ホップ葉抽出物およびその製造方法
【課題】新規なホップ葉抽出物およびその製造方法を提供する。
【解決手段】本発明のホップ葉抽出物は、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）の葉から水またはアルコールにより抽出したものであり、例えば、ホップの葉に溶媒として水またはアルコールを添加してホップの葉の成分を溶媒に抽出した後（ステップＳ１０１）、ホップの葉を分離して除去する（ステップＳ１０２）ことにより得られる。このホップ葉抽出物は、ヒト由来白血病細胞株Ｕ９３７に対する抗がん作用、アンジオテンシン変換酵素に対する阻害作用、または、抗酸化能を有している。
【解決手段】本発明のホップ葉抽出物は、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）の葉から水またはアルコールにより抽出したものであり、例えば、ホップの葉に溶媒として水またはアルコールを添加してホップの葉の成分を溶媒に抽出した後（ステップＳ１０１）、ホップの葉を分離して除去する（ステップＳ１０２）ことにより得られる。このホップ葉抽出物は、ヒト由来白血病細胞株Ｕ９３７に対する抗がん作用、アンジオテンシン変換酵素に対する阻害作用、または、抗酸化能を有している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホップの葉から抽出したホップ葉抽出物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホップ（学名：Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）は、アサ科の多年草で、雌雄異株の蔓性植物である。ホップの球花（毬花）は、従来より、ビールの原料として用いられており、苦味、香り、泡の要素であり、また、雑菌の繁殖を抑制して保存性を高める働きがある。更に、ホップの球花は、生薬としても健胃・鎮静効果があるとされ、またハーブの一種としてヨーロッパでは民間薬として用いられてきた。球花には、苦味成分や香り成分の他、キサントフモール、イソキサントフモール、8-プレニルナリンゲニンといった機能性を持つ物質が多く含まれていことが報告されており、エストロゲン様作用による更年期障害の改善作用やイソフムロンの肥満予防効果、ホップフラボノールに花粉症症状を軽減する効果などが示されている。このように、球花の機能性物質や芳香成分に関する研究は多くの蓄積がある。
【０００３】
一方で、ホップの葉は特に苦味や芳香がないため、これまでほとんど利用されることなく落葉しているのが現状であり、成分や機能性の研究も行われていない。なお、出願人は、ホップの葉の利用を促進するために、ホップの葉と球花とを混合して用いたホップ茶を開発した（特許文献１参照）が、更なる利用の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特願２００９−２５５４６８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような問題に基づきなされたものであり、ホップの葉の利用を図るために、新規なホップ葉抽出物およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のホップ葉抽出物は、ホップの葉から水またはアルコールにより抽出したものである。
【０００７】
本発明のホップ葉抽出物の製造方法は、ホップの葉に溶媒として水またはアルコールを添加してホップの葉の成分を溶媒に抽出した後、ホップの葉を分離して除去するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のホップ葉抽出物によれば、ヒト由来白血病細胞株Ｕ９３７に対する抗がん作用、アンジオテンシン変換酵素に対する阻害作用、または、抗酸化能を有することができる。
【０００９】
本発明のホップ葉抽出物の製造方法によれば、容易に本発明のホップ葉抽出物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施の形態に係るホップ葉抽出物の製造方法を表す流れ図である。
【図２】本発明のホップ葉抽出物の抗がん作用を表すグラフであり、添加したホップ葉抽出物の濃度と吸光度との関係を表している。
【図３】本発明のホップ葉抽出物によるヒト白血病細胞株Ｕ９３７のＤＮＡ断片化の解析結果を表すものである。
【図４】本発明のホップ葉抽出物を精製した各画分の抗がん作用を表すグラフであり、添加した各画分の濃度と吸光度との関係を表している。
【図５】本発明のホップ葉抽出物のアンジオテンシン変換酵素に対する阻害作用を表すグラフであり、添加したホップ葉抽出物の濃度とアンジオテンシン変換酵素の活性を表す蛍光強度との関係を表している。
【図６】本発明のホップ葉抽出物を精製した各画分のアンジオテンシン変換酵素に対する阻害作用を表すグラフであり、添加した各画分の濃度とＡＣＥ活性との関係を表している。
【図７】本発明のホップ葉抽出物の抗酸化能を表すグラフであり、添加したホップ葉抽出物の濃度と吸光度との関係を表している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。
【００１２】
図１は、本発明の一実施の形態に係るホップ葉抽出物の製造方法の流れを表すものである。本発明の一実施の形態に係るホップ葉抽出物は、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）の葉から水またはアルコールにより抽出したものであり、例えば、ホップの葉に溶媒として水またはアルコールを添加してホップの葉の成分を溶媒に抽出した後（ステップＳ１０１）、ホップの葉を分離して除去する（ステップＳ１０２）ことにより得られる。
【００１３】
ホップの葉はそのまま用いてもよく、必要に応じて、細かく切断して用いてもよい。ホップの葉の成分の抽出は、例えば、ホップの葉と溶媒との混合物を適宜撹拌することにより行い、時間は３０分から３時間程度行うことが好ましい。また、溶媒は常温でも加熱してもよく、加熱する場合には、加熱したものを添加してもよく、添加した後、抽出時に加熱するようにしてもよい。ホップの葉の分離除去は、例えば、ホップの葉と溶媒との混合物を必要に応じて遠心分離し、その上層を濾過し、濾過物を回収することにより行う。更に、遠心分離した下層に溶媒を加え、撹拌した後、遠心分離して、その上層を濾過し、その濾過物を回収するようにしてもよい。
【００１４】
ホップの葉を分離除去したのち、乾燥させて溶媒を除去して粉末化してもよいし、濃縮して濃縮エキスとしてもよいし、または、粉末化したものを溶媒に溶解して濃縮エキスとしてもよい（ステップＳ１０３）。乾燥は、凍結乾燥、減圧乾固、またはスプレードライヤーによるなどのどのような方法でもよい。また、必要に応じて、溶媒を乾燥または濃縮した後、または、ホップの葉を分離除去した後に乾燥または濃縮する前に、精製するようにしてもよい（ステップＳ１０４）。
【００１５】
このホップ葉抽出物は、ヒト由来白血病細胞株Ｕ９３７に対する抗がん作用、アンジオテンシン変換酵素に対する阻害作用、または、抗酸化能を有している。抗がん作用については、アポトーシス誘導による細胞死であり、がん細胞に選択的に作用する。よって、このホップ葉抽出物は、様々な食品に添加して用いることができ、抗がん剤または健康食品素材として広く利用することができる。
【実施例】
【００１６】
（実施例１−１，１−２，１−３）
粉末状にしたホップの葉８．０ｇに溶媒１００ｍｌを添加して、６０分間撹拌することにより、溶媒にホップの葉の成分を抽出した（ステップＳ１０１）。溶媒には、実施例１−１では熱水（常温の水を添加して６０分間撹拌後に１００℃で１０分間加熱）を用い、実施例１−２では７０％エタノール（７０％（v/v）のエタノール水溶液）を用い、実施例１−３では１００％メタノールを用いた。次いで、ホップの葉と溶媒との混合物を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上層を濾過し、濾過物を回収することにより、ホップの葉を分離除去した（ステップＳ１０２）。また、遠心分離した下層に１００ｍｌの溶媒を加え、３０分間スターラーバーで回したものを同様に遠心分離し、上層を濾過して濾過物を回収し、先の濾過物に加えた。溶媒には、抽出で用いたものと同一種類のものを用いた。続いて、実施例１−１では凍結乾燥、実施例１−２，１−３では減圧乾固により溶媒を乾燥除去して粉末化したのち、抽出で用いた溶媒と同一種類の溶媒を加えて０．１ｇ／ｍｌの濃縮エキスとした（ステップＳ１０３）。これにより実施例１−１，１−２，１−３についてそれぞれホップ葉抽出物が得られた。実施例１−１は水によるホップ葉抽出物、実施例１−２はエタノールによるホップ葉抽出物、実施例１−３はメタノールによるホップ葉抽出物である。
【００１７】
（実施例２）
得られたホップ葉抽出物について、抗がん作用を検討した。がん細胞にはヒト由来の白血病細胞株Ｕ９３７を用いた。培養には、ＲＰＭＩ１６４０を基礎培地として用い、１０％（v/v）ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）、１２ｍｌ １０％ＮａＨＣＯ３、５ｍｌ ０．０３ｇ／ｍｌＬ−グルタミン酸、１００μｇ／ｍｌペニシリン、ストレプトマイシンを添加し、３７℃・５％ＣＯ２の条件の下で培養した。培地は３日に１回希釈して継代した。
【００１８】
ヒト白血病細胞で毒性測定を行う際には、まずヒト白血病細胞株Ｕ９３７を回収し、細胞数を５．５５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌにして９６ ウェル マイクロプレート（ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）に９０μｌずつ添加後、３７℃・５％ＣＯ２の条件の下で２４時間培養した。培養後、実施例１−１，１−２，１−３のホップ葉抽出物を個別に１０μｌずつ添加し、更に同条件下で４８時間培養した。その際、ホップ葉抽出物の濃度を２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、または１５０μｇ／ｍｌと変化させて、個別に添加した。培養後、１０μｌ／ｗｅｌｌのＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（Ｗａｋｏ)を添加し、３０秒撹拌して、４時間後の６５５ｎｍを対照波長とした４５０ｎｍ吸光度（４５０ｎｍ／６５５ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を用い測定した。得られた結果を図２に示す。
【００１９】
図２では、吸光度が小さくなるほどホップ葉抽出物による抗がん作用によりがん細胞の数が少なくなっていることを意味している。一般に、天然物の粗抽出物では、抗がん活性が高いものは１００μｇ／ｍｌの濃度で細胞が死滅する。図２に示したように、本実施例によれば、実施例１−３のメタノールによるホップ葉抽出物で高い抗がん活性が得られ、実施例１−２のエタノールによるホップ葉抽出物でも抗がん活性が得られることが分かった。
【００２０】
また、細胞死には一般にプログラム細胞死であるアポトーシスと、一般毒性によるネクローシスとが知られている。アポトーシス誘導による細胞死はガン細胞に選択性が高く、抗ガン剤やガン予防食品に利用することができる。アポトーシスの特徴は、核萎縮によるアポトーシス小体の形成と、それに伴ったＤＮＡエンドヌクレアーゼによるＤＮＡの断片化である。そこで、本実施例による抗がん作用がアポトーシスであるか否かを調べた。
【００２１】
上述と同様にして培養したヒト白血病細胞株Ｕ９３７に実施例１−３のメタノールによるホップ葉抽出物（濃度２００μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃・５％ＣＯ２の条件の下で４時間または２４時間培養した。また、ネガティブコントロールとして、メタノールによるホップ葉抽出物に代えて溶媒であるメタノールのみを添加したものを同様の条件下で４時間培養した（未処理）。更に、ポジティブコントロールとして、メタノールによるホップ葉抽出物に代えてアポトーシス誘導性の抗がん剤であるエトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）を添加したものを同様の条件下で４時間培養した。培養後、それぞれについて細胞を回収し、ＤＮＡを抽出後、３％アガロースゲルで電気泳動を行い、ゲルをＥｔＢｒで染色後、泳動パターンであるＵＶ照射下の蛍光をＤｏｌｐｈｉｎ−Ｃｈｅｍ（クラボウ）で解析した。その結果を図３に示す。
【００２２】
図３に示したように、本実施例のメタノールによるホップ葉抽出物を添加した場合、４時間ではネガティブコントロール（溶媒であるメタノールのみを添加した未処理のもの）と同様に蛍光が見られないが、２４時間処理するとポジティブコントロール（エトポシドを添加したもの）と同様に蛍光が見られた。すなわち、本実施例のメタノールによるホップ葉抽出物で処理した細胞は２４時間でＤＮＡ断片化が起こることが分かった。以上より、メタノールによるホップ葉抽出物によるヒト白血病細胞株Ｕ９３７の細胞死はアポトーシスであることが分かった。
【００２３】
更に、メタノールによるホップ葉抽出物を逆相カラムＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０により精製した。具体的には、粉末化したメタノールによるホップ葉抽出物を３０％メタノール（３０％（v/v）のメタノール水溶液）に溶解してカラムに流し、未吸着の画分を画分１、５０％メタノール（５０％（v/v）のメタノール水溶液）で溶出した画分を画分２、７５％メタノール（７５％（v/v）のメタノール水溶液）で溶出した画分を画分３、１００％メタノールで溶出した画分を画分４、クロロホルムで溶出した画分を画分５とした。
【００２４】
得られた各画分について、上述と同様にしてヒト白血病細胞株Ｕ９３７に対する抗がん作用を調べた。得られた結果を図４に示す。図４に示したように、画分２について高い抗がん活性が見られた。すなわち、抗ガン作用を持つ成分は、画分２に濃縮されることが分かった。
【００２５】
（実施例３）
得られたホップ葉抽出物について、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に対する阻害作用を検討した。ＡＣＥは不活性型のアンジオテンシンＩを活性型のアンジオテンシIIに変換する酵素であり、アンジオテンシンIIが血圧上昇に働くホルモンとして作用する。この変換酵素を阻害することで、血圧の上昇を抑制することができる。
【００２６】
測定にはウサギ肺由来のＡＣＥを用い、基質にはヒプリル−ヒスチジル−ロイシン（Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）を用いた。実施例１−１，１−２，１−３のホップ葉抽出物の濃度を変化させて個別に添加し、１時間反応させた後、０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を加えて反応を停止した。酵素反応で生成したヒスチジル−ロイシン（Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）をｏ−フタルアルデヒドと反応させて蛍光誘導体化し、励起波長３５５ｎｍ、放出波長４６０ｎｍでの蛍光強度を測定した。得られた結果を図５に示す。
【００２７】
図５では、蛍光強度が小さいほど酵素反応で生成したヒスチジル−ロイシン（Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）が少なく、ＡＣＥが阻害されていることを意味している。本実施例によれば、いずれも高い阻害作用を有することが分かった。
【００２８】
また、実施例１−１の水によるホップ葉抽出物および実施例１−３のメタノールによるホップ葉抽出物について、逆相カラムＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０により精製した。具体的には、粉末化したホップ葉抽出物を３０％メタノール（３０％（v/v）のメタノール水溶液）に溶解してカラムに流し、未吸着の画分を画分１、５０％メタノール（５０％（v/v）のメタノール水溶液）で溶出した画分を画分２、７５％メタノール（７５％（v/v）のメタノール水溶液）で溶出した画分を画分３、１００％メタノールで溶出した画分を画分４、クロロホルムで溶出した画分を画分５とした。
【００２９】
得られた実施例１−１の水によるホップ葉抽出物および実施例１−３のメタノールによるホップ葉抽出物の各画分について、上述と同様にしてＡＣＥに対する阻害作用を調べた。得られた結果を図６に示す。図６において、（Ａ）は水によるホップ葉抽出物の結果であり、（Ｂ）はメタノールによるホップ葉抽出物の結果である。縦軸のＡＣＥ活性は、ホップ葉抽出物を添加していない時の蛍光強度に対する各蛍光強度の割合である。図６（Ａ）に示したように、水によるホップ葉抽出物では、ＡＣＥ阻害作用を有する成分は、画分１、画分２および画分３に分散して濃縮された。すなわち、水溶性の極性の高いＡＣＥ阻害成分は、ホップ葉に複数種類含有されていることが分かった。また、図６（Ｂ）に示したように、メタノールによるホップ葉抽出物では、ＡＣＥ阻害作用を有する成分は、画分２に濃縮されることが分かった。
【００３０】
（実施例４）
得られたホップ葉抽出物について、ＤＰＰＨ（１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）を用いて抗酸化能を検討した。まず、１００μＭのＤＰＰＨをエタノールに溶解したエタノール溶液を１ｍｌとり、そこに実施例１−１，１−２，１−３のホップ葉抽出物の濃度を変化させて２０μｌずつ個別に加えて撹拌し、室温、暗所で３０分間放置した。その後、分光光度計で５１７ｎｍの吸光度を測定し、ＤＰＰＨラジカルの減少を測定した。得られた結果を図７に示す。
【００３１】
図７では、吸光度が小さくなるほどＤＰＰＨラジカルが減少し、ホップ葉抽出物による抗酸化能が強いことを意味している。本実施例によれば、いずれも抗酸化能を有し、特に、実施例１−２のエタノールによるホップ葉抽出物および実施例１−３のメタノールについて強い抗酸化能が見られた。
【００３２】
以上、実施の形態を挙げて本発明を説明したが、本発明は上記実施の形態に限定されるものではなく、種々変形可能である。例えば、上記実施の形態ではホップ葉抽出物の製造方法について具体的に説明したが、全ての工程を含んでいなくてもよく、また、他の工程を含んでいてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
抗がん剤または健康食品素材として広く利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホップの葉から抽出したホップ葉抽出物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホップ（学名：Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）は、アサ科の多年草で、雌雄異株の蔓性植物である。ホップの球花（毬花）は、従来より、ビールの原料として用いられており、苦味、香り、泡の要素であり、また、雑菌の繁殖を抑制して保存性を高める働きがある。更に、ホップの球花は、生薬としても健胃・鎮静効果があるとされ、またハーブの一種としてヨーロッパでは民間薬として用いられてきた。球花には、苦味成分や香り成分の他、キサントフモール、イソキサントフモール、8-プレニルナリンゲニンといった機能性を持つ物質が多く含まれていことが報告されており、エストロゲン様作用による更年期障害の改善作用やイソフムロンの肥満予防効果、ホップフラボノールに花粉症症状を軽減する効果などが示されている。このように、球花の機能性物質や芳香成分に関する研究は多くの蓄積がある。
【０００３】
一方で、ホップの葉は特に苦味や芳香がないため、これまでほとんど利用されることなく落葉しているのが現状であり、成分や機能性の研究も行われていない。なお、出願人は、ホップの葉の利用を促進するために、ホップの葉と球花とを混合して用いたホップ茶を開発した（特許文献１参照）が、更なる利用の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特願２００９−２５５４６８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような問題に基づきなされたものであり、ホップの葉の利用を図るために、新規なホップ葉抽出物およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のホップ葉抽出物は、ホップの葉から水またはアルコールにより抽出したものである。
【０００７】
本発明のホップ葉抽出物の製造方法は、ホップの葉に溶媒として水またはアルコールを添加してホップの葉の成分を溶媒に抽出した後、ホップの葉を分離して除去するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のホップ葉抽出物によれば、ヒト由来白血病細胞株Ｕ９３７に対する抗がん作用、アンジオテンシン変換酵素に対する阻害作用、または、抗酸化能を有することができる。
【０００９】
本発明のホップ葉抽出物の製造方法によれば、容易に本発明のホップ葉抽出物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施の形態に係るホップ葉抽出物の製造方法を表す流れ図である。
【図２】本発明のホップ葉抽出物の抗がん作用を表すグラフであり、添加したホップ葉抽出物の濃度と吸光度との関係を表している。
【図３】本発明のホップ葉抽出物によるヒト白血病細胞株Ｕ９３７のＤＮＡ断片化の解析結果を表すものである。
【図４】本発明のホップ葉抽出物を精製した各画分の抗がん作用を表すグラフであり、添加した各画分の濃度と吸光度との関係を表している。
【図５】本発明のホップ葉抽出物のアンジオテンシン変換酵素に対する阻害作用を表すグラフであり、添加したホップ葉抽出物の濃度とアンジオテンシン変換酵素の活性を表す蛍光強度との関係を表している。
【図６】本発明のホップ葉抽出物を精製した各画分のアンジオテンシン変換酵素に対する阻害作用を表すグラフであり、添加した各画分の濃度とＡＣＥ活性との関係を表している。
【図７】本発明のホップ葉抽出物の抗酸化能を表すグラフであり、添加したホップ葉抽出物の濃度と吸光度との関係を表している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。
【００１２】
図１は、本発明の一実施の形態に係るホップ葉抽出物の製造方法の流れを表すものである。本発明の一実施の形態に係るホップ葉抽出物は、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）の葉から水またはアルコールにより抽出したものであり、例えば、ホップの葉に溶媒として水またはアルコールを添加してホップの葉の成分を溶媒に抽出した後（ステップＳ１０１）、ホップの葉を分離して除去する（ステップＳ１０２）ことにより得られる。
【００１３】
ホップの葉はそのまま用いてもよく、必要に応じて、細かく切断して用いてもよい。ホップの葉の成分の抽出は、例えば、ホップの葉と溶媒との混合物を適宜撹拌することにより行い、時間は３０分から３時間程度行うことが好ましい。また、溶媒は常温でも加熱してもよく、加熱する場合には、加熱したものを添加してもよく、添加した後、抽出時に加熱するようにしてもよい。ホップの葉の分離除去は、例えば、ホップの葉と溶媒との混合物を必要に応じて遠心分離し、その上層を濾過し、濾過物を回収することにより行う。更に、遠心分離した下層に溶媒を加え、撹拌した後、遠心分離して、その上層を濾過し、その濾過物を回収するようにしてもよい。
【００１４】
ホップの葉を分離除去したのち、乾燥させて溶媒を除去して粉末化してもよいし、濃縮して濃縮エキスとしてもよいし、または、粉末化したものを溶媒に溶解して濃縮エキスとしてもよい（ステップＳ１０３）。乾燥は、凍結乾燥、減圧乾固、またはスプレードライヤーによるなどのどのような方法でもよい。また、必要に応じて、溶媒を乾燥または濃縮した後、または、ホップの葉を分離除去した後に乾燥または濃縮する前に、精製するようにしてもよい（ステップＳ１０４）。
【００１５】
このホップ葉抽出物は、ヒト由来白血病細胞株Ｕ９３７に対する抗がん作用、アンジオテンシン変換酵素に対する阻害作用、または、抗酸化能を有している。抗がん作用については、アポトーシス誘導による細胞死であり、がん細胞に選択的に作用する。よって、このホップ葉抽出物は、様々な食品に添加して用いることができ、抗がん剤または健康食品素材として広く利用することができる。
【実施例】
【００１６】
（実施例１−１，１−２，１−３）
粉末状にしたホップの葉８．０ｇに溶媒１００ｍｌを添加して、６０分間撹拌することにより、溶媒にホップの葉の成分を抽出した（ステップＳ１０１）。溶媒には、実施例１−１では熱水（常温の水を添加して６０分間撹拌後に１００℃で１０分間加熱）を用い、実施例１−２では７０％エタノール（７０％（v/v）のエタノール水溶液）を用い、実施例１−３では１００％メタノールを用いた。次いで、ホップの葉と溶媒との混合物を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上層を濾過し、濾過物を回収することにより、ホップの葉を分離除去した（ステップＳ１０２）。また、遠心分離した下層に１００ｍｌの溶媒を加え、３０分間スターラーバーで回したものを同様に遠心分離し、上層を濾過して濾過物を回収し、先の濾過物に加えた。溶媒には、抽出で用いたものと同一種類のものを用いた。続いて、実施例１−１では凍結乾燥、実施例１−２，１−３では減圧乾固により溶媒を乾燥除去して粉末化したのち、抽出で用いた溶媒と同一種類の溶媒を加えて０．１ｇ／ｍｌの濃縮エキスとした（ステップＳ１０３）。これにより実施例１−１，１−２，１−３についてそれぞれホップ葉抽出物が得られた。実施例１−１は水によるホップ葉抽出物、実施例１−２はエタノールによるホップ葉抽出物、実施例１−３はメタノールによるホップ葉抽出物である。
【００１７】
（実施例２）
得られたホップ葉抽出物について、抗がん作用を検討した。がん細胞にはヒト由来の白血病細胞株Ｕ９３７を用いた。培養には、ＲＰＭＩ１６４０を基礎培地として用い、１０％（v/v）ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）、１２ｍｌ １０％ＮａＨＣＯ３、５ｍｌ ０．０３ｇ／ｍｌＬ−グルタミン酸、１００μｇ／ｍｌペニシリン、ストレプトマイシンを添加し、３７℃・５％ＣＯ２の条件の下で培養した。培地は３日に１回希釈して継代した。
【００１８】
ヒト白血病細胞で毒性測定を行う際には、まずヒト白血病細胞株Ｕ９３７を回収し、細胞数を５．５５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌにして９６ ウェル マイクロプレート（ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）に９０μｌずつ添加後、３７℃・５％ＣＯ２の条件の下で２４時間培養した。培養後、実施例１−１，１−２，１−３のホップ葉抽出物を個別に１０μｌずつ添加し、更に同条件下で４８時間培養した。その際、ホップ葉抽出物の濃度を２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、または１５０μｇ／ｍｌと変化させて、個別に添加した。培養後、１０μｌ／ｗｅｌｌのＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（Ｗａｋｏ)を添加し、３０秒撹拌して、４時間後の６５５ｎｍを対照波長とした４５０ｎｍ吸光度（４５０ｎｍ／６５５ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を用い測定した。得られた結果を図２に示す。
【００１９】
図２では、吸光度が小さくなるほどホップ葉抽出物による抗がん作用によりがん細胞の数が少なくなっていることを意味している。一般に、天然物の粗抽出物では、抗がん活性が高いものは１００μｇ／ｍｌの濃度で細胞が死滅する。図２に示したように、本実施例によれば、実施例１−３のメタノールによるホップ葉抽出物で高い抗がん活性が得られ、実施例１−２のエタノールによるホップ葉抽出物でも抗がん活性が得られることが分かった。
【００２０】
また、細胞死には一般にプログラム細胞死であるアポトーシスと、一般毒性によるネクローシスとが知られている。アポトーシス誘導による細胞死はガン細胞に選択性が高く、抗ガン剤やガン予防食品に利用することができる。アポトーシスの特徴は、核萎縮によるアポトーシス小体の形成と、それに伴ったＤＮＡエンドヌクレアーゼによるＤＮＡの断片化である。そこで、本実施例による抗がん作用がアポトーシスであるか否かを調べた。
【００２１】
上述と同様にして培養したヒト白血病細胞株Ｕ９３７に実施例１−３のメタノールによるホップ葉抽出物（濃度２００μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃・５％ＣＯ２の条件の下で４時間または２４時間培養した。また、ネガティブコントロールとして、メタノールによるホップ葉抽出物に代えて溶媒であるメタノールのみを添加したものを同様の条件下で４時間培養した（未処理）。更に、ポジティブコントロールとして、メタノールによるホップ葉抽出物に代えてアポトーシス誘導性の抗がん剤であるエトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）を添加したものを同様の条件下で４時間培養した。培養後、それぞれについて細胞を回収し、ＤＮＡを抽出後、３％アガロースゲルで電気泳動を行い、ゲルをＥｔＢｒで染色後、泳動パターンであるＵＶ照射下の蛍光をＤｏｌｐｈｉｎ−Ｃｈｅｍ（クラボウ）で解析した。その結果を図３に示す。
【００２２】
図３に示したように、本実施例のメタノールによるホップ葉抽出物を添加した場合、４時間ではネガティブコントロール（溶媒であるメタノールのみを添加した未処理のもの）と同様に蛍光が見られないが、２４時間処理するとポジティブコントロール（エトポシドを添加したもの）と同様に蛍光が見られた。すなわち、本実施例のメタノールによるホップ葉抽出物で処理した細胞は２４時間でＤＮＡ断片化が起こることが分かった。以上より、メタノールによるホップ葉抽出物によるヒト白血病細胞株Ｕ９３７の細胞死はアポトーシスであることが分かった。
【００２３】
更に、メタノールによるホップ葉抽出物を逆相カラムＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０により精製した。具体的には、粉末化したメタノールによるホップ葉抽出物を３０％メタノール（３０％（v/v）のメタノール水溶液）に溶解してカラムに流し、未吸着の画分を画分１、５０％メタノール（５０％（v/v）のメタノール水溶液）で溶出した画分を画分２、７５％メタノール（７５％（v/v）のメタノール水溶液）で溶出した画分を画分３、１００％メタノールで溶出した画分を画分４、クロロホルムで溶出した画分を画分５とした。
【００２４】
得られた各画分について、上述と同様にしてヒト白血病細胞株Ｕ９３７に対する抗がん作用を調べた。得られた結果を図４に示す。図４に示したように、画分２について高い抗がん活性が見られた。すなわち、抗ガン作用を持つ成分は、画分２に濃縮されることが分かった。
【００２５】
（実施例３）
得られたホップ葉抽出物について、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に対する阻害作用を検討した。ＡＣＥは不活性型のアンジオテンシンＩを活性型のアンジオテンシIIに変換する酵素であり、アンジオテンシンIIが血圧上昇に働くホルモンとして作用する。この変換酵素を阻害することで、血圧の上昇を抑制することができる。
【００２６】
測定にはウサギ肺由来のＡＣＥを用い、基質にはヒプリル−ヒスチジル−ロイシン（Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）を用いた。実施例１−１，１−２，１−３のホップ葉抽出物の濃度を変化させて個別に添加し、１時間反応させた後、０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を加えて反応を停止した。酵素反応で生成したヒスチジル−ロイシン（Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）をｏ−フタルアルデヒドと反応させて蛍光誘導体化し、励起波長３５５ｎｍ、放出波長４６０ｎｍでの蛍光強度を測定した。得られた結果を図５に示す。
【００２７】
図５では、蛍光強度が小さいほど酵素反応で生成したヒスチジル−ロイシン（Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）が少なく、ＡＣＥが阻害されていることを意味している。本実施例によれば、いずれも高い阻害作用を有することが分かった。
【００２８】
また、実施例１−１の水によるホップ葉抽出物および実施例１−３のメタノールによるホップ葉抽出物について、逆相カラムＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０により精製した。具体的には、粉末化したホップ葉抽出物を３０％メタノール（３０％（v/v）のメタノール水溶液）に溶解してカラムに流し、未吸着の画分を画分１、５０％メタノール（５０％（v/v）のメタノール水溶液）で溶出した画分を画分２、７５％メタノール（７５％（v/v）のメタノール水溶液）で溶出した画分を画分３、１００％メタノールで溶出した画分を画分４、クロロホルムで溶出した画分を画分５とした。
【００２９】
得られた実施例１−１の水によるホップ葉抽出物および実施例１−３のメタノールによるホップ葉抽出物の各画分について、上述と同様にしてＡＣＥに対する阻害作用を調べた。得られた結果を図６に示す。図６において、（Ａ）は水によるホップ葉抽出物の結果であり、（Ｂ）はメタノールによるホップ葉抽出物の結果である。縦軸のＡＣＥ活性は、ホップ葉抽出物を添加していない時の蛍光強度に対する各蛍光強度の割合である。図６（Ａ）に示したように、水によるホップ葉抽出物では、ＡＣＥ阻害作用を有する成分は、画分１、画分２および画分３に分散して濃縮された。すなわち、水溶性の極性の高いＡＣＥ阻害成分は、ホップ葉に複数種類含有されていることが分かった。また、図６（Ｂ）に示したように、メタノールによるホップ葉抽出物では、ＡＣＥ阻害作用を有する成分は、画分２に濃縮されることが分かった。
【００３０】
（実施例４）
得られたホップ葉抽出物について、ＤＰＰＨ（１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）を用いて抗酸化能を検討した。まず、１００μＭのＤＰＰＨをエタノールに溶解したエタノール溶液を１ｍｌとり、そこに実施例１−１，１−２，１−３のホップ葉抽出物の濃度を変化させて２０μｌずつ個別に加えて撹拌し、室温、暗所で３０分間放置した。その後、分光光度計で５１７ｎｍの吸光度を測定し、ＤＰＰＨラジカルの減少を測定した。得られた結果を図７に示す。
【００３１】
図７では、吸光度が小さくなるほどＤＰＰＨラジカルが減少し、ホップ葉抽出物による抗酸化能が強いことを意味している。本実施例によれば、いずれも抗酸化能を有し、特に、実施例１−２のエタノールによるホップ葉抽出物および実施例１−３のメタノールについて強い抗酸化能が見られた。
【００３２】
以上、実施の形態を挙げて本発明を説明したが、本発明は上記実施の形態に限定されるものではなく、種々変形可能である。例えば、上記実施の形態ではホップ葉抽出物の製造方法について具体的に説明したが、全ての工程を含んでいなくてもよく、また、他の工程を含んでいてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
抗がん剤または健康食品素材として広く利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）の葉から水またはアルコールにより抽出したことを特徴とするホップ葉抽出物。
【請求項２】
ヒト由来白血病細胞株Ｕ９３７に対する抗がん作用、アンジオテンシン変換酵素に対する阻害作用、または、抗酸化能を有することを特徴とする請求項１記載のホップ葉抽出物。
【請求項３】
ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）の葉に溶媒として水またはアルコールを添加してホップの葉の成分を溶媒に抽出した後、ホップの葉を分離して除去することを特徴とするホップ葉抽出物の製造方法。
【請求項１】
ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）の葉から水またはアルコールにより抽出したことを特徴とするホップ葉抽出物。
【請求項２】
ヒト由来白血病細胞株Ｕ９３７に対する抗がん作用、アンジオテンシン変換酵素に対する阻害作用、または、抗酸化能を有することを特徴とする請求項１記載のホップ葉抽出物。
【請求項３】
ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）の葉に溶媒として水またはアルコールを添加してホップの葉の成分を溶媒に抽出した後、ホップの葉を分離して除去することを特徴とするホップ葉抽出物の製造方法。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１５３６５９（Ｐ２０１２−１５３６５９Ａ）
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４８１０（Ｐ２０１１−１４８１０）
【出願日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【出願人】（５０４４０９５４３）国立大学法人秋田大学 (210)
【出願人】（５０８２５５１７１）株式会社大雄振興公社 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【出願人】（５０４４０９５４３）国立大学法人秋田大学 (210)
【出願人】（５０８２５５１７１）株式会社大雄振興公社 (4)
【Ｆターム（参考）】
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