説明

ペプチド混合物及びペプチドの製造方法

【課題】アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害作用を有するペプチド混合物及びペプチドの新規な製造方法の提供。
【解決手段】水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去する工程を有する下記式(1)〜(9)で表されるL−アミノ酸配列からなるいずれか1種以上のペプチドを含有するペプチド混合物の製造方法。不溶分除去工程後に、ペプチド類を分画する工程を有する下記式(1)〜(9)で表されるL−アミノ酸配列からなるいずれか1種のペプチドの製造方法。
[化1]
Ile−Ala−Pro(1)
Ile−Arg−Pro(2)
Leu−Arg−Pro(3)
Leu−Ala−Pro(4)
Val−Arg−Pro(5)
Ile−Tyr (6)
Leu−Ala−Tyr(7)
Val−Ile−Tyr(8)
Leu−Arg−Tyr(9)

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチド混合物及びペプチドの新規な製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
アンジオテンシンは、腎静脈中に分泌されるレニンが血漿中のαグロブリン分画に含まれるレニン基質に作用してつくられるポリペプチドであり、まずアンジオテンシンIがつくられるが、これは生物学的活性を有しない。アンジオテンシンIは、循環血液中で主に肺循環の間にアンジオテンシン変換酵素(以下ACEと略記する)の作用により2個のアミノ酸を失いアンジオテンシンIIに変換される。
レニンとアンジオテンシンは体内の重要な昇圧系を構成し、レニン−アンジオテンシン系と呼ばれるが、そのおもな作用物質はアンジオテンシンIIである。臨床的に最も重要なアンジオテンシンIIの作用は血圧上昇作用であり、血管平滑筋を収縮して血圧を上昇させる体内の最も強力な昇圧物質である。その血管収縮作用は細動脈で強いが静脈系で弱く、また、腎・内臓血管領域で強いが四肢、脳、心、肺では弱い特徴を有する。アンジオテンシンIIは、生体のナトリウム平衡と血圧維持に重要な役割を果たしており、ナトリウム消失、血圧下降時には、レニン、アンジオテンシンIIが上昇し、直接的にはアルドステロン分泌を介して、ナトリウム貯留と血圧上昇にはたらく。また、高血圧疾患では、高血圧の成因ないし維持機構に重要な役割を果たしている(非特許文献1)。
【0003】
以上のように、ACE阻害剤は、アンジオテンシンIからアンジオテンシンIIを生成する変換酵素の作用を阻害することにより、アンジオテンシンIIの生成を特異的に抑制し、アンジオテンシンIIの血漿濃度を低下させ、降圧作用を示す。
これまで、ACE阻害物質としては、天然物又は天然物由来の物質として蛇毒由来のブラデイキニン増強因子(非特許文献2)、ゼラチンのコラゲナーゼ消化物由来の6種類のペプチド(非特許文献3)、牛カゼインのトリプシン消化物由来のペプチド(非特許文献4)、イワシ筋肉由来の5種のヘクサペプチド(特許文献1)、海苔由来のテトラペプチド(特許文献2)、並びにペンタペプチド(特許文献3)、朝鮮人参由来のペンタペプチド(特許文献4)、クロレラ由来のペンタペプチド(特許文献5)が挙げられ、いずれもACE阻害剤となり得ることが開示されている。
更に、合成法により得た鎖長の短いジ、トリペプチド(特許文献6、特許文献7)についての提案は行われているが、発見されてから長時間経過しているものの、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない。
【0004】
近年、健康意識の向上から、当該ACE阻害作用を有するペプチドを含有する健康食品も開発されてきている。例えば、わかめから抽出されるペプチドとして、Phe−Tyr、もしくはVal−Tyr、又はIle−Tyr等を含むゼリー食品、Val−Pro、又はIle−Pro−Proを含む乳酸飲料等が開発され、販売されている。
しかしながら、微細藻類を原料として用い、効率よくACE阻害作用を有する1種以上のペプチドを得る方法はこれまでに開示されていない。
【0005】
次に、微細藻類のタンパク質分解酵素による処理方法に関しては、特許文献8に、栄養成分が豊富で、微細藻類特有の味、臭いが少なく、かつ、食品に添加しても沈殿物や不溶物が析出しない微細藻類水抽出液の製造方法に関する記載がある。
しかしながら、これらの従来技術においては、ACE阻害作用を有するペプチドを得る方法については、記載も示唆もされてもいなかった。
【非特許文献1】医科学大辞典、94ページ、1982年、講談社
【非特許文献2】S.H.Ferreia et al:Biochemistry,9,3583(1970)
【非特許文献3】G.Oshima et al:Biochim.Biophs.Acta,566,128(1979)
【非特許文献4】S.Maruyama et al.:Agric.Biol.Chem.,46,1393(1983)
【特許文献1】特許第2046483号公報
【特許文献2】特許第2678180号公報
【特許文献3】特開平10−36391号公報
【特許文献4】特許第2920829号公報
【特許文献5】特許第2990354号公報
【特許文献6】特許第948071号公報
【特許文献7】特開平6−16568号公報
【特許文献8】特開2004−204034号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の課題は、ACE阻害作用を有するペプチド混合物及びペプチドの新規な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討を行った結果、以下の知見を得た。すなわち、
(1)微細藻類をタンパク質分解酵素で処理することにより、ペプチド類が得られること
(2)ペプチド類からの単離同定の結果、下記式(1)〜(9)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチドの1種以上が得られること
(3)当該ペプチドは、優れたACE阻害作用を有すること
を見出し、本発明を完成するに至った。
【0008】
[化1]
Ile−Ala−Pro (1)
Ile−Arg−Pro (2)
Leu−Arg−Pro (3)
Leu−Ala−Pro (4)
Val−Arg−Pro (5)
Ile−Tyr (6)
Leu−Ala−Tyr (7)
Val−Ile−Tyr (8)
Leu−Arg−Tyr (9)
【0009】
すなわち、本発明は、水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去する工程を有することを特徴とする下記式(1)〜(9)で表されるL−アミノ酸配列からなるいずれか1種以上のペプチドを含有するペプチド混合物の製造方法を提供するものである。
【0010】
[化2]
Ile−Ala−Pro (1)
Ile−Arg−Pro (2)
Leu−Arg−Pro (3)
Leu−Ala−Pro (4)
Val−Arg−Pro (5)
Ile−Tyr (6)
Leu−Ala−Tyr (7)
Val−Ile−Tyr (8)
Leu−Arg−Tyr (9)
【0011】
また、本発明は、水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を分画する工程を有することを特徴とする下記式(1)〜(9)で表されるL−アミノ酸配列からなるいずれか1種のペプチドの製造方法を提供するものである。
以下に、その分画の条件の一例を記載する。
溶離媒体:水/アセトニトリル=97/3(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(A液)、水/アセトニトリル=20/80(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(B液)、
(i)カラム:Develosil ODS−5(10mm×250mm)
流速:4.0mL/min
溶離条件:B液の濃度を毎分0.052体積%上昇させ、B液の濃度が下記の時の溶出画分を採取する。
下記式(1)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 3.4〜5.8体積%
下記式(2)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 3.5〜5.9体積%
下記式(3)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 3.6〜6.0体積%
下記式(4)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 3.6〜6.0体積%
下記式(6)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 3.7〜6.1体積%
(ii)カラム:Develosil ODS−5(10mm×250mm)
流速:4.0mL/min
溶離条件:B液の濃度を毎分0.383%上昇させ、B液の濃度が下記の時の溶出画分を採取する。
下記式(5)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 2.7〜4.5体積%
(iii)カラム:Develosil ODS−5(4.6mm×250mm)
流速:0.8mL/min
溶離条件:B液の濃度を毎分0.231%上昇させ、B液の濃度が下記の時の溶出画分を採取する。
下記式(7)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 8.2〜13.8体積%
下記式(8)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 8.6〜14.4体積%
下記式(9)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 7.3〜12.3体積%
【0012】
[化3]
Ile−Ala−Pro (1)
Ile−Arg−Pro (2)
Leu−Arg−Pro (3)
Leu−Ala−Pro (4)
Val−Arg−Pro (5)
Ile−Tyr (6)
Leu−Ala−Tyr (7)
Val−Ile−Tyr (8)
Leu−Arg−Tyr (9)
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、ACE阻害作用を有するペプチドを効率よく低コストで製造することができ、血圧低下剤、健康食品、食品等の製造に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0014】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられる微細藻類は、水中に生育する微細な藻類であって、光合成をする植物のうち、大きさ数ミクロン〜数百ミクロンの植物プランクトンであり、例えば、スピルリナ(Spirulina)属、クロレラ(Chlorella)属、アファニゾメノン(Aphanizomenon)属、フィッシェレラ(Fisherella)属、アナベナ(Anabaena)属、ネンジュモ(Nostoc)属、スイゼンジノリ(Aphanothece)属、ヘマトコッカス(Haematococcus)属、ドナリエラ(Dunaliella)属、セネデスムス(Scenedesmus)属等が挙げられるが、工業的規模で生産され、その安全性が確認されているスピルリナ属、クロレラ属、ヘマトコッカス属、ドナリエラ属、セネデスムス属に属するものが好ましく、なかでもスピルリナ属に属するものがより好ましい。
【0015】
スピルリナ(Spirulina)とは、藍藻類(Cyanobacteria)に包含され、従来一括してスピルリナ属と呼称されていたアルスロスピラ属(Arthrospira)及びスピルリナ属(Spirulina)に属する微細な単細胞微生物であり、例えばアルスロスピラ・プラテンシス(Arthrospira platensis)、アルスロスピラ・マキシマ(Arthrospira maxima)、アルスロスピラ・ゲイトレリ(Arthrospira geitleri)、アルスロスピラ・サイアミーゼ(Arthrospira siamese)、スピルリナ・メイヤー(Spirulina major)、スピルリナ・サブサルサ(Spirulina subsalsa)、等が挙げられるが、中でも、人工的に培養でき、入手が容易なことから、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・ゲイトレリ、アルスロスピラ・サイアミーゼが好ましい。
【0016】
クロレラは、クロレラ属の微細藻類であり、入手が容易で、安全性に優れている点で、例えば、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ ・レギュラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・ピレノイドーサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsidea)等が好ましい。
ヘマトコッカスは、緑藻綱ボルボックス目クラミドモナス科ヘマトコッカス属に属する藻類であり、食品や飼料として付加価値の高いカロチノイド色素であるアスタキサンチン生産藻類として有用である。
ドナリエラは、イスラエルの死海で発見された微細藻類であり、抗酸化作用を有するカロチノイドを豊富に含んだ微細藻類で、特にβ‐カロチンの生産藻類として有用である。
セネデスムスは、セネデスムス属に属する緑藻であり、和名「イカダモ」と呼ばれ、例えば、セネデスムス・アクタス(S.acutus)、セネデスムス・バシレンシス(Scenedesmus basilensis)、セネデスムス・ビジュガ(Scenedesmus bijuga)、セネデスムス・クロレロイド(Scenedesmus chlorelloides)、セネデスムス・コスタラタス(Scenedesmus costulatus)、セネデスムス・ナヌス(Scenedesmus nanus)、セネデスムス・オブリカス(Scenedesmus obliquus)等の藻類が知られている。
【0017】
本発明で用いられる微細藻類としては、生の微細藻類、乾燥処理を施した微細藻類、微細藻類の由来成分等が挙げられる。生の微細藻類は、例えば、水中で培養された微細藻類を遠心分離、濾過等の方法により収穫して得られる。生の微細藻類は、培養池から収穫後そのままの状態で使用することもできるが、水もしくは生理食塩水で洗浄するのが好ましい。乾燥処理を施した微細藻類は、例えば、前記方法で得られた生の微細藻類を凍結乾燥処理やスプレー乾燥処理したもの等が挙げられる。微細藻類由来成分としては、超音波照射やホモゲナイズ等の機械的処理を微細藻類に施して得られたものや、酵素処理等の化学的な処理を微細藻類に施して得られたもの等が挙げられる。
【0018】
さらに、本発明では、残渣微細藻類を、ペプチドの製造原料として用いることができる。ここでいう残渣微細藻類とは、抽出媒体にて微細藻類に含まれる、前記式(1)〜(9)で表されるペプチド、該ペプチドが由来するポリペプチド、タンパク質以外の有用な成分を抽出した後に得られる微細藻類をいう。
抽出は水、熱水、有機溶媒、又は超臨界抽出ガス等によって行うことができ、これらを単独で、或いは組み合わせて用いることができる。用いられる有機溶媒は、例えば、エタノール等のアルコール系溶媒、ヘキサン等の炭化水素系溶媒、アセトン等のケトン系溶媒を挙げることができる。
実施の一例を挙げるとすれば、例えば、室温時含水エタノール、エタノール、アセトンもしくはこれらを2種以上混合したもので抽出することが可能である。
また、超臨界抽出に用いられる炭酸ガス等によっても抽出操作を行うことが可能である。
抽出する温度は、目的とする有用物が最も効果的に抽出し得る温度であればよいが、一般的には室温から媒体の沸点程度の温度を挙げることができる。
これらの抽出操作を行って得られる残渣微細藻類を原料に用いて抽出を行った際にも、得られるペプチド類のACE阻害作用は低減されることなく、該ACE阻害剤の有効成分が前記式(1)〜(9)で表される1種以上のペプチドである場合にも、これらペプチドのいずれもACE阻害作用は低減されることがない。このように、製造原料として残渣スピルリナを好適に用いることができ、原料藻類の有効活用に寄与することから工業上好ましい。
例えば、微細藻類がスピルリナの場合、含有されるフィコシアニンは、青色色素として有用であるが、従来フィコシアニンを水により抽出を行った後の残渣は廃棄されていた。しかし、本発明によれば、フィコシアニンを抽出した後の残渣スピルリナを原料として酵素処理を行っても、得られた前記式(1)〜(9)で表されるペプチドのACE阻害作用は低下せず、好適に用いることができる。また同様に、スピルリナエキス抽出残渣も原料として用いることができる。
例えば、微細藻類がクロレラの場合、含有されるクロロフィルは、緑色色素、或いは健康食品として有用であるが、クロロフィルを水により抽出した後の残渣クロレラを用いても、ACE阻害作用を有する前記式(1)〜(9)で表されるペプチドを得ることができる。
例えば、微細藻類がヘマトコッカスの場合、含有されるアスタキサンチンを有機溶媒にて抽出した後の残渣ヘマトコッカスを用いても、ACE阻害作用を有する前記式(1)〜(9)で表されるペプチドを得ることができる。有機溶媒としては、例えば、室温時含水エタノール、エタノール、アセトンもしくはこれらを2種以上混合したもので抽出することが可能である。
例えば、微細藻類がドナリエラの場合、含有されるβ-カロチンを有機溶媒にて抽出した後の残渣ドナリエラを用いても、ACE阻害作用を有する前記式(1)〜(9)で表されるペプチドを得ることができる。有機溶媒としては、例えば、室温時含水エタノール、エタノール、アセトンもしくはこれらを2種以上混合したもので抽出することが可能である。
【0019】
本発明で用いるタンパク質分解酵素としては、pH2.0〜9.0においてタンパク質の加水分解を行う酵素であれば特に制限なく用いることができ、精製されていてもされていなくてもよい。タンパク質分解酵素としては、例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ等の動物消化器系由来のタンパク質分解酵素(消化酵素)、コウジカビ(Aspergillus)属由来のタンパク質分解酵素、バチルス(Bacillus)属由来のタンパク質分解酵素、クモノスカビ(Rhizopus)属由来のタンパク質分解酵素、アオカビ(Penicillium)属由来のタンパク質分解酵素、ケカビ(Mucor)属由来のタンパク質分解酵素等の微生物由来のタンパク質分解酵素、パパイン、ブロメレイン、フィシン等の植物由来のタンパク質分解酵素等が挙げられる。タンパク質分解酵素としては微生物由来のタンパク質分解酵素、動物性由来のタンパク質分解酵素が好ましく、コウジカビ属由来のタンパク質分解酵素、バチルス属由来のタンパク質分解酵素、ペプシンがより好ましい。
【0020】
また、本発明にいうペプチド類とは、微細藻類をタンパク質分解酵素で処理することにより得られる、ペプチド、アミノ酸、及びタンパク質を含有するタンパク質分解酵素処理物をいうが、微細藻類に酵素処理前から含まれるペプチドを含んでもよい。
当該ペプチド類は、溶液状であっても、懸濁液状であっても、媒体を留去させた乾燥物状であってもよい。
本発明において、微細藻類のタンパク質分解酵素による処理は、例えば、
(1)微細藻類の水懸濁液に粉末状または液体状のタンパク質分解酵素を加える
(2)乾燥させた微細藻類と粉末状のタンパク質分解酵素に水を加える
(3)乾燥させた微細藻類に水とタンパク質分解酵素を加える
等の方法により行うことができる。
【0021】
処理工程における微細藻類の濃度としては、タンパク質分解酵素の作用効率が良く、後工程の処理も容易な濃度が好ましく、微細藻類固形分濃度で1〜30質量%が好ましく、5〜20質量%がより好ましい。
タンパク質分解酵素の使用量としては、微細藻類固形分1gに対して1〜100000ユニット(U)が好ましく、10〜50000Uがより好ましい。ここで1ユニットは、株式会社学会出版センター発行の「生物化学実験法31 蛋白質分解酵素II 鶴大典・船津勝編 1993年」の146〜147頁に記載された方法で測定した。具体的には、1Uは、基質として熱変性カゼインを用い、タンパク質分解酵素を添加した濃度1質量%の基質水溶液を1ml調製し、この基質水溶液の280nmにおける吸光度を測定したとき、1分間に吸光度を0.001上昇させる酵素量である。
【0022】
当該処理のpHは、2.0〜9.0に調整することが好ましい。pHが9.0をこえると得られる水抽出液に微細藻類特有の味、臭いが残り、例えば、得られたペプチドを食品等に配合して用いた場合に、食品の香味が悪化するばかりでなく、清涼飲料水等の酸性領域の食品中で沈殿物や浮遊物等の水不溶性成分が生じ易い為に好ましくない。pHを調整するには、通常の食品の製造で用いる化合物、例えば、水酸化ナトリウムや塩酸等を用いればよい。
処理は、静置して行っても攪拌して行ってもよいが、攪拌するのが好ましい。処理温度は、タンパク質分解酵素の作用効率が良好なことから30〜75℃が好ましく、35〜60℃がより好ましい。
処理時間は、1〜36時間が好ましく、2〜24時間がより好ましい。
【0023】
水可溶性ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、後述する不溶物の除去工程を行うが、その前に必要に応じてタンパク質分解酵素を失活させてもよい。失活させるには、例えば、70〜95℃の環境下に5〜20分間静置すればよい。
水可溶性ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶物を除去する。不溶物を除去する方法としては、固液分離できる手段であれば制限は無く、例えば、ろ紙やろ布等のろ材を用いたろ過方法や、上澄を回収するデカンテーション法、フィルタープレス法、遠心分離法等が挙げられる。なかでも、工業的に大量処理の可能な遠心分離法、フィルタープレス法等の上澄を回収する方法が好ましく、特に遠心分離法が好ましい。
遠心分離は、処理液から不溶分を除去できる条件であればよいが、重力加速度が1,000〜30,000Gで10秒〜2時間の条件が好ましく、重力加速度が3,000〜15,000Gで1〜30分間の条件がより好ましい。遠心分離機としては、ディスラッジ型遠心分離機、アルファ型遠心分離機、シャープレス型遠心分離機があるが、作業性が向上することから、ディスラッジ型遠心分離機とアルファ型遠心分離機の組み合わせによる連続遠心分離が好ましい。
【0024】
前記式(1)〜(9)で表されるいずれか1種以上のペプチドを含有するペプチド混合物は、上記の不溶物除去工程の後、公知の方法で分画を行って得ても良い。
例えば、イオンクロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー法や、膜分離処理などのペプチドの分離手段として通常使用されている方法を、単独で或いは任意の順序で組み合わせて行う。
また、上記の不溶物除去工程の後に得られたペプチド混合物を、通常の高速液体クロマトグラフィーによって分画することにより、前記式(1)〜(9)で表されるいずれか1種のペプチドを製造することができる。
使用されるカラム担体は逆相カラムクロマトグラフィーで使用可能なオクタデシル基結合シリカゲルが好ましい。このようなオクタデシル基結合シリカゲルとしては、市販のものを用いることができ、例えば、Develosil(商標名)ODS、Inertsil(商標名)ODS等のカラム担体を挙げることができる。
分画条件の一例を挙げると、例えば、B液の濃度が以下の時の溶出画分をそれぞれ採取することで、前記式(1)〜(9)で表されるいずれか1種のペプチドを得ることができる。
(分画条件)
溶離媒体:水/アセトニトリル=97/3(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(A液)、水/アセトニトリル=20/80(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(B液)、
(i)カラム:Develosil ODS−5(10mm×250mm)
流速:4.0mL/min
溶離条件:B液の濃度を毎分0.052体積%上昇させ、B液の濃度が下記の時の溶出画分を採取する。
下記式(1)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 3.4〜5.8体積%、好ましくは4.6体積%
下記式(2)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 3.5〜5.9体積%、好ましくは4.7体積%
下記式(3)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 3.6〜6.0体積%、好ましくは4.8体積%
下記式(4)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 3.6〜6.0体積%、好ましくは4.8体積%
下記式(6)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 3.7〜6.1体積%、好ましくは4.9体積%
(ii)カラム:Develosil ODS−5(10mm×250mm)
流速:4.0mL/min
溶離条件:B液の濃度を毎分0.383体積%上昇させ、B液の濃度が下記の時の溶出画分を採取する。
下記式(5)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 2.7〜4.5体積%、好ましくは3.6体積%
(iii)カラム:Develosil ODS−5(4.6mm×250mm)
流速:0.8mL/min
溶離条件:B液の濃度を毎分0.231体積%上昇させ、B液の濃度が下記の時の溶出画分を採取する。
下記式(7)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 8.2〜13.8体積%、好ましくは11.0体積%
下記式(8)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 8.6〜14.4体積%、好ましくは11.5体積%
下記式(9)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチド;B液濃度 7.3〜12.3体積%、好ましくは9.8体積%
このようにすることで、より純度の高いペプチドを得ることができる。
【0025】
[化4]
Ile−Ala−Pro (1)
Ile−Arg−Pro (2)
Leu−Arg−Pro (3)
Leu−Ala−Pro (4)
Val−Arg−Pro (5)
Ile−Tyr (6)
Leu−Ala−Tyr (7)
Val−Ile−Tyr (8)
Leu−Arg−Tyr (9)
【0026】
上記で得られたACE阻害作用を有するペプチド混合物又はペプチドは、必要に応じて濃縮等の後処理を行い、そのまま飲料等に使用することもできるが、濾過等によって精製してもよい。また、必要であれば、更に殺菌後、乾燥して食品に供してもよい。更に粉末化することもできる。乾燥方法としては、凍結乾燥法、噴霧乾燥法等があるが、経済的なことから噴霧乾燥法が好ましい。また乾燥する時に、微細藻類抽出液にデキストリン等を加えて乾燥して、粉末物性を整えることも可能である。
【0027】
得られたペプチドのアミノ酸配列の分析は、通常公知のエドマン(Edman)法により行うことができる。本法の概要を説明すると、まず、ペプチドに、N末端の遊離のアミノ基としか共有結合しない化学試薬を加え、次に、弱い酸を加えて、この試薬を活性化し、N末端のペプチド結合だけを切断し、切断されたアミノ酸をクロマトグラフィーで同定する。続いて、アミノ酸1つ分だけ短くなったペプチドに対して同じ操作を順次繰り返し、ペプチド中のアミノ酸配列を決定する。本発明においても、当該法により、得られたペプチドのアミノ酸配列の決定を行った。
【0028】
得られたペプチドのACE阻害作用測定には、通常公知の、例えば、CushmanとCheungらの開発した方法が簡便であり、広く用いられている。測定は、ACEを作用させる基質として、例えば、Hip−His−Leu(Hipは馬尿酸残基)を用い、ACE処理を行った後の遊離した馬尿酸を測定し、酵素阻害作用を評価する。例えば、試験管中に試料溶液、基質を入れ、恒温槽中に保持し、ACE溶液を添加、攪拌し、反応させる。塩酸を添加し、反応を停止させた後、酢酸エチルを添加し遊離した馬尿酸を回収する。酢酸エチルを留去後、水を加え、馬尿酸を溶解した後、分光光度計により、吸光度を測定する。
ACE阻害活性は以下の式に従って計算する。阻害率(%)={(E−E)/(E−E)}×100。ここで、Eは試料溶液を添加したときの吸光度、Eは試料溶液の代わりに蒸留水を加えたときの吸光度、Eは、予め1N塩酸を加えて反応させたときの吸光度を示す。阻害率50%を示すときの反応液中の試料濃度をIC50値とする。
【0029】
本発明の製造方法により得られる、前記式(1)〜(9)で表されるペプチドはいずれも、ACE阻害作用を有するため、これらを有効成分として含有するACE阻害剤は、血圧降下作用、ブラデイキニン不活化抑制作用を示す。従って、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症の予防、治療剤、これらうっ血性心不全に対する臓器循環の正常化と長期予後の改善(延命効果)作用を有し、心不全の治療剤として有用である。
また、前記式(1)〜(9)で表されるペプチドは、L−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解される為、毒性は極めて低く、安全性は極めて高い(LD50>2000mg/kg;ラット経口投与)。
【0030】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下において、単位「M」は「mol/L」を示す。
【実施例1】
【0031】
(ペプチドの製造)
スピルリナ粉末1gに蒸留水10mLを加え、スピルリナ懸濁液を得た。この懸濁液を1M水酸化カリウムにてpH6.5〜7.4に調整し、95℃、30分間煮沸した。放冷後、プロテアーゼN(天野エンザイム社製、製品名「アマノ」G)0.01gを添加し、55℃、18時間撹拌しながら加水分解を行った。分解反応液を95℃、30分間煮沸放冷後、遠心分離(10,000G、1時間)にて沈殿を除去し、上清を凍結乾燥してペプチド混合物(1)を0.50g得た。
続いて、得られたペプチド混合物(1)400mgを2mLの0.1体積%トリフルオロ酢酸(以下、TFAと略記する)水溶液に溶解した後、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を行った。カラムとしては野村化学社製 商標名:Develosil ODS−5(10mmID×250mm)を使用し、移動相としては(A液);0.1体積%TFA水溶液/アセトニトリル=97/3(v/v)、(B液);0.1体積%TFA水溶液/アセトニトリル=20/80(v/v)を用い、A液中のB液濃度を0〜6体積%まで濃度勾配をかけながら、流速4.0mL/min、検出波長215nmでクロマトグラフィーを行った。その結果、溶出時間;32.1分、B液濃度4.6体積%にACE阻害活性の高いペプチドフラグメントのピークを得た。このHPLC分析の結果は図1に示す。
このようにして得たペプチドフラグメントのアミノ酸分析を行ったところ、Pro;1.00、Ala;0.84、及びIle;0.88であった。
当該ペプチドフラグメントのアミノ酸配列は、ヒューレットパッカード社製のプロテインシークエンサーGI000AおよびPTHアナライザーI090型を用いて決定した。その結果、得られたペプチドは、前記式(1)で表されるL体のアミノ酸配列からなるペプチドであることが確認された。
なお、当該ペプチドの常温における性状は白色の粉末であった。
同様にして、ペプチド(1)〜(6)について分画、及び確認を行った。その結果を図1に示す。横軸はHPLCによる溶出時間、縦軸は215nmにおけるピーク値を示す。
【0032】
[試験例1]
(合成ペプチドとの比較)
島津製作所社製の多種品目同時固相法自動ペプチド合成装置PSSM−8型を用いて、9−フルオレニルメトキシカルボニル(以下、F−mocと略記する)法によって、常法どおり、そのC末端側のProから前記式(1)で表されるペプチドを合成した。
得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、ジーエルサイエンス社製 商標名:Inertsil PREP ODS(4.5mmID×250mm)を用いたHPLCにより精製した。移動相として(A)0.1体積%TFA含有蒸留水、(B)0.1体積%TFA含有アセトニトリル溶液を使用し、(B)液が30分間で5→65体積%の濃度勾配法により流速1.5ml/minでクロマトグラフィーを行った。紫外部波長220nmで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とするペプチドを得た。
本試験例により得られた合成ペプチドは、実施例1により単離されたペプチドと同一のHPLC条件にて分析を行った結果、同一の保持時間を有した。
【実施例2】
【0033】
(ペプチドの分離・同定、合成ペプチドとの比較)
図1において、実施例1と同様の方法で、ACE阻害活性の高いピークのペプチドフラグメントを順に単離後、ヒューレットパッカード社製のプロテインシークエンサーGI000AおよびPTHアナライザーI090型を用いてアミノ酸配列を決定した。その結果、得られたペプチドはそれぞれ、前記式(2)〜(6)で表されるL体のアミノ酸配列からなるペプチドであることが判明した。各々のペプチドを試験例1に記載した方法と同様にして合成し、単離したペプチドと同一のHPLC条件で同一の保持時間であることを確認した。
【実施例3】
【0034】
プロテアーゼNの代わりに、ペプシン(メルク社製、酵素番号EC3.4.23.1)を用いたこと以外は実施例1と同様にしてペプチドの製造を行い、ペプチド(7)〜(9)を得た。
図2は、ペプチド(7)〜(9)に関し、横軸はHPLCによる溶出時間、縦軸は215nmにおけるピーク値を示す。
(HPLC条件)
ジーエルサイエンス社製 商標名:Inertsil PREP ODS(4.5mmID×250mm)を用いたHPLCにより精製した。移動相として(A)0.1体積%TFA含有蒸留水、(B)0.1体積%TFA含有アセトニトリル溶液を使用し、(B)液が30分間で5→65体積%の濃度勾配法により流速1.5ml/minでクロマトグラフィーを行った。
各々のペプチドを試験例1に記載した方法と同様にして合成し、単離したペプチドと同一のHPLC条件で同一の保持時間であることを確認した。
【実施例4】
【0035】
(青色色素抽出残渣の処理)
スピルリナ粉末10gに1%塩化カルシウム2水和物溶液300mLを加え、25℃、16時間静置、スピルリナ青色素を抽出した。得られた抽出液にリン酸水素2ナトリウム12水和物5gを添加、よく撹拌し、遠心分離(10,000G、1時間)を行った。その結果、スピルリナ青色色素抽出残渣11.7g(無機塩を含む)を得た。こうして得られた残渣1gに蒸留水10mLを加え、スピルリナ懸濁液を得た。この懸濁液を1M水酸化カリウムにてpH6.5〜7.4に調整し、95℃、30分間煮沸した。放冷後、プロテアーゼN(天野エンザイム社製、製品名「アマノ」G)0.01gを添加し、55℃、3時間撹拌しながら加水分解を行った。分解反応液を95℃、30分間煮沸放冷後、遠心分離(10,000G、1時間)にて沈殿を除去し、上清を凍結乾燥してペプチド混合物(2)を0.20g得た。
【実施例5】
【0036】
(スピルリナエキス抽出残渣の処理)
スピルリナ粉末10gに蒸留水100mLを加え、121℃、1時間、スピルリナエキスを抽出した。放冷後、抽出液のpHをクエン酸にて4に調整し、遠心分離(10,000G、1時間)を行った。その結果、スピルリナエキス抽出残渣8.7gを得た。こうして得られた残渣1gに蒸留水10mLを加え、スピルリナ懸濁液を得た。この懸濁液を1M水酸化カリウムにてpH6.5〜7.4に調整し、95℃、30分間煮沸した。放冷後、プロテアーゼN(天野エンザイム社製、製品名「アマノ」G)0.01gを添加し、55℃、3時間撹拌しながら加水分解を行った。分解反応液を95℃、30分間煮沸放冷後、遠心分離(10,000G、1時間)にて沈殿を除去し、上清を凍結乾燥してペプチド混合物(3)を0.43g得た。
【0037】
[試験例2]
(ACE阻害活性の測定)
ACE(シグマ社製、酵素番号EC3.4.15.1)1.5mU、合成基質Hip-His-Leu(シグマ社製)6.5mMを用い、通常公知の方法に準じて測定した。即ち、生成した馬尿酸を酢酸エチルにて抽出し228nmの吸光度で測定した。被検液での吸光度をEs、被検液の代わりに緩衝液を加えた時の値をEc、予め反応停止液を加えて反応させた時の値をEbとして次式から阻害率を求めた。
阻害率(%)=(Ec−Es)/(Ec−Eb)×100
先に得たペプチド混合物(1)、(2)及び(3)を蒸留水にて0.09(w/v)%に調整後、各々の阻害率を測定したところ、50%、47%、50%であった。
【産業上の利用可能性】
【0038】
本発明は、高血圧患者のための血圧低下剤の製造等に利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1】実施例1で得られたペプチドをHPLCで分析した結果を示す。
【図2】実施例3で得られたペプチドをHPLCで分析した結果を示す。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去する工程を有することを特徴とする下記式(1)〜(9)で表されるL−アミノ酸配列からなるいずれか1種以上のペプチドを含有するペプチド混合物の製造方法。
[化1]
Ile−Ala−Pro (1)
Ile−Arg−Pro (2)
Leu−Arg−Pro (3)
Leu−Ala−Pro (4)
Val−Arg−Pro (5)
Ile−Tyr (6)
Leu−Ala−Tyr (7)
Val−Ile−Tyr (8)
Leu−Arg−Tyr (9)
【請求項2】
水溶液中の不溶分を除去する工程に次いで、得られたペプチド類を分画する工程を有する請求項1に記載のペプチド混合物の製造方法。
【請求項3】
前記微細藻類がスピルリナ(Spirulina)である請求項1又は2に記載のペプチド混合物の製造方法。
【請求項4】
前記スピルリナが、水、有機溶媒、又は超臨界抽出ガスによる抽出工程を経た後の残渣スピルリナである請求項3に記載のペプチド混合物の製造方法。
【請求項5】
前記タンパク質分解酵素が微生物由来のタンパク質分解酵素である請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチド混合物の製造方法。
【請求項6】
前記微生物由来のタンパク質分解酵素が、コウジカビ(Aspergillus)属由来のタンパク質分解酵素およびバチルス(Bacillus)属由来のタンパク質分解酵素からなる群から選ばれる1種以上である請求項5に記載のペプチド混合物の製造方法。
【請求項7】
前記タンパク質分解酵素が、動物性消化酵素である請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチド混合物の製造方法。
【請求項8】
前記動物性消化酵素がペプシンである請求項7に記載のペプチド混合物の製造方法。
【請求項9】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式(1)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム:Develosil ODS−5(10mm×250mm)、
溶離媒体:水/アセトニトリル=97/3(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(A液)、水/アセトニトリル=20/80(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(B液)、
流速:4.0mL/min、
溶離条件:B液の濃度を毎分0.052体積%上昇させ、B液の濃度が3.4〜5.8体積%の時の溶出画分を採取する。
[化2]
Ile−Ala−Pro (1)
【請求項10】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式(2)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム:Develosil ODS−5(10mm×250mm)、
溶離媒体:水/アセトニトリル=97/3(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(A液)、水/アセトニトリル=20/80(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(B液)、
流速:4.0mL/min、
溶離条件:B液の濃度を毎分0.052体積%上昇させ、B液の濃度が3.5〜5.9体積%の時の溶出画分を採取する。
[化3]
Ile−Arg−Pro (2)
【請求項11】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式(3)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム:Develosil ODS−5(10mm×250mm)、
溶離媒体:水/アセトニトリル=97/3(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(A液)、水/アセトニトリル=20/80(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(B液)、
流速:4.0mL/min、
溶離条件:B液の濃度を毎分0.052体積%上昇させ、B液の濃度が3.6〜6.0体積%の時の溶出画分を採取する。
[化4]
Leu−Arg−Pro (3)
【請求項12】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式(4)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム:Develosil ODS−5(10mm×250mm)、
溶離媒体:水/アセトニトリル=97/3(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(A液)、水/アセトニトリル=20/80(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(B液)、
流速:4.0mL/min、
溶離条件:B液の濃度を毎分0.052体積%上昇させ、B液の濃度が3.6〜6.0体積%の時の溶出画分を採取する。
[化5]
Leu−Ala−Pro (4)
【請求項13】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式(5)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム:Develosil ODS−5(10mm×250mm)、
溶離媒体:水/アセトニトリル=97/3(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(A液)、水/アセトニトリル=20/80(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(B液)、
流速:4.0mL/min、
溶離条件:B液の濃度を毎分0.383体積%上昇させ、B液の濃度が2.7〜4.5体積%の時の溶出画分を採取する。
[化6]
Val−Arg−Pro (5)
【請求項14】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式(6)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム:Develosil ODS−5(10mm×250mm)、
溶離媒体:水/アセトニトリル=97/3(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(A液)、水/アセトニトリル=20/80(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(B液)、
流速:4.0mL/min、
溶離条件:B液の濃度を毎分0.052体積%上昇させ、B液の濃度が3.7〜6.1体積%の時の溶出画分を採取する。
[化7]
Ile−Tyr (6)
【請求項15】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式(7)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム:Develosil ODS−5(4.6mm×250mm)、
溶離媒体:水/アセトニトリル=97/3(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(A液)、水/アセトニトリル=20/80(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(B液)、
流速:0.8mL/min、
溶離条件:B液の濃度を毎分0.231体積%上昇させ、B液の濃度が8.2〜13.8体積%の時の溶出画分を採取する。
[化8]
Leu−Ala−Tyr (7)
【請求項16】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式(8)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム:Develosil ODS−5(4.6mm×250mm)、
溶離媒体:水/アセトニトリル=97/3(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(A液)、水/アセトニトリル=20/80(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(B液)、
流速:0.8mL/min、
溶離条件:B液の濃度を毎分0.231体積%上昇させ、B液の濃度が8.6〜14.4体積%の時の溶出画分を採取する。
[化9]
Val−Ile−Tyr (8)
【請求項17】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式(9)で表されるL−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム:Develosil ODS−5(4.6mm×250mm)、
溶離媒体:水/アセトニトリル=97/3(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(A液)、水/アセトニトリル=20/80(v/v)トリフルオロ酢酸0.1体積%(B液)、
流速:0.8mL/min、
溶離条件:B液の濃度を毎分0.231体積%上昇させ、B液の濃度が7.3〜12.3体積%の時の溶出画分を採取する。
[化10]
Leu−Arg−Tyr (9)
【請求項18】
前記微細藻類がスピルリナ(Spirulina)である請求項9〜17のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項19】
前記スピルリナが、水、有機溶媒、又は超臨界抽出ガスによる抽出工程を経た後の残渣スピルリナである請求項18に記載のペプチドの製造方法。
【請求項20】
前記タンパク質分解酵素が微生物由来のタンパク質分解酵素である請求項9〜19のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項21】
前記微生物由来のタンパク質分解酵素が、コウジカビ(Aspergillus)属由来のタンパク質分解酵素およびバチルス(Bacillus)属由来のタンパク質分解酵素からなる群から選ばれる1種以上である請求項20に記載のペプチドの製造方法。
【請求項22】
前記タンパク質分解酵素が、動物性消化酵素である請求項9〜19のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項23】
前記動物性消化酵素がペプシンである請求項22に記載のペプチドの製造方法。

【図1】
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【図2】
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【公開番号】特開2007−295841(P2007−295841A)
【公開日】平成19年11月15日(2007.11.15)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−126310(P2006−126310)
【出願日】平成18年4月28日(2006.4.28)
【出願人】(000002886)大日本インキ化学工業株式会社 (2,597)
【Fターム(参考)】