ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼおよび／またはピルビン酸正リン酸ジキナーゼをコードする構築物を含む形質転換植物
本発明は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）活性および／またはピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）活性を有する少なくとも１種のポリペプチドをコードする、少なくとも１つのコード配列に作動可能に連結された老化特異的プロモーターを含む遺伝子構築物を提供する。本構築物は、形質転換植物において、葉の老化中に窒素の転流を引き起こす能力を持っていて、窒素を葉から植物の他の領域まで輸送することができる。本発明は、そのような構築物によって形質転換された植物細胞および植物、形質転換植物を生産する方法、ならびに、老化した植物における窒素の転流率および成長率を上げる方法を提供する。本発明は、遺伝子構築物で形質転換されている収穫された植物の葉（例えば、タバコの葉）、およびそのような収穫された植物の葉を含む喫煙物品も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換植物の生産に使用される遺伝子構築物に関する。本構築物は、葉の老化中に窒素の転流(remobilisation)を引き起こす能力を持っていて、窒素を葉から植物の他の領域まで輸送することができる。本発明は、そのような構築物で形質転換された植物細胞、および形質転換植物そのものに及ぶ。本発明は、形質転換植物の生産方法、および老化した植物中の窒素転流率を上昇させる方法にも関する。また、本発明は、遺伝子構築物で形質転換されている収穫された植物の葉（例えば、タバコの葉）、およびそのような収穫された植物の葉を含む喫煙物品にも関する。
【背景技術】
【０００２】
葉の老化は、葉の細胞が細胞死の前に異なる代謝および構造の変化を受ける植物の発育の一段階である。生理学的および遺伝学的研究では、老化は高度に調節されたプロセスであることが示されている。葉の老化の進行は、葉緑体の分解によって生じるクロロフィルの喪失およびその後の黄変を見かけ上の特徴とする。このような発育段階の特徴である葉のクロロフィル濃度の低下は、例えば、溶媒抽出および分光光度測定によって、あるいは、クロロフィル成分計によって測定することができる。好ましくは一定の条件で育てられた同じ植物について記録された初期の葉のクロロフィル濃度と比較した葉のクロロフィル濃度の低下は、老化を示す。
【０００３】
分子的研究では、老化は遺伝子発現における変化と関連していることが示されている。光合成に関与するタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは老化中に減少するが、老化に関与していると思われているタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルは増加する。老化は、老化関連遺伝子（ＳＡＧ）として知られている遺伝子によって調節される高度に組織化されたプロセスである。葉の老化は、タンパク質、核酸および膜の劣化、ならびに、この劣化によってその後に生じる発育中の種子、葉または貯蔵器官などの植物の他の領域への栄養分の輸送を伴う。植物の老化の問題の１つは、老化した葉に存在する多くの有用なミネラルおよび栄養分が葉の中に残留し、葉が枯れるにつれて実質的に失われることである。例えば、老化した葉に存在する窒素（アミノ酸のアミン基の形態であってもよい）は、枯れている葉から取り出さなければ無駄になる。
【０００４】
従って、特に植物が老化した場合に植物中の窒素の転流を増加させることは、作物生産において重要な有用性を有する可能性がある。最初に、葉から転流される窒素は、より若い葉ならびに発育中の種子に輸送することができる。従って、老化した葉からの窒素の退出効率を上げることによって、種子および植物のより若い部分への窒素の供給を増加させ、それにより、作物収穫率および窒素使用効率を上げることができるかもしれない。これは、世界人口が増加している際には明らかに有益な目的であるが、作物収穫率は需要を満たす程十分に上昇していない。１つの標的となり得る作物は、栄養組織からの窒素の転流が乏しいために低い窒素効率を有するセイヨウアブラナ（学名：Brassica napus）（菜種）である。穀物タンパク質含有量を増加させるという潜在的な利点が大きいという理由から、別の標的作物は小麦である。穀物タンパク質含有量は、小麦の栄養価に影響を与えるだけでなく、穀物の使用および、従って市場価格も決定する。例えば、穀物タンパク質含有量の増加によりパンの体積が増加する。また、タバコの葉の中の残余窒素はニトロソアミンの生成に寄与することが知られているため、窒素の転流を増加させる能力は、タバコ産業において非常に有用になり得る。
【０００５】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫまたはＰＣＫ）［ＥＣ４．１．１．４９］およびピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）［ＥＣ２．７．９．１］という酵素が知られている。ＰＰＤＫは原核生物および真核生物の両方に存在し、細菌とより高度な植物との間で配列および三次構造が保存されている(Pocalyko et al., 1990, Biochemistry, 29, 10757-10765)。この酵素は、ピルビン酸＋Ｐｉ＋ＡＴＰ＝ＰＥＰ＋ＰＰｉ＋ＡＭＰの反応において、ピルビン酸の可逆的リン酸化を触媒してホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を生成する(Carroll et al., 1990, Federation of European Biochemical Societies, 274, 178-180; Hatch & Slack, 1968, Biochemical Journal, 106, 141-146)。Ｃ３およびＣ４植物の両方において、ＰＰＤＫ遺伝子は、同じ遺伝子から産生される２種類の転写産物を有する変わった構造を有する。長い方の転写産物は葉緑体のタンパク質をコードし、第一エクソンが葉縁体輸送ペプチドをコードするが、短い方の転写産物は、長い方の転写産物の第一イントロン内で別のプロモーターから転写されるため、葉縁体輸送ペプチドをコードする第一エクソンが存在しない。この短い方の転写産物は、ＰＰＤＫの細胞質基質のイソ型を生成する。この遺伝子構造は、トウモロコシ、イネ、Ｃ３およびＣ４フラベリア属およびシロイヌナズナ（学名：Arabidopsis thaliana）で報告されている。
【０００６】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）は、オキサロ酢酸＋ＡＴＰ＝ＰＥＰ＋ＡＤＰ＋ＣＯ２の反応において、ＡＤＰ、二酸化炭素およびホスホエノールピルビン酸の可逆的反応を触媒して、ＡＴＰおよびオキサロ酢酸を生成する。ＰＣＫは広範囲な植物組織の細胞の細胞質基質に存在することが知られている。これらの植物組織としては、発育中の種子、毛状突起および根が挙げられる。植物中のＰＣＫは窒素化合物の代謝が増加した組織内に出現する。
【０００７】
本発明者らは、ＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫ酵素をコードする遺伝子がプロモーターの制御下で単独あるいは一緒に配置されている複数の遺伝子構築物を作製し、存在すれば、これらの遺伝子の過剰発現が老化した葉の中の窒素の転流にどのような効果を与えたかについて調べた。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の第１の局面によれば、少なくとも１つのコード配列に作動可能に連結された老化特異的プロモーターを含み、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）活性および／またはピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）活性を有する少なくとも１種のポリペプチドをコードする遺伝子構築物が提供される。
【０００９】
本発明の第２の局面によれば、少なくとも１つのコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）活性およびピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）活性を有する少なくとも１種のポリペプチドをコードする遺伝子構築物が提供される。
【００１０】
本発明者らは、ＰＣＫおよびＰＰＤＫの２種類の酵素が、老化中の葉からの窒素の転流の間に、様々なアミノ酸の相互転換に関与している可能性があると考えた。本発明者らは仮定に縛られることを望んでないが、ＰＣＫおよびＰＰＤＫがどのように窒素の転流に影響を与え得るかについて示す推測上の生化学的経路が図１８に示されている。従って、本発明者らは、老化中に独立してあるいは同時に植物中のこれらの２種類の酵素の過剰発現を刺激することが窒素の転流に関わっている可能性があると考えた。
【００１１】
研究の結果として、本発明者らは、驚くべきことにＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫをコードする本発明に係る構築物によって、老化した葉からの窒素転流率を上昇させることを見い出した。本発明者らは、窒素はアミノ酸の形態で老化した葉から植物の種子などの植物のより若い部分に移動するのではないかと仮定する。さらに、本発明者らは、これらの酵素が老化した葉の中で過剰発現した際に、栄養植物の成長量の増加（作物収穫率の上昇に該当する）も観察した。従って、本発明者らは、本発明に係る構築物が形質転換植物の生産に有用であり、それにより、老化した葉からの窒素転流率および／または成長率の上昇を示すことができるのではないかと考える。
【００１２】
第１または第２の局面の遺伝子構築物中のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを誘発してＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫ活性を有する少なくとも１種のポリペプチドをコードする少なくとも１つのコード領域に結合しかつその転写を開始することができるものであってもよい。
【００１３】
第２の局面の構築物中に存在するプロモーターは、構成性、非構成性または組織特異的であってもよい。好適なプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（完全もしくは切断型）、ルビスコプロモーター、エンドウマメプラストシアニンプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、クロロフィルｒ／ｂ結合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α，β−グリアジンプロモーター、ホルデインプロモーターまたはパタチンプロモーターが挙げられる。
【００１４】
第２の局面の構築物に存在するプロモーターは、老化特異的プロモーターであってもよい。
【００１５】
「老化特異的プロモーター（ＳＡＧ）」は、老化関連遺伝子の発現の制御に関連するプロモーターとすることができる。従って、このプロモーターは、実質的に老化している組織の中でのみ、プロモーターが作動可能に連結されたコード配列（すなわち、遺伝子）の発現を制限することができる。従って、老化特異的プロモーターは、実質的に植物組織が老化している場合にのみ３’タンパク質コード領域の発現が生じるように発生学的に調節される方法で、植物組織中で遺伝子発現を優先的に促進することができるプロモーターとすることができる。当然のことながら、老化は古い葉などの植物の古い部分で生じ、種子などの植物の若い部分では生じない傾向がある。
【００１６】
多数の老化関連遺伝子を発現することで知られている植物の一例は、シロイヌナズナである。従って、第１または第２の局面に係る構築物中のプロモーターは、シロイヌナズナの老化関連遺伝子から単離したものであってもよい。Ｇｅｐｓｔｅｉｎら(The Plant Journal, 2003, 36, 629-642)は、モデルとしてシロイヌナズナを用いて、ＳＡＧおよびそのプロモーターについて詳しい研究を行なった。当該遺伝子構築物は、本明細書に開示されている任意のＳＡＧ由来のプロモーターを含んでいてもよい。例えば、好適なプロモーターは、ＳＡＧ１２、ＳＡＧ１３、ＳＡＧ１０１、ＳＡＧ２１およびＳＡＧ１８からなる群またはその機能的な変異体もしくは機能的な断片から選択されてもよい。
【００１７】
好ましいプロモーターは、ＳＡＧ１２およびＳＡＧ１３プロモーターである。一実施形態では、当該プロモーターは、当業者に知られているＳＡＧ１２プロモーターまたはその機能的な変異体もしくは断片である(Gan & Amasino, 1997, Plant Physiology, 113: 313-319)。ＳＡＧ１２プロモーターをコードするＤＮＡ配列は、本明細書では以下のとおり配列番号１６と称する：
配列番号１６
TCGAGACCCGATTGTTATTTTTAGACTGAGACAAAAAAGTAGAATCGTTGATTGTTAAAATTTAAAATTAGTTTCATTACGTTTCGATAAAAAAATGATTAGTTTATCATAGCTTAATTATAGCATTGATTTCTAAATTTGTTTTTTGACCACCCTTTTTTCTCTCTTTGGTGTTTTCTTAACATTAGAAGAACCCATAACAATGTACGTTCAAATTAATTAAAAACAATATTTCCAAGTTTTATATACGAAACTTGTTTTTTTTAATGAAAACAGTTGAATAGTTGATTATGAATTAGTTAGATCAATACTCAATATATGATCAATGATGTATATATATGAACTCAGTTGTTATACAAGAAATGAAAATGCTATTTAAATACAGATCATGAAGTGTTAAAAAGTGTCAGAATATGACATGAAGCGTTTTGTCCTACCGGGTATTCGAGTTATAGGTTTGGATCTCTCAAGAATATTTTGGGCCATACTAGTTATATTTGGGCTTAAGCGTTTTGCAAAGAGACGAGGAAGAAAGATTGGGTCAAGTTAACAAAACAGAGACACTCGTATTAGTTGGTACTTTGGTAGCAAGTCGATTTATTTGCCAGTAAAAACTTGGTACACAACTGACAACTCGTATCGTTATTAGTTTGTACTTGGTACCTTTGGTTCAAGAAAAAGTTGATATAGTTAAATCAGTTGTGTTCATGAGGTGATTGTGATTTAATTTGTTGACTAGGGCGATTCCTTCACATCACAATAACAAAGTTTTATAGATTTTTTTTTTATAACATTTTTGCCACGCTTCGTAAAGTTTGGTATTTACACCGCATTTTTCCCTGTACAAGAATTCATATATTATTTATTTATATACTCCAGTTGACAATTATAAGTTTATAACGTTTTTACAATTATTTAAATACCATGTGAAGATCCAAGAATATGTCTTACTTCTTCTTTGTGTAAGAAAACTAACTATATCACTATAATAAAATAATTCTAATCATTATATTTGTAAATATGCAGTTATTTGTCAATTTTGAATTTAGTATTTTAGACGTTATCACTTCAGCCAAATATGATTTGGATTTAAGTCCAAAATGCAATTTCGTACGTATCCCTCTTGTCGTCTAATGATTATTTCAATATTTCTTATATTATCCCTAACTACAGAGCTACATTTATATTGTATTCTAATGACAGGGAAACCTTCATAGAGATTCAGATAGATGAAATTGGTGGGAAACATCATTGAACAGGAAACTTTTAGCAAATCATATCGATTTATCTACAAAAGAATACGTAGCGTAATGAAGTCCACTTGTTGTGAATGACTATGATTTGATCAAATTAGTTAATTTTGTCGAATCATTTTTCTTTTTGATTTGATTAAGCTTTTAACTTGCACGAATGGTTCTCTTGTGAATAAACAGAATCTTTGAATTCAAACTATTTGATTAGTGAAAAGACAAAAGAAGATTCCTTGTTTTTATGTGATTAGTGATTTTGATGCATGAAAGGTACCTACGTACTACAAGAAAAATAAACATGTACGTAACTACGTATCAGCATGTAAAAGTATTTTTTTCCAAATAATTTATACTCATGATAGATTTTTTTTTTTTGAAATGTCAATTAAAAATGCTTTCTTAAATATTAATTTTAATTAATTAAATAAGGAAATATATTTATGCAAAACATCATCAACACATATCCAACTTCGAAAATCTCTATAGTACACAAGTAGAGAAATTAAATTTTACTAGATACAAACTTCCTAATCATCAAATATAAATGTTTACAAAACTAATTAAACCCACCACTAAAATTAACTAAAAATCCGAGCAAAGTGAGTGAACAAGACTTGATTTCAGGTTGATGTAGGACTAAAATGACTACGTATCAAACATCAACGATCATTTAGTTATGTATGAATGAATGTAGTCATTACTTGTAAAACAAAAATGCTTTGATTTGGATCAATCACTTCATGTGAACATTAGCAATTACATCAACCTTATTTTCACTATAAAACCCCATCTCAGTACCCTTCTGAAGTAATCAAATTAAGAGCAAAAGTCATTTAACTTAGG
【００１８】
従って、本発明の構築物中のプロモーターは、実質的に配列番号１６に示すヌクレオチド配列またはその機能的な変異体もしくは機能的な断片を含んでいてもよい。ＳＡＧ１２プロモーター配列は、米国特許第５，６８９，０４２号に記載されているようなシロイヌナズナから得られたものであってもよい。このプロモーター配列は、図３に示すように本発明に係る遺伝子構築物のそれぞれにおいて見られる。プロモーターがＳＡＧ１２である実施形態では、当然のことながら、当該プロモーターは、配列番号１６の１〜２０９３の各塩基を含んでいてもよい。ただし、プロモーターの機能的な変異体もしくは機能的な断片が本発明の遺伝子構築物に使用されていてもよい。
【００１９】
「プロモーターの機能的な変異体もしくは機能的な断片」は、そこに作動可能に連結された任意のコード領域の発現を開始させるのに機能的に十分であるプロモーターの誘導体または部分とすることができる。例えば、プロモーターがＳＡＧ１２に基づいている実施形態では、当業者であれば、配列番号１６が修飾されていても、ＳＡＧ１２プロモーターの部分のみが必要とされてもよく、それによって、本構築物における遺伝子発現がなお開始されることを理解しているであろう。
【００２０】
プロモーターの機能的な変異体および機能的な断片は、転写酵素が推定プロモーター領域に結合し、次いで、コード領域の転写を引き起こしてＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫ活性を有するポリペプチドが発現するか否かを評価することによって容易に同定することができる。あるいは、そのような機能的な変異体および断片は、コード領域に結合されている場合には、プロモーター上で突然変異生成を行ない、遺伝子発現が生じ得るか否かを評価することによって調べてもよい。
【００２１】
第１の局面の遺伝子構築物は、老化中にＰＣＫ活性および／またはＰＰＤＫ活性を示す少なくとも１種のポリペプチドの発現を生じさせることができる。従って、遺伝子構築物は、（ｉ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片および／または（ｉｉ）ピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片をコードする少なくとも１つのコード配列を含んでいてもよい。実施例に記載されているように、本発明者らは、ＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫ活性を有するポリペプチドに基づいた様々な遺伝子構築物を開発し、これらを図３に示す。
【００２２】
第１の局面に係る遺伝子構築物の第１の実施形態では、プロモーターは、ＰＣＫ活性を示すポリペプチドをコードするコード配列の発現を誘発してもよい。これは、本明細書では「ＰＣＫ構築物」と称し、図３に示す。従って、第１の実施形態では、遺伝子構築物は、老化特異的プロモーター、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）をコードするコード配列あるいはその機能的な変異体もしくは断片を含んでいてもよい。本遺伝子構築物は、ＰＰＤＫ活性を有するポリペプチドをコードしないものであってもよい。
【００２３】
第１の局面に係る構築物の第２の実施形態では、プロモーターは、ＰＰＤＫ活性を示すポリペプチドをコードするコード配列の発現を誘発してもよい。これは、本明細書では「ＰＰＤＫ構築物」と称し、図３に示す。第２の実施形態では、本遺伝子構築物は、老化特異的プロモーター、およびピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）をコードするコード配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含んでいてもよい。遺伝子構築物は、ＰＣＫ活性を有するポリペプチドをコードしないものであってもよい。
【００２４】
第１の局面に係る構築物の第３の実施形態では、プロモーターは、ＰＣＫ活性およびＰＰＤＫ活性を示すポリペプチドをコードする単一のコード配列の発現を誘発してもよい。これを「ＰＣＫ／ＰＰＤＫ構築物１」と称す。第３の実施形態では、遺伝子構築物は、老化特異的プロモーターならびに（ｉ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片および（ｉｉ）ピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片をコードするコード配列を含んでいてもよい。第３の実施形態の構築物は、二重活性（すなわち、ＰＣＫおよびＰＰＤＫの両方の酵素活性）を示す単一の転写産物をコードしてもよい。ＰＣＫコード領域は、ＰＰＤＫコード領域の３'末端に配置されていてもよい。ただし、好ましくは、ＰＣＫコード領域は、ＰＰＤＫコード領域の５'末端に配置されている。
【００２５】
第１の局面に係る構築物の第４の実施形態では、プロモーターは、（ｉ）ＰＣＫ活性を示す第１のポリペプチドをコードする第１のコード配列および（ｉｉ）ＰＰＤＫ活性を示す第２のポリペプチドをコードする第２のコード配列の発現を誘発してもよい。これをＰＣＫ／ＰＰＤＫ構築物２と称す。よって、第４の実施形態では、本遺伝子構築物は、少なくとも１つの老化特異的プロモーターならびに（ｉ）ＰＣＫをコードする第１のコード配列またはその機能的な変異体もしくは断片および（ｉｉ）ＰＰＤＫをコードする第２のコード配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含んでいてもよい（すなわち、各酵素に対して１種類の２種類の転写産物がコードされる）。
【００２６】
実施例６に記載されているように、本発明者らは、（例えば、「ＰＣＫ構築物」または「ＰＰＤＫ構築物」のいずれか一方による形質転換によって）宿主細胞中のＰＣＫまたはＰＰＤＫのいずれか一方を過剰発現させることで、老化した葉の中の窒素の転流が増加することを見い出した。さらに、本発明者らは、ＰＣＫおよびＰＰＤＫの単一の構築物によって栄養成長が増加することを見い出した。
【００２７】
実施例８に記載されているように、本発明者らは、（例えば、「ＰＣＫ構築物」または「ＰＰＤＫ構築物」の両方による形質転換によって）宿主細胞中のＰＣＫまたはＰＰＤＫを同時に過剰発現させることは、老化した葉の中の窒素の転流を誘発する際に驚くほど有効であることを見い出した。従って、窒素は、例えば輸送アミノ酸として老化した葉から輸送されてもよい。好適な輸送アミノ酸はグルタミンおよび／またはアスパラギンであってもよい。さらに、老化中にＰＣＫおよびＰＰＤＫを同時に過剰発現させることによって成長率を上げ、それにより、栄養成長を増加させてもよい。従って、第１の局面の構築物は、ＰＣＫおよびＰＰＤＫまたはそれらの機能的な変異体もしくは断片をコードするコード配列を含んでいてもよい。
【００２８】
第２の局面の構築物がＰＣＫおよびＰＰＤＫをコードするコード配列またはそれらの機能的な変異体もしくは断片を含むことはいうまでもない。この２種類の酵素は二重活性を有する単一のポリペプチドとして、あるいは一方がＰＣＫ活性を有し、他方がＰＰＤＫ活性を有する２種類のポリペプチドとしてコードされてもよい。
【００２９】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片およびピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片はそれぞれ、植物などの任意の好適な供給源に由来するものであってもよい。各酵素のコード配列は、好適な植物源、例えばシロイヌナズナに由来するものであってもよい。従って、ＰＣＫ活性を有するポリペプチドをコードするコード配列は、シロイヌナズナに由来するものであってもよい。さらに、ＰＰＤＫ活性を有するポリペプチドをコードするコード配列は、シロイヌナズナ属、トウモロコシ属、フラベリア属またはクレオメ属に由来するものであってもよい。ＰＰＤＫ活性を有するポリペプチドをコードするコード配列は、シロイヌナズナ、トウモロコシ、フラベリア・トリネルビア(Flaveria trinervia)、フラベリア・ビデンティス(Flaveria bidentis)、フラベリア・ブロウニー(Flaveria brownie)またはフウチョウソウに由来するものであってもよい。
【００３０】
シロイヌナズナにはＰＣＫをコードする３種類の遺伝子が存在すると考えられている。シロイヌナズナのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）の一実施形態をコードするゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）配列（イントロンおよびエクソンを含む）は、本明細書では以下のとおり配列番号１７として示す：
配列番号１７
ATGTCGGCCGGTAACGGAAATGCTACTAACGGTGACGGAGGGTTTAGTTTCCCTAAAGGACCGGTGATGCCGAAGATAACGACCGGAGCAGCAAAGAGAGGTAGCGGAGTCTGCCACGACGATAGTGGTCCGACGGTGAATGCCACAACCATCGATGAGCTTCATTCGTTACAGAAGAAACGTTCTGCTCCTACCACACCGATCAACCAAAACGCCGCCGCTGCTTTTGCCGCCGTCTCCGAGGAGGAGCGTCAGAAGATTCAGCTTCAATCTATCAGGTCCTTATAATAACTTCACATATACAGATTATTCATACGTTACTTTTGTTTATAACATACTTTATATCGAATTAAGGAAGATTATTGCGTTTTCGTGTCCGATCATTTTCATGGAAAAAGTGTCTTTTAGCTAAATATATGGTGTAGTATTAAATATTTCTGACGTGATATACACTAAACTTGAAAATTTTCAATTACTATTTCTTCCTTTAATTCGGCAATATAATTTGTTTTTGTTTATTTTTGGATTAGACATTTATGGACAAGTTAATGCGCTATTGTGACTATTACCAGAAAATAATACTTTAATGTACATGACACGTGTTTAAAACGACACGTGGAAACTAATTTTGATTAATTGTGAAACAGTGCATCGTTAGCATCGTTAACGAGAGAGTCAGGACCAAAGGTGGTGAGAGGAGATCCGGCGGAGAAGAAGACCGATGGTTCAACTACTCCGGCGTACGCTCACGGCCAACATCATTCTATCTTTTCTCCGGCTACTGGTGCTGTCAGTGATAGCTCCTTGAAGTTTACTCACGTCCTCTACAATCTTTCGCCTGCAGGTCAACAAATAAACCTAGAATCCGAATCTGAATATTGATAAATGTTTCTGCAACGAGTTTGATAGATTTGGTTTGTGATTTTGTTGTTTGTAGAGCTTTATGAGCAAGCTATTAAGTATGAGAAAGGTTCGTTTATCACTTCTAATGGAGCTTTGGCGACGCTTTCTGGTGCTAAGACTGGTCGTGCTCCCAGAGATAAGCGTGTTGTTAGAGATGCTACTACTGAGGATGAGCTTTGGTGGGGAAAGTGAGTATTCCTAATCTCGATTTTGATTGATGGAGTTTTTGGGTTTATGCTCTGTTTTCGTTTATTGATTTTGGAGTTTGATTTTGATTTTAGGGGTTCGCCGAATATCGAAATGGATGAACATACTTTCATGGTGAACAGAGAAAGAGCTGTTGATTACTTGAATTCCTTGGAAAAGGTATTAAATTTTGAAAACTTTAATCAATGTTGTTGAGTGTAGAACTTTTGATCTAAGTTTATGAAATTTCTGTTGTTGTTGGGGTTTTTAGGTCTTTGTCAATGACCAATACTTAAACTGGGATCCAGAGAACAGAATCAAAGTCAGGATTGTCTCAGCTAGAGCTTACCATTCATTGTTTATGCACAACATGTAAGTAAAATCATTATTGACTCCTTGTATGTCAATCCATTATTGTGGGTGAAAGAAAACAACAAATTAGTAACTGGGGAGGGTGTCAGGTGTATCCGACCAACTCAGGAGGAGCTTGAGAGCTTTGGTACTCCGGATTTTACTATATACAATGCTGGGCAGTTTCCATGTAATCGTTACACTCATTACATGACTTCGTCCACTAGCGTAGACCTTAATCTGGCTAGGAGGGAAATGGTTATACTTGGTACTCAGTATGCTGGGGAAATGAAGAAGGGTCTTTTCAGTGTGATGCATTACCTTATGCCTAAGCGTCGTATTCTCTCCCTTCATTCTGGATGCAATATGGGAAAAGATGGAGATGTTGCTCTCTTCTTTGGACTTTCAGGTATAGTAGAGACAGTACCAACTATGGTGTTGGGTGATGATGGAAGGAACGATAAATCAAATGATACAATACAATTACTGCTGAACTGACTTGAGAACTGCTTGCCTCTTTGTTGAGTTTAGCGGGTGAATTGAGATTGATGATTGTGTTTTTTGTTTTCTATGAATGATGATTTTAGGTACCGGGAAGACAACGCTGTCTACTGATCACAACAGGTATCTTATTGGAGATGATGAGCATTGTTGGACTGAGACTGGTGTTTCGAACATTGAGGGTGGGTGCTATGCTAAGTGTGTTGATCTTTCGAGGGAGAAGGAGCCTGATATCTGGAACGCTATCAAGTTTGGAACAGGTAGAAAGACAGTACGTTGGAATTGTTTTTGAGAAAAAAACATAAAGCAGTGATATAACAATAAGATTCTGATCTTGTTGCAGTTTTGGAAAATGTTGTGTTTGATGAGCACACCAGAGAAGTGGATTACTCTGATAAATCTGTTACAGGTAAAACAATTGTTATTTCTTTCATTCTCTTCGTCCTCACAATTAACAGAATGATCATTTTCGATTCTCTTTGGTTGCAGAGAACACACGTGCTGCCTACCCAATTGAGTTCATTCCAAATGCGAAAATACCTTGTGTTGGTCCACACCCGACAAATGTGATACTTCTGGCTTGTGATGCCTTTGGTGTTCTCCCACCTGTGAGCAAGCTGAATCTGGCACAAACCATGTACCACTTCATCAGTGGTTACACTGCTCTGGTAAGGCCAAAGTAAAAGTCTTTATTTTGCACATCGTCTTCATAAATTTCAAAAGCATAACCAAAGATGTGCAACATATATAGGTTGCTGGCACAGAGGATGGTATCAAGGAGCCAACAGCAACATTCTCAGCTTGCTTTGGTGCAGCTTTCATAATGTTGCATCCCACAAAGTATGCAGCTATGTTAGCTGAGAAGATGAAGTCACAAGGTGCTACTGGTTGGCTCGTCAACACTGGTTGGTCTGGTGGCAGGTATATATGTCCTTCTATGGAAATCGATACAACAAAACGCTGCCTTGTAACACATGTTTGTAGGCTATTAACATGATCTGTAATGTTTTATTTCCTGCAGTTATGGTGTTGGAAACAGAATCAAGCTGGCATACACTAGAAAGATCATCGATGCAATCCATTCGGGCAGTCTCTTGAAGGCAAACTACAAGAAAACCGAAATCTTTGGATTTGAAATCCCAACTGAGATCGAAGGGATACCTTCAGAGATCTTGGACCCCGTCAACTCCGTAAGTTTCTGCAAATCTGTATAATGTAATTGCTTAAGTGATGATGAACAATTTTTTGTTGATTTGGGTTTAATGAAAATGCAGTGGTCTGATAAGAAGGCACACAAAGATACTCTGGTGAAACTGGGAGGTCTGTTCAAGAAGAACTTCGAGGTTTTTGCTAACCATAAGATTGGTGTGATGGTAAGCTTACGGAGGAGATTCTCGCTGCTGGTCCTATCTTTTAG
【００３１】
シロイヌナズナのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列（エクソンのみ）は、本明細書では以下のとおり配列番号１８として示す：
配列番号１８
ATGTCGGCCGGTAACGGAAATGCTACTAACGGTGACGGAGGGTTTAGTTTCCCTAAAGGACCGGTGATGCCGAAGATAACGACCGGAGCAGCAAAGAGAGGTAGCGGAGTCTGCCACGACGATAGTGGTCCGACGGTGAATGCCACAACCATCGATGAGCTTCATTCGTTACAGAAGAAACGTTCTGCTCCTACCACACCGATCAACCAAAACGCCGCCGCTGCTTTTGCCGCCGTCTCCGAGGAGGAGCGTCAGAAGATTCAGCTTCAATCTATCAGTGCATCGTTAGCATCGTTAACGAGAGAGTCAGGACCAAAGGTGGTGAGAGGAGATCCGGCGGAGAAGAAGACCGATGGTTCAACTACTCCGGCGTACGCTCACGGCCAACATCATTCTATCTTTTCTCCGGCTACTGGTGCTGTCAGTGATAGCTCCTTGAAGTTTACTCACGTCCTCTACAATCTTTCGCCTGCAGAGCTTTATGAGCAAGCTATTAAGTATGAGAAAGGTTCGTTTATCACTTCTAATGGAGCTTTGGCGACGCTTTCTGGTGCTAAGACTGGTCGTGCTCCCAGAGATAAGCGTGTTGTTAGAGATGCTACTACTGAGGATGAGCTTTGGTGGGGAAAGGGTTCGCCGAATATCGAAATGGATGAACATACTTTCATGGTGAACAGAGAAAGAGCTGTTGATTACTTGAATTCCTTGGAAAAGGTCTTTGTCAATGACCAATACTTAAACTGGGATCCAGAGAACAGAATCAAAGTCAGGATTGTCTCAGCTAGAGCTTACCATTCATTGTTTATGCACAACATGTGTATCCGACCAACTCAGGAGGAGCTTGAGAGCTTTGGTACTCCGGATTTTACTATATACAATGCTGGGCAGTTTCCATGTAATCGTTACACTCATTACATGACTTCGTCCACTAGCGTAGACCTTAATCTGGCTAGGAGGGAAATGGTTATACTTGGTACTCAGTATGCTGGGGAAATGAAGAAGGGTCTTTTCAGTGTGATGCATTACCTTATGCCTAAGCGTCGTATTCTCTCCCTTCATTCTGGATGCAATATGGGAAAAGATGGAGATGTTGCTCTCTTCTTTGGACTTTCAGGTACCGGGAAGACAACGCTGTCTACTGATCACAACAGGTATCTTATTGGAGATGATGAGCATTGTTGGACTGAGACTGGTGTTTCGAACATTGAGGGTGGGTGCTATGCTAAGTGTGTTGATCTTTCGAGGGAGAAGGAGCCTGATATCTGGAACGCTATCAAGTTTGGAACAGTTTTGGAAAATGTTGTGTTTGATGAGCACACCAGAGAAGTGGATTACTCTGATAAATCTGTTACAGAGAACACACGTGCTGCCTACCCAATTGAGTTCATTCCAAATGCGAAAATACCTTGTGTTGGTCCACACCCGACAAATGTGATACTTCTGGCTTGTGATGCCTTTGGTGTTCTCCCACCTGTGAGCAAGCTGAATCTGGCACAAACCATGTACCACTTCATCAGTGGTTACACTGCTCTGGTTGCTGGCACAGAGGATGGTATCAAGGAGCCAACAGCAACATTCTCAGCTTGCTTTGGTGCAGCTTTCATAATGTTGCATCCCACAAAGTATGCAGCTATGTTAGCTGAGAAGATGAAGTCACAAGGTGCTACTGGTTGGCTCGTCAACACTGGTTGGTCTGGTGGCAGTTATGGTGTTGGAAACAGAATCAAGCTGGCATACACTAGAAAGATCATCGATGCAATCCATTCGGGCAGTCTCTTGAAGGCAAACTACAAGAAAACCGAAATCTTTGGATTTGAAATCCCAACTGAGATCGAAGGGATACCTTCAGAGATCTTGGACCCCGTCAACTCCTGGTCTGATAAGAAGGCACACAAAGATACTCTGGTGAAACTGGGAGGTCTGTTCAAGAAGAACTTCGAGGTTTTTGCTAACCATAAGATTGGTGTGATGGTAAGCTTA CGGAGGAGATTCTCGCTGCTGGTCCTATCTTTTAG
【００３２】
従って、ＰＣＫ活性を有するポリペプチドをコードするコード配列は、実質的に配列番号１７または配列番号１８に示す核酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含んでいてもよい。
【００３３】
シロイヌナズナのＰＣＫのポリペプチド配列は、本明細書では以下のとおり配列番号１９として示す：
配列番号１９
MSAGNGNATNGDGGFSFPKGPVMPKITTGAAKRGSGVCHDDSGPTVNATTIDELHSLQKKRSAPTTPINQNAAAAFAAVSEEERQKIQLQSISASLASLTRESGPKVVRGDPAEKKTDGSTTPAYAHGQHHSIFSPATGAVSDSSLKFTHVLYNLSPAELYEQAIKYEKGSFITSNGALATLSGAKTGRAPRDKRVVRDATTEDELWWGKGSPNIEMDEHTFMVNRERAVDYLNSLEKVFVNDQYLNWDPENRIKVRIVSARAYHSLFMHNMCIRPTQEELESFGTPDFTIYNAGQFPCNRYTHYMTSSTSVDLNLARREMVILGTQYAGEMKKGLFSVMHYLMPKRRILSLHSGCNMGKDGDVALFFGLSGTGKTTLSTDHNRYLIGDDEHCWTETGVSNIEGGCYAKCVDLSREKEPDIWNAIKFGTVLENVVFDEHTREVDYSDKSVTENTRAAYPIEFIPNAKIPCVGPHPTNVILLACDAFGVLPPVSKLNLAQTMYHFISGYTALVAGTEDGIKEPTATFSACFGAAFIMLHPTKYAAMLAEKMKSQGATGWLVNTGWSGGSYGVGNRIKLAYTRKIIDAIHSGSLLKANYKKTEIFGFEIPTEIEGIPSEILDPVNSWSDKKAHKDTLVKLGGLFKKNFEVFANHKIGVMVSLRRRFSLLVLSF
【００３４】
従って、ＰＣＫ活性を有するポリペプチドは、実質的に配列番号１９に示すアミノ酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含んでいてもよい。
【００３５】
シロイヌナズナはＰＰＤＫの少なくとも２種類の型、すなわち葉緑体型および細胞質基質型を有し、どちらも遺伝子の５'末端に僅かなスプライシングの変形を有する同じ遺伝子によってコードされ、それにより２種類の型が生じると考えられている。シロイヌナズナのピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）の両型をコードするｇＤＮＡ配列（イントロンおよびエクソンを含む）は、本明細書では以下のとおり配列番号２０として示す：
配列番号２０
ATGACAAGTATGATCGTGAAGACAACGCCGGAGCTCTTCAAAGGAAATGGAGTGTTCCGTACGGATCATCTCGGAGAAAACCGAATGGTTAGTCGATCAAACCGGCTAGGTGATGGATCAAACCGTTTCCCTAGAACCGGTACAATCCATTGCCAACGGTTAAGCATAGCAAAGACCGGTTTGCATCGTGAGACGAAGGCTCGAGCCATACTTAGCCCTGTGTCCGATCCGGCCGCTTCCATAGCCCAAAAGGTAAGCCTTTCCATTTCAATCATTCTGGTGTATTTTCACCATAAAATTTTATACACTTTTTTATTACGTTTTGTTTTATGATTCTGACGTGAGATTCTTGAGAGAAACTATCACCGATCATTGGGTCGAACCATCTAGCAGCTCAATTATTATCGGTTATAACCCTACCGGTTATAGAATACAAAACAGGTTACGCCATTGTGACATTTGCTTTGTGATCTTGTGAGACGATTAATTATTTGATGTTGATTGGTTTCGTTACTCTTGTTTAAACAATCGAACGGTTCAAACTAATACACACATGTGATGTGAGATCATTTCGGTAGTAATACCAAATAGCGTCTGGCCTAAATTATGAAAGTACTATTTTGAATTAAATTATTGTGGAAACATGAACTTATTTAAATTCAAGTATTTTCGAAATTTGTAATAAAAAAAAACTTTTCCTCTAGATTCATTAGCCCTACTTTTCGTAGAAACAACTTTAATGTATTCAAAGACCACTTTGCTGCTTAAGTCAGACTCTTGTGCCACTTGGTAGATCCACCAATGCCACGTTTTGTTATTGTGCCAAAGAATACGTGAATATGTCCAAACGGCAATCAAATTCTTGGCGTAAAACACAAAAATTATGATACTAGTTTAAATCCACAATTCACCTTCACCATAAAGAATTCATGTATTAGAGATGGTATGACAAGAACTGGTTGAATTTGATGACATTTGTTTGCTATTGTTTTGGTTAAGTAAAAGTTTTGTTAAAAAGGAAAATAGCATCGGTAGTGGCAGATAGCAAGTGTGTGAGTGAGATCAGATATGGTTGACACATCTATGACGAGTCATCGCAACGAAACTTCTTTAATTTTGGTCAATTATATTACAATTTAGCATTTCGAGGTTGGAATTTTGGAATGATCTCTTGATAAGATAATAATGTATTTTTGATGACGTATCCATCAAAACTATAAATGATTTATATTAAATATGAAATTTCGACTGTATACAAGTTTTTATATTATAAAATTATTCGATGTACATATGATCATAATAACTTTACTATATATATAGATACGTATATGTGTTCTTAAACTTGCACAAACATTTCTGCAATCTAAACCTCAATCAAAACAAACAAACAAAAAACCATGATGCAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAGTCCTTGGTATGTTACCAATACCATCATCATGATCATATCAATTCATTAATAATTTAGTGTTTGCTATTTTCAAGAACCATTTATCAAAAATGTTAATTGTTGTTGTGTATGAAGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAAAAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGACATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCCGCCGTAAGTTAATTATAACTTTTTTTCTTGACTATTTTTATTTTAAGGATTTTTTCTAATGTTAAATTTCTGTTTTTTTTTCTTTCTATGTTTTCTTTAATCTTTTGAAGATTTTTTGACGCAGATTTTGACTTGTTAGATTTCTTTTATTGAAGTTGAGATCCAAATATTTTTTTGGTTATTTTGCCATTTGGCCGTTTTTGGAAGAGTTTAAAATGTACTAGATAGAAAATGAATAAGTTTTGTGGCTATTGAAAGACCTAATGATTTTGGTATTCAAACTATAACGTAGAAAATGAAGATCTTTCGTTTATCTATTTTTAAAACAGAACTACATTGACTTGTCTTTGATCGATATTTTGCATTGTAGATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTCGTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTTGATATGTTTGGTGATGTTGTAAGTCCTCTGTTTTTCAATACTATTTCAGGTAACTTGCATGACAAGAAAATTCTTTGACCTACCTTATAATTGTTTTCTTGATCAATAAAAGGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTAGAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTCAAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCTTCAGGTTTGTTTTGATTCCTACTTGAGGTCAAGTGATAAAAATTAGTTATTAGTTACAAATGTTTAAACGGGGTTAATTGCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGCCCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTTAACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTCACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAGGTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGTAAGCCCATACTCATTAAATATTGGTTTTGGGACAGGGAGAGGATGTGGTTGCAGGGATAAGAACACCAGAAGATTTGGATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATCTTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGTTGATACACATAAACAATACTTCAATTAGTCCTCATCAACAATTCTTTAGTAATTTAAACAAAATCTCAAATGTGTATTGCAGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGATTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGTTGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAACATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGGTACAAACTCAAATATTCATCTTCTTCTTTTTTCATAGTCATAAACTTGATGTTGAAACCAAAATTCGAAACTTACTGGTAATGATTGGTTCACTTGAACAAGAACTAATGGGTTTAAGACGTTTAGGGTTTAGGAGTAAAAGCAGAGATGATTGTCTGACACGTAACCGATGAATAGGGTTTGGAAATTTTGATTCAGAGGTCAATGAAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTGATGGATTAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTTTTGGATTCGATTTTAGAAACTTGTCATATAAGTTAGGGGAAGATTGTTTCTAAAGTTAGGGTTTAAAAATTTTCAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATCAGACGTCTCAAGGTGTTTATGAGTTTCTGTTCCTTTAACTTGTTTGATATTTTTAAACTTTCTAACTCAAATGTTCGATGACCGATAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGGTAACTCCTCCTCTGTACTTGATTTCATGTTTTTGATGATTTAGATTGTTTGTATCCAAATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCAGTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTGCTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTAAATGTTTTGAGTCGTCTCTCTAAAATGTATCACAACTTAAAACATGCCTAAACCTTTTTATTTTTCTAGGTTTACCGGTAACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAACATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATAGAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGTTTCTTACTCTCTTTGTTTCTCTCTGTCTCTTTGCACCTGAAGAACAATCTGATGATCGGTAAACTTGTACGTTATAGGCTCGGAATATCGTATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAGGACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAATTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGTCATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGATGAGGTAAATGTAACAAGACACAAAATGTGTTTTAGGCACTTGAAACCATGTTGCTATTTGCTAAGTAGGAACCTTTTTCTTTTGACAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATGACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGAATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTATAATGACTACCATTTCGTTTGCTCTCTATCCATAGGATAAAATCTTGATAGCCATTTTTTTGTGTTTGGACCAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAGATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAACATGGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCTTGTTCTCCTTTCAGGTAATTGATTAATTTCCAAACCAATAAACACTTTTTTTACAACACTATTGTATAACTCAGATTGATGTAATTTTGGGATTTCTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA
【００３６】
シロイヌナズナのピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）の細胞質基質型をコードするｃＤＮＡ配列は、本明細書では以下のとおり配列番号２１として示す：
配列番号２１
ATGATGCAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAGTCCTTGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAAAAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGACATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCCGCCATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTCGTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTTGATATGTTTGGTGATGTTGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTAGAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTCAAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCTTCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGCCCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTTAACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTCACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAGGTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGGATAAGAACACCAGAAGATTTGGATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATCTTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGATTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGTTGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAACATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATCAGACGTCTCAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGATTGTTTGTATCCAAATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCAGTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTGCTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTTTACCGGTAACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAACATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATAGAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGCTCGGAATATCGTATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAGGACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAATTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGTCATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGATGAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATGACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGAATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAGATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAACATGGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCTTGTTCTCCTTTCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA
【００３７】
シロイヌナズナのピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）の葉緑体型をコードするｃＤＮＡ配列は、本明細書では以下のとおり配列番号２２として示す：
配列番号２２
ATGACAAGTATGATCGTGAAGACAACGCCGGAGCTCTTCAAAGGAAATGGAGTGTTCCGTACGGATCATCTCGGAGAAAACCGAATGGTTAGTCGATCAAACCGGCTAGGTGATGGATCAAACCGTTTCCCTAGAACCGGTACAATCCATTGCCAACGGTTAAGCATAGCAAAGACCGGTTTGCATCGTGAGACGAAGGCTCGAGCCATACTTAGCCCTGTGTCCGATCCGGCCGCTTCCATAGCCCAAAAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAGTCCTTGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAAAAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGACATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCCGCCATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTCGTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTTGATATGTTTGGTGATGTTGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTAGAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTCAAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCTTCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGCCCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTTAACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTCACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAGGTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGGATAAGAACACCAGAAGATTTGGATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATCTTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGATTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGTTGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAACATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATCAGACGTCTCAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGATTGTTTGTATCCAAATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCAGTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTGCTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTTTACCGGTAACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAACATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATAGAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGCTCGGAATATCGTATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAGGACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAATTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGTCATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGATGAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATGACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGAATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAGATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAACATGGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCTTGTTCTCCTTTCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA
【００３８】
従って、ＰＰＤＫ活性を有するポリペプチドをコードするコード配列は、実質的に配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２に示す核酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含んでいてもよい。
【００３９】
シロイヌナズナＰＰＤＫの細胞質基質型のポリペプチド配列は、本明細書では以下のとおり配列番号２３として示す：
配列番号２３
MMQRVFTFGKGRSEGNKGMKSLLGGKGANLAEMASIGLSVPPGLTISTEACQQYQIAGKKLPEGLWEEILEGLSFIERDIGASLADPSKPLLLSVRSGAAISMPGMMDTVLNLGLNDQVVVGLAAKSGERFAYDSFRRFLDMFGDVVMGIPHAKFEEKLERMKERKGVKNDTDLSAADLKELVEQYKSVYLEAKGQEFPSDPKKQLELAIEAVFDSWDSPRANKYRSINQITGLKGTAVNIQCMVFGNMGDTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLVNAQVWHLSQCVNLISTRIRTPEDLDTMKRFMPEAYAELVENCNILERHYKDMMDIEFTVQEERLWMLQCRAGKRTGKGAVKIAVDMVGEGLVEKSSAIKMVEPQHLDQLLHPQFHDPSGYREKVVAKGLPASPGAAVGQVVFTAEEAEAWHSQGKTVILVRTETSPDDVGGMHAAEGILTARGGMTSHAAVVARGWGKCCIAGCSEIRVDENHKVLLIGDLTINEGEWISMNGSTGEVILGKQALAPPALSPDLETFMSWADAIRRLKVMANADTPEDAIAARKNGAQGIGLCRTEHMIVCIQMFNVVFGLVFKFFGADRIKAVRKMIMAVTTEQRKASLDILLPYQRSDFEGIFRAMDGLPVTIRLLDPPLHEFLPEGDLDNIVHELAEETGVKEDEVLSRIEKLSEVNPMLGFRGCRLGISYPELTEMQARAIFEAAASMQDQGVTVIPEIMVPLVGTPQELGHQVDVIRKVAKKVFAEKGHTVSYKVGTMIEIPRAALIADEIAKEAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLPIYLAKGILQHDPFEVLDQQGVGQLIKMATEKGRAARPSLKVGICGEHGGDPSSVGFFAEAGLDYVSCSPFRVPIARLAAAQVVVA
【００４０】
シロイヌナズナのＰＰＤＫの葉緑体型のポリペプチド配列は、本明細書では以下のとおり配列番号２４として示す：
配列番号２４
MTSMIVKTTPELFKGNGVFRTDHLGENRMVSRSNRLGDGSNRFPRTGTIHCQRLSIAKTGLHRETKARAILSPVSDPAASIAQKRVFTFGKGRSEGNKGMKSLLGGKGANLAEMASIGLSVPPGLTISTEACQQYQIAGKKLPEGLWEEILEGLSFIERDIGASLADPSKPLLLSVRSGAAISMPGMMDTVLNLGLNDQVVVGLAAKSGERFAYDSFRRFLDMFGDVVMGIPHAKFEEKLERMKERKGVKNDTDLSAADLKELVEQYKSVYLEAKGQEFPSDPKKQLELAIEAVFDSWDSPRANKYRSINQITGLKGTAVNIQCMVFGNMGDTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLVNAQVWHLSQCVNLISTRIRTPEDLDTMKRFMPEAYAELVENCNILERHYKDMMDIEFTVQEERLWMLQCRAGKRTGKGAVKIAVDMVGEGLVEKSSAIKMVEPQHLDQLLHPQFHDPSGYREKVVAKGLPASPGAAVGQVVFTAEEAEAWHSQGKTVILVRTETSPDDVGGMHAAEGILTARGGMTSHAAVVARGWGKCCIAGCSEIRVDENHKVLLIGDLTINEGEWISMNGSTGEVILGKQALAPPALSPDLETFMSWADAIRRLKVMANADTPEDAIAARKNGAQGIGLCRTEHMIVCIQMFNVVFGLVFKFFGADRIKAVRKMIMAVTTEQRKASLDILLPYQRSDFEGIFRAMDGLPVTIRLLDPPLHEFLPEGDLDNIVHELAEETGVKEDEVLSRIEKLSEVNPMLGFRGCRLGISYPELTEMQARAIFEAAASMQDQGVTVIPEIMVPLVGTPQELGHQVDVIRKVAKKVFAEKGHTVSYKVGTMIEIPRAALIADEIAKEAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLPIYLAKGILQHDPFEVLDQQGVGQLIKMATEKGRAARPSLKVGICGEHGGDPSSVGFFAEAGLDYVSCSPFRVPIARLAAAQVVVA
【００４１】
従って、ＰＰＤＫ活性を有するポリペプチドは、実質的に配列番号２３または配列番号２４に示すアミノ酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含んでいてもよい。最も高いＰＰＤＫ発現量が、ほぼ例外なくＰＰＤＫをコードするｇＤＮＡを内部に含む細胞株のみで認められたため、イントロンがＰＰＤＫの発現にプラスの影響を与えたのではないかと思われる。従って、一実施形態では、本構築物は、ＰＰＤＫおよび／またはＰＣＫのいずれか一方をコードする遺伝子のｃＤＮＡを含んでいてもよい。
【００４２】
本発明の遺伝子構築物は、発現カセットの形態であってもよく、宿主細胞における少なくとも１つのコード配列の発現に適したものであればよい。本発明の遺伝子構築物は、それがベクターに組み込まれることなく宿主細胞に導入されてもよい。例えば、核酸分子であり得る遺伝子構築物は、リポソームまたはウイルス粒子内に組み込まれてもよい。あるいは、精製された核酸分子（例えば、ヒストンを含まないＤＮＡ、すなわち裸のＤＮＡ）が、例えば、直接的なエンドサイトーシス取り込みなどの好適な手段によって宿主細胞に直接挿入されてもよい。本遺伝子構築物は、形質移入、感染、微量注入、細胞融合、原形質融合または衝撃照射(ballistic bombardment)によって宿主対象（例えば、植物）の細胞に直接導入されていてもよい。あるいは、本発明の遺伝子構築物は、パーティクルガン法を用いて宿主細胞に直接導入されていてもよい。あるいは、当該遺伝子構築物は、好適な宿主細胞における発現のために組換え型ベクターの内部に含まれていてもよい。
【００４３】
従って、第３の局面では、第１または第２の局面に係る遺伝子構築物を含む組換え型ベクターが提供される。組換え型ベクターは、プラスミド、コスミドまたはファージであってもよい。そのような組換え型ベクターは、宿主細胞を本発明の遺伝子構築物で形質転換し、かつその中の発現カセットを複製するのに非常に有用である。当業者であれば、本発明の遺伝子構築物は、発現のために多くの種類の骨格ベクターと組み合わせ得ることを理解しているであろう。骨格ベクターは、例えば、１つのベクターが大腸菌およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスの両方で複製することができるバイナリーベクターであってもよい。例えば、好適なベクターは、ｐＢＩＮ１９などのｐＢＩＮプラスミドであってもよい。しかし、好ましい骨格ベクターはＢＮＰ１３８００００００１であり、これは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ(F. A. van Engelen et al. Transgenic Research (1995) 4, 288-290)に基づいており、かつＳＡＧ１２プロモーターを内部に含む。
【００４４】
組換え型ベクターは、プロモーター（例えば、老化関連プロモーター）に加えて、様々な他の機能的な成分、および少なくとも１つの（ＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫをコードする）コード配列を含んでいてもよい。例えば、組換え型ベクターは、宿主細胞中の細胞質基質内で自己複製するように設計されていてもよい。この場合、組換え型ベクター内に、ＤＮＡ複製を誘発または調節する成分が必要とされる場合がある。あるいは、組換え型ベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれるように設計されていてもよい。この場合、（例えば相同組換えによる）標的組換えを支持するＤＮＡ配列が想定される。
【００４５】
また、組換え型ベクターは、クローン化プロセスにおける選択可能なマーカーとして、すなわち、形質移入または形質転換されている細胞の選択を可能にするため、および異種のＤＮＡが組み込まれているベクターを内部に含む細胞の選択を可能にするために使用できる遺伝子のＤＮＡコードを含んでいてもよい。当該ベクターは、コード配列の発現の調節に関与するＤＮＡ、または発現されるポリペプチドをある種の宿主細胞、例えば葉緑体に導くためのＤＮＡを含んでいてもよい。従って、第３の局面のベクターは、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、ポリペプチド終結シグナルおよびタンパク質標的配列（例えば、葉緑体輸送ペプチド）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる成分を含んでいてもよい。
【００４６】
好適なマーカー遺伝子の例としては、抗生物質耐性遺伝子、例えば、カナマイシン、ジェネテシン（Ｇ４１８）およびハイグロマイシン（ｎｐｔ−ＩＩ、ｈｙｇ−Ｂ）に対して耐性を示す遺伝子；除草剤耐性遺伝子、例えば、ホスフィノトリシンおよびスルホンアミド系除草剤に対して耐性を示す遺伝子（それぞれｂａｒおよびｓｕＩ：欧州特許出願公開第２４２２４６号、欧州特許出願公開第０２４９６３７号）；およびスクリーニング可能なマーカー、例えば、β−グルクロニダーゼ（英国特許第２１９７６５３号）、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられる。当該マーカー遺伝子は、第２のプロモーター（老化関連プロモーターでなくてもよい）によって制御されてもよく、細胞における発現を可能にし、種子の中に存在していても存在していなくてもよく、それにより、植物の発育の任意の段階でマーカーを含有する細胞または組織の選択を可能にする。好適な第２のプロモーターは、アグロバクテリウムのノパリン合成酵素遺伝子のプロモーターおよび３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）転写産物をコードする遺伝子に由来するプロモーターである。ただし、任意の他の好適な第２のプロモーターを使用してもよい。
【００４７】
本発明の遺伝子構築物の様々な実施形態は図１に示すクローン化手順を用いて作製してもよく、それについて以下のようにまとめることができる。ＰＣＫおよびＰＰＤＫをコードする遺伝子のｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ型は、好適なプライマーを用いるＰＣＲによってｇＤＮＡまたはｃＤＮＡ鋳型から増幅してもよい。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動法を用いて調べてもよい。次いで、ＰＣＲ産物を、クローン化目的のための好適なベクター（例えば、pCR 4Blunt-TOPOベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））に結合してもよい。ＰＣＲ産物を内部に含むベクターを大腸菌などの好適な宿主中で増殖させてもよい。次いで、大腸菌コロニーを、好適なプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングしてもよく、正しい制限酵素消化パターンを示すプラスミド中の挿入断片を好適なプライマーを用いて配列決定してもよい。
【００４８】
ＴＯＰＯｃＤＮＡ（ＰＣＫまたはＰＰＤＫ）またはＴＯＰＯｇＤＮＡ（ＰＣＫまたはＰＰＤＫ）を保有する大腸菌のコロニーは、好適な量の各プラスミドを産生するために培養してもよく、次いでそれを精製してもよい。次いで、プラスミドを消化して、ＰＰＤＫまたはＰＣＫをコードするＤＮＡ断片を遊離させた後、これを、ｐＢＮＰプラスミドなどの好適なプロモーター（例えば、ＳＡＧプロモーター）を内部に含むベクターにクローン化してもよい。得られたＰＰＤＫ構築物をＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡと命名し、得られたＰＣＫ構築物をｐＡＬＢＮＰ１（ｃＤＮＡ）およびｐＡＬＢＮＰ２（ｇＤＮＡ）と命名した。第３の局面に係るベクターの実施形態は、実質的に図３に示すものであってもよい。
【００４９】
第４の局面では、同じ条件で培養された野生型植物中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの対応する濃度よりも試験植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度を上げる方法であって、葉の老化の開始後に植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度の上昇を達成するために試験植物における植物の代謝を変えることを含む方法が提供される。
【００５０】
第５の局面では、同じ条件で培養された野生型植物中の窒素の対応する濃度よりも試験植物の葉の中の窒素濃度を下げる方法であって、葉の老化の開始後に植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度の上昇を達成するために試験植物における植物の代謝を変えることを含む方法が提供される。
【００５１】
第６の局面では、同じ条件で培養された野生型植物の対応する成長率と比較して試験植物の成長率を上げる方法であって、葉の老化の開始後に植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度の上昇を達成するために試験植物における植物の代謝を変えることを含む方法が提供される。
【００５２】
植物の葉の中の窒素濃度および植物の成長率の測定方法は実施例に記載されている。第４、第５または第６の局面の方法は、第１または第２の局面に係る遺伝子構築物あるいは第３の局面に係るベクターで試験植物の細胞を形質転換することを含んでもよい。本遺伝子構築物またはベクターは、任意の好適な手段によって宿主細胞に導入してもよい。
【００５３】
第７の局面では、第１または第２の局面に係る遺伝子構築物あるいは第３の局面に係る組換え型ベクターを含む細胞が提供される。
【００５４】
当該細胞は植物細胞であってもよい。本発明者らが、宿主細胞中にＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫを過剰発現させることが老化した葉の中の窒素の転流を誘発する際に驚くほど有効であることを観察したように、第７の局面の細胞は、ＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫが過剰発現されるように、第１または第２の局面の１種または複数の構築物あるいは第３の局面の１種または複数のベクターを含んでいてもよい。
【００５５】
例えば、宿主細胞は、第１の局面の遺伝子構築物の第１の実施形態（すなわちＰＣＫ構築物）のみで形質転換されていてもよい。あるいは、宿主細胞は、第２の局面の遺伝子構築物の第２の実施形態（すなわちＰＰＤＫ構築物）のみで形質転換されていてもよい。別の実施形態では、宿主細胞は、ＰＣＫおよびＰＰＤＫが宿主細胞において発現されるように、第１の局面の遺伝子構築物の第１および第２の実施形態で形質転換されていてもよい。あるいは、宿主細胞は、ＰＣＫおよびＰＰＤＫが宿主細胞において発現されるように、第１の局面の構築物の第３または第４の実施形態（すなわちＰＣＫ／ＰＰＤＫ構築物１または２）で形質転換されていてもよい。また、宿主細胞が、ＰＣＫおよびＰＰＤＫの両方をコードする第２の局面の構築物で形質転換されていてもよいことも想定される。
【００５６】
当該細胞は、公知の技術を用いて本発明に係る遺伝子構築物またはベクターで形質転換されていてもよい。遺伝子構築物を宿主細胞に導入するのに適した手段は、例えば、欧州特許出願公開第０１１６７１８号および第０２７０８２２号に記載されているように当該技術分野で知られている手段による、アグロバクテリウムが保持するディスアーム型Ｔｉプラスミドベクターの使用を含んでもよい。さらなる方法は、植物原形質を形質転換することであってもよく、この方法では、最初に細胞壁を除去し、核酸を導入し、次いで細胞壁を再編成する。次いで、形質転換された細胞を植物に成長させてもよい。
【００５７】
第８の局面では、第１または第２の局面に係る遺伝子構築物あるいは第３の局面に係るベクターを含む形質転換植物が提供される。
【００５８】
第８の局面に係る形質転換植物としては、アブラナ属などのアブラナ科が挙げられる。当該植物は、セイヨウアブラナ（菜種）であってもよい。
【００５９】
第８の局面に係る形質転換植物のさらなる例としては、コムギ連(Triticeae)などのイネ科が挙げられる。当該植物は、コムギ属(Triticum spp.)（小麦）であってもよい。小麦中の種子タンパク質含有量を増加させることによって、パンなどの小麦を含む食品の体積を増加させてもよい。
【００６０】
第８の局面に係る好適な形質転換植物のさらなる例としては、植物のナス科が挙げられ、ナス科の例としては、例えば、チョウセンアサガオ、ナス、マンドレイク、ベラドンナ(deadly nightshade (belladonna))、トウガラシ（パプリカ、カラトウガラシ）、ジャガイモおよびタバコが挙げられる。ナス科の好適な属の一例はニコチアナである。ニコチアナの好適な種は、タバコ植物、または単にタバコと称される場合がある。植物を第１または第２の局面の遺伝子構築物あるいは第３の局面のベクターで形質転換する様々な方法が知られており、本発明で使用することができる。
【００６１】
例えば、タバコは、以下のように形質転換してもよい。タバコ(学名：Nicotiana tabacum)を、基本的にHorsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985)に記載されているように葉片共培養法を用いて形質転換する。最も若い２枚の広がった葉を７週齢のタバコ植物から採取してもよく、８％のドメストス（商標）中で１０分間表面滅菌し、滅菌蒸留水で６回洗浄してもよい。葉片をＮｏ．６コルク穿孔器を用いて切断し、約２分間かけて（本発明に係る）適当なバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウム懸濁液に入れてもよい。この葉片を、２枚の無菌濾紙の間に穏やかにブロットしてもよい。１０枚の葉片をＬＳ３％スクロース＋２μＭのＢＡＰ＋０．２μＭのＮＡＡを含むプレート上に置き、次いで、これを成長室(growth room)で２日間培養してもよい。葉片は、クラフォラン５００ｇ／ｌおよびのカナマイシン１００ｇ／ｌを添加したＬＳ＋３％スクロース＋２μＭのＢＡＰ＋０．２μＭのＮＡＡを含むプレートに移してもよい。この葉片は、２週間後に上記培地を含む新しいプレートに移してもよい。さらに２週間後、この葉片は、クラフォラン５００ｍｇ／ｌおよびカナマイシン１００ｍｇ／ｌを添加したＬＳ＋３％スクロース＋０．５μＭのＢＡＰを含むプレートに移してもよい。この葉片は、２週間ごとに新しい培地に移してもよい。苗条が現れたら、それらを切除し、クラフォラン５００ｍｇ／ｌを添加したＬＳ＋３％スクロースを入れた瓶に移してもよい。瓶の中の苗条は、約４週間後、ＬＳ＋３％スクロース＋クラフォラン２５０ｍｇ／ｌに移してもよい。さらに３〜４週間後、この植物を、ＬＳ＋３％スクロース（抗生物質なし）に移して、根づかせてもよい。植物が根づいたら、温室の土壌に移してもよい。
【００６２】
第９の局面では、第８の局面に係る形質転換植物から得られた植物繁殖用製品が提供される。
【００６３】
「植物繁殖用製品」は、そこからさらなる植物を生産することができる任意の植物であってもよい。好適には、この植物繁殖用製品は種子であってもよい。
【００６４】
本発明の第１０の局面では、同じ条件で培養された対応する野生型植物よりも高い割合で窒素を転流させる形質転換植物の生産方法であって、
ｉ）第１または第２の局面に係る遺伝子構築物あるいは第３の局面に係るベクターで植物細胞を形質転換する工程と、
ｉｉ）形質転換細胞から植物を再生させる工程と、
を含む方法が提供される。
【００６５】
第１１の局面では、同じ条件で培養された対応する野生型植物よりも高い成長率を有する形質転換植物の生産方法であって、
ｉ）第１または第２の局面に係る遺伝子構築物あるいは第３の局面に係るベクターで植物細胞を形質転換する工程と、
ｉｉ）形質転換細胞から植物を再生させる工程と、
を含む方法が提供される。
【００６６】
好ましくかつ有利なことに、本発明に係る方法は、生産される植物の健康または適応度を損なうことはない。好ましくは、本方法は、第１または第２の局面の遺伝子構築物あるいは第３の局面のベクターを用いて、試験植物および好ましくはその葉を形質転換することを含む。本発明者らは、宿主細胞中でＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫを過剰発現させることが老化した葉の中の窒素の転流を誘発する際に有効であることを観察した。従って、第１０および第１１の局面の方法は、ＰＣＫおよびＰＰＤＫの両方が過剰発現されるように、本発明の１種または複数の構築物で試験植物を形質転換することを含むことが好ましい。例えば、試験植物は、本発明の第１の局面の遺伝子構築物の第１の実施形態（すなわちＰＣＫ構築物）およびさらに第１の局面の構築物の第２の実施形態（すなわちＰＰＤＫ構築物）で形質転換してもよい。従って、これらの２種類の構築物の形質転換によって両方の酵素の過剰発現が生じる。あるいは、試験植物は、ＰＣＫおよびＰＰＤＫをそれぞれコードする本発明の第１の局面の構築物の第３または第４の実施形態で形質転換してもよい。あるいは、試験植物は、ＰＣＫおよびＰＰＤＫの両方をコードする本発明の第２の局面の構築物で形質転換してもよい。
【００６７】
本発明者らは、ＰＣＫおよびＰＰＤＫをコードする１種以上の構築物で形質転換された試験植物の植物の葉が老化の開始時に窒素の転流の増加を示し、従って、窒素濃度がその葉において低下するすことを観察した。さらに、本発明者らは栄養成長率の上昇を観察した。本発明者らは、仮定に縛られてはいないが、葉の中の窒素濃度の低下によって成長率の上昇、従って作物収穫率の上昇が誘発され得ると考える。
【００６８】
本発明の第１２の局面では、同じ条件で栽培された野生型植物から採取された、収穫された葉の中の対応する窒素濃度よりも低濃度の窒素を含有する収穫された葉が提供され、ここで、この葉は、第８の局面に係る形質転換植物から収穫されたもの、あるいは第１０または第１１の局面に係る方法によって生産されたものである。
【００６９】
本発明の第１３の局面では、老化した葉の中の窒素濃度を低下させることができる変異型タバコ植物から得られる窒素が減少したタバコを含む喫煙物品が提供される。
【００７０】
窒素が減少したタバコには、同じ条件で栽培された野生型植物中の対応する濃度よりも窒素濃度の低いタバコが含まれる。そのような喫煙物品は、変異型タバコ植物から得られたタバコを含んでもよく、このタバコは、本発明の第１または第２の局面に係る遺伝子構築物あるいは第３の局面に係るベクターで形質転換されたものであってもよい。
【００７１】
本明細書で使用する「喫煙物品」という用語は、タバコ、タバコ誘導体、膨張タバコ、再生タバコまたはタバコ代用品および、また不燃性(heat-not-burn)製品をベースとするか否かに関わらず、喫煙に適した製品、例えば、手巻きタバコ、紙巻タバコ、葉巻およびシガリロ（小型葉巻）を含むことができる。
【００７２】
当然のことながら、本発明は、実質的に本明細書で参照されている配列のいずれかのアミノ酸または核酸配列（その機能的な変異体もしくは機能的な断片を含む）を含む、任意の核酸、ペプチド、その変異体、誘導体または類似体に及ぶ。「実質的にアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペチド配列」、「機能的な変異体」および「機能的な断片」という用語は、本明細書において参照される配列のいずれか１つを含むアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペチド配列との少なくとも４０％の配列同一性、例えば、（ＰＣＫ酵素の一実施形態をコードする）配列番号１７として同定される遺伝子との４０％の同一性、配列番号１９（すなわちＰＣＫ酵素の一実施形態）として同定されたポリペチドとの４０％の同一性、（ＰＰＤＫ酵素の一実施形態をコードする）配列番号２１として同定された遺伝子との４０％の同一性、または配列番号２３（すなわちＰＰＤＫ酵素の一実施形態）として同定されたポリペチドとの４０％の同一性を有する配列とすることができる。
【００７３】
また、参照されている配列のいずれかに対して６５％超、より好ましくは７０％超、さらにより好ましくは７５％超、なおより好ましくは８０％超の配列の同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列も想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、本明細書で参照されている配列のいずれかとの少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９２％の同一性、なおより好ましくは少なくとも９５％の同一性、なおより好ましくは少なくとも９７％の同一性、なおより好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【００７４】
当業者には、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性の割合の計算方法が分かっている。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性の割合を計算するために、最初に２つの配列のアラインメントを作成した後、配列の同一性値を計算しなければならない。２つの配列の同一性の割合は、（ｉ）配列を整列させるために使用される方法、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法（異なるプログラムで実行される）、あるいは３Ｄ比較による構造アラインメント、および（ｉｉ）アラインメント法（例えば、ローカルまたはグローバルアラインメント）によって使用されるパラメータ、使用される対のスコア行列（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）、およびギャップペナルティ（例えば、関数および定数）によって異なる値を取る場合もある。
【００７５】
アラインメント作成後の、２つの配列間の同一性の割合に関する計算方法は数多くある。例えば、（ｉ）最も短い配列の長さ、（ｉｉ）アラインメントの長さ、（ｉｉｉ）配列の平均長、（ｉｖ）ギャップのない位置の数、または（ｉｖ）オーバーハングを除く等価位置の数によって同一部分の数を割ってもよい。さらに、当然のことながら、同一性の割合は長さにも強く依存する。従って、一対の配列が短い程、偶然に生じることを予測し得る配列の同一性が高くなる。
【００７６】
従って、当然のことながら、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアラインメントは複雑なプロセスである。有名なマルチプルアライメントプログラムであるＣｌｕｓｔａｌＷ(Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882)は、本発明に従ってタンパク質またはＤＮＡのマルチプルアラインメントを生成する好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの好適なパラメータは、以下のとおりであってもよい：ＤＮＡアラインメントについては：ギャップ開始ペナルティー(Gap Open Penalty)＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティー(Gap Extension Penalty)＝６．６６、および行列＝同一性。タンパク質アラインメントについては：ギャップ開始ペナルティー＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティー＝０．２、および行列＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡおよびタンパク質アラインメントについては：ＥＮＤＧＡＰ＝−１およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者であれば、最適な配列アラインメントのためにこれらのパラメータおよび他のパラメータを変える必要があるかも知れないことに気付いているであろう。
【００７７】
好ましくは、次に、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性の割合の計算は、（Ｎ／Ｔ）＊１００（式中、Ｎは、同一の残基を共有する配列の位置の数であり、Ｔは、ギャップを含めるがオーバーハングを除いて比較される位置の合計数である）としてそのようなアラインメントから計算する。従って、２つの配列間の同一性の割合の最も好ましい計算方法は、（ｉ）好適な組み合わせのパラメータ（例えば、上記のようなパラメータ）を用いるＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて配列アラインメントを作成すること、および（ｉｉ）ＮおよびＴの値を式：配列の同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００に挿入することを含む。
【００７８】
同様の配列の他の同定方法が当該技術分野で知られている。例えば、実質的に類似したヌクレオチド配列は、厳密な条件で、配列番号１６、１７、１８、２０、２１、２２に示されている配列またはそれらの相補体とハイブリッド形成する配列によってコードされる。厳密な条件とは、ヌクレオチドが約４５℃で３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルター結合ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリッド形成した後、約２０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で少なくとも１回洗浄されることを意味する。あるいは、実質的に同様のポリペプチドは、配列番号１９、２３または２４に示されている配列とは、少なくとも１個、ただし５、１０、２０、５０または１００個未満のアミノ酸が異なっていてもよい。
【００７９】
遺伝子コードの縮重により、任意の核酸配列を、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を与えることなく変化または変更させてその機能的な変異体を得ることができることは明らかである。好適なヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって静的な変化(silent change)を生じさせることにより変化した配列を有する変異体である。他の好適な変異体は、相同ヌクレオチド配列を有するが、置換されたアミノ酸と同様の生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって保存的変化を生じさせることにより変化した配列の全てもしくは一部を含む変異体である。例えば、小型で非極性の疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリンおよびメチオニンが挙げられる。大型で非極性の疎水性アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが挙げられる。中立極性のアミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷を持つ（塩基性）アミノ酸としては、リジン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられる。負の電荷を持つ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。従って、当然のことながら、アミノ酸は同様の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置換することができ、当業者には、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が分かっている。
【００８０】
本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面のいずれも含む）に記載されている全ての特徴、および／またはそのように開示されている任意の方法またはプロセスの全ての工程は、そのような特徴および／または工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除く任意の組み合わせで、上記の局面のいずれかと組み合わせてもよい。
【００８１】
本発明のさらなる理解のため、および本発明の実施形態の実施方法を示すために、ここで、例として添付の図を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】遺伝子構築物のＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡのクローン化に使用される手順を示す。（ａ）シロイヌナズナＰＰＤＫの細胞質基質のイソ型のｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ型のＰＣＲ増幅、（ｂ）クローニングベクターpCR 4Blunt-TOPOへの挿入、（ｃ）ＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩによる、ＰＰＤＫを放出するためのクローニングベクター（左側）および標的ＳＡＧ１２含有ベクターｐＢＮＰ（右側）の制限エンドヌクレアーゼ消化、（ｄ）ＰＰＤＫのｐＢＮＰへの連結反応および、ＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩによる構築物の制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されたＤＮＡ断片を示すアガロースゲル、および（ｅ）アグロバクテリウム媒介性形質転換によってシロイヌナズナ生態型Columbia 0に導入される構築物。
【図２ａ】本発明に係る発現ベクターの作製に使用されるプラスミドpCR4 BLUNT-TOPOを示す。
【図２ｂ】ＰＰＤＫをコードするｃＤＮＡまたはｇＤＮＡがＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩ消化を用いてpCR4 BLUNT-TOPOに挿入されたことをまとめた表である。
【図３ａ】ＳＡＧ１２プロモーターを含有するプラスミドｐＢＮＰを示す。
【図３ｂ】ＰＰＤＫ挿入断片（ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ）がＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩ消化を用いてｐＢＮＰに導入され、かつＰＣＫ挿入断片（ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ）がＸｂａＩおよびＳａｃＩ消化を用いてｐＢＮＰに導入され、その結果、本発明の実施形態に係るベクターが得られたことをまとめた表である。
【図４】ウェスタンブロットによる形質転換ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫシロイヌナズナ細胞株の選択を示す。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ細胞株を上側に示し、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ細胞株を下側に示す。
【図５】野生型、ΔＰＰＤＫおよび５種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統における５週目以降のＰＰＤＫ発現量の定量化を示す。
【図６】（ｂ）Ｋ３２６および（ｃ）バーレー２１タバコ系統におけるＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ（ｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ）の選択を示す。
【図７】Ｋ３２６タバコの熟した葉におけるＰＰＤＫの過剰発現を示す。
【図８】時間に対する、シロイヌナズナの様々な細胞株、すなわち、野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡのロゼットの写真を示す。
【図９】９週目のシロイヌナズナの生殖組織の質量を示す。
【図１０】播種後３〜９週目の野生型およびＳＡＧ１２−ＰＰＤｇＤＮＡ植物の総植物生質量（すなわち、ロゼット＋生殖組織）を示す。
【図１１】７週目における野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物の葉の窒素含有量を示す。
【図１２】野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物の個々の種子の窒素含有量を示す。
【図１３】野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡシロイヌナズナ細胞株の葉の総遊離アミノ酸含有量を示す。
【図１４】様々なタバコの細胞株の種子の質量を示し、ゼロコピーは野生型であり、Ｇ４（ｇＤＮＡ）、Ｇ１０、Ｇ８およびＣ１０（ｃＤＮＡ）はＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統である。
【図１５】様々なタバコの細胞株の種子の窒素含有量を示し、ゼロコピーは野生型であり、Ｇ４（ｇＤＮＡ）、Ｇ１０、Ｇ８およびＣ１０（ｃＤＮＡ）はＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統である。
【図１６】ＰＣＫ／ＰＰＤＫ二重挿入断片のためのウェスタンブロット法の結果である。全ての系統は、ＳＡＧ１２プロモーターの活性と相関する特に７週目に、より高濃度のＰＣＫを示す。
【図１７】形質転換した植物のＰＣＫおよびＰＰＤＫの両発現によって、対照７と比較してロゼット質量が増加することを示す。
【図１８】窒素の転流が、輸送アミノ酸であるアスパラギンおよびグルタミンのＰＣＫおよびＰＰＤＫ依存的産生によって生じ得ることを示す仮定上の生化学的経路を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００８３】
実施例１−ＳＡＧ１２プロモーターシロイヌナズナＰＰＤＫ植物形質転換構築物の作製
一連のＳＡＧ１２−ＰＰＤＫおよびＰＣＫ発現ベクターを、図３に示すように作製し、次いで、形質転換した植物においてＰＰＤＫおよびＰＣＫの発現を増加させるそれらの能力を分析した。一実施形態では、本構築物は、ＰＣＫまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードし、かつＰＰＤＫをコードしないものであってもよい。別の実施形態では、本構築物は、ＰＰＤＫまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードし、かつＰＣＫをコードしないものであってもよい。ただし、さらに別の局面では、本構築物は、ＰＣＫまたはその機能的な変異体もしくは断片およびＰＰＤＫまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードするものであってもよい。後述するように、最初にシロイヌナズナのＰＰＤＫ遺伝子のｇＤＮＡを単離する。
【００８４】
ｇＤＮＡの単離
シロイヌナズナ生態型Columbia 0からのｇＤＮＡを、推奨されている手順に従ってＤＮｅａｓｙ植物ミニキット(DNeasy Plant Mini Kit)（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて葉から抽出した。ｇＤＮＡを、表１にまとめたプライマー配列を用いる下記のようなＰＣＲ反応のための鋳型として使用した。
【００８５】
【表１】
【００８６】
ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡを７日齢のシロイヌナズナの子葉から抽出した。リボヌクレアーゼを含まない機器を用いて氷上でＲＮＡの抽出を行い、ピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で処理した水を用いて溶液を調製した。水１リットルにつきＤＥＰＣ１ｍｌを添加し、混合物を換気フード内で一晩撹拌した後、加圧滅菌した。ＴｒｉＰｕｒｅ単離試薬（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてＲＮＡを抽出した。乳鉢と乳棒を用いて組織２００ｍｇを液体窒素中で粉砕し、ＴｒｉＰｕｒｅ単離試薬１ｍｌを添加し、推奨されている手順を続けた。ＲＮＡペレットは、６０℃まで１０分間予熱した無傷のＲＮＡ溶液(RNA Secure)（Ａｍｂｉｏｎ社）２０μｌに再懸濁した。試料を、１３，０００ｒｐｍで、４℃で５分間遠心分離し、上澄みを清潔な１．５ｍｌのマイクロ遠心分離管に移し、汚染性の破片を除去した。
【００８７】
ＲＮＡの量および純度は、Eppendorf Biophotometer分光光度計を用いて２６０および２８０ｎｍで読み取ることによって、分光測光法で測定した(Maniatis et al., 1982, Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory)。また、ＲＮＡは、０．５×ＴＢＥに溶かした１．５％（ｗ／ｖ）のアガロース（Melford Laboratories社）を用いるアガロースゲル電気泳動を用いて調べた。試料を１×ＲＮＡ試料緩衝液に懸濁し、泳動用緩衝液として０．５×ＴＢＥを用いて８０Ｖの電気泳動に供した。４×作業濃度のＲＮＡ試料緩衝液は、０．００２％（ｗ／ｖ）の臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、２×トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（２×ＴＢＥ）（２×ＴＢＥは、１８０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１８０ｍＭのホウ酸および８ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．３）を含有していた）、１３％のフィコール４００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、０．０１％のブロムフェノールブルーおよび７Ｍの尿素（Ficher Scientific社））を含有していた。
【００８８】
ｃＤＮＡを合成するためのＲＮＡの逆転写は、２５μｌの最終体積に対して、２μｇのＲＮＡ、１μｇのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）（１５）プライマー（Ｒｏｃｈｅ社）、１×モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、０．４ｍＭのｄＮＴＰ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）、４０単位の組み換え型ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、２００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社）およびヌクレアーゼ非含有水を用いて行った。この試料を４２℃で１時間培養した。
【００８９】
シロイヌナズナＰＰＤＫの増幅
ＰＰＤＫの細胞質基質のイソ型をコードする遺伝子のｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ型を、表１に示すＡｖｒＩＩ制限部位を含む順方向プライマー（ＡｔＣｙｔＦＷＤ−ＡｖｒＩＩ、配列番号１）およびＢａｍＨＩ制限部位を含む逆方向プライマー（ＡｔＣｙｔＲＥＶ−ＢａｍＨＩ、配列番号２）を用いるＰＣＲによって、ｇＤＮＡまたはｃＤＮＡの鋳型から増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、１×ＨＦ緩衝液（ＮＥＢ社）、２ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２、ＮＥＢ社）、０．５ｍＭのｄＮＴＰs（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）、１００ｎｇの鋳型（ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ）、０．５μＭの各プライマーおよび１単位のPhusion High-Fidelity ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社）を含有していた。熱循環は、９８℃で３０秒間の最初の変性工程、次いで、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２分間の３０サイクル、７２℃で５分間の最終的な伸長工程によって、Ｔｅｃｈｎｅサーマルサイクラー(Techne Thermal Cycler)を用いて行った。
【００９０】
シロイヌナズナＰＰＤＫのｃＤＮＡおよびｇＤＮＡを単離および調製した後、それらを使用して、図１にまとめた手順を用いて様々な構築物を作製した。老化中にＰＰＤＫを過剰発現させるために、シロイヌナズナのＰＰＤＫの細胞質基質のイソ型のｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ型を、ｐＢＮＰベクター中の老化誘発ＳＡＧ１２プロモーターに融合した。
（ａ）ＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれ含み、かつ２．４および４．３ｋｂ産物を産生するプライマーを用いる、シロイヌナズナのＰＰＤＫの細胞質基質のイソ型のｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ型のＰＣＲ増幅。
（ｂ）クローニングベクターpCR 4Blunt-TOPOへの挿入。ＰＰＤＫ挿入断片全体を配列決定し、予想した配列と同一であることが分かった。
（ｃ）ＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩによるクローニングベクターおよび目的ベクターｐＢＮＰの制限エンドヌクレアーゼ消化。
（ｄ）ＢＮＰへの連結反応、および構築物のＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩによる制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されたＤＮＡ断片を示すアガロースゲル。予想されたバンドの大きさは、ｃＤＮＡ構築物では１４．８ｋｂおよび２．４ｋｂ、ｇＤＮＡ構築物では１４．８ｋｂおよび４．４ｋｂであった。
（ｅ）アグロバクテリウム媒介性の形質転換によってシロイヌナズナ生態型Columbia 0に導入された構築物。構築物は、連結反応部位全体にわたって配列決定した。遺伝子ｎｐｔＩＩはネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードし、植物中にカナマイシン耐性を付与する。ＬＢおよびＲＢ：Ｔ−ＤＮＡの左右それぞれの境界；nos Pro:ノパリンシンターゼプロモーター；nos t:ノパリンシンターゼターミネーター；SAG12 Pro:シロイヌナズナＳＡＧ１２遺伝子のプロモーター。
【００９１】
図１を参照しながら、構築物の作製について以下に詳細に説明する。
【００９２】
pCR 4Blunt-TOPOベクターへのクローン化
ＰＣＲ産物を、０．５×ＴＢＥに溶かした１％（ｗ／ｖ）のアガロース、０．５μｇｍｌ−１の臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用するアガロースゲル電気泳動を用いて調べた。試料を、１×ＤＮＡ試料緩衝液（６×作業濃度のＤＮＡ試料緩衝液は、５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス−ＨＣｌ、Melford Laboratories社）、６０％のグリセリンおよび０．２５％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有していた）に懸濁し、泳動用緩衝液として０．５×ＴＢＥを用いる８０Ｖの電気泳動に供した。
【００９３】
２．６ｋｂのＰＰＤＫｃＤＮＡバンドおよび４．４ｋｂのＰＰＤＫｇＤＮＡバンドを、推奨されている手順に従ってQIAQuick PCR精製キット(QIAQuick PCR Purification Kit)（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製し、３０μｌの分子生物学等級水（BDH Laboratory Supplies社）を用いて溶出した。ＰＣＲ産物は、推奨されている手順に従ってpCR 4Blunt-TOPOベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に連結させた（平滑末端）。クローン化反応物（２μｌ）を、推奨されている手順に従って５０μｌのSub-cloning Efficiency DH5α大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に形質転換した。形質転換した大腸菌細胞は、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）寒天上で３７℃で一晩増殖させた。ルリア−ベルターニ培地（ＬＢ培地）は、１０ｇｌ−１のバクト−トリプトン(Bacto-Tryptone)（ＢＤ）、５ｇｌ−１のバクト酵母抽出物(Bacto-Yeast Extract)（Ｏｘｏｉｄ社）および８５ｍＭの塩化ナトリウム（Fisher Scientific社）を含んでいた。このｐＨは、高圧蒸気滅菌前に１０Ｍの水酸化ナトリウムで７．０に調整した。１．５％（ｗ／ｖ）の寒天（ＢＤ）を５０μｇｍｌ−１のカナマイシン（Melford Laboratories社）を含むＬＢ培地に添加してＬＢ寒天を調製した。
【００９４】
大腸菌のコロニーは、１×ＮＨ４緩衝液（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）、０．５ｍＭのｄＮＴＰs（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）、０．３μＭの各プライマー（ＡｔＣｙｔＦＷＤ−ＡｖｒＩＩおよびＡｔＣｙｔＲＥＶ−ＢａｍＨＩ）、すなわち配列番号１および２、ならびに０．５単位のBioTaq ＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）を用いるＰＣＲによってスクリーニングした。熱循環は、９５℃で５分間の最初の変性工程、次いで、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で４分３０秒間の３０サイクル、７２℃で５分間の最終的な伸長工程によって行った。ＰＣＲ産物を、上記のように１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル電気泳動を用いて調べた。所望の挿入断片を含むコロニーを、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ培地において３７℃の振盪培養器内で一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、推奨されている手順に従ってＱＩＡＰｒｅｐスピンミニプレップキット(QIAPrep Spin Miniprep Kit)（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて抽出した。ＤＮＡは、１×ＢａｍＨＩ緩衝液中の１０単位のＢａｍＨＩ（ＮＥＢ１）によって３７℃で１時間消化した。消化は、上記のように１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル電気泳動を用いて調べた。正しい制限酵素消化パターンを示すプラスミ中の挿入断片を、３７３０ＤＮＡ分析機（Applied Biosystems社）を用いて、表１に示すプライマーＡｔＣｙｔＦＷＤ−ＡｖｒＩＩ（配列番号１）、ＡｔＰＰＤＫＳｅｑＦ１（配列番号３）、ＡｔＰＰＤＫＳｅｑＦ２（配列番号４）、ＡｔＰＰＤＫＳｅｑＲ１（配列番号５）、ＡｔＰＰＤＫＳｅｑＲ２（配列番号６）およびＡｔＣｙｔＲＥＶ−ＢａｍＨＩ（配列番号２）を用いて配列決定した。配列は、ＢｉｏＥｄｉｔ（Ibis Biosciences社）で分析した。
【００９５】
これらの構築物をＴＯＰＯ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＴＯＰＯ−ＰＰＤＫｇＤＮＡと命名し、図２ａおよび図２ｂに示す。
【００９６】
ｐＢＮＰ構築物のクローン化
ＰＰＤＫを、老化誘発プロモーターＳＡＧ１２の制御下でＢＮＰ１３８００００００１バイナリーベクターに連結させた。ＳＡＧ１２を含む骨格プラスミド（ＢＮＰ１３８００００００１）は、ｐＢＩＮＰＬＵＳ(F. A. van Engelen et al. Transgenic Research (1995) 4, 288-290)に基づくものであり、図３ａに示す。最初に、ＴＯＰＯ−ｃＤＮＡまたはＴＯＰＯ−ｇＤＮＡを保有する大腸菌のコロニーを使用して、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンを含む２５ｍｌのＬＢ培地に植菌した。これらの培養物を３７℃の振盪培養器内で一晩培養し、推奨されている手順に従ってプラスミドミディキット(Plasmid Midi Kit)（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドミディキットを用いて、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンを含む１００ｍｌの培養物からｐＢＮＰ１３８００００００１ベクターを精製した。
【００９７】
次いで、これらのプラスミドを、制限酵素ＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩによって消化した。消化反応物は、３７℃で一晩培養し、２μｇのＤＮＡ（ＢＮＰ社）または４μｇのＤＮＡ（ＴＯＰＯ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＴＯＰＯ−ＰＰＤＫｇＤＮＡ）のいずれか一方、１×緩衝液２、１０単位のＡｖｒＩＩおよび１０単位のＢａｍＨＩを含んでいた。試料は、０．８％（ｗ／ｖ）のアガロース、０．５×ＴＢＥおよび２５μＭのクリスタルバイオレット（Hopkin and Williams社）を用いるクリスタルバイオレットアガロースゲル電気泳動(Rand, 1996, Crystal violet can be used to visualize DNA bands during gel electrophoresis and to improve cloning efficiency（クリスタルバイオレットは、ゲル電気泳動中にＤＮＡバンドを視覚化し、かつクローン化効率を向上させるために使用することができる）. Elsevier Trends Journals Technical Tips Online.)によって分離し、クリスタルバイオレット試料緩衝液（２５０μＭのクリスタルバイオレット（Hopkin and Williams社）および３０％（ｗ／ｖ）のスクロース（Fisher Scientific社）および泳動用緩衝液としての２５μＭのクリスタルバイオレットを含有する０．５×ＴＢＥを用いて、約２時間５０Ｖの電気泳動に供した。推奨されている手順に従ってＱＩＡＱｕｉｃｋゲル抽出キット(QIAQuick Gel Extraction Kit)（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いるゲルバンド抽出を使用して、１４．４ｋｂのＢＮＰ、２．６ｋｂのＰＰＤＫｃＤＮＡおよび４．４ｋｂのＰＰＤＫｇＤＮＡ断片を抽出した。断片は、臭化エチジウムを用いる１％のアガロースゲル電気泳動を用いてHyperLadder I（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）に対して調査および定量化した。
【００９８】
ゲル抽出したｇＤＮＡ断片は、ｇＤＮＡ断片（４．４ｋｂ）およびＴＯＰＯ骨格（３．９ｋｂ）と同様の大きさであるため、ホスファターゼで処理してあらゆる汚染性ＴＯＰＯ骨格との連結反応を防止した。エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ、１単位、Ｒｏｃｈｅ社）を、１×脱リン酸化緩衝液（Ｒｏｃｈｅ社）に入れた１μｇのゲル抽出したｇＤＮＡ断片に添加し、この反応物を３７℃で３０分間培養した後、６５℃で１０分間失活させた。連結反応は、１０：１のモル比で消化したＢＮＰを有するｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ断片のいずれか一方、１×連結反応緩衝液（ＮＥＢ社）および１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）を用いて行った。連結反応物を１６℃で一晩培養し、２μｌを使用して、推奨されている手順に従ってＬｉｂｒａｒｙ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５α大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を形質転換した。
【００９９】
形質転換した大腸菌を、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンを含むＬＢ寒天上に移し、３７℃で一晩培養した。大腸菌のコロニーは、１×ＮＨ４緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、０．３μＭの表１に示す各プライマー（ＡｔＰＰＤＫｅｘｏｎ１５ＦＷＤ（配列番号７）およびＢＮＰｎｏｓｔＲＥＶ（配列番号８）、および０．５単位のBioTaq DNAポリメラーゼを用いるＰＣＲによってスクリーニングした。熱循環は、９５℃で５分間の最初の変性工程、次いで、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３分間の３０サイクル、７２℃で５分間の最終的な伸長工程によって行った。ＰＣＲ産物は、上記のように１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル電気泳動を用いて調べた。所望の挿入断片を含むコロニーを、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ培地において３７℃の振盪培養器内で一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡは、推奨されている手順に従ってＱＩＡＰｒｅｐスピンミニプレップキット(QIAPrep Spin Miniprep Kit)を用いて抽出した。ＤＮＡは、上記のように１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル電気泳動に供する前に３７℃で１時間、１×ＢａｍＨＩ緩衝液中で１０単位のＢａｍＨＩおよび１０単位のＳｔｕＩで消化した。正しい制限酵素消化パターンを示す、ｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ連結反応によってそれぞれ得られた１つのコロニーを選択し、上述のように、表１に示すプライマーＢＮＰ−ＳＡＧ１２ＦＷＤ（配列番号９）を用いて配列決定した。
【０１００】
これらの構築物をＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡと命名し、図３ａおよび図３ｂに示す。
【０１０１】
実施例２−ＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡによるシロイヌナズナの形質転換
アグロバクテリウムチュメファシエンスのＧＶ３１０１−Ｒ株を、電気穿孔によって、図３に示すプラスミドＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡで形質転換した。それらの調製については、実施例１に記載されている。
【０１０２】
電気的形質転換受容性(electrocompetent)アグロバクテリウムを、２５ｍｇｌ−１のリファンピシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含むＬＢ培地の培養物から産生し、３０℃および、６００ｎｍにおいて０．４〜０．６の光学濃度で増殖させ、Eppendorf Biophotometer分光光度計を用いて測定した。５００ｍｌの培養物を４０００ｇで１５分間遠心分離し、上澄みを捨て、細胞を５００ｍｌの１０％冷グリセリン（Fisher Scientific社）に再懸濁した。遠心分離および再懸濁を２５０ｍｌ、次いで１０ｍｌ、最後に２ｍｌのグリセリンを用いて繰り返した。細胞は、５０μｌの分割量に等分し、液体窒素中で急速冷凍し、−８０℃で保存した。電気穿孔は、ＢｉｏＲａｄ遺伝子導入装置(BioRad Gene Pulser)を用いて行った。プラスミドＤＮＡ（２００ｎｇ）を、上記のように予備冷却した電気穿孔法用キュベット（Gene Pulser Cuvette、ＢｉｏＲａｄ社）に入れた５０μｌのアグロバクテリウム細胞に添加し、この細胞を氷上で５分間培養した。このキュベットに対して、２．５ｍＶのパルス、４００オームの抵抗および２５μＦの静電容量を用いた電気穿孔を行った。１ｍｌのＳＯＣ培地（Super Optimal Broth, Catabolite Repression）は、２０ｇ／ｌのバクト−トリプトン、５ｇ／ｌのバクト酵母抽出物、８５ｍＭの塩化ナトリウムおよび２５０ｍＭの塩化カリウムを含んでいた。１０Ｍの水酸化ナトリウムを使用して、高圧蒸気滅菌前にｐＨを７．０に調整した。使用前に、最終濃度が１０ｍＭになるように無菌塩化マグネシウムを添加し、最終濃度が２０ｍＭになるように無菌グルコース（Fisher Scientific社）を添加した。この細胞を３０℃の振盪培養器内で２時間培養した後、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンおよび５０μｇｍｌ−１のリファンピシンを含むＬＢ寒天上に移した。
【０１０３】
３０℃で２日間の培養後に、コロニーをＰＣＲ、次いで制限酵素消化によってスクリーニングした。ＰＣＲのスクリーニングで陽性であり、かつ期待した制限消化パターンを示すコロニーを、５０μｌｍｌ−１のカナマイシンおよび５０μｌｍｌ−１のリファンピシンを含む５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３０℃の振盪培養器内で一晩培養した。翌日、この培養物６００μｌを使用して上記のように５００ｍｌのＬＢ培地に植菌し、花浸漬(floral dipping)に使用する前に、３０℃の振盪培養器内で３０時間培養した。
【０１０４】
シロイヌナズナ植物は４週齢で花浸漬のために使用した。全ての構築物を、野生型の生態型Columbia 0に形質転換した。上記のように調製したアグロバクテリウム培養物を５，０００ｇで、４℃で１５分間遠心分離し、細胞ペレットは、２５０ｍｌの無菌の５％スクロース（Fisher Scientific社）溶液（ｗ／ｖ）および０．０５％Silwett L-77（OSi Specialties社）に再懸濁した。植物は、穏やかに撹拌しながら細胞懸濁液に約１０秒間浸漬した後、ポリエチレン製ラップで蓋をし、２４時間直射日光を避けた。この後、植物を標準的な規制飼育に戻し、種子を収穫した。
【０１０５】
形質転換シロイヌナズナの選択
形質転換した植物からの種子は、Harrison et al. (2006), Plant Methods, 2, 19に従って、５０μｇｍｌ−１のカナマイシン（Dufecha Biochemie社）に関して選択した。抗生物質抵抗性を示すＴ１植物は結実するまで成長し、自己授粉した。この種子を上記のように選択し、３：１の耐性：非耐性比を示すＴ２系統を、導入遺伝子の単一コピーを保有するものとして選択した。これらの植物は再び自己授粉し、上記のように選択した。１００％の耐性を示す子孫（Ｔ３）を産生したＴ２系統をホモ接合性として選択し、全ての実験に使用した。メンデル遺伝学を使用して、導入遺伝子に対してホモ接合性であり、かつ単一の導入遺伝子コピーを含むＴ２世代植物を選択した。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡで形質転換した各植物に対して、５種類の独立した単一の挿入断片のホモ接合性系統を選択した。
【０１０６】
実施例３−ＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡによるタバコの形質転換
形質転換受容性アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＬＢＡ４４０４を、実施例２に記載されているように電気穿孔法によって、プラスミドＢＮＰ、ＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰＰＰＤＫｇＤＮＡで形質転換した。電気穿孔後、電気穿孔した細胞に１ｍｌのＬＢ培地を添加し、次いで、その細胞を、５０μｇｍｌ−１カナマイシンおよび１００μｇｍｌ−１スペクチノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含むＬＢ寒天上に移す前に、２８℃の振盪培養器内で２時間培養した。２８℃で２日間の培養後、１つのコロニーを使用して、５０μｇｍｌ−１カナマイシンおよび１００μｇｍｌ−１スペクチノマイシンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に植菌した。この培養物を、２８℃の振盪培養器内で３日間培養した。プラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素消化によって分析し、５０μｌの培養物を使用して、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンおよび１００μｇｍｌ−１のスペクチノマイシンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に植菌した。この培養物を、２８℃の振盪培養器内で一晩培養した。
【０１０７】
タバコ栽培品種バーレー２１およびＫ３２６を種子から栽培し、最も若い葉を８週齢の植物から切除し、８％（ｖ／ｖ）ドメストス濃厚漂白剤（Ｄｏｍｅｓｔｏｓ社）で１０分間滅菌した後、無菌蒸留水ですすいだ。Ｎｏ．６コルク穿孔器を使用して葉片に穴を開け、次いで、これを２５ｍｌのアグロバクテリウム培養物に２分間入れた。次いで、葉片を、２．２μＭの６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）および０．２７μＭのα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を含むＭＳ培地上に下側を下に向けて置いた。これらを、２２℃の成長室に２日間置いた。次いで、葉片を、５００μｇｍｌ−１のクラフォラン(Roussel Laboratories社)（共培養されていない対照）または５００μｇｍｌ−１のクラフォランおよび１００μｇｍｌ−１のカナマイシンを含む上記のような選択的なＭＳ培地に移した。葉片は、６週間にわたって１４日毎に、上記のような新しい選択的なＭＳ培地に移した。次いで、カルスおよび苗条塊(shoot clump)を葉片から除去し、０．５μＭのＢＡＰ、５００μｇｍｌ−１のクラフォランおよび１００μｇｍｌ−１のカナマイシンを含むＬＳ培地に入れた。２週間後、苗条を０．５μＭのＢＡＰ、５００μｇｍｌ−１のクラフォランを含みかつカナマイシンを含まないＬＳ培地を入れた１５０ｍｌの瓶に移した。
【０１０８】
それから３週間後、優性の苗条を、２５０μｇｍｌ−１のクラフォランを含みかつＢＡＰまたはカナマイシンを含まないＬＳ培地に移した。さらに３週間後、苗条を、抗生物質またはＢＡＰを含まないをＬＳ培地に移すことによって、さらに浄化した。十分な根が生えたら、植物を温室内の土壌に移した。
【０１０９】
形質転換タバコの選択
定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用して、Ｔ０およびＴ１植物中の導入遺伝子のコピー数を定量化した。可能であれば、単一の挿入断片Ｔ０およびホモ接合性Ｔ１植物を分析のために選択した。導入遺伝子の検出のために、表１に示すようなプライマーＢＮＰ−１２７１Ｆ（配列番号１０）およびＢＮＰ−１３３４Ｒ（配列番号１１）を使用し、Ｖｉｃ／ＴＡＭＡＲＡ標識プローブＢＮＰ１２９１ＴＶ（配列番号１２）を使用して、ｎｐｔＩＩ導入遺伝子にアニールした。内部定量化のために、プライマーＮｔＣｙｃ−１８４Ｆ（配列番号１３）およびＮｔＣｙｃ−３１６Ｒ（配列番号１４）を使用し、ＦＡＭ／ＴＡＭＡＲＡ標識プローブＮｔＣｙｃ−２６７Ｔ（配列番号１５）を使用して、サイクロフィリンをコードする内因性遺伝子にアニールした。定量化は、比較Ｃｔ法によるものであった(ΔΔCt method, Bubner & Baldwin (2004), Plant Cell Reports, 23, 263-271)。反応混合物は、１×ユニバーサルマスターミックス(Universal Master Mix)（ＡＢＩ社）、０．９μＭの各プライマー、０．２μＭの各プローブ（ＢＮＰおよびＮｔＣｙｃプライマーおよびプローブに対して別の反応を用いる）および推奨されている手順に従ってＤＮｅａｓｙ植物ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて葉の組織から抽出した約５００ｎｇのｇＤＮＡ鋳型を含んでいた。熱循環は、９５℃で１０分間の最初の変性工程、次いで、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サイクルによって、7900HT FastリアルタイムＰＣＲシステム(7900HT Fast Real-Time PCR System)（Applied Biosystems社）で行った。データは、付属のＳＤＳ２．２ソフトウェア（Applied Biosystems社）を用いて分析した。
【０１１０】
形質転換したＴ０世代のＫ３２６およびバーレー２１タバコの組織培養における再生後、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用して、導入遺伝子の単一コピーを有する植物を選択した。単一の挿入断片の植物は、導入遺伝子サイレンシングの可能性を減少させるように選択した。Ｑ−ＰＣＲは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｎｐｔＩＩ導入遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて行った。この遺伝子は、構築物ｐＢＮＰ、ＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡ中の植物ゲノム内に運ばれたＴ−ＤＮＡの左右の境界の間に存在していた。ｐＢＮＰのみによって形質転換した植物は、組織培養による再生が空のベクターによって形質転換された植物とＰＰＤＫコード配列を含むベクターによって形質転換された植物との間で一致することを確認するための空のベクター対照として機能した。形質転換が成功したことを確認するための再生およびＱ−ＰＣＲ検査後、これらの植菌を破棄した。
【０１１１】
各構築物（ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ）ならびに各栽培品種（Ｋ３２６およびバーレー２１）のために、６種類の植物を選択した。単一の挿入断片の植物のみを選択することができなかったため、６種類の単一の挿入断片の植物が入手できなかった場合は、可能な限り最も少ないコピー数を有する植物を選択した。これらの植物は自己授粉し、その種子を収穫した。
【０１１２】
選択したＴ０植物ごとに１４株の子孫を育て、Ｑ−ＰＣＲを繰り返してホモ接合性植物を選択した。ホモ接合性植物の使用によって、将来の世代における導入遺伝子の安定性を確保しなければならない。Ｔ０親ごとに、導入遺伝子を保有している４株の子孫を選択した。しかし、全てのＴ０親に対して、ホモ接合性の子孫を必ずしも選択することができるわけではなかった。親のコピー数が３つ以上であった場合は、より少ないコピー数を有する植物を選択して、導入遺伝子サイレンシングの可能性を減少させかつ、また必要であれば、Ｔ２世代からのホモ接合体の選択を単純化した。このようにして、各構築物および各栽培品種のために、５種類の独立した系統から、全てのさらなる実験のためにより少ない導入遺伝子コピー数を有する４種類の生物学的複製（同胞）を選択した。
【０１１３】
実施例４−形質転換したシロイヌナズナ植物中のＰＰＤＫタンパク質の検出および定量化
タンパク質の抽出
シロイヌナズナの葉の組織（１００ｍｇ）を、マイクロ乳棒を用いて１．５ｍｌの微小遠心管中で液体窒素冷却して粉砕し、４００μｌの抽出緩衝液（リン酸カリウム緩衝液（＋プロテアーゼ阻害剤反応混液（ＰＩＣ、Ｓｉｇｍａ社）））を添加した。タンパク質の濃度は、推奨された手順に従ってＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬(Bio-Rad Protein Assay Reagent)（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてブラッドフォードアッセイ(Jones et al., 1989, Journal of Chemical Ecology, 15, 979-992)で測定した。
【０１１４】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動
タンパク質は、１０％（ｖ／ｖ）アクリルアミド（３７．５：１＝アクリル：ビスアクリル、Severn Biotech社）、５０％（ｖ／ｖ）免疫ブロット分解緩衝液（セクション２．１０を参照）、０．０５％（ｗ／ｖ）ペルオキソ二硫酸アンモニウム（APS、AnalaR社）、および０．０５％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’,Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、Severn Biotech社）を含む分解ゲルにおけるポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ社）によって分離した。濃縮用ゲルは、上記のような５％アクリルアミド、５０％（ｖ／ｖ）免疫ブロット濃縮用緩衝液、０．０６％（ｗ／ｖ）ＡＰＳおよび０．１％（ｖ／ｖ）ＴＥＭＥＤを含んでいた。電気泳動は、１×免疫ブロット試料緩衝液（６６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセリン、０．７ｍＭのＳＤＳ、０．７Ｍのβ−メルカプトエタノール（BDH Laboratory Supplies社）および０．０５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）および免疫ブロット泳動用緩衝液、（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．２９ｍＭのグリシン(Fisher Scientific社)および３．５ｍＭのＳＤＳ）を用いて抽出した２０μｇの総タンパク質に対して７０ｍＡの電流で１時間３０分間行った。
【０１１５】
二組のゲルを同時に泳動した。一方を免疫ブロット分析（以下に記載する）のために使用し、他方を推奨された手順に従ってＧｅｌＣｏｄｅ青色安全タンパク質染色(GelCode Blue Safe Protein Stain)（Thermo Scientific社）を用いて染色した。ゲル乾燥膜(Gel Drying Film)（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して染色したゲルを乾燥した。
【０１１６】
免疫ブロット分析
免疫ブロット分析用のゲルからのタンパク質を、Ｐｒｏｔｅａｎ極厚ブロット紙(Protean Extra-Thick Blot Paper)（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）、および免疫ブロット用転写緩衝液（４８ｍＭのトリス−ＨＣｌ、３９ｍＭのグリシン、１．３ｍＭのＳＤＳおよび２０％（ｖ／ｖ）メタノール（Fisher Scientific社））を用いて、セミドライブロッター(Semi-Dry Blotter)（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中でProtan BA83硝酸セルロース膜（Schleicher and Schuell社）に１５Ｖで１時間転写した。タンパク質の転写を確認するために、ポンソー染色（０．５％（ｗ／ｖ）ポンソーＳ（Ｆｌｕｋａ社）および１％（ｗ／ｖ）氷酢酸（Fisher Scientific社））をブロットした後の膜に塗布し、次いで、その膜を蒸留水ですすいだ。
【０１１７】
ＰＰＤＫ免疫ブロット分析用のブロッキング緩衝液は、１％（ｗ／ｖ）乾燥脱脂乳粉末（Ｍａｒｖｅｌ社）および０．１％（ｖ／ｖ）ポリオキシエチレンモノラウリン酸ソルビタン（ＴＷＥＥＮ２０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：１．５ｍＭの正トリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４、ＡｎａｌａＲ社）、８．１ｍＭの正リン酸二水素ナトリウム、２．７ｍＭの塩化カリウムおよび１３７ｍＭの塩化ナトリウム）を用いて毎日更新した。塩酸を使用してｐＨを７．４に調整した。膜は、振盪機上の室温のブロッキング緩衝液中で１時間培養した。一次ハイブリッド形成は、ウサギ抗ＰＰＤＫ抗体（Chris Chastain、ミネソタ州立大学）の１：１０，０００の希釈液を用いて行い、次いで、ブロッキング緩衝液でそれぞれ５分間の洗浄を３回行った。二次ハイブリッド形成は、ロバ抗ラビットビオチン化全抗体(GE Healthcare社)の１：１０００の希釈液を用いて行い、次いで、上記のように３回洗浄した。三次ハイブリッド形成は、ストレプトアビジンビオチン化ワサビペルオキシダーゼ複合体（GE Healthcare社）の１：１０００の希釈液を用いて行い、次いで、各０．１％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳ中で５分間の洗浄を３回行った。
【０１１８】
次いで、膜を蒸留水中で３回すすいだ。検出は、推奨されている手順に従って、Western Lightning化学発光試薬(Western Lightning Chemiluminescence Reagent)（増感ルミノール(Enhanced Luminol)、Perkin Elmer社）を用いて行った。
【０１１９】
図４を参照すると、ウェスタンブロットによる形質転換ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫシロイヌナズナ細胞株の選択が示されている。タンパク質を、８週齢のシロイヌナズナ野生型、ΔＰＰＤＫ、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物の葉の組織から抽出し、より高濃度のＰＰＤＫを発現している株を選択するために免疫ブロット分析に供した。組み換え型トウモロコシＰＰＤＫ（３０μｇ）を陽性対照として使用した。ＰＰＤＫは、野生型またはＰＰＤＫ変異型植物（ΔＰＰＤＫ）において検出されなかった。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物は、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡよりも高濃度のＰＰＤＫを発現していた。その後の全ての分析は、５種類のＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統に対して行った。
【０１２０】
ＰＰＤＫは、野生型およびΔＰＰＤＫ植物中では検出することができず、いくつかのＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ植物中では低濃度で検出することができ、全てのＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統で検出することができた。これらの系統のうち３つにおいて、野生型またはＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ系統に比べ非常により高い量のＰＰＤＫが検出された。従って、イントロンの存在は、ＰＰＤＫの発現レベルに対してプラスの効果があると思われ、全てのさらなる実験での使用のためにＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統を選択した。
【０１２１】
ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物におけるＰＰＤＫの累積の開始および程度を測定するために、ＰＰＤＫの免疫ブロットを、野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物に対して行った。
【０１２２】
図５を参照すると、野生型、ΔＰＰＤＫおよび５週目以降の５種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統におけるＰＰＤＫ発現量の定量化が示されている。ＰＰＤＫ発現量は、５〜９週目の各時点の野生型の割合として計算した。データは、これらの５つの時点の平均として示されている。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統は、ＰＰＤＫ発現量の昇順で配置されている。遺伝子型間の差は、分散分析を用いて試験した（Ｆ＝４．７７５、ｄｆ＝６、ｐ＝０．００１）。野生型と有意差が認められる系統は、Ｇ１２．３（ｐ＝０．００５）およびＧ１６．１（ｐ＝０．００４）であった。
【０１２３】
タンパク質は、播種後３週目から９週目までの週間隔で収穫された葉の組織から抽出した。ＰＰＤＫは、５週目以降の野生型植物中で低量検出され、これにより、転写産物の観察された増加によってタンパク質の発現量が増加することが確認された。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物では、ＰＰＤＫの累積の開始も５週目に観察されたが、ＰＰＤＫ発現量は野生型よりも多い。ＰＰＤＫタンパク質は、ΔＰＰＤＫ植物ではいずれの段階においても検出されなかった。
【０１２４】
葉のタンパク質抽出物中のＰＰＤＫの定量化を可能にする方法も最適化した。異なる量の組み換え型トウモロコシＰＰＤＫタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット分析に供した。バンド強度は、ＡｌｐｈａＥａｓｅ画像化ソフトウェアおよび作成された標準曲線を用いて計算した。回帰直線はＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェアを用いて計算し、次いで、これを使用して植物の葉の試料中のＰＰＤＫ量を計算した。免疫ブロットの検出レベルが変化する可能性があるため、異なる免疫ブロットの間の真の比較を可能にするために、全ての免疫ブロットに対して少なくとも３種類の標準物質を含める必要があった。異なる抽出物中のＰＰＤＫ発現量の定量化のためのこの技術を使用して、異なる形質転換系統を選択および比較した。
【０１２５】
ＰＰＤＫタンパク質発現量は、各時点における各系統の少なくとも４個の生物学的複製について、組み換え型トウモロコシＰＰＤＫタンパク質の公知の標準物質を参照することによって計算した。分析から、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ中のＰＰＤＫ発現量が５週目以降の野生型における発現量よりも高いことが分かった。ＰＰＤＫ発現量は、各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統について５週目以降の各時点の野生型の割合、および各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統の老化期間におけるＰＰＤＫの累積を定量化するためのこれらの値からの平均として計算した。図５に示すように、これによって、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統をＰＰＤＫ発現量の増加に従って順序付けることができた。
【０１２６】
形質転換植物中に高い量で蓄積したタンパク質が失活する場合があるため、タンパク質発現量の増加が必ずしも酵素活性の増加を暗示するというわけではない。ＰＰＤＫは暗所で可逆的にリン酸化され、その結果、ＰＰＤＫは失活する。抗体は、ＰＰＤＫのリン酸化された型（リン酸化ＰＰＤＫ）に抗して増加し、ＰＰＤＫの失活型の特異的検出を可能にするが、リン酸化状態に関係なく以前に使用された抗体（抗ＰＰＤＫ）はＰＰＤＫを検出する(Chastain et al., 2002, Plant Physiology, 128, 1368-1378)。抗リン酸化ＰＰＤＫ抗体を使用して、免疫ブロット時には抗ＰＰＤＫ抗体によって最初に検出され、次いで剥離され、かつ再検出される播種後３週目から９週目までに経時的に失活したＰＰＤＫを検出した。
【０１２７】
驚くべきことに、失活した（リン酸化された）ＰＰＤＫは、複数の免疫ブロットにおいて野生型植物中に超低濃度でのみ、かつ老化の後期段階の間にのみ検出することができた。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物では、失活した時点に応じて、ＰＰＤＫは、より高濃度で検出された。しかし、ＰＰＤＫ発現量の増加開始直後の時点では、総ＰＰＤＫの高い発現量にも関わらず、失活したＰＰＤＫは、ほとんどあるいは全く検出されなかった。これらの結果は、一部のＰＰＤＫの失活がＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物中に生じる可能性があるが、酵素的に活性なＰＰＤＫの発現量の増加は、少なくとも老化の初期段階の間にＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物において存在することを示唆している。
【０１２８】
実施例５−形質転換したタバコ(Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ)植物中のＰＰＤＫタンパク質の検出および定量化
タバコの葉の組織（１００ｍｇ）を、マイクロ乳棒を用いて１．５ｍｌの微小遠心管の中で液体窒素下で粉砕し、４００μｌの抽出緩衝液（オーバーコート緩衝液(Overcoat Buffer)（ＰＩＣ社））を添加した。タンパク質の濃度は、推奨されている手順に従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてブラッドフォードアッセイ(Jones et al., 1989)で測定した。タンパク質は、実施例４に記載されているようにポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ社）によって分離した。実施例４に記載されている免疫ブロットによってタンパク質を分析し、かつＰＰＤＫタンパク質を定量化した。
【０１２９】
ＰＰＤＫに対する免疫ブロットは、分離および暗所での３０℃の培養によって老化が誘発されたＫ３２６およびバーレー２１のＴ１世代タバコの葉から抽出した葉のタンパク質に対して行った。老化は、植物が成熟期に達する前に最も高いＰＰＤＫ発現量を有する形質転換系統を特定し、かつ他の系統を破棄できるように誘発した。Ｋ３２６植物では、ＰＰＤＫは、３種類のＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統（Ｇ４、Ｇ８およびＧ１０）および１種類のＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ系統（Ｃ１０）において高い発現量で検出された。バーレー２１植物では、ＰＰＤＫは、４種類のＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統（Ｇ３、Ｇ７、Ｇ１５およびＧ２３）に大量に存在したが、Ｋ３２６系統に認められる程に高い発現量では存在していなかった。最も高いＰＰＤＫ発現量を有するＫ３２６およびバーレー２１のそれぞれの４種類の系統をさらなる全ての分析のために使用した。ほぼ例外なくＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統のみに最も高いＰＰＤＫ発現量が観察されたため、イントロンがＰＰＤＫ発現に対してプラスの効果を有していると思われる。
【０１３０】
図６を参照すると、以下のように、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ−Ｋ３２６およびバーレー２１タバコ系統の選択が示されている：
（ｂ）形質転換Ｋ３２６系統を選択するためのＰＰＤＫ免疫ブロット。老化は、分離および暗所での３０℃で３日間の培養によって６週齢の植物の緑葉において誘発された。タンパク質を抽出し、免疫ブロット分析に供して、より高濃度のＰＰＤＫを発現している系統を選択した。組み換え型トウモロコシＰＰＤＫ（５０μｇ）を陽性対照として使用した。各親のＴ０植物からの１つの子孫に関する１つの代表的な免疫ブロットが示されている。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ親系統Ｇ４、Ｇ８およびＧ１０から、および、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ系統Ｃ１０からの植物をその後の全ての分析に使用した。
（ｃ）セクション（ｂ）におけるＫ３２６に関して、形質転換バーレー２１系統を選択するためのＰＰＤＫ免疫ブロット。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ親系統Ｇ３、Ｇ７、Ｇ１５およびＧ２３からの植物をその後の全ての分析のために使用した。
【０１３１】
ＰＰＤＫに対する免疫ブロットを、野生型、ゼロコピー（陰性の分離体）、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ−Ｋ３２６、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ−Ｋ３２６およびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ−バーレー２１タバコに対して行って、ＰＰＤＫの発現の開始を測定し、かつ形質転換した植物中のＰＰＤＫの過剰発現の程度を定量化した。タンパク質は、Ｋ３２６野生型および形質転換した植物の葉１（最も古い）〜３ヵ月齢の植物の８（若い）から抽出し、ＰＰＤＫに対する免疫ブロットを行った。
【０１３２】
図７を参照すると、Ｋ３２６タバコの熟した葉におけるＰＰＤＫの過剰発現が示されている。ＰＰＤＫ発現量は免疫ブロットから計算した。データは、ゼロコピー植物の１０個の生物学的複製および各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統の４個の生物学的複製の平均として示されている。エラーバーは標準誤差を示す。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統は、ＰＰＤＫ発現量の上昇で配置されている。遺伝子型間の差は、分散分析を用いて試験した（Ｆ＝６．９９５、ｄｆ＝４、ｐ＝０．００１）。ゼロコピー植物と有意差が認められる系統は、Ｇ１０（ｐ＝０．００６）、Ｇ８（ｐ＝０．００３）およびＣ１０（ｐ＝０．０００）であった。
【０１３３】
ＰＰＤＫ発現量は、野生型植物のより古い葉の中でより高く、これは、ＰＰＤＫが、タバコならびにシロイヌナズナにおける老化中に自然に上方制御されることを示している。形質転換したＫ３２６植物では、ＰＰＤＫ発現量は同様に、より古い葉においてより高く、野生型植物において非常により高かった。また、最も高いＰＰＤＫ発現量を有する形質転換した系統のより若い葉においてＰＰＤＫ発現量はより高かった。免疫ブロットを、ゼロコピー植物（陰性の分離体）および形質転換した植物の「熟した」葉から抽出したタンパク質に対して行った。熟した葉は、収穫可能な段階にあり、かつ老化の後期段階にある葉である。ＰＰＤＫ発現量を定量化した。ＰＰＤＫ発現量は、ゼロコピー植物と比較して、全ての４種類の独立した形質転換した系統の熟した葉においてより高かった。ＳＡＧ１２プロモーターを用いる老化中のＰＰＤＫの過剰発現は、Ｋ３２６タバコでは成功していた。
【０１３４】
実施例６−形質転換したシロイヌナズナ植物の表現型分析
シロイヌナズナ植物の成長分析
図８を参照すると、シロイヌナズナにおけるＰＰＤＫｇＤＮＡの過剰発現によって、より大きなロゼットを有する植物が生産されることが明らかに示されている。播種後３、５、７および９週目に野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物を撮影した。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物は野生型よりも大きかった。ＰＰＤＫ植物と野生型植物との間に識別可能な差はなかった。
【０１３５】
ロゼットおよび生殖組織の生質量は、０．１ｍｇの単位まで、メトラー・トレドＡＢ１０４−Ｓ(Mettler Toledo AB104-S)天秤を用いて精密に測定した。ロゼット組織の乾燥質量は、Edwards Super Modulyo凍結乾燥器(Edwards Super Modulyo Freeze Dryer)を用いて一晩凍結乾燥した試料から、０．１ｍｇの単位まで精密に測定した。
【０１３６】
図９を参照すると、９週目の生殖組織の質量が示されている。より高い生殖組織質量を有するより高いＰＰＤＫ発現量を有する系統について、ＰＰＤＫに対する用量反応が観察された。総生殖組織（茎、茎生葉、花および長角果）を計量した。値は３個の生物学的複製の平均である。エラーバーは標準誤差を示す。形質転換ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統は、ＰＰＤＫ発現量の昇順で配置されている。遺伝子型間の差は分散分析を用いて試験した（Ｆ＝８．０６２、ｄｆ＝６、ｐ＝０．００１）。全てのＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統は、野生型とは有意に異なっていた（Ｇ９．４：ｐ＝０．０３１、Ｇ５．４：ｐ＝０．０００、Ｇ１９．２：ｐ＝０．０００、Ｇ１２．３：ｐ＝０．００１、Ｇ１６．１：ｐ＝０．００１）。傾向は絶対ではないが、より高いＰＰＤＫ発現量を有する系統はより高い生殖組織質量を有する傾向にあった。総植物生質量の割合としての生殖組織も計算したが、分散分析を用いて試験した場合、野生型、ΔＰＰＤＫまたはＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物では有意差は認められなかった（Ｆ＝０．５４４、ｄｆ＝６、ｐ＝０．７６７、データは示さない）。
【０１３７】
しかし、総植物質量の割合としての生殖組織の比率は変化せず、これは、植物は全体としてより大きく、かつ栄養組織と生殖組織との資源分配は変化しないことを示唆していた。ΔＰＰＤＫ植物における総植物生質量および生殖組織質量も測定したが、野生型とは有意差は認められなかった。ロゼットの乾燥質量も測定したところ、総植物生質量および生殖組織質量に関しては、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物が野生型よりも有意に高い質量を有することが分かった。
【０１３８】
図１０を参照すると、播種後３週目から９週目までの野生型およびＳＡＧ１２−ＰＰＤｇＤＮＡ植物の総植物生質量（ロゼット＋生殖組織）が示されている。データは、野生型では３個の生物学的複製、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡでは１５個の生物学的複製（５種類の独立した系統ごとに３個の植物）の平均として示されている。エラーバーは標準誤差を示す。野生型およびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡの総植物質量は、各時点でスチューデントのt−検定を用いて比較した。ロゼット質量は、９週目では、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物の方が有意に高かった（ｐ＝０．０３２）。
【０１３９】
５週目では、ＳＡＧ１２プロモーターによるＰＰＤＫ過剰発現の開始前に、優位差は認められなかった。全ての５種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統のロゼットの乾燥質量は増加した。質量が大きくＰＰＤＫ含有量の高い系統については、ＰＰＤＫ発現量に対する用量反応が生殖組織質量に関して観察された。ロゼットの乾燥質量をΔＰＰＤＫ植物についても測定し、野生型植物とは有意差は認められなかった。
【０１４０】
シロイヌナズナの葉の表面積の測定
ロゼットの表面積は、単一の成葉の試料（通常は葉１０枚）を採取し、上記のように葉およびロゼット全体の質量を測定し、かつルーラーに並べてそれらの葉を撮影して測定した。葉の表面積は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所）を用いて測定し、ここから、ロゼット全体の表面積を計算した。
【０１４１】
ロゼットの表面積は、ＰＰＤＫ過剰発現の開始後にＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物で増加した。６週目および７週目にＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物の表面積は有意により大きかったが、８週目および９週目では、表面積は野生型とは有意差は認められなかった。表面積のこの大きい減少は、野生型と比較してＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物中の栄養分の転流が増加したことに起因していると思われた。ΔＰＰＤＫ植物の表面積は野生型植物とは有意差は認められなかった。
【０１４２】
クロロフィル濃度の測定
クロロフィル含有量は、ＣＣＭ−２００手持ち式クロロフィル計（Opti-Sciences社）を用いて、相対的な単位で測定した。
【０１４３】
シロイヌナズナの蛍光測定
ＦＶ／ＦＭ比を、Hansatech FMS2蛍光光度計を用いて測定した。葉は、測定前に一晩、製造業者によって提供されたリーフクリップ(leaf clip)を用いて暗順応させた。老化の開始が野生型植物に対してＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡまたはΔＰＰＤＫ植物において変化したか否かを判定するために、ＦＶ／ＦＭ比を測定した。ＦＶ／ＦＭは、光化学系IIの量子効率の推定値であり、光阻害が生じると減少する。クロロフィル含有量の減少が検出される前に、光合成の減少が老化の初期に生じるため、ＦＶ／ＦＭは老化の開始の有用な基準である。ＦＶ／ＦＭは、播種後（葉がＦＶ／ＦＭを測定するのに十分な程大きくなる）４週目から９週目までに経時的に測定した。野生型、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびΔＰＰＤＫ植物のＦＶ／ＦＭは、７週目に最大となり、その後減少し、これは、全ての３種類の遺伝子型において老化の開始のタイミングが同じであったことを示していた。しかし、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物のＦＶ／ＦＭは、８週目に野生型よりも有意に高く、これは、老化の後期段階における長期にわたる光合成作用を示していた。
【０１４４】
窒素含有量
窒素分析用の組織を、Edwards Super Modulyo凍結乾燥器を用いて凍結乾燥した。シロイヌナズナの葉の組織（２５ｍｇ）またはタバコの葉の組織（１００ｍｇ）を、窒素非含有秤量紙(Elementar Analysensysteme社)に包装した。推奨されている設定を用いて、Rapid N III窒素分析装置(Rapid N III Nitrogen Analyzer)（Elementar Analysensysteme社）を使用して乾燥重量の割合として窒素含有量を測定した。アスパラギン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を標準物質として使用した。葉の窒素含有量は、シロイヌナズナの野生型、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびΔＰＰＤＫ植物において、播種後３週目から９週間目までに経時的に測定した。
【０１４５】
図１１を参照すると、７週目における野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物の葉の窒素含有量が示されている。データは、野生型およびΔＰＰＤＫでは８個の生物学的複製、各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統では４個の生物学的複製の平均として示している。エラーバーは標準誤差である。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統は、ＰＰＤＫ発現量の昇順で配置されている。遺伝子型間の差は分散分析を用いて試験した（Ｆ＝６．０４７、ｄｆ＝６、ｐ＝０．０００）。ΔＰＰＤＫ植物および全てのＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統は、野生型とは有意に異なっていた（ΔＰＰＤＫ：ｐ＝０．００４、Ｇ９．４：ｐ＝０．０００、Ｇ５．４：ｐ＝０．０００、Ｇ１９．２：ｐ＝０．００１、Ｇ１２．３：ｐ＝０．００７、Ｇ１６．１：ｐ＝０．００６）。
【０１４６】
葉の窒素は、７週目以降は、野生型と比較して全ての５種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統において有意により低く、これは、老化中にＰＰＤＫ発現量が増加することによって窒素の転流効率を高めることができるという仮定を支持するものであった。ＰＰＤＫの発現および活性は、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物において６週目にピークに達し、これは、ＰＰＤＫ発現量の増加と測定可能な葉の窒素の減少との間に時間の遅れが生じたことを示唆しており、この時間の遅れは、タンパク質アミノ酸を輸送アミノ酸（アスパラギンおよびグルタミン）に変換し、かつそれらを葉から輸送するのに要する時間に起因していると思われた。
【０１４７】
シロイヌナズナ種子の分析
個々の種子の質量および窒素含有量を、野生型、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびΔＰＰＤＫシロイヌナズナ植物の種子について測定した。
【０１４８】
図１２を参照すると、野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物の個々の種子の窒素含有量が示されている。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物の種子窒素含有量において有意な増加が認められた。データは、野生型およびΔＰＰＤＫでは８個の生物学的複製、各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統では４個の生物学的複製の平均として示されている。エラーバーは標準誤差である。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統は、ＰＰＤＫ発現量の昇順で配置されている。遺伝子型間の差は分散分析を用いて試験した（Ｆ＝６．７０４、ｄｆ＝６、ｐ＝０．０００）。野生型と有意差が認められる系統は、Ｇ１９．２（ｐ＝０．０００）、Ｇ１２．３（ｐ＝０．００５）およびＧ１６．１（ｐ＝０．００２）であった。より高いＰＰＤＫ発現量を有する系統は、より高い種子窒素質量を有する傾向がある。従って、個々の種子質量は、野生型に対して全ての５種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統で増加し、より高い種子質量を有するより高いＰＰＤＫ発現量を有する植物については、ＰＰＤＫ発現量に対する用量反応が観察された。各植物から収穫された全種子を計量し、野生型とＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物との間に有意差はなく、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物において種子の大きさがそのように増加したことによって総種子収穫量は損なわれなかった。
【０１４９】
シロイヌナズナの葉の組織の遊離アミノ酸含有量
葉の組織（１００ｍｇ）を、マイクロ乳棒（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を用いて、１．５ｍｌの微小遠心管中で液体窒素冷却して粉砕し、３００μｌの無菌脱イオン水を添加した。試料は、１３，０００ｒｐｍで、４℃で５分間遠心分離にかけた。タンパク質の濃度は、推奨されている手順に従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いるブラッドフォードアッセイ(Jones et al., 1989)で測定した。推奨されている手順に係って、ＥＺｆａａｓｔアミノ酸試料試験キット(EZfaast Amino Acid Sample Testing Kit)（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を用いるアミノ酸分析のために試料を調製した。１０ｍＭのギ酸アンモニウム（BDH laboratory supplies社）の５０％無菌蒸留水と５０％超高純度メタノール（Ｒｏｍｉｌ社）溶液に試料を再懸濁した。
【０１５０】
次いで、試料を、ＥＺｆａａｓｔ２５０×３．０ｍｍＡＡＡ−ＭＳカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）ならびに移動相として１０ｍＭのギ酸アンモニウム／５０％（ｖ／ｖ）無菌蒸留水および５０％（ｖ／ｖ）超高純度メタノールを用いるQ Trap LC/MS/MS（Applied Biosystems社／MDS SCIEX社）による液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）にかけた。質量分析計は、ＥＺｆａａｓｔキット(EZfaast Kit)（Ｐｈｅｍｏｎｅｎｅｘ社）で推奨されているような条件を用いて正イオンモードで使用した。結果は、付属のＡｎａｌｙｓｔソフトウェア（Applied Biosystems社／MDS SCIEX社）で分析した。
【０１５１】
総遊離アミノ酸含有量は、野生型、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびΔＰＰＤＫシロイヌナズナ植物の葉において、播種後３週目から９週目までに経時的に測定した。
【０１５２】
図１３を参照すると、ＰＰＤＫを過剰発現しているシロイヌナズナの葉の中で総遊離アミノ酸含有量が増加することが示されている。データは、野生型およびΔＰＰＤＫでは６個の生物学的複製、各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統では４個の生物学的複製の平均として示されている。エラーバーは標準誤差である。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統は、ＰＰＤＫ発現量の昇順で配置されている。全ての５種類のＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統が、野生型よりも高い総アミノ酸含有量を有するが、ばらつきが高く、かつ分散分析を用いて試験した場合、有意差は認められなかった（Ｆ＝１．３１４、ｄｆ＝６、ｐ＝０．２８９）。
【０１５３】
ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物では、葉の窒素含有量が野生型よりも有意に低くなるときと同じでかつＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物の葉の中のＰＰＤＫ発現量が最大になったときから１週間後である７週目の時点で、総遊離アミノ酸含有量は、野生型植物よりも有意に高かった。全ての５種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統で増加が生じたが、ばらつきは高く、かつ個々の系統と野生型との間に有意差は認められなかった。この増加は、この時点で、アミノ酸の排出が生じ得るよりも大きな割合でアミノ酸の産生が生じるため、アミノ酸は葉の老化中に蓄積することを示唆している。総遊離アミノ酸は、野生型と比較してΔＰＰＤＫ植物に有意差は認められなかった。
【０１５４】
輸送アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）も測定し、総遊離アミノ酸の割合として表した。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物では、輸送アミノ酸含有量は、７週目および８週目において野生型植物よりも有意に高かった。この増加は、全ての５種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統において生じたが、ばらつきは高く、かつ個々の系統と野生型の差は有意ではなかった。従って、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物における総遊離アミノ酸含有量の増加に加えて、輸送アミノ酸の含有量は、全体の割合として増加する。これも、グルタミンおよびアスパラギンの産生がこれらの時点において葉の排出量を上回ることを示唆し、老化中のＰＰＤＫ発現量の増加によってアミノ酸の相互転換効率が上昇し、その結果、輸送アミノ酸が産生されるという仮定を支持している。ΔＰＰＤＫ植物では、野生型に対する有意差は観察されなかった。
【０１５５】
実施例７−形質転換したタバコ植物の表現型分析
タバコの葉の窒素含有量の分析
葉の窒素含有量を、陰性の分離体およびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ−Ｋ３２６タバコの熟した葉について測定した。熟した葉は、タバコの生産のために収穫の準備ができいている葉である。４種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統のいくつかでは、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物の葉の窒素含有量は陰性の分離体植物よりも低かった。
【０１５６】
熟した葉は、タバコの生産のために収穫される段階にあるため、葉の窒素含有量を測定するために使用した。しかし、熟した葉における葉の窒素含有量にほとんど差がなかったという事実は、必ずしも窒素の転流が増加しなかったことを暗示しているわけではない。老化しているＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡシロイヌナズナ植物の時間的経過において、葉の窒素含有量は野生型よりも有意に低かったが、老化の後半までにその差は非常により小さくなった。従って、タバコの葉の窒素含有量における差は老化の初期に生じ、葉の窒素含有量を測定するときまでに差が減少するという可能性がある。
【０１５７】
タバコの葉のアミノ酸含有量の分析
分離および暗所での３０℃で３日間の培養によって老化が誘発されたＫ３２６タバコの成葉についてアミノ酸含有量を測定した。これによって、老化の誘発の前後で同じ葉を比較することができた。葉の分離および暗所での培養による老化の誘発は、重複が最大である年齢に関連する老化による遺伝子発現パターンを示す。
【０１５８】
Ｋ３２６タバコでは、陰性の分離体植物およびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物における老化の誘発後に総アミノ酸含有量が増加した。この増加は、老化の誘発前の総アミノ酸含有量の割合として計算した。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統Ｃ１０については、この増加は、陰性の分離体植物よりも有意に小さかったが、他のＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統はどれも陰性の分離体植物に対して有意差を示さなかった。従って、老化中のＰＰＤＫの過剰発現は、暗所で誘発された老化の誘発後の総アミノ酸含有量にほとんど影響を与えることはないと思われた。老化の誘発後に、Ｋ３２６タバコについて、輸送アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）含有量も増加したが、この増加は、陰性の分離体およびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統において生じ、老化の誘発後の増加の程度において遺伝子型間に有意差はなかった。
【０１５９】
タバコの種子の分析
全ての４種類の独立した形質転換系統について、個々の種子の質量をＫ３２６タバコについて測定し、陰性の分離体植物と比較して、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ植物の方が有意に高かった。莢あたりの種子の質量も測定し、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ植物の方が有意に高かった。
【０１６０】
図１４を参照すると、種子の大きさがＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ−Ｋ３２６タバコで増加することが示されている。Ｋ３２６ゼロコピー（ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ挿入断片の陰性の分離体である植物）およびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物の個々の種子の質量は、約１０００個の種子を撮影、計数および計量して計算した。データは、ゼロコピー植物では１０個の生物学的複製、各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統では４個の生物学的複製の平均として示されている。エラーバーは標準誤差である。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統は、熟した葉におけるＰＰＤＫ発現量の昇順で配置されている。種子の質量はＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物の方が高い。遺伝子型間の差は分散分析を用いて試験した（Ｆ＝４．８７０、ｄｆ＝４、ｐ＝０．００６）。ゼロコピー植物との有意差が認められる系統は、Ｇ８（ｐ＝０．００５）およびＣ１０（ｐ＝０．００２）であった。
【０１６１】
種子の窒素含有量の割合は、全ての４種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ系統の方が高かったが、有意差は認められなかった。しかし、種子あたりの窒素の質量は、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ植物の方が有意に高かった。
【０１６２】
図１５を参照すると、種子の窒素含有量がＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ−Ｋ３２６タバコで増加することが明らかに示されている。Ｋ３２６ゼロコピーおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物の個々の種子中の窒素の質量は、種子の質量および窒素含有量のデータから計算した。データは、ゼロコピー植物では１０個の生物学的複製、各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫでは４個の生物学的複製の平均として示されている。エラーバーは標準誤差である。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統は、熟した葉におけるＰＰＤＫ発現量の昇順で配置されている。個々の種子中の窒素の質量は、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物の方が高い。遺伝子型間の差は分散分析を用いて試験した（Ｆ＝７．８０７、ｄｆ＝４、ｐ＝０．００１）。ゼロコピー植物との有意差が認められる系統は、Ｇ８（ｐ＝０．０００）およびＣ１０（ｐ＝０．０００）であった。
【０１６３】
これは、種子への窒素の供給がＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ−Ｋ３２６タバコ植物で増加したことを示唆している。Ｋ３２６植物では、ＰＰＤＫに対する用量反応が観察された。熟した葉のＰＰＤＫ発現量がより高い植物は、種子の個々の種子の質量がより大きく、莢あたりの種子の質量がより高く、かつ個々の種子中の窒素の質量が増加していた。ＰＰＤＫ含有量の増加が種子への窒素の供給の増加と関係があるように思われるため、この結果は窒素の転流におけるＰＰＤＫの役割を強く支持するものである。
【０１６４】
要約すると、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ−Ｋ３２６タバコでは、個々の種子の質量（図１４）および種子あたりの窒素の質量（図１５）はどちらも増加し、この結果は、ＰＰＤＫの過剰発現によって窒素の転流が増加したことを示唆していた。従って、シロイヌナズナＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物に関しては、老化している葉の輸送アミノ酸含有量の増加が期待される。ただし、シロイヌナズナでは、自然に老化した葉についてアミノ酸含有量を測定したが、タバコでは、葉の分離および暗所での培養によって老化を誘発した。暗所で誘発された老化と年齢に関連する老化とでは生じるプロセスが異なるため、このタバコの葉で生じているプロセスは、シロイヌナズナの葉におけるプロセスに類似している可能性は低かった。
【０１６５】
実施例８−ＰＣＫおよびＰＰＤＫを過剰発現しているシロイヌナズナ植物の世代
実施例１および２に記載されているように、ＰＣＫのコード領域およびゲノムクローンを、シロイヌナズナに形質転換されたＢＮＰ１３８００００００１バイナリーベクター中の老化関連遺伝子１２（ＳＡＧ１２）プロモーターに融合させることによって、老化中にシロイヌナズナＰＣＫ（Ａｔ４ｇ３７８７０．１）の過剰な発現が達成された。
【０１６６】
最初にＡｔＰＣＫコード配列をシロイヌナズナｃＤＮＡから単離し、ＰＰＤＫに関して実施例１に記載されているように、ＰＣＲを用いてゲノム配列をシロイヌナズナｇＤＮＡから単離した。ただし、ＰＣＲプライマーは、シロイヌナズナＡｔＰＣＫ遺伝子の開始および終止コドンを含むように設計されており、図３ａに示すその後のＢＮＰ１３８００００００１ベクターへの遺伝子の連結反応を容易にするために、表１に示すように、順方向プライマー（ＡｔＰＣＫ−ＸｂａＩ−ＦＯＲ）（配列番号２５）内にＸｂａＩ制限部位、そして逆方向プライマー（ＡｔＰＣＫ−ＳａｃＩ−ＲＥＶ）（配列番号２６）内にＳａｃＩ制限部位も含む。
【０１６７】
実施例１に従って、各ＰＣＲ反応に使用されるｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ鋳型を調製した。ＰＣＲ反応混合物は、１×ＨＦ緩衝液（ＮＥＢ社）、２ｍＭの塩化マグネシウム（ＮＥＢ社）、０．５ｍＭのｄＮＴＰ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）、１００ｎｇの鋳型（ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ）、０．５μＭの各プライマーおよび１単位のPhusion High-FidelityＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社）を含んでいた。熱循環は、９８℃で３０秒間の最初の変性工程、次いで、９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間の３５サイクル、および７２℃でコード領域に対して２分３０秒間、ゲノムクローンに対して４分３０秒間の伸長時間によって、Ｔｅｃｈｎｅサーマルサイクラーを用いて行った。最後の工程では、７２℃で１０分間の最終的な伸長を行った。
【０１６８】
これらのＰＣＲ産物によって、コード配列（ｃＤＮＡ）に対する２ｋｂのバンドおよびＰＣＫのゲノム配列に対する３．５ｋｂのバンドが得られ、これらをＰＥＧ沈殿させた。実施例１に記載されているＰＰＤＫ同様に、増幅したＤＮＡを、推奨されている手順に従って、pCR4 Blunt-TOPOベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に連結させた（平滑末端）。次いで、このプラスミドを、Library Efficiency DH5α大腸菌細胞に形質転換した。カナマイシン（５０μｇｍｌ−１）を選択的な抗生物質として使用した。陽性のコロニーを、コード領域およびゲノムクローンのためのプライマーＡｔＰＣＫ−ＸｂａＩ−ＦＯＲ（配列番号２５）およびＡｔＰＣＫ−ＳａｃＩ−ＲＥＶ（配列番号２６）を用いるコロニーＰＣＲによって選択した。陽性のコロニーを、５０μｇｍｌ−１カナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ培地において、３７℃の振盪培養器内で一晩増殖させた。
【０１６９】
プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて単離し、挿入断片の大きさを連続的な酵素制限消化によって分析した。これは、１０単位のＸｂａＩおよび１×ＸｂａＩ緩衝液によって１μｇのＤＮＡを３７℃で２時間消化し、次いで１０単位ＳａｃＩおよび１×ＳａｃＩ緩衝液を３７℃で一晩添加することによって行った。正しい挿入断片を含むプラスミドＤＮＡは、ＡｔＰＣＫ−ＸｂａＩ−ＦＯＲ／ＡｔＰＣＫ−ＳａｃＩ−ＲＥＶを用いて配列決定した。配列はＢｉｏＥｄｉｔを用いて分析し、増幅したＡｔＰＣＫコード配列およびゲノム配列はＢＬＡＳＴＸを用いて確認した。
【０１７０】
ＡｔＰＣＫコード領域およびゲノムクローンを図３ａに示すｐＢＮＰベクターに連結させるために、２種類のプラスミドをそれぞれ表す大腸菌コロニーを使用して、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンを含む２５ｍｌのＬＢ培地に植菌した。培養物は３７℃で一晩振盪させ続け、プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒプラスミドミディキット(QIAfilter plasmid midi kit)（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。ｐＢＮＰベクターは、同一の様式だが、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンを含む１００ｍｌの培養物から精製した。上述したものと同じ連続的な酵素消化を、全ての精製したプラスミドＤＮＡに対して行った。コード領域およびゲノムクローンを含むプラスミドのために３μｇのＤＮＡを消化し、ｐＢＮＰベクターのために１μｇのＤＮＡを消化した。試料はクリスタルバイオレットゲル電気泳動によって分離し、その産物はＱｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。１４．４ｋｂのｐＢＮＰベクター産物をアルカリホスファターゼで処理して自己連結反応を防止し、コード領域およびゲノムクローン挿入断片は、ＸｂａＩ／ＳａｃＩ消化を用いてｐＢＮＰベクターに連結させた。Library efficiency DH5α大腸菌細胞は２μｌの連結反応物で形質転換し、陽性のコロニーを、ＡｔＰＣＫ−ＸｂａＩ−ＦＯＲおよびＡｔＰＣＫ−ＳａｃＩ−ＲＥＶを用いるＰＣＲによってスクリーニングした。
【０１７１】
プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、所望の挿入断片を含むコロニーから抽出し、続いて、ＤＮＡを１０単位のＸｂａＩ、１５単位のＳａｃＩおよび１×ＸｂａＩ緩衝液によって３７℃で２時間消化した。期待される正しい制限酵素消化パターンを示したｐＢＮＰベクター中のコード配列およびにゲノム配列挿入断片それぞれの２つの別々のコロニーをＢＮＰ−ＳＡＧ１２ＦＷＤプライマー（配列番号９）を用いて選択および配列決定した。この配列はＢｉｏＥｄｉｔプログラムを用いて分析した。図３ｂに示すように、作製した構築物はｐＡＬＢＮＰ１（コード配列）およびｐＡＬＢＮＰ２（ゲノム配列）と命名した。
【０１７２】
５種類のホモ接合性単一挿入断片系統を作製し、ＰＣＫ特異的抗体を用いて、実施例３に記載されているような免疫ブロットによってＰＣＫの過剰発現を確認した。ポリクローナル抗血清は、ＰＣＫアミノ酸配列に対して設計された合成ペプチドを用いてウサギで産生した。この配列は、（ｉ）ＤＥＨＣＷＴＥＴＧＶＳＮＩＥＧ（配列番号２７）および（ｉｉ）ＣＶＤＬＳＲＥＫＥＰＤＩＷＮＡ（配列番号２８）であり、それらは、化学的に合成した後、ウサギに混注される前に、キーホールリンペットヘモシアニンに連結したものであった。抗体を用いて得られた結果を図１６に示す。図１６は、形質転換した植物中のＰＣＫタンパク質濃度が上昇したことを示している。
【０１７３】
ＳＡＧ１２−ＰＣＫ−ＰＰＤＫ細胞株は、単一のＳＡＧ１２−ＰＣＫ形質転換体（３）１および（１９）４を、強いＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ過剰発現系統と交差させることによって作製した。図１７に示すように、ＰＣＫおよびＰＰＤＫの両方の濃度が上昇した植物の分析によって、ロゼットの質量が増加していることが分かった。
【０１７４】
最後に、本発明者らは仮定に縛られることを望んでいないが、図１８は、ＰＣＫおよびＰＰＤＫがどのように窒素転流に影響を与え得るかについて示す推測上の生化学的経路を示す。
【０１７５】
ＰＣＫ／ＰＰＤＫ二重構築物
本発明者らは、図３に示すＰＣＫおよびＰＰＤＫ単一構築物が、植物に形質転換されると、これらの酵素が老化した葉で過剰発現した場合に、老化した葉からの窒素の転流率の上昇、さらに栄養植物成長量の増加（作物収穫率の上昇に該当する）を引き起こすことを観察した。従って、本発明者らは、ＰＣＫおよびＰＰＤＫをコードする遺伝子がどちらもＳＡＧ１２プロモーターの制御下でｐＢＮＰ１３００００００１に挿入されている２種類の二重構築物を作製することに決めた。
【０１７６】
第１の二重構築物は、ＸｂａＩ/ＳａｃＩ消化を用いて、ＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡのＰＰＤＫをコードするｇＤＮＡ断片の下流（すなわち３'末端）にｇＤＮＡをコードするＰＣＫを連結させることによって作製した。従って、プラスミド内のＳＡＧ１２プロモーターは、ＰＰＤＫ遺伝子およびＰＣＫ遺伝子の両方の発現に関与した。
【０１７７】
第２の二重構築物は、ＡｖｒＩＩ／ＢａｍＨＩ消化を用いて、ｐＡＬＢＮＰ２のＰＣＫをコードするｇＤＮＡ断片のすぐ下流にＰＰＤＫをコードするｇＤＮＡを連結させることによって作製した。この場合も、ＳＡＧ１２はＰＰＤＫ遺伝子およびＰＣＫ遺伝子の両方の発現に関与した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換植物の生産に使用される遺伝子構築物に関する。本構築物は、葉の老化中に窒素の転流(remobilisation)を引き起こす能力を持っていて、窒素を葉から植物の他の領域まで輸送することができる。本発明は、そのような構築物で形質転換された植物細胞、および形質転換植物そのものに及ぶ。本発明は、形質転換植物の生産方法、および老化した植物中の窒素転流率を上昇させる方法にも関する。また、本発明は、遺伝子構築物で形質転換されている収穫された植物の葉（例えば、タバコの葉）、およびそのような収穫された植物の葉を含む喫煙物品にも関する。
【背景技術】
【０００２】
葉の老化は、葉の細胞が細胞死の前に異なる代謝および構造の変化を受ける植物の発育の一段階である。生理学的および遺伝学的研究では、老化は高度に調節されたプロセスであることが示されている。葉の老化の進行は、葉緑体の分解によって生じるクロロフィルの喪失およびその後の黄変を見かけ上の特徴とする。このような発育段階の特徴である葉のクロロフィル濃度の低下は、例えば、溶媒抽出および分光光度測定によって、あるいは、クロロフィル成分計によって測定することができる。好ましくは一定の条件で育てられた同じ植物について記録された初期の葉のクロロフィル濃度と比較した葉のクロロフィル濃度の低下は、老化を示す。
【０００３】
分子的研究では、老化は遺伝子発現における変化と関連していることが示されている。光合成に関与するタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは老化中に減少するが、老化に関与していると思われているタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルは増加する。老化は、老化関連遺伝子（ＳＡＧ）として知られている遺伝子によって調節される高度に組織化されたプロセスである。葉の老化は、タンパク質、核酸および膜の劣化、ならびに、この劣化によってその後に生じる発育中の種子、葉または貯蔵器官などの植物の他の領域への栄養分の輸送を伴う。植物の老化の問題の１つは、老化した葉に存在する多くの有用なミネラルおよび栄養分が葉の中に残留し、葉が枯れるにつれて実質的に失われることである。例えば、老化した葉に存在する窒素（アミノ酸のアミン基の形態であってもよい）は、枯れている葉から取り出さなければ無駄になる。
【０００４】
従って、特に植物が老化した場合に植物中の窒素の転流を増加させることは、作物生産において重要な有用性を有する可能性がある。最初に、葉から転流される窒素は、より若い葉ならびに発育中の種子に輸送することができる。従って、老化した葉からの窒素の退出効率を上げることによって、種子および植物のより若い部分への窒素の供給を増加させ、それにより、作物収穫率および窒素使用効率を上げることができるかもしれない。これは、世界人口が増加している際には明らかに有益な目的であるが、作物収穫率は需要を満たす程十分に上昇していない。１つの標的となり得る作物は、栄養組織からの窒素の転流が乏しいために低い窒素効率を有するセイヨウアブラナ（学名：Brassica napus）（菜種）である。穀物タンパク質含有量を増加させるという潜在的な利点が大きいという理由から、別の標的作物は小麦である。穀物タンパク質含有量は、小麦の栄養価に影響を与えるだけでなく、穀物の使用および、従って市場価格も決定する。例えば、穀物タンパク質含有量の増加によりパンの体積が増加する。また、タバコの葉の中の残余窒素はニトロソアミンの生成に寄与することが知られているため、窒素の転流を増加させる能力は、タバコ産業において非常に有用になり得る。
【０００５】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫまたはＰＣＫ）［ＥＣ４．１．１．４９］およびピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）［ＥＣ２．７．９．１］という酵素が知られている。ＰＰＤＫは原核生物および真核生物の両方に存在し、細菌とより高度な植物との間で配列および三次構造が保存されている(Pocalyko et al., 1990, Biochemistry, 29, 10757-10765)。この酵素は、ピルビン酸＋Ｐｉ＋ＡＴＰ＝ＰＥＰ＋ＰＰｉ＋ＡＭＰの反応において、ピルビン酸の可逆的リン酸化を触媒してホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を生成する(Carroll et al., 1990, Federation of European Biochemical Societies, 274, 178-180; Hatch & Slack, 1968, Biochemical Journal, 106, 141-146)。Ｃ３およびＣ４植物の両方において、ＰＰＤＫ遺伝子は、同じ遺伝子から産生される２種類の転写産物を有する変わった構造を有する。長い方の転写産物は葉緑体のタンパク質をコードし、第一エクソンが葉縁体輸送ペプチドをコードするが、短い方の転写産物は、長い方の転写産物の第一イントロン内で別のプロモーターから転写されるため、葉縁体輸送ペプチドをコードする第一エクソンが存在しない。この短い方の転写産物は、ＰＰＤＫの細胞質基質のイソ型を生成する。この遺伝子構造は、トウモロコシ、イネ、Ｃ３およびＣ４フラベリア属およびシロイヌナズナ（学名：Arabidopsis thaliana）で報告されている。
【０００６】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）は、オキサロ酢酸＋ＡＴＰ＝ＰＥＰ＋ＡＤＰ＋ＣＯ２の反応において、ＡＤＰ、二酸化炭素およびホスホエノールピルビン酸の可逆的反応を触媒して、ＡＴＰおよびオキサロ酢酸を生成する。ＰＣＫは広範囲な植物組織の細胞の細胞質基質に存在することが知られている。これらの植物組織としては、発育中の種子、毛状突起および根が挙げられる。植物中のＰＣＫは窒素化合物の代謝が増加した組織内に出現する。
【０００７】
本発明者らは、ＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫ酵素をコードする遺伝子がプロモーターの制御下で単独あるいは一緒に配置されている複数の遺伝子構築物を作製し、存在すれば、これらの遺伝子の過剰発現が老化した葉の中の窒素の転流にどのような効果を与えたかについて調べた。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の第１の局面によれば、少なくとも１つのコード配列に作動可能に連結された老化特異的プロモーターを含み、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）活性および／またはピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）活性を有する少なくとも１種のポリペプチドをコードする遺伝子構築物が提供される。
【０００９】
本発明の第２の局面によれば、少なくとも１つのコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）活性およびピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）活性を有する少なくとも１種のポリペプチドをコードする遺伝子構築物が提供される。
【００１０】
本発明者らは、ＰＣＫおよびＰＰＤＫの２種類の酵素が、老化中の葉からの窒素の転流の間に、様々なアミノ酸の相互転換に関与している可能性があると考えた。本発明者らは仮定に縛られることを望んでないが、ＰＣＫおよびＰＰＤＫがどのように窒素の転流に影響を与え得るかについて示す推測上の生化学的経路が図１８に示されている。従って、本発明者らは、老化中に独立してあるいは同時に植物中のこれらの２種類の酵素の過剰発現を刺激することが窒素の転流に関わっている可能性があると考えた。
【００１１】
研究の結果として、本発明者らは、驚くべきことにＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫをコードする本発明に係る構築物によって、老化した葉からの窒素転流率を上昇させることを見い出した。本発明者らは、窒素はアミノ酸の形態で老化した葉から植物の種子などの植物のより若い部分に移動するのではないかと仮定する。さらに、本発明者らは、これらの酵素が老化した葉の中で過剰発現した際に、栄養植物の成長量の増加（作物収穫率の上昇に該当する）も観察した。従って、本発明者らは、本発明に係る構築物が形質転換植物の生産に有用であり、それにより、老化した葉からの窒素転流率および／または成長率の上昇を示すことができるのではないかと考える。
【００１２】
第１または第２の局面の遺伝子構築物中のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを誘発してＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫ活性を有する少なくとも１種のポリペプチドをコードする少なくとも１つのコード領域に結合しかつその転写を開始することができるものであってもよい。
【００１３】
第２の局面の構築物中に存在するプロモーターは、構成性、非構成性または組織特異的であってもよい。好適なプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（完全もしくは切断型）、ルビスコプロモーター、エンドウマメプラストシアニンプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、クロロフィルｒ／ｂ結合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α，β−グリアジンプロモーター、ホルデインプロモーターまたはパタチンプロモーターが挙げられる。
【００１４】
第２の局面の構築物に存在するプロモーターは、老化特異的プロモーターであってもよい。
【００１５】
「老化特異的プロモーター（ＳＡＧ）」は、老化関連遺伝子の発現の制御に関連するプロモーターとすることができる。従って、このプロモーターは、実質的に老化している組織の中でのみ、プロモーターが作動可能に連結されたコード配列（すなわち、遺伝子）の発現を制限することができる。従って、老化特異的プロモーターは、実質的に植物組織が老化している場合にのみ３’タンパク質コード領域の発現が生じるように発生学的に調節される方法で、植物組織中で遺伝子発現を優先的に促進することができるプロモーターとすることができる。当然のことながら、老化は古い葉などの植物の古い部分で生じ、種子などの植物の若い部分では生じない傾向がある。
【００１６】
多数の老化関連遺伝子を発現することで知られている植物の一例は、シロイヌナズナである。従って、第１または第２の局面に係る構築物中のプロモーターは、シロイヌナズナの老化関連遺伝子から単離したものであってもよい。Ｇｅｐｓｔｅｉｎら(The Plant Journal, 2003, 36, 629-642)は、モデルとしてシロイヌナズナを用いて、ＳＡＧおよびそのプロモーターについて詳しい研究を行なった。当該遺伝子構築物は、本明細書に開示されている任意のＳＡＧ由来のプロモーターを含んでいてもよい。例えば、好適なプロモーターは、ＳＡＧ１２、ＳＡＧ１３、ＳＡＧ１０１、ＳＡＧ２１およびＳＡＧ１８からなる群またはその機能的な変異体もしくは機能的な断片から選択されてもよい。
【００１７】
好ましいプロモーターは、ＳＡＧ１２およびＳＡＧ１３プロモーターである。一実施形態では、当該プロモーターは、当業者に知られているＳＡＧ１２プロモーターまたはその機能的な変異体もしくは断片である(Gan & Amasino, 1997, Plant Physiology, 113: 313-319)。ＳＡＧ１２プロモーターをコードするＤＮＡ配列は、本明細書では以下のとおり配列番号１６と称する：
配列番号１６
TCGAGACCCGATTGTTATTTTTAGACTGAGACAAAAAAGTAGAATCGTTGATTGTTAAAATTTAAAATTAGTTTCATTACGTTTCGATAAAAAAATGATTAGTTTATCATAGCTTAATTATAGCATTGATTTCTAAATTTGTTTTTTGACCACCCTTTTTTCTCTCTTTGGTGTTTTCTTAACATTAGAAGAACCCATAACAATGTACGTTCAAATTAATTAAAAACAATATTTCCAAGTTTTATATACGAAACTTGTTTTTTTTAATGAAAACAGTTGAATAGTTGATTATGAATTAGTTAGATCAATACTCAATATATGATCAATGATGTATATATATGAACTCAGTTGTTATACAAGAAATGAAAATGCTATTTAAATACAGATCATGAAGTGTTAAAAAGTGTCAGAATATGACATGAAGCGTTTTGTCCTACCGGGTATTCGAGTTATAGGTTTGGATCTCTCAAGAATATTTTGGGCCATACTAGTTATATTTGGGCTTAAGCGTTTTGCAAAGAGACGAGGAAGAAAGATTGGGTCAAGTTAACAAAACAGAGACACTCGTATTAGTTGGTACTTTGGTAGCAAGTCGATTTATTTGCCAGTAAAAACTTGGTACACAACTGACAACTCGTATCGTTATTAGTTTGTACTTGGTACCTTTGGTTCAAGAAAAAGTTGATATAGTTAAATCAGTTGTGTTCATGAGGTGATTGTGATTTAATTTGTTGACTAGGGCGATTCCTTCACATCACAATAACAAAGTTTTATAGATTTTTTTTTTATAACATTTTTGCCACGCTTCGTAAAGTTTGGTATTTACACCGCATTTTTCCCTGTACAAGAATTCATATATTATTTATTTATATACTCCAGTTGACAATTATAAGTTTATAACGTTTTTACAATTATTTAAATACCATGTGAAGATCCAAGAATATGTCTTACTTCTTCTTTGTGTAAGAAAACTAACTATATCACTATAATAAAATAATTCTAATCATTATATTTGTAAATATGCAGTTATTTGTCAATTTTGAATTTAGTATTTTAGACGTTATCACTTCAGCCAAATATGATTTGGATTTAAGTCCAAAATGCAATTTCGTACGTATCCCTCTTGTCGTCTAATGATTATTTCAATATTTCTTATATTATCCCTAACTACAGAGCTACATTTATATTGTATTCTAATGACAGGGAAACCTTCATAGAGATTCAGATAGATGAAATTGGTGGGAAACATCATTGAACAGGAAACTTTTAGCAAATCATATCGATTTATCTACAAAAGAATACGTAGCGTAATGAAGTCCACTTGTTGTGAATGACTATGATTTGATCAAATTAGTTAATTTTGTCGAATCATTTTTCTTTTTGATTTGATTAAGCTTTTAACTTGCACGAATGGTTCTCTTGTGAATAAACAGAATCTTTGAATTCAAACTATTTGATTAGTGAAAAGACAAAAGAAGATTCCTTGTTTTTATGTGATTAGTGATTTTGATGCATGAAAGGTACCTACGTACTACAAGAAAAATAAACATGTACGTAACTACGTATCAGCATGTAAAAGTATTTTTTTCCAAATAATTTATACTCATGATAGATTTTTTTTTTTTGAAATGTCAATTAAAAATGCTTTCTTAAATATTAATTTTAATTAATTAAATAAGGAAATATATTTATGCAAAACATCATCAACACATATCCAACTTCGAAAATCTCTATAGTACACAAGTAGAGAAATTAAATTTTACTAGATACAAACTTCCTAATCATCAAATATAAATGTTTACAAAACTAATTAAACCCACCACTAAAATTAACTAAAAATCCGAGCAAAGTGAGTGAACAAGACTTGATTTCAGGTTGATGTAGGACTAAAATGACTACGTATCAAACATCAACGATCATTTAGTTATGTATGAATGAATGTAGTCATTACTTGTAAAACAAAAATGCTTTGATTTGGATCAATCACTTCATGTGAACATTAGCAATTACATCAACCTTATTTTCACTATAAAACCCCATCTCAGTACCCTTCTGAAGTAATCAAATTAAGAGCAAAAGTCATTTAACTTAGG
【００１８】
従って、本発明の構築物中のプロモーターは、実質的に配列番号１６に示すヌクレオチド配列またはその機能的な変異体もしくは機能的な断片を含んでいてもよい。ＳＡＧ１２プロモーター配列は、米国特許第５，６８９，０４２号に記載されているようなシロイヌナズナから得られたものであってもよい。このプロモーター配列は、図３に示すように本発明に係る遺伝子構築物のそれぞれにおいて見られる。プロモーターがＳＡＧ１２である実施形態では、当然のことながら、当該プロモーターは、配列番号１６の１〜２０９３の各塩基を含んでいてもよい。ただし、プロモーターの機能的な変異体もしくは機能的な断片が本発明の遺伝子構築物に使用されていてもよい。
【００１９】
「プロモーターの機能的な変異体もしくは機能的な断片」は、そこに作動可能に連結された任意のコード領域の発現を開始させるのに機能的に十分であるプロモーターの誘導体または部分とすることができる。例えば、プロモーターがＳＡＧ１２に基づいている実施形態では、当業者であれば、配列番号１６が修飾されていても、ＳＡＧ１２プロモーターの部分のみが必要とされてもよく、それによって、本構築物における遺伝子発現がなお開始されることを理解しているであろう。
【００２０】
プロモーターの機能的な変異体および機能的な断片は、転写酵素が推定プロモーター領域に結合し、次いで、コード領域の転写を引き起こしてＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫ活性を有するポリペプチドが発現するか否かを評価することによって容易に同定することができる。あるいは、そのような機能的な変異体および断片は、コード領域に結合されている場合には、プロモーター上で突然変異生成を行ない、遺伝子発現が生じ得るか否かを評価することによって調べてもよい。
【００２１】
第１の局面の遺伝子構築物は、老化中にＰＣＫ活性および／またはＰＰＤＫ活性を示す少なくとも１種のポリペプチドの発現を生じさせることができる。従って、遺伝子構築物は、（ｉ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片および／または（ｉｉ）ピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片をコードする少なくとも１つのコード配列を含んでいてもよい。実施例に記載されているように、本発明者らは、ＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫ活性を有するポリペプチドに基づいた様々な遺伝子構築物を開発し、これらを図３に示す。
【００２２】
第１の局面に係る遺伝子構築物の第１の実施形態では、プロモーターは、ＰＣＫ活性を示すポリペプチドをコードするコード配列の発現を誘発してもよい。これは、本明細書では「ＰＣＫ構築物」と称し、図３に示す。従って、第１の実施形態では、遺伝子構築物は、老化特異的プロモーター、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）をコードするコード配列あるいはその機能的な変異体もしくは断片を含んでいてもよい。本遺伝子構築物は、ＰＰＤＫ活性を有するポリペプチドをコードしないものであってもよい。
【００２３】
第１の局面に係る構築物の第２の実施形態では、プロモーターは、ＰＰＤＫ活性を示すポリペプチドをコードするコード配列の発現を誘発してもよい。これは、本明細書では「ＰＰＤＫ構築物」と称し、図３に示す。第２の実施形態では、本遺伝子構築物は、老化特異的プロモーター、およびピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）をコードするコード配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含んでいてもよい。遺伝子構築物は、ＰＣＫ活性を有するポリペプチドをコードしないものであってもよい。
【００２４】
第１の局面に係る構築物の第３の実施形態では、プロモーターは、ＰＣＫ活性およびＰＰＤＫ活性を示すポリペプチドをコードする単一のコード配列の発現を誘発してもよい。これを「ＰＣＫ／ＰＰＤＫ構築物１」と称す。第３の実施形態では、遺伝子構築物は、老化特異的プロモーターならびに（ｉ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片および（ｉｉ）ピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片をコードするコード配列を含んでいてもよい。第３の実施形態の構築物は、二重活性（すなわち、ＰＣＫおよびＰＰＤＫの両方の酵素活性）を示す単一の転写産物をコードしてもよい。ＰＣＫコード領域は、ＰＰＤＫコード領域の３'末端に配置されていてもよい。ただし、好ましくは、ＰＣＫコード領域は、ＰＰＤＫコード領域の５'末端に配置されている。
【００２５】
第１の局面に係る構築物の第４の実施形態では、プロモーターは、（ｉ）ＰＣＫ活性を示す第１のポリペプチドをコードする第１のコード配列および（ｉｉ）ＰＰＤＫ活性を示す第２のポリペプチドをコードする第２のコード配列の発現を誘発してもよい。これをＰＣＫ／ＰＰＤＫ構築物２と称す。よって、第４の実施形態では、本遺伝子構築物は、少なくとも１つの老化特異的プロモーターならびに（ｉ）ＰＣＫをコードする第１のコード配列またはその機能的な変異体もしくは断片および（ｉｉ）ＰＰＤＫをコードする第２のコード配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含んでいてもよい（すなわち、各酵素に対して１種類の２種類の転写産物がコードされる）。
【００２６】
実施例６に記載されているように、本発明者らは、（例えば、「ＰＣＫ構築物」または「ＰＰＤＫ構築物」のいずれか一方による形質転換によって）宿主細胞中のＰＣＫまたはＰＰＤＫのいずれか一方を過剰発現させることで、老化した葉の中の窒素の転流が増加することを見い出した。さらに、本発明者らは、ＰＣＫおよびＰＰＤＫの単一の構築物によって栄養成長が増加することを見い出した。
【００２７】
実施例８に記載されているように、本発明者らは、（例えば、「ＰＣＫ構築物」または「ＰＰＤＫ構築物」の両方による形質転換によって）宿主細胞中のＰＣＫまたはＰＰＤＫを同時に過剰発現させることは、老化した葉の中の窒素の転流を誘発する際に驚くほど有効であることを見い出した。従って、窒素は、例えば輸送アミノ酸として老化した葉から輸送されてもよい。好適な輸送アミノ酸はグルタミンおよび／またはアスパラギンであってもよい。さらに、老化中にＰＣＫおよびＰＰＤＫを同時に過剰発現させることによって成長率を上げ、それにより、栄養成長を増加させてもよい。従って、第１の局面の構築物は、ＰＣＫおよびＰＰＤＫまたはそれらの機能的な変異体もしくは断片をコードするコード配列を含んでいてもよい。
【００２８】
第２の局面の構築物がＰＣＫおよびＰＰＤＫをコードするコード配列またはそれらの機能的な変異体もしくは断片を含むことはいうまでもない。この２種類の酵素は二重活性を有する単一のポリペプチドとして、あるいは一方がＰＣＫ活性を有し、他方がＰＰＤＫ活性を有する２種類のポリペプチドとしてコードされてもよい。
【００２９】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片およびピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片はそれぞれ、植物などの任意の好適な供給源に由来するものであってもよい。各酵素のコード配列は、好適な植物源、例えばシロイヌナズナに由来するものであってもよい。従って、ＰＣＫ活性を有するポリペプチドをコードするコード配列は、シロイヌナズナに由来するものであってもよい。さらに、ＰＰＤＫ活性を有するポリペプチドをコードするコード配列は、シロイヌナズナ属、トウモロコシ属、フラベリア属またはクレオメ属に由来するものであってもよい。ＰＰＤＫ活性を有するポリペプチドをコードするコード配列は、シロイヌナズナ、トウモロコシ、フラベリア・トリネルビア(Flaveria trinervia)、フラベリア・ビデンティス(Flaveria bidentis)、フラベリア・ブロウニー(Flaveria brownie)またはフウチョウソウに由来するものであってもよい。
【００３０】
シロイヌナズナにはＰＣＫをコードする３種類の遺伝子が存在すると考えられている。シロイヌナズナのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）の一実施形態をコードするゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）配列（イントロンおよびエクソンを含む）は、本明細書では以下のとおり配列番号１７として示す：
配列番号１７
ATGTCGGCCGGTAACGGAAATGCTACTAACGGTGACGGAGGGTTTAGTTTCCCTAAAGGACCGGTGATGCCGAAGATAACGACCGGAGCAGCAAAGAGAGGTAGCGGAGTCTGCCACGACGATAGTGGTCCGACGGTGAATGCCACAACCATCGATGAGCTTCATTCGTTACAGAAGAAACGTTCTGCTCCTACCACACCGATCAACCAAAACGCCGCCGCTGCTTTTGCCGCCGTCTCCGAGGAGGAGCGTCAGAAGATTCAGCTTCAATCTATCAGGTCCTTATAATAACTTCACATATACAGATTATTCATACGTTACTTTTGTTTATAACATACTTTATATCGAATTAAGGAAGATTATTGCGTTTTCGTGTCCGATCATTTTCATGGAAAAAGTGTCTTTTAGCTAAATATATGGTGTAGTATTAAATATTTCTGACGTGATATACACTAAACTTGAAAATTTTCAATTACTATTTCTTCCTTTAATTCGGCAATATAATTTGTTTTTGTTTATTTTTGGATTAGACATTTATGGACAAGTTAATGCGCTATTGTGACTATTACCAGAAAATAATACTTTAATGTACATGACACGTGTTTAAAACGACACGTGGAAACTAATTTTGATTAATTGTGAAACAGTGCATCGTTAGCATCGTTAACGAGAGAGTCAGGACCAAAGGTGGTGAGAGGAGATCCGGCGGAGAAGAAGACCGATGGTTCAACTACTCCGGCGTACGCTCACGGCCAACATCATTCTATCTTTTCTCCGGCTACTGGTGCTGTCAGTGATAGCTCCTTGAAGTTTACTCACGTCCTCTACAATCTTTCGCCTGCAGGTCAACAAATAAACCTAGAATCCGAATCTGAATATTGATAAATGTTTCTGCAACGAGTTTGATAGATTTGGTTTGTGATTTTGTTGTTTGTAGAGCTTTATGAGCAAGCTATTAAGTATGAGAAAGGTTCGTTTATCACTTCTAATGGAGCTTTGGCGACGCTTTCTGGTGCTAAGACTGGTCGTGCTCCCAGAGATAAGCGTGTTGTTAGAGATGCTACTACTGAGGATGAGCTTTGGTGGGGAAAGTGAGTATTCCTAATCTCGATTTTGATTGATGGAGTTTTTGGGTTTATGCTCTGTTTTCGTTTATTGATTTTGGAGTTTGATTTTGATTTTAGGGGTTCGCCGAATATCGAAATGGATGAACATACTTTCATGGTGAACAGAGAAAGAGCTGTTGATTACTTGAATTCCTTGGAAAAGGTATTAAATTTTGAAAACTTTAATCAATGTTGTTGAGTGTAGAACTTTTGATCTAAGTTTATGAAATTTCTGTTGTTGTTGGGGTTTTTAGGTCTTTGTCAATGACCAATACTTAAACTGGGATCCAGAGAACAGAATCAAAGTCAGGATTGTCTCAGCTAGAGCTTACCATTCATTGTTTATGCACAACATGTAAGTAAAATCATTATTGACTCCTTGTATGTCAATCCATTATTGTGGGTGAAAGAAAACAACAAATTAGTAACTGGGGAGGGTGTCAGGTGTATCCGACCAACTCAGGAGGAGCTTGAGAGCTTTGGTACTCCGGATTTTACTATATACAATGCTGGGCAGTTTCCATGTAATCGTTACACTCATTACATGACTTCGTCCACTAGCGTAGACCTTAATCTGGCTAGGAGGGAAATGGTTATACTTGGTACTCAGTATGCTGGGGAAATGAAGAAGGGTCTTTTCAGTGTGATGCATTACCTTATGCCTAAGCGTCGTATTCTCTCCCTTCATTCTGGATGCAATATGGGAAAAGATGGAGATGTTGCTCTCTTCTTTGGACTTTCAGGTATAGTAGAGACAGTACCAACTATGGTGTTGGGTGATGATGGAAGGAACGATAAATCAAATGATACAATACAATTACTGCTGAACTGACTTGAGAACTGCTTGCCTCTTTGTTGAGTTTAGCGGGTGAATTGAGATTGATGATTGTGTTTTTTGTTTTCTATGAATGATGATTTTAGGTACCGGGAAGACAACGCTGTCTACTGATCACAACAGGTATCTTATTGGAGATGATGAGCATTGTTGGACTGAGACTGGTGTTTCGAACATTGAGGGTGGGTGCTATGCTAAGTGTGTTGATCTTTCGAGGGAGAAGGAGCCTGATATCTGGAACGCTATCAAGTTTGGAACAGGTAGAAAGACAGTACGTTGGAATTGTTTTTGAGAAAAAAACATAAAGCAGTGATATAACAATAAGATTCTGATCTTGTTGCAGTTTTGGAAAATGTTGTGTTTGATGAGCACACCAGAGAAGTGGATTACTCTGATAAATCTGTTACAGGTAAAACAATTGTTATTTCTTTCATTCTCTTCGTCCTCACAATTAACAGAATGATCATTTTCGATTCTCTTTGGTTGCAGAGAACACACGTGCTGCCTACCCAATTGAGTTCATTCCAAATGCGAAAATACCTTGTGTTGGTCCACACCCGACAAATGTGATACTTCTGGCTTGTGATGCCTTTGGTGTTCTCCCACCTGTGAGCAAGCTGAATCTGGCACAAACCATGTACCACTTCATCAGTGGTTACACTGCTCTGGTAAGGCCAAAGTAAAAGTCTTTATTTTGCACATCGTCTTCATAAATTTCAAAAGCATAACCAAAGATGTGCAACATATATAGGTTGCTGGCACAGAGGATGGTATCAAGGAGCCAACAGCAACATTCTCAGCTTGCTTTGGTGCAGCTTTCATAATGTTGCATCCCACAAAGTATGCAGCTATGTTAGCTGAGAAGATGAAGTCACAAGGTGCTACTGGTTGGCTCGTCAACACTGGTTGGTCTGGTGGCAGGTATATATGTCCTTCTATGGAAATCGATACAACAAAACGCTGCCTTGTAACACATGTTTGTAGGCTATTAACATGATCTGTAATGTTTTATTTCCTGCAGTTATGGTGTTGGAAACAGAATCAAGCTGGCATACACTAGAAAGATCATCGATGCAATCCATTCGGGCAGTCTCTTGAAGGCAAACTACAAGAAAACCGAAATCTTTGGATTTGAAATCCCAACTGAGATCGAAGGGATACCTTCAGAGATCTTGGACCCCGTCAACTCCGTAAGTTTCTGCAAATCTGTATAATGTAATTGCTTAAGTGATGATGAACAATTTTTTGTTGATTTGGGTTTAATGAAAATGCAGTGGTCTGATAAGAAGGCACACAAAGATACTCTGGTGAAACTGGGAGGTCTGTTCAAGAAGAACTTCGAGGTTTTTGCTAACCATAAGATTGGTGTGATGGTAAGCTTACGGAGGAGATTCTCGCTGCTGGTCCTATCTTTTAG
【００３１】
シロイヌナズナのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列（エクソンのみ）は、本明細書では以下のとおり配列番号１８として示す：
配列番号１８
ATGTCGGCCGGTAACGGAAATGCTACTAACGGTGACGGAGGGTTTAGTTTCCCTAAAGGACCGGTGATGCCGAAGATAACGACCGGAGCAGCAAAGAGAGGTAGCGGAGTCTGCCACGACGATAGTGGTCCGACGGTGAATGCCACAACCATCGATGAGCTTCATTCGTTACAGAAGAAACGTTCTGCTCCTACCACACCGATCAACCAAAACGCCGCCGCTGCTTTTGCCGCCGTCTCCGAGGAGGAGCGTCAGAAGATTCAGCTTCAATCTATCAGTGCATCGTTAGCATCGTTAACGAGAGAGTCAGGACCAAAGGTGGTGAGAGGAGATCCGGCGGAGAAGAAGACCGATGGTTCAACTACTCCGGCGTACGCTCACGGCCAACATCATTCTATCTTTTCTCCGGCTACTGGTGCTGTCAGTGATAGCTCCTTGAAGTTTACTCACGTCCTCTACAATCTTTCGCCTGCAGAGCTTTATGAGCAAGCTATTAAGTATGAGAAAGGTTCGTTTATCACTTCTAATGGAGCTTTGGCGACGCTTTCTGGTGCTAAGACTGGTCGTGCTCCCAGAGATAAGCGTGTTGTTAGAGATGCTACTACTGAGGATGAGCTTTGGTGGGGAAAGGGTTCGCCGAATATCGAAATGGATGAACATACTTTCATGGTGAACAGAGAAAGAGCTGTTGATTACTTGAATTCCTTGGAAAAGGTCTTTGTCAATGACCAATACTTAAACTGGGATCCAGAGAACAGAATCAAAGTCAGGATTGTCTCAGCTAGAGCTTACCATTCATTGTTTATGCACAACATGTGTATCCGACCAACTCAGGAGGAGCTTGAGAGCTTTGGTACTCCGGATTTTACTATATACAATGCTGGGCAGTTTCCATGTAATCGTTACACTCATTACATGACTTCGTCCACTAGCGTAGACCTTAATCTGGCTAGGAGGGAAATGGTTATACTTGGTACTCAGTATGCTGGGGAAATGAAGAAGGGTCTTTTCAGTGTGATGCATTACCTTATGCCTAAGCGTCGTATTCTCTCCCTTCATTCTGGATGCAATATGGGAAAAGATGGAGATGTTGCTCTCTTCTTTGGACTTTCAGGTACCGGGAAGACAACGCTGTCTACTGATCACAACAGGTATCTTATTGGAGATGATGAGCATTGTTGGACTGAGACTGGTGTTTCGAACATTGAGGGTGGGTGCTATGCTAAGTGTGTTGATCTTTCGAGGGAGAAGGAGCCTGATATCTGGAACGCTATCAAGTTTGGAACAGTTTTGGAAAATGTTGTGTTTGATGAGCACACCAGAGAAGTGGATTACTCTGATAAATCTGTTACAGAGAACACACGTGCTGCCTACCCAATTGAGTTCATTCCAAATGCGAAAATACCTTGTGTTGGTCCACACCCGACAAATGTGATACTTCTGGCTTGTGATGCCTTTGGTGTTCTCCCACCTGTGAGCAAGCTGAATCTGGCACAAACCATGTACCACTTCATCAGTGGTTACACTGCTCTGGTTGCTGGCACAGAGGATGGTATCAAGGAGCCAACAGCAACATTCTCAGCTTGCTTTGGTGCAGCTTTCATAATGTTGCATCCCACAAAGTATGCAGCTATGTTAGCTGAGAAGATGAAGTCACAAGGTGCTACTGGTTGGCTCGTCAACACTGGTTGGTCTGGTGGCAGTTATGGTGTTGGAAACAGAATCAAGCTGGCATACACTAGAAAGATCATCGATGCAATCCATTCGGGCAGTCTCTTGAAGGCAAACTACAAGAAAACCGAAATCTTTGGATTTGAAATCCCAACTGAGATCGAAGGGATACCTTCAGAGATCTTGGACCCCGTCAACTCCTGGTCTGATAAGAAGGCACACAAAGATACTCTGGTGAAACTGGGAGGTCTGTTCAAGAAGAACTTCGAGGTTTTTGCTAACCATAAGATTGGTGTGATGGTAAGCTTA CGGAGGAGATTCTCGCTGCTGGTCCTATCTTTTAG
【００３２】
従って、ＰＣＫ活性を有するポリペプチドをコードするコード配列は、実質的に配列番号１７または配列番号１８に示す核酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含んでいてもよい。
【００３３】
シロイヌナズナのＰＣＫのポリペプチド配列は、本明細書では以下のとおり配列番号１９として示す：
配列番号１９
MSAGNGNATNGDGGFSFPKGPVMPKITTGAAKRGSGVCHDDSGPTVNATTIDELHSLQKKRSAPTTPINQNAAAAFAAVSEEERQKIQLQSISASLASLTRESGPKVVRGDPAEKKTDGSTTPAYAHGQHHSIFSPATGAVSDSSLKFTHVLYNLSPAELYEQAIKYEKGSFITSNGALATLSGAKTGRAPRDKRVVRDATTEDELWWGKGSPNIEMDEHTFMVNRERAVDYLNSLEKVFVNDQYLNWDPENRIKVRIVSARAYHSLFMHNMCIRPTQEELESFGTPDFTIYNAGQFPCNRYTHYMTSSTSVDLNLARREMVILGTQYAGEMKKGLFSVMHYLMPKRRILSLHSGCNMGKDGDVALFFGLSGTGKTTLSTDHNRYLIGDDEHCWTETGVSNIEGGCYAKCVDLSREKEPDIWNAIKFGTVLENVVFDEHTREVDYSDKSVTENTRAAYPIEFIPNAKIPCVGPHPTNVILLACDAFGVLPPVSKLNLAQTMYHFISGYTALVAGTEDGIKEPTATFSACFGAAFIMLHPTKYAAMLAEKMKSQGATGWLVNTGWSGGSYGVGNRIKLAYTRKIIDAIHSGSLLKANYKKTEIFGFEIPTEIEGIPSEILDPVNSWSDKKAHKDTLVKLGGLFKKNFEVFANHKIGVMVSLRRRFSLLVLSF
【００３４】
従って、ＰＣＫ活性を有するポリペプチドは、実質的に配列番号１９に示すアミノ酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含んでいてもよい。
【００３５】
シロイヌナズナはＰＰＤＫの少なくとも２種類の型、すなわち葉緑体型および細胞質基質型を有し、どちらも遺伝子の５'末端に僅かなスプライシングの変形を有する同じ遺伝子によってコードされ、それにより２種類の型が生じると考えられている。シロイヌナズナのピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）の両型をコードするｇＤＮＡ配列（イントロンおよびエクソンを含む）は、本明細書では以下のとおり配列番号２０として示す：
配列番号２０
ATGACAAGTATGATCGTGAAGACAACGCCGGAGCTCTTCAAAGGAAATGGAGTGTTCCGTACGGATCATCTCGGAGAAAACCGAATGGTTAGTCGATCAAACCGGCTAGGTGATGGATCAAACCGTTTCCCTAGAACCGGTACAATCCATTGCCAACGGTTAAGCATAGCAAAGACCGGTTTGCATCGTGAGACGAAGGCTCGAGCCATACTTAGCCCTGTGTCCGATCCGGCCGCTTCCATAGCCCAAAAGGTAAGCCTTTCCATTTCAATCATTCTGGTGTATTTTCACCATAAAATTTTATACACTTTTTTATTACGTTTTGTTTTATGATTCTGACGTGAGATTCTTGAGAGAAACTATCACCGATCATTGGGTCGAACCATCTAGCAGCTCAATTATTATCGGTTATAACCCTACCGGTTATAGAATACAAAACAGGTTACGCCATTGTGACATTTGCTTTGTGATCTTGTGAGACGATTAATTATTTGATGTTGATTGGTTTCGTTACTCTTGTTTAAACAATCGAACGGTTCAAACTAATACACACATGTGATGTGAGATCATTTCGGTAGTAATACCAAATAGCGTCTGGCCTAAATTATGAAAGTACTATTTTGAATTAAATTATTGTGGAAACATGAACTTATTTAAATTCAAGTATTTTCGAAATTTGTAATAAAAAAAAACTTTTCCTCTAGATTCATTAGCCCTACTTTTCGTAGAAACAACTTTAATGTATTCAAAGACCACTTTGCTGCTTAAGTCAGACTCTTGTGCCACTTGGTAGATCCACCAATGCCACGTTTTGTTATTGTGCCAAAGAATACGTGAATATGTCCAAACGGCAATCAAATTCTTGGCGTAAAACACAAAAATTATGATACTAGTTTAAATCCACAATTCACCTTCACCATAAAGAATTCATGTATTAGAGATGGTATGACAAGAACTGGTTGAATTTGATGACATTTGTTTGCTATTGTTTTGGTTAAGTAAAAGTTTTGTTAAAAAGGAAAATAGCATCGGTAGTGGCAGATAGCAAGTGTGTGAGTGAGATCAGATATGGTTGACACATCTATGACGAGTCATCGCAACGAAACTTCTTTAATTTTGGTCAATTATATTACAATTTAGCATTTCGAGGTTGGAATTTTGGAATGATCTCTTGATAAGATAATAATGTATTTTTGATGACGTATCCATCAAAACTATAAATGATTTATATTAAATATGAAATTTCGACTGTATACAAGTTTTTATATTATAAAATTATTCGATGTACATATGATCATAATAACTTTACTATATATATAGATACGTATATGTGTTCTTAAACTTGCACAAACATTTCTGCAATCTAAACCTCAATCAAAACAAACAAACAAAAAACCATGATGCAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAGTCCTTGGTATGTTACCAATACCATCATCATGATCATATCAATTCATTAATAATTTAGTGTTTGCTATTTTCAAGAACCATTTATCAAAAATGTTAATTGTTGTTGTGTATGAAGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAAAAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGACATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCCGCCGTAAGTTAATTATAACTTTTTTTCTTGACTATTTTTATTTTAAGGATTTTTTCTAATGTTAAATTTCTGTTTTTTTTTCTTTCTATGTTTTCTTTAATCTTTTGAAGATTTTTTGACGCAGATTTTGACTTGTTAGATTTCTTTTATTGAAGTTGAGATCCAAATATTTTTTTGGTTATTTTGCCATTTGGCCGTTTTTGGAAGAGTTTAAAATGTACTAGATAGAAAATGAATAAGTTTTGTGGCTATTGAAAGACCTAATGATTTTGGTATTCAAACTATAACGTAGAAAATGAAGATCTTTCGTTTATCTATTTTTAAAACAGAACTACATTGACTTGTCTTTGATCGATATTTTGCATTGTAGATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTCGTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTTGATATGTTTGGTGATGTTGTAAGTCCTCTGTTTTTCAATACTATTTCAGGTAACTTGCATGACAAGAAAATTCTTTGACCTACCTTATAATTGTTTTCTTGATCAATAAAAGGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTAGAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTCAAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCTTCAGGTTTGTTTTGATTCCTACTTGAGGTCAAGTGATAAAAATTAGTTATTAGTTACAAATGTTTAAACGGGGTTAATTGCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGCCCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTTAACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTCACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAGGTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGTAAGCCCATACTCATTAAATATTGGTTTTGGGACAGGGAGAGGATGTGGTTGCAGGGATAAGAACACCAGAAGATTTGGATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATCTTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGTTGATACACATAAACAATACTTCAATTAGTCCTCATCAACAATTCTTTAGTAATTTAAACAAAATCTCAAATGTGTATTGCAGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGATTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGTTGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAACATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGGTACAAACTCAAATATTCATCTTCTTCTTTTTTCATAGTCATAAACTTGATGTTGAAACCAAAATTCGAAACTTACTGGTAATGATTGGTTCACTTGAACAAGAACTAATGGGTTTAAGACGTTTAGGGTTTAGGAGTAAAAGCAGAGATGATTGTCTGACACGTAACCGATGAATAGGGTTTGGAAATTTTGATTCAGAGGTCAATGAAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTGATGGATTAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTTTTGGATTCGATTTTAGAAACTTGTCATATAAGTTAGGGGAAGATTGTTTCTAAAGTTAGGGTTTAAAAATTTTCAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATCAGACGTCTCAAGGTGTTTATGAGTTTCTGTTCCTTTAACTTGTTTGATATTTTTAAACTTTCTAACTCAAATGTTCGATGACCGATAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGGTAACTCCTCCTCTGTACTTGATTTCATGTTTTTGATGATTTAGATTGTTTGTATCCAAATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCAGTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTGCTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTAAATGTTTTGAGTCGTCTCTCTAAAATGTATCACAACTTAAAACATGCCTAAACCTTTTTATTTTTCTAGGTTTACCGGTAACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAACATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATAGAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGTTTCTTACTCTCTTTGTTTCTCTCTGTCTCTTTGCACCTGAAGAACAATCTGATGATCGGTAAACTTGTACGTTATAGGCTCGGAATATCGTATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAGGACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAATTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGTCATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGATGAGGTAAATGTAACAAGACACAAAATGTGTTTTAGGCACTTGAAACCATGTTGCTATTTGCTAAGTAGGAACCTTTTTCTTTTGACAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATGACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGAATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTATAATGACTACCATTTCGTTTGCTCTCTATCCATAGGATAAAATCTTGATAGCCATTTTTTTGTGTTTGGACCAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAGATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAACATGGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCTTGTTCTCCTTTCAGGTAATTGATTAATTTCCAAACCAATAAACACTTTTTTTACAACACTATTGTATAACTCAGATTGATGTAATTTTGGGATTTCTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA
【００３６】
シロイヌナズナのピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）の細胞質基質型をコードするｃＤＮＡ配列は、本明細書では以下のとおり配列番号２１として示す：
配列番号２１
ATGATGCAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAGTCCTTGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAAAAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGACATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCCGCCATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTCGTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTTGATATGTTTGGTGATGTTGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTAGAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTCAAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCTTCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGCCCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTTAACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTCACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAGGTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGGATAAGAACACCAGAAGATTTGGATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATCTTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGATTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGTTGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAACATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATCAGACGTCTCAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGATTGTTTGTATCCAAATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCAGTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTGCTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTTTACCGGTAACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAACATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATAGAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGCTCGGAATATCGTATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAGGACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAATTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGTCATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGATGAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATGACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGAATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAGATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAACATGGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCTTGTTCTCCTTTCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA
【００３７】
シロイヌナズナのピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）の葉緑体型をコードするｃＤＮＡ配列は、本明細書では以下のとおり配列番号２２として示す：
配列番号２２
ATGACAAGTATGATCGTGAAGACAACGCCGGAGCTCTTCAAAGGAAATGGAGTGTTCCGTACGGATCATCTCGGAGAAAACCGAATGGTTAGTCGATCAAACCGGCTAGGTGATGGATCAAACCGTTTCCCTAGAACCGGTACAATCCATTGCCAACGGTTAAGCATAGCAAAGACCGGTTTGCATCGTGAGACGAAGGCTCGAGCCATACTTAGCCCTGTGTCCGATCCGGCCGCTTCCATAGCCCAAAAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAGTCCTTGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAAAAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGACATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCCGCCATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTCGTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTTGATATGTTTGGTGATGTTGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTAGAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTCAAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCTTCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGCCCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTTAACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTCACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAGGTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGGATAAGAACACCAGAAGATTTGGATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATCTTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGATTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGTTGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAACATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATCAGACGTCTCAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGATTGTTTGTATCCAAATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCAGTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTGCTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTTTACCGGTAACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAACATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATAGAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGCTCGGAATATCGTATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAGGACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAATTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGTCATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGATGAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATGACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGAATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAGATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAACATGGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCTTGTTCTCCTTTCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA
【００３８】
従って、ＰＰＤＫ活性を有するポリペプチドをコードするコード配列は、実質的に配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２に示す核酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含んでいてもよい。
【００３９】
シロイヌナズナＰＰＤＫの細胞質基質型のポリペプチド配列は、本明細書では以下のとおり配列番号２３として示す：
配列番号２３
MMQRVFTFGKGRSEGNKGMKSLLGGKGANLAEMASIGLSVPPGLTISTEACQQYQIAGKKLPEGLWEEILEGLSFIERDIGASLADPSKPLLLSVRSGAAISMPGMMDTVLNLGLNDQVVVGLAAKSGERFAYDSFRRFLDMFGDVVMGIPHAKFEEKLERMKERKGVKNDTDLSAADLKELVEQYKSVYLEAKGQEFPSDPKKQLELAIEAVFDSWDSPRANKYRSINQITGLKGTAVNIQCMVFGNMGDTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLVNAQVWHLSQCVNLISTRIRTPEDLDTMKRFMPEAYAELVENCNILERHYKDMMDIEFTVQEERLWMLQCRAGKRTGKGAVKIAVDMVGEGLVEKSSAIKMVEPQHLDQLLHPQFHDPSGYREKVVAKGLPASPGAAVGQVVFTAEEAEAWHSQGKTVILVRTETSPDDVGGMHAAEGILTARGGMTSHAAVVARGWGKCCIAGCSEIRVDENHKVLLIGDLTINEGEWISMNGSTGEVILGKQALAPPALSPDLETFMSWADAIRRLKVMANADTPEDAIAARKNGAQGIGLCRTEHMIVCIQMFNVVFGLVFKFFGADRIKAVRKMIMAVTTEQRKASLDILLPYQRSDFEGIFRAMDGLPVTIRLLDPPLHEFLPEGDLDNIVHELAEETGVKEDEVLSRIEKLSEVNPMLGFRGCRLGISYPELTEMQARAIFEAAASMQDQGVTVIPEIMVPLVGTPQELGHQVDVIRKVAKKVFAEKGHTVSYKVGTMIEIPRAALIADEIAKEAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLPIYLAKGILQHDPFEVLDQQGVGQLIKMATEKGRAARPSLKVGICGEHGGDPSSVGFFAEAGLDYVSCSPFRVPIARLAAAQVVVA
【００４０】
シロイヌナズナのＰＰＤＫの葉緑体型のポリペプチド配列は、本明細書では以下のとおり配列番号２４として示す：
配列番号２４
MTSMIVKTTPELFKGNGVFRTDHLGENRMVSRSNRLGDGSNRFPRTGTIHCQRLSIAKTGLHRETKARAILSPVSDPAASIAQKRVFTFGKGRSEGNKGMKSLLGGKGANLAEMASIGLSVPPGLTISTEACQQYQIAGKKLPEGLWEEILEGLSFIERDIGASLADPSKPLLLSVRSGAAISMPGMMDTVLNLGLNDQVVVGLAAKSGERFAYDSFRRFLDMFGDVVMGIPHAKFEEKLERMKERKGVKNDTDLSAADLKELVEQYKSVYLEAKGQEFPSDPKKQLELAIEAVFDSWDSPRANKYRSINQITGLKGTAVNIQCMVFGNMGDTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLVNAQVWHLSQCVNLISTRIRTPEDLDTMKRFMPEAYAELVENCNILERHYKDMMDIEFTVQEERLWMLQCRAGKRTGKGAVKIAVDMVGEGLVEKSSAIKMVEPQHLDQLLHPQFHDPSGYREKVVAKGLPASPGAAVGQVVFTAEEAEAWHSQGKTVILVRTETSPDDVGGMHAAEGILTARGGMTSHAAVVARGWGKCCIAGCSEIRVDENHKVLLIGDLTINEGEWISMNGSTGEVILGKQALAPPALSPDLETFMSWADAIRRLKVMANADTPEDAIAARKNGAQGIGLCRTEHMIVCIQMFNVVFGLVFKFFGADRIKAVRKMIMAVTTEQRKASLDILLPYQRSDFEGIFRAMDGLPVTIRLLDPPLHEFLPEGDLDNIVHELAEETGVKEDEVLSRIEKLSEVNPMLGFRGCRLGISYPELTEMQARAIFEAAASMQDQGVTVIPEIMVPLVGTPQELGHQVDVIRKVAKKVFAEKGHTVSYKVGTMIEIPRAALIADEIAKEAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLPIYLAKGILQHDPFEVLDQQGVGQLIKMATEKGRAARPSLKVGICGEHGGDPSSVGFFAEAGLDYVSCSPFRVPIARLAAAQVVVA
【００４１】
従って、ＰＰＤＫ活性を有するポリペプチドは、実質的に配列番号２３または配列番号２４に示すアミノ酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含んでいてもよい。最も高いＰＰＤＫ発現量が、ほぼ例外なくＰＰＤＫをコードするｇＤＮＡを内部に含む細胞株のみで認められたため、イントロンがＰＰＤＫの発現にプラスの影響を与えたのではないかと思われる。従って、一実施形態では、本構築物は、ＰＰＤＫおよび／またはＰＣＫのいずれか一方をコードする遺伝子のｃＤＮＡを含んでいてもよい。
【００４２】
本発明の遺伝子構築物は、発現カセットの形態であってもよく、宿主細胞における少なくとも１つのコード配列の発現に適したものであればよい。本発明の遺伝子構築物は、それがベクターに組み込まれることなく宿主細胞に導入されてもよい。例えば、核酸分子であり得る遺伝子構築物は、リポソームまたはウイルス粒子内に組み込まれてもよい。あるいは、精製された核酸分子（例えば、ヒストンを含まないＤＮＡ、すなわち裸のＤＮＡ）が、例えば、直接的なエンドサイトーシス取り込みなどの好適な手段によって宿主細胞に直接挿入されてもよい。本遺伝子構築物は、形質移入、感染、微量注入、細胞融合、原形質融合または衝撃照射(ballistic bombardment)によって宿主対象（例えば、植物）の細胞に直接導入されていてもよい。あるいは、本発明の遺伝子構築物は、パーティクルガン法を用いて宿主細胞に直接導入されていてもよい。あるいは、当該遺伝子構築物は、好適な宿主細胞における発現のために組換え型ベクターの内部に含まれていてもよい。
【００４３】
従って、第３の局面では、第１または第２の局面に係る遺伝子構築物を含む組換え型ベクターが提供される。組換え型ベクターは、プラスミド、コスミドまたはファージであってもよい。そのような組換え型ベクターは、宿主細胞を本発明の遺伝子構築物で形質転換し、かつその中の発現カセットを複製するのに非常に有用である。当業者であれば、本発明の遺伝子構築物は、発現のために多くの種類の骨格ベクターと組み合わせ得ることを理解しているであろう。骨格ベクターは、例えば、１つのベクターが大腸菌およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスの両方で複製することができるバイナリーベクターであってもよい。例えば、好適なベクターは、ｐＢＩＮ１９などのｐＢＩＮプラスミドであってもよい。しかし、好ましい骨格ベクターはＢＮＰ１３８００００００１であり、これは、ｐＢＩＮＰＬＵＳ(F. A. van Engelen et al. Transgenic Research (1995) 4, 288-290)に基づいており、かつＳＡＧ１２プロモーターを内部に含む。
【００４４】
組換え型ベクターは、プロモーター（例えば、老化関連プロモーター）に加えて、様々な他の機能的な成分、および少なくとも１つの（ＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫをコードする）コード配列を含んでいてもよい。例えば、組換え型ベクターは、宿主細胞中の細胞質基質内で自己複製するように設計されていてもよい。この場合、組換え型ベクター内に、ＤＮＡ複製を誘発または調節する成分が必要とされる場合がある。あるいは、組換え型ベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれるように設計されていてもよい。この場合、（例えば相同組換えによる）標的組換えを支持するＤＮＡ配列が想定される。
【００４５】
また、組換え型ベクターは、クローン化プロセスにおける選択可能なマーカーとして、すなわち、形質移入または形質転換されている細胞の選択を可能にするため、および異種のＤＮＡが組み込まれているベクターを内部に含む細胞の選択を可能にするために使用できる遺伝子のＤＮＡコードを含んでいてもよい。当該ベクターは、コード配列の発現の調節に関与するＤＮＡ、または発現されるポリペプチドをある種の宿主細胞、例えば葉緑体に導くためのＤＮＡを含んでいてもよい。従って、第３の局面のベクターは、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、ポリペプチド終結シグナルおよびタンパク質標的配列（例えば、葉緑体輸送ペプチド）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる成分を含んでいてもよい。
【００４６】
好適なマーカー遺伝子の例としては、抗生物質耐性遺伝子、例えば、カナマイシン、ジェネテシン（Ｇ４１８）およびハイグロマイシン（ｎｐｔ−ＩＩ、ｈｙｇ−Ｂ）に対して耐性を示す遺伝子；除草剤耐性遺伝子、例えば、ホスフィノトリシンおよびスルホンアミド系除草剤に対して耐性を示す遺伝子（それぞれｂａｒおよびｓｕＩ：欧州特許出願公開第２４２２４６号、欧州特許出願公開第０２４９６３７号）；およびスクリーニング可能なマーカー、例えば、β−グルクロニダーゼ（英国特許第２１９７６５３号）、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられる。当該マーカー遺伝子は、第２のプロモーター（老化関連プロモーターでなくてもよい）によって制御されてもよく、細胞における発現を可能にし、種子の中に存在していても存在していなくてもよく、それにより、植物の発育の任意の段階でマーカーを含有する細胞または組織の選択を可能にする。好適な第２のプロモーターは、アグロバクテリウムのノパリン合成酵素遺伝子のプロモーターおよび３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）転写産物をコードする遺伝子に由来するプロモーターである。ただし、任意の他の好適な第２のプロモーターを使用してもよい。
【００４７】
本発明の遺伝子構築物の様々な実施形態は図１に示すクローン化手順を用いて作製してもよく、それについて以下のようにまとめることができる。ＰＣＫおよびＰＰＤＫをコードする遺伝子のｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ型は、好適なプライマーを用いるＰＣＲによってｇＤＮＡまたはｃＤＮＡ鋳型から増幅してもよい。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動法を用いて調べてもよい。次いで、ＰＣＲ産物を、クローン化目的のための好適なベクター（例えば、pCR 4Blunt-TOPOベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））に結合してもよい。ＰＣＲ産物を内部に含むベクターを大腸菌などの好適な宿主中で増殖させてもよい。次いで、大腸菌コロニーを、好適なプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングしてもよく、正しい制限酵素消化パターンを示すプラスミド中の挿入断片を好適なプライマーを用いて配列決定してもよい。
【００４８】
ＴＯＰＯｃＤＮＡ（ＰＣＫまたはＰＰＤＫ）またはＴＯＰＯｇＤＮＡ（ＰＣＫまたはＰＰＤＫ）を保有する大腸菌のコロニーは、好適な量の各プラスミドを産生するために培養してもよく、次いでそれを精製してもよい。次いで、プラスミドを消化して、ＰＰＤＫまたはＰＣＫをコードするＤＮＡ断片を遊離させた後、これを、ｐＢＮＰプラスミドなどの好適なプロモーター（例えば、ＳＡＧプロモーター）を内部に含むベクターにクローン化してもよい。得られたＰＰＤＫ構築物をＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡと命名し、得られたＰＣＫ構築物をｐＡＬＢＮＰ１（ｃＤＮＡ）およびｐＡＬＢＮＰ２（ｇＤＮＡ）と命名した。第３の局面に係るベクターの実施形態は、実質的に図３に示すものであってもよい。
【００４９】
第４の局面では、同じ条件で培養された野生型植物中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの対応する濃度よりも試験植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度を上げる方法であって、葉の老化の開始後に植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度の上昇を達成するために試験植物における植物の代謝を変えることを含む方法が提供される。
【００５０】
第５の局面では、同じ条件で培養された野生型植物中の窒素の対応する濃度よりも試験植物の葉の中の窒素濃度を下げる方法であって、葉の老化の開始後に植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度の上昇を達成するために試験植物における植物の代謝を変えることを含む方法が提供される。
【００５１】
第６の局面では、同じ条件で培養された野生型植物の対応する成長率と比較して試験植物の成長率を上げる方法であって、葉の老化の開始後に植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度の上昇を達成するために試験植物における植物の代謝を変えることを含む方法が提供される。
【００５２】
植物の葉の中の窒素濃度および植物の成長率の測定方法は実施例に記載されている。第４、第５または第６の局面の方法は、第１または第２の局面に係る遺伝子構築物あるいは第３の局面に係るベクターで試験植物の細胞を形質転換することを含んでもよい。本遺伝子構築物またはベクターは、任意の好適な手段によって宿主細胞に導入してもよい。
【００５３】
第７の局面では、第１または第２の局面に係る遺伝子構築物あるいは第３の局面に係る組換え型ベクターを含む細胞が提供される。
【００５４】
当該細胞は植物細胞であってもよい。本発明者らが、宿主細胞中にＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫを過剰発現させることが老化した葉の中の窒素の転流を誘発する際に驚くほど有効であることを観察したように、第７の局面の細胞は、ＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫが過剰発現されるように、第１または第２の局面の１種または複数の構築物あるいは第３の局面の１種または複数のベクターを含んでいてもよい。
【００５５】
例えば、宿主細胞は、第１の局面の遺伝子構築物の第１の実施形態（すなわちＰＣＫ構築物）のみで形質転換されていてもよい。あるいは、宿主細胞は、第２の局面の遺伝子構築物の第２の実施形態（すなわちＰＰＤＫ構築物）のみで形質転換されていてもよい。別の実施形態では、宿主細胞は、ＰＣＫおよびＰＰＤＫが宿主細胞において発現されるように、第１の局面の遺伝子構築物の第１および第２の実施形態で形質転換されていてもよい。あるいは、宿主細胞は、ＰＣＫおよびＰＰＤＫが宿主細胞において発現されるように、第１の局面の構築物の第３または第４の実施形態（すなわちＰＣＫ／ＰＰＤＫ構築物１または２）で形質転換されていてもよい。また、宿主細胞が、ＰＣＫおよびＰＰＤＫの両方をコードする第２の局面の構築物で形質転換されていてもよいことも想定される。
【００５６】
当該細胞は、公知の技術を用いて本発明に係る遺伝子構築物またはベクターで形質転換されていてもよい。遺伝子構築物を宿主細胞に導入するのに適した手段は、例えば、欧州特許出願公開第０１１６７１８号および第０２７０８２２号に記載されているように当該技術分野で知られている手段による、アグロバクテリウムが保持するディスアーム型Ｔｉプラスミドベクターの使用を含んでもよい。さらなる方法は、植物原形質を形質転換することであってもよく、この方法では、最初に細胞壁を除去し、核酸を導入し、次いで細胞壁を再編成する。次いで、形質転換された細胞を植物に成長させてもよい。
【００５７】
第８の局面では、第１または第２の局面に係る遺伝子構築物あるいは第３の局面に係るベクターを含む形質転換植物が提供される。
【００５８】
第８の局面に係る形質転換植物としては、アブラナ属などのアブラナ科が挙げられる。当該植物は、セイヨウアブラナ（菜種）であってもよい。
【００５９】
第８の局面に係る形質転換植物のさらなる例としては、コムギ連(Triticeae)などのイネ科が挙げられる。当該植物は、コムギ属(Triticum spp.)（小麦）であってもよい。小麦中の種子タンパク質含有量を増加させることによって、パンなどの小麦を含む食品の体積を増加させてもよい。
【００６０】
第８の局面に係る好適な形質転換植物のさらなる例としては、植物のナス科が挙げられ、ナス科の例としては、例えば、チョウセンアサガオ、ナス、マンドレイク、ベラドンナ(deadly nightshade (belladonna))、トウガラシ（パプリカ、カラトウガラシ）、ジャガイモおよびタバコが挙げられる。ナス科の好適な属の一例はニコチアナである。ニコチアナの好適な種は、タバコ植物、または単にタバコと称される場合がある。植物を第１または第２の局面の遺伝子構築物あるいは第３の局面のベクターで形質転換する様々な方法が知られており、本発明で使用することができる。
【００６１】
例えば、タバコは、以下のように形質転換してもよい。タバコ(学名：Nicotiana tabacum)を、基本的にHorsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985)に記載されているように葉片共培養法を用いて形質転換する。最も若い２枚の広がった葉を７週齢のタバコ植物から採取してもよく、８％のドメストス（商標）中で１０分間表面滅菌し、滅菌蒸留水で６回洗浄してもよい。葉片をＮｏ．６コルク穿孔器を用いて切断し、約２分間かけて（本発明に係る）適当なバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウム懸濁液に入れてもよい。この葉片を、２枚の無菌濾紙の間に穏やかにブロットしてもよい。１０枚の葉片をＬＳ３％スクロース＋２μＭのＢＡＰ＋０．２μＭのＮＡＡを含むプレート上に置き、次いで、これを成長室(growth room)で２日間培養してもよい。葉片は、クラフォラン５００ｇ／ｌおよびのカナマイシン１００ｇ／ｌを添加したＬＳ＋３％スクロース＋２μＭのＢＡＰ＋０．２μＭのＮＡＡを含むプレートに移してもよい。この葉片は、２週間後に上記培地を含む新しいプレートに移してもよい。さらに２週間後、この葉片は、クラフォラン５００ｍｇ／ｌおよびカナマイシン１００ｍｇ／ｌを添加したＬＳ＋３％スクロース＋０．５μＭのＢＡＰを含むプレートに移してもよい。この葉片は、２週間ごとに新しい培地に移してもよい。苗条が現れたら、それらを切除し、クラフォラン５００ｍｇ／ｌを添加したＬＳ＋３％スクロースを入れた瓶に移してもよい。瓶の中の苗条は、約４週間後、ＬＳ＋３％スクロース＋クラフォラン２５０ｍｇ／ｌに移してもよい。さらに３〜４週間後、この植物を、ＬＳ＋３％スクロース（抗生物質なし）に移して、根づかせてもよい。植物が根づいたら、温室の土壌に移してもよい。
【００６２】
第９の局面では、第８の局面に係る形質転換植物から得られた植物繁殖用製品が提供される。
【００６３】
「植物繁殖用製品」は、そこからさらなる植物を生産することができる任意の植物であってもよい。好適には、この植物繁殖用製品は種子であってもよい。
【００６４】
本発明の第１０の局面では、同じ条件で培養された対応する野生型植物よりも高い割合で窒素を転流させる形質転換植物の生産方法であって、
ｉ）第１または第２の局面に係る遺伝子構築物あるいは第３の局面に係るベクターで植物細胞を形質転換する工程と、
ｉｉ）形質転換細胞から植物を再生させる工程と、
を含む方法が提供される。
【００６５】
第１１の局面では、同じ条件で培養された対応する野生型植物よりも高い成長率を有する形質転換植物の生産方法であって、
ｉ）第１または第２の局面に係る遺伝子構築物あるいは第３の局面に係るベクターで植物細胞を形質転換する工程と、
ｉｉ）形質転換細胞から植物を再生させる工程と、
を含む方法が提供される。
【００６６】
好ましくかつ有利なことに、本発明に係る方法は、生産される植物の健康または適応度を損なうことはない。好ましくは、本方法は、第１または第２の局面の遺伝子構築物あるいは第３の局面のベクターを用いて、試験植物および好ましくはその葉を形質転換することを含む。本発明者らは、宿主細胞中でＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫを過剰発現させることが老化した葉の中の窒素の転流を誘発する際に有効であることを観察した。従って、第１０および第１１の局面の方法は、ＰＣＫおよびＰＰＤＫの両方が過剰発現されるように、本発明の１種または複数の構築物で試験植物を形質転換することを含むことが好ましい。例えば、試験植物は、本発明の第１の局面の遺伝子構築物の第１の実施形態（すなわちＰＣＫ構築物）およびさらに第１の局面の構築物の第２の実施形態（すなわちＰＰＤＫ構築物）で形質転換してもよい。従って、これらの２種類の構築物の形質転換によって両方の酵素の過剰発現が生じる。あるいは、試験植物は、ＰＣＫおよびＰＰＤＫをそれぞれコードする本発明の第１の局面の構築物の第３または第４の実施形態で形質転換してもよい。あるいは、試験植物は、ＰＣＫおよびＰＰＤＫの両方をコードする本発明の第２の局面の構築物で形質転換してもよい。
【００６７】
本発明者らは、ＰＣＫおよびＰＰＤＫをコードする１種以上の構築物で形質転換された試験植物の植物の葉が老化の開始時に窒素の転流の増加を示し、従って、窒素濃度がその葉において低下するすことを観察した。さらに、本発明者らは栄養成長率の上昇を観察した。本発明者らは、仮定に縛られてはいないが、葉の中の窒素濃度の低下によって成長率の上昇、従って作物収穫率の上昇が誘発され得ると考える。
【００６８】
本発明の第１２の局面では、同じ条件で栽培された野生型植物から採取された、収穫された葉の中の対応する窒素濃度よりも低濃度の窒素を含有する収穫された葉が提供され、ここで、この葉は、第８の局面に係る形質転換植物から収穫されたもの、あるいは第１０または第１１の局面に係る方法によって生産されたものである。
【００６９】
本発明の第１３の局面では、老化した葉の中の窒素濃度を低下させることができる変異型タバコ植物から得られる窒素が減少したタバコを含む喫煙物品が提供される。
【００７０】
窒素が減少したタバコには、同じ条件で栽培された野生型植物中の対応する濃度よりも窒素濃度の低いタバコが含まれる。そのような喫煙物品は、変異型タバコ植物から得られたタバコを含んでもよく、このタバコは、本発明の第１または第２の局面に係る遺伝子構築物あるいは第３の局面に係るベクターで形質転換されたものであってもよい。
【００７１】
本明細書で使用する「喫煙物品」という用語は、タバコ、タバコ誘導体、膨張タバコ、再生タバコまたはタバコ代用品および、また不燃性(heat-not-burn)製品をベースとするか否かに関わらず、喫煙に適した製品、例えば、手巻きタバコ、紙巻タバコ、葉巻およびシガリロ（小型葉巻）を含むことができる。
【００７２】
当然のことながら、本発明は、実質的に本明細書で参照されている配列のいずれかのアミノ酸または核酸配列（その機能的な変異体もしくは機能的な断片を含む）を含む、任意の核酸、ペプチド、その変異体、誘導体または類似体に及ぶ。「実質的にアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペチド配列」、「機能的な変異体」および「機能的な断片」という用語は、本明細書において参照される配列のいずれか１つを含むアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペチド配列との少なくとも４０％の配列同一性、例えば、（ＰＣＫ酵素の一実施形態をコードする）配列番号１７として同定される遺伝子との４０％の同一性、配列番号１９（すなわちＰＣＫ酵素の一実施形態）として同定されたポリペチドとの４０％の同一性、（ＰＰＤＫ酵素の一実施形態をコードする）配列番号２１として同定された遺伝子との４０％の同一性、または配列番号２３（すなわちＰＰＤＫ酵素の一実施形態）として同定されたポリペチドとの４０％の同一性を有する配列とすることができる。
【００７３】
また、参照されている配列のいずれかに対して６５％超、より好ましくは７０％超、さらにより好ましくは７５％超、なおより好ましくは８０％超の配列の同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列も想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、本明細書で参照されている配列のいずれかとの少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９２％の同一性、なおより好ましくは少なくとも９５％の同一性、なおより好ましくは少なくとも９７％の同一性、なおより好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【００７４】
当業者には、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性の割合の計算方法が分かっている。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性の割合を計算するために、最初に２つの配列のアラインメントを作成した後、配列の同一性値を計算しなければならない。２つの配列の同一性の割合は、（ｉ）配列を整列させるために使用される方法、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法（異なるプログラムで実行される）、あるいは３Ｄ比較による構造アラインメント、および（ｉｉ）アラインメント法（例えば、ローカルまたはグローバルアラインメント）によって使用されるパラメータ、使用される対のスコア行列（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）、およびギャップペナルティ（例えば、関数および定数）によって異なる値を取る場合もある。
【００７５】
アラインメント作成後の、２つの配列間の同一性の割合に関する計算方法は数多くある。例えば、（ｉ）最も短い配列の長さ、（ｉｉ）アラインメントの長さ、（ｉｉｉ）配列の平均長、（ｉｖ）ギャップのない位置の数、または（ｉｖ）オーバーハングを除く等価位置の数によって同一部分の数を割ってもよい。さらに、当然のことながら、同一性の割合は長さにも強く依存する。従って、一対の配列が短い程、偶然に生じることを予測し得る配列の同一性が高くなる。
【００７６】
従って、当然のことながら、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアラインメントは複雑なプロセスである。有名なマルチプルアライメントプログラムであるＣｌｕｓｔａｌＷ(Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882)は、本発明に従ってタンパク質またはＤＮＡのマルチプルアラインメントを生成する好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの好適なパラメータは、以下のとおりであってもよい：ＤＮＡアラインメントについては：ギャップ開始ペナルティー(Gap Open Penalty)＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティー(Gap Extension Penalty)＝６．６６、および行列＝同一性。タンパク質アラインメントについては：ギャップ開始ペナルティー＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティー＝０．２、および行列＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡおよびタンパク質アラインメントについては：ＥＮＤＧＡＰ＝−１およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者であれば、最適な配列アラインメントのためにこれらのパラメータおよび他のパラメータを変える必要があるかも知れないことに気付いているであろう。
【００７７】
好ましくは、次に、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性の割合の計算は、（Ｎ／Ｔ）＊１００（式中、Ｎは、同一の残基を共有する配列の位置の数であり、Ｔは、ギャップを含めるがオーバーハングを除いて比較される位置の合計数である）としてそのようなアラインメントから計算する。従って、２つの配列間の同一性の割合の最も好ましい計算方法は、（ｉ）好適な組み合わせのパラメータ（例えば、上記のようなパラメータ）を用いるＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて配列アラインメントを作成すること、および（ｉｉ）ＮおよびＴの値を式：配列の同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００に挿入することを含む。
【００７８】
同様の配列の他の同定方法が当該技術分野で知られている。例えば、実質的に類似したヌクレオチド配列は、厳密な条件で、配列番号１６、１７、１８、２０、２１、２２に示されている配列またはそれらの相補体とハイブリッド形成する配列によってコードされる。厳密な条件とは、ヌクレオチドが約４５℃で３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルター結合ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリッド形成した後、約２０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で少なくとも１回洗浄されることを意味する。あるいは、実質的に同様のポリペプチドは、配列番号１９、２３または２４に示されている配列とは、少なくとも１個、ただし５、１０、２０、５０または１００個未満のアミノ酸が異なっていてもよい。
【００７９】
遺伝子コードの縮重により、任意の核酸配列を、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を与えることなく変化または変更させてその機能的な変異体を得ることができることは明らかである。好適なヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって静的な変化(silent change)を生じさせることにより変化した配列を有する変異体である。他の好適な変異体は、相同ヌクレオチド配列を有するが、置換されたアミノ酸と同様の生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって保存的変化を生じさせることにより変化した配列の全てもしくは一部を含む変異体である。例えば、小型で非極性の疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリンおよびメチオニンが挙げられる。大型で非極性の疎水性アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが挙げられる。中立極性のアミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷を持つ（塩基性）アミノ酸としては、リジン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられる。負の電荷を持つ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。従って、当然のことながら、アミノ酸は同様の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置換することができ、当業者には、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が分かっている。
【００８０】
本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面のいずれも含む）に記載されている全ての特徴、および／またはそのように開示されている任意の方法またはプロセスの全ての工程は、そのような特徴および／または工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除く任意の組み合わせで、上記の局面のいずれかと組み合わせてもよい。
【００８１】
本発明のさらなる理解のため、および本発明の実施形態の実施方法を示すために、ここで、例として添付の図を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】遺伝子構築物のＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡのクローン化に使用される手順を示す。（ａ）シロイヌナズナＰＰＤＫの細胞質基質のイソ型のｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ型のＰＣＲ増幅、（ｂ）クローニングベクターpCR 4Blunt-TOPOへの挿入、（ｃ）ＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩによる、ＰＰＤＫを放出するためのクローニングベクター（左側）および標的ＳＡＧ１２含有ベクターｐＢＮＰ（右側）の制限エンドヌクレアーゼ消化、（ｄ）ＰＰＤＫのｐＢＮＰへの連結反応および、ＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩによる構築物の制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されたＤＮＡ断片を示すアガロースゲル、および（ｅ）アグロバクテリウム媒介性形質転換によってシロイヌナズナ生態型Columbia 0に導入される構築物。
【図２ａ】本発明に係る発現ベクターの作製に使用されるプラスミドpCR4 BLUNT-TOPOを示す。
【図２ｂ】ＰＰＤＫをコードするｃＤＮＡまたはｇＤＮＡがＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩ消化を用いてpCR4 BLUNT-TOPOに挿入されたことをまとめた表である。
【図３ａ】ＳＡＧ１２プロモーターを含有するプラスミドｐＢＮＰを示す。
【図３ｂ】ＰＰＤＫ挿入断片（ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ）がＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩ消化を用いてｐＢＮＰに導入され、かつＰＣＫ挿入断片（ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ）がＸｂａＩおよびＳａｃＩ消化を用いてｐＢＮＰに導入され、その結果、本発明の実施形態に係るベクターが得られたことをまとめた表である。
【図４】ウェスタンブロットによる形質転換ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫシロイヌナズナ細胞株の選択を示す。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ細胞株を上側に示し、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ細胞株を下側に示す。
【図５】野生型、ΔＰＰＤＫおよび５種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統における５週目以降のＰＰＤＫ発現量の定量化を示す。
【図６】（ｂ）Ｋ３２６および（ｃ）バーレー２１タバコ系統におけるＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ（ｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ）の選択を示す。
【図７】Ｋ３２６タバコの熟した葉におけるＰＰＤＫの過剰発現を示す。
【図８】時間に対する、シロイヌナズナの様々な細胞株、すなわち、野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡのロゼットの写真を示す。
【図９】９週目のシロイヌナズナの生殖組織の質量を示す。
【図１０】播種後３〜９週目の野生型およびＳＡＧ１２−ＰＰＤｇＤＮＡ植物の総植物生質量（すなわち、ロゼット＋生殖組織）を示す。
【図１１】７週目における野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物の葉の窒素含有量を示す。
【図１２】野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物の個々の種子の窒素含有量を示す。
【図１３】野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡシロイヌナズナ細胞株の葉の総遊離アミノ酸含有量を示す。
【図１４】様々なタバコの細胞株の種子の質量を示し、ゼロコピーは野生型であり、Ｇ４（ｇＤＮＡ）、Ｇ１０、Ｇ８およびＣ１０（ｃＤＮＡ）はＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統である。
【図１５】様々なタバコの細胞株の種子の窒素含有量を示し、ゼロコピーは野生型であり、Ｇ４（ｇＤＮＡ）、Ｇ１０、Ｇ８およびＣ１０（ｃＤＮＡ）はＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統である。
【図１６】ＰＣＫ／ＰＰＤＫ二重挿入断片のためのウェスタンブロット法の結果である。全ての系統は、ＳＡＧ１２プロモーターの活性と相関する特に７週目に、より高濃度のＰＣＫを示す。
【図１７】形質転換した植物のＰＣＫおよびＰＰＤＫの両発現によって、対照７と比較してロゼット質量が増加することを示す。
【図１８】窒素の転流が、輸送アミノ酸であるアスパラギンおよびグルタミンのＰＣＫおよびＰＰＤＫ依存的産生によって生じ得ることを示す仮定上の生化学的経路を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００８３】
実施例１−ＳＡＧ１２プロモーターシロイヌナズナＰＰＤＫ植物形質転換構築物の作製
一連のＳＡＧ１２−ＰＰＤＫおよびＰＣＫ発現ベクターを、図３に示すように作製し、次いで、形質転換した植物においてＰＰＤＫおよびＰＣＫの発現を増加させるそれらの能力を分析した。一実施形態では、本構築物は、ＰＣＫまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードし、かつＰＰＤＫをコードしないものであってもよい。別の実施形態では、本構築物は、ＰＰＤＫまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードし、かつＰＣＫをコードしないものであってもよい。ただし、さらに別の局面では、本構築物は、ＰＣＫまたはその機能的な変異体もしくは断片およびＰＰＤＫまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードするものであってもよい。後述するように、最初にシロイヌナズナのＰＰＤＫ遺伝子のｇＤＮＡを単離する。
【００８４】
ｇＤＮＡの単離
シロイヌナズナ生態型Columbia 0からのｇＤＮＡを、推奨されている手順に従ってＤＮｅａｓｙ植物ミニキット(DNeasy Plant Mini Kit)（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて葉から抽出した。ｇＤＮＡを、表１にまとめたプライマー配列を用いる下記のようなＰＣＲ反応のための鋳型として使用した。
【００８５】
【表１】
【００８６】
ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡを７日齢のシロイヌナズナの子葉から抽出した。リボヌクレアーゼを含まない機器を用いて氷上でＲＮＡの抽出を行い、ピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で処理した水を用いて溶液を調製した。水１リットルにつきＤＥＰＣ１ｍｌを添加し、混合物を換気フード内で一晩撹拌した後、加圧滅菌した。ＴｒｉＰｕｒｅ単離試薬（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてＲＮＡを抽出した。乳鉢と乳棒を用いて組織２００ｍｇを液体窒素中で粉砕し、ＴｒｉＰｕｒｅ単離試薬１ｍｌを添加し、推奨されている手順を続けた。ＲＮＡペレットは、６０℃まで１０分間予熱した無傷のＲＮＡ溶液(RNA Secure)（Ａｍｂｉｏｎ社）２０μｌに再懸濁した。試料を、１３，０００ｒｐｍで、４℃で５分間遠心分離し、上澄みを清潔な１．５ｍｌのマイクロ遠心分離管に移し、汚染性の破片を除去した。
【００８７】
ＲＮＡの量および純度は、Eppendorf Biophotometer分光光度計を用いて２６０および２８０ｎｍで読み取ることによって、分光測光法で測定した(Maniatis et al., 1982, Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory)。また、ＲＮＡは、０．５×ＴＢＥに溶かした１．５％（ｗ／ｖ）のアガロース（Melford Laboratories社）を用いるアガロースゲル電気泳動を用いて調べた。試料を１×ＲＮＡ試料緩衝液に懸濁し、泳動用緩衝液として０．５×ＴＢＥを用いて８０Ｖの電気泳動に供した。４×作業濃度のＲＮＡ試料緩衝液は、０．００２％（ｗ／ｖ）の臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、２×トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（２×ＴＢＥ）（２×ＴＢＥは、１８０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１８０ｍＭのホウ酸および８ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．３）を含有していた）、１３％のフィコール４００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、０．０１％のブロムフェノールブルーおよび７Ｍの尿素（Ficher Scientific社））を含有していた。
【００８８】
ｃＤＮＡを合成するためのＲＮＡの逆転写は、２５μｌの最終体積に対して、２μｇのＲＮＡ、１μｇのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）（１５）プライマー（Ｒｏｃｈｅ社）、１×モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、０．４ｍＭのｄＮＴＰ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）、４０単位の組み換え型ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、２００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社）およびヌクレアーゼ非含有水を用いて行った。この試料を４２℃で１時間培養した。
【００８９】
シロイヌナズナＰＰＤＫの増幅
ＰＰＤＫの細胞質基質のイソ型をコードする遺伝子のｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ型を、表１に示すＡｖｒＩＩ制限部位を含む順方向プライマー（ＡｔＣｙｔＦＷＤ−ＡｖｒＩＩ、配列番号１）およびＢａｍＨＩ制限部位を含む逆方向プライマー（ＡｔＣｙｔＲＥＶ−ＢａｍＨＩ、配列番号２）を用いるＰＣＲによって、ｇＤＮＡまたはｃＤＮＡの鋳型から増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、１×ＨＦ緩衝液（ＮＥＢ社）、２ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２、ＮＥＢ社）、０．５ｍＭのｄＮＴＰs（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）、１００ｎｇの鋳型（ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ）、０．５μＭの各プライマーおよび１単位のPhusion High-Fidelity ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社）を含有していた。熱循環は、９８℃で３０秒間の最初の変性工程、次いで、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２分間の３０サイクル、７２℃で５分間の最終的な伸長工程によって、Ｔｅｃｈｎｅサーマルサイクラー(Techne Thermal Cycler)を用いて行った。
【００９０】
シロイヌナズナＰＰＤＫのｃＤＮＡおよびｇＤＮＡを単離および調製した後、それらを使用して、図１にまとめた手順を用いて様々な構築物を作製した。老化中にＰＰＤＫを過剰発現させるために、シロイヌナズナのＰＰＤＫの細胞質基質のイソ型のｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ型を、ｐＢＮＰベクター中の老化誘発ＳＡＧ１２プロモーターに融合した。
（ａ）ＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれ含み、かつ２．４および４．３ｋｂ産物を産生するプライマーを用いる、シロイヌナズナのＰＰＤＫの細胞質基質のイソ型のｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ型のＰＣＲ増幅。
（ｂ）クローニングベクターpCR 4Blunt-TOPOへの挿入。ＰＰＤＫ挿入断片全体を配列決定し、予想した配列と同一であることが分かった。
（ｃ）ＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩによるクローニングベクターおよび目的ベクターｐＢＮＰの制限エンドヌクレアーゼ消化。
（ｄ）ＢＮＰへの連結反応、および構築物のＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩによる制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されたＤＮＡ断片を示すアガロースゲル。予想されたバンドの大きさは、ｃＤＮＡ構築物では１４．８ｋｂおよび２．４ｋｂ、ｇＤＮＡ構築物では１４．８ｋｂおよび４．４ｋｂであった。
（ｅ）アグロバクテリウム媒介性の形質転換によってシロイヌナズナ生態型Columbia 0に導入された構築物。構築物は、連結反応部位全体にわたって配列決定した。遺伝子ｎｐｔＩＩはネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードし、植物中にカナマイシン耐性を付与する。ＬＢおよびＲＢ：Ｔ−ＤＮＡの左右それぞれの境界；nos Pro:ノパリンシンターゼプロモーター；nos t:ノパリンシンターゼターミネーター；SAG12 Pro:シロイヌナズナＳＡＧ１２遺伝子のプロモーター。
【００９１】
図１を参照しながら、構築物の作製について以下に詳細に説明する。
【００９２】
pCR 4Blunt-TOPOベクターへのクローン化
ＰＣＲ産物を、０．５×ＴＢＥに溶かした１％（ｗ／ｖ）のアガロース、０．５μｇｍｌ−１の臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用するアガロースゲル電気泳動を用いて調べた。試料を、１×ＤＮＡ試料緩衝液（６×作業濃度のＤＮＡ試料緩衝液は、５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス−ＨＣｌ、Melford Laboratories社）、６０％のグリセリンおよび０．２５％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有していた）に懸濁し、泳動用緩衝液として０．５×ＴＢＥを用いる８０Ｖの電気泳動に供した。
【００９３】
２．６ｋｂのＰＰＤＫｃＤＮＡバンドおよび４．４ｋｂのＰＰＤＫｇＤＮＡバンドを、推奨されている手順に従ってQIAQuick PCR精製キット(QIAQuick PCR Purification Kit)（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製し、３０μｌの分子生物学等級水（BDH Laboratory Supplies社）を用いて溶出した。ＰＣＲ産物は、推奨されている手順に従ってpCR 4Blunt-TOPOベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に連結させた（平滑末端）。クローン化反応物（２μｌ）を、推奨されている手順に従って５０μｌのSub-cloning Efficiency DH5α大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に形質転換した。形質転換した大腸菌細胞は、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）寒天上で３７℃で一晩増殖させた。ルリア−ベルターニ培地（ＬＢ培地）は、１０ｇｌ−１のバクト−トリプトン(Bacto-Tryptone)（ＢＤ）、５ｇｌ−１のバクト酵母抽出物(Bacto-Yeast Extract)（Ｏｘｏｉｄ社）および８５ｍＭの塩化ナトリウム（Fisher Scientific社）を含んでいた。このｐＨは、高圧蒸気滅菌前に１０Ｍの水酸化ナトリウムで７．０に調整した。１．５％（ｗ／ｖ）の寒天（ＢＤ）を５０μｇｍｌ−１のカナマイシン（Melford Laboratories社）を含むＬＢ培地に添加してＬＢ寒天を調製した。
【００９４】
大腸菌のコロニーは、１×ＮＨ４緩衝液（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）、０．５ｍＭのｄＮＴＰs（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）、０．３μＭの各プライマー（ＡｔＣｙｔＦＷＤ−ＡｖｒＩＩおよびＡｔＣｙｔＲＥＶ−ＢａｍＨＩ）、すなわち配列番号１および２、ならびに０．５単位のBioTaq ＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）を用いるＰＣＲによってスクリーニングした。熱循環は、９５℃で５分間の最初の変性工程、次いで、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で４分３０秒間の３０サイクル、７２℃で５分間の最終的な伸長工程によって行った。ＰＣＲ産物を、上記のように１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル電気泳動を用いて調べた。所望の挿入断片を含むコロニーを、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ培地において３７℃の振盪培養器内で一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、推奨されている手順に従ってＱＩＡＰｒｅｐスピンミニプレップキット(QIAPrep Spin Miniprep Kit)（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて抽出した。ＤＮＡは、１×ＢａｍＨＩ緩衝液中の１０単位のＢａｍＨＩ（ＮＥＢ１）によって３７℃で１時間消化した。消化は、上記のように１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル電気泳動を用いて調べた。正しい制限酵素消化パターンを示すプラスミ中の挿入断片を、３７３０ＤＮＡ分析機（Applied Biosystems社）を用いて、表１に示すプライマーＡｔＣｙｔＦＷＤ−ＡｖｒＩＩ（配列番号１）、ＡｔＰＰＤＫＳｅｑＦ１（配列番号３）、ＡｔＰＰＤＫＳｅｑＦ２（配列番号４）、ＡｔＰＰＤＫＳｅｑＲ１（配列番号５）、ＡｔＰＰＤＫＳｅｑＲ２（配列番号６）およびＡｔＣｙｔＲＥＶ−ＢａｍＨＩ（配列番号２）を用いて配列決定した。配列は、ＢｉｏＥｄｉｔ（Ibis Biosciences社）で分析した。
【００９５】
これらの構築物をＴＯＰＯ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＴＯＰＯ−ＰＰＤＫｇＤＮＡと命名し、図２ａおよび図２ｂに示す。
【００９６】
ｐＢＮＰ構築物のクローン化
ＰＰＤＫを、老化誘発プロモーターＳＡＧ１２の制御下でＢＮＰ１３８００００００１バイナリーベクターに連結させた。ＳＡＧ１２を含む骨格プラスミド（ＢＮＰ１３８００００００１）は、ｐＢＩＮＰＬＵＳ(F. A. van Engelen et al. Transgenic Research (1995) 4, 288-290)に基づくものであり、図３ａに示す。最初に、ＴＯＰＯ−ｃＤＮＡまたはＴＯＰＯ−ｇＤＮＡを保有する大腸菌のコロニーを使用して、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンを含む２５ｍｌのＬＢ培地に植菌した。これらの培養物を３７℃の振盪培養器内で一晩培養し、推奨されている手順に従ってプラスミドミディキット(Plasmid Midi Kit)（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドミディキットを用いて、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンを含む１００ｍｌの培養物からｐＢＮＰ１３８００００００１ベクターを精製した。
【００９７】
次いで、これらのプラスミドを、制限酵素ＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩによって消化した。消化反応物は、３７℃で一晩培養し、２μｇのＤＮＡ（ＢＮＰ社）または４μｇのＤＮＡ（ＴＯＰＯ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＴＯＰＯ−ＰＰＤＫｇＤＮＡ）のいずれか一方、１×緩衝液２、１０単位のＡｖｒＩＩおよび１０単位のＢａｍＨＩを含んでいた。試料は、０．８％（ｗ／ｖ）のアガロース、０．５×ＴＢＥおよび２５μＭのクリスタルバイオレット（Hopkin and Williams社）を用いるクリスタルバイオレットアガロースゲル電気泳動(Rand, 1996, Crystal violet can be used to visualize DNA bands during gel electrophoresis and to improve cloning efficiency（クリスタルバイオレットは、ゲル電気泳動中にＤＮＡバンドを視覚化し、かつクローン化効率を向上させるために使用することができる）. Elsevier Trends Journals Technical Tips Online.)によって分離し、クリスタルバイオレット試料緩衝液（２５０μＭのクリスタルバイオレット（Hopkin and Williams社）および３０％（ｗ／ｖ）のスクロース（Fisher Scientific社）および泳動用緩衝液としての２５μＭのクリスタルバイオレットを含有する０．５×ＴＢＥを用いて、約２時間５０Ｖの電気泳動に供した。推奨されている手順に従ってＱＩＡＱｕｉｃｋゲル抽出キット(QIAQuick Gel Extraction Kit)（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いるゲルバンド抽出を使用して、１４．４ｋｂのＢＮＰ、２．６ｋｂのＰＰＤＫｃＤＮＡおよび４．４ｋｂのＰＰＤＫｇＤＮＡ断片を抽出した。断片は、臭化エチジウムを用いる１％のアガロースゲル電気泳動を用いてHyperLadder I（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）に対して調査および定量化した。
【００９８】
ゲル抽出したｇＤＮＡ断片は、ｇＤＮＡ断片（４．４ｋｂ）およびＴＯＰＯ骨格（３．９ｋｂ）と同様の大きさであるため、ホスファターゼで処理してあらゆる汚染性ＴＯＰＯ骨格との連結反応を防止した。エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ、１単位、Ｒｏｃｈｅ社）を、１×脱リン酸化緩衝液（Ｒｏｃｈｅ社）に入れた１μｇのゲル抽出したｇＤＮＡ断片に添加し、この反応物を３７℃で３０分間培養した後、６５℃で１０分間失活させた。連結反応は、１０：１のモル比で消化したＢＮＰを有するｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ断片のいずれか一方、１×連結反応緩衝液（ＮＥＢ社）および１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）を用いて行った。連結反応物を１６℃で一晩培養し、２μｌを使用して、推奨されている手順に従ってＬｉｂｒａｒｙ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５α大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を形質転換した。
【００９９】
形質転換した大腸菌を、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンを含むＬＢ寒天上に移し、３７℃で一晩培養した。大腸菌のコロニーは、１×ＮＨ４緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、０．３μＭの表１に示す各プライマー（ＡｔＰＰＤＫｅｘｏｎ１５ＦＷＤ（配列番号７）およびＢＮＰｎｏｓｔＲＥＶ（配列番号８）、および０．５単位のBioTaq DNAポリメラーゼを用いるＰＣＲによってスクリーニングした。熱循環は、９５℃で５分間の最初の変性工程、次いで、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３分間の３０サイクル、７２℃で５分間の最終的な伸長工程によって行った。ＰＣＲ産物は、上記のように１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル電気泳動を用いて調べた。所望の挿入断片を含むコロニーを、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ培地において３７℃の振盪培養器内で一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡは、推奨されている手順に従ってＱＩＡＰｒｅｐスピンミニプレップキット(QIAPrep Spin Miniprep Kit)を用いて抽出した。ＤＮＡは、上記のように１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル電気泳動に供する前に３７℃で１時間、１×ＢａｍＨＩ緩衝液中で１０単位のＢａｍＨＩおよび１０単位のＳｔｕＩで消化した。正しい制限酵素消化パターンを示す、ｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ連結反応によってそれぞれ得られた１つのコロニーを選択し、上述のように、表１に示すプライマーＢＮＰ−ＳＡＧ１２ＦＷＤ（配列番号９）を用いて配列決定した。
【０１００】
これらの構築物をＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡと命名し、図３ａおよび図３ｂに示す。
【０１０１】
実施例２−ＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡによるシロイヌナズナの形質転換
アグロバクテリウムチュメファシエンスのＧＶ３１０１−Ｒ株を、電気穿孔によって、図３に示すプラスミドＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡで形質転換した。それらの調製については、実施例１に記載されている。
【０１０２】
電気的形質転換受容性(electrocompetent)アグロバクテリウムを、２５ｍｇｌ−１のリファンピシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含むＬＢ培地の培養物から産生し、３０℃および、６００ｎｍにおいて０．４〜０．６の光学濃度で増殖させ、Eppendorf Biophotometer分光光度計を用いて測定した。５００ｍｌの培養物を４０００ｇで１５分間遠心分離し、上澄みを捨て、細胞を５００ｍｌの１０％冷グリセリン（Fisher Scientific社）に再懸濁した。遠心分離および再懸濁を２５０ｍｌ、次いで１０ｍｌ、最後に２ｍｌのグリセリンを用いて繰り返した。細胞は、５０μｌの分割量に等分し、液体窒素中で急速冷凍し、−８０℃で保存した。電気穿孔は、ＢｉｏＲａｄ遺伝子導入装置(BioRad Gene Pulser)を用いて行った。プラスミドＤＮＡ（２００ｎｇ）を、上記のように予備冷却した電気穿孔法用キュベット（Gene Pulser Cuvette、ＢｉｏＲａｄ社）に入れた５０μｌのアグロバクテリウム細胞に添加し、この細胞を氷上で５分間培養した。このキュベットに対して、２．５ｍＶのパルス、４００オームの抵抗および２５μＦの静電容量を用いた電気穿孔を行った。１ｍｌのＳＯＣ培地（Super Optimal Broth, Catabolite Repression）は、２０ｇ／ｌのバクト−トリプトン、５ｇ／ｌのバクト酵母抽出物、８５ｍＭの塩化ナトリウムおよび２５０ｍＭの塩化カリウムを含んでいた。１０Ｍの水酸化ナトリウムを使用して、高圧蒸気滅菌前にｐＨを７．０に調整した。使用前に、最終濃度が１０ｍＭになるように無菌塩化マグネシウムを添加し、最終濃度が２０ｍＭになるように無菌グルコース（Fisher Scientific社）を添加した。この細胞を３０℃の振盪培養器内で２時間培養した後、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンおよび５０μｇｍｌ−１のリファンピシンを含むＬＢ寒天上に移した。
【０１０３】
３０℃で２日間の培養後に、コロニーをＰＣＲ、次いで制限酵素消化によってスクリーニングした。ＰＣＲのスクリーニングで陽性であり、かつ期待した制限消化パターンを示すコロニーを、５０μｌｍｌ−１のカナマイシンおよび５０μｌｍｌ−１のリファンピシンを含む５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３０℃の振盪培養器内で一晩培養した。翌日、この培養物６００μｌを使用して上記のように５００ｍｌのＬＢ培地に植菌し、花浸漬(floral dipping)に使用する前に、３０℃の振盪培養器内で３０時間培養した。
【０１０４】
シロイヌナズナ植物は４週齢で花浸漬のために使用した。全ての構築物を、野生型の生態型Columbia 0に形質転換した。上記のように調製したアグロバクテリウム培養物を５，０００ｇで、４℃で１５分間遠心分離し、細胞ペレットは、２５０ｍｌの無菌の５％スクロース（Fisher Scientific社）溶液（ｗ／ｖ）および０．０５％Silwett L-77（OSi Specialties社）に再懸濁した。植物は、穏やかに撹拌しながら細胞懸濁液に約１０秒間浸漬した後、ポリエチレン製ラップで蓋をし、２４時間直射日光を避けた。この後、植物を標準的な規制飼育に戻し、種子を収穫した。
【０１０５】
形質転換シロイヌナズナの選択
形質転換した植物からの種子は、Harrison et al. (2006), Plant Methods, 2, 19に従って、５０μｇｍｌ−１のカナマイシン（Dufecha Biochemie社）に関して選択した。抗生物質抵抗性を示すＴ１植物は結実するまで成長し、自己授粉した。この種子を上記のように選択し、３：１の耐性：非耐性比を示すＴ２系統を、導入遺伝子の単一コピーを保有するものとして選択した。これらの植物は再び自己授粉し、上記のように選択した。１００％の耐性を示す子孫（Ｔ３）を産生したＴ２系統をホモ接合性として選択し、全ての実験に使用した。メンデル遺伝学を使用して、導入遺伝子に対してホモ接合性であり、かつ単一の導入遺伝子コピーを含むＴ２世代植物を選択した。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡで形質転換した各植物に対して、５種類の独立した単一の挿入断片のホモ接合性系統を選択した。
【０１０６】
実施例３−ＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡによるタバコの形質転換
形質転換受容性アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＬＢＡ４４０４を、実施例２に記載されているように電気穿孔法によって、プラスミドＢＮＰ、ＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰＰＰＤＫｇＤＮＡで形質転換した。電気穿孔後、電気穿孔した細胞に１ｍｌのＬＢ培地を添加し、次いで、その細胞を、５０μｇｍｌ−１カナマイシンおよび１００μｇｍｌ−１スペクチノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含むＬＢ寒天上に移す前に、２８℃の振盪培養器内で２時間培養した。２８℃で２日間の培養後、１つのコロニーを使用して、５０μｇｍｌ−１カナマイシンおよび１００μｇｍｌ−１スペクチノマイシンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に植菌した。この培養物を、２８℃の振盪培養器内で３日間培養した。プラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素消化によって分析し、５０μｌの培養物を使用して、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンおよび１００μｇｍｌ−１のスペクチノマイシンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に植菌した。この培養物を、２８℃の振盪培養器内で一晩培養した。
【０１０７】
タバコ栽培品種バーレー２１およびＫ３２６を種子から栽培し、最も若い葉を８週齢の植物から切除し、８％（ｖ／ｖ）ドメストス濃厚漂白剤（Ｄｏｍｅｓｔｏｓ社）で１０分間滅菌した後、無菌蒸留水ですすいだ。Ｎｏ．６コルク穿孔器を使用して葉片に穴を開け、次いで、これを２５ｍｌのアグロバクテリウム培養物に２分間入れた。次いで、葉片を、２．２μＭの６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）および０．２７μＭのα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を含むＭＳ培地上に下側を下に向けて置いた。これらを、２２℃の成長室に２日間置いた。次いで、葉片を、５００μｇｍｌ−１のクラフォラン(Roussel Laboratories社)（共培養されていない対照）または５００μｇｍｌ−１のクラフォランおよび１００μｇｍｌ−１のカナマイシンを含む上記のような選択的なＭＳ培地に移した。葉片は、６週間にわたって１４日毎に、上記のような新しい選択的なＭＳ培地に移した。次いで、カルスおよび苗条塊(shoot clump)を葉片から除去し、０．５μＭのＢＡＰ、５００μｇｍｌ−１のクラフォランおよび１００μｇｍｌ−１のカナマイシンを含むＬＳ培地に入れた。２週間後、苗条を０．５μＭのＢＡＰ、５００μｇｍｌ−１のクラフォランを含みかつカナマイシンを含まないＬＳ培地を入れた１５０ｍｌの瓶に移した。
【０１０８】
それから３週間後、優性の苗条を、２５０μｇｍｌ−１のクラフォランを含みかつＢＡＰまたはカナマイシンを含まないＬＳ培地に移した。さらに３週間後、苗条を、抗生物質またはＢＡＰを含まないをＬＳ培地に移すことによって、さらに浄化した。十分な根が生えたら、植物を温室内の土壌に移した。
【０１０９】
形質転換タバコの選択
定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用して、Ｔ０およびＴ１植物中の導入遺伝子のコピー数を定量化した。可能であれば、単一の挿入断片Ｔ０およびホモ接合性Ｔ１植物を分析のために選択した。導入遺伝子の検出のために、表１に示すようなプライマーＢＮＰ−１２７１Ｆ（配列番号１０）およびＢＮＰ−１３３４Ｒ（配列番号１１）を使用し、Ｖｉｃ／ＴＡＭＡＲＡ標識プローブＢＮＰ１２９１ＴＶ（配列番号１２）を使用して、ｎｐｔＩＩ導入遺伝子にアニールした。内部定量化のために、プライマーＮｔＣｙｃ−１８４Ｆ（配列番号１３）およびＮｔＣｙｃ−３１６Ｒ（配列番号１４）を使用し、ＦＡＭ／ＴＡＭＡＲＡ標識プローブＮｔＣｙｃ−２６７Ｔ（配列番号１５）を使用して、サイクロフィリンをコードする内因性遺伝子にアニールした。定量化は、比較Ｃｔ法によるものであった(ΔΔCt method, Bubner & Baldwin (2004), Plant Cell Reports, 23, 263-271)。反応混合物は、１×ユニバーサルマスターミックス(Universal Master Mix)（ＡＢＩ社）、０．９μＭの各プライマー、０．２μＭの各プローブ（ＢＮＰおよびＮｔＣｙｃプライマーおよびプローブに対して別の反応を用いる）および推奨されている手順に従ってＤＮｅａｓｙ植物ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて葉の組織から抽出した約５００ｎｇのｇＤＮＡ鋳型を含んでいた。熱循環は、９５℃で１０分間の最初の変性工程、次いで、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サイクルによって、7900HT FastリアルタイムＰＣＲシステム(7900HT Fast Real-Time PCR System)（Applied Biosystems社）で行った。データは、付属のＳＤＳ２．２ソフトウェア（Applied Biosystems社）を用いて分析した。
【０１１０】
形質転換したＴ０世代のＫ３２６およびバーレー２１タバコの組織培養における再生後、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用して、導入遺伝子の単一コピーを有する植物を選択した。単一の挿入断片の植物は、導入遺伝子サイレンシングの可能性を減少させるように選択した。Ｑ−ＰＣＲは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｎｐｔＩＩ導入遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて行った。この遺伝子は、構築物ｐＢＮＰ、ＢＮＰ−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡ中の植物ゲノム内に運ばれたＴ−ＤＮＡの左右の境界の間に存在していた。ｐＢＮＰのみによって形質転換した植物は、組織培養による再生が空のベクターによって形質転換された植物とＰＰＤＫコード配列を含むベクターによって形質転換された植物との間で一致することを確認するための空のベクター対照として機能した。形質転換が成功したことを確認するための再生およびＱ−ＰＣＲ検査後、これらの植菌を破棄した。
【０１１１】
各構築物（ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ）ならびに各栽培品種（Ｋ３２６およびバーレー２１）のために、６種類の植物を選択した。単一の挿入断片の植物のみを選択することができなかったため、６種類の単一の挿入断片の植物が入手できなかった場合は、可能な限り最も少ないコピー数を有する植物を選択した。これらの植物は自己授粉し、その種子を収穫した。
【０１１２】
選択したＴ０植物ごとに１４株の子孫を育て、Ｑ−ＰＣＲを繰り返してホモ接合性植物を選択した。ホモ接合性植物の使用によって、将来の世代における導入遺伝子の安定性を確保しなければならない。Ｔ０親ごとに、導入遺伝子を保有している４株の子孫を選択した。しかし、全てのＴ０親に対して、ホモ接合性の子孫を必ずしも選択することができるわけではなかった。親のコピー数が３つ以上であった場合は、より少ないコピー数を有する植物を選択して、導入遺伝子サイレンシングの可能性を減少させかつ、また必要であれば、Ｔ２世代からのホモ接合体の選択を単純化した。このようにして、各構築物および各栽培品種のために、５種類の独立した系統から、全てのさらなる実験のためにより少ない導入遺伝子コピー数を有する４種類の生物学的複製（同胞）を選択した。
【０１１３】
実施例４−形質転換したシロイヌナズナ植物中のＰＰＤＫタンパク質の検出および定量化
タンパク質の抽出
シロイヌナズナの葉の組織（１００ｍｇ）を、マイクロ乳棒を用いて１．５ｍｌの微小遠心管中で液体窒素冷却して粉砕し、４００μｌの抽出緩衝液（リン酸カリウム緩衝液（＋プロテアーゼ阻害剤反応混液（ＰＩＣ、Ｓｉｇｍａ社）））を添加した。タンパク質の濃度は、推奨された手順に従ってＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬(Bio-Rad Protein Assay Reagent)（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてブラッドフォードアッセイ(Jones et al., 1989, Journal of Chemical Ecology, 15, 979-992)で測定した。
【０１１４】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動
タンパク質は、１０％（ｖ／ｖ）アクリルアミド（３７．５：１＝アクリル：ビスアクリル、Severn Biotech社）、５０％（ｖ／ｖ）免疫ブロット分解緩衝液（セクション２．１０を参照）、０．０５％（ｗ／ｖ）ペルオキソ二硫酸アンモニウム（APS、AnalaR社）、および０．０５％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’,Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、Severn Biotech社）を含む分解ゲルにおけるポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ社）によって分離した。濃縮用ゲルは、上記のような５％アクリルアミド、５０％（ｖ／ｖ）免疫ブロット濃縮用緩衝液、０．０６％（ｗ／ｖ）ＡＰＳおよび０．１％（ｖ／ｖ）ＴＥＭＥＤを含んでいた。電気泳動は、１×免疫ブロット試料緩衝液（６６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセリン、０．７ｍＭのＳＤＳ、０．７Ｍのβ−メルカプトエタノール（BDH Laboratory Supplies社）および０．０５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）および免疫ブロット泳動用緩衝液、（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．２９ｍＭのグリシン(Fisher Scientific社)および３．５ｍＭのＳＤＳ）を用いて抽出した２０μｇの総タンパク質に対して７０ｍＡの電流で１時間３０分間行った。
【０１１５】
二組のゲルを同時に泳動した。一方を免疫ブロット分析（以下に記載する）のために使用し、他方を推奨された手順に従ってＧｅｌＣｏｄｅ青色安全タンパク質染色(GelCode Blue Safe Protein Stain)（Thermo Scientific社）を用いて染色した。ゲル乾燥膜(Gel Drying Film)（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して染色したゲルを乾燥した。
【０１１６】
免疫ブロット分析
免疫ブロット分析用のゲルからのタンパク質を、Ｐｒｏｔｅａｎ極厚ブロット紙(Protean Extra-Thick Blot Paper)（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）、および免疫ブロット用転写緩衝液（４８ｍＭのトリス−ＨＣｌ、３９ｍＭのグリシン、１．３ｍＭのＳＤＳおよび２０％（ｖ／ｖ）メタノール（Fisher Scientific社））を用いて、セミドライブロッター(Semi-Dry Blotter)（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中でProtan BA83硝酸セルロース膜（Schleicher and Schuell社）に１５Ｖで１時間転写した。タンパク質の転写を確認するために、ポンソー染色（０．５％（ｗ／ｖ）ポンソーＳ（Ｆｌｕｋａ社）および１％（ｗ／ｖ）氷酢酸（Fisher Scientific社））をブロットした後の膜に塗布し、次いで、その膜を蒸留水ですすいだ。
【０１１７】
ＰＰＤＫ免疫ブロット分析用のブロッキング緩衝液は、１％（ｗ／ｖ）乾燥脱脂乳粉末（Ｍａｒｖｅｌ社）および０．１％（ｖ／ｖ）ポリオキシエチレンモノラウリン酸ソルビタン（ＴＷＥＥＮ２０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：１．５ｍＭの正トリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４、ＡｎａｌａＲ社）、８．１ｍＭの正リン酸二水素ナトリウム、２．７ｍＭの塩化カリウムおよび１３７ｍＭの塩化ナトリウム）を用いて毎日更新した。塩酸を使用してｐＨを７．４に調整した。膜は、振盪機上の室温のブロッキング緩衝液中で１時間培養した。一次ハイブリッド形成は、ウサギ抗ＰＰＤＫ抗体（Chris Chastain、ミネソタ州立大学）の１：１０，０００の希釈液を用いて行い、次いで、ブロッキング緩衝液でそれぞれ５分間の洗浄を３回行った。二次ハイブリッド形成は、ロバ抗ラビットビオチン化全抗体(GE Healthcare社)の１：１０００の希釈液を用いて行い、次いで、上記のように３回洗浄した。三次ハイブリッド形成は、ストレプトアビジンビオチン化ワサビペルオキシダーゼ複合体（GE Healthcare社）の１：１０００の希釈液を用いて行い、次いで、各０．１％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳ中で５分間の洗浄を３回行った。
【０１１８】
次いで、膜を蒸留水中で３回すすいだ。検出は、推奨されている手順に従って、Western Lightning化学発光試薬(Western Lightning Chemiluminescence Reagent)（増感ルミノール(Enhanced Luminol)、Perkin Elmer社）を用いて行った。
【０１１９】
図４を参照すると、ウェスタンブロットによる形質転換ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫシロイヌナズナ細胞株の選択が示されている。タンパク質を、８週齢のシロイヌナズナ野生型、ΔＰＰＤＫ、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物の葉の組織から抽出し、より高濃度のＰＰＤＫを発現している株を選択するために免疫ブロット分析に供した。組み換え型トウモロコシＰＰＤＫ（３０μｇ）を陽性対照として使用した。ＰＰＤＫは、野生型またはＰＰＤＫ変異型植物（ΔＰＰＤＫ）において検出されなかった。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物は、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡよりも高濃度のＰＰＤＫを発現していた。その後の全ての分析は、５種類のＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統に対して行った。
【０１２０】
ＰＰＤＫは、野生型およびΔＰＰＤＫ植物中では検出することができず、いくつかのＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ植物中では低濃度で検出することができ、全てのＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統で検出することができた。これらの系統のうち３つにおいて、野生型またはＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ系統に比べ非常により高い量のＰＰＤＫが検出された。従って、イントロンの存在は、ＰＰＤＫの発現レベルに対してプラスの効果があると思われ、全てのさらなる実験での使用のためにＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統を選択した。
【０１２１】
ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物におけるＰＰＤＫの累積の開始および程度を測定するために、ＰＰＤＫの免疫ブロットを、野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物に対して行った。
【０１２２】
図５を参照すると、野生型、ΔＰＰＤＫおよび５週目以降の５種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統におけるＰＰＤＫ発現量の定量化が示されている。ＰＰＤＫ発現量は、５〜９週目の各時点の野生型の割合として計算した。データは、これらの５つの時点の平均として示されている。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統は、ＰＰＤＫ発現量の昇順で配置されている。遺伝子型間の差は、分散分析を用いて試験した（Ｆ＝４．７７５、ｄｆ＝６、ｐ＝０．００１）。野生型と有意差が認められる系統は、Ｇ１２．３（ｐ＝０．００５）およびＧ１６．１（ｐ＝０．００４）であった。
【０１２３】
タンパク質は、播種後３週目から９週目までの週間隔で収穫された葉の組織から抽出した。ＰＰＤＫは、５週目以降の野生型植物中で低量検出され、これにより、転写産物の観察された増加によってタンパク質の発現量が増加することが確認された。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物では、ＰＰＤＫの累積の開始も５週目に観察されたが、ＰＰＤＫ発現量は野生型よりも多い。ＰＰＤＫタンパク質は、ΔＰＰＤＫ植物ではいずれの段階においても検出されなかった。
【０１２４】
葉のタンパク質抽出物中のＰＰＤＫの定量化を可能にする方法も最適化した。異なる量の組み換え型トウモロコシＰＰＤＫタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット分析に供した。バンド強度は、ＡｌｐｈａＥａｓｅ画像化ソフトウェアおよび作成された標準曲線を用いて計算した。回帰直線はＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェアを用いて計算し、次いで、これを使用して植物の葉の試料中のＰＰＤＫ量を計算した。免疫ブロットの検出レベルが変化する可能性があるため、異なる免疫ブロットの間の真の比較を可能にするために、全ての免疫ブロットに対して少なくとも３種類の標準物質を含める必要があった。異なる抽出物中のＰＰＤＫ発現量の定量化のためのこの技術を使用して、異なる形質転換系統を選択および比較した。
【０１２５】
ＰＰＤＫタンパク質発現量は、各時点における各系統の少なくとも４個の生物学的複製について、組み換え型トウモロコシＰＰＤＫタンパク質の公知の標準物質を参照することによって計算した。分析から、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ中のＰＰＤＫ発現量が５週目以降の野生型における発現量よりも高いことが分かった。ＰＰＤＫ発現量は、各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統について５週目以降の各時点の野生型の割合、および各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統の老化期間におけるＰＰＤＫの累積を定量化するためのこれらの値からの平均として計算した。図５に示すように、これによって、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統をＰＰＤＫ発現量の増加に従って順序付けることができた。
【０１２６】
形質転換植物中に高い量で蓄積したタンパク質が失活する場合があるため、タンパク質発現量の増加が必ずしも酵素活性の増加を暗示するというわけではない。ＰＰＤＫは暗所で可逆的にリン酸化され、その結果、ＰＰＤＫは失活する。抗体は、ＰＰＤＫのリン酸化された型（リン酸化ＰＰＤＫ）に抗して増加し、ＰＰＤＫの失活型の特異的検出を可能にするが、リン酸化状態に関係なく以前に使用された抗体（抗ＰＰＤＫ）はＰＰＤＫを検出する(Chastain et al., 2002, Plant Physiology, 128, 1368-1378)。抗リン酸化ＰＰＤＫ抗体を使用して、免疫ブロット時には抗ＰＰＤＫ抗体によって最初に検出され、次いで剥離され、かつ再検出される播種後３週目から９週目までに経時的に失活したＰＰＤＫを検出した。
【０１２７】
驚くべきことに、失活した（リン酸化された）ＰＰＤＫは、複数の免疫ブロットにおいて野生型植物中に超低濃度でのみ、かつ老化の後期段階の間にのみ検出することができた。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物では、失活した時点に応じて、ＰＰＤＫは、より高濃度で検出された。しかし、ＰＰＤＫ発現量の増加開始直後の時点では、総ＰＰＤＫの高い発現量にも関わらず、失活したＰＰＤＫは、ほとんどあるいは全く検出されなかった。これらの結果は、一部のＰＰＤＫの失活がＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物中に生じる可能性があるが、酵素的に活性なＰＰＤＫの発現量の増加は、少なくとも老化の初期段階の間にＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物において存在することを示唆している。
【０１２８】
実施例５−形質転換したタバコ(Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ)植物中のＰＰＤＫタンパク質の検出および定量化
タバコの葉の組織（１００ｍｇ）を、マイクロ乳棒を用いて１．５ｍｌの微小遠心管の中で液体窒素下で粉砕し、４００μｌの抽出緩衝液（オーバーコート緩衝液(Overcoat Buffer)（ＰＩＣ社））を添加した。タンパク質の濃度は、推奨されている手順に従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてブラッドフォードアッセイ(Jones et al., 1989)で測定した。タンパク質は、実施例４に記載されているようにポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ社）によって分離した。実施例４に記載されている免疫ブロットによってタンパク質を分析し、かつＰＰＤＫタンパク質を定量化した。
【０１２９】
ＰＰＤＫに対する免疫ブロットは、分離および暗所での３０℃の培養によって老化が誘発されたＫ３２６およびバーレー２１のＴ１世代タバコの葉から抽出した葉のタンパク質に対して行った。老化は、植物が成熟期に達する前に最も高いＰＰＤＫ発現量を有する形質転換系統を特定し、かつ他の系統を破棄できるように誘発した。Ｋ３２６植物では、ＰＰＤＫは、３種類のＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統（Ｇ４、Ｇ８およびＧ１０）および１種類のＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ系統（Ｃ１０）において高い発現量で検出された。バーレー２１植物では、ＰＰＤＫは、４種類のＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統（Ｇ３、Ｇ７、Ｇ１５およびＧ２３）に大量に存在したが、Ｋ３２６系統に認められる程に高い発現量では存在していなかった。最も高いＰＰＤＫ発現量を有するＫ３２６およびバーレー２１のそれぞれの４種類の系統をさらなる全ての分析のために使用した。ほぼ例外なくＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統のみに最も高いＰＰＤＫ発現量が観察されたため、イントロンがＰＰＤＫ発現に対してプラスの効果を有していると思われる。
【０１３０】
図６を参照すると、以下のように、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ−Ｋ３２６およびバーレー２１タバコ系統の選択が示されている：
（ｂ）形質転換Ｋ３２６系統を選択するためのＰＰＤＫ免疫ブロット。老化は、分離および暗所での３０℃で３日間の培養によって６週齢の植物の緑葉において誘発された。タンパク質を抽出し、免疫ブロット分析に供して、より高濃度のＰＰＤＫを発現している系統を選択した。組み換え型トウモロコシＰＰＤＫ（５０μｇ）を陽性対照として使用した。各親のＴ０植物からの１つの子孫に関する１つの代表的な免疫ブロットが示されている。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ親系統Ｇ４、Ｇ８およびＧ１０から、および、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ系統Ｃ１０からの植物をその後の全ての分析に使用した。
（ｃ）セクション（ｂ）におけるＫ３２６に関して、形質転換バーレー２１系統を選択するためのＰＰＤＫ免疫ブロット。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ親系統Ｇ３、Ｇ７、Ｇ１５およびＧ２３からの植物をその後の全ての分析のために使用した。
【０１３１】
ＰＰＤＫに対する免疫ブロットを、野生型、ゼロコピー（陰性の分離体）、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ−Ｋ３２６、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ−Ｋ３２６およびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ−バーレー２１タバコに対して行って、ＰＰＤＫの発現の開始を測定し、かつ形質転換した植物中のＰＰＤＫの過剰発現の程度を定量化した。タンパク質は、Ｋ３２６野生型および形質転換した植物の葉１（最も古い）〜３ヵ月齢の植物の８（若い）から抽出し、ＰＰＤＫに対する免疫ブロットを行った。
【０１３２】
図７を参照すると、Ｋ３２６タバコの熟した葉におけるＰＰＤＫの過剰発現が示されている。ＰＰＤＫ発現量は免疫ブロットから計算した。データは、ゼロコピー植物の１０個の生物学的複製および各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統の４個の生物学的複製の平均として示されている。エラーバーは標準誤差を示す。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統は、ＰＰＤＫ発現量の上昇で配置されている。遺伝子型間の差は、分散分析を用いて試験した（Ｆ＝６．９９５、ｄｆ＝４、ｐ＝０．００１）。ゼロコピー植物と有意差が認められる系統は、Ｇ１０（ｐ＝０．００６）、Ｇ８（ｐ＝０．００３）およびＣ１０（ｐ＝０．０００）であった。
【０１３３】
ＰＰＤＫ発現量は、野生型植物のより古い葉の中でより高く、これは、ＰＰＤＫが、タバコならびにシロイヌナズナにおける老化中に自然に上方制御されることを示している。形質転換したＫ３２６植物では、ＰＰＤＫ発現量は同様に、より古い葉においてより高く、野生型植物において非常により高かった。また、最も高いＰＰＤＫ発現量を有する形質転換した系統のより若い葉においてＰＰＤＫ発現量はより高かった。免疫ブロットを、ゼロコピー植物（陰性の分離体）および形質転換した植物の「熟した」葉から抽出したタンパク質に対して行った。熟した葉は、収穫可能な段階にあり、かつ老化の後期段階にある葉である。ＰＰＤＫ発現量を定量化した。ＰＰＤＫ発現量は、ゼロコピー植物と比較して、全ての４種類の独立した形質転換した系統の熟した葉においてより高かった。ＳＡＧ１２プロモーターを用いる老化中のＰＰＤＫの過剰発現は、Ｋ３２６タバコでは成功していた。
【０１３４】
実施例６−形質転換したシロイヌナズナ植物の表現型分析
シロイヌナズナ植物の成長分析
図８を参照すると、シロイヌナズナにおけるＰＰＤＫｇＤＮＡの過剰発現によって、より大きなロゼットを有する植物が生産されることが明らかに示されている。播種後３、５、７および９週目に野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物を撮影した。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物は野生型よりも大きかった。ＰＰＤＫ植物と野生型植物との間に識別可能な差はなかった。
【０１３５】
ロゼットおよび生殖組織の生質量は、０．１ｍｇの単位まで、メトラー・トレドＡＢ１０４−Ｓ(Mettler Toledo AB104-S)天秤を用いて精密に測定した。ロゼット組織の乾燥質量は、Edwards Super Modulyo凍結乾燥器(Edwards Super Modulyo Freeze Dryer)を用いて一晩凍結乾燥した試料から、０．１ｍｇの単位まで精密に測定した。
【０１３６】
図９を参照すると、９週目の生殖組織の質量が示されている。より高い生殖組織質量を有するより高いＰＰＤＫ発現量を有する系統について、ＰＰＤＫに対する用量反応が観察された。総生殖組織（茎、茎生葉、花および長角果）を計量した。値は３個の生物学的複製の平均である。エラーバーは標準誤差を示す。形質転換ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統は、ＰＰＤＫ発現量の昇順で配置されている。遺伝子型間の差は分散分析を用いて試験した（Ｆ＝８．０６２、ｄｆ＝６、ｐ＝０．００１）。全てのＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統は、野生型とは有意に異なっていた（Ｇ９．４：ｐ＝０．０３１、Ｇ５．４：ｐ＝０．０００、Ｇ１９．２：ｐ＝０．０００、Ｇ１２．３：ｐ＝０．００１、Ｇ１６．１：ｐ＝０．００１）。傾向は絶対ではないが、より高いＰＰＤＫ発現量を有する系統はより高い生殖組織質量を有する傾向にあった。総植物生質量の割合としての生殖組織も計算したが、分散分析を用いて試験した場合、野生型、ΔＰＰＤＫまたはＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物では有意差は認められなかった（Ｆ＝０．５４４、ｄｆ＝６、ｐ＝０．７６７、データは示さない）。
【０１３７】
しかし、総植物質量の割合としての生殖組織の比率は変化せず、これは、植物は全体としてより大きく、かつ栄養組織と生殖組織との資源分配は変化しないことを示唆していた。ΔＰＰＤＫ植物における総植物生質量および生殖組織質量も測定したが、野生型とは有意差は認められなかった。ロゼットの乾燥質量も測定したところ、総植物生質量および生殖組織質量に関しては、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物が野生型よりも有意に高い質量を有することが分かった。
【０１３８】
図１０を参照すると、播種後３週目から９週目までの野生型およびＳＡＧ１２−ＰＰＤｇＤＮＡ植物の総植物生質量（ロゼット＋生殖組織）が示されている。データは、野生型では３個の生物学的複製、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡでは１５個の生物学的複製（５種類の独立した系統ごとに３個の植物）の平均として示されている。エラーバーは標準誤差を示す。野生型およびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡの総植物質量は、各時点でスチューデントのt−検定を用いて比較した。ロゼット質量は、９週目では、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物の方が有意に高かった（ｐ＝０．０３２）。
【０１３９】
５週目では、ＳＡＧ１２プロモーターによるＰＰＤＫ過剰発現の開始前に、優位差は認められなかった。全ての５種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統のロゼットの乾燥質量は増加した。質量が大きくＰＰＤＫ含有量の高い系統については、ＰＰＤＫ発現量に対する用量反応が生殖組織質量に関して観察された。ロゼットの乾燥質量をΔＰＰＤＫ植物についても測定し、野生型植物とは有意差は認められなかった。
【０１４０】
シロイヌナズナの葉の表面積の測定
ロゼットの表面積は、単一の成葉の試料（通常は葉１０枚）を採取し、上記のように葉およびロゼット全体の質量を測定し、かつルーラーに並べてそれらの葉を撮影して測定した。葉の表面積は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所）を用いて測定し、ここから、ロゼット全体の表面積を計算した。
【０１４１】
ロゼットの表面積は、ＰＰＤＫ過剰発現の開始後にＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物で増加した。６週目および７週目にＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物の表面積は有意により大きかったが、８週目および９週目では、表面積は野生型とは有意差は認められなかった。表面積のこの大きい減少は、野生型と比較してＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物中の栄養分の転流が増加したことに起因していると思われた。ΔＰＰＤＫ植物の表面積は野生型植物とは有意差は認められなかった。
【０１４２】
クロロフィル濃度の測定
クロロフィル含有量は、ＣＣＭ−２００手持ち式クロロフィル計（Opti-Sciences社）を用いて、相対的な単位で測定した。
【０１４３】
シロイヌナズナの蛍光測定
ＦＶ／ＦＭ比を、Hansatech FMS2蛍光光度計を用いて測定した。葉は、測定前に一晩、製造業者によって提供されたリーフクリップ(leaf clip)を用いて暗順応させた。老化の開始が野生型植物に対してＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡまたはΔＰＰＤＫ植物において変化したか否かを判定するために、ＦＶ／ＦＭ比を測定した。ＦＶ／ＦＭは、光化学系IIの量子効率の推定値であり、光阻害が生じると減少する。クロロフィル含有量の減少が検出される前に、光合成の減少が老化の初期に生じるため、ＦＶ／ＦＭは老化の開始の有用な基準である。ＦＶ／ＦＭは、播種後（葉がＦＶ／ＦＭを測定するのに十分な程大きくなる）４週目から９週目までに経時的に測定した。野生型、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびΔＰＰＤＫ植物のＦＶ／ＦＭは、７週目に最大となり、その後減少し、これは、全ての３種類の遺伝子型において老化の開始のタイミングが同じであったことを示していた。しかし、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物のＦＶ／ＦＭは、８週目に野生型よりも有意に高く、これは、老化の後期段階における長期にわたる光合成作用を示していた。
【０１４４】
窒素含有量
窒素分析用の組織を、Edwards Super Modulyo凍結乾燥器を用いて凍結乾燥した。シロイヌナズナの葉の組織（２５ｍｇ）またはタバコの葉の組織（１００ｍｇ）を、窒素非含有秤量紙(Elementar Analysensysteme社)に包装した。推奨されている設定を用いて、Rapid N III窒素分析装置(Rapid N III Nitrogen Analyzer)（Elementar Analysensysteme社）を使用して乾燥重量の割合として窒素含有量を測定した。アスパラギン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を標準物質として使用した。葉の窒素含有量は、シロイヌナズナの野生型、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびΔＰＰＤＫ植物において、播種後３週目から９週間目までに経時的に測定した。
【０１４５】
図１１を参照すると、７週目における野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物の葉の窒素含有量が示されている。データは、野生型およびΔＰＰＤＫでは８個の生物学的複製、各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統では４個の生物学的複製の平均として示している。エラーバーは標準誤差である。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統は、ＰＰＤＫ発現量の昇順で配置されている。遺伝子型間の差は分散分析を用いて試験した（Ｆ＝６．０４７、ｄｆ＝６、ｐ＝０．０００）。ΔＰＰＤＫ植物および全てのＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統は、野生型とは有意に異なっていた（ΔＰＰＤＫ：ｐ＝０．００４、Ｇ９．４：ｐ＝０．０００、Ｇ５．４：ｐ＝０．０００、Ｇ１９．２：ｐ＝０．００１、Ｇ１２．３：ｐ＝０．００７、Ｇ１６．１：ｐ＝０．００６）。
【０１４６】
葉の窒素は、７週目以降は、野生型と比較して全ての５種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統において有意により低く、これは、老化中にＰＰＤＫ発現量が増加することによって窒素の転流効率を高めることができるという仮定を支持するものであった。ＰＰＤＫの発現および活性は、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物において６週目にピークに達し、これは、ＰＰＤＫ発現量の増加と測定可能な葉の窒素の減少との間に時間の遅れが生じたことを示唆しており、この時間の遅れは、タンパク質アミノ酸を輸送アミノ酸（アスパラギンおよびグルタミン）に変換し、かつそれらを葉から輸送するのに要する時間に起因していると思われた。
【０１４７】
シロイヌナズナ種子の分析
個々の種子の質量および窒素含有量を、野生型、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびΔＰＰＤＫシロイヌナズナ植物の種子について測定した。
【０１４８】
図１２を参照すると、野生型、ΔＰＰＤＫおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物の個々の種子の窒素含有量が示されている。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物の種子窒素含有量において有意な増加が認められた。データは、野生型およびΔＰＰＤＫでは８個の生物学的複製、各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統では４個の生物学的複製の平均として示されている。エラーバーは標準誤差である。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統は、ＰＰＤＫ発現量の昇順で配置されている。遺伝子型間の差は分散分析を用いて試験した（Ｆ＝６．７０４、ｄｆ＝６、ｐ＝０．０００）。野生型と有意差が認められる系統は、Ｇ１９．２（ｐ＝０．０００）、Ｇ１２．３（ｐ＝０．００５）およびＧ１６．１（ｐ＝０．００２）であった。より高いＰＰＤＫ発現量を有する系統は、より高い種子窒素質量を有する傾向がある。従って、個々の種子質量は、野生型に対して全ての５種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統で増加し、より高い種子質量を有するより高いＰＰＤＫ発現量を有する植物については、ＰＰＤＫ発現量に対する用量反応が観察された。各植物から収穫された全種子を計量し、野生型とＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物との間に有意差はなく、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物において種子の大きさがそのように増加したことによって総種子収穫量は損なわれなかった。
【０１４９】
シロイヌナズナの葉の組織の遊離アミノ酸含有量
葉の組織（１００ｍｇ）を、マイクロ乳棒（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を用いて、１．５ｍｌの微小遠心管中で液体窒素冷却して粉砕し、３００μｌの無菌脱イオン水を添加した。試料は、１３，０００ｒｐｍで、４℃で５分間遠心分離にかけた。タンパク質の濃度は、推奨されている手順に従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いるブラッドフォードアッセイ(Jones et al., 1989)で測定した。推奨されている手順に係って、ＥＺｆａａｓｔアミノ酸試料試験キット(EZfaast Amino Acid Sample Testing Kit)（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を用いるアミノ酸分析のために試料を調製した。１０ｍＭのギ酸アンモニウム（BDH laboratory supplies社）の５０％無菌蒸留水と５０％超高純度メタノール（Ｒｏｍｉｌ社）溶液に試料を再懸濁した。
【０１５０】
次いで、試料を、ＥＺｆａａｓｔ２５０×３．０ｍｍＡＡＡ−ＭＳカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）ならびに移動相として１０ｍＭのギ酸アンモニウム／５０％（ｖ／ｖ）無菌蒸留水および５０％（ｖ／ｖ）超高純度メタノールを用いるQ Trap LC/MS/MS（Applied Biosystems社／MDS SCIEX社）による液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）にかけた。質量分析計は、ＥＺｆａａｓｔキット(EZfaast Kit)（Ｐｈｅｍｏｎｅｎｅｘ社）で推奨されているような条件を用いて正イオンモードで使用した。結果は、付属のＡｎａｌｙｓｔソフトウェア（Applied Biosystems社／MDS SCIEX社）で分析した。
【０１５１】
総遊離アミノ酸含有量は、野生型、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびΔＰＰＤＫシロイヌナズナ植物の葉において、播種後３週目から９週目までに経時的に測定した。
【０１５２】
図１３を参照すると、ＰＰＤＫを過剰発現しているシロイヌナズナの葉の中で総遊離アミノ酸含有量が増加することが示されている。データは、野生型およびΔＰＰＤＫでは６個の生物学的複製、各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統では４個の生物学的複製の平均として示されている。エラーバーは標準誤差である。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統は、ＰＰＤＫ発現量の昇順で配置されている。全ての５種類のＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統が、野生型よりも高い総アミノ酸含有量を有するが、ばらつきが高く、かつ分散分析を用いて試験した場合、有意差は認められなかった（Ｆ＝１．３１４、ｄｆ＝６、ｐ＝０．２８９）。
【０１５３】
ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物では、葉の窒素含有量が野生型よりも有意に低くなるときと同じでかつＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物の葉の中のＰＰＤＫ発現量が最大になったときから１週間後である７週目の時点で、総遊離アミノ酸含有量は、野生型植物よりも有意に高かった。全ての５種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統で増加が生じたが、ばらつきは高く、かつ個々の系統と野生型との間に有意差は認められなかった。この増加は、この時点で、アミノ酸の排出が生じ得るよりも大きな割合でアミノ酸の産生が生じるため、アミノ酸は葉の老化中に蓄積することを示唆している。総遊離アミノ酸は、野生型と比較してΔＰＰＤＫ植物に有意差は認められなかった。
【０１５４】
輸送アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）も測定し、総遊離アミノ酸の割合として表した。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物では、輸送アミノ酸含有量は、７週目および８週目において野生型植物よりも有意に高かった。この増加は、全ての５種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ系統において生じたが、ばらつきは高く、かつ個々の系統と野生型の差は有意ではなかった。従って、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物における総遊離アミノ酸含有量の増加に加えて、輸送アミノ酸の含有量は、全体の割合として増加する。これも、グルタミンおよびアスパラギンの産生がこれらの時点において葉の排出量を上回ることを示唆し、老化中のＰＰＤＫ発現量の増加によってアミノ酸の相互転換効率が上昇し、その結果、輸送アミノ酸が産生されるという仮定を支持している。ΔＰＰＤＫ植物では、野生型に対する有意差は観察されなかった。
【０１５５】
実施例７−形質転換したタバコ植物の表現型分析
タバコの葉の窒素含有量の分析
葉の窒素含有量を、陰性の分離体およびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ−Ｋ３２６タバコの熟した葉について測定した。熟した葉は、タバコの生産のために収穫の準備ができいている葉である。４種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統のいくつかでは、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物の葉の窒素含有量は陰性の分離体植物よりも低かった。
【０１５６】
熟した葉は、タバコの生産のために収穫される段階にあるため、葉の窒素含有量を測定するために使用した。しかし、熟した葉における葉の窒素含有量にほとんど差がなかったという事実は、必ずしも窒素の転流が増加しなかったことを暗示しているわけではない。老化しているＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡシロイヌナズナ植物の時間的経過において、葉の窒素含有量は野生型よりも有意に低かったが、老化の後半までにその差は非常により小さくなった。従って、タバコの葉の窒素含有量における差は老化の初期に生じ、葉の窒素含有量を測定するときまでに差が減少するという可能性がある。
【０１５７】
タバコの葉のアミノ酸含有量の分析
分離および暗所での３０℃で３日間の培養によって老化が誘発されたＫ３２６タバコの成葉についてアミノ酸含有量を測定した。これによって、老化の誘発の前後で同じ葉を比較することができた。葉の分離および暗所での培養による老化の誘発は、重複が最大である年齢に関連する老化による遺伝子発現パターンを示す。
【０１５８】
Ｋ３２６タバコでは、陰性の分離体植物およびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物における老化の誘発後に総アミノ酸含有量が増加した。この増加は、老化の誘発前の総アミノ酸含有量の割合として計算した。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統Ｃ１０については、この増加は、陰性の分離体植物よりも有意に小さかったが、他のＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統はどれも陰性の分離体植物に対して有意差を示さなかった。従って、老化中のＰＰＤＫの過剰発現は、暗所で誘発された老化の誘発後の総アミノ酸含有量にほとんど影響を与えることはないと思われた。老化の誘発後に、Ｋ３２６タバコについて、輸送アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）含有量も増加したが、この増加は、陰性の分離体およびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統において生じ、老化の誘発後の増加の程度において遺伝子型間に有意差はなかった。
【０１５９】
タバコの種子の分析
全ての４種類の独立した形質転換系統について、個々の種子の質量をＫ３２６タバコについて測定し、陰性の分離体植物と比較して、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ植物の方が有意に高かった。莢あたりの種子の質量も測定し、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ植物の方が有意に高かった。
【０１６０】
図１４を参照すると、種子の大きさがＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ−Ｋ３２６タバコで増加することが示されている。Ｋ３２６ゼロコピー（ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ挿入断片の陰性の分離体である植物）およびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物の個々の種子の質量は、約１０００個の種子を撮影、計数および計量して計算した。データは、ゼロコピー植物では１０個の生物学的複製、各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統では４個の生物学的複製の平均として示されている。エラーバーは標準誤差である。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統は、熟した葉におけるＰＰＤＫ発現量の昇順で配置されている。種子の質量はＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物の方が高い。遺伝子型間の差は分散分析を用いて試験した（Ｆ＝４．８７０、ｄｆ＝４、ｐ＝０．００６）。ゼロコピー植物との有意差が認められる系統は、Ｇ８（ｐ＝０．００５）およびＣ１０（ｐ＝０．００２）であった。
【０１６１】
種子の窒素含有量の割合は、全ての４種類の独立したＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ系統の方が高かったが、有意差は認められなかった。しかし、種子あたりの窒素の質量は、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ植物の方が有意に高かった。
【０１６２】
図１５を参照すると、種子の窒素含有量がＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ−Ｋ３２６タバコで増加することが明らかに示されている。Ｋ３２６ゼロコピーおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物の個々の種子中の窒素の質量は、種子の質量および窒素含有量のデータから計算した。データは、ゼロコピー植物では１０個の生物学的複製、各ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫでは４個の生物学的複製の平均として示されている。エラーバーは標準誤差である。ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ系統は、熟した葉におけるＰＰＤＫ発現量の昇順で配置されている。個々の種子中の窒素の質量は、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ植物の方が高い。遺伝子型間の差は分散分析を用いて試験した（Ｆ＝７．８０７、ｄｆ＝４、ｐ＝０．００１）。ゼロコピー植物との有意差が認められる系統は、Ｇ８（ｐ＝０．０００）およびＣ１０（ｐ＝０．０００）であった。
【０１６３】
これは、種子への窒素の供給がＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡおよびＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｃＤＮＡ−Ｋ３２６タバコ植物で増加したことを示唆している。Ｋ３２６植物では、ＰＰＤＫに対する用量反応が観察された。熟した葉のＰＰＤＫ発現量がより高い植物は、種子の個々の種子の質量がより大きく、莢あたりの種子の質量がより高く、かつ個々の種子中の窒素の質量が増加していた。ＰＰＤＫ含有量の増加が種子への窒素の供給の増加と関係があるように思われるため、この結果は窒素の転流におけるＰＰＤＫの役割を強く支持するものである。
【０１６４】
要約すると、ＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ−Ｋ３２６タバコでは、個々の種子の質量（図１４）および種子あたりの窒素の質量（図１５）はどちらも増加し、この結果は、ＰＰＤＫの過剰発現によって窒素の転流が増加したことを示唆していた。従って、シロイヌナズナＳＡＧ１２−ＰＰＤＫｇＤＮＡ植物に関しては、老化している葉の輸送アミノ酸含有量の増加が期待される。ただし、シロイヌナズナでは、自然に老化した葉についてアミノ酸含有量を測定したが、タバコでは、葉の分離および暗所での培養によって老化を誘発した。暗所で誘発された老化と年齢に関連する老化とでは生じるプロセスが異なるため、このタバコの葉で生じているプロセスは、シロイヌナズナの葉におけるプロセスに類似している可能性は低かった。
【０１６５】
実施例８−ＰＣＫおよびＰＰＤＫを過剰発現しているシロイヌナズナ植物の世代
実施例１および２に記載されているように、ＰＣＫのコード領域およびゲノムクローンを、シロイヌナズナに形質転換されたＢＮＰ１３８００００００１バイナリーベクター中の老化関連遺伝子１２（ＳＡＧ１２）プロモーターに融合させることによって、老化中にシロイヌナズナＰＣＫ（Ａｔ４ｇ３７８７０．１）の過剰な発現が達成された。
【０１６６】
最初にＡｔＰＣＫコード配列をシロイヌナズナｃＤＮＡから単離し、ＰＰＤＫに関して実施例１に記載されているように、ＰＣＲを用いてゲノム配列をシロイヌナズナｇＤＮＡから単離した。ただし、ＰＣＲプライマーは、シロイヌナズナＡｔＰＣＫ遺伝子の開始および終止コドンを含むように設計されており、図３ａに示すその後のＢＮＰ１３８００００００１ベクターへの遺伝子の連結反応を容易にするために、表１に示すように、順方向プライマー（ＡｔＰＣＫ−ＸｂａＩ−ＦＯＲ）（配列番号２５）内にＸｂａＩ制限部位、そして逆方向プライマー（ＡｔＰＣＫ−ＳａｃＩ−ＲＥＶ）（配列番号２６）内にＳａｃＩ制限部位も含む。
【０１６７】
実施例１に従って、各ＰＣＲ反応に使用されるｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ鋳型を調製した。ＰＣＲ反応混合物は、１×ＨＦ緩衝液（ＮＥＢ社）、２ｍＭの塩化マグネシウム（ＮＥＢ社）、０．５ｍＭのｄＮＴＰ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）、１００ｎｇの鋳型（ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ）、０．５μＭの各プライマーおよび１単位のPhusion High-FidelityＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社）を含んでいた。熱循環は、９８℃で３０秒間の最初の変性工程、次いで、９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間の３５サイクル、および７２℃でコード領域に対して２分３０秒間、ゲノムクローンに対して４分３０秒間の伸長時間によって、Ｔｅｃｈｎｅサーマルサイクラーを用いて行った。最後の工程では、７２℃で１０分間の最終的な伸長を行った。
【０１６８】
これらのＰＣＲ産物によって、コード配列（ｃＤＮＡ）に対する２ｋｂのバンドおよびＰＣＫのゲノム配列に対する３．５ｋｂのバンドが得られ、これらをＰＥＧ沈殿させた。実施例１に記載されているＰＰＤＫ同様に、増幅したＤＮＡを、推奨されている手順に従って、pCR4 Blunt-TOPOベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に連結させた（平滑末端）。次いで、このプラスミドを、Library Efficiency DH5α大腸菌細胞に形質転換した。カナマイシン（５０μｇｍｌ−１）を選択的な抗生物質として使用した。陽性のコロニーを、コード領域およびゲノムクローンのためのプライマーＡｔＰＣＫ−ＸｂａＩ−ＦＯＲ（配列番号２５）およびＡｔＰＣＫ−ＳａｃＩ−ＲＥＶ（配列番号２６）を用いるコロニーＰＣＲによって選択した。陽性のコロニーを、５０μｇｍｌ−１カナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ培地において、３７℃の振盪培養器内で一晩増殖させた。
【０１６９】
プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて単離し、挿入断片の大きさを連続的な酵素制限消化によって分析した。これは、１０単位のＸｂａＩおよび１×ＸｂａＩ緩衝液によって１μｇのＤＮＡを３７℃で２時間消化し、次いで１０単位ＳａｃＩおよび１×ＳａｃＩ緩衝液を３７℃で一晩添加することによって行った。正しい挿入断片を含むプラスミドＤＮＡは、ＡｔＰＣＫ−ＸｂａＩ−ＦＯＲ／ＡｔＰＣＫ−ＳａｃＩ−ＲＥＶを用いて配列決定した。配列はＢｉｏＥｄｉｔを用いて分析し、増幅したＡｔＰＣＫコード配列およびゲノム配列はＢＬＡＳＴＸを用いて確認した。
【０１７０】
ＡｔＰＣＫコード領域およびゲノムクローンを図３ａに示すｐＢＮＰベクターに連結させるために、２種類のプラスミドをそれぞれ表す大腸菌コロニーを使用して、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンを含む２５ｍｌのＬＢ培地に植菌した。培養物は３７℃で一晩振盪させ続け、プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒプラスミドミディキット(QIAfilter plasmid midi kit)（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。ｐＢＮＰベクターは、同一の様式だが、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンを含む１００ｍｌの培養物から精製した。上述したものと同じ連続的な酵素消化を、全ての精製したプラスミドＤＮＡに対して行った。コード領域およびゲノムクローンを含むプラスミドのために３μｇのＤＮＡを消化し、ｐＢＮＰベクターのために１μｇのＤＮＡを消化した。試料はクリスタルバイオレットゲル電気泳動によって分離し、その産物はＱｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。１４．４ｋｂのｐＢＮＰベクター産物をアルカリホスファターゼで処理して自己連結反応を防止し、コード領域およびゲノムクローン挿入断片は、ＸｂａＩ／ＳａｃＩ消化を用いてｐＢＮＰベクターに連結させた。Library efficiency DH5α大腸菌細胞は２μｌの連結反応物で形質転換し、陽性のコロニーを、ＡｔＰＣＫ−ＸｂａＩ−ＦＯＲおよびＡｔＰＣＫ−ＳａｃＩ−ＲＥＶを用いるＰＣＲによってスクリーニングした。
【０１７１】
プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、所望の挿入断片を含むコロニーから抽出し、続いて、ＤＮＡを１０単位のＸｂａＩ、１５単位のＳａｃＩおよび１×ＸｂａＩ緩衝液によって３７℃で２時間消化した。期待される正しい制限酵素消化パターンを示したｐＢＮＰベクター中のコード配列およびにゲノム配列挿入断片それぞれの２つの別々のコロニーをＢＮＰ−ＳＡＧ１２ＦＷＤプライマー（配列番号９）を用いて選択および配列決定した。この配列はＢｉｏＥｄｉｔプログラムを用いて分析した。図３ｂに示すように、作製した構築物はｐＡＬＢＮＰ１（コード配列）およびｐＡＬＢＮＰ２（ゲノム配列）と命名した。
【０１７２】
５種類のホモ接合性単一挿入断片系統を作製し、ＰＣＫ特異的抗体を用いて、実施例３に記載されているような免疫ブロットによってＰＣＫの過剰発現を確認した。ポリクローナル抗血清は、ＰＣＫアミノ酸配列に対して設計された合成ペプチドを用いてウサギで産生した。この配列は、（ｉ）ＤＥＨＣＷＴＥＴＧＶＳＮＩＥＧ（配列番号２７）および（ｉｉ）ＣＶＤＬＳＲＥＫＥＰＤＩＷＮＡ（配列番号２８）であり、それらは、化学的に合成した後、ウサギに混注される前に、キーホールリンペットヘモシアニンに連結したものであった。抗体を用いて得られた結果を図１６に示す。図１６は、形質転換した植物中のＰＣＫタンパク質濃度が上昇したことを示している。
【０１７３】
ＳＡＧ１２−ＰＣＫ−ＰＰＤＫ細胞株は、単一のＳＡＧ１２−ＰＣＫ形質転換体（３）１および（１９）４を、強いＳＡＧ１２−ＰＰＤＫ過剰発現系統と交差させることによって作製した。図１７に示すように、ＰＣＫおよびＰＰＤＫの両方の濃度が上昇した植物の分析によって、ロゼットの質量が増加していることが分かった。
【０１７４】
最後に、本発明者らは仮定に縛られることを望んでいないが、図１８は、ＰＣＫおよびＰＰＤＫがどのように窒素転流に影響を与え得るかについて示す推測上の生化学的経路を示す。
【０１７５】
ＰＣＫ／ＰＰＤＫ二重構築物
本発明者らは、図３に示すＰＣＫおよびＰＰＤＫ単一構築物が、植物に形質転換されると、これらの酵素が老化した葉で過剰発現した場合に、老化した葉からの窒素の転流率の上昇、さらに栄養植物成長量の増加（作物収穫率の上昇に該当する）を引き起こすことを観察した。従って、本発明者らは、ＰＣＫおよびＰＰＤＫをコードする遺伝子がどちらもＳＡＧ１２プロモーターの制御下でｐＢＮＰ１３００００００１に挿入されている２種類の二重構築物を作製することに決めた。
【０１７６】
第１の二重構築物は、ＸｂａＩ/ＳａｃＩ消化を用いて、ＢＮＰ−ＰＰＤＫｇＤＮＡのＰＰＤＫをコードするｇＤＮＡ断片の下流（すなわち３'末端）にｇＤＮＡをコードするＰＣＫを連結させることによって作製した。従って、プラスミド内のＳＡＧ１２プロモーターは、ＰＰＤＫ遺伝子およびＰＣＫ遺伝子の両方の発現に関与した。
【０１７７】
第２の二重構築物は、ＡｖｒＩＩ／ＢａｍＨＩ消化を用いて、ｐＡＬＢＮＰ２のＰＣＫをコードするｇＤＮＡ断片のすぐ下流にＰＰＤＫをコードするｇＤＮＡを連結させることによって作製した。この場合も、ＳＡＧ１２はＰＰＤＫ遺伝子およびＰＣＫ遺伝子の両方の発現に関与した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）活性および／またはピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）活性を有する少なくとも１種のポリペプチドをコードする、少なくとも１つのコード配列に作動可能に連結された老化特異的プロモーターを含む遺伝子構築物。
【請求項２】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）活性およびピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）活性を有する少なくとも１種のポリペプチドをコードする、少なくとも１つのコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む遺伝子構築物。
【請求項３】
前記プロモーターが老化特異的プロモーターである、請求項２に記載の遺伝子構築物。
【請求項４】
前記プロモーターがシロイヌナズナ中の老化関連遺伝子から単離されたものである、請求項１乃至３いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項５】
前記プロモーターが、ＳＡＧ１２、ＳＡＧ１３、ＳＡＧ１０１、ＳＡＧ２１およびＳＡＧ１８またはその機能的な変異体もしくは断片からなる群から選択される、請求項１乃至４いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項６】
前記プロモーターがＳＡＧ１２プロモーターまたはその機能的な変異体もしくは断片である、請求項１乃至５いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項７】
前記プロモーターが、実質的に配列番号１６に示されているヌクレオチド配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含む、請求項１乃至６いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項８】
前記少なくとも１つのコード配列が、（ｉ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片および／または（ｉｉ）ピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片をコードする、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項９】
ＰＣＫ活性を有する前記ポリペプチドをコードする前記コード配列がシロイヌナズナに由来する、請求項１乃至８いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１０】
ＰＰＤＫ活性を有する前記ポリペプチドをコードする前記コード配列が、シロイヌナズナ属、トウモロコシ属、フラベリア属またはクレオメ属に由来する、請求項１乃至９いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１１】
ＰＣＫ活性を有するポリペチドをコードする前記コード配列が、実質的に配列番号１７または配列番号１８に示されている核酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含む、請求項１乃至１０いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１２】
ＰＣＫ活性を有する前記ポリペチドが、実質的に配列番号１９に示されているアミノ酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含む、請求項１乃至１１いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１３】
ＰＰＤＫ活性を有するポリペチドをコードする前記コード配列が、実質的に配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２に示されている核酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含む、請求項１乃至１２いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１４】
ＰＰＤＫ活性を有する前記ポリペチドが、実質的に配列番号２３または配列番号２４に示されているアミノ酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含む、請求項１乃至１３いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１５】
前記構築物がＰＣＫまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードしかつＰＰＤＫをコードしない、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項１６】
前記構築物がＰＰＤＫまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードし、かつＰＣＫをコードしない、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項１７】
前記構築物がＰＣＫまたはその機能的な変異体もしくは断片およびＰＰＤＫまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードする、請求項１乃至１４いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１８】
請求項１乃至１７いずれか１項に記載の遺伝子構築物を含む組み換え型ベクター。
【請求項１９】
実質的に図３に示す組み換え型ベクター。
【請求項２０】
同じ条件で培養された野生型植物中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの対応する濃度よりも試験植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度を上げる方法であって、葉の老化の開始後に植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度の上昇を達成するために前記試験植物における植物の代謝を変えることを含む方法。
【請求項２１】
同じ条件で培養された野生型植物中の対応する窒素濃度よりも試験植物の葉の中の窒素濃度を下げる方法であって、葉の老化の開始後に植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度の上昇を達成するために前記試験植物における植物の代謝を変えることを含む方法。
【請求項２２】
同じ条件で培養された野生型植物の対応する成長率と比較して試験植物の成長率を上げる方法であって、葉の老化の開始後の植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度の上昇を達成するために前記試験植物における植物の代謝を変えることを含む方法。
【請求項２３】
請求項１乃至１７いずれか１項に記載の遺伝子構築物または請求項１８または１９に記載のベクターによって試験植物の細胞を形質転換することを含む、請求項２０乃至２２いずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
同じ条件で培養された前記野生型植物中のＰＣＫおよびＰＰＤＫの対応する濃度よりも前記植物の葉の中のＰＣＫおよびＰＰＤＫの濃度を上げることを含む、請求項２０乃至２３いずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１乃至１７いずれか１項に記載の遺伝子構築物または請求項１８または１９に記載の組み換え型ベクターを含む細胞。
【請求項２６】
請求項１乃至１７いずれか１項に記載の遺伝子構築物または請求項１８または１９に記載の組み換え型ベクターを含む形質転換植物。
【請求項２７】
前記植物はアブラナ科に由来する、請求項２６に記載の形質転換植物。
【請求項２８】
前記植物はイネ科に由来する、請求項２６に記載の形質転換植物。
【請求項２９】
前記植物はナス科に由来する、請求項２６に記載の形質転換植物。
【請求項３０】
請求項２６乃至２９いずれか１項に記載の形質転換植物から入手可能な植物繁用製品。
【請求項３１】
前記植物繁殖用製品が種子である、請求項３０に記載の植物繁殖用製品。
【請求項３２】
同じ条件で培養された対応する野生型植物よりも高い割合で窒素を転流させる形質転換植物を生産する方法であって、
ｉ）請求項１乃至１７いずれか１項に記載の遺伝子構築物または請求項１８または１９に記載のベクターによって植物細胞を形質転換する工程と、
ｉｉ）前記形質転換した細胞から植物を再生させる工程と、
を含む方法。
【請求項３３】
同じ条件で培養された対応する野生型植物よりも高い成長率を有する形質転換植物を生産する方法であって、
ｉ）請求項１乃至１７いずれか１項に記載の遺伝子構築物または請求項１８または１９に記載のベクターによって植物細胞を形質転換する工程と、
ｉｉ）前記形質転換した細胞から植物を再生させる工程と、
を含む方法。
【請求項３４】
同じ条件で栽培された野生型植物から採取した、収穫された葉の中の対応する窒素濃度よりも低濃度の窒素を含有する収穫された葉であって、前記葉が、請求項２６乃至２９いずれか１項に記載の形質転換植物から収穫されたものまたは請求項３２または３３に記載の方法によって生産されたものである収穫された葉。
【請求項３５】
変異型タバコ植物から得られた、窒素が減少したタバコを含む喫煙物品であって、前記変異体が老化した葉の中の窒素濃度を下げることができる喫煙物品。
【請求項３６】
前記喫煙物品が、請求項１乃至１７いずれか１項に記載の遺伝子構築物または請求項１８または１９に記載のベクターをによって形質転換されている変異型タバコ植物から得られたタバコから製造されている、請求項３５に記載の喫煙物品。
【請求項１】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）活性および／またはピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）活性を有する少なくとも１種のポリペプチドをコードする、少なくとも１つのコード配列に作動可能に連結された老化特異的プロモーターを含む遺伝子構築物。
【請求項２】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）活性およびピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）活性を有する少なくとも１種のポリペプチドをコードする、少なくとも１つのコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む遺伝子構築物。
【請求項３】
前記プロモーターが老化特異的プロモーターである、請求項２に記載の遺伝子構築物。
【請求項４】
前記プロモーターがシロイヌナズナ中の老化関連遺伝子から単離されたものである、請求項１乃至３いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項５】
前記プロモーターが、ＳＡＧ１２、ＳＡＧ１３、ＳＡＧ１０１、ＳＡＧ２１およびＳＡＧ１８またはその機能的な変異体もしくは断片からなる群から選択される、請求項１乃至４いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項６】
前記プロモーターがＳＡＧ１２プロモーターまたはその機能的な変異体もしくは断片である、請求項１乃至５いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項７】
前記プロモーターが、実質的に配列番号１６に示されているヌクレオチド配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含む、請求項１乃至６いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項８】
前記少なくとも１つのコード配列が、（ｉ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片および／または（ｉｉ）ピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）またはその機能的な変異体もしくは断片をコードする、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項９】
ＰＣＫ活性を有する前記ポリペプチドをコードする前記コード配列がシロイヌナズナに由来する、請求項１乃至８いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１０】
ＰＰＤＫ活性を有する前記ポリペプチドをコードする前記コード配列が、シロイヌナズナ属、トウモロコシ属、フラベリア属またはクレオメ属に由来する、請求項１乃至９いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１１】
ＰＣＫ活性を有するポリペチドをコードする前記コード配列が、実質的に配列番号１７または配列番号１８に示されている核酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含む、請求項１乃至１０いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１２】
ＰＣＫ活性を有する前記ポリペチドが、実質的に配列番号１９に示されているアミノ酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含む、請求項１乃至１１いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１３】
ＰＰＤＫ活性を有するポリペチドをコードする前記コード配列が、実質的に配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２に示されている核酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含む、請求項１乃至１２いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１４】
ＰＰＤＫ活性を有する前記ポリペチドが、実質的に配列番号２３または配列番号２４に示されているアミノ酸配列またはその機能的な変異体もしくは断片を含む、請求項１乃至１３いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１５】
前記構築物がＰＣＫまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードしかつＰＰＤＫをコードしない、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項１６】
前記構築物がＰＰＤＫまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードし、かつＰＣＫをコードしない、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項１７】
前記構築物がＰＣＫまたはその機能的な変異体もしくは断片およびＰＰＤＫまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードする、請求項１乃至１４いずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１８】
請求項１乃至１７いずれか１項に記載の遺伝子構築物を含む組み換え型ベクター。
【請求項１９】
実質的に図３に示す組み換え型ベクター。
【請求項２０】
同じ条件で培養された野生型植物中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの対応する濃度よりも試験植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度を上げる方法であって、葉の老化の開始後に植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度の上昇を達成するために前記試験植物における植物の代謝を変えることを含む方法。
【請求項２１】
同じ条件で培養された野生型植物中の対応する窒素濃度よりも試験植物の葉の中の窒素濃度を下げる方法であって、葉の老化の開始後に植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度の上昇を達成するために前記試験植物における植物の代謝を変えることを含む方法。
【請求項２２】
同じ条件で培養された野生型植物の対応する成長率と比較して試験植物の成長率を上げる方法であって、葉の老化の開始後の植物の葉の中のＰＣＫおよび／またはＰＰＤＫの濃度の上昇を達成するために前記試験植物における植物の代謝を変えることを含む方法。
【請求項２３】
請求項１乃至１７いずれか１項に記載の遺伝子構築物または請求項１８または１９に記載のベクターによって試験植物の細胞を形質転換することを含む、請求項２０乃至２２いずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
同じ条件で培養された前記野生型植物中のＰＣＫおよびＰＰＤＫの対応する濃度よりも前記植物の葉の中のＰＣＫおよびＰＰＤＫの濃度を上げることを含む、請求項２０乃至２３いずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１乃至１７いずれか１項に記載の遺伝子構築物または請求項１８または１９に記載の組み換え型ベクターを含む細胞。
【請求項２６】
請求項１乃至１７いずれか１項に記載の遺伝子構築物または請求項１８または１９に記載の組み換え型ベクターを含む形質転換植物。
【請求項２７】
前記植物はアブラナ科に由来する、請求項２６に記載の形質転換植物。
【請求項２８】
前記植物はイネ科に由来する、請求項２６に記載の形質転換植物。
【請求項２９】
前記植物はナス科に由来する、請求項２６に記載の形質転換植物。
【請求項３０】
請求項２６乃至２９いずれか１項に記載の形質転換植物から入手可能な植物繁用製品。
【請求項３１】
前記植物繁殖用製品が種子である、請求項３０に記載の植物繁殖用製品。
【請求項３２】
同じ条件で培養された対応する野生型植物よりも高い割合で窒素を転流させる形質転換植物を生産する方法であって、
ｉ）請求項１乃至１７いずれか１項に記載の遺伝子構築物または請求項１８または１９に記載のベクターによって植物細胞を形質転換する工程と、
ｉｉ）前記形質転換した細胞から植物を再生させる工程と、
を含む方法。
【請求項３３】
同じ条件で培養された対応する野生型植物よりも高い成長率を有する形質転換植物を生産する方法であって、
ｉ）請求項１乃至１７いずれか１項に記載の遺伝子構築物または請求項１８または１９に記載のベクターによって植物細胞を形質転換する工程と、
ｉｉ）前記形質転換した細胞から植物を再生させる工程と、
を含む方法。
【請求項３４】
同じ条件で栽培された野生型植物から採取した、収穫された葉の中の対応する窒素濃度よりも低濃度の窒素を含有する収穫された葉であって、前記葉が、請求項２６乃至２９いずれか１項に記載の形質転換植物から収穫されたものまたは請求項３２または３３に記載の方法によって生産されたものである収穫された葉。
【請求項３５】
変異型タバコ植物から得られた、窒素が減少したタバコを含む喫煙物品であって、前記変異体が老化した葉の中の窒素濃度を下げることができる喫煙物品。
【請求項３６】
前記喫煙物品が、請求項１乃至１７いずれか１項に記載の遺伝子構築物または請求項１８または１９に記載のベクターをによって形質転換されている変異型タバコ植物から得られたタバコから製造されている、請求項３５に記載の喫煙物品。
【図１】
【図２ａ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２ｂ】
【図２ａ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２ｂ】
【公表番号】特表２０１２−５１８９９５（Ｐ２０１２−５１８９９５Ａ）
【公表日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５１５２８（Ｐ２０１１−５５１５２８）
【出願日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５０３２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９７６２３
【国際公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【出願人】（３０１００４８５７）アドヴァンスト・テクノロジーズ（ケンブリッジ）リミテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５０３２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９７６２３
【国際公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【出願人】（３０１００４８５７）アドヴァンスト・テクノロジーズ（ケンブリッジ）リミテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
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