ホルマリンおよびＵＶ光での処理によるサンプル中の病原体の不活化
【課題】ホルマリンおよびＵＶ光での処理によるサンプル中の病原体の不活化方法の提供。
【解決手段】本発明は、ウイルス含有サンプルを有効濃度のホルマリンで処理すること、およびそのサンプルをフロースルー装置において有効線量のＵＶ光で処理することによって、ウイルスを不活化するための方法に関する。本出願は、具体的には、サンプル中に含まれるウイルスを不活化するための方法を提供する。この方法は、（ｉ）そのサンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程；および（ｉｉ）そのサンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程；を包含し、工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の前に実施されるかまたはその逆であり、その装置を通るサンプルの流量は、約５０Ｌ／時間〜約１０００Ｌ／時間である。
【解決手段】本発明は、ウイルス含有サンプルを有効濃度のホルマリンで処理すること、およびそのサンプルをフロースルー装置において有効線量のＵＶ光で処理することによって、ウイルスを不活化するための方法に関する。本出願は、具体的には、サンプル中に含まれるウイルスを不活化するための方法を提供する。この方法は、（ｉ）そのサンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程；および（ｉｉ）そのサンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程；を包含し、工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の前に実施されるかまたはその逆であり、その装置を通るサンプルの流量は、約５０Ｌ／時間〜約１０００Ｌ／時間である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ウイルス含有サンプルを有効濃度のホルマリンで処理することによって、およびそのサンプルをフロースルー装置中で有効照射量のＵＶ光で処理することによって、ウイルスを不活化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
医学的製品中の病原体の有効な不活化は、公共に健康に関する問題である。なぜなら、以前には未知であった疾患が、治療の投与を介して急速に伝播し得ることが発見されたからである。従って、バイオテクノロジー製品が、それを使用することによって病原因子を伝達するリスクを低下することを意図する、ますます厳しくなる基準の下で出現している。潜在的な混入物質が、血液製品の製造における問題であるのみならず、安全なワクチンの製造における問題でもある。
【０００３】
病原体に対するワクチン（特に、ウイルスワクチン）の製造における最も重要な工程のうちの１つは、ウイルス不活化である。ウイルス不活化の場合、ホルマリンが、ワクチン製造において最も頻繁に使用される不活化剤である。このホルマリン不活化工程は、確立された分析手順を用いて確認されている。しかし、非常に厳密な品質管理試験（例えば、哺乳動物細胞培養試験（例えば、ＶＥＲＯ安全性試験））の導入は、いくつかの場合において、残留感染性の証拠を示した。この残留感染性を除去するための努力において、凝集物および／または濾過の機械的破壊が、成功しないことがわかった。
【０００４】
ホルマリン処理に対する代替法として、ＵＶ不活化が、上記製造プロセス中に組み込むために考えられた。ヒトワクチンのＵＶ照射不活化の使用が、以前に実証されている。非特許文献１および非特許文献２は、ヒトにおける研究からの免疫原性の結果に関して報告しており、この研究において、その著者らは、ＵＶ不活化したポリオワクチンを使用した。ポリオウイルスは、非エンベロープピコルナウイルスであり、１つのセグメント中に＋鎖の一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。このウイルスゲノムは、ウイルス表面抗原よりもＵＶ損傷に対して感受性が高いので、ポリオウイルスキャプシドタンパク質の場合、ＵＶ不活化は、製品の生化学的特徴にも免疫原性にも、ほとんど負の影響を有さないことが示された。ＵＶ不活化のための標的は、ホルマリンにより標的とされるタンパク質とは対照的に、主に核酸である。ホルマリンとＵＶ不活化とを組合わせることによって、科学者達は、特に活発なポリオウイルスを不活化する場合に、単独のＵＶ不活化またはホルマリン不活化それぞれの限界を克服しようとした。例えば、非特許文献３を参照のこと。
【０００５】
ＵＶ照射技術は、食物、薬剤、化粧品、および飲料の産業、ならびに飲料水において広範な適用範囲を有する。ＵＶ殺菌は、物理化学的プロセスであり、このプロセスにおいて、プリン塩基およびピリミジン塩基の環状分子の共有結合が、ＵＶ波長照射の励起エネルギーによって破壊され、核酸とその核酸がコードする遺伝情報とを損傷させる。有効なＵＶＣ（１００ｎｍ〜２８０ｎｍ）に対して曝露された微生物（例えば、細菌および酵母など、ならびにウイルス）は、数秒以内に不活化される。結果として、成功する殺菌は、低下等価（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ−ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）照射線量に依存する。平均殺菌照射線量（Ｊ／ｍ２で表わす）が、バイオ線量計を使用して照射ゾーンにおいて測定される。しかし、ＵＶ不活化単独では、安全かつ有効なワクチンを生成するためには適切ではない。
【０００６】
非特許文献４は、ホルマリンと紫外線との組み合わせを用いるポリオウイルスの不活化を記載する。非特許文献５は、紫外線−ホルマリンで不活化したポリオワクチンでワクチン接種された被験体の血液における、測定可能なレベルの循環抗体の形成を記載する。非特許文献６は、ホルマリン、ＵＶ光、およびβ−プロピオラクトンからなる３段階不活化プロセスによる、ハムスターにおけるアデノウイルスおよびシミアンウイルス４０の腫瘍原性の不活化に関して報告する。非特許文献７は、紫外線とホルマリンとでの処理による、センダイウイルスの免疫原の調製を記載する。上記の構想のうちのいずれも、ワクチン製造における一般的使用のためにこれまで採用されていないが、産業規模で安全かつ有効なワクチンの製造について、絶えず存在する必要性があった。さらに、引用した研究のいずれも、本研究において使用されるＶＥＲＯ安全性試験と同程度に感度が高い、「不活化ウイルス」の残留感染性を決定するための安全性試験を使用していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｉｌｚｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂ．Ｈｅａｌｔｈ（１９５４）４４：２６〜３３
【非特許文献２】Ｗｏｌｆら、ＪＡＭＡ（１９５６）１６１：７７５〜８１
【非特許文献３】ＭｃＬｅａｎら、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．（１９５８），ｖｏｌ １，ｐｐ．１２２〜１６４
【非特許文献４】Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９５７）７９：２６５〜７５
【非特許文献５】Ｍｏｌｎｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂ．Ｈｅａｌｔｈ（１９５８）４８：５９０〜８
【非特許文献６】Ｔｒｕｆｆｅｌｌｉら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９６７）１５：５１６〜２７
【非特許文献７】Ｍｉｙａｍａｅ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８６）３０：２１３〜２３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、ホルマリン不活化工程とＵＶ不活化工程との組み合わせが、産業規模でのワクチン調製のために不活化ウイルスの製造のための高体積スループット系においてバルクウイルス中のウイルスを完全に不活化するために利用され得る。このことはまた、実施例において使用されるような高力価濃縮ウイルス調製物に関して示されており、実施例において、残留ウイルス活性が、非常に感度の高いＶＥＲＯ細胞培養物試験を使用して検出されなかった。本発明者らはまた、驚くべきことには、この方法は、非エンベロープウイルス（例えば、ポリオピコルナウイルス）と比較して、エンベロープウイルス（例えば、オルトミクソウイルス）について特によく機能することを実証した。この発見は、新生の急速に変化するウイルス疾患（例えば、大流行間性（ｉｎｔｅｒｐａｎｄｅｍｉｃ）インフルエンザ株および汎発性（ｐａｎｄｅｍｉｃ）インフルエンザ株）のための、安全な非常に免疫原性のワクチンの迅速な製造のための重要な暗示を有する。
【０００９】
（発明の要旨）
サンプル中に含まれるワクチンの非常に効率的かつ安全な不活化を可能にし、同時に、その不活化ワクチンの高い抗原性および免疫原性を保持する方法を提供することが、本発明の目的である。具体的には、本発明の方法は、高体積スループット系において、ホルマリン不活化工程をＵＶ不活化工程と合わせて利用して、ワクチン製造において使用するための高抗原含量の安全なバルクウイルス調製物を製造する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
サンプル中に含まれるウイルスを不活化するための方法であって、該方法は、
（ｉ）該サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程；および
（ｉｉ）該サンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程；
を包含し、工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の前に実施されるかまたはその逆であり、該装置を通る該サンプルの流量は、約５０Ｌ／時間〜約１０００Ｌ／時間である、方法。
（項目２）
サンプル中に含まれるエンベロープウイルスを不活化するための方法であって、該方法は、
（ｉ）該サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程；および
（ｉｉ）該サンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程；
を包含し、工程（ｉ）は工程（ｉｉ）の前に実施されるかまたはその逆であり、該エンベロープウイルスは、完全に不活化される、方法。
（項目３）
サンプル中に含まれるエンベロープＲＮＡウイルスを不活化するための方法であって、該方法は、
（ｉ）該サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程；および
（ｉｉ）該サンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程；
を包含し、工程（ｉ）は工程（ｉｉ）の前に実施されるかまたはその逆であり、該エンベロープウイルスは、完全に不活化される、方法。
（項目４）
サンプル中に含まれるウイルスを不活化するための方法であって、該方法は、
（ｉ）該サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程；および
（ｉｉ）該サンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程であって、該装置は、該装置中にＵＶランプと該ＵＶランプの直径に対して実質的に垂直な薄層チャンバとを備える、工程；
を包含し、工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の前に実施されるかまたはその逆であり、該サンプルは、工程（ｉｉ）において該装置の薄層チャンバを通される、方法。
（項目５）
項目１〜項目４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプル中の前記ウイルスの不活化に起因するウイルス力価の低下は、少なくとも約１×１０５または少なくとも約１×１０７または少なくとも約１×１０１０または少なくとも約１×１０１４である、方法。
（項目６）
項目１〜項目５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程は、約１２時間〜約９６時間かけて実行される、方法。
（項目７）
項目１〜項目６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ホルマリンの有効濃度は、約０．０１％〜約０．１％である、方法。
方法。
（項目８）
項目１〜項目７のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ＵＶ光は、約１００ｎｍ〜約２８０ｎｍの波長を有するＵＶＣである、方法。
（項目９）
項目１〜項目８のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ＵＶ光の線量は、約５ｍＪ／ｃｍ２〜約２００ｍＪ／ｃｍ２である、方法。
（項目１０）
項目１〜項目９のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルと前記ＵＶ光との接触時間は、約１秒間〜約２０秒間である、方法。
（項目１１）
項目１〜項目１０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記フロースルー装置における流量は、約５０Ｌ／時間〜約１００Ｌ／時間である、方法。
（項目１２）
項目１〜項目１１のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記フロースルー装置は、薄層チャンバを備える、方法。
（項目１３）
項目１〜項目１２のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記薄層チャンバを通る前記サンプルのフローは、濁っている、方法。
（項目１４）
項目１２または項目１３に記載の方法であって、前記薄層チャンバの薄層は、約１ｍｍの厚さを有する、方法。
（項目１５）
項目１〜項目１４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程は、約２回〜約１０回反復される、方法。
（項目１６）
項目１〜項目１５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルは、生物学的製品、医学的製品、または薬学的製品を調製するための細胞培養プロセスに由来する、生物学的流体または溶液からなる群より選択される、方法。
（項目１７）
項目１〜項目１６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、該方法は、
前記サンプルを精製工程に供して該サンプル中の残留ホルマリンを除去する工程；
をさらに包含する、方法。
（項目１８）
項目１〜項目１７のうちのいずれか１項に記載の方法であって、該方法は、
前記サンプル中の不活化ウイルスを薬学的純度まで精製する工程；および
該精製された不活化ウイルスを、ワクチンとして使用するための薬学的組成物へと処方する工程；
をさらに包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明のＵＶ不活化工程のために使用され得るＵＶ薄層チャンバを示す。
【図２】図２は、ＵＶセンサーを備えたＵＶ不活化システムを示す。上記のＵＶセンサーおよびフローメーターは、必要に応じた特徴である。本願のさらなる実施形態において、上記ポンプおよび／またはフローメーターは、出口チューブに備えられ得る。
【図３】図３は、フロースルー装置における有効線量にサンプルを反復して供するために、互いに接続されたいくつかのＵＶ薄層チャンバ（ＵＶリアクター）を使用するＵＶ不活化システムを示す。ＵＶ薄層チャンバの数は、約２個〜約１０個の間で変化し得る。上記ＵＶセンサーおよびフローメーターは、必要に応じた特徴である。本願のさらなる実施形態において、上記ポンプおよび／またはフローメーターは、出口チューブに設置され得る。連続的に接続された不活化チャンバを備える連続ＵＶ生成器が、大規模製造プロセスにおいて使用され得、それによって、サンプルのハイスループットが可能になる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明の一局面に従って、上記目的は、サンプル中に含まれるウイルスを不活化するための方法を提供することによって解決される。この方法は、
（ｉ）上記サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程；および
（ｉｉ）上記サンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程；
を包含し、工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の前に実施されるかまたはその逆である。好ましくは、上記装置を通る上記サンプルの流量は、約５０Ｌ／時間〜約１０００Ｌ／時間である。
【００１２】
不活化するための方法の別の好ましい局面において、不活化されるべきウイルスは、それぞれ、エンベロープウイルスまたはエンベロープＲＮＡであり、上記エンベロープウイルスまたはエンベロープＲＮＡウイルスは、それぞれ、完全に不活化される。
【００１３】
別の局面に従って、サンプル中に含まれるウイルスを不活化するための方法が提供される。この方法は、
（ｉ）上記サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程；および
（ｉｉ）上記サンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程；
を包含し、上記装置は、上記装置中にＵＶランプと上記ＵＶランプの直径に対して実質的に垂直な薄層チャンバとを備え、工程（ｉ）は工程（ｉｉ）の前に実施されるかまたはその逆であり、上記サンプルは、工程（ｉｉ）において上記装置の薄層チャンバを通される。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態において、上記サンプルは、有効濃度のホルマリンで処理された後に、フロースルー装置中で有効線量のＵＶ光で処理される。本発明者らは、いかなる理論によっても拘束されないが、ビリオンの表面分子上でのホルマリンの架橋効果が、ＵＶ不活化フロースルー装置の高体積流体力学の厳密さ（ｒｉｇｏｒ）のためにウイルスを安定化すると、考えられる。
【００１５】
本発明に従う不活化する方法は、実施例２および実施例４（Ａ）において実証されるように、有効かつ安全である。さらに、不活化する方法は、実施例４（Ｂ）において示されるように防御免疫応答を惹起する、高い抗原性および免疫原性を有するワクチンの製造を可能にする。
【００１６】
用語「サンプル」とは、本明細書中で使用される場合、病原体もしくはその一部を含有する任意のサンプル（例えば、（生物学的製品、医学的製品、または薬学的製品（例えば、血液製品もしくはワクチン）を調製するための細胞培養プロセスに由来する任意の流体（例えば、生物学的流体もしくは溶液））を包含する。そのサンプルは、生物学的流体（例えば、血液または血漿）を含むサンプルであり得る。そのサンプルはまた、細胞培養物の収集された成分（例えば、その培養物の細胞もしくは培養培地画分）を含む流体であり得る。好ましい実施形態において、そのサンプルは、例えば、ワクチンの製造における治療剤の製造において使用される流体であり、その不活化ワクチンまたはその部分が、治療剤である。特に好ましい実施形態において、細胞成分は、例えば、濾過または遠心分離によって、不活化方法の前の上記サンプルから分離される。
【００１７】
本出願の好ましい実施形態において、上記ウイルスは、細胞培養物の収集物（その上清および細胞からなる）から生成され、これは、医療製品（例えば、ワクチン）の調製のためにさらに使用される。本発明のさらなる実施形態において、上記細胞培養物の細胞は、病原体に感染している。上記細胞は、上記ウイルスを生成するために適切な一次細胞または任意の培養細胞であり得る。使用され得る細胞の例としては、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＥＬＡ細胞）、鳥類細胞（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞、または鳥類由来の連続細胞株）、および昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）が挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、ウイルスバルクの細胞培養生成に由来する細胞および細胞破片は、化学的（ホルマリン）不活化工程および／またはＵＶ照射不活化工程の前に、そのウイルスバルクから分離される。
【００１８】
本発明において、不活化されるべきウイルスは、エンベロープまたは非エンベロープのＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルスであり、一本鎖ゲノムもしくは二本鎖（ＤＮＡ）ゲノムを有し、センスもしくはアンチセンスであり、連続的であるかもしくは分節している（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）。上記ウイルスは、バキュロウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、パルボウイルス、ヘパドナウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、アストロウイルス、ピコルナウイルス、レトロウイルス、オルトミクソウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、およびブンヤウイルスからなる群より選択され得る。本発明の好ましい実施形態において、上記ウイルスは、エンベロープウイルス（フラビウイルス、トガウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ラブドウイルス、ブンヤウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、アレナウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルスが挙げられる）の群から選択される。実施例および実施例７において示されるように、本発明の不活化方法は、非エンベロープポリオおよび非エンベロープアデノウイルスと比較して、エンベロープウイルス（例えば、インフルエンザウイルスおよびロス川ウイルス）に対して特に有効である。本発明の他の好ましい実施形態において、上記ウイルスは、エンベロープＲＮＡウイルス（フラビウイルス、トガウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ラブドウイルス、ブンヤウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、およびアレナウイルスが挙げられる）の群から選択される。特に好ましい一実施形態において、上記ウイルスは、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス株）から選択される。インフルエンザウイルス株は、赤血球凝集素タンパク質およびノイラミニダーゼ表面タンパク質の種々の組み合わせを有し得る。別の特に好ましい実施形態において、上記ウイルスは、トガウイルス（例えば、アルファウイルス（例えば、ロス川ウイルス（ＲＲＶ）））から選択される。バルクウイルス溶液として使用するための別の好ましいウイルス群は、コロナウイルス（重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）に関連するウイルスが挙げられる）である。別の好ましいウイルス群は、フラビウイルス（日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、および出血熱ウイルスが挙げられる）およびトリポックスウイルスである。
【００１９】
不活化ウイルス病原体の部分もまた、本発明によって包含される。本発明の好ましい実施形態において、上記部分は、免疫原においてエピトープとして役立ち得る。このエピトープは、上記病原体に対する免疫応答を惹起するために使用され得る。本願の好ましい実施形態において、病原体の部分は、上記病原体に対するワクチンとして使用される。特に好ましい実施形態において、上記病原体の部分は、分割されたビリオン（ｓｐｌｉｔ ｖｉｒｉｏｎ）であり、これは、分割される前または分割された後に、不活化され得る。
【００２０】
本発明の意味においては、本発明に従う不活化する方法は、その方法を使用して生成された不活化されたウイルスが哺乳動物細胞培養試験（例えば、実施例２において詳述される安全性試験）を合格した場合に、安全である、または完全に不活化されている、と考えられる。示されるように、これらの試験は、使用される他の試験（例えば、卵試験）よりも感度が高い。その安全性試験の好ましい合格／不合格の基準は、実施例１および実施例２において詳述される。
【００２１】
本願の好ましい実施形態において、上記サンプルにおけるウイルスの不活化に起因するウイルス力価の低下は、少なくとも約１×１０５、より好ましい実施形態において少なくとも１×１０７、より好ましい実施形態において少なくとも約１×１０１０、最も好ましい実施形態約１×１０１４である。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、上記サンプルは、有効濃度のホルマリンで約１２時間〜約９６時間処理される。より好ましい実施形態において、上記サンプルは、有効濃度のホルマリンで約２４時間〜約４８時間、より好ましくは約２４時間〜約３０時間、処理される。
【００２３】
本発明の特に好ましい実施形態において、上記サンプルは、有効濃度のホルマリンで２４時間〜約２４．５時間される。
【００２４】
さらなる実施形態において、上記サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程は、約１０℃〜約４０℃にて実行される。本出願の特に好ましい実施形態において、上記サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程は、約３２℃で実行される。
【００２５】
本発明の特に好ましい実施形態は、有効濃度のホルマリンによる上記サンプルの処理を包含し、そのホルマリンの有効濃度は、好ましくは約０．０１％（ｗ／ｗ）〜約１％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．０１％〜約０．１％、より好ましくは約０．０２５％（これは、この有効濃度を調節するために３７％ホルマリン溶液を使用する場合、約９２ｍｇ／ｌホルマリンに対応する）〜約０．１％（これは、この有効濃度を調節するために３７％ホルマリン溶液を使用する場合、それぞれ、約３６８ｍｇ／ｌホルマリンに対応する）の範囲である。
【００２６】
本出願において、用語「ＵＶ光」とは、１００ｎｍ〜４００ｎｍの波長を有する紫外線を意味する。上記ＵＶ光は、ＵＶＣ（１００ｎｍ〜２８０ｎｍ）、ＵＶＢ（２８０ｎｍ〜３２０ｎｍ）、およびＵＶＡ（３２０ｎｍ〜４００ｎｍ）からなる群より選択され得る。光感作剤（ＤＮＡ中にインターカレートしかつＵＶ光によって不活化されるもの（例えば、ソラレン）など）が、ＵＶ照射の不活化効果を増強するために使用され得る。本発明の好ましい実施形態において、上記ＵＶ光は、約１００ｎｍ〜〜約２８０ｎｍの波長を有するＵＶＣである。本発明のより好ましい実施形態において、上記ＵＶ光は、約２４０ｎｍ〜〜約２９０ｎｍの波長を有する。本発明の特に好ましい実施形態において、上記ＵＶ光のうちの約８５％以上は、約２５４ｎｍの波長を有する。
【００２７】
ＵＶ光放射は、連続形態のＵＶ光放射（例えば水銀ランプ技術）であっても、パルス型ＵＶ光（単色レーザー技術）であってもよい。望ましいＵＶ強度は、２つ以上のランプを組合わせることによって、生成され得る。好ましい実施形態において、上記光は、約１１０Ｗのランプによって連続的に放射される。実施例において示される好ましい実施形態において、上記ＵＶランプは、実施例において使用されるランプ（９５０ｎｍ）と同様に、少なくとも１ｍの長さを有する。
【００２８】
本発明の主題は、有効線量のＵＶ光（すなわち、上記のようなホルマリン処理と組み合わせた場合に所定のウイルスを安全に不活化する、任意の線量のＵＶ光）を包含する。その有効線量は、当該分野で一般的に公知である種々の要因（例えば、ＵＶ不活化の物理的パラメーター（例えば、ランプおよびチャンバの大きさおよび直径；ウイルス含有培地とＵＶ光源との間の距離；チャンバ材料の光吸収特性および光反射特性））に依存し得る。同じ理由によって、ＵＶ光の波長および強度、ならびにウイルスがＵＶ光に曝露される接触時間もまた、上記有効線量のために重要である。さらに、有効線量はまた、ウイルス自体、ウイルスを含む培地、およびそれらの光吸収特性によって影響を受ける。好ましくは、上記有効線量は、サンプル中に含まれるウイルスのうちの少なくとも９９．９９％を死滅させるために十分であり、より好ましくは、活性なウイルスが哺乳動物細胞培養試験（好ましくは実施例２に従う試験）において検出されないレベルまで上記ウイルスを不活化する（すなわち、完全に不活化する）ために、十分である。好ましい実施形態において、ＵＶＣ光を使用して、上記ウイルスを含むサンプルが、約５ｍＪ／ｃｍ２〜約２００ｍＪ／ｃｍ２の範囲の有効線量に曝露される。好ましい実施形態において、上記有効線量は、約２０ｍＪ／ｃｍ２〜約１００ｍＪ／ｃｍ２の範囲にある。他の好ましい実施形態において、上記有効線量は、約４０ｍＪ／ｃｍ２〜約９０ｍＪ／ｃｍ２の範囲にある。比較として、飲料水中に存在する病原体のうちの９９．９９％を死滅させるための有効線量は、約＞４０ｍＪ／ｃｍ２である。好ましい実施形態において、上記有効線量は、初期ウイルス力価を１×１０５低下させる。バルクワクチン不活化において、上記有効線量は、初期化学的（ホルマリン）不活化工程の後に存在し得るあらゆる残留ウイルスを除去するために十分であるべきである。実施例において示されるように、これは、非常に感度の高い哺乳動物細胞培養感染試験（例えば、記載されるＶｅｒｏ細胞培養試験）によって決定され得る。
【００２９】
本発明（特に、ＵＶ光チャンバ）のさらなる好ましい実施形態が、実施例に提供される。
【００３０】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、上記サンプルとＵＶ光との接触時間は、約１秒間〜約２０秒間、好ましくは約１．４秒間〜約１４秒間の範囲にある。上記接触時間は、上記光源に対する接線に沿って約１ｍｍ厚であるサンプルおよび上記ＵＶランプのワット量約１１０Ｗに基づいて好ましくは計算される。当業者は、サンプルの奥行きが厚く光源のエネルギー（ワット量）が少ない程、上記曝露時間が増大し、その逆もまた真であることを、認識する。本出願のより好ましい実施形態において、上記サンプルとＵＶ光との接触時間は、約１．４秒間〜約７秒間である。本願の特に好ましい実施形態において、上記サンプルと上記ＵＶ光との接触時間は、約２．８秒間〜約４．２秒間である。
【００３１】
所定のＵＶ光線量を使用する本発明に従う所定の設定が本発明に従って病原体を有効に不活化するか否かを試験するために、その不活化されたウイルスを、残留ウイルス活性について試験すべきである。これは、哺乳動物細胞培養試験（例えば、Ｖｅｒｏ安全性試験）を使用することによって、好ましくは実施例１および実施例２に詳述される基準を適用して、達成され得る。
【００３２】
本発明に従って、有効線量のＵＶ光による上記サンプルの処理は、好ましくは表１および図１において特定されるように、フロースルー装置において実行される。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、上記フロースルー装置は、薄層チャンバを含む。そのチャンバの最小厚は、妥当な迅速な処理を可能にしかつ完全不活化ウイルスワクチンのためにウイルス破壊を防止するために、上記バルクウイルス溶液の十分なフローを可能にすべきである。また、上記バルクウイルス溶液によるＵＶ照射の吸収と、上記溶液中のすべてのウイルスの十分な照射を確実にする必要性とに起因して、その最大の厚みは、すべてのビリオンが十分に照射されることなく上記装置を通過することを許容すべきではない。従って、上記薄層は、約１ｃｍ厚よりも厚いものであるべきではない。上記薄層は、好ましくは０．５ｍｍ厚〜約３ｍｍ厚であり、より好ましくは約１ｍｍであり、その結果、上記ＵＶランプと不活化されるべき病原体との間の最大距離は、約１ｍｍ未満である。あるいは、上記サンプルは、上記ランプの長さに対して平行に上記ランプウを通され得、その結果、上記サンプルは、上記サンプルチャンバの内径ではなく外径から照射される。同様に、ランプ（またはランプの円）中のサンプルチャンバ内のランプは、内径および外径の両方から上記サンプルチャンバを照射する構成として、使用され得る。さらに、上記チャンバは、好ましくは、上記チャンバを通るサンプルのフローが厳密には層流ではなく乱流であるように、設計される。このことは、上記ウイルスをサンプル培地と混合することを補助し、ＵＶ照射に対する均一な曝露を確実にする。
【００３４】
本出願の別の好ましい実施形態において、上記フロースルー装置は、ＵＶ不活化チャンバを含み、ＵＶランプは、直径約３０ｍｍを有し、上記サンプルが流れるＵＶランプを取り囲むチャンバは、約３２ｍｍの直径を有する。本願の好ましい実施形態において、上記チャンバは、総体積約９２ｍｌを有する。
【００３５】
照射されるべきサンプルは、上記装置を通され得る。好ましい実施形態において、上記サンプルは、上記ＵＶ照射チャンバを通りながら冷却される。本発明のさらなる好ましい実施形態において、上記ＵＶチャンバを通るサンプルは、約２℃〜約３２℃、より好ましくは約２℃〜約８℃の温度を有する。
【００３６】
好ましくは、上記フロースルー装置中のサンプルの流量は、約５０Ｌ／時間〜約１０００Ｌ／時間、より好ましくは約２３０Ｌ／時間〜約４８０Ｌ／時間の範囲にある。特に好ましい実施形態において、上記フロー装置中のサンプルの流量は、約２３０Ｌ／時間〜約２５０Ｌ／時間の範囲にあり、より好ましくは約２４０Ｌ／時間である。実施例において例証されるこれらの好ましい流量は、上記バルクウイルス溶液の経済的大規模ＵＶ処理を可能にする。
【００３７】
好ましい実施形態において、上記接触時間は、上記サンプルがＵＶ照射に曝露されるサンプルチャンバの長さ、およびそのチャンバを通る上記サンプルの流量に依存する。従って、上記フロースルー装置において配置されたＵＶランプの数を増加することによって簡単に調整され得る有効線量は、ＵＶ照射に対して曝露されるサンプルチャンバの有効長さを増加する。あるいは、同じ数の、より長いランプ−チャンバを使用すると、上記有効線量を増加し、同様に、より多くの数の、より短いランプ−チャンバを使用すると、同じ有効線量と等価であり得る。
【００３８】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、上記サンプルをフロースルー装置において有効線量のＵＶ光に供する工程は、周期的様式または連続的様式で反復される。この工程は、約２回〜約１０回反復され得る。本願の好ましい実施形態において、上記サンプルをフロースルー装置において有効線量のＵＶ光に供する工程は、約２回〜約５回反復され、本願のより好ましい実施形態において、この工程は、約２回〜約３回反復される。複数のランプチャンバを連続して使用することまたは同じランプを通す再循環フローを使用することに対するさらなる利点は、上記サンプルが、チャンバ間またはサイクル間で、より徹底的に混合され得て、ＵＶ照射に対する上記ウイルスの均一な曝露を確実にし得ることである。
【００３９】
上記サンプル中のウイルスが不活化された後に、不活化されたウイルスは、種々の適用（ワクチンおよび他の薬学的組成物が挙げられる）における使用のために精製され得る。本発明の別の好ましい実施形態によると、不活化する方法は、上記サンプル中の不活化ウイルスを薬学純度に精製し、精製されたウイルスを、ワクチンとして使用するための薬学的組成物へと処方する工程をさらに包含する。精製は、当該分野において公知の手段（濾過、またはダイアフィルトレーション、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィーなど）、または遠心分離が挙げられるが、これらに限定はされない）によって達成され得る。あるいは、上記ウイルスは、本発明の方法による不活化の前に、精製され得る。
【００４０】
本発明の別の好ましい実施形態によると、不活化する方法は、精製工程をさらに包含する。すなわち、上記サンプルは、そのサンプル中の残留ホルマリンを除去するための精製工程に供される。そのような精製は、薬学的に受容可能なレベルよりも高いホルマリンレベルが残る場合に、有用である。不活化されたウイルスは、必要に応じた精製工程の後に、薬学的組成物へと処方され得る。処方物は、必要に応じて、キャリア（例えば、生理食塩水もしくは緩衝液）、賦形剤、安定剤（例えば、アルブミン、糖、および／もしくはアミノ酸）、塩および／またはアジュバント（例えば、ミョウバン）を含み得る。あるいは、不活化されたウイルスは、薬学的使用のために、例えば、リポソーム中への封入によって、さらに改変され得る。
【００４１】
本発明は、以下の実施例においてさらに例証され、以下の実施例は決して限定されない。本発明が詳細に記載されているが、改変および変化が、添付の特許請求の範囲において定義される発明の範囲から逸脱することなく可能であることが、明らかである。
【実施例】
【００４２】
（実施例１：標準的卵安全性試験の原理）
標準的卵安全性試験を使用して、不活化されたインフルエンザウイルスの残留感染性について試験した。一価バルク製品（すなわち、ショ糖勾配遠心分離および超ダイアフィルトレーションの後の精製ウイルス抗原）を、１０個の卵（０．２ｍｌ／卵）に注入する。３２℃にて３日間インキュベートした後、それらの卵を収集し、プールし、再度、１０個の卵（０．２ｍｌ／卵）に注入する。３２℃にて３日間さらにインキュベートした後、それらの卵を収集し、プールし、赤血球凝集素（ＨＡ）について試験する。
【００４３】
このＨＡ試験は、インフルエンザウイルスが、その表面タンパク質である赤血球凝集素を使用して赤血球に結合し得ることに基づく。この試験は、滅菌環境において実行する。所定のＨＡ力価を有するインフルエンザ懸濁物が、ポジティブコントロールとして役立ち、０．９％ ＮａＣｌ溶液が、ネガティブコントロールとして役立つ。０．９％ ＮａＣｌ中における試験すべきサンプルの１：２希釈物５０μｌを、９６ウェルプレートのうちの１つのウェルに提供する。各ウェルに、ニワトリ赤血球を含む溶液５０μｌを添加する。その後、そのプレートを、室温で３０分間〜４５分間インキュベートする。そのｇお、赤血球凝集素を視覚的に決定する。この場合、同じサンプルを含む５つのサンプルが赤血球凝集素を全く示さない場合、そのサンプルは、このＨＡ試験を合格した。
【００４４】
（実施例２：標準的Ｖｅｒｏ安全性試験の原理）
標準的Ｖｅｒｏ安全性試験は、不活化インフルエンザ株の残留感染性についての非常に厳密な品質試験である。この試験はまた、他のウイルスにも適用可能である。一価バルク製品（すなわち、ショ糖勾配遠心分離および超ダイアフィルトレーションの後の精製ウイルス抗原）を、５個のルー瓶（４ｍｌ／瓶）に注入する。Ｖｅｒｏ培地中で３２℃にて７日間インキュベートした後、それらの細胞培養物を収集し、プールし、５個のルー瓶（１０ｍｌ／瓶）に注入する。３２℃にて７日間さらにインキュベートした後、それらの細胞培養物を収集し、プールし、実施例１において記載されるように赤血球凝集素（ＨＡ）について試験する。
【００４５】
（実施例３：ホルマリン不活化）
ホルマリンによる最初の不活化工程は、無細胞の感染性一価ウイルス収集物（すなわち、遠心分離を介して清澄化した後のバイオリアクター収集物）で実行する。３０℃〜３４℃で収集した後、その一価ウイルス収集物を、約０．９Ｕ／ｍｌ〜約１．１Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼを用いて３０℃〜３４℃にて４時間〜８時間処理する。その後、それを、≦９２ｍｇ／ｌのホルマリンを用いて３２±２℃にて２４時間〜２４．５時間処理する。
【００４６】
（実施例４：６５ワットＵＶランプを用いる不活化実験）
ホルマリン不活化ウイルスを用いる多数の不活化実験を、６５ＷのＵＶランプと薄層チャンバとを備える不活化チャンバを使用して実行する。一価ウイルス収集物の完全な不活化が、１００Ｌ／時間の流量で３サイクルを使用した場合に実証され得るが、この設定は、ＵＶシグナルのオンライン測定を可能にはしなかった。インフルエンザ生成のために使用されるＶｅｒｏ細胞培地は、ＵＶシグナルの吸収を担う種々の有機化合物を含む。従って、上記のシステムは、１１０Ｗのランプを備え、これによって、一価ウイルス収集物の処理の間のＵＶシグナルの連続的モニタリングを可能にする。
【００４７】
（実施例５：１１０ワットＵＶランプを用いる不活化実験）
ホルマリン処理した一価インフルエンザパナマ（Ｐａｎａｍａ）収集物を、この不活化研究のためのモデル基質として使用する。薄層ＵＶ技術を用いる連続的不活化のために、ＶＩＳＡランプ（１１０Ｗ／４Ｖ）を備えるＷＥＤＥＣＯ ＶＩＳＡシステム（Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する。ＵＶ薄層チャンバは、３０ｍｍ直径石英チューブを備えるステンレス鋼製１．４４３５デバイスである（表１を参照のこと）。較正済みＵＶセンサーは、ＵＶシグナルのオンライン制御を可能にする。ＵＶ薄層チャンバを、周囲温度において２４０±１０Ｌ／時間の流量で操作する。この流量条件を、較正済みフローメーターによって制御する（表２を参照のこと）。
【００４８】
（表１）
（ＵＶ不活化チャンバの特徴）
【００４９】
【表１】
上記一価収集物を、１０回のＵＶサイクルに曝露する。各サイクルの後、ＵＶ処理済み一価収集物のうちの２０Ｌを取り出す。これを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中での長期４２％ショ糖勾配を用いる連続的超遠心分離条件を使用するショ糖勾配精製によってさらに精製し、所定の精製一価収集物（ＰＭＶＨ）を、プレ清澄器（ｐｒｅｃｌａｒｉｆｉｅｒ）を備えないＳｏｒｖａｌｌ ＣＣ４０遠心機（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｋｏｋｉ Ｃｏ，ＬＴＤ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、４８％から３６％へのショ糖を使用して精製する。
【００５０】
（表２）
（ホルマリンとＵＶとで処理したインフルエンザパナマ（Ｐａｎａｍａ）の超遠心分離実行の概要）
【００５１】
【表２】
（（Ａ）抗原の収率および純度）
インフルエンザ抗原の収率および純度を、赤血球凝集素（ＨＡ）含量、総タンパク質、およびＶｅｒｏタンパク質（宿主細胞タンパク質）に基づいて比較する。精製ウイルスを、ＨＡ／タンパク質比、宿主細胞タンパク質／ＨＡ比、およびウイルス安全性に基づいて比較する（表３を参照のこと）。ＵＶ処理したすべての収集物について、何のウイルス増殖も検出され得ない。対照的に、標準的ホルマリン不活化プロセス（ＵＶ照射を適用しない）に由来する精製ウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞培養物において増殖され得る。ＨＡ／タンパク質比の有意な低下がサイクル７およびサイクル１０の後に観察され得るが、ホルマリン不活化製品と二重不活化製品との有意な差異は、ＨＡ／タンパク質比および宿主細胞タンパク質／ＨＡ比として測定した抗原純度に関して検出されない。
【００５２】
（表３）
（ホルマリンとＵＶとでの処理の後のショ糖勾配精製したパナマ（Ｐａｎａｍａ）ウイルス。０回〜１０回のＵＶサイクル後の、ＨＡ／タンパク質比、宿主細胞タンパク質／ＨＡ比、および安全性）
【００５３】
【表３】
さらなる研究を実行して、赤血球凝集素阻害（ＨＡＩ）分析によってモルモットおよびマウスにおける抗原性と免疫原性とに対するＵＶ不活化の効果を特徴付ける。
【００５４】
（（Ｂ）抗原性）
抗原性を、パナマ（Ｐａｎａｍａ）特異的抗血清に対するＨＡＩアッセイによって分析する。ＵＶ接触時間の増加は、ＨＡのわずかな喪失をもたらすが、ＨＡＩ力価については何の負の影響も示されない（表４を参照のこと）。
【００５５】
（表４）
（ホルマリンとＵＶとでの処理の後のショ糖勾配精製したパナマ（Ｐａｎａｍａ）ウイルス。０回〜１０回のＵＶサイクル後の、パナマ（Ｐａｎａｍａ）特異的抗血清を用いたＨＡ力価およびＨＡＩ力価に基づく抗原性の比較）
【００５６】
【表４】
（（Ｃ）免疫原性）
免疫原性を、モルモットおよびマウスを、種々のアリコートの精製一価ウイルス収集物で免疫して、最初の免疫の３週間後にブースターで免疫することによって、分析する。免疫した動物の血清を、３週間後および６週間後に収集してプールし、卵由来抗原に対するＨＡＩアッセイおよびＶｅｒｏ由来抗原に対するＨＡＩアッセイによって分析する。３週間後および６週間後にモルモットおよびマウスにおいて試験した免疫原性は、非常に有望な結果を与える。二重不活化ウイルスについて、標準的ホルマリン処理ウイルスに対する有意な差異は、観察され得ない（表５を参照のこと）。
【００５７】
（表５）
（ホルマリンとＵＶとでの処理（０回〜１０回のサイクル）の後のショ糖勾配精製パナマ（Ｐａｎａｍａ）ウイルス。モルモットおよびマウスにおいて試験した免疫原性の比較。Ａ）３種間後、Ｂ）６週間後。卵由来インフルエンザ抗原を用いるＨＡＩおよびＶｅｒｏ由来インフルエンザ抗原を用いるＨＡＩ）
【００５８】
【表５】
表４および表５において要約される結果は、ＵＶ処理が、ＨＡＩ力価の有意な差異を生じないことを示し、このことは、その製品の抗原性（従って、免疫原性）が、影響を受けないことを示す。
【００５９】
すべての二重不活化実験において、１サイクルのＵＶ処理の後でさえ、完全な安全性が実証され得る。実験室および最終規模における詳細な研究は、ホルマリン処理と組合わせた場合に、ＵＶ照射工程の有効性を実証した。ＵＶ処理の後の精製ウイルス抗原の免疫学的特徴づけは、非ＵＶ未処理製品で得られる結果に匹敵する結果を生じる。そのウイルス製品の生化学的特徴に対しても免疫原性に対しても、何の負の影響も検出され得ない。
【００６０】
（実施例６：ホルマリンおよび／またはＵＶでの不活化によるウイルス力価の低下）
有効濃度のホルマリンとフロースルー装置における有効濃度のＵＶ光とを組合わせたサンプル処理によるウイルス力価低下を、種々のウイルスを用いて試験する。ホルマリン不活化を、最終ホルマリン濃度０．０２５％（ｗ／ｖ）を用いて３２℃で２４時間実行した。フロースルー装置におけるＵＶ不活化を、流量２４０ｌ／時間にて３サイクル事項する。１サイクル当たりのサンプルとＵＶ光との接触時間は、１．４秒間である。
【００６１】
（表６）
（ホルマリンおよび／またはＵＶ不活化によるウイルス力価低下）
【００６２】
【表６】
この結果は、ホルマリンとＵＶとを合わせたウイルス処理によって、それぞれのウイルス力価の劇的な低下が得られることを示す。
【００６３】
（実施例７：ロス川ウイルス（ＲＲＶ）候補ワクチンのＵＶ不活化）
ロス川ウイルス（ＲＲＶ）は、流行性多発性関節炎（ＥＰＡ）として公知であるヒトの疾患を引き起こす、蚊媒介性アルファウイルスである。症状としては、関節炎（特に、膝ならびに手および脚の小関節における関節炎）が挙げられ、しばしば、発熱、発疹、および他の非特異的全身変化を伴う）が挙げられる。関節炎の症状は、一般的には、３０週間〜４０週間継続し、患者のうちの２５％は、発症１年後に残留する症状を依然として有する。これは、オーストラリア（毎年８０００件よりも多い症例がある）および太平洋領域全体にわって流行する。１９８９／８０年において、ロス川ウイルス感染の流行がまた、フィジー、サモア、クック諸島、およびニューカレドニアにおいて生じた。現在、何のワクチンも存在しない。
【００６４】
（（Ａ）無血清マイクロキャリアベースの１２００Ｌ Ｖｅｒｏ細胞発酵槽培養物のＲＲＶ接種、およびホルマリン不活化）
マイクロキャリアベースの無血清Ｖｅｒｏ細胞の１２００Ｌ発酵槽培養物に、ロス川産生ウイルスを接種した。その培養物を、３７℃にて３日間インキュベートした。サンプルを、力価決定用に毎日取り出した。３日目に、その細胞のうちの１００％がＣＰＲ（細胞障害効果）によって破壊された場合に、ウイルスを収集した。感染性ウイルス収集物からの細胞破片およびマイクロキャリアの分離と最初の力価決定工程（１．２μｍ／０．２μｍ）の後、ベンゾナーゼを、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）分解のために添加した。ホルマリン不活化を、０．１％（ｗ／ｖ）ホルマリン最終濃度を用いて８日間実行した。第二の濾過工程および第三の濾過工程を、それぞれ、２時間後および２４時間後に実行した。ベンゾナーゼを、残留核酸の除去のために、２４時間目に２回目に添加した。サンプルを、ウイルス力価決定（Ｖｅｒｏ細胞における組織培養感染量（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ）５０（ＴＣＩＤ５０/ｍｌ）のため、および表７に従
うＣ６−３６細胞およびＶｅｒｏ細胞における安全性試験のために、取り出した。
【００６５】
ＲＲＶを１２００Ｌ発酵槽に接種した１日後に、ｌｏｇＴＣＩＤ５０／ｍｌ＝５．８であるウイルス力価が、実証され得、これは、７．８（２日目）、８．１（収集前３日目）、および８．０（ウイルス収集後）に増加した。分離、第一濾過、およびベンゾナーゼ添加の後、ウイルス力価は、それぞれ、７．５、７．２、および７．４へと低下した。ホルマリン添加後、ウイルスペレットの遠心分離および再懸濁（表７、カラム：ＴＣＩＤ５０／ｍｌ ＴＬ１００）によって細胞傷害性ホルマリン懸濁物を除去した後に、力価を決定した。ホルマリンをウイルス収集物に添加した１５分間後に、力価は、１．６へと隙敵に添加した。ホルマリン不活化の１２時間後、もはやウイルス力価は実証され得なかった。
【００６６】
ホルマリン不活化開始の２４時間後に、サンプルを、Ｃ６−３６細胞およびＶｅｒｏ細胞における安全性試験に供した。不活化の２４時間後および２６時間後に、１つの陽性サンプル（ＣＰＥ）および４つの陰性サンプルが、Ｖｅｒｏ細胞において実証され得、４つの陽性サンプルおよび１つの陰性サンプルが、さらに感度が高いＣ６−３６細胞株を用いて得られた。２日目よりも後には、すべてのサンプルがＶｅｒｏ細胞において院生であった。このＣ６−３６細胞は、２日目および３日目に１つのサンプルでＣＰＥ、および４つの陰性サンプルをそれぞれ依然として示した。４日目および５日目に、すべてのサンプルは、Ｃ６−３６細胞において陰性であると試験されたが、６日目および７日目に、１つのサンプルが、再びＣＰＥを示した。８日目に、Ｖｅｒｏ細胞においてもＣ６−３６細胞においても、もはや陽性サンプルは示され得なかった。
【００６７】
【表７】
（（Ｂ）ＲＲＶ ＲＮＡを用いるトランスフェクション実験および感染実験）
上記の安全性試験の結果は、ゲノムＲＲＶ ＲＮＡが上記不活化手順の間に放出され得るという疑いを増加させた。これは、次に、それぞれの細胞中へのゲノムＲＲＶ ＲＮＡの組み込みをもたらし得る。ベンゾナーゼ処理は、ＲＮＡの完全な分解をもたらすはずであるが、リポソーム形成または他の機構（タンパク質破片によるゲノムＲＲＶ ＲＮＡのマスキングなど）が、インタクトなＲＮＡの逃避ストラテジーを説明し得る。
【００６８】
ＲＲＶゲノムＲＮＡを、勾配精製したビリオンから単離した。ＲＴ−ＰＣＲを介して、粒子等価物の数を決定し得た。第一の実験（表８、番号１）において、粒子等価物（ゲノムＲＮＡ）は、トランスフェクション培地（すなわち、トランスフェクション）および通常培地（すなわち、感染）の両方において１０倍段階で希釈した。両方の混合物を用いて、Ｃ６−３６細胞およびＶｅｒｏ細胞に接種した。培地交換の後、細胞培養物を、数時間インキュベートした。個々の上清のサンプルを、ウイルス力価決定およびＨＡ決定のために使用した。ゲノムＲＮＡを用いる感染実験を、数回実行した（表８、番号１〜５）。
【００６９】
上記トランスフェクション実験は、Ｃ６−３６細胞およびＶｅｒｏ細胞の両方において、ＴＣＩＤ５０を生じる。Ｖｅｒｏ細胞上清はまた、ＨＡ力価を示した。多数の粒子等価物（１０８）によるＶｅｒｏ細胞の感染は、ウイルス力価６．８ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを示し、ＨＡ力価１２８を有したが、Ｃ６−３６細胞には感染しなかった。ゲノムＲＲＶ ＲＮＡを用いる別の感染実験（番号４）は、Ｃ６−３６細胞およびＶｅｒｏ細胞の両方の感染（それぞれ、力価８．４ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌおよび６．６ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を生じた。感染試行２、３、および５は、Ｖｅｒｏ細胞において陽性の結果を生じなかった。感染事項番号３は、Ｃ６−３６細胞において、低い力価１．６ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを生じた。
【００７０】
純粋なゲノムＲＲＶ ＲＮＡを用いて細胞を感染させるすべての試行が陽性の結果を示したわけではないが、高濃度のゲノムＲＮＡが、細胞にランダムに感染可能であるようである。リポソームトランスフェクション試薬を使用したすべての実験が、陽性の結果を示した。従って、ＲＮＡのタンパク質マスキングまたはリポソーム形成機構が、表７におけるホルマリン不活化および遊離ＤＮＡ／ＲＮＡのベンゾナーゼ分解の後の陽性の安全性試験を説明する。
【００７１】
【表８】
（（Ｃ）感染性ＲＲＶのＵＶ不活化）
上記の考慮事項について、小規模実験を実行して、ＵＶ照射によりＲＲＶを不活化した。ＲＲＶ ＰＶ上清を、２つのＵＶ強度（２．１ｍＷ／ｃｍ２（サンプル１〜１０）および３．３ｍＷ／ｃｍ２（サンプル１１〜２０））を用いて、種々の時間の間ＵＶ照射した。その後、これらのサンプルをウイルス力価決定に供し、抗原力価（ＥＩＡ）および赤血球凝集素力価を決定した。３分間よりも長く照射したサンプル（番号６〜１０および１４〜１９）もまた、Ｃ６−３６細胞において安全性試験に供した（表９）。
【００７２】
ウイルス力価は、両方のＵＶ強度を用いた１０分間のＵＶ照射の後に、７．４ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（コントロール、サンプル番号１）から１．５ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌへと低下した。赤血球凝集反応は、ＵＶ強度２．１ｍＷ／ｃｍ２にて１５分間の間安定なままでありＨＡ力価が９であったが、ＵＶ強度３．３ｍＷ／ｃｍ２では８まで低下した。抗原力価（ＥＩＡ）はまた、１５分間の照射の間、６４０〜１２８０の範囲内で安定なままであった。安全性試験は、ＵＶ強度２．１ｍＷ／ｃｍ２にて３分間および５分間照射したサンプル（サンプル番号６および７）を用いて実行したところ、依然として、細胞培養物においてＣＰＥを示し、それぞれ、ウイルス力価８．２ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌおよび８．６ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを生じた。安全性試験は、ＵＶ強度３．３ｍＷ／ｃｍ２にて２分間、３分間、および５分間照射したサンプル（サンプル番号１４〜１６）を用いて実行したところ、依然として、細胞培養物においてＣＰＥを示し、それぞれ、ウイルス力価８．２ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、８．６ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、および８．７ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを生じた。１０分間の照射の後、すべての安全性試験は陰性であった。
【００７３】
２．１ｍＷ／ｃｍ２および３．３ｍＷ／ｃｍ２の両方の強度で１０分間よりも長くＵＶ照射すると、ＲＲＶ調製物を完全に不活化した。ＨＡ試験およびＥＩＡ試験において示されるように、抗原性は、両方の照射強度で１５分間の間で損なわれないままであった。３０分間後、抗原性は影響を受けた。
【００７４】
【表９】
（（Ｄ）ホルマリンで不活化した１２００Ｌ発酵槽収集物のＵＶ不活化）
ホルマリンで処理した１２００Ｌ発酵槽のウイルス収集物のアリコートを、流量３００ｌ／時間で３サイクル、１５０ｌ／時間で３サイクル、７５ｌ／時間で３サイクルにてＵＶ照射した。ホルマリンで処理した１２００Ｌ発酵槽のウイルス収集物の第二アリコートを、流量３００ｌ／時間にて１０サイクルでＵＶ照射したが、今度は、ダイアフィルトレーションの後に、高濃度の残留する小タンパク質を除去した。ＨＡ力価、抗原−ＥＩＡ力価、ウイルス力価、および安全性（ＣＰＥ）を、各試行の後に決定した（表１０）。
【００７５】
第一の実験（ダイアフィルトレーションなし）におけるウイルス力価は、流速１５０ｌ／時間にて１サイクルのＵＶ照射の後に、６．１３ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌから検出限界未満までに低下した。安全性試験もまた、ＣＰＥを示さなかった。しかし、流量１５０ｌ／時間にて３サイクルのＵＶ照射の後、細胞培養物における安全性試験は、陽性の結果を示し、そしてまた、ウイルス力価決定においても陽性であった（６．７ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）。流量７５ｌ／時間にて３サイクルのＵＶ照射は、ウイルス力価決定および安全性試験の両方において陰性のままであった。第二実験において、安全性試験およびウイルス力価決定は、５回以上の照射サイクルの後で陰性のままであった。第一の実験において、すべての照射線量は、ＨＡ力価およびＥＩＡ力価に影響を与えず、それぞれ、１１および１：３２０であった。第二の実験において、すべてのＨＡ力価およびＥＩＡ力価は、それぞれ、１０および１：３２０であり、例外として、６回の照射サイクルが、ＥＩＡ力価１：６４０を生じた。
【００７６】
ホルマリンと、流量３００ｌ／時間にて５サイクル以上のＵＶ照射とで、ＲＲＶの発酵槽収集物を二重不活化することが、抗原性を損なうことなく感染性を完全に破壊するためには十分である。
【００７７】
【表１０】
【００７８】
（（Ｅ）二重不活化したＲＲＶ候補ワクチン調製物の効力）
（免疫したマウスにおける有効用量（ＥＤ５０）、防御用量（ＰＤ５０）、およびＥＬＩＳＡ力価）
ホルマリンで不活化したＲＲＶ候補ワクチンおよび二重不活化（ホルマリン＋ＵＶ照射）したＲＲＶ候補ワクチンを、１０μｇ／用量に調整し、その後、４倍段階で希釈した。各希釈物を、１０匹のマウスからなる群に注射した。３週間後に、そのマウスに、対応する量の上記ワクチンをブースター投与した。血液サンプルを、３週間後、ブースター前、６週間目、ブースターの３週間後に取り出した。その血清を、ＲＲＶ抗体ＥＬＩＳＡによって分析した。有効用量５０（ＥＤ５０）（これは、免疫したマウスのうちの５０％におけるセロコンバーションを誘導するために十分である抗原用量である）を、その後算出した。
【００７９】
３週間目に、ブースターの前に、ホルマリンで不活化した群のＥＤ５０は、６３５ｎｇであった。ホルマリン・ＵＶ二重不活化した群のＥＤ５０は、２０２ｎｇであった。ブースターの後に、そのＥＤ５０値は、それぞれ、３３ｎｇおよび１０ｎｇであった。しかし、ＥＬＩＳＡ力価の分析は、二重不活化した群が、さらに高い抗体力価を有した（例えば、３週間目に、ＥＬＩＳＡ力価１０００であるマウスが二重不活化群において１６匹であったのに対してホルマリン群では９匹であり、ＥＬＩＳＡ力価１０，０００であるマウスが二重不活化群において４匹であるのに対してホルマリン群ではなかった）ことを、実証した。ブースターの後もまた、二重不活化群の力価は、より高かった（ＥＬＩＳＡ力価１００，０００であるマウスが二重不活化群において１１匹であったのに対してホルマリン群では８匹であり、ＥＬＩＳＡ力価が１，０００，０００であるマウスが二重不活化群においてはさらに４匹いた（表１１））。
【００８０】
６週間目（ブースターの３週間後）に、マウスに、１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（組織培養感染用量５０）のロス川ウイルス（Ｔ４８株）を静脈内感染させた。感染後１日目、２日目、３日目、および４日目に、血液サンプルを採取し、その血清のＴＣＩＤ５０をその後決定した。防御用量５０（ＰＤ５０）（これは、感染したマウスのうちの５０％がウイルス血症を示されない抗原用量である）を算出した。ＰＤ５０＝７８ｎｇが、両方の抗原調製物（ホルマリン不活化抗原、および二重不活化（ホルマリン＋ＵＶ照射）抗原）について同じであった。
【００８１】
（表１１）
（免疫したマウスにおける有効用量（ＥＤ５０）、防御用量（ＰＤ５０）、およびＥＬＩＳＡ力価）
【００８２】
【表１１】
ホルマリン処理単独の後に非常に感受性であるＣ６−３６細胞株において主に見出される残留感染性は、ほぼおそらくは、感染性ＲＲＶ ＲＮＡによって引き起こされる。第二のさらなるウイルス不活化工程（ＵＶ照射）（これは、ホルマリン処理後のウイルスゲノムに影響を及ぼす）は、マウスモデルにおいて免疫原性および効力に影響を及ぼすことなく、完全に不活化されかつ安全なＲＲＶ候補ワクチン調製物を生じた。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ウイルス含有サンプルを有効濃度のホルマリンで処理することによって、およびそのサンプルをフロースルー装置中で有効照射量のＵＶ光で処理することによって、ウイルスを不活化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
医学的製品中の病原体の有効な不活化は、公共に健康に関する問題である。なぜなら、以前には未知であった疾患が、治療の投与を介して急速に伝播し得ることが発見されたからである。従って、バイオテクノロジー製品が、それを使用することによって病原因子を伝達するリスクを低下することを意図する、ますます厳しくなる基準の下で出現している。潜在的な混入物質が、血液製品の製造における問題であるのみならず、安全なワクチンの製造における問題でもある。
【０００３】
病原体に対するワクチン（特に、ウイルスワクチン）の製造における最も重要な工程のうちの１つは、ウイルス不活化である。ウイルス不活化の場合、ホルマリンが、ワクチン製造において最も頻繁に使用される不活化剤である。このホルマリン不活化工程は、確立された分析手順を用いて確認されている。しかし、非常に厳密な品質管理試験（例えば、哺乳動物細胞培養試験（例えば、ＶＥＲＯ安全性試験））の導入は、いくつかの場合において、残留感染性の証拠を示した。この残留感染性を除去するための努力において、凝集物および／または濾過の機械的破壊が、成功しないことがわかった。
【０００４】
ホルマリン処理に対する代替法として、ＵＶ不活化が、上記製造プロセス中に組み込むために考えられた。ヒトワクチンのＵＶ照射不活化の使用が、以前に実証されている。非特許文献１および非特許文献２は、ヒトにおける研究からの免疫原性の結果に関して報告しており、この研究において、その著者らは、ＵＶ不活化したポリオワクチンを使用した。ポリオウイルスは、非エンベロープピコルナウイルスであり、１つのセグメント中に＋鎖の一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。このウイルスゲノムは、ウイルス表面抗原よりもＵＶ損傷に対して感受性が高いので、ポリオウイルスキャプシドタンパク質の場合、ＵＶ不活化は、製品の生化学的特徴にも免疫原性にも、ほとんど負の影響を有さないことが示された。ＵＶ不活化のための標的は、ホルマリンにより標的とされるタンパク質とは対照的に、主に核酸である。ホルマリンとＵＶ不活化とを組合わせることによって、科学者達は、特に活発なポリオウイルスを不活化する場合に、単独のＵＶ不活化またはホルマリン不活化それぞれの限界を克服しようとした。例えば、非特許文献３を参照のこと。
【０００５】
ＵＶ照射技術は、食物、薬剤、化粧品、および飲料の産業、ならびに飲料水において広範な適用範囲を有する。ＵＶ殺菌は、物理化学的プロセスであり、このプロセスにおいて、プリン塩基およびピリミジン塩基の環状分子の共有結合が、ＵＶ波長照射の励起エネルギーによって破壊され、核酸とその核酸がコードする遺伝情報とを損傷させる。有効なＵＶＣ（１００ｎｍ〜２８０ｎｍ）に対して曝露された微生物（例えば、細菌および酵母など、ならびにウイルス）は、数秒以内に不活化される。結果として、成功する殺菌は、低下等価（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ−ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）照射線量に依存する。平均殺菌照射線量（Ｊ／ｍ２で表わす）が、バイオ線量計を使用して照射ゾーンにおいて測定される。しかし、ＵＶ不活化単独では、安全かつ有効なワクチンを生成するためには適切ではない。
【０００６】
非特許文献４は、ホルマリンと紫外線との組み合わせを用いるポリオウイルスの不活化を記載する。非特許文献５は、紫外線−ホルマリンで不活化したポリオワクチンでワクチン接種された被験体の血液における、測定可能なレベルの循環抗体の形成を記載する。非特許文献６は、ホルマリン、ＵＶ光、およびβ−プロピオラクトンからなる３段階不活化プロセスによる、ハムスターにおけるアデノウイルスおよびシミアンウイルス４０の腫瘍原性の不活化に関して報告する。非特許文献７は、紫外線とホルマリンとでの処理による、センダイウイルスの免疫原の調製を記載する。上記の構想のうちのいずれも、ワクチン製造における一般的使用のためにこれまで採用されていないが、産業規模で安全かつ有効なワクチンの製造について、絶えず存在する必要性があった。さらに、引用した研究のいずれも、本研究において使用されるＶＥＲＯ安全性試験と同程度に感度が高い、「不活化ウイルス」の残留感染性を決定するための安全性試験を使用していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｉｌｚｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂ．Ｈｅａｌｔｈ（１９５４）４４：２６〜３３
【非特許文献２】Ｗｏｌｆら、ＪＡＭＡ（１９５６）１６１：７７５〜８１
【非特許文献３】ＭｃＬｅａｎら、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．（１９５８），ｖｏｌ １，ｐｐ．１２２〜１６４
【非特許文献４】Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９５７）７９：２６５〜７５
【非特許文献５】Ｍｏｌｎｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂ．Ｈｅａｌｔｈ（１９５８）４８：５９０〜８
【非特許文献６】Ｔｒｕｆｆｅｌｌｉら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９６７）１５：５１６〜２７
【非特許文献７】Ｍｉｙａｍａｅ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８６）３０：２１３〜２３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、ホルマリン不活化工程とＵＶ不活化工程との組み合わせが、産業規模でのワクチン調製のために不活化ウイルスの製造のための高体積スループット系においてバルクウイルス中のウイルスを完全に不活化するために利用され得る。このことはまた、実施例において使用されるような高力価濃縮ウイルス調製物に関して示されており、実施例において、残留ウイルス活性が、非常に感度の高いＶＥＲＯ細胞培養物試験を使用して検出されなかった。本発明者らはまた、驚くべきことには、この方法は、非エンベロープウイルス（例えば、ポリオピコルナウイルス）と比較して、エンベロープウイルス（例えば、オルトミクソウイルス）について特によく機能することを実証した。この発見は、新生の急速に変化するウイルス疾患（例えば、大流行間性（ｉｎｔｅｒｐａｎｄｅｍｉｃ）インフルエンザ株および汎発性（ｐａｎｄｅｍｉｃ）インフルエンザ株）のための、安全な非常に免疫原性のワクチンの迅速な製造のための重要な暗示を有する。
【０００９】
（発明の要旨）
サンプル中に含まれるワクチンの非常に効率的かつ安全な不活化を可能にし、同時に、その不活化ワクチンの高い抗原性および免疫原性を保持する方法を提供することが、本発明の目的である。具体的には、本発明の方法は、高体積スループット系において、ホルマリン不活化工程をＵＶ不活化工程と合わせて利用して、ワクチン製造において使用するための高抗原含量の安全なバルクウイルス調製物を製造する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
サンプル中に含まれるウイルスを不活化するための方法であって、該方法は、
（ｉ）該サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程；および
（ｉｉ）該サンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程；
を包含し、工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の前に実施されるかまたはその逆であり、該装置を通る該サンプルの流量は、約５０Ｌ／時間〜約１０００Ｌ／時間である、方法。
（項目２）
サンプル中に含まれるエンベロープウイルスを不活化するための方法であって、該方法は、
（ｉ）該サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程；および
（ｉｉ）該サンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程；
を包含し、工程（ｉ）は工程（ｉｉ）の前に実施されるかまたはその逆であり、該エンベロープウイルスは、完全に不活化される、方法。
（項目３）
サンプル中に含まれるエンベロープＲＮＡウイルスを不活化するための方法であって、該方法は、
（ｉ）該サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程；および
（ｉｉ）該サンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程；
を包含し、工程（ｉ）は工程（ｉｉ）の前に実施されるかまたはその逆であり、該エンベロープウイルスは、完全に不活化される、方法。
（項目４）
サンプル中に含まれるウイルスを不活化するための方法であって、該方法は、
（ｉ）該サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程；および
（ｉｉ）該サンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程であって、該装置は、該装置中にＵＶランプと該ＵＶランプの直径に対して実質的に垂直な薄層チャンバとを備える、工程；
を包含し、工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の前に実施されるかまたはその逆であり、該サンプルは、工程（ｉｉ）において該装置の薄層チャンバを通される、方法。
（項目５）
項目１〜項目４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプル中の前記ウイルスの不活化に起因するウイルス力価の低下は、少なくとも約１×１０５または少なくとも約１×１０７または少なくとも約１×１０１０または少なくとも約１×１０１４である、方法。
（項目６）
項目１〜項目５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程は、約１２時間〜約９６時間かけて実行される、方法。
（項目７）
項目１〜項目６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ホルマリンの有効濃度は、約０．０１％〜約０．１％である、方法。
方法。
（項目８）
項目１〜項目７のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ＵＶ光は、約１００ｎｍ〜約２８０ｎｍの波長を有するＵＶＣである、方法。
（項目９）
項目１〜項目８のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ＵＶ光の線量は、約５ｍＪ／ｃｍ２〜約２００ｍＪ／ｃｍ２である、方法。
（項目１０）
項目１〜項目９のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルと前記ＵＶ光との接触時間は、約１秒間〜約２０秒間である、方法。
（項目１１）
項目１〜項目１０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記フロースルー装置における流量は、約５０Ｌ／時間〜約１００Ｌ／時間である、方法。
（項目１２）
項目１〜項目１１のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記フロースルー装置は、薄層チャンバを備える、方法。
（項目１３）
項目１〜項目１２のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記薄層チャンバを通る前記サンプルのフローは、濁っている、方法。
（項目１４）
項目１２または項目１３に記載の方法であって、前記薄層チャンバの薄層は、約１ｍｍの厚さを有する、方法。
（項目１５）
項目１〜項目１４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程は、約２回〜約１０回反復される、方法。
（項目１６）
項目１〜項目１５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルは、生物学的製品、医学的製品、または薬学的製品を調製するための細胞培養プロセスに由来する、生物学的流体または溶液からなる群より選択される、方法。
（項目１７）
項目１〜項目１６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、該方法は、
前記サンプルを精製工程に供して該サンプル中の残留ホルマリンを除去する工程；
をさらに包含する、方法。
（項目１８）
項目１〜項目１７のうちのいずれか１項に記載の方法であって、該方法は、
前記サンプル中の不活化ウイルスを薬学的純度まで精製する工程；および
該精製された不活化ウイルスを、ワクチンとして使用するための薬学的組成物へと処方する工程；
をさらに包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明のＵＶ不活化工程のために使用され得るＵＶ薄層チャンバを示す。
【図２】図２は、ＵＶセンサーを備えたＵＶ不活化システムを示す。上記のＵＶセンサーおよびフローメーターは、必要に応じた特徴である。本願のさらなる実施形態において、上記ポンプおよび／またはフローメーターは、出口チューブに備えられ得る。
【図３】図３は、フロースルー装置における有効線量にサンプルを反復して供するために、互いに接続されたいくつかのＵＶ薄層チャンバ（ＵＶリアクター）を使用するＵＶ不活化システムを示す。ＵＶ薄層チャンバの数は、約２個〜約１０個の間で変化し得る。上記ＵＶセンサーおよびフローメーターは、必要に応じた特徴である。本願のさらなる実施形態において、上記ポンプおよび／またはフローメーターは、出口チューブに設置され得る。連続的に接続された不活化チャンバを備える連続ＵＶ生成器が、大規模製造プロセスにおいて使用され得、それによって、サンプルのハイスループットが可能になる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明の一局面に従って、上記目的は、サンプル中に含まれるウイルスを不活化するための方法を提供することによって解決される。この方法は、
（ｉ）上記サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程；および
（ｉｉ）上記サンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程；
を包含し、工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の前に実施されるかまたはその逆である。好ましくは、上記装置を通る上記サンプルの流量は、約５０Ｌ／時間〜約１０００Ｌ／時間である。
【００１２】
不活化するための方法の別の好ましい局面において、不活化されるべきウイルスは、それぞれ、エンベロープウイルスまたはエンベロープＲＮＡであり、上記エンベロープウイルスまたはエンベロープＲＮＡウイルスは、それぞれ、完全に不活化される。
【００１３】
別の局面に従って、サンプル中に含まれるウイルスを不活化するための方法が提供される。この方法は、
（ｉ）上記サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程；および
（ｉｉ）上記サンプルをフロースルー装置中で有効線量のＵＶ光に供す工程；
を包含し、上記装置は、上記装置中にＵＶランプと上記ＵＶランプの直径に対して実質的に垂直な薄層チャンバとを備え、工程（ｉ）は工程（ｉｉ）の前に実施されるかまたはその逆であり、上記サンプルは、工程（ｉｉ）において上記装置の薄層チャンバを通される。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態において、上記サンプルは、有効濃度のホルマリンで処理された後に、フロースルー装置中で有効線量のＵＶ光で処理される。本発明者らは、いかなる理論によっても拘束されないが、ビリオンの表面分子上でのホルマリンの架橋効果が、ＵＶ不活化フロースルー装置の高体積流体力学の厳密さ（ｒｉｇｏｒ）のためにウイルスを安定化すると、考えられる。
【００１５】
本発明に従う不活化する方法は、実施例２および実施例４（Ａ）において実証されるように、有効かつ安全である。さらに、不活化する方法は、実施例４（Ｂ）において示されるように防御免疫応答を惹起する、高い抗原性および免疫原性を有するワクチンの製造を可能にする。
【００１６】
用語「サンプル」とは、本明細書中で使用される場合、病原体もしくはその一部を含有する任意のサンプル（例えば、（生物学的製品、医学的製品、または薬学的製品（例えば、血液製品もしくはワクチン）を調製するための細胞培養プロセスに由来する任意の流体（例えば、生物学的流体もしくは溶液））を包含する。そのサンプルは、生物学的流体（例えば、血液または血漿）を含むサンプルであり得る。そのサンプルはまた、細胞培養物の収集された成分（例えば、その培養物の細胞もしくは培養培地画分）を含む流体であり得る。好ましい実施形態において、そのサンプルは、例えば、ワクチンの製造における治療剤の製造において使用される流体であり、その不活化ワクチンまたはその部分が、治療剤である。特に好ましい実施形態において、細胞成分は、例えば、濾過または遠心分離によって、不活化方法の前の上記サンプルから分離される。
【００１７】
本出願の好ましい実施形態において、上記ウイルスは、細胞培養物の収集物（その上清および細胞からなる）から生成され、これは、医療製品（例えば、ワクチン）の調製のためにさらに使用される。本発明のさらなる実施形態において、上記細胞培養物の細胞は、病原体に感染している。上記細胞は、上記ウイルスを生成するために適切な一次細胞または任意の培養細胞であり得る。使用され得る細胞の例としては、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＥＬＡ細胞）、鳥類細胞（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞、または鳥類由来の連続細胞株）、および昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）が挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、ウイルスバルクの細胞培養生成に由来する細胞および細胞破片は、化学的（ホルマリン）不活化工程および／またはＵＶ照射不活化工程の前に、そのウイルスバルクから分離される。
【００１８】
本発明において、不活化されるべきウイルスは、エンベロープまたは非エンベロープのＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルスであり、一本鎖ゲノムもしくは二本鎖（ＤＮＡ）ゲノムを有し、センスもしくはアンチセンスであり、連続的であるかもしくは分節している（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）。上記ウイルスは、バキュロウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、パルボウイルス、ヘパドナウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、アストロウイルス、ピコルナウイルス、レトロウイルス、オルトミクソウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、およびブンヤウイルスからなる群より選択され得る。本発明の好ましい実施形態において、上記ウイルスは、エンベロープウイルス（フラビウイルス、トガウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ラブドウイルス、ブンヤウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、アレナウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルスが挙げられる）の群から選択される。実施例および実施例７において示されるように、本発明の不活化方法は、非エンベロープポリオおよび非エンベロープアデノウイルスと比較して、エンベロープウイルス（例えば、インフルエンザウイルスおよびロス川ウイルス）に対して特に有効である。本発明の他の好ましい実施形態において、上記ウイルスは、エンベロープＲＮＡウイルス（フラビウイルス、トガウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ラブドウイルス、ブンヤウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、およびアレナウイルスが挙げられる）の群から選択される。特に好ましい一実施形態において、上記ウイルスは、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス株）から選択される。インフルエンザウイルス株は、赤血球凝集素タンパク質およびノイラミニダーゼ表面タンパク質の種々の組み合わせを有し得る。別の特に好ましい実施形態において、上記ウイルスは、トガウイルス（例えば、アルファウイルス（例えば、ロス川ウイルス（ＲＲＶ）））から選択される。バルクウイルス溶液として使用するための別の好ましいウイルス群は、コロナウイルス（重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）に関連するウイルスが挙げられる）である。別の好ましいウイルス群は、フラビウイルス（日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、および出血熱ウイルスが挙げられる）およびトリポックスウイルスである。
【００１９】
不活化ウイルス病原体の部分もまた、本発明によって包含される。本発明の好ましい実施形態において、上記部分は、免疫原においてエピトープとして役立ち得る。このエピトープは、上記病原体に対する免疫応答を惹起するために使用され得る。本願の好ましい実施形態において、病原体の部分は、上記病原体に対するワクチンとして使用される。特に好ましい実施形態において、上記病原体の部分は、分割されたビリオン（ｓｐｌｉｔ ｖｉｒｉｏｎ）であり、これは、分割される前または分割された後に、不活化され得る。
【００２０】
本発明の意味においては、本発明に従う不活化する方法は、その方法を使用して生成された不活化されたウイルスが哺乳動物細胞培養試験（例えば、実施例２において詳述される安全性試験）を合格した場合に、安全である、または完全に不活化されている、と考えられる。示されるように、これらの試験は、使用される他の試験（例えば、卵試験）よりも感度が高い。その安全性試験の好ましい合格／不合格の基準は、実施例１および実施例２において詳述される。
【００２１】
本願の好ましい実施形態において、上記サンプルにおけるウイルスの不活化に起因するウイルス力価の低下は、少なくとも約１×１０５、より好ましい実施形態において少なくとも１×１０７、より好ましい実施形態において少なくとも約１×１０１０、最も好ましい実施形態約１×１０１４である。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、上記サンプルは、有効濃度のホルマリンで約１２時間〜約９６時間処理される。より好ましい実施形態において、上記サンプルは、有効濃度のホルマリンで約２４時間〜約４８時間、より好ましくは約２４時間〜約３０時間、処理される。
【００２３】
本発明の特に好ましい実施形態において、上記サンプルは、有効濃度のホルマリンで２４時間〜約２４．５時間される。
【００２４】
さらなる実施形態において、上記サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程は、約１０℃〜約４０℃にて実行される。本出願の特に好ましい実施形態において、上記サンプルを有効濃度のホルマリンで処理する工程は、約３２℃で実行される。
【００２５】
本発明の特に好ましい実施形態は、有効濃度のホルマリンによる上記サンプルの処理を包含し、そのホルマリンの有効濃度は、好ましくは約０．０１％（ｗ／ｗ）〜約１％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．０１％〜約０．１％、より好ましくは約０．０２５％（これは、この有効濃度を調節するために３７％ホルマリン溶液を使用する場合、約９２ｍｇ／ｌホルマリンに対応する）〜約０．１％（これは、この有効濃度を調節するために３７％ホルマリン溶液を使用する場合、それぞれ、約３６８ｍｇ／ｌホルマリンに対応する）の範囲である。
【００２６】
本出願において、用語「ＵＶ光」とは、１００ｎｍ〜４００ｎｍの波長を有する紫外線を意味する。上記ＵＶ光は、ＵＶＣ（１００ｎｍ〜２８０ｎｍ）、ＵＶＢ（２８０ｎｍ〜３２０ｎｍ）、およびＵＶＡ（３２０ｎｍ〜４００ｎｍ）からなる群より選択され得る。光感作剤（ＤＮＡ中にインターカレートしかつＵＶ光によって不活化されるもの（例えば、ソラレン）など）が、ＵＶ照射の不活化効果を増強するために使用され得る。本発明の好ましい実施形態において、上記ＵＶ光は、約１００ｎｍ〜〜約２８０ｎｍの波長を有するＵＶＣである。本発明のより好ましい実施形態において、上記ＵＶ光は、約２４０ｎｍ〜〜約２９０ｎｍの波長を有する。本発明の特に好ましい実施形態において、上記ＵＶ光のうちの約８５％以上は、約２５４ｎｍの波長を有する。
【００２７】
ＵＶ光放射は、連続形態のＵＶ光放射（例えば水銀ランプ技術）であっても、パルス型ＵＶ光（単色レーザー技術）であってもよい。望ましいＵＶ強度は、２つ以上のランプを組合わせることによって、生成され得る。好ましい実施形態において、上記光は、約１１０Ｗのランプによって連続的に放射される。実施例において示される好ましい実施形態において、上記ＵＶランプは、実施例において使用されるランプ（９５０ｎｍ）と同様に、少なくとも１ｍの長さを有する。
【００２８】
本発明の主題は、有効線量のＵＶ光（すなわち、上記のようなホルマリン処理と組み合わせた場合に所定のウイルスを安全に不活化する、任意の線量のＵＶ光）を包含する。その有効線量は、当該分野で一般的に公知である種々の要因（例えば、ＵＶ不活化の物理的パラメーター（例えば、ランプおよびチャンバの大きさおよび直径；ウイルス含有培地とＵＶ光源との間の距離；チャンバ材料の光吸収特性および光反射特性））に依存し得る。同じ理由によって、ＵＶ光の波長および強度、ならびにウイルスがＵＶ光に曝露される接触時間もまた、上記有効線量のために重要である。さらに、有効線量はまた、ウイルス自体、ウイルスを含む培地、およびそれらの光吸収特性によって影響を受ける。好ましくは、上記有効線量は、サンプル中に含まれるウイルスのうちの少なくとも９９．９９％を死滅させるために十分であり、より好ましくは、活性なウイルスが哺乳動物細胞培養試験（好ましくは実施例２に従う試験）において検出されないレベルまで上記ウイルスを不活化する（すなわち、完全に不活化する）ために、十分である。好ましい実施形態において、ＵＶＣ光を使用して、上記ウイルスを含むサンプルが、約５ｍＪ／ｃｍ２〜約２００ｍＪ／ｃｍ２の範囲の有効線量に曝露される。好ましい実施形態において、上記有効線量は、約２０ｍＪ／ｃｍ２〜約１００ｍＪ／ｃｍ２の範囲にある。他の好ましい実施形態において、上記有効線量は、約４０ｍＪ／ｃｍ２〜約９０ｍＪ／ｃｍ２の範囲にある。比較として、飲料水中に存在する病原体のうちの９９．９９％を死滅させるための有効線量は、約＞４０ｍＪ／ｃｍ２である。好ましい実施形態において、上記有効線量は、初期ウイルス力価を１×１０５低下させる。バルクワクチン不活化において、上記有効線量は、初期化学的（ホルマリン）不活化工程の後に存在し得るあらゆる残留ウイルスを除去するために十分であるべきである。実施例において示されるように、これは、非常に感度の高い哺乳動物細胞培養感染試験（例えば、記載されるＶｅｒｏ細胞培養試験）によって決定され得る。
【００２９】
本発明（特に、ＵＶ光チャンバ）のさらなる好ましい実施形態が、実施例に提供される。
【００３０】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、上記サンプルとＵＶ光との接触時間は、約１秒間〜約２０秒間、好ましくは約１．４秒間〜約１４秒間の範囲にある。上記接触時間は、上記光源に対する接線に沿って約１ｍｍ厚であるサンプルおよび上記ＵＶランプのワット量約１１０Ｗに基づいて好ましくは計算される。当業者は、サンプルの奥行きが厚く光源のエネルギー（ワット量）が少ない程、上記曝露時間が増大し、その逆もまた真であることを、認識する。本出願のより好ましい実施形態において、上記サンプルとＵＶ光との接触時間は、約１．４秒間〜約７秒間である。本願の特に好ましい実施形態において、上記サンプルと上記ＵＶ光との接触時間は、約２．８秒間〜約４．２秒間である。
【００３１】
所定のＵＶ光線量を使用する本発明に従う所定の設定が本発明に従って病原体を有効に不活化するか否かを試験するために、その不活化されたウイルスを、残留ウイルス活性について試験すべきである。これは、哺乳動物細胞培養試験（例えば、Ｖｅｒｏ安全性試験）を使用することによって、好ましくは実施例１および実施例２に詳述される基準を適用して、達成され得る。
【００３２】
本発明に従って、有効線量のＵＶ光による上記サンプルの処理は、好ましくは表１および図１において特定されるように、フロースルー装置において実行される。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、上記フロースルー装置は、薄層チャンバを含む。そのチャンバの最小厚は、妥当な迅速な処理を可能にしかつ完全不活化ウイルスワクチンのためにウイルス破壊を防止するために、上記バルクウイルス溶液の十分なフローを可能にすべきである。また、上記バルクウイルス溶液によるＵＶ照射の吸収と、上記溶液中のすべてのウイルスの十分な照射を確実にする必要性とに起因して、その最大の厚みは、すべてのビリオンが十分に照射されることなく上記装置を通過することを許容すべきではない。従って、上記薄層は、約１ｃｍ厚よりも厚いものであるべきではない。上記薄層は、好ましくは０．５ｍｍ厚〜約３ｍｍ厚であり、より好ましくは約１ｍｍであり、その結果、上記ＵＶランプと不活化されるべき病原体との間の最大距離は、約１ｍｍ未満である。あるいは、上記サンプルは、上記ランプの長さに対して平行に上記ランプウを通され得、その結果、上記サンプルは、上記サンプルチャンバの内径ではなく外径から照射される。同様に、ランプ（またはランプの円）中のサンプルチャンバ内のランプは、内径および外径の両方から上記サンプルチャンバを照射する構成として、使用され得る。さらに、上記チャンバは、好ましくは、上記チャンバを通るサンプルのフローが厳密には層流ではなく乱流であるように、設計される。このことは、上記ウイルスをサンプル培地と混合することを補助し、ＵＶ照射に対する均一な曝露を確実にする。
【００３４】
本出願の別の好ましい実施形態において、上記フロースルー装置は、ＵＶ不活化チャンバを含み、ＵＶランプは、直径約３０ｍｍを有し、上記サンプルが流れるＵＶランプを取り囲むチャンバは、約３２ｍｍの直径を有する。本願の好ましい実施形態において、上記チャンバは、総体積約９２ｍｌを有する。
【００３５】
照射されるべきサンプルは、上記装置を通され得る。好ましい実施形態において、上記サンプルは、上記ＵＶ照射チャンバを通りながら冷却される。本発明のさらなる好ましい実施形態において、上記ＵＶチャンバを通るサンプルは、約２℃〜約３２℃、より好ましくは約２℃〜約８℃の温度を有する。
【００３６】
好ましくは、上記フロースルー装置中のサンプルの流量は、約５０Ｌ／時間〜約１０００Ｌ／時間、より好ましくは約２３０Ｌ／時間〜約４８０Ｌ／時間の範囲にある。特に好ましい実施形態において、上記フロー装置中のサンプルの流量は、約２３０Ｌ／時間〜約２５０Ｌ／時間の範囲にあり、より好ましくは約２４０Ｌ／時間である。実施例において例証されるこれらの好ましい流量は、上記バルクウイルス溶液の経済的大規模ＵＶ処理を可能にする。
【００３７】
好ましい実施形態において、上記接触時間は、上記サンプルがＵＶ照射に曝露されるサンプルチャンバの長さ、およびそのチャンバを通る上記サンプルの流量に依存する。従って、上記フロースルー装置において配置されたＵＶランプの数を増加することによって簡単に調整され得る有効線量は、ＵＶ照射に対して曝露されるサンプルチャンバの有効長さを増加する。あるいは、同じ数の、より長いランプ−チャンバを使用すると、上記有効線量を増加し、同様に、より多くの数の、より短いランプ−チャンバを使用すると、同じ有効線量と等価であり得る。
【００３８】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、上記サンプルをフロースルー装置において有効線量のＵＶ光に供する工程は、周期的様式または連続的様式で反復される。この工程は、約２回〜約１０回反復され得る。本願の好ましい実施形態において、上記サンプルをフロースルー装置において有効線量のＵＶ光に供する工程は、約２回〜約５回反復され、本願のより好ましい実施形態において、この工程は、約２回〜約３回反復される。複数のランプチャンバを連続して使用することまたは同じランプを通す再循環フローを使用することに対するさらなる利点は、上記サンプルが、チャンバ間またはサイクル間で、より徹底的に混合され得て、ＵＶ照射に対する上記ウイルスの均一な曝露を確実にし得ることである。
【００３９】
上記サンプル中のウイルスが不活化された後に、不活化されたウイルスは、種々の適用（ワクチンおよび他の薬学的組成物が挙げられる）における使用のために精製され得る。本発明の別の好ましい実施形態によると、不活化する方法は、上記サンプル中の不活化ウイルスを薬学純度に精製し、精製されたウイルスを、ワクチンとして使用するための薬学的組成物へと処方する工程をさらに包含する。精製は、当該分野において公知の手段（濾過、またはダイアフィルトレーション、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィーなど）、または遠心分離が挙げられるが、これらに限定はされない）によって達成され得る。あるいは、上記ウイルスは、本発明の方法による不活化の前に、精製され得る。
【００４０】
本発明の別の好ましい実施形態によると、不活化する方法は、精製工程をさらに包含する。すなわち、上記サンプルは、そのサンプル中の残留ホルマリンを除去するための精製工程に供される。そのような精製は、薬学的に受容可能なレベルよりも高いホルマリンレベルが残る場合に、有用である。不活化されたウイルスは、必要に応じた精製工程の後に、薬学的組成物へと処方され得る。処方物は、必要に応じて、キャリア（例えば、生理食塩水もしくは緩衝液）、賦形剤、安定剤（例えば、アルブミン、糖、および／もしくはアミノ酸）、塩および／またはアジュバント（例えば、ミョウバン）を含み得る。あるいは、不活化されたウイルスは、薬学的使用のために、例えば、リポソーム中への封入によって、さらに改変され得る。
【００４１】
本発明は、以下の実施例においてさらに例証され、以下の実施例は決して限定されない。本発明が詳細に記載されているが、改変および変化が、添付の特許請求の範囲において定義される発明の範囲から逸脱することなく可能であることが、明らかである。
【実施例】
【００４２】
（実施例１：標準的卵安全性試験の原理）
標準的卵安全性試験を使用して、不活化されたインフルエンザウイルスの残留感染性について試験した。一価バルク製品（すなわち、ショ糖勾配遠心分離および超ダイアフィルトレーションの後の精製ウイルス抗原）を、１０個の卵（０．２ｍｌ／卵）に注入する。３２℃にて３日間インキュベートした後、それらの卵を収集し、プールし、再度、１０個の卵（０．２ｍｌ／卵）に注入する。３２℃にて３日間さらにインキュベートした後、それらの卵を収集し、プールし、赤血球凝集素（ＨＡ）について試験する。
【００４３】
このＨＡ試験は、インフルエンザウイルスが、その表面タンパク質である赤血球凝集素を使用して赤血球に結合し得ることに基づく。この試験は、滅菌環境において実行する。所定のＨＡ力価を有するインフルエンザ懸濁物が、ポジティブコントロールとして役立ち、０．９％ ＮａＣｌ溶液が、ネガティブコントロールとして役立つ。０．９％ ＮａＣｌ中における試験すべきサンプルの１：２希釈物５０μｌを、９６ウェルプレートのうちの１つのウェルに提供する。各ウェルに、ニワトリ赤血球を含む溶液５０μｌを添加する。その後、そのプレートを、室温で３０分間〜４５分間インキュベートする。そのｇお、赤血球凝集素を視覚的に決定する。この場合、同じサンプルを含む５つのサンプルが赤血球凝集素を全く示さない場合、そのサンプルは、このＨＡ試験を合格した。
【００４４】
（実施例２：標準的Ｖｅｒｏ安全性試験の原理）
標準的Ｖｅｒｏ安全性試験は、不活化インフルエンザ株の残留感染性についての非常に厳密な品質試験である。この試験はまた、他のウイルスにも適用可能である。一価バルク製品（すなわち、ショ糖勾配遠心分離および超ダイアフィルトレーションの後の精製ウイルス抗原）を、５個のルー瓶（４ｍｌ／瓶）に注入する。Ｖｅｒｏ培地中で３２℃にて７日間インキュベートした後、それらの細胞培養物を収集し、プールし、５個のルー瓶（１０ｍｌ／瓶）に注入する。３２℃にて７日間さらにインキュベートした後、それらの細胞培養物を収集し、プールし、実施例１において記載されるように赤血球凝集素（ＨＡ）について試験する。
【００４５】
（実施例３：ホルマリン不活化）
ホルマリンによる最初の不活化工程は、無細胞の感染性一価ウイルス収集物（すなわち、遠心分離を介して清澄化した後のバイオリアクター収集物）で実行する。３０℃〜３４℃で収集した後、その一価ウイルス収集物を、約０．９Ｕ／ｍｌ〜約１．１Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼを用いて３０℃〜３４℃にて４時間〜８時間処理する。その後、それを、≦９２ｍｇ／ｌのホルマリンを用いて３２±２℃にて２４時間〜２４．５時間処理する。
【００４６】
（実施例４：６５ワットＵＶランプを用いる不活化実験）
ホルマリン不活化ウイルスを用いる多数の不活化実験を、６５ＷのＵＶランプと薄層チャンバとを備える不活化チャンバを使用して実行する。一価ウイルス収集物の完全な不活化が、１００Ｌ／時間の流量で３サイクルを使用した場合に実証され得るが、この設定は、ＵＶシグナルのオンライン測定を可能にはしなかった。インフルエンザ生成のために使用されるＶｅｒｏ細胞培地は、ＵＶシグナルの吸収を担う種々の有機化合物を含む。従って、上記のシステムは、１１０Ｗのランプを備え、これによって、一価ウイルス収集物の処理の間のＵＶシグナルの連続的モニタリングを可能にする。
【００４７】
（実施例５：１１０ワットＵＶランプを用いる不活化実験）
ホルマリン処理した一価インフルエンザパナマ（Ｐａｎａｍａ）収集物を、この不活化研究のためのモデル基質として使用する。薄層ＵＶ技術を用いる連続的不活化のために、ＶＩＳＡランプ（１１０Ｗ／４Ｖ）を備えるＷＥＤＥＣＯ ＶＩＳＡシステム（Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する。ＵＶ薄層チャンバは、３０ｍｍ直径石英チューブを備えるステンレス鋼製１．４４３５デバイスである（表１を参照のこと）。較正済みＵＶセンサーは、ＵＶシグナルのオンライン制御を可能にする。ＵＶ薄層チャンバを、周囲温度において２４０±１０Ｌ／時間の流量で操作する。この流量条件を、較正済みフローメーターによって制御する（表２を参照のこと）。
【００４８】
（表１）
（ＵＶ不活化チャンバの特徴）
【００４９】
【表１】
上記一価収集物を、１０回のＵＶサイクルに曝露する。各サイクルの後、ＵＶ処理済み一価収集物のうちの２０Ｌを取り出す。これを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中での長期４２％ショ糖勾配を用いる連続的超遠心分離条件を使用するショ糖勾配精製によってさらに精製し、所定の精製一価収集物（ＰＭＶＨ）を、プレ清澄器（ｐｒｅｃｌａｒｉｆｉｅｒ）を備えないＳｏｒｖａｌｌ ＣＣ４０遠心機（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｋｏｋｉ Ｃｏ，ＬＴＤ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、４８％から３６％へのショ糖を使用して精製する。
【００５０】
（表２）
（ホルマリンとＵＶとで処理したインフルエンザパナマ（Ｐａｎａｍａ）の超遠心分離実行の概要）
【００５１】
【表２】
（（Ａ）抗原の収率および純度）
インフルエンザ抗原の収率および純度を、赤血球凝集素（ＨＡ）含量、総タンパク質、およびＶｅｒｏタンパク質（宿主細胞タンパク質）に基づいて比較する。精製ウイルスを、ＨＡ／タンパク質比、宿主細胞タンパク質／ＨＡ比、およびウイルス安全性に基づいて比較する（表３を参照のこと）。ＵＶ処理したすべての収集物について、何のウイルス増殖も検出され得ない。対照的に、標準的ホルマリン不活化プロセス（ＵＶ照射を適用しない）に由来する精製ウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞培養物において増殖され得る。ＨＡ／タンパク質比の有意な低下がサイクル７およびサイクル１０の後に観察され得るが、ホルマリン不活化製品と二重不活化製品との有意な差異は、ＨＡ／タンパク質比および宿主細胞タンパク質／ＨＡ比として測定した抗原純度に関して検出されない。
【００５２】
（表３）
（ホルマリンとＵＶとでの処理の後のショ糖勾配精製したパナマ（Ｐａｎａｍａ）ウイルス。０回〜１０回のＵＶサイクル後の、ＨＡ／タンパク質比、宿主細胞タンパク質／ＨＡ比、および安全性）
【００５３】
【表３】
さらなる研究を実行して、赤血球凝集素阻害（ＨＡＩ）分析によってモルモットおよびマウスにおける抗原性と免疫原性とに対するＵＶ不活化の効果を特徴付ける。
【００５４】
（（Ｂ）抗原性）
抗原性を、パナマ（Ｐａｎａｍａ）特異的抗血清に対するＨＡＩアッセイによって分析する。ＵＶ接触時間の増加は、ＨＡのわずかな喪失をもたらすが、ＨＡＩ力価については何の負の影響も示されない（表４を参照のこと）。
【００５５】
（表４）
（ホルマリンとＵＶとでの処理の後のショ糖勾配精製したパナマ（Ｐａｎａｍａ）ウイルス。０回〜１０回のＵＶサイクル後の、パナマ（Ｐａｎａｍａ）特異的抗血清を用いたＨＡ力価およびＨＡＩ力価に基づく抗原性の比較）
【００５６】
【表４】
（（Ｃ）免疫原性）
免疫原性を、モルモットおよびマウスを、種々のアリコートの精製一価ウイルス収集物で免疫して、最初の免疫の３週間後にブースターで免疫することによって、分析する。免疫した動物の血清を、３週間後および６週間後に収集してプールし、卵由来抗原に対するＨＡＩアッセイおよびＶｅｒｏ由来抗原に対するＨＡＩアッセイによって分析する。３週間後および６週間後にモルモットおよびマウスにおいて試験した免疫原性は、非常に有望な結果を与える。二重不活化ウイルスについて、標準的ホルマリン処理ウイルスに対する有意な差異は、観察され得ない（表５を参照のこと）。
【００５７】
（表５）
（ホルマリンとＵＶとでの処理（０回〜１０回のサイクル）の後のショ糖勾配精製パナマ（Ｐａｎａｍａ）ウイルス。モルモットおよびマウスにおいて試験した免疫原性の比較。Ａ）３種間後、Ｂ）６週間後。卵由来インフルエンザ抗原を用いるＨＡＩおよびＶｅｒｏ由来インフルエンザ抗原を用いるＨＡＩ）
【００５８】
【表５】
表４および表５において要約される結果は、ＵＶ処理が、ＨＡＩ力価の有意な差異を生じないことを示し、このことは、その製品の抗原性（従って、免疫原性）が、影響を受けないことを示す。
【００５９】
すべての二重不活化実験において、１サイクルのＵＶ処理の後でさえ、完全な安全性が実証され得る。実験室および最終規模における詳細な研究は、ホルマリン処理と組合わせた場合に、ＵＶ照射工程の有効性を実証した。ＵＶ処理の後の精製ウイルス抗原の免疫学的特徴づけは、非ＵＶ未処理製品で得られる結果に匹敵する結果を生じる。そのウイルス製品の生化学的特徴に対しても免疫原性に対しても、何の負の影響も検出され得ない。
【００６０】
（実施例６：ホルマリンおよび／またはＵＶでの不活化によるウイルス力価の低下）
有効濃度のホルマリンとフロースルー装置における有効濃度のＵＶ光とを組合わせたサンプル処理によるウイルス力価低下を、種々のウイルスを用いて試験する。ホルマリン不活化を、最終ホルマリン濃度０．０２５％（ｗ／ｖ）を用いて３２℃で２４時間実行した。フロースルー装置におけるＵＶ不活化を、流量２４０ｌ／時間にて３サイクル事項する。１サイクル当たりのサンプルとＵＶ光との接触時間は、１．４秒間である。
【００６１】
（表６）
（ホルマリンおよび／またはＵＶ不活化によるウイルス力価低下）
【００６２】
【表６】
この結果は、ホルマリンとＵＶとを合わせたウイルス処理によって、それぞれのウイルス力価の劇的な低下が得られることを示す。
【００６３】
（実施例７：ロス川ウイルス（ＲＲＶ）候補ワクチンのＵＶ不活化）
ロス川ウイルス（ＲＲＶ）は、流行性多発性関節炎（ＥＰＡ）として公知であるヒトの疾患を引き起こす、蚊媒介性アルファウイルスである。症状としては、関節炎（特に、膝ならびに手および脚の小関節における関節炎）が挙げられ、しばしば、発熱、発疹、および他の非特異的全身変化を伴う）が挙げられる。関節炎の症状は、一般的には、３０週間〜４０週間継続し、患者のうちの２５％は、発症１年後に残留する症状を依然として有する。これは、オーストラリア（毎年８０００件よりも多い症例がある）および太平洋領域全体にわって流行する。１９８９／８０年において、ロス川ウイルス感染の流行がまた、フィジー、サモア、クック諸島、およびニューカレドニアにおいて生じた。現在、何のワクチンも存在しない。
【００６４】
（（Ａ）無血清マイクロキャリアベースの１２００Ｌ Ｖｅｒｏ細胞発酵槽培養物のＲＲＶ接種、およびホルマリン不活化）
マイクロキャリアベースの無血清Ｖｅｒｏ細胞の１２００Ｌ発酵槽培養物に、ロス川産生ウイルスを接種した。その培養物を、３７℃にて３日間インキュベートした。サンプルを、力価決定用に毎日取り出した。３日目に、その細胞のうちの１００％がＣＰＲ（細胞障害効果）によって破壊された場合に、ウイルスを収集した。感染性ウイルス収集物からの細胞破片およびマイクロキャリアの分離と最初の力価決定工程（１．２μｍ／０．２μｍ）の後、ベンゾナーゼを、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）分解のために添加した。ホルマリン不活化を、０．１％（ｗ／ｖ）ホルマリン最終濃度を用いて８日間実行した。第二の濾過工程および第三の濾過工程を、それぞれ、２時間後および２４時間後に実行した。ベンゾナーゼを、残留核酸の除去のために、２４時間目に２回目に添加した。サンプルを、ウイルス力価決定（Ｖｅｒｏ細胞における組織培養感染量（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ）５０（ＴＣＩＤ５０/ｍｌ）のため、および表７に従
うＣ６−３６細胞およびＶｅｒｏ細胞における安全性試験のために、取り出した。
【００６５】
ＲＲＶを１２００Ｌ発酵槽に接種した１日後に、ｌｏｇＴＣＩＤ５０／ｍｌ＝５．８であるウイルス力価が、実証され得、これは、７．８（２日目）、８．１（収集前３日目）、および８．０（ウイルス収集後）に増加した。分離、第一濾過、およびベンゾナーゼ添加の後、ウイルス力価は、それぞれ、７．５、７．２、および７．４へと低下した。ホルマリン添加後、ウイルスペレットの遠心分離および再懸濁（表７、カラム：ＴＣＩＤ５０／ｍｌ ＴＬ１００）によって細胞傷害性ホルマリン懸濁物を除去した後に、力価を決定した。ホルマリンをウイルス収集物に添加した１５分間後に、力価は、１．６へと隙敵に添加した。ホルマリン不活化の１２時間後、もはやウイルス力価は実証され得なかった。
【００６６】
ホルマリン不活化開始の２４時間後に、サンプルを、Ｃ６−３６細胞およびＶｅｒｏ細胞における安全性試験に供した。不活化の２４時間後および２６時間後に、１つの陽性サンプル（ＣＰＥ）および４つの陰性サンプルが、Ｖｅｒｏ細胞において実証され得、４つの陽性サンプルおよび１つの陰性サンプルが、さらに感度が高いＣ６−３６細胞株を用いて得られた。２日目よりも後には、すべてのサンプルがＶｅｒｏ細胞において院生であった。このＣ６−３６細胞は、２日目および３日目に１つのサンプルでＣＰＥ、および４つの陰性サンプルをそれぞれ依然として示した。４日目および５日目に、すべてのサンプルは、Ｃ６−３６細胞において陰性であると試験されたが、６日目および７日目に、１つのサンプルが、再びＣＰＥを示した。８日目に、Ｖｅｒｏ細胞においてもＣ６−３６細胞においても、もはや陽性サンプルは示され得なかった。
【００６７】
【表７】
（（Ｂ）ＲＲＶ ＲＮＡを用いるトランスフェクション実験および感染実験）
上記の安全性試験の結果は、ゲノムＲＲＶ ＲＮＡが上記不活化手順の間に放出され得るという疑いを増加させた。これは、次に、それぞれの細胞中へのゲノムＲＲＶ ＲＮＡの組み込みをもたらし得る。ベンゾナーゼ処理は、ＲＮＡの完全な分解をもたらすはずであるが、リポソーム形成または他の機構（タンパク質破片によるゲノムＲＲＶ ＲＮＡのマスキングなど）が、インタクトなＲＮＡの逃避ストラテジーを説明し得る。
【００６８】
ＲＲＶゲノムＲＮＡを、勾配精製したビリオンから単離した。ＲＴ−ＰＣＲを介して、粒子等価物の数を決定し得た。第一の実験（表８、番号１）において、粒子等価物（ゲノムＲＮＡ）は、トランスフェクション培地（すなわち、トランスフェクション）および通常培地（すなわち、感染）の両方において１０倍段階で希釈した。両方の混合物を用いて、Ｃ６−３６細胞およびＶｅｒｏ細胞に接種した。培地交換の後、細胞培養物を、数時間インキュベートした。個々の上清のサンプルを、ウイルス力価決定およびＨＡ決定のために使用した。ゲノムＲＮＡを用いる感染実験を、数回実行した（表８、番号１〜５）。
【００６９】
上記トランスフェクション実験は、Ｃ６−３６細胞およびＶｅｒｏ細胞の両方において、ＴＣＩＤ５０を生じる。Ｖｅｒｏ細胞上清はまた、ＨＡ力価を示した。多数の粒子等価物（１０８）によるＶｅｒｏ細胞の感染は、ウイルス力価６．８ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを示し、ＨＡ力価１２８を有したが、Ｃ６−３６細胞には感染しなかった。ゲノムＲＲＶ ＲＮＡを用いる別の感染実験（番号４）は、Ｃ６−３６細胞およびＶｅｒｏ細胞の両方の感染（それぞれ、力価８．４ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌおよび６．６ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を生じた。感染試行２、３、および５は、Ｖｅｒｏ細胞において陽性の結果を生じなかった。感染事項番号３は、Ｃ６−３６細胞において、低い力価１．６ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを生じた。
【００７０】
純粋なゲノムＲＲＶ ＲＮＡを用いて細胞を感染させるすべての試行が陽性の結果を示したわけではないが、高濃度のゲノムＲＮＡが、細胞にランダムに感染可能であるようである。リポソームトランスフェクション試薬を使用したすべての実験が、陽性の結果を示した。従って、ＲＮＡのタンパク質マスキングまたはリポソーム形成機構が、表７におけるホルマリン不活化および遊離ＤＮＡ／ＲＮＡのベンゾナーゼ分解の後の陽性の安全性試験を説明する。
【００７１】
【表８】
（（Ｃ）感染性ＲＲＶのＵＶ不活化）
上記の考慮事項について、小規模実験を実行して、ＵＶ照射によりＲＲＶを不活化した。ＲＲＶ ＰＶ上清を、２つのＵＶ強度（２．１ｍＷ／ｃｍ２（サンプル１〜１０）および３．３ｍＷ／ｃｍ２（サンプル１１〜２０））を用いて、種々の時間の間ＵＶ照射した。その後、これらのサンプルをウイルス力価決定に供し、抗原力価（ＥＩＡ）および赤血球凝集素力価を決定した。３分間よりも長く照射したサンプル（番号６〜１０および１４〜１９）もまた、Ｃ６−３６細胞において安全性試験に供した（表９）。
【００７２】
ウイルス力価は、両方のＵＶ強度を用いた１０分間のＵＶ照射の後に、７．４ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（コントロール、サンプル番号１）から１．５ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌへと低下した。赤血球凝集反応は、ＵＶ強度２．１ｍＷ／ｃｍ２にて１５分間の間安定なままでありＨＡ力価が９であったが、ＵＶ強度３．３ｍＷ／ｃｍ２では８まで低下した。抗原力価（ＥＩＡ）はまた、１５分間の照射の間、６４０〜１２８０の範囲内で安定なままであった。安全性試験は、ＵＶ強度２．１ｍＷ／ｃｍ２にて３分間および５分間照射したサンプル（サンプル番号６および７）を用いて実行したところ、依然として、細胞培養物においてＣＰＥを示し、それぞれ、ウイルス力価８．２ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌおよび８．６ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを生じた。安全性試験は、ＵＶ強度３．３ｍＷ／ｃｍ２にて２分間、３分間、および５分間照射したサンプル（サンプル番号１４〜１６）を用いて実行したところ、依然として、細胞培養物においてＣＰＥを示し、それぞれ、ウイルス力価８．２ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、８．６ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、および８．７ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを生じた。１０分間の照射の後、すべての安全性試験は陰性であった。
【００７３】
２．１ｍＷ／ｃｍ２および３．３ｍＷ／ｃｍ２の両方の強度で１０分間よりも長くＵＶ照射すると、ＲＲＶ調製物を完全に不活化した。ＨＡ試験およびＥＩＡ試験において示されるように、抗原性は、両方の照射強度で１５分間の間で損なわれないままであった。３０分間後、抗原性は影響を受けた。
【００７４】
【表９】
（（Ｄ）ホルマリンで不活化した１２００Ｌ発酵槽収集物のＵＶ不活化）
ホルマリンで処理した１２００Ｌ発酵槽のウイルス収集物のアリコートを、流量３００ｌ／時間で３サイクル、１５０ｌ／時間で３サイクル、７５ｌ／時間で３サイクルにてＵＶ照射した。ホルマリンで処理した１２００Ｌ発酵槽のウイルス収集物の第二アリコートを、流量３００ｌ／時間にて１０サイクルでＵＶ照射したが、今度は、ダイアフィルトレーションの後に、高濃度の残留する小タンパク質を除去した。ＨＡ力価、抗原−ＥＩＡ力価、ウイルス力価、および安全性（ＣＰＥ）を、各試行の後に決定した（表１０）。
【００７５】
第一の実験（ダイアフィルトレーションなし）におけるウイルス力価は、流速１５０ｌ／時間にて１サイクルのＵＶ照射の後に、６．１３ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌから検出限界未満までに低下した。安全性試験もまた、ＣＰＥを示さなかった。しかし、流量１５０ｌ／時間にて３サイクルのＵＶ照射の後、細胞培養物における安全性試験は、陽性の結果を示し、そしてまた、ウイルス力価決定においても陽性であった（６．７ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）。流量７５ｌ／時間にて３サイクルのＵＶ照射は、ウイルス力価決定および安全性試験の両方において陰性のままであった。第二実験において、安全性試験およびウイルス力価決定は、５回以上の照射サイクルの後で陰性のままであった。第一の実験において、すべての照射線量は、ＨＡ力価およびＥＩＡ力価に影響を与えず、それぞれ、１１および１：３２０であった。第二の実験において、すべてのＨＡ力価およびＥＩＡ力価は、それぞれ、１０および１：３２０であり、例外として、６回の照射サイクルが、ＥＩＡ力価１：６４０を生じた。
【００７６】
ホルマリンと、流量３００ｌ／時間にて５サイクル以上のＵＶ照射とで、ＲＲＶの発酵槽収集物を二重不活化することが、抗原性を損なうことなく感染性を完全に破壊するためには十分である。
【００７７】
【表１０】
【００７８】
（（Ｅ）二重不活化したＲＲＶ候補ワクチン調製物の効力）
（免疫したマウスにおける有効用量（ＥＤ５０）、防御用量（ＰＤ５０）、およびＥＬＩＳＡ力価）
ホルマリンで不活化したＲＲＶ候補ワクチンおよび二重不活化（ホルマリン＋ＵＶ照射）したＲＲＶ候補ワクチンを、１０μｇ／用量に調整し、その後、４倍段階で希釈した。各希釈物を、１０匹のマウスからなる群に注射した。３週間後に、そのマウスに、対応する量の上記ワクチンをブースター投与した。血液サンプルを、３週間後、ブースター前、６週間目、ブースターの３週間後に取り出した。その血清を、ＲＲＶ抗体ＥＬＩＳＡによって分析した。有効用量５０（ＥＤ５０）（これは、免疫したマウスのうちの５０％におけるセロコンバーションを誘導するために十分である抗原用量である）を、その後算出した。
【００７９】
３週間目に、ブースターの前に、ホルマリンで不活化した群のＥＤ５０は、６３５ｎｇであった。ホルマリン・ＵＶ二重不活化した群のＥＤ５０は、２０２ｎｇであった。ブースターの後に、そのＥＤ５０値は、それぞれ、３３ｎｇおよび１０ｎｇであった。しかし、ＥＬＩＳＡ力価の分析は、二重不活化した群が、さらに高い抗体力価を有した（例えば、３週間目に、ＥＬＩＳＡ力価１０００であるマウスが二重不活化群において１６匹であったのに対してホルマリン群では９匹であり、ＥＬＩＳＡ力価１０，０００であるマウスが二重不活化群において４匹であるのに対してホルマリン群ではなかった）ことを、実証した。ブースターの後もまた、二重不活化群の力価は、より高かった（ＥＬＩＳＡ力価１００，０００であるマウスが二重不活化群において１１匹であったのに対してホルマリン群では８匹であり、ＥＬＩＳＡ力価が１，０００，０００であるマウスが二重不活化群においてはさらに４匹いた（表１１））。
【００８０】
６週間目（ブースターの３週間後）に、マウスに、１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（組織培養感染用量５０）のロス川ウイルス（Ｔ４８株）を静脈内感染させた。感染後１日目、２日目、３日目、および４日目に、血液サンプルを採取し、その血清のＴＣＩＤ５０をその後決定した。防御用量５０（ＰＤ５０）（これは、感染したマウスのうちの５０％がウイルス血症を示されない抗原用量である）を算出した。ＰＤ５０＝７８ｎｇが、両方の抗原調製物（ホルマリン不活化抗原、および二重不活化（ホルマリン＋ＵＶ照射）抗原）について同じであった。
【００８１】
（表１１）
（免疫したマウスにおける有効用量（ＥＤ５０）、防御用量（ＰＤ５０）、およびＥＬＩＳＡ力価）
【００８２】
【表１１】
ホルマリン処理単独の後に非常に感受性であるＣ６−３６細胞株において主に見出される残留感染性は、ほぼおそらくは、感染性ＲＲＶ ＲＮＡによって引き起こされる。第二のさらなるウイルス不活化工程（ＵＶ照射）（これは、ホルマリン処理後のウイルスゲノムに影響を及ぼす）は、マウスモデルにおいて免疫原性および効力に影響を及ぼすことなく、完全に不活化されかつ安全なＲＲＶ候補ワクチン調製物を生じた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１４３２４９（Ｐ２０１２−１４３２４９Ａ）
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−９６６２３（Ｐ２０１２−９６６２３）
【出願日】平成２４年４月２０日（２０１２．４．２０）
【分割の表示】特願２００７−５１３８０６（Ｐ２００７−５１３８０６）の分割
【原出願日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−９６６２３（Ｐ２０１２−９６６２３）
【出願日】平成２４年４月２０日（２０１２．４．２０）
【分割の表示】特願２００７−５１３８０６（Ｐ２００７−５１３８０６）の分割
【原出願日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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