ペプチド組成物
【課題】β−ラクトグロブリンの抗原性を低減した、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞のバランスを整え、特異的ＩｇＥ依存型のＩ型アレルギーの産生を抑制するペプチド組成物を得る。
【解決手段】β−ラクトグロブリンをアルカラーゼ、或いはトリプシンで加水分解したペプチド組成物にＩＦＮ−γの産生を促進させ、ＩＬ−４の産生を抑制する作用を見出した。さらに、その分解物から当該活性を有するペプチドを単離・精製し、ペプチド配列を同定することができた。
【解決手段】β−ラクトグロブリンをアルカラーゼ、或いはトリプシンで加水分解したペプチド組成物にＩＦＮ−γの産生を促進させ、ＩＬ−４の産生を抑制する作用を見出した。さらに、その分解物から当該活性を有するペプチドを単離・精製し、ペプチド配列を同定することができた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫細胞のうちリンパ球から分化したナイーブＴ細胞がヘルパーＴ細胞へ分化する過程において、ヘルパーＴ細胞のＩ型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１細胞）とＩＩ型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）のバランスを調整することでアレルギー抑制作用を有する、β−ラクトグロブリンを加水分解して得られる、ペプチド組成物に関する。
【０００２】
更に詳しくは、Ｔｈ１細胞の分化を誘導し、ＩｇＥ産生を抑制するＴｈ１サイトカインであるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）産生を促進し、また、Ｔｈ２細胞の分化を誘導し、ＩｇＥ産生を亢進するサイトカインであるインターロイキン４（ＩＬ−４）の産生を抑制することで、Ｔｈ１／Ｔｈ２の細胞バランスをＴｈ１優位に導く。この結果、抗原特異的ＩｇＥの産生を抑制することで抗原特異的ＩｇＥ抗体の過剰産生が原因で起こるＩ型アレルギー反応を抑制する効果のあるペプチド組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、乳幼児を中心として食物アレルギーの罹患者が増加しており、最近の調査では乳児の食物アレルギー有病率は５−１０％と報告されている（非特許文献１）。また、平成１３年の厚生労働省の調査では、０歳児の感作抗原は鶏卵６１．１％、乳製品２１．７％、小麦６．７％であり、（非特許文献２）深刻な社会問題となっている
【０００４】
食物アレルギーの多くは年齢とともにアウトグローする。しかし、アレルギー患者は抗原となる食物の摂取制限や、抗原成分を除去したり、抗原性を低減させた飲食物を喫食することで、精神的負担や経済的負担を被る。
【０００５】
食物アレルギーが増加している理由としては、食生活や環境など様々な要因が関与しているが、根本的な原因は免疫細胞のヘルパーＴ細胞のバランスが崩れることがひとつの大きな原因である（非特許文献３）。
【０００６】
同様に、ヘルパーＴ細胞のバランスが崩れることによって、花粉によるアレルギー性鼻炎や気管支喘息などのＩ型アレルギーも起こりやすくなると言われている。
【０００７】
ヘルパーＴ細胞は産生するサイトカインの違いから、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞と呼ばれる２つの異なる細胞集団に分類され、異なる免疫反応を制御している。Ｔｈ１細胞は主に細胞性免疫反応における感染防御担当し、アトピー性皮膚炎を抑えるＩＦＮ−γなどのサイトカインを分泌する免疫担当細胞である。Ｔｈ２細胞は主に体液性免疫反応により細胞外寄生性微生物に対する感染防御に関与しており、Ｉ型アレルギー（食物アレルギーなどの即時型アレルギー）の原因となる特異的ＩｇＥ抗体の産生を促進するサイトカインであるＩＬ−４などを産生する。これらのバランスにおいてＴｈ２細胞が優位になることがＩ型アレルギーの起こることのひとつの原因である（非特許文献４、５）。
【０００８】
アレルギーの治療方法としては、一般的に抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬、抗ステロイド薬などの薬剤があるが、この方法では抗ヒスタミン薬や抗アレルギー薬などによる副作用があり、特に乳幼児では医師の厳格な管理の元で使用しなければならない。また、これらの治療方法は対処療法であり、根本的な治療方法ではない。
【０００９】
医薬品によるアレルギー治療以外の方法として、例えば、食物アレルギーの抑制方法として１）タンパク質を分解することで低アレルゲン化する。２）抗原性を保持したタンパク質の吸収を抑制する。３）Ｉ型アレルギーの原因となる特異的ＩｇＥの産生を抑制する。４）Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞のバランスをＴｈ１細胞優位に誘導することでＩｇＥ依存のＩ型アレルギーを抑制する方法が知られている。
【００１０】
上記の１）については、例えば、牛乳アレルギー原因抗原である乳タンパク質をタンパク質加水分解酵素で加水分解し、抗原性を低下させることでアレルギー反応が抑制されるペプチドの製造方法がある（例えば、特許文献１、２、３参照）
【００１１】
しかし、これらの方法では、ペプチドに分解することによる特有の風味があり、これらの原料を使用した場合、本来の食品のもつおいしさがなくなると言う不都合、また、これらの原料を含有する食品しか飲食できないと言う不都合がある。
【００１２】
上記の２）の方法として、抗原性を保持したタンパク質の腸管の通過を抑制するために、腸管上皮細胞間に存在するタイト・ジャンクションの透過性を抑制する作用をもったホエイタンパク質またはその分解物を利用することで食物アレルギーを予防する効果を発揮する腸管透過抑制剤がある（例えば、特許文献４、５参照）。
【００１３】
しかし、これらの方法では、アレルゲンの吸収を抑制するものであり、アレルギー症状の抑制やアレルギー体質の改善を目的としたものではない。
【００１４】
上記の３）の方法としては、例えば乳清タンパク質を加水分解したペプチドを含有する組成物でＩ型アレルギーの原因となるアレルゲン特異ＩｇＥの産生を抑制する方法がある（特許文献６参照）。
【００１５】
しかしながら、上記１）から３）の従来の技術では根本的なアレルギーの治療や体質改善には至っておらず、アレルギー反応の低減あるいはアレルギーを一時的に抑制しているに過ぎない。
【００１６】
上記の４）の技術として、例えば、β−ラクトグロブリンを使うことによってヘルパーＴ細胞の分化をＴｈ１細胞優位に導き、アレルギー体質の改善に関するものがある（非特許文献６）。
【００１７】
しかしながら、β−ラクトグロブリンは、それ自身が食物アレルゲンとなり、特に乳幼児ではβ−ラクトグロブリンに対する食物アレルギーに感作する可能性が高い。また、牛乳アレルギーのひとには使用できないと言う不都合がある。
【非特許文献１】向山徳子、西島三馨．食物アレルギー診察ガイドライン２００５．協和企画．２００５
【非特許文献２】今井孝成、海老沢元宏．平成１４年厚生労働省科学研究報告書．
【非特許文献３】田中和子．食品とアレルギー食物アレルギー発症のメカニズム．保健の科学．２００３．４５．１６１−１６５
【非特許文献４】小安重夫編集．免疫学がわかる．羊土社．２０００．
【非特許文献５】中村晋、飯倉洋治編集．食物アレルギー．永井書店．２００２．
【非特許文献６】吉見一真、岡本威明、立花宏文、他．マウス脾臓リンパ球のサイトカイン発現に及ぼす乳清タンパク質の影響．日本農芸化学会大会公演集．２００３．２２３．
【特許文献１】特開平８−２２８６９２
【特許文献２】特開平６−３４３４２２
【特許文献３】特開平２−１８２１５５
【特許文献４】特開平９−２４１１７７
【特許文献５】特開平８−７３３７５
【特許文献６】特開２００５−３５０４５２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
牛乳のホエイタンパク質に含まれるβ−ラクトグロブリンには、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞のバランスをＴｈ１細胞優位に導き、抗原特異的ＩｇＥの産生により引き起こされるＩ型アレルギーの発生を抑制する効果がある。しかし、β−ラクトグロブリン自体が強力な食物アレルギーの原因となるため、牛乳アレルギーの発症頻度が高い乳幼児や牛乳アレルギーをもつ人に対しては使用できない、という問題点があった。そこでβ−ラクトグロブリンの抗原性を低下させ、なおかつ免疫調整作用を保持するβ−ラクトグロブリン由来のペプチドを得ることを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、先の目的を達成させるため、各種のタンパク質分解酵素を用いてβ−ラクトグロブリンを加水分解した結果、アルカラーゼ、或いはトリプシンを用いることで、アレルゲン性を低下させ、且つ、免疫調整作用、すなわちＩＦＮ−γ産生を促進しＴｈ１細胞を優位にすること、及びＩＬ−４を抑制し、Ｔｈ２細胞を抑制する作用を有するペプチドを得られることを見出した。なお、アルカラーゼとはノボ・インダストリー社から販売されているプロテアーゼであり、登録商標である。
【００２０】
すなわち、β−ラクトグロブリンをアルカラーゼ、或いはトリプシンで分子量約３，０００ダルトン以下に加水分解物した画分にＩＦＮ−γ産生を誘導し、ＩＬ−４産生を抑制する活性が存在することを見出した。これらのペプチド組成物から活性のあるペプチドを単離、精製してアミノ酸配列を決定した。また、これらの配列を有するペプチドを合成して上記の活性があることを確認した。
【００２１】
本発明は、ペプチド配列がＳＬＡＭＡＡＳＤＩＳＬＬＤＡＱＳＡＰＬＲ、或いはＶＹＶＥＥＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬＬＱＫを有する分子量３，０００ダルトン以下のペプチド組成物にＩＦＮ−γ産生を促進し、Ｔｈ１細胞を優位にすること、及びＩＬ−４産生を抑制し、Ｔｈ２細胞を抑制する作用を有することを見出して完成した。なお、ペプチド配列のローマ字はアミノ酸の一文字表記である。
【００２２】
本発明に用いられる酵素は、トリプシン、或いはアルカラーゼから選ばれる少なくとも一つから選んで用いることが出来る。
【発明の効果】
【００２３】
以上述べた通り、本発明のペプチド組成物は、分子量３，０００ダルトン以下に低アレルゲン化されており、尚且つ、ヘルパーＴ細胞の分化をＴｈ１細胞優位に誘導し、Ｔｈ１細胞／Ｔｈ２細胞のバランスを調整することで免疫調整作用を有する。すなわち、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γ産生を促進させ、かつＴｈ２サイトカインであるＩＬ−４産生を抑制する。この結果、特異的ＩｇＥ過剰産生が原因で起こるＩ型アレルギーを抑制する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下に本発明の事例を詳しく説明するが、本発明はこれらの事例に限定するものではない。
【実施例】
【００２５】
［実施例１］β−ラクトグロブリン加水分解物の調製
β−ラクトグロブリン（β−ラクトグロブリン含有率９０％、ダビスコ社製）をリン酸緩衝液に１％濃度で溶解し、タンパク質１ｇに対してアルカラーゼ［商標登録］２ｍｇを加え３７℃で２４時間反応させ、加水分解した。こうして得られた分解物の分子量を確認するため、反応液の一部をゲルろ過カラムのＨＰＬＣに供し｛カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー社製）、カラムサイズ：７．８ｍｍ×３０ｃｍ、溶離液：５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液＋０．３５ｍｏｌ／ｌＮａＣｌ（ｐＨ７．０）｝、分子量が３，０００ダルトン以下に分解されているのを確認した。
【００２６】
［実施例２］β−ラクトグロブリン加水分解物の調製
β−ラクトグロブリン（β−ラクトグロブリン含有率９０％、ダビスコ社製）をリン酸緩衝液に１％濃度で溶解し、タンパク質１ｇに対してトリプシン（ブタ膵臓由来、２５ＵＳＰキモトリプシンＵｎｉｔｓ／ｍｇ以下、和光純薬社製）を２ｍｇ加え、３７℃で２４時間反応させ、加水分解した。実施例１と同様に分子量が３，０００ダルトン以下であるのを確認した。
【００２７】
［実施例３］加水分解ペプチドの精製
β−ラクトグロブリン（β−ラクトグロブリン含有率９０％、ダビスコ社製）のトリプシン分解物を実施例２に準じて調整した。これらのトリプシン分解物をＳｅｐ−ｐａｃ Ｃ１８（日本ウオーターズ社製）でアセトニトリル溶液を用いて粗分画を行い、ＩＦＮ−γ産生促進作用とＩＬ−４産生抑制作用のある粗ペプチド組成物を得た。更に、これらの粗ペプチド組成物を逆相ＨＰＬＣに供し｛カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＭＧＩＩ（資生堂）、カラムサイズ：４．６×２５０ｍｍ、溶離液：Ａ液（０．１％ＴＦＡ）からＢ液（８０％アセトニトリル、０．０８５％ＴＦＡ）の直線グラジエント（６０分間）｝、Ｐ１からＰ４の４つのペプチドを得た。結果を図１に示す。再度これらのペプチドの、ＩＦＮ−γ産生量とＩＬ−４産生量を測定した。その結果、ピークＰ３とＰ４のペプチドに活性が認められた。更にＰ３とＰ４を逆相ＨＰＬＣに供してリクロマトを行い、ペプチドの単離・精製を行った。その結果、ピークＰ３のペプチドはＰ３−１とＰ３−２の二つのペプチドに単離・精製できた。一方、ピークＰ４のペプチドはそのまま一つのペプチドとして単離・精製できた。これら３つのペプチドのうちＰ３−１（ＳＬＡＭＡＡＳＤＩＳＬＬＤＡＱＳＡＰＬＲ）とＰ４（ＶＹＶＥＥＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬＬＱＫ）の二つのペプチドにＩＦＮ−γ産生の促進とＩＬ−４産生の抑制の活性が認められた。
【００２８】
［試験例１］ＩＦＮ−γ生産促進作用
β−ラクトグロブリンと実施例１、２で得られたβ−ラクトグロブリンのアルカラーゼ［商標登録］及びトリプシン分解物のＩＦＮ−γ生産作用を確認した。
Ｂａｌｂ／Ｃマウス（メス、６週齢）の脾臓細胞を２４ウェルプレートに、細胞数が１ウェルあたり２×１０７となるように調整した。β−ラクトグロブリン及び加水分解物を１ウェルあたり１００μｇの濃度で加え、更にＴ細胞刺激物として、ホルボール１２−ミリステート１３アセテート（ナカライテスク）２５ｎｇ／ｍｌと、イオノマイシン１μｇ／ｍｌの２種類を培地に添加した。３７℃で７２時間培養した後、産生したＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ法（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙ Ｋｉｔ Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ、ＢＩＯＳＵＲＣＥ社製）にて測定した。これらの結果を図２に示す。
【００２９】
［試験例２］ＩＦＮ−γ産生促進作用
実施例３において粗ペプチド分画物から逆相ＨＰＬＣで得られた４つのペプチドＰ１からＰ４（図１参照）のＩＦＮ−γ生産作用を確認した。試験例１と同様に調製したマウス脾臓培養液に１０μｇ／ｍｌになるように４種類のペプチドを添加し、３７℃で７２時間培養して、同様にＩＮＦ−γを測定した。結果は図３に示した。
【００３０】
［試験例３］ＩＦＮ−γ生産促進作用及びＩＬ−４産生抑制作用
実施例３における単離・精製して、活性が認められた２種類のペプチドを合成してＩＦＮ−γ生産促進作用及びＩＬ−４産生抑制作用を確認した。試験例１と同様に調製したマウス脾細胞培養液に合成ペプチド各１００μｇ／ｍｌ加え、ＩＦＮ−γとＩＬ−４濃度をＥＬＩＳＡ法（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙ Ｋｉｔ Ｍｏｕｓｅ ＩＬ−４、ＢＩＯＳＵＲＣＥ社製）にて測定した。結果は図４と５に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明により、免疫細胞であるヘルパーＴ細胞のバランスをＴｈ１細胞優位に誘導し、Ｔｈ２細胞によるＩ型アレルギーの発症を根本的に抑制できることが可能で、且つ、それ自体がアレルゲン性を有さない、経口摂取可能なペプチドを得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】β−ラクトグロブリンのトリプシン分解物の粗精製物の逆相ＨＰＬＣのクロマトグラフを示す。
【図２】β−ラクトグロブリン及びそのトリプシン分解物、或いはアルカラーゼ［商標登録］分解物のＩＦＮ−γ産生促進作用を示す。
【図３】β−ラクトグロブリンのトリプシン分解物の粗精製物を逆相ＨＰＬＣにて分画した４つのペプチド組成物のＩＦＮ−γ産生促進作用を示す。
【図４】β−ラクトグロブリンのトリプシン分解物を逆相ＨＰＬＣにて分画した４つのペプチドのうち、活性のあった２つの画分をリクロマトし、単離・精製し、配列決定したペプチドを合成してＩＦＮ−γ産生促進作用を確認した図を示す。
【図５】β−ラクトグロブリンのトリプシン分解物を逆相ＨＰＬＣにて分画した４つのペプチドのうち、活性のあった２つの画分をリクロマトし、単離・精製し、配列決定したペプチドを合成してＩＬ−４産生抑制作用を確認した図を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫細胞のうちリンパ球から分化したナイーブＴ細胞がヘルパーＴ細胞へ分化する過程において、ヘルパーＴ細胞のＩ型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１細胞）とＩＩ型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）のバランスを調整することでアレルギー抑制作用を有する、β−ラクトグロブリンを加水分解して得られる、ペプチド組成物に関する。
【０００２】
更に詳しくは、Ｔｈ１細胞の分化を誘導し、ＩｇＥ産生を抑制するＴｈ１サイトカインであるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）産生を促進し、また、Ｔｈ２細胞の分化を誘導し、ＩｇＥ産生を亢進するサイトカインであるインターロイキン４（ＩＬ−４）の産生を抑制することで、Ｔｈ１／Ｔｈ２の細胞バランスをＴｈ１優位に導く。この結果、抗原特異的ＩｇＥの産生を抑制することで抗原特異的ＩｇＥ抗体の過剰産生が原因で起こるＩ型アレルギー反応を抑制する効果のあるペプチド組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、乳幼児を中心として食物アレルギーの罹患者が増加しており、最近の調査では乳児の食物アレルギー有病率は５−１０％と報告されている（非特許文献１）。また、平成１３年の厚生労働省の調査では、０歳児の感作抗原は鶏卵６１．１％、乳製品２１．７％、小麦６．７％であり、（非特許文献２）深刻な社会問題となっている
【０００４】
食物アレルギーの多くは年齢とともにアウトグローする。しかし、アレルギー患者は抗原となる食物の摂取制限や、抗原成分を除去したり、抗原性を低減させた飲食物を喫食することで、精神的負担や経済的負担を被る。
【０００５】
食物アレルギーが増加している理由としては、食生活や環境など様々な要因が関与しているが、根本的な原因は免疫細胞のヘルパーＴ細胞のバランスが崩れることがひとつの大きな原因である（非特許文献３）。
【０００６】
同様に、ヘルパーＴ細胞のバランスが崩れることによって、花粉によるアレルギー性鼻炎や気管支喘息などのＩ型アレルギーも起こりやすくなると言われている。
【０００７】
ヘルパーＴ細胞は産生するサイトカインの違いから、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞と呼ばれる２つの異なる細胞集団に分類され、異なる免疫反応を制御している。Ｔｈ１細胞は主に細胞性免疫反応における感染防御担当し、アトピー性皮膚炎を抑えるＩＦＮ−γなどのサイトカインを分泌する免疫担当細胞である。Ｔｈ２細胞は主に体液性免疫反応により細胞外寄生性微生物に対する感染防御に関与しており、Ｉ型アレルギー（食物アレルギーなどの即時型アレルギー）の原因となる特異的ＩｇＥ抗体の産生を促進するサイトカインであるＩＬ−４などを産生する。これらのバランスにおいてＴｈ２細胞が優位になることがＩ型アレルギーの起こることのひとつの原因である（非特許文献４、５）。
【０００８】
アレルギーの治療方法としては、一般的に抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬、抗ステロイド薬などの薬剤があるが、この方法では抗ヒスタミン薬や抗アレルギー薬などによる副作用があり、特に乳幼児では医師の厳格な管理の元で使用しなければならない。また、これらの治療方法は対処療法であり、根本的な治療方法ではない。
【０００９】
医薬品によるアレルギー治療以外の方法として、例えば、食物アレルギーの抑制方法として１）タンパク質を分解することで低アレルゲン化する。２）抗原性を保持したタンパク質の吸収を抑制する。３）Ｉ型アレルギーの原因となる特異的ＩｇＥの産生を抑制する。４）Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞のバランスをＴｈ１細胞優位に誘導することでＩｇＥ依存のＩ型アレルギーを抑制する方法が知られている。
【００１０】
上記の１）については、例えば、牛乳アレルギー原因抗原である乳タンパク質をタンパク質加水分解酵素で加水分解し、抗原性を低下させることでアレルギー反応が抑制されるペプチドの製造方法がある（例えば、特許文献１、２、３参照）
【００１１】
しかし、これらの方法では、ペプチドに分解することによる特有の風味があり、これらの原料を使用した場合、本来の食品のもつおいしさがなくなると言う不都合、また、これらの原料を含有する食品しか飲食できないと言う不都合がある。
【００１２】
上記の２）の方法として、抗原性を保持したタンパク質の腸管の通過を抑制するために、腸管上皮細胞間に存在するタイト・ジャンクションの透過性を抑制する作用をもったホエイタンパク質またはその分解物を利用することで食物アレルギーを予防する効果を発揮する腸管透過抑制剤がある（例えば、特許文献４、５参照）。
【００１３】
しかし、これらの方法では、アレルゲンの吸収を抑制するものであり、アレルギー症状の抑制やアレルギー体質の改善を目的としたものではない。
【００１４】
上記の３）の方法としては、例えば乳清タンパク質を加水分解したペプチドを含有する組成物でＩ型アレルギーの原因となるアレルゲン特異ＩｇＥの産生を抑制する方法がある（特許文献６参照）。
【００１５】
しかしながら、上記１）から３）の従来の技術では根本的なアレルギーの治療や体質改善には至っておらず、アレルギー反応の低減あるいはアレルギーを一時的に抑制しているに過ぎない。
【００１６】
上記の４）の技術として、例えば、β−ラクトグロブリンを使うことによってヘルパーＴ細胞の分化をＴｈ１細胞優位に導き、アレルギー体質の改善に関するものがある（非特許文献６）。
【００１７】
しかしながら、β−ラクトグロブリンは、それ自身が食物アレルゲンとなり、特に乳幼児ではβ−ラクトグロブリンに対する食物アレルギーに感作する可能性が高い。また、牛乳アレルギーのひとには使用できないと言う不都合がある。
【非特許文献１】向山徳子、西島三馨．食物アレルギー診察ガイドライン２００５．協和企画．２００５
【非特許文献２】今井孝成、海老沢元宏．平成１４年厚生労働省科学研究報告書．
【非特許文献３】田中和子．食品とアレルギー食物アレルギー発症のメカニズム．保健の科学．２００３．４５．１６１−１６５
【非特許文献４】小安重夫編集．免疫学がわかる．羊土社．２０００．
【非特許文献５】中村晋、飯倉洋治編集．食物アレルギー．永井書店．２００２．
【非特許文献６】吉見一真、岡本威明、立花宏文、他．マウス脾臓リンパ球のサイトカイン発現に及ぼす乳清タンパク質の影響．日本農芸化学会大会公演集．２００３．２２３．
【特許文献１】特開平８−２２８６９２
【特許文献２】特開平６−３４３４２２
【特許文献３】特開平２−１８２１５５
【特許文献４】特開平９−２４１１７７
【特許文献５】特開平８−７３３７５
【特許文献６】特開２００５−３５０４５２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
牛乳のホエイタンパク質に含まれるβ−ラクトグロブリンには、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞のバランスをＴｈ１細胞優位に導き、抗原特異的ＩｇＥの産生により引き起こされるＩ型アレルギーの発生を抑制する効果がある。しかし、β−ラクトグロブリン自体が強力な食物アレルギーの原因となるため、牛乳アレルギーの発症頻度が高い乳幼児や牛乳アレルギーをもつ人に対しては使用できない、という問題点があった。そこでβ−ラクトグロブリンの抗原性を低下させ、なおかつ免疫調整作用を保持するβ−ラクトグロブリン由来のペプチドを得ることを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、先の目的を達成させるため、各種のタンパク質分解酵素を用いてβ−ラクトグロブリンを加水分解した結果、アルカラーゼ、或いはトリプシンを用いることで、アレルゲン性を低下させ、且つ、免疫調整作用、すなわちＩＦＮ−γ産生を促進しＴｈ１細胞を優位にすること、及びＩＬ−４を抑制し、Ｔｈ２細胞を抑制する作用を有するペプチドを得られることを見出した。なお、アルカラーゼとはノボ・インダストリー社から販売されているプロテアーゼであり、登録商標である。
【００２０】
すなわち、β−ラクトグロブリンをアルカラーゼ、或いはトリプシンで分子量約３，０００ダルトン以下に加水分解物した画分にＩＦＮ−γ産生を誘導し、ＩＬ−４産生を抑制する活性が存在することを見出した。これらのペプチド組成物から活性のあるペプチドを単離、精製してアミノ酸配列を決定した。また、これらの配列を有するペプチドを合成して上記の活性があることを確認した。
【００２１】
本発明は、ペプチド配列がＳＬＡＭＡＡＳＤＩＳＬＬＤＡＱＳＡＰＬＲ、或いはＶＹＶＥＥＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬＬＱＫを有する分子量３，０００ダルトン以下のペプチド組成物にＩＦＮ−γ産生を促進し、Ｔｈ１細胞を優位にすること、及びＩＬ−４産生を抑制し、Ｔｈ２細胞を抑制する作用を有することを見出して完成した。なお、ペプチド配列のローマ字はアミノ酸の一文字表記である。
【００２２】
本発明に用いられる酵素は、トリプシン、或いはアルカラーゼから選ばれる少なくとも一つから選んで用いることが出来る。
【発明の効果】
【００２３】
以上述べた通り、本発明のペプチド組成物は、分子量３，０００ダルトン以下に低アレルゲン化されており、尚且つ、ヘルパーＴ細胞の分化をＴｈ１細胞優位に誘導し、Ｔｈ１細胞／Ｔｈ２細胞のバランスを調整することで免疫調整作用を有する。すなわち、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γ産生を促進させ、かつＴｈ２サイトカインであるＩＬ−４産生を抑制する。この結果、特異的ＩｇＥ過剰産生が原因で起こるＩ型アレルギーを抑制する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下に本発明の事例を詳しく説明するが、本発明はこれらの事例に限定するものではない。
【実施例】
【００２５】
［実施例１］β−ラクトグロブリン加水分解物の調製
β−ラクトグロブリン（β−ラクトグロブリン含有率９０％、ダビスコ社製）をリン酸緩衝液に１％濃度で溶解し、タンパク質１ｇに対してアルカラーゼ［商標登録］２ｍｇを加え３７℃で２４時間反応させ、加水分解した。こうして得られた分解物の分子量を確認するため、反応液の一部をゲルろ過カラムのＨＰＬＣに供し｛カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー社製）、カラムサイズ：７．８ｍｍ×３０ｃｍ、溶離液：５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液＋０．３５ｍｏｌ／ｌＮａＣｌ（ｐＨ７．０）｝、分子量が３，０００ダルトン以下に分解されているのを確認した。
【００２６】
［実施例２］β−ラクトグロブリン加水分解物の調製
β−ラクトグロブリン（β−ラクトグロブリン含有率９０％、ダビスコ社製）をリン酸緩衝液に１％濃度で溶解し、タンパク質１ｇに対してトリプシン（ブタ膵臓由来、２５ＵＳＰキモトリプシンＵｎｉｔｓ／ｍｇ以下、和光純薬社製）を２ｍｇ加え、３７℃で２４時間反応させ、加水分解した。実施例１と同様に分子量が３，０００ダルトン以下であるのを確認した。
【００２７】
［実施例３］加水分解ペプチドの精製
β−ラクトグロブリン（β−ラクトグロブリン含有率９０％、ダビスコ社製）のトリプシン分解物を実施例２に準じて調整した。これらのトリプシン分解物をＳｅｐ−ｐａｃ Ｃ１８（日本ウオーターズ社製）でアセトニトリル溶液を用いて粗分画を行い、ＩＦＮ−γ産生促進作用とＩＬ−４産生抑制作用のある粗ペプチド組成物を得た。更に、これらの粗ペプチド組成物を逆相ＨＰＬＣに供し｛カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＭＧＩＩ（資生堂）、カラムサイズ：４．６×２５０ｍｍ、溶離液：Ａ液（０．１％ＴＦＡ）からＢ液（８０％アセトニトリル、０．０８５％ＴＦＡ）の直線グラジエント（６０分間）｝、Ｐ１からＰ４の４つのペプチドを得た。結果を図１に示す。再度これらのペプチドの、ＩＦＮ−γ産生量とＩＬ−４産生量を測定した。その結果、ピークＰ３とＰ４のペプチドに活性が認められた。更にＰ３とＰ４を逆相ＨＰＬＣに供してリクロマトを行い、ペプチドの単離・精製を行った。その結果、ピークＰ３のペプチドはＰ３−１とＰ３−２の二つのペプチドに単離・精製できた。一方、ピークＰ４のペプチドはそのまま一つのペプチドとして単離・精製できた。これら３つのペプチドのうちＰ３−１（ＳＬＡＭＡＡＳＤＩＳＬＬＤＡＱＳＡＰＬＲ）とＰ４（ＶＹＶＥＥＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬＬＱＫ）の二つのペプチドにＩＦＮ−γ産生の促進とＩＬ−４産生の抑制の活性が認められた。
【００２８】
［試験例１］ＩＦＮ−γ生産促進作用
β−ラクトグロブリンと実施例１、２で得られたβ−ラクトグロブリンのアルカラーゼ［商標登録］及びトリプシン分解物のＩＦＮ−γ生産作用を確認した。
Ｂａｌｂ／Ｃマウス（メス、６週齢）の脾臓細胞を２４ウェルプレートに、細胞数が１ウェルあたり２×１０７となるように調整した。β−ラクトグロブリン及び加水分解物を１ウェルあたり１００μｇの濃度で加え、更にＴ細胞刺激物として、ホルボール１２−ミリステート１３アセテート（ナカライテスク）２５ｎｇ／ｍｌと、イオノマイシン１μｇ／ｍｌの２種類を培地に添加した。３７℃で７２時間培養した後、産生したＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ法（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙ Ｋｉｔ Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ、ＢＩＯＳＵＲＣＥ社製）にて測定した。これらの結果を図２に示す。
【００２９】
［試験例２］ＩＦＮ−γ産生促進作用
実施例３において粗ペプチド分画物から逆相ＨＰＬＣで得られた４つのペプチドＰ１からＰ４（図１参照）のＩＦＮ−γ生産作用を確認した。試験例１と同様に調製したマウス脾臓培養液に１０μｇ／ｍｌになるように４種類のペプチドを添加し、３７℃で７２時間培養して、同様にＩＮＦ−γを測定した。結果は図３に示した。
【００３０】
［試験例３］ＩＦＮ−γ生産促進作用及びＩＬ−４産生抑制作用
実施例３における単離・精製して、活性が認められた２種類のペプチドを合成してＩＦＮ−γ生産促進作用及びＩＬ−４産生抑制作用を確認した。試験例１と同様に調製したマウス脾細胞培養液に合成ペプチド各１００μｇ／ｍｌ加え、ＩＦＮ−γとＩＬ−４濃度をＥＬＩＳＡ法（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙ Ｋｉｔ Ｍｏｕｓｅ ＩＬ−４、ＢＩＯＳＵＲＣＥ社製）にて測定した。結果は図４と５に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明により、免疫細胞であるヘルパーＴ細胞のバランスをＴｈ１細胞優位に誘導し、Ｔｈ２細胞によるＩ型アレルギーの発症を根本的に抑制できることが可能で、且つ、それ自体がアレルゲン性を有さない、経口摂取可能なペプチドを得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】β−ラクトグロブリンのトリプシン分解物の粗精製物の逆相ＨＰＬＣのクロマトグラフを示す。
【図２】β−ラクトグロブリン及びそのトリプシン分解物、或いはアルカラーゼ［商標登録］分解物のＩＦＮ−γ産生促進作用を示す。
【図３】β−ラクトグロブリンのトリプシン分解物の粗精製物を逆相ＨＰＬＣにて分画した４つのペプチド組成物のＩＦＮ−γ産生促進作用を示す。
【図４】β−ラクトグロブリンのトリプシン分解物を逆相ＨＰＬＣにて分画した４つのペプチドのうち、活性のあった２つの画分をリクロマトし、単離・精製し、配列決定したペプチドを合成してＩＦＮ−γ産生促進作用を確認した図を示す。
【図５】β−ラクトグロブリンのトリプシン分解物を逆相ＨＰＬＣにて分画した４つのペプチドのうち、活性のあった２つの画分をリクロマトし、単離・精製し、配列決定したペプチドを合成してＩＬ−４産生抑制作用を確認した図を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ラクトグロブリンを加水分解し、得られるＳＬＡＭＡＡＳＤＩＳＬＬＤＡＱＳＡＰＬＲのアミノ酸配列を有する分子量３，０００ダルトン以下のペプチド組成物。
【請求項２】
β−ラクトグロブリンを加水分解し、得られるＶＹＶＥＥＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬＬＱＫのアミノ酸配列を有する分子量３，０００ダルトン以下のペプチド組成物。
【請求項３】
加水分解酵素がアルカラーゼ、或いはトリプシンから選ばれる少なくとも一つである請求項１、２記載のペプチド組成物。
【請求項４】
請求項１、２記載のペプチド組成物を少なくとも一つ含む飲食品
【請求項５】
請求項１、２記載のペプチド組成物を少なくとも一つ含むヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞とＴｈ２細胞のバランスを調整することを機序としてアレルギーを抑制することを特徴とするアレルギー抑制剤もしくはアレルギーを抑制する方法。
【請求項１】
β−ラクトグロブリンを加水分解し、得られるＳＬＡＭＡＡＳＤＩＳＬＬＤＡＱＳＡＰＬＲのアミノ酸配列を有する分子量３，０００ダルトン以下のペプチド組成物。
【請求項２】
β−ラクトグロブリンを加水分解し、得られるＶＹＶＥＥＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬＬＱＫのアミノ酸配列を有する分子量３，０００ダルトン以下のペプチド組成物。
【請求項３】
加水分解酵素がアルカラーゼ、或いはトリプシンから選ばれる少なくとも一つである請求項１、２記載のペプチド組成物。
【請求項４】
請求項１、２記載のペプチド組成物を少なくとも一つ含む飲食品
【請求項５】
請求項１、２記載のペプチド組成物を少なくとも一つ含むヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞とＴｈ２細胞のバランスを調整することを機序としてアレルギーを抑制することを特徴とするアレルギー抑制剤もしくはアレルギーを抑制する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１０５９１５（Ｐ２０１０−１０５９１５Ａ）
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３３９１７２（Ｐ２００６−３３９１７２）
【出願日】平成１８年１１月１９日（２００６．１１．１９）
【出願人】（５００１３０７５９）アイクレオ株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月１９日（２００６．１１．１９）
【出願人】（５００１３０７５９）アイクレオ株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
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