ペプチドリガンドを介して結合された複数の免疫原性成分を有するＨＢＶコア抗原粒子
【課題】複数の免疫原特異性により特徴付けられるHBVコア抗原粒子を提供すること。
【解決手段】複数の免疫原特異性により特徴付けられるHBVコア抗原粒子。より具体的には、HBVコアタンパク質に選択的に結合するHBVキャプシド結合ペプチドであるリガンドによって架橋された、免疫原、エピトープまたは他の関連構造を含むHBVコア抗原粒子。このような粒子の、多様な範囲の免疫原性エピトープ（HBVキャプシド結合ペプチドを含む）のための送達系としての使用。同じHBVコア粒子に架橋された、異なる免疫原および／またはキャプシド結合ペプチドリガンドの混合物。このような複数成分のまたは多価のHBVコア粒子の治療的または予防的なワクチンおよび組成物、ならびにそれらを用いた診断組成物および診断方法。
【解決手段】複数の免疫原特異性により特徴付けられるHBVコア抗原粒子。より具体的には、HBVコアタンパク質に選択的に結合するHBVキャプシド結合ペプチドであるリガンドによって架橋された、免疫原、エピトープまたは他の関連構造を含むHBVコア抗原粒子。このような粒子の、多様な範囲の免疫原性エピトープ（HBVキャプシド結合ペプチドを含む）のための送達系としての使用。同じHBVコア粒子に架橋された、異なる免疫原および／またはキャプシド結合ペプチドリガンドの混合物。このような複数成分のまたは多価のHBVコア粒子の治療的または予防的なワクチンおよび組成物、ならびにそれらを用いた診断組成物および診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、複数の免疫原特異性により特徴付けられる、Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）コア抗原粒子に関する。より具体的には、本発明は、ＨＢＶコアタンパク質に選択的に結合するＨＢＶキャプシド結合ペプチドであるリガンドによって、ＨＢＶコア抗原粒子に架橋した免疫原、エピトープ、または他の関連する構造を含む、ＨＢＶコア抗原粒子に関する。このような粒子は、さまざまな範囲の免疫原性エピトープ（ＨＢＶキャプシド結合ペプチドを含み、これはまた、ＨＢＶコアタンパク質とＨＢＶ表面タンパク質との間の相互作用をブロックすることにより、有利には、ＨＢＶウイルスのアセンブリを阻害および妨害する）のための送達系として使用され得る。異なる免疫原、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドリガンド、または両方の混合物は、同じＨＢＶコア粒子に架橋され得る。このように生じる多成分ＨＢＶコア粒子または多価ＨＢＶコア粒子は、治療用および予防用のワクチンおよび組成物、ならびに治療組成物およびこれらを使用する方法において、有利に使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
臨床的免疫療法レジメンの第一線は、感染性病原体および他の健康を脅かす因子に対して患者を免疫することを含む。過剰の免疫剤にかかわらず、接種は、せいぜい部分的な免疫を与え得、頻繁な再免疫を必要とする。種々の従来の一価または多価のワクチンは、こういう事情である。そしてこのようなワクチンのうちでさえ、種々の免疫原に対して免疫を惹起し得る単一薬剤の接種剤の数は、限定される。さらに、病原体間の抗原性変動は、従来のワクチンの効力を制限し得る。
【０００３】
このような妨害のために、所与の免疫原に対する免疫系応答の増強のための方法論に、努力が集中されてきた。この目的のために、ＨＢＶ核抗原のＴ細胞依存性決定因子およびＴ細胞非依存性決定因子の操作により架橋した免疫原の免疫性を増強させようと努力して、免疫原性結合体が、免疫原をＢ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）コア粒子（ヌクレオキャプシドまたはヌクレオキャプシド殻とも呼ばれる）に架橋させることによって生成された。例えば、米国特許第４，８１８，５２７号およびＲ．Ｕｌｒｉｃｈら、「Ｃｏｒｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ ａｓ Ｃａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ」、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ．Ｒｅｓ．、５０、１４１〜８２頁（１９９８）を参照のこと。目的のエピトープの増強された免疫原性もまた、少なくとも一部の天然に存在するウイルス粒子形成タンパク質（例えばＨＢＶ表面抗原）および１つ以上の目的のエピトープ部位を含む、ハイブリッドウイルス粒子形成タンパク質を介して、取りかかられた。米国特許第５，９６５，１４０号を参照のこと。このような努力から明らかであるように、ＨＢＶのタンパク質は、目的の免疫原を免疫系に提示するためのプラットフォームとして使用されてきた。
【０００４】
Ｂ型肝炎ウイルスは、血行性ウイルスであり、小さな、部分的に二本鎖のＤＮＡゲノムを含み（４つの広範囲にわたってオーバーラップするオープンリーディングフレームを担持する）内部ヌクレオキャプシドからなり（ＨＢＶコアタンパク質（「ＨＢｃＡｇ」）、ウイルスポリメラーゼおよびウイルスＤＮＡを含む）ＨＢＶ表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）を含む膜性エンベロープにより包囲されている。そのウイルスエンベロープは、３つの異なるが、関連する表面抗原タンパク質（長（Ｌ）、中（Ｍ）および短（Ｓ））を含み、これは、共通のカルボキシ末端領域を共有するが、異なるアミノ末端を有し、連続するオープンリーディングフレーム内の異なる地点の開始トリプレットの可変的使用から生じる。
【０００５】
長いポリペプチド（Ｌポリペプチド）は、プレＳ１、プレＳ２およびＳ領域からなる。それは、リーディングフレーム全体の産物であり、１０８個のアミノ酸（または、１９９個、ウイルスサブタイプに依存する）のプレＳ１ドメインを、そのアミノ末端にて含み、次いで５５個のアミノ酸のプレＳ２ドメイン、および２２６アミノ酸の短いポリペプチド（Ｓポリペプチド）領域が続く。中程度の長さのポリペプチド（Ｍポリペプチド）は、そのアミノ末端にプレＳ２ドメインを有し、次いでＳ領域が続くが、Ｓポリペプチド（これは、最も豊富な形態である）は、Ｓ領域のみからなる。このプレＳ領域は、宿主細胞へのウイルスのアセンブリおよび付着の両方において重要な役割を果たすと考えられている。このＳ形態は、ウイルスにおいて、ＨＢｓＡｇのＭ形態およびＬ形態よりも豊富であり、そしてグリコシル化形態および非グリコシル化形態の両方が存在する［Ｖ．ＢｒｕｓｓおよびＤ．Ｇａｎｅｍ、「Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、１０５９〜６３（１９９１）；Ｖ．Ｂｒｕｓｓら、「Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｏｐｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｌａｒｇｅ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ」、ＥＭＢＯ Ｊ、１３、２２７３〜７９頁（１９９４）；Ａ．Ｒ．Ｎｅｕｒａｔｈら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ ｏｎ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ」、Ｃｅｌｌ、４６、４２９〜３６頁（１９８６）；Ｋ，Ｕｅｄａら、「Ｔｈｒｅｅ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ：Ｌａｒｇｅ Ｓ，Ｍｉｄｄｌｅ Ｓ ａｎｄ Ｍａｊｏｒ Ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｎｅｅｄｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｎｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５、３５２１〜２９頁（１９９１）］。コアの外部表面とエンベロープの内部表面との間の特異的な相互作用は、おそらく、正確なウイルスのアセンブリを導き、そして生じた粒子を安定化させる。
【０００６】
ＨＢＶコアタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて効率的に発現され得る［Ｍ．Ｐａｓｅｋら、「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ」、Ｎａｔｕｒｅ、２８２、５７５−７９（１９７９）］、ここで、それは、２つのサイズ（１８０（Ｔ＝３）サブユニットまたは２４０（Ｔ＝４）サブユニットを含む）の正二十面体殻の中にアセンブリする［Ｒ.Ａ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒら、「Ｔｈｒｅｅ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｒｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｃｅｌｌ、７７、９４３〜５０頁（１９９４）］。そのサブユニットは、ダイマーとしてクラスター化され、そして各ダイマーは、殻の表面上に突出するスパイクを形成する。電子低温顕微鏡法（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）および画像処理を使用して、最近、Ｔ＝４の殻の地図を、６０００を超える個々の粒子の画像から７．４Ａの解像度で作製した［Ｂ．Ｂｏｔｔｃｈｅｒら、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｏｌｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ ３８６、８８−９１（１９９７）］。これは、そのポリペプチド鎖の折り畳みを明らかにし、その大部分はαヘリカルであって、以前に解析されたウイルスキャプシドと全く異なっていた。各ダイマースパイクは、一対の長αヘリカルヘアピンによって形成され、１つはダイマー内の各モノマーに由来する［Ｂｏｔｔｃｈｅｒら、（１９９７）；Ｊ．Ｆ．Ｃｏｎｗａｙら、「Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ４−Ｈｅｌｉｘ Ｂｕｎｄｌｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ ｂｙ Ｃｒｙｏｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ、３８６、９１−９４頁（１９９７）］。折り畳みに対するアミノ酸配列に上書きした番号付けスキーム［Ｂｏｔｔｃｈｅｒら、（１９９７）］は、ＨＢＶコアタンパク質の主要な免疫優性領域をスパイクの先端における７８−８２アミノ酸の周りに配置した［Ｊ．Ｓａｌｆｅｌｄら、「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ Ｃｏｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ Ｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ｆｒｏｍ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６３、７９０−８００頁（１９８９）；Ｍ．Ｓａｌｌｂｅｒｇら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌｉｎｅａｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ ｆｏｒ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｃｏｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎ」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、３３、２４８−５２頁（１９９１）］。
【０００７】
ＨＢＶウイルスアセンブリを阻害する薬剤は、ＨＢＶのコア抗原に結合し、それにより、ＨＢＶコアタンパク質とＨＢＶ表面タンパク質との間の相互作用をブロックする薬剤を含む。そのようないくつかのＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１８８１８およびＭ.Ｒ．ＤｙｓｏｎおよびＫ．Ｍｕｒｒａｙ、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ：Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ Ｃｏｒｅ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、２１９４−９８頁（１９９５）。
【０００８】
以下の開示から明らかであるように、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、単一または複数の免疫原に対する増強された免疫応答を誘発する能力によって特徴付けられるＨＢＶコア抗原粒子を構築するためのリガンドとして有利に使用され得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の開示）
本発明は、一つ以上の成分の免疫原に対して増強された免疫原性を誘発するＨＢＶコア抗原粒子を提供することにより上記で言及される問題に取り組む。そのような多成分のＨＢＶコア抗原粒子または多価ＨＢＶコア抗原粒子は、免疫原、エピトープ、または他の関連構造を含み、ＨＢＶコア抗原粒子と選択的に結合するペプチドであるリガンドを介してそれらと架橋され、さらに、免疫原性ドメインまたはエピトープが、コード配列の遺伝子操作またはポリペプチド合成によってＨＢＶコア抗原ポリペプチドに付着されるか、または挿入される。そのような、粒子は、多様な範囲の免疫原性エピトープの送達系として使用され得、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドを含み、これはそれ自身で、ＨＢＶコアタンパク質とＨＢＶ表面タンパク質との間の相互作用をブロックすることによりＨＢＶウイルスアセンブリを阻害および妨害する。生じた多成分のＨＢＶコア粒子または多価ＨＢＶコア粒子は、治療および予防ワクチンおよび組成物、ならびに診断的組成物およびそれらを使用する方法において有利に使用され得る。
【００１０】
本発明は、異なる免疫原の混合物、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドリガンドまたは両方が、同じＨＢＶコア粒子と架橋されることを有利に可能にする。その結果は、Ｔ細胞の有効な刺激剤であり、そして免疫学的に多価である単一粒子である。従って、単一抗原提示細胞は、特異性の異なる複数のＢ細胞クローンの増殖を刺激し得る。
上記に加えて、本発明は、以下を提供する。
（項目１） 複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、該粒子が、少なくとも１つのキャプシド結合免疫原を含み、該キャプシド結合免疫原が、少なくとも１つのＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分および少なくとも１つの免疫原性成分を含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、該粒子が個体に投与される場合に、前記キャプシド結合免疫原性成分が免疫応答を誘発させるように該粒子上に配向されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目３） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記キャプシド結合免疫原が、前記ＨＢＶキャプシドペプチド成分の任意のアミノ酸残基を通じて該粒子に連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目４） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記キャプシド結合免疫原が、前記免疫原性成分の任意のアミノ酸残基または他の残基を通じて該粒子に連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目５） 項目４に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分の他の残基が糖質である、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目６） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記キャプシド結合免疫原が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分のアミノ末端を通じて該粒子に連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目７） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記キャプシド結合免疫原が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分のカルボキシ末端を通じて該粒子に連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目８） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記キャプシド結合免疫原が、架橋剤によって該粒子に架橋されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目９） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分に直接またはリンカー配列を通じて連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１０） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分のアミノ末端に直接またはリンカー配列を通じて連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１１） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分のカルボキシ末端に直接またはリンカー配列を通じて連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１２） 項目９〜１１のいずれか１項に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、架橋剤によって前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分に連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１３） 前記架橋剤が多官能性架橋剤である、項目８に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１４） 前記架橋剤が多官能性架橋剤である、項目１２に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１５） 前記多官能性架橋剤が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリドおよびＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミドからなる群より選択される、項目１４に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１６） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が免疫学的エピトープ、免疫原性エピトープおよび抗原性エピトープからなる群より選択される、１つ以上のエピトープを含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１７） 項目１６に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記エピトープが直鎖状エピトープ、立体配座エピトープ、単一性エピトープ、および混合エピトープからなる群より選択される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１８） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、抗原、アレルゲン、抗原決定基、タンパク質、糖タンパク質、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、抗原または抗原決定基を模倣するミモトープ、ポリペプチド、糖ペプチド、糖質、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドからなる群より選択される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１９） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、ウイルス、寄生体、マイコバクテリア、細菌、桿菌、真菌、原生動物、植物、ファージ、動物細胞および植物細胞からなる群より選択される病原性因子に標的化されるか、またはこれらの病原性因子から誘導される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２０） 項目１９に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ウイルスが、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ヘパドナウイスル、フラビウイルス、ピコルナウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルス、ハンタウイルス、パルボウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、腫瘍ウイルス、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、トガウイルス、ラブドウイルスおよびポックスウイルスからなる群より選択される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２１） 項目２０に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ウイルスが、ヒト免疫不全１型ウイルス、ヒト免疫不全２型ウイルス、Ｔ細胞白血病ウイルス、単純ヘルペス１型ウイルス、単純ヘルペス２型ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、麻疹様ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、マラリア、デング熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、オンコウイルス、ポリオウイルス、パピローマウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルスおよびワクシニアウイルスからなる群より選択される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２２） 項目１９に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、スピロヘータ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属をに標的化されるか、またはこれらから誘導される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２３） 項目１９に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、ジフテリア、破傷風、無細胞百日咳、インフルエンザ菌、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、水痘、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、肺炎球菌性肺炎、黄熱病、マラリア、腸チフス、髄膜炎菌性髄膜炎またはコレラに標的化される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２４） 項目１８に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、動物アレルゲン、昆虫アレルゲン、植物アレルゲン、大気アレルゲン、および吸入アレルゲンからなる群より選択される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２５） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、該ＨＢＶコア抗原が、ＨＢＶコア抗原融合タンパク質である、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２６） 項目２５に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原融合タンパク質が、免疫学的エピトープ、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２７） 項目２６に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原融合タンパク質が、ＨＢＶコア抗原に直接またはリンカー配列を通じて融合した免疫学的エピトープ、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２８） 項目２６に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原融合タンパク質が、ＨＢＶコア抗原のカルボキシ末端に直接またはリンカー配列を通じて融合した免疫学的エピトープ、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２９） 項目２６に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原融合タンパク質が、ＨＢＶコア抗原のアミノ末端に直接またはリンカー配列を通じて融合した免疫学的エピトープ、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目３０） 項目２５に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原融合タンパク質が、短縮化ＨＢＶコア抗原を含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目３１） 項目２５に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原融合タンパク質が、ＨＢＶ表面抗原またはその部分を含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目３２） 項目３１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原融合タンパク質が、ＨＢＶ表面抗原のプレＳ１領域、ＨＢＶ表面抗原のプレＳ２領域、ＨＢＶ表面抗原の免疫優性領域、およびそれらの部分からなる群より選択される配列を含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目３３） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原が、粒子状形態にアセンブリされ得る、全長ＨＢＶコア抗原ポリペプチド、またはその部分、短縮物、変異体または誘導体である、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目３４） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分が、
【化１】
からなる群より選択される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目３５） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有する、予防的に有効量のＨＢＶコア抗原粒子を含む、ワクチン。
（項目３６） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有する、治療的に有効量のＨＢＶコア抗原粒子を含む、薬学的組成物。
（項目３７） 個体における免疫応答を生成するための方法であって、該方法は、項目１に記載の複数の免疫原特異性を有する、免疫応答を生成するに有効な量のＨＢＶコア抗原粒子を該個体に投与する工程を包含する、方法。
（項目３８） 前記ＨＢＶコア抗原粒子が、非経口経路によって前記個体に投与される、項目３７に記載の方法。
（項目３９） 前記免疫原をＨＢＶキャプシド結合ペプチドを通じてＨＢＶコア抗原粒子に連結することによる、該免疫原の免疫原性を増大させるための方法。
（項目４０） 前記キャプシド結合免疫原が、診断標識または化学マーカーを含む、項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子。
（項目４１） サンプルにおいて免疫原に対する抗体の存在を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）サンプルと、項目４０に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子とを、該サンプル中の任意の抗体が、該キャプシド結合免疫原と複合体を形成することを可能にするに十分な時間にわたり接触させる工程；および
（ｂ）該サンプル中の該キャプシド結合免疫原と該抗体との間で形成された該複合体を検出するための検出手段を用いる工程、
を包含する、方法。
（項目４２） 少なくとも１つのキャプシド結合ペプチド成分および少なくとも１つの免疫原性成分を含む、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目４３） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分に直接またはリンカー配列を通じて連結されている、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目４４） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分のアミノ末端に直接またはリンカー配列を通じて該粒子に連結されている、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目４５） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分のカルボキシ末端に直接またはリンカー配列を通じて該粒子に連結されている、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目４６） 項目４２〜４４のいずれか１項に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、架橋剤によって前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分に架橋されている、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目４７） 前記架橋剤が多官能性架橋剤である、項目４６に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目４８） 前記多官能性架橋剤が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリドおよびＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミドからなる群より選択される、項目４７に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目４９） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が免疫学的エピトープ、免疫原性エピトープおよび抗原性エピトープからなる群より選択される、１つ以上のエピトープを含む、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５０） 項目４９に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記エピトープが直鎖状エピトープ、立体配座エピトープ、単一性エピトープ、および混合エピトープからなる群より選択される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５１） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、抗原、アレルゲン、抗原決定基、タンパク質、糖タンパク質、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、抗原または抗原決定基を模倣するミモトープ、ポリペプチド、糖ペプチド、糖質、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドからなる群より選択される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５２） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、ウイルス、寄生体、マイコバクテリア、細菌、桿菌、真菌、原生動物、植物、ファージ、動物細胞および植物細胞からなる群より選択される病原性因子に標的化されるか、またはこれらの病原性因子から誘導される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５３） 項目５２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記ウイルスが、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ヘパドナウイスル、フラビウイルス、ピコルナウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルス、ハンタウイルス、パルボウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、腫瘍ウイルス、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、トガウイルス、ラブドウイルスおよびポックスウイルスからなる群より選択される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５４） 項目５３に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記ウイルスが、ヒト免疫不全１型ウイルス、ヒト免疫不全２型ウイルス、Ｔ細胞白血病ウイルス、単純ヘルペス１型ウイルス、単純ヘルペス２型ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、麻疹様ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、マラリア、ダニ媒介脳炎ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルスおよびワクシニアウイルスからなる群より選択される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５５） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、スピロヘータ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属に標的化されるか、またはこれらから誘導される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５６） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、ジフテリア、破傷風、無細胞百日咳、インフルエンザ菌、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎、狂犬病、水痘、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、肺炎球菌性肺炎、黄熱病、マラリア、腸チフス、髄膜炎菌性髄膜炎またはコレラに標的化される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５７） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、動物アレルゲン、昆虫アレルゲン、植物アレルゲン、大気アレルゲン、および吸入アレルゲンからなる群より選択される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５８） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分が、
【化２】
からなる群より選択される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５９） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分が、
【化３】
のフラグメントまたはアナログである、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目６０） 項目１に記載のＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分が、
【化４】
のフラグメントまたはアナログである、ＨＢＶコア抗原粒子。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記載される本発明が、より十分に理解され得るように、以下の詳細な記載が示される。
【００１２】
本発明の一つの実施形態に従って、一つよりも多い型の免疫原、および１つ以上の型のＨＢＶキャプシド結合ペプチドリガンドが、同じＨＢＶコア粒子に架橋され得る。あるいは、同じ免疫原の複数のコピーが、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドの一つの型に連結され得、ＨＢＶコア粒子上の種々の位置に架橋され得る。本発明に従う多成分または多価ＨＢＶコア抗原粒子は、すべての成分免疫原に対して抗体を誘導するために特に有用である。
【００１３】
免疫原をＨＢＶコア抗原粒子に連結させるＨＢＶキャプシド結合ペプチドの使用は、変性、コンホメーションの崩壊または他の不安定化効果によって、免疫原の免疫原性または安定性を破壊することなしに、増強された免疫原提示を可能にする。例えば、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドリンカーは、成分免疫原が、相互に妨害して機能物質の喪失を引き起こす危険を減少させる。結果として、ＨＢＶコア抗原粒子は、その免疫原成分に対する増強された免疫応答を誘発する。従って、各免疫原が、単一薬剤として投与される場合、必要とされるよりも少ない接種および／または少ない接種物をともなう、所望の治療効果または予防効果を達成することが可能である。
【００１４】
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドを介するＨＢＶコア抗原粒子への免疫原の結合はまた、サイズ、コンホメーションおよび性質が変化した免疫原の提示を可能にする。結果として、本発明は、所定の個人における免疫または処置の広いスペクトルを誘発するのに有用な免疫原の組み合わせを一つのワクチンまたは組成物内に含めることを可能にする。
【００１５】
（免疫原）
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドに連結され得、従ってＨＢＶコア抗原粒子内に組み込まれ得る免疫原としては、一つ以上の免疫性エピトープ、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む任意の分子が挙げられる。そのようなエピトープは、直線性であり得、立体配置的であり得、単一であり得、または性質が混合され得る。
【００１６】
より詳細には、免疫原は、免疫応答を誘発し得る任意の薬剤から選択され得る。そのような薬剤としては、抗原、抗原決定基、タンパク質、糖タンパク質、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、抗原または抗原決定基を模倣するペプチドミモトープ、ポリペプチド、糖ペプチド、糖質、オリゴ糖、多糖、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。免疫原はまた、アレルゲン、毒素、または内毒素であり得る。
【００１７】
そのような薬剤はまた、種々の病原因子（例えば、ウイルス、寄生虫、細菌、真菌、ファージ、原生動物および植物）に標的化されるか、またはこれらに由来するものを含む。そのようなウイルスとしては、レトロウイルス（ヒト免疫不全１型および２型ウイルスならびにＴ細胞白血病ウイルスを含む）；ヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹１型および２型ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス）；オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス；パラミクソウイルス（例えば、ＲＳウイルス、麻疹様ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスおよびパラインフルエンザウイルス）；ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；フラビウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、およびダニ媒介脳炎ウイルス）；ピコルナウイルス（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、口蹄疫ウイルスおよびポリオウイルス；トガウイルス（例えば、風疹ウイルス）；ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）；アデノウイルス、エボラウイルス；バキュロウイルス；ハンタウイルス；パポバウイルス（ｐａｐｏｖｉｒｕｓ）（例えば、パピローマウイルス）；パルボウイルス；ＤＮＡウイルス；ＲＮＡウイルス；ＲＮＡ腫瘍ウイルス（例えば、オンコウイルス）；およびポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）が挙げられる。さらに、免疫原は、杆菌、腸内細菌、クロストリジウム、リステリア、マイコバクテリア、シュードモナス、ストレプトコッカス、真正細菌、マイコプラズマ、クラミジア、スピロヘータ、ナイセリアまたはサルモネラに標的化されたものか、またはこれらに由来するものであり得る。免疫原はまた、以下のヒト免疫不全ウイルスのエピトープから選択され得る：ＧＥＬＤＲＷＥＫＩ（ｇａｇ）；ＥＬＤＫＷＡＳ（ｇｐ４０）；ＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮ（Ｖ３ループ）；ＥＬＤＫＷＡ（ｇｐ４１）およびＤＲＦＹＫＴＫＲＡ（ｇｐ４１）。
【００１８】
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドに連結され得、従ってＨＢＶコア抗原粒子に組み込まれ得る糖タンパク質としては、例えば、抗体、動物細胞もしくはウイルスもしくは細菌の表面成分に由来するか、または似ている糖ペプチド（例えば、髄膜炎を引き起こすようなもの）、またはそのような部分のフラグメントが挙げられる。
【００１９】
当業者に理解されるように、免疫原のサイズは、その官能基がＨＢＶキャプシド結合ペプチドリンカーを妨害することを可能にするほど十分に大きなものであるべきではない。
【００２０】
（ＨＢＶコア抗原タンパク質）
その粒子の性質に起因して、ＨＢＶコア抗原タンパク質は、免疫系に複数の免疫原（類似している型または異なる型）の提示のために有利なプラットフォームを構成する。本発明に従って、この利点は、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドを、ＨＢＶコア粒子に所望の免疫原を付着させるリガンドとして使用することにより、さらに増強される。そのような粒子は、９０または１２０のいずれかのリガンド結合部位（キャプシドスパイク）を含み、各々は、ＨＢＶコア抗原ダイマーから構成された（図１参照のこと）。従って、複数の免疫原は、リガンドとしてのＨＢＶキャプシド結合ペプチドによって、ＨＢＶコア抗原粒子に物理的に連結され得る。生じた粒子は、その成分免疫原の全てに対して免疫応答を誘導し得る。
【００２１】
ＨＢＶコア抗原粒子は、適切な微生物系、動物系、または植物系におけるＨＢＶコア抗原ペプチドに対する組換えコード配列の発現の際に形成され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照のこと。発現されるべきポリペプチドは、全長ＨＢＶコア抗原配列、変異体、誘導体、短縮物（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、またはその部分を含み得、これは、発現系の細胞において粒子形態でアセンブリする能力を保持する。そのようなＨＢＶコア抗原粒子を産生するための組換え方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第４，７１０，４６３号を参照のこと。
【００２２】
あるいは、化学合成法を使用して、ＨＢＶコア抗原ペプチドを産生し得る。化学合成は、ＨＢＶコア抗原ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、固相合成を使用して実行され得る［Ｒ.Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃｅｄ．、２１、４１２頁（１９６４）；Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３、１３８５−９０頁（１９６４）およびＤ.Ｒ．Ｍｉｌｉｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９、１２２３−３１頁（１９８７）］。
【００２３】
当業者は、変異されたＨＢＶコア抗原配列または改変体ＨＢＶコア配列は結合ペプチドまたはリガンドペプチドとの反応に影響を及ぼし得るので、本発明が、ＨＢＶコア抗原サブユニットまたは対応する結合ペプチドもしくはリガンドペプチドにおけるコード配列の操作または他の手順によって、天然改変体または変異に等しく適用されることを理解する。
【００２４】
（ペプチド結合に重要なコアタンパク質残基の変異）
コアタンパク質の折り畳みを決定するために使用される方法は、ＳＬＬＧＲＭＫＧＡ（Ｌ−ＨＢｓＡｇへの結合を阻害するＨＢＶキャプシド結合ペプチド）のコア部分における結合部位を、低温顕微鏡（ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって、位置付けするために適用されている。このアプローチは、現在、Ｔ＝３殻およびＴ＝４殻の両方において、スパイクの先端に結合されるペプチドを示している［Ｂ．Ｂｏｔｔｃｈｅｒら、「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ Ｂｌｏｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ａｓｓｅｍｂｌｙ：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ］、ＥＭＢＯ Ｊ．，１７、６３４９−４５（１９９８）］。画像分析は、ポリペプチド結合部位が、ポリペプチドの折り畳みについて提唱された番号づけスキーム［Ｂｏｔｔｅｃｈｅｒら（１９９７）］においてアミノ酸７８〜８２の領域の残基に対応するスパイクの先端に位置することを示す。コアタンパク質の先端に近い２つの酸性残基（ｇｌｕ７７およびａｓｐ７８）および２つの保存塩基性残基に含まれる選択された結合ペプチドが存在する。結合反応におけるこれらの逆に荷電した残基の重要性は、タンパク質の酸性残基のいずれかのアラニンへの変異が、変化したコア殻に対するペプチドの親和性を大きく減少することが見出され場合に確認された。アスパラギン酸７８をアラニンに変化させると、親和性は１６０倍減少し、グルタミン酸７７をアラニンに変更させると、親和性は１０００倍減少した。このことは、ＨＢＶコア抗原タンパク質上のいずれかまたは両方の酸性残基が、ＨＢＶキャプシド結合タンパク質についての結合部位の少なくとも一部を提供し得ることを示唆する。
【００２５】
これらの結果はまた、リガンド結合についてのスパイクの先端の領域におけるＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列の重要性を例示する。当業者は、いくつかのＨＢＶ株由来のＨＢＶコア抗原が、特定のリガンド−免疫原ペプチドの有効な結合のための変異、または特定のＨＢＶコア抗原改変体に有効に結合するタンパク質へのリガンドの改変体の選択および適合を必要とし得ることを理解する。
【００２６】
（ＨＢＶコア抗原融合タンパク質）
本発明の１実施形態に従って、免疫原がＨＢＶキャプシド結合ペプチドを介して連結され得るＨＢＶコア抗原粒子は、遺伝子融合技術の結果として、１以上の免疫原をすでに提示しているものであり得る。１つのこのような技術において、関連コード配列は、ＨＢＶコア抗原ポリペプチドについてのものを保有する他のプラスミドまたはベクターにおける適切な位置で取り込まれる。
【００２７】
ＨＢＶコア抗原ポリペプチドの発現レベルを増強するために使用したＥ．ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子への融合は、この抗原の最初の２つのアミノ酸の、１１のアミノ酸の配列（β−ガラクトシダーゼのアミノ末端からの８つおよび遺伝子融合において取り込まれたリンカー配列の翻訳から生じた３つのさらなる残基）との置換は、その産物の回収の容易さ、抗原性または形態学に有害な影響を与えなかったことを実証した［Ｓ．Ｓｔａｈｌら、「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９、１６０６−１０頁（１９８２）；Ｂ．Ｊ．ＣｏｈｅｎおよびＪ．Ｅ．Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，「Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｃｏｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｉｎ Ｅ．Ｃｏｌｉ」、Ｎａｔｕｒｅ，２８６、６７７−７８頁（１９８２）］。
【００２８】
本発明に有用なＨＢＶコア抗原融合タンパク質は、Ｓ．Ｊ．ＳｔａｈｌおよびＫ．Ｍｕｒｒａｙ、「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ ｔｏ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、６２８３−８７頁（１９８９）に例示された通りに産生され得る。あるいは、高度に免疫原性の粒子を得るためのＨＢＶコア抗原の主要なセグメントへのポリペプチド配列を融合は、図２に列挙されるような多数のウイルスコード配列とともに例示される。これらは、高度な免疫原性を有する特定の産物を含み、この産物は、ワクシニアウイルスベクターを介して、肝臓ペプチドリンカー配列を介してＨＢＶコア抗原ポリペプチドのアミノ末端に直ぐ続くプレコア配列の６つのアミノ酸に融合されたＶＰ１ペプチド（残基１４２−１６０）の発現によって産生される［Ｂ．Ｅ．Ｃｌａｒｋｅら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ ａｆｔｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ ｔｏ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｃｏｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｎａｔｕｒｅ，３３０、３８１−８４ページ（１９８７）］。他の有用なＨＢＶコア抗原融合タンパク質については、Ｕｌｒｉｃｈら（１９９８）もまた参照のこと。
【００２９】
一連の他の融合タンパク質は、他の代替的コード配列によるＨＢＶコア抗原ポリペプチドのカルボキシ末端でのアルギニンリッチ領域の置換によって特徴付けられる。ＨＢＶ表面抗原の免疫優性領域（残基１１１〜１６５）、プレＳ１およびプレＳ２エピトープ、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のエンベロープタンパク質の種々のセグメントを含むペプチドは、ＨＢＶコア抗原ポリペプチドの残基１４４に付着された。全て物が、Ｅ，ｃｏｌｉにおいて効率的に発現されて、ＨＢＶコア抗原自体の形態と同じ形態を本質的に提示する粒子状生成物を生じた（ＳｔａｈｌおよびＭｕｒｒａｙ，１９８９）。この生成物は、ＨＢＶコア抗原の抗原性反応性を提示し、そして残基１４４で短縮されたＨＢＶコア抗原ポリペプチドの調製物のように、試験されたものもまた、ＨＢＶ ｅ抗原反応性を示したが、一方、全長ＨＢＶコア抗原は、このような活性を非常にわずかしか示さない。ＨＢＶ表面抗原からの残基１１１〜１５６または１１１〜１６５を保有する融合タンパク質は、有意なＨＢＶ表面抗原反応性を提示せず、結果は、この主要なエピトープのコンホメーション依存性、または粒子内で不明瞭である配列の確率と一致しなかった。しかし、融合タンパク質に対する免疫原性応答は、これらの種々の成分エピトープを反映した。
【００３０】
ＨＢＶ表面抗原に対する免疫応答は、Ｌ−ＨＢｓＡｇおよび主要免疫優性のプレＳ１およびプレＳ２領域に存在するエピトープに加えて、領域について複雑であり、多数の可変サブタイプ決定基は、短い他の領域、またはＨＢＶ表面抗原のＳポリペプチドに割り当てられている［Ｇ．Ｌ．ＬｅＢｏｕｖｉｅｒ，「Ｔｈｅ Ｈｅｔｅｔｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１２３、６７１−７５頁（１９７１）；Ｗ．Ｈ．Ｂａｎｃｒｏｆｔら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ａｎｔｉｇｅｎ］、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０９、８４２−４８頁（１９７２）；Ａ．−Ｍ．Ｃｏｕｒｏｕｃｅ−Ｐａｕｔｙ Ｐ．Ｖ．およびＨｏｌｌａｎｄ，「Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ Ａ２：ＨＢｓＡｇ ａｎｄ ｉｔｓ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ］、ｉｎ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，Ｇ．Ｎ．Ｖｙａｓ，Ｓ．Ｎ．ＣｏｈｅｎおよびＲ．Ｓｃｈｍｉｄ編、（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＵＳＡ：Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐｒｅｓｓ），６４９−５４頁）１９７８）］。異なるサブタイプの血清からクローニングされたＨＢＶ ＤＮＡにおいて決定されたＨＢＶ表面抗原コード配列は、対応するタンパク質配列において差異を提示する。しかし、明らかに重要な残基の特異的単一変異は、ある血清学的サブタイプ（ｙ）から別のもの（ｄ）へのスイッチをもたらさなかったが、さらなる単一変異は、同じ分子から提示されるｙおよびｄの両方の反応性および免疫原性との漸進的変化を誘導した［Ｐ．Ｇ．Ａｓｈｔｏｎ−ＲｉｃｋａｒｄｔおよびＫ．Ｍｕｒｒａｙ，「Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ Ｃｈａｎｇｅ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｂｔｙｐｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，２９、２０４−１４（１９８９）］。関与する変異は、コンホメーション感受性免疫優性領域内またはそれに密接してなされ、そして上記のＨＢＶコア抗原に対する融合において使用されるＨＢＶコア抗原のセグメント内に全て存在した。
【００３１】
誘導された抗体のサブタイプ特異性に対する変異の影響は、融合タンパク質はまた、特にそれらがコンホメーションに依存する場合に、目的のエピトープに対する応答の特異性を変化させるための手段を提供し得るという示唆を促した。グリシン145の、アルギニン、天然のエスケープ変異体の模倣物、および他の正もしくは負に荷電した残基（リジンおよびグルタミン酸）への変異は、それゆえ、体液性および細胞性の免疫応答の比較研究についてＨＢｃＳ111-156におけるこの残基でなされた（Ａ．Ｌ．ＳｈｉａｕおよびＫ．Ｍｕｒｒａｙ，「Ｍｕｔｔａｔｅｄ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｆｕｓｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｏｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｄｕｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｈａｔ Ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５１、１５９−６６頁（１９９７）］。全てのものが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて効率的に発現され、強力なＨＢＶコア抗原性を示す予測された粒子状生成物を生じ、そして全てものが、ウサギにおいてＨＢＶコア抗原に対する抗力価の抗体を誘導した。
【００３２】
それらの親タンパク質ＨＢｃＳ111-156のように、３つの残基１４５変異体は、固相ラジオイムノアッセイ（ＡＵＳＲＩＡ；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または溶液における抗体沈降アッセイにおいてＨＢＶ表面抗原に対する抗体と最小の相互作用を示した。しかし、それらは全て、変性条件下でのアクリルアミドゲルにおける電気泳動後のイムノブロット実験において、ウサギ抗ＨＢＶ表面血清との強力な反応を示した［Ａ．Ｌ．Ｓｈｉａｕ，「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｉｔｓ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」、履くし論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，ＵＫ．（１９９３）］。高濃度では、親タンパク質および変異体タンパク質はまた、ＨＢＶコア抗原に対する抗体で被覆された固相上に捕捉される場合、おそらく、抗ＨＢｓＡｇ分子に対する接近を与える粒子のいいくらかの破壊の結果として、ＨＢＶ表面抗原に対する抗体との弱い陽性反応を与えた。（ＳｈｉａｕおよびＭｕｒｒａｙ，１９９７）。
【００３３】
免疫したウサギを使用して、融合タンパク質に対するＴ細胞応答および抗体産生を実験した。免疫後に種々の時間で採取した末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＨＢＶコア抗原に対する曝露に応答する［3Ｈ］−チミジン取り込みに基づく増殖アッセイのために使用したか、または融合タンパク質を免疫のために使用した。全ての場合において、ＨＢＶコア抗原よりも高い刺激指数を示す融合タンパク質との強力な応答が見出され、そして、予測されたように、ＨＢＶ表面抗原は、乏しい刺激因子（ｓｔｉｍｕｌａｎｔ）であった。［128Ｉ］−ＨＢＶ表面抗原を用いる二抗体放射性免疫沈降アッセイ（ｄｏｕｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）［Ｃ．Ｊ．Ｂｕｒｒｅｌｌら、「Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ Ｄｏｕｂｌｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓａｙ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，３、１９２６頁（１９７８）］を使用して、血清サンプルにおける抗ＨＢｓを測定し、そしてＨＢｃＳ111-156に対する予測された陽性応答が示された。アルギニン変異体もまた、このアッセイにおいて陽性応答を生じたが、その親分子よりはいくらか低く、そして弱い応答がグルタミン酸変異体から得られたが、リジン変異体からは何も得られなかった。従って、これらの結果は、アルギニン１４５変異を保有する融合タンパク質（ＨＢｃＳ145Rと称する）が、強力なＴ細胞刺激因子であり、そしてより広範な反応特性を有する抗体を誘導したことを示した。
【００３４】
ＨＢＶコア抗原ポリペプチドに対するＨＢＶ表面抗原ポリペプチド（残基１４５変異体を含む）の種々の部分のさらなる群の融合は、生成物の免疫原性に対する全体のサイズならびに種々のさらなる構成要素の数および位置に対する効果を探索するためになされた［Ｓｈｉａｕ（１９９３）］。これらの構築物は図２に含まれ、そして他の融合物を用いた場合、全てのものが、ＨＢＶコア抗原の形態学を提示する粒子状生成物を生じたが、ＨＢＶコア抗原のアミノ末端でのＨＢｓ111-156フラグメントとの融合は、あまり満足の行くものではなく、不溶性凝集物を形成した生成物を生じた。
【００３５】
この群の産物は、ＨＢｃＳ111-156セグメントを有するより初期のものと同様に、固相上または溶液中でＨＢＶ表面抗原に対する抗体とわずかな反応性を示したか、またはまったく反応性を示さなかったが、固相上のＨＢＶコア抗原に対する抗体によって捕捉された場合、それらは、ＨＢＶ表面抗原に対する抗体との類似の固反応性を示し、そしてこれは、ＨＢｓ111-156に加えてプレＳ１およびプレＳ２を保有する融合物を用いると、いくらか高い（約２倍）。リンパ球増殖阻害についての刺激指標は、また、全ての融合タンパク質およびプレＳセグメントを誘導したものならびにより強力な応答を生じたネイティブまたは変異体ＨＢｓ111-156配列について強力であった。ＨＢｃＳ144配列とＨＢｃＳ111-156配列（野生型または変異体のいずれか）との間のプレＳ１およびプレ２配列の封入は、二抗体放射性免疫沈降アッセイにおいて、プレ５セグメントを欠く融合物より高い抗体レベルを生じたが、ＨＢｃ144配列とプレ５配列との間の第２のＨＢｃＳ111-15６配列の挿入は、任意の応答においてさらなる増強を生成しなかった。プロリン144でＨＢＶコア抗原ポリペプチドに付着した最長のこれらの配列（１６５アミノ酸）は、融合タンパク質の収率または物理的特徴に対する自明の有害な影響を有さなかった。
【００３６】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のコアタンパク質（ＨＣｃ）はまた、部分的および複数の全長コピーにおいて、バリン１４９で短縮されたＨＢＶコア抗原ポリペプチドに融合されている［Ａ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａら、「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｒｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ Ｐａｒｔ ｏｆ Ｃｏｐｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７、６０６４−７０頁（１９９３）］。ＨＣｃ残基３９−３７を保有する融合物は、ごくわずかなＨＣｃ抗原性を示したが、残基１−９１または１８０アミノ残の全長配列は陽性反応を生じ、そして抗原性は、短いリンカーを介する１−１８０配列のさらなるコピー（４つまで）の付加とともにほとんど等差級数的に増加した。電子顕微鏡は、ＨＣｃ残基１−９１の単一のコピーを保有する融合物は、ＨＢＶコア抗原ポリペプチドに形態学的に等しい粒子を形成したが、３つの全長コピーは、この構造を非常に破壊し、そしてこの生成物は、しかし、ＨＢＶコア抗原性を維持した物質を生じるタンパク質分解に対して非常に感受性であった。より大きな融合タンパク質は、７２０よりも多いさらなるアミノ酸をもたらしたが、ＨＢＶコア抗原型の粒子についての制限は、評価的に少ないようである。
【００３７】
プレＳ配列は、ＨＢｃＡｇへの融合の位置の、免疫原性に対する効果の他の研究において使用されてきた。Ｂｏｒｉｓｏｖａら（１９８９）は、プロリン１４４で短縮されたＨＢＶコア抗原に連結されるかまたは全長ＨＢＶコア抗原配列内のこの位置に挿入される、プレＳ１のセグメント（残基２０〜６８、２０〜６９または６９〜１０６）またはプレＳ２の全体との融合を作製した。ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）のエンベロープタンパク質の残基５６〜１０３またはＨＩＶ膜貫通タンパク質（ｇｐ４１）の残基７８〜１２９とのこれらおよび類似の構築物において、ＨＢＶコア抗原に融合された配列は、粒子表面に対して露出されると考えられており、全てについて、抗原性および免疫原性の両方であることが報告されており、そしてＣ末端アルギニンリッチドメインは、明らかにわずかな逆効果しか有さなかった。
【００３８】
Ｆ．Ｓｃｈｏｄｅｌら、「Ｔｈｅ Ｐｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ Ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｒｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６、１０６−１４頁（１９９２）は、プレＳ１またはプレＳ２セグメントが全長ＨＢＶコア抗原のアミノ末端で（プレコア配列に直接またはその一部を介してのいずれかで）または短縮されたＨＢＶコア抗原のカルボキシ末端で付着された場合、近交系マウスにおける融合の位置の免疫原性に対する影響および免疫応答を開発した：さらなる構築物は、ＨＢＶコア抗原の残基７５と８３との間のプレＳ１セグメントならびに短縮されたカルボキシ末端でのプレＳ２セグメント（プロリン１５６）を保有した。
【００３９】
包括的な分析は、ＨＢＶコア抗原のアミノ末端に短いプレコア配列を介して融合されたプレＳ１配列は抗原性であるが、アミノ末端に直接融合されたものは抗原性ではなく、両方は同じＨＢＶコア抗原免疫原性を有したが、プレコア配列を介する融合は、ずっと高い抗プレＳ１応答を刺激したことを示した。短縮されたＨＢＶコア抗原末端でのプレＳ２配列は、両方の状況において同程度に抗原性および免疫原性であったが、残基７６〜８２（これは、主要なＨＢＶコア抗原エピトープを含む）を置換するように内部融合されたプレＳ１配列は、Ｎ末端融合においてよりも、実質的により抗原性であり、そして劇的により免疫原性であった。予測されたように、ＨＢＶコア抗原性および免疫原性は、内部融合タンパク質において非常に減少された。ＨＢＶコア抗原（残基７８〜８２）の、免疫優性エピトープを含むＨＢＶ表面抗原のフラグメントとの置換はまた、陽性のＨＢＶコア抗原性および免疫原性を示す生成物を生じた［Ｇ．Ｂｏｒｉｓｏｖａら、「Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ Ｂｅｒｉｎｇ ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７、３６９６−３７０１（１９９３）］。
【００４０】
さらなる代替として、または上記の融合タンパク質への追加として、免疫原性成分は、化学的架橋手順によって、ＨＢＶコア抗原に付着され得る。
【００４１】
Ｂｏｔｔｃｈｅｒら（１９９７）によって示唆された物理的構造に対するＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列の付加は、ＨＢＶコア抗原のカルボキシ末端で、もしくはその付近で融合された配列の低い抗原性の説明を補助する。なぜなら、このようなセグメントは、ＨＢＶコア抗原粒子に内に埋没されるようであり、一方Ｎ末端融合は、可撓性リンカー配列から利益を受け得、スパイクの足の相対的に限定された空間からさらに免疫原をもたらす。スパイクの先端での免疫優性ＨＢＶコア抗原エピトープの位置［残基７８〜８２；Ｓａｌｆｅｌｄら（１９８９）］は、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド−免疫原の挿入または付着についてのこの位置の誘引力を示す。原則的には、すべてのこれらの位置は、所定のＨＢＶコア抗原粒子によって提示されるエピトープの数および／または多様性を増加するために同時に使用され得る。
【００４２】
（ＨＢＶコア抗原粒子に免疫原を連結するために使用されるＨＢＶキャプシド結合ペプチド）
上記のように、目的の免疫原は、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドであるリガンドを使用して、ＨＢＶコア粒子に結合され得る。このようなＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、単離され、精製されたペプチドである。これらのＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、ＨＢＶコアタンパク質とＨＢＶ表面タンパク質との間の相互作用をブロックすることによって、ＨＢＶウイルスのアセンブリを有利に阻害し、そして干渉する。
【００４３】
好ましくは、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、約２アミノ酸と約２０アミノ酸との間の長さであるペプチド、そのフラグメント、アナログ、およびホモログを含む。より好ましくは、このペプチドは、約３アミノ酸〜約１５アミノ酸の間の長さである。このようなペプチドは、下記の表に列挙したペプチド、ならびにそのフラグメントおよびアナログを含む。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「フラグメント」とは、そのフラグメントが由来するペプチドよりも短いが、もとのペプチドの生物学的活性と実質的に類似の生物学的活性を保持する、アミノ酸配列をいう。このようなフラグメントは、少なくとも２アミノ酸の長さである。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「アナログ」とは、ペプチドのアミノ酸配列のバリエーションをいい、このバリエーションは、代表的には、１〜約４アミノ酸の変化によってのみ異なる、アナログを含み得る。アナログの他の例は、本明細書中に例示されるペプチドからの少しのアミノ酸バリエーションを有するペプチドを含む。特に、保存的アミノ酸置換（すなわち、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの内で生じるアミノ酸置換）を含むペプチドは、アナログを構成する。
【００４６】
遺伝子にコードされるアミノ酸は、一般的に、４つのファミリーへと分割される：（１）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性：リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性：グリシン、アスパラギン酸、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時に、芳香族アミノ酸としてともに分類される。ＨＢＶキャプシド結合ペプチドに関して、１つ以上のアミノ酸を変化させることは、有益であり得る。当業者は、このような変化の影響を容易に評価し得る。
【００４７】
用語「ホモログ」とは、参照ペプチドに対して、アミノ酸レベルでの少なくとも６０％同一性、そして好ましくは７５％同一性、そして実質的に類似の生物学的活性を共有する、ペプチドフラグメントを含む。これらの好ましいパーセンテージは、これらのペプチドのサイズの小ささを反映する。
【００４８】
有用なＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、ＤｖｓｏｎおよびＭｕｒｒａｙ（１９９５）に開示されたペプチドに基づくものを含む。このようなペプチドは、融合ファージＢ１中のペプチドＬＬＧＲＭＫに隣接する残基のランダムな変異誘発、およびバイオパニング反応におけるＨＢＶコア抗原に対する再選択の後に合成されて、改良された親和性で抗原に結合する誘導体を生じた。高解像度の電子低温顕微鏡は、このようなＨＢＶキャプシド結合ペプチドが、ＨＢＶコアタンパク質の殻のスパイクの先端に結合することを、示した。感染した細胞におけるＨＢＶコア抗原とＨＢＶ表面抗原タンパク質との間の相互作用に対するこのペプチドの阻害効果を、ＨＢＶゲノムの頭−尾二量体を保有する複製コンピテントプラスミドを用いた、透過性の肝細胞癌Ｈｅｐ Ｇ２細胞のトランスフェクションを介して、このペプチドの存在下または不在下で試験した。Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒら（１９９８）を参照のこと。
【００４９】
このＬＬＧＲＭＫ配列を保有するＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、トランスフェクトされた肝細胞癌細胞培養物中にて、用量依存性様式でＨＢＶの収量を減少させ、そして溶液中のＨＢＶコア抗原とＬ−ＨＢＶ表面抗原との間の反応のこのペプチドによる阻害において、このペプチドについてのＩＣ50値を反映する、相対効力を有した。
【００５０】
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、約１０μＭ未満、好ましくは５μＭ未満、より好ましくは約２μＭ未満、そして最も好ましくは約０．５μＭ未満である、半最大濃度（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＩＣ50）を好ましくは有する。好ましいペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＳＬＬＧＲＭＫＧ（β−Ａ）Ｃ、ＲＳＬＬＧＲＭＫＧＡ、ＨＲＳＬＬＧＲＭＫＧＡ、およびＲＳＬＬＧＲＭＫＧＡ（β−Ａ）Ｃ、あるいはこれら由来のペプチド。あるいは、このようなペプチドは、ペプチドＡＬＬＧＲＭＫＧであり得、このペプチドは、長いＢ型肝炎ウイルス表面抗原（Ｌ ＨＢｓＡｇ）とＨＢｃＡｇとの間の相互作用を阻害し、半最大濃度（ＩＣ50）は、１０．０μＭである。
【００５１】
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、以下によって例証される。ＫDRel（ｎＭ）は、ＨＢＶコア抗原と、ｇｐＩＩＩタンパク質のアミノ末端領域中のペプチド配列を保有するｆｄ融合ファージとの間の反応についての相対解離定数を示す。
【００５２】
【化５】
これらのペプチド（Ｌ ＨＢｓＡｇの細胞質領域を模倣する）は、糸状ファージ上に提示されたランダムヘキサペプチドライブラリーからの選択、およびファージ結合形態にて決定された溶液中でのＨＢＶコア抗原についてのこれらペプチドの親和性によって、同定された。以下の関連ペプチド（以下に列挙した）もまた、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドの例であり、そしてそのＩＣ50μＭ値は、半最大レベルのＨＢＶコア抗原へのＬ ＨＢｓＡｇの結合を阻害するのに必要なペプチドの濃度を示し、Ｎ／Ｄは、観察可能な阻害がないことを示し、そしてβ−Ａは、β−アラニンを示す[ＤｙｓｏｎおよびＭｕｒｒａｙ（１９９５）]：
【００５３】
【化６】
このＨＢＶキャプシド結合ペプチド、そのフラグメント、アナログおよびホモログ（これらは、ＨＢＶコア抗原粒子に対する免疫原を結合するリガンドとして作用し得る）は、好ましくは、従来の合成技術を用いて（例えば、化学合成技術によって）、合成される。あるいは、当業者は、標準的化学（例えば、ｔ−ＢＯＣ化学）を使用する自動ペプチド合成機を使用することによって、これらのペプチドのいずれをも合成し得る。例えば、Ｌ．Ａ．Ｃａｒｐｉｎｏ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７９、４４２７頁（１９５７）を参照のこと。そしてこれらのペプチドは、タンパク質の化学切断または他の方法によって、調製され得る。これらのペプチドは、化学的に合成された場合またはタンパク質の化学切断によって得られた場合に、そのペプチドが、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないように、単離される。
【００５４】
あるいは、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、従来の遺伝子操作技術（例えば、このペプチドをコードする核酸配列で形質転換された宿主細胞における組換えＤＮＡ技術）によって、その選択されたペプチドのコード配列を保有するＤＮＡフラグメントを、宿主微生物または細胞中でクローニングおよび発現することによって、調製され得る。組換え技術によって適切に形質転換された細胞において産生された場合、このペプチドは、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方から、従来の方法を使用して精製され得る。この組換えペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって産生された場合に、そのペプチドが細胞の物質または細胞培地を実質的に含まないように、単離される。このペプチドのコード配列は、合成によって調製されても、または公知の技術によってウイルスＲＮＡに由来しても、または利用可能なｃＤＮＡ含有プラスミドに由来してもよい。
【００５５】
本発明の方法における使用のために、上記のペプチドは、そのペプチドの産生またはＨＢＶコア抗原へのそのペプチドの結合を増大するように、従来から公知である構築物または代替的構築物へと設計され得る。例えば、これらのペプチドは、タンパク質融合パートナーまたはペプチド融合パートナーに、必要に応じて融合され得る。従って、当業者は、選択した融合パートナー（別のペプチド、またはそのペプチドに所望の特徴を付与する他のペプチドもしくはタンパク質）と結合したこのペプチドを設計し得る。
【００５６】
種々の微生物および細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、バチルス細胞、ストレプトミセス細胞、サッカロミセス細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞を含む）においてＨＢＶキャプシド結合ペプチドをクローニングおよび発現するための系ならびにその系に適切なベクターは、公知であり、そして私的および公的な、実験室および寄託機関から、そして商業的供給者から、入手可能である。
【００５７】
組換え生成されようとまたは合成されようと、このＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、従来の精製手段を使用して精製され得る。当業者は、このペプチドが使用される所望の適用に必要な、適切なレベルの純度を容易に決定し得る。
【００５８】
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドリンカーの選択は、ある程度まで、ＨＢＶコア抗原粒子を形成する特定のＨＢＶコア抗原ポリペプチドの性質に依存することが、理解されるべきである。例えば、異なる起源ウイルス株のＨＢＶコア抗原粒子は、異なるＨＢＶキャプシド結合ペプチドリガンドを必要とし得、それは、所定のＨＢＶコア抗原ポリペプチドのリガンド結合部位のアミノ酸配列またはそのリガンド結合部位付近のアミノ酸配列の違いに起因する。
【００５９】
（免疫原とのＨＢＶキャプシド結合ペプチドの結合）
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、目的の免疫原と結合され得て、ペプチド結合を介してキャプシド結合免疫原を形成し得る。この免疫原自体がペプチドである場合、これは、通常は、単一の合成によってか、または形質転換された細胞における、この免疫原配列に結合したＨＢＶキャプシド結合配列を含むペプチド（通常そして好ましくは、この長い方のペプチドの２つの成分間の一定程度の可撓性を付与するために、２〜５（しばしば３）つのグリシン残基を介する）の対応するコード配列の発現によって、従来通りに達成される。あるいは、このペプチドは、この免疫原に架橋され得る。
【００６０】
このペプチドおよび免疫原の結合成分間の結合の配置は、このＨＢＶコア抗原粒子へのキャプシド結合免疫原の架橋のための最終プロセスの効率に影響し得る。あるいは、ＨＢＶコア抗原粒子に架橋されるべき多数のキャプシド結合免疫原の中で、所定の免疫原は、その免疫原が結合するペプチドのアミノ末端に配置され得るが、一方、別の免疫原は、その免疫原が結合するペプチドのカルボキシ末端に配置され得る。いくつかの場合において、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドの各末端に同じ免疫原または異なる免疫原を配置することは、有利であり得る。所定のＨＢＶコア抗原粒子に架橋されるべきＨＢＶキャプシド結合ペプチド−免疫原複合体の構成のこのようなバリエーションは、有利なことに、非常に多成分または多価のＨＢＶコア抗原粒子を提供する。図１を参照のこと。
【００６１】
従って、このＨＢＶコア抗原粒子に架橋されるべきキャプシド結合免疫原の配置は、生じる粒子の最終的な免疫原性または多価性にとって重要である。その免疫原が、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドのアミノ末端に位置付けられている場合、より高い免疫原性または多価性が予期される。このような配置（より大きな可撓性を付与する）もまた、大きなサイズの免疫原にとって好ましい。
【００６２】
（ＨＢＶコア抗原粒子へのキャプシド結合免疫原の結合）
キャプシド結合免疫原は、従来の任意の架橋剤を使用して、ＨＢＶコア抗原粒子に架橋され得る。このような架橋剤としては、例えば、多官能性架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド、スクシンアルデヒド、オクタンジアルデヒド、およびグリオキサール（ｇｌｙｏｘｏｌ））が挙げられる。さらなる架橋剤は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９９７）に列挙されている。他の架橋剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）のような架橋剤が挙げられ、これらは、隣接する一級アミノ基とカルボキシル基を結合してアミド結合を形成する。キャプシド結合免疫原／ＨＢＶコア抗原粒子混合物に添加された場合、このような薬剤は、このペプチドの利用可能なリジン成分を、ＨＢＶコア抗原からの隣接するアスパラギン酸またはグルタミン酸に共有結合的に架橋する。
【００６３】
所定のＨＢＶコア抗原粒子に結合される異なる免疫原の比率は、もちろん、ＨＢＶコア抗原粒子にキャプシド結合免疫原を結合するために使用される混合物中の個々の免疫原の相対比率によって変化され得ることもまた、理解されるべきである。
【００６４】
（本発明に従う治療組成物）
本発明はまた、本明細書中に開示される多成分または多価のＨＢＶコア抗原粒子を用いての個体の治療処置または予防処置に有用な、組成物を提供する。任意の個体（ヒトおよび他の哺乳動物を含む）ならびに任意の動物が、本明細書中に開示されるＨＢＶコア抗原粒子を用いて処置され得る。治療組成物は、薬学的に有効な量（すなわち、その組成物がいくらかの期間にわたって投与される個体において、１つ以上の感染性因子に対して免疫するか、または１つ以上の状態を処置するために有効である量）のＨＢＶコア抗原粒子を含む。予防組成物は、予防的に有効な量（すなわち、その組成物がいくらかの期間にわたって投与される個体において、１つ以上の状態を予防するために有効である量）のＨＢＶコア抗原粒子を含む。
【００６５】
このＨＢＶコア抗原粒子が、異なる型の複数の免疫原を含む場合、この粒子を含む組成物およびワクチンは、個体において各成分免疫原に対する増強した免疫応答を惹起するために使用され得る。このＨＢＶコア抗原粒子が、共通の型の複数の免疫原を含む場合、この粒子を含む組成物およびワクチンは、個体においてその共通の免疫原に対する増強した免疫応答を惹起するために使用され得る。この後者の組成物およびワクチンは、従来の単独療法(ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ）と比較した場合に、増強された一価性および能力によって特徴付けられる。
【００６６】
本発明の多成分または多価のＨＢＶコア抗原粒子を含む組成物は、単独でか、または薬学的調製物もしくは予防調製物（徐放性処方物を含む）の一部として（アジュバントを含んでも含まなくても）、投与され得る。これらは、このような感染の処置のための投与に適切な、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含み得る。適切な、薬学的に受容可能なキャリアは、生理学的に不活性および／または非毒性である。多数のキャリアが、当該分野で公知であり、そして所望の適用に基づいて選択され得る。例示的キャリアとしては、以下があげられるが、これらに限定されない：滅菌した、生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ミョウバン、アルミナ、水酸化アルミニウム、ペクチン（ｐｅｐｔｉｎ）、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、および水。さらに、このキャリアまたは賦形剤は、時間遅延（ｔｉｍｅ ｄｅｌａｙ）材料（例えば、モノステアリン酸グリセロールまたはジステアリン酸グリセロール）を、単独でか、またはろうと組み合わせて、含み得る。さらに、従来の徐放性ポリマー処方物（例えば、可溶性ガラスを含む）が、使用され得る。
【００６７】
おそらく、多成分または多価のＨＢＶコア抗原粒子を含む組成物は、他の治療剤または予防剤を含み得る。例えば、このような組成物は、感染の処置または予防にて有用な複数の試薬の「カクテル」を含み得る。１つのこのようなカクテルは、他の試薬（例えば、インターフェロン、ヌクレオシドアナログおよび／またはＮ−アセチル−システイン）を含み得る。
【００６８】
必要に応じて、免疫原性ＨＢＶコア抗原粒子を含む組成物は、患者において抗体応答およびＴ細胞応答をさらに誘導するために有用であるアジュバントまたはサイトカインのような免疫系修飾因子をさらに含有し得る。このような修飾因子には、従来のミョウバンベースのアジュバント、またはムラミルジペプチド、保存剤、化学安定剤、またはその他の抗原性タンパク質が含まれる。代表的には、安定剤、アジュバント、および保存剤などは、所望の適用における効力について最良の処方物を決定するために最適化される。適切な保存剤は、クルリルブチノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫酸、プロピルガラード（ｐｒｏｐｙｌ ｇａｌｌａｄｅ）、パラベン、グリセリン、およびフェノールを含み得る。
【００６９】
これらの組成物の適切な量は、所望の応答のレベルに基づいて決定され得る。一般に、免疫原性ＨＢＶコア抗原粒子を含む組成物は、約５μｇと約２００μｇとの間の粒子を含有し得る。このような組成物は、１回または一連の接種（例えば、２ヶ月〜６ヶ月の間隔での３回の接種）として投与され得る。適切な投薬量はまた、処置している担当医の判断によって、患者の健康状態、体重、または年齢、ならびに単独療法として投与される場合の成分免疫原の一般的な投薬量のようなファクターを考慮して、決定され得る。患者の状態または所定の病原への曝露の増大の可能性の改善時に、免疫原性ＨＢＶコア抗原粒子を含む維持用量の組成物が、必要であれば、投与され得る。結果として、投与の投薬量または頻度、あるいはその両方は、所望の効果が維持できるレベルまで減少され得る。その時点では、処置は、中止すべきである。しかし、個体は、所定の所望でない状態の再発時には、長期ベースの間欠的な処置を必要とし得る。
【００７０】
複数成分または多価のＨＢＶコア抗原粒子を含む組成物は、任意の適切な経路（例えば、非経口投与（特に、筋肉内または皮下）および経口投与のような）で投与され得る。その他の経路（例えば、肺、鼻、耳、肛門、皮膚、眼、静脈内、動脈内、腹腔内、粘膜内、舌下、皮下、および頭蓋内）が使用され得る。
【００７１】
本発明の免疫原性ＨＢＶコア抗原粒子は、ＨＢＶ感染個体の能動的な治療において、体内でのそのウイルスの増殖を阻害、減少、または遅延するために使用され得る。治療用組成物は、そのウイルスの構築機構を不能に、阻害、または防止し得る免疫原性ＨＢＶコア抗原粒子を含む。このような治療用組成物は、キャリアまたは希釈剤、および本発明の１つ以上の免疫原性ＨＢＶコア抗原粒子を含有するように処方され得る。このようなキャリアおよび希釈剤は、特定の他の組成物と組み合わせて上記にて考察され、そして当業者には理解され得る。
【００７２】
有効成分として免疫原性ＨＢＶコア抗原粒子を含有する組成物またはワクチンの調製は、注射可能な組成物またはワクチンを、液体溶液または懸濁液のいずれかとして処方するために実施され得る。注射前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態もまた調製され得る。調製物はまた、特定の実施形態において、徐放および／または長期の送達のために、リポソーム中または可溶性ガラス中に乳化され得るか、またはカプセル化され得る。あるいは、調製物は、エアロゾルまたはスプレーの形態であり得る。それらはまた、経皮パッチ中に含められ得る。有効成分は、薬学的に受容可能であり、そして有効成分と適合性である任意の数の賦形剤と混合され得る。このような賦形剤には、例えば、フロイントの不完全、細菌リポポリサッカライド、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、ムラミルジペプチド、レシチン、緩衝液物質、セルロースベースの物質、およびポリエチレングリコールが含まれる。
【００７３】
有利には、本発明に従うＨＢＶコア抗原粒子を含むワクチンは、組み合わせワクチンであり得、これは多数の異なる免疫原を含む。このようなワクチンは、例えば、ジフテリア、破傷風、無細胞百日咳、インフルエンザ菌、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、水痘、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、または肺炎球菌性肺炎のうちの２つ以上に対する免疫原を含む組み合わせワクチンを含む。その他のワクチンには、国際旅行前の個体の接種のためのものが含まれる。このようなワクチンには、例えば、黄熱病、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、腸チフス、髄膜炎菌性脳炎、またはコレラのうちの２つ以上に対する免疫原を含むワクチンが含まれる。
【００７４】
本発明のＨＢＶコア抗原粒子を含む組成物はまた、動物アレルゲン、昆虫アレルゲン、植物アレルゲン、大気アレルゲン、および吸入アレルゲンのような１つ以上のアレルゲンに対して個体を脱感作するために免疫治療レジメンにおいて使用され得る。
【００７５】
本発明の代替の実施形態に従って、ＨＢＶコア抗原粒子は、免疫治療または診断における使用のために、目的の免疫原に対する抗体を惹起するために使用され得る。例えば、ＨＢＶコア抗原粒子を接種された個体において惹起された抗体は、単離され得、そして精製された形態で使用され得る。あるいは、個体由来のこのような抗体またはＢ細胞は、従来の技術を使用してモノクローナル抗体を産生するために利用され得る。
【００７６】
（本発明に従う検出方法）
本発明のＨＢＶコア抗原粒子はまた、感染または感染性因子への曝露の診断のための多数の従来のアッセイ形式（特に、イムノアッセイ形式）において使用され得る。このような有用性は、本発明の構築物のＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分が、診断標識、化学マーカー、トキシン、または別のタンパク質もしくはペプチドと結合した場合に実現される。例えば、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、所定のＨＢＶコア抗原結合ペプチドへ結合した免疫原への曝露の際に、単独で、あるいは他の組成物または化合物と組み合わせて、サンプル中の標的分析物の存在を指示する検出可能なシグナルを提供し得る従来の標識と結合され得る。このような検出可能な標識は、診断アッセイの当業者に公知の、および容易に入手可能な多数の組成物の中から選択され得る。
【００７７】
本発明は、それゆえ、特定のアッセイ形式の選択に限定されず、そして当業者に公知のアッセイ形式を包含すると考えられる。簡便のために、アッセイのための試薬は、キットの形態で提供され得る。これらのキットは、本発明のＨＢＶコア抗原粒子が予め吸着されたマイクロタイタープレート、種々の希釈剤および緩衝剤、特異的に結合したキャプシド結合ペプチド免疫原の検出のための標識化結合体、ならびにその他のシグナル生成試薬（例えば、酵素基質、補因子、およびクロモゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ））を含み得る。他の成分は、当業者に容易に決定され得る。
【００７８】
あるいは、本発明のＨＢＶコア抗原粒子は、病原体検出のために現在利用可能である免疫学的診断試験（すなわち、ラジオイムノアッセイまたはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ））に使用され得る。
【００７９】
本発明の１つの実施形態において、種々の免疫原に対する抗体の存在について試験されるべきサンプルは、そのサンプル中の任意の抗体が１つ以上のＨＢＶキャプシド結合免疫原との複合体を形成し得るのに充分な時間、異なる免疫原性成分を有する検出可能に標識されたＨＢＶキャプシド結合免疫原を含むＨＢＶコア抗原粒子と接触され得る。次いで、検出手段が使用され、その複合体がそのサンプル中でキャプシド結合免疫原とその抗体との間に形成され得る。次いで、第２のスクリーニングを、各成分免疫原に基づいてサンプル上で行い、そのサンプル中の抗体の特異性を同定し得る。
【００８０】
本発明の代替の実施形態において、特定の免疫原に対する抗体の存在について試験されるべきサンプルは、その特異的免疫原をその免疫原性成分として有する検出可能に標識されたＨＢＶキャプシド結合免疫原を含むＨＢＶコア抗原粒子と、そのサンプル中の任意の抗体が１つ以上のＨＢＶキャプシド結合免疫原と複合体を形成し得るのに充分な時間、接触され得る。ＨＢＶコア抗原粒子によって実証される多価の（ｈｉｇｈ ｖａｌｅｎｃｙ）特異的免疫原のために、このような診断アッセイは、従来のアッセイよりも高い感度によって特徴づけられる。
【００８１】
（実施例）
本明細書に記載される発明がより充分に理解されるために、以下の実施例が示される。これらの実施例は、例示目的のためのみであり、いかなる様式においても本発明を限定するものとは解釈されるべきではないことが理解されるべきである。
【００８２】
（実施例１）
（ＨＢＶコア抗原調製物）
ＨＢＶコア抗原（ａａ３〜１８３）またはＣ末端短縮ＨＢＶコア抗原（ａａ３〜１４８）のいずれかのＥ．ｃｏｌｉ中での発現および精製を、ＤｙｓｏｎおよびＭｕｒｒａｙ（１９９５）に記載されるように行った。タンパク質調製物を、４℃で、ＴＢＳ、スクロース（２０％）、およびＮａＮ3（０．０２％）を含有する緩衝液中にクロース勾配画分として保存した。調製物は、少なくとも６ヶ月間この形態で安定であった。
【００８３】
（ＨＢＶキャプシド結合ペプチドのＨＢＶコア抗原への化学架橋）
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドＭＨＲＳＬＬＧＲＭＫＧＡ（Ａｌｂａｃｈｅｍ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｂｕｒｇｈ）を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホＮＨＳ）（いずれもＰｉｅｒｃｅ Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．から入手）を使用して、ＨＢＶコア抗原粒子に架橋した。これらの試薬は、隣接する一級アミノ基およびカルボキシル基を連結して、アミド結合を形成する［Ｓｔａｒｏｓら、「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｂｙ Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｏｆ Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｃａｒｂｏｎｄｄｉｍｉｄｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５６，２２０−２２頁（１９８６）］。ＨＢＶキャプシド結合ペプチド／ＨＢＶコア抗原混合物に添加された場合、それらはペプチドからのリジンを、ＨＢＶコア抗原からの隣接するアスパラギン酸またはグルタミン酸に共有結合して、その分子量を増大させるべきである。
【００８４】
より詳細には、短縮型ＨＢＶコア抗原（１５μｇ）を、室温で、リン酸カリウム（２５ｍＭ、ｐＨ７）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、（ＥＤＣ １．８ｍＭ）およびスルホＮＨＳ（１．８ｍＭ）を含有する緩衝液（３０μｌ）中で、ペプチドＭＨＲＳＬＬＧＲＭＫＧＡ（１ｍＭ）の存在下または非存在下でインキュベートした。
【００８５】
１８時間後、その反応物を記載されたように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９））ＳＤＳ／ＰＡＧＥ（１５％ｗ／ｖ）によって分析した。ＥＤＣおよびスルホＮＨＳのペプチドＨＢＶコア抗原粒子複合体への添加により、ＨＢＶコア抗原の画分に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に生じる約１ｋｄに対応するバンドのシフトを生じた。種々の条件下での数回の反応にもかかわらず、シフトしたタンパク質バンドの５０％を超える収量は得られなかった。これは、ＨＢＶコア抗原のダイマーに対して１つのペプチドの結合と一致し、局所的２倍軸に近く、従って、２倍関連部位への別のペプチドの結合を立体的にブロックしている。
【００８６】
（実施例２）
（ＨＢＶコア抗原調製物）
実施例１で調製された２つのコア抗原サンプルに加えて、短縮型ＨＢＶコア抗原ポリペプチド（残基１４４にて短縮された）に短いリンカーペプチド配列を介して結合した、ＨＢＶプレＳ１配列１〜３６またはＨＢＶ表面抗原配列１１１〜１５６もしくは１１１〜１６５を有するＨＢＶコア抗原のサンプルもまた、ＳｔａｈｌおよびＭｕｒｒａｙ（１９８９）によって記載されたように調製された。
【００８７】
（ＨＢＶキャプシド結合ペプチドのＨＢＶコア抗原への化学架橋）
固相合成によって作製された以下のキャプシド結合免疫原は、Ａｌｂａｃｈｅｍ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈから得た：
ＡＳ−１５１ ＧＳＬＬＧＲＭＫＧＡ ＧＧＧ ＬＤＰＡＦＲＧ
ＡＳ−１５２ ＧＳＬＬＧＲＭＫＧＡ ＧＧＧ ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ
ＡＳ−１６３ ＬＤＰＡＦＲ ＧＧ ＣＳＬＬＧＲＭＫＧＡ
ＡＳ−１６４ ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ ＧＧ ＧＳＬＬＧＲＭＫＧＡ
ここで、配列ＧＳＬＬＧＲＭＫＧＡは、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドであり、配列ＬＤＰＡＦＲは、ＨＢＶプレＳ１エピトープまたは免疫原であり、そして配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬは、ｍｙｃ癌遺伝子エピトープまたは免疫原である。これらのペプチドおよび塩基性ＨＢＶキャプシド結合ペプチドＧＳＬＬＧＲＭＫＧＡは、ＨＢＶコア抗原粒子に、異なる濃度で、別々に、または組み合わせて結合し、そして実施例１に記載のようにＥＤＣまたはスルホＮＨＳと架橋した。
【００８８】
（得られるＨＢＶコア抗原粒子の特性）
その産物を、アクリルアミドゲル中でＳＤＳの存在下で（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、電気泳動によって分析し、次いでクーマシーブルーによって染色し、そしてＨＢＶコア抗原粒子または変性ＨＢＶ表面抗原粒子に対して惹起されたモノクローナル抗体およびポリクローナルウサギ血清を用いてウエスタンブロット分析した。ＨＢＶプレＳ１エピトープおよびｍｙｃ癌遺伝子エピトープの各々に対するモノクローナル抗体が入手可能である。これらは、それぞれ、モノクローナル抗体１８／７［Ｋ．Ｈ．Ｈｅｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５２，３９６〜４０２頁（１９８４）］およびモノクローナル抗体９Ｅ１０［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｒ９５０−２５］である。
【００８９】
これらの実験は、全ての架橋反応からの産物が、連結反応成分における構成性エピトープの各々に対する抗体に対して陽性反応を示したことを実証した。陽性反応物を、リガンドペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端を介して結合した免疫原を用いて得た。
【００９０】
以下に詳述するように、共通のＨＢＶキャプシド結合ペプチドリガンドを使用する２つ以上の異なる免疫原との架橋を含む反応物からの精製されたＨＢＶコア抗原粒子の調製物は、全ての成分免疫原に対する抗体と反応する。さらに、免疫原の１つに対して特異的な抗体で沈殿するＨＢＶコア抗原粒子は、リガンド架橋手順に含まれる他のペプチドに対する抗体との交差反応性を示す。
【００９１】
連結産物を、スクロース勾配を介する限界濾過に供した。これらを、抗体の１つ（抗ｍｙｃ抗体）を用いて沈殿させ、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって分析した。
【００９２】
抗体の１つ（例えば、抗ｍｙｃ抗体）で沈殿させた材料は、ウエスタンブロットにおいて、抗ｍｙｃ抗体および抗プレＳ１抗体の両方との強力な交差反応性を示した。他の抗体（抗プレＳ１抗体）で沈殿させた産物もまた、同じことを示した。
【００９３】
異なる免疫原を有する２つのＨＢＶキャプシド結合ペプチドを結合について異なる比率で混合し、そしてコア粒子に架橋した反応において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによる分析は、２つのモノクローナル抗体での染色の相対的な強度は、架橋のために使用された混合物中の２つの免疫原の比率を反映することを示した。
【００９４】
これらの実験は、反応物から生じるＨＢＶコア粒子の少なくともいくつかが、それに共有結合した両方の免疫原を有することを示した。リガンドペプチドは、ＨＢＶコア抗原粒子（ヌクレオキャプシド）の先端に結合するので、そのような調製物は、両方の成分について高い免疫原性効力を示し、そしてこれらが投与された個体において高い抗体力価を誘発することが予想される。
【００９５】
本発明者らは、上記において、本発明の多数の実施形態を提示してきたが、本発明者らの基本的な構成が改変されて、本発明のプロセスを利用する他の実施形態を提供し得ることが明らかである。従って、本発明の範囲は、例示として上記に提示された特定の実施形態ではなく、むしろ、本明細書に添付の特許請求の範囲によって規定されることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、種々のキャプシド結合免疫原を含むＨＢＶコア抗原粒子の構造を示す。「キャプシド結合免疫原」は、少なくとも一つのＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分および少なくとも一つの免疫原性成分を含む。各キャプシド結合免疫原は、ＥＢＶキャプシド結合ペプチドを介してＥＢＶコア抗原粒子と連結される。
【図２】図２は、種々の免疫原がＨＢＶキャプシド結合ペプチドを介して連結され得るＨＢＶコア抗原としてもまた役に立ち得る種々のＨＢＶコア抗原融合タンパク質を要約した表である。
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、複数の免疫原特異性により特徴付けられる、Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）コア抗原粒子に関する。より具体的には、本発明は、ＨＢＶコアタンパク質に選択的に結合するＨＢＶキャプシド結合ペプチドであるリガンドによって、ＨＢＶコア抗原粒子に架橋した免疫原、エピトープ、または他の関連する構造を含む、ＨＢＶコア抗原粒子に関する。このような粒子は、さまざまな範囲の免疫原性エピトープ（ＨＢＶキャプシド結合ペプチドを含み、これはまた、ＨＢＶコアタンパク質とＨＢＶ表面タンパク質との間の相互作用をブロックすることにより、有利には、ＨＢＶウイルスのアセンブリを阻害および妨害する）のための送達系として使用され得る。異なる免疫原、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドリガンド、または両方の混合物は、同じＨＢＶコア粒子に架橋され得る。このように生じる多成分ＨＢＶコア粒子または多価ＨＢＶコア粒子は、治療用および予防用のワクチンおよび組成物、ならびに治療組成物およびこれらを使用する方法において、有利に使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
臨床的免疫療法レジメンの第一線は、感染性病原体および他の健康を脅かす因子に対して患者を免疫することを含む。過剰の免疫剤にかかわらず、接種は、せいぜい部分的な免疫を与え得、頻繁な再免疫を必要とする。種々の従来の一価または多価のワクチンは、こういう事情である。そしてこのようなワクチンのうちでさえ、種々の免疫原に対して免疫を惹起し得る単一薬剤の接種剤の数は、限定される。さらに、病原体間の抗原性変動は、従来のワクチンの効力を制限し得る。
【０００３】
このような妨害のために、所与の免疫原に対する免疫系応答の増強のための方法論に、努力が集中されてきた。この目的のために、ＨＢＶ核抗原のＴ細胞依存性決定因子およびＴ細胞非依存性決定因子の操作により架橋した免疫原の免疫性を増強させようと努力して、免疫原性結合体が、免疫原をＢ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）コア粒子（ヌクレオキャプシドまたはヌクレオキャプシド殻とも呼ばれる）に架橋させることによって生成された。例えば、米国特許第４，８１８，５２７号およびＲ．Ｕｌｒｉｃｈら、「Ｃｏｒｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ ａｓ Ｃａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ」、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ．Ｒｅｓ．、５０、１４１〜８２頁（１９９８）を参照のこと。目的のエピトープの増強された免疫原性もまた、少なくとも一部の天然に存在するウイルス粒子形成タンパク質（例えばＨＢＶ表面抗原）および１つ以上の目的のエピトープ部位を含む、ハイブリッドウイルス粒子形成タンパク質を介して、取りかかられた。米国特許第５，９６５，１４０号を参照のこと。このような努力から明らかであるように、ＨＢＶのタンパク質は、目的の免疫原を免疫系に提示するためのプラットフォームとして使用されてきた。
【０００４】
Ｂ型肝炎ウイルスは、血行性ウイルスであり、小さな、部分的に二本鎖のＤＮＡゲノムを含み（４つの広範囲にわたってオーバーラップするオープンリーディングフレームを担持する）内部ヌクレオキャプシドからなり（ＨＢＶコアタンパク質（「ＨＢｃＡｇ」）、ウイルスポリメラーゼおよびウイルスＤＮＡを含む）ＨＢＶ表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）を含む膜性エンベロープにより包囲されている。そのウイルスエンベロープは、３つの異なるが、関連する表面抗原タンパク質（長（Ｌ）、中（Ｍ）および短（Ｓ））を含み、これは、共通のカルボキシ末端領域を共有するが、異なるアミノ末端を有し、連続するオープンリーディングフレーム内の異なる地点の開始トリプレットの可変的使用から生じる。
【０００５】
長いポリペプチド（Ｌポリペプチド）は、プレＳ１、プレＳ２およびＳ領域からなる。それは、リーディングフレーム全体の産物であり、１０８個のアミノ酸（または、１９９個、ウイルスサブタイプに依存する）のプレＳ１ドメインを、そのアミノ末端にて含み、次いで５５個のアミノ酸のプレＳ２ドメイン、および２２６アミノ酸の短いポリペプチド（Ｓポリペプチド）領域が続く。中程度の長さのポリペプチド（Ｍポリペプチド）は、そのアミノ末端にプレＳ２ドメインを有し、次いでＳ領域が続くが、Ｓポリペプチド（これは、最も豊富な形態である）は、Ｓ領域のみからなる。このプレＳ領域は、宿主細胞へのウイルスのアセンブリおよび付着の両方において重要な役割を果たすと考えられている。このＳ形態は、ウイルスにおいて、ＨＢｓＡｇのＭ形態およびＬ形態よりも豊富であり、そしてグリコシル化形態および非グリコシル化形態の両方が存在する［Ｖ．ＢｒｕｓｓおよびＤ．Ｇａｎｅｍ、「Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、１０５９〜６３（１９９１）；Ｖ．Ｂｒｕｓｓら、「Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｏｐｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｌａｒｇｅ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ」、ＥＭＢＯ Ｊ、１３、２２７３〜７９頁（１９９４）；Ａ．Ｒ．Ｎｅｕｒａｔｈら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ ｏｎ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ」、Ｃｅｌｌ、４６、４２９〜３６頁（１９８６）；Ｋ，Ｕｅｄａら、「Ｔｈｒｅｅ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ：Ｌａｒｇｅ Ｓ，Ｍｉｄｄｌｅ Ｓ ａｎｄ Ｍａｊｏｒ Ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｎｅｅｄｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｎｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５、３５２１〜２９頁（１９９１）］。コアの外部表面とエンベロープの内部表面との間の特異的な相互作用は、おそらく、正確なウイルスのアセンブリを導き、そして生じた粒子を安定化させる。
【０００６】
ＨＢＶコアタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて効率的に発現され得る［Ｍ．Ｐａｓｅｋら、「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ」、Ｎａｔｕｒｅ、２８２、５７５−７９（１９７９）］、ここで、それは、２つのサイズ（１８０（Ｔ＝３）サブユニットまたは２４０（Ｔ＝４）サブユニットを含む）の正二十面体殻の中にアセンブリする［Ｒ.Ａ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒら、「Ｔｈｒｅｅ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｒｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｃｅｌｌ、７７、９４３〜５０頁（１９９４）］。そのサブユニットは、ダイマーとしてクラスター化され、そして各ダイマーは、殻の表面上に突出するスパイクを形成する。電子低温顕微鏡法（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）および画像処理を使用して、最近、Ｔ＝４の殻の地図を、６０００を超える個々の粒子の画像から７．４Ａの解像度で作製した［Ｂ．Ｂｏｔｔｃｈｅｒら、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｏｌｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ ３８６、８８−９１（１９９７）］。これは、そのポリペプチド鎖の折り畳みを明らかにし、その大部分はαヘリカルであって、以前に解析されたウイルスキャプシドと全く異なっていた。各ダイマースパイクは、一対の長αヘリカルヘアピンによって形成され、１つはダイマー内の各モノマーに由来する［Ｂｏｔｔｃｈｅｒら、（１９９７）；Ｊ．Ｆ．Ｃｏｎｗａｙら、「Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ４−Ｈｅｌｉｘ Ｂｕｎｄｌｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ ｂｙ Ｃｒｙｏｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ、３８６、９１−９４頁（１９９７）］。折り畳みに対するアミノ酸配列に上書きした番号付けスキーム［Ｂｏｔｔｃｈｅｒら、（１９９７）］は、ＨＢＶコアタンパク質の主要な免疫優性領域をスパイクの先端における７８−８２アミノ酸の周りに配置した［Ｊ．Ｓａｌｆｅｌｄら、「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ Ｃｏｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ Ｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ｆｒｏｍ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６３、７９０−８００頁（１９８９）；Ｍ．Ｓａｌｌｂｅｒｇら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌｉｎｅａｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ ｆｏｒ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｃｏｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎ」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、３３、２４８−５２頁（１９９１）］。
【０００７】
ＨＢＶウイルスアセンブリを阻害する薬剤は、ＨＢＶのコア抗原に結合し、それにより、ＨＢＶコアタンパク質とＨＢＶ表面タンパク質との間の相互作用をブロックする薬剤を含む。そのようないくつかのＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１８８１８およびＭ.Ｒ．ＤｙｓｏｎおよびＫ．Ｍｕｒｒａｙ、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ：Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ Ｃｏｒｅ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、２１９４−９８頁（１９９５）。
【０００８】
以下の開示から明らかであるように、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、単一または複数の免疫原に対する増強された免疫応答を誘発する能力によって特徴付けられるＨＢＶコア抗原粒子を構築するためのリガンドとして有利に使用され得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の開示）
本発明は、一つ以上の成分の免疫原に対して増強された免疫原性を誘発するＨＢＶコア抗原粒子を提供することにより上記で言及される問題に取り組む。そのような多成分のＨＢＶコア抗原粒子または多価ＨＢＶコア抗原粒子は、免疫原、エピトープ、または他の関連構造を含み、ＨＢＶコア抗原粒子と選択的に結合するペプチドであるリガンドを介してそれらと架橋され、さらに、免疫原性ドメインまたはエピトープが、コード配列の遺伝子操作またはポリペプチド合成によってＨＢＶコア抗原ポリペプチドに付着されるか、または挿入される。そのような、粒子は、多様な範囲の免疫原性エピトープの送達系として使用され得、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドを含み、これはそれ自身で、ＨＢＶコアタンパク質とＨＢＶ表面タンパク質との間の相互作用をブロックすることによりＨＢＶウイルスアセンブリを阻害および妨害する。生じた多成分のＨＢＶコア粒子または多価ＨＢＶコア粒子は、治療および予防ワクチンおよび組成物、ならびに診断的組成物およびそれらを使用する方法において有利に使用され得る。
【００１０】
本発明は、異なる免疫原の混合物、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドリガンドまたは両方が、同じＨＢＶコア粒子と架橋されることを有利に可能にする。その結果は、Ｔ細胞の有効な刺激剤であり、そして免疫学的に多価である単一粒子である。従って、単一抗原提示細胞は、特異性の異なる複数のＢ細胞クローンの増殖を刺激し得る。
上記に加えて、本発明は、以下を提供する。
（項目１） 複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、該粒子が、少なくとも１つのキャプシド結合免疫原を含み、該キャプシド結合免疫原が、少なくとも１つのＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分および少なくとも１つの免疫原性成分を含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、該粒子が個体に投与される場合に、前記キャプシド結合免疫原性成分が免疫応答を誘発させるように該粒子上に配向されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目３） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記キャプシド結合免疫原が、前記ＨＢＶキャプシドペプチド成分の任意のアミノ酸残基を通じて該粒子に連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目４） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記キャプシド結合免疫原が、前記免疫原性成分の任意のアミノ酸残基または他の残基を通じて該粒子に連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目５） 項目４に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分の他の残基が糖質である、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目６） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記キャプシド結合免疫原が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分のアミノ末端を通じて該粒子に連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目７） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記キャプシド結合免疫原が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分のカルボキシ末端を通じて該粒子に連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目８） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記キャプシド結合免疫原が、架橋剤によって該粒子に架橋されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目９） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分に直接またはリンカー配列を通じて連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１０） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分のアミノ末端に直接またはリンカー配列を通じて連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１１） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分のカルボキシ末端に直接またはリンカー配列を通じて連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１２） 項目９〜１１のいずれか１項に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、架橋剤によって前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分に連結されている、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１３） 前記架橋剤が多官能性架橋剤である、項目８に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１４） 前記架橋剤が多官能性架橋剤である、項目１２に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１５） 前記多官能性架橋剤が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリドおよびＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミドからなる群より選択される、項目１４に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１６） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が免疫学的エピトープ、免疫原性エピトープおよび抗原性エピトープからなる群より選択される、１つ以上のエピトープを含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１７） 項目１６に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記エピトープが直鎖状エピトープ、立体配座エピトープ、単一性エピトープ、および混合エピトープからなる群より選択される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１８） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、抗原、アレルゲン、抗原決定基、タンパク質、糖タンパク質、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、抗原または抗原決定基を模倣するミモトープ、ポリペプチド、糖ペプチド、糖質、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドからなる群より選択される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目１９） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、ウイルス、寄生体、マイコバクテリア、細菌、桿菌、真菌、原生動物、植物、ファージ、動物細胞および植物細胞からなる群より選択される病原性因子に標的化されるか、またはこれらの病原性因子から誘導される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２０） 項目１９に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ウイルスが、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ヘパドナウイスル、フラビウイルス、ピコルナウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルス、ハンタウイルス、パルボウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、腫瘍ウイルス、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、トガウイルス、ラブドウイルスおよびポックスウイルスからなる群より選択される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２１） 項目２０に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ウイルスが、ヒト免疫不全１型ウイルス、ヒト免疫不全２型ウイルス、Ｔ細胞白血病ウイルス、単純ヘルペス１型ウイルス、単純ヘルペス２型ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、麻疹様ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、マラリア、デング熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、オンコウイルス、ポリオウイルス、パピローマウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルスおよびワクシニアウイルスからなる群より選択される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２２） 項目１９に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、スピロヘータ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属をに標的化されるか、またはこれらから誘導される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２３） 項目１９に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、ジフテリア、破傷風、無細胞百日咳、インフルエンザ菌、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、水痘、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、肺炎球菌性肺炎、黄熱病、マラリア、腸チフス、髄膜炎菌性髄膜炎またはコレラに標的化される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２４） 項目１８に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記免疫原性成分が、動物アレルゲン、昆虫アレルゲン、植物アレルゲン、大気アレルゲン、および吸入アレルゲンからなる群より選択される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２５） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、該ＨＢＶコア抗原が、ＨＢＶコア抗原融合タンパク質である、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２６） 項目２５に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原融合タンパク質が、免疫学的エピトープ、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２７） 項目２６に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原融合タンパク質が、ＨＢＶコア抗原に直接またはリンカー配列を通じて融合した免疫学的エピトープ、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２８） 項目２６に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原融合タンパク質が、ＨＢＶコア抗原のカルボキシ末端に直接またはリンカー配列を通じて融合した免疫学的エピトープ、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目２９） 項目２６に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原融合タンパク質が、ＨＢＶコア抗原のアミノ末端に直接またはリンカー配列を通じて融合した免疫学的エピトープ、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目３０） 項目２５に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原融合タンパク質が、短縮化ＨＢＶコア抗原を含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目３１） 項目２５に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原融合タンパク質が、ＨＢＶ表面抗原またはその部分を含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目３２） 項目３１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原融合タンパク質が、ＨＢＶ表面抗原のプレＳ１領域、ＨＢＶ表面抗原のプレＳ２領域、ＨＢＶ表面抗原の免疫優性領域、およびそれらの部分からなる群より選択される配列を含む、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目３３） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶコア抗原が、粒子状形態にアセンブリされ得る、全長ＨＢＶコア抗原ポリペプチド、またはその部分、短縮物、変異体または誘導体である、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目３４） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分が、
【化１】
からなる群より選択される、ＨＢＶコア抗原粒子。
（項目３５） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有する、予防的に有効量のＨＢＶコア抗原粒子を含む、ワクチン。
（項目３６） 項目１に記載の複数の免疫原特異性を有する、治療的に有効量のＨＢＶコア抗原粒子を含む、薬学的組成物。
（項目３７） 個体における免疫応答を生成するための方法であって、該方法は、項目１に記載の複数の免疫原特異性を有する、免疫応答を生成するに有効な量のＨＢＶコア抗原粒子を該個体に投与する工程を包含する、方法。
（項目３８） 前記ＨＢＶコア抗原粒子が、非経口経路によって前記個体に投与される、項目３７に記載の方法。
（項目３９） 前記免疫原をＨＢＶキャプシド結合ペプチドを通じてＨＢＶコア抗原粒子に連結することによる、該免疫原の免疫原性を増大させるための方法。
（項目４０） 前記キャプシド結合免疫原が、診断標識または化学マーカーを含む、項目１に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子。
（項目４１） サンプルにおいて免疫原に対する抗体の存在を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）サンプルと、項目４０に記載の複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子とを、該サンプル中の任意の抗体が、該キャプシド結合免疫原と複合体を形成することを可能にするに十分な時間にわたり接触させる工程；および
（ｂ）該サンプル中の該キャプシド結合免疫原と該抗体との間で形成された該複合体を検出するための検出手段を用いる工程、
を包含する、方法。
（項目４２） 少なくとも１つのキャプシド結合ペプチド成分および少なくとも１つの免疫原性成分を含む、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目４３） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分に直接またはリンカー配列を通じて連結されている、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目４４） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分のアミノ末端に直接またはリンカー配列を通じて該粒子に連結されている、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目４５） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分のカルボキシ末端に直接またはリンカー配列を通じて該粒子に連結されている、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目４６） 項目４２〜４４のいずれか１項に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、架橋剤によって前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分に架橋されている、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目４７） 前記架橋剤が多官能性架橋剤である、項目４６に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目４８） 前記多官能性架橋剤が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリドおよびＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミドからなる群より選択される、項目４７に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目４９） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が免疫学的エピトープ、免疫原性エピトープおよび抗原性エピトープからなる群より選択される、１つ以上のエピトープを含む、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５０） 項目４９に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記エピトープが直鎖状エピトープ、立体配座エピトープ、単一性エピトープ、および混合エピトープからなる群より選択される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５１） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、抗原、アレルゲン、抗原決定基、タンパク質、糖タンパク質、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、抗原または抗原決定基を模倣するミモトープ、ポリペプチド、糖ペプチド、糖質、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドからなる群より選択される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５２） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、ウイルス、寄生体、マイコバクテリア、細菌、桿菌、真菌、原生動物、植物、ファージ、動物細胞および植物細胞からなる群より選択される病原性因子に標的化されるか、またはこれらの病原性因子から誘導される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５３） 項目５２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記ウイルスが、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ヘパドナウイスル、フラビウイルス、ピコルナウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルス、ハンタウイルス、パルボウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、腫瘍ウイルス、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、トガウイルス、ラブドウイルスおよびポックスウイルスからなる群より選択される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５４） 項目５３に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記ウイルスが、ヒト免疫不全１型ウイルス、ヒト免疫不全２型ウイルス、Ｔ細胞白血病ウイルス、単純ヘルペス１型ウイルス、単純ヘルペス２型ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、麻疹様ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、マラリア、ダニ媒介脳炎ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルスおよびワクシニアウイルスからなる群より選択される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５５） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、スピロヘータ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属に標的化されるか、またはこれらから誘導される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５６） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、ジフテリア、破傷風、無細胞百日咳、インフルエンザ菌、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎、狂犬病、水痘、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、肺炎球菌性肺炎、黄熱病、マラリア、腸チフス、髄膜炎菌性髄膜炎またはコレラに標的化される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５７） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記免疫原性成分が、動物アレルゲン、昆虫アレルゲン、植物アレルゲン、大気アレルゲン、および吸入アレルゲンからなる群より選択される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５８） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分が、
【化２】
からなる群より選択される、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目５９） 項目４２に記載のＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原であって、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分が、
【化３】
のフラグメントまたはアナログである、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド免疫原。
（項目６０） 項目１に記載のＨＢＶコア抗原粒子であって、前記ＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分が、
【化４】
のフラグメントまたはアナログである、ＨＢＶコア抗原粒子。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記載される本発明が、より十分に理解され得るように、以下の詳細な記載が示される。
【００１２】
本発明の一つの実施形態に従って、一つよりも多い型の免疫原、および１つ以上の型のＨＢＶキャプシド結合ペプチドリガンドが、同じＨＢＶコア粒子に架橋され得る。あるいは、同じ免疫原の複数のコピーが、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドの一つの型に連結され得、ＨＢＶコア粒子上の種々の位置に架橋され得る。本発明に従う多成分または多価ＨＢＶコア抗原粒子は、すべての成分免疫原に対して抗体を誘導するために特に有用である。
【００１３】
免疫原をＨＢＶコア抗原粒子に連結させるＨＢＶキャプシド結合ペプチドの使用は、変性、コンホメーションの崩壊または他の不安定化効果によって、免疫原の免疫原性または安定性を破壊することなしに、増強された免疫原提示を可能にする。例えば、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドリンカーは、成分免疫原が、相互に妨害して機能物質の喪失を引き起こす危険を減少させる。結果として、ＨＢＶコア抗原粒子は、その免疫原成分に対する増強された免疫応答を誘発する。従って、各免疫原が、単一薬剤として投与される場合、必要とされるよりも少ない接種および／または少ない接種物をともなう、所望の治療効果または予防効果を達成することが可能である。
【００１４】
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドを介するＨＢＶコア抗原粒子への免疫原の結合はまた、サイズ、コンホメーションおよび性質が変化した免疫原の提示を可能にする。結果として、本発明は、所定の個人における免疫または処置の広いスペクトルを誘発するのに有用な免疫原の組み合わせを一つのワクチンまたは組成物内に含めることを可能にする。
【００１５】
（免疫原）
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドに連結され得、従ってＨＢＶコア抗原粒子内に組み込まれ得る免疫原としては、一つ以上の免疫性エピトープ、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む任意の分子が挙げられる。そのようなエピトープは、直線性であり得、立体配置的であり得、単一であり得、または性質が混合され得る。
【００１６】
より詳細には、免疫原は、免疫応答を誘発し得る任意の薬剤から選択され得る。そのような薬剤としては、抗原、抗原決定基、タンパク質、糖タンパク質、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、抗原または抗原決定基を模倣するペプチドミモトープ、ポリペプチド、糖ペプチド、糖質、オリゴ糖、多糖、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。免疫原はまた、アレルゲン、毒素、または内毒素であり得る。
【００１７】
そのような薬剤はまた、種々の病原因子（例えば、ウイルス、寄生虫、細菌、真菌、ファージ、原生動物および植物）に標的化されるか、またはこれらに由来するものを含む。そのようなウイルスとしては、レトロウイルス（ヒト免疫不全１型および２型ウイルスならびにＴ細胞白血病ウイルスを含む）；ヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹１型および２型ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス）；オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス；パラミクソウイルス（例えば、ＲＳウイルス、麻疹様ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスおよびパラインフルエンザウイルス）；ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；フラビウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、およびダニ媒介脳炎ウイルス）；ピコルナウイルス（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、口蹄疫ウイルスおよびポリオウイルス；トガウイルス（例えば、風疹ウイルス）；ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）；アデノウイルス、エボラウイルス；バキュロウイルス；ハンタウイルス；パポバウイルス（ｐａｐｏｖｉｒｕｓ）（例えば、パピローマウイルス）；パルボウイルス；ＤＮＡウイルス；ＲＮＡウイルス；ＲＮＡ腫瘍ウイルス（例えば、オンコウイルス）；およびポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）が挙げられる。さらに、免疫原は、杆菌、腸内細菌、クロストリジウム、リステリア、マイコバクテリア、シュードモナス、ストレプトコッカス、真正細菌、マイコプラズマ、クラミジア、スピロヘータ、ナイセリアまたはサルモネラに標的化されたものか、またはこれらに由来するものであり得る。免疫原はまた、以下のヒト免疫不全ウイルスのエピトープから選択され得る：ＧＥＬＤＲＷＥＫＩ（ｇａｇ）；ＥＬＤＫＷＡＳ（ｇｐ４０）；ＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮ（Ｖ３ループ）；ＥＬＤＫＷＡ（ｇｐ４１）およびＤＲＦＹＫＴＫＲＡ（ｇｐ４１）。
【００１８】
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドに連結され得、従ってＨＢＶコア抗原粒子に組み込まれ得る糖タンパク質としては、例えば、抗体、動物細胞もしくはウイルスもしくは細菌の表面成分に由来するか、または似ている糖ペプチド（例えば、髄膜炎を引き起こすようなもの）、またはそのような部分のフラグメントが挙げられる。
【００１９】
当業者に理解されるように、免疫原のサイズは、その官能基がＨＢＶキャプシド結合ペプチドリンカーを妨害することを可能にするほど十分に大きなものであるべきではない。
【００２０】
（ＨＢＶコア抗原タンパク質）
その粒子の性質に起因して、ＨＢＶコア抗原タンパク質は、免疫系に複数の免疫原（類似している型または異なる型）の提示のために有利なプラットフォームを構成する。本発明に従って、この利点は、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドを、ＨＢＶコア粒子に所望の免疫原を付着させるリガンドとして使用することにより、さらに増強される。そのような粒子は、９０または１２０のいずれかのリガンド結合部位（キャプシドスパイク）を含み、各々は、ＨＢＶコア抗原ダイマーから構成された（図１参照のこと）。従って、複数の免疫原は、リガンドとしてのＨＢＶキャプシド結合ペプチドによって、ＨＢＶコア抗原粒子に物理的に連結され得る。生じた粒子は、その成分免疫原の全てに対して免疫応答を誘導し得る。
【００２１】
ＨＢＶコア抗原粒子は、適切な微生物系、動物系、または植物系におけるＨＢＶコア抗原ペプチドに対する組換えコード配列の発現の際に形成され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照のこと。発現されるべきポリペプチドは、全長ＨＢＶコア抗原配列、変異体、誘導体、短縮物（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、またはその部分を含み得、これは、発現系の細胞において粒子形態でアセンブリする能力を保持する。そのようなＨＢＶコア抗原粒子を産生するための組換え方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第４，７１０，４６３号を参照のこと。
【００２２】
あるいは、化学合成法を使用して、ＨＢＶコア抗原ペプチドを産生し得る。化学合成は、ＨＢＶコア抗原ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、固相合成を使用して実行され得る［Ｒ.Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃｅｄ．、２１、４１２頁（１９６４）；Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３、１３８５−９０頁（１９６４）およびＤ.Ｒ．Ｍｉｌｉｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９、１２２３−３１頁（１９８７）］。
【００２３】
当業者は、変異されたＨＢＶコア抗原配列または改変体ＨＢＶコア配列は結合ペプチドまたはリガンドペプチドとの反応に影響を及ぼし得るので、本発明が、ＨＢＶコア抗原サブユニットまたは対応する結合ペプチドもしくはリガンドペプチドにおけるコード配列の操作または他の手順によって、天然改変体または変異に等しく適用されることを理解する。
【００２４】
（ペプチド結合に重要なコアタンパク質残基の変異）
コアタンパク質の折り畳みを決定するために使用される方法は、ＳＬＬＧＲＭＫＧＡ（Ｌ−ＨＢｓＡｇへの結合を阻害するＨＢＶキャプシド結合ペプチド）のコア部分における結合部位を、低温顕微鏡（ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって、位置付けするために適用されている。このアプローチは、現在、Ｔ＝３殻およびＴ＝４殻の両方において、スパイクの先端に結合されるペプチドを示している［Ｂ．Ｂｏｔｔｃｈｅｒら、「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ Ｂｌｏｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ａｓｓｅｍｂｌｙ：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ］、ＥＭＢＯ Ｊ．，１７、６３４９−４５（１９９８）］。画像分析は、ポリペプチド結合部位が、ポリペプチドの折り畳みについて提唱された番号づけスキーム［Ｂｏｔｔｅｃｈｅｒら（１９９７）］においてアミノ酸７８〜８２の領域の残基に対応するスパイクの先端に位置することを示す。コアタンパク質の先端に近い２つの酸性残基（ｇｌｕ７７およびａｓｐ７８）および２つの保存塩基性残基に含まれる選択された結合ペプチドが存在する。結合反応におけるこれらの逆に荷電した残基の重要性は、タンパク質の酸性残基のいずれかのアラニンへの変異が、変化したコア殻に対するペプチドの親和性を大きく減少することが見出され場合に確認された。アスパラギン酸７８をアラニンに変化させると、親和性は１６０倍減少し、グルタミン酸７７をアラニンに変更させると、親和性は１０００倍減少した。このことは、ＨＢＶコア抗原タンパク質上のいずれかまたは両方の酸性残基が、ＨＢＶキャプシド結合タンパク質についての結合部位の少なくとも一部を提供し得ることを示唆する。
【００２５】
これらの結果はまた、リガンド結合についてのスパイクの先端の領域におけるＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列の重要性を例示する。当業者は、いくつかのＨＢＶ株由来のＨＢＶコア抗原が、特定のリガンド−免疫原ペプチドの有効な結合のための変異、または特定のＨＢＶコア抗原改変体に有効に結合するタンパク質へのリガンドの改変体の選択および適合を必要とし得ることを理解する。
【００２６】
（ＨＢＶコア抗原融合タンパク質）
本発明の１実施形態に従って、免疫原がＨＢＶキャプシド結合ペプチドを介して連結され得るＨＢＶコア抗原粒子は、遺伝子融合技術の結果として、１以上の免疫原をすでに提示しているものであり得る。１つのこのような技術において、関連コード配列は、ＨＢＶコア抗原ポリペプチドについてのものを保有する他のプラスミドまたはベクターにおける適切な位置で取り込まれる。
【００２７】
ＨＢＶコア抗原ポリペプチドの発現レベルを増強するために使用したＥ．ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子への融合は、この抗原の最初の２つのアミノ酸の、１１のアミノ酸の配列（β−ガラクトシダーゼのアミノ末端からの８つおよび遺伝子融合において取り込まれたリンカー配列の翻訳から生じた３つのさらなる残基）との置換は、その産物の回収の容易さ、抗原性または形態学に有害な影響を与えなかったことを実証した［Ｓ．Ｓｔａｈｌら、「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９、１６０６−１０頁（１９８２）；Ｂ．Ｊ．ＣｏｈｅｎおよびＪ．Ｅ．Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，「Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｃｏｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｉｎ Ｅ．Ｃｏｌｉ」、Ｎａｔｕｒｅ，２８６、６７７−７８頁（１９８２）］。
【００２８】
本発明に有用なＨＢＶコア抗原融合タンパク質は、Ｓ．Ｊ．ＳｔａｈｌおよびＫ．Ｍｕｒｒａｙ、「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ ｔｏ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、６２８３−８７頁（１９８９）に例示された通りに産生され得る。あるいは、高度に免疫原性の粒子を得るためのＨＢＶコア抗原の主要なセグメントへのポリペプチド配列を融合は、図２に列挙されるような多数のウイルスコード配列とともに例示される。これらは、高度な免疫原性を有する特定の産物を含み、この産物は、ワクシニアウイルスベクターを介して、肝臓ペプチドリンカー配列を介してＨＢＶコア抗原ポリペプチドのアミノ末端に直ぐ続くプレコア配列の６つのアミノ酸に融合されたＶＰ１ペプチド（残基１４２−１６０）の発現によって産生される［Ｂ．Ｅ．Ｃｌａｒｋｅら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ ａｆｔｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ ｔｏ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｃｏｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｎａｔｕｒｅ，３３０、３８１−８４ページ（１９８７）］。他の有用なＨＢＶコア抗原融合タンパク質については、Ｕｌｒｉｃｈら（１９９８）もまた参照のこと。
【００２９】
一連の他の融合タンパク質は、他の代替的コード配列によるＨＢＶコア抗原ポリペプチドのカルボキシ末端でのアルギニンリッチ領域の置換によって特徴付けられる。ＨＢＶ表面抗原の免疫優性領域（残基１１１〜１６５）、プレＳ１およびプレＳ２エピトープ、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のエンベロープタンパク質の種々のセグメントを含むペプチドは、ＨＢＶコア抗原ポリペプチドの残基１４４に付着された。全て物が、Ｅ，ｃｏｌｉにおいて効率的に発現されて、ＨＢＶコア抗原自体の形態と同じ形態を本質的に提示する粒子状生成物を生じた（ＳｔａｈｌおよびＭｕｒｒａｙ，１９８９）。この生成物は、ＨＢＶコア抗原の抗原性反応性を提示し、そして残基１４４で短縮されたＨＢＶコア抗原ポリペプチドの調製物のように、試験されたものもまた、ＨＢＶ ｅ抗原反応性を示したが、一方、全長ＨＢＶコア抗原は、このような活性を非常にわずかしか示さない。ＨＢＶ表面抗原からの残基１１１〜１５６または１１１〜１６５を保有する融合タンパク質は、有意なＨＢＶ表面抗原反応性を提示せず、結果は、この主要なエピトープのコンホメーション依存性、または粒子内で不明瞭である配列の確率と一致しなかった。しかし、融合タンパク質に対する免疫原性応答は、これらの種々の成分エピトープを反映した。
【００３０】
ＨＢＶ表面抗原に対する免疫応答は、Ｌ−ＨＢｓＡｇおよび主要免疫優性のプレＳ１およびプレＳ２領域に存在するエピトープに加えて、領域について複雑であり、多数の可変サブタイプ決定基は、短い他の領域、またはＨＢＶ表面抗原のＳポリペプチドに割り当てられている［Ｇ．Ｌ．ＬｅＢｏｕｖｉｅｒ，「Ｔｈｅ Ｈｅｔｅｔｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１２３、６７１−７５頁（１９７１）；Ｗ．Ｈ．Ｂａｎｃｒｏｆｔら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ａｎｔｉｇｅｎ］、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０９、８４２−４８頁（１９７２）；Ａ．−Ｍ．Ｃｏｕｒｏｕｃｅ−Ｐａｕｔｙ Ｐ．Ｖ．およびＨｏｌｌａｎｄ，「Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ Ａ２：ＨＢｓＡｇ ａｎｄ ｉｔｓ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ］、ｉｎ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，Ｇ．Ｎ．Ｖｙａｓ，Ｓ．Ｎ．ＣｏｈｅｎおよびＲ．Ｓｃｈｍｉｄ編、（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＵＳＡ：Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐｒｅｓｓ），６４９−５４頁）１９７８）］。異なるサブタイプの血清からクローニングされたＨＢＶ ＤＮＡにおいて決定されたＨＢＶ表面抗原コード配列は、対応するタンパク質配列において差異を提示する。しかし、明らかに重要な残基の特異的単一変異は、ある血清学的サブタイプ（ｙ）から別のもの（ｄ）へのスイッチをもたらさなかったが、さらなる単一変異は、同じ分子から提示されるｙおよびｄの両方の反応性および免疫原性との漸進的変化を誘導した［Ｐ．Ｇ．Ａｓｈｔｏｎ−ＲｉｃｋａｒｄｔおよびＫ．Ｍｕｒｒａｙ，「Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ Ｃｈａｎｇｅ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｂｔｙｐｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，２９、２０４−１４（１９８９）］。関与する変異は、コンホメーション感受性免疫優性領域内またはそれに密接してなされ、そして上記のＨＢＶコア抗原に対する融合において使用されるＨＢＶコア抗原のセグメント内に全て存在した。
【００３１】
誘導された抗体のサブタイプ特異性に対する変異の影響は、融合タンパク質はまた、特にそれらがコンホメーションに依存する場合に、目的のエピトープに対する応答の特異性を変化させるための手段を提供し得るという示唆を促した。グリシン145の、アルギニン、天然のエスケープ変異体の模倣物、および他の正もしくは負に荷電した残基（リジンおよびグルタミン酸）への変異は、それゆえ、体液性および細胞性の免疫応答の比較研究についてＨＢｃＳ111-156におけるこの残基でなされた（Ａ．Ｌ．ＳｈｉａｕおよびＫ．Ｍｕｒｒａｙ，「Ｍｕｔｔａｔｅｄ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｆｕｓｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｏｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｄｕｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｈａｔ Ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５１、１５９−６６頁（１９９７）］。全てのものが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて効率的に発現され、強力なＨＢＶコア抗原性を示す予測された粒子状生成物を生じ、そして全てものが、ウサギにおいてＨＢＶコア抗原に対する抗力価の抗体を誘導した。
【００３２】
それらの親タンパク質ＨＢｃＳ111-156のように、３つの残基１４５変異体は、固相ラジオイムノアッセイ（ＡＵＳＲＩＡ；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または溶液における抗体沈降アッセイにおいてＨＢＶ表面抗原に対する抗体と最小の相互作用を示した。しかし、それらは全て、変性条件下でのアクリルアミドゲルにおける電気泳動後のイムノブロット実験において、ウサギ抗ＨＢＶ表面血清との強力な反応を示した［Ａ．Ｌ．Ｓｈｉａｕ，「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｉｔｓ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」、履くし論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，ＵＫ．（１９９３）］。高濃度では、親タンパク質および変異体タンパク質はまた、ＨＢＶコア抗原に対する抗体で被覆された固相上に捕捉される場合、おそらく、抗ＨＢｓＡｇ分子に対する接近を与える粒子のいいくらかの破壊の結果として、ＨＢＶ表面抗原に対する抗体との弱い陽性反応を与えた。（ＳｈｉａｕおよびＭｕｒｒａｙ，１９９７）。
【００３３】
免疫したウサギを使用して、融合タンパク質に対するＴ細胞応答および抗体産生を実験した。免疫後に種々の時間で採取した末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＨＢＶコア抗原に対する曝露に応答する［3Ｈ］−チミジン取り込みに基づく増殖アッセイのために使用したか、または融合タンパク質を免疫のために使用した。全ての場合において、ＨＢＶコア抗原よりも高い刺激指数を示す融合タンパク質との強力な応答が見出され、そして、予測されたように、ＨＢＶ表面抗原は、乏しい刺激因子（ｓｔｉｍｕｌａｎｔ）であった。［128Ｉ］−ＨＢＶ表面抗原を用いる二抗体放射性免疫沈降アッセイ（ｄｏｕｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）［Ｃ．Ｊ．Ｂｕｒｒｅｌｌら、「Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ Ｄｏｕｂｌｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓａｙ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，３、１９２６頁（１９７８）］を使用して、血清サンプルにおける抗ＨＢｓを測定し、そしてＨＢｃＳ111-156に対する予測された陽性応答が示された。アルギニン変異体もまた、このアッセイにおいて陽性応答を生じたが、その親分子よりはいくらか低く、そして弱い応答がグルタミン酸変異体から得られたが、リジン変異体からは何も得られなかった。従って、これらの結果は、アルギニン１４５変異を保有する融合タンパク質（ＨＢｃＳ145Rと称する）が、強力なＴ細胞刺激因子であり、そしてより広範な反応特性を有する抗体を誘導したことを示した。
【００３４】
ＨＢＶコア抗原ポリペプチドに対するＨＢＶ表面抗原ポリペプチド（残基１４５変異体を含む）の種々の部分のさらなる群の融合は、生成物の免疫原性に対する全体のサイズならびに種々のさらなる構成要素の数および位置に対する効果を探索するためになされた［Ｓｈｉａｕ（１９９３）］。これらの構築物は図２に含まれ、そして他の融合物を用いた場合、全てのものが、ＨＢＶコア抗原の形態学を提示する粒子状生成物を生じたが、ＨＢＶコア抗原のアミノ末端でのＨＢｓ111-156フラグメントとの融合は、あまり満足の行くものではなく、不溶性凝集物を形成した生成物を生じた。
【００３５】
この群の産物は、ＨＢｃＳ111-156セグメントを有するより初期のものと同様に、固相上または溶液中でＨＢＶ表面抗原に対する抗体とわずかな反応性を示したか、またはまったく反応性を示さなかったが、固相上のＨＢＶコア抗原に対する抗体によって捕捉された場合、それらは、ＨＢＶ表面抗原に対する抗体との類似の固反応性を示し、そしてこれは、ＨＢｓ111-156に加えてプレＳ１およびプレＳ２を保有する融合物を用いると、いくらか高い（約２倍）。リンパ球増殖阻害についての刺激指標は、また、全ての融合タンパク質およびプレＳセグメントを誘導したものならびにより強力な応答を生じたネイティブまたは変異体ＨＢｓ111-156配列について強力であった。ＨＢｃＳ144配列とＨＢｃＳ111-156配列（野生型または変異体のいずれか）との間のプレＳ１およびプレ２配列の封入は、二抗体放射性免疫沈降アッセイにおいて、プレ５セグメントを欠く融合物より高い抗体レベルを生じたが、ＨＢｃ144配列とプレ５配列との間の第２のＨＢｃＳ111-15６配列の挿入は、任意の応答においてさらなる増強を生成しなかった。プロリン144でＨＢＶコア抗原ポリペプチドに付着した最長のこれらの配列（１６５アミノ酸）は、融合タンパク質の収率または物理的特徴に対する自明の有害な影響を有さなかった。
【００３６】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のコアタンパク質（ＨＣｃ）はまた、部分的および複数の全長コピーにおいて、バリン１４９で短縮されたＨＢＶコア抗原ポリペプチドに融合されている［Ａ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａら、「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｒｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ Ｐａｒｔ ｏｆ Ｃｏｐｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７、６０６４−７０頁（１９９３）］。ＨＣｃ残基３９−３７を保有する融合物は、ごくわずかなＨＣｃ抗原性を示したが、残基１−９１または１８０アミノ残の全長配列は陽性反応を生じ、そして抗原性は、短いリンカーを介する１−１８０配列のさらなるコピー（４つまで）の付加とともにほとんど等差級数的に増加した。電子顕微鏡は、ＨＣｃ残基１−９１の単一のコピーを保有する融合物は、ＨＢＶコア抗原ポリペプチドに形態学的に等しい粒子を形成したが、３つの全長コピーは、この構造を非常に破壊し、そしてこの生成物は、しかし、ＨＢＶコア抗原性を維持した物質を生じるタンパク質分解に対して非常に感受性であった。より大きな融合タンパク質は、７２０よりも多いさらなるアミノ酸をもたらしたが、ＨＢＶコア抗原型の粒子についての制限は、評価的に少ないようである。
【００３７】
プレＳ配列は、ＨＢｃＡｇへの融合の位置の、免疫原性に対する効果の他の研究において使用されてきた。Ｂｏｒｉｓｏｖａら（１９８９）は、プロリン１４４で短縮されたＨＢＶコア抗原に連結されるかまたは全長ＨＢＶコア抗原配列内のこの位置に挿入される、プレＳ１のセグメント（残基２０〜６８、２０〜６９または６９〜１０６）またはプレＳ２の全体との融合を作製した。ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）のエンベロープタンパク質の残基５６〜１０３またはＨＩＶ膜貫通タンパク質（ｇｐ４１）の残基７８〜１２９とのこれらおよび類似の構築物において、ＨＢＶコア抗原に融合された配列は、粒子表面に対して露出されると考えられており、全てについて、抗原性および免疫原性の両方であることが報告されており、そしてＣ末端アルギニンリッチドメインは、明らかにわずかな逆効果しか有さなかった。
【００３８】
Ｆ．Ｓｃｈｏｄｅｌら、「Ｔｈｅ Ｐｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ Ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｒｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６、１０６−１４頁（１９９２）は、プレＳ１またはプレＳ２セグメントが全長ＨＢＶコア抗原のアミノ末端で（プレコア配列に直接またはその一部を介してのいずれかで）または短縮されたＨＢＶコア抗原のカルボキシ末端で付着された場合、近交系マウスにおける融合の位置の免疫原性に対する影響および免疫応答を開発した：さらなる構築物は、ＨＢＶコア抗原の残基７５と８３との間のプレＳ１セグメントならびに短縮されたカルボキシ末端でのプレＳ２セグメント（プロリン１５６）を保有した。
【００３９】
包括的な分析は、ＨＢＶコア抗原のアミノ末端に短いプレコア配列を介して融合されたプレＳ１配列は抗原性であるが、アミノ末端に直接融合されたものは抗原性ではなく、両方は同じＨＢＶコア抗原免疫原性を有したが、プレコア配列を介する融合は、ずっと高い抗プレＳ１応答を刺激したことを示した。短縮されたＨＢＶコア抗原末端でのプレＳ２配列は、両方の状況において同程度に抗原性および免疫原性であったが、残基７６〜８２（これは、主要なＨＢＶコア抗原エピトープを含む）を置換するように内部融合されたプレＳ１配列は、Ｎ末端融合においてよりも、実質的により抗原性であり、そして劇的により免疫原性であった。予測されたように、ＨＢＶコア抗原性および免疫原性は、内部融合タンパク質において非常に減少された。ＨＢＶコア抗原（残基７８〜８２）の、免疫優性エピトープを含むＨＢＶ表面抗原のフラグメントとの置換はまた、陽性のＨＢＶコア抗原性および免疫原性を示す生成物を生じた［Ｇ．Ｂｏｒｉｓｏｖａら、「Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ Ｂｅｒｉｎｇ ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７、３６９６−３７０１（１９９３）］。
【００４０】
さらなる代替として、または上記の融合タンパク質への追加として、免疫原性成分は、化学的架橋手順によって、ＨＢＶコア抗原に付着され得る。
【００４１】
Ｂｏｔｔｃｈｅｒら（１９９７）によって示唆された物理的構造に対するＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列の付加は、ＨＢＶコア抗原のカルボキシ末端で、もしくはその付近で融合された配列の低い抗原性の説明を補助する。なぜなら、このようなセグメントは、ＨＢＶコア抗原粒子に内に埋没されるようであり、一方Ｎ末端融合は、可撓性リンカー配列から利益を受け得、スパイクの足の相対的に限定された空間からさらに免疫原をもたらす。スパイクの先端での免疫優性ＨＢＶコア抗原エピトープの位置［残基７８〜８２；Ｓａｌｆｅｌｄら（１９８９）］は、ＨＢＶキャプシド結合ペプチド−免疫原の挿入または付着についてのこの位置の誘引力を示す。原則的には、すべてのこれらの位置は、所定のＨＢＶコア抗原粒子によって提示されるエピトープの数および／または多様性を増加するために同時に使用され得る。
【００４２】
（ＨＢＶコア抗原粒子に免疫原を連結するために使用されるＨＢＶキャプシド結合ペプチド）
上記のように、目的の免疫原は、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドであるリガンドを使用して、ＨＢＶコア粒子に結合され得る。このようなＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、単離され、精製されたペプチドである。これらのＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、ＨＢＶコアタンパク質とＨＢＶ表面タンパク質との間の相互作用をブロックすることによって、ＨＢＶウイルスのアセンブリを有利に阻害し、そして干渉する。
【００４３】
好ましくは、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、約２アミノ酸と約２０アミノ酸との間の長さであるペプチド、そのフラグメント、アナログ、およびホモログを含む。より好ましくは、このペプチドは、約３アミノ酸〜約１５アミノ酸の間の長さである。このようなペプチドは、下記の表に列挙したペプチド、ならびにそのフラグメントおよびアナログを含む。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「フラグメント」とは、そのフラグメントが由来するペプチドよりも短いが、もとのペプチドの生物学的活性と実質的に類似の生物学的活性を保持する、アミノ酸配列をいう。このようなフラグメントは、少なくとも２アミノ酸の長さである。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「アナログ」とは、ペプチドのアミノ酸配列のバリエーションをいい、このバリエーションは、代表的には、１〜約４アミノ酸の変化によってのみ異なる、アナログを含み得る。アナログの他の例は、本明細書中に例示されるペプチドからの少しのアミノ酸バリエーションを有するペプチドを含む。特に、保存的アミノ酸置換（すなわち、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの内で生じるアミノ酸置換）を含むペプチドは、アナログを構成する。
【００４６】
遺伝子にコードされるアミノ酸は、一般的に、４つのファミリーへと分割される：（１）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性：リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性：グリシン、アスパラギン酸、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時に、芳香族アミノ酸としてともに分類される。ＨＢＶキャプシド結合ペプチドに関して、１つ以上のアミノ酸を変化させることは、有益であり得る。当業者は、このような変化の影響を容易に評価し得る。
【００４７】
用語「ホモログ」とは、参照ペプチドに対して、アミノ酸レベルでの少なくとも６０％同一性、そして好ましくは７５％同一性、そして実質的に類似の生物学的活性を共有する、ペプチドフラグメントを含む。これらの好ましいパーセンテージは、これらのペプチドのサイズの小ささを反映する。
【００４８】
有用なＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、ＤｖｓｏｎおよびＭｕｒｒａｙ（１９９５）に開示されたペプチドに基づくものを含む。このようなペプチドは、融合ファージＢ１中のペプチドＬＬＧＲＭＫに隣接する残基のランダムな変異誘発、およびバイオパニング反応におけるＨＢＶコア抗原に対する再選択の後に合成されて、改良された親和性で抗原に結合する誘導体を生じた。高解像度の電子低温顕微鏡は、このようなＨＢＶキャプシド結合ペプチドが、ＨＢＶコアタンパク質の殻のスパイクの先端に結合することを、示した。感染した細胞におけるＨＢＶコア抗原とＨＢＶ表面抗原タンパク質との間の相互作用に対するこのペプチドの阻害効果を、ＨＢＶゲノムの頭−尾二量体を保有する複製コンピテントプラスミドを用いた、透過性の肝細胞癌Ｈｅｐ Ｇ２細胞のトランスフェクションを介して、このペプチドの存在下または不在下で試験した。Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒら（１９９８）を参照のこと。
【００４９】
このＬＬＧＲＭＫ配列を保有するＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、トランスフェクトされた肝細胞癌細胞培養物中にて、用量依存性様式でＨＢＶの収量を減少させ、そして溶液中のＨＢＶコア抗原とＬ−ＨＢＶ表面抗原との間の反応のこのペプチドによる阻害において、このペプチドについてのＩＣ50値を反映する、相対効力を有した。
【００５０】
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、約１０μＭ未満、好ましくは５μＭ未満、より好ましくは約２μＭ未満、そして最も好ましくは約０．５μＭ未満である、半最大濃度（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＩＣ50）を好ましくは有する。好ましいペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＳＬＬＧＲＭＫＧ（β−Ａ）Ｃ、ＲＳＬＬＧＲＭＫＧＡ、ＨＲＳＬＬＧＲＭＫＧＡ、およびＲＳＬＬＧＲＭＫＧＡ（β−Ａ）Ｃ、あるいはこれら由来のペプチド。あるいは、このようなペプチドは、ペプチドＡＬＬＧＲＭＫＧであり得、このペプチドは、長いＢ型肝炎ウイルス表面抗原（Ｌ ＨＢｓＡｇ）とＨＢｃＡｇとの間の相互作用を阻害し、半最大濃度（ＩＣ50）は、１０．０μＭである。
【００５１】
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、以下によって例証される。ＫDRel（ｎＭ）は、ＨＢＶコア抗原と、ｇｐＩＩＩタンパク質のアミノ末端領域中のペプチド配列を保有するｆｄ融合ファージとの間の反応についての相対解離定数を示す。
【００５２】
【化５】
これらのペプチド（Ｌ ＨＢｓＡｇの細胞質領域を模倣する）は、糸状ファージ上に提示されたランダムヘキサペプチドライブラリーからの選択、およびファージ結合形態にて決定された溶液中でのＨＢＶコア抗原についてのこれらペプチドの親和性によって、同定された。以下の関連ペプチド（以下に列挙した）もまた、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドの例であり、そしてそのＩＣ50μＭ値は、半最大レベルのＨＢＶコア抗原へのＬ ＨＢｓＡｇの結合を阻害するのに必要なペプチドの濃度を示し、Ｎ／Ｄは、観察可能な阻害がないことを示し、そしてβ−Ａは、β−アラニンを示す[ＤｙｓｏｎおよびＭｕｒｒａｙ（１９９５）]：
【００５３】
【化６】
このＨＢＶキャプシド結合ペプチド、そのフラグメント、アナログおよびホモログ（これらは、ＨＢＶコア抗原粒子に対する免疫原を結合するリガンドとして作用し得る）は、好ましくは、従来の合成技術を用いて（例えば、化学合成技術によって）、合成される。あるいは、当業者は、標準的化学（例えば、ｔ−ＢＯＣ化学）を使用する自動ペプチド合成機を使用することによって、これらのペプチドのいずれをも合成し得る。例えば、Ｌ．Ａ．Ｃａｒｐｉｎｏ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７９、４４２７頁（１９５７）を参照のこと。そしてこれらのペプチドは、タンパク質の化学切断または他の方法によって、調製され得る。これらのペプチドは、化学的に合成された場合またはタンパク質の化学切断によって得られた場合に、そのペプチドが、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないように、単離される。
【００５４】
あるいは、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、従来の遺伝子操作技術（例えば、このペプチドをコードする核酸配列で形質転換された宿主細胞における組換えＤＮＡ技術）によって、その選択されたペプチドのコード配列を保有するＤＮＡフラグメントを、宿主微生物または細胞中でクローニングおよび発現することによって、調製され得る。組換え技術によって適切に形質転換された細胞において産生された場合、このペプチドは、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方から、従来の方法を使用して精製され得る。この組換えペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって産生された場合に、そのペプチドが細胞の物質または細胞培地を実質的に含まないように、単離される。このペプチドのコード配列は、合成によって調製されても、または公知の技術によってウイルスＲＮＡに由来しても、または利用可能なｃＤＮＡ含有プラスミドに由来してもよい。
【００５５】
本発明の方法における使用のために、上記のペプチドは、そのペプチドの産生またはＨＢＶコア抗原へのそのペプチドの結合を増大するように、従来から公知である構築物または代替的構築物へと設計され得る。例えば、これらのペプチドは、タンパク質融合パートナーまたはペプチド融合パートナーに、必要に応じて融合され得る。従って、当業者は、選択した融合パートナー（別のペプチド、またはそのペプチドに所望の特徴を付与する他のペプチドもしくはタンパク質）と結合したこのペプチドを設計し得る。
【００５６】
種々の微生物および細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、バチルス細胞、ストレプトミセス細胞、サッカロミセス細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞を含む）においてＨＢＶキャプシド結合ペプチドをクローニングおよび発現するための系ならびにその系に適切なベクターは、公知であり、そして私的および公的な、実験室および寄託機関から、そして商業的供給者から、入手可能である。
【００５７】
組換え生成されようとまたは合成されようと、このＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、従来の精製手段を使用して精製され得る。当業者は、このペプチドが使用される所望の適用に必要な、適切なレベルの純度を容易に決定し得る。
【００５８】
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドリンカーの選択は、ある程度まで、ＨＢＶコア抗原粒子を形成する特定のＨＢＶコア抗原ポリペプチドの性質に依存することが、理解されるべきである。例えば、異なる起源ウイルス株のＨＢＶコア抗原粒子は、異なるＨＢＶキャプシド結合ペプチドリガンドを必要とし得、それは、所定のＨＢＶコア抗原ポリペプチドのリガンド結合部位のアミノ酸配列またはそのリガンド結合部位付近のアミノ酸配列の違いに起因する。
【００５９】
（免疫原とのＨＢＶキャプシド結合ペプチドの結合）
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、目的の免疫原と結合され得て、ペプチド結合を介してキャプシド結合免疫原を形成し得る。この免疫原自体がペプチドである場合、これは、通常は、単一の合成によってか、または形質転換された細胞における、この免疫原配列に結合したＨＢＶキャプシド結合配列を含むペプチド（通常そして好ましくは、この長い方のペプチドの２つの成分間の一定程度の可撓性を付与するために、２〜５（しばしば３）つのグリシン残基を介する）の対応するコード配列の発現によって、従来通りに達成される。あるいは、このペプチドは、この免疫原に架橋され得る。
【００６０】
このペプチドおよび免疫原の結合成分間の結合の配置は、このＨＢＶコア抗原粒子へのキャプシド結合免疫原の架橋のための最終プロセスの効率に影響し得る。あるいは、ＨＢＶコア抗原粒子に架橋されるべき多数のキャプシド結合免疫原の中で、所定の免疫原は、その免疫原が結合するペプチドのアミノ末端に配置され得るが、一方、別の免疫原は、その免疫原が結合するペプチドのカルボキシ末端に配置され得る。いくつかの場合において、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドの各末端に同じ免疫原または異なる免疫原を配置することは、有利であり得る。所定のＨＢＶコア抗原粒子に架橋されるべきＨＢＶキャプシド結合ペプチド−免疫原複合体の構成のこのようなバリエーションは、有利なことに、非常に多成分または多価のＨＢＶコア抗原粒子を提供する。図１を参照のこと。
【００６１】
従って、このＨＢＶコア抗原粒子に架橋されるべきキャプシド結合免疫原の配置は、生じる粒子の最終的な免疫原性または多価性にとって重要である。その免疫原が、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドのアミノ末端に位置付けられている場合、より高い免疫原性または多価性が予期される。このような配置（より大きな可撓性を付与する）もまた、大きなサイズの免疫原にとって好ましい。
【００６２】
（ＨＢＶコア抗原粒子へのキャプシド結合免疫原の結合）
キャプシド結合免疫原は、従来の任意の架橋剤を使用して、ＨＢＶコア抗原粒子に架橋され得る。このような架橋剤としては、例えば、多官能性架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド、スクシンアルデヒド、オクタンジアルデヒド、およびグリオキサール（ｇｌｙｏｘｏｌ））が挙げられる。さらなる架橋剤は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９９７）に列挙されている。他の架橋剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）のような架橋剤が挙げられ、これらは、隣接する一級アミノ基とカルボキシル基を結合してアミド結合を形成する。キャプシド結合免疫原／ＨＢＶコア抗原粒子混合物に添加された場合、このような薬剤は、このペプチドの利用可能なリジン成分を、ＨＢＶコア抗原からの隣接するアスパラギン酸またはグルタミン酸に共有結合的に架橋する。
【００６３】
所定のＨＢＶコア抗原粒子に結合される異なる免疫原の比率は、もちろん、ＨＢＶコア抗原粒子にキャプシド結合免疫原を結合するために使用される混合物中の個々の免疫原の相対比率によって変化され得ることもまた、理解されるべきである。
【００６４】
（本発明に従う治療組成物）
本発明はまた、本明細書中に開示される多成分または多価のＨＢＶコア抗原粒子を用いての個体の治療処置または予防処置に有用な、組成物を提供する。任意の個体（ヒトおよび他の哺乳動物を含む）ならびに任意の動物が、本明細書中に開示されるＨＢＶコア抗原粒子を用いて処置され得る。治療組成物は、薬学的に有効な量（すなわち、その組成物がいくらかの期間にわたって投与される個体において、１つ以上の感染性因子に対して免疫するか、または１つ以上の状態を処置するために有効である量）のＨＢＶコア抗原粒子を含む。予防組成物は、予防的に有効な量（すなわち、その組成物がいくらかの期間にわたって投与される個体において、１つ以上の状態を予防するために有効である量）のＨＢＶコア抗原粒子を含む。
【００６５】
このＨＢＶコア抗原粒子が、異なる型の複数の免疫原を含む場合、この粒子を含む組成物およびワクチンは、個体において各成分免疫原に対する増強した免疫応答を惹起するために使用され得る。このＨＢＶコア抗原粒子が、共通の型の複数の免疫原を含む場合、この粒子を含む組成物およびワクチンは、個体においてその共通の免疫原に対する増強した免疫応答を惹起するために使用され得る。この後者の組成物およびワクチンは、従来の単独療法(ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ）と比較した場合に、増強された一価性および能力によって特徴付けられる。
【００６６】
本発明の多成分または多価のＨＢＶコア抗原粒子を含む組成物は、単独でか、または薬学的調製物もしくは予防調製物（徐放性処方物を含む）の一部として（アジュバントを含んでも含まなくても）、投与され得る。これらは、このような感染の処置のための投与に適切な、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含み得る。適切な、薬学的に受容可能なキャリアは、生理学的に不活性および／または非毒性である。多数のキャリアが、当該分野で公知であり、そして所望の適用に基づいて選択され得る。例示的キャリアとしては、以下があげられるが、これらに限定されない：滅菌した、生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ミョウバン、アルミナ、水酸化アルミニウム、ペクチン（ｐｅｐｔｉｎ）、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、および水。さらに、このキャリアまたは賦形剤は、時間遅延（ｔｉｍｅ ｄｅｌａｙ）材料（例えば、モノステアリン酸グリセロールまたはジステアリン酸グリセロール）を、単独でか、またはろうと組み合わせて、含み得る。さらに、従来の徐放性ポリマー処方物（例えば、可溶性ガラスを含む）が、使用され得る。
【００６７】
おそらく、多成分または多価のＨＢＶコア抗原粒子を含む組成物は、他の治療剤または予防剤を含み得る。例えば、このような組成物は、感染の処置または予防にて有用な複数の試薬の「カクテル」を含み得る。１つのこのようなカクテルは、他の試薬（例えば、インターフェロン、ヌクレオシドアナログおよび／またはＮ−アセチル−システイン）を含み得る。
【００６８】
必要に応じて、免疫原性ＨＢＶコア抗原粒子を含む組成物は、患者において抗体応答およびＴ細胞応答をさらに誘導するために有用であるアジュバントまたはサイトカインのような免疫系修飾因子をさらに含有し得る。このような修飾因子には、従来のミョウバンベースのアジュバント、またはムラミルジペプチド、保存剤、化学安定剤、またはその他の抗原性タンパク質が含まれる。代表的には、安定剤、アジュバント、および保存剤などは、所望の適用における効力について最良の処方物を決定するために最適化される。適切な保存剤は、クルリルブチノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫酸、プロピルガラード（ｐｒｏｐｙｌ ｇａｌｌａｄｅ）、パラベン、グリセリン、およびフェノールを含み得る。
【００６９】
これらの組成物の適切な量は、所望の応答のレベルに基づいて決定され得る。一般に、免疫原性ＨＢＶコア抗原粒子を含む組成物は、約５μｇと約２００μｇとの間の粒子を含有し得る。このような組成物は、１回または一連の接種（例えば、２ヶ月〜６ヶ月の間隔での３回の接種）として投与され得る。適切な投薬量はまた、処置している担当医の判断によって、患者の健康状態、体重、または年齢、ならびに単独療法として投与される場合の成分免疫原の一般的な投薬量のようなファクターを考慮して、決定され得る。患者の状態または所定の病原への曝露の増大の可能性の改善時に、免疫原性ＨＢＶコア抗原粒子を含む維持用量の組成物が、必要であれば、投与され得る。結果として、投与の投薬量または頻度、あるいはその両方は、所望の効果が維持できるレベルまで減少され得る。その時点では、処置は、中止すべきである。しかし、個体は、所定の所望でない状態の再発時には、長期ベースの間欠的な処置を必要とし得る。
【００７０】
複数成分または多価のＨＢＶコア抗原粒子を含む組成物は、任意の適切な経路（例えば、非経口投与（特に、筋肉内または皮下）および経口投与のような）で投与され得る。その他の経路（例えば、肺、鼻、耳、肛門、皮膚、眼、静脈内、動脈内、腹腔内、粘膜内、舌下、皮下、および頭蓋内）が使用され得る。
【００７１】
本発明の免疫原性ＨＢＶコア抗原粒子は、ＨＢＶ感染個体の能動的な治療において、体内でのそのウイルスの増殖を阻害、減少、または遅延するために使用され得る。治療用組成物は、そのウイルスの構築機構を不能に、阻害、または防止し得る免疫原性ＨＢＶコア抗原粒子を含む。このような治療用組成物は、キャリアまたは希釈剤、および本発明の１つ以上の免疫原性ＨＢＶコア抗原粒子を含有するように処方され得る。このようなキャリアおよび希釈剤は、特定の他の組成物と組み合わせて上記にて考察され、そして当業者には理解され得る。
【００７２】
有効成分として免疫原性ＨＢＶコア抗原粒子を含有する組成物またはワクチンの調製は、注射可能な組成物またはワクチンを、液体溶液または懸濁液のいずれかとして処方するために実施され得る。注射前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態もまた調製され得る。調製物はまた、特定の実施形態において、徐放および／または長期の送達のために、リポソーム中または可溶性ガラス中に乳化され得るか、またはカプセル化され得る。あるいは、調製物は、エアロゾルまたはスプレーの形態であり得る。それらはまた、経皮パッチ中に含められ得る。有効成分は、薬学的に受容可能であり、そして有効成分と適合性である任意の数の賦形剤と混合され得る。このような賦形剤には、例えば、フロイントの不完全、細菌リポポリサッカライド、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、ムラミルジペプチド、レシチン、緩衝液物質、セルロースベースの物質、およびポリエチレングリコールが含まれる。
【００７３】
有利には、本発明に従うＨＢＶコア抗原粒子を含むワクチンは、組み合わせワクチンであり得、これは多数の異なる免疫原を含む。このようなワクチンは、例えば、ジフテリア、破傷風、無細胞百日咳、インフルエンザ菌、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、水痘、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、または肺炎球菌性肺炎のうちの２つ以上に対する免疫原を含む組み合わせワクチンを含む。その他のワクチンには、国際旅行前の個体の接種のためのものが含まれる。このようなワクチンには、例えば、黄熱病、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、腸チフス、髄膜炎菌性脳炎、またはコレラのうちの２つ以上に対する免疫原を含むワクチンが含まれる。
【００７４】
本発明のＨＢＶコア抗原粒子を含む組成物はまた、動物アレルゲン、昆虫アレルゲン、植物アレルゲン、大気アレルゲン、および吸入アレルゲンのような１つ以上のアレルゲンに対して個体を脱感作するために免疫治療レジメンにおいて使用され得る。
【００７５】
本発明の代替の実施形態に従って、ＨＢＶコア抗原粒子は、免疫治療または診断における使用のために、目的の免疫原に対する抗体を惹起するために使用され得る。例えば、ＨＢＶコア抗原粒子を接種された個体において惹起された抗体は、単離され得、そして精製された形態で使用され得る。あるいは、個体由来のこのような抗体またはＢ細胞は、従来の技術を使用してモノクローナル抗体を産生するために利用され得る。
【００７６】
（本発明に従う検出方法）
本発明のＨＢＶコア抗原粒子はまた、感染または感染性因子への曝露の診断のための多数の従来のアッセイ形式（特に、イムノアッセイ形式）において使用され得る。このような有用性は、本発明の構築物のＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分が、診断標識、化学マーカー、トキシン、または別のタンパク質もしくはペプチドと結合した場合に実現される。例えば、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドは、所定のＨＢＶコア抗原結合ペプチドへ結合した免疫原への曝露の際に、単独で、あるいは他の組成物または化合物と組み合わせて、サンプル中の標的分析物の存在を指示する検出可能なシグナルを提供し得る従来の標識と結合され得る。このような検出可能な標識は、診断アッセイの当業者に公知の、および容易に入手可能な多数の組成物の中から選択され得る。
【００７７】
本発明は、それゆえ、特定のアッセイ形式の選択に限定されず、そして当業者に公知のアッセイ形式を包含すると考えられる。簡便のために、アッセイのための試薬は、キットの形態で提供され得る。これらのキットは、本発明のＨＢＶコア抗原粒子が予め吸着されたマイクロタイタープレート、種々の希釈剤および緩衝剤、特異的に結合したキャプシド結合ペプチド免疫原の検出のための標識化結合体、ならびにその他のシグナル生成試薬（例えば、酵素基質、補因子、およびクロモゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ））を含み得る。他の成分は、当業者に容易に決定され得る。
【００７８】
あるいは、本発明のＨＢＶコア抗原粒子は、病原体検出のために現在利用可能である免疫学的診断試験（すなわち、ラジオイムノアッセイまたはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ））に使用され得る。
【００７９】
本発明の１つの実施形態において、種々の免疫原に対する抗体の存在について試験されるべきサンプルは、そのサンプル中の任意の抗体が１つ以上のＨＢＶキャプシド結合免疫原との複合体を形成し得るのに充分な時間、異なる免疫原性成分を有する検出可能に標識されたＨＢＶキャプシド結合免疫原を含むＨＢＶコア抗原粒子と接触され得る。次いで、検出手段が使用され、その複合体がそのサンプル中でキャプシド結合免疫原とその抗体との間に形成され得る。次いで、第２のスクリーニングを、各成分免疫原に基づいてサンプル上で行い、そのサンプル中の抗体の特異性を同定し得る。
【００８０】
本発明の代替の実施形態において、特定の免疫原に対する抗体の存在について試験されるべきサンプルは、その特異的免疫原をその免疫原性成分として有する検出可能に標識されたＨＢＶキャプシド結合免疫原を含むＨＢＶコア抗原粒子と、そのサンプル中の任意の抗体が１つ以上のＨＢＶキャプシド結合免疫原と複合体を形成し得るのに充分な時間、接触され得る。ＨＢＶコア抗原粒子によって実証される多価の（ｈｉｇｈ ｖａｌｅｎｃｙ）特異的免疫原のために、このような診断アッセイは、従来のアッセイよりも高い感度によって特徴づけられる。
【００８１】
（実施例）
本明細書に記載される発明がより充分に理解されるために、以下の実施例が示される。これらの実施例は、例示目的のためのみであり、いかなる様式においても本発明を限定するものとは解釈されるべきではないことが理解されるべきである。
【００８２】
（実施例１）
（ＨＢＶコア抗原調製物）
ＨＢＶコア抗原（ａａ３〜１８３）またはＣ末端短縮ＨＢＶコア抗原（ａａ３〜１４８）のいずれかのＥ．ｃｏｌｉ中での発現および精製を、ＤｙｓｏｎおよびＭｕｒｒａｙ（１９９５）に記載されるように行った。タンパク質調製物を、４℃で、ＴＢＳ、スクロース（２０％）、およびＮａＮ3（０．０２％）を含有する緩衝液中にクロース勾配画分として保存した。調製物は、少なくとも６ヶ月間この形態で安定であった。
【００８３】
（ＨＢＶキャプシド結合ペプチドのＨＢＶコア抗原への化学架橋）
ＨＢＶキャプシド結合ペプチドＭＨＲＳＬＬＧＲＭＫＧＡ（Ａｌｂａｃｈｅｍ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｂｕｒｇｈ）を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホＮＨＳ）（いずれもＰｉｅｒｃｅ Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．から入手）を使用して、ＨＢＶコア抗原粒子に架橋した。これらの試薬は、隣接する一級アミノ基およびカルボキシル基を連結して、アミド結合を形成する［Ｓｔａｒｏｓら、「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｂｙ Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｏｆ Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｃａｒｂｏｎｄｄｉｍｉｄｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５６，２２０−２２頁（１９８６）］。ＨＢＶキャプシド結合ペプチド／ＨＢＶコア抗原混合物に添加された場合、それらはペプチドからのリジンを、ＨＢＶコア抗原からの隣接するアスパラギン酸またはグルタミン酸に共有結合して、その分子量を増大させるべきである。
【００８４】
より詳細には、短縮型ＨＢＶコア抗原（１５μｇ）を、室温で、リン酸カリウム（２５ｍＭ、ｐＨ７）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、（ＥＤＣ １．８ｍＭ）およびスルホＮＨＳ（１．８ｍＭ）を含有する緩衝液（３０μｌ）中で、ペプチドＭＨＲＳＬＬＧＲＭＫＧＡ（１ｍＭ）の存在下または非存在下でインキュベートした。
【００８５】
１８時間後、その反応物を記載されたように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９））ＳＤＳ／ＰＡＧＥ（１５％ｗ／ｖ）によって分析した。ＥＤＣおよびスルホＮＨＳのペプチドＨＢＶコア抗原粒子複合体への添加により、ＨＢＶコア抗原の画分に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に生じる約１ｋｄに対応するバンドのシフトを生じた。種々の条件下での数回の反応にもかかわらず、シフトしたタンパク質バンドの５０％を超える収量は得られなかった。これは、ＨＢＶコア抗原のダイマーに対して１つのペプチドの結合と一致し、局所的２倍軸に近く、従って、２倍関連部位への別のペプチドの結合を立体的にブロックしている。
【００８６】
（実施例２）
（ＨＢＶコア抗原調製物）
実施例１で調製された２つのコア抗原サンプルに加えて、短縮型ＨＢＶコア抗原ポリペプチド（残基１４４にて短縮された）に短いリンカーペプチド配列を介して結合した、ＨＢＶプレＳ１配列１〜３６またはＨＢＶ表面抗原配列１１１〜１５６もしくは１１１〜１６５を有するＨＢＶコア抗原のサンプルもまた、ＳｔａｈｌおよびＭｕｒｒａｙ（１９８９）によって記載されたように調製された。
【００８７】
（ＨＢＶキャプシド結合ペプチドのＨＢＶコア抗原への化学架橋）
固相合成によって作製された以下のキャプシド結合免疫原は、Ａｌｂａｃｈｅｍ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈから得た：
ＡＳ−１５１ ＧＳＬＬＧＲＭＫＧＡ ＧＧＧ ＬＤＰＡＦＲＧ
ＡＳ−１５２ ＧＳＬＬＧＲＭＫＧＡ ＧＧＧ ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ
ＡＳ−１６３ ＬＤＰＡＦＲ ＧＧ ＣＳＬＬＧＲＭＫＧＡ
ＡＳ−１６４ ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ ＧＧ ＧＳＬＬＧＲＭＫＧＡ
ここで、配列ＧＳＬＬＧＲＭＫＧＡは、ＨＢＶキャプシド結合ペプチドであり、配列ＬＤＰＡＦＲは、ＨＢＶプレＳ１エピトープまたは免疫原であり、そして配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬは、ｍｙｃ癌遺伝子エピトープまたは免疫原である。これらのペプチドおよび塩基性ＨＢＶキャプシド結合ペプチドＧＳＬＬＧＲＭＫＧＡは、ＨＢＶコア抗原粒子に、異なる濃度で、別々に、または組み合わせて結合し、そして実施例１に記載のようにＥＤＣまたはスルホＮＨＳと架橋した。
【００８８】
（得られるＨＢＶコア抗原粒子の特性）
その産物を、アクリルアミドゲル中でＳＤＳの存在下で（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、電気泳動によって分析し、次いでクーマシーブルーによって染色し、そしてＨＢＶコア抗原粒子または変性ＨＢＶ表面抗原粒子に対して惹起されたモノクローナル抗体およびポリクローナルウサギ血清を用いてウエスタンブロット分析した。ＨＢＶプレＳ１エピトープおよびｍｙｃ癌遺伝子エピトープの各々に対するモノクローナル抗体が入手可能である。これらは、それぞれ、モノクローナル抗体１８／７［Ｋ．Ｈ．Ｈｅｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５２，３９６〜４０２頁（１９８４）］およびモノクローナル抗体９Ｅ１０［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｒ９５０−２５］である。
【００８９】
これらの実験は、全ての架橋反応からの産物が、連結反応成分における構成性エピトープの各々に対する抗体に対して陽性反応を示したことを実証した。陽性反応物を、リガンドペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端を介して結合した免疫原を用いて得た。
【００９０】
以下に詳述するように、共通のＨＢＶキャプシド結合ペプチドリガンドを使用する２つ以上の異なる免疫原との架橋を含む反応物からの精製されたＨＢＶコア抗原粒子の調製物は、全ての成分免疫原に対する抗体と反応する。さらに、免疫原の１つに対して特異的な抗体で沈殿するＨＢＶコア抗原粒子は、リガンド架橋手順に含まれる他のペプチドに対する抗体との交差反応性を示す。
【００９１】
連結産物を、スクロース勾配を介する限界濾過に供した。これらを、抗体の１つ（抗ｍｙｃ抗体）を用いて沈殿させ、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって分析した。
【００９２】
抗体の１つ（例えば、抗ｍｙｃ抗体）で沈殿させた材料は、ウエスタンブロットにおいて、抗ｍｙｃ抗体および抗プレＳ１抗体の両方との強力な交差反応性を示した。他の抗体（抗プレＳ１抗体）で沈殿させた産物もまた、同じことを示した。
【００９３】
異なる免疫原を有する２つのＨＢＶキャプシド結合ペプチドを結合について異なる比率で混合し、そしてコア粒子に架橋した反応において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによる分析は、２つのモノクローナル抗体での染色の相対的な強度は、架橋のために使用された混合物中の２つの免疫原の比率を反映することを示した。
【００９４】
これらの実験は、反応物から生じるＨＢＶコア粒子の少なくともいくつかが、それに共有結合した両方の免疫原を有することを示した。リガンドペプチドは、ＨＢＶコア抗原粒子（ヌクレオキャプシド）の先端に結合するので、そのような調製物は、両方の成分について高い免疫原性効力を示し、そしてこれらが投与された個体において高い抗体力価を誘発することが予想される。
【００９５】
本発明者らは、上記において、本発明の多数の実施形態を提示してきたが、本発明者らの基本的な構成が改変されて、本発明のプロセスを利用する他の実施形態を提供し得ることが明らかである。従って、本発明の範囲は、例示として上記に提示された特定の実施形態ではなく、むしろ、本明細書に添付の特許請求の範囲によって規定されることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、種々のキャプシド結合免疫原を含むＨＢＶコア抗原粒子の構造を示す。「キャプシド結合免疫原」は、少なくとも一つのＨＢＶキャプシド結合ペプチド成分および少なくとも一つの免疫原性成分を含む。各キャプシド結合免疫原は、ＥＢＶキャプシド結合ペプチドを介してＥＢＶコア抗原粒子と連結される。
【図２】図２は、種々の免疫原がＨＢＶキャプシド結合ペプチドを介して連結され得るＨＢＶコア抗原としてもまた役に立ち得る種々のＨＢＶコア抗原融合タンパク質を要約した表である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載される複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子。
【請求項１】
明細書中に記載される複数の免疫原特異性を有するＨＢＶコア抗原粒子。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−７４８６７（Ｐ２００８−７４８６７Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２９２６３４（Ｐ２００７−２９２６３４）
【出願日】平成１９年１１月９日（２００７．１１．９）
【分割の表示】特願２０００−５８５２６６（Ｐ２０００−５８５２６６）の分割
【原出願日】平成１１年１２月３日（１９９９．１２．３）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月９日（２００７．１１．９）
【分割の表示】特願２０００−５８５２６６（Ｐ２０００−５８５２６６）の分割
【原出願日】平成１１年１２月３日（１９９９．１２．３）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
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