ホモシステインをアッセイするための方法および組成物
本発明は概して、ホモシステイン検出の分野に関連する。特に、本発明は、サンプル中のホモシステイン存在またはホモシステイン濃度を決定するための方法であって、その方法は以下：Ｈｃｙ変換生成物およびＨｃｙ補基質変換生成物を形成するために、Ｈｃｙ変換反応中で、Ｈｃｙを含むサンプルまたはＨｃｙを含むと推測されるサンプルと、Ｈｃｙ補基質およびＨｃｙ変換酵素とを接触させる工程；ならびに上記サンプル中のＨｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために上記Ｈｃｙ補基質変換生成物を評価する工程を包含する方法を提供する。同じ原理に基づいてホモシステインをアッセイするためのキットもまた、提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願番号６０／４８６，８６５（２００３年７月１０日出願）、および米国特許出願番号１０／８０１，６２３（２００４年３月１５日出願）の優先権の利益を主張し、その内容は、その全てが参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は概して、ホモシステイン検出の分野に関連する。特に、本発明は、サンプル中のホモシステイン（Ｈｃｙ）の、存在または濃度を決定するための方法を提供し、そのサンプルにおいて、ホモシステインは、Ｈｃｙ変換酵素によって触媒されるＨｃｙ変換反応中で、Ｈｃｙ補基質と反応し、Ｈｃｙ変換生成物およびＨｃｙ補基質変換生成物を形成し、そしてそのＨｃｙ補基質変換生成物は、そのサンプル中のＨｃｙの、存在および／または濃度を決定するために評価される。同じ原理に基づいてホモシステインをアッセイするためのキットもまた、提供される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
体液（例えば、血漿または血清）中のホモシステインの総濃度は、疾患に対する重要なマーカーである。例えば、ホモシステイン定量は、心血管疾患に対する重要なリスク指標であり得、コバラミン欠乏症および葉酸欠乏症の感応性マーカーであり得、そしてホモシスチン尿症として公知である代謝における先天性異常の診断に使用され得る。ホモシステイン定量はまた、妊婦における出生異常の評価および高齢者における認知障害の評価において有用であると報告されてきた。Ｆｒａｎｔｚｅｎら、Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｔｏｔａｌ Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ｏｒ Ｓｅｒｕｍ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４：２，３１１−３１６（１９９８）を参照のこと。
【０００４】
ホモシステイン（Ｈｃｙ）は、Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチル基転移反応の間に、メチオニンから形成されるチオール含有アミノ酸である。細胞内Ｈｃｙは、メチオニンに再メチル化され、またはシステインを形成する一連の反応において不可逆的に異化される。細胞内Ｈｃｙは、細胞外液（例えば、血液および尿）に拡散され、そして大部分は酸化型で循環し、そして主に血漿タンパク質に結合される（Ｒｅｆｓｕｍら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４９：３１−６２（１９９８））。血漿中および尿中におけるＨｃｙの量は、Ｈｃｙ生成とＨｃｙ利用との間のバランスを反映する。このバランスは、Ｈｃｙトランス硫化（ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）ならびにＨｃｙ再メチル化（例えば、シスタチオニンβ−シンターゼおよびＮ５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素、またはＨｃｙ代謝に関連したビタミン（例えば、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２および葉酸）の栄養失調（Ｂａｕａｌら、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６４：５４３−５４９（１９９７））に関する酵素の遺伝病によって特徴付けられる臨床状態によって乱され得る。さらに、血漿Ｈｃｙレベルはまた、癌の治療または関節炎の治療のために使用される抗葉酸薬物（例えば、メトトレキサート）のようないくつかの医薬品によって乱され得る（Ｆｏｏｄｙら、Ｃｌｉｎｉｃｉａｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ，８：２０３−２１０（１９９８））。
【０００５】
ホモシステイン血症の重篤な症例は、Ｈｃｙ代謝に関連した酵素をコードする遺伝子におけるホモ接合性欠失によって引き起こされる。そのような症例において、Ｈｃｙ再メチル化またはＨｃｙトランス硫化のいずれかに関連した酵素における欠失は、血液中のＨｃｙおよび尿中のＨｃｙの５０倍程度の上昇をもたらす。そのような疾患（先天性ホモシステイン血症（Ｈｃｙｅｍｉａ））の標準的形態は、シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）をコードする遺伝子におけるホモ接合性欠損によって引き起こされる。これらの患者は、脳卒中、心筋梗塞、腎血管性高血圧症、間欠性跛行、腸間膜虚血、および肺塞栓症を生じる若年期における血栓塞栓性合併症を被る。そのような患者はまた、精神遅滞、ならびに水晶体転位症および骨格変形に類似する他の異常を示す（Ｐｅｒｒｙ Ｔ．，Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｓｐｅｃｔｓ ｉｎ Ｎｙｈａｍ Ｗ．Ｌ．ｅｄ．Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ｐｐ．４１９−４５１（１９７４））。妊婦において上昇したＨｃｙレベルは、神経細管閉鎖（ｎｅｕｒｏｔｕｂｅ ｃｌｏｓｕｒｅ）を伴う、子供の出生時欠損に関係することも知られている（Ｇｒａｈａｍ，Ｉ．，Ｒｅｆｓｕｍ，Ｈ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｉ．Ｈ．，およびＵｒｅｌａｎｄ Ｐ．Ｍ．編「Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：ｆｒｏｍ ｂａｓｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ」Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．１３３−１３６（１９９５）中のＳｃｏｔｔら「Ｔｈｅ ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｄｅｆｅｃｔｓ」）。従って、そのＨｃｙ決定の診断的有用性は、これらの臨床条件で良く実証されてきた。
【０００６】
軽度または中程度に上昇したＨｃｙのレベルでさえも、冠状動脈、大脳動脈、末梢性動脈のアテローム硬化症のリスク、ならびに心血管の疾患のリスクを増加することが実証されてきた（Ｂｏｕｓｈｅｙら、ＪＡＭＡ，２７４：１０４９−１０５７（１９９５））。先天性ホモシステイン血症の罹患率は、それぞれ、脳血管疾患の患者間で４２％、末梢血管疾患の患者間で２８％、および心血管疾患間で３０％であることが示された（Ｍｏｇｈａｄａｓｉａｎら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１５７：２２９９−２３０７（１９９７））。２７の臨床研究のメタ分析は、それぞれのＨｃｙレベルにおける５μＭの増加が、冠動脈疾患のリスクを、男性においては６０％増加し、女性においては８０％増加すると計算し、そのことは血漿コレステロールの２０ｍｇ／ｄｌ−１（０．５ｍｍｏｌ／ｄｌ−１）の増加と等価であり、Ｈｃｙが、リスク因子として、一般的集団においてコレステロールと同程度強いことを示唆する。これらの臨床研究の結果は、高ホモシステイン血症が、心血管疾患について新たに独立のリスク因子を出現させ、そして高ホモシステイン血症は、はっきりした心血管リスク因子（例えば、高血圧症、高コレステロール血症、喫煙、糖尿病、著しい肥満および運動不足）のいずれかを有さない全ての心血管患者の半分を説明し得ると結論付けた。
【０００７】
軽度ホモシステイン血症は主に、ヘテロ接合性の酵素欠損によって引き起こされる。メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素についての遺伝子における一般的な多型は、葉酸欠損に対するホモシステインレベルの感受性に影響するようである（Ｂｏｅｒｓら、Ｊ．Ｉｎｈｅｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．，２０：３０１−３０６（１９９７））。さらに、血漿ホモシステインレベルはまた、心臓移植患者および腎臓移植患者（Ｕｅｌａｎｄら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１１４：４７３−５０１（１９８９））、アルツハイマー病患者（Ｊａｃｏｂｓｅｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４４：２２３８−２２３９（１９９８））、ならびに非インスリン依存性糖尿病の患者（Ｄｕｃｌｏｕｘら、Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｌ，１３：２８９０−２８９３（１９９８））において有意に増加される。心血管疾患によって上昇したホモシステインに関連する証拠の蓄積は、血管疾患の進行の、妨害または停止における血漿Ｈｃｙの低下の有効性を実証するための、二重盲検の無作為化された、かつプラセボ制御された多施設臨床試験の開始を促進した（Ｄｉａｚ−Ａｒｒａｓｔｉａら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５５：１４０７−１４０８（１９９８））。血漿ホモシステインレベルの決定は、一般的な臨床診療であるべきである。
【０００８】
心血管疾患におけるリスク因子として、全血漿Ｈｃｙレベル（還元型、酸化型およびタンパク質結合型）の決定は、臨床環境において推奨されてきた（Ｈｏｒｎｂｅｒｇｅｒら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ．ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，８８：６１−６７（１９９８））。１９８２年以来、全血漿Ｈｃｙを決定するためのいくつかの方法が、記載されてきた（Ｍａｎｓｏｏｒら、Ａｎａｌ．ＢｉｏＣｈｅｍ．，２００：２１８−２２９（１９９２；Ｓｔｅｉｒら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１５８：１３０１−１３０６（１９９８）；Ｕｅｌａｎｄら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３９：１７６４−１７７９（１９９３）；およびＦｒａｎｃｉｓ，Ｒ．Ｂ．Ｊｒ．編Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，ａｎｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｏｋｋｅｒ，ｐｐ．１８３−２３６（１９９２）中のＵｅｌａｎｄら「Ｐｌａｓｍａ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ」；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｒ．Ｂ．Ｊｒ．編Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，ａｎｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｏｋｋｅｒ，ｐｐ．１８３−２３６（１９９２）中のＵｅｌａｎｄら「Ｐｌａｓｍａ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ」も参照のこと）。血漿中または血清中の全Ｈｃｙのアッセイは、７０％の血漿Ｈｃｙがタンパク質結合型であり、そして２０％〜３０％の血漿Ｈｃｙが、非対称またはほぼ非対称に混合したジスルフィドとして存在するという事実によって困難にされる。遊離した還元型Ｈｃｙは、微量にしか存在しない（Ｓｔｅｈｏｕｗｅｒら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，５５３０８−３１４（１９９９））。
【０００９】
上記方法のほとんどは、直接的または間接的（例えば、次にＨＰＬＣ分離またはＴＬＣ分離される、ＳＡＨ加水分解酵素によるＨｃｙのＳＡＨ（Ｓ−アデノシルホモシステイン）への酵素的変換）に、Ｈｃｙを測定するために、高度なクロマトグラフ技術（例えば、ＨＰＬＣ、キャピラリーガスクロマトグラフィー、または質量分析（ＧＣ／ＭＳ））を必要とする。ＴＬＣ分離前のＳＡＨ加水分解酵素によるＨｃｙの放射標識ＳＡＨへの放射酵素的変換がまた、使用されてきた。これらのアッセイにおいて、クロマトグラフ分離は、実施するのに、多くの場合、時間が掛かりかつ扱いにくいが、一般的にこれらの方法の重要な工程である。さらに詳しくは、これらの方法は、高度に特化し、かつ高機能化した装置、ならびによく訓練された分析の専門家を必要とする。そのような装置の使用は概して、汎用的な臨床実験室での実施においてはあまり受け入れられない。
【００１０】
ＳＡＨに対するモノクローナル抗体を使用するＨｃｙについてのイムノアッセイ（Ａｒａｋｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，４２２：４３−５２（１９８７））はまた、公知である。これらのアッセイは、ＨｃｙのＳＡＨへの変換に基づき、次にモノクローナル抗体によって検出される、アルブミン結合Ｈｃｙに対するモノクローナル抗体は、全血漿Ｈｃｙの主要な画分であるアルブミン結合Ｈｃｙの決定のために開発された（Ｓｔａｂｌｅｒら、Ｊ，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１：４６６−４７４（１９８８））。他の免疫学的プロトコルもまた、利用可能である（例えば、米国特許番号第５，６３１，１２７号、同第５，８２７，６４５号、同第５，９５８，７１７号、同第６，０６３，５８１号、および同第５，８８５，７６７号を参照のこと）。イムノアッセイは、時間の掛かるクロマトグラフ分離工程を回避し、そして自動化に適用しやすいが、モノクローナル抗体の生成は高価であり、いくぶん予測不可能であり、そして多くの場合、検出のために、２次抗体または３次抗体さえも必要とする。最近、ホモシステインアッセイのための酵素的方法が、報告されており（Ｍａｔｓｕｙａｍａら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７：２１５５−２１５６（２００１）；Ｔａｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９：１０２９−１０３０（２００３）；米国特許第５，８８５，７６７号、同第５，９９８，１９１号、同第６，０４６，０１７号、同第６，１７４，６９６号、同第６，４３６，６５８号および同第６，６６４，０７３Ｂ１号）、これらの全ては、ホモシステイン変換酵素によって産生されるホモシステイン変換生成物の評価に基づいたホモシステインアッセイを記載する。
【００１１】
サンプル中のホモシステインを決定するための他の方法は、米国特許第６，６８６，１７２号および米国特許出願公開番号２００２／０１１９５０７に記載される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
高度に熟練した人員または複雑な分析化学装置を必要とせずに実施し得る、効率的かつ正確なアッセイが必要とされてきた。本発明は、当該分野に関して、上述および他の関連することに焦点をあてる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の簡単な要旨）
１つの局面において、本発明は、サンプル中のホモシステインについてのアッセイに関する。このアッセイによって、ホモシステイン（Ｈｃｙ）を含むサンプルまたはＨｃｙを含むと推測されるサンプルは、Ｈｃｙ変換生成物およびＨｃｙ補基質変換生成物を形成するＨｃｙ変換反応中で、Ｈｃｙ補基質およびＨｃｙ変換酵素と接触され；そして上記Ｈｃｙ補基質変換生成物は、上記サンプル中のＨｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために評価される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態において、上記Ｈｃｙ補基質変換生成物は、クロマトグラフ分離なしで評価される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、上記Ｈｃｙ補基質はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であり、上記Ｈｃｙ変換酵素はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素であり、上記Ｈｃｙ変換生成物はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、および上記Ｈｃｙ補基質変換生成物はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）であり、そして上記ＳＡＨは、上記サンプル中のＨｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために評価される。
【００１６】
上記ＳＡＭは、任意の適切な形態で使用され得る。例えば、上記ＳＡＭは、上記サンプルに直接添加される。別の例において、上記ＳＡＭは、さらなる反応によって生成される（例えば、ＳＡＭシンターゼによって、ＡＴＰおよびＭｅｔから生成される）。
【００１７】
上記ＳＡＨは、Ｈｃｙおよびアデノシン（Ａｄｏ）に変換され得、そしてＡｄｏは、上記サンプル中のＨｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために評価される。いくつかの実施形態において、上記ＳＡＨは、ＳＡＭからＨｃｙを産生するためにＳＡＨ加水分解酵素と接触され、そのＳＡＭは、ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素によって上記Ｈｃｙ変換反応中に循環され、Ｈｃｙ補基質ベースの酵素循環反応系、およびアデノシン（Ａｄｏ）を形成し、上記アデノシンは、上記サンプル中の上記Ｈｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために評価される。
【００１８】
上記Ａｄｏは、当該分野で公知の適切な方法のいずれか（例えば、免疫学的方法または酵素的方法）によって評価され得る。上記Ａｄｏは、直接的または間接的に評価され得る。例えば、上記Ａｄｏは、アデノシン変換酵素によるアデノシン変換の、補基質または反応生成物を評価することによって、間接的に評価され得る。いくつかの実施形態において、上記アデノシン変換酵素は、アデノシンキナーゼであり、そしてその反応生成物は、アデノシン５’−一リン酸である。他の実施形態において、上記アデノシン変換酵素は、アデノシンデアミナーゼであり、そしてその反応生成物は、アンモニウムおよびイノシンである。
【００１９】
１つの局面において、本発明は、サンプル中のホモシステイン（Ｈｃｙ）をアッセイするための方法に関し、その方法は、以下：ａ）Ｈｃｙ変換生成物およびＨｃｙ補基質変換生成物を形成するために、Ｈｃｙ変換反応中で、Ｈｃｙを含むサンプルまたはＨｃｙを含むと推測されるサンプルと、Ｈｃｙ補基質およびＨｃｙ変換酵素とを接触させる工程であって、上記Ｈｃｙ補基質はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であり、上記Ｈｃｙ変換酵素はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素であり、上記Ｈｃｙ変換生成物はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、および上記Ｈｃｙ補基質変換生成物はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）である、工程、ならびにｂ）上記サンプル中のＨｃｙの、存在、非存在および量を決定するために上記ＳＡＨを評価する工程であって、そのＳＡＨが、クロマトグラフ分離せずに評価される、工程を包含する。
【００２０】
上記ＳＡＭは、任意の適切な形態で使用され得る。例えば、上記ＳＡＭは、上記サンプルに直接添加される。別の例において、上記ＳＡＭは、さらなる反応によって生成される（例えば、ＳＡＭシンターゼによってＡＴＰおよびＭｅｔから生成される）。
【００２１】
上記ＳＡＨは、当該分野で公知の適切な方法のいずれか例えば、免疫学的方法または酵素的方法）によって評価され得る。例えば、ＳＡＨは、ＳＡＨと変異体ＳＡＨ結合酵素（例えば、Ｈｃｙ、ＳＡＨまたはアデノシンに対する結合親和性を有するが、触媒活性が弱力化された変異体ＳＡＨ加水分解酵素）との間の結合を評価する工程によって評価され得る。１つの例において、上記ＳＡＨの評価は、Ｈ２Ｏ２を産生する酵素反応およびＨ２Ｏ２の検出に関連しない。
【００２２】
別の例において、上記ＳＡＨは、そのＳＡＨに特異的に結合する抗体を使用することによって評価され得る。上記抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。上記抗体はまた、キャリアーマトリックスに結合され得る。任意の適切なイムノアッセイ型式（例えば、サンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）アッセイ型式および競合アッセイ型式）は、使用され得る。
【００２３】
本発明の方法は、任意のサンプル（体液または生物学的組織を含むがこれらに限定されない）中の、ホモシステインをアッセイするために使用され得る。上記体液は、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞、痰、脳脊髄液、涙液、粘液および羊水からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態において、上記体液は血液である。いくつかの実施形態において、上記血液サンプルはさらに、血漿画分または血清画分に分離される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、上記サンプルと、上記Ｈｃｙ補基質および上記Ｈｃｙ変換酵素との間の接触の前、またはその接触と同時に、そのサンプル中の酸化型Ｈｃｙまたは結合型Ｈｃｙは、還元型Ｈｃｙに変換される。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、そのサンプル中で遊離型ホモシステインを生成するのに適切な量の、ジチオスレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）または他の還元剤による処置に供される。
【００２５】
本発明の方法はさらに、上記サンプルと、上記Ｈｃｙ補基質および上記Ｈｃｙ変換酵素とが接触する工程の前、またはその工程と同時に、酸化型Ｈｃｙまたは結合型Ｈｃｙを還元型Ｈｃｙに変換するために使用される上記還元剤を除去する工程を包含し得る。例えば、上記還元剤は、Ｎ−エチルマレイミドの添加、または他のチオール還元化合物の添加によって除去され得る。
【００２６】
本発明のさらに別の局面は、サンプル中のホモシステインの、存在または濃度を決定するためのキットに関し、そのキットは、以下：ａ）Ｈｃｙ変換酵素；ｂ）Ｈｃｙ補基質；そしてｃ）Ｈｃｙ補基質変換生成物を評価するための試薬を備える。
【００２７】
いくつかの実施形態において、上記Ｈｃｙ補基質はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であり、上記Ｈｃｙ変換酵素はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素であり、上記Ｈｃｙ補基質変換生成物はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）であり、そして上記Ｈｃｙ補基質変換生成物を評価するための試薬はＳＡＨを評価するための試薬である。いくつかの実施形態において、上記キットはさらに、Ｈｃｙ補基質ベースの酵素循環反応系、およびアデノシン（Ａｄｏ）を形成するために、ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素によって、上記Ｈｃｙ変換反応中に循環されるＳＡＭからＨｃｙを産生するための試薬（例えば、ＳＡＨ加水分解酵素）を含む。
【００２８】
本発明はまた、サンプル中のＨｃｙをアッセイするためのキットを提供し、そのキットは、以下：ａ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素；ｂ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）またはＡＴＰ、ＭｅｔおよびＳＡＭシンターゼ；ｃ）ＳＡＨ加水分解酵素；ならびにｄ）アデノシン（Ａｄｏ）を評価するための試薬を備える。上記Ａｄｏを評価するための試薬は、上記ＳＡＨ加水分解酵素（例えば、アデノシンキナーゼおよびアデノシンデアミナーゼ）以外のアデノシン変換酵素であり得る。
【００２９】
本発明はまた、サンプル中のＨｃｙをアッセイするためのキットを提供し、そのキットは、以下：ａ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素；ｂ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）またはＡＴＰ、ＭｅｔおよびＳＡＭシンターゼ；ならびにｃ）ＳＡＨを評価するための試薬を備え、ここでそのキットは、Ｈ２Ｏ２を産生するための酵素または試薬、およびＨ２Ｏ２を検出するための試薬を備えない。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明のキットはさらに、還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはＴＣＥＰ）を備える。
【００３１】
本発明のキットは、任意の適切なパッケージ中にあり得、そしてまた、本明細書中に記載される方法を実施するための説明書を備え得る。上記キットは、必要に応じて、緩衝液のようなさらなる構成要素を備え得る。
【００３２】
本明細書に記載されたアッセイは、任意の適切な目的（例えば、予防目的、診断目的、薬物スクリーニング目的または処置モニタリング目的）のために使用され得る。上記アッセイは、容易に自動化され得る。さらに、上記アッセイは、治療システムおよび在宅検査キットの点での使用に適応され得る。例えば、治療システムに関する血液検査は、本明細書中で提供される方法を使用するホモシステインレベルの測定に適用され得る。在宅検査キットはまた、本明細書中で提供される方法を用いる使用に適合され得る。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
限定のためではなく開示の明瞭性のために、発明の詳細な説明は、以下の小節に分割される。
【００３４】
（Ａ．定義）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての、技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって、通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中で参照される全ての、特許、出願、公開された出願および他の刊行物は、その全てが参考として援用される。この節に示された定義が、本明細書中で参考として援用される、特許、出願、公開された出願および他の刊行物に示された定義に、反するかまたは矛盾する場合、この節に示された定義は、本明細書中に参考として援用される定義より優先する。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」または「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味する。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「ホモシステイン（Ｈｃｙ）」は、以下の分子式：ＨＳＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨを有する化合物を称する。生物学的に、Ｈｃｙは、メチオニンの脱メチル化によって生成され、そしてＨｃｙは、メチオニン由来のシステインの生合成における中間体である。用語「Ｈｃｙ」は、遊離型Ｈｃｙ（還元型形態である）および結合型Ｈｃｙ（酸化型形態である）を包含する。Ｈｃｙは、タンパク質、ペプチド、Ｈｃｙ自体または他のチオールと、ジスルフィド結合を介して結合し得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「ホモシステイン（Ｈｃｙ）変換反応」は、反応生成物を形成するために化学基（例えば、メチル基）が、化合物からＨｃｙ分子に転移される間に、上記化合物が上記Ｈｃｙ分子と反応する反応を称する。上記Ｈｃｙ分子と反応し、そして上記化学基を提供する化合物は、「ホモシステイン（Ｈｃｙ）補基質」と称される。上記反応を触媒する酵素は、「ホモシステイン（Ｈｃｙ）変換酵素」と称される。最初のＨｃｙ分子の、全部または一部を含む反応生成物は、「ホモシステイン（Ｈｃｙ）変換生成物」と称される。最初のＨｃｙ分子由来のいずれの要素も含まない上記反応生成物は、「Ｈｃｙ補基質変換生成物」と称される。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素」は、ホモシステインおよびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）からの、メチオニンおよびＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）の形成を触媒する酵素を称する。ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素の活性を、実質的に変えない保存的アミノ酸置換を伴うＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素を包含することが、意図される。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「ＳＡＨ加水分解酵素」は、ＳＡＨの、アデノシン（Ａｄｏ）およびＨｃｙへの加水分解を触媒し、いくつかの原核生物においても見出される偏在性真核生物酵素を称する。ＳＡＨ加水分解酵素はまた、ＡｄｏおよびＨｃｙからのＳＡＨの形成を触媒する。上記ＳＡＨ加水分解酵素の補酵素は、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨである。ＳＡＨ加水分解酵素は、いくつかの触媒活性を有し得る。その加水分解機構において、第１工程は、酵素結合ＮＡＤ＋（Ｅ−ＮＡＤ＋）によるＳＡＨの３’−ヒドロキシル基の酸化（３’−酸化活性）、その後の、３’−ケト−４’，５’−ジデヒドロ−５’−デオキシ−Ａｄｏを与える、Ｌ−Ｈｃｙのβ−脱離を包含する。このしっかりと結合した中間体の５’位への水のＭｉｃｈａｅｌ付加（５’−加水分解活性）は３’−ケト−Ａｄｏを生じ、その後、酵素結合ＮＡＤＨ（Ｅ−ＮＡＤＨ）によってＡｄｏに還元（３’−還元活性）される。ＳＡＨ加水分解酵素の活性を、実質的に変えない保存的アミノ酸置換を伴うＳＡＨ加水分解酵素を包含することが、意図される。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「評価すること」は、上記サンプル中に存在する検体（例えば、ホモシステインまたはＡｄｏ）の、量または濃度についての絶対値を得るという意味の量的決定および質的決定を包含することが意図され、そしてそのサンプル中の検体のレベルを示す、指標、比、パーセンテージ、視覚的な値または他の値を得る意義における、量的決定および質的決定を包含することが意図される。評価は、直接的または間接的であり得、そして実際に検出された化学種は、当然のことながらその検体自体である必要はないが、例えばそれらの誘導体またはいくつかのさらなる物質であり得る。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「アデノシンデアミナーゼ」は、イノシンを形成するアデノシンの脱アミノ化を触媒する酵素を称する。アデノシンデアミナーゼの活性を、実質的に変えない保存的アミノ酸置換を伴うアデノシンデアミナーゼを包含することが、意図される。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「アデノシンキナーゼ」は、アデノシンおよびＡＴＰからのアデノシン５’−一リン酸およびＡＤＰの形成を触媒する酵素を称する。アデノシンキナーゼの活性を、実質的に変えない保存的アミノ酸置換を伴うアデノシンキナーゼを包含することが、意図される。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「血清」は、循環血液において血漿と区別される、フィブリン凝塊および血球の除去後に得られる血液の流体部分を称する。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「血漿」は、凝血後に得られる血清と区別される、血液の、流体の非細胞部分を称する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「組換え手段による生成」は、クローンされた核酸によってコードされるタンパク質を発現するための、分子生物学の周知の方法に依存する組換え核酸方法を使用する生成方法を称する。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「流体」は、流動し得る任意の組成物を称する。従って、流体は、半固体の形態、ペーストの形態、溶液の形態、水溶性混合物の形態、ゲルの形態、ローションの形態、クリームの形態および他のそのような組成物である組成物を包含する。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「サンプル」は、検体アッセイが所望される検体を含み得る任意のものを称する。上記サンプルは、生物学的流体または生物学的組織のような生物学的サンプルであり得る。生物学的流体の例としては、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞、痰、脳脊髄液、涙液、粘液、羊水などが挙げられる。生物学的組織は、細胞の凝集体であり、通常、結合性の上皮、結合性の筋肉および結合性の神経組織を含む、ヒト構造、動物構造、植物構造、細菌構造、真菌構造またはウイルス構造の構成材料の１つを形成する、特定の種類の細胞内物質と一緒になった特定の種類の凝集体である。生物学的組織の例としてはまた、器官、腫瘍、リンパ節、動脈および個々の細胞が挙げられる。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「疾患または障害」は、例えば、感染または遺伝的欠損から生じ、そして特定可能な症状によって特徴付けられる、生物における病理学的状態を称する。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「抗体」は、インタクトなポリクローナル抗体またはインタクトなモノクローナル抗体だけではなく、またそれらのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、二重特異性抗体、抗体フラグメントから形成されるマルチ特異的（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、これらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の立体配置を改変した他の融合タンパク質のいずれかを包含する。抗体としては、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそれらのサブクラス））の抗体が挙げられ、そしてその抗体は、特定のクラスのいずれかである必要はない。
【００５０】
（Ｂ．ホモシステインをアッセイするための方法）
本発明は、サンプル中のホモシステイン（Ｈｃｙ）をアッセイするための方法を提供し、その方法は、以下：ａ）Ｈｃｙ変換生成物およびＨｃｙ補基質変換生成物を形成するために、Ｈｃｙ変換反応中で、Ｈｃｙを含むサンプルまたはＨｃｙを含むと推測されるサンプルと、Ｈｃｙ補基質およびＨｃｙ変換酵素とを接触させる工程；ならびにｂ）当該サンプル中の当該Ｈｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために、当該Ｈｃｙ補基質変換生成物を評価する工程を包含する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、上記Ｈｃｙ補基質変換生成物は、クロマトグラフ分離なしで評価される。
【００５２】
いくつかの実施形態において、上記Ｈｃｙ変換酵素は、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素である。ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素が、Ｈｃｙ変換酵素として使用される場合、上記Ｈｃｙ補基質はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であり、上記Ｈｃｙ変換生成物はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、そして上記Ｈｃｙ補基質変換生成物はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）であり、そしてそのＳＡＨは上記サンプル中のＨｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために評価される。
【００５３】
メチル基をＳＡＭからＨｃｙに転移する任意のＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素が、使用され得る。例えば、ＳｈａｐｉｒｏおよびＳｔａｎｌｅｙ Ｋ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７ Ｐｔ．Ｂ，Ｓｕｌｆｕｒ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，ｐｐ．４００−４０５（１９７１））ならびにＳｈａｐｉｒｏ ＳＫ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２９：４０５−９（１９５８））に記載される、Ｓ−アデノシルメチオニン：Ｌ−ホモシステインＳ−メチル基転移酵素が、使用され得る。以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２９７３９４を有する核酸、ならびに以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＧ１０３０１、同ＣＡＡ１６０３５、同ＮＰ＿８５６１３２、同ＮＰ＿３０２０３９、同ＣＡＤ９７３４６、同Ｔ５１９３９、同Ｔ５１９４１および同ＣＡＣ３０４２８を有するアミノ酸配列によってコードされるホモシステインＳ−メチル基転移酵素（ＥＣ ２．１．１．１０）もまた、使用され得る。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素（Ｔｈａｎｂｉｃｈｌｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８１（２）：６６２−５（１９９９））またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３９（５）：１５５１−６（１９６４）およびＴｈｏｍａｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５（５２）：４０７１８−２４（２０００））が、使用され得る。
【００５４】
上記ＳＡＭは、任意の適切な形態で使用され得る。例えば、上記ＳＡＭは、上記サンプルに直接添加される。別の実施形態において、上記ＳＡＭは、さらなる反応によって生成される（例えば、ＳＡＭシンターゼによってＡＴＰおよびＭｅｔから生成される）。
【００５５】
ＳＡＨは、当該分野で公知の方法のいずれかを使用して評価され得る。例えば、ＳＡＨは、ＳＡＨに特異的に結合する抗体を使用することによって評価され得る。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。ＳＡＨに対して特異的な抗体の例は、米国特許第５，６３１，１２７号および同第６，０６３，５８１号に記載される。ＳＡＨに特異的な抗体はまた、当該分野で公知の方法を使用して産生され得、その方法は、例えば、米国特許第５，６３１，１２７号および同第６，０６３，５８１号に記載される。
【００５６】
任意の免疫学的アッセイは、ＳＡＨに対して特異的な抗体（例えば、溶液中または固体支持体上における競合アッセイまたはサンドイッチアッセイ、沈降／凝集アッセイ）を用いてＳＡＨを検出するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記ＳＡＨは、ＳＡＭの存在下でＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素と反応させたサンプルと、ＳＡＨに対して特異的な抗体、および抗体に対する上記ＳＡＨ以外の検出可能なハプテンとを接触させることによって評価され、ここでそのＳＡＨの、存在または量を決定する工程は、上記抗体に、結合した検出可能なハプテンまたは結合しなかった検出可能なハプテンのいずれかの、存在または量を決定することによって間接的に達成される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、キャリアーマトリックスに結合される。
【００５７】
ＳＡＨはまた、ＳＡＨに対する結合親和性を有するが触媒活性が弱力化された、変異体ＳＡＨ加水分解酵素を使用して評価され得る。これらの変異体ＳＡＨ加水分解酵素、および変異体ＳＡＨ加水分解酵素を使用するアッセイ方法は、米国特許番号第６，３７６，２１０号およびＷＯ ０３／０６０４７８に記載される。
【００５８】
ＳＡＨはまた、ＳＡＨ加水分解酵素によるＳＡＨの、アデノシンおよびＨｃｙへの変換によって評価され得、そして産生されたアデノシンが、評価される。いくつかの実施形態において、上記ＳＡＨは、ＳＡＭからＨｃｙを産生するためにＳＡＨ加水分解酵素と接触され、そのＳＡＭは、上記ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素によってＨｃｙ変換反応中に循環され、Ｈｃｙ補基質ベースの酵素循環反応系、およびアデノシン（Ａｄｏ）を形成し、そのアデノシンは、そのサンプル中のＨｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために評価される。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中のホモシステインをアッセイするための方法を提供し、その方法は、以下：ａ）サンプル中にホモシステインが存在する場合、メチル供与体（例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、ならびにメチオニンおよびＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）を形成する、ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素）を使用してホモシステインをメチル化する工程；ｂ）当該形成されたＳＡＨからアデノシン（Ａｄｏ）を放出する工程、および酵素Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素を使用してホモシステインを産生する工程；そしてｃ）当該サンプル中のホモシステインの、存在および／または量を決定するために当該放出されたＡｄｏを評価する工程を包含する。上記方法はさらに、上記Ａｄｏの放出された量を長期にわたり測定する工程を包含し得る。好ましくは、工程ａ）および工程ｂ）は、上記サンプル中のホモシステインの濃度に相関し得る割合で当該Ａｄｏを放出するために循環される。また好ましくは、上記Ａｄｏの放出の割合は、標準的なホモシステインの濃度値に相関する。任意の適切なメチル供与体および任意の適切なメチル基転移酵素が、使用され得る。例えば、上記メチル供与体は、ＳＡＭであり得、そして上記メチル化酵素は、ＳＡＭ依存性ホモシステインメチル基転移酵素であり得る。好ましくは、上記メチル供与体ＳＡＭは、少なくとも約５μＭの濃度で提供される。上記Ａｄｏ形成の割合は、任意の適切な方法を使用して測定され得る。例えば、上記Ａｄｏ形成の割合は、酵素的に測定され得る。好ましくは、上記Ａｄｏ形成の割合は、Ａｄｏデアミナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アデノシンキナーゼ、またはこれらの酵素の２種以上の任意の組み合わせを使用して測定される。これらのアッセイ法はさらに、本明細書中に記載される。
【００６０】
上記ＳＡＭは、任意の適切な形態で使用され得る。例えば、上記ＳＡＭは、上記サンプルに直接添加される。別の例において、上記ＳＡＭは、さらなる反応によって生成される（例えば、ＳＡＭシンターゼによってＡＴＰおよびＭｅｔから生成される）。
【００６１】
任意のＳＡＨ加水分解酵素が、使用され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ６１８３１〜Ｍ６１８３２のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、ＳＡＨ加水分解酵素をコードする核酸を得るために使用され得る（Ｃｏｕｌｔｅｒ−ＫａｒｉｓおよびＨｅｒｓｈｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，５３（２）：１６９−１７５（１９８９）を参照のこと）。また好ましくは、上記ヌクレオチドの配列を含むか、または米国特許第５，８５４，０２３号に記載されるアミノ酸をコードする核酸分子は、ＳＡＨ加水分解酵素を得るために使用され得る。
【００６２】
種々の還元剤（例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、システイン、メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、水酸化ホウ素ナトリウムなど）が、使用され得るが、ＤＴＴ（例えば、約５ｍＭ濃度の）は、特に適している。ＤＴＴそれ自体は、低いｐＨで保管されるべきであり、従って、上記アッセイキットは都合の良いことに、低いｐＨ（例えば、約３）であるが低い緩衝能およびＳＡＨ加水分解酵素の別個の溶液を有するＤＴＴの溶液を含み、そのＳＡＨ加水分解酵素は、部分的にまたは完全に不活性であり得、実質的に中性ｐＨであり得、そして好ましくは緩衝され得る。これらの溶液が、混合される場合、上記酵素は、中性ｐＨで再活性化される。この組み合わせは、所望される場合、上記試験サンプルの存在下で生じ得るか、またはすぐその後に添加されるその試験サンプルと一緒に生じ得る。上に記載された他の還元剤は同様に、ＳＡＨ加水分解酵素の安定化／活性化の両方のために使用される。ＴＣＥＰは、上記酵素が上記還元剤と一緒に、同じ試薬中に含まれることを可能にする中性ｐＨで保管され得る。
【００６３】
上記Ａｄｏは、当該分野で公知の適切な方法のいずれか（例えば、免疫学的方法または酵素的方法）によって評価され得る。測光的（例えば、比色定量的、分光光度的または蛍光定量的）検出および免疫学的方法に依存する一般的方法は、臨床検査における使用に特に容易に適用され得るものとして使用され得る。酵素反応、またはモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体を用いる反応に基づく方法はまた、単純かつ迅速であり、そして実施するのに比較的安価であり得るので使用され得る。例えば、上記Ａｄｏは、それを直接的または間接的に、測光的に（例えば、分光光度的に）検出され得る生成物に変換する酵素を用いる反応をモニタリングすることによって評価され得る。当然のことながらホモシステイン変換酵素の他の基質（特に、ホモシステイン）と非反応性であるべきである適切な酵素としては、アデノシンデアミナーゼ（アデノシンをイノシンに変換する）およびアデノシンキナーゼ（アデノシンおよびＡＴＰを、ＡＤＰおよびリン酸化したアデノシンに変換する）があげられる。そのような酵素はさらに、形成された生成物を、さらに検出可能な生成物に変換するために作用する他の酵素と組み合わせられ得る。
【００６４】
従って、本発明のアッセイに有用な、例示的なＡｄｏ検出スキームとしては、以下：
【００６５】
【化１−１】
【００６６】
【化１−２】
が挙げられる。
【００６７】
スキーム（１）において、イムノアッセイが行われ、そしてフルオレッセイン標識アデノシンが検出され得る。
【００６８】
スキーム（２）において、上記反応は、アデノシンデアミナーゼによって触媒され、そして上記アデノシンデアミナーゼ反応によって産生されたアンモニアは、公知の方法（例えば、比色定量技術）を使用して容易に検出され得る。従って、例えば、上記サンプル中で産生されたアンモニアは、着色された生成物を形成するために反応され得、その形成は、スペクトル光度測定的（ｓｐｅｃｔｒａｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）に検出され得る。
【００６９】
スキーム（２ａ）において、上記反応は、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒され、そして上記ＮＡＤ（Ｐ）＋は、３４０ｎｍでスペクトル光度測定的に検出され得る。
【００７０】
スキーム（２ｂ１）において、上記反応は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼによって触媒される。スキーム（２ｂ２）およびスキーム（２ｂ３）において、上記反応は、キサンチンオキシダーゼによって触媒される。スキーム（２ｂ４）において、上記反応は、ペルオキシダーゼによって触媒される。上記イノシンおよび上記尿酸は、特有のＵＶ吸収特性を有し、従って、反応速度測定によって、スペクトル光度測定的にモニタリングされ得る。しかし、尿酸またはイノシンのＵＶ検出の使用は、その方法の感受性がやや悪く、そしてＵＶ光源およびＵＶ透過性サンプル容器を必要とするというある種の制限を有する。従って、５５０ｎｍにおけるキノン色素の比色定量検出に頼ることは、より都合が良い。
【００７１】
あるいは、スキーム（２ｂ）において；上記キサンチンオキシダーゼ反応は、それ自体を、還元／酸化能力を評価することによってか、またはＯ２消費量、もしくはより詳しくは、Ｈ２Ｏ２形成を測定することによって（例えば、電子感知器の使用によって）、蛍光発生体または色素体（例えば、酸化還元指示薬）を使用する検出に役立つ。多くの酸化還元指示薬は、この目的のために使用され得、そして幅広い方法が、溶液中のＨ２Ｏ２および溶液中のＯ２の、アッセイについての文献に記載される。実際に、Ｈ２Ｏ２は臨床アッセイにおいて、頻繁に検出される。例えば、過酸化水素はまた、過酸化シュウ酸（ｐｅｒｏｘｉｏｘａｌａｔｅ）およびアクリジニウムエステル（後者は中性ｐＨの水溶液中にある）の、非酵素的化学発光反応を使用して評価され得る。
【００７２】
スキーム（３）において、上記反応は、アデノシンキナーゼによって触媒される。スキーム（３ａ）において、上記反応は、ピルビン酸キナーゼによって触媒される。スキーム（３ｂ）において、上記反応は、乳酸デヒドロゲナーゼによって触媒される。スキーム（３ｂ）中で産生されたＮＡＤ（Ｐ）＋は、３４０ｎｍでスペクトル光度測定的に検出され得る。
【００７３】
任意のアデノシンデアミナーゼが、スキーム（２）について使用され得る。例えば、ウシ脾臓由来のアデノシンデアミナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ａ５１６８、６６４８および５０４３）、仔ウシ腸管粘膜由来のアデノシンデアミナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号０１８９８、Ａ９８７６およびＡ１０３０）、またはヒト赤血球由来のヒトアデノシンデアミナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＢＣＲ６４７）が、使用され得る。別の例において、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７６４２２（ヒト、Ｌａｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１７（５）：２４１３−２４（１９９７）も参照のこと）を有する核酸によってコードされるアデノシンデアミナーゼが、使用され得る。
【００７４】
任意のプリンヌクレオシドホスホリラーゼが、スキーム（２ｂ）について使用され得る。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ８８５２９（Ｅ．ｃｏｌｉ）；Ｕ２４４３８（Ｅ．ｃｏｌｉ，ＣｏｒｎｅｌｌおよびＲｉｓｃｏｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，ｌ３９６（ｌ）：８−ｌ４（１９９８）も参照のこと）；Ｕ８３７０３（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）；ならびにＭ３０４６９（Ｅ．ｃｏｌｉ）を有する核酸によってコードされるプリンヌクレオシドホスホリラーゼが、使用され得る。
【００７５】
任意のキサンチンオキシダーゼが、スキーム（２ｂ）について使用され得る。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ０８０５４８（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）；ならびにＵ３９４８７（ヒト、ＳａｋｓｅｌａおよびＲａｉｖｉｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３１５（１）：２３５−９（１９９６）も参照のこと）を有する核酸によってコードされるキサンチンオキシダーゼが、使用され得る。
【００７６】
任意のアデノシンキナーゼが、スキーム（３）について使用され得る。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００６７２１（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）；ＮＭ＿００１５３２（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）；ＮＭ＿００１１２３（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）；ＮＭ＿０２１１２９（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）；およびＢＣ００３５６８（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を有する核酸によってコードされるアデノシンキナーゼが、使用され得る。米国特許第５，８６１，２９４号、ＭｃＮａｌｌｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３１：６４５−６５０（１９９７）、およびＳｉｎｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４１：５６４−５７１（１９９６）に開示されるアデノシンキナーゼがまた、使用され得る。
【００７７】
任意のグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、スキーム（２ａ）について使用され得る。例えば、Ｐｅｒｅｚ−ｄｅ ｌａ Ｍｏｒａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８０（２）：２４８−５２（１９８９）およびＧｏｒｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３（８）：８７９−８６（１９８１）に開示されるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（またはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ））が、使用され得る。
【００７８】
任意のピルビン酸キナーゼが、スキーム（３ａ）について使用され得る。例えば、ブタ由来のピルビン酸キナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｋ４３８８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のピルビン酸キナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｐ１９０３）、ニワトリ筋肉由来のピルビン酸キナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｐ５７８８）、およびウサギ筋肉由来のピルビン酸キナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号８３３３０）が、使用され得る。
【００７９】
任意の乳酸デヒドロゲナーゼが、スキーム（３ｂ）について使用され得る。例えば、ヒト由来の乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＢＣＲ４０４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｉｉ由来の乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号６１３０６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ由来の乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号５９０２３）、およびウサギ筋肉由来の乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号６１３１１）が、使用され得る。
【００８０】
本明細書中で記載される方法は、任意のサンプル（例えば、体液または生物学的組織）をアッセイするために使用され得る。典型的な体液としては、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞、痰、脳脊髄液、涙液、粘液および羊水が挙げられる。好ましくは、アッセイされる体液は、血液である。上記血液サンプルは、直接アッセイされ得るか、またはアッセイの前に処理され得る。例えば、上記血液サンプルはさらに、血漿画分または血清画分に分離され得る。
【００８１】
上記サンプルと、上記Ｈｃｙ補基質および上記Ｈｃｙ変換酵素との間の接触の前、またはその接触と同時に、上記サンプル中の、酸化型Ｈｃｙまたは結合型Ｈｃｙは、還元型Ｈｃｙに変換され得る。上記血漿または上記尿において、ホモシステイン存在の有意な比率は、アルブミンのような循環するタンパク質へのジスルフィド結合によって結合され得、そしてホモシステインはまた、他のジスルフィド誘導体（一般的に、ホモシステイン−システイン結合体）の形態で存在し得る。上記サンプル中の全ホモシステイン存在の見積りを得るために、従って、上記サンプルを、上記ジスルフィド結合を切断し、そして遊離型ホモシステインを遊離する還元剤で処理することが好まれ得る。
【００８２】
任意の適切な還元剤が、使用され得る。ジスルフィドは、チオール（例えば、トリ−ｎ−ブチルホスフィン（ＴＢＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、２−メルカプト−エタノール、システイン−チオグリコール酸、チオグリコール酸、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、遊離型の金属、グルタチオン、および類似の化合物）によって容易かつ特異的に還元される。直接の化学的還元は、ホウ化水素（例えば、ホウ化水素ナトリウム）、もしくはアマルガム（例えば、アマルガムナトリウム）を使用して達成され得るか、またはより特化した試薬（例えば、ホスフィンもしくはホスホロチオエート）が、使用され得る。ジスルフィド反応は、幅広い適切な還元剤が列挙されるＪｏｃｅｌｙｎのＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １４３：２４３−２５６（１９８７）によって概説される。上記還元剤はまた、トリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン塩酸（ＴＣＥＰ）であり得る。好ましくは、上記ジチオスレイトールまたは上記ＴＣＥＰは、約３０ｍＭまでの濃度で提供される。
【００８３】
本発明の方法はさらに、上記サンプルと、上記Ｈｃｙ補基質および上記Ｈｃｙ変換酵素とを接触させる工程の前、または接触させる工程と同時に、酸化型Ｈｃｙまたは結合型Ｈｃｙを、還元型Ｈｃｙに変換するために使用する還元剤を除去する工程を包含し得る。例えば、上記還元剤は、Ｎ−エチルマレイミドの添加または他のチオ−反応化合物の添加によって除去され得る。
【００８４】
（Ｃ．ホモシステインをアッセイするためのキット）
別の局面において、本発明は、サンプル中のＨｃｙをアッセイするためのキットに関し、そのキットは、以下：ａ）Ｈｃｙ変換酵素；ｂ）Ｈｃｙ補基質；およびｃ）Ｈｃｙ補基質変換生成物を評価するための試薬を備える。
【００８５】
いくつかの実施形態において、上記Ｈｃｙ補基質はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であり、上記Ｈｃｙ変換酵素はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基変換酵素であり、そして上記Ｈｃｙ補基質変換生成物はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）である。いくつかの実施形態において、Ｈｃｙ補基質変換生成物ＳＡＨを評価するための試薬は、ＳＡＨに対して特異的に結合する抗体である。
【００８６】
別の局面において、本発明は、サンプル中のＨｃｙをアッセイするためのキットに関し、そのキットは、以下：ａ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素；ｂ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）またはＡＴＰ、ＭｅｔおよびＳＡＭシンターゼ；ｃ）ＳＡＨ加水分解酵素；およびｄ）アデノシン（Ａｄｏ）を評価するための試薬を備える。
【００８７】
さらに別の局面において、本発明は、サンプル中のＨｃｙをアッセイするためのキットに関し、そのキットは、以下：ａ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素；ｂ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）またはＡＴＰ、ＭｅｔおよびＳＡＭシンターゼ；ならびにｃ）ＳＡＨを評価するための試薬を備え、ここでそのキットは、Ｈ２Ｏ２を産生するための、酵素または試薬およびＨ２Ｏ２を検出するための試薬を備えない。
【００８８】
いくつかの実施形態において、上記Ａｄｏをアッセイするための試薬は、ＳＡＨ加水分解酵素以外のアデノシン変換酵素を含む。いくつかの実施形態において、上記アデノシン変換酵素は、アデノシンキナーゼである。他の実施形態において、上記アデノシン変換酵素は、アデノシンデアミナーゼである。
【００８９】
本明細書中に記載されるキットはさらに、還元剤（例えば、ジチオスレイトールまたはトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン塩酸（ＴＣＥＰ）を備え得る。
【００９０】
本発明のキットは、任意の適切なパッケージ中にあり得る。例えば、本明細書中で診断システムに関連して議論されるパッケージは、診断システムに習慣的に利用されるパッケージである。そのようなパッケージとしては、ガラスおよびプラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリカーボネート）、瓶およびバイアル、プラスチックおよびプラスチック箔を積層した包装材料などが挙げられる。上記パッケージはまた、自動アナライザーにおける使用に適した容器を含み得る。上記パッケージは代表的に、本明細書中に記載されるアッセイを行うための説明書を備える。
【実施例】
【００９１】
（Ｄ．実施例）
以下の実施例は、例示する目的のみのために含まれ、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００９２】
（実施例１．精製されたＳＡＭを使用する酵素循環によって産生されたＮＨ４＋を検出するＧＬＤＨ−ＮＡＤＨ共役）
この研究において、以下の共役した酵素循環反応：
【００９３】
【化２】
を使用する。
【００９４】
スキーム（１）において、上記反応は、ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素によって触媒される。スキーム（２）において、上記反応は、ＳＡＨ加水分解酵素によって触媒される。スキーム（３）において、上記反応は、アデノシンデアミナーゼによって触媒される。スキーム（４）において、上記反応は、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される。上記ＮＡＤ（Ｐ）＋を、３４０ｎｍでスペクトル光度測定的に検出する。この研究において使用される試薬の、より詳細な説明を、以下の表１および表２に示す。
【００９５】
【表１】
【００９６】
【表２】
この研究において、１８０μｌの試薬１を、２０μｌの、試験する血清サンプルまたは試験する血漿サンプルと混合し、その混合物を、３７℃で５分間インキュベートした。その後、６０μｌの試薬２を、上記混合物に添加し、そしてそれを３７℃で、さらに５分間インキュベートした。３４０ｎｍにおける吸光度の変化を、上記試薬２を添加した後の２分間〜５分間について測定した。１つの例示的な試験結果を図２に示した。
【００９７】
（実施例２．ＡＴＰおよびメチオニンから、ＳＡＭシンターゼによって同時に変換されたＳＡＭを使用する酵素循環によって産生されたＮＨ４＋を検出するＧＬＤＨ−ＮＡＤＨ共役）
この研究において、以下の共役した酵素循環反応：
【００９８】
【化３】
を使用する。
【００９９】
スキーム（１）において、上記反応は、ＳＡＭシンターゼによって触媒される。スキーム（２）において、上記反応は、ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素によって触媒される。スキーム（３）において、上記反応は、ＳＡＨ加水分解酵素によって触媒される。スキーム（４）において、上記反応は、アデノシンデアミナーゼによって触媒される。スキーム（５）において、上記反応は、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される。上記ＮＡＤ（Ｐ）＋を、３４０ｎｍでスペクトル光度測定的に検出する。この研究において使用される試薬の、より詳細な説明を、以下の表３および表４に示す。
【０１００】
【表３】
【０１０１】
【表４】
この研究において、２７０μｌの試薬３を、２０μｌの、試験する血清サンプルまたは試験する血漿サンプルと混合し、そしてその混合物を、３７℃で５分間インキュベートする。その後、６０μｌの試薬４を、上記混合物に添加し、そしてそれを３７℃で、もう一度５分間インキュベートした。３４０ｎｍにおける吸光度の変化を、上記試薬４を添加した後の２分間〜５分間について測定した。
【０１０２】
（実施例３．酵素循環によって産生されたアデノシンを検出する、アデノシンキナーゼ−ピルビン酸キナーゼ−乳酸デヒドロゲナーゼ−ＮＡＤＨ共役）
この研究において、以下の共役した酵素循環反応：
【０１０３】
【化４】
を使用する。
【０１０４】
スキーム（１）において、上記反応は、ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素によって触媒される。スキーム（２）において、上記反応は、ＳＡＨ加水分解酵素によって触媒される。スキーム（３）において、上記反応は、アデノシンキナーゼによって触媒される。スキーム（４）において、上記反応は、ピルビン酸キナーゼによって触媒される。スキーム（５）において、上記反応は、乳酸デヒドロゲナーゼによって触媒される。上記ＮＡＤ（Ｐ）＋を、３４０ｎｍでスペクトル光度測定的に検出する。この研究において使用される試薬の、より詳細な説明を、以下の表５および表６に示す。
【０１０５】
【表５−１】
【０１０６】
【表５−２】
【０１０７】
【表６】
この研究において、１８０μｌの試薬５を、２０μｌの、試験する血清サンプルまたは試験する血漿サンプルと混合し、そしてその混合物を、３７℃で５分間インキュベートする。その後、６０μｌの試薬６を、上記混合物に添加し、そしてそれを３７℃で、さらに５分間インキュベートした。３４０ｎｍにおける吸光度の変化を、上記試薬２を添加した後の２分間〜５分間について測定する。
【０１０８】
（実施例４．例示的なＤｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイとＣａｔｃｈホモシステインアッセイとの間の比較）
精度を実証するために、例示的なＤｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイを、Ｃｏｂａｓ Ｍｉｒａアナライザー上、およびＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｎ ＣＸ−７アナライザー上の両方におけるＣａｔｃｈホモシステインアッセイに対して比較して個々の血清サンプルを用いて試験した。例示的なＤｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイを、実施例１に示される手順によって行った。Ｃａｔｃｈホモシステインアッセイは、米国特許第６，１７４，６９６号および同第６，４３６，６５８号に記載される。
【０１０９】
この研究に使用した個々の患者血清サンプルは、認定された商業的供給源、ＰｒｏＭｅｄＤｘ，ＬＬＣ由来である。上記血清サンプルは、ＩＲＢによって認定された（即ち、サンプルを収集するために使用したプロトコルおよびインフォームドコンセントは、ＩＲＢによって認可された）。報告可能なダイナミックレンジを越えて分散したホモシステインの濃度を確定するために、本研究に使用したいくつかのホモシステイン血清サンプルを、標的濃度までホモシステインのストック溶液に混合した。
【０１１０】
１つの試験において、例示的なＤｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイおよびＣａｔｃｈホモシステインアッセイを、Ｃｏｂａｓ Ｍｉｒａアナライザー上で比較した。４７個の血清サンプルの全てを試験した。生じたホモシステイン値の比較結果を、以下の表７に示す。
【０１１１】
【表７−１】
【０１１２】
【表７−２】
Ｄｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイによって得られたホモシステイン濃度をまた、Ｃａｔｃｈホモシステインアッセイによって得られたホモシステイン濃度に対してプロットする。図３に示されるように、その傾きは、１．０２９であり、そして上記２つの方法の間の相関係数は、０．９７であり、そしてｙ切片は、１．４７である。
【０１１３】
別の試験において、例示的なＤｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイおよびＣａｔｃｈホモシステインアッセイを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｎ ＣＸ−７アナライザー上で比較した。１５個の血清サンプルの全てを試験した。ホモシステイン値の比較結果を、以下の表８に示す。
【０１１４】
【表８−１】
【０１１５】
【表８−２】
Ｄｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイによって得られたホモシステイン濃度をまた、Ｃａｔｃｈホモシステインアッセイによって得られたホモシステイン濃度に対してプロットする。図４に示されるように、その傾きは、１．０７であり、そして上記２つの方法の間の相関係数は、０．９９であり、そしてｙ切片は、−１．１４である。
【０１１６】
上の実施例は、例示する目的のみのために含まれ、そして発明の範囲を限定することを意図しない。上述された実施例についての多くの変更が可能である。上述された実施例についての改変および変更は、当業者にとって明らかであるので、本発明が特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１は、ホモシステインについての例示的なアッセイ法を例示する。Ｈｃｙ：Ｌ−ホモシステイン；ＳＡＭ：Ｓ−アデノシルメチオニン；ＨＭＴａｓｅ：ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素；およびＳＡＨａｓｅ：Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素。
【図２】図２は、実施例１に記載される実験で得られた、血清ホモシステイン用量反応曲線を示す。
【図３】図３は、Ｃｏｂａｓ Ｍｉｒａアナライザー上で行われた、典型的なＤｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイとＣａｔｃｈホモシステインアッセイとの間の比較を示す。
【図４】図４は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｎ ＣＸ−７アナライザー上で行われた、例示的なＤｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイとＣａｔｃｈホモシステインアッセイとの間の比較を示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願番号６０／４８６，８６５（２００３年７月１０日出願）、および米国特許出願番号１０／８０１，６２３（２００４年３月１５日出願）の優先権の利益を主張し、その内容は、その全てが参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は概して、ホモシステイン検出の分野に関連する。特に、本発明は、サンプル中のホモシステイン（Ｈｃｙ）の、存在または濃度を決定するための方法を提供し、そのサンプルにおいて、ホモシステインは、Ｈｃｙ変換酵素によって触媒されるＨｃｙ変換反応中で、Ｈｃｙ補基質と反応し、Ｈｃｙ変換生成物およびＨｃｙ補基質変換生成物を形成し、そしてそのＨｃｙ補基質変換生成物は、そのサンプル中のＨｃｙの、存在および／または濃度を決定するために評価される。同じ原理に基づいてホモシステインをアッセイするためのキットもまた、提供される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
体液（例えば、血漿または血清）中のホモシステインの総濃度は、疾患に対する重要なマーカーである。例えば、ホモシステイン定量は、心血管疾患に対する重要なリスク指標であり得、コバラミン欠乏症および葉酸欠乏症の感応性マーカーであり得、そしてホモシスチン尿症として公知である代謝における先天性異常の診断に使用され得る。ホモシステイン定量はまた、妊婦における出生異常の評価および高齢者における認知障害の評価において有用であると報告されてきた。Ｆｒａｎｔｚｅｎら、Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｔｏｔａｌ Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ｏｒ Ｓｅｒｕｍ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４：２，３１１−３１６（１９９８）を参照のこと。
【０００４】
ホモシステイン（Ｈｃｙ）は、Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチル基転移反応の間に、メチオニンから形成されるチオール含有アミノ酸である。細胞内Ｈｃｙは、メチオニンに再メチル化され、またはシステインを形成する一連の反応において不可逆的に異化される。細胞内Ｈｃｙは、細胞外液（例えば、血液および尿）に拡散され、そして大部分は酸化型で循環し、そして主に血漿タンパク質に結合される（Ｒｅｆｓｕｍら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４９：３１−６２（１９９８））。血漿中および尿中におけるＨｃｙの量は、Ｈｃｙ生成とＨｃｙ利用との間のバランスを反映する。このバランスは、Ｈｃｙトランス硫化（ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）ならびにＨｃｙ再メチル化（例えば、シスタチオニンβ−シンターゼおよびＮ５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素、またはＨｃｙ代謝に関連したビタミン（例えば、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２および葉酸）の栄養失調（Ｂａｕａｌら、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６４：５４３−５４９（１９９７））に関する酵素の遺伝病によって特徴付けられる臨床状態によって乱され得る。さらに、血漿Ｈｃｙレベルはまた、癌の治療または関節炎の治療のために使用される抗葉酸薬物（例えば、メトトレキサート）のようないくつかの医薬品によって乱され得る（Ｆｏｏｄｙら、Ｃｌｉｎｉｃｉａｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ，８：２０３−２１０（１９９８））。
【０００５】
ホモシステイン血症の重篤な症例は、Ｈｃｙ代謝に関連した酵素をコードする遺伝子におけるホモ接合性欠失によって引き起こされる。そのような症例において、Ｈｃｙ再メチル化またはＨｃｙトランス硫化のいずれかに関連した酵素における欠失は、血液中のＨｃｙおよび尿中のＨｃｙの５０倍程度の上昇をもたらす。そのような疾患（先天性ホモシステイン血症（Ｈｃｙｅｍｉａ））の標準的形態は、シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）をコードする遺伝子におけるホモ接合性欠損によって引き起こされる。これらの患者は、脳卒中、心筋梗塞、腎血管性高血圧症、間欠性跛行、腸間膜虚血、および肺塞栓症を生じる若年期における血栓塞栓性合併症を被る。そのような患者はまた、精神遅滞、ならびに水晶体転位症および骨格変形に類似する他の異常を示す（Ｐｅｒｒｙ Ｔ．，Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｓｐｅｃｔｓ ｉｎ Ｎｙｈａｍ Ｗ．Ｌ．ｅｄ．Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ｐｐ．４１９−４５１（１９７４））。妊婦において上昇したＨｃｙレベルは、神経細管閉鎖（ｎｅｕｒｏｔｕｂｅ ｃｌｏｓｕｒｅ）を伴う、子供の出生時欠損に関係することも知られている（Ｇｒａｈａｍ，Ｉ．，Ｒｅｆｓｕｍ，Ｈ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｉ．Ｈ．，およびＵｒｅｌａｎｄ Ｐ．Ｍ．編「Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：ｆｒｏｍ ｂａｓｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ」Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．１３３−１３６（１９９５）中のＳｃｏｔｔら「Ｔｈｅ ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｄｅｆｅｃｔｓ」）。従って、そのＨｃｙ決定の診断的有用性は、これらの臨床条件で良く実証されてきた。
【０００６】
軽度または中程度に上昇したＨｃｙのレベルでさえも、冠状動脈、大脳動脈、末梢性動脈のアテローム硬化症のリスク、ならびに心血管の疾患のリスクを増加することが実証されてきた（Ｂｏｕｓｈｅｙら、ＪＡＭＡ，２７４：１０４９−１０５７（１９９５））。先天性ホモシステイン血症の罹患率は、それぞれ、脳血管疾患の患者間で４２％、末梢血管疾患の患者間で２８％、および心血管疾患間で３０％であることが示された（Ｍｏｇｈａｄａｓｉａｎら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１５７：２２９９−２３０７（１９９７））。２７の臨床研究のメタ分析は、それぞれのＨｃｙレベルにおける５μＭの増加が、冠動脈疾患のリスクを、男性においては６０％増加し、女性においては８０％増加すると計算し、そのことは血漿コレステロールの２０ｍｇ／ｄｌ−１（０．５ｍｍｏｌ／ｄｌ−１）の増加と等価であり、Ｈｃｙが、リスク因子として、一般的集団においてコレステロールと同程度強いことを示唆する。これらの臨床研究の結果は、高ホモシステイン血症が、心血管疾患について新たに独立のリスク因子を出現させ、そして高ホモシステイン血症は、はっきりした心血管リスク因子（例えば、高血圧症、高コレステロール血症、喫煙、糖尿病、著しい肥満および運動不足）のいずれかを有さない全ての心血管患者の半分を説明し得ると結論付けた。
【０００７】
軽度ホモシステイン血症は主に、ヘテロ接合性の酵素欠損によって引き起こされる。メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素についての遺伝子における一般的な多型は、葉酸欠損に対するホモシステインレベルの感受性に影響するようである（Ｂｏｅｒｓら、Ｊ．Ｉｎｈｅｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．，２０：３０１−３０６（１９９７））。さらに、血漿ホモシステインレベルはまた、心臓移植患者および腎臓移植患者（Ｕｅｌａｎｄら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１１４：４７３−５０１（１９８９））、アルツハイマー病患者（Ｊａｃｏｂｓｅｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４４：２２３８−２２３９（１９９８））、ならびに非インスリン依存性糖尿病の患者（Ｄｕｃｌｏｕｘら、Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｌ，１３：２８９０−２８９３（１９９８））において有意に増加される。心血管疾患によって上昇したホモシステインに関連する証拠の蓄積は、血管疾患の進行の、妨害または停止における血漿Ｈｃｙの低下の有効性を実証するための、二重盲検の無作為化された、かつプラセボ制御された多施設臨床試験の開始を促進した（Ｄｉａｚ−Ａｒｒａｓｔｉａら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５５：１４０７−１４０８（１９９８））。血漿ホモシステインレベルの決定は、一般的な臨床診療であるべきである。
【０００８】
心血管疾患におけるリスク因子として、全血漿Ｈｃｙレベル（還元型、酸化型およびタンパク質結合型）の決定は、臨床環境において推奨されてきた（Ｈｏｒｎｂｅｒｇｅｒら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ．ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，８８：６１−６７（１９９８））。１９８２年以来、全血漿Ｈｃｙを決定するためのいくつかの方法が、記載されてきた（Ｍａｎｓｏｏｒら、Ａｎａｌ．ＢｉｏＣｈｅｍ．，２００：２１８−２２９（１９９２；Ｓｔｅｉｒら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１５８：１３０１−１３０６（１９９８）；Ｕｅｌａｎｄら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３９：１７６４−１７７９（１９９３）；およびＦｒａｎｃｉｓ，Ｒ．Ｂ．Ｊｒ．編Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，ａｎｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｏｋｋｅｒ，ｐｐ．１８３−２３６（１９９２）中のＵｅｌａｎｄら「Ｐｌａｓｍａ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ」；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｒ．Ｂ．Ｊｒ．編Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，ａｎｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｏｋｋｅｒ，ｐｐ．１８３−２３６（１９９２）中のＵｅｌａｎｄら「Ｐｌａｓｍａ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ」も参照のこと）。血漿中または血清中の全Ｈｃｙのアッセイは、７０％の血漿Ｈｃｙがタンパク質結合型であり、そして２０％〜３０％の血漿Ｈｃｙが、非対称またはほぼ非対称に混合したジスルフィドとして存在するという事実によって困難にされる。遊離した還元型Ｈｃｙは、微量にしか存在しない（Ｓｔｅｈｏｕｗｅｒら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，５５３０８−３１４（１９９９））。
【０００９】
上記方法のほとんどは、直接的または間接的（例えば、次にＨＰＬＣ分離またはＴＬＣ分離される、ＳＡＨ加水分解酵素によるＨｃｙのＳＡＨ（Ｓ−アデノシルホモシステイン）への酵素的変換）に、Ｈｃｙを測定するために、高度なクロマトグラフ技術（例えば、ＨＰＬＣ、キャピラリーガスクロマトグラフィー、または質量分析（ＧＣ／ＭＳ））を必要とする。ＴＬＣ分離前のＳＡＨ加水分解酵素によるＨｃｙの放射標識ＳＡＨへの放射酵素的変換がまた、使用されてきた。これらのアッセイにおいて、クロマトグラフ分離は、実施するのに、多くの場合、時間が掛かりかつ扱いにくいが、一般的にこれらの方法の重要な工程である。さらに詳しくは、これらの方法は、高度に特化し、かつ高機能化した装置、ならびによく訓練された分析の専門家を必要とする。そのような装置の使用は概して、汎用的な臨床実験室での実施においてはあまり受け入れられない。
【００１０】
ＳＡＨに対するモノクローナル抗体を使用するＨｃｙについてのイムノアッセイ（Ａｒａｋｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，４２２：４３−５２（１９８７））はまた、公知である。これらのアッセイは、ＨｃｙのＳＡＨへの変換に基づき、次にモノクローナル抗体によって検出される、アルブミン結合Ｈｃｙに対するモノクローナル抗体は、全血漿Ｈｃｙの主要な画分であるアルブミン結合Ｈｃｙの決定のために開発された（Ｓｔａｂｌｅｒら、Ｊ，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１：４６６−４７４（１９８８））。他の免疫学的プロトコルもまた、利用可能である（例えば、米国特許番号第５，６３１，１２７号、同第５，８２７，６４５号、同第５，９５８，７１７号、同第６，０６３，５８１号、および同第５，８８５，７６７号を参照のこと）。イムノアッセイは、時間の掛かるクロマトグラフ分離工程を回避し、そして自動化に適用しやすいが、モノクローナル抗体の生成は高価であり、いくぶん予測不可能であり、そして多くの場合、検出のために、２次抗体または３次抗体さえも必要とする。最近、ホモシステインアッセイのための酵素的方法が、報告されており（Ｍａｔｓｕｙａｍａら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７：２１５５−２１５６（２００１）；Ｔａｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９：１０２９−１０３０（２００３）；米国特許第５，８８５，７６７号、同第５，９９８，１９１号、同第６，０４６，０１７号、同第６，１７４，６９６号、同第６，４３６，６５８号および同第６，６６４，０７３Ｂ１号）、これらの全ては、ホモシステイン変換酵素によって産生されるホモシステイン変換生成物の評価に基づいたホモシステインアッセイを記載する。
【００１１】
サンプル中のホモシステインを決定するための他の方法は、米国特許第６，６８６，１７２号および米国特許出願公開番号２００２／０１１９５０７に記載される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
高度に熟練した人員または複雑な分析化学装置を必要とせずに実施し得る、効率的かつ正確なアッセイが必要とされてきた。本発明は、当該分野に関して、上述および他の関連することに焦点をあてる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の簡単な要旨）
１つの局面において、本発明は、サンプル中のホモシステインについてのアッセイに関する。このアッセイによって、ホモシステイン（Ｈｃｙ）を含むサンプルまたはＨｃｙを含むと推測されるサンプルは、Ｈｃｙ変換生成物およびＨｃｙ補基質変換生成物を形成するＨｃｙ変換反応中で、Ｈｃｙ補基質およびＨｃｙ変換酵素と接触され；そして上記Ｈｃｙ補基質変換生成物は、上記サンプル中のＨｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために評価される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態において、上記Ｈｃｙ補基質変換生成物は、クロマトグラフ分離なしで評価される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、上記Ｈｃｙ補基質はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であり、上記Ｈｃｙ変換酵素はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素であり、上記Ｈｃｙ変換生成物はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、および上記Ｈｃｙ補基質変換生成物はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）であり、そして上記ＳＡＨは、上記サンプル中のＨｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために評価される。
【００１６】
上記ＳＡＭは、任意の適切な形態で使用され得る。例えば、上記ＳＡＭは、上記サンプルに直接添加される。別の例において、上記ＳＡＭは、さらなる反応によって生成される（例えば、ＳＡＭシンターゼによって、ＡＴＰおよびＭｅｔから生成される）。
【００１７】
上記ＳＡＨは、Ｈｃｙおよびアデノシン（Ａｄｏ）に変換され得、そしてＡｄｏは、上記サンプル中のＨｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために評価される。いくつかの実施形態において、上記ＳＡＨは、ＳＡＭからＨｃｙを産生するためにＳＡＨ加水分解酵素と接触され、そのＳＡＭは、ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素によって上記Ｈｃｙ変換反応中に循環され、Ｈｃｙ補基質ベースの酵素循環反応系、およびアデノシン（Ａｄｏ）を形成し、上記アデノシンは、上記サンプル中の上記Ｈｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために評価される。
【００１８】
上記Ａｄｏは、当該分野で公知の適切な方法のいずれか（例えば、免疫学的方法または酵素的方法）によって評価され得る。上記Ａｄｏは、直接的または間接的に評価され得る。例えば、上記Ａｄｏは、アデノシン変換酵素によるアデノシン変換の、補基質または反応生成物を評価することによって、間接的に評価され得る。いくつかの実施形態において、上記アデノシン変換酵素は、アデノシンキナーゼであり、そしてその反応生成物は、アデノシン５’−一リン酸である。他の実施形態において、上記アデノシン変換酵素は、アデノシンデアミナーゼであり、そしてその反応生成物は、アンモニウムおよびイノシンである。
【００１９】
１つの局面において、本発明は、サンプル中のホモシステイン（Ｈｃｙ）をアッセイするための方法に関し、その方法は、以下：ａ）Ｈｃｙ変換生成物およびＨｃｙ補基質変換生成物を形成するために、Ｈｃｙ変換反応中で、Ｈｃｙを含むサンプルまたはＨｃｙを含むと推測されるサンプルと、Ｈｃｙ補基質およびＨｃｙ変換酵素とを接触させる工程であって、上記Ｈｃｙ補基質はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であり、上記Ｈｃｙ変換酵素はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素であり、上記Ｈｃｙ変換生成物はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、および上記Ｈｃｙ補基質変換生成物はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）である、工程、ならびにｂ）上記サンプル中のＨｃｙの、存在、非存在および量を決定するために上記ＳＡＨを評価する工程であって、そのＳＡＨが、クロマトグラフ分離せずに評価される、工程を包含する。
【００２０】
上記ＳＡＭは、任意の適切な形態で使用され得る。例えば、上記ＳＡＭは、上記サンプルに直接添加される。別の例において、上記ＳＡＭは、さらなる反応によって生成される（例えば、ＳＡＭシンターゼによってＡＴＰおよびＭｅｔから生成される）。
【００２１】
上記ＳＡＨは、当該分野で公知の適切な方法のいずれか例えば、免疫学的方法または酵素的方法）によって評価され得る。例えば、ＳＡＨは、ＳＡＨと変異体ＳＡＨ結合酵素（例えば、Ｈｃｙ、ＳＡＨまたはアデノシンに対する結合親和性を有するが、触媒活性が弱力化された変異体ＳＡＨ加水分解酵素）との間の結合を評価する工程によって評価され得る。１つの例において、上記ＳＡＨの評価は、Ｈ２Ｏ２を産生する酵素反応およびＨ２Ｏ２の検出に関連しない。
【００２２】
別の例において、上記ＳＡＨは、そのＳＡＨに特異的に結合する抗体を使用することによって評価され得る。上記抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。上記抗体はまた、キャリアーマトリックスに結合され得る。任意の適切なイムノアッセイ型式（例えば、サンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）アッセイ型式および競合アッセイ型式）は、使用され得る。
【００２３】
本発明の方法は、任意のサンプル（体液または生物学的組織を含むがこれらに限定されない）中の、ホモシステインをアッセイするために使用され得る。上記体液は、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞、痰、脳脊髄液、涙液、粘液および羊水からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態において、上記体液は血液である。いくつかの実施形態において、上記血液サンプルはさらに、血漿画分または血清画分に分離される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、上記サンプルと、上記Ｈｃｙ補基質および上記Ｈｃｙ変換酵素との間の接触の前、またはその接触と同時に、そのサンプル中の酸化型Ｈｃｙまたは結合型Ｈｃｙは、還元型Ｈｃｙに変換される。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、そのサンプル中で遊離型ホモシステインを生成するのに適切な量の、ジチオスレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）または他の還元剤による処置に供される。
【００２５】
本発明の方法はさらに、上記サンプルと、上記Ｈｃｙ補基質および上記Ｈｃｙ変換酵素とが接触する工程の前、またはその工程と同時に、酸化型Ｈｃｙまたは結合型Ｈｃｙを還元型Ｈｃｙに変換するために使用される上記還元剤を除去する工程を包含し得る。例えば、上記還元剤は、Ｎ−エチルマレイミドの添加、または他のチオール還元化合物の添加によって除去され得る。
【００２６】
本発明のさらに別の局面は、サンプル中のホモシステインの、存在または濃度を決定するためのキットに関し、そのキットは、以下：ａ）Ｈｃｙ変換酵素；ｂ）Ｈｃｙ補基質；そしてｃ）Ｈｃｙ補基質変換生成物を評価するための試薬を備える。
【００２７】
いくつかの実施形態において、上記Ｈｃｙ補基質はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であり、上記Ｈｃｙ変換酵素はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素であり、上記Ｈｃｙ補基質変換生成物はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）であり、そして上記Ｈｃｙ補基質変換生成物を評価するための試薬はＳＡＨを評価するための試薬である。いくつかの実施形態において、上記キットはさらに、Ｈｃｙ補基質ベースの酵素循環反応系、およびアデノシン（Ａｄｏ）を形成するために、ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素によって、上記Ｈｃｙ変換反応中に循環されるＳＡＭからＨｃｙを産生するための試薬（例えば、ＳＡＨ加水分解酵素）を含む。
【００２８】
本発明はまた、サンプル中のＨｃｙをアッセイするためのキットを提供し、そのキットは、以下：ａ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素；ｂ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）またはＡＴＰ、ＭｅｔおよびＳＡＭシンターゼ；ｃ）ＳＡＨ加水分解酵素；ならびにｄ）アデノシン（Ａｄｏ）を評価するための試薬を備える。上記Ａｄｏを評価するための試薬は、上記ＳＡＨ加水分解酵素（例えば、アデノシンキナーゼおよびアデノシンデアミナーゼ）以外のアデノシン変換酵素であり得る。
【００２９】
本発明はまた、サンプル中のＨｃｙをアッセイするためのキットを提供し、そのキットは、以下：ａ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素；ｂ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）またはＡＴＰ、ＭｅｔおよびＳＡＭシンターゼ；ならびにｃ）ＳＡＨを評価するための試薬を備え、ここでそのキットは、Ｈ２Ｏ２を産生するための酵素または試薬、およびＨ２Ｏ２を検出するための試薬を備えない。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明のキットはさらに、還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはＴＣＥＰ）を備える。
【００３１】
本発明のキットは、任意の適切なパッケージ中にあり得、そしてまた、本明細書中に記載される方法を実施するための説明書を備え得る。上記キットは、必要に応じて、緩衝液のようなさらなる構成要素を備え得る。
【００３２】
本明細書に記載されたアッセイは、任意の適切な目的（例えば、予防目的、診断目的、薬物スクリーニング目的または処置モニタリング目的）のために使用され得る。上記アッセイは、容易に自動化され得る。さらに、上記アッセイは、治療システムおよび在宅検査キットの点での使用に適応され得る。例えば、治療システムに関する血液検査は、本明細書中で提供される方法を使用するホモシステインレベルの測定に適用され得る。在宅検査キットはまた、本明細書中で提供される方法を用いる使用に適合され得る。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
限定のためではなく開示の明瞭性のために、発明の詳細な説明は、以下の小節に分割される。
【００３４】
（Ａ．定義）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての、技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって、通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中で参照される全ての、特許、出願、公開された出願および他の刊行物は、その全てが参考として援用される。この節に示された定義が、本明細書中で参考として援用される、特許、出願、公開された出願および他の刊行物に示された定義に、反するかまたは矛盾する場合、この節に示された定義は、本明細書中に参考として援用される定義より優先する。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」または「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味する。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「ホモシステイン（Ｈｃｙ）」は、以下の分子式：ＨＳＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨを有する化合物を称する。生物学的に、Ｈｃｙは、メチオニンの脱メチル化によって生成され、そしてＨｃｙは、メチオニン由来のシステインの生合成における中間体である。用語「Ｈｃｙ」は、遊離型Ｈｃｙ（還元型形態である）および結合型Ｈｃｙ（酸化型形態である）を包含する。Ｈｃｙは、タンパク質、ペプチド、Ｈｃｙ自体または他のチオールと、ジスルフィド結合を介して結合し得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「ホモシステイン（Ｈｃｙ）変換反応」は、反応生成物を形成するために化学基（例えば、メチル基）が、化合物からＨｃｙ分子に転移される間に、上記化合物が上記Ｈｃｙ分子と反応する反応を称する。上記Ｈｃｙ分子と反応し、そして上記化学基を提供する化合物は、「ホモシステイン（Ｈｃｙ）補基質」と称される。上記反応を触媒する酵素は、「ホモシステイン（Ｈｃｙ）変換酵素」と称される。最初のＨｃｙ分子の、全部または一部を含む反応生成物は、「ホモシステイン（Ｈｃｙ）変換生成物」と称される。最初のＨｃｙ分子由来のいずれの要素も含まない上記反応生成物は、「Ｈｃｙ補基質変換生成物」と称される。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素」は、ホモシステインおよびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）からの、メチオニンおよびＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）の形成を触媒する酵素を称する。ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素の活性を、実質的に変えない保存的アミノ酸置換を伴うＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素を包含することが、意図される。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「ＳＡＨ加水分解酵素」は、ＳＡＨの、アデノシン（Ａｄｏ）およびＨｃｙへの加水分解を触媒し、いくつかの原核生物においても見出される偏在性真核生物酵素を称する。ＳＡＨ加水分解酵素はまた、ＡｄｏおよびＨｃｙからのＳＡＨの形成を触媒する。上記ＳＡＨ加水分解酵素の補酵素は、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨである。ＳＡＨ加水分解酵素は、いくつかの触媒活性を有し得る。その加水分解機構において、第１工程は、酵素結合ＮＡＤ＋（Ｅ−ＮＡＤ＋）によるＳＡＨの３’−ヒドロキシル基の酸化（３’−酸化活性）、その後の、３’−ケト−４’，５’−ジデヒドロ−５’−デオキシ−Ａｄｏを与える、Ｌ−Ｈｃｙのβ−脱離を包含する。このしっかりと結合した中間体の５’位への水のＭｉｃｈａｅｌ付加（５’−加水分解活性）は３’−ケト−Ａｄｏを生じ、その後、酵素結合ＮＡＤＨ（Ｅ−ＮＡＤＨ）によってＡｄｏに還元（３’−還元活性）される。ＳＡＨ加水分解酵素の活性を、実質的に変えない保存的アミノ酸置換を伴うＳＡＨ加水分解酵素を包含することが、意図される。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「評価すること」は、上記サンプル中に存在する検体（例えば、ホモシステインまたはＡｄｏ）の、量または濃度についての絶対値を得るという意味の量的決定および質的決定を包含することが意図され、そしてそのサンプル中の検体のレベルを示す、指標、比、パーセンテージ、視覚的な値または他の値を得る意義における、量的決定および質的決定を包含することが意図される。評価は、直接的または間接的であり得、そして実際に検出された化学種は、当然のことながらその検体自体である必要はないが、例えばそれらの誘導体またはいくつかのさらなる物質であり得る。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「アデノシンデアミナーゼ」は、イノシンを形成するアデノシンの脱アミノ化を触媒する酵素を称する。アデノシンデアミナーゼの活性を、実質的に変えない保存的アミノ酸置換を伴うアデノシンデアミナーゼを包含することが、意図される。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「アデノシンキナーゼ」は、アデノシンおよびＡＴＰからのアデノシン５’−一リン酸およびＡＤＰの形成を触媒する酵素を称する。アデノシンキナーゼの活性を、実質的に変えない保存的アミノ酸置換を伴うアデノシンキナーゼを包含することが、意図される。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「血清」は、循環血液において血漿と区別される、フィブリン凝塊および血球の除去後に得られる血液の流体部分を称する。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「血漿」は、凝血後に得られる血清と区別される、血液の、流体の非細胞部分を称する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「組換え手段による生成」は、クローンされた核酸によってコードされるタンパク質を発現するための、分子生物学の周知の方法に依存する組換え核酸方法を使用する生成方法を称する。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「流体」は、流動し得る任意の組成物を称する。従って、流体は、半固体の形態、ペーストの形態、溶液の形態、水溶性混合物の形態、ゲルの形態、ローションの形態、クリームの形態および他のそのような組成物である組成物を包含する。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「サンプル」は、検体アッセイが所望される検体を含み得る任意のものを称する。上記サンプルは、生物学的流体または生物学的組織のような生物学的サンプルであり得る。生物学的流体の例としては、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞、痰、脳脊髄液、涙液、粘液、羊水などが挙げられる。生物学的組織は、細胞の凝集体であり、通常、結合性の上皮、結合性の筋肉および結合性の神経組織を含む、ヒト構造、動物構造、植物構造、細菌構造、真菌構造またはウイルス構造の構成材料の１つを形成する、特定の種類の細胞内物質と一緒になった特定の種類の凝集体である。生物学的組織の例としてはまた、器官、腫瘍、リンパ節、動脈および個々の細胞が挙げられる。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「疾患または障害」は、例えば、感染または遺伝的欠損から生じ、そして特定可能な症状によって特徴付けられる、生物における病理学的状態を称する。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「抗体」は、インタクトなポリクローナル抗体またはインタクトなモノクローナル抗体だけではなく、またそれらのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、二重特異性抗体、抗体フラグメントから形成されるマルチ特異的（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、これらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の立体配置を改変した他の融合タンパク質のいずれかを包含する。抗体としては、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそれらのサブクラス））の抗体が挙げられ、そしてその抗体は、特定のクラスのいずれかである必要はない。
【００５０】
（Ｂ．ホモシステインをアッセイするための方法）
本発明は、サンプル中のホモシステイン（Ｈｃｙ）をアッセイするための方法を提供し、その方法は、以下：ａ）Ｈｃｙ変換生成物およびＨｃｙ補基質変換生成物を形成するために、Ｈｃｙ変換反応中で、Ｈｃｙを含むサンプルまたはＨｃｙを含むと推測されるサンプルと、Ｈｃｙ補基質およびＨｃｙ変換酵素とを接触させる工程；ならびにｂ）当該サンプル中の当該Ｈｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために、当該Ｈｃｙ補基質変換生成物を評価する工程を包含する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、上記Ｈｃｙ補基質変換生成物は、クロマトグラフ分離なしで評価される。
【００５２】
いくつかの実施形態において、上記Ｈｃｙ変換酵素は、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素である。ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素が、Ｈｃｙ変換酵素として使用される場合、上記Ｈｃｙ補基質はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であり、上記Ｈｃｙ変換生成物はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、そして上記Ｈｃｙ補基質変換生成物はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）であり、そしてそのＳＡＨは上記サンプル中のＨｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために評価される。
【００５３】
メチル基をＳＡＭからＨｃｙに転移する任意のＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素が、使用され得る。例えば、ＳｈａｐｉｒｏおよびＳｔａｎｌｅｙ Ｋ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７ Ｐｔ．Ｂ，Ｓｕｌｆｕｒ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，ｐｐ．４００−４０５（１９７１））ならびにＳｈａｐｉｒｏ ＳＫ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２９：４０５−９（１９５８））に記載される、Ｓ−アデノシルメチオニン：Ｌ−ホモシステインＳ−メチル基転移酵素が、使用され得る。以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２９７３９４を有する核酸、ならびに以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＧ１０３０１、同ＣＡＡ１６０３５、同ＮＰ＿８５６１３２、同ＮＰ＿３０２０３９、同ＣＡＤ９７３４６、同Ｔ５１９３９、同Ｔ５１９４１および同ＣＡＣ３０４２８を有するアミノ酸配列によってコードされるホモシステインＳ−メチル基転移酵素（ＥＣ ２．１．１．１０）もまた、使用され得る。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素（Ｔｈａｎｂｉｃｈｌｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８１（２）：６６２−５（１９９９））またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３９（５）：１５５１−６（１９６４）およびＴｈｏｍａｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５（５２）：４０７１８−２４（２０００））が、使用され得る。
【００５４】
上記ＳＡＭは、任意の適切な形態で使用され得る。例えば、上記ＳＡＭは、上記サンプルに直接添加される。別の実施形態において、上記ＳＡＭは、さらなる反応によって生成される（例えば、ＳＡＭシンターゼによってＡＴＰおよびＭｅｔから生成される）。
【００５５】
ＳＡＨは、当該分野で公知の方法のいずれかを使用して評価され得る。例えば、ＳＡＨは、ＳＡＨに特異的に結合する抗体を使用することによって評価され得る。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。ＳＡＨに対して特異的な抗体の例は、米国特許第５，６３１，１２７号および同第６，０６３，５８１号に記載される。ＳＡＨに特異的な抗体はまた、当該分野で公知の方法を使用して産生され得、その方法は、例えば、米国特許第５，６３１，１２７号および同第６，０６３，５８１号に記載される。
【００５６】
任意の免疫学的アッセイは、ＳＡＨに対して特異的な抗体（例えば、溶液中または固体支持体上における競合アッセイまたはサンドイッチアッセイ、沈降／凝集アッセイ）を用いてＳＡＨを検出するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記ＳＡＨは、ＳＡＭの存在下でＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素と反応させたサンプルと、ＳＡＨに対して特異的な抗体、および抗体に対する上記ＳＡＨ以外の検出可能なハプテンとを接触させることによって評価され、ここでそのＳＡＨの、存在または量を決定する工程は、上記抗体に、結合した検出可能なハプテンまたは結合しなかった検出可能なハプテンのいずれかの、存在または量を決定することによって間接的に達成される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、キャリアーマトリックスに結合される。
【００５７】
ＳＡＨはまた、ＳＡＨに対する結合親和性を有するが触媒活性が弱力化された、変異体ＳＡＨ加水分解酵素を使用して評価され得る。これらの変異体ＳＡＨ加水分解酵素、および変異体ＳＡＨ加水分解酵素を使用するアッセイ方法は、米国特許番号第６，３７６，２１０号およびＷＯ ０３／０６０４７８に記載される。
【００５８】
ＳＡＨはまた、ＳＡＨ加水分解酵素によるＳＡＨの、アデノシンおよびＨｃｙへの変換によって評価され得、そして産生されたアデノシンが、評価される。いくつかの実施形態において、上記ＳＡＨは、ＳＡＭからＨｃｙを産生するためにＳＡＨ加水分解酵素と接触され、そのＳＡＭは、上記ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素によってＨｃｙ変換反応中に循環され、Ｈｃｙ補基質ベースの酵素循環反応系、およびアデノシン（Ａｄｏ）を形成し、そのアデノシンは、そのサンプル中のＨｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために評価される。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中のホモシステインをアッセイするための方法を提供し、その方法は、以下：ａ）サンプル中にホモシステインが存在する場合、メチル供与体（例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、ならびにメチオニンおよびＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）を形成する、ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素）を使用してホモシステインをメチル化する工程；ｂ）当該形成されたＳＡＨからアデノシン（Ａｄｏ）を放出する工程、および酵素Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素を使用してホモシステインを産生する工程；そしてｃ）当該サンプル中のホモシステインの、存在および／または量を決定するために当該放出されたＡｄｏを評価する工程を包含する。上記方法はさらに、上記Ａｄｏの放出された量を長期にわたり測定する工程を包含し得る。好ましくは、工程ａ）および工程ｂ）は、上記サンプル中のホモシステインの濃度に相関し得る割合で当該Ａｄｏを放出するために循環される。また好ましくは、上記Ａｄｏの放出の割合は、標準的なホモシステインの濃度値に相関する。任意の適切なメチル供与体および任意の適切なメチル基転移酵素が、使用され得る。例えば、上記メチル供与体は、ＳＡＭであり得、そして上記メチル化酵素は、ＳＡＭ依存性ホモシステインメチル基転移酵素であり得る。好ましくは、上記メチル供与体ＳＡＭは、少なくとも約５μＭの濃度で提供される。上記Ａｄｏ形成の割合は、任意の適切な方法を使用して測定され得る。例えば、上記Ａｄｏ形成の割合は、酵素的に測定され得る。好ましくは、上記Ａｄｏ形成の割合は、Ａｄｏデアミナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アデノシンキナーゼ、またはこれらの酵素の２種以上の任意の組み合わせを使用して測定される。これらのアッセイ法はさらに、本明細書中に記載される。
【００６０】
上記ＳＡＭは、任意の適切な形態で使用され得る。例えば、上記ＳＡＭは、上記サンプルに直接添加される。別の例において、上記ＳＡＭは、さらなる反応によって生成される（例えば、ＳＡＭシンターゼによってＡＴＰおよびＭｅｔから生成される）。
【００６１】
任意のＳＡＨ加水分解酵素が、使用され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ６１８３１〜Ｍ６１８３２のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、ＳＡＨ加水分解酵素をコードする核酸を得るために使用され得る（Ｃｏｕｌｔｅｒ−ＫａｒｉｓおよびＨｅｒｓｈｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，５３（２）：１６９−１７５（１９８９）を参照のこと）。また好ましくは、上記ヌクレオチドの配列を含むか、または米国特許第５，８５４，０２３号に記載されるアミノ酸をコードする核酸分子は、ＳＡＨ加水分解酵素を得るために使用され得る。
【００６２】
種々の還元剤（例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、システイン、メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、水酸化ホウ素ナトリウムなど）が、使用され得るが、ＤＴＴ（例えば、約５ｍＭ濃度の）は、特に適している。ＤＴＴそれ自体は、低いｐＨで保管されるべきであり、従って、上記アッセイキットは都合の良いことに、低いｐＨ（例えば、約３）であるが低い緩衝能およびＳＡＨ加水分解酵素の別個の溶液を有するＤＴＴの溶液を含み、そのＳＡＨ加水分解酵素は、部分的にまたは完全に不活性であり得、実質的に中性ｐＨであり得、そして好ましくは緩衝され得る。これらの溶液が、混合される場合、上記酵素は、中性ｐＨで再活性化される。この組み合わせは、所望される場合、上記試験サンプルの存在下で生じ得るか、またはすぐその後に添加されるその試験サンプルと一緒に生じ得る。上に記載された他の還元剤は同様に、ＳＡＨ加水分解酵素の安定化／活性化の両方のために使用される。ＴＣＥＰは、上記酵素が上記還元剤と一緒に、同じ試薬中に含まれることを可能にする中性ｐＨで保管され得る。
【００６３】
上記Ａｄｏは、当該分野で公知の適切な方法のいずれか（例えば、免疫学的方法または酵素的方法）によって評価され得る。測光的（例えば、比色定量的、分光光度的または蛍光定量的）検出および免疫学的方法に依存する一般的方法は、臨床検査における使用に特に容易に適用され得るものとして使用され得る。酵素反応、またはモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体を用いる反応に基づく方法はまた、単純かつ迅速であり、そして実施するのに比較的安価であり得るので使用され得る。例えば、上記Ａｄｏは、それを直接的または間接的に、測光的に（例えば、分光光度的に）検出され得る生成物に変換する酵素を用いる反応をモニタリングすることによって評価され得る。当然のことながらホモシステイン変換酵素の他の基質（特に、ホモシステイン）と非反応性であるべきである適切な酵素としては、アデノシンデアミナーゼ（アデノシンをイノシンに変換する）およびアデノシンキナーゼ（アデノシンおよびＡＴＰを、ＡＤＰおよびリン酸化したアデノシンに変換する）があげられる。そのような酵素はさらに、形成された生成物を、さらに検出可能な生成物に変換するために作用する他の酵素と組み合わせられ得る。
【００６４】
従って、本発明のアッセイに有用な、例示的なＡｄｏ検出スキームとしては、以下：
【００６５】
【化１−１】
【００６６】
【化１−２】
が挙げられる。
【００６７】
スキーム（１）において、イムノアッセイが行われ、そしてフルオレッセイン標識アデノシンが検出され得る。
【００６８】
スキーム（２）において、上記反応は、アデノシンデアミナーゼによって触媒され、そして上記アデノシンデアミナーゼ反応によって産生されたアンモニアは、公知の方法（例えば、比色定量技術）を使用して容易に検出され得る。従って、例えば、上記サンプル中で産生されたアンモニアは、着色された生成物を形成するために反応され得、その形成は、スペクトル光度測定的（ｓｐｅｃｔｒａｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）に検出され得る。
【００６９】
スキーム（２ａ）において、上記反応は、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒され、そして上記ＮＡＤ（Ｐ）＋は、３４０ｎｍでスペクトル光度測定的に検出され得る。
【００７０】
スキーム（２ｂ１）において、上記反応は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼによって触媒される。スキーム（２ｂ２）およびスキーム（２ｂ３）において、上記反応は、キサンチンオキシダーゼによって触媒される。スキーム（２ｂ４）において、上記反応は、ペルオキシダーゼによって触媒される。上記イノシンおよび上記尿酸は、特有のＵＶ吸収特性を有し、従って、反応速度測定によって、スペクトル光度測定的にモニタリングされ得る。しかし、尿酸またはイノシンのＵＶ検出の使用は、その方法の感受性がやや悪く、そしてＵＶ光源およびＵＶ透過性サンプル容器を必要とするというある種の制限を有する。従って、５５０ｎｍにおけるキノン色素の比色定量検出に頼ることは、より都合が良い。
【００７１】
あるいは、スキーム（２ｂ）において；上記キサンチンオキシダーゼ反応は、それ自体を、還元／酸化能力を評価することによってか、またはＯ２消費量、もしくはより詳しくは、Ｈ２Ｏ２形成を測定することによって（例えば、電子感知器の使用によって）、蛍光発生体または色素体（例えば、酸化還元指示薬）を使用する検出に役立つ。多くの酸化還元指示薬は、この目的のために使用され得、そして幅広い方法が、溶液中のＨ２Ｏ２および溶液中のＯ２の、アッセイについての文献に記載される。実際に、Ｈ２Ｏ２は臨床アッセイにおいて、頻繁に検出される。例えば、過酸化水素はまた、過酸化シュウ酸（ｐｅｒｏｘｉｏｘａｌａｔｅ）およびアクリジニウムエステル（後者は中性ｐＨの水溶液中にある）の、非酵素的化学発光反応を使用して評価され得る。
【００７２】
スキーム（３）において、上記反応は、アデノシンキナーゼによって触媒される。スキーム（３ａ）において、上記反応は、ピルビン酸キナーゼによって触媒される。スキーム（３ｂ）において、上記反応は、乳酸デヒドロゲナーゼによって触媒される。スキーム（３ｂ）中で産生されたＮＡＤ（Ｐ）＋は、３４０ｎｍでスペクトル光度測定的に検出され得る。
【００７３】
任意のアデノシンデアミナーゼが、スキーム（２）について使用され得る。例えば、ウシ脾臓由来のアデノシンデアミナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ａ５１６８、６６４８および５０４３）、仔ウシ腸管粘膜由来のアデノシンデアミナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号０１８９８、Ａ９８７６およびＡ１０３０）、またはヒト赤血球由来のヒトアデノシンデアミナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＢＣＲ６４７）が、使用され得る。別の例において、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７６４２２（ヒト、Ｌａｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１７（５）：２４１３−２４（１９９７）も参照のこと）を有する核酸によってコードされるアデノシンデアミナーゼが、使用され得る。
【００７４】
任意のプリンヌクレオシドホスホリラーゼが、スキーム（２ｂ）について使用され得る。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ８８５２９（Ｅ．ｃｏｌｉ）；Ｕ２４４３８（Ｅ．ｃｏｌｉ，ＣｏｒｎｅｌｌおよびＲｉｓｃｏｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，ｌ３９６（ｌ）：８−ｌ４（１９９８）も参照のこと）；Ｕ８３７０３（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）；ならびにＭ３０４６９（Ｅ．ｃｏｌｉ）を有する核酸によってコードされるプリンヌクレオシドホスホリラーゼが、使用され得る。
【００７５】
任意のキサンチンオキシダーゼが、スキーム（２ｂ）について使用され得る。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ０８０５４８（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）；ならびにＵ３９４８７（ヒト、ＳａｋｓｅｌａおよびＲａｉｖｉｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３１５（１）：２３５−９（１９９６）も参照のこと）を有する核酸によってコードされるキサンチンオキシダーゼが、使用され得る。
【００７６】
任意のアデノシンキナーゼが、スキーム（３）について使用され得る。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００６７２１（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）；ＮＭ＿００１５３２（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）；ＮＭ＿００１１２３（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）；ＮＭ＿０２１１２９（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）；およびＢＣ００３５６８（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を有する核酸によってコードされるアデノシンキナーゼが、使用され得る。米国特許第５，８６１，２９４号、ＭｃＮａｌｌｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３１：６４５−６５０（１９９７）、およびＳｉｎｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４１：５６４−５７１（１９９６）に開示されるアデノシンキナーゼがまた、使用され得る。
【００７７】
任意のグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、スキーム（２ａ）について使用され得る。例えば、Ｐｅｒｅｚ−ｄｅ ｌａ Ｍｏｒａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８０（２）：２４８−５２（１９８９）およびＧｏｒｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３（８）：８７９−８６（１９８１）に開示されるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（またはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ））が、使用され得る。
【００７８】
任意のピルビン酸キナーゼが、スキーム（３ａ）について使用され得る。例えば、ブタ由来のピルビン酸キナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｋ４３８８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のピルビン酸キナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｐ１９０３）、ニワトリ筋肉由来のピルビン酸キナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｐ５７８８）、およびウサギ筋肉由来のピルビン酸キナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号８３３３０）が、使用され得る。
【００７９】
任意の乳酸デヒドロゲナーゼが、スキーム（３ｂ）について使用され得る。例えば、ヒト由来の乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＢＣＲ４０４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｉｉ由来の乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号６１３０６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ由来の乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号５９０２３）、およびウサギ筋肉由来の乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号６１３１１）が、使用され得る。
【００８０】
本明細書中で記載される方法は、任意のサンプル（例えば、体液または生物学的組織）をアッセイするために使用され得る。典型的な体液としては、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞、痰、脳脊髄液、涙液、粘液および羊水が挙げられる。好ましくは、アッセイされる体液は、血液である。上記血液サンプルは、直接アッセイされ得るか、またはアッセイの前に処理され得る。例えば、上記血液サンプルはさらに、血漿画分または血清画分に分離され得る。
【００８１】
上記サンプルと、上記Ｈｃｙ補基質および上記Ｈｃｙ変換酵素との間の接触の前、またはその接触と同時に、上記サンプル中の、酸化型Ｈｃｙまたは結合型Ｈｃｙは、還元型Ｈｃｙに変換され得る。上記血漿または上記尿において、ホモシステイン存在の有意な比率は、アルブミンのような循環するタンパク質へのジスルフィド結合によって結合され得、そしてホモシステインはまた、他のジスルフィド誘導体（一般的に、ホモシステイン−システイン結合体）の形態で存在し得る。上記サンプル中の全ホモシステイン存在の見積りを得るために、従って、上記サンプルを、上記ジスルフィド結合を切断し、そして遊離型ホモシステインを遊離する還元剤で処理することが好まれ得る。
【００８２】
任意の適切な還元剤が、使用され得る。ジスルフィドは、チオール（例えば、トリ−ｎ−ブチルホスフィン（ＴＢＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、２−メルカプト−エタノール、システイン−チオグリコール酸、チオグリコール酸、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、遊離型の金属、グルタチオン、および類似の化合物）によって容易かつ特異的に還元される。直接の化学的還元は、ホウ化水素（例えば、ホウ化水素ナトリウム）、もしくはアマルガム（例えば、アマルガムナトリウム）を使用して達成され得るか、またはより特化した試薬（例えば、ホスフィンもしくはホスホロチオエート）が、使用され得る。ジスルフィド反応は、幅広い適切な還元剤が列挙されるＪｏｃｅｌｙｎのＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １４３：２４３−２５６（１９８７）によって概説される。上記還元剤はまた、トリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン塩酸（ＴＣＥＰ）であり得る。好ましくは、上記ジチオスレイトールまたは上記ＴＣＥＰは、約３０ｍＭまでの濃度で提供される。
【００８３】
本発明の方法はさらに、上記サンプルと、上記Ｈｃｙ補基質および上記Ｈｃｙ変換酵素とを接触させる工程の前、または接触させる工程と同時に、酸化型Ｈｃｙまたは結合型Ｈｃｙを、還元型Ｈｃｙに変換するために使用する還元剤を除去する工程を包含し得る。例えば、上記還元剤は、Ｎ−エチルマレイミドの添加または他のチオ−反応化合物の添加によって除去され得る。
【００８４】
（Ｃ．ホモシステインをアッセイするためのキット）
別の局面において、本発明は、サンプル中のＨｃｙをアッセイするためのキットに関し、そのキットは、以下：ａ）Ｈｃｙ変換酵素；ｂ）Ｈｃｙ補基質；およびｃ）Ｈｃｙ補基質変換生成物を評価するための試薬を備える。
【００８５】
いくつかの実施形態において、上記Ｈｃｙ補基質はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であり、上記Ｈｃｙ変換酵素はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基変換酵素であり、そして上記Ｈｃｙ補基質変換生成物はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）である。いくつかの実施形態において、Ｈｃｙ補基質変換生成物ＳＡＨを評価するための試薬は、ＳＡＨに対して特異的に結合する抗体である。
【００８６】
別の局面において、本発明は、サンプル中のＨｃｙをアッセイするためのキットに関し、そのキットは、以下：ａ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素；ｂ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）またはＡＴＰ、ＭｅｔおよびＳＡＭシンターゼ；ｃ）ＳＡＨ加水分解酵素；およびｄ）アデノシン（Ａｄｏ）を評価するための試薬を備える。
【００８７】
さらに別の局面において、本発明は、サンプル中のＨｃｙをアッセイするためのキットに関し、そのキットは、以下：ａ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素；ｂ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）またはＡＴＰ、ＭｅｔおよびＳＡＭシンターゼ；ならびにｃ）ＳＡＨを評価するための試薬を備え、ここでそのキットは、Ｈ２Ｏ２を産生するための、酵素または試薬およびＨ２Ｏ２を検出するための試薬を備えない。
【００８８】
いくつかの実施形態において、上記Ａｄｏをアッセイするための試薬は、ＳＡＨ加水分解酵素以外のアデノシン変換酵素を含む。いくつかの実施形態において、上記アデノシン変換酵素は、アデノシンキナーゼである。他の実施形態において、上記アデノシン変換酵素は、アデノシンデアミナーゼである。
【００８９】
本明細書中に記載されるキットはさらに、還元剤（例えば、ジチオスレイトールまたはトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン塩酸（ＴＣＥＰ）を備え得る。
【００９０】
本発明のキットは、任意の適切なパッケージ中にあり得る。例えば、本明細書中で診断システムに関連して議論されるパッケージは、診断システムに習慣的に利用されるパッケージである。そのようなパッケージとしては、ガラスおよびプラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリカーボネート）、瓶およびバイアル、プラスチックおよびプラスチック箔を積層した包装材料などが挙げられる。上記パッケージはまた、自動アナライザーにおける使用に適した容器を含み得る。上記パッケージは代表的に、本明細書中に記載されるアッセイを行うための説明書を備える。
【実施例】
【００９１】
（Ｄ．実施例）
以下の実施例は、例示する目的のみのために含まれ、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００９２】
（実施例１．精製されたＳＡＭを使用する酵素循環によって産生されたＮＨ４＋を検出するＧＬＤＨ−ＮＡＤＨ共役）
この研究において、以下の共役した酵素循環反応：
【００９３】
【化２】
を使用する。
【００９４】
スキーム（１）において、上記反応は、ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素によって触媒される。スキーム（２）において、上記反応は、ＳＡＨ加水分解酵素によって触媒される。スキーム（３）において、上記反応は、アデノシンデアミナーゼによって触媒される。スキーム（４）において、上記反応は、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される。上記ＮＡＤ（Ｐ）＋を、３４０ｎｍでスペクトル光度測定的に検出する。この研究において使用される試薬の、より詳細な説明を、以下の表１および表２に示す。
【００９５】
【表１】
【００９６】
【表２】
この研究において、１８０μｌの試薬１を、２０μｌの、試験する血清サンプルまたは試験する血漿サンプルと混合し、その混合物を、３７℃で５分間インキュベートした。その後、６０μｌの試薬２を、上記混合物に添加し、そしてそれを３７℃で、さらに５分間インキュベートした。３４０ｎｍにおける吸光度の変化を、上記試薬２を添加した後の２分間〜５分間について測定した。１つの例示的な試験結果を図２に示した。
【００９７】
（実施例２．ＡＴＰおよびメチオニンから、ＳＡＭシンターゼによって同時に変換されたＳＡＭを使用する酵素循環によって産生されたＮＨ４＋を検出するＧＬＤＨ−ＮＡＤＨ共役）
この研究において、以下の共役した酵素循環反応：
【００９８】
【化３】
を使用する。
【００９９】
スキーム（１）において、上記反応は、ＳＡＭシンターゼによって触媒される。スキーム（２）において、上記反応は、ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素によって触媒される。スキーム（３）において、上記反応は、ＳＡＨ加水分解酵素によって触媒される。スキーム（４）において、上記反応は、アデノシンデアミナーゼによって触媒される。スキーム（５）において、上記反応は、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される。上記ＮＡＤ（Ｐ）＋を、３４０ｎｍでスペクトル光度測定的に検出する。この研究において使用される試薬の、より詳細な説明を、以下の表３および表４に示す。
【０１００】
【表３】
【０１０１】
【表４】
この研究において、２７０μｌの試薬３を、２０μｌの、試験する血清サンプルまたは試験する血漿サンプルと混合し、そしてその混合物を、３７℃で５分間インキュベートする。その後、６０μｌの試薬４を、上記混合物に添加し、そしてそれを３７℃で、もう一度５分間インキュベートした。３４０ｎｍにおける吸光度の変化を、上記試薬４を添加した後の２分間〜５分間について測定した。
【０１０２】
（実施例３．酵素循環によって産生されたアデノシンを検出する、アデノシンキナーゼ−ピルビン酸キナーゼ−乳酸デヒドロゲナーゼ−ＮＡＤＨ共役）
この研究において、以下の共役した酵素循環反応：
【０１０３】
【化４】
を使用する。
【０１０４】
スキーム（１）において、上記反応は、ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素によって触媒される。スキーム（２）において、上記反応は、ＳＡＨ加水分解酵素によって触媒される。スキーム（３）において、上記反応は、アデノシンキナーゼによって触媒される。スキーム（４）において、上記反応は、ピルビン酸キナーゼによって触媒される。スキーム（５）において、上記反応は、乳酸デヒドロゲナーゼによって触媒される。上記ＮＡＤ（Ｐ）＋を、３４０ｎｍでスペクトル光度測定的に検出する。この研究において使用される試薬の、より詳細な説明を、以下の表５および表６に示す。
【０１０５】
【表５−１】
【０１０６】
【表５−２】
【０１０７】
【表６】
この研究において、１８０μｌの試薬５を、２０μｌの、試験する血清サンプルまたは試験する血漿サンプルと混合し、そしてその混合物を、３７℃で５分間インキュベートする。その後、６０μｌの試薬６を、上記混合物に添加し、そしてそれを３７℃で、さらに５分間インキュベートした。３４０ｎｍにおける吸光度の変化を、上記試薬２を添加した後の２分間〜５分間について測定する。
【０１０８】
（実施例４．例示的なＤｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイとＣａｔｃｈホモシステインアッセイとの間の比較）
精度を実証するために、例示的なＤｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイを、Ｃｏｂａｓ Ｍｉｒａアナライザー上、およびＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｎ ＣＸ−７アナライザー上の両方におけるＣａｔｃｈホモシステインアッセイに対して比較して個々の血清サンプルを用いて試験した。例示的なＤｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイを、実施例１に示される手順によって行った。Ｃａｔｃｈホモシステインアッセイは、米国特許第６，１７４，６９６号および同第６，４３６，６５８号に記載される。
【０１０９】
この研究に使用した個々の患者血清サンプルは、認定された商業的供給源、ＰｒｏＭｅｄＤｘ，ＬＬＣ由来である。上記血清サンプルは、ＩＲＢによって認定された（即ち、サンプルを収集するために使用したプロトコルおよびインフォームドコンセントは、ＩＲＢによって認可された）。報告可能なダイナミックレンジを越えて分散したホモシステインの濃度を確定するために、本研究に使用したいくつかのホモシステイン血清サンプルを、標的濃度までホモシステインのストック溶液に混合した。
【０１１０】
１つの試験において、例示的なＤｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイおよびＣａｔｃｈホモシステインアッセイを、Ｃｏｂａｓ Ｍｉｒａアナライザー上で比較した。４７個の血清サンプルの全てを試験した。生じたホモシステイン値の比較結果を、以下の表７に示す。
【０１１１】
【表７−１】
【０１１２】
【表７−２】
Ｄｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイによって得られたホモシステイン濃度をまた、Ｃａｔｃｈホモシステインアッセイによって得られたホモシステイン濃度に対してプロットする。図３に示されるように、その傾きは、１．０２９であり、そして上記２つの方法の間の相関係数は、０．９７であり、そしてｙ切片は、１．４７である。
【０１１３】
別の試験において、例示的なＤｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイおよびＣａｔｃｈホモシステインアッセイを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｎ ＣＸ−７アナライザー上で比較した。１５個の血清サンプルの全てを試験した。ホモシステイン値の比較結果を、以下の表８に示す。
【０１１４】
【表８−１】
【０１１５】
【表８−２】
Ｄｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイによって得られたホモシステイン濃度をまた、Ｃａｔｃｈホモシステインアッセイによって得られたホモシステイン濃度に対してプロットする。図４に示されるように、その傾きは、１．０７であり、そして上記２つの方法の間の相関係数は、０．９９であり、そしてｙ切片は、−１．１４である。
【０１１６】
上の実施例は、例示する目的のみのために含まれ、そして発明の範囲を限定することを意図しない。上述された実施例についての多くの変更が可能である。上述された実施例についての改変および変更は、当業者にとって明らかであるので、本発明が特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１は、ホモシステインについての例示的なアッセイ法を例示する。Ｈｃｙ：Ｌ−ホモシステイン；ＳＡＭ：Ｓ−アデノシルメチオニン；ＨＭＴａｓｅ：ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素；およびＳＡＨａｓｅ：Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン加水分解酵素。
【図２】図２は、実施例１に記載される実験で得られた、血清ホモシステイン用量反応曲線を示す。
【図３】図３は、Ｃｏｂａｓ Ｍｉｒａアナライザー上で行われた、典型的なＤｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイとＣａｔｃｈホモシステインアッセイとの間の比較を示す。
【図４】図４は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｎ ＣＸ−７アナライザー上で行われた、例示的なＤｉａｚｙｍｅホモシステイン酵素的アッセイとＣａｔｃｈホモシステインアッセイとの間の比較を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のホモシステイン（Ｈｃｙ）を、クロマトグラフ分離せずにアッセイするための方法であって、該方法は以下：
ａ）Ｈｃｙ変換生成物およびＨｃｙ補基質変換生成物を形成するために、Ｈｃｙ変換反応中で、Ｈｃｙを含むサンプルまたはＨｃｙを含むと推測されるサンプルと、Ｈｃｙ補基質およびＨｃｙ変換酵素とを接触させる工程であって、ここで該Ｈｃｙ補基質はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であり、該Ｈｃｙ変換酵素はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素であり、該Ｈｃｙ変換生成物はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、そして該Ｈｃｙ補基質変換生成物はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）である、工程；
ｂ）ＳＡＭからＨｃｙを産生するために該ＳＡＨとＳＡＨ加水分解酵素とを接触させる工程によって、工程（ａ）で産生された該Ｈｃｙ補基質変換生成物ＳＡＨを評価する工程であって、該ＳＡＭは、該ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素によってＨｃｙ変換反応中に循環され、Ｈｃｙ補基質ベースの酵素循環反応系、およびアデノシン（Ａｄｏ）を形成し、該アデノシンは、該サンプル中の該Ｈｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために評価される工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記Ａｄｏが、前記ＳＡＨ加水分解酵素以外のアデノシン変換酵素と接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ａｄｏの評価が、前記アデノシン変換酵素によるアデノシン変換の、補基質の評価または反応生成物の評価によって間接的に達成される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アデノシン変換酵素がアデノシンキナーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アデノシン変換酵素がアデノシンデアミナーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、体液または生物学的組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記体液が、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞、痰、脳脊髄液、涙液、粘液、羊水からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記体液が血液である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記血液サンプルが、さらに血漿画分または血清画分に分離される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルと前記Ｈｃｙ補基質および前記Ｈｃｙ変換酵素との間の接触の前、または接触と同時に、該サンプル中の酸化型Ｈｃｙまたは結合型Ｈｃｙが還元型Ｈｃｙに変換される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ａｄｏが、クロマトグラフ分離なしで評価される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＡＭが、前記サンプルに添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＳＡＭが、ＳＡＭシンターゼによって、ＡＴＰおよびＭｅｔから生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
サンプル中のホモシステイン（Ｈｃｙ）をアッセイするための方法であって、該方法は以下：
ａ）Ｈｃｙ変換生成物およびＨｃｙ補基質変換生成物を形成するために、Ｈｃｙ変換反応中で、Ｈｃｙを含むサンプルまたはＨｃｙを含むと推測されるサンプルと、Ｈｃｙ補基質およびＨｃｙ変換酵素とを接触させる工程であって、ここで該Ｈｃｙ補基質はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であり、該Ｈｃｙ変換酵素はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素であり、該Ｈｃｙ変換生成物はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、そして該Ｈｃｙ補基質変換生成物はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）である、工程；
ｂ）該サンプル中のＨｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために、該Ｈｃｙ補基質変換生成物ＳＡＨを評価する工程であって、ここで該ＳＡＨが、クロマトグラフ分離なしで評価される、工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記ＳＡＨの評価が、Ｈ２Ｏ２を産生する酵素反応およびＨ２Ｏ２の検出に関連しない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＳＡＭが前記サンプルに添加される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＳＡＭが、ＳＡＭシンターゼによって、ＡＴＰおよびＭｅｔから生成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
サンプル中のＨｃｙをアッセイするためのキットであって、該キットは、以下：
ａ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素；
ｂ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）またはＡＴＰ、ＭｅｔおよびＳＡＭシンターゼ；
ｃ）ＳＡＨ加水分解酵素；および
ｄ）アデノシン（Ａｄｏ）を評価するための試薬
を備える、キット。
【請求項１９】
前記Ａｄｏを評価するための試薬が、前記ＳＡＨ加水分解酵素以外のアデノシン変換酵素を含有する、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記アデノシン変換酵素が、アデノシンキナーゼまたはアデノシンデアミナーゼである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
サンプル中のＨｃｙをアッセイするためのキットであって、該キットは以下：
ａ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素；
ｂ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）またはＡＴＰ、ＭｅｔおよびＳＡＭシンターゼ；ならびに
ｃ）ＳＡＨを評価するための試薬
を備えし、Ｈ２Ｏ２を産生するための酵素または試薬、およびＨ２Ｏ２を検出するための試薬を備えない、キット。
【請求項１】
サンプル中のホモシステイン（Ｈｃｙ）を、クロマトグラフ分離せずにアッセイするための方法であって、該方法は以下：
ａ）Ｈｃｙ変換生成物およびＨｃｙ補基質変換生成物を形成するために、Ｈｃｙ変換反応中で、Ｈｃｙを含むサンプルまたはＨｃｙを含むと推測されるサンプルと、Ｈｃｙ補基質およびＨｃｙ変換酵素とを接触させる工程であって、ここで該Ｈｃｙ補基質はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であり、該Ｈｃｙ変換酵素はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素であり、該Ｈｃｙ変換生成物はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、そして該Ｈｃｙ補基質変換生成物はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）である、工程；
ｂ）ＳＡＭからＨｃｙを産生するために該ＳＡＨとＳＡＨ加水分解酵素とを接触させる工程によって、工程（ａ）で産生された該Ｈｃｙ補基質変換生成物ＳＡＨを評価する工程であって、該ＳＡＭは、該ＳＡＭ依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素によってＨｃｙ変換反応中に循環され、Ｈｃｙ補基質ベースの酵素循環反応系、およびアデノシン（Ａｄｏ）を形成し、該アデノシンは、該サンプル中の該Ｈｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために評価される工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記Ａｄｏが、前記ＳＡＨ加水分解酵素以外のアデノシン変換酵素と接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ａｄｏの評価が、前記アデノシン変換酵素によるアデノシン変換の、補基質の評価または反応生成物の評価によって間接的に達成される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アデノシン変換酵素がアデノシンキナーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アデノシン変換酵素がアデノシンデアミナーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、体液または生物学的組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記体液が、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞、痰、脳脊髄液、涙液、粘液、羊水からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記体液が血液である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記血液サンプルが、さらに血漿画分または血清画分に分離される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルと前記Ｈｃｙ補基質および前記Ｈｃｙ変換酵素との間の接触の前、または接触と同時に、該サンプル中の酸化型Ｈｃｙまたは結合型Ｈｃｙが還元型Ｈｃｙに変換される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ａｄｏが、クロマトグラフ分離なしで評価される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＡＭが、前記サンプルに添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＳＡＭが、ＳＡＭシンターゼによって、ＡＴＰおよびＭｅｔから生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
サンプル中のホモシステイン（Ｈｃｙ）をアッセイするための方法であって、該方法は以下：
ａ）Ｈｃｙ変換生成物およびＨｃｙ補基質変換生成物を形成するために、Ｈｃｙ変換反応中で、Ｈｃｙを含むサンプルまたはＨｃｙを含むと推測されるサンプルと、Ｈｃｙ補基質およびＨｃｙ変換酵素とを接触させる工程であって、ここで該Ｈｃｙ補基質はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であり、該Ｈｃｙ変換酵素はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素であり、該Ｈｃｙ変換生成物はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、そして該Ｈｃｙ補基質変換生成物はＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）である、工程；
ｂ）該サンプル中のＨｃｙの、存在、非存在および／または量を決定するために、該Ｈｃｙ補基質変換生成物ＳＡＨを評価する工程であって、ここで該ＳＡＨが、クロマトグラフ分離なしで評価される、工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記ＳＡＨの評価が、Ｈ２Ｏ２を産生する酵素反応およびＨ２Ｏ２の検出に関連しない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＳＡＭが前記サンプルに添加される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＳＡＭが、ＳＡＭシンターゼによって、ＡＴＰおよびＭｅｔから生成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
サンプル中のＨｃｙをアッセイするためのキットであって、該キットは、以下：
ａ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素；
ｂ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）またはＡＴＰ、ＭｅｔおよびＳＡＭシンターゼ；
ｃ）ＳＡＨ加水分解酵素；および
ｄ）アデノシン（Ａｄｏ）を評価するための試薬
を備える、キット。
【請求項１９】
前記Ａｄｏを評価するための試薬が、前記ＳＡＨ加水分解酵素以外のアデノシン変換酵素を含有する、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記アデノシン変換酵素が、アデノシンキナーゼまたはアデノシンデアミナーゼである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
サンプル中のＨｃｙをアッセイするためのキットであって、該キットは以下：
ａ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性ホモシステインＳ−メチル基転移酵素；
ｂ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）またはＡＴＰ、ＭｅｔおよびＳＡＭシンターゼ；ならびに
ｃ）ＳＡＨを評価するための試薬
を備えし、Ｈ２Ｏ２を産生するための酵素または試薬、およびＨ２Ｏ２を検出するための試薬を備えない、キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００７−５２８７１４（Ｐ２００７−５２８７１４Ａ）
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１８９５７（Ｐ２００６−５１８９５７）
【出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２２１８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００８２５２
【国際公開日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【出願人】（５９１０５６２５９）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２２１８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００８２５２
【国際公開日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【出願人】（５９１０５６２５９）
【Ｆターム（参考）】
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