ボツリヌストキシンの定量化
【課題】本発明は試料中に含まれるシナプス前神経筋遮断物質（特にはボツリヌストキシン）の含量の測定方法に関する。
【解決手段】ある態様において、当該方法は以下の工程を含んで成る：
（ｉ）筋肉組織の収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmを測定すること（上記筋肉組織は、運動神経を介して電気刺激装置に結合されており、好ましくはグルコースを含む酸素添加した生理バッファー中に浸漬されている）；（ii）シナプス前神経筋遮断物質を含む試料を添加すること；（iii ）少なくともＶmに等しい電位において、一定の時間間隔において筋肉組織を電気刺激すること；（iv）当該試料により誘導された効果と、基準物質により誘導された効果を比較し、そして、これにより試料中のシナプス前神経筋遮断物質の含量を測定すること。
【解決手段】ある態様において、当該方法は以下の工程を含んで成る：
（ｉ）筋肉組織の収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmを測定すること（上記筋肉組織は、運動神経を介して電気刺激装置に結合されており、好ましくはグルコースを含む酸素添加した生理バッファー中に浸漬されている）；（ii）シナプス前神経筋遮断物質を含む試料を添加すること；（iii ）少なくともＶmに等しい電位において、一定の時間間隔において筋肉組織を電気刺激すること；（iv）当該試料により誘導された効果と、基準物質により誘導された効果を比較し、そして、これにより試料中のシナプス前神経筋遮断物質の含量を測定すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるシナプス前神経筋遮断物質の含量の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中に含まれるシナプス前神経筋遮断物質の含量の測定は、一般的に、マウス又はラットにおける当該物質の致死量ＬＤ50の計測により行われる。当該方法は、活性ボツリヌストキシンの含量の測定のために現在特に使用される。このようなＬＤ50法は多数の動物を殺す必要がある。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、通常のＬＤ50法と比較して、有意な数の動物の生命を残す新規な方法を供する。
【０００４】
従って、本発明に従い、以下の工程を含んで成る、試料中のシナプス前神経筋遮断物質の定量方法を供する：
（ｉ）筋肉組織の収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmを測定すること（上記筋肉組織は、運動神経を介して電気刺激装置に結合されている）；
（ii）シナプス前神経筋遮断物質を含む試料を添加すること；
（iii ）少なくともＶmに等しい電位において、一定の時間間隔において筋肉組織を電気刺激すること；
（iv）当該試料により誘導された効果と、基準物質により誘導された効果を比較し、そして、これにより試料中のシナプス前神経筋遮断物質の含量を測定すること。
【０００５】
シナプス前神経筋遮断物質により、シナプス前神経筋活性に関係する化学メッセージ及びシグナルの伝達を防止及び／又は阻害する物質は、本出願において理解されるべきである。シナプス前神経筋遮断物質の例は、アセチルコリン（ＡＣＨ）の合成又は放出を阻害する物質であり；これらは顕著な生物毒素（ボツリヌス神経毒素、及びブンガロトキシン）、及び化学物質（例えば、ＡＣＨの合成を阻害するヘミコリニウム又はトリエチルコリン、ＡＣＨ放出又はツボクラリンを阻害するアミノグリコシド抗生物質、及び類似化合物）を含む。本発明に従う好ましいシナプス前神経筋遮断物質は、ボツリヌス神経毒素及びブンガロトキシンであろう（ブンガロトキシンの中でもα−ブンガロトキシンが好ましい）。
【０００６】
ボツリヌス神経毒素（又はボツリヌストキシン）は本出願中において、ボツリヌス神経毒素複合体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧ型のいずれか）、並びに高純度ボツリヌス神経毒素（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧ型のいずれか）を意味する。ボツリヌストキシンＡ型はボツリヌストキシンＡ型の全ての型を含み、Ａ１、Ａ２及びＡ３を含む。
【０００７】
ボツリヌス神経毒素複合体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧ型のいずれか）は、本出願において、少なくとも他の非毒性タンパク質と会合しているボツリヌス神経毒素として理解すべきである。
【０００８】
高純度ボツリヌス神経毒素（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧ型のいずれか）は、本出願において、少なくとも他のタンパク質を含む複合体以外のボツリヌス神経毒素（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧ型のいずれか）であり、言い換えれば、高純度ボツリヌス神経毒素（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧ型）は、ボツリヌス神経毒素（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧ型）以外の有意な量のいかなる他のクロストリジウム属（Clostridium spp)由来のタンパク質も含まない。
【０００９】
本出願において、筋肉組織は１又は複数の筋線維を含んで成る筋線維試料を意味する。
【００１０】
好ましくは、上記筋肉組織は、バッファー、例えば、生理バッファーに浸漬される。当該バッファーはエネルギー源を含んで成ってよい。当該エネルギー源は、ＡＴＰエネルギー源、例えば、１又は複数の以下のものであってよい：ＡＴＰ、糖質、例えば、グルコース及び／又はクレアチン（リン酸クレアチンを含む）、脂肪酸、アミノ酸、グリコーゲン及びピルビン酸。上記バッファーは、特により長時間のアッセイのために酸素添加してもよい。
【００１１】
好ましい態様において、上記バッファーは、グルコースを含む酸素添加生理バッファーである。
【００１２】
筋肉組織が浸漬される上記バッファーは、好ましくは、少なくとも１０ｍＭのグルコース（例えば、１１ｍＭ）を含むであろう。また、好ましくは、上記バッファーは酸素で飽和されているであろう（例えば、バッファー中に酸素又は９５／５ Ｏ2／ＣＯ2混合体を通気することによる）。更に、上記バッファーは、好ましくは、１００〜２００ｍＭのＮａＣｌ、１〜５ｍＭのＫＣｌ、１０〜１５ｍＭのＮａＨＣＯ3、０．５〜２ｍＭのＭｇＣｌ2、及び１〜５ｍＭのＣａＣｌ2を含むであろう。当該バッファーのｐＨは好ましくは、約７．４であろう。
【００１３】
好ましくは、上記方法は、工程（iii ）の電気刺激が少なくとも、過最大電位ＶSMと等しい電位で行われるであろう。過最大電位は、筋肉組織の最大の単収縮を得るための最小電位であると理解される。
【００１４】
本発明の最初の変形（今後、変形Ａとする）に従い、上記方法の段階（iv）の比較のために使用した誘導効果は、筋肉組織が麻痺するまでの時間である（本出願において「寿命」と呼ぶ）。亜変形に従い、麻痺までの時間は、筋肉収縮距離（麻痺に達すると、当該収縮距離がゼロに等しくなる）（変形Ａ１）又は筋肉単収縮頻度（麻痺に達すると、単収縮頻度がゼロに等しくなる）（変形Ａ２）に基づき測定することができる。
【００１５】
本発明の他の変形（今後、変形Ｂとする）に従い、上記方法の段階（iv）の比較のために使用した誘導効果は、筋肉組織の収縮速度における変化である。
【００１６】
本発明の他の変形（今後、変形Ｃとする）に従い、上記方法の段階（iv）の比較のために使用した誘導効果は、筋肉組織の収縮距離における変化である。
【００１７】
本発明の他の変形（今後、変形Ｄとする）に従い、上記方法の段階（iv）の比較のために使用した誘導効果は、筋肉組織の収縮力における変化である。
【００１８】
本発明の他の変形（今後、変形Ｅとする）に従い、上記方法の段階（iv）の比較のために使用した誘導効果は、筋肉組織中の終板電位又は微小終板電位おける変化である。
【００１９】
変形Ａ（その亜変形を含む）、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥの組み合わせは、得られる結果の精度における改善を達成するために当業者により使用されることができる。特に、当業者は、変形Ａ１と変形Ａ２を組み合わせることを考慮することができる。
【００２０】
好ましくは、シナプス前神経筋遮断物質は、ボツリヌス神経毒素であろう。特に、当該ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素Ａ型、ボツリヌス神経毒素Ｂ型、及びボツリヌス神経毒素Ｆ型から選択することができる。より好ましくは、ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素Ａ型、及びボツリヌス神経毒素Ｂ型から選択されるであろう。特に、好ましい方法において、ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素Ａ型であり、顕著にはボツリヌス神経毒素Ａ型複合体（商業製品Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）又はＢｏｔｏｘ（登録商標）の活性成分等）であろう。
【００２１】
通常の方法において、上記方法は、低濃度（例えば、０〜１００ＬＤ50ユニット／ｍｌ、そして好ましくは０〜５０又は０〜１０ＬＤ50ユニット／ｍｌ）においてより感応性であろうが、一方、試料中に高濃度のシナプス前神経筋遮断物質が存在する場合は機能しなくてよい（電気刺激にもかかわらず筋肉組織は麻痺状態を維持する）。結果として、本発明の方法が行われる場合、試験試料は、好ましくは、少なくとも２又は３回の希釈（例えば、希釈無し、１０倍希釈、及び１００倍希釈）において調製されるであろう；当該方法において、より高濃度のシナプス前神経筋遮断物質においてもまた測定することができる。しかしながら、前述の方法の感応性は、上述の通り改善することができる。
【００２２】
本発明の好ましい遂行方法に従い、上記筋肉組織は、マウス又はラットから得られた肋骨筋肉の断片から構成されるであろう。好ましくは、当該断片は、少なくとも２ｍｍ×１０ｍｍの大きさを有するであろう。筋肉組織は、例えば、肋骨筋肉の２−肋骨切片に相当する大きさを有してよい。
【００２３】
更に好ましい本発明の遂行方法に従い、各電気刺激は、常に、筋肉組織の収縮を誘導するために必要とされる少なくとも最小電位Ｖmと同じである電位Ｖsを適用することにあり、更に、ＶsはＶmよりわずかに上の電位以下又は同じである。「Ｖmよりわずかに上の電位」は、Ｖmプラス３ボルト、Ｖmプラス２ボルト、又はＶmプラス１．５ボルトである。例えば、適用される刺激電位は、Ｖmプラス１ボルトとして選択できる。
【００２４】
本発明の更に可能な特徴は、ビデオレコーダーを併用したビデオカメラの使用を含む。それから当該作製されたフィルムを分析することができ、そして、シナプス前神経筋遮断物質の効果を正確に評価することができる。それから、試料中に存在するシナプス前神経筋遮断物質の含量は、基準に観察されたものと比較した、試料に観察される効果に由来することができる。
【００２５】
あるいは、上述の変形Ｄのために筋肉組織の収縮力を計測するために使用される圧力変換トランスデューサーは、自動リアルタイム電子データキャプチャーシステムを付随することができる。
【００２６】
結果の可変性を減少させるために、電気刺激装置は、特定の時間間隔において選択された電位Ｖsを送る。この場合、各時間は一定の効果をもたらす。これらの条件において観察される平均的な効果を使用することは、試料中に存在するシナプス前神経筋遮断物質の含量のより正確な測定を許容する。
【００２７】
上記方法のための感応性を増大させる方法は、当該方法をより長時間にわたり行うことにあり、獲得すべきより多くのデータ（例えば、少なくとも５、１０又は３０分から１、２、４、８、１２、２４、４８、７２時間又はそれ以上まで）を許容する。例えば、上記方法の変形Ｄのために、上記方法は、筋肉組織の収縮力の一定の割合における減少が計測されるまで行うことができる（例えば、１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０又は９０％の減少）。
【００２８】
当該好ましい遂行方法を行うために、筋肉組織の寿命は、前に説明されたより一般的な方法と比較して延長されることが必要である。
【００２９】
上記寿命を延長することを目的とするある特定のアプローチにおいて、酸素及びグルコース（又はＡＴＰ源）が定期的な方法において筋肉組織に供される。
【００３０】
上記を達成するための１つの方法は、一定の間隔において、グルコース（又は他のＡＴＰ源）を含有する酸素添加した生理バッファーバスを、消費した酸素及びグルコース（又は他のＡＴＰ源）を）を置き換えるために（上記間隔は、好ましくは、１分以上２４時間以内であり、例えば、１、２、５、１０、１５又は６０分毎）、新しいものと交換することである。他の方法は、バスの酸素濃度を一定に保つことを許容する、酸素が常に通気されているバスを使用することであり；更には、グルコース（又はＡＴＰ源）は、筋肉組織により消費されたグルコース（又はＡＴＰ源）を置き換えるために、定期的な間隔において添加することができる。
【００３１】
あるいは、一定のグルコース（又は他のＡＴＰ源）及び任意的な酸素レベルを保つために有利なフロースルーバスシステムを使用することができる。当該システムにおいて、グルコース（又は他のＡＴＰ源）を含有する酸素添加した生理バッファーは、筋肉組織が浸されている容器の一方で汲み入れられ、他方で汲み出される。
【００３２】
筋肉組織の寿命を延長させるための他の方法は、試料の疲労を減少させるトレインパルス刺激の使用を含む。トレインパルス刺激は、刺激が及ぼされない時間ｔp続く周期により相互から分離された時間ｔs続く刺激を意味する。当該時間ｔsは、好ましくは５０μｓ〜５００ｍｓ、より好ましくは１００μｓ〜２５０ｍｓ及びより更に好ましくは１００μｓ〜１ｍｓ（例えば、２００μｓ又は約２００μｓ）であり；時間ｔpは、好ましくは０．１〜１０ｓ、及びより好ましくは０．５及び２ｓ（例えば、１ｓ又は約１ｓ）であり；ｔs／ｔp比は、好ましくは１：２〜１：５００００、より好ましくは１：５〜１：２００００、及びより更に好ましくは１：５００〜１：１００００（例えば、約１：５０００）である。
【００３３】
また、本発明は、以下の工程を含んで成る、試料中のシナプス前神経筋遮断物質に対する中和抗体の含量の測定方法を供する：
(ｉ）筋肉組織の収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmを測定すること（上記筋肉組織は運動神経を介して電気刺激装置に結合されている）；
（ii）シナプス前神経筋遮断物質に対する中和抗体、及び測定した量の上記シナプス前神経筋遮断物質を含有する試験すべき試料混合物（上記混合体は０〜４５℃で約１５〜約１２０分間前もってインキュベートする）を添加すること、；
（iii ）少なくともＶmに等しい電位において、一定の時間間隔において筋肉組織を電気刺激すること；
（iv）当該混合物により誘導された効果と、測定した量の上記シナプス前神経筋遮断物質により誘導された効果を比較し、そして、これにより試料中のシナプス前神経筋遮断物質に対する中和抗体の含量を測定すること。
【００３４】
試料中のシナプス前神経筋遮断物質の含量を測定する方法のために前に示した全ての変形は、試料中のシナプス前神経筋遮断物質に対する中和抗体の含量を測定するための本発明の方法に修正を加えて適用することができる。
【００３５】
「約」の語は、考慮される値の中間を意味する。本出願において使用される「約Ｘ」は、ＸマイナスＸの１０％〜ＸプラスＸの１０％の中間を、そして好ましくはＸマイナスＸの５％〜ＸプラスＸの５％の中間を意味する。
【００３６】
これらは別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的語句は、本発明が属する分野における当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。同様に、本明細書において述べられる全ての刊行物、特許出願、全ての特許及び全ての他の引例は引例の方法として組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、実施例１に説明される手順に従い、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）の濃度変化（０、１、１０及び５０Ｕ）での時間の関数において計測された肋間ラット調製物の相対的な収縮距離を示す。
【図２】図２は、実施例１に説明される手順に従い、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）の濃度変化（０、１、１０及び５０Ｕ）での収縮距離から計測された肋間ラット調製物の寿命を示す。当該データは、平均値±標準誤差、ｎ＝４〜５において示される。Ｘ軸は、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）の収縮時間（ＬＤ５０ ユニット／ｍｌ）を、一方、Ｙ軸は時間（ｓ）を示す。
【図３】図３は、実施例１に説明される手順に従い、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）の濃度変化（０、１、１０及び５０Ｕ）での収縮頻度から計測された肋間ラット調製物の寿命を示す。当該データは、平均値±標準誤差、ｎ＝４〜５において示される。Ｘ軸は、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）の収縮時間（ＬＤ５０ ユニット／ｍｌ）を、一方、Ｙ軸は時間（ｓ）を示す。
【図４】図４は、スタティックバスにおいて、圧力変換トランスデューサーに付着させた２肋骨組織を示す。
【図５】図５は、スタティックシステムにおいて実施例３の直接的適用法（以下の実験ｎの数を適用する：プラセボ：ｎ＝４；５００Ｕ：ｎ＝８；１０００Ｕ：ｎ＝５；１５００Ｕ：ｎ＝１１）を使用して、プラセボ、又は５００、１０００、１５００若しくは３０００Ｕのトキシンのいずれかに暴露した２肋骨切片の最大単収縮力計測でかかった時間（ｈ）を示す。エラーバーは、±平均値標準誤差を示す。Ｘ軸は、最大単収縮力における％減少を示し、一方Ｙ軸は、時間（ｈ）を示す。
【図６】図６は、スタティックシステムにおいて実施例３の浸漬法（以下の実験ｎの数を適用する：プラセボ：ｎ＝３；３Ｕ：ｎ＝５；６Ｕ：ｎ＝２；１２Ｕ：ｎ＝２）を使用して、プラセボ、又は３、６若しくは１２Ｕのトキシンのいずれかに暴露した２−肋骨切片の最大単収縮力計測でかかった時間（ｈ）を示す。エラーバーは、±平均値標準誤差を示す。Ｘ軸は、最大単収縮力における％減少を示し、一方Ｙ軸は、時間（ｈ）を示す。
【００３８】
以下の実施例は上記を説明するために存在し、そして本発明の範囲を制限するものとして考慮してはならない。
【実施例】
【００３９】
以下の実施例において、１Ｓｐｅｙｗｏｏｄユニット又は１Ｕは、マウス中のボツリヌストキシンのメジアン腹腔内ＬＤ50用量に対応する。
【００４０】
実施例１：ボツリヌストキシン含有試料
使用される材料
ａ）使用されるバッファー溶液：
「リリーズ（Lillies）リンゲルバッファー」として後に識別される改変リンゲルバッファーは、水中で以下を希釈することにより調製される：
【表１】
【００４１】
使用の直前において、グルコース（１１ｍＭ）を、前に調製された溶液に添加し、そして９５％Ｏ2と５％ＣＯ2のガス混合体を上記バッファー溶液に通気させ、リリーズリンゲルバッファーを産出する。
【００４２】
後に言及するリン酸バッファー生理食塩水溶液（ＰＢＳ）は、Ｓｉｇｍａにより供されるタブレットを２００ｍｌの水に添加し溶解することにより調製し、当該バッファーは以下の特徴を供する。
【表２】
【００４３】
ｂ）組織の単離：
ウィスターラット（体重約２７５ｇ）を、ＣＯ2暴露（意識を失わせるために約３分間）後に、頚椎脱臼により犠牲にする。胸郭を各動物から解剖し、リリーズリンゲルバッファー中に置き、そして実験場所に運ぶ（行程時間：約１５分）。これらの胸郭は、脊柱にそって注意深く解剖することにより２つの切片に分離させる。当該組織を、実験手順を行う前に酸素添加バッファー中に保存する。
【００４４】
ｃ）筋肉の収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmの測定：
各肋間調製物（半分の胸郭）を、リリーズリンゲルバッファーを含むペトリ皿に置く。各調製物のために、約１〜２ｍｍの神経束を明らかにするために１つの肋間神経を注意深く解剖する。解剖後、上記調製物は、１０ｍｌの酸素添加リリーズリンゲルバッファーを含むペトリ皿に戻す前に、新鮮な酸素添加リリーズリンゲルバッファー中に約１５〜２０分おいて回復させることができる。解剖した肋間神経をそれから吸引電極を介して、培地中におかれた回帰（return)接触電極を有する刺激装置と接続する。細胞収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmを測定する。刺激が１０Ｖ以下に達することができない場合、他の神経を解剖し、そして接続の前に調製物を回復させる。
【００４５】
試料中に含有されるボツリヌストキシントキシンの含量の測定方法
上記神経をパルス電位（５〜９Ｖ、１Ｈｚ）で刺激し、当該選択された電位は、刺激及び筋肉収縮を達成するために必要な閾電位Ｖｍより常に１Ｖ上にする。上記切片のビデオ顕微鏡観察は、組み合わせたＴＶ／ビデオレコーダーに接続したＪＶＣ ＴＫＣ１４８１ＥＧビデオカメラを伴うＮｉｌｋｏｎ ＳＭＺ８００ステレオマイクロスコープで行う。
【００４６】
Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）（活性成分：ボツリヌストキシンＡ型）をＰＢＳ中に、直接肋間調製物（１０ｍｌのバッファー中に僅かに浸されている）上に加える。ｍｌ用量当たり５０ Ｓｐｅｙｗｏｏｄユニット（Ｕ）のために、５００Ｕのトキシンを培養皿（１０ｍｌバッファー）に添加し、５０Ｕ／ｍｌ用量の最終濃度を得る。１０Ｕ／ｍｌ用量のために、１００Ｕを、上記培養皿に添加し、１０Ｕ／ｍｌ用量の最終濃度を得る。１Ｕ／ｍｌ用量のために、１０Ｕを、上記培養皿に添加し、１Ｕ／ｍｌ用量の最終濃度を得る。プラセボ（ボツリヌストキシンが存在しないことを除き、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）と同じ組成を有する）のために、バイアル（０．２ｍｌのＰＢＳ中）の全ての内容物を培養皿に添加する。
【００４７】
データ分析
記録したビデオクリップを、ＭＰＥＧファイルに変換する。後の分析を補助するために、各ムービーを２分間のセクションにカットし、そしてこれらのセクションを、Ａｄｏｂｅ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｅｒｅ（登録商標）５．１ソフトウェアを使用して開始速度の１／２にスローにする。それから、分析は１０秒間（半分のスピードのクリップでは２０秒間）中の単収縮の回数をカウントすることにより行い、そして当該１０秒間にわたる単収縮の回数を平均化し、単収縮の頻度の値を得る。また、収縮距離は、重ねられたスケールバー（任意単位−通常６〜７ポイントスケール）を伴うムービーを再生することにより測定でき、当該データを平均化し、各１０秒間にわたる収縮距離を得ることができ、あるいは、上記距離は開始収縮距離と比較される。
【００４８】
上記実験は一定回数繰り返し（０Ｕ／ｍｌ：ｎ＝５；１Ｕ／ｍｌ：ｎ＝５；１０Ｕ／ｍｌ：ｎ＝４；５０Ｕ／ｍｌ：ｎ＝４）、そして当該結果を平均化する。
【００４９】
結果
図１から、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）濃度の関数として、相対的な収縮距離（即ち、トキシンの不存在下における収縮距離により得られたトキシンの存在下における収縮距離）が、多かれ少なかれ急速に減少されることを示す。
【００５０】
また、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）濃度の関数として観察できるように、図２は、距離単収縮寿命（即ち、当該トキシンが添加されてから、収縮距離がゼロになるまでに必要とされる時間）に関する結果が、筋肉収縮距離において用量依存的な減少を示すことが解る。
【００５１】
図３に示される通り、単収縮頻度寿命（即ち、当該トキシンが添加されてから、単収縮頻度がゼロになるまでに必要とされる時間）もまた、用量依存的な方法において、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）により減少される。
【００５２】
実施例２：α−ブンガロトキシン含有試料
実施例１のために説明した同じ手順を使用して、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）の代わりにα−ブンガロトキシンを、２１μＭ（ｎ＝３）の濃度において試験する。α−ブンガロトキシン調製物の平均単収縮寿命は、２２５ｓ（±標準誤差９３、ｎ＝３）、及び２３８ｓ（±標準誤差９３、ｎ＝３）であり、それぞれ収縮距離及び単収縮頻度から計測される。
【００５３】
実施例３：延長生命系
材料調製
ａ）使用されるバッファー溶液：
当該実施例において使用される改変リンゲルバッファー又は「リリーズリンゲルバッファー」は１リットルの水に以下を希釈することにより調製される：
ゼラチン ２ｇ
ＮａＨＰＯ4，２Ｈ2Ｏ １０ｇ
【００５４】
ｂ）組織の単離：
オスのウィスターラット（約２３０〜３００ｇ）を、ＣＯ2暴露（意識を失わせるために約３分間）後に、頚椎脱臼により犠牲にする。胸郭を各動物から解剖し、リリーズリンゲルバッファー中に置き、そして実験場所に運ぶ（行程時間：約２０分）。これらの胸郭は、脊柱及び胸骨にそって注意深く解剖することにより２つの切片に分離させる。実験手順の前に、２つの半分の胸郭を約３００ｍｌの継続的に酸素添加したリリーズリンゲルバッファー中に少なくとも３０分間保存する。
【００５５】
ｃ）筋肉の収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmの測定：
１つの半分の胸郭を、約１０ｍｌのリリーズリンゲルバッファーを含むペトリ皿に置き、約１〜２ｍｍの神経束を明らかにするように１つの肋間神経を注意深く解剖する。それから、当該神経を、吸引電極を介して培地中におかれた回帰（return)接触電極を有する刺激装置(Grass Instruments Model S48)と接続する。細胞収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmを測定する。刺激が１０Ｖ（１Ｈｚ、２００μ秒持続時間）以下に達することができない場合、他の神経を解剖する。神経を有する２−肋骨切片を半分の胸郭から解剖し、圧力変換トランスデューサーに後で付着するための２つの肋骨の端のいずれかを残せる程度に過剰な筋肉組織を確保する。
【００５６】
ｄ）圧力変換トランスデューサーへの付着：
図４に示されるスタティックバスシステムに関して、３つの金属ステーブルが、２つの肋骨のいずれかの端上の非刺激筋肉組織に付着された。２−肋骨切片（５）の一方の端は、３つのステーブルを介して、固定した脚（４）に付着させ、他の端は自由な脚に付随させた。上記固定した脚は、その場所にしっかりと固定し、一方自由な脚は、約４ｃｍの綿針（７）を介して、圧力変換トランスデューサー(1 ; Grass Instruments Model FT03)に付着させた。当該固定された組織を約５００ｍｌのリリーズリンゲルバッファーに浸し、そして回帰電極（２）を当該バッファー中に置いた。解剖した肋間神経を、（正）吸引電極（３）を介して、刺激装置に接続した。また、図４に示された当該システムは、ＣＯ２／Ｏ２ガス入り口（６）を含む。
【００５７】
試料中に含まれるボツリヌストキシンの含量の測定方法
上記２−肋骨組織切片を、連続パルス刺激を使用して（毎回３０秒間の最初の５秒間は１パルス／秒）、約９０分間、１５Ｖ、２００μ秒持続時間で刺激する。
【００５８】
所望されるトキシンの濃度は、適用の直前にＧＰＢ中で再構成させる。当該トキシン伝達は以下２つの方法のひとつを介する：
Ａ）直接的適用−上記２−肋骨切片を、組織バス中のいくらかのバッファーを除去することにより、空気／液体界面に暴露させる。ハミルトンシリンジを使用して、トキシンを滴下法において、暴露した組織に直接的に適用する。オリジナルリンゲルバッファーでカバーする前に、トキシンを取り込むことができるように、上記組織を更に１５分間暴露したままにする。必要であれば、いずれかの取り外された、解剖された神経を吸引電極に再接続させる。
Ｂ）浸漬−ハミルトンシリンジを使用して、トキシンを、２−肋骨切片に近接する（但し、直接その上ではない）組織バスに直接的に適用する。
【００５９】
圧力変換トランスデューサーから記録された単収縮力の読みは、Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＣ／ＤＣ ストレインゲージ増幅器(Model P122)を通して増幅させ、それから、シグナルは、Ｇｒａｓｓ ＰｏｌｙＶＩＥＷTMソフトウェアを使用して記録される。
【００６０】
データ分析
記録されたトレースから、一定のパーセンテージにより減少させるように、初期の最大単収縮力計測にかかった時間（トキシン／プラセボの添加後）を計測した。当該実験は、一定の回数繰り返す（直接的適用法：プラセボ：ｎ＝４；５００Ｕ：ｎ＝８；１０００Ｕ：ｎ＝５；１５００Ｕ：ｎ＝１１；浸漬法：プラセボ：ｎ＝３；３Ｕ／ｍｌ：ｎ＝５；６Ｕ／ｍｌ：ｎ＝２，１２Ｕ／ｍｌ：ｎ＝２）。プラセボ及び低レベルのトキシンに暴露した場合の組織の長い寿命のために、単収縮力における９０％減少において示された値は、一定の減少速度と仮定するデータの推定に基づく結果が予想される。
【００６１】
結果
Ａ）直接的適用法
図５において示されるように、時間による単収縮力の計測におけるゆっくりとした減少は、プラセボの添加後を含む全ての試料において記録される。プラセボの暴露後、約１２時間後に、最大単収縮力における５０％減少が観察される。比較において、１５００Ｕのトキシンに暴露されたこれらの組織試料中、単収縮はより急速に減少され、約５時間後、５０％減少に達する。
【００６２】
Ｂ）浸漬法
図６において示されるように、単収縮力計測における減少は、プラセボの添加後に記録され、約２０時間後に最大単収縮力における５０％減少が観察された。３ユニット／ｍｌのトキシン溶液中の組織の浸漬は、単収縮力の５０％減少に達する１３時間の刺激後に、単収縮力の速度を更に増加させた。より高いトキシン濃度では、用量依存型応答は、更に明らかである。
【００６３】
理解されるように、反復可能な用量依存型トキシン誘導性の筋肉収縮の抑制は、トキシン伝達の直接適用法及び浸漬法の両方を使用して観察される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるシナプス前神経筋遮断物質の含量の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中に含まれるシナプス前神経筋遮断物質の含量の測定は、一般的に、マウス又はラットにおける当該物質の致死量ＬＤ50の計測により行われる。当該方法は、活性ボツリヌストキシンの含量の測定のために現在特に使用される。このようなＬＤ50法は多数の動物を殺す必要がある。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、通常のＬＤ50法と比較して、有意な数の動物の生命を残す新規な方法を供する。
【０００４】
従って、本発明に従い、以下の工程を含んで成る、試料中のシナプス前神経筋遮断物質の定量方法を供する：
（ｉ）筋肉組織の収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmを測定すること（上記筋肉組織は、運動神経を介して電気刺激装置に結合されている）；
（ii）シナプス前神経筋遮断物質を含む試料を添加すること；
（iii ）少なくともＶmに等しい電位において、一定の時間間隔において筋肉組織を電気刺激すること；
（iv）当該試料により誘導された効果と、基準物質により誘導された効果を比較し、そして、これにより試料中のシナプス前神経筋遮断物質の含量を測定すること。
【０００５】
シナプス前神経筋遮断物質により、シナプス前神経筋活性に関係する化学メッセージ及びシグナルの伝達を防止及び／又は阻害する物質は、本出願において理解されるべきである。シナプス前神経筋遮断物質の例は、アセチルコリン（ＡＣＨ）の合成又は放出を阻害する物質であり；これらは顕著な生物毒素（ボツリヌス神経毒素、及びブンガロトキシン）、及び化学物質（例えば、ＡＣＨの合成を阻害するヘミコリニウム又はトリエチルコリン、ＡＣＨ放出又はツボクラリンを阻害するアミノグリコシド抗生物質、及び類似化合物）を含む。本発明に従う好ましいシナプス前神経筋遮断物質は、ボツリヌス神経毒素及びブンガロトキシンであろう（ブンガロトキシンの中でもα−ブンガロトキシンが好ましい）。
【０００６】
ボツリヌス神経毒素（又はボツリヌストキシン）は本出願中において、ボツリヌス神経毒素複合体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧ型のいずれか）、並びに高純度ボツリヌス神経毒素（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧ型のいずれか）を意味する。ボツリヌストキシンＡ型はボツリヌストキシンＡ型の全ての型を含み、Ａ１、Ａ２及びＡ３を含む。
【０００７】
ボツリヌス神経毒素複合体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧ型のいずれか）は、本出願において、少なくとも他の非毒性タンパク質と会合しているボツリヌス神経毒素として理解すべきである。
【０００８】
高純度ボツリヌス神経毒素（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧ型のいずれか）は、本出願において、少なくとも他のタンパク質を含む複合体以外のボツリヌス神経毒素（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧ型のいずれか）であり、言い換えれば、高純度ボツリヌス神経毒素（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧ型）は、ボツリヌス神経毒素（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧ型）以外の有意な量のいかなる他のクロストリジウム属（Clostridium spp)由来のタンパク質も含まない。
【０００９】
本出願において、筋肉組織は１又は複数の筋線維を含んで成る筋線維試料を意味する。
【００１０】
好ましくは、上記筋肉組織は、バッファー、例えば、生理バッファーに浸漬される。当該バッファーはエネルギー源を含んで成ってよい。当該エネルギー源は、ＡＴＰエネルギー源、例えば、１又は複数の以下のものであってよい：ＡＴＰ、糖質、例えば、グルコース及び／又はクレアチン（リン酸クレアチンを含む）、脂肪酸、アミノ酸、グリコーゲン及びピルビン酸。上記バッファーは、特により長時間のアッセイのために酸素添加してもよい。
【００１１】
好ましい態様において、上記バッファーは、グルコースを含む酸素添加生理バッファーである。
【００１２】
筋肉組織が浸漬される上記バッファーは、好ましくは、少なくとも１０ｍＭのグルコース（例えば、１１ｍＭ）を含むであろう。また、好ましくは、上記バッファーは酸素で飽和されているであろう（例えば、バッファー中に酸素又は９５／５ Ｏ2／ＣＯ2混合体を通気することによる）。更に、上記バッファーは、好ましくは、１００〜２００ｍＭのＮａＣｌ、１〜５ｍＭのＫＣｌ、１０〜１５ｍＭのＮａＨＣＯ3、０．５〜２ｍＭのＭｇＣｌ2、及び１〜５ｍＭのＣａＣｌ2を含むであろう。当該バッファーのｐＨは好ましくは、約７．４であろう。
【００１３】
好ましくは、上記方法は、工程（iii ）の電気刺激が少なくとも、過最大電位ＶSMと等しい電位で行われるであろう。過最大電位は、筋肉組織の最大の単収縮を得るための最小電位であると理解される。
【００１４】
本発明の最初の変形（今後、変形Ａとする）に従い、上記方法の段階（iv）の比較のために使用した誘導効果は、筋肉組織が麻痺するまでの時間である（本出願において「寿命」と呼ぶ）。亜変形に従い、麻痺までの時間は、筋肉収縮距離（麻痺に達すると、当該収縮距離がゼロに等しくなる）（変形Ａ１）又は筋肉単収縮頻度（麻痺に達すると、単収縮頻度がゼロに等しくなる）（変形Ａ２）に基づき測定することができる。
【００１５】
本発明の他の変形（今後、変形Ｂとする）に従い、上記方法の段階（iv）の比較のために使用した誘導効果は、筋肉組織の収縮速度における変化である。
【００１６】
本発明の他の変形（今後、変形Ｃとする）に従い、上記方法の段階（iv）の比較のために使用した誘導効果は、筋肉組織の収縮距離における変化である。
【００１７】
本発明の他の変形（今後、変形Ｄとする）に従い、上記方法の段階（iv）の比較のために使用した誘導効果は、筋肉組織の収縮力における変化である。
【００１８】
本発明の他の変形（今後、変形Ｅとする）に従い、上記方法の段階（iv）の比較のために使用した誘導効果は、筋肉組織中の終板電位又は微小終板電位おける変化である。
【００１９】
変形Ａ（その亜変形を含む）、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥの組み合わせは、得られる結果の精度における改善を達成するために当業者により使用されることができる。特に、当業者は、変形Ａ１と変形Ａ２を組み合わせることを考慮することができる。
【００２０】
好ましくは、シナプス前神経筋遮断物質は、ボツリヌス神経毒素であろう。特に、当該ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素Ａ型、ボツリヌス神経毒素Ｂ型、及びボツリヌス神経毒素Ｆ型から選択することができる。より好ましくは、ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素Ａ型、及びボツリヌス神経毒素Ｂ型から選択されるであろう。特に、好ましい方法において、ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素Ａ型であり、顕著にはボツリヌス神経毒素Ａ型複合体（商業製品Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）又はＢｏｔｏｘ（登録商標）の活性成分等）であろう。
【００２１】
通常の方法において、上記方法は、低濃度（例えば、０〜１００ＬＤ50ユニット／ｍｌ、そして好ましくは０〜５０又は０〜１０ＬＤ50ユニット／ｍｌ）においてより感応性であろうが、一方、試料中に高濃度のシナプス前神経筋遮断物質が存在する場合は機能しなくてよい（電気刺激にもかかわらず筋肉組織は麻痺状態を維持する）。結果として、本発明の方法が行われる場合、試験試料は、好ましくは、少なくとも２又は３回の希釈（例えば、希釈無し、１０倍希釈、及び１００倍希釈）において調製されるであろう；当該方法において、より高濃度のシナプス前神経筋遮断物質においてもまた測定することができる。しかしながら、前述の方法の感応性は、上述の通り改善することができる。
【００２２】
本発明の好ましい遂行方法に従い、上記筋肉組織は、マウス又はラットから得られた肋骨筋肉の断片から構成されるであろう。好ましくは、当該断片は、少なくとも２ｍｍ×１０ｍｍの大きさを有するであろう。筋肉組織は、例えば、肋骨筋肉の２−肋骨切片に相当する大きさを有してよい。
【００２３】
更に好ましい本発明の遂行方法に従い、各電気刺激は、常に、筋肉組織の収縮を誘導するために必要とされる少なくとも最小電位Ｖmと同じである電位Ｖsを適用することにあり、更に、ＶsはＶmよりわずかに上の電位以下又は同じである。「Ｖmよりわずかに上の電位」は、Ｖmプラス３ボルト、Ｖmプラス２ボルト、又はＶmプラス１．５ボルトである。例えば、適用される刺激電位は、Ｖmプラス１ボルトとして選択できる。
【００２４】
本発明の更に可能な特徴は、ビデオレコーダーを併用したビデオカメラの使用を含む。それから当該作製されたフィルムを分析することができ、そして、シナプス前神経筋遮断物質の効果を正確に評価することができる。それから、試料中に存在するシナプス前神経筋遮断物質の含量は、基準に観察されたものと比較した、試料に観察される効果に由来することができる。
【００２５】
あるいは、上述の変形Ｄのために筋肉組織の収縮力を計測するために使用される圧力変換トランスデューサーは、自動リアルタイム電子データキャプチャーシステムを付随することができる。
【００２６】
結果の可変性を減少させるために、電気刺激装置は、特定の時間間隔において選択された電位Ｖsを送る。この場合、各時間は一定の効果をもたらす。これらの条件において観察される平均的な効果を使用することは、試料中に存在するシナプス前神経筋遮断物質の含量のより正確な測定を許容する。
【００２７】
上記方法のための感応性を増大させる方法は、当該方法をより長時間にわたり行うことにあり、獲得すべきより多くのデータ（例えば、少なくとも５、１０又は３０分から１、２、４、８、１２、２４、４８、７２時間又はそれ以上まで）を許容する。例えば、上記方法の変形Ｄのために、上記方法は、筋肉組織の収縮力の一定の割合における減少が計測されるまで行うことができる（例えば、１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０又は９０％の減少）。
【００２８】
当該好ましい遂行方法を行うために、筋肉組織の寿命は、前に説明されたより一般的な方法と比較して延長されることが必要である。
【００２９】
上記寿命を延長することを目的とするある特定のアプローチにおいて、酸素及びグルコース（又はＡＴＰ源）が定期的な方法において筋肉組織に供される。
【００３０】
上記を達成するための１つの方法は、一定の間隔において、グルコース（又は他のＡＴＰ源）を含有する酸素添加した生理バッファーバスを、消費した酸素及びグルコース（又は他のＡＴＰ源）を）を置き換えるために（上記間隔は、好ましくは、１分以上２４時間以内であり、例えば、１、２、５、１０、１５又は６０分毎）、新しいものと交換することである。他の方法は、バスの酸素濃度を一定に保つことを許容する、酸素が常に通気されているバスを使用することであり；更には、グルコース（又はＡＴＰ源）は、筋肉組織により消費されたグルコース（又はＡＴＰ源）を置き換えるために、定期的な間隔において添加することができる。
【００３１】
あるいは、一定のグルコース（又は他のＡＴＰ源）及び任意的な酸素レベルを保つために有利なフロースルーバスシステムを使用することができる。当該システムにおいて、グルコース（又は他のＡＴＰ源）を含有する酸素添加した生理バッファーは、筋肉組織が浸されている容器の一方で汲み入れられ、他方で汲み出される。
【００３２】
筋肉組織の寿命を延長させるための他の方法は、試料の疲労を減少させるトレインパルス刺激の使用を含む。トレインパルス刺激は、刺激が及ぼされない時間ｔp続く周期により相互から分離された時間ｔs続く刺激を意味する。当該時間ｔsは、好ましくは５０μｓ〜５００ｍｓ、より好ましくは１００μｓ〜２５０ｍｓ及びより更に好ましくは１００μｓ〜１ｍｓ（例えば、２００μｓ又は約２００μｓ）であり；時間ｔpは、好ましくは０．１〜１０ｓ、及びより好ましくは０．５及び２ｓ（例えば、１ｓ又は約１ｓ）であり；ｔs／ｔp比は、好ましくは１：２〜１：５００００、より好ましくは１：５〜１：２００００、及びより更に好ましくは１：５００〜１：１００００（例えば、約１：５０００）である。
【００３３】
また、本発明は、以下の工程を含んで成る、試料中のシナプス前神経筋遮断物質に対する中和抗体の含量の測定方法を供する：
(ｉ）筋肉組織の収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmを測定すること（上記筋肉組織は運動神経を介して電気刺激装置に結合されている）；
（ii）シナプス前神経筋遮断物質に対する中和抗体、及び測定した量の上記シナプス前神経筋遮断物質を含有する試験すべき試料混合物（上記混合体は０〜４５℃で約１５〜約１２０分間前もってインキュベートする）を添加すること、；
（iii ）少なくともＶmに等しい電位において、一定の時間間隔において筋肉組織を電気刺激すること；
（iv）当該混合物により誘導された効果と、測定した量の上記シナプス前神経筋遮断物質により誘導された効果を比較し、そして、これにより試料中のシナプス前神経筋遮断物質に対する中和抗体の含量を測定すること。
【００３４】
試料中のシナプス前神経筋遮断物質の含量を測定する方法のために前に示した全ての変形は、試料中のシナプス前神経筋遮断物質に対する中和抗体の含量を測定するための本発明の方法に修正を加えて適用することができる。
【００３５】
「約」の語は、考慮される値の中間を意味する。本出願において使用される「約Ｘ」は、ＸマイナスＸの１０％〜ＸプラスＸの１０％の中間を、そして好ましくはＸマイナスＸの５％〜ＸプラスＸの５％の中間を意味する。
【００３６】
これらは別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的語句は、本発明が属する分野における当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。同様に、本明細書において述べられる全ての刊行物、特許出願、全ての特許及び全ての他の引例は引例の方法として組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、実施例１に説明される手順に従い、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）の濃度変化（０、１、１０及び５０Ｕ）での時間の関数において計測された肋間ラット調製物の相対的な収縮距離を示す。
【図２】図２は、実施例１に説明される手順に従い、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）の濃度変化（０、１、１０及び５０Ｕ）での収縮距離から計測された肋間ラット調製物の寿命を示す。当該データは、平均値±標準誤差、ｎ＝４〜５において示される。Ｘ軸は、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）の収縮時間（ＬＤ５０ ユニット／ｍｌ）を、一方、Ｙ軸は時間（ｓ）を示す。
【図３】図３は、実施例１に説明される手順に従い、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）の濃度変化（０、１、１０及び５０Ｕ）での収縮頻度から計測された肋間ラット調製物の寿命を示す。当該データは、平均値±標準誤差、ｎ＝４〜５において示される。Ｘ軸は、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）の収縮時間（ＬＤ５０ ユニット／ｍｌ）を、一方、Ｙ軸は時間（ｓ）を示す。
【図４】図４は、スタティックバスにおいて、圧力変換トランスデューサーに付着させた２肋骨組織を示す。
【図５】図５は、スタティックシステムにおいて実施例３の直接的適用法（以下の実験ｎの数を適用する：プラセボ：ｎ＝４；５００Ｕ：ｎ＝８；１０００Ｕ：ｎ＝５；１５００Ｕ：ｎ＝１１）を使用して、プラセボ、又は５００、１０００、１５００若しくは３０００Ｕのトキシンのいずれかに暴露した２肋骨切片の最大単収縮力計測でかかった時間（ｈ）を示す。エラーバーは、±平均値標準誤差を示す。Ｘ軸は、最大単収縮力における％減少を示し、一方Ｙ軸は、時間（ｈ）を示す。
【図６】図６は、スタティックシステムにおいて実施例３の浸漬法（以下の実験ｎの数を適用する：プラセボ：ｎ＝３；３Ｕ：ｎ＝５；６Ｕ：ｎ＝２；１２Ｕ：ｎ＝２）を使用して、プラセボ、又は３、６若しくは１２Ｕのトキシンのいずれかに暴露した２−肋骨切片の最大単収縮力計測でかかった時間（ｈ）を示す。エラーバーは、±平均値標準誤差を示す。Ｘ軸は、最大単収縮力における％減少を示し、一方Ｙ軸は、時間（ｈ）を示す。
【００３８】
以下の実施例は上記を説明するために存在し、そして本発明の範囲を制限するものとして考慮してはならない。
【実施例】
【００３９】
以下の実施例において、１Ｓｐｅｙｗｏｏｄユニット又は１Ｕは、マウス中のボツリヌストキシンのメジアン腹腔内ＬＤ50用量に対応する。
【００４０】
実施例１：ボツリヌストキシン含有試料
使用される材料
ａ）使用されるバッファー溶液：
「リリーズ（Lillies）リンゲルバッファー」として後に識別される改変リンゲルバッファーは、水中で以下を希釈することにより調製される：
【表１】
【００４１】
使用の直前において、グルコース（１１ｍＭ）を、前に調製された溶液に添加し、そして９５％Ｏ2と５％ＣＯ2のガス混合体を上記バッファー溶液に通気させ、リリーズリンゲルバッファーを産出する。
【００４２】
後に言及するリン酸バッファー生理食塩水溶液（ＰＢＳ）は、Ｓｉｇｍａにより供されるタブレットを２００ｍｌの水に添加し溶解することにより調製し、当該バッファーは以下の特徴を供する。
【表２】
【００４３】
ｂ）組織の単離：
ウィスターラット（体重約２７５ｇ）を、ＣＯ2暴露（意識を失わせるために約３分間）後に、頚椎脱臼により犠牲にする。胸郭を各動物から解剖し、リリーズリンゲルバッファー中に置き、そして実験場所に運ぶ（行程時間：約１５分）。これらの胸郭は、脊柱にそって注意深く解剖することにより２つの切片に分離させる。当該組織を、実験手順を行う前に酸素添加バッファー中に保存する。
【００４４】
ｃ）筋肉の収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmの測定：
各肋間調製物（半分の胸郭）を、リリーズリンゲルバッファーを含むペトリ皿に置く。各調製物のために、約１〜２ｍｍの神経束を明らかにするために１つの肋間神経を注意深く解剖する。解剖後、上記調製物は、１０ｍｌの酸素添加リリーズリンゲルバッファーを含むペトリ皿に戻す前に、新鮮な酸素添加リリーズリンゲルバッファー中に約１５〜２０分おいて回復させることができる。解剖した肋間神経をそれから吸引電極を介して、培地中におかれた回帰（return)接触電極を有する刺激装置と接続する。細胞収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmを測定する。刺激が１０Ｖ以下に達することができない場合、他の神経を解剖し、そして接続の前に調製物を回復させる。
【００４５】
試料中に含有されるボツリヌストキシントキシンの含量の測定方法
上記神経をパルス電位（５〜９Ｖ、１Ｈｚ）で刺激し、当該選択された電位は、刺激及び筋肉収縮を達成するために必要な閾電位Ｖｍより常に１Ｖ上にする。上記切片のビデオ顕微鏡観察は、組み合わせたＴＶ／ビデオレコーダーに接続したＪＶＣ ＴＫＣ１４８１ＥＧビデオカメラを伴うＮｉｌｋｏｎ ＳＭＺ８００ステレオマイクロスコープで行う。
【００４６】
Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）（活性成分：ボツリヌストキシンＡ型）をＰＢＳ中に、直接肋間調製物（１０ｍｌのバッファー中に僅かに浸されている）上に加える。ｍｌ用量当たり５０ Ｓｐｅｙｗｏｏｄユニット（Ｕ）のために、５００Ｕのトキシンを培養皿（１０ｍｌバッファー）に添加し、５０Ｕ／ｍｌ用量の最終濃度を得る。１０Ｕ／ｍｌ用量のために、１００Ｕを、上記培養皿に添加し、１０Ｕ／ｍｌ用量の最終濃度を得る。１Ｕ／ｍｌ用量のために、１０Ｕを、上記培養皿に添加し、１Ｕ／ｍｌ用量の最終濃度を得る。プラセボ（ボツリヌストキシンが存在しないことを除き、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）と同じ組成を有する）のために、バイアル（０．２ｍｌのＰＢＳ中）の全ての内容物を培養皿に添加する。
【００４７】
データ分析
記録したビデオクリップを、ＭＰＥＧファイルに変換する。後の分析を補助するために、各ムービーを２分間のセクションにカットし、そしてこれらのセクションを、Ａｄｏｂｅ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｅｒｅ（登録商標）５．１ソフトウェアを使用して開始速度の１／２にスローにする。それから、分析は１０秒間（半分のスピードのクリップでは２０秒間）中の単収縮の回数をカウントすることにより行い、そして当該１０秒間にわたる単収縮の回数を平均化し、単収縮の頻度の値を得る。また、収縮距離は、重ねられたスケールバー（任意単位−通常６〜７ポイントスケール）を伴うムービーを再生することにより測定でき、当該データを平均化し、各１０秒間にわたる収縮距離を得ることができ、あるいは、上記距離は開始収縮距離と比較される。
【００４８】
上記実験は一定回数繰り返し（０Ｕ／ｍｌ：ｎ＝５；１Ｕ／ｍｌ：ｎ＝５；１０Ｕ／ｍｌ：ｎ＝４；５０Ｕ／ｍｌ：ｎ＝４）、そして当該結果を平均化する。
【００４９】
結果
図１から、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）濃度の関数として、相対的な収縮距離（即ち、トキシンの不存在下における収縮距離により得られたトキシンの存在下における収縮距離）が、多かれ少なかれ急速に減少されることを示す。
【００５０】
また、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）濃度の関数として観察できるように、図２は、距離単収縮寿命（即ち、当該トキシンが添加されてから、収縮距離がゼロになるまでに必要とされる時間）に関する結果が、筋肉収縮距離において用量依存的な減少を示すことが解る。
【００５１】
図３に示される通り、単収縮頻度寿命（即ち、当該トキシンが添加されてから、単収縮頻度がゼロになるまでに必要とされる時間）もまた、用量依存的な方法において、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）により減少される。
【００５２】
実施例２：α−ブンガロトキシン含有試料
実施例１のために説明した同じ手順を使用して、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）の代わりにα−ブンガロトキシンを、２１μＭ（ｎ＝３）の濃度において試験する。α−ブンガロトキシン調製物の平均単収縮寿命は、２２５ｓ（±標準誤差９３、ｎ＝３）、及び２３８ｓ（±標準誤差９３、ｎ＝３）であり、それぞれ収縮距離及び単収縮頻度から計測される。
【００５３】
実施例３：延長生命系
材料調製
ａ）使用されるバッファー溶液：
当該実施例において使用される改変リンゲルバッファー又は「リリーズリンゲルバッファー」は１リットルの水に以下を希釈することにより調製される：
ゼラチン ２ｇ
ＮａＨＰＯ4，２Ｈ2Ｏ １０ｇ
【００５４】
ｂ）組織の単離：
オスのウィスターラット（約２３０〜３００ｇ）を、ＣＯ2暴露（意識を失わせるために約３分間）後に、頚椎脱臼により犠牲にする。胸郭を各動物から解剖し、リリーズリンゲルバッファー中に置き、そして実験場所に運ぶ（行程時間：約２０分）。これらの胸郭は、脊柱及び胸骨にそって注意深く解剖することにより２つの切片に分離させる。実験手順の前に、２つの半分の胸郭を約３００ｍｌの継続的に酸素添加したリリーズリンゲルバッファー中に少なくとも３０分間保存する。
【００５５】
ｃ）筋肉の収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmの測定：
１つの半分の胸郭を、約１０ｍｌのリリーズリンゲルバッファーを含むペトリ皿に置き、約１〜２ｍｍの神経束を明らかにするように１つの肋間神経を注意深く解剖する。それから、当該神経を、吸引電極を介して培地中におかれた回帰（return)接触電極を有する刺激装置(Grass Instruments Model S48)と接続する。細胞収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmを測定する。刺激が１０Ｖ（１Ｈｚ、２００μ秒持続時間）以下に達することができない場合、他の神経を解剖する。神経を有する２−肋骨切片を半分の胸郭から解剖し、圧力変換トランスデューサーに後で付着するための２つの肋骨の端のいずれかを残せる程度に過剰な筋肉組織を確保する。
【００５６】
ｄ）圧力変換トランスデューサーへの付着：
図４に示されるスタティックバスシステムに関して、３つの金属ステーブルが、２つの肋骨のいずれかの端上の非刺激筋肉組織に付着された。２−肋骨切片（５）の一方の端は、３つのステーブルを介して、固定した脚（４）に付着させ、他の端は自由な脚に付随させた。上記固定した脚は、その場所にしっかりと固定し、一方自由な脚は、約４ｃｍの綿針（７）を介して、圧力変換トランスデューサー(1 ; Grass Instruments Model FT03)に付着させた。当該固定された組織を約５００ｍｌのリリーズリンゲルバッファーに浸し、そして回帰電極（２）を当該バッファー中に置いた。解剖した肋間神経を、（正）吸引電極（３）を介して、刺激装置に接続した。また、図４に示された当該システムは、ＣＯ２／Ｏ２ガス入り口（６）を含む。
【００５７】
試料中に含まれるボツリヌストキシンの含量の測定方法
上記２−肋骨組織切片を、連続パルス刺激を使用して（毎回３０秒間の最初の５秒間は１パルス／秒）、約９０分間、１５Ｖ、２００μ秒持続時間で刺激する。
【００５８】
所望されるトキシンの濃度は、適用の直前にＧＰＢ中で再構成させる。当該トキシン伝達は以下２つの方法のひとつを介する：
Ａ）直接的適用−上記２−肋骨切片を、組織バス中のいくらかのバッファーを除去することにより、空気／液体界面に暴露させる。ハミルトンシリンジを使用して、トキシンを滴下法において、暴露した組織に直接的に適用する。オリジナルリンゲルバッファーでカバーする前に、トキシンを取り込むことができるように、上記組織を更に１５分間暴露したままにする。必要であれば、いずれかの取り外された、解剖された神経を吸引電極に再接続させる。
Ｂ）浸漬−ハミルトンシリンジを使用して、トキシンを、２−肋骨切片に近接する（但し、直接その上ではない）組織バスに直接的に適用する。
【００５９】
圧力変換トランスデューサーから記録された単収縮力の読みは、Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＣ／ＤＣ ストレインゲージ増幅器(Model P122)を通して増幅させ、それから、シグナルは、Ｇｒａｓｓ ＰｏｌｙＶＩＥＷTMソフトウェアを使用して記録される。
【００６０】
データ分析
記録されたトレースから、一定のパーセンテージにより減少させるように、初期の最大単収縮力計測にかかった時間（トキシン／プラセボの添加後）を計測した。当該実験は、一定の回数繰り返す（直接的適用法：プラセボ：ｎ＝４；５００Ｕ：ｎ＝８；１０００Ｕ：ｎ＝５；１５００Ｕ：ｎ＝１１；浸漬法：プラセボ：ｎ＝３；３Ｕ／ｍｌ：ｎ＝５；６Ｕ／ｍｌ：ｎ＝２，１２Ｕ／ｍｌ：ｎ＝２）。プラセボ及び低レベルのトキシンに暴露した場合の組織の長い寿命のために、単収縮力における９０％減少において示された値は、一定の減少速度と仮定するデータの推定に基づく結果が予想される。
【００６１】
結果
Ａ）直接的適用法
図５において示されるように、時間による単収縮力の計測におけるゆっくりとした減少は、プラセボの添加後を含む全ての試料において記録される。プラセボの暴露後、約１２時間後に、最大単収縮力における５０％減少が観察される。比較において、１５００Ｕのトキシンに暴露されたこれらの組織試料中、単収縮はより急速に減少され、約５時間後、５０％減少に達する。
【００６２】
Ｂ）浸漬法
図６において示されるように、単収縮力計測における減少は、プラセボの添加後に記録され、約２０時間後に最大単収縮力における５０％減少が観察された。３ユニット／ｍｌのトキシン溶液中の組織の浸漬は、単収縮力の５０％減少に達する１３時間の刺激後に、単収縮力の速度を更に増加させた。より高いトキシン濃度では、用量依存型応答は、更に明らかである。
【００６３】
理解されるように、反復可能な用量依存型トキシン誘導性の筋肉収縮の抑制は、トキシン伝達の直接適用法及び浸漬法の両方を使用して観察される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のシナプス前神経筋遮断物質の含量の測定方法であって、以下の行程：
（ｉ）筋肉組織の収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmを測定すること、ここで、上記筋肉組織は運動神経を介して電気刺激装置に結合されている；
（ii）シナプス前神経筋遮断物質を含む試料を添加すること；
（iii ）少なくともＶmに等しい電位において、一定の時間間隔において筋肉組織を電気刺激すること；
（iv）当該試料により誘導された効果と、基準物質により誘導された効果を比較し、そして、これにより試料中のシナプス前神経筋遮断物質の含量を測定すること；
を含んで成る方法。
【請求項２】
上記筋肉組織がバッファー中に浸漬される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記バッファーが生理バッファーである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記バッファーがエネルギー源を含んで成る、請求項２又は請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記エネルギー源がＡＴＰエネルギー源である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記バッファーが酸素添加される、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
上記バッファーがグルコースを含む酸素添加した生理バッファーである、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の行程（iii ）における電気刺激が、少なくとも過最大電位ＶSMと等しい電位において行われる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
上記誘導される効果が、筋肉組織の麻痺に対する時間である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
上記誘導される効果が、筋肉組織の収縮速度における変化である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
上記誘導される効果が、筋肉組織の収縮距離における変化である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記誘導される効果が、筋肉組織の収縮力における変化である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
上記誘導される効果が、筋肉組織の終板電位、又は微小終板電位における変化である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の行程（iii ）における電気刺激が、刺激が及ぼされない時間ｔp持続する周期により相互から分離された時間ｔs持続する刺激を含んで成り、上記時間ｔsが５０μｓ〜５００ｍｓであり、上記時間ｔpが０．１〜１０ｓであり、そしてｔs／ｔp比が１：２〜１：５００００である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
上記シナプス前神経筋遮断物質がボツリヌストキシンである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
上記ボツリヌストキシンが、ボツリヌストキシンＡ型、ボツリヌストキシンＢ型、及びボツリヌストキシンＦ型から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記ボツリヌストキシンが、ボツリヌストキシンＡ型、及びボツリヌストキシンＢ型から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記ボツリヌストキシンがボツリヌストキシンＡ型である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記シナプス前神経筋遮断物質がブンガロトキシンである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
上記ブンガロトキシンが、α−ブンガロトキシンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
試料中のシナプス前神経筋遮断物質に対する中和抗体の含量の測定方法であって、以下の行程：
(ｉ）筋肉組織の収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmを測定すること、ここで、上記筋肉組織は運動神経を介して電気刺激装置に結合されている；
（ii）シナプス前神経筋遮断物質に対する中和抗体、及び測定した量の上記シナプス前神経筋遮断物質を含有する試験すべき試料混合物を添加すること、ここで、上記混合物は０〜４５℃で約１５〜約１２０分間前もってインキュベートされている；
（iii ）少なくともＶmに等しい電位において、一定の時間間隔において筋肉組織を電気刺激すること；
（iv）当該混合物により誘導された効果と、測定した量の上記シナプス前神経筋遮断物質により誘導された効果を比較し、そして、これにより試料中のシナプス前神経筋遮断物質に対する中和抗体の含量を測定すること；
を含んで成る方法。
【請求項２２】
上記誘導される効果が筋肉組織の収縮力の変化である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記シナプス前神経筋遮断物質がボツリヌストキシンである、請求項２１又は請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記ボツリヌストキシンがボツリヌストキシンＡ型である、請求項２３に記載の方法。
【請求項１】
試料中のシナプス前神経筋遮断物質の含量の測定方法であって、以下の行程：
（ｉ）筋肉組織の収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmを測定すること、ここで、上記筋肉組織は運動神経を介して電気刺激装置に結合されている；
（ii）シナプス前神経筋遮断物質を含む試料を添加すること；
（iii ）少なくともＶmに等しい電位において、一定の時間間隔において筋肉組織を電気刺激すること；
（iv）当該試料により誘導された効果と、基準物質により誘導された効果を比較し、そして、これにより試料中のシナプス前神経筋遮断物質の含量を測定すること；
を含んで成る方法。
【請求項２】
上記筋肉組織がバッファー中に浸漬される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記バッファーが生理バッファーである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記バッファーがエネルギー源を含んで成る、請求項２又は請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記エネルギー源がＡＴＰエネルギー源である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記バッファーが酸素添加される、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
上記バッファーがグルコースを含む酸素添加した生理バッファーである、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の行程（iii ）における電気刺激が、少なくとも過最大電位ＶSMと等しい電位において行われる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
上記誘導される効果が、筋肉組織の麻痺に対する時間である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
上記誘導される効果が、筋肉組織の収縮速度における変化である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
上記誘導される効果が、筋肉組織の収縮距離における変化である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記誘導される効果が、筋肉組織の収縮力における変化である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
上記誘導される効果が、筋肉組織の終板電位、又は微小終板電位における変化である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の行程（iii ）における電気刺激が、刺激が及ぼされない時間ｔp持続する周期により相互から分離された時間ｔs持続する刺激を含んで成り、上記時間ｔsが５０μｓ〜５００ｍｓであり、上記時間ｔpが０．１〜１０ｓであり、そしてｔs／ｔp比が１：２〜１：５００００である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
上記シナプス前神経筋遮断物質がボツリヌストキシンである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
上記ボツリヌストキシンが、ボツリヌストキシンＡ型、ボツリヌストキシンＢ型、及びボツリヌストキシンＦ型から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記ボツリヌストキシンが、ボツリヌストキシンＡ型、及びボツリヌストキシンＢ型から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記ボツリヌストキシンがボツリヌストキシンＡ型である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記シナプス前神経筋遮断物質がブンガロトキシンである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
上記ブンガロトキシンが、α−ブンガロトキシンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
試料中のシナプス前神経筋遮断物質に対する中和抗体の含量の測定方法であって、以下の行程：
(ｉ）筋肉組織の収縮を誘導するために必要な最小電位Ｖmを測定すること、ここで、上記筋肉組織は運動神経を介して電気刺激装置に結合されている；
（ii）シナプス前神経筋遮断物質に対する中和抗体、及び測定した量の上記シナプス前神経筋遮断物質を含有する試験すべき試料混合物を添加すること、ここで、上記混合物は０〜４５℃で約１５〜約１２０分間前もってインキュベートされている；
（iii ）少なくともＶmに等しい電位において、一定の時間間隔において筋肉組織を電気刺激すること；
（iv）当該混合物により誘導された効果と、測定した量の上記シナプス前神経筋遮断物質により誘導された効果を比較し、そして、これにより試料中のシナプス前神経筋遮断物質に対する中和抗体の含量を測定すること；
を含んで成る方法。
【請求項２２】
上記誘導される効果が筋肉組織の収縮力の変化である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記シナプス前神経筋遮断物質がボツリヌストキシンである、請求項２１又は請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記ボツリヌストキシンがボツリヌストキシンＡ型である、請求項２３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−２５４８２５（Ｐ２０１１−２５４８２５Ａ）
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１６００５３（Ｐ２０１１−１６００５３）
【出願日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【分割の表示】特願２００６−５０２３１１（Ｐ２００６−５０２３１１）の分割
【原出願日】平成１６年２月２０日（２００４．２．２０）
【出願人】（５１０１８６０１８）イプセン バイオファーム リミティド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６００５３（Ｐ２０１１−１６００５３）
【出願日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【分割の表示】特願２００６−５０２３１１（Ｐ２００６−５０２３１１）の分割
【原出願日】平成１６年２月２０日（２００４．２．２０）
【出願人】（５１０１８６０１８）イプセン バイオファーム リミティド (2)
【Ｆターム（参考）】
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