ホルボール抗原
【課題】ホルボール抗原、抗ホルボール抗体、ホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法、ホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬及び検出用キットを提供する。
【解決手段】 ホルボール又はホルボール誘導体にキャリアータンパク質を結合させることにより、ホルボール及びホルボール誘導体に対する免疫原性を持たせたホルボール抗原を提供する。キャリアータンパク質としては、ＢＳＡ又はＲＳＡが好適に用いられる。このホルボール抗原を用いて抗ホルボール抗体を作製し、上の抗ホルボール抗体を用いて免疫学的方法により、ホルボール及びホルボール誘導体を検出する。好ましくは免疫学的方法がＥＬＩＳＡであり、さらに競合的ＥＬＩＳＡが好適に用いられる。検出用試薬は、抗ホルボール抗体を含み、さらに固相化抗ホルボール抗体及び酵素標識抗ホルボール抗体を含んでもよい。
【解決手段】 ホルボール又はホルボール誘導体にキャリアータンパク質を結合させることにより、ホルボール及びホルボール誘導体に対する免疫原性を持たせたホルボール抗原を提供する。キャリアータンパク質としては、ＢＳＡ又はＲＳＡが好適に用いられる。このホルボール抗原を用いて抗ホルボール抗体を作製し、上の抗ホルボール抗体を用いて免疫学的方法により、ホルボール及びホルボール誘導体を検出する。好ましくは免疫学的方法がＥＬＩＳＡであり、さらに競合的ＥＬＩＳＡが好適に用いられる。検出用試薬は、抗ホルボール抗体を含み、さらに固相化抗ホルボール抗体及び酵素標識抗ホルボール抗体を含んでもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホルボール抗原、抗ホルボール抗体、ホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法、ホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬及び検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
トウダイグサ（Euphorbia helioscopia L.）は日本の本州から南西諸島の道端や畑で見られる雑草である。和名のトウダイグサとは、花の姿が昔の照明器具「燈台(とうだい)」に似ていることからつけられた名前である。草丈は約３０ｃｍで、茎は1本立ちするか根元から分株して株立ちし、へら形の葉をまばらに互生し、茎の頂部には5枚の葉が輪生する。ここから上は花で、散形状に広がる花枝を数段出し、椀形の苞葉の中にごく小さな花を多数つける。花期は４〜６月、花色は黄色である。
【０００３】
トウダイグサが所属するトウダイグサ科（Euphorbiaceae）は種子植物門、被子植物亜門、双子葉植物綱、離弁花亜綱、トウダイグサ目に分類される。熱帯から亜熱帯に多く、木本または草本であり、およそ３００属・８０００種以上と非常に種類が多い。葉は互生、まれに対生し托葉を持つ。花は単生、がくと花弁は退化していて存在しないものもある。子房は上位、３室からなり、胚珠は子房各室に１個または２個がある。果はほとんどが朔果であり、３分果に分かれる。種子には肉質の胚乳がある。
【０００４】
トウダイグサ科植物は薬用、食用、油用、鑑賞用、化粧品、その他様々な目的に供される。その代表的な例は次の通りである。ヒマ（トウゴマ、Ricinus communis L.）は峻下薬であるひまし油の原料である。アブラギリ（Aleurites cordata Steud.）はα−エラエオステアリック酸（α−ｅｌａｅｏｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ）などを含み乾性油として用いられる桐油を種子からとることができる。パラゴムノキ（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）からは天然ゴムが採られ、ナンキンハゼ（Sapium sebiferum Roxburgh ）の種子からは和蝋燭用のろうが得られる。キャッサバ（Manihot esculenta Crantz.）はタピオカの原料として食用に用いられる。観賞用のものはトウダイグサ属に多く、ポインセチア（Euphorbia pulcherrima Willd）はクリスマスの時期によく見られる。ショウジョウソウ (Euphorbia heterophylla L.)、ハナキリン (Euphorbia. milii Des Moulin var.splendens Ursch et Leandri ) なども我々の目を楽しませてくれる。またキャンデリア（Euphorbia antisyphilitica Zucc.）の茎から抽出した固形状の成分は口紅・リップクリームなどの基材として用いられ、ヒマやククイナッツ（Aleurites moluccana）の種子から抽出されたオイルはスキンケア用植物オイルとして用いられる。アフリカのサバンナにみられるチュウテンカク（Euphorbia ingens E.May.）、オオマトイ（Euphorbia triangularis Desf.）らは木材として価値が検討されている（非特許文献１）。
【０００５】
その一方で、トウダイグサ科植物の一部は有毒植物として知られている。これらの植物は乳管を持ち、葉や茎を傷つけると白い乳液が流れ出る。乳液が肌に触れると、かぶれ・水ぶくれ・皮膚炎・結膜炎などを引き起こす。また誤って食べてしまうと、喉がはれ、嘔吐や下痢を引き起こす。この乳液にはホルボールおよびその各種誘導体が多く含まれている。
【０００６】
ホルボールは化１に示す化学構造をもつ、分子量３６４、イソプレン単位４個からなるＣ２０化合物である。
【０００７】
【化１】
【０００８】
このホルボールは、環式、チグラン型のジテルペノイドであり、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）から生合成される。トウダイグサ科植物に含まれるホルボール誘導体の多くはエステル体として存在し、その主な作用は次の２つである。
【０００９】
1つ目は皮膚刺激性である。ホルボール誘導体は皮膚に接触し、表皮細胞に接合することにより遅延型のアレルギーを生じさせる。表皮細胞を標的として、真皮に血管周囲性の滲出性炎症を起こし、表皮に好中球あるいはリンパ球の浸潤と細胞間浮腫である海綿状態をきたす。海綿状態は進行して水泡を形成する。臨床的には、かぶれ、湿疹、浮腫性紅斑、丘疹、水泡などが見られる。
【００１０】
２つ目として、ホルボール誘導体は代表的な発ガンプロモーターである。発ガン２段階説では初発段階（イニシエーション）と促進段階（プロモーション）の２段階があると考えられており、それぞれの段階で作用する物質を発ガンイニシエーター、発ガンプロモーターと呼ぶ。発ガンプロモーターは動物にこれのみを与えても発ガンしないが、イニシエーションを行った後に与えると発ガンする。なかでもハズ（Croton tiglium L.）の種子油、ナンキンハゼ（Sapium sebiferum）の葉等に含まれる１２−Ｏ−テトラデカノイル ホルボール−１３−アセテート（１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ ｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ：ＴＰＡ、ＰＭＡ）やシナアブラギリ（Aleurites fordii Hemsl.）などに含まれる１２−Ｏ−ヘキサデカノイル−１６−ヒドロキシホルボール−１３−アセテート（１２−Ｏ−ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ−１６−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ：ＨＨＰＡ）は非常に強力な発ガンプロモーターである。（非特許文献２）ＴＰＡ、ＨＨＰＡ等は細胞内のタンパク質リン酸化酵素プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のシステインが豊富なドメイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ：ＣＲＤ）に優位に結合し、これを活性化させ細胞のガン化を引き起こす（非特許文献３および４）。これらの物質はガン研究において、動物に腫瘍を形成させる際に汎用されている。
【００１１】
以上のように、ホルボール誘導体の多くはエステル体として存在し、皮膚刺激作用、瀉下作用をもち、そのほか魚毒活性をもつ。魚毒とは、毒を川や沼に流して毒によって麻痺した魚を浮かび上がらせて採る、現在の日本では禁止されている魚法に使う毒のことである。また、ホルボール誘導体で代表的な発ガンプロモーターであるＴＰＡは、ナノモル単位でマウスに腫瘍を発生させる（非特許文献５および６）。
【００１２】
そのため、これらトウダイグサ科植物を利用するに当たり、とくにその成分が直接人体に接触する食用・化粧品用に利用する場合は、ホルボールおよびその各種誘導体が混入することは非常に危険である。そこで、それらを検出する手法の開発が重要となるが、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの方法ではナノモル単位でホルボール及びホルボール誘導体を検出することはできない。またガスクロマトグラフィー（ＧＣ）では感度は高いが、高価な機器が必要となる。また、ホルボールには各種の誘導体が天然に存在しており、それらすべてを標品として準備し使用することは事実上不可能である。
【非特許文献１】竹松哲夫、一前宣正：世界の雑草II−離弁花類−、１５４−２０２、１９９３
【非特許文献２】奥田拓夫：薬用天然物化学−第2版−、１１６−１２０、２００３
【非特許文献３】Slater, S. J., Ho, C., et al.,: Protein kinase C αcontains two activator binding sites that bind Phorbol esters and diacylglycerols with opposite affinities. J. Biol. Chem., 271:4627-4631, 1996.
【非特許文献４】Medkova, M. ＆ Cho, W. : Interplay of C1 and C2 domains of protein kinase C-α in its membrane binding and activation . J. Biol. Chem., 274:19852-19861, 1999.
【非特許文献５】Clifford G. Tepper, Supriya Jayadev, et al.: Role for ceramede as an endogenous mediator of Fas-induced cytotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92: 8443-8447 1995.
【非特許文献６】Moammir H. Aziz, Deric L. Wheeler, et al.: Protein Kinase C δOverexpressing Transgenic Mice Are Resistant to Chemically but not to UV Radiation-Induced Development of Squamous Cell Carcinomas: A Possible Link to Specific Cytokines and Cyclooxygenase-2. Cancer Res 2006 66:(2). January 15, 2006.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そこで本発明は、ホルボールおよびその各種誘導体を幅広く、簡便に、高感度に検出するためのＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を確立し、ホルボール抗原、抗ホルボール抗体、ホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法、ホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬及び検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を行い、ホルボール及びホルボール誘導体にキャリアータンパク質を結合させることにより、ホルボール及びホルボール誘導体に対する免疫原性を持たせたホルボール抗原を作製することに成功した。そして、作製したホルボール抗原を用いて抗ホルボール抗体を作製し、作製した抗ホルボール抗体を用いて、免疫学的方法によりホルボール及びホルボール誘導体を検出することのできるホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明の請求項１記載のホルボール抗原は、ホルボール又はホルボール誘導体にキャリアータンパク質を結合させることにより、ホルボール及びホルボール誘導体に対する免疫原性を持たせたことを特徴とする。
【００１６】
本発明の請求項２記載のホルボール抗原は、請求項１において、前記キャリアータンパク質が、ＢＳＡ又はＲＳＡであることを特徴とする。
【００１７】
本発明の請求項３記載の抗ホルボール抗体は、請求項２記載のホルボール抗原を用いて作製したことを特徴とする。
【００１８】
本発明の請求項４記載のホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法は、請求項３記載の抗ホルボール抗体を用いて免疫学的方法により、ホルボール及びホルボール誘導体を検出することを特徴とする。
【００１９】
本発明の請求項５記載のホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法は、請求項４において、前記免疫学的方法がＥＬＩＳＡであることを特徴とする。
【００２０】
本発明の請求項６記載のホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法は、請求項５において、前記ＥＬＩＳＡが競合的ＥＬＩＳＡであることを特徴とする。
【００２１】
本発明の請求項７記載のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬は、請求項３記載の抗ホルボール抗体を含む。
【００２２】
本発明の請求項８記載のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬は、請求項３記載の抗ホルボール抗体を用いて作製した固相化抗ホルボール抗体及び酵素標識抗ホルボール抗体を含む。
【００２３】
本発明の請求項９記載のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬は、請求項７又は８において、前記抗ホルボール抗体がポリクローナル抗体である。
【００２４】
本発明の請求項１０記載のホルボール及びホルボール誘導体の検出用キットは、請求項７〜９のいずれかに記載のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬を備えている。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、本発明により作製したホルボール抗原を用いて、抗ホルボール抗体を作製する。そして、抗ホルボール抗体を用いて免疫学的方法により、ホルボール及びホルボール誘導体を検出する。本発明の免疫学的検出方法によれば、ホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬及び検出用キットを用いて、ホルボールおよびその各種誘導体を幅広く、簡便に、高感度に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明のホルボール抗原は、ホルボール又はホルボール誘導体にキャリアータンパク質を結合させることにより、ホルボール及びホルボール誘導体に対する免疫原性を持たせたことを特徴とする。
【００２７】
ホルボールは分子量が３６４と小さく免疫原性を持たないため、そのまま単独で免疫しただけでは抗体は産生されない。免疫原性を持つためには一般に分子量１０，０００以上が必要と言われている。ホルボールは免疫原性を持たないが、反応原性は有しているハプテン（ｈａｐｔｅｎ）であるので、完全抗原であるタンパク質と結合させることによって、免疫原性を持たせることができる。免疫原性とは抗体産生や感作リンパ球を誘発する性質のことであり、反応原性とは抗体あるいは感作リンパ球と特異的に反応する性質のことである（西岡久壽彌、眞崎知生：役に立つ免疫実験法 第2版、11、1994）。多くの薬剤を含む低分子の有機化合物はハプテンに属し、それ自体は免疫原性を持たない。しかし、タンパク質をキャリアーとして、これと共有結合した複合体は免疫原性を持つ。その際、ハプテン部分はエピトープとして認識され、抗ハプテン抗体が産生される。
【００２８】
キャリアータンパク質としては、ＢＳＡ又はＲＳＡが好適に用いられる。
【００２９】
ＢＳＡはウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）であり、ＲＳＡはウサギ血清アルブミン（ｒａｂｂｉｔ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ)である。キャリアータンパク質としては、ほかに、スカシ貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ：ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ：ＯＶＡ）を用いることができる。
【００３０】
また、本発明の抗ホルボール抗体は、上記のホルボール抗原を用いて作製したことを特徴とする。
【００３１】
ホルボールの誘導体は、その構造の１２位、１３位炭素に結合している２級水酸基と３級水酸基のエステル体として存在しているものが多い。本発明では多くのホルボール及びホルボール誘導体を一度に検出できるアッセイ系の確立を目的にしているため、ホルボール及びホルボール誘導体に共通する構造を認識する抗体を作製する。そのため、目的の抗体を作製するために１３位炭素に結合している水酸基をエステル化し、キャリアータンパク質に結合させる。
【００３２】
ホルボールエステル体とキャリアータンパク質の複合体を動物に免疫しても、立体障害により、ホルボールのエステル部分がエピトープと認識されずに抗体が産生されないケースも考えられる。目的のエピトープがキャリアータンパク質の表面に出ていない可能性があるからである。そのため、キャリアータンパク質の表面にエピトープを出すために、リンカー（架橋剤、スぺーサー）と呼ばれる繋ぎの化合物を使用する。リンカーには、ＫＭＵＨ（Ｎ−（κ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、ＥＭＣＨ（Ｎ−（ε−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）等を用いることができる。これらはスルフィド基、およびカルボキシル基との反応性を有する両機能性リンカーである。ＢＳＡ、ＲＳＡのアミノ酸配列はすでに決定されており、両分子１ｍｏｌ中にはシステインが３５ｍｏｌ存在する。そのシステインのスルフィド基とホルボールエステル体のカルボキシル基を架橋して合成する。
【００３３】
抗原には抗体と特異的に結合する部位があり、この領域を抗原決定基という。抗体が抗原決定基を認識することによって、免疫系が特異性を持つことができる。抗体のもつ精密な抗原認識機能のために、免疫学的実験手法の中で抗体を用いたものが最も広く利用されている。ＥＬＩＳＡもその中のひとつである。
【００３４】
また、本発明のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬は、ホルボール及びホルボール誘導体をＥＬＩＳＡにより検出することができるように、本発明のホルボール抗原を用いて作製され、本発明のホルボール抗原を認識して特異的に反応する抗ホルボール抗体を含むものである。
【００３５】
または、本発明のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬は、本発明の抗ホルボール抗体を用いて作製した固相化抗ホルボール抗体及び酵素標識抗ホルボール抗体を含む。
【００３６】
本発明の抗ホルボール抗体としては、モノクローナル抗体であってもよい。
【００３７】
本発明の検出用キットは、以上のようなホルボール化合物の検出用試薬を備えている。
【００３８】
以下に具体例を挙げて詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの具体例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
（抗原作製）
（１）ホルボールのエステル化
ホルボール誘導体は、１２位、１３位炭素水酸基のエステル体として存在しているものが多い。本発明ではホルボール及びホルボール誘導体に共通する構造を認識する抗体の作製を目的としているので、１３位炭素水酸基のエステル化を試みた。はじめにホルボールにコハク酸を反応させ、１３位、２０位炭素水酸基をエステル化しホルボール １３，２０−ジサクシネートを合成した後、２０位の対応するエステルを加溶媒分解して、ホルボール １３−サクシネートに導く方法をとった。
【００４０】
まず、ホルボール（シグマ、Ｐ１２８１）１８ｍｇとコハク酸無水物３０ｍｇをピリジン２ｍＬに入れ、９０℃、油浴中で３時間攪拌した。反応液の溶媒を留出した後、残滓をＯＤＳカラム（メタノール―１％酢酸溶液）で精製し、無色・非結晶粉末状のホルボール １３，２０−ジサクシネート（２０ｍｇ・収率７２％）を得た。
【００４１】
すなわち、ホルボールをピリジン中コハク酸無水物と反応させ、まずホルボール １３，２０−ジサクシネートを得た。
【００４２】
化２に、ホルボール １３，２０−ジサクシネートの合成方法を示す。
【００４３】
【化２】
【００４４】
この化合物のＥＳＩ−ＭＳの結果から、ホルボールよりもコハク酸残基２個分の２００多い分子量が確認されたこと、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、２０位のプロトンが低磁場にシフトしていること、１２位のプロトンはシフトしておらず、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて１３位炭素が６９．５ｐｐｍに観測され、これはこれまでのデータから１３位アシル体を推定させる値であることから（表１）、得られた化合物をホルボール １３，２０−ジサクシネートと決定した。
【００４５】
次に、０℃において、このホルボール １３，２０−ジサクシネート７ｍｇのメタノール溶液１ｍＬに、２％ＮａＯＭｅ−メタノール溶液１００μＬを加え、氷浴上で９時間攪拌した。反応液を１％酢酸で中和後、分取逆相ＴＬＣ（メタノール：１％酢酸＝２：３の水溶液）と逆相ＨＰＬＣ（メタノール−１％酢酸の水溶液）を用いて精製し、無色・非結晶粉末状のホルボール １３−サクシネート（１．３ｍｇ・収率４０％）を得た。
【００４６】
すなわち、ホルボール １３，２０−ジサクシネートをメタノール中２％ＮａＯＭｅ−メタノール溶液を用いて加溶媒分解し、ホルボール １３−サクシネートを得た。
【００４７】
化３に、ホルボール １３−サクシネートの合成方法を示す。
【００４８】
【化３】
【００４９】
この化合物は、ＥＳＩ−ＭＳでホルボールよりもコハク酸残基１個分の１００多い分子量と分子式が確認できたこと、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて１２位、２０位ともホルボールとほぼ同じ化学シフト値を示すのに対して、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて１３位の炭素は、ジサクシネートとほぼ同じ化学シフト値を示すことから（表１）、残ったサクシネートは１３位にあると決定した。
【００５０】
（２）ホルボールのエステル化の確認
ホルボールのエステル化の確認をＮＭＲ及びＥＳＩ ＭＳ測定で行った。表１に、そのＮＭＲスペクトルデータとＥＳＩ ＭＳ値を示す。
【００５１】
【表１】
【００５２】
（３）ホルボール １３−サクシネート―ＫＭＵＨ―ＢＳＡ複合体（Ｐ−ＢＳＡ）の合成
作製したホルボール １３−サクシネートとキャリアータンパク質であるＢＳＡを結合させ、Ｐ−ＢＳＡを合成するために、反応温度・溶媒・反応時間・反応比・リンカーなど反応の様々な条件を検討した（Gong Wu, Rolf F. Barth, et al., (2004) Site-Specific Conjugation of Boron-Containing Dendrimers to Antibody Cetuximab (IMC-C225) and Its Evaluation as a Potential Delivery Agent for Neutron Capture Therapy. Bioconjugate Chem. 15: 185−194）。検討の結果、以下の方法で合成を行った（化４）。
【００５３】
【化４】
【００５４】
１．キャリアータンパク質であるＢＳＡ（シグマ、Ａ−７９０６）２．０ｍｇ（Ｍ．Ｗ．≒６６０００ ３．０×１０−８ｍｏｌ）をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）４．０ｍＬに溶解した。
２．リンカーであるＫＭＵＨ(ピアス、２２１１１)３．１ｍｇ（Ｍ．Ｗ．＝２９５．３８ ３．０×１０−８×３５×１０ｍｏｌ）をＤＭＳＯ１００μＬに溶解した。
３．１と２を混合し、遮光下、３７℃で４時間反応させた。
４．ホルボール １３−サクシネート０．９７ｍｇ（Ｍ．Ｗ．＝４６４．４ ３．０×１０−８×３５×２ｍｏｌ）をＤＭＳＯ２０μＬに溶解した。
５．３と４を混合し、遮光下、３７℃で２４時間反応させた。
【００５５】
（４）Ｐ−ＢＳＡ合成の確認
ホルボール−タンパク質複合体合成の確認およびホルボール結合数の測定は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）によって行った。
【００５６】
Ｐ−ＢＳＡが合成されたことをＴＯＦ−ＭＳ測定により確認した。また、その分子量を測定することで、結合数を測定した。ＢＳＡ、ＢＳＡとＫＭＵＨを反応させたもの、ＢＳＡとＫＭＵＨとホルボール １３−サクシネートを反応させたもののＴＯＦ−ＭＳスペクトルを各々測定した。
【００５７】
ＴＯＦ−ＭＳ測定により得られた各生成物の分子量を表２に示す。ＢＳＡの分子量は６６５００．４であり、以前報告された分子量の計算値である６６２６７とほぼ一致した。差は０．３５２％であった（Reed RG, Puntma FW and Peters Jr T (1980) Sequence of residues 400−403 of bovine serum albumin. Biochem.J. 191: 867−868）。
【００５８】
【表２】
【００５９】
ＫＭＵＨは分子量が２９５．３８でありＢＳＡにＫＭＵＨが１つ結合すると、分子量は２９５．３８増加する。またホルボール １３−サクシネートは分子量が４６４．４でありＢＳＡ−ＫＭＵＨにホルボール １３−サクシネートが１つ結合すると、分子量は４４６．４増加する。このことからＢＳＡへのＫＭＵＨ、ホルボール １３−サクシネートの結合数を計算すると、
（７０８４８．８−６６５００．４）÷２９５．３８≒１４．７２
（７２２００．１−７０８４８．８）÷４４６．４≒３．０２７
以上より、ＢＳＡ１ｍｏｌにつき、ＫＭＵＨ１５ｍｏｌ、ホルボール １３−サクシネート３ｍｏｌが結合したことを確認した。
【００６０】
（５）ホルボール １３−サクシネート−ＫＭＵＨ−ＲＳＡ複合体（Ｐ−ＲＳＡ）合成およびその確認
Ｐ−ＢＳＡ合成と同様の方法で、ホルボール １３−サクシネートとＲＳＡ（シグマ、Ａ−０６３９）を反応させホルボール １３−サクシネート−ＫＭＵＨ−ＲＳＡ複合体（Ｐ−ＲＳＡ）を合成した。Ｐ−ＲＳＡが合成されたことをＴＯＦ−ＭＳ測定により確認した。またその分子量を測定することで、結合数を測定した。
【００６１】
ＢＳＡ、ＲＳＡとＫＭＵＨを反応させたもの、ＲＳＡとＫＭＵＨとホルボール １３−サクシネートを反応させたものを各々測定した。
【００６２】
ＴＯＦ−ＭＳ測定により得られた各生成物の分子量を表３に示す。
【００６３】
【表３】
【００６４】
ＫＭＵＨは分子量が２９５．３８でありＲＳＡにＫＭＵＨが１つ結合すると、分子量は２９５．３８増加する。またホルボール １３−サクシネートは分子量が４６４．４でありＲＳＡ−ＫＭＵＨにホルボール １３−サクシネートが１つ結合すると、分子量は４４６．４増加する。このことからＲＳＡへのＫＭＵＨ、ホルボール １３−サクシネートの結合数を計算すると、
（７０８６２．６−６６２６５．５）÷２９５．３８≒１５．５６
（７２８８９．１−７０８６２．６）÷４４６．４≒４．５４０
以上より、ＲＳＡ１ｍｏｌにつき、ＫＭＵＨ１６ｍｏｌ、ホルボール １３−サクシネート５ｍｏｌが結合したことが確認された。
【実施例２】
【００６５】
（抗体作製）
ホルボールに対するモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）およびポリクローナル抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を作製した。
【００６６】
（１）抗ホルボールモノクローナル抗体作製
１−１．免疫
実施例１で作製したＰ−ＢＳＡをアジュバンド（免疫賦活化剤）と混合し、マウスに下記のように免疫した。脾臓細胞とミエローマ細胞は遺伝的に同系マウス由来のもののほうが、ハイブリドーマ形成率が高い。ＰＡＩ細胞がＢＡＬＢ／ｃマウス由来のものであるため、ＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫した。
【００６７】
実験には、７週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズ・リバー）１１匹を使用した。
【００６８】
Ｐ−ＢＳＡ６．０７ｍｇ、インコンプリート・フロインド・アジュバンド（和光純薬）４．４ｍＬ、乾燥マイコバクテリウム・ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ）（和光純薬）２９．０４ｍｇを５ｍＬシリンジ（テルモ）に入れ、硬くなるまで混合した。シリンジに２６Ｇ注射針（テルモ）を付け、1匹につき４００μＬ、６ヶ所に腹腔内注射した。１４日ごとに５度行った。２度目以降は乾燥マイコバクテリウム・ブチリカムは加えなかった。
【００６９】
１−２．抗体産生の確認
マウス眼窩静脈叢から毛細管を用いて血液をサンプリングし、室温、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、血清と血餅に分けた。９６ウェルイムノプレートにＰ−ＢＳＡ１ｍｇ／２００ｍＬ（０．５μｇ／ウェル）を吸着させ、血清中の抗体産生をＥＬＩＳＡで確認した。本実施例では、Ｐ−ＢＳＡをマウスに免疫したため、マウスの血清中には抗ＢＳＡ抗体と抗ホルボール抗体が混在している。そのため、抗ＢＳＡ抗体を除くために、希釈にはＢＳＡ１ｍｇ／ｍＬ含有ＰＢＳを用いた。
【００７０】
詳しい実験の手順は以下のとおりである（Hiroyuki Tanaka,Yukihiro Shoyama (1999) Monoclonal anti body against tetrahydrocannabinolic acid distinguishes Cannabis sativa samples from different plant species. Forensic Science International 106: 135−146）、（Ritsu Sakata, Yukihiro Shoyama and Hiroki Murakami (1994) Production of monoclonal antibodies and enzyme immunoassay for typical adenylate cyclase activator, Forskolin. Cytotechnology 16:101−108）。
１．ＢＳＡ（シグマ、Ａ−７９０６）１ｍｇ、Ｐ−ＢＳＡ１ｍｇを各々ＰＢＳ２００ｍＬに溶解した。これらを抗原とし９６ウェルイムノプレート（スミロン）にそれぞれ１００μＬ、４８ウェルずつ入れた。４℃で一晩インキュベートし、吸着させた（０．５μｇ／１００μＬ／ウェル)。
２．０．０５％トウィーン２０（ナカライテスク）含有ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で３度洗浄した。
３．非特異的吸着を防ぐために５％スキムミルク（雪印乳業）含有ＰＢＳで１時間ブロッキングした。ＴＰＢＳで３度洗浄した。
４．血清をＢＳＡ１ｍｇ／ｍＬ含有ＰＢＳで１０、４０、２００、１０００倍希釈した。３０分間静置した後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を１ウェルにつき６０μＬ入れ、３７℃で一晩インキュベートした。ＴＰＢＳで３度洗浄した。
５．０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで４０００倍希釈した二次抗体ＨＲＰ−ラット 抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ジムド・ラボラトリーズ）を１ウェルにつき１００μL入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＴＰＢＳで５度洗浄した。
６．基質Ｏ−フェニレンジアミン溶液に使用直前に３０％過酸化水素水３０μＬを加え、１ウェルにつき１００μＬ入れた。遮光して３７℃で１時間インキュベートした。なお、Ｏ−フェニレンジアミン溶液は、Ｏ−フェニレンジアミン（ナカライテスク）２０ｍｇを０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸緩衝液５０ｍＬに溶解し、作製した。また、０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸緩衝液の調製方法は以下のとおりである。
Ａ クエン酸（ナカライテスク）１．９２ｇを１００ｍＬの水に溶解させたもの
Ｂ リン酸水素２ナトリウム１２水和物（ナカライテスク）７．１７ｇを１００ｍＬの水に溶解させたもの
Ａ２４．３ｍＬとＢ２５．７ｍＬを混合し、１００ｍＬにメスアップした後、ｐＨ５．０に調整した。
７．６Ｎ硫酸を１０μＬずつ加え反応を停止させた。よく攪拌し、マイクロプレートリーダー（４９０ｎｍ、単一波長）で測定した。
【００７１】
本実施例では、１１匹のマウスに免疫したが、ホルボールの毒性のため腹腔内で癒着がおこり、４匹のマウスが飼育中に死亡した。マウス７匹において抗ホルボール抗体の産生がみられた（図１）。
【００７２】
１−３．ハイブリドーマの作製
血清中に抗体価の上昇が認められたマウス５匹から脾臓細胞を調製し、ミエローマ細胞とポリエチレングリコールを用いて細胞融合させ、ハイブリドーマを作製した。ミエローマ細胞はＰＡＩ細胞（マウス骨髄腫細胞）を使用した。作製したハイブリドーマはＨＡＴ培地・ＨＴ培地で培養した。
【００７３】
ａ．細胞培養
培養は３７℃、空気中二酸化炭素５％条件下で行った。培養条件を以下に示す。ＦＢＳは５６℃で３０分加温して非働化した後使用した。
【００７４】
Ａ．ＰＡＩ細胞（ミエローマ細胞：マウス）
培養培地：ＲＰＭＩ１６４０（アーバイン・サイエンティフィック）と２．０ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ（アーバイン・サイエンティフィック）、１００００ユニット／ｍＬペニシリンと１００００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）
Ｂ．ハイブリドーマ
ａ．培養培地（０−１３週齢）：ＨＡＴ培地：ＲＰＭＩ１６４０（アーバイン・サイエンティフィック）と２．０ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ（ハイクローン）、１００００ユニット／ｍＬペニシリンと１００００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ギブコ）、ＨＡＴ培地サプリメント (シグマ)
ｂ．培養培地（１４−２０週齢）：ＨＴ培地：ＲＰＭＩ１６４０（アーバイン・サイエンティフィック）と２．０ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ（ハイクローン）、１００００ユニット／ｍＬペニシリンと１００００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（ギブコ）、ＨＴ培地サプリメント（シグマ）
ｃ．培養培地（２１週齢以降）：ＲＰＭＩ１６４０（アーバイン・サイエンティフィック）と２．０ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ（アーバイン・サイエンティフィック）、１００００ユニット／ｍＬペニシリンと１００００μｇ/mlストレプトマイシン（ギブコ）
ｄ．培養培地（限界希釈法）：ＲＰＭＩ１６４０（アーバイン・サイエンティフィック）と２．０ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ（ハイクローン）、１００００ユニット／ｍＬペニシリンと１００００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ギブコ）、１０％ハイブリドーマ・クローニング・ファクター（アイゲン）
詳しい実験の手順は以下のとおりである。なお、細胞融合の操作は全て室温で行った。
【００７５】
ｂ．脾臓細胞の回収と計数
１．細胞融合を行う３日前に最終免疫を行った。
２．マウスをエーテルによって致死させた。７０％エタノールで十分消毒した後、マウスをクリーンベンチ内に入れた。
３．左わき腹から脾臓を摘出した。
４．ＲＰＭＩ１６４０（無血清）入りのディッシュ中で、ピンセットとハサミを用いて脾臓に付着した脂肪などを丁寧に除去した。
５．別のディッシュ中にて２６Ｇ針付き注射器で脾臓にＲＰＭＩ１６４０（無血清）を送り込み、リンパ球を遊離させた。
６．滅菌済みナイロンメッシュで不要物を取り除いた後、全ての細胞を１５ｍＬコニカルチューブに集め、２０００ｒｐｍで５分間遠心して沈殿させた。沈殿物は赤色であった。
７．上清を取り除き、沈殿物を５ｍＬ０．８３％塩化アンモニア水溶液（０．２２μｍフィルター滅菌済）に氷上で５分間懸濁することにより、赤血球を溶血させた。２０００ｒｐｍで５分間遠心して沈殿させた。
８．上清を取り除いた後、ＲＰＭＩ１６４０（無血清）＋ゲンタマイシン溶液（１０〜２０μｇ／ｍＬ）（シグマ、Ｇ１３９７）を加え、５０ｍＬにした。脾臓細胞懸濁液５０ｍＬから５０μＬとり、ＲＰＭＩ１６４０（無血清）４５０μＬと混合した。この５００μＬから１０μＬとり計数した。残りを２０００ｒｐｍで５分間遠心し沈殿させた。沈殿物は白色であった。沈殿物にＲＰＭＩ１６４０（無血清）５０ｍＬを加え、懸濁した。
【００７６】
ｃ．ミエローマ細胞の回収と計数
１．シャーレで培養したミエローマ細胞を滅菌済みナイロンメッシュで不要物を取り除いた後、コニカルチューブに集めた。
２．２０００ｒｐｍで５分間遠心して沈殿させ、上清を取り除き、ＲＰＭＩ（無血清）で５０ｍＬにした。１０μＬとり計数した。
【００７７】
ｄ．細胞融合
１．ミエローマ細胞（５×１０７セル）と脾臓細胞（５×１０７セル）を混合し、ＲＰＭＩ１６４０（無血清）で５０ｍＬにした。２０００ｒｐｍで５分間遠心し沈殿させ、上清をできるだけ多く取り除いた。
２．７０℃で溶解したポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ、シグマ、ハイブリ・マキシ・シグマ、Ｐ２９０６）５ｍＬに３７℃で温めておいたＲＰＭＩ１６４０（無血清）５ｍＬ、ＤＭＳＯ１．５ｍＬを加えた。（以下、融合混合物と略す。）
３．ゆっくりと振り混ぜながら１分以上かけ、融合混合物２．３ｍＬを加えた。９０秒間、３７℃湯浴中で振り混ぜた。
４．ＲＰＭＩ１６４０（無血清）（全量２１ｍＬ）をピペットの先端で細胞をつつきながら、次のように加えた。３０秒間１ｍＬ、３０秒間３ｍＬ、1分間１７ｍＬ。
５．ＲＰＭＩ１６４０（無血清）で５０ｍＬにし、室温で５分間放置した。１５００ｒｐｍで１０分間遠心した。ＤＭＳＯを除去するためにこの作業を２度繰り返した。
６．上清を取り除き、沈殿を５０ｍＬＨＡＴ培地に懸濁した。
７．９６ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ細胞懸濁液をいれ、培養した。
８．融合した日を０日として、２・３・５・８・１１日目にＨＡＴ培地を１００μＬ捨て、１００μＬ加えた。１４日目にＨＴ培地に変更した。２１日目まで３日おきにＨＴ培地を１００μＬ捨て、１００μＬ加えた。２１日目からＲＰＭＩ１６４０培地に変更し、培養を続けた。
【００７８】
ハイブリドーマの培養は、７４７ウェルプレートで行った。培養を続けると、１０日目くらいからハイブリドーマの増殖が顕微鏡で観察できるようになった。コロニーを計数したところ、１２７ウェルでコロニーの形成が確認された。
【００７９】
１−４．スクリーニング
抗フォルボール抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングのために、コロニーの形成が確認されたウェルから上清を採取し、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡの手順は１−２．抗体産生の確認と同様に行った。４９０ｎｍで吸光度を測定した。
【００８０】
得られたハイブリドーマのうち、１−１ ５Ｇ、１−１ ６Ｆ、１−２ １０Ｆ、１−３ ７Ｄ、１−３ ８Ａ、１−３ １１Ｄ、２−３ ２Ｈ、２−３ ８Ａ、３−２ １１Ｄの９株を陽性と判定した。（数字はハイブリドーマの系統Ｎｏ．を示している。数字の最初は脾臓を摘出したマウスのＮｏ．、次の数字はコロニーＮｏ．、次はそのコロニーからサブクローニングによって得たクローンのＮｏ．（コロニーの生育しているウェルの位置）をそれぞれ示している。）
１−５．クローニング
陽性と判定したウェルには数種類のハイブリドーマが混在していると考えられる。そこで、目的とする抗体を産生している細胞のみを得るために、スクリーニングしたウェルから抗ＢＳＡ抗体産生細胞を除き、抗ホルボール抗体産生細胞のみを選抜するために、クローニングを行った。
【００８１】
陽性と判断した９株を限界希釈法でクローニングした。1ウェルに細胞１個が入るように液体培地を希釈、調整して、９６ウェルプレートにまき液体培地中で単一種類のコロニーを形成させた。
【００８２】
限界希釈法によるクローニングは、以下の手順により行った。
１．計数板でハイブリドーマを計数し、１ウェルにつき細胞１個が入るように、培地を１００個／１０ｍＬに希釈・調整した。培地にはハイブリドーマ・クローニング・ファクター（アイゲン）を最終濃度で１０％加えた。
２．９６ウェルプレートに各ウェル１００μＬずつまいた。
３．液体培地中で単一種類のコロニーを形成させた。
４．確実に単一コロニーにするために、１〜３をもう一度繰り返した。
【００８３】
その後、顕微鏡で観察し、コロニーが形成されているウェルの上清を採取し、ＥＬＩＳＡを行った。ハプテンと結合した抗体の量を、ホースラディッシュ・ペルオキシターゼ（ＨＰＲ）で標識した二次抗体の結合量を４９０ｎｍの吸光度（基質であるフェニレンジアミンからＨＲＰによって生成する反応産物の色）を測定することにより評価した。９株中２−３ ８Ａ ９、３−２ １１Ｄ ８の２株において、抗体の産生が見られた（図２）。
【００８４】
１−６．抗体の作製・精製
限界希釈法で抗体の産生が確認された２株のハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に投与し、抗体を作らせた。
【００８５】
抗体の培養には、７週齢の雌性ＩＣＲヌードマウス（チャールズ・リバー）６匹を使用し、実験は以下のとおりに行った。
１．ハイブリドーマ（２×１０６セル／マウス）をマウス腹腔内に打ち込んだ。
２．パスツールピペットで腹水を採取した。
【００８６】
２０〜２５日で腹部が肥大してきたため、腹水を採取した。採取した腹水は１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を採取し、凍結保存した。
【００８７】
(２)抗ホルボールポリクローナル抗体作製
２−１．免疫
実施例１で作製したＰ−ＲＳＡをアジュバンドと混合し、ウサギに免疫した。
なお、コントロールとして使用するために、免疫前にウサギの耳の静脈から少量採血しておいた。12週齢の雌性日本白ウサギ1匹を使用し、以下のとおり実験を行った。
【００８８】
Ｐ−ＲＳＡ６．０７ｍｇ、インコンプリート・フロインド・アジュバンド（和光純薬工業）４．４ｍＬ、乾燥マイコバクテリウム・ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ）（和光純薬工業）２９．０４mgを５ｍＬシリンジに入れ、硬くなるまで混合した。シリンジに２２G注射針を付け、０．２ｍＬずつ全量２ｍＬを背中１０ヶ所に皮内注射した。１４日ごとに７度行った。２度目以降は乾燥マイコバクテリウム・ブチリカムは加えなかった。
２−２．抗体産生の確認
ウサギの耳介動脈から血液をサンプリングし、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、血清と血餅に分けた。96ウェルイムノプレートにＰ−ＲＳＡおよびＲＳＡを吸着させ、血清中の抗体産生を直接ＥＬＩＳＡで確認した。コントロールには免疫前のウサギの血清を用いた。
【００８９】
直接ＥＬＩＳＡによる抗体産生の確認は、以下のとおりに行った。
１．ＲＳＡ(シグマ、Ａ−０６３９)１ｍｇ、Ｐ−ＲＳＡ１ｍｇをそれぞれＰＢＳ２００ｍＬに溶解した。これらを抗原とし９６ウェルイムノプレートにそれぞれ１００μＬ、４８ウェルずつ入れた。４℃で一晩放置し、吸着させた（０．５μｇ／１００μＬ／ウェル)。
２．０．０５％トウィーン２０含有ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で３度洗浄した。
３．非特異的吸着を防ぐために、５％スキムミルク含有ＰＢＳで１時間ブロッキングした後、ＴＰＢＳで３度洗浄した。
４．１０〜２５６００倍に希釈した血清をプレートにまき、３７℃で１時間インキュベートした。ＴＰＢＳで３度洗浄した。
５．０．１％ＲＳＡ含有ＰＢＳで４０００倍希釈した二次抗体ＨＲＰ−ヤギ・抗ウサギＩｇＧ ＤＳ グレード（ジムド・ラボラトリーズ）を１ウェルにつき１００μＬ入れ、３７℃で１時間インキュベートした。
６．ＴＰＢＳで５度洗浄した。基質Ｏ−フェニレンジアミン溶液に使用直前に３０％過酸化水素水３０μＬを加え、１ウェルにつき１００μＬ入れた。遮光して３７℃で１０分間インキュベートした。
７．６Ｎ硫酸を１０μＬずつ加え反応を停止させた。よく攪拌し、マイクロプレートリーダー（４９０ｎｍ、単一波長）で測定した。
【００９０】
その結果、免疫したウサギにおいて、抗体価の上昇がみられた（図３）。キャリアータンパク質であるＲＳＡをプレートに吸着させたウェルでは吸光度の上昇はみられないことから、抗ＲＳＡ抗体は産生されておらず、抗ホルボール抗体が産生されていることを確認した。
【００９１】
２−３．抗体の採取・精製
免疫したウサギで、抗ホルボール抗体の産生が確認されたため、心臓採血により全血を採取した。採取した血液を、室温、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、血清と血餅に分けた。血清を硫安沈殿し、沈殿物を適量のＰＢＳに溶解し、透析後、凍結保存した。
【００９２】
心臓採血は次のとおりに行った。採血を行う３日前に最終免疫を行った。ネンブタール（大日本製薬）１mＬをウサギの耳の静脈から打ち込み、麻酔をかけた。心臓に１６G留置針（テルモ）を刺し、心臓採血を行った。血液を室温、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、血清と血餅に分離した。
【００９３】
抗体の精製のための血清の硫安沈殿（植木厚：免疫生化学研究法、13-14、 1986）は以下のとおりに行った。
１．血清３７．５ｍＬにＰＢＳ３７．５ｍＬを加えた。スターラーで攪拌しながら、硫酸アンモニウム飽和溶液３７．５ｍＬを少量ずつ滴下した。白い沈殿が発生してきた。一晩静置した。なお、飽和硫酸アンモニウム水溶液の調製はつぎのとおりに行った。約８００ｇの硫酸アンモニウム（ナカライテスク）に１Ｌ蒸留水を加え加温溶解し、室温でわずかに結晶が析出するまで冷却した。この飽和溶液は酸性を示すので、少量をとって蒸留水で１０倍希釈した溶液がｐＨ７．０〜７．２になるようにアンモニア水で調整した（植木厚：免疫生化学研究法、13-14、 1986）。
２．超遠心機で１５℃、８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。沈殿を採り、ＰＢＳ３７．５ｍＬに溶かした。
３．硫酸アンモニウム飽和溶液１８．７５ｍＬを加えて再沈殿を行い、同じ条件で再び超遠心機にかけた。
４．上清を捨て、沈殿を適量のＰＢＳに溶かした。
【００９４】
透析は、以下のとおりに行った。硫安沈殿で得られた沈殿を半透膜（Ｃｅｌｌｕ Ｓｅｐ（登録商標）Ｔ１、フナコシ）に入れた。ＰＢＳ３Ｌ中に入れ、低温実験室（４℃）においてスターラーでゆっくり攪拌し、透析した。８時間を1回として３度繰り返した。
【実施例３】
【００９５】
（ホルボール誘導体検出法の検討）
ホルボール誘導体およびトウダイグサ科植物含有成分あるいはそれらの成分と類似した基本骨格を有する化合物を用いて、作製した抗ホルボール抗体の特異性を競合ＥＬＩＳＡで検討した。
【００９６】
まず抗ホルボール抗体にサンプルを加えて一定時間静置し、サンプル中の検出対象物質と抗ホルボール抗体との間に抗原抗体反応を起こさせた。この混合物を、あらかじめ抗原（Ｐ−ＢＳＡ、Ｐ−ＲＳＡ）を吸着させておいたプレートに加えた。ここでも再度、抗原抗体反応が起こる可能性がある。しかし、先の反応で抗ホルボール抗体がサンプル中の対象物質を捕捉していれば、プレートに吸着させた抗原（Ｐ−ＢＳＡ、Ｐ−ＲＳＡ）とは反応することはできない。逆に、捕捉していなければ、プレートに吸着させた抗原と結合する。その後、二次抗体、基質溶液を加えて発色させ、吸光度を測定した。
【００９７】
サンプル中の対象物質と抗ホルボール抗体の親和性が高ければ、吸光度は小さくなる。親和性が小さければ、吸光度は大きくなる。つまり作製した抗ホルボール抗体の特異性が高ければ、吸光度も高くなり、低ければ吸光度も低くなる。
【００９８】
競合的ＥＬＩＳＡを行うために、プロトコールの条件検討を行った。抗体希釈倍率、サンプル濃度、溶媒、反応時間、反応時間等を検討した。
【００９９】
検討した条件で、競合ＥＬＩＳＡを行い、抗ホルボール抗体の特異性、非特異的吸着性の有無を確かめ、その検出感度を測定した。また様々なホルボール誘導体をサンプルとしてアッセイし、抗ホルボール抗体の抗原認識部位を推定した。
【０１００】
実施例２までに抗ホルボールモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を作製したが、実施例３では、より抗体価の高かったポリクローナル抗体を用いて、実験を進めた。
【０１０１】
抗ホルボール抗体特異性の検討における競合的ＥＬＩＳＡは、以下のとおりに行った。
１．Ｐ−ＢＳＡ１ｍｇをＰＢＳ２００ｍＬに溶解した。これを９６ウェルイムノプレートに１００μＬずつ入れ、４℃で一晩放置し、吸着させた（０．５μｇ／１００μＬ／ウェル）。ウサギ血清と表４記載の各種化合物またはホルボール誘導体とを０．６ｍＬチューブに入れ、混合し、４℃で一晩放置した。
２．０．０５％トウィーン２０含有ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で３度洗浄した。
３． 非特異的吸着を防ぐため５％スキムミルク含有ＰＢＳで１時間ブロッキングした。ＴＰＢＳで３度洗浄した。
４．混合物をプレートに入れ、３７℃で２時間インキュベートした。ネガティブコントロールには溶媒ＤＭＳＯのみを添加した。ＴＰＢＳで３度洗浄した。
５． ０．１％ＲＳＡ含有ＰＢＳで４０００倍希釈した二次抗体ＨＲＰ−ヤギ・抗ウサギＩｇＧ ＤＳ グレードを１ウェルにつき１００μＬ入れ、３７℃で２時間インキュベートした。
６．ＴＰＢＳで５度洗浄した。基質Ｏ−フェニレンジアミン溶液に使用直前に３０％過酸化水素水３０μＬを加え、１ウェルにつき１００μＬ入れた。遮光して、３７℃で１０分間インキュベートした。
７．６Ｎ硫酸を１０μＬずつ加え反応を停止させた。よく攪拌し、マイクロプレートリーダー（４９０ｎｍ、単一波長)で測定した。
【０１０２】
Ｂ／Ｂｏ値（％）は以下のとおり計算した。
【０１０３】
Ｂ／Ｂｏ値（％）＝試験化合物添加時の吸光度／試験化合物無添加時の吸光度×１００
（１）各種化合物との反応
トウダイグサ科植物にはホルボール誘導体以外にも様々な成分が含有されている。それらの成分に対する作製した抗ホルボール抗体の認識特異性を検討することが必要である。そこで、これまでに報告されているトウダイグサ科植物成分あるいはそれらの成分と類似した基本骨格を有する化合物などを収集し、それらに対する抗ホルボール抗体の親和性を測定した。その結果を図４〜図１１に示す。使用した２９化合物を表４に示す。
【０１０４】
【表４】
【０１０５】
Ｂ／Ｂｏ値とは前記の式で表され、試験化合物を加えなかったウェルの吸光度に対する試験化合物を加えたウェルの吸光度の割合を示す。この値が小さくなるほど、試験化合物と抗体の親和性が高いことを示す。試験化合物無添加時にはサンプルの溶媒であるＤＭＳＯのみを抗体と混合した。
【０１０６】
図４〜図１１ではどの試験化合物においてもＢ／Ｂｏ値の低下は見られなかった。すなわち作製した抗体はこれらの表４記載の化合物を認識しなかった。また抗体は非特異的な吸着は起こしていないことを確認した。
【０１０７】
（２）ホルボール誘導体との反応
次に作製した抗体の特異性、及びその検出限界を検討した。その結果を図１２（A)、(B)に示す。また様々なホルボール誘導体を試験化合物とすることで、抗体の抗原認識部位を推定した。
【０１０８】
使用したホルボール誘導体の構造を化５、表５に示す。
【０１０９】
【化５】
【０１１０】
【表５】
【０１１１】
１２位、１３位、２０位水酸基がエステル体になっている４β−ホルボール誘導体、１２位、１３位水酸基がエステル体になっている4α−ホルボール誘導体はすべて濃度依存的にＢ／Ｂｏ値を低下させた。これは作製した抗ホルボール抗体が今回使用したホルボール誘導体をすべて認識できることを示している。本発明では多くのホルボール誘導体を広く認識する特異的抗体を作製することを目標としてきた。図１２より、抗体はどの誘導体とも同様に反応しており、ホルボール誘導体の共通構造を認識することができる抗体が得られたと考えられる。
【０１１２】
また、本抗体の反応は１２位、１３位、２０位炭素に付く水酸基がエステル化されても影響が見られないこと、さらに４位の水酸基の立体構造がα位、β位でも同様の反応性を示すことから、得られた抗体は、ホルボールのＡ環（五員環）−Ｂ環（七員環）構造、とりわけＡ環構造を認識している可能性が高いと推定される。
【０１１３】
抗体の検出限界はＢ／Ｂｏ値が大きく低下している１〜１０ng／ｍＬ付近であると推定され、ホルボール及びホルボール誘導体が皮膚刺激作用を起こす濃度は数μｇ／ｍＬ、発ガンプロモーターとしての作用を示す濃度は数ｎｇ／ｍＬである。よって本発明によって確立したアッセイ系は作用を示すホルボールを十分に検出できる感度を有しており、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＧＣなどよりも感度が高かった。
【０１１４】
また、その作業は簡便で、前処理を含めて1日でアッセイをすることができ、高価な機器も、複雑な技術も必要としないため利用しやすく、利用価値は高いと思われる。
【０１１５】
さらに、本発明の抗ホルボール抗体は、ホルボール誘導体のＡ環構造を認識していることが推定されることから、本実施例では使用しなかったが、同様の構造を有するダフネトキシン、メゼレイン等に対しても親和性があると予想される。ダフネトキシンやメゼレインもホルボールに似た構造のダフナン型のジテルペノイドであり、ジンチョウゲ科セイヨウオニバシリ（Ｄａｐｈｎｅ ｍｅｚｅｒｅｕｍ）に含まれる。これらはＴＰＡに匹敵する発ガンプロモーターである（奥田拓夫：薬用天然物化学−第２版−、１１６−１２０、２００３）。これらの化合物に対しても、もし反応していれば、植物含有発ガンプロモーターの検出系として非常に意味がある。化６に、ダフナン型ジテルペノイドの構造を示す。
【０１１６】
【化６】
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】実施例２において、Ｐ−ＢＳＡで免疫されたマウスから作製された血清におけるホルボール抗体の抗体価を示す血清の希釈率と４９０ｎｍにおける吸光度の関係のグラフである。
【図２】実施例２において、抗体の産生が見られた２株の抗ホルボール抗体の抗体価を示す４９０ｎｍにおける吸光度のグラフである。
【図３】実施例２において、Ｐ−ＲＳＡで免疫されたウサギから作製された血清における抗ホルボール抗体の抗体価を示す血清の希釈率と４９０ｎｍにおける吸光度のグラフである。
【図４】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載４化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図５】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載４化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図６】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載４化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図７】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載４化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図８】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載４化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図９】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載３化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図１０】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載３化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図１１】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載３化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図１２】実施例３において、抗ホルボール抗体とホルボール誘導体の親和性の測定結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホルボール抗原、抗ホルボール抗体、ホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法、ホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬及び検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
トウダイグサ（Euphorbia helioscopia L.）は日本の本州から南西諸島の道端や畑で見られる雑草である。和名のトウダイグサとは、花の姿が昔の照明器具「燈台(とうだい)」に似ていることからつけられた名前である。草丈は約３０ｃｍで、茎は1本立ちするか根元から分株して株立ちし、へら形の葉をまばらに互生し、茎の頂部には5枚の葉が輪生する。ここから上は花で、散形状に広がる花枝を数段出し、椀形の苞葉の中にごく小さな花を多数つける。花期は４〜６月、花色は黄色である。
【０００３】
トウダイグサが所属するトウダイグサ科（Euphorbiaceae）は種子植物門、被子植物亜門、双子葉植物綱、離弁花亜綱、トウダイグサ目に分類される。熱帯から亜熱帯に多く、木本または草本であり、およそ３００属・８０００種以上と非常に種類が多い。葉は互生、まれに対生し托葉を持つ。花は単生、がくと花弁は退化していて存在しないものもある。子房は上位、３室からなり、胚珠は子房各室に１個または２個がある。果はほとんどが朔果であり、３分果に分かれる。種子には肉質の胚乳がある。
【０００４】
トウダイグサ科植物は薬用、食用、油用、鑑賞用、化粧品、その他様々な目的に供される。その代表的な例は次の通りである。ヒマ（トウゴマ、Ricinus communis L.）は峻下薬であるひまし油の原料である。アブラギリ（Aleurites cordata Steud.）はα−エラエオステアリック酸（α−ｅｌａｅｏｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ）などを含み乾性油として用いられる桐油を種子からとることができる。パラゴムノキ（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）からは天然ゴムが採られ、ナンキンハゼ（Sapium sebiferum Roxburgh ）の種子からは和蝋燭用のろうが得られる。キャッサバ（Manihot esculenta Crantz.）はタピオカの原料として食用に用いられる。観賞用のものはトウダイグサ属に多く、ポインセチア（Euphorbia pulcherrima Willd）はクリスマスの時期によく見られる。ショウジョウソウ (Euphorbia heterophylla L.)、ハナキリン (Euphorbia. milii Des Moulin var.splendens Ursch et Leandri ) なども我々の目を楽しませてくれる。またキャンデリア（Euphorbia antisyphilitica Zucc.）の茎から抽出した固形状の成分は口紅・リップクリームなどの基材として用いられ、ヒマやククイナッツ（Aleurites moluccana）の種子から抽出されたオイルはスキンケア用植物オイルとして用いられる。アフリカのサバンナにみられるチュウテンカク（Euphorbia ingens E.May.）、オオマトイ（Euphorbia triangularis Desf.）らは木材として価値が検討されている（非特許文献１）。
【０００５】
その一方で、トウダイグサ科植物の一部は有毒植物として知られている。これらの植物は乳管を持ち、葉や茎を傷つけると白い乳液が流れ出る。乳液が肌に触れると、かぶれ・水ぶくれ・皮膚炎・結膜炎などを引き起こす。また誤って食べてしまうと、喉がはれ、嘔吐や下痢を引き起こす。この乳液にはホルボールおよびその各種誘導体が多く含まれている。
【０００６】
ホルボールは化１に示す化学構造をもつ、分子量３６４、イソプレン単位４個からなるＣ２０化合物である。
【０００７】
【化１】
【０００８】
このホルボールは、環式、チグラン型のジテルペノイドであり、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）から生合成される。トウダイグサ科植物に含まれるホルボール誘導体の多くはエステル体として存在し、その主な作用は次の２つである。
【０００９】
1つ目は皮膚刺激性である。ホルボール誘導体は皮膚に接触し、表皮細胞に接合することにより遅延型のアレルギーを生じさせる。表皮細胞を標的として、真皮に血管周囲性の滲出性炎症を起こし、表皮に好中球あるいはリンパ球の浸潤と細胞間浮腫である海綿状態をきたす。海綿状態は進行して水泡を形成する。臨床的には、かぶれ、湿疹、浮腫性紅斑、丘疹、水泡などが見られる。
【００１０】
２つ目として、ホルボール誘導体は代表的な発ガンプロモーターである。発ガン２段階説では初発段階（イニシエーション）と促進段階（プロモーション）の２段階があると考えられており、それぞれの段階で作用する物質を発ガンイニシエーター、発ガンプロモーターと呼ぶ。発ガンプロモーターは動物にこれのみを与えても発ガンしないが、イニシエーションを行った後に与えると発ガンする。なかでもハズ（Croton tiglium L.）の種子油、ナンキンハゼ（Sapium sebiferum）の葉等に含まれる１２−Ｏ−テトラデカノイル ホルボール−１３−アセテート（１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ ｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ：ＴＰＡ、ＰＭＡ）やシナアブラギリ（Aleurites fordii Hemsl.）などに含まれる１２−Ｏ−ヘキサデカノイル−１６−ヒドロキシホルボール−１３−アセテート（１２−Ｏ−ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ−１６−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ：ＨＨＰＡ）は非常に強力な発ガンプロモーターである。（非特許文献２）ＴＰＡ、ＨＨＰＡ等は細胞内のタンパク質リン酸化酵素プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のシステインが豊富なドメイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ：ＣＲＤ）に優位に結合し、これを活性化させ細胞のガン化を引き起こす（非特許文献３および４）。これらの物質はガン研究において、動物に腫瘍を形成させる際に汎用されている。
【００１１】
以上のように、ホルボール誘導体の多くはエステル体として存在し、皮膚刺激作用、瀉下作用をもち、そのほか魚毒活性をもつ。魚毒とは、毒を川や沼に流して毒によって麻痺した魚を浮かび上がらせて採る、現在の日本では禁止されている魚法に使う毒のことである。また、ホルボール誘導体で代表的な発ガンプロモーターであるＴＰＡは、ナノモル単位でマウスに腫瘍を発生させる（非特許文献５および６）。
【００１２】
そのため、これらトウダイグサ科植物を利用するに当たり、とくにその成分が直接人体に接触する食用・化粧品用に利用する場合は、ホルボールおよびその各種誘導体が混入することは非常に危険である。そこで、それらを検出する手法の開発が重要となるが、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの方法ではナノモル単位でホルボール及びホルボール誘導体を検出することはできない。またガスクロマトグラフィー（ＧＣ）では感度は高いが、高価な機器が必要となる。また、ホルボールには各種の誘導体が天然に存在しており、それらすべてを標品として準備し使用することは事実上不可能である。
【非特許文献１】竹松哲夫、一前宣正：世界の雑草II−離弁花類−、１５４−２０２、１９９３
【非特許文献２】奥田拓夫：薬用天然物化学−第2版−、１１６−１２０、２００３
【非特許文献３】Slater, S. J., Ho, C., et al.,: Protein kinase C αcontains two activator binding sites that bind Phorbol esters and diacylglycerols with opposite affinities. J. Biol. Chem., 271:4627-4631, 1996.
【非特許文献４】Medkova, M. ＆ Cho, W. : Interplay of C1 and C2 domains of protein kinase C-α in its membrane binding and activation . J. Biol. Chem., 274:19852-19861, 1999.
【非特許文献５】Clifford G. Tepper, Supriya Jayadev, et al.: Role for ceramede as an endogenous mediator of Fas-induced cytotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92: 8443-8447 1995.
【非特許文献６】Moammir H. Aziz, Deric L. Wheeler, et al.: Protein Kinase C δOverexpressing Transgenic Mice Are Resistant to Chemically but not to UV Radiation-Induced Development of Squamous Cell Carcinomas: A Possible Link to Specific Cytokines and Cyclooxygenase-2. Cancer Res 2006 66:(2). January 15, 2006.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そこで本発明は、ホルボールおよびその各種誘導体を幅広く、簡便に、高感度に検出するためのＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を確立し、ホルボール抗原、抗ホルボール抗体、ホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法、ホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬及び検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を行い、ホルボール及びホルボール誘導体にキャリアータンパク質を結合させることにより、ホルボール及びホルボール誘導体に対する免疫原性を持たせたホルボール抗原を作製することに成功した。そして、作製したホルボール抗原を用いて抗ホルボール抗体を作製し、作製した抗ホルボール抗体を用いて、免疫学的方法によりホルボール及びホルボール誘導体を検出することのできるホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明の請求項１記載のホルボール抗原は、ホルボール又はホルボール誘導体にキャリアータンパク質を結合させることにより、ホルボール及びホルボール誘導体に対する免疫原性を持たせたことを特徴とする。
【００１６】
本発明の請求項２記載のホルボール抗原は、請求項１において、前記キャリアータンパク質が、ＢＳＡ又はＲＳＡであることを特徴とする。
【００１７】
本発明の請求項３記載の抗ホルボール抗体は、請求項２記載のホルボール抗原を用いて作製したことを特徴とする。
【００１８】
本発明の請求項４記載のホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法は、請求項３記載の抗ホルボール抗体を用いて免疫学的方法により、ホルボール及びホルボール誘導体を検出することを特徴とする。
【００１９】
本発明の請求項５記載のホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法は、請求項４において、前記免疫学的方法がＥＬＩＳＡであることを特徴とする。
【００２０】
本発明の請求項６記載のホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法は、請求項５において、前記ＥＬＩＳＡが競合的ＥＬＩＳＡであることを特徴とする。
【００２１】
本発明の請求項７記載のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬は、請求項３記載の抗ホルボール抗体を含む。
【００２２】
本発明の請求項８記載のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬は、請求項３記載の抗ホルボール抗体を用いて作製した固相化抗ホルボール抗体及び酵素標識抗ホルボール抗体を含む。
【００２３】
本発明の請求項９記載のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬は、請求項７又は８において、前記抗ホルボール抗体がポリクローナル抗体である。
【００２４】
本発明の請求項１０記載のホルボール及びホルボール誘導体の検出用キットは、請求項７〜９のいずれかに記載のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬を備えている。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、本発明により作製したホルボール抗原を用いて、抗ホルボール抗体を作製する。そして、抗ホルボール抗体を用いて免疫学的方法により、ホルボール及びホルボール誘導体を検出する。本発明の免疫学的検出方法によれば、ホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬及び検出用キットを用いて、ホルボールおよびその各種誘導体を幅広く、簡便に、高感度に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明のホルボール抗原は、ホルボール又はホルボール誘導体にキャリアータンパク質を結合させることにより、ホルボール及びホルボール誘導体に対する免疫原性を持たせたことを特徴とする。
【００２７】
ホルボールは分子量が３６４と小さく免疫原性を持たないため、そのまま単独で免疫しただけでは抗体は産生されない。免疫原性を持つためには一般に分子量１０，０００以上が必要と言われている。ホルボールは免疫原性を持たないが、反応原性は有しているハプテン（ｈａｐｔｅｎ）であるので、完全抗原であるタンパク質と結合させることによって、免疫原性を持たせることができる。免疫原性とは抗体産生や感作リンパ球を誘発する性質のことであり、反応原性とは抗体あるいは感作リンパ球と特異的に反応する性質のことである（西岡久壽彌、眞崎知生：役に立つ免疫実験法 第2版、11、1994）。多くの薬剤を含む低分子の有機化合物はハプテンに属し、それ自体は免疫原性を持たない。しかし、タンパク質をキャリアーとして、これと共有結合した複合体は免疫原性を持つ。その際、ハプテン部分はエピトープとして認識され、抗ハプテン抗体が産生される。
【００２８】
キャリアータンパク質としては、ＢＳＡ又はＲＳＡが好適に用いられる。
【００２９】
ＢＳＡはウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）であり、ＲＳＡはウサギ血清アルブミン（ｒａｂｂｉｔ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ)である。キャリアータンパク質としては、ほかに、スカシ貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ：ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ：ＯＶＡ）を用いることができる。
【００３０】
また、本発明の抗ホルボール抗体は、上記のホルボール抗原を用いて作製したことを特徴とする。
【００３１】
ホルボールの誘導体は、その構造の１２位、１３位炭素に結合している２級水酸基と３級水酸基のエステル体として存在しているものが多い。本発明では多くのホルボール及びホルボール誘導体を一度に検出できるアッセイ系の確立を目的にしているため、ホルボール及びホルボール誘導体に共通する構造を認識する抗体を作製する。そのため、目的の抗体を作製するために１３位炭素に結合している水酸基をエステル化し、キャリアータンパク質に結合させる。
【００３２】
ホルボールエステル体とキャリアータンパク質の複合体を動物に免疫しても、立体障害により、ホルボールのエステル部分がエピトープと認識されずに抗体が産生されないケースも考えられる。目的のエピトープがキャリアータンパク質の表面に出ていない可能性があるからである。そのため、キャリアータンパク質の表面にエピトープを出すために、リンカー（架橋剤、スぺーサー）と呼ばれる繋ぎの化合物を使用する。リンカーには、ＫＭＵＨ（Ｎ−（κ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、ＥＭＣＨ（Ｎ−（ε−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）等を用いることができる。これらはスルフィド基、およびカルボキシル基との反応性を有する両機能性リンカーである。ＢＳＡ、ＲＳＡのアミノ酸配列はすでに決定されており、両分子１ｍｏｌ中にはシステインが３５ｍｏｌ存在する。そのシステインのスルフィド基とホルボールエステル体のカルボキシル基を架橋して合成する。
【００３３】
抗原には抗体と特異的に結合する部位があり、この領域を抗原決定基という。抗体が抗原決定基を認識することによって、免疫系が特異性を持つことができる。抗体のもつ精密な抗原認識機能のために、免疫学的実験手法の中で抗体を用いたものが最も広く利用されている。ＥＬＩＳＡもその中のひとつである。
【００３４】
また、本発明のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬は、ホルボール及びホルボール誘導体をＥＬＩＳＡにより検出することができるように、本発明のホルボール抗原を用いて作製され、本発明のホルボール抗原を認識して特異的に反応する抗ホルボール抗体を含むものである。
【００３５】
または、本発明のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬は、本発明の抗ホルボール抗体を用いて作製した固相化抗ホルボール抗体及び酵素標識抗ホルボール抗体を含む。
【００３６】
本発明の抗ホルボール抗体としては、モノクローナル抗体であってもよい。
【００３７】
本発明の検出用キットは、以上のようなホルボール化合物の検出用試薬を備えている。
【００３８】
以下に具体例を挙げて詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの具体例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
（抗原作製）
（１）ホルボールのエステル化
ホルボール誘導体は、１２位、１３位炭素水酸基のエステル体として存在しているものが多い。本発明ではホルボール及びホルボール誘導体に共通する構造を認識する抗体の作製を目的としているので、１３位炭素水酸基のエステル化を試みた。はじめにホルボールにコハク酸を反応させ、１３位、２０位炭素水酸基をエステル化しホルボール １３，２０−ジサクシネートを合成した後、２０位の対応するエステルを加溶媒分解して、ホルボール １３−サクシネートに導く方法をとった。
【００４０】
まず、ホルボール（シグマ、Ｐ１２８１）１８ｍｇとコハク酸無水物３０ｍｇをピリジン２ｍＬに入れ、９０℃、油浴中で３時間攪拌した。反応液の溶媒を留出した後、残滓をＯＤＳカラム（メタノール―１％酢酸溶液）で精製し、無色・非結晶粉末状のホルボール １３，２０−ジサクシネート（２０ｍｇ・収率７２％）を得た。
【００４１】
すなわち、ホルボールをピリジン中コハク酸無水物と反応させ、まずホルボール １３，２０−ジサクシネートを得た。
【００４２】
化２に、ホルボール １３，２０−ジサクシネートの合成方法を示す。
【００４３】
【化２】
【００４４】
この化合物のＥＳＩ−ＭＳの結果から、ホルボールよりもコハク酸残基２個分の２００多い分子量が確認されたこと、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、２０位のプロトンが低磁場にシフトしていること、１２位のプロトンはシフトしておらず、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて１３位炭素が６９．５ｐｐｍに観測され、これはこれまでのデータから１３位アシル体を推定させる値であることから（表１）、得られた化合物をホルボール １３，２０−ジサクシネートと決定した。
【００４５】
次に、０℃において、このホルボール １３，２０−ジサクシネート７ｍｇのメタノール溶液１ｍＬに、２％ＮａＯＭｅ−メタノール溶液１００μＬを加え、氷浴上で９時間攪拌した。反応液を１％酢酸で中和後、分取逆相ＴＬＣ（メタノール：１％酢酸＝２：３の水溶液）と逆相ＨＰＬＣ（メタノール−１％酢酸の水溶液）を用いて精製し、無色・非結晶粉末状のホルボール １３−サクシネート（１．３ｍｇ・収率４０％）を得た。
【００４６】
すなわち、ホルボール １３，２０−ジサクシネートをメタノール中２％ＮａＯＭｅ−メタノール溶液を用いて加溶媒分解し、ホルボール １３−サクシネートを得た。
【００４７】
化３に、ホルボール １３−サクシネートの合成方法を示す。
【００４８】
【化３】
【００４９】
この化合物は、ＥＳＩ−ＭＳでホルボールよりもコハク酸残基１個分の１００多い分子量と分子式が確認できたこと、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて１２位、２０位ともホルボールとほぼ同じ化学シフト値を示すのに対して、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて１３位の炭素は、ジサクシネートとほぼ同じ化学シフト値を示すことから（表１）、残ったサクシネートは１３位にあると決定した。
【００５０】
（２）ホルボールのエステル化の確認
ホルボールのエステル化の確認をＮＭＲ及びＥＳＩ ＭＳ測定で行った。表１に、そのＮＭＲスペクトルデータとＥＳＩ ＭＳ値を示す。
【００５１】
【表１】
【００５２】
（３）ホルボール １３−サクシネート―ＫＭＵＨ―ＢＳＡ複合体（Ｐ−ＢＳＡ）の合成
作製したホルボール １３−サクシネートとキャリアータンパク質であるＢＳＡを結合させ、Ｐ−ＢＳＡを合成するために、反応温度・溶媒・反応時間・反応比・リンカーなど反応の様々な条件を検討した（Gong Wu, Rolf F. Barth, et al., (2004) Site-Specific Conjugation of Boron-Containing Dendrimers to Antibody Cetuximab (IMC-C225) and Its Evaluation as a Potential Delivery Agent for Neutron Capture Therapy. Bioconjugate Chem. 15: 185−194）。検討の結果、以下の方法で合成を行った（化４）。
【００５３】
【化４】
【００５４】
１．キャリアータンパク質であるＢＳＡ（シグマ、Ａ−７９０６）２．０ｍｇ（Ｍ．Ｗ．≒６６０００ ３．０×１０−８ｍｏｌ）をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）４．０ｍＬに溶解した。
２．リンカーであるＫＭＵＨ(ピアス、２２１１１)３．１ｍｇ（Ｍ．Ｗ．＝２９５．３８ ３．０×１０−８×３５×１０ｍｏｌ）をＤＭＳＯ１００μＬに溶解した。
３．１と２を混合し、遮光下、３７℃で４時間反応させた。
４．ホルボール １３−サクシネート０．９７ｍｇ（Ｍ．Ｗ．＝４６４．４ ３．０×１０−８×３５×２ｍｏｌ）をＤＭＳＯ２０μＬに溶解した。
５．３と４を混合し、遮光下、３７℃で２４時間反応させた。
【００５５】
（４）Ｐ−ＢＳＡ合成の確認
ホルボール−タンパク質複合体合成の確認およびホルボール結合数の測定は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）によって行った。
【００５６】
Ｐ−ＢＳＡが合成されたことをＴＯＦ−ＭＳ測定により確認した。また、その分子量を測定することで、結合数を測定した。ＢＳＡ、ＢＳＡとＫＭＵＨを反応させたもの、ＢＳＡとＫＭＵＨとホルボール １３−サクシネートを反応させたもののＴＯＦ−ＭＳスペクトルを各々測定した。
【００５７】
ＴＯＦ−ＭＳ測定により得られた各生成物の分子量を表２に示す。ＢＳＡの分子量は６６５００．４であり、以前報告された分子量の計算値である６６２６７とほぼ一致した。差は０．３５２％であった（Reed RG, Puntma FW and Peters Jr T (1980) Sequence of residues 400−403 of bovine serum albumin. Biochem.J. 191: 867−868）。
【００５８】
【表２】
【００５９】
ＫＭＵＨは分子量が２９５．３８でありＢＳＡにＫＭＵＨが１つ結合すると、分子量は２９５．３８増加する。またホルボール １３−サクシネートは分子量が４６４．４でありＢＳＡ−ＫＭＵＨにホルボール １３−サクシネートが１つ結合すると、分子量は４４６．４増加する。このことからＢＳＡへのＫＭＵＨ、ホルボール １３−サクシネートの結合数を計算すると、
（７０８４８．８−６６５００．４）÷２９５．３８≒１４．７２
（７２２００．１−７０８４８．８）÷４４６．４≒３．０２７
以上より、ＢＳＡ１ｍｏｌにつき、ＫＭＵＨ１５ｍｏｌ、ホルボール １３−サクシネート３ｍｏｌが結合したことを確認した。
【００６０】
（５）ホルボール １３−サクシネート−ＫＭＵＨ−ＲＳＡ複合体（Ｐ−ＲＳＡ）合成およびその確認
Ｐ−ＢＳＡ合成と同様の方法で、ホルボール １３−サクシネートとＲＳＡ（シグマ、Ａ−０６３９）を反応させホルボール １３−サクシネート−ＫＭＵＨ−ＲＳＡ複合体（Ｐ−ＲＳＡ）を合成した。Ｐ−ＲＳＡが合成されたことをＴＯＦ−ＭＳ測定により確認した。またその分子量を測定することで、結合数を測定した。
【００６１】
ＢＳＡ、ＲＳＡとＫＭＵＨを反応させたもの、ＲＳＡとＫＭＵＨとホルボール １３−サクシネートを反応させたものを各々測定した。
【００６２】
ＴＯＦ−ＭＳ測定により得られた各生成物の分子量を表３に示す。
【００６３】
【表３】
【００６４】
ＫＭＵＨは分子量が２９５．３８でありＲＳＡにＫＭＵＨが１つ結合すると、分子量は２９５．３８増加する。またホルボール １３−サクシネートは分子量が４６４．４でありＲＳＡ−ＫＭＵＨにホルボール １３−サクシネートが１つ結合すると、分子量は４４６．４増加する。このことからＲＳＡへのＫＭＵＨ、ホルボール １３−サクシネートの結合数を計算すると、
（７０８６２．６−６６２６５．５）÷２９５．３８≒１５．５６
（７２８８９．１−７０８６２．６）÷４４６．４≒４．５４０
以上より、ＲＳＡ１ｍｏｌにつき、ＫＭＵＨ１６ｍｏｌ、ホルボール １３−サクシネート５ｍｏｌが結合したことが確認された。
【実施例２】
【００６５】
（抗体作製）
ホルボールに対するモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）およびポリクローナル抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を作製した。
【００６６】
（１）抗ホルボールモノクローナル抗体作製
１−１．免疫
実施例１で作製したＰ−ＢＳＡをアジュバンド（免疫賦活化剤）と混合し、マウスに下記のように免疫した。脾臓細胞とミエローマ細胞は遺伝的に同系マウス由来のもののほうが、ハイブリドーマ形成率が高い。ＰＡＩ細胞がＢＡＬＢ／ｃマウス由来のものであるため、ＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫した。
【００６７】
実験には、７週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズ・リバー）１１匹を使用した。
【００６８】
Ｐ−ＢＳＡ６．０７ｍｇ、インコンプリート・フロインド・アジュバンド（和光純薬）４．４ｍＬ、乾燥マイコバクテリウム・ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ）（和光純薬）２９．０４ｍｇを５ｍＬシリンジ（テルモ）に入れ、硬くなるまで混合した。シリンジに２６Ｇ注射針（テルモ）を付け、1匹につき４００μＬ、６ヶ所に腹腔内注射した。１４日ごとに５度行った。２度目以降は乾燥マイコバクテリウム・ブチリカムは加えなかった。
【００６９】
１−２．抗体産生の確認
マウス眼窩静脈叢から毛細管を用いて血液をサンプリングし、室温、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、血清と血餅に分けた。９６ウェルイムノプレートにＰ−ＢＳＡ１ｍｇ／２００ｍＬ（０．５μｇ／ウェル）を吸着させ、血清中の抗体産生をＥＬＩＳＡで確認した。本実施例では、Ｐ−ＢＳＡをマウスに免疫したため、マウスの血清中には抗ＢＳＡ抗体と抗ホルボール抗体が混在している。そのため、抗ＢＳＡ抗体を除くために、希釈にはＢＳＡ１ｍｇ／ｍＬ含有ＰＢＳを用いた。
【００７０】
詳しい実験の手順は以下のとおりである（Hiroyuki Tanaka,Yukihiro Shoyama (1999) Monoclonal anti body against tetrahydrocannabinolic acid distinguishes Cannabis sativa samples from different plant species. Forensic Science International 106: 135−146）、（Ritsu Sakata, Yukihiro Shoyama and Hiroki Murakami (1994) Production of monoclonal antibodies and enzyme immunoassay for typical adenylate cyclase activator, Forskolin. Cytotechnology 16:101−108）。
１．ＢＳＡ（シグマ、Ａ−７９０６）１ｍｇ、Ｐ−ＢＳＡ１ｍｇを各々ＰＢＳ２００ｍＬに溶解した。これらを抗原とし９６ウェルイムノプレート（スミロン）にそれぞれ１００μＬ、４８ウェルずつ入れた。４℃で一晩インキュベートし、吸着させた（０．５μｇ／１００μＬ／ウェル)。
２．０．０５％トウィーン２０（ナカライテスク）含有ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で３度洗浄した。
３．非特異的吸着を防ぐために５％スキムミルク（雪印乳業）含有ＰＢＳで１時間ブロッキングした。ＴＰＢＳで３度洗浄した。
４．血清をＢＳＡ１ｍｇ／ｍＬ含有ＰＢＳで１０、４０、２００、１０００倍希釈した。３０分間静置した後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を１ウェルにつき６０μＬ入れ、３７℃で一晩インキュベートした。ＴＰＢＳで３度洗浄した。
５．０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで４０００倍希釈した二次抗体ＨＲＰ−ラット 抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ジムド・ラボラトリーズ）を１ウェルにつき１００μL入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＴＰＢＳで５度洗浄した。
６．基質Ｏ−フェニレンジアミン溶液に使用直前に３０％過酸化水素水３０μＬを加え、１ウェルにつき１００μＬ入れた。遮光して３７℃で１時間インキュベートした。なお、Ｏ−フェニレンジアミン溶液は、Ｏ−フェニレンジアミン（ナカライテスク）２０ｍｇを０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸緩衝液５０ｍＬに溶解し、作製した。また、０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸緩衝液の調製方法は以下のとおりである。
Ａ クエン酸（ナカライテスク）１．９２ｇを１００ｍＬの水に溶解させたもの
Ｂ リン酸水素２ナトリウム１２水和物（ナカライテスク）７．１７ｇを１００ｍＬの水に溶解させたもの
Ａ２４．３ｍＬとＢ２５．７ｍＬを混合し、１００ｍＬにメスアップした後、ｐＨ５．０に調整した。
７．６Ｎ硫酸を１０μＬずつ加え反応を停止させた。よく攪拌し、マイクロプレートリーダー（４９０ｎｍ、単一波長）で測定した。
【００７１】
本実施例では、１１匹のマウスに免疫したが、ホルボールの毒性のため腹腔内で癒着がおこり、４匹のマウスが飼育中に死亡した。マウス７匹において抗ホルボール抗体の産生がみられた（図１）。
【００７２】
１−３．ハイブリドーマの作製
血清中に抗体価の上昇が認められたマウス５匹から脾臓細胞を調製し、ミエローマ細胞とポリエチレングリコールを用いて細胞融合させ、ハイブリドーマを作製した。ミエローマ細胞はＰＡＩ細胞（マウス骨髄腫細胞）を使用した。作製したハイブリドーマはＨＡＴ培地・ＨＴ培地で培養した。
【００７３】
ａ．細胞培養
培養は３７℃、空気中二酸化炭素５％条件下で行った。培養条件を以下に示す。ＦＢＳは５６℃で３０分加温して非働化した後使用した。
【００７４】
Ａ．ＰＡＩ細胞（ミエローマ細胞：マウス）
培養培地：ＲＰＭＩ１６４０（アーバイン・サイエンティフィック）と２．０ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ（アーバイン・サイエンティフィック）、１００００ユニット／ｍＬペニシリンと１００００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）
Ｂ．ハイブリドーマ
ａ．培養培地（０−１３週齢）：ＨＡＴ培地：ＲＰＭＩ１６４０（アーバイン・サイエンティフィック）と２．０ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ（ハイクローン）、１００００ユニット／ｍＬペニシリンと１００００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ギブコ）、ＨＡＴ培地サプリメント (シグマ)
ｂ．培養培地（１４−２０週齢）：ＨＴ培地：ＲＰＭＩ１６４０（アーバイン・サイエンティフィック）と２．０ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ（ハイクローン）、１００００ユニット／ｍＬペニシリンと１００００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（ギブコ）、ＨＴ培地サプリメント（シグマ）
ｃ．培養培地（２１週齢以降）：ＲＰＭＩ１６４０（アーバイン・サイエンティフィック）と２．０ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ（アーバイン・サイエンティフィック）、１００００ユニット／ｍＬペニシリンと１００００μｇ/mlストレプトマイシン（ギブコ）
ｄ．培養培地（限界希釈法）：ＲＰＭＩ１６４０（アーバイン・サイエンティフィック）と２．０ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ（ハイクローン）、１００００ユニット／ｍＬペニシリンと１００００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ギブコ）、１０％ハイブリドーマ・クローニング・ファクター（アイゲン）
詳しい実験の手順は以下のとおりである。なお、細胞融合の操作は全て室温で行った。
【００７５】
ｂ．脾臓細胞の回収と計数
１．細胞融合を行う３日前に最終免疫を行った。
２．マウスをエーテルによって致死させた。７０％エタノールで十分消毒した後、マウスをクリーンベンチ内に入れた。
３．左わき腹から脾臓を摘出した。
４．ＲＰＭＩ１６４０（無血清）入りのディッシュ中で、ピンセットとハサミを用いて脾臓に付着した脂肪などを丁寧に除去した。
５．別のディッシュ中にて２６Ｇ針付き注射器で脾臓にＲＰＭＩ１６４０（無血清）を送り込み、リンパ球を遊離させた。
６．滅菌済みナイロンメッシュで不要物を取り除いた後、全ての細胞を１５ｍＬコニカルチューブに集め、２０００ｒｐｍで５分間遠心して沈殿させた。沈殿物は赤色であった。
７．上清を取り除き、沈殿物を５ｍＬ０．８３％塩化アンモニア水溶液（０．２２μｍフィルター滅菌済）に氷上で５分間懸濁することにより、赤血球を溶血させた。２０００ｒｐｍで５分間遠心して沈殿させた。
８．上清を取り除いた後、ＲＰＭＩ１６４０（無血清）＋ゲンタマイシン溶液（１０〜２０μｇ／ｍＬ）（シグマ、Ｇ１３９７）を加え、５０ｍＬにした。脾臓細胞懸濁液５０ｍＬから５０μＬとり、ＲＰＭＩ１６４０（無血清）４５０μＬと混合した。この５００μＬから１０μＬとり計数した。残りを２０００ｒｐｍで５分間遠心し沈殿させた。沈殿物は白色であった。沈殿物にＲＰＭＩ１６４０（無血清）５０ｍＬを加え、懸濁した。
【００７６】
ｃ．ミエローマ細胞の回収と計数
１．シャーレで培養したミエローマ細胞を滅菌済みナイロンメッシュで不要物を取り除いた後、コニカルチューブに集めた。
２．２０００ｒｐｍで５分間遠心して沈殿させ、上清を取り除き、ＲＰＭＩ（無血清）で５０ｍＬにした。１０μＬとり計数した。
【００７７】
ｄ．細胞融合
１．ミエローマ細胞（５×１０７セル）と脾臓細胞（５×１０７セル）を混合し、ＲＰＭＩ１６４０（無血清）で５０ｍＬにした。２０００ｒｐｍで５分間遠心し沈殿させ、上清をできるだけ多く取り除いた。
２．７０℃で溶解したポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ、シグマ、ハイブリ・マキシ・シグマ、Ｐ２９０６）５ｍＬに３７℃で温めておいたＲＰＭＩ１６４０（無血清）５ｍＬ、ＤＭＳＯ１．５ｍＬを加えた。（以下、融合混合物と略す。）
３．ゆっくりと振り混ぜながら１分以上かけ、融合混合物２．３ｍＬを加えた。９０秒間、３７℃湯浴中で振り混ぜた。
４．ＲＰＭＩ１６４０（無血清）（全量２１ｍＬ）をピペットの先端で細胞をつつきながら、次のように加えた。３０秒間１ｍＬ、３０秒間３ｍＬ、1分間１７ｍＬ。
５．ＲＰＭＩ１６４０（無血清）で５０ｍＬにし、室温で５分間放置した。１５００ｒｐｍで１０分間遠心した。ＤＭＳＯを除去するためにこの作業を２度繰り返した。
６．上清を取り除き、沈殿を５０ｍＬＨＡＴ培地に懸濁した。
７．９６ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ細胞懸濁液をいれ、培養した。
８．融合した日を０日として、２・３・５・８・１１日目にＨＡＴ培地を１００μＬ捨て、１００μＬ加えた。１４日目にＨＴ培地に変更した。２１日目まで３日おきにＨＴ培地を１００μＬ捨て、１００μＬ加えた。２１日目からＲＰＭＩ１６４０培地に変更し、培養を続けた。
【００７８】
ハイブリドーマの培養は、７４７ウェルプレートで行った。培養を続けると、１０日目くらいからハイブリドーマの増殖が顕微鏡で観察できるようになった。コロニーを計数したところ、１２７ウェルでコロニーの形成が確認された。
【００７９】
１−４．スクリーニング
抗フォルボール抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングのために、コロニーの形成が確認されたウェルから上清を採取し、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡの手順は１−２．抗体産生の確認と同様に行った。４９０ｎｍで吸光度を測定した。
【００８０】
得られたハイブリドーマのうち、１−１ ５Ｇ、１−１ ６Ｆ、１−２ １０Ｆ、１−３ ７Ｄ、１−３ ８Ａ、１−３ １１Ｄ、２−３ ２Ｈ、２−３ ８Ａ、３−２ １１Ｄの９株を陽性と判定した。（数字はハイブリドーマの系統Ｎｏ．を示している。数字の最初は脾臓を摘出したマウスのＮｏ．、次の数字はコロニーＮｏ．、次はそのコロニーからサブクローニングによって得たクローンのＮｏ．（コロニーの生育しているウェルの位置）をそれぞれ示している。）
１−５．クローニング
陽性と判定したウェルには数種類のハイブリドーマが混在していると考えられる。そこで、目的とする抗体を産生している細胞のみを得るために、スクリーニングしたウェルから抗ＢＳＡ抗体産生細胞を除き、抗ホルボール抗体産生細胞のみを選抜するために、クローニングを行った。
【００８１】
陽性と判断した９株を限界希釈法でクローニングした。1ウェルに細胞１個が入るように液体培地を希釈、調整して、９６ウェルプレートにまき液体培地中で単一種類のコロニーを形成させた。
【００８２】
限界希釈法によるクローニングは、以下の手順により行った。
１．計数板でハイブリドーマを計数し、１ウェルにつき細胞１個が入るように、培地を１００個／１０ｍＬに希釈・調整した。培地にはハイブリドーマ・クローニング・ファクター（アイゲン）を最終濃度で１０％加えた。
２．９６ウェルプレートに各ウェル１００μＬずつまいた。
３．液体培地中で単一種類のコロニーを形成させた。
４．確実に単一コロニーにするために、１〜３をもう一度繰り返した。
【００８３】
その後、顕微鏡で観察し、コロニーが形成されているウェルの上清を採取し、ＥＬＩＳＡを行った。ハプテンと結合した抗体の量を、ホースラディッシュ・ペルオキシターゼ（ＨＰＲ）で標識した二次抗体の結合量を４９０ｎｍの吸光度（基質であるフェニレンジアミンからＨＲＰによって生成する反応産物の色）を測定することにより評価した。９株中２−３ ８Ａ ９、３−２ １１Ｄ ８の２株において、抗体の産生が見られた（図２）。
【００８４】
１−６．抗体の作製・精製
限界希釈法で抗体の産生が確認された２株のハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に投与し、抗体を作らせた。
【００８５】
抗体の培養には、７週齢の雌性ＩＣＲヌードマウス（チャールズ・リバー）６匹を使用し、実験は以下のとおりに行った。
１．ハイブリドーマ（２×１０６セル／マウス）をマウス腹腔内に打ち込んだ。
２．パスツールピペットで腹水を採取した。
【００８６】
２０〜２５日で腹部が肥大してきたため、腹水を採取した。採取した腹水は１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を採取し、凍結保存した。
【００８７】
(２)抗ホルボールポリクローナル抗体作製
２−１．免疫
実施例１で作製したＰ−ＲＳＡをアジュバンドと混合し、ウサギに免疫した。
なお、コントロールとして使用するために、免疫前にウサギの耳の静脈から少量採血しておいた。12週齢の雌性日本白ウサギ1匹を使用し、以下のとおり実験を行った。
【００８８】
Ｐ−ＲＳＡ６．０７ｍｇ、インコンプリート・フロインド・アジュバンド（和光純薬工業）４．４ｍＬ、乾燥マイコバクテリウム・ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ）（和光純薬工業）２９．０４mgを５ｍＬシリンジに入れ、硬くなるまで混合した。シリンジに２２G注射針を付け、０．２ｍＬずつ全量２ｍＬを背中１０ヶ所に皮内注射した。１４日ごとに７度行った。２度目以降は乾燥マイコバクテリウム・ブチリカムは加えなかった。
２−２．抗体産生の確認
ウサギの耳介動脈から血液をサンプリングし、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、血清と血餅に分けた。96ウェルイムノプレートにＰ−ＲＳＡおよびＲＳＡを吸着させ、血清中の抗体産生を直接ＥＬＩＳＡで確認した。コントロールには免疫前のウサギの血清を用いた。
【００８９】
直接ＥＬＩＳＡによる抗体産生の確認は、以下のとおりに行った。
１．ＲＳＡ(シグマ、Ａ−０６３９)１ｍｇ、Ｐ−ＲＳＡ１ｍｇをそれぞれＰＢＳ２００ｍＬに溶解した。これらを抗原とし９６ウェルイムノプレートにそれぞれ１００μＬ、４８ウェルずつ入れた。４℃で一晩放置し、吸着させた（０．５μｇ／１００μＬ／ウェル)。
２．０．０５％トウィーン２０含有ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で３度洗浄した。
３．非特異的吸着を防ぐために、５％スキムミルク含有ＰＢＳで１時間ブロッキングした後、ＴＰＢＳで３度洗浄した。
４．１０〜２５６００倍に希釈した血清をプレートにまき、３７℃で１時間インキュベートした。ＴＰＢＳで３度洗浄した。
５．０．１％ＲＳＡ含有ＰＢＳで４０００倍希釈した二次抗体ＨＲＰ−ヤギ・抗ウサギＩｇＧ ＤＳ グレード（ジムド・ラボラトリーズ）を１ウェルにつき１００μＬ入れ、３７℃で１時間インキュベートした。
６．ＴＰＢＳで５度洗浄した。基質Ｏ−フェニレンジアミン溶液に使用直前に３０％過酸化水素水３０μＬを加え、１ウェルにつき１００μＬ入れた。遮光して３７℃で１０分間インキュベートした。
７．６Ｎ硫酸を１０μＬずつ加え反応を停止させた。よく攪拌し、マイクロプレートリーダー（４９０ｎｍ、単一波長）で測定した。
【００９０】
その結果、免疫したウサギにおいて、抗体価の上昇がみられた（図３）。キャリアータンパク質であるＲＳＡをプレートに吸着させたウェルでは吸光度の上昇はみられないことから、抗ＲＳＡ抗体は産生されておらず、抗ホルボール抗体が産生されていることを確認した。
【００９１】
２−３．抗体の採取・精製
免疫したウサギで、抗ホルボール抗体の産生が確認されたため、心臓採血により全血を採取した。採取した血液を、室温、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、血清と血餅に分けた。血清を硫安沈殿し、沈殿物を適量のＰＢＳに溶解し、透析後、凍結保存した。
【００９２】
心臓採血は次のとおりに行った。採血を行う３日前に最終免疫を行った。ネンブタール（大日本製薬）１mＬをウサギの耳の静脈から打ち込み、麻酔をかけた。心臓に１６G留置針（テルモ）を刺し、心臓採血を行った。血液を室温、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、血清と血餅に分離した。
【００９３】
抗体の精製のための血清の硫安沈殿（植木厚：免疫生化学研究法、13-14、 1986）は以下のとおりに行った。
１．血清３７．５ｍＬにＰＢＳ３７．５ｍＬを加えた。スターラーで攪拌しながら、硫酸アンモニウム飽和溶液３７．５ｍＬを少量ずつ滴下した。白い沈殿が発生してきた。一晩静置した。なお、飽和硫酸アンモニウム水溶液の調製はつぎのとおりに行った。約８００ｇの硫酸アンモニウム（ナカライテスク）に１Ｌ蒸留水を加え加温溶解し、室温でわずかに結晶が析出するまで冷却した。この飽和溶液は酸性を示すので、少量をとって蒸留水で１０倍希釈した溶液がｐＨ７．０〜７．２になるようにアンモニア水で調整した（植木厚：免疫生化学研究法、13-14、 1986）。
２．超遠心機で１５℃、８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。沈殿を採り、ＰＢＳ３７．５ｍＬに溶かした。
３．硫酸アンモニウム飽和溶液１８．７５ｍＬを加えて再沈殿を行い、同じ条件で再び超遠心機にかけた。
４．上清を捨て、沈殿を適量のＰＢＳに溶かした。
【００９４】
透析は、以下のとおりに行った。硫安沈殿で得られた沈殿を半透膜（Ｃｅｌｌｕ Ｓｅｐ（登録商標）Ｔ１、フナコシ）に入れた。ＰＢＳ３Ｌ中に入れ、低温実験室（４℃）においてスターラーでゆっくり攪拌し、透析した。８時間を1回として３度繰り返した。
【実施例３】
【００９５】
（ホルボール誘導体検出法の検討）
ホルボール誘導体およびトウダイグサ科植物含有成分あるいはそれらの成分と類似した基本骨格を有する化合物を用いて、作製した抗ホルボール抗体の特異性を競合ＥＬＩＳＡで検討した。
【００９６】
まず抗ホルボール抗体にサンプルを加えて一定時間静置し、サンプル中の検出対象物質と抗ホルボール抗体との間に抗原抗体反応を起こさせた。この混合物を、あらかじめ抗原（Ｐ−ＢＳＡ、Ｐ−ＲＳＡ）を吸着させておいたプレートに加えた。ここでも再度、抗原抗体反応が起こる可能性がある。しかし、先の反応で抗ホルボール抗体がサンプル中の対象物質を捕捉していれば、プレートに吸着させた抗原（Ｐ−ＢＳＡ、Ｐ−ＲＳＡ）とは反応することはできない。逆に、捕捉していなければ、プレートに吸着させた抗原と結合する。その後、二次抗体、基質溶液を加えて発色させ、吸光度を測定した。
【００９７】
サンプル中の対象物質と抗ホルボール抗体の親和性が高ければ、吸光度は小さくなる。親和性が小さければ、吸光度は大きくなる。つまり作製した抗ホルボール抗体の特異性が高ければ、吸光度も高くなり、低ければ吸光度も低くなる。
【００９８】
競合的ＥＬＩＳＡを行うために、プロトコールの条件検討を行った。抗体希釈倍率、サンプル濃度、溶媒、反応時間、反応時間等を検討した。
【００９９】
検討した条件で、競合ＥＬＩＳＡを行い、抗ホルボール抗体の特異性、非特異的吸着性の有無を確かめ、その検出感度を測定した。また様々なホルボール誘導体をサンプルとしてアッセイし、抗ホルボール抗体の抗原認識部位を推定した。
【０１００】
実施例２までに抗ホルボールモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を作製したが、実施例３では、より抗体価の高かったポリクローナル抗体を用いて、実験を進めた。
【０１０１】
抗ホルボール抗体特異性の検討における競合的ＥＬＩＳＡは、以下のとおりに行った。
１．Ｐ−ＢＳＡ１ｍｇをＰＢＳ２００ｍＬに溶解した。これを９６ウェルイムノプレートに１００μＬずつ入れ、４℃で一晩放置し、吸着させた（０．５μｇ／１００μＬ／ウェル）。ウサギ血清と表４記載の各種化合物またはホルボール誘導体とを０．６ｍＬチューブに入れ、混合し、４℃で一晩放置した。
２．０．０５％トウィーン２０含有ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で３度洗浄した。
３． 非特異的吸着を防ぐため５％スキムミルク含有ＰＢＳで１時間ブロッキングした。ＴＰＢＳで３度洗浄した。
４．混合物をプレートに入れ、３７℃で２時間インキュベートした。ネガティブコントロールには溶媒ＤＭＳＯのみを添加した。ＴＰＢＳで３度洗浄した。
５． ０．１％ＲＳＡ含有ＰＢＳで４０００倍希釈した二次抗体ＨＲＰ−ヤギ・抗ウサギＩｇＧ ＤＳ グレードを１ウェルにつき１００μＬ入れ、３７℃で２時間インキュベートした。
６．ＴＰＢＳで５度洗浄した。基質Ｏ−フェニレンジアミン溶液に使用直前に３０％過酸化水素水３０μＬを加え、１ウェルにつき１００μＬ入れた。遮光して、３７℃で１０分間インキュベートした。
７．６Ｎ硫酸を１０μＬずつ加え反応を停止させた。よく攪拌し、マイクロプレートリーダー（４９０ｎｍ、単一波長)で測定した。
【０１０２】
Ｂ／Ｂｏ値（％）は以下のとおり計算した。
【０１０３】
Ｂ／Ｂｏ値（％）＝試験化合物添加時の吸光度／試験化合物無添加時の吸光度×１００
（１）各種化合物との反応
トウダイグサ科植物にはホルボール誘導体以外にも様々な成分が含有されている。それらの成分に対する作製した抗ホルボール抗体の認識特異性を検討することが必要である。そこで、これまでに報告されているトウダイグサ科植物成分あるいはそれらの成分と類似した基本骨格を有する化合物などを収集し、それらに対する抗ホルボール抗体の親和性を測定した。その結果を図４〜図１１に示す。使用した２９化合物を表４に示す。
【０１０４】
【表４】
【０１０５】
Ｂ／Ｂｏ値とは前記の式で表され、試験化合物を加えなかったウェルの吸光度に対する試験化合物を加えたウェルの吸光度の割合を示す。この値が小さくなるほど、試験化合物と抗体の親和性が高いことを示す。試験化合物無添加時にはサンプルの溶媒であるＤＭＳＯのみを抗体と混合した。
【０１０６】
図４〜図１１ではどの試験化合物においてもＢ／Ｂｏ値の低下は見られなかった。すなわち作製した抗体はこれらの表４記載の化合物を認識しなかった。また抗体は非特異的な吸着は起こしていないことを確認した。
【０１０７】
（２）ホルボール誘導体との反応
次に作製した抗体の特異性、及びその検出限界を検討した。その結果を図１２（A)、(B)に示す。また様々なホルボール誘導体を試験化合物とすることで、抗体の抗原認識部位を推定した。
【０１０８】
使用したホルボール誘導体の構造を化５、表５に示す。
【０１０９】
【化５】
【０１１０】
【表５】
【０１１１】
１２位、１３位、２０位水酸基がエステル体になっている４β−ホルボール誘導体、１２位、１３位水酸基がエステル体になっている4α−ホルボール誘導体はすべて濃度依存的にＢ／Ｂｏ値を低下させた。これは作製した抗ホルボール抗体が今回使用したホルボール誘導体をすべて認識できることを示している。本発明では多くのホルボール誘導体を広く認識する特異的抗体を作製することを目標としてきた。図１２より、抗体はどの誘導体とも同様に反応しており、ホルボール誘導体の共通構造を認識することができる抗体が得られたと考えられる。
【０１１２】
また、本抗体の反応は１２位、１３位、２０位炭素に付く水酸基がエステル化されても影響が見られないこと、さらに４位の水酸基の立体構造がα位、β位でも同様の反応性を示すことから、得られた抗体は、ホルボールのＡ環（五員環）−Ｂ環（七員環）構造、とりわけＡ環構造を認識している可能性が高いと推定される。
【０１１３】
抗体の検出限界はＢ／Ｂｏ値が大きく低下している１〜１０ng／ｍＬ付近であると推定され、ホルボール及びホルボール誘導体が皮膚刺激作用を起こす濃度は数μｇ／ｍＬ、発ガンプロモーターとしての作用を示す濃度は数ｎｇ／ｍＬである。よって本発明によって確立したアッセイ系は作用を示すホルボールを十分に検出できる感度を有しており、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＧＣなどよりも感度が高かった。
【０１１４】
また、その作業は簡便で、前処理を含めて1日でアッセイをすることができ、高価な機器も、複雑な技術も必要としないため利用しやすく、利用価値は高いと思われる。
【０１１５】
さらに、本発明の抗ホルボール抗体は、ホルボール誘導体のＡ環構造を認識していることが推定されることから、本実施例では使用しなかったが、同様の構造を有するダフネトキシン、メゼレイン等に対しても親和性があると予想される。ダフネトキシンやメゼレインもホルボールに似た構造のダフナン型のジテルペノイドであり、ジンチョウゲ科セイヨウオニバシリ（Ｄａｐｈｎｅ ｍｅｚｅｒｅｕｍ）に含まれる。これらはＴＰＡに匹敵する発ガンプロモーターである（奥田拓夫：薬用天然物化学−第２版−、１１６−１２０、２００３）。これらの化合物に対しても、もし反応していれば、植物含有発ガンプロモーターの検出系として非常に意味がある。化６に、ダフナン型ジテルペノイドの構造を示す。
【０１１６】
【化６】
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】実施例２において、Ｐ−ＢＳＡで免疫されたマウスから作製された血清におけるホルボール抗体の抗体価を示す血清の希釈率と４９０ｎｍにおける吸光度の関係のグラフである。
【図２】実施例２において、抗体の産生が見られた２株の抗ホルボール抗体の抗体価を示す４９０ｎｍにおける吸光度のグラフである。
【図３】実施例２において、Ｐ−ＲＳＡで免疫されたウサギから作製された血清における抗ホルボール抗体の抗体価を示す血清の希釈率と４９０ｎｍにおける吸光度のグラフである。
【図４】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載４化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図５】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載４化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図６】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載４化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図７】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載４化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図８】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載４化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図９】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載３化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図１０】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載３化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図１１】実施例３において、抗ホルボール抗体と表４記載３化合物の親和性の測定結果を示すグラフである。
【図１２】実施例３において、抗ホルボール抗体とホルボール誘導体の親和性の測定結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルボール又はホルボール誘導体にキャリアータンパク質を結合させることにより、ホルボール及びホルボール誘導体に対する免疫原性を持たせたことを特徴とするホルボール抗原。
【請求項２】
前記キャリアータンパク質が、ＢＳＡ又はＲＳＡであることを特徴とする請求項１記載のホルボール抗原。
【請求項３】
請求項２記載のホルボール抗原を用いて作製したことを特徴とする抗ホルボール抗体。
【請求項４】
請求項３記載の抗ホルボール抗体を用いて免疫学的方法により、ホルボール及びホルボール誘導体を検出することを特徴とするホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法。
【請求項５】
前記免疫学的方法がＥＬＩＳＡであることを特徴とする請求項４記載のホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法。
【請求項６】
前記ＥＬＩＳＡが競合的ＥＬＩＳＡであることを特徴とする請求項５記載のホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法。
【請求項７】
請求項３記載の抗ホルボール抗体を含むホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬。
【請求項８】
請求項３記載の抗ホルボール抗体を用いて作製した固相化抗ホルボール抗体及び酵素標識抗ホルボール抗体を含むホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬。
【請求項９】
前記抗ホルボール抗体がポリクローナル抗体である請求項７又は８に記載のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬を備えたホルボール及びホルボール誘導体の検出用キット。
【請求項１】
ホルボール又はホルボール誘導体にキャリアータンパク質を結合させることにより、ホルボール及びホルボール誘導体に対する免疫原性を持たせたことを特徴とするホルボール抗原。
【請求項２】
前記キャリアータンパク質が、ＢＳＡ又はＲＳＡであることを特徴とする請求項１記載のホルボール抗原。
【請求項３】
請求項２記載のホルボール抗原を用いて作製したことを特徴とする抗ホルボール抗体。
【請求項４】
請求項３記載の抗ホルボール抗体を用いて免疫学的方法により、ホルボール及びホルボール誘導体を検出することを特徴とするホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法。
【請求項５】
前記免疫学的方法がＥＬＩＳＡであることを特徴とする請求項４記載のホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法。
【請求項６】
前記ＥＬＩＳＡが競合的ＥＬＩＳＡであることを特徴とする請求項５記載のホルボール及びホルボール誘導体の免疫学的検出方法。
【請求項７】
請求項３記載の抗ホルボール抗体を含むホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬。
【請求項８】
請求項３記載の抗ホルボール抗体を用いて作製した固相化抗ホルボール抗体及び酵素標識抗ホルボール抗体を含むホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬。
【請求項９】
前記抗ホルボール抗体がポリクローナル抗体である請求項７又は８に記載のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載のホルボール及びホルボール誘導体の検出用試薬を備えたホルボール及びホルボール誘導体の検出用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００８−５１５８９（Ｐ２００８−５１５８９Ａ）
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２２６５３８（Ｐ２００６−２２６５３８）
【出願日】平成１８年８月２３日（２００６．８．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年３月６日 名古屋市立大学大学院薬学研究科発行の「平成１７年度 名古屋市立大学大学院薬学研究科 博士前期課程論文内容要旨集」に発表
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月２３日（２００６．８．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年３月６日 名古屋市立大学大学院薬学研究科発行の「平成１７年度 名古屋市立大学大学院薬学研究科 博士前期課程論文内容要旨集」に発表
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
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