ペントース糖の発酵
【課題】アルコール発酵ができ、炭素源としてキシロースを利用できる酵母を提供する。
【解決手段】嫌気性菌から得られる真核生物性キシロース異性化酵素をコードする核酸配列で形質転換した宿主細胞であり、発現したときにキシロース異性化酵素をコードする配列は、キシロースをキシルロースに変換する能力を宿主細胞に付与し、それは宿主細胞によりさらに代謝される。従って、宿主細胞は、炭素源としてのキシロースに対して増殖することができる。宿主細胞は酵母または糸状菌のような真核性微生物であることが望ましい。さらにエタノールのような発酵産物の生産プロセスに関し、そのプロセスにおいて、該宿主細胞は増殖及び発酵産物の生産のためにキシロースを利用できる。
【解決手段】嫌気性菌から得られる真核生物性キシロース異性化酵素をコードする核酸配列で形質転換した宿主細胞であり、発現したときにキシロース異性化酵素をコードする配列は、キシロースをキシルロースに変換する能力を宿主細胞に付与し、それは宿主細胞によりさらに代謝される。従って、宿主細胞は、炭素源としてのキシロースに対して増殖することができる。宿主細胞は酵母または糸状菌のような真核性微生物であることが望ましい。さらにエタノールのような発酵産物の生産プロセスに関し、そのプロセスにおいて、該宿主細胞は増殖及び発酵産物の生産のためにキシロースを利用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核生物性キシロース異性化酵素をコードする核酸配列で形質転換した宿主細胞に関するものである。このキシロース異性化酵素は、宿主細胞で発現し、キシロースをキシルロースに変換する能力を付与する。この宿主細胞は、ペントース含有培地の発酵によるエタノール及びその他の発酵産物の製造プロセスに使用される。さらに本発明は、真核生物性キシロース異性化酵素をコードする核酸配列に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
この数十年間における古典的化石燃料（石油燃料）の大量消費は、高レベルの汚染の原因となっている。さらに、世界中の石油埋蔵量は無限でないことが認識され、このような認識は、環境問題への関心の高まりと相俟って、ＣＯ２排出の６０−９０％減少を実現できるエタノールのような代替燃料の可能性を研究する新しい動きを生んだ。バイオマス由来のエタノールは、多数の種々の資源から得られるヘキソース糖の発酵により生産することができるが、にも拘らず工業的規模の生産または燃料アルコールに向けられる原料は、ショ糖及びトウモロコシデンプンである。これらの原料の欠点は高価なことである。
【０００３】
燃料アルコールの生産拡大には、低コストの供給原料の使用を可能にすることが求められる。現在、植物バイオマスからは唯一リグノセルロース原料がかなり大量に使用可能であり、エタノール生産用の農産物を代替している。リグノセルロース原料の主な発酵可能な糖はグルコース及びキシロースであり、それぞれリグノセルロース中に約４０％及び２５％含有される。しかし、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのようなアルコール発酵ができる酵母のほとんどは、炭素源としてキシロースを使用できない。さらに、高収量及び高生産性でキシロースをエタノールに発酵できる微生物は知られていない。リグノセルロース加水分解産物からエタノールを商業的に生産することを可能にするには、これらの性質を持つ微生物が求められるであろう。従って本発明の一つの目的は、アルコール発酵ができ、炭素源としてキシロースを利用できる酵母を提供することである。
【０００４】
Ｄ−キシロースは、腸内細菌、一部の酵母及び真菌のような種々の微生物によって代謝される。大部分のキシロース利用細菌において、キシロースはキシロース（グルコース）異性化酵素（ＸＩ）により直接Ｄ−キシルロースに異性化される。しかし、糸状菌及び酵母は、この一ステップの異性化を行うことができず、まずキシロース還元酵素（ＸＲ）の作用によりキシロースをキシリトールに還元し、次いでキシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）によりキシリトールをキシルロースに変換する。最初のステップは補因子としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とし、第二ステップはＮＡＤ＋を必要とする。生成したキシルロースは、その後、キシルロースキナーゼ（ＸＫ）によりリン酸化された後にペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に入る。厳密なＮＡＤＰＨ依存性のキシロース還元酵素（ＸＲ）を持つ微生物では、キシロースからエタノールへの嫌気性発酵は不可能である。キシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）は厳密にＮＡＤ＋に依存しているので、酸化還元不均衡（すなわち、ＮＡＤ＋欠乏）を生じるからである。嫌気性条件においてこの酸化還元不均衡を解決するために、微生物はグリセロール及びキシリトールのような副産物を生産する。同様に、キシロースに対するβ−ラクタムの嫌気的な生産も、グルコースに対するβ−ラクタム生産に比較すると生じにくい。これらの低収量の原因は、グルコースを利用する場合に比較して、この経路においてはＮＡＤＰＨの形の還元体を比較的高度に必要とすることにあるように思われる（W.M.van Gulik et al.,Biotechnol Bioeng.Vol.68,No.6,June 20,2000）。
【０００５】
Ｚａｌｄｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．（2001,Appl.Microbiol.Biotechnol.56;17-34）に総説されているように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及び類似の酵母にキシロース代謝を導入する多くの試みが行われてきた。一つの方法は、少なくとも、キシロース（アルドース）還元酵素及びキシリトール脱水素酵素、すなわちＰｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓのＸＹＬ１及びＸＹＬ２、をコードする遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに発現させることに関する（ＵＳ５，８６６，３８２；ＷＯ９５／１３３６２；及びＷＯ９７／４２３０７）。この方法は、キシロースに対してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖を可能にしたが、主にＸＲ及びＸＤＨの間の酸化還元不均衡の結果として、一般的にエタノール生産性及び／または収量が低く、キシリトールの生産が多いという欠点がある。
【０００６】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ若しくは関連酵母または糸状菌にＸＩを発現させることにより、酸化還元不均衡及びその結果としてのキシリトール生産と分泌を回避することができるであろう。数種の細菌のキシロース異性化酵素遺伝子がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに挿入されたが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて中等温度好性原核生物のＸＩを発現させても、活性のあるＸＩを生じなかった（Amore and Hollenverg, 1989, Nucleic Acids Res. 17:7515 ; Amore et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol.30:351-357; Chan et al., 1986, Biotechnol. Lett 8:231-234;Chan et al., 1989,Appl.Microbiol.Biotechnol. 31:524-528; Ho et al., 1983, Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 42 : 2167 ; Hollenberg, 1987, EBC Symposium on Brewer's Yeast, Helsinki(Finland), 24-25 Nov 1986 ; Sarthy et al., 1987, Appl. Envion. Microbiol. 53:1996-2000 ; Ueng et al., 1985, Biotechnol. Lett. 7: 153-158）。しかし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに発現させた好熱性細菌の二種のＸＩは８５℃において１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇの比活性を示した（Bao et al.,1999,Weishengwu-Xuebao 39:49-54;Walfridson et al.,1996,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190）。しかし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの生理的温度（２０−３５℃）では、この活性のわずか数％しか維持できず、キシロースから有効にアルコールを発酵するには不十分であった。従って、生理的条件下において十分なＸＩ活性を提供して、炭素源としてキシロースを利用することを可能とするように、酵母で発現することができるＸＩをコードする核酸に対する要求は依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳ５，８６６，３８２
【特許文献２】ＷＯ９５／１３３６２
【特許文献３】ＷＯ９７／４２３０７
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】W.M.van Gulik et al.,Biotechnol Bioeng. Vol.68, No.6, June 20,2000
【非特許文献２】Ｚａｌｄｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．, 2001, Appl.Microbiol.Biotechnol.56;17-34）
【非特許文献３】more and Hollenverg, 1989, Nucleic Acids Res. 17:7515
【非特許文献４】Amore et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol.30:351-357
【非特許文献５】Chan et al., 1986, Biotechnol. Lett 8:231-234
【非特許文献６】Chan et al., 1989,Appl.Microbiol.Biotechnol. 31:524-528
【非特許文献７】Ho et al., 1983, Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 42 : 2167
【非特許文献８】Hollenberg, 1987, EBC Symposium on Brewer's Yeast, Helsinki(Finland), 24-25 Nov 1986
【非特許文献９】Sarthy et al., 1987, Appl. Envion. Microbiol. 53:1996-2000
【非特許文献１０】Ueng et al., 1985, Biotechnol. Lett. 7: 153-158
【非特許文献１１】Bao et al.,1999,Weishengwu-Xuebao 39:49-54;Walfridson et al.,1996,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
［発明の説明］
（定義）
キシロース異性化酵素
本明細書において、酵素「キシロース異性化酵素」（ＥＣ５．３．１．５）は、Ｄ−キシロースのＤ−キシルロースへのの直接の異性化、及びその逆の直接の異性化を触媒する酵素として定義される。この酵素はまた、Ｄ−キシロースケト異性化酵素としても知られている。一部のキシロース異性化酵素は、Ｄ−グルコース及びＤ−フルクトースの間の変換を触媒することもできるので、時にはグルコース異性化酵素とも呼ばれる。キシロース異性化酵素は補因子としてマグネシウムを必要とする。本発明のキシロース異性化酵素はさらに後述するアミノ酸配列によって定義される。同様に、キシロース異性化酵素はこの酵素をコードするヌクレオチド配列並びに後述されるキシロース異性化酵素をコードする対照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。
【００１０】
本明細書において、キシロース異性化酵素活性の単位（Ｕ）は、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０），１０ｍＭキシロース及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む反応混合物中、３７℃で、１分間に１ｎｍｏｌのキシルロースを生産する酵素の量として定義される。生成したキシルロースは、Ｄｉｓｃｈｅ ａｎｄ Ｂｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ（1951,J.Biol.Chem.192:583-587）の方法または実施例に記述したＨＰＬＣにより測定した。
【００１１】
配列の同一性及び類似性
本明細書において配列同一性（sequence identity）とは、配列比較により決定される、二以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク）配列または二以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の関係として定義される。この分野で、「同一性」は、場合によって、アミノ酸配列又は核酸配列の配列間の一致により決定される、アミノ酸または核酸配列間の配列関連性（sequence relatedness）の程度も意味している。二つのアミノ酸配列の「類似性（similarity）」は、あるポリペプチドの他のポリペプチドに対する、アミノ酸配列及び保存的置換アミノ酸を比較して決定される。「同一性」及び「類似性」は、限定はしないが以下に記述されている方法を含む既知方法により容易に計算することができる（Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994;Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, g., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073(1988）。
【００１２】
同一性を決める望ましい方法は、試験する配列間に最大の一致が得られるように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、一般に使用可能なコンピュータプログラムとして作成される。二つの配列間の同一性及び類似性を決定するための望ましいコンピュータプログラム方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BestFit, BLASTP, BLASTN,及びFASTA(Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990）が含まれる。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩ及びその他のサイトから誰でも入手できる（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990）。よく知られたＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性決定に使用することができる。
【００１３】
ポリペプチド配列比較のための望ましいパラメーターには以下のアルゴリズムが含まれる：Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453 (1970);Comparison matrix:BLOSSUM62 from Hentikoff and Hentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919(1992);Gap Penalty:12;及びGap Length Penalty:4。これらのパラメーターを使用する有用なプログラムはＭａｄｉｓｏｎ，ＷＩにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐの「Ｏｇａｐ」プログラムとして一般に入手することができる。既述のパラメーターはアミノ酸比較（エンドギャップに対するペナルティーなし）のためのデホルトパラメーターである。
【００１４】
核酸比較のための望ましいパラメーターは以下のアルゴリズムを含む：アルゴリズム：Needlemann and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970);Comparison matrix：一致＝＋１０、不一致＝０；Gap Penalty:50;Gap Length Penalty:3。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧａｐプログラムとして入手できる。上記に示したものは核酸比較のためのデホルトパラメーターである。任意に、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れることもでき、このことは、当業者には明らかである。保存的アミノ酸置換とは類似の側鎖を持つ残基の互換性のことである。例えば、脂肪族側鎖をもつアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；ヒドロキシ脂肪族側鎖を持つアミノ酸の群はセリン及びトレオニン；アミノ基を含む側鎖を持つアミノ酸の群はアスパラギン及びグルタミン；芳香族側鎖を持つアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；塩基性側鎖を持つアミノ酸の群はリシン、アルギニン、及びヒスチジン；硫黄を含む側鎖を持つアミノ酸の群はシステイン及びメチオニンである。望ましい保存的アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書において開示したアミノ酸配列の置換変異体は、開示配列中の少なくとも一つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。望ましくはアミノ酸の変換は保存的である。天然に存在するアミノ酸の望ましい保存置換は以下のようなものである：アラニンからセリンへ；アルギニンからリシンへ；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸へ；システインからセリンまたはアラニンへ；グルタミンからアスパラギンへ；グルタミン酸からアスパラギン酸へ；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへ；イソロイシンからロイシンまたはバリンへ；ロイシンからイソロイシンまたはバリンへ；リシンからアルギニン；グルタミンまたはグルタミン酸；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからメチオニン、ロイシンまたはチロシンへ；セリンからトレオニンへ；トレオニンからセリンへ；トリプトファンからチロシンへ；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへ；及びバリンからイソロイシンまたはロイシン。
【００１５】
核酸配列のハイブリッド形成
本発明のキシロース異性化酵素またはキシルロースキナーゼをコードする核酸配列は、中等度のまたは望ましくは厳密なハイブリッド形成条件下に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のヌクレオチド配列それぞれとハイブリッド形成する能力によって規定することもできる。厳密なハイブリッド形成条件とは、少なくとも約２５、望ましくは約５０ヌクレオチド、７５または１００及び最も望ましくは約２００またはそれ以上のヌクレオチドの核酸配列を、約６５℃の温度において、１Ｍの塩、望ましくは６ｘＳＳＣまたは同等のイオン強度を持つその他の溶液中でハイブリッド形成させることができ、そして０．１Ｍの塩、またはそれ以下、望ましくは０．２ｘＳＳＣまたは同等のイオン強度を持つその他の溶液中で６５℃において洗浄する条件とここでは定義する。望ましくは、ハイブリッド形成は終夜、すなわち少なくとも１０時間行い、望ましくは、洗浄は洗浄液を少なくとも２回交換して少なくとも１時間行う。この条件により、通常約９０％またはそれ以上の配列同一性を持つ配列との特異的ハイブリッド形成が可能であろう。
【００１６】
中等度の条件とは、少なくとも５０ヌクレオチド、望ましくは約２００またはそれ以上のヌクレオチドの配列を、約１Ｍ塩を含む溶液、望ましくは６ｘＳＳＣまたは同等のイオン強度のその他の溶液の中で約４５℃の温度においてハイブリッド形成させ、そして約１Ｍ塩を含む溶液、望ましくは６ｘＳＳＣまたは相当するイオン強度のその他の溶液の中で室温において洗浄する条件とここでは定義する。望ましくは、ハイブリッド形成は終夜、すなわち少なくとも１０時間行い、望ましくは、洗浄は洗浄液を少なくとも２回交換して少なくとも１時間行う。この条件により、通常約５０％までの配列同一性を持つ配列との特異的ハイブリッド形成が可能であろう。当業者は、５０％及び９０％の間の同一性をもつ配列を特異的に同定するためにこれらのハイブリッド形成条件を変更できるであろう。
【００１７】
作動的連結
本明細書で使用される「作動的に連結した」とは、機能的に関連するポリヌクレオチド配列の連結のことである。他の核酸配列との機能的な関連を持って配置されている場合に、核酸は「作動的に連結している」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響するならば、コード配列と作動的に連結している。作動的に連結したとは、典型的には、連結したＤＮＡ配列同士が隣接しており、二個のタンパクコード領域を結合する必要がある場合には、連続し、読み枠内にあることを意味する。
【００１８】
プロモーター
本明細書で使用される「プロモーター」とは、転写の方向の点で遺伝子の転写開始部位の上流に存在する１またはそれ以上の遺伝子の転写を調節する機能を持つ核酸フラグメントであって、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、転写開始部位、及び限定はしないが、転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化タンパク結合部位を含むその他のＤＮＡ配列、並びにプロモーターの転写の量を直接的若しくは間接的に調節することが当業者には既知のその他のヌクレオチドの配列によって構造的に同定される。「構成的」プロモーターはほとんどの環境及び発生条件において活性であるプロモーターである。「誘導的」プロモーターは環境及び発生が調節されたときに活性となるプロモーターである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】炭素源として２５ｍＭガラクトース及び１００ｍＭキシロースを含む培地で増殖した形質転換Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖曲線。形質転換体ｐＹｅｓは挿入のない酵母発現ベクターを含む。形質転換体１４．３，１６．２．１及び１６．２．２はＰｉｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．Ｅ２キシロース異性化酵素コード配列を含むｐＹＥＳベクターで形質転換されている。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
［発明の詳細な説明］
本発明の最初の態様は、キシロースからキシルロースへ異性化する能力を持つ形質転換宿主細胞に関するものである。キシロースからキシルロースへ異性化する能力は、キシロース異性化酵素をコードする核酸配列を含む核酸構築物で宿主細胞を形質転換することにより付与される。キシロースからキシルロースへ異性化する形質転換宿主細胞の能力は、キシロースからキシルロースへの直接の異性化である。これは、それぞれキシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵素に触媒されてキシリトール中間体を経由してキシロースからキシルロースへ変換する２ステップ反応に対して、キシロース異性化酵素により触媒される１ステップ反応によりキシロースがキシルロースへ異性化したことを意味すると理解される。
【００２１】
核酸配列は、形質転換宿主細胞中で活性形態で発現するキシロース異性化酵素をコードすることが望ましい。従って、宿主細胞中で核酸配列が発現することにより、２５℃でタンパクｍｇ当り少なくとも１０Ｕのキシロース異性化酵素比活性、望ましくは２５℃で少なくとも２０，２５，３０，５０，１００，２００または３００Ｕ／ｍｇ、の比活性を持つキシロース異性化酵素が生産される。本明細書において、形質転換宿主細胞中で発現したキシロース異性化酵素の比活性は、宿主細胞の細胞分解物、例えば、酵母細胞分解物のタンパクｍｇ当りのキシロース異性化酵素活性の量と定義される。キシロース異性化酵素活性の測定、タンパク量、及び細胞分解物の調製については実施例１に記述されている。また、比活性は、実施例４に示すように測定することもできる。従って、宿主細胞中にヌクレオチド配列を発現させることにより、３０℃で少なくとも５０Ｕ／ｍｇタンパクのキシロース異性化酵素活性、望ましくは３０℃で少なくとも１００，２００，５００または７５０Ｕ／ｍｇの比活性を持つキシロース異性化酵素が生成される。
【００２２】
望ましくは、宿主細胞中にヌクレオチド配列を発現することにより、キシロースに対するＫｍが５０，４０，３０または２５未満のキシロース異性化酵素が得られ、より望ましくは、キシロースに対するＫｍが約２０ｍＭまたはそれ未満である。
【００２３】
キシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列と少なくとも４０，４５，４９，５０，５３，５５，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２のヌクレオチド配列と少なくとも４０，５０，５５，５６，５７，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列；
（ｃ）その相補鎖が、（ａ）または（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（ｄ）遺伝子コードの縮重による、（ｃ）の核酸分子の配列と異なる配列からなるヌクレオチド配列：
からなる群から選択することができる。
【００２４】
ヌクレオチド配列は、真核生物性キシロース異性化酵素、すなわち真核生物中に天然に存在するキシロース異性化酵素と同じアミノ酸配列を持つキシロース異性化酵素をコードしていることが望ましい。中等温度好性原核性キシロース異性化酵素に比べ、真核生物性キシロース異性化酵素の発現は、酵母のような真核性宿主細胞においてキシロース異性化酵素が活性形態で発現する可能性を高める。ヌクレオチド配列が植物キシロース異性化酵素（例えば、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ由来）または菌（fungal）キシロース異性化酵素（例えば、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｓ由来）をコードするのがより望ましい。但し、真核生物性宿主細胞、特に酵母において酵素的に活性形態で発現する可能性をさらに増加させるためには、ヌクレオチド配列が嫌気性菌のキシロース異性化酵素をコードすることが最も望ましい。Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ，Ｃａｅｃｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ，Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ，またはＲｕｍｉｎｏｍｙｃｅｓ科に属する嫌気性菌のキシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列が最も望ましい。
【００２５】
キシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列で形質転換するための宿主細胞は、細胞の中へ能動的にまたは受動的にキシロースを輸送できる宿主であることが望ましい。宿主細胞は、活性な解糖経路、ペントースリン酸経路を含有していることが望ましく、キシロースから異性化されたキシルロースがピルビン酸に代謝されるようにキシルロースキナーゼを含有していることが望ましい。さらに宿主はピルビン酸を目的とする発酵産物、例えばエタノール、エチレンまたは乳酸に変換するための酵素を含有することが望ましい。望ましい宿主細胞は、天然においてアルコール発酵、望ましくは嫌気性アルコール発酵ができる宿主細胞である。さらに宿主細胞はエタノール及び乳酸、酢酸、ギ酸のような有機酸、及びフルフラール及びヒドロキシメチルフルフラールのような糖分解産物に対して高度な耐性を持っていることが望ましい。宿主細胞のこれらの特性または活性は天然に宿主細胞中に存在することもあるが、遺伝子操作により導入または修飾することができる。適する宿主細胞は細菌または真菌のような微生物であるが、宿主として最も適当なのは酵母または糸状菌である。
【００２６】
本明細書において酵母は、真核性微生物として定義され、主として単細胞の形で増殖するＥｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の全種（Alexopoulos,C.J.,1962,In:Introductory Mycology,John Wiley & Sons,Inc.,New York）を含む。酵母は単細胞葉状体の発芽によっても、また生物体の分裂によっても増殖することができる。宿主細胞として望ましい酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ，Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ，及びＹａｒｒｏｗｉａ種に属する。酵母は、嫌気性発酵、より望ましくは嫌気性アルコール発酵ができるものが望ましい。
【００２７】
本明細書において糸状菌は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の全ての糸状形態を含む真核性微生物として定義される。これらの菌は、キチン、セルロース、及びその他の複合多糖からなる栄養菌糸体によって特徴付けられる。本発明の糸状菌は、形態的、生理的、及び遺伝的に、酵母とは区別される。糸状菌による栄養増殖は菌糸の延長によるものであり、ほとんどの糸状菌の炭素異化は、絶対的好気性による。宿主細胞として望ましい糸状菌はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ，Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ，及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種に属するものである。
【００２８】
数年にわたって、農産糖からバイオ−エタノールを生産するために、種々の生物体の導入が提案されてきた。しかしながら、実用的な主なバイオ−エタノール生産プロセスの全てにおいて、エタノール生産体としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種の酵母を使用し続けてきた。これは工業的プロセスに対するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種の多くの魅力的な特徴、すなわち、高濃度の酸、エタノール及び浸透圧に対する耐性、嫌気的増殖能力、及び当然ではあるが高いアルコール発酵能力に基づくものである。宿主細胞として望ましい酵母の種は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ，Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ，Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ，Ｓ．ｕｖａｒｕｍ，Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ，Ｋ．ｌａｃｔｉｓ，Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ，Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓを含む。
【００２９】
宿主細胞は後に定義する核酸構築物で形質転換され、核酸構築物の一つのコピーを含むものでもよいが、複数のコピーを含むものが望ましい。この核酸構築物はエピソームとして維持され、ＡＲＳ配列のような自律的複製のための配列を含む。適するエピソーム性核酸構築物は、例えば、酵母２μまたはｐＫＤ１（Fleer et al.,1991, Biotechnology 9: 968-975）プラスミドに基づくことができる。しかし、核酸構築物は、宿主細胞のゲノム中に１以上のコピーが組み込まれていることが望ましい。宿主細胞ゲノムへの組み込みは、変則的な組換えによりランダムに生じることもありうるが、菌分子遺伝学の分野でよく知られている相同組換えにより核酸構築物を宿主細胞ゲノムへ組み込むことが望ましい（例えば、ＷＯ９０／１４４２３，ＥＰ−Ａ−０ ４８１ ００８，ＥＰ−Ａ−０ ６３５ ５７４及びＵＳ６，２６５，１８６参照）。
【００３０】
本発明による望ましい形質転換宿主細胞において、核酸構築物は、宿主細胞に、炭素源として、望ましくは唯一の炭素源としてのキシロースに対して、望ましくは嫌気的条件下で増殖する能力を付与する。それにより形質転換宿主は、好ましくはキシリトールを本質的に生産せず、例えば、当該宿主によって生産されるキシリトールは、検出限界以下、またはモルベースで消費した炭素の５，２，１％未満である。その形質転換宿主細胞は、唯一の炭素源としてのキシロースに対して少なくとも０．０１，０．０２，０．０５，０．１または０．２ｈ−１の速度で増殖する能力を有する。このように本発明の形質転換宿主細胞は、既に定義した比活性レベルでキシロース異性化酵素を発現する。
【００３１】
宿主細胞は、（ａ）宿主細胞中へのキシロース輸送の増加；（ｂ）キシルロースキナーゼ活性の増加；（ｃ）ペントースリン酸経路の流量の増加；（ｄ）カタボライト抑制に対する感受性の減少；（ｅ）エタノール、浸透圧または有機酸に対する耐性の増加；及び（ｆ）副生物生産の減少、からなる群から選択された特徴の一つまたはそれ以上を生じる遺伝子修飾をさらに含むことができる。副生物は目的とする発酵産物以外の炭素含有分子を意味すると理解され、例えば、キシリトール、グリセロール及び／または酢酸が含まれる。そのような遺伝子修飾は、古典的突然変異誘起及びスクリーニング及び／または目的変異体の選別により導入することができる。その他に、遺伝子修飾は、外来性遺伝子の過剰発現及び／または異種遺伝子の発現及び／または内在性遺伝子の不活化を含むことができる。これらの遺伝子は、ヘキソースまたはペントーストランスポーター；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（XKSI Deng and Ho, 1990, Appl. Biochem. Biotechnol. 24-25: 193-199）またはＰｉｒｏｍｙｃｅｓ（ｘｙｌＢ，すなわちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）のキシルロースキナーゼのようなキシルロースキナーゼ；トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ１）またはトランスケトラーゼ（ＴＫＬ１）のようなペントースリン酸経路の酵素（例えば、Ｍｅｉｎａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｕｐｐｌ，２：４５参照）、解糖酵素、アルコール脱水素酵素のようなアルコール代謝酵素、をコードする遺伝子から選択されることが望ましい。不活化される望ましい内在性遺伝子としては、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＨＸＫ２遺伝子（Diderich et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 1587-1593参照）のようなヘキソースキナーゼ；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＩＧ１またはＭＩＧ２遺伝子；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＥ３遺伝子（Traff et al.,2001,Appl.Environm.Microbiol.67:5668-5674）のような（非特異的）アルドース還元酵素遺伝子；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセロール−リン酸脱水素酵素１及び／または２遺伝子のようなグリセロール代謝に関係する酵素の遺伝子；またはその他の宿主の種の遺伝子の（ハイブリッド形成）相同体、が含まれる。宿主細胞のキシロース代謝に関するその他の望ましい修飾についてはＺａｌｄｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．（２００１、前出）に総説されている。
【００３２】
その他の態様において、本発明は、エタノール以外の発酵産物を生産するための形質転換宿主細胞に関係している。その非エタノール発酵産物は原則として酵母または糸状菌のような真核性微生物によって生産することができる大量のまたは精製した化学品である。そのような発酵産物としては、例えば、乳酸、酢酸、コハク酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質及びセファロスポリンがある。
【００３３】
本発明の核酸構築物による宿主細胞の形質転換及び宿主細胞、望ましくは酵母の前記のようなその他の遺伝子修飾は当業者によく知られている方法により行われる。その方法は例えば標準的教科書から知ることができる、例えば、Sambrook and Russel(2001)“Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd edition)”,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, または F. Ausubel et al, eds.,“Current protocols in molecular biology”,Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)。菌宿主細胞の形質転換及び遺伝子修飾の方法は、例えば、ＥＰ−Ａ−０ ６３５ ５７４，ＷＯ９８／４６７７２，ＷＯ９９／６０１０２及びＷＯ００／３７６７１から知ることができる。
【００３４】
その他の態様において、本発明は、前記で定義したキシロース異性化酵素をコードし、前記の宿主細胞の形質転換に使用されるヌクレオチド配列からなる核酸構築物に関する。核酸構築物において、キシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列は、後述するように宿主細胞中でヌクレオチド配列の転写を調節し開始するためのプロモーターに作動的に連結していることが望ましい。このプロモーターは、宿主細胞にキシロースをキシルロースに異性化する能力を付与するために、宿主細胞中でキシロース異性化酵素を十分に発現できることが望ましい。プロモーターは、前記のような宿主細胞中で、特異的キシロース異性化酵素を生じさせるものが望ましい。本発明の核酸構築物中において有用なプロモーターは、構成的及び誘導的な天然プロモーター並びに人工的プロモーターである。さらに本発明に使用するための望ましいプロモーターは、カタボライト（グルコース）抑制に感受性がなくそして／または誘導のためのキシロースを必要としないものが望ましいであろう。このような特徴を持つプロモーターは、広く入手可能であり、同業者には知られている。そのようなプロモーターの適当な例は、例えば、酵母のリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＫ）、トリオースリン酸異性化酵素（ＴＰＩ）、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤ，ＴＤＨ３またはＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、ホスホグリンセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターのような解糖遺伝子の酵母プロモーターである。そのようなプロモーターに関する詳細は（ＷＯ９３／０３１５９）に見ることができる。その他の有用なプロモーターは、リボソームタンパクコード遺伝子プロモーター、ラクターゼ遺伝子プロモーター（ＬＡＣ４）、アルコール脱水素酵素プロモーター（ＡＤＨ１，ＡＤＨ４，など）、及びエノラーゼプロモーター（ＥＮＯ）である。その他の、構成的及び誘導的プロモーター及びエンハンサーまたは上流活性化配列は当業者に知られているであろう。本発明の核酸構築物に使用されるプロモーターは、必要に応じて、修飾して、その調節特徴を変更することができる。キシロース異性化酵素を発現させるために核酸構築物に使用されるプロモーターは、キシロース異性化酵素を発現させる宿主細胞と同種であることが望ましい。
【００３５】
核酸構築物において、キシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列の３’−末端は、転写ターミネーター配列に作動的に連結していることが望ましい。このターミネーター配列は、選択した宿主細胞、例えば選択した酵母種において作動し得ることが望ましい。いずれの場合にも、ターミネーターの選択は重要ではなく、ターミネーターは酵母ではない真核生物の遺伝子の場合にしばしば作動するが、酵母遺伝子由来のものを用いることができる。転写終結配列はさらにポリアデニル化シグナルを含むことが望ましい。
【００３６】
任意に、核酸構築物中に選択マーカーを入れることができる。本明細書で使用する用語「マーカー」とは、マーカーを含有する宿主細胞を、選別、またはスクリーニングすることができる特徴または表現型をコードする遺伝子のことである。マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子とすることができ、それによって形質転換されていない細胞の中から形質転換された細胞を選別するために適当な抗生物質を使用することができる。適当な抗生物質耐性マーカーの例としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、３’−Ｏ−ホスホトランスフェラーゼＩＩ（カナマイシン、ネオマイシン及びＧ４１８耐性）が含まれる。抗生物質耐性マーカーは、倍数体宿主細胞の形質転換には最も便利であるが、しかし栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３，ＴＲＰ１，ＬＥＵ２）またはＳ．ｐｏｍｂｅ ＴＰＩ遺伝子（Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｐ Ｒ，１９８５，Ｇｅｎｅ４０：１２５−１３０に記載）のような非抗生物質耐性マーカーが使用されることが望ましい。望ましい態様において、核酸構築物により形質転換された宿主細胞はマーカー遺伝子を含まない。マーカー遺伝子を含まない組換え微生物宿主細胞を作る方法はＥＰ−Ａ−０ ６３５ ５７４に開示されており、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子または酵母ＵＲＡ３及びＬＹＳ２遺伝子のような二方向性マーカーの使用に基づいている。そのほかには、形質転換細胞をスクリーニングできるように、緑色蛍光タンパク、ｌａｃＺ，ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−グルクロニダーゼのようなスクリーニングに役立つマーカーを本発明の核酸構築物の中に組み込むことができる。
【００３７】
さらに任意に本発明の核酸構築物中に存在することができる配列としては、これらに限定はしないが、一つまたはそれ以上のリーダー配列、エンハンサー、組み込み因子、並びに／或いはレポーター遺伝子、イントロン配列、セントロメア、テロメア及び／またはマトリックス接着（ＭＡＲ）配列がある。本発明の核酸構築物はさらに、ＡＲＳ配列のような自己複製のための配列を含むことができる。適するエピソーム核酸構築物は、例えば、酵母２μまたはｐＫＤ１（Fleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968-975）プラスミドを基にすることができる。その他に核酸構築物は、望ましくは相同組換えによる、組み込みのための配列を含むことができる。従ってその配列は、宿主細胞のゲノム中の組み込みの標的部位に対して相同的な配列である。本発明の核酸構築物は、本来既知方法により提供することができ、その方法には核酸／核酸配列を制限及び連結するような技術を含み、その参考文献は例えば、Sambrook and Russel (2001) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, またはF. Ausubel et al., eds.,”Current protocols in molecular biology”,Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)のような標準的教科書に示されている。
【００３８】
そのほかの態様において、本発明はキシロース異性化酵素をコードするヌクレオチドを含む核酸分子に関する。この核酸分子は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列と少なくとも５０，５３，５４，５５，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２のヌクレオチド配列と少なくとも５０，５６，５７，５８，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｃ）その相補鎖が、（ａ）または（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズする核酸分子；及び
（ｄ）遺伝子コードの縮重により（ｃ）の核酸分子配列と異なる配列からなる核酸分子；
からなる群から選択されることが望ましい。
【００３９】
また、（ａ）の核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列と少なくとも６７，６８，６９，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることができる。（ｃ）の核酸分子は望ましくは前記に定義した中等度の条件、より望ましくは厳密な条件の下にハイブリッド形成する。核酸分子は真核生物由来であることが望ましく、菌のような真核微生物由来であることがより望ましく、前記の嫌気性菌のような嫌気性菌由来であることが最も望ましい。
【００４０】
本発明の更に他の態様は、キシルロースキナーゼ、望ましくはＤ−キシルロースキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関するものである。本明細書において、Ｄ−キシルロースキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１７；Ｄ−キシルロキナーゼとも呼ばれる）は、Ｄ−キシルロースのキシルロース−５−リン酸への変換を触媒する酵素である。この核酸分子は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸配列と少なくとも４５，４７，４８，４９，５０，５５，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のヌクレオチド配列と少なくとも３０，３７，３８，３９，４０，５０，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる核酸分子；
（ｃ）その相補鎖が、（ａ）または（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズする核酸分子；及び
（ｄ）遺伝子コードの縮重による、（ｃ）の核酸分子配列と異なる配列からなる核酸分子：
からなる群から選択されることが望ましい。
【００４１】
また、（ａ）の核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸配列と少なくとも６４，６５，６６，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることができる。（ｃ）の核酸分子は望ましくは前記で定義した中等度の条件、より望ましくは厳密な条件の下にハイブリッド形成する。核酸分子は、真核生物由来であることが望ましく、菌のような真核微生物由来であることがより望ましく、前記の嫌気性菌のような嫌気性菌由来であることが最も望ましい。
【００４２】
そのほかの態様において、本発明は、本発明の形質転換宿主細胞がキシロースのようなキシロース資源を含む炭素源の発酵のために使用される、発酵プロセスに関するものである。発酵培地中の炭素源は、キシロース資源に加えてグルコース資源も含むことができる。キシロースまたはグルコースの資源としては、キシロースまたはグルコースそのものでもよく、例えば、リグノセルロース、キシラン、セルロース、デンプンなどのようなキシロースまたはグルコース単位からなる炭水化物のオリゴマーまたはポリマーでもよい。そのような炭水化物からキシロースまたはグルコース単位を遊離させるために（キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼなどのような）、適当な炭水化物分解酵素を、発酵培地に加えてもよく、形質転換宿主細胞に生産させてもよい。後者の場合には、形質転換宿主細胞に遺伝子操作を施し、その炭水化物分解酵素を生産させ、分泌させることができる。望ましいプロセスにおいて、形質転換宿主細胞は、キシロース及びグルコースを共に、望ましくは同時に発酵し、その場合にはグルコース抑制に非感受性の形質転換宿主細胞を使用してジオキシ増殖を阻害することが望ましい。炭素源としてのキシロース（及びグルコース）に加えて、発酵培地はさらに形質転換宿主細胞の増殖に必要な適当な成分を含むであろう。酵母などの微生物を増殖するための発酵培地の組成は、当業者にはよく知られている。
【００４３】
発酵プロセスは、エタノール、乳酸、酢酸、コハク酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ペニシリンＧ若しくはペニシリンＶ及びそれらの発酵誘導体のようなβ−ラクタム並びにセファロスポリンなどの発酵産物を生産するためのプロセスである。発酵プロセスは、好気的または嫌気的な発酵プロセスとすることができる。本明細書において嫌気的発酵プロセスとは、発酵プロセスが無酸素の状態でまたは実質的に酸素が消費されないで（例えば、５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満）で行われ、有機分子が、電子供与体及び電子受容体のいずれとしても働く発酵プロセスと定義される。酸素が存在しないところでは、糖分解及びバイオマス形成において生成したＮＡＤＨは、酸化的リン酸化により酸化することはできない。この問題を解決するために多くの微生物は電子及び水素受容体としてピルビン酸またはその誘導体の一つを利用することによって、ＮＡＤ＋を再生する。従って、望ましい嫌気的発酵プロセスにおいて、ピルビン酸は、電子（及び水素）受容体として使用され、エタノール、乳酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、酢酸またはコハク酸のような発酵産物へと還元される。
【００４４】
発酵プロセスは、形質転換宿主細胞にとって最適の温度で行うことが望ましい。従って、ほとんどの酵母または菌の宿主細胞に対して、発酵プロセスは３８℃未満の温度で実施される。酵母または糸状菌の宿主細胞に対して、発酵プロセスは３５，３３，３０または２８℃未満、且つ２０，２２，または２５℃を超える温度で実施されることが望ましい。
【００４５】
望ましいプロセスは、（ａ）前記に定義した形質転換宿主細胞と共にキシロース資源を含む培地を発酵することによって、宿主細胞にキシロースをエタノールに発酵させ；任意に、（ｂ）エタノールを回収するステップを含むエタノールの生産プロセスである。発酵培地は、グルコース資源を含むことができ、それもエタノールに発酵される。このプロセスにおいて、エタノールの容積生産性は、少なくとも０．５，１．０，１．５，２．０，２．５，３．０，５．０または１０．０ｇエタノール／リットル／時間であることが望ましい。このプロセスにおけるキシロース及び／またはグルコースに対するエタノール収率は、少なくとも５０，６０，７０，９０，９５または９８％であることが望ましい。本明細書においてエタノール収率は、理論的収量（グルコース及びキシロースについて０．５１ｇエタノール／ｇグルコースまたはキシロース）のパーセンテージとして定義する。
【００４６】
その他の態様において、本発明は、乳酸、酢酸、コハク酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物の生産プロセスに関する。このプロセスは、（ａ）前記に定義した形質転換宿主細胞と共にキシロース資源を含む培地を発酵することにより、宿主細胞に、キシロールを発酵産物に発酵させ、任意に、（ｂ）発酵産物を回収する、ステップを含むことが望ましい。望ましいプロセスにおいて、培地はグルコース資源も含む。
【実施例】
【００４７】
［実施例１］Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓキシラナーゼ異性化酵素及びキシルロースキナーゼｃＤＮＡのクローニング
（生物及び増殖条件）
インド象の糞から単離した嫌気性菌Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２（ＡＴＣＣ７６７６２）を、Ｎ２／ＣＯ２（８０％／２０％）中、３９℃で、種々の炭素源を添加したＭ２培地で嫌気的に増殖した（２４）。使用した炭素源は、アビセル（微結晶セルロース、タイプＰＨ１０５、Ｓｅｒｖａ，ドイツ）、フルクトースまたはキシロース（全て０．５％、ｗ／ｖ）であった。増殖が止まった後（水素の発生により判断した）、細胞を遠心分離（１５，０００ｘｇ，４℃，１５分間）またはナイロンガーゼ（３０μｍ孔径）による濾過により回収した。
【００４８】
（無細胞抽出物の調製）
菌細胞を脱イオン水で洗い、培地成分を除去した。細胞を液体窒素中で凍結し、次いで、乳鉢中で、硝子ビーズ（０．１０−０．１１ｍｍ径）ですりつぶして、無細胞抽出物を調製した。Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．０）を粉末に加え（１：１，ｗ／ｖ）そして１５分間解凍した後、懸濁液を遠心分離した（１８，０００ｘｇ，４℃，１５分間）。透明な上清を細胞内酵素の原料として使用した。
【００４９】
（酵素検定）
キシロース異性化酵素活性は、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０），１０ｍＭキシロース，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び適当量の無細胞抽出物を含む反応混合物中３７℃で検定した。生成したキシルロースの量は、システイン−カルバゾール法（９）により測定した。キシルロースキナーゼ及びキシロース還元酵素活性はＷｉｔｔｅｖｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（２８）による記述にしたがって検定した。活性の１単位は、検定条件の下に、毎分１ ｎｍｏｌのキシルロースを生産する酵素量と定義される。生成したキシルロースは、Ｄｉｓｃｈｅ ａｎｄ Ｂｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ（Dische and Borenfreund, 1951, J. Biol. Chem. 192: 583-587）の方法によるか、または８０℃のＢｉｏｒａｄ ＨＰＸ−８７Ｎカラムを使用し、溶出液として０．０１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４を使用して０．６ｍｌ／ｍｉｎで溶出するＨＰＬＣにより測定した。キシロース及びキシルロースは、内部温度６０℃で屈折計により測定した。
【００５０】
比活性は、タンパク１ｍｇ当りの単位として示す。タンパクは、ウシγ−グロブリンを標準としてＢｉｏ−Ｒａｄタンパク試薬（Bio-Rad Laboratories,Richmond,CA,米国）で測定した。
【００５１】
（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２ｃＤＮＡライブラリーのランダム配列）
既に記述されている（２）ベクターラムダＺＡＰＩＩ中に構築したｃＤＮＡライブラリーを使用した。このライブラリーの一部をＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（Stratagene,La Jolla,CA,米国）による大量切除（mass excission）によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−クローンに変換した。無作為に取り出したクローンをＭ１３逆プライマーを使用して配列解析し、５’部分の配列を得た。不完全ｃＤＮＡを使用してプローブを合成し、ライブラリーを再スクリーニングするために使用した。全長配列を得るためにｐＵＣ１８にサブクローニングを生成さた。配列分析は、ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅターミネーターサイクルシークエンス即時反応ＤＮＡシークエンスキット（Perkin-Elmer Applied Biosystems）を使用してＡＢＩプリズム３１０自動化シークエンサーで実施した。
【００５２】
（結果）
嫌気性菌Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２のｃＤＮＡライブラリーから無作為に選択したクローンを配列解析し、その結果キシロース異性化酵素及びＤ−キシルロキナーゼ遺伝子にそれぞれ高い相同性を示す二つのクローン（ｐＨ９７及びｐＡＫ４４）を得た。これらのクローンを詳細に解析した。
【００５３】
クローンｐＨ９７は完全なＯＲＦを含有していなかったので、クローンｐＨ９７の配列データに基づいて設計したプローブを使用してｃＤＮＡライブラリーを再度スクリーニングした。この結果１６６９ｂｐの挿入配列を有するクローンｐＲ３を得た。キシロース異性化酵素に高い類似性のある４３７アミノ酸のタンパクをコードするＯＲＦを同定することができた。５’非翻訳領域はわずか４ｂｐを含むのみであったが、推定開始メチオニン残基は、既知キシロース異性化酵素配列の整列によく一致した。３’非翻訳領域は３５１ｂｐの長さであり、嫌気性菌で典型的である、高いＡＴ含有率を有していた。ＯＲＦは、基質との相互作用（触媒トリアド（catalytic triad）Ｈｉｓ１０２，Ａｓｐ１０５，Ａｓｐ３４０及びＬｙｓ２３５）及びマグネシウムとの結合（Ｇｌｕ２３２）に重要であることが示されているアミノ酸を含有していた（１４，２６）。さらに、キシロース異性化酵素のために開発した（２０）２個の符号パターン（残基１８５−１９４、及び２３０−２３７）が存在した。このＰｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２キシロース異性化酵素（ＸｙｌＡ）はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａの酵素（５２％同一性、６８％類似性）及びＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（４９％同一性、６７％類似性）と高い相同性を示す。ｃＤＮＡ配列から推定されるポリペプチドは４９，３９５Ｄａの分子量に相当し、５．２の計算値ｐＩを有す。
【００５４】
二番目のクローンｐＡＫ４４は、２０４１ｂｐの挿入を有し、５３，１５８Ｄａの分子量及び５．０のｐＩを持つ４９４アミノ酸のタンパクをコードする完全ＯＲＦを含有した。最初のメチオニンに先行して１１１ｂｐの５’非翻訳領域が存在したが、３’非翻訳領域は４４５ ｂｐからなっていた。両領域はＡＴが多い。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ調査によりキシルロキナーゼとの高い類似性が明らかにされた。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｅｆｉａ ｅｔ ａｌ．（２２）により定義された２個のリン酸共通領域が部分整列に示されるように位置６−２３及び２５４−２７０に認められた。さらにＰｒｏｓｉｔｅデーターベースに記述されているこの糖キナーゼファミリーの記号が同定された（１３１−１４５及び３５１−３７２）。Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２キシルロキナーゼ（ＸｙｌＢ）はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａのＸｙｌＢと高い相同性を示した（４６％同一性、６４％類似性）。
【００５５】
［実施例２］酵母発現ベクターの構築
Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２のキシロース異性化酵素のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の発現
Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２のｃＤＮＡをｐｆｕポリメラーゼ（Stratgene）を使用するＰＣＲ反応に使用した。プライマーはキシロース異性化酵素の５’及び３’末端の配列を使用して設計し、ＳｆｉＩ及びＸｂａＩ制限部位を含めた。ＰＣＲ産物をｐＰＩＣＺαベクター（Invitrogen,Carlsbad,CA,米国）中にクローニングした。キシロース異性化酵素を取り出すために、ｐＰＩＣＺαベクターをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化した。消化産物をｐＹｅｓ２ベクター（Invitrogen）に連結した。キシロース異性化酵素を含むｐＹｅｓ２プラスミドをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（株ＢＪ１９９１，Ｂｅｔｈ Ｊｏｈｎｓ，ＵｖＡから供与）に導入した。この株の遺伝型は：ｍａｔα，ｌｅｕ２，ｔｒｐ１，ｕｒａ３−２５１，ｐｒｂ１−１１２２及びｐｅｐ４−３、である。形質転換細胞をＳＣプレート（０．６７％ ＹＮＢ培地＋０．０５％ Ｌ−Ｌｅｕ＋０．０５％ Ｌ−Ｔｒｐ＋２％グルコース＋２％アガロース）に接種した。
【００５６】
形質転換Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞をグルコース培地で２５℃で７２時間増殖した（グルコースの代わりにラフィノースを使用することができる）。細胞を回収し、グルコースの代わりにガラクトースを加えたＳＣ培地中に再懸濁した。８時間の誘導後、細胞を回収し、硝子ビーズ（０．１０−０．１１ｍｍ径）及び「破壊緩衝液」（５０ｍＭリン酸緩衝液＋５％グリセロール＋プロテアーゼ阻害剤）を使用して分解した。分解の後混合物を遠心分離（１８，０００ｘｇ，４℃，１５分間）した。透明上清を使用して前記方法（実施例１）によりキシロース異性化酵素活性を測定した。１０Ｕ／ｍｇタンパクの活性が３７℃において測定された。
【００５７】
［実施例３］キシロース上での形質転換酵母株の増殖
（培地組成）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を下記組成のＳＣ−培地上で増殖した：０．６７％（ｗ／ｖ）酵母窒素塩基；０．０１％（ｗ／ｖ）Ｌ−トリプトファン；０．０１％（ｗ／ｖ）Ｌ−ロイシン及びグルコース、ガラクトースまたはキシロースまたはこれら基質の組合せのいずれか（下記参照）。寒天培地用に培地に２％（ｗ／ｖ）細菌用寒天を加えた。
【００５８】
（増殖実験）
挿入のないｐＹｅｓ２で形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＪ１９９１（遺伝型：ｍａｔα，ｌｅｕ２，ｔｒｐ１，ｕｒａ３−２５１，ｐｒｂ１−１１２２，ｐｅｐ４−３）及びＰｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２キシロース異性化酵素遺伝子を持つｐＹｅｓ２を含む形質転換細胞（１６．２．１；１６．２．２及び１４．３）を、炭素源として１０ｍＭグルコースを含むＳＣ−寒天プレート上で増殖した。コロニーが見えるようになったとき、一つのコロニーを使用して、炭素源として１００ｍＭキシロース及び２５ｍＭガラクトースを含むＳＶＣ液体培地に接種した。ＬＫＢ Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ Ｋ分光光度計を使用して６００ｎｍの光学密度の増加を測定することにより増殖を監視した。
【００５９】
（結果）
増殖実験の結果を図１にまとめた。挿入のないｐＹｅｓ２で形質転換したＢＪ１９９１株の培養は８０時間までＯＤ６００の増加を示した。この後徐々に減少が観察された。これは増殖の末期にしばしば観察される酵母細胞の凝集によるものである。３種の形質転換細胞は、８０時間後も増殖を止めず、少なくとも１５０時間までさらに増加を示した。
【００６０】
［実施例４］Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＰｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２キシロース異性化酵素を構成的に発現するための新規で改良された酵母発現ベクターの構築
キシロース異性化酵素をコードするＰｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２遺伝子を含むｐＰＩＣＺαベクターを、ＶｅｎｔＲ ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）によるＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーはキシロース異性化酵素をコードする遺伝子の５’及び３’配列を使用して設計し、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ部位を含めた。さらに、プライマーはｐＰＩＣＺα構築中に認められるＸｂａＩ部位を除去し、その代わりに終結コドン（ＴＡＡ）を入れて設計した。最終産物は、ｐＰＩＣＺα構築に認められる追加のアミノ酸（ｈｉｓ及びｃ−Ｍｙｃタグ）のない、元のオープンリードフレームを復元するように設計した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで切り出した。最終産物をｐＹＥＳ２（Invitrogen）由来のベクター中にクローニングした。このベクター中において、キシロース異性化酵素の構成的発現を確実にし、それにより培地にガラクトースを加える必要をなくするために、ｐＹＥＳ２中にあるＧＡＬ１プロモーターをＴＰＩ１プロモーターに置換した。ＴＰＩ１プロモーターはプラスミドｐＹＸ０１２（R&D systems）の修飾型からクローニングした。このプロモーターをＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして切り出した。
【００６１】
このＴＰＩ１プロモーター及びキシロース異性化酵素をコードする遺伝子のＰＣＲ産物を共に、ＳｐｅＩ及びＸｂａＩで切り出したｐＹＥＳ２に連結した。このプラスミドを使用してＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄ（Ｐｅｔｅｒ Ｋｏｔｔｅｒ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔより供与）を形質転換した。この株の遺伝型は：ＭａｔＡ ｕｒａ３−５２である。形質転換細胞は、炭素源として２％グルコースを加えたミネラル培地プレート上で選別した（Verduyn et al.:Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts; a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation.(1992) Yeast 8(7): 501-17)。形質転換していない細胞は、このプレート上では増殖できない。
【００６２】
形質転換細胞を、炭素限定恒成分培養において、グルコース／キシロース混合物に対して増殖した。この条件下で増殖した形質転換細胞は、Ｄｅｒｓｔｅｒｓ−Ｈｉｌｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Kinetic characterization of D-xylose isomerases by enzymatic assays using D-sorbitol dehydrogenase. Enz. Microb. Techol. 9 (1987) 145-148）により開発された特異的酵素検定により、高いキシロース異性化活性（３０℃において８００単位／ｍｇ）を示す。形質転換Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の無細胞抽出物中のキシロース異性化酵素のインビトロ活性は、２価カチオン（Ｍｇ２＋またはＣｏ２＋）に依存し、キシロースに対して約２０ｍＭの比較的低いＫｍ値が認められた。
【００６３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核生物性キシロース異性化酵素をコードする核酸配列で形質転換した宿主細胞に関するものである。このキシロース異性化酵素は、宿主細胞で発現し、キシロースをキシルロースに変換する能力を付与する。この宿主細胞は、ペントース含有培地の発酵によるエタノール及びその他の発酵産物の製造プロセスに使用される。さらに本発明は、真核生物性キシロース異性化酵素をコードする核酸配列に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
この数十年間における古典的化石燃料（石油燃料）の大量消費は、高レベルの汚染の原因となっている。さらに、世界中の石油埋蔵量は無限でないことが認識され、このような認識は、環境問題への関心の高まりと相俟って、ＣＯ２排出の６０−９０％減少を実現できるエタノールのような代替燃料の可能性を研究する新しい動きを生んだ。バイオマス由来のエタノールは、多数の種々の資源から得られるヘキソース糖の発酵により生産することができるが、にも拘らず工業的規模の生産または燃料アルコールに向けられる原料は、ショ糖及びトウモロコシデンプンである。これらの原料の欠点は高価なことである。
【０００３】
燃料アルコールの生産拡大には、低コストの供給原料の使用を可能にすることが求められる。現在、植物バイオマスからは唯一リグノセルロース原料がかなり大量に使用可能であり、エタノール生産用の農産物を代替している。リグノセルロース原料の主な発酵可能な糖はグルコース及びキシロースであり、それぞれリグノセルロース中に約４０％及び２５％含有される。しかし、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのようなアルコール発酵ができる酵母のほとんどは、炭素源としてキシロースを使用できない。さらに、高収量及び高生産性でキシロースをエタノールに発酵できる微生物は知られていない。リグノセルロース加水分解産物からエタノールを商業的に生産することを可能にするには、これらの性質を持つ微生物が求められるであろう。従って本発明の一つの目的は、アルコール発酵ができ、炭素源としてキシロースを利用できる酵母を提供することである。
【０００４】
Ｄ−キシロースは、腸内細菌、一部の酵母及び真菌のような種々の微生物によって代謝される。大部分のキシロース利用細菌において、キシロースはキシロース（グルコース）異性化酵素（ＸＩ）により直接Ｄ−キシルロースに異性化される。しかし、糸状菌及び酵母は、この一ステップの異性化を行うことができず、まずキシロース還元酵素（ＸＲ）の作用によりキシロースをキシリトールに還元し、次いでキシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）によりキシリトールをキシルロースに変換する。最初のステップは補因子としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とし、第二ステップはＮＡＤ＋を必要とする。生成したキシルロースは、その後、キシルロースキナーゼ（ＸＫ）によりリン酸化された後にペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に入る。厳密なＮＡＤＰＨ依存性のキシロース還元酵素（ＸＲ）を持つ微生物では、キシロースからエタノールへの嫌気性発酵は不可能である。キシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）は厳密にＮＡＤ＋に依存しているので、酸化還元不均衡（すなわち、ＮＡＤ＋欠乏）を生じるからである。嫌気性条件においてこの酸化還元不均衡を解決するために、微生物はグリセロール及びキシリトールのような副産物を生産する。同様に、キシロースに対するβ−ラクタムの嫌気的な生産も、グルコースに対するβ−ラクタム生産に比較すると生じにくい。これらの低収量の原因は、グルコースを利用する場合に比較して、この経路においてはＮＡＤＰＨの形の還元体を比較的高度に必要とすることにあるように思われる（W.M.van Gulik et al.,Biotechnol Bioeng.Vol.68,No.6,June 20,2000）。
【０００５】
Ｚａｌｄｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．（2001,Appl.Microbiol.Biotechnol.56;17-34）に総説されているように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及び類似の酵母にキシロース代謝を導入する多くの試みが行われてきた。一つの方法は、少なくとも、キシロース（アルドース）還元酵素及びキシリトール脱水素酵素、すなわちＰｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓのＸＹＬ１及びＸＹＬ２、をコードする遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに発現させることに関する（ＵＳ５，８６６，３８２；ＷＯ９５／１３３６２；及びＷＯ９７／４２３０７）。この方法は、キシロースに対してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖を可能にしたが、主にＸＲ及びＸＤＨの間の酸化還元不均衡の結果として、一般的にエタノール生産性及び／または収量が低く、キシリトールの生産が多いという欠点がある。
【０００６】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ若しくは関連酵母または糸状菌にＸＩを発現させることにより、酸化還元不均衡及びその結果としてのキシリトール生産と分泌を回避することができるであろう。数種の細菌のキシロース異性化酵素遺伝子がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに挿入されたが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて中等温度好性原核生物のＸＩを発現させても、活性のあるＸＩを生じなかった（Amore and Hollenverg, 1989, Nucleic Acids Res. 17:7515 ; Amore et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol.30:351-357; Chan et al., 1986, Biotechnol. Lett 8:231-234;Chan et al., 1989,Appl.Microbiol.Biotechnol. 31:524-528; Ho et al., 1983, Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 42 : 2167 ; Hollenberg, 1987, EBC Symposium on Brewer's Yeast, Helsinki(Finland), 24-25 Nov 1986 ; Sarthy et al., 1987, Appl. Envion. Microbiol. 53:1996-2000 ; Ueng et al., 1985, Biotechnol. Lett. 7: 153-158）。しかし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに発現させた好熱性細菌の二種のＸＩは８５℃において１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇの比活性を示した（Bao et al.,1999,Weishengwu-Xuebao 39:49-54;Walfridson et al.,1996,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190）。しかし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの生理的温度（２０−３５℃）では、この活性のわずか数％しか維持できず、キシロースから有効にアルコールを発酵するには不十分であった。従って、生理的条件下において十分なＸＩ活性を提供して、炭素源としてキシロースを利用することを可能とするように、酵母で発現することができるＸＩをコードする核酸に対する要求は依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳ５，８６６，３８２
【特許文献２】ＷＯ９５／１３３６２
【特許文献３】ＷＯ９７／４２３０７
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】W.M.van Gulik et al.,Biotechnol Bioeng. Vol.68, No.6, June 20,2000
【非特許文献２】Ｚａｌｄｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．, 2001, Appl.Microbiol.Biotechnol.56;17-34）
【非特許文献３】more and Hollenverg, 1989, Nucleic Acids Res. 17:7515
【非特許文献４】Amore et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol.30:351-357
【非特許文献５】Chan et al., 1986, Biotechnol. Lett 8:231-234
【非特許文献６】Chan et al., 1989,Appl.Microbiol.Biotechnol. 31:524-528
【非特許文献７】Ho et al., 1983, Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 42 : 2167
【非特許文献８】Hollenberg, 1987, EBC Symposium on Brewer's Yeast, Helsinki(Finland), 24-25 Nov 1986
【非特許文献９】Sarthy et al., 1987, Appl. Envion. Microbiol. 53:1996-2000
【非特許文献１０】Ueng et al., 1985, Biotechnol. Lett. 7: 153-158
【非特許文献１１】Bao et al.,1999,Weishengwu-Xuebao 39:49-54;Walfridson et al.,1996,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
［発明の説明］
（定義）
キシロース異性化酵素
本明細書において、酵素「キシロース異性化酵素」（ＥＣ５．３．１．５）は、Ｄ−キシロースのＤ−キシルロースへのの直接の異性化、及びその逆の直接の異性化を触媒する酵素として定義される。この酵素はまた、Ｄ−キシロースケト異性化酵素としても知られている。一部のキシロース異性化酵素は、Ｄ−グルコース及びＤ−フルクトースの間の変換を触媒することもできるので、時にはグルコース異性化酵素とも呼ばれる。キシロース異性化酵素は補因子としてマグネシウムを必要とする。本発明のキシロース異性化酵素はさらに後述するアミノ酸配列によって定義される。同様に、キシロース異性化酵素はこの酵素をコードするヌクレオチド配列並びに後述されるキシロース異性化酵素をコードする対照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。
【００１０】
本明細書において、キシロース異性化酵素活性の単位（Ｕ）は、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０），１０ｍＭキシロース及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む反応混合物中、３７℃で、１分間に１ｎｍｏｌのキシルロースを生産する酵素の量として定義される。生成したキシルロースは、Ｄｉｓｃｈｅ ａｎｄ Ｂｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ（1951,J.Biol.Chem.192:583-587）の方法または実施例に記述したＨＰＬＣにより測定した。
【００１１】
配列の同一性及び類似性
本明細書において配列同一性（sequence identity）とは、配列比較により決定される、二以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク）配列または二以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の関係として定義される。この分野で、「同一性」は、場合によって、アミノ酸配列又は核酸配列の配列間の一致により決定される、アミノ酸または核酸配列間の配列関連性（sequence relatedness）の程度も意味している。二つのアミノ酸配列の「類似性（similarity）」は、あるポリペプチドの他のポリペプチドに対する、アミノ酸配列及び保存的置換アミノ酸を比較して決定される。「同一性」及び「類似性」は、限定はしないが以下に記述されている方法を含む既知方法により容易に計算することができる（Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994;Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, g., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073(1988）。
【００１２】
同一性を決める望ましい方法は、試験する配列間に最大の一致が得られるように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、一般に使用可能なコンピュータプログラムとして作成される。二つの配列間の同一性及び類似性を決定するための望ましいコンピュータプログラム方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BestFit, BLASTP, BLASTN,及びFASTA(Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990）が含まれる。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩ及びその他のサイトから誰でも入手できる（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990）。よく知られたＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性決定に使用することができる。
【００１３】
ポリペプチド配列比較のための望ましいパラメーターには以下のアルゴリズムが含まれる：Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453 (1970);Comparison matrix:BLOSSUM62 from Hentikoff and Hentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919(1992);Gap Penalty:12;及びGap Length Penalty:4。これらのパラメーターを使用する有用なプログラムはＭａｄｉｓｏｎ，ＷＩにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐの「Ｏｇａｐ」プログラムとして一般に入手することができる。既述のパラメーターはアミノ酸比較（エンドギャップに対するペナルティーなし）のためのデホルトパラメーターである。
【００１４】
核酸比較のための望ましいパラメーターは以下のアルゴリズムを含む：アルゴリズム：Needlemann and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970);Comparison matrix：一致＝＋１０、不一致＝０；Gap Penalty:50;Gap Length Penalty:3。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧａｐプログラムとして入手できる。上記に示したものは核酸比較のためのデホルトパラメーターである。任意に、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れることもでき、このことは、当業者には明らかである。保存的アミノ酸置換とは類似の側鎖を持つ残基の互換性のことである。例えば、脂肪族側鎖をもつアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；ヒドロキシ脂肪族側鎖を持つアミノ酸の群はセリン及びトレオニン；アミノ基を含む側鎖を持つアミノ酸の群はアスパラギン及びグルタミン；芳香族側鎖を持つアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；塩基性側鎖を持つアミノ酸の群はリシン、アルギニン、及びヒスチジン；硫黄を含む側鎖を持つアミノ酸の群はシステイン及びメチオニンである。望ましい保存的アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書において開示したアミノ酸配列の置換変異体は、開示配列中の少なくとも一つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。望ましくはアミノ酸の変換は保存的である。天然に存在するアミノ酸の望ましい保存置換は以下のようなものである：アラニンからセリンへ；アルギニンからリシンへ；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸へ；システインからセリンまたはアラニンへ；グルタミンからアスパラギンへ；グルタミン酸からアスパラギン酸へ；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへ；イソロイシンからロイシンまたはバリンへ；ロイシンからイソロイシンまたはバリンへ；リシンからアルギニン；グルタミンまたはグルタミン酸；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからメチオニン、ロイシンまたはチロシンへ；セリンからトレオニンへ；トレオニンからセリンへ；トリプトファンからチロシンへ；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへ；及びバリンからイソロイシンまたはロイシン。
【００１５】
核酸配列のハイブリッド形成
本発明のキシロース異性化酵素またはキシルロースキナーゼをコードする核酸配列は、中等度のまたは望ましくは厳密なハイブリッド形成条件下に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のヌクレオチド配列それぞれとハイブリッド形成する能力によって規定することもできる。厳密なハイブリッド形成条件とは、少なくとも約２５、望ましくは約５０ヌクレオチド、７５または１００及び最も望ましくは約２００またはそれ以上のヌクレオチドの核酸配列を、約６５℃の温度において、１Ｍの塩、望ましくは６ｘＳＳＣまたは同等のイオン強度を持つその他の溶液中でハイブリッド形成させることができ、そして０．１Ｍの塩、またはそれ以下、望ましくは０．２ｘＳＳＣまたは同等のイオン強度を持つその他の溶液中で６５℃において洗浄する条件とここでは定義する。望ましくは、ハイブリッド形成は終夜、すなわち少なくとも１０時間行い、望ましくは、洗浄は洗浄液を少なくとも２回交換して少なくとも１時間行う。この条件により、通常約９０％またはそれ以上の配列同一性を持つ配列との特異的ハイブリッド形成が可能であろう。
【００１６】
中等度の条件とは、少なくとも５０ヌクレオチド、望ましくは約２００またはそれ以上のヌクレオチドの配列を、約１Ｍ塩を含む溶液、望ましくは６ｘＳＳＣまたは同等のイオン強度のその他の溶液の中で約４５℃の温度においてハイブリッド形成させ、そして約１Ｍ塩を含む溶液、望ましくは６ｘＳＳＣまたは相当するイオン強度のその他の溶液の中で室温において洗浄する条件とここでは定義する。望ましくは、ハイブリッド形成は終夜、すなわち少なくとも１０時間行い、望ましくは、洗浄は洗浄液を少なくとも２回交換して少なくとも１時間行う。この条件により、通常約５０％までの配列同一性を持つ配列との特異的ハイブリッド形成が可能であろう。当業者は、５０％及び９０％の間の同一性をもつ配列を特異的に同定するためにこれらのハイブリッド形成条件を変更できるであろう。
【００１７】
作動的連結
本明細書で使用される「作動的に連結した」とは、機能的に関連するポリヌクレオチド配列の連結のことである。他の核酸配列との機能的な関連を持って配置されている場合に、核酸は「作動的に連結している」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響するならば、コード配列と作動的に連結している。作動的に連結したとは、典型的には、連結したＤＮＡ配列同士が隣接しており、二個のタンパクコード領域を結合する必要がある場合には、連続し、読み枠内にあることを意味する。
【００１８】
プロモーター
本明細書で使用される「プロモーター」とは、転写の方向の点で遺伝子の転写開始部位の上流に存在する１またはそれ以上の遺伝子の転写を調節する機能を持つ核酸フラグメントであって、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、転写開始部位、及び限定はしないが、転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化タンパク結合部位を含むその他のＤＮＡ配列、並びにプロモーターの転写の量を直接的若しくは間接的に調節することが当業者には既知のその他のヌクレオチドの配列によって構造的に同定される。「構成的」プロモーターはほとんどの環境及び発生条件において活性であるプロモーターである。「誘導的」プロモーターは環境及び発生が調節されたときに活性となるプロモーターである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】炭素源として２５ｍＭガラクトース及び１００ｍＭキシロースを含む培地で増殖した形質転換Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖曲線。形質転換体ｐＹｅｓは挿入のない酵母発現ベクターを含む。形質転換体１４．３，１６．２．１及び１６．２．２はＰｉｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．Ｅ２キシロース異性化酵素コード配列を含むｐＹＥＳベクターで形質転換されている。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
［発明の詳細な説明］
本発明の最初の態様は、キシロースからキシルロースへ異性化する能力を持つ形質転換宿主細胞に関するものである。キシロースからキシルロースへ異性化する能力は、キシロース異性化酵素をコードする核酸配列を含む核酸構築物で宿主細胞を形質転換することにより付与される。キシロースからキシルロースへ異性化する形質転換宿主細胞の能力は、キシロースからキシルロースへの直接の異性化である。これは、それぞれキシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵素に触媒されてキシリトール中間体を経由してキシロースからキシルロースへ変換する２ステップ反応に対して、キシロース異性化酵素により触媒される１ステップ反応によりキシロースがキシルロースへ異性化したことを意味すると理解される。
【００２１】
核酸配列は、形質転換宿主細胞中で活性形態で発現するキシロース異性化酵素をコードすることが望ましい。従って、宿主細胞中で核酸配列が発現することにより、２５℃でタンパクｍｇ当り少なくとも１０Ｕのキシロース異性化酵素比活性、望ましくは２５℃で少なくとも２０，２５，３０，５０，１００，２００または３００Ｕ／ｍｇ、の比活性を持つキシロース異性化酵素が生産される。本明細書において、形質転換宿主細胞中で発現したキシロース異性化酵素の比活性は、宿主細胞の細胞分解物、例えば、酵母細胞分解物のタンパクｍｇ当りのキシロース異性化酵素活性の量と定義される。キシロース異性化酵素活性の測定、タンパク量、及び細胞分解物の調製については実施例１に記述されている。また、比活性は、実施例４に示すように測定することもできる。従って、宿主細胞中にヌクレオチド配列を発現させることにより、３０℃で少なくとも５０Ｕ／ｍｇタンパクのキシロース異性化酵素活性、望ましくは３０℃で少なくとも１００，２００，５００または７５０Ｕ／ｍｇの比活性を持つキシロース異性化酵素が生成される。
【００２２】
望ましくは、宿主細胞中にヌクレオチド配列を発現することにより、キシロースに対するＫｍが５０，４０，３０または２５未満のキシロース異性化酵素が得られ、より望ましくは、キシロースに対するＫｍが約２０ｍＭまたはそれ未満である。
【００２３】
キシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列と少なくとも４０，４５，４９，５０，５３，５５，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２のヌクレオチド配列と少なくとも４０，５０，５５，５６，５７，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列；
（ｃ）その相補鎖が、（ａ）または（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（ｄ）遺伝子コードの縮重による、（ｃ）の核酸分子の配列と異なる配列からなるヌクレオチド配列：
からなる群から選択することができる。
【００２４】
ヌクレオチド配列は、真核生物性キシロース異性化酵素、すなわち真核生物中に天然に存在するキシロース異性化酵素と同じアミノ酸配列を持つキシロース異性化酵素をコードしていることが望ましい。中等温度好性原核性キシロース異性化酵素に比べ、真核生物性キシロース異性化酵素の発現は、酵母のような真核性宿主細胞においてキシロース異性化酵素が活性形態で発現する可能性を高める。ヌクレオチド配列が植物キシロース異性化酵素（例えば、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ由来）または菌（fungal）キシロース異性化酵素（例えば、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｓ由来）をコードするのがより望ましい。但し、真核生物性宿主細胞、特に酵母において酵素的に活性形態で発現する可能性をさらに増加させるためには、ヌクレオチド配列が嫌気性菌のキシロース異性化酵素をコードすることが最も望ましい。Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ，Ｃａｅｃｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ，Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ，またはＲｕｍｉｎｏｍｙｃｅｓ科に属する嫌気性菌のキシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列が最も望ましい。
【００２５】
キシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列で形質転換するための宿主細胞は、細胞の中へ能動的にまたは受動的にキシロースを輸送できる宿主であることが望ましい。宿主細胞は、活性な解糖経路、ペントースリン酸経路を含有していることが望ましく、キシロースから異性化されたキシルロースがピルビン酸に代謝されるようにキシルロースキナーゼを含有していることが望ましい。さらに宿主はピルビン酸を目的とする発酵産物、例えばエタノール、エチレンまたは乳酸に変換するための酵素を含有することが望ましい。望ましい宿主細胞は、天然においてアルコール発酵、望ましくは嫌気性アルコール発酵ができる宿主細胞である。さらに宿主細胞はエタノール及び乳酸、酢酸、ギ酸のような有機酸、及びフルフラール及びヒドロキシメチルフルフラールのような糖分解産物に対して高度な耐性を持っていることが望ましい。宿主細胞のこれらの特性または活性は天然に宿主細胞中に存在することもあるが、遺伝子操作により導入または修飾することができる。適する宿主細胞は細菌または真菌のような微生物であるが、宿主として最も適当なのは酵母または糸状菌である。
【００２６】
本明細書において酵母は、真核性微生物として定義され、主として単細胞の形で増殖するＥｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の全種（Alexopoulos,C.J.,1962,In:Introductory Mycology,John Wiley & Sons,Inc.,New York）を含む。酵母は単細胞葉状体の発芽によっても、また生物体の分裂によっても増殖することができる。宿主細胞として望ましい酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ，Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ，及びＹａｒｒｏｗｉａ種に属する。酵母は、嫌気性発酵、より望ましくは嫌気性アルコール発酵ができるものが望ましい。
【００２７】
本明細書において糸状菌は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の全ての糸状形態を含む真核性微生物として定義される。これらの菌は、キチン、セルロース、及びその他の複合多糖からなる栄養菌糸体によって特徴付けられる。本発明の糸状菌は、形態的、生理的、及び遺伝的に、酵母とは区別される。糸状菌による栄養増殖は菌糸の延長によるものであり、ほとんどの糸状菌の炭素異化は、絶対的好気性による。宿主細胞として望ましい糸状菌はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ，Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ，及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種に属するものである。
【００２８】
数年にわたって、農産糖からバイオ−エタノールを生産するために、種々の生物体の導入が提案されてきた。しかしながら、実用的な主なバイオ−エタノール生産プロセスの全てにおいて、エタノール生産体としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種の酵母を使用し続けてきた。これは工業的プロセスに対するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種の多くの魅力的な特徴、すなわち、高濃度の酸、エタノール及び浸透圧に対する耐性、嫌気的増殖能力、及び当然ではあるが高いアルコール発酵能力に基づくものである。宿主細胞として望ましい酵母の種は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ，Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ，Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ，Ｓ．ｕｖａｒｕｍ，Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ，Ｋ．ｌａｃｔｉｓ，Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ，Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓを含む。
【００２９】
宿主細胞は後に定義する核酸構築物で形質転換され、核酸構築物の一つのコピーを含むものでもよいが、複数のコピーを含むものが望ましい。この核酸構築物はエピソームとして維持され、ＡＲＳ配列のような自律的複製のための配列を含む。適するエピソーム性核酸構築物は、例えば、酵母２μまたはｐＫＤ１（Fleer et al.,1991, Biotechnology 9: 968-975）プラスミドに基づくことができる。しかし、核酸構築物は、宿主細胞のゲノム中に１以上のコピーが組み込まれていることが望ましい。宿主細胞ゲノムへの組み込みは、変則的な組換えによりランダムに生じることもありうるが、菌分子遺伝学の分野でよく知られている相同組換えにより核酸構築物を宿主細胞ゲノムへ組み込むことが望ましい（例えば、ＷＯ９０／１４４２３，ＥＰ−Ａ−０ ４８１ ００８，ＥＰ−Ａ−０ ６３５ ５７４及びＵＳ６，２６５，１８６参照）。
【００３０】
本発明による望ましい形質転換宿主細胞において、核酸構築物は、宿主細胞に、炭素源として、望ましくは唯一の炭素源としてのキシロースに対して、望ましくは嫌気的条件下で増殖する能力を付与する。それにより形質転換宿主は、好ましくはキシリトールを本質的に生産せず、例えば、当該宿主によって生産されるキシリトールは、検出限界以下、またはモルベースで消費した炭素の５，２，１％未満である。その形質転換宿主細胞は、唯一の炭素源としてのキシロースに対して少なくとも０．０１，０．０２，０．０５，０．１または０．２ｈ−１の速度で増殖する能力を有する。このように本発明の形質転換宿主細胞は、既に定義した比活性レベルでキシロース異性化酵素を発現する。
【００３１】
宿主細胞は、（ａ）宿主細胞中へのキシロース輸送の増加；（ｂ）キシルロースキナーゼ活性の増加；（ｃ）ペントースリン酸経路の流量の増加；（ｄ）カタボライト抑制に対する感受性の減少；（ｅ）エタノール、浸透圧または有機酸に対する耐性の増加；及び（ｆ）副生物生産の減少、からなる群から選択された特徴の一つまたはそれ以上を生じる遺伝子修飾をさらに含むことができる。副生物は目的とする発酵産物以外の炭素含有分子を意味すると理解され、例えば、キシリトール、グリセロール及び／または酢酸が含まれる。そのような遺伝子修飾は、古典的突然変異誘起及びスクリーニング及び／または目的変異体の選別により導入することができる。その他に、遺伝子修飾は、外来性遺伝子の過剰発現及び／または異種遺伝子の発現及び／または内在性遺伝子の不活化を含むことができる。これらの遺伝子は、ヘキソースまたはペントーストランスポーター；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（XKSI Deng and Ho, 1990, Appl. Biochem. Biotechnol. 24-25: 193-199）またはＰｉｒｏｍｙｃｅｓ（ｘｙｌＢ，すなわちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）のキシルロースキナーゼのようなキシルロースキナーゼ；トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ１）またはトランスケトラーゼ（ＴＫＬ１）のようなペントースリン酸経路の酵素（例えば、Ｍｅｉｎａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｕｐｐｌ，２：４５参照）、解糖酵素、アルコール脱水素酵素のようなアルコール代謝酵素、をコードする遺伝子から選択されることが望ましい。不活化される望ましい内在性遺伝子としては、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＨＸＫ２遺伝子（Diderich et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 1587-1593参照）のようなヘキソースキナーゼ；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＩＧ１またはＭＩＧ２遺伝子；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＥ３遺伝子（Traff et al.,2001,Appl.Environm.Microbiol.67:5668-5674）のような（非特異的）アルドース還元酵素遺伝子；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセロール−リン酸脱水素酵素１及び／または２遺伝子のようなグリセロール代謝に関係する酵素の遺伝子；またはその他の宿主の種の遺伝子の（ハイブリッド形成）相同体、が含まれる。宿主細胞のキシロース代謝に関するその他の望ましい修飾についてはＺａｌｄｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．（２００１、前出）に総説されている。
【００３２】
その他の態様において、本発明は、エタノール以外の発酵産物を生産するための形質転換宿主細胞に関係している。その非エタノール発酵産物は原則として酵母または糸状菌のような真核性微生物によって生産することができる大量のまたは精製した化学品である。そのような発酵産物としては、例えば、乳酸、酢酸、コハク酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質及びセファロスポリンがある。
【００３３】
本発明の核酸構築物による宿主細胞の形質転換及び宿主細胞、望ましくは酵母の前記のようなその他の遺伝子修飾は当業者によく知られている方法により行われる。その方法は例えば標準的教科書から知ることができる、例えば、Sambrook and Russel(2001)“Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd edition)”,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, または F. Ausubel et al, eds.,“Current protocols in molecular biology”,Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)。菌宿主細胞の形質転換及び遺伝子修飾の方法は、例えば、ＥＰ−Ａ−０ ６３５ ５７４，ＷＯ９８／４６７７２，ＷＯ９９／６０１０２及びＷＯ００／３７６７１から知ることができる。
【００３４】
その他の態様において、本発明は、前記で定義したキシロース異性化酵素をコードし、前記の宿主細胞の形質転換に使用されるヌクレオチド配列からなる核酸構築物に関する。核酸構築物において、キシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列は、後述するように宿主細胞中でヌクレオチド配列の転写を調節し開始するためのプロモーターに作動的に連結していることが望ましい。このプロモーターは、宿主細胞にキシロースをキシルロースに異性化する能力を付与するために、宿主細胞中でキシロース異性化酵素を十分に発現できることが望ましい。プロモーターは、前記のような宿主細胞中で、特異的キシロース異性化酵素を生じさせるものが望ましい。本発明の核酸構築物中において有用なプロモーターは、構成的及び誘導的な天然プロモーター並びに人工的プロモーターである。さらに本発明に使用するための望ましいプロモーターは、カタボライト（グルコース）抑制に感受性がなくそして／または誘導のためのキシロースを必要としないものが望ましいであろう。このような特徴を持つプロモーターは、広く入手可能であり、同業者には知られている。そのようなプロモーターの適当な例は、例えば、酵母のリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＫ）、トリオースリン酸異性化酵素（ＴＰＩ）、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤ，ＴＤＨ３またはＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、ホスホグリンセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターのような解糖遺伝子の酵母プロモーターである。そのようなプロモーターに関する詳細は（ＷＯ９３／０３１５９）に見ることができる。その他の有用なプロモーターは、リボソームタンパクコード遺伝子プロモーター、ラクターゼ遺伝子プロモーター（ＬＡＣ４）、アルコール脱水素酵素プロモーター（ＡＤＨ１，ＡＤＨ４，など）、及びエノラーゼプロモーター（ＥＮＯ）である。その他の、構成的及び誘導的プロモーター及びエンハンサーまたは上流活性化配列は当業者に知られているであろう。本発明の核酸構築物に使用されるプロモーターは、必要に応じて、修飾して、その調節特徴を変更することができる。キシロース異性化酵素を発現させるために核酸構築物に使用されるプロモーターは、キシロース異性化酵素を発現させる宿主細胞と同種であることが望ましい。
【００３５】
核酸構築物において、キシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列の３’−末端は、転写ターミネーター配列に作動的に連結していることが望ましい。このターミネーター配列は、選択した宿主細胞、例えば選択した酵母種において作動し得ることが望ましい。いずれの場合にも、ターミネーターの選択は重要ではなく、ターミネーターは酵母ではない真核生物の遺伝子の場合にしばしば作動するが、酵母遺伝子由来のものを用いることができる。転写終結配列はさらにポリアデニル化シグナルを含むことが望ましい。
【００３６】
任意に、核酸構築物中に選択マーカーを入れることができる。本明細書で使用する用語「マーカー」とは、マーカーを含有する宿主細胞を、選別、またはスクリーニングすることができる特徴または表現型をコードする遺伝子のことである。マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子とすることができ、それによって形質転換されていない細胞の中から形質転換された細胞を選別するために適当な抗生物質を使用することができる。適当な抗生物質耐性マーカーの例としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、３’−Ｏ−ホスホトランスフェラーゼＩＩ（カナマイシン、ネオマイシン及びＧ４１８耐性）が含まれる。抗生物質耐性マーカーは、倍数体宿主細胞の形質転換には最も便利であるが、しかし栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３，ＴＲＰ１，ＬＥＵ２）またはＳ．ｐｏｍｂｅ ＴＰＩ遺伝子（Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｐ Ｒ，１９８５，Ｇｅｎｅ４０：１２５−１３０に記載）のような非抗生物質耐性マーカーが使用されることが望ましい。望ましい態様において、核酸構築物により形質転換された宿主細胞はマーカー遺伝子を含まない。マーカー遺伝子を含まない組換え微生物宿主細胞を作る方法はＥＰ−Ａ−０ ６３５ ５７４に開示されており、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子または酵母ＵＲＡ３及びＬＹＳ２遺伝子のような二方向性マーカーの使用に基づいている。そのほかには、形質転換細胞をスクリーニングできるように、緑色蛍光タンパク、ｌａｃＺ，ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−グルクロニダーゼのようなスクリーニングに役立つマーカーを本発明の核酸構築物の中に組み込むことができる。
【００３７】
さらに任意に本発明の核酸構築物中に存在することができる配列としては、これらに限定はしないが、一つまたはそれ以上のリーダー配列、エンハンサー、組み込み因子、並びに／或いはレポーター遺伝子、イントロン配列、セントロメア、テロメア及び／またはマトリックス接着（ＭＡＲ）配列がある。本発明の核酸構築物はさらに、ＡＲＳ配列のような自己複製のための配列を含むことができる。適するエピソーム核酸構築物は、例えば、酵母２μまたはｐＫＤ１（Fleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968-975）プラスミドを基にすることができる。その他に核酸構築物は、望ましくは相同組換えによる、組み込みのための配列を含むことができる。従ってその配列は、宿主細胞のゲノム中の組み込みの標的部位に対して相同的な配列である。本発明の核酸構築物は、本来既知方法により提供することができ、その方法には核酸／核酸配列を制限及び連結するような技術を含み、その参考文献は例えば、Sambrook and Russel (2001) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, またはF. Ausubel et al., eds.,”Current protocols in molecular biology”,Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)のような標準的教科書に示されている。
【００３８】
そのほかの態様において、本発明はキシロース異性化酵素をコードするヌクレオチドを含む核酸分子に関する。この核酸分子は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列と少なくとも５０，５３，５４，５５，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２のヌクレオチド配列と少なくとも５０，５６，５７，５８，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｃ）その相補鎖が、（ａ）または（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズする核酸分子；及び
（ｄ）遺伝子コードの縮重により（ｃ）の核酸分子配列と異なる配列からなる核酸分子；
からなる群から選択されることが望ましい。
【００３９】
また、（ａ）の核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列と少なくとも６７，６８，６９，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることができる。（ｃ）の核酸分子は望ましくは前記に定義した中等度の条件、より望ましくは厳密な条件の下にハイブリッド形成する。核酸分子は真核生物由来であることが望ましく、菌のような真核微生物由来であることがより望ましく、前記の嫌気性菌のような嫌気性菌由来であることが最も望ましい。
【００４０】
本発明の更に他の態様は、キシルロースキナーゼ、望ましくはＤ−キシルロースキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関するものである。本明細書において、Ｄ−キシルロースキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１７；Ｄ−キシルロキナーゼとも呼ばれる）は、Ｄ−キシルロースのキシルロース−５−リン酸への変換を触媒する酵素である。この核酸分子は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸配列と少なくとも４５，４７，４８，４９，５０，５５，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のヌクレオチド配列と少なくとも３０，３７，３８，３９，４０，５０，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる核酸分子；
（ｃ）その相補鎖が、（ａ）または（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズする核酸分子；及び
（ｄ）遺伝子コードの縮重による、（ｃ）の核酸分子配列と異なる配列からなる核酸分子：
からなる群から選択されることが望ましい。
【００４１】
また、（ａ）の核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸配列と少なくとも６４，６５，６６，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることができる。（ｃ）の核酸分子は望ましくは前記で定義した中等度の条件、より望ましくは厳密な条件の下にハイブリッド形成する。核酸分子は、真核生物由来であることが望ましく、菌のような真核微生物由来であることがより望ましく、前記の嫌気性菌のような嫌気性菌由来であることが最も望ましい。
【００４２】
そのほかの態様において、本発明は、本発明の形質転換宿主細胞がキシロースのようなキシロース資源を含む炭素源の発酵のために使用される、発酵プロセスに関するものである。発酵培地中の炭素源は、キシロース資源に加えてグルコース資源も含むことができる。キシロースまたはグルコースの資源としては、キシロースまたはグルコースそのものでもよく、例えば、リグノセルロース、キシラン、セルロース、デンプンなどのようなキシロースまたはグルコース単位からなる炭水化物のオリゴマーまたはポリマーでもよい。そのような炭水化物からキシロースまたはグルコース単位を遊離させるために（キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼなどのような）、適当な炭水化物分解酵素を、発酵培地に加えてもよく、形質転換宿主細胞に生産させてもよい。後者の場合には、形質転換宿主細胞に遺伝子操作を施し、その炭水化物分解酵素を生産させ、分泌させることができる。望ましいプロセスにおいて、形質転換宿主細胞は、キシロース及びグルコースを共に、望ましくは同時に発酵し、その場合にはグルコース抑制に非感受性の形質転換宿主細胞を使用してジオキシ増殖を阻害することが望ましい。炭素源としてのキシロース（及びグルコース）に加えて、発酵培地はさらに形質転換宿主細胞の増殖に必要な適当な成分を含むであろう。酵母などの微生物を増殖するための発酵培地の組成は、当業者にはよく知られている。
【００４３】
発酵プロセスは、エタノール、乳酸、酢酸、コハク酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ペニシリンＧ若しくはペニシリンＶ及びそれらの発酵誘導体のようなβ−ラクタム並びにセファロスポリンなどの発酵産物を生産するためのプロセスである。発酵プロセスは、好気的または嫌気的な発酵プロセスとすることができる。本明細書において嫌気的発酵プロセスとは、発酵プロセスが無酸素の状態でまたは実質的に酸素が消費されないで（例えば、５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満）で行われ、有機分子が、電子供与体及び電子受容体のいずれとしても働く発酵プロセスと定義される。酸素が存在しないところでは、糖分解及びバイオマス形成において生成したＮＡＤＨは、酸化的リン酸化により酸化することはできない。この問題を解決するために多くの微生物は電子及び水素受容体としてピルビン酸またはその誘導体の一つを利用することによって、ＮＡＤ＋を再生する。従って、望ましい嫌気的発酵プロセスにおいて、ピルビン酸は、電子（及び水素）受容体として使用され、エタノール、乳酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、酢酸またはコハク酸のような発酵産物へと還元される。
【００４４】
発酵プロセスは、形質転換宿主細胞にとって最適の温度で行うことが望ましい。従って、ほとんどの酵母または菌の宿主細胞に対して、発酵プロセスは３８℃未満の温度で実施される。酵母または糸状菌の宿主細胞に対して、発酵プロセスは３５，３３，３０または２８℃未満、且つ２０，２２，または２５℃を超える温度で実施されることが望ましい。
【００４５】
望ましいプロセスは、（ａ）前記に定義した形質転換宿主細胞と共にキシロース資源を含む培地を発酵することによって、宿主細胞にキシロースをエタノールに発酵させ；任意に、（ｂ）エタノールを回収するステップを含むエタノールの生産プロセスである。発酵培地は、グルコース資源を含むことができ、それもエタノールに発酵される。このプロセスにおいて、エタノールの容積生産性は、少なくとも０．５，１．０，１．５，２．０，２．５，３．０，５．０または１０．０ｇエタノール／リットル／時間であることが望ましい。このプロセスにおけるキシロース及び／またはグルコースに対するエタノール収率は、少なくとも５０，６０，７０，９０，９５または９８％であることが望ましい。本明細書においてエタノール収率は、理論的収量（グルコース及びキシロースについて０．５１ｇエタノール／ｇグルコースまたはキシロース）のパーセンテージとして定義する。
【００４６】
その他の態様において、本発明は、乳酸、酢酸、コハク酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物の生産プロセスに関する。このプロセスは、（ａ）前記に定義した形質転換宿主細胞と共にキシロース資源を含む培地を発酵することにより、宿主細胞に、キシロールを発酵産物に発酵させ、任意に、（ｂ）発酵産物を回収する、ステップを含むことが望ましい。望ましいプロセスにおいて、培地はグルコース資源も含む。
【実施例】
【００４７】
［実施例１］Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓキシラナーゼ異性化酵素及びキシルロースキナーゼｃＤＮＡのクローニング
（生物及び増殖条件）
インド象の糞から単離した嫌気性菌Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２（ＡＴＣＣ７６７６２）を、Ｎ２／ＣＯ２（８０％／２０％）中、３９℃で、種々の炭素源を添加したＭ２培地で嫌気的に増殖した（２４）。使用した炭素源は、アビセル（微結晶セルロース、タイプＰＨ１０５、Ｓｅｒｖａ，ドイツ）、フルクトースまたはキシロース（全て０．５％、ｗ／ｖ）であった。増殖が止まった後（水素の発生により判断した）、細胞を遠心分離（１５，０００ｘｇ，４℃，１５分間）またはナイロンガーゼ（３０μｍ孔径）による濾過により回収した。
【００４８】
（無細胞抽出物の調製）
菌細胞を脱イオン水で洗い、培地成分を除去した。細胞を液体窒素中で凍結し、次いで、乳鉢中で、硝子ビーズ（０．１０−０．１１ｍｍ径）ですりつぶして、無細胞抽出物を調製した。Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．０）を粉末に加え（１：１，ｗ／ｖ）そして１５分間解凍した後、懸濁液を遠心分離した（１８，０００ｘｇ，４℃，１５分間）。透明な上清を細胞内酵素の原料として使用した。
【００４９】
（酵素検定）
キシロース異性化酵素活性は、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０），１０ｍＭキシロース，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び適当量の無細胞抽出物を含む反応混合物中３７℃で検定した。生成したキシルロースの量は、システイン−カルバゾール法（９）により測定した。キシルロースキナーゼ及びキシロース還元酵素活性はＷｉｔｔｅｖｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（２８）による記述にしたがって検定した。活性の１単位は、検定条件の下に、毎分１ ｎｍｏｌのキシルロースを生産する酵素量と定義される。生成したキシルロースは、Ｄｉｓｃｈｅ ａｎｄ Ｂｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ（Dische and Borenfreund, 1951, J. Biol. Chem. 192: 583-587）の方法によるか、または８０℃のＢｉｏｒａｄ ＨＰＸ−８７Ｎカラムを使用し、溶出液として０．０１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４を使用して０．６ｍｌ／ｍｉｎで溶出するＨＰＬＣにより測定した。キシロース及びキシルロースは、内部温度６０℃で屈折計により測定した。
【００５０】
比活性は、タンパク１ｍｇ当りの単位として示す。タンパクは、ウシγ−グロブリンを標準としてＢｉｏ−Ｒａｄタンパク試薬（Bio-Rad Laboratories,Richmond,CA,米国）で測定した。
【００５１】
（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２ｃＤＮＡライブラリーのランダム配列）
既に記述されている（２）ベクターラムダＺＡＰＩＩ中に構築したｃＤＮＡライブラリーを使用した。このライブラリーの一部をＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（Stratagene,La Jolla,CA,米国）による大量切除（mass excission）によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−クローンに変換した。無作為に取り出したクローンをＭ１３逆プライマーを使用して配列解析し、５’部分の配列を得た。不完全ｃＤＮＡを使用してプローブを合成し、ライブラリーを再スクリーニングするために使用した。全長配列を得るためにｐＵＣ１８にサブクローニングを生成さた。配列分析は、ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅターミネーターサイクルシークエンス即時反応ＤＮＡシークエンスキット（Perkin-Elmer Applied Biosystems）を使用してＡＢＩプリズム３１０自動化シークエンサーで実施した。
【００５２】
（結果）
嫌気性菌Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２のｃＤＮＡライブラリーから無作為に選択したクローンを配列解析し、その結果キシロース異性化酵素及びＤ−キシルロキナーゼ遺伝子にそれぞれ高い相同性を示す二つのクローン（ｐＨ９７及びｐＡＫ４４）を得た。これらのクローンを詳細に解析した。
【００５３】
クローンｐＨ９７は完全なＯＲＦを含有していなかったので、クローンｐＨ９７の配列データに基づいて設計したプローブを使用してｃＤＮＡライブラリーを再度スクリーニングした。この結果１６６９ｂｐの挿入配列を有するクローンｐＲ３を得た。キシロース異性化酵素に高い類似性のある４３７アミノ酸のタンパクをコードするＯＲＦを同定することができた。５’非翻訳領域はわずか４ｂｐを含むのみであったが、推定開始メチオニン残基は、既知キシロース異性化酵素配列の整列によく一致した。３’非翻訳領域は３５１ｂｐの長さであり、嫌気性菌で典型的である、高いＡＴ含有率を有していた。ＯＲＦは、基質との相互作用（触媒トリアド（catalytic triad）Ｈｉｓ１０２，Ａｓｐ１０５，Ａｓｐ３４０及びＬｙｓ２３５）及びマグネシウムとの結合（Ｇｌｕ２３２）に重要であることが示されているアミノ酸を含有していた（１４，２６）。さらに、キシロース異性化酵素のために開発した（２０）２個の符号パターン（残基１８５−１９４、及び２３０−２３７）が存在した。このＰｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２キシロース異性化酵素（ＸｙｌＡ）はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａの酵素（５２％同一性、６８％類似性）及びＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（４９％同一性、６７％類似性）と高い相同性を示す。ｃＤＮＡ配列から推定されるポリペプチドは４９，３９５Ｄａの分子量に相当し、５．２の計算値ｐＩを有す。
【００５４】
二番目のクローンｐＡＫ４４は、２０４１ｂｐの挿入を有し、５３，１５８Ｄａの分子量及び５．０のｐＩを持つ４９４アミノ酸のタンパクをコードする完全ＯＲＦを含有した。最初のメチオニンに先行して１１１ｂｐの５’非翻訳領域が存在したが、３’非翻訳領域は４４５ ｂｐからなっていた。両領域はＡＴが多い。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ調査によりキシルロキナーゼとの高い類似性が明らかにされた。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｅｆｉａ ｅｔ ａｌ．（２２）により定義された２個のリン酸共通領域が部分整列に示されるように位置６−２３及び２５４−２７０に認められた。さらにＰｒｏｓｉｔｅデーターベースに記述されているこの糖キナーゼファミリーの記号が同定された（１３１−１４５及び３５１−３７２）。Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２キシルロキナーゼ（ＸｙｌＢ）はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａのＸｙｌＢと高い相同性を示した（４６％同一性、６４％類似性）。
【００５５】
［実施例２］酵母発現ベクターの構築
Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２のキシロース異性化酵素のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の発現
Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２のｃＤＮＡをｐｆｕポリメラーゼ（Stratgene）を使用するＰＣＲ反応に使用した。プライマーはキシロース異性化酵素の５’及び３’末端の配列を使用して設計し、ＳｆｉＩ及びＸｂａＩ制限部位を含めた。ＰＣＲ産物をｐＰＩＣＺαベクター（Invitrogen,Carlsbad,CA,米国）中にクローニングした。キシロース異性化酵素を取り出すために、ｐＰＩＣＺαベクターをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化した。消化産物をｐＹｅｓ２ベクター（Invitrogen）に連結した。キシロース異性化酵素を含むｐＹｅｓ２プラスミドをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（株ＢＪ１９９１，Ｂｅｔｈ Ｊｏｈｎｓ，ＵｖＡから供与）に導入した。この株の遺伝型は：ｍａｔα，ｌｅｕ２，ｔｒｐ１，ｕｒａ３−２５１，ｐｒｂ１−１１２２及びｐｅｐ４−３、である。形質転換細胞をＳＣプレート（０．６７％ ＹＮＢ培地＋０．０５％ Ｌ−Ｌｅｕ＋０．０５％ Ｌ−Ｔｒｐ＋２％グルコース＋２％アガロース）に接種した。
【００５６】
形質転換Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞をグルコース培地で２５℃で７２時間増殖した（グルコースの代わりにラフィノースを使用することができる）。細胞を回収し、グルコースの代わりにガラクトースを加えたＳＣ培地中に再懸濁した。８時間の誘導後、細胞を回収し、硝子ビーズ（０．１０−０．１１ｍｍ径）及び「破壊緩衝液」（５０ｍＭリン酸緩衝液＋５％グリセロール＋プロテアーゼ阻害剤）を使用して分解した。分解の後混合物を遠心分離（１８，０００ｘｇ，４℃，１５分間）した。透明上清を使用して前記方法（実施例１）によりキシロース異性化酵素活性を測定した。１０Ｕ／ｍｇタンパクの活性が３７℃において測定された。
【００５７】
［実施例３］キシロース上での形質転換酵母株の増殖
（培地組成）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を下記組成のＳＣ−培地上で増殖した：０．６７％（ｗ／ｖ）酵母窒素塩基；０．０１％（ｗ／ｖ）Ｌ−トリプトファン；０．０１％（ｗ／ｖ）Ｌ−ロイシン及びグルコース、ガラクトースまたはキシロースまたはこれら基質の組合せのいずれか（下記参照）。寒天培地用に培地に２％（ｗ／ｖ）細菌用寒天を加えた。
【００５８】
（増殖実験）
挿入のないｐＹｅｓ２で形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＪ１９９１（遺伝型：ｍａｔα，ｌｅｕ２，ｔｒｐ１，ｕｒａ３−２５１，ｐｒｂ１−１１２２，ｐｅｐ４−３）及びＰｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２キシロース異性化酵素遺伝子を持つｐＹｅｓ２を含む形質転換細胞（１６．２．１；１６．２．２及び１４．３）を、炭素源として１０ｍＭグルコースを含むＳＣ−寒天プレート上で増殖した。コロニーが見えるようになったとき、一つのコロニーを使用して、炭素源として１００ｍＭキシロース及び２５ｍＭガラクトースを含むＳＶＣ液体培地に接種した。ＬＫＢ Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ Ｋ分光光度計を使用して６００ｎｍの光学密度の増加を測定することにより増殖を監視した。
【００５９】
（結果）
増殖実験の結果を図１にまとめた。挿入のないｐＹｅｓ２で形質転換したＢＪ１９９１株の培養は８０時間までＯＤ６００の増加を示した。この後徐々に減少が観察された。これは増殖の末期にしばしば観察される酵母細胞の凝集によるものである。３種の形質転換細胞は、８０時間後も増殖を止めず、少なくとも１５０時間までさらに増加を示した。
【００６０】
［実施例４］Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＰｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２キシロース異性化酵素を構成的に発現するための新規で改良された酵母発現ベクターの構築
キシロース異性化酵素をコードするＰｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２遺伝子を含むｐＰＩＣＺαベクターを、ＶｅｎｔＲ ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）によるＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーはキシロース異性化酵素をコードする遺伝子の５’及び３’配列を使用して設計し、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ部位を含めた。さらに、プライマーはｐＰＩＣＺα構築中に認められるＸｂａＩ部位を除去し、その代わりに終結コドン（ＴＡＡ）を入れて設計した。最終産物は、ｐＰＩＣＺα構築に認められる追加のアミノ酸（ｈｉｓ及びｃ−Ｍｙｃタグ）のない、元のオープンリードフレームを復元するように設計した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで切り出した。最終産物をｐＹＥＳ２（Invitrogen）由来のベクター中にクローニングした。このベクター中において、キシロース異性化酵素の構成的発現を確実にし、それにより培地にガラクトースを加える必要をなくするために、ｐＹＥＳ２中にあるＧＡＬ１プロモーターをＴＰＩ１プロモーターに置換した。ＴＰＩ１プロモーターはプラスミドｐＹＸ０１２（R&D systems）の修飾型からクローニングした。このプロモーターをＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして切り出した。
【００６１】
このＴＰＩ１プロモーター及びキシロース異性化酵素をコードする遺伝子のＰＣＲ産物を共に、ＳｐｅＩ及びＸｂａＩで切り出したｐＹＥＳ２に連結した。このプラスミドを使用してＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄ（Ｐｅｔｅｒ Ｋｏｔｔｅｒ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔより供与）を形質転換した。この株の遺伝型は：ＭａｔＡ ｕｒａ３−５２である。形質転換細胞は、炭素源として２％グルコースを加えたミネラル培地プレート上で選別した（Verduyn et al.:Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts; a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation.(1992) Yeast 8(7): 501-17)。形質転換していない細胞は、このプレート上では増殖できない。
【００６２】
形質転換細胞を、炭素限定恒成分培養において、グルコース／キシロース混合物に対して増殖した。この条件下で増殖した形質転換細胞は、Ｄｅｒｓｔｅｒｓ−Ｈｉｌｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Kinetic characterization of D-xylose isomerases by enzymatic assays using D-sorbitol dehydrogenase. Enz. Microb. Techol. 9 (1987) 145-148）により開発された特異的酵素検定により、高いキシロース異性化活性（３０℃において８００単位／ｍｇ）を示す。形質転換Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の無細胞抽出物中のキシロース異性化酵素のインビトロ活性は、２価カチオン（Ｍｇ２＋またはＣｏ２＋）に依存し、キシロースに対して約２０ｍＭの比較的低いＫｍ値が認められた。
【００６３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列と少なくとも７０％配列同一性（sequence identity）を有するアミノ酸配列（配列同一性は、Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453 (1970)に記載のアルゴリズムを使用し、Hentikoff and Hentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919(1992)に記載のBLOSSUM62 Comparison matrixを使用し、Gap Penalty:12及びGap Length Penalty:4で同定した）を含むキシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物で形質転換した真菌宿主細胞であって、
該形質転換で、該核酸構築物により、キシロースを炭素源として利用する能力を付与された、真菌宿主細胞。
【請求項２】
前記アミノ酸配列は、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列の１８５−１９４の位置のアミノ酸配列、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列の２３０−２３７の位置のアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列の１０２の位置のヒスチジン、１０５の位置のアスパラギン酸、３４０の位置のアスパラギン酸、及び２３５の位置のリジン、並びに
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列の２３３の位置のグルタミン
を含む、請求項１に記載の真菌宿主細胞。
【請求項３】
前記宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ，Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ，及びＹａｒｒｏｗｉａ属の何れか一つに属する酵母である、請求項１又は２に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項４】
前記酵母が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ，Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ，Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ，Ｓ．ｕｖａｒｕｍ，Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ，Ｋ．ｌａｃｔｉｓ，Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ，及びＫ．ｆｒａｇｉｌｉｓ種の何れか一つに属する、請求項３に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項５】
前記宿主細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ，Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ，及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属の何れか一つに属する糸状菌である、請求項１又は２に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項６】
キシロースをキシルロースに異性化する能力を宿主細胞に付与するために、キシロース異性化酵素をコードする前記ヌクレオチド配列を、前記宿主細胞中で該キシロース異性化酵素を充分に発現させるプロモーターに作動的に連結している、請求項１から５の何れか１項に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞中で、該プロモーターがカタボライト抑制に非感受性である、請求項６に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が
（ａ）該宿主細胞中へのキシロース輸送の増加；
（ｂ）キシルロースキナーゼ活性の増加；
（ｃ）ペントースリン酸経路の流量の増加；
（ｄ）カタボライト抑制に対する感受性の減少；
（ｅ）エタノール、浸透圧または有機酸に対する耐性の増加；及び
（ｆ）副産物生産の減少、
からなる群から選択された特徴を生じる遺伝子修飾を含む、請求項１から７の何れか１項に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項９】
前記遺伝子修飾が、内在性遺伝子の過剰発現、異種遺伝子の発現、またはそれらの組合せからなり、それらによって、該遺伝子が；ヘキソースまたはペントーストランスポーター、キシルロースキナーゼ；ペントースリン酸経路系酵素、解糖系酵素、及びエタノール代謝酵素をコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１０】
前記遺伝子修飾が内在性遺伝子の不活化からなり、それによって、該遺伝子がヘキソースキナーゼ遺伝子、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＩＧ１及びＭＩＧ２遺伝子、並びにそれらの遺伝子の塩基配列に対する相補配列を有するポリヌクレオチドとストリジェントな条件でハイブリダイズし、ヘキソキナーゼ、ＭＩＧ１又はＭＩＧ２活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ホモログからなる群から選択される、請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、該宿主細胞に、乳酸、酢酸、コハク酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質及びセファロスポリンを生産する能力を付与する一つまたはそれ以上の酵素を発現している、請求項１から１０の何れか１項に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、アルコール脱水素酵素活性を減少させる遺伝子修飾を含む、請求項１１に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１３】
（ａ）請求項１から１０の何れか一項に記載の形質転換真菌宿主細胞であって、アルコール発酵能力を有する細胞と共にキシロース資源を含有する培地を発酵することによって、該宿主細胞によってキシロースをエタノールに発酵させ、任意に
（ｂ）エタノールを回収する、
ステップを含む、エタノールの生産プロセス。
【請求項１４】
前記培地がグルコース資源も含む、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
エタノールの容積生産性が、少なくとも０．５ｇ／リットル／時間である、請求項１３又は１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
エタノール収率が少なくとも５０％である、請求項１３から１５の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１７】
（ａ）請求項１１又は１２に記載の形質転換真菌宿主細胞と共にキシロース資源を含む培地を発酵することによって、該真菌宿主細胞によりキシロースを発酵産物に発酵させ、任意に
（ｂ）発酵産物を回収する、
ステップを含む、乳酸、酢酸、コハク酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質及びセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物を生産するプロセス。
【請求項１８】
該培地がグルコース資源も含む、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列と少なくとも７０％配列同一性（sequence identity）を有するアミノ酸配列（配列同一性は、Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453 (1970)に記載のアルゴリズムを使用し、Hentikoff and Hentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919(1992)に記載のBLOSSUM62 Comparison matrixを使用し、Gap Penalty:12及びGap Length Penalty:4で同定した）を含むキシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物で形質転換した真菌宿主細胞であって、
該形質転換で、該核酸構築物により、キシロースを炭素源として利用する能力を付与された、真菌宿主細胞。
【請求項２】
前記アミノ酸配列は、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列の１８５−１９４の位置のアミノ酸配列、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列の２３０−２３７の位置のアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列の１０２の位置のヒスチジン、１０５の位置のアスパラギン酸、３４０の位置のアスパラギン酸、及び２３５の位置のリジン、並びに
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列の２３３の位置のグルタミン
を含む、請求項１に記載の真菌宿主細胞。
【請求項３】
前記宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ，Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ，及びＹａｒｒｏｗｉａ属の何れか一つに属する酵母である、請求項１又は２に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項４】
前記酵母が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ，Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ，Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ，Ｓ．ｕｖａｒｕｍ，Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ，Ｋ．ｌａｃｔｉｓ，Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ，及びＫ．ｆｒａｇｉｌｉｓ種の何れか一つに属する、請求項３に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項５】
前記宿主細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ，Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ，及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属の何れか一つに属する糸状菌である、請求項１又は２に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項６】
キシロースをキシルロースに異性化する能力を宿主細胞に付与するために、キシロース異性化酵素をコードする前記ヌクレオチド配列を、前記宿主細胞中で該キシロース異性化酵素を充分に発現させるプロモーターに作動的に連結している、請求項１から５の何れか１項に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞中で、該プロモーターがカタボライト抑制に非感受性である、請求項６に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が
（ａ）該宿主細胞中へのキシロース輸送の増加；
（ｂ）キシルロースキナーゼ活性の増加；
（ｃ）ペントースリン酸経路の流量の増加；
（ｄ）カタボライト抑制に対する感受性の減少；
（ｅ）エタノール、浸透圧または有機酸に対する耐性の増加；及び
（ｆ）副産物生産の減少、
からなる群から選択された特徴を生じる遺伝子修飾を含む、請求項１から７の何れか１項に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項９】
前記遺伝子修飾が、内在性遺伝子の過剰発現、異種遺伝子の発現、またはそれらの組合せからなり、それらによって、該遺伝子が；ヘキソースまたはペントーストランスポーター、キシルロースキナーゼ；ペントースリン酸経路系酵素、解糖系酵素、及びエタノール代謝酵素をコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１０】
前記遺伝子修飾が内在性遺伝子の不活化からなり、それによって、該遺伝子がヘキソースキナーゼ遺伝子、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＩＧ１及びＭＩＧ２遺伝子、並びにそれらの遺伝子の塩基配列に対する相補配列を有するポリヌクレオチドとストリジェントな条件でハイブリダイズし、ヘキソキナーゼ、ＭＩＧ１又はＭＩＧ２活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ホモログからなる群から選択される、請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、該宿主細胞に、乳酸、酢酸、コハク酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質及びセファロスポリンを生産する能力を付与する一つまたはそれ以上の酵素を発現している、請求項１から１０の何れか１項に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、アルコール脱水素酵素活性を減少させる遺伝子修飾を含む、請求項１１に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１３】
（ａ）請求項１から１０の何れか一項に記載の形質転換真菌宿主細胞であって、アルコール発酵能力を有する細胞と共にキシロース資源を含有する培地を発酵することによって、該宿主細胞によってキシロースをエタノールに発酵させ、任意に
（ｂ）エタノールを回収する、
ステップを含む、エタノールの生産プロセス。
【請求項１４】
前記培地がグルコース資源も含む、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
エタノールの容積生産性が、少なくとも０．５ｇ／リットル／時間である、請求項１３又は１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
エタノール収率が少なくとも５０％である、請求項１３から１５の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１７】
（ａ）請求項１１又は１２に記載の形質転換真菌宿主細胞と共にキシロース資源を含む培地を発酵することによって、該真菌宿主細胞によりキシロースを発酵産物に発酵させ、任意に
（ｂ）発酵産物を回収する、
ステップを含む、乳酸、酢酸、コハク酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質及びセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物を生産するプロセス。
【請求項１８】
該培地がグルコース資源も含む、請求項１７に記載のプロセス。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−２３１７９４（Ｐ２０１２−２３１７９４Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１６７５８５（Ｐ２０１２−１６７５８５）
【出願日】平成２４年７月２７日（２０１２．７．２７）
【分割の表示】特願２００９−１１２８２７（Ｐ２００９−１１２８２７）の分割
【原出願日】平成１５年１月２３日（２００３．１．２３）
【出願人】（５１１１２２３７４）シー５ イースト カンパニー ビー．ブイ． (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年７月２７日（２０１２．７．２７）
【分割の表示】特願２００９−１１２８２７（Ｐ２００９−１１２８２７）の分割
【原出願日】平成１５年１月２３日（２００３．１．２３）
【出願人】（５１１１２２３７４）シー５ イースト カンパニー ビー．ブイ． (2)
【Ｆターム（参考）】
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