ペプチドワクチン
【課題】免疫原性に優れ、より高い抗体産生誘導能を有するペプチドであって、追加投与によっても目的の抗体の産生を増強することのできるペプチドの提供。
【解決手段】細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列、免疫記憶が成立しているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（Ｔ）、抗原の特定の１又は２以上のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（Ｂ）、及び前記Ｔと前記Ｂの間にそれらを連結させるように配置されたリンカーペプチドのアミノ酸配列を含み、該リンカーペプチドのアミノ酸配列がＧＫＫ又はＶＶＫＫであることを特徴とするペプチド、該ペプチドを有効成分として含有する組成物。
【解決手段】細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列、免疫記憶が成立しているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（Ｔ）、抗原の特定の１又は２以上のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（Ｂ）、及び前記Ｔと前記Ｂの間にそれらを連結させるように配置されたリンカーペプチドのアミノ酸配列を含み、該リンカーペプチドのアミノ酸配列がＧＫＫ又はＶＶＫＫであることを特徴とするペプチド、該ペプチドを有効成分として含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性に優れ、抗原に対する抗体の産生を効率よく誘導するペプチド、該ペプチドを有効成分として含有する組成物とその用途に関する。より詳しくは本発明は、ヒトのアミロイドβペプチド（以下、「Ａβペプチド」と略記する。）の特定のＢ細胞エピトープに対する抗体の産生を効率良く誘導するペプチド、該ペプチドを有効成分とするＡβペプチドに起因するアルツハイマー病をはじめとする神経変性疾患の予防及び／又は治療用の組成物とその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体に、特定の抗原に対して特異的な抗体産生のみを誘導する場合には、精製した抗原を単独で、或いは、抗体産生を増強する活性を有する免疫アジュバント（免疫機構を非特異的に刺激することによって、抗原に対する特異的免疫反応を強める物質）と共に生体に投与する方法が一般的に用いられてきた。この方法は、種々の感染症に対する最も有効な予防手段としても汎用されている。
【０００３】
特に抗生物質が無効であるウイルスや、微生物が産生する毒素などのように、他に有効な予防或いは治療方法がない場合には、生体に、これらのウイルスや毒素に対する抗体産生を誘導し、防御することが唯一の対策である場合も多い。現在この方法が実用化されているものとしては、病原微生物を有機溶媒や紫外線照射などで不活化して感染性を無くした不活化ワクチン及び病原体を弱毒化して生体への病原性を弱めた弱毒化ワクチンがある。これらのワクチンはポリオウイルスワクチンなど一部を除き、注射により非経口的に投与されている。しかし、不活化ワクチン、生ワクチンは何れも生体に対してアナフィラキシーショックを与えることがある。さらにウイルス粒子そのもの、或いは、蛋白巨大分子を免疫原として用いるため、ワクチン製剤とした際の安定性を保持するためヒト血清アルブミンやゼラチンなどを製剤の安定剤として用いる場合もあった。このためこれら安定剤に用いた物質に未知の感染性微生物の混入が否定できないこと、或いは、安定剤に対する生体のアナフィラキシーショックが生じることがあった。また大部分のワクチンは注射剤として製剤化されているが、注射剤以外のワクチン製剤も求められている。
【０００４】
一方、不活化ワクチンや生ワクチンよりも高い安全性と有効性をもつ、不活化ワクチンや生ワクチンの部分アミノ酸配列からなるポリペプチドを利用した新型ワクチンの開発研究が世界中で鋭意進められている。Ｂ型肝炎ウイルスワクチンに代表される組換え型ワクチンやコンポーネントワクチンは、その新型ワクチンの代表例である。しかしながら、ワクチンとして利用するポリペプチドの鎖長は短いものほど好ましいものの、短くすればするほど、生体が個別にもつ主要組織適合性抗原（以下、「ＭＨＣ」と略記する。）のクラスＩＩハプロタイプの拘束性を幅広くカバーし、十分な免疫原性を有するようにデザインすることが難しくなる。
【０００５】
経粘膜投与時の抗原の免疫原性を高める方法としては、対象とする抗原とともに、コレラ毒素や大腸菌由来の熱不安定型のエンテロトキシンや、これらのアミノ酸配列の一部を置換して弱毒化したものを免疫アジュバントとして投与する方法が知られている（非特許文献１）。しかしながら、目的とする抗原以外に、免疫アジュバントとして使用したコレラ毒素や大腸菌由来の熱不安定型のエンテロトキシンに対する抗体が産生されるなどの問題があり、実用に供されていない。
【０００６】
本発明者らは、目的とする抗体を免疫アジュバントを用いずに生体内で充分量産生誘導でき、且つ、安全に投与できるペプチドワクチンの提供を検討し、新規構造特性を有するペプチドを開発した（特許文献１）。すなわち、特許文献１には、アミノ末端（以下、「Ｎ末端」と略称する。）側にＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、リンカーペプチドをはさんで、そのカルボキシ末端（以下、「Ｃ末端」と略称する。）側にＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するペプチド内に、細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を有するペプチドが開示されている。このような構造を有するペプチドは、免疫アジュバント非存在下で経鼻などの経粘膜投与した場合に、複数のＭＨＣ クラスＩＩハプロタイプにおいて、目的とする抗原に対する特異抗体の充分な産生を効率よく増強した。しかも、上記ペプチドは、目的とする特異抗体以外の抗体の産生誘導能が低く、また、アナフラキシーなどの副作用を誘発しない安全性の高いポリペプチドであることを明らかにした。さらには、上記ポリペプチドが免疫アジュバント効果を有することを明らかにした。
【０００７】
本発明者らは、さらに、特許文献１に開示された構造特性に基づいて、ヒトＡβに対する抗体の産生を効率よく誘導するペプチドを作製し、本願ペプチドをアルツハイマー病の治療に利用できることを開示した（特許文献２）。すなわち、特許文献２には、Ｎ末端側に免疫記憶の成立しているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（以下、「Ｔ」と略記する場合がある。）を有し、リンカーペプチド（以下、「Ｌ」と略記する場合がある。）をはさんで、そのＣ末端側にＡβペプチドの１又は２以上のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（以下、「Ｂ」と略記する場合がある。）を有し、さらに細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列をＴのＮ末端側、ＴとＬの間、ＬとＢの間、及びＢのＣ末端側から選ばれる少なくとも１つの位置に有するペプチドが開示されている。
【０００８】
アルツハイマー病（以下、「ＡＤ」と略称する。）は老人性認知症の発症原因の大勢を占めるとされており、患者に記憶障害や運動障害を引き起こし生活の質（ＱＯＬ）の低下が著しい疾病である。さらに病気の治療以外に多大な介護が必要で、患者本人とその家族をはじめ介護者の時間的損失、労働機会の損失、精神的負担など、医療コストのみならず社会的負担が多くなる疾病である。高齢化が進む先進諸国において、認知症は、患者数が増加の一途をたどっており深刻な問題となっている。
【０００９】
ＡＤは、根本的な治療法がない重篤な神経変性疾患の一種類であり、病理的には４２個（配列表における配列番号１）又は４０個（配列表における配列番号２）のアミノ酸からなるＡβが中枢神経に蓄積されるいわゆる「老人斑」の沈着、神経原線維変化、及び神経細胞の変性と脱落が特徴的な疾病である。ＡＤの治療には、コリンエステラーゼ阻害剤による治療や、抗高脂血症剤やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）エチルなどの脳神経保護剤による臨床試験が実施されている。
【００１０】
ＡＤの治療方法の開発においては、ＡＤの中心的な役割を担っているＡβを標的分子としたワクチン開発も進められている（非特許文献２）。また、ヒト型抗Ａβモノクローナル抗体、ＤＮＡワクチン、ＣｐＧＤＮＡなどの新しいアジュバント、及び経口投与用のペプチドワクチンなどの開発も進められている。しかしながら、ＤＮＡワクチンは、ＭＨＣクラスＩ拘束性であるために細胞障害性Ｔ細胞の活性化を誘導しやすく、そのためＡＤの治療には適当でないと考えられていた。ペプチドワクチンは免疫原性が弱くＡβに対する抗体産生誘導能が低いため、抗体産生の誘導にアジュバントを必要とすることが多く、アジュバントの使用による過剰な免疫反応を惹起する可能性がある。また、抗原が比較的高分子のものではＴ細胞エピトープならびにＢ細胞エピトープを多数含むために、これらエピトープに対する過剰な免疫反応が惹起されることがある。このような過剰な免疫反応は予期せぬ炎症反応などを惹起する可能性があり、これによる脳炎などの副作用リスクがあるとされている。そのため、依然としてＡＤの根本的な治療方法は確立されていない。また、ＡβはＡＤ以外の各種疾患の発症や増悪にも関与していることが知られているが、これらの疾患の予防法や治療法も確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００４／０８７７６７号パンフレット。
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００７／０９７２５１号パンフレット。
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ラベル（Ｌａｖｅｌｌｅ Ｅ．Ｃ．）、「Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｌｅｃｔｉｎｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ」、イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、２０００年、第９９巻、第１号、ｐ．３０−３７。
【非特許文献２】アガジャニャン（Ａｇａｄｊａｎｙａｎ Ｍ．Ｇ）ら、「Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ Ｂ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｆｒｏｍ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ａｎｄ ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐａｎ ＨＬＡ ＤＲ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ」、ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、２００５年、第１７４巻、第３号、ｐ．１５８０−１５８６。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従前、本発明者らは、免疫原性に優れ、目的とする抗体を免疫アジュバントを用いずに生体内で充分量産生誘導でき、且つ、安全に投与できる新規構造特性を有するペプチドを開発した。すなわち、Ｎ末端側にＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、リンカーペプチドをはさんで、そのＣ末端側にＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するペプチド内に、細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を有するペプチドを開示している（特許文献１）。また、このような構造特性に基づいて、Ａβに対する抗体の産生を効率よく誘導するペプチド、すなわち、Ｎ末端側に生体において免疫記憶の成立しているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（Ｔ）を有し、リンカーペプチド（Ｌ）をはさんで、そのＣ末端側にＡβペプチドの１又は２以上のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（Ｂ）を有し、さらに細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列をＴのＮ末端側、ＴとＬの間、ＬとＢの間、及びＢのＣ末端側から選ばれる少なくとも１つの位置に有するペプチドを作製し、開示した（特許文献２）。このようなペプチドにより、正常マウスにおいて高い抗Ａβ抗体産生が認められた。
【００１４】
しかしながら、ペプチドワクチンの充分な薬効を得るためには、より高い抗体産生誘導能を有するペプチドが求められていた。
【００１５】
本発明の課題は、免疫原性に優れ、より高い抗体産生誘導能を有するペプチドであって、追加投与によっても目的の抗体の産生を増強することのできるペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、特許文献２に開示したＡβペプチドワクチンに含まれている各構造要素、すなわち、Ｔ細胞エピトープ、リンカーペプチド、及びＢ細胞エピトープそれぞれに対する抗体の産生量に着目した。そこで、抗原性の低いリンカーペプチドの探索を行い、その結果、細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列、Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列、Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列、及びリンカーペプチドとしてＧＫＫ又はＶＶＫＫ（配列表における配列番号３）で表されるアミノ酸配列を含むペプチドが、目的とする抗体の産生を効率よく誘導することを見出した。本発明者らは、さらに、当該ペプチドが、追加投与の際に従前のペプチドに比べて目的の抗体の産生をより増強することを見出して本発明を完成した。
【００１７】
すなわち、本発明は以下に関する：
１．一般式：Ｒ１−Ｔ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ３−Ｂ−Ｒ４で示されるアミノ酸配列を有するペプチド、ここでＴは免疫記憶の成立しているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を示し、Ｌはリンカーペプチドのアミノ酸配列を示し、Ｂは抗原の特定の１又は２以上のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を示すペプチドであって、該リンカーペプチドのアミノ酸配列がＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列であることを特徴とするペプチド、
２．Ｔ細胞エピトープが、ジフテリア、結核、破傷風、及び百日咳の予防接種に抗原として用いられるペプチドから選ばれる何れか１種又は２種以上のペプチドに由来するアミノ酸配列を有することを特徴とする前記１．のペプチド、
３．Ｂ細胞エピトープが、ＡβペプチドのＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする前記１．又は２．のペプチド、
４．ＡβペプチドのＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列が、ＡβのＮ末端から第１番目のアミノ酸から第１５番目のアミノ酸配列（配列表における配列番号４）又はＡβのＮ末端から第１番目のアミノ酸から第１３番目のアミノ酸配列（配列表における配列番号５）である前記３．のペプチド、
５．配列表における配列番号６から１１の何れかに記載のアミノ酸配列からなる前記４．のペプチド、
６．前記１．から５．の何れかのペプチドと共に、製剤学的に許容される１種以上の製剤用添加剤を含有する組成物、
７．前記３．から５．の何れかのペプチドと共に、製剤学的に許容される１種以上の製剤用添加剤を含有する、Ａβに対する抗体の産生を誘導することができる組成物、
８．アルツハイマー病の予防及び／又は治療用である前記７．の組成物、及び
９．前記１．から５．の何れかのペプチドをコードするＤＮＡ。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、免疫原性に優れ、高い抗体産生誘導能を有し、追加投与により目的の抗体の産生を増強することのできるペプチドを提供することができる。
【００１９】
さらに本発明に係るペプチドにより、効果及び安全性の高いペプチドワクチンを提供できる。本発明に係るペプチドは、高い抗体産生誘導能を有し、また、該ペプチドにより産生誘導された抗体は該ペプチドの投与終了後に速やかに低減する。そのため、抗原による過剰な炎症反応などの免疫反応に起因する副作用が生じる可能性が少ない。特にＡβのような内部抗原に対するワクチンは、かかる副作用が少ないことは大きな利点である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】各種Ａβペプチドワクチンの追加投与後の抗Ａβ抗体産生誘導能をＢａｌｂ／ｃマウスを用いて評価した結果を示す図である。評価は１群４匹のマウスを用いて行い、抗Ａβ抗体量は平均±Ｓ．Ｅ．で示した。試験したペプチドは全て、そのＮ末端に細胞接着分子の細胞結合モチーフであるＲＧＤで表されるアミノ酸配列を有し、それに続いてジフテリアトキソイド（以下、「ＤｉＴｏｘ」と略称する。）由来のＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、リンカーペプチドのアミノ酸配列、及びＡβペプチド由来のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列が順次連結された構造を有する。評価した８種類のペプチドの中で、ＧＫＫで表されるアミノ酸配列からなるリンカーペプチド（以下、「ＧＫＫリンカーペプチド」と略称することがある。）を有するＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）が最も高い抗Ａβ抗体産生誘導能を示し、６回の追加投与後でも抗Ａβ抗体の産生の増加が観察された。ＧＫＫリンカーペプチドを有する他のペプチドも高い抗Ａβ抗体産生誘導能を示した。また、ＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列からなるリンカーペプチドを有するＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＶＫＫ−Ａβ（１−１５）も高い抗Ａβ抗体産生誘導能を示した。図中、「Ｖｅｈ」はＡβペプチドワクチンの代わりにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した結果を示す。（実施例１）
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、下記一般式で示されるアミノ酸配列を有するペプチド、ここでＴは免疫記憶の成立しているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を示し、Ｌはリンカーペプチドのアミノ酸配列を示し、Ｂは抗原の特定の１又は２以上のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を示すペプチドであって、該リンカーペプチドのアミノ酸配列がＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列であることを特徴とするペプチドに関する。
（化１）
Ｒ１−Ｔ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ３−Ｂ−Ｒ４
【００２２】
本明細書におけるアミノ酸配列の表記は、配列表においては三文字表記とし、その他の記載においては一文字表記とする。
【００２３】
本発明に係るペプチドは、該ペプチドに含まれるＢ細胞エピトープ或いはこれを含むアミノ酸配列に対する抗体の産生を誘導する能力を有し、且つ、該ペプチドの追加投与により目的とする抗体の産生を増強することができる。本発明でいう抗体とは、主としてイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）抗体であり、血中や体液中に分泌されるものはもとより、鼻腔、口腔、眼、消化管などに分泌される抗体も当然これに含まれる。
【００２４】
本発明に係るペプチドは、Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列とＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列との間にそれらを連結させるように配置されたリンカーペプチドのアミノ酸配列がＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列であることに特徴がある。従前の開示（特許文献１及び２）ではリンカーペプチドとして、抗原プロセッシングに関与するプロテアーゼの認識配列、特にジペプチドが例示され、さらにカテプシンＢの認識配列であるリジン−リジン（ＫＫ）からなるジペプチドが推奨されていた。しかしながら、リンカーペプチドとしてＫＫからなるジペプチドを使用して作製したＡβペプチドワクチンは、追加免疫を繰り返すことにより抗Ａβ抗体産生量が増加しなかったり、増加の程度が低いことがあった。一方、ＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列からなるペプチドをリンカーペプチドとして作製したＡβぺプチドワクチンは、後述する実施例に示すように、ＫＫからなるジペプチドをリンカーペプチドとして作製したＡβぺプチドワクチンと比較して、より高い抗Ａβ抗体産生誘導能を示し、また、追加投与により抗体産生量の増加の程度も大きかった。リンカー部位は目的とする抗体の産生誘導に直接関与する部位ではないことから、ＡβペプチドのＢ細胞エピトープの代わりに他の抗原のＢ細胞エピトープを用いても同様の結果が得られると考えることができる。さらに、ＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列からなるペプチドをリンカーペプチドとして作製したＡβぺプチドワクチンは、ＫＫからなるジペプチドをリンカーペプチドとして作製したＡβぺプチドワクチンと比較して、その投与終了後に血中抗Ａβ抗体濃度が速やかに低減する。ワクチンの弱点として、ワクチンにより誘発される免疫反応が一旦惹起されるとそれを制御することや元の状態に戻すことは容易ではなく、それにより例えば過剰な炎症反応が生じて副作用が生じるおそれがあることが一般的に知られている。しかしながら、本発明に係るペプチドワクチンはその投与終了後に目的とする抗体の血中濃度が速やかに低減することから副作用を誘発する可能性は少ない。特に、Ａβのような内部抗原に対するワクチンは、副作用が少ないことは大きな利点である。また、ＧＫＫで表されるアミノ酸配列からなるペプチドをリンカーペプチドとして作製したＡβぺプチドワクチンの投与終了後の血中抗Ａβ抗体濃度の速やかな低減は、Ａβ由来のＢ細胞エピトープを含むアミノ酸配列の長さを変更しても同程度に認められたことから、Ｂ細胞エピトープの差異には依存せず、リンカーペプチドの配列の差異に依存すると考えている。したがって、本発明に係るペプチドワクチンにおいてＡβペプチドのＢ細胞エピトープの代わりに他の抗原のＢ細胞エピトープを用いても、その投与終了後に目的とする抗体の血中濃度が速やかに低減すると考えることができる。このように、ＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列からなるペプチドをリンカーペプチドとして作製したＡβぺプチドワクチンは、極めて高い抗体産生誘導能を有し、かつ安全性が高いという大きな利点を有する。抗体産生誘導能がより高いことから、ＧＫＫで表されるアミノ酸配列からなるペプチドをリンカーペプチドとして作製したＡβぺプチドワクチンがより好ましい。
【００２５】
本発明でいう「エピトープ」とは、抗原決定基ともいい、免疫応答に関与するＴ細胞、Ｂ細胞及び抗体に認識される抗原分子の特定の構造単位を意味し、６〜１０個のアミノ酸配列や５〜８個の単糖の配列から成る。「抗原」とは、生体を刺激して抗体産生や細胞性免疫などの免疫応答を惹起する物質の総称をいう。一般的には免疫応答を惹起するタンパク質をいう。糖、脂質、核酸などの種々の有機物に対して抗体が産生されるが、タンパク質以外の物質は、一般的にタンパク質と結合して複合体を形成した場合に抗原としての活性を現す。Ｔ細胞及びＢ細胞により認識される抗原分子の特定の構造単位をそれぞれ「Ｔ細胞エピトープ」及び「Ｂ細胞エピトープ」と呼ぶ。
【００２６】
本発明に係るペプチドにおいて、Ｂ細胞エピトープは抗体産生を誘導する部位として使用される。Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列は、微生物、細胞、又は腫瘍細胞に由来する毒素、アレルゲン、酵素、細胞膜抗原、腫瘍特異性抗原などの抗原であって、その各々について文献的に既に明らかにされている既知の抗原エピトープのアミノ酸配列そのものでもよく、また実際に生体に対して免疫原性をもつ様々な抗原そのもの、或いは、常法により、抗原の部分ペプチドを免疫してＢ細胞エピトープ配列を同定し、この同定したアミノ酸配列を有するペプチドをＢ細胞エピトープとして用いてもよい。また、このＢ細胞エピトープは、後述のＴ細胞エピトープと同じ抗原上にあるものでもよく、Ｂ細胞エピトープとそのアミノ酸配列の一部又は全部を共有していてもよい。従って、Ｂ細胞エピトープ部分については、感染防御、癌、腫瘍、潰瘍、肝炎など炎症性疾患、アレルギー及びアトピー性皮膚炎などの免疫性疾患などの予防や治療、酵素の中和、臨床検査などに使用される各種抗原の検出など、抗体の使用目的に応じて、好ましい抗原ペプチドを選択することが出来る。これらのＢ細胞エピトープを含むペプチドはそのまま使用してもよく、タンデムに連結して、その２量体、３量体或いは多量体として使用してもよい。また、同一抗原上に存在する２種以上のＢ細胞エピトープをタンデムに連結することも、抗原全体をＢ細胞エピトープとすることもできる。また、複数種の抗原性タンパク質が関与する疾患治療の場合、それらのＢ細胞エピトープをタンデムに連結することにより、１つのペプチドで複数種の抗原性タンパク質に対する抗体を産生できるペプチドを設計することもできる。この場合には、各Ｂ細胞エピトープの間に、前述の抗原プロセッシングに関与するプロテアーゼの認識配列をリンカーペプチドとして挿入することにより、個々のエピトープのプロセッシングをより確実に行わせることもできる。
【００２７】
本発明に係るペプチドにおいて、抗体産生を誘導する部位としてＡβペプチドのＢ細胞エピトープを使用することにより、Ａβに対する抗体産生を誘導するペプチドを製造できる。「ＡβペプチドのＢ細胞エピトープ」とは、アルツハイマー病の原因とされるＡβのＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むペプチドをいう。なかでも、Ａβ凝集線維を溶解したり、Ａβの神経線維やその他の臓器への沈着の阻害、アセチルコリンレセプターへの結合を阻害する抗体の産生を誘導することができるアミノ酸配列を有するペプチドが好ましく、その点からは、ＡβのＮ末端付近のアミノ酸配列を含むペプチドが特に好ましく、アミノ酸が５乃至２０個程度で構成されるものが好ましい。構成するアミノ酸の数が少なすぎると抗体産生誘導能が消失し、多すぎると抗原性は高くなるがその一方で副作用を誘発するような抗体の産生を誘導するエピトープを含む可能性がある。このＢ細胞エピトープを含むペプチドはそのまま使用してもよく、タンデムに連結して、その２量体、３量体或いは多量体として使用してもよい。また、必要であれば、Ａβ上に存在する２種以上のＢ細胞エピトープをタンデムに連結することも、Ａβ全体、例えば、アミノ酸数が４２個（配列表における配列番号１、以下、「Ａβ（１−４２）」と略記する。）や４０個（配列表における配列番号２、以下、「Ａβ（１−４０）」と略記する。）のＡβをＢ細胞エピトープとすることもできる。また、複数のエピトープを連結して、複数種の抗体の産生を同時に誘導するようなペプチドを設計することもできる。これらの場合には、各Ｂ細胞エピトープの間に、前述の抗原プロセッシングに関与するプロテアーゼの認識配列をリンカーペプチドとして挿入することにより、個々のエピトープのプロセッシングをより確実に行わせることもできる。
【００２８】
本発明に係るペプチドにおいて、Ｂ細胞エピトープとして、ＡβのＮ末端付近のアミノ酸配列を用いる場合は、少なくともＡβのＮ末端から４−１０番目のアミノ酸配列を有することが好ましく、例えば、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列における１−１５番目のＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号４、以下、「Ａβ（１−１５）」と略記する。）、１−１３番目のＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号５、以下、「Ａβ（１−１３）」と略記する。）、１−１１番目のＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号１４、以下、「Ａβ（１−１１）」と略記する。）、３−１１番目のＥＦＲＨＤＳＧＹＥのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号１５、以下、「Ａβ（３−１１）」と略記する。）、３−１５番目のＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号１６、以下、「Ａβ（３−１５）」と略記する。）、などを挙げることができる。その他、ＡβペプチドのＢ細胞エピトープとして、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列における１−１０番目のＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号１７、以下、「Ａβ（１−１０）」と略記する。）、１−８番目のＤＡＥＦＲＨＤＳのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号１８、以下、「Ａβ（１−８）」と略記する。）１−６番目のＤＡＥＦＲＨのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号１９、以下、「Ａβ（１−６）」と略記する。）を挙げることができる。Ａβペプチドに対する抗体の産生誘導能や副作用の点を考慮すれば、Ａβ（１−１５）又はＡβ（１−１３）を用いるのが好ましく、Ａβ（１−１５）が特に好ましく用いられる。
【００２９】
本発明に係るペプチドに使用する「免疫記憶が成立しているＴ細胞エピトープ」とは、本発明に係るペプチドワクチンの投与時、その投与する生体に、既に、免疫記憶が成立しているものをいう。例えば、本発明に係るペプチドを投与する生体に対して、本発明に係るペプチドと同じＴ細胞エピトープを含むペプチドを予め投与し、免疫記憶を成立させておけばよい。生体において免疫記憶が成立しているＴ細胞エピトープは、好ましくは、ヒトにおいて免疫記憶が成立しているＴ細胞エピトープをいう。とりわけ、予防接種などにより、大多数のヒトが、幼児期以降に免疫を獲得している抗原ペプチドがもつＴ細胞エピトープは、上記のような免疫記憶を成立させる操作を行なわなくても使用できる。また、すでに免疫記憶が成立している患者に対して、再度、上記操作を行えばさらなる効果の向上が期待できる。
【００３０】
Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣ クラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲ分子とそのアグレトープで結合し、ヘルパーＴ細胞用抗原として提示される。「アグレトープ」とは、Ｔ細胞エピトープがもつ、ＨＬＡ−ＤＲ分子との結合部位のアミノ酸残基をいう。Ｔ細胞エピトープは、ＨＬＡ−ＤＲのハプロタイプに拘束されるため、できるだけ多数のＨＬＡ−ＤＲハプロタイプ（アレル）の拘束を受ける重複・シフト型のマルチアグレトープ型ペプチドやそれを含むアミノ酸配列のものを使用するのが好ましい。
【００３１】
本発明で使用するＴ細胞エピトープとしては、例えば、ジフテリア、破傷風、百日咳、舌下腺炎、風疹、麻疹、結核などの予防接種に抗原として使用するペプチドが、大部分のヒトで、幼児期から免疫記憶が成立していることから好ましい。ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳ワクチンを含む三種混合ワクチンやＢＣＧ（結核）の接種は、日本では接種が義務づけられており、世界的にも接種が広く行われていることから、汎用性の点から、特に好ましい。
【００３２】
これらのペプチドのアミノ酸配列は何れも既に公知であることから、当該ペプチドの公知のＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を利用してもよい。また、実際にヒトの末梢血の幼若化反応などを利用して、抗原の部分ペプチドのエピトープ配列を同定し、この同定したアミノ酸配列を有するペプチドをＴ細胞エピトープとして用いてもよい。また、利用可能なＨＬＡ−ＤＲのＴ細胞エピトープ予測プログラムを利用して、多くのＨＬＡ−ＤＲに結合するマルチアグレトープ領域を選択して、ペプチドのアミノ酸配列を決定することも任意に行うことができる。
【００３３】
また、このＴ細胞エピトープ自身は、当該エピトープに対する抗体産生誘導能が低い方が、副作用などの点から好ましい。一方で、エピトープとして予防接種に使用される感作抗原由来のアミノ配列のペプチドを使用すれば、当該エピトープは、本来、ヒトにおいて、このエピトープに対する抗体の産生を誘導するために使用されるものなので、このエピトープに対する抗体が産生されたとしても、その安全性は確立されており、副作用が発生しにくいという利点がある。これらのＴ細胞エピトープペプチドはそのまま使用しても、或いは同種又は複数種のＴ細胞エピトープをタンデムに連結して使用してもよい。また、Ｔ細胞エピトープは、アグレトープとなるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換しても機能を発揮することができる。
【００３４】
このＴ細胞エピトープとしては、具体的には、例えば、ジフテリアトキソイド由来のエピトープであるＡＹＮＦＶＥＳＩＩＮＬＦＱＶＶＨＮＳＹＮのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２０）（以下、「ＤｉＴｏｘ（２０）」と略記する。）、ＡＹＮＦＶＥＳＩＩＮＬＦＱＶＶＨＮＳＹのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２１）（（以下、「ＤｉＴｏｘ（１９）」と略記する。）、及びＹＮＦＶＥＳＩＩＮＬＦＱＶＶＨＮＳＹＮのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２２）、及び破傷風トキソイド由来のエピトープである、ＬＱＴＭＶＫＬＦＮＲＩＫＮＮＶＡのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２３）、ＦＬＱＴＭＶＫＬＦＮＲＩＫＮＮＶＡＧのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２４）（以下、「ＴｅｔＴ１Ｌ）」と略記する。）、ＩＨＶＬＨＧＬＹＧＭＱＶＳＳＨＥのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２５）、ＬＩＨＶＬＨＧＬＹＧＭＱＶＳＳＨＥＩのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２６）、ＹＩＶＮＥＤＫＦＱＩＬＹＮＳＩＭＹＧのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２７）、ＱＹＩＶＮＥＤＫＦＱＩＬＹＮＳＩＭＹＧＦのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２８）（以下、「ＴｅｔＴ３Ｌ）」と略記する。）、ＳＹＱＭＹＲＳＬＥＹＱＶＤＡＩのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２９）、ＲＳＹＱＭＹＲＳＬＥＹＱＶＤＡＩのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号３０）、ＮＩＮＩＦＭＲＥＳＳＲＳＦＬＶのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号３１）、ＩＮＩＮＩＦＭＲＥＳＳＲＳＦＬＶＮのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号３２）、ヒト型及びウシ型の結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ｂｏｖｉｓ）共通の分泌タンパク質として知られるＭＰＴ６４由来ペプチドであるＩＱＭＳＤＰＡＹＮＩＮＩＳＬＰＳＹＹＰＤのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号３３）（以下、「ＭｐｔＬ（４３−６２）」と略記する。）、ＩＱＭＳＤＰＡＹＮＩＮＩＳＬＰＳのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号３４）、ＤＰＡＹＮＩＮＩＳＬＰＳＹＹＰＤのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号３５）及びＹＮＩＮＩＳＬＰＳＹＹＰＤＱＫＳのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号３６）などのアミノ酸配列を有するエピトープを挙げることができる。中でも、抗体産生誘導能の高さと、後述のＨＬＡ−ＤＲ拘束性予測プログラム「ＰｒｏＰｒｅｐ」で予測可能なＨＬＡ−ＤＲと結合可能な５１アレルの内、それぞれ４７アレル、３９アレル、４１アレル、或いは５０アレルに結合できると予測されるＭｐｔＬ（４３−６２）、ＤｉＴｏｘ（２０）、ＴｅｔＴ１Ｌ及びＴｅｔＴ３Ｌが好ましく、ＤｉＴｏｘ（２０）が特に好ましい。
【００３５】
ＤｉＴｏｘ（２０）のＣ末端においてアミノ酸残基が１つ欠失したＤｉＴｏｘ（１９）は、ペプチドの抗原性やマルチアグレトープ機能にＣ末端のアミノ酸が影響しないことがインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）解析により判明したことから、ＤｉＴｏｘ（２０）と同様のアレルに結合できると予測されるため、ＤｉＴｏｘ（２０）と同様に好ましく使用できる。
【００３６】
また、必要に応じて本発明に係るペプチドワクチンを投与するヒトの末梢血とこれらのＴ細胞エピトープを混合培養し、その幼若化反応を確認するか、或いは、その少量を皮内に投与して遅延型過敏症が起きることを確認して、メモリーＴ細胞の存在の有無を確認して、投与するヒトに好ましいＴ細胞エピトープを選択することもできる。
【００３７】
細胞接着分子の細胞結合モチーフとしては、本発明に係るペプチドを粘膜表面に長期間保持することができて、経口、経鼻などの経粘膜投与での抗体産生の誘導能の増強作用のあるものである限り利用することができる。例えば、インテグリンファミリーに対する結合モチーフをはじめとし、その他の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を用いることができる。例えば、インテグリン結合モチーフに属するアミノ酸配列としては、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン、ヒト免疫不全ウイルスのＴａｔタンパク質などの細胞接着分子に存在する結合モチーフとして知られる、ＲＧＤ、ＲＥＤ、ＬＤＶ、ＰＨＳＲＮ（配列表における配列番号３７）、ＲＫＫ、ＤＧＥＡ（配列表における配列番号３８）などのアミノ酸配列を挙げることができる。また、インテグリンのファミリー以外の結合モチーフのアミノ酸配列としては、ＹＩＧＳＲ（配列表における配列番号３９）、ＩＫＶＡＶ（配列表における配列番号４０）、ＲＦＹＶＶＭＷＫ（配列表における配列番号４１）、ＩＲＶＶＭ（配列表における配列番号４２）などを挙げることができる。なかでも、ＲＧＤ、ＲＥＤ、及びＹＩＧＳＲで表される各アミノ酸配列からなるペプチドが、特異的な抗体の産生誘導能が強いことから好ましく、ＲＧＤが特に好ましい。また、本発明に係るペプチドにおいて、これら細胞結合モチーフのアミノ酸配列の連結部位は、Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列のＮ末端側又はＣ末端側、又は、Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列のＮ末端側又はＣ末端側の合計４箇所から選択でき、そのうち少なくとも１箇所に連結すればよい。とりわけ、Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列のＮ末端側又はＣ末端側の片側、又は両側に、細胞接着分子の細胞結合モチーフを連結した本発明に係るペプチドは、Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列に特異的な抗体の産生が特に増強されるので好ましく、Ｎ末端側に連結したものが特に好ましい。
【００３８】
本発明に係るペプチドの具体例として、抗体産生を誘導する部位としてＡβペプチドのＢ細胞エピトープを含み、Ａβに対する抗体産生を誘導するペプチドを挙げることができる。より具体的には、配列表において配列番号６−１１に記載のアミノ酸配列によりそれぞれ表されるＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＶＫＫ−Ａβ（１−１５）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１３）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１０）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−８）、及びＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−６）を例示できる。
【００３９】
本発明に係るペプチドを製造するための方法に限定はなく、慣用のペプチド合成法によるか、或いは、慣用のペプチド合成法によりあらかじめ部分的に合成したペプチド同士を結合して、調製することができる。また当該ペプチドは、各メーカーから市販されているペプチドシンセサイザーを用いて装置のプロトコールに従って合成することができる。
【００４０】
また、本発明に係るペプチドは、組換えＤＮＡ技術により調製することができる。例えば、設計したペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製し、これを自律増殖可能なベクターに挿入し、それを大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母などの微生物、動植物やそれらの細胞又は組織などの宿主に導入して形質転換体としたり、トランスジェニック動植物を作製して、それらを培養、育成した後、本発明に係るペプチドを適宜の方法により、採取・精製することができる。さらには、本発明に係るペプチドを発現させた菌体、動物体或いは植物体をそのまま加工して、本発明に係るペプチドを含有する経口摂取用の組成物として使用することもできる。植物種としては、例えば、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、セリ科（Ａｐｉａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、ブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）、ツツジ科（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）、パパイヤ科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、クルミ科（Ｊｕｇｌａｎｄａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、ヒルガオ科（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｅ）、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、又はヤモノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）などに属する植物種、より詳細には、レタス、チコリ、ヨモギ、ブロッコリ、キャベツ、ダイコン、ワサビ、カラシ、キュウリ、メロン、カボチャ、ハヤトウリ、ニンジン、ミツバ、セロリ、リンゴ、プラム、ウメ、モモ、イチゴ、ラズベリー、アーモンド、ナシ、ビワ、ブドウ、クランベリー、コケモモ、ブルーベリー、パパイヤ、アルファルファ、ダイズ、クルミ、ホウレンソウ、トマト、トウガラシ、サツマイモ、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ヤマノイモ、ジャガイモなどを挙げることができる。また、本発明に係るペプチドは、前記の何れかの方法により、その全アミノ酸配列を有するペプチドを直接調製してもよく、或いは、予めその一部アミノ酸配列を有するペプチドを合成したもの同士を化学的に結合して調製することもできる。
【００４１】
本発明の効果を妨げない限り、本発明に係るペプチドに、製剤学的に許容できる１種又は２種以上の製剤用添加剤を組み合わせた組成物を調製することもできる。製剤用の添加剤としては、水、アルコールなどの溶媒、グルコース、マルトースなどの還元性糖質、α，α−トレハロース、ショ糖、サイクロデキストリンなどの非還元性糖質、或いは、α，α−トレハロース、マルトシルトレハロースなどのα，α−トレハロースの糖質誘導体、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、マルトトリイトールなどの糖アルコール、寒天、プルラン、グアガム、アラビアガムなどの水溶性高分子、ゼラチン、シルクなどのタンパク質やそれらの加水分解物、脂質、アミノ酸、緩衝剤、安定化剤、抗菌剤、香料、栄養機能食品、医薬部外品或いは医薬品の有効成分、ミョウバン、水酸化アルミニウムなどの免疫アジュバントや上記以外の食品添加物、医薬品添加物などを挙げることができ、これらの１種又は２種以上を適宜組み合わせて使用できる。なかでも、ペプチドの安定化効果の高い、α，α−トレハロース及びα，α−トレハロースの糖質誘導体が好ましい。
【００４２】
また、本発明に係るペプチドを含有する製剤の形態としては、その製剤中のペプチドが長期間安定に保持されるものであれば特に制限はなく、溶液、凍結乾燥品、錠剤、舌下錠、トローチ、粉末、顆粒、クリーム、軟膏、シラップなどの剤形から、投与対象、投与方法、製剤の保存方法や輸送方法を考慮して適宜選択すればよい。また、本発明に係るペプチド又はそれを含有する組成物は、必要に応じて、リポソームに封入したり、皮膚、組織への浸透促進剤やイオン導入法などを併用することにより、抗原提示細胞の存在部位への浸透を促進させることもできる。また、本発明に係るペプチドは、錠菓、飴、清涼飲料などの各種飲食品に含有せしめ、これを経口的に摂取することにより、ペプチドを経粘膜的に投与することもできる。また、本発明に係るペプチドをコードするＲＮＡを直接生体に投与したり、細胞にＤＮＡを導入するいわゆる遺伝子治療などにより、生体内において本発明に係るペプチドを発現させることもできる。
【００４３】
本発明に係るペプチド又はこれを含む組成物のヒトへの投与方法には、特に制限はなく、本発明に係るペプチドが、投与部位へ確実に到達できる方法であれば何れでよい。例えば、スポイトや注射器を使用して適量を粘膜上に滴下してもよく、経口摂取や、クリーム或いはジェル状にして粘膜に塗布したり、カテーテルなどで投与部位に誘導してもよく、さらには、スプレーやネブライザーなどにより霧状にして吹き付けたり、鼻、気管或いは肺へ吸引させてもよい。皮下、皮内、筋肉内、血管内、腹腔内や胸腔内などの体腔内への投与には、注射器、カテーテル、点滴などの投与方法を使用することができる。本発明に係るペプチドの投与量は、抗体産生誘導能、疾患の種類、投与経路、投与方法、投与対象動物などを考慮して適宜決定すればよく、通常、０．００００１乃至１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０００１乃至２５ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．００１乃至１０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、本発明に係るペプチドは、初回の投与で、効果的に抗体産生を誘導することができるので、以後は、このペプチドのＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を有するペプチドのみで追加投与を行った場合でも、目的とする抗体の産生を増強することができる。
【００４４】
本発明に係るペプチド又はこれを含む組成物は、ペプチドワクチンとして使用できる。ワクチンとは、病原体に対する能動免疫を与える目的で投与される製剤をいう。能動免疫とは、抗原の投与により免疫応答を誘発することをいう。ペプチドワクチンとは、タンパク質のアミノ酸配列のうち実際に免疫反応を惹起して生体防御に働く部分のアミノ酸配列からなるペプチドを含む製剤をいう。
【００４５】
本発明に係るペプチドワクチンは、それにより産生誘導する抗体の使用目的に応じて、好ましい抗原ペプチドを選択することにより、感染防御、癌、腫瘍、潰瘍、肝炎など炎症性疾患、アレルギー及びアトピー性皮膚炎などの免疫性疾患などの予防や治療に使用することができる。或いは、酵素の中和、臨床検査などに使用される各種抗原の検出に使用する抗体の製造に使用することができる。
【００４６】
本発明に係るペプチドワクチンにおいて、Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列として、Ａβ由来のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を選択することにより、抗Ａβ抗体の産生を誘導するペプチドワクチンを得ることができる。このようなペプチドワクチンにより、Ａβに起因する疾患の予防や治療を行うことができる。本発明でいうＡβに起因する疾患とは、Ａβが特定の組織に沈着するなどして起きる疾患をいい、その沈着が病因の主因となるものは言うまでもなく、他の疾患に付随するＡβの沈着により発生乃至増悪する疾患を含み、これらの疾患に伴う臨床症状も含む。具体的には、例えば、アルツハイマー病、ピック病、びまん性レビー小体病、進行性核上麻痺（スチール−リチャードソン症候群）、多系統変性（シャイ−ドレーガー症候群）、筋萎縮性側索硬化症、変性運動失調、皮質基底変性、グアムＡＬＳ−パーキンソン−痴呆合併症、亜急性硬化性汎脳炎、ハンチントン病、パーキンソン病、シヌクレイノパシー、一次性進行性失語症、線条体黒質変性、マチャド−ジョセフ病／脊髄小脳性運動失調３型及びオリーブ橋小脳変性を含む運動ニューロン疾患、ジル・ド・ラ・ツレット病、球麻痺及び偽球麻痺、脊髄及び脊髄延髄筋委縮症（ゲネディ病）、一次性側索硬化症、家族性痙性対麻痺、ヴェルニッヒ−ホフマン病、クーゲルベルグ−ヴェランデル病、テイ−サックス病、ザントホフ病、家族性痙性病、ヴォールファルト−クーゲルベルグ−ヴェランデル病、痙性対麻痺、進行性多病巣性白質脳障害、及びプリオン病（クロイツフェルト−ヤコブ病）、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、クールー及び致死性家族性不眠症を含む、年齢が関係する痴呆、血管性痴呆、拡散性白質病（ヴィンズヴァンガー病）、内分泌又は代謝を起源とする痴呆、頭部外傷及び拡散性脳損傷の痴呆、痴呆性の拳闘姿勢又は前頭葉痴呆、大脳虚血又は塞栓性の閉塞及び血栓性の閉塞を含むインファクションならびに任意の種類の脳蓋内出血から生じる神経変性疾患、脳蓋内及び椎骨損傷、遺伝性大脳血管障害、非神経障害性遺伝性アミロイド、ダウン症候群、マクログロブリン血症、二次的家族性地中海熱、マックル−ウェルズ症候群、多発性骨髄腫、膵臓疾患又は心臓疾患に関連するアミロイドーシス、慢性血液透析関節症又はフィンランド型及びアイオワ型アミロイドーシス、糖尿病変成ニューロパチーなどの神経変性疾患や膵臓へのＡβの沈着に起因する糖尿病などを挙げることができ、これらの疾患に伴う臨床症状も含む。
【００４７】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
各種Ａβペプチドワクチンを作製し、その抗Ａβ抗体産生誘導能をＢａｌｂ／ｃマウスを用いて評価した。
【００４９】
ペプチドは、特許文献２で開発したペプチドプロトタイプのＡβペプチドワクチンであるＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）（配列表における配列番号１２）のリンカー部位及びＢ細胞エピトープ部位を変換することにより設計し、外部委託（オペロンバイオテクノロジー株式会社）により合成した。ペプチドは全て、１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解した。
【００５０】
評価したペプチドは、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）（配列表における配列番号１２）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＫＫ−Ａβ（１−１５）（配列表における配列番号１３）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＶＫＫ−Ａβ（１−１５）（配列表における配列番号６）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）（配列表における配列番号７）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１３）（配列表における配列番号８）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１０）（配列表における配列番号９）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−８）（配列表における配列番号１０）、及びＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−６）（配列表における配列番号１１）の８種類である。
【００５１】
ペプチドのマウスへの投与は次のように行った。まず、５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（日本チャールズリバー株式会社）に沈降ジフテリア破傷風混合トキソイド（北里研究所製）を５０μＬ／マウスで背部皮下に投与して予備免疫を行い、免疫２週間後からペプチド投与を行なった。投与は１ｍｇ／ｍＬに調製したペプチド溶液５０μＬ／マウス（５０μｇ／マウス）を背部皮下に投与した。１群（Ｎ）４匹とし、初回投与後、２週間間隔で６回の追加投与を行なった。ペプチド投与１週間後にマウス尾部より採血を行い、血漿成分を採取した。血漿にはプロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加し、抗Ａβ抗体測定用試料とした。また、陰性対照群としてＰＢＳを５０μＬ／マウスで背部皮下に投与した。
【００５２】
血中抗Ａβ抗体量の測定は、Ａβ（１−４２）合成ペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ社製）をコーティングしたプレートを用い、ＥＬＩＳＡ法にて行った。具体的には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したＡβ（１−４２）合成ペプチドを蒸留水に希釈して、９６穴プレートに添加し（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）、４℃で１晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）コーティングした。１％ ブロックエース（雪印乳業株式会社製）でブロッキングし、測定用試料を１００μＬで添加し、４℃で１晩インキュベートした。反応終了後、プレートを洗浄し、２０００倍希釈したホースラディッシュ パーオキシダーゼ接合・抗マウスイムノグロブリン抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ Ｉｇ−ＨＲＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を添加し、２時間、４℃でインキュベートした。反応終了後、ＰＢＳで洗浄し、発色基質ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸、ＫＰＬ社製）を添加し、室温で３０分インキュベートした後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。抗Ａβ抗体の定量は抗Ａβモノクローナル抗体を使用し、標準曲線から抗Ａβ抗体を定量化した。
【００５３】
評価した８種類のペプチドは何れも抗Ａβ抗体の産生を誘導し、追加投与を行うことで抗体量が増加した（図１）。その中でもＧＫＫリンカーペプチドを有するＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）は最も高い抗Ａβ抗体産生誘導能を有しており、６回の追加投与後では従来のペプチドであるＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）の６倍以上の抗Ａβ抗体が産生されていることが明らかとなった（図１及び表１）。ＧＫＫリンカーペプチドを有する他のペプチドも高い抗Ａβ抗体産生誘導能を有していた（図１及び表１）。また、ＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列からなるリンカーペプチドを有するＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＶＫＫ−Ａβ（１−１５）も高い抗Ａβ抗体産生誘導能を有していた（図１及び表１）。ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＫＫ−Ａβ（１−１５）はＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）と同程度の抗Ａβ抗体産生誘導能であった（図１及び表１）。一方、Ｂ細胞エピトープについては明確な傾向を見出すことは出来なかった（図１）。
【００５４】
【表１】
【００５５】
以上の結果から、リンカーペプチドのアミノ酸配列をＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列とすることにより、ＫＫで表されるアミノ酸配列を使用するよりも、高い抗Ａβ抗体産生誘導能が得られることが明らかとなった。また、リンカーペプチドのアミノ酸配列がＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列であるＡβペプチドワクチンは、追加投与により抗体の産生を著しく増強した。特に、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）は高い抗Ａβ抗体産生誘導能を有しており、アルツハイマー病治療用ペプチドワクチンとして有用であると考えられた。
【００５６】
６回の追加投与終了後、１ヶ月間の休薬期間をおき、休薬による血中抗Ａβ抗体量の推移を観察した。ＧＫＫ、ＶＫＫ、及びＶＶＫＫの何れか１で表されるアミノ酸配列からなるリンカーペプチドを有するペプチドを投与した場合は、追加投与終了後、血中抗Ａβ抗体量が速やかに低下した。一方、従来のペプチドＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）を投与した場合は、血中抗Ａβ抗体量が低下せず、１ヶ月間維持されていた。
【実施例２】
【００５７】
各種Ａβペプチドワクチンを作製し、その抗Ａβ抗体産生誘導能をＪＵマウスを用いて評価した。ＪＵマウス（クオン（Ｑｕｏｎ Ｄ．）ら、「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｐｏｓｉｔｓ ｉｎ ｂｒａｉｎｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９１年、第３５２巻、ｐ．２３９−２４１。）は自家繁殖を行い使用した。
【００５８】
ペプチドは、特許文献２で開発したペプチドプロトタイプのＡβペプチドワクチンであるＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）（配列表における配列番号１２）のリンカー部位及びＢ細胞エピトープ部位を変換することにより設計し、外部委託（オペロンバイオテクノロジー株式会社）により合成した。ペプチドは全て、１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解した。
【００５９】
評価したペプチドは、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）（配列表における配列番号１２）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＫＫ−Ａβ（１−１５）（配列表における配列番号１３）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＶＫＫ−Ａβ（１−１５）（配列表における配列番号６）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）（配列表における配列番号７）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１３）（配列表における配列番号８）の５種類である。
【００６０】
各種ペプチドのマウスへの投与は次のように行った。まず、８週齢のＪＵマウスに沈降ジフテリア破傷風混合トキソイド（北里研究所製）を５０μＬ／マウスで背部皮下に投与し、予備免疫を行い、免疫２週間後からペプチド投与を行なった。ペプチドは２００μｇ／ｍＬに調製し、等量のアジュバンド（フロインド インコンプリート アジュバント（ＦＩＡ）、和光純薬株式会社製）と混合してエマルジョンを作製し、ＪＵマウスの背部皮下に１００μｇ／マウス（１０μｇ／マウス）で投与した。１群（Ｎ）４匹とし、初回投与後、２週間間隔で２回の追加投与を行なった。２回目の追加投与１週間後にマウス尾部より採血を行い、血漿成分を採取した。血漿にはプロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加し、抗Ａβ抗体測定用試料とした。また、陰性対照群としてＰＢＳと等量のＦＩＡを混合してエマルジョンを作製し、１００μＬ／マウスで背部皮下に投与した。
【００６１】
血中抗Ａβ抗体量の測定は、実施例１に記載の抗Ａβ抗体量測定方法と同様の方法に従って行った。
【００６２】
評価した５種類のペプチドは何れも２回の追加投与により抗Ａβ抗体の産生を誘導した（表２）。その中でもＧＫＫリンカーペプチドを有するＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）は最も高い抗Ａβ抗体産生誘導能を有しており、従来のペプチドであるＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）と比較して８５倍の抗Ａβ抗体の産生を誘導した（表２）。また、同様にＧＫＫリンカーペプチドを有するＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１３）及びＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＶＫＫ−Ａβ（１−１５）も、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）と比較して１０倍以上高い抗Ａβ抗体産生誘導能を有していた（表２）。エマルジョンによる投与においてもペプチド溶液投与と同様の結果が確認できた。
【００６３】
【表２】
【００６４】
以上の結果から、アジュバンドを用いた投与においても、リンカーペプチドのアミノ酸配列をＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列とすることにより、ＫＫで表されるアミノ酸配列を使用するよりも、高い抗Ａβ抗体産生誘導能が得られることが明らかとなった。特に、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）は高い抗Ａβ抗体産生誘導能を有しており、アルツハイマー病治療用ペプチドワクチンとして有用であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
以上説明したとおり、本発明は、生体において免疫記憶が成立しているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（Ｔ）、抗原の特定の１又は２以上のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（Ｂ）、及び前記Ｔと前記Ｂの間にそれらを連結させるように配置されたリンカーペプチドのアミノ酸配列を含み、該リンカーペプチドのアミノ酸配列がＧＫＫ又はＶＶＫＫであることを特徴とするペプチド、及び該ペプチドを有効成分として含有する組成物を提供する。例えば、本発明はこのような構造を有する抗Ａβ抗体産生誘導能を有するペプチド及び該ペプチドを有効成分として含有する組成物を提供する。本発明に係るペプチドは、広範なヒトのＨＬＡ−ＤＲのハプロタイプに拘束されるため、多くのヒト、とりわけ、予防接種などにより免疫記憶の成立したヒトにおいて、病原菌やウイルスなど異物の異物に起因する各種疾患の予防・治療に有効なペプチドワクチンとして使用することができる。或いはアルツハイマー病をはじめとする神経変性疾患などの各種疾患の予防・治療に有効な、Ａβに対する抗体産生を誘導するペプチドワクチンとして使用することができる。また、本発明に係るペプチドワクチンは、免疫アジュバントを用いなくても、抗体産生誘導能を示し、また、経鼻投与や経口投与などの経粘膜投与で使用できること、さらに、投与終了後に抗体の血中濃度が速やかに低下することから、簡易かつ安全なペプチドワクチンである。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号１：アミロイドβペプチド１−４２。
配列番号２：アミロイドβペプチド１−４０。
配列番号３：合成ペプチド。
配列番号４：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基１−１５からなるペプチド。
配列番号５：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基１−１３からなるペプチド。
配列番号６：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＶＫＫ−Ａβ（１−１５）と称する。
配列番号７：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）と称する。
配列番号８：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１３）と称する。
配列番号９：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１０）と称する。
配列番号１０：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−８）と称する。
配列番号１１：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−６）と称する。
配列番号１２：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）と称する。
配列番号１３：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＫＫ−Ａβ（１−１５）と称する。
配列番号１４：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基１−１１からなるペプチド。
配列番号１５：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基３−１１からなるペプチド。
配列番号１６：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基３−１５からなるペプチド。
配列番号１７：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基１−１０からなるペプチド。
配列番号１８：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基１−８からなるペプチド。
配列番号１９：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基１−６からなるペプチド。
配列番号２０：ジフテリアトキソイドの部分ペプチド。
配列番号２１：ジフテリアトキソイドの部分ペプチド。
配列番号２２：ジフテリアトキソイドの部分ペプチド。
配列番号２３：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号２４：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号２５：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号２６：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号２７：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号２８：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号２９：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号３０：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号３１：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号３２：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号３３：ヒト型／ウシ型結核菌の分泌タンパク質ＭＰＴ６４の部分ペプチド。
配列番号３４：ヒト型／ウシ型結核菌の分泌タンパク質ＭＰＴ６４の部分ペプチド。
配列番号３５：ヒト型／ウシ型結核菌の分泌タンパク質ＭＰＴ６４の部分ペプチド。
配列番号３６：ヒト型／ウシ型結核菌の分泌タンパク質ＭＰＴ６４の部分ペプチド。
配列番号３７：細胞接着モチーフを含むペプチド。
配列番号３８：細胞接着モチーフを含むペプチド。
配列番号３９：細胞接着モチーフを含むペプチド。
配列番号４０：細胞接着モチーフを含むペプチド。
配列番号４１：細胞接着モチーフを含むペプチド。
配列番号４２：細胞接着モチーフを含むペプチド。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性に優れ、抗原に対する抗体の産生を効率よく誘導するペプチド、該ペプチドを有効成分として含有する組成物とその用途に関する。より詳しくは本発明は、ヒトのアミロイドβペプチド（以下、「Ａβペプチド」と略記する。）の特定のＢ細胞エピトープに対する抗体の産生を効率良く誘導するペプチド、該ペプチドを有効成分とするＡβペプチドに起因するアルツハイマー病をはじめとする神経変性疾患の予防及び／又は治療用の組成物とその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体に、特定の抗原に対して特異的な抗体産生のみを誘導する場合には、精製した抗原を単独で、或いは、抗体産生を増強する活性を有する免疫アジュバント（免疫機構を非特異的に刺激することによって、抗原に対する特異的免疫反応を強める物質）と共に生体に投与する方法が一般的に用いられてきた。この方法は、種々の感染症に対する最も有効な予防手段としても汎用されている。
【０００３】
特に抗生物質が無効であるウイルスや、微生物が産生する毒素などのように、他に有効な予防或いは治療方法がない場合には、生体に、これらのウイルスや毒素に対する抗体産生を誘導し、防御することが唯一の対策である場合も多い。現在この方法が実用化されているものとしては、病原微生物を有機溶媒や紫外線照射などで不活化して感染性を無くした不活化ワクチン及び病原体を弱毒化して生体への病原性を弱めた弱毒化ワクチンがある。これらのワクチンはポリオウイルスワクチンなど一部を除き、注射により非経口的に投与されている。しかし、不活化ワクチン、生ワクチンは何れも生体に対してアナフィラキシーショックを与えることがある。さらにウイルス粒子そのもの、或いは、蛋白巨大分子を免疫原として用いるため、ワクチン製剤とした際の安定性を保持するためヒト血清アルブミンやゼラチンなどを製剤の安定剤として用いる場合もあった。このためこれら安定剤に用いた物質に未知の感染性微生物の混入が否定できないこと、或いは、安定剤に対する生体のアナフィラキシーショックが生じることがあった。また大部分のワクチンは注射剤として製剤化されているが、注射剤以外のワクチン製剤も求められている。
【０００４】
一方、不活化ワクチンや生ワクチンよりも高い安全性と有効性をもつ、不活化ワクチンや生ワクチンの部分アミノ酸配列からなるポリペプチドを利用した新型ワクチンの開発研究が世界中で鋭意進められている。Ｂ型肝炎ウイルスワクチンに代表される組換え型ワクチンやコンポーネントワクチンは、その新型ワクチンの代表例である。しかしながら、ワクチンとして利用するポリペプチドの鎖長は短いものほど好ましいものの、短くすればするほど、生体が個別にもつ主要組織適合性抗原（以下、「ＭＨＣ」と略記する。）のクラスＩＩハプロタイプの拘束性を幅広くカバーし、十分な免疫原性を有するようにデザインすることが難しくなる。
【０００５】
経粘膜投与時の抗原の免疫原性を高める方法としては、対象とする抗原とともに、コレラ毒素や大腸菌由来の熱不安定型のエンテロトキシンや、これらのアミノ酸配列の一部を置換して弱毒化したものを免疫アジュバントとして投与する方法が知られている（非特許文献１）。しかしながら、目的とする抗原以外に、免疫アジュバントとして使用したコレラ毒素や大腸菌由来の熱不安定型のエンテロトキシンに対する抗体が産生されるなどの問題があり、実用に供されていない。
【０００６】
本発明者らは、目的とする抗体を免疫アジュバントを用いずに生体内で充分量産生誘導でき、且つ、安全に投与できるペプチドワクチンの提供を検討し、新規構造特性を有するペプチドを開発した（特許文献１）。すなわち、特許文献１には、アミノ末端（以下、「Ｎ末端」と略称する。）側にＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、リンカーペプチドをはさんで、そのカルボキシ末端（以下、「Ｃ末端」と略称する。）側にＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するペプチド内に、細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を有するペプチドが開示されている。このような構造を有するペプチドは、免疫アジュバント非存在下で経鼻などの経粘膜投与した場合に、複数のＭＨＣ クラスＩＩハプロタイプにおいて、目的とする抗原に対する特異抗体の充分な産生を効率よく増強した。しかも、上記ペプチドは、目的とする特異抗体以外の抗体の産生誘導能が低く、また、アナフラキシーなどの副作用を誘発しない安全性の高いポリペプチドであることを明らかにした。さらには、上記ポリペプチドが免疫アジュバント効果を有することを明らかにした。
【０００７】
本発明者らは、さらに、特許文献１に開示された構造特性に基づいて、ヒトＡβに対する抗体の産生を効率よく誘導するペプチドを作製し、本願ペプチドをアルツハイマー病の治療に利用できることを開示した（特許文献２）。すなわち、特許文献２には、Ｎ末端側に免疫記憶の成立しているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（以下、「Ｔ」と略記する場合がある。）を有し、リンカーペプチド（以下、「Ｌ」と略記する場合がある。）をはさんで、そのＣ末端側にＡβペプチドの１又は２以上のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（以下、「Ｂ」と略記する場合がある。）を有し、さらに細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列をＴのＮ末端側、ＴとＬの間、ＬとＢの間、及びＢのＣ末端側から選ばれる少なくとも１つの位置に有するペプチドが開示されている。
【０００８】
アルツハイマー病（以下、「ＡＤ」と略称する。）は老人性認知症の発症原因の大勢を占めるとされており、患者に記憶障害や運動障害を引き起こし生活の質（ＱＯＬ）の低下が著しい疾病である。さらに病気の治療以外に多大な介護が必要で、患者本人とその家族をはじめ介護者の時間的損失、労働機会の損失、精神的負担など、医療コストのみならず社会的負担が多くなる疾病である。高齢化が進む先進諸国において、認知症は、患者数が増加の一途をたどっており深刻な問題となっている。
【０００９】
ＡＤは、根本的な治療法がない重篤な神経変性疾患の一種類であり、病理的には４２個（配列表における配列番号１）又は４０個（配列表における配列番号２）のアミノ酸からなるＡβが中枢神経に蓄積されるいわゆる「老人斑」の沈着、神経原線維変化、及び神経細胞の変性と脱落が特徴的な疾病である。ＡＤの治療には、コリンエステラーゼ阻害剤による治療や、抗高脂血症剤やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）エチルなどの脳神経保護剤による臨床試験が実施されている。
【００１０】
ＡＤの治療方法の開発においては、ＡＤの中心的な役割を担っているＡβを標的分子としたワクチン開発も進められている（非特許文献２）。また、ヒト型抗Ａβモノクローナル抗体、ＤＮＡワクチン、ＣｐＧＤＮＡなどの新しいアジュバント、及び経口投与用のペプチドワクチンなどの開発も進められている。しかしながら、ＤＮＡワクチンは、ＭＨＣクラスＩ拘束性であるために細胞障害性Ｔ細胞の活性化を誘導しやすく、そのためＡＤの治療には適当でないと考えられていた。ペプチドワクチンは免疫原性が弱くＡβに対する抗体産生誘導能が低いため、抗体産生の誘導にアジュバントを必要とすることが多く、アジュバントの使用による過剰な免疫反応を惹起する可能性がある。また、抗原が比較的高分子のものではＴ細胞エピトープならびにＢ細胞エピトープを多数含むために、これらエピトープに対する過剰な免疫反応が惹起されることがある。このような過剰な免疫反応は予期せぬ炎症反応などを惹起する可能性があり、これによる脳炎などの副作用リスクがあるとされている。そのため、依然としてＡＤの根本的な治療方法は確立されていない。また、ＡβはＡＤ以外の各種疾患の発症や増悪にも関与していることが知られているが、これらの疾患の予防法や治療法も確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００４／０８７７６７号パンフレット。
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００７／０９７２５１号パンフレット。
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ラベル（Ｌａｖｅｌｌｅ Ｅ．Ｃ．）、「Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｌｅｃｔｉｎｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ」、イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、２０００年、第９９巻、第１号、ｐ．３０−３７。
【非特許文献２】アガジャニャン（Ａｇａｄｊａｎｙａｎ Ｍ．Ｇ）ら、「Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ Ｂ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｆｒｏｍ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ａｎｄ ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐａｎ ＨＬＡ ＤＲ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ」、ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、２００５年、第１７４巻、第３号、ｐ．１５８０−１５８６。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従前、本発明者らは、免疫原性に優れ、目的とする抗体を免疫アジュバントを用いずに生体内で充分量産生誘導でき、且つ、安全に投与できる新規構造特性を有するペプチドを開発した。すなわち、Ｎ末端側にＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、リンカーペプチドをはさんで、そのＣ末端側にＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するペプチド内に、細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を有するペプチドを開示している（特許文献１）。また、このような構造特性に基づいて、Ａβに対する抗体の産生を効率よく誘導するペプチド、すなわち、Ｎ末端側に生体において免疫記憶の成立しているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（Ｔ）を有し、リンカーペプチド（Ｌ）をはさんで、そのＣ末端側にＡβペプチドの１又は２以上のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（Ｂ）を有し、さらに細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列をＴのＮ末端側、ＴとＬの間、ＬとＢの間、及びＢのＣ末端側から選ばれる少なくとも１つの位置に有するペプチドを作製し、開示した（特許文献２）。このようなペプチドにより、正常マウスにおいて高い抗Ａβ抗体産生が認められた。
【００１４】
しかしながら、ペプチドワクチンの充分な薬効を得るためには、より高い抗体産生誘導能を有するペプチドが求められていた。
【００１５】
本発明の課題は、免疫原性に優れ、より高い抗体産生誘導能を有するペプチドであって、追加投与によっても目的の抗体の産生を増強することのできるペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、特許文献２に開示したＡβペプチドワクチンに含まれている各構造要素、すなわち、Ｔ細胞エピトープ、リンカーペプチド、及びＢ細胞エピトープそれぞれに対する抗体の産生量に着目した。そこで、抗原性の低いリンカーペプチドの探索を行い、その結果、細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列、Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列、Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列、及びリンカーペプチドとしてＧＫＫ又はＶＶＫＫ（配列表における配列番号３）で表されるアミノ酸配列を含むペプチドが、目的とする抗体の産生を効率よく誘導することを見出した。本発明者らは、さらに、当該ペプチドが、追加投与の際に従前のペプチドに比べて目的の抗体の産生をより増強することを見出して本発明を完成した。
【００１７】
すなわち、本発明は以下に関する：
１．一般式：Ｒ１−Ｔ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ３−Ｂ−Ｒ４で示されるアミノ酸配列を有するペプチド、ここでＴは免疫記憶の成立しているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を示し、Ｌはリンカーペプチドのアミノ酸配列を示し、Ｂは抗原の特定の１又は２以上のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を示すペプチドであって、該リンカーペプチドのアミノ酸配列がＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列であることを特徴とするペプチド、
２．Ｔ細胞エピトープが、ジフテリア、結核、破傷風、及び百日咳の予防接種に抗原として用いられるペプチドから選ばれる何れか１種又は２種以上のペプチドに由来するアミノ酸配列を有することを特徴とする前記１．のペプチド、
３．Ｂ細胞エピトープが、ＡβペプチドのＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする前記１．又は２．のペプチド、
４．ＡβペプチドのＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列が、ＡβのＮ末端から第１番目のアミノ酸から第１５番目のアミノ酸配列（配列表における配列番号４）又はＡβのＮ末端から第１番目のアミノ酸から第１３番目のアミノ酸配列（配列表における配列番号５）である前記３．のペプチド、
５．配列表における配列番号６から１１の何れかに記載のアミノ酸配列からなる前記４．のペプチド、
６．前記１．から５．の何れかのペプチドと共に、製剤学的に許容される１種以上の製剤用添加剤を含有する組成物、
７．前記３．から５．の何れかのペプチドと共に、製剤学的に許容される１種以上の製剤用添加剤を含有する、Ａβに対する抗体の産生を誘導することができる組成物、
８．アルツハイマー病の予防及び／又は治療用である前記７．の組成物、及び
９．前記１．から５．の何れかのペプチドをコードするＤＮＡ。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、免疫原性に優れ、高い抗体産生誘導能を有し、追加投与により目的の抗体の産生を増強することのできるペプチドを提供することができる。
【００１９】
さらに本発明に係るペプチドにより、効果及び安全性の高いペプチドワクチンを提供できる。本発明に係るペプチドは、高い抗体産生誘導能を有し、また、該ペプチドにより産生誘導された抗体は該ペプチドの投与終了後に速やかに低減する。そのため、抗原による過剰な炎症反応などの免疫反応に起因する副作用が生じる可能性が少ない。特にＡβのような内部抗原に対するワクチンは、かかる副作用が少ないことは大きな利点である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】各種Ａβペプチドワクチンの追加投与後の抗Ａβ抗体産生誘導能をＢａｌｂ／ｃマウスを用いて評価した結果を示す図である。評価は１群４匹のマウスを用いて行い、抗Ａβ抗体量は平均±Ｓ．Ｅ．で示した。試験したペプチドは全て、そのＮ末端に細胞接着分子の細胞結合モチーフであるＲＧＤで表されるアミノ酸配列を有し、それに続いてジフテリアトキソイド（以下、「ＤｉＴｏｘ」と略称する。）由来のＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、リンカーペプチドのアミノ酸配列、及びＡβペプチド由来のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列が順次連結された構造を有する。評価した８種類のペプチドの中で、ＧＫＫで表されるアミノ酸配列からなるリンカーペプチド（以下、「ＧＫＫリンカーペプチド」と略称することがある。）を有するＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）が最も高い抗Ａβ抗体産生誘導能を示し、６回の追加投与後でも抗Ａβ抗体の産生の増加が観察された。ＧＫＫリンカーペプチドを有する他のペプチドも高い抗Ａβ抗体産生誘導能を示した。また、ＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列からなるリンカーペプチドを有するＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＶＫＫ−Ａβ（１−１５）も高い抗Ａβ抗体産生誘導能を示した。図中、「Ｖｅｈ」はＡβペプチドワクチンの代わりにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した結果を示す。（実施例１）
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、下記一般式で示されるアミノ酸配列を有するペプチド、ここでＴは免疫記憶の成立しているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を示し、Ｌはリンカーペプチドのアミノ酸配列を示し、Ｂは抗原の特定の１又は２以上のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を示すペプチドであって、該リンカーペプチドのアミノ酸配列がＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列であることを特徴とするペプチドに関する。
（化１）
Ｒ１−Ｔ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ３−Ｂ−Ｒ４
【００２２】
本明細書におけるアミノ酸配列の表記は、配列表においては三文字表記とし、その他の記載においては一文字表記とする。
【００２３】
本発明に係るペプチドは、該ペプチドに含まれるＢ細胞エピトープ或いはこれを含むアミノ酸配列に対する抗体の産生を誘導する能力を有し、且つ、該ペプチドの追加投与により目的とする抗体の産生を増強することができる。本発明でいう抗体とは、主としてイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）抗体であり、血中や体液中に分泌されるものはもとより、鼻腔、口腔、眼、消化管などに分泌される抗体も当然これに含まれる。
【００２４】
本発明に係るペプチドは、Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列とＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列との間にそれらを連結させるように配置されたリンカーペプチドのアミノ酸配列がＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列であることに特徴がある。従前の開示（特許文献１及び２）ではリンカーペプチドとして、抗原プロセッシングに関与するプロテアーゼの認識配列、特にジペプチドが例示され、さらにカテプシンＢの認識配列であるリジン−リジン（ＫＫ）からなるジペプチドが推奨されていた。しかしながら、リンカーペプチドとしてＫＫからなるジペプチドを使用して作製したＡβペプチドワクチンは、追加免疫を繰り返すことにより抗Ａβ抗体産生量が増加しなかったり、増加の程度が低いことがあった。一方、ＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列からなるペプチドをリンカーペプチドとして作製したＡβぺプチドワクチンは、後述する実施例に示すように、ＫＫからなるジペプチドをリンカーペプチドとして作製したＡβぺプチドワクチンと比較して、より高い抗Ａβ抗体産生誘導能を示し、また、追加投与により抗体産生量の増加の程度も大きかった。リンカー部位は目的とする抗体の産生誘導に直接関与する部位ではないことから、ＡβペプチドのＢ細胞エピトープの代わりに他の抗原のＢ細胞エピトープを用いても同様の結果が得られると考えることができる。さらに、ＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列からなるペプチドをリンカーペプチドとして作製したＡβぺプチドワクチンは、ＫＫからなるジペプチドをリンカーペプチドとして作製したＡβぺプチドワクチンと比較して、その投与終了後に血中抗Ａβ抗体濃度が速やかに低減する。ワクチンの弱点として、ワクチンにより誘発される免疫反応が一旦惹起されるとそれを制御することや元の状態に戻すことは容易ではなく、それにより例えば過剰な炎症反応が生じて副作用が生じるおそれがあることが一般的に知られている。しかしながら、本発明に係るペプチドワクチンはその投与終了後に目的とする抗体の血中濃度が速やかに低減することから副作用を誘発する可能性は少ない。特に、Ａβのような内部抗原に対するワクチンは、副作用が少ないことは大きな利点である。また、ＧＫＫで表されるアミノ酸配列からなるペプチドをリンカーペプチドとして作製したＡβぺプチドワクチンの投与終了後の血中抗Ａβ抗体濃度の速やかな低減は、Ａβ由来のＢ細胞エピトープを含むアミノ酸配列の長さを変更しても同程度に認められたことから、Ｂ細胞エピトープの差異には依存せず、リンカーペプチドの配列の差異に依存すると考えている。したがって、本発明に係るペプチドワクチンにおいてＡβペプチドのＢ細胞エピトープの代わりに他の抗原のＢ細胞エピトープを用いても、その投与終了後に目的とする抗体の血中濃度が速やかに低減すると考えることができる。このように、ＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列からなるペプチドをリンカーペプチドとして作製したＡβぺプチドワクチンは、極めて高い抗体産生誘導能を有し、かつ安全性が高いという大きな利点を有する。抗体産生誘導能がより高いことから、ＧＫＫで表されるアミノ酸配列からなるペプチドをリンカーペプチドとして作製したＡβぺプチドワクチンがより好ましい。
【００２５】
本発明でいう「エピトープ」とは、抗原決定基ともいい、免疫応答に関与するＴ細胞、Ｂ細胞及び抗体に認識される抗原分子の特定の構造単位を意味し、６〜１０個のアミノ酸配列や５〜８個の単糖の配列から成る。「抗原」とは、生体を刺激して抗体産生や細胞性免疫などの免疫応答を惹起する物質の総称をいう。一般的には免疫応答を惹起するタンパク質をいう。糖、脂質、核酸などの種々の有機物に対して抗体が産生されるが、タンパク質以外の物質は、一般的にタンパク質と結合して複合体を形成した場合に抗原としての活性を現す。Ｔ細胞及びＢ細胞により認識される抗原分子の特定の構造単位をそれぞれ「Ｔ細胞エピトープ」及び「Ｂ細胞エピトープ」と呼ぶ。
【００２６】
本発明に係るペプチドにおいて、Ｂ細胞エピトープは抗体産生を誘導する部位として使用される。Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列は、微生物、細胞、又は腫瘍細胞に由来する毒素、アレルゲン、酵素、細胞膜抗原、腫瘍特異性抗原などの抗原であって、その各々について文献的に既に明らかにされている既知の抗原エピトープのアミノ酸配列そのものでもよく、また実際に生体に対して免疫原性をもつ様々な抗原そのもの、或いは、常法により、抗原の部分ペプチドを免疫してＢ細胞エピトープ配列を同定し、この同定したアミノ酸配列を有するペプチドをＢ細胞エピトープとして用いてもよい。また、このＢ細胞エピトープは、後述のＴ細胞エピトープと同じ抗原上にあるものでもよく、Ｂ細胞エピトープとそのアミノ酸配列の一部又は全部を共有していてもよい。従って、Ｂ細胞エピトープ部分については、感染防御、癌、腫瘍、潰瘍、肝炎など炎症性疾患、アレルギー及びアトピー性皮膚炎などの免疫性疾患などの予防や治療、酵素の中和、臨床検査などに使用される各種抗原の検出など、抗体の使用目的に応じて、好ましい抗原ペプチドを選択することが出来る。これらのＢ細胞エピトープを含むペプチドはそのまま使用してもよく、タンデムに連結して、その２量体、３量体或いは多量体として使用してもよい。また、同一抗原上に存在する２種以上のＢ細胞エピトープをタンデムに連結することも、抗原全体をＢ細胞エピトープとすることもできる。また、複数種の抗原性タンパク質が関与する疾患治療の場合、それらのＢ細胞エピトープをタンデムに連結することにより、１つのペプチドで複数種の抗原性タンパク質に対する抗体を産生できるペプチドを設計することもできる。この場合には、各Ｂ細胞エピトープの間に、前述の抗原プロセッシングに関与するプロテアーゼの認識配列をリンカーペプチドとして挿入することにより、個々のエピトープのプロセッシングをより確実に行わせることもできる。
【００２７】
本発明に係るペプチドにおいて、抗体産生を誘導する部位としてＡβペプチドのＢ細胞エピトープを使用することにより、Ａβに対する抗体産生を誘導するペプチドを製造できる。「ＡβペプチドのＢ細胞エピトープ」とは、アルツハイマー病の原因とされるＡβのＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むペプチドをいう。なかでも、Ａβ凝集線維を溶解したり、Ａβの神経線維やその他の臓器への沈着の阻害、アセチルコリンレセプターへの結合を阻害する抗体の産生を誘導することができるアミノ酸配列を有するペプチドが好ましく、その点からは、ＡβのＮ末端付近のアミノ酸配列を含むペプチドが特に好ましく、アミノ酸が５乃至２０個程度で構成されるものが好ましい。構成するアミノ酸の数が少なすぎると抗体産生誘導能が消失し、多すぎると抗原性は高くなるがその一方で副作用を誘発するような抗体の産生を誘導するエピトープを含む可能性がある。このＢ細胞エピトープを含むペプチドはそのまま使用してもよく、タンデムに連結して、その２量体、３量体或いは多量体として使用してもよい。また、必要であれば、Ａβ上に存在する２種以上のＢ細胞エピトープをタンデムに連結することも、Ａβ全体、例えば、アミノ酸数が４２個（配列表における配列番号１、以下、「Ａβ（１−４２）」と略記する。）や４０個（配列表における配列番号２、以下、「Ａβ（１−４０）」と略記する。）のＡβをＢ細胞エピトープとすることもできる。また、複数のエピトープを連結して、複数種の抗体の産生を同時に誘導するようなペプチドを設計することもできる。これらの場合には、各Ｂ細胞エピトープの間に、前述の抗原プロセッシングに関与するプロテアーゼの認識配列をリンカーペプチドとして挿入することにより、個々のエピトープのプロセッシングをより確実に行わせることもできる。
【００２８】
本発明に係るペプチドにおいて、Ｂ細胞エピトープとして、ＡβのＮ末端付近のアミノ酸配列を用いる場合は、少なくともＡβのＮ末端から４−１０番目のアミノ酸配列を有することが好ましく、例えば、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列における１−１５番目のＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号４、以下、「Ａβ（１−１５）」と略記する。）、１−１３番目のＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号５、以下、「Ａβ（１−１３）」と略記する。）、１−１１番目のＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号１４、以下、「Ａβ（１−１１）」と略記する。）、３−１１番目のＥＦＲＨＤＳＧＹＥのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号１５、以下、「Ａβ（３−１１）」と略記する。）、３−１５番目のＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号１６、以下、「Ａβ（３−１５）」と略記する。）、などを挙げることができる。その他、ＡβペプチドのＢ細胞エピトープとして、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列における１−１０番目のＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号１７、以下、「Ａβ（１−１０）」と略記する。）、１−８番目のＤＡＥＦＲＨＤＳのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号１８、以下、「Ａβ（１−８）」と略記する。）１−６番目のＤＡＥＦＲＨのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号１９、以下、「Ａβ（１−６）」と略記する。）を挙げることができる。Ａβペプチドに対する抗体の産生誘導能や副作用の点を考慮すれば、Ａβ（１−１５）又はＡβ（１−１３）を用いるのが好ましく、Ａβ（１−１５）が特に好ましく用いられる。
【００２９】
本発明に係るペプチドに使用する「免疫記憶が成立しているＴ細胞エピトープ」とは、本発明に係るペプチドワクチンの投与時、その投与する生体に、既に、免疫記憶が成立しているものをいう。例えば、本発明に係るペプチドを投与する生体に対して、本発明に係るペプチドと同じＴ細胞エピトープを含むペプチドを予め投与し、免疫記憶を成立させておけばよい。生体において免疫記憶が成立しているＴ細胞エピトープは、好ましくは、ヒトにおいて免疫記憶が成立しているＴ細胞エピトープをいう。とりわけ、予防接種などにより、大多数のヒトが、幼児期以降に免疫を獲得している抗原ペプチドがもつＴ細胞エピトープは、上記のような免疫記憶を成立させる操作を行なわなくても使用できる。また、すでに免疫記憶が成立している患者に対して、再度、上記操作を行えばさらなる効果の向上が期待できる。
【００３０】
Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣ クラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲ分子とそのアグレトープで結合し、ヘルパーＴ細胞用抗原として提示される。「アグレトープ」とは、Ｔ細胞エピトープがもつ、ＨＬＡ−ＤＲ分子との結合部位のアミノ酸残基をいう。Ｔ細胞エピトープは、ＨＬＡ−ＤＲのハプロタイプに拘束されるため、できるだけ多数のＨＬＡ−ＤＲハプロタイプ（アレル）の拘束を受ける重複・シフト型のマルチアグレトープ型ペプチドやそれを含むアミノ酸配列のものを使用するのが好ましい。
【００３１】
本発明で使用するＴ細胞エピトープとしては、例えば、ジフテリア、破傷風、百日咳、舌下腺炎、風疹、麻疹、結核などの予防接種に抗原として使用するペプチドが、大部分のヒトで、幼児期から免疫記憶が成立していることから好ましい。ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳ワクチンを含む三種混合ワクチンやＢＣＧ（結核）の接種は、日本では接種が義務づけられており、世界的にも接種が広く行われていることから、汎用性の点から、特に好ましい。
【００３２】
これらのペプチドのアミノ酸配列は何れも既に公知であることから、当該ペプチドの公知のＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を利用してもよい。また、実際にヒトの末梢血の幼若化反応などを利用して、抗原の部分ペプチドのエピトープ配列を同定し、この同定したアミノ酸配列を有するペプチドをＴ細胞エピトープとして用いてもよい。また、利用可能なＨＬＡ−ＤＲのＴ細胞エピトープ予測プログラムを利用して、多くのＨＬＡ−ＤＲに結合するマルチアグレトープ領域を選択して、ペプチドのアミノ酸配列を決定することも任意に行うことができる。
【００３３】
また、このＴ細胞エピトープ自身は、当該エピトープに対する抗体産生誘導能が低い方が、副作用などの点から好ましい。一方で、エピトープとして予防接種に使用される感作抗原由来のアミノ配列のペプチドを使用すれば、当該エピトープは、本来、ヒトにおいて、このエピトープに対する抗体の産生を誘導するために使用されるものなので、このエピトープに対する抗体が産生されたとしても、その安全性は確立されており、副作用が発生しにくいという利点がある。これらのＴ細胞エピトープペプチドはそのまま使用しても、或いは同種又は複数種のＴ細胞エピトープをタンデムに連結して使用してもよい。また、Ｔ細胞エピトープは、アグレトープとなるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換しても機能を発揮することができる。
【００３４】
このＴ細胞エピトープとしては、具体的には、例えば、ジフテリアトキソイド由来のエピトープであるＡＹＮＦＶＥＳＩＩＮＬＦＱＶＶＨＮＳＹＮのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２０）（以下、「ＤｉＴｏｘ（２０）」と略記する。）、ＡＹＮＦＶＥＳＩＩＮＬＦＱＶＶＨＮＳＹのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２１）（（以下、「ＤｉＴｏｘ（１９）」と略記する。）、及びＹＮＦＶＥＳＩＩＮＬＦＱＶＶＨＮＳＹＮのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２２）、及び破傷風トキソイド由来のエピトープである、ＬＱＴＭＶＫＬＦＮＲＩＫＮＮＶＡのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２３）、ＦＬＱＴＭＶＫＬＦＮＲＩＫＮＮＶＡＧのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２４）（以下、「ＴｅｔＴ１Ｌ）」と略記する。）、ＩＨＶＬＨＧＬＹＧＭＱＶＳＳＨＥのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２５）、ＬＩＨＶＬＨＧＬＹＧＭＱＶＳＳＨＥＩのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２６）、ＹＩＶＮＥＤＫＦＱＩＬＹＮＳＩＭＹＧのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２７）、ＱＹＩＶＮＥＤＫＦＱＩＬＹＮＳＩＭＹＧＦのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２８）（以下、「ＴｅｔＴ３Ｌ）」と略記する。）、ＳＹＱＭＹＲＳＬＥＹＱＶＤＡＩのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号２９）、ＲＳＹＱＭＹＲＳＬＥＹＱＶＤＡＩのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号３０）、ＮＩＮＩＦＭＲＥＳＳＲＳＦＬＶのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号３１）、ＩＮＩＮＩＦＭＲＥＳＳＲＳＦＬＶＮのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号３２）、ヒト型及びウシ型の結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ｂｏｖｉｓ）共通の分泌タンパク質として知られるＭＰＴ６４由来ペプチドであるＩＱＭＳＤＰＡＹＮＩＮＩＳＬＰＳＹＹＰＤのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号３３）（以下、「ＭｐｔＬ（４３−６２）」と略記する。）、ＩＱＭＳＤＰＡＹＮＩＮＩＳＬＰＳのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号３４）、ＤＰＡＹＮＩＮＩＳＬＰＳＹＹＰＤのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号３５）及びＹＮＩＮＩＳＬＰＳＹＹＰＤＱＫＳのアミノ酸配列を有するペプチド（配列表における配列番号３６）などのアミノ酸配列を有するエピトープを挙げることができる。中でも、抗体産生誘導能の高さと、後述のＨＬＡ−ＤＲ拘束性予測プログラム「ＰｒｏＰｒｅｐ」で予測可能なＨＬＡ−ＤＲと結合可能な５１アレルの内、それぞれ４７アレル、３９アレル、４１アレル、或いは５０アレルに結合できると予測されるＭｐｔＬ（４３−６２）、ＤｉＴｏｘ（２０）、ＴｅｔＴ１Ｌ及びＴｅｔＴ３Ｌが好ましく、ＤｉＴｏｘ（２０）が特に好ましい。
【００３５】
ＤｉＴｏｘ（２０）のＣ末端においてアミノ酸残基が１つ欠失したＤｉＴｏｘ（１９）は、ペプチドの抗原性やマルチアグレトープ機能にＣ末端のアミノ酸が影響しないことがインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）解析により判明したことから、ＤｉＴｏｘ（２０）と同様のアレルに結合できると予測されるため、ＤｉＴｏｘ（２０）と同様に好ましく使用できる。
【００３６】
また、必要に応じて本発明に係るペプチドワクチンを投与するヒトの末梢血とこれらのＴ細胞エピトープを混合培養し、その幼若化反応を確認するか、或いは、その少量を皮内に投与して遅延型過敏症が起きることを確認して、メモリーＴ細胞の存在の有無を確認して、投与するヒトに好ましいＴ細胞エピトープを選択することもできる。
【００３７】
細胞接着分子の細胞結合モチーフとしては、本発明に係るペプチドを粘膜表面に長期間保持することができて、経口、経鼻などの経粘膜投与での抗体産生の誘導能の増強作用のあるものである限り利用することができる。例えば、インテグリンファミリーに対する結合モチーフをはじめとし、その他の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を用いることができる。例えば、インテグリン結合モチーフに属するアミノ酸配列としては、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン、ヒト免疫不全ウイルスのＴａｔタンパク質などの細胞接着分子に存在する結合モチーフとして知られる、ＲＧＤ、ＲＥＤ、ＬＤＶ、ＰＨＳＲＮ（配列表における配列番号３７）、ＲＫＫ、ＤＧＥＡ（配列表における配列番号３８）などのアミノ酸配列を挙げることができる。また、インテグリンのファミリー以外の結合モチーフのアミノ酸配列としては、ＹＩＧＳＲ（配列表における配列番号３９）、ＩＫＶＡＶ（配列表における配列番号４０）、ＲＦＹＶＶＭＷＫ（配列表における配列番号４１）、ＩＲＶＶＭ（配列表における配列番号４２）などを挙げることができる。なかでも、ＲＧＤ、ＲＥＤ、及びＹＩＧＳＲで表される各アミノ酸配列からなるペプチドが、特異的な抗体の産生誘導能が強いことから好ましく、ＲＧＤが特に好ましい。また、本発明に係るペプチドにおいて、これら細胞結合モチーフのアミノ酸配列の連結部位は、Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列のＮ末端側又はＣ末端側、又は、Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列のＮ末端側又はＣ末端側の合計４箇所から選択でき、そのうち少なくとも１箇所に連結すればよい。とりわけ、Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列のＮ末端側又はＣ末端側の片側、又は両側に、細胞接着分子の細胞結合モチーフを連結した本発明に係るペプチドは、Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列に特異的な抗体の産生が特に増強されるので好ましく、Ｎ末端側に連結したものが特に好ましい。
【００３８】
本発明に係るペプチドの具体例として、抗体産生を誘導する部位としてＡβペプチドのＢ細胞エピトープを含み、Ａβに対する抗体産生を誘導するペプチドを挙げることができる。より具体的には、配列表において配列番号６−１１に記載のアミノ酸配列によりそれぞれ表されるＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＶＫＫ−Ａβ（１−１５）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１３）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１０）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−８）、及びＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−６）を例示できる。
【００３９】
本発明に係るペプチドを製造するための方法に限定はなく、慣用のペプチド合成法によるか、或いは、慣用のペプチド合成法によりあらかじめ部分的に合成したペプチド同士を結合して、調製することができる。また当該ペプチドは、各メーカーから市販されているペプチドシンセサイザーを用いて装置のプロトコールに従って合成することができる。
【００４０】
また、本発明に係るペプチドは、組換えＤＮＡ技術により調製することができる。例えば、設計したペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製し、これを自律増殖可能なベクターに挿入し、それを大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母などの微生物、動植物やそれらの細胞又は組織などの宿主に導入して形質転換体としたり、トランスジェニック動植物を作製して、それらを培養、育成した後、本発明に係るペプチドを適宜の方法により、採取・精製することができる。さらには、本発明に係るペプチドを発現させた菌体、動物体或いは植物体をそのまま加工して、本発明に係るペプチドを含有する経口摂取用の組成物として使用することもできる。植物種としては、例えば、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、セリ科（Ａｐｉａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、ブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）、ツツジ科（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）、パパイヤ科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、クルミ科（Ｊｕｇｌａｎｄａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、ヒルガオ科（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｅ）、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、又はヤモノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）などに属する植物種、より詳細には、レタス、チコリ、ヨモギ、ブロッコリ、キャベツ、ダイコン、ワサビ、カラシ、キュウリ、メロン、カボチャ、ハヤトウリ、ニンジン、ミツバ、セロリ、リンゴ、プラム、ウメ、モモ、イチゴ、ラズベリー、アーモンド、ナシ、ビワ、ブドウ、クランベリー、コケモモ、ブルーベリー、パパイヤ、アルファルファ、ダイズ、クルミ、ホウレンソウ、トマト、トウガラシ、サツマイモ、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ヤマノイモ、ジャガイモなどを挙げることができる。また、本発明に係るペプチドは、前記の何れかの方法により、その全アミノ酸配列を有するペプチドを直接調製してもよく、或いは、予めその一部アミノ酸配列を有するペプチドを合成したもの同士を化学的に結合して調製することもできる。
【００４１】
本発明の効果を妨げない限り、本発明に係るペプチドに、製剤学的に許容できる１種又は２種以上の製剤用添加剤を組み合わせた組成物を調製することもできる。製剤用の添加剤としては、水、アルコールなどの溶媒、グルコース、マルトースなどの還元性糖質、α，α−トレハロース、ショ糖、サイクロデキストリンなどの非還元性糖質、或いは、α，α−トレハロース、マルトシルトレハロースなどのα，α−トレハロースの糖質誘導体、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、マルトトリイトールなどの糖アルコール、寒天、プルラン、グアガム、アラビアガムなどの水溶性高分子、ゼラチン、シルクなどのタンパク質やそれらの加水分解物、脂質、アミノ酸、緩衝剤、安定化剤、抗菌剤、香料、栄養機能食品、医薬部外品或いは医薬品の有効成分、ミョウバン、水酸化アルミニウムなどの免疫アジュバントや上記以外の食品添加物、医薬品添加物などを挙げることができ、これらの１種又は２種以上を適宜組み合わせて使用できる。なかでも、ペプチドの安定化効果の高い、α，α−トレハロース及びα，α−トレハロースの糖質誘導体が好ましい。
【００４２】
また、本発明に係るペプチドを含有する製剤の形態としては、その製剤中のペプチドが長期間安定に保持されるものであれば特に制限はなく、溶液、凍結乾燥品、錠剤、舌下錠、トローチ、粉末、顆粒、クリーム、軟膏、シラップなどの剤形から、投与対象、投与方法、製剤の保存方法や輸送方法を考慮して適宜選択すればよい。また、本発明に係るペプチド又はそれを含有する組成物は、必要に応じて、リポソームに封入したり、皮膚、組織への浸透促進剤やイオン導入法などを併用することにより、抗原提示細胞の存在部位への浸透を促進させることもできる。また、本発明に係るペプチドは、錠菓、飴、清涼飲料などの各種飲食品に含有せしめ、これを経口的に摂取することにより、ペプチドを経粘膜的に投与することもできる。また、本発明に係るペプチドをコードするＲＮＡを直接生体に投与したり、細胞にＤＮＡを導入するいわゆる遺伝子治療などにより、生体内において本発明に係るペプチドを発現させることもできる。
【００４３】
本発明に係るペプチド又はこれを含む組成物のヒトへの投与方法には、特に制限はなく、本発明に係るペプチドが、投与部位へ確実に到達できる方法であれば何れでよい。例えば、スポイトや注射器を使用して適量を粘膜上に滴下してもよく、経口摂取や、クリーム或いはジェル状にして粘膜に塗布したり、カテーテルなどで投与部位に誘導してもよく、さらには、スプレーやネブライザーなどにより霧状にして吹き付けたり、鼻、気管或いは肺へ吸引させてもよい。皮下、皮内、筋肉内、血管内、腹腔内や胸腔内などの体腔内への投与には、注射器、カテーテル、点滴などの投与方法を使用することができる。本発明に係るペプチドの投与量は、抗体産生誘導能、疾患の種類、投与経路、投与方法、投与対象動物などを考慮して適宜決定すればよく、通常、０．００００１乃至１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０００１乃至２５ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．００１乃至１０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、本発明に係るペプチドは、初回の投与で、効果的に抗体産生を誘導することができるので、以後は、このペプチドのＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を有するペプチドのみで追加投与を行った場合でも、目的とする抗体の産生を増強することができる。
【００４４】
本発明に係るペプチド又はこれを含む組成物は、ペプチドワクチンとして使用できる。ワクチンとは、病原体に対する能動免疫を与える目的で投与される製剤をいう。能動免疫とは、抗原の投与により免疫応答を誘発することをいう。ペプチドワクチンとは、タンパク質のアミノ酸配列のうち実際に免疫反応を惹起して生体防御に働く部分のアミノ酸配列からなるペプチドを含む製剤をいう。
【００４５】
本発明に係るペプチドワクチンは、それにより産生誘導する抗体の使用目的に応じて、好ましい抗原ペプチドを選択することにより、感染防御、癌、腫瘍、潰瘍、肝炎など炎症性疾患、アレルギー及びアトピー性皮膚炎などの免疫性疾患などの予防や治療に使用することができる。或いは、酵素の中和、臨床検査などに使用される各種抗原の検出に使用する抗体の製造に使用することができる。
【００４６】
本発明に係るペプチドワクチンにおいて、Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列として、Ａβ由来のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を選択することにより、抗Ａβ抗体の産生を誘導するペプチドワクチンを得ることができる。このようなペプチドワクチンにより、Ａβに起因する疾患の予防や治療を行うことができる。本発明でいうＡβに起因する疾患とは、Ａβが特定の組織に沈着するなどして起きる疾患をいい、その沈着が病因の主因となるものは言うまでもなく、他の疾患に付随するＡβの沈着により発生乃至増悪する疾患を含み、これらの疾患に伴う臨床症状も含む。具体的には、例えば、アルツハイマー病、ピック病、びまん性レビー小体病、進行性核上麻痺（スチール−リチャードソン症候群）、多系統変性（シャイ−ドレーガー症候群）、筋萎縮性側索硬化症、変性運動失調、皮質基底変性、グアムＡＬＳ−パーキンソン−痴呆合併症、亜急性硬化性汎脳炎、ハンチントン病、パーキンソン病、シヌクレイノパシー、一次性進行性失語症、線条体黒質変性、マチャド−ジョセフ病／脊髄小脳性運動失調３型及びオリーブ橋小脳変性を含む運動ニューロン疾患、ジル・ド・ラ・ツレット病、球麻痺及び偽球麻痺、脊髄及び脊髄延髄筋委縮症（ゲネディ病）、一次性側索硬化症、家族性痙性対麻痺、ヴェルニッヒ−ホフマン病、クーゲルベルグ−ヴェランデル病、テイ−サックス病、ザントホフ病、家族性痙性病、ヴォールファルト−クーゲルベルグ−ヴェランデル病、痙性対麻痺、進行性多病巣性白質脳障害、及びプリオン病（クロイツフェルト−ヤコブ病）、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、クールー及び致死性家族性不眠症を含む、年齢が関係する痴呆、血管性痴呆、拡散性白質病（ヴィンズヴァンガー病）、内分泌又は代謝を起源とする痴呆、頭部外傷及び拡散性脳損傷の痴呆、痴呆性の拳闘姿勢又は前頭葉痴呆、大脳虚血又は塞栓性の閉塞及び血栓性の閉塞を含むインファクションならびに任意の種類の脳蓋内出血から生じる神経変性疾患、脳蓋内及び椎骨損傷、遺伝性大脳血管障害、非神経障害性遺伝性アミロイド、ダウン症候群、マクログロブリン血症、二次的家族性地中海熱、マックル−ウェルズ症候群、多発性骨髄腫、膵臓疾患又は心臓疾患に関連するアミロイドーシス、慢性血液透析関節症又はフィンランド型及びアイオワ型アミロイドーシス、糖尿病変成ニューロパチーなどの神経変性疾患や膵臓へのＡβの沈着に起因する糖尿病などを挙げることができ、これらの疾患に伴う臨床症状も含む。
【００４７】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
各種Ａβペプチドワクチンを作製し、その抗Ａβ抗体産生誘導能をＢａｌｂ／ｃマウスを用いて評価した。
【００４９】
ペプチドは、特許文献２で開発したペプチドプロトタイプのＡβペプチドワクチンであるＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）（配列表における配列番号１２）のリンカー部位及びＢ細胞エピトープ部位を変換することにより設計し、外部委託（オペロンバイオテクノロジー株式会社）により合成した。ペプチドは全て、１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解した。
【００５０】
評価したペプチドは、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）（配列表における配列番号１２）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＫＫ−Ａβ（１−１５）（配列表における配列番号１３）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＶＫＫ−Ａβ（１−１５）（配列表における配列番号６）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）（配列表における配列番号７）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１３）（配列表における配列番号８）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１０）（配列表における配列番号９）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−８）（配列表における配列番号１０）、及びＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−６）（配列表における配列番号１１）の８種類である。
【００５１】
ペプチドのマウスへの投与は次のように行った。まず、５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（日本チャールズリバー株式会社）に沈降ジフテリア破傷風混合トキソイド（北里研究所製）を５０μＬ／マウスで背部皮下に投与して予備免疫を行い、免疫２週間後からペプチド投与を行なった。投与は１ｍｇ／ｍＬに調製したペプチド溶液５０μＬ／マウス（５０μｇ／マウス）を背部皮下に投与した。１群（Ｎ）４匹とし、初回投与後、２週間間隔で６回の追加投与を行なった。ペプチド投与１週間後にマウス尾部より採血を行い、血漿成分を採取した。血漿にはプロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加し、抗Ａβ抗体測定用試料とした。また、陰性対照群としてＰＢＳを５０μＬ／マウスで背部皮下に投与した。
【００５２】
血中抗Ａβ抗体量の測定は、Ａβ（１−４２）合成ペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ社製）をコーティングしたプレートを用い、ＥＬＩＳＡ法にて行った。具体的には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したＡβ（１−４２）合成ペプチドを蒸留水に希釈して、９６穴プレートに添加し（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）、４℃で１晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）コーティングした。１％ ブロックエース（雪印乳業株式会社製）でブロッキングし、測定用試料を１００μＬで添加し、４℃で１晩インキュベートした。反応終了後、プレートを洗浄し、２０００倍希釈したホースラディッシュ パーオキシダーゼ接合・抗マウスイムノグロブリン抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ Ｉｇ−ＨＲＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を添加し、２時間、４℃でインキュベートした。反応終了後、ＰＢＳで洗浄し、発色基質ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸、ＫＰＬ社製）を添加し、室温で３０分インキュベートした後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。抗Ａβ抗体の定量は抗Ａβモノクローナル抗体を使用し、標準曲線から抗Ａβ抗体を定量化した。
【００５３】
評価した８種類のペプチドは何れも抗Ａβ抗体の産生を誘導し、追加投与を行うことで抗体量が増加した（図１）。その中でもＧＫＫリンカーペプチドを有するＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）は最も高い抗Ａβ抗体産生誘導能を有しており、６回の追加投与後では従来のペプチドであるＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）の６倍以上の抗Ａβ抗体が産生されていることが明らかとなった（図１及び表１）。ＧＫＫリンカーペプチドを有する他のペプチドも高い抗Ａβ抗体産生誘導能を有していた（図１及び表１）。また、ＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列からなるリンカーペプチドを有するＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＶＫＫ−Ａβ（１−１５）も高い抗Ａβ抗体産生誘導能を有していた（図１及び表１）。ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＫＫ−Ａβ（１−１５）はＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）と同程度の抗Ａβ抗体産生誘導能であった（図１及び表１）。一方、Ｂ細胞エピトープについては明確な傾向を見出すことは出来なかった（図１）。
【００５４】
【表１】
【００５５】
以上の結果から、リンカーペプチドのアミノ酸配列をＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列とすることにより、ＫＫで表されるアミノ酸配列を使用するよりも、高い抗Ａβ抗体産生誘導能が得られることが明らかとなった。また、リンカーペプチドのアミノ酸配列がＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列であるＡβペプチドワクチンは、追加投与により抗体の産生を著しく増強した。特に、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）は高い抗Ａβ抗体産生誘導能を有しており、アルツハイマー病治療用ペプチドワクチンとして有用であると考えられた。
【００５６】
６回の追加投与終了後、１ヶ月間の休薬期間をおき、休薬による血中抗Ａβ抗体量の推移を観察した。ＧＫＫ、ＶＫＫ、及びＶＶＫＫの何れか１で表されるアミノ酸配列からなるリンカーペプチドを有するペプチドを投与した場合は、追加投与終了後、血中抗Ａβ抗体量が速やかに低下した。一方、従来のペプチドＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）を投与した場合は、血中抗Ａβ抗体量が低下せず、１ヶ月間維持されていた。
【実施例２】
【００５７】
各種Ａβペプチドワクチンを作製し、その抗Ａβ抗体産生誘導能をＪＵマウスを用いて評価した。ＪＵマウス（クオン（Ｑｕｏｎ Ｄ．）ら、「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｐｏｓｉｔｓ ｉｎ ｂｒａｉｎｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９１年、第３５２巻、ｐ．２３９−２４１。）は自家繁殖を行い使用した。
【００５８】
ペプチドは、特許文献２で開発したペプチドプロトタイプのＡβペプチドワクチンであるＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）（配列表における配列番号１２）のリンカー部位及びＢ細胞エピトープ部位を変換することにより設計し、外部委託（オペロンバイオテクノロジー株式会社）により合成した。ペプチドは全て、１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解した。
【００５９】
評価したペプチドは、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）（配列表における配列番号１２）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＫＫ−Ａβ（１−１５）（配列表における配列番号１３）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＶＫＫ−Ａβ（１−１５）（配列表における配列番号６）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）（配列表における配列番号７）、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１３）（配列表における配列番号８）の５種類である。
【００６０】
各種ペプチドのマウスへの投与は次のように行った。まず、８週齢のＪＵマウスに沈降ジフテリア破傷風混合トキソイド（北里研究所製）を５０μＬ／マウスで背部皮下に投与し、予備免疫を行い、免疫２週間後からペプチド投与を行なった。ペプチドは２００μｇ／ｍＬに調製し、等量のアジュバンド（フロインド インコンプリート アジュバント（ＦＩＡ）、和光純薬株式会社製）と混合してエマルジョンを作製し、ＪＵマウスの背部皮下に１００μｇ／マウス（１０μｇ／マウス）で投与した。１群（Ｎ）４匹とし、初回投与後、２週間間隔で２回の追加投与を行なった。２回目の追加投与１週間後にマウス尾部より採血を行い、血漿成分を採取した。血漿にはプロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加し、抗Ａβ抗体測定用試料とした。また、陰性対照群としてＰＢＳと等量のＦＩＡを混合してエマルジョンを作製し、１００μＬ／マウスで背部皮下に投与した。
【００６１】
血中抗Ａβ抗体量の測定は、実施例１に記載の抗Ａβ抗体量測定方法と同様の方法に従って行った。
【００６２】
評価した５種類のペプチドは何れも２回の追加投与により抗Ａβ抗体の産生を誘導した（表２）。その中でもＧＫＫリンカーペプチドを有するＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）は最も高い抗Ａβ抗体産生誘導能を有しており、従来のペプチドであるＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）と比較して８５倍の抗Ａβ抗体の産生を誘導した（表２）。また、同様にＧＫＫリンカーペプチドを有するＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１３）及びＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＶＫＫ−Ａβ（１−１５）も、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）と比較して１０倍以上高い抗Ａβ抗体産生誘導能を有していた（表２）。エマルジョンによる投与においてもペプチド溶液投与と同様の結果が確認できた。
【００６３】
【表２】
【００６４】
以上の結果から、アジュバンドを用いた投与においても、リンカーペプチドのアミノ酸配列をＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列とすることにより、ＫＫで表されるアミノ酸配列を使用するよりも、高い抗Ａβ抗体産生誘導能が得られることが明らかとなった。特に、ＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）は高い抗Ａβ抗体産生誘導能を有しており、アルツハイマー病治療用ペプチドワクチンとして有用であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
以上説明したとおり、本発明は、生体において免疫記憶が成立しているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（Ｔ）、抗原の特定の１又は２以上のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（Ｂ）、及び前記Ｔと前記Ｂの間にそれらを連結させるように配置されたリンカーペプチドのアミノ酸配列を含み、該リンカーペプチドのアミノ酸配列がＧＫＫ又はＶＶＫＫであることを特徴とするペプチド、及び該ペプチドを有効成分として含有する組成物を提供する。例えば、本発明はこのような構造を有する抗Ａβ抗体産生誘導能を有するペプチド及び該ペプチドを有効成分として含有する組成物を提供する。本発明に係るペプチドは、広範なヒトのＨＬＡ−ＤＲのハプロタイプに拘束されるため、多くのヒト、とりわけ、予防接種などにより免疫記憶の成立したヒトにおいて、病原菌やウイルスなど異物の異物に起因する各種疾患の予防・治療に有効なペプチドワクチンとして使用することができる。或いはアルツハイマー病をはじめとする神経変性疾患などの各種疾患の予防・治療に有効な、Ａβに対する抗体産生を誘導するペプチドワクチンとして使用することができる。また、本発明に係るペプチドワクチンは、免疫アジュバントを用いなくても、抗体産生誘導能を示し、また、経鼻投与や経口投与などの経粘膜投与で使用できること、さらに、投与終了後に抗体の血中濃度が速やかに低下することから、簡易かつ安全なペプチドワクチンである。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号１：アミロイドβペプチド１−４２。
配列番号２：アミロイドβペプチド１−４０。
配列番号３：合成ペプチド。
配列番号４：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基１−１５からなるペプチド。
配列番号５：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基１−１３からなるペプチド。
配列番号６：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＶＫＫ−Ａβ（１−１５）と称する。
配列番号７：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１５）と称する。
配列番号８：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１３）と称する。
配列番号９：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−１０）と称する。
配列番号１０：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−８）と称する。
配列番号１１：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＧＫＫ−Ａβ（１−６）と称する。
配列番号１２：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（２０）−ＫＫ−Ａβ（１−１３）と称する。
配列番号１３：合成ペプチドであり、ここでＲＧＤ−ＤｉＴｏｘ（１９）−ＶＫＫ−Ａβ（１−１５）と称する。
配列番号１４：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基１−１１からなるペプチド。
配列番号１５：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基３−１１からなるペプチド。
配列番号１６：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基３−１５からなるペプチド。
配列番号１７：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基１−１０からなるペプチド。
配列番号１８：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基１−８からなるペプチド。
配列番号１９：アミロイドβペプチドのアミノ酸残基１−６からなるペプチド。
配列番号２０：ジフテリアトキソイドの部分ペプチド。
配列番号２１：ジフテリアトキソイドの部分ペプチド。
配列番号２２：ジフテリアトキソイドの部分ペプチド。
配列番号２３：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号２４：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号２５：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号２６：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号２７：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号２８：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号２９：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号３０：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号３１：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号３２：破傷風トキソイドの部分ペプチド。
配列番号３３：ヒト型／ウシ型結核菌の分泌タンパク質ＭＰＴ６４の部分ペプチド。
配列番号３４：ヒト型／ウシ型結核菌の分泌タンパク質ＭＰＴ６４の部分ペプチド。
配列番号３５：ヒト型／ウシ型結核菌の分泌タンパク質ＭＰＴ６４の部分ペプチド。
配列番号３６：ヒト型／ウシ型結核菌の分泌タンパク質ＭＰＴ６４の部分ペプチド。
配列番号３７：細胞接着モチーフを含むペプチド。
配列番号３８：細胞接着モチーフを含むペプチド。
配列番号３９：細胞接着モチーフを含むペプチド。
配列番号４０：細胞接着モチーフを含むペプチド。
配列番号４１：細胞接着モチーフを含むペプチド。
配列番号４２：細胞接着モチーフを含むペプチド。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式で示されるアミノ酸配列を有するペプチド、ここでＴは免疫記憶の成立しているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を示し、Ｌはリンカーペプチドのアミノ酸配列を示し、Ｂは抗原の特定の１又は２以上のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが、細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を示すペプチドであって、該リンカーペプチドのアミノ酸配列がＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列であることを特徴とするペプチド。
（化１）
Ｒ１−Ｔ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ３−Ｂ−Ｒ４
【請求項２】
Ｔ細胞エピトープが、ジフテリア、結核、破傷風、及び百日咳の予防接種に抗原として用いられるペプチドから選ばれる何れか１種又は２種以上のペプチドに由来するアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｂ細胞エピトープが、アミロイドβペプチドのＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
アミロイドβペプチドのＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列が、アミロイドβのＮ末端から第１番目のアミノ酸から第１５番目のアミノ酸配列（配列表における配列番号４）又はアミロイドβのＮ末端から第１番目のアミノ酸から第１３番目のアミノ酸配列（配列表における配列番号５）である請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
配列表における配列番号６から１１の何れか１に記載のアミノ酸配列からなる請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載のペプチドと共に、製剤学的に許容される１種以上の製剤用添加剤を含有する組成物。
【請求項７】
請求項３から５の何れか１項に記載のペプチドと共に、製剤学的に許容される１種以上の製剤用添加剤を含有する、アミロイドβペプチドに対する抗体の産生を誘導することができる組成物。
【請求項８】
アルツハイマー病の予防及び／又は治療用である請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１から５の何れか１項に記載のペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１】
下記一般式で示されるアミノ酸配列を有するペプチド、ここでＴは免疫記憶の成立しているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を示し、Ｌはリンカーペプチドのアミノ酸配列を示し、Ｂは抗原の特定の１又は２以上のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが、細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を示すペプチドであって、該リンカーペプチドのアミノ酸配列がＧＫＫ又はＶＶＫＫで表されるアミノ酸配列であることを特徴とするペプチド。
（化１）
Ｒ１−Ｔ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ３−Ｂ−Ｒ４
【請求項２】
Ｔ細胞エピトープが、ジフテリア、結核、破傷風、及び百日咳の予防接種に抗原として用いられるペプチドから選ばれる何れか１種又は２種以上のペプチドに由来するアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｂ細胞エピトープが、アミロイドβペプチドのＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
アミロイドβペプチドのＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列が、アミロイドβのＮ末端から第１番目のアミノ酸から第１５番目のアミノ酸配列（配列表における配列番号４）又はアミロイドβのＮ末端から第１番目のアミノ酸から第１３番目のアミノ酸配列（配列表における配列番号５）である請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
配列表における配列番号６から１１の何れか１に記載のアミノ酸配列からなる請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載のペプチドと共に、製剤学的に許容される１種以上の製剤用添加剤を含有する組成物。
【請求項７】
請求項３から５の何れか１項に記載のペプチドと共に、製剤学的に許容される１種以上の製剤用添加剤を含有する、アミロイドβペプチドに対する抗体の産生を誘導することができる組成物。
【請求項８】
アルツハイマー病の予防及び／又は治療用である請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１から５の何れか１項に記載のペプチドをコードするＤＮＡ。
【図１】
【公開番号】特開２０１３−９０５７４（Ｐ２０１３−９０５７４Ａ）
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０９５３（Ｐ２０１０−１０９５３）
【出願日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（３０７０１０１６６）第一三共株式会社 (196)
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（３０７０１０１６６）第一三共株式会社 (196)
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
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