージング剤濃度に無関係である。
【０１１５】
段階（ｃ）の定量化は、好ましくは、（ｉ）値の推定値を設定し、（ｉｉ）推定値の関数として計算発光を求め、（ｉｉｉ）計算発光を前記検出段階の発光と比較して誤差を求め、（ｉｖ）誤差の関数として蛍光特性の修正推定値を得ることを含んでいる。定量化は、好ましくは、組織の多重光散乱挙動をモデル化する数学的関係から値を求めることを含んでいる。第１のオプションの方法は、好ましくはさらに、前記蛍光特性の変動を検出することでインビボでの組織の代謝特性をモニターすることを含んでいる。
【０１１６】
第５の態様の光学イメージングは、好ましくは結腸直腸癌（ＣＲＣ）の管理を容易にするために使用される。「ＣＲＣの管理」という用語は、検出、ステージング、診断、疾患進行のモニタリング又は治療のモニタリングでの使用を意味する。好適な光学イメージング方法のさらなる詳細は、Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ他［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］によって総説されている。
【０１１７】
第６の態様では、本発明は、哺乳類の身体の結腸直腸癌（ＣＲＣ）の検出、ステージング、診断、疾患進行のモニタリング又は治療のモニタリングを行う方法であって、第４の態様のインビボ光学イメージング方法を含んでなる方法を提供する。
【実施例】
【０１１８】
以下に詳述する非限定的な実施例によって本発明を例証する。実施例１は、ｃＭｅｔに対して結合する生物学的標的化ペプチド（ペプチド１）の合成法を示している。実施例２は、本発明のＢｚｐM色素をペプチド（特にペプチド１）にコンジュゲートする方法を示している。実施例３は、本発明のペプチド１のペプチドコンジュゲートがｃＭｅｔに対する親和性を保有すること（即ち、コンジュゲートした色素が生物学的結合及び選択性を妨害しないこと）を実証するデータを示している。ヒト血清アルブミンに対する適切な低い結合及び血漿中での高い安定性が実証された。実施例４は、本発明のペプチドコンジュゲートが結腸直腸癌の動物モデルにおいて有用な腫瘍／バックグラウンド比を示すことを示している。実施例５は本発明の色素に関する予測ソフトウェアの使用を記載しており、本発明の色素がインビボで潜在的に危険な代謝産物を生じないことを実証している。実施例６は化合物６の毒性試験を記載しており、予想される臨床用量がいかなる薬物関連の副作用も生じることなく十分に許容されることを示している。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
ＤＹ−７５２はＤＹ−６５２と同じ環及び置換基パターンを有するが、ＤＹ−６５２のトリメチン結合の代わりにペンタメチン結合（即ち、ｗ＝２及びＲ5＝Ｈ）を有している。
【０１２１】
略語
通常の三文字及び一文字アミノ酸略語を使用する。
Ａｃｍ： アセトアミドメチル
ＡＣＮ： アセトニトリル
Ｂｏｃ： ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＭＦ： Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ： ジメチルスルホキシド
Ｆｍｏｃ： ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＣｌ： 塩酸
ＨＰＬＣ： 高速液体クロマトグラフィー
ＨＳＰｙＵ： Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレン ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
Ｉｌｅ： イソロイシン
ＬＣ−ＭＳ： 液体クロマトグラフィー質量分析法
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
ＮＨＳ： Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＮＭＭ： Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＰ： １−メチル−２−ピロリジノン
Ｐｂｆ： ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホ ニル
ＰＢＳ： リン酸塩緩衝食塩水
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
Ｔｒｔ： トリチル
ＴＳＴＵ： Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウ ロニウムテトラフルオロボレート
実施例１：ペプチド１の合成
下記の配列を有しかつ２つのＣｙｓ−Ｃｙｓ結合（Ｃｙｓ４−１６及びＣｙｓ６−１４）を有する２６量体二環式ペプチドを使用した。
Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2（「ペプチド１」）。
【０１２２】
【化１６】
【０１２３】
段階（ａ）：ペプチド１の保護線状前駆体の合成
前駆体線状ペプチドは下記の配列を有している。
Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−
Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
ＮＨ2。
【０１２４】
０．１ｍｍｏｌのＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｎｏｖａｇｅｌ樹脂から出発するＦｍｏｃ化学を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３３Ａペプチド合成機上でペプチジル樹脂Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ψMe,Meｐｒｏ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ポリマーをアセンブルした。カップリング段階では、（ＨＢＴＵを用いて）予備活性化した過剰量の１ｍｍｏｌアミノ酸を適用した。Ｇｌｕ−Ｔｈｒプソイドプロリン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ０５−２０−１１２２）を配列中に組み込んだ。樹脂を窒素バブラー装置に移し、無水酢酸（１ｍｍｏｌ）及びＮＭＭ（１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した溶液で６０分間処理した。濾過によって無水物溶液を除去し、樹脂をＤＣＭで洗浄してから窒素流下で乾燥した。
【０１２５】
２．５％のＴＩＳ、２．５％の４−チオクレゾール及び２．５％の水を含むＴＦＡ（１０ｍＬ）中で、側鎖保護基の除去及び樹脂からのペプチド切断を２時間３０分にわたり同時に実施した。樹脂を濾過によって取り除き、ＴＦＡを真空中で除去し、残留物にジエチルエーテルを添加した。生じた沈殿をジエチルエーテルで洗浄し、空気乾燥することで、２６４ｍｇの粗ペプチドを得た。
【０１２６】
粗ペプチドを分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３０分）によって精製することで、純粋なペプチド１の線状前駆体１００ｍｇを得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：６．５４分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１４６４．６、ＭＨ22+実測値：１４６５．１）。
【０１２７】
段階（ｂ）：Ｃｙｓ４−１６ジスルフィドブリッジの形成
Ｃｙｓ４−１６；Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2。
【０１２８】
段階（ａ）からの線状前駆体（１００ｍｇ）を５％ＤＭＳＯ／水（２００ｍＬ）に溶解し、アンモニアを用いて溶液をｐＨ６に調整した。反応混合物を５日間撹拌した。次いで、ＴＦＡを用いて溶液をｐＨ２に調整し、大部分の溶媒を真空中での蒸発によって除去した。生成物の精製のため、残留物（４０ｍＬ）を分取ＨＰＬＣカラム上に少しずつ注入した。
【０１２９】
残留物を分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂを１０分間、次いで４０分で０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：４４分）によって精製することで、純粋なペプチド１の単環式前駆体７２ｍｇを得た。（異性体Ｐ１乃至Ｐ３の混合物としての）純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：５．３７分（Ｐ１）、５．６１分（Ｐ２）、６．０５分（Ｐ３））によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１４６３．６、ＭＨ22+実測値：１４６４．１（Ｐ１）、１４６４．４（Ｐ２）、１４６４．３（Ｐ３））。
【０１３０】
段階（ｃ）：Ｃｙｓ６−１４ジスルフィドブリッジの形成（ペプチド１）
段階（ｂ）からの単環式前駆体（７２ｍｇ）を窒素ブランケット下で７５％ＡｃＯＨ／水（７２ｍＬ）に溶解した。１Ｍ ＨＣｌ（７．２ｍＬ）及びＡｃＯＨ中の０．０５Ｍ Ｉ2（４．８ｍＬ）をその順序で添加し、混合物を４５分間撹拌した。１Ｍアスコルビン酸（１ｍＬ）を添加して無色の混合物を得た。大部分の溶媒を真空中で蒸発させ、残留物（１８ｍＬ）を水／０．１％ＴＦＡ（４ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１３１】
残留物を分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂを１０分間、次いで４０分で２０〜３０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：４３〜５３分）によって精製することで、５２ｍｇの純粋なペプチド１を得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：１０分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：６．５４分）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した（ＭＨ22+計算値：１３９１．５、ＭＨ22+実測値：１３９２．５）。
【０１３２】
実施例２：ベンゾピリリウム色素のペプチドコンジュゲートの合成
一般コンジュゲーション方法
実施例１からのペプチド１（４ｍｇ、１．４μｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、ＢｚｐM ＮＨＳエステル（１ｍｇ、１μｍｏｌ）及びｓｙｍ−コリジン（８μＬ、６０μｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液を添加した。反応混合物を（マイクロ波支援により）６０℃で１時間加熱し、次いでＲＴで一晩放置した。次いで、反応混合物を２０％ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ（７ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１３３】
精製及び特性決定
粗ペプチドを分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） ２５０×２１．２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ）によって精製することで、純粋な［ペプチド１］−ＢｚｐMコンジュゲートを得た。純生成物を分析ＨＰＬＣ（勾配：５分で１０〜４０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：０．６ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２） ２０×２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ）によって分析した。さらに、エレクトロスプレー質量分析法を用いて追加の生成物特性決定を実施した。製造した化合物を表３に示す。
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
実施例３：インビトロ蛍光偏光アッセイ
蛍光偏光アッセイを用いて、ｃＭｅｔ標的に対するイメージング剤の結合親和性並びに血漿タンパク質に関する結合特性を検査した。蛍光偏光法の原理を簡単に述べれば、以下の通りである。
【０１３６】
単色光が水平偏光フィルターを通過し、試料中の蛍光分子を励起する。垂直偏光面内に正しく配向した分子のみが光を吸収し、励起され、次いで光を放出する。放出された光を水平面内及び垂直面内で測定する。異方性値（Ａ）は、下記の式に従った光強度の比である。
【０１３７】
【数１】
【０１３８】
蛍光異方性測定は、Ｅｘ６３５／Ｅｍ６７８ｎｍでＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ蛍光偏光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社、米国）を使用しながら、３８４ウェルマイクロプレート中において結合緩衝液（ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）中１０μＬの体積で実施した。色素標識ペプチドの濃度を一定（５ｎＭ）に保つと共に、ヒトｃＭｅｔ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）の濃度を０〜２５０ｎＭの範囲内で変化させた。結合混合物をマイクロプレート中において３０℃で１０分間平衡させた。観察された異方性の変化を下記の式に当てはめた。
【０１３９】
【数２】
【０１４０】
式中、ｒobsは観察された異方性であり、ｒfreeは遊離ペプチドの異方性であり、ｒboundは結合ペプチドの異方性であり、ＫDは解離定数であり、ｃＭｅｔは総ｃＭｅｔ濃度であり、Ｐは総色素標識ペプチド濃度である。この式は、合成ペプチド及びレセプターが溶液中において１：１の化学量論比で可逆複合体を形成することを仮定している。ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェアを用いて非線形回帰によりデータ当てはめを行うことでＫD値（一部位結合）を得た。
【０１４１】
ヒトｃＭｅｔ（Ｆｃキメラ）に対する結合に関して化合物１乃至化合物６を試験した。結果は、ヒトｃＭｅｔに対するすべての試験化合物の結合に関するｎＭ単位のＫDを示している（表４参照）。
【０１４２】
偏光値の変化が小さいことはインビボ用途に適した低い結合性に関連しているので、偏光値の変化を用いてヒト血清アルブミンに対する化合物の結合度を評価した。血漿タンパク質結合度（ＰＰＢ）はＢｉａｃｏｒｅ測定によって確認した。血漿中でのイメージング剤の安定性は、マウス血漿中において３７℃で２時間インキュベートした後に残留する化合物の量を測定することで確認した。
【０１４３】
【表３】
【０１４４】
実施例４：化合物２〜６のインビボ試験
（ａ）動物モデル
この試験では雌のＢＡＬＢ ｃ／Ａヌード（Ｂｏｍ）マウスを使用した。動物の使用は地方倫理委員会によって承認された。ＢＡＬＢ ｃ／Ａヌードは、他のヌードマウス系統に比べてヒト腫瘍に対し高い生着率を有する、同系交配された免疫無防備状態のマウス系統である。マウスは到着時に８週齢であり、試験の開始時には約２０グラムの体重を有していた。動物は、ＨＥＰＡ濾過空気を備えた個別換気ケージ（ＩＶＣ、Ｓｃａｎｂｕｒ ＢＫ社）内に収容した。動物は、“Ｒａｔ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ ｎｒ．３ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ”飼料（Ｓｃａｎｂｕｒ ＢＫ社）及び１ｍＭのモル濃度にＨＣｌを添加して酸性化した水道水（ｐＨ３．０）に随意にアクセスできた。
【０１４５】
結腸癌細胞ＨＴ−２９はヒト結腸癌腫から導かれ、Ｚｅｎｇ他［Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，２１，４０９−４１７（２００４）］によればｃＭｅｔを発現することが報告されている。この細胞株は、ヌードマウスに皮下接種した場合に腫瘍を形成することが判明した［Ｆｌａｔｍａｒｋ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４０，１５９３−１５９８（２００４）］。
【０１４６】
１０％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＭｃＣｏｙ’ｓ ５ａ培地（Ｓｉｇｍａ ＃Ｍ８４０３）中でＨＴ−２９細胞を増殖させた。継代数４（Ｐ４）で保存株を作成し、５％ＤＭＳＯを含むそれぞれの培地中における１０7細胞／バイアルの量を液体窒素中で凍結して貯蔵した。移植当日、細胞を３７℃の水浴中で急速に解凍し（約２分間）、洗浄し、ＰＢＳ／２％血清中に再懸濁した（１２００ｒｐｍで１０分間の遠心）。投与用注射器中に細胞を吸引する際には、常にバイアル内の細胞を完全に混合してから行った。ファインボア注射針（２５Ｇ）を用いて０．１ｍｌの量の細胞懸濁液を肩及び背中に皮下注射した。次いで、動物をケージに戻し、腫瘍を１３〜１７日間増殖させた。動物には、５日以上の順化期間を置いてから接種処置を施した。
【０１４７】
（ｂ）処置
すべての試験物質は、凍結乾燥粉末からＰＢＳを用いて再構成した。白色プリンター用紙の小さな堆積物をイメージ化してフラットフィールド画像を得、これを用いて照明の不均一性を補正した。光学イメージング処置中の不動化のため、酸素をキャリヤーガスとするイソフルラン（通例１．３〜２％）により、動物を同軸オープンマスク内で軽い外科レベル麻酔に麻酔した。動物を麻酔している間に、外科用鉗子及び微小はさみを用いて腫瘍及び隣接する筋肉の部分から小さい皮膚片（３〜５ｍｍ）を取り除いた。これは、上方に位置する皮膚組織の妨害なしに腫瘍及び筋肉からの信号を測定するために行った。創傷は、液状の非蛍光性スプレー包帯（３Ｍ社、米国ミネソタ州）を適用することで覆った。
【０１４８】
動物下方の空気圧センサー及び直腸温度プローブを用いるＢｉｏＶｅｔシステム（ｍ２ｍ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，米国ニュージャージー州）によって動物の呼吸及び体温をモニターした。ＢｉｏＶｅｔシステムはまた、イメージング処置期間（２時間）中に正常体温を維持するため、加熱マットセットを用いて４０℃に外部加熱することを可能にした。造影剤投与のため、尾静脈中にＶｅｎｆｌｏｎカテーテルを配置した。各動物に１回の造影剤注射を施した。注射量は０．１ｍｌの試験化合物であり、その直後に０．２ｍｌの食塩水フラッシュを行った。注射の直前に蛍光画像を取得し、次いで２時間にわたり３０秒ごとに取得した。
【０１４９】
（ｃ）イメージング
イメージングは、光源を用いてレポーターを励起しかつ濾光系を用いて蛍光成分を抽出するように改造した臨床用腹腔鏡を通して実施した。レポーター分子の励起のためには６３５ｎｍレーザーを使用した。検出器としてはＨａｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ ＥＲＧ ＣＣＤカメラを使用した。カメラは利得０の２×２ビンニングモードで動作させた。結腸イメージング用の標準露光時間は４秒であった。画像中の強度分布は、システム較正データにより、照明の不均一性について補正した。露出腫瘍及び正常筋肉バックグラウンドの上方に位置する検査対象領域から標的／バックグラウンド比を計算した。
【０１５０】
（ｄ）結果
試験化合物は、下記の平均腫瘍：筋肉比を有していた（表５）。
【０１５１】
【表４】
【０１５２】
実施例５：代謝及び毒性予測
Ｌｈａｓａ Ｌｔｄ（２２−２３ Ｂｌｅｎｈｅｉｍ Ｔｅｒｒａｃｅ，Ｌｅｅｄｓ ＬＳ２ ９ＨＤ，英国）からソフトウェアツールＤｅｒｅｋ及びＭｅｔｅｏｒを入手した。Ｄｅｒｅｋは、既知の構造依存毒性に基づいて新しい化学的実在物の毒性を予測するために使用される。同様に、Ｍｅｔｅｏｒは新規化学物質から生じ得る代謝産物を予測する。両ツールは、化合物に関する公表データ及び未公表（だが確認済みの）データに基づいている。色素ＤＹ−６５２の化学構造を入力した。インビボでの潜在的に危険な代謝産物は予測されなかった。
【０１５３】
実施例６：化合物６の毒性試験
前臨床イメージング用量（５０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）の１００倍での化合物６の許容性を調べるため、限定急性用量毒性試験を行った。雄ラットに化合物を静脈内注射し、注射後（ｐ．ｉ．）１日目、１４日目、２１日目及び２８日目に屠殺した。検死時に、主要器官の肉眼的病理状態を検査し、以後の組織形態学的評価のために腎臓を中性緩衝ホルマリン中に採取した。注射直後には皮膚の弱い青色着色及び尿の中等度の青色着色が認められたが、注射後１日以内に消失した。検死時には、腎臓は注射後１日目で全般的に緑色であった。光学顕微鏡検査によれば、腎臓には化合物６に関連する所見は見られなかった。見られた他の小変化は偶発的なものであり、若い実験用ラット成体では普通のものであった。腎臓における血管の強い蛍光染色が注射後１日目に認められた。染色は注射後１４日目までに減少し、注射後２１日目には対照と識別できなかった。
【０１５４】
いずれの処理動物でも変性、壊死又は炎症の形跡は認められず、これは化合物の腎毒性が低いことを示唆している。予想される臨床用量の１００倍で雄ラットに化合物６を１回だけ静脈内投与することは、いかなる薬物関連の副作用も生じることなく十分に許容されるという結論が得られた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉのコンジュゲートを含んでなるイメージング剤。
【化１】
（式中、
Ｚ1はｃＭＢＰのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭIGであり、
Ｚ2はｃＭＢＰのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢc（式中、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）又はＭIGであり、
ｃＭＢＰは、下記のアミノ酸配列（配列番号１）を含む１７〜３０のアミノ酸のｃＭｅｔ結合環状ペプチドであり、
Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
（式中、Ｘ1はＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＴｙｒであり、Ｘ2はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｓｎであり、Ｘ3はＴｈｒ又はＡｒｇであり、Ｘ4はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ5はＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ6はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｃｙｓa-dの各々はシステイン残基であって、残基ａ及びｂ並びに残基ｃ及びｄは環化して２つの独立したジスルフィド結合を形成している。）
ＭIGは、ペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基である代謝阻害基であり、
Ｌは式−（Ａ）m−（式中、各Ａは独立に−ＣＲ2−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ2−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ2ＮＲ−、−ＮＲＳＯ2−、−ＣＲ2ＯＣＲ2−、−ＣＲ2ＳＣＲ2−、−ＣＲ2ＮＲＣＲ2−、Ｃ4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基又はＣ3-12ヘテロアリーレン基、或いはアミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4アルケニル、Ｃ2-4アルキニル、Ｃ1-4アルコキシアルキル及びＣ1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。）の合成リンカー基であり、
ｎは０又は１の値を有する整数であり、
ＢｚｐMは下記式ＩＩのベンゾピリリウム色素である。
【化２】
（式中、
Ｙ1は下記式Ｙa又はＹbの基であり、
【化３】
Ｒ1〜Ｒ4及びＲ9〜Ｒ13はＨ、−ＳＯ3Ｍ1（式中、各Ｍ1は独立にＨ又はＢcである。）、Ｈａｌ、Ｒa及びＣ3-12アリールから独立に選択され、
Ｒ5はＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ3-12アリールスルホニル又はＣｌであり、或いは任意にはＲ6、Ｒ14、Ｒ15又はＲ16の１つと共に五員又は六員の不飽和脂肪族環、不飽和ヘテロ脂肪族環又は芳香環を形成でき、
Ｒ6及びＲ16は独立にＲa基であり、
Ｒ7及びＲ8は独立にＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル又はＣ1-6ヒドロキシアルキルであり、或いは任意にはＲ9及び／又はＲ10の一方又は両方と共に五員又は六員のＮ含有複素環又はヘテロアリール環を形成でき、
Ｘは−ＣＲ14Ｒ15−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＮＲ16−又は−ＣＨ＝ＣＨ−（式中、Ｒ14〜Ｒ16は独立にＲa基である。）であり、
ＲaはＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル又はＣ1-6ヒドロキシアルキルであり、
ｗは１又は２であり、
Ｊは生体適合性陰イオンであり、
ＢｚｐMはＲ1〜Ｒ16基から選択される１以上のスルホン酸置換基を含むことを条件とする。））
【請求項２】
配列番号１に加えて、ｃＭＢＰがさらにＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、（Ｌ）n［ＢｚｐM］が前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基のカルボキシル側鎖にコンジュゲートされてアミド結合を与えるアミン基で官能化されている、請求項１記載のイメージング剤。
【請求項３】
配列番号１に加えて、ｃＭＢＰがさらにＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＬｙｓ残基を含み、（Ｌ）n［ＢｚｐM］が前記Ｌｙｓ残基のε−アミン側鎖にコンジュゲートされてアミド結合を与えるカルボキシル基で官能化されている、請求項１又は請求項２記載のイメージング剤。
【請求項４】
ｃＭＢＰが下記配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のイメージング剤。
Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−
Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6（配列番号２）
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｇｌｙ−
Ｔｈｒ（配列番号３）
【請求項５】
Ｘ3がＡｒｇである、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２又は配列番号３に加えて、ｃＭＢＰがさらに−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号４）、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号５）及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−（配列番号６）から選択されるリンカーペプチドをＮ末端又はＣ末端に含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項７】
ｃＭＢＰが下記のアミノ酸配列（配列番号７）を有する、請求項６記載のイメージング剤。
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｔｙｒ−Ｃｙｓc−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
【請求項８】
Ｚ1及びＺ2の両方が独立にＭIGである、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項９】
Ｚ1がアセチルであり、Ｚ2が第一アミドである、請求項８記載のイメージング剤。
【請求項１０】
ｎが０である、請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項１１】
ＢｚｐMが下記式ＩＩａを有する、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【化４】
【請求項１２】
ＢｚｐMが下記式ＩＩｂを有する、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【化５】
【請求項１３】
ＢｚｐMが２〜４のスルホン酸置換基を含む、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項１４】
ＢｚｐMが１以上のＣ1-4スルホアルキル置換基を含む、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項１５】
ＢｚｐMが下記式ＩＩＩを有する、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【化６】
（式中、Ｙ1、Ｒ1〜Ｒ4、Ｒ6、Ｒ14、Ｒ15及びＪは請求項１に定義した通りである。）
【請求項１６】
下記式ＩＩＩｃ、ＩＩＩｄ又はＩＩＩｅを有する、請求項１５記載のイメージング剤。
【化７】
（式中、
Ｍ1はＨ又はＢc（式中、Ｂcは請求項１に定義した通りである。）であり、
Ｒ17及びＲ18は独立にＣ1-4アルキル及びＣ1-4スルホアルキルから選択され、
Ｒ19はＨ又はＣ1-4アルキルであり、
Ｒ20はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｒ21はＣ1-4スルホアルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｒ22はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｅ2、Ｅ3及びＥ4は独立にＨ又はＣ1-4アルキルである。）
【請求項１７】
ｃＭＢＰが請求項７に定義した通りであり、Ｚ1及びＺ2が請求項９に定義した通りであり、ＢｚｐMが請求項１１乃至請求項１６のいずれか１項に定義した通りである、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項１８】
請求項１乃至請求項１７のいずれか１項に記載のイメージング剤を、哺乳類への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬品組成物。
【請求項１９】
１人の患者用に適した用量を有し、適当な注射器又は容器に入れて供給される、請求項１８記載の医薬品組成物。
【請求項２０】
請求項１乃至請求項１７記載のイメージング剤の製造方法であって、
（ｉ）Ｚ1がＨでありかつＺ2がＭIGである式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドを式Ｊ1−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがＺ1位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（ｉｉ）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、ｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドを式Ｊ1−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがｃＭＢＰペプチドの前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基の位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（ｉｉｉ）Ｚ1がＭIGであり、Ｚ3がＺ2基又は活性化エステルであり、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ3のペプチドを式Ｊ2−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがＺ2位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階、及び
（ｉｖ）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、かつｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＬｙｓを含む式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドを式Ｊ1−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがｃＭＢＰペプチドのＬｙｓ残基の位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階
の１つを含んでなり、式中のＺ1、ｃＭＢＰ、Ｚ2、ＭIG、Ｌ、ｎ及びＢｚｐMは請求項１に定義した通りであり、Ｚ3はＺ2基又は活性化エステルであり、Ｊ1はカルボン酸、活性化エステル、イソチオシアネート基又はチオシアネート基であり、Ｊ2はアミン基である、方法。
【請求項２１】
段階（ｉｖ）の反応が使用される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１８又は請求項１９記載の医薬品組成物を製造するためのキットであって、当該キットは請求項１乃至請求項１７記載のイメージング剤を無菌固体形態で含んでいて、請求項１８又は請求項１９に定義された生体適合性キャリヤーの無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の医薬品組成物が得られる、キット。
【請求項２３】
無菌固体形態が凍結乾燥固体である、請求項２２記載のキット。
【請求項２４】
哺乳類の身体のインビボ光学イメージング方法であって、請求項１乃至請求項１７記載のイメージング剤或いは請求項１８又は請求項１９記載の医薬品組成物を用いてインビボでｃＭｅｔの過剰発現部位又は局在部位の画像を得ることを含んでなる方法。
【請求項２５】
請求項１乃至請求項１７記載のイメージング剤或いは請求項１８又は請求項１９記載の医薬品組成物が前記哺乳類の身体に予め投与されている、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法であって、
（ｉ）哺乳類の身体内の検査対象組織表面を励起光で照明する段階、
（ｉｉ）ＢｚｐMの励起によって生じるイメージング剤からの蛍光を蛍光検出器を用いて検出する段階、
（ｉｉｉ）蛍光検出器によって検出された光を任意に濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（ｉｖ）段階（ｉｉ）又は段階（ｉｉｉ）の蛍光から前記検査対象組織表面の画像を形成する段階
を含んでなる方法。
【請求項２７】
段階（ｉ）の励起光が連続波（ＣＷ）の性質を有する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項２５記載の方法であって、
（ａ）不均質組成を有する前記哺乳類の身体の光散乱性生体組織を、所定の経時変動強度を有する光源からの光に暴露してイメージング剤を励起する段階であって、組織が励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記暴露に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応する複数の値をプロセッサーで確定することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルが組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことで組織の画像を生成する段階
を含んでなる方法。
【請求項２９】
光学イメージング方法が蛍光内視鏡検査からなる、請求項２４乃至請求項２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
インビボ光学イメージングが、結腸直腸癌（ＣＲＣ）の検出、ステージング、診断、疾患進行のモニタリング又は治療のモニタリングを支援するために使用される、請求項２４乃至請求項２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
哺乳類の身体の結腸直腸癌（ＣＲＣ）の検出、ステージング、診断、疾患進行のモニタリング又は治療のモニタリングを行う方法であって、請求項２４乃至請求項２９のいずれか１項記載のインビボ光学イメージング方法を含んでなる方法。
【請求項１】
下記式Ｉのコンジュゲートを含んでなるイメージング剤。
【化１】
（式中、
Ｚ1はｃＭＢＰのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭIGであり、
Ｚ2はｃＭＢＰのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢc（式中、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）又はＭIGであり、
ｃＭＢＰは、下記のアミノ酸配列（配列番号１）を含む１７〜３０のアミノ酸のｃＭｅｔ結合環状ペプチドであり、
Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6
（式中、Ｘ1はＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＴｙｒであり、Ｘ2はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｓｎであり、Ｘ3はＴｈｒ又はＡｒｇであり、Ｘ4はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ5はＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ6はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｃｙｓa-dの各々はシステイン残基であって、残基ａ及びｂ並びに残基ｃ及びｄは環化して２つの独立したジスルフィド結合を形成している。）
ＭIGは、ペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基である代謝阻害基であり、
Ｌは式−（Ａ）m−（式中、各Ａは独立に−ＣＲ2−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ2−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ2ＮＲ−、−ＮＲＳＯ2−、−ＣＲ2ＯＣＲ2−、−ＣＲ2ＳＣＲ2−、−ＣＲ2ＮＲＣＲ2−、Ｃ4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基又はＣ3-12ヘテロアリーレン基、或いはアミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4アルケニル、Ｃ2-4アルキニル、Ｃ1-4アルコキシアルキル及びＣ1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。）の合成リンカー基であり、
ｎは０又は１の値を有する整数であり、
ＢｚｐMは下記式ＩＩのベンゾピリリウム色素である。
【化２】
（式中、
Ｙ1は下記式Ｙa又はＹbの基であり、
【化３】
Ｒ1〜Ｒ4及びＲ9〜Ｒ13はＨ、−ＳＯ3Ｍ1（式中、各Ｍ1は独立にＨ又はＢcである。）、Ｈａｌ、Ｒa及びＣ3-12アリールから独立に選択され、
Ｒ5はＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ3-12アリールスルホニル又はＣｌであり、或いは任意にはＲ6、Ｒ14、Ｒ15又はＲ16の１つと共に五員又は六員の不飽和脂肪族環、不飽和ヘテロ脂肪族環又は芳香環を形成でき、
Ｒ6及びＲ16は独立にＲa基であり、
Ｒ7及びＲ8は独立にＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル又はＣ1-6ヒドロキシアルキルであり、或いは任意にはＲ9及び／又はＲ10の一方又は両方と共に五員又は六員のＮ含有複素環又はヘテロアリール環を形成でき、
Ｘは−ＣＲ14Ｒ15−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＮＲ16−又は−ＣＨ＝ＣＨ−（式中、Ｒ14〜Ｒ16は独立にＲa基である。）であり、
ＲaはＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル又はＣ1-6ヒドロキシアルキルであり、
ｗは１又は２であり、
Ｊは生体適合性陰イオンであり、
ＢｚｐMはＲ1〜Ｒ16基から選択される１以上のスルホン酸置換基を含むことを条件とする。））
【請求項２】
配列番号１に加えて、ｃＭＢＰがさらにＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、（Ｌ）n［ＢｚｐM］が前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基のカルボキシル側鎖にコンジュゲートされてアミド結合を与えるアミン基で官能化されている、請求項１記載のイメージング剤。
【請求項３】
配列番号１に加えて、ｃＭＢＰがさらにＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＬｙｓ残基を含み、（Ｌ）n［ＢｚｐM］が前記Ｌｙｓ残基のε−アミン側鎖にコンジュゲートされてアミド結合を与えるカルボキシル基で官能化されている、請求項１又は請求項２記載のイメージング剤。
【請求項４】
ｃＭＢＰが下記配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のイメージング剤。
Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−
Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6（配列番号２）
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｇｌｙ−
Ｔｈｒ（配列番号３）
【請求項５】
Ｘ3がＡｒｇである、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２又は配列番号３に加えて、ｃＭＢＰがさらに−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号４）、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号５）及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−（配列番号６）から選択されるリンカーペプチドをＮ末端又はＣ末端に含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項７】
ｃＭＢＰが下記のアミノ酸配列（配列番号７）を有する、請求項６記載のイメージング剤。
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｔｙｒ−Ｃｙｓc−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
【請求項８】
Ｚ1及びＺ2の両方が独立にＭIGである、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項９】
Ｚ1がアセチルであり、Ｚ2が第一アミドである、請求項８記載のイメージング剤。
【請求項１０】
ｎが０である、請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項１１】
ＢｚｐMが下記式ＩＩａを有する、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【化４】
【請求項１２】
ＢｚｐMが下記式ＩＩｂを有する、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【化５】
【請求項１３】
ＢｚｐMが２〜４のスルホン酸置換基を含む、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項１４】
ＢｚｐMが１以上のＣ1-4スルホアルキル置換基を含む、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項１５】
ＢｚｐMが下記式ＩＩＩを有する、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【化６】
（式中、Ｙ1、Ｒ1〜Ｒ4、Ｒ6、Ｒ14、Ｒ15及びＪは請求項１に定義した通りである。）
【請求項１６】
下記式ＩＩＩｃ、ＩＩＩｄ又はＩＩＩｅを有する、請求項１５記載のイメージング剤。
【化７】
（式中、
Ｍ1はＨ又はＢc（式中、Ｂcは請求項１に定義した通りである。）であり、
Ｒ17及びＲ18は独立にＣ1-4アルキル及びＣ1-4スルホアルキルから選択され、
Ｒ19はＨ又はＣ1-4アルキルであり、
Ｒ20はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｒ21はＣ1-4スルホアルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｒ22はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｅ2、Ｅ3及びＥ4は独立にＨ又はＣ1-4アルキルである。）
【請求項１７】
ｃＭＢＰが請求項７に定義した通りであり、Ｚ1及びＺ2が請求項９に定義した通りであり、ＢｚｐMが請求項１１乃至請求項１６のいずれか１項に定義した通りである、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項に記載のイメージング剤。
【請求項１８】
請求項１乃至請求項１７のいずれか１項に記載のイメージング剤を、哺乳類への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬品組成物。
【請求項１９】
１人の患者用に適した用量を有し、適当な注射器又は容器に入れて供給される、請求項１８記載の医薬品組成物。
【請求項２０】
請求項１乃至請求項１７記載のイメージング剤の製造方法であって、
（ｉ）Ｚ1がＨでありかつＺ2がＭIGである式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドを式Ｊ1−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがＺ1位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（ｉｉ）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、ｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を含み、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドを式Ｊ1−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがｃＭＢＰペプチドの前記Ａｓｐ又はＧｌｕ残基の位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階、
（ｉｉｉ）Ｚ1がＭIGであり、Ｚ3がＺ2基又は活性化エステルであり、かつｃＭＢＰペプチドの他のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のすべてが保護されている式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ3のペプチドを式Ｊ2−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがＺ2位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階、及び
（ｉｖ）Ｚ1＝Ｚ2＝ＭIGであり、かつｃＭＢＰがＣ−又はＮ−ｃＭＢＰペプチド末端の４つのアミノ酸残基中にＬｙｓを含む式Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2のペプチドを式Ｊ1−（Ｌ）n−［ＢｚｐM］の化合物と反応させることで、ＢｚｐMがｃＭＢＰペプチドのＬｙｓ残基の位置にコンジュゲートされた式Ｉのイメージング剤を得る段階
の１つを含んでなり、式中のＺ1、ｃＭＢＰ、Ｚ2、ＭIG、Ｌ、ｎ及びＢｚｐMは請求項１に定義した通りであり、Ｚ3はＺ2基又は活性化エステルであり、Ｊ1はカルボン酸、活性化エステル、イソチオシアネート基又はチオシアネート基であり、Ｊ2はアミン基である、方法。
【請求項２１】
段階（ｉｖ）の反応が使用される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１８又は請求項１９記載の医薬品組成物を製造するためのキットであって、当該キットは請求項１乃至請求項１７記載のイメージング剤を無菌固体形態で含んでいて、請求項１８又は請求項１９に定義された生体適合性キャリヤーの無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の医薬品組成物が得られる、キット。
【請求項２３】
無菌固体形態が凍結乾燥固体である、請求項２２記載のキット。
【請求項２４】
哺乳類の身体のインビボ光学イメージング方法であって、請求項１乃至請求項１７記載のイメージング剤或いは請求項１８又は請求項１９記載の医薬品組成物を用いてインビボでｃＭｅｔの過剰発現部位又は局在部位の画像を得ることを含んでなる方法。
【請求項２５】
請求項１乃至請求項１７記載のイメージング剤或いは請求項１８又は請求項１９記載の医薬品組成物が前記哺乳類の身体に予め投与されている、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法であって、
（ｉ）哺乳類の身体内の検査対象組織表面を励起光で照明する段階、
（ｉｉ）ＢｚｐMの励起によって生じるイメージング剤からの蛍光を蛍光検出器を用いて検出する段階、
（ｉｉｉ）蛍光検出器によって検出された光を任意に濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（ｉｖ）段階（ｉｉ）又は段階（ｉｉｉ）の蛍光から前記検査対象組織表面の画像を形成する段階
を含んでなる方法。
【請求項２７】
段階（ｉ）の励起光が連続波（ＣＷ）の性質を有する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項２５記載の方法であって、
（ａ）不均質組成を有する前記哺乳類の身体の光散乱性生体組織を、所定の経時変動強度を有する光源からの光に暴露してイメージング剤を励起する段階であって、組織が励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記暴露に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応する複数の値をプロセッサーで確定することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルが組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことで組織の画像を生成する段階
を含んでなる方法。
【請求項２９】
光学イメージング方法が蛍光内視鏡検査からなる、請求項２４乃至請求項２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
インビボ光学イメージングが、結腸直腸癌（ＣＲＣ）の検出、ステージング、診断、疾患進行のモニタリング又は治療のモニタリングを支援するために使用される、請求項２４乃至請求項２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
哺乳類の身体の結腸直腸癌（ＣＲＣ）の検出、ステージング、診断、疾患進行のモニタリング又は治療のモニタリングを行う方法であって、請求項２４乃至請求項２９のいずれか１項記載のインビボ光学イメージング方法を含んでなる方法。
【公表番号】特表２０１０−５３４７１１（Ｐ２０１０−５３４７１１Ａ）
【公表日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１８６５１（Ｐ２０１０−５１８６５１）
【出願日】平成２０年７月２９日（２００８．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５９９４１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１６１８０
【国際公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（３０５０４０７１０）ジーイー・ヘルスケア・リミテッド (99)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２９日（２００８．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５９９４１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１６１８０
【国際公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（３０５０４０７１０）ジーイー・ヘルスケア・リミテッド (99)
【Ｆターム（参考）】
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