ボルデテラ属菌産生壊死毒素のトキソイドおよび該トキソイドを含む混合ワクチン
【課題】壊死毒素の調製方法、並びにボルデテラ属菌が産生する壊死毒素の改良されたトキソイド及びそのパスツレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドとの混合トキソイドを提供する。
【解決手段】ボルデテラ・ブロンキセプティカ（気管支敗血症菌）が産生する壊死毒素の含有液を、直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルにヘパリン、スルフォプロピル基もしくは分子内にスルフォン基を有するブルー色素が結合されたゲルに接触せしめ、当該壊死毒素を吸着させた後、吸着した壊死毒素をゲルから溶出することによって得られる部分精製壊死毒素、あるいは当該部分精製壊死毒素を他の精製方法と組み合わせてさらに高純度に精製したボルデテラ・ブロンキセプティカ壊死毒素のトキソイド、およびパスツレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドを主成分とする混合ワクチン。
【解決手段】ボルデテラ・ブロンキセプティカ（気管支敗血症菌）が産生する壊死毒素の含有液を、直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルにヘパリン、スルフォプロピル基もしくは分子内にスルフォン基を有するブルー色素が結合されたゲルに接触せしめ、当該壊死毒素を吸着させた後、吸着した壊死毒素をゲルから溶出することによって得られる部分精製壊死毒素、あるいは当該部分精製壊死毒素を他の精製方法と組み合わせてさらに高純度に精製したボルデテラ・ブロンキセプティカ壊死毒素のトキソイド、およびパスツレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドを主成分とする混合ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、豚の伝染性疾患に対する予防薬に関する。さらに詳細には、改良されたボルデテラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドおよびそのパスツレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドとの混合トキソイド並びに該トキソイドの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
萎縮性鼻炎（以下、ＡＲと略称することがある）は豚の慢性呼吸器病で、鼻甲介萎縮、発育遅延、鼻出血、鼻曲がり及び他の呼吸器病の誘発等を主徴とする伝播力の極めて強い疾病である。本病の起因菌としては、毒素原性気管支敗血症菌（以下、Ｂｂと略称することがある）及び毒素原性パスツレラ・マルトシーダ（以下、Ｐｍと略称することがある）が認められており、上部気道粘膜に感染する。Ｂｂは定着因子である赤血球凝集素や線毛を保有しているため鼻粘膜に対する定着性が強いが、それを保有しないＰｍは単独で定着することが困難である。そのため、Ｐｍの感染が成立するためには予め鼻粘膜を障害する因子の存在が必要である。その最も代表的な因子がＢｂであり、鼻粘膜障害に関与する病原性因子として、気管細胞毒素や壊死毒素が知られている。実験感染では、子ブタに対しＢｂ、続いて数日後にＰｍを鼻内感染させることにより野外農場で観察されるような重篤なＡＲを再現することができる。
【０００３】
ボルデテラ属菌には、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌、ボルデテラ・アビウム等があり、これらは種々の生物学的活性物質を産生する。Ｂｂ壊死毒素（以下、ＢｂＴと略称することがある）はこれらの生物学的活性物質の１つであり、いずれのボルデテラ属菌もＢｂＴを産生する。ＢｂＴは出血壊死作用、鼻甲介萎縮作用、発育遅延作用、致死作用、血管平滑筋収縮作用、局所の血行障害、脾臓萎縮作用および抗体産生阻害作用などの生物学的活性を有し、ボルデテラ属菌による発症において重要な役割を演じていることが明らかになった。さらに、ＢｂＴはＢｂによる子豚の肺炎病巣形成にも重要な役割を演じていることが明らかにされた(非特許文献１)。
【０００４】
一方、パスツレラ・マルトシーダの一部あるいは非定型的パスツレラの一部の菌株は、Ｐｍ壊死毒素（以下、ＰｍＴと略称することがある）を産生する。ＰｍＴは出血壊死作用、鼻甲介萎縮作用、発育遅延作用、致死作用、局所の血行障害および脾臓萎縮作用などの生物学的活性を有し、毒素原性Ｐｍによる発症において重要な役割を演じていることが明らかにされている。また、ＰｍＴは毒素原性Ｐｍによる豚の肺炎病巣形成において密接に関係していることが明らかになった(非特許文献２)。ＢｂＴおよびＰｍＴはいずれも培地中に産生されず菌体内に蓄積されるが、長期間培養による溶菌に伴って菌体内から培養上清に遊離する。生体内においては溶菌に伴って菌体内から遊離した壊死毒素が作用する。
【０００５】
従来知られている細菌由来の壊死毒素含有液、とりわけボルデテラ菌菌体抽出液からの壊死毒素の部分精製方法としてはイオン交換クロマトグラフィーによる方法がある(非特許文献３)。しかしながら、この方法は再現性に乏しい欠点がある。また、同様に壊死毒素の部分精製例として、透析、ショ糖密度勾配超遠心分離及びゲルろ過クロマトグラフィーに基づく方法がある(非特許文献４)が、この方法は再現性に乏しく、さらに、工程が多いにもかかわらず精製度があまり高くないという欠点がある。
【０００６】
他の例として、核酸除去剤処理及び陰イオン交換クロマトグラフィー及びハイドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーによる方法がある(非特許文献５)。しかしながら、この方法は核酸除去剤のような高価な試薬を必要とし、工程が多い欠点がある。また、核酸除去剤、透析及び陽イオン交換クロマトグラフィーによる方法もある(非特許文献６)が、この方法は再現性が高く比較的高純度の壊死毒素が得られるものの、前記方法と同様、高価な試薬を必要とする欠点がある。
【０００７】
さらに別の例として、塩析及び色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーによる方法がある(非特許文献７)が、この方法は再現性は高いものの精製度があまり高くないという欠点がある。
【０００８】
従来報告されたＡＲ不活化ワクチンにはＢｂ単味、Ｐｍ単味並びにＢｂ、Ｐｍ混合不活化ワクチンの３種類があり研究あるいは実用化されている。
【０００９】
Ｂｂ不活化ワクチンとしては、ホルマリンやグルタールアルデヒド等で不活化された死菌にアルミニウムゲルや油性アジュバントを加えたものがある(非特許文献８、非特許文献９および非特許文献１０)。また、Ｂｂの外膜に存在しアデニールサイクラーゼ活性を有する６８ｋＤaの蛋白に萎縮性鼻炎の防御効果のあることが明らかにされている(非特許文献１１)。さらに、Ｂｂ菌の産生する線維状赤血球凝集素を主成分とするコンポーネントワクチンが存在する(非特許文献１２および非特許文献１３)。抗毒素を与える目的で壊死毒素を加えたワクチンは効果を得ていないという報告もある(非特許文献１４および非特許文献１５)。
【００１０】
一方、Ｐｍの不活化単味ワクチンとしては、ＰｍＴトキソイド(非特許文献１６および非特許文献１７)が研究あるいは実用化されている。
【００１１】
さらに、Ｂｂ及びＰｍの混合不活化ワクチンとしては、（１）ＡＲの予防のみを目的とするためＢｂとＰｍD型のＰｍＴ産生株の死菌を混合したもの、これらにＰｍＴ非産生株を加えたもの、あるいはＢｂとＰｍＴトキソイドを混合したもの(非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０および非特許文献２１)、（２）ＡＲと肺炎予防を目的とするため、ＢｂとＰｍＤ型のＰｍＴ産生株、ＰｍＡ型の死菌を混合したもの(非特許文献２２)、（３）ＡＲと肺炎に加えて他の疾病の予防も目的とするためＢｂ、ＰｍＡ型株、豚丹毒菌の死菌にＰｍＴトキソイドを加えたものが実用化されている(非特許文献２３)。
【００１２】
ところで、Roop II，R.M.らはＢｂＴがＢｂ感染による豚の鼻甲介萎縮や肺炎病巣形成に重要な役割を演じていることから、ＢｂＴトキソイドの必要性を指摘している(非特許文献１)。しかし、ＢｂＴとＰｍＴトキソイドとの混合化に関しては全く言及していない。また、Chanter，N.らはＢｂＴ及びＰｍＴの共同作用による豚鼻粘膜障害がＢｂ及びＰｍの増殖に好ましい環境を形成することから、Ｂｂの重要な成分を含有するＰｍＴトキソイドがより効果的であることを提案している（非特許文献２４)。
【００１３】
しかし、これまでのところ、単にＢｂＴ活性を有する画分からなるワクチンではＢｂＴ中和抗体を上昇させることに成功していない(非特許文献１４、非特許文献１５)。
【００１４】
一方で、中井らは高度に精製したＢｂＴトキソイドを用いてブタ及びマウスに中和抗体の上昇することを明らかにした（非特許文献２５)。しかし、彼らも当該ＢｂＴトキソイドとＰｍＴトキソイドとの混合化に関しては全く触れていない。
【非特許文献１】Roop II,R.M．ら、Infection and Immunity，５５,ｐ.２１７〜２２２(１９８７)
【非特許文献２】Iwamatsu, S.およびSawada, T.、Japanese Journal of Veterinary Science, ５０, ｐ.１２００〜１２０６(１９８８)
【非特許文献３】Kume，K.ら，Infection and Immunity, ５２(４), ｐ.３７０〜３７７(１９８６)
【非特許文献４】Endoh，M.ら，Microbiology and Immunology, ３０,(７), ｐ.６５９〜６７３(１９８６)
【非特許文献５】Horiguchi，Y.ら、Microbial Pathogenesis, ６, ｐ.３６１〜３６８(１９８９)
【非特許文献６】Horiguchi，Y.ら、FEMS Microbiology Letters, ６６, ｐ.３９〜４４(１９９０)
【非特許文献７】Zhang Y. L.およびSekura R. D.、Infection and Immunity, ５９(１０), ,ｐ.３７５４〜３７５９(１９９１)
【非特許文献８】Goodnow, R. A.、Veterinary Medicine Small Animal Clinician, ７２, ｐ.１２１０〜１２１２(１９７７)
【非特許文献９】Nakase，Y.ら、Proceedings of International Pig Veterinary Society Congress, ８,(１９７６)
【非特許文献１０】Giles, C. J.およびSmith, I. M.、Veterinary Bulletin (London), ５３, ｐ.３２７〜３３８(１９８３)
【非特許文献１１】Montaraz J. A.ら、Infection and Immunity, ４７, ｐ.７４４〜７５５(１９８５)
【非特許文献１２】Hansen, G. R.ら、In Atrophic rhinitis in pigs (Peterson, K. B.およびNielsen, N.C.編）Communication of the European Communities，Luxembourg, ｐ.８９〜９７(１９８３)
【非特許文献１３】Ohgitani, T.ら、Vaccine, ９, ｐ.６５３〜６５８(１９９１)
【非特許文献１４】Soderlind, O.およびBergstrom, G.，Proceedings of International Pig Veterinary Science Congress, ｐ.１７５(１９８４)
【非特許文献１５】Marel, C. M. von der.ら、Proceedings of International Pig Veterinary Science Congress, ｐ.１７０(１９８４)
【非特許文献１６】Pedersen, K. B.およびBarfod, K.、Nordish Veterina Medicine, ３１, ｐ.２９３〜３０２(１９８２)
【非特許文献１７】Foged, N. T.ら、ヴェテリナリー レコード:Veterinary Record, １２５, ｐ.７〜１１(１９８９)
【非特許文献１８】Barfod, K.およびPedersen,K. B.、Nordish Veterina Medicine, ３６, ｐ.３３７〜３４５(１９８４)
【非特許文献１９】Baalsrud, K. J.、Acta Veterina Scandinavia., ２８, ｐ.３０５〜３１１(１９８７)
【非特許文献２０】de Jong, M. F.ら、Veterinary Quarterly, ９, ｐ.４９〜５９(１９８７)
【非特許文献２１】Kobisch, M.およびPennings, A.、Veterinary Record, １２４, ｐ.５７〜６１(１９８９)
【非特許文献２２】Ostle, A. G.ら、Veterinary Medicine, ｐ.７７２〜７７５(１９８６)
【非特許文献２３】Jayappa, H.ら、International Pig Veterinary Society Congress, ｐ.４４(１９８８)
【非特許文献２４】Chanter, N.ら、Research Veterinary Science, ４７, ｐ．４８〜５３(１９８９)
【非特許文献２５】第111回日本獣医学会講演要旨集，ｐ.１８３(１９９１)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述の状況下、壊死毒素の生体防御における役割についてはなお不明な点があり、これらを解明していく上での壊死毒素を大量に調製する方法の開発、ならびに疾病予防のための壊死毒素のトキソイドの開発が望まれている。しかし、壊死毒素は熱に対し不安定で精製が進むにつれて自己凝集しやすくなったり、脂質、酸性蛋白質および疎水性物質等の菌体由来物質と複合体を形成するなどの性質のため精製が困難といった問題点があった。
また、前記ＢｂＴとＰｍＴは生物学的活性は類似しているものの、免疫学的に交差しないことが明らかにされており、このようなことから、獣医療上、養豚産業上安全かつ有効なＢｂＴ・ＰｍＴ混合トキソイドの開発が切望されている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、壊死毒素の効率的な精製方法を見い出すべく種々検討を重ねた結果、（１）壊死毒素含有溶液例えばボルデテラ属菌菌体抽出物を、セルロース硫酸エステルゲル、ヘパリン固定化吸着ゲルもしくは硫酸化アルキル基固定化吸着ゲル等で例示される直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを用いてクロマトグラフィーを行なうことにより内毒素含有量の少ない部分精製壊死毒素が簡単にしかも比較的高い回収率で得られること、（２）上記直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを用いて部分精製した壊死毒素をさらに透析、陽イオン交換クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーを実施することにより高純度の壊死毒素が簡単に、しかも比較的高回収率で得られること、（３）直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを用いて部分精製した壊死毒素が未精製のボルデテラ属菌菌体抽出物中壊死毒素に比べ免疫応答が大幅に改善されることの知見を得た。
【００１７】
さらに、本発明者らは、ボルデテラ属菌菌体抽出物を直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルに接触せしめ、壊死毒素を吸着させ、夾雑物質と分離し、ゲルから溶出することにより得られた壊死毒素画分を化学的に減毒したものが豚において安全かつ萎縮性鼻炎の予防に有効であることを確認し本発明を完成するに至った。
【００１８】
豚に対してＰｍの感染が成立するためには予め豚鼻粘膜を障害する因子としてのＢｂの前感染が必要である。ＢｂＴ抗毒素による免疫をブタに行なった場合、Ｂｂ及びＰｍの攻撃によりＰｍの鼻粘膜定着並びに鼻甲介萎縮を軽減できる。しかし、個体間で効果に大きな差が認められることから、ＡＲ不活化ワクチンの成分としてＢｂＴトキソイドのみでは不十分であることが判明した。
【００１９】
本発明者らは、上述の知見を基に混合トキソイドを開発すべく鋭意検討を重ねた結果、ボルデテラ属菌菌体抽出物をセルロース硫酸エステルゲル等を用いて比活性３７,０００MND/mg蛋白以上に精製した毒素に由来するトキソイドと毒素原性Ｐｍ産生ＰｍＴに由来するトキソイドを混合することにより得られる混合トキソイドが、豚において安全かつ萎縮性鼻炎の予防に有効であることを確認し、本発明の第二の態様である混合トキソイドを供するに至った。
【００２０】
なお、本発明において使用される最少壊死毒単位(ＭＮＤ)とは、リポポリサッカライド(大腸菌、血清型０111:Ｂ４由来など)１μg/ml存在下でモルモット皮内に注射され１日後に直径５ｍｍ以上の壊死斑を形成する最少毒素量を１ＭＮＤと定義される量に基づくものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、壊死毒素含有液をセルロース硫酸エステル等の直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルに接触せしめ、壊死毒素を吸着させた後、ゲルから溶出することを特徴とする壊死毒素の部分精製方法を提供する。また、前記壊死毒素の部分精製方法によって得られたＢｂＴに由来するＢｂＴのトキソイド、並びに該ＢｂＴトキソイドと毒素原性Ｐｍ産生ＰｍＴに由来するトキソイドを混合することにより得られる、豚において安全かつ萎縮性鼻炎の予防に有効な混合トキソイドを提供するものである。
【００２２】
本発明において、出発材料である壊死毒素含有液とは、Ｂｂ、百日咳菌、パラ百日咳菌及びボルデテラ アビウムの菌体抽出液を含む。または、遺伝子組換え技術によりＢｂＴを発現させた細胞抽出液も本発明の出発材料として含まれる。
【００２３】
本発明において好ましい抽出液は、Ｂｂの菌体抽出液であり、Ｂｂをボルデ・ジャング培地、マッコンキー培地などの寒天培地あるいはペプトン培地(Horiguchi, Y.ら,マイクロバイアル パソジェネーシス：Microb. Pathogen., ６,ｐ.３６１〜３６８(１９８９))、コーエン・ウィラー培地、ステナー・ショルテ培地などの液体培地にて、常法により静置培養または振盪培養もしくは通気撹拌培養する。寒天培養菌は、コーンラージ棒等でセルロース硫酸エステルゲルの開始緩衝液に浮遊する。液体培養菌は、遠心分離により菌体を回収し、セルロース硫酸エステルゲルの開始緩衝液に浮遊する。
【００２４】
この菌体浮遊液について、Kume, K.らの方法(インフェクション アンド イムニティー:Infect. Immun. ５２(4), ｐ.３７０〜３７７(１９８６))、Endoh, M.らの方法(マイクロバイオロジー アンド イムノロジー:Microbial. Immunol., ３０(7), ｐ.６５９〜６７３(１９８６))、Horiguchi, Y.らの方法(マイクロバイアル パソジェネーシス:Microbial Pathogen., ６, ｐ.３６１〜３６８(１９８９)あるいはFEMSマイクロバイオロジー レターズ:FEMS Microbiol. Letters, ６６, ｐ.３９〜４４(１９９０))、Zhang Y. L.およびSekura R. D．の方法(インフェクション アンド イムニティー:Infect. Immun., ５９(10), ｐ.３７５４〜３７５９(１９９１))によって、またはセルロース硫酸エステルゲル等の直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを用いた吸着クロマトグラフィーにより精製を行なうことができるが、本発明においては、直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを用いた吸着クロマトグラフィーによる精製を実施することを最適な態様とする。
【００２５】
この菌体浮遊液を超音波処理、酵素処理、プレス処理、凍結融解の繰り返し等を行なうことにより菌体を破壊し、遠心分離あるいは膜ろ過により菌体残渣を除去する。この菌体抽出物の形であるいは核酸除去剤、塩析、超遠心分離等の前段部分精製処理後に本発明の方法に供される。本発明の方法によれば、前段部分精製処理をあえて行なう必要はなく、菌体抽出液をそのまま硫酸基を有する分子をリガンドとする吸着ゲルあるいは直接硫酸化された吸着ゲルを用いた吸着クロマトグラフィーに付すことができ、工程がきわめて簡便となる。
【００２６】
本発明で用いられる直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルについては以下のものが例示される。
【００２７】
直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルとは、セルロースなどのクロマト担体ゲルが、ピリジンなどの有機溶媒の存在下、クロルスルホン酸、無水硫酸などの硫酸化剤の作用により例えばエステル結合を介してクロマト担体ゲルそのものに直接硫酸基が導入されたものを意味し、結晶セルロースまたは結晶領域および非結晶領域セルロースなどからなる球状セルロースに硫酸エステルが導入されたセルロース硫酸エステルのゲルはその代表である。この場合、得られたセルロース硫酸エステルは原料の形状を保持し、水性溶媒に不溶性であり、物理的安定性に優れ、クロマトグラフィー用ゲルとして好適である。これらの原料セルロース類はすでに市販されており、例えばアビセル(旭化成工業社製)、セルロファインＧＣ−１５、同ＧＨ−２５、同ＧＣ−１００、同ＧＣ−２００(チッソ社製)などがある。原料セルロースを前記の方法で硫酸化することもできるし、そのなかのいくつかは硫酸化セルロースとして例えば「硫酸化−セルロファイン」の販売名(チッソ社製)で市販されている。
【００２８】
硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルとは、架橋セルロース、架橋デキストランもしくは架橋アガロースゲルなどの天然高分子重合体または親水性ビニルポリマーもしくはスチレンジビニルベンゼン共重合体などの人工高分子重合体からなるクロマト担体ゲルに、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンであるヘパリン、硫酸化アルキル基の一種であるスルフォプロピル基またはスルフォン基を有するブルー色素などがＣＮＢｒ法などの方法で共有結合的に結合されているものを意味し、すでに数多くのものが市販されている。ヘパリン結合クロマト担体ゲルとしては、「ヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ」(ファルマシア社)、「アフィゲルヘパリンゲル」(バイオラッド社)、「ヘパリンセルロファイン」(生化学工業社)など、ブルー色素結合クロマト担体ゲルとしては「アフィゲルブルーゲル」(バイオラッド社)、「ＡＦ−ブルートヨパール」(東ソー社)、「ブルーセルロファイン」(生化学工業社)など、さらにスルフォプロピル基結合クロマト担体ゲルとしては「ＳＰ−セファデックス」(ファルマシア社)、「ＳＰ−トヨパール６５０Ｍ」(東ソー社)などが例示される。
【００２９】
本発明において、硫酸基を有する分子をリガンドとする吸着ゲルあるいは直接硫酸化された吸着ゲルを用いて壊死毒素含有液とりわけボルデテラ属菌菌体抽出液中の壊死毒素を精製採取するにあたっては、以下の方法で実施する。ここでは、好適な実施態様であるセルロース硫酸エステルゲルを用いた例について概説するが、他のゲルの場合も同様の条件下で実施することができる。
【００３０】
セルロース硫酸エステルゲルを、予め、例えば０〜０.２Ｍ塩化ナトリウム添加０.０２Ｍリン酸緩衝液等の中性付近のｐＨ値(ｐＨ７〜９)であり、適当な比電導度、すなわちゲルクロマトグラフィーにおける洗浄、溶出の際の一定の基準となる比電導度(その範囲はゲルの種類によっても若干異なるが、通常、２０mS/cm以下、一般的には３〜２０mS/cm、より一般的には５〜２０mS/cmの範囲にある)またはそれ以下の比電導度を有する緩衝液にて平衡化した後に、壊死毒素の吸着操作に供する。セルロース硫酸エステルゲルへの壊死毒素の吸着、ゲルの洗浄、壊死毒素の溶出等一連の精製操作は、バッチ法およびカラム法等の工業的に通常よく用いられる操作方法で行なう。バッチ法で行なう場合は、ボルデテラ属菌菌体抽出液中にセルロース硫酸エステルを投入し、ｐＨ７.０〜９.０程度の範囲において０〜３０℃程度の温度にて１０〜６０分程度緩く撹拌して壊死毒素を吸着させる。この際、ボルデテラ属菌菌体抽出液の比電導度が上記所定の範囲、一般的に３〜２０mS/cmの範囲、またはそれ以下となるように、適宜濃縮または希釈して吸着操作に付す。
【００３１】
吸着終了後、抽出物・ゲル混合液をろ過器上に充填し、吸引ろ過してゲルとろ液を分離する。分離したゲルを、上記所定の範囲の比電導度(一般的には３〜２０mS/cm程度)またはそれ以下で、ｐＨが５〜１０程度である適当な緩衝液、例えば、０.１Ｍ塩化ナトリウム添加０.０２Ｍリン酸緩衝液等を注ぎ吸引して洗浄する。この後、ｐＨが５〜１０程度で、比電導度が上記所定の範囲の比電導度以上で、一般的には１３０mS/cm以下のもの(好ましい範囲は、例えば２２〜４６mS/cm程度）である適当な緩衝液、０.２〜０.５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着している壊死毒素を溶出する。
【００３２】
カラム法にて本発明方法を実施する場合は原材料、洗浄用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はバッチ法の場合と同様でよく、これらの通液速度は、１０ml/cm2/hr〜５００ml/cm2/hr程度に調整して行なうことが推奨される。
【００３３】
本発明の精製方法によれば、壊死毒素含有液中の壊死毒素に対する特異的吸着能に優れ、壊死毒素の精製度は数１０倍〜１１０倍に達し、しかも壊死毒素の回収率は４０％〜１００％と良好である。発熱やショック等副作用の原因物質で壊死毒素とともに菌体破砕抽出液中に大量に含まれる内毒素はセルロース硫酸エステルゲルに吸着しないため、１／３０〜１／８００量に低減される。得られた精製壊死毒素の比活性が４×１０5〜３×１０6MND/mg蛋白と高く、ＳＤＳ-ポリアクリルアミド電気泳動分析において主要バンドを形成する。
【００３４】
上述のとおり、本発明の方法によれば、出発材料の壊死毒素含有液から所望の壊死毒素を良好な収率、純度で採取することができ、その操作も極めて簡便で、また、その精製用クロマトグラフィー吸着体は安価に調製あるいは入手でき、しかも繰り返し使用しても劣化が全くなく経済的にも極めて優れている。従って、本発明の方法は壊死毒素の工業的製造法として極めて優れた方法である。また、本発明の方法は従来の技術である陽イオン交換クロマトグラフィー法、ゲルろ過クロマトグラフィー法等と組み合わせて純度をさらに高めることも可能であり、その際は従来法で得られる結果をはるかに凌ぐ結果を得ることができる。
【００３５】
本発明の方法により精製された壊死毒素は、化学薬品で処理することにより、免疫原性を保持しながら毒素活性を消失させトキソイド化される。トキソイド化に際しては一般的に用いられている方法、例えばホルマリンによる方法(Nakai，T.ら，インフェクション アンド イムニティー: Infect．Immun.，４６，ｐ.４２９〜４３４(１９８４))やグルタールアルデヒドによる方法(Endoh，M.ら，マイクロバイオロジー アンド イムノロジー：Microbiol．Immunol.，３０，ｐ.６５９〜６７３(１９８６))などが適用され得る。さらに、当該トキソイドを体内に投与して液性免疫の惹起を期する場合はアジュバントを加える。加えるアジュバントとしては、アルミニウムゲル、油性アジュバント、サポニンなどが使用できる。当該トキソイドは未精製の壊死毒素画分に比べ免疫原性が高く、かつ安全性にも優れており、このことは後述の実施例のデータにより支持される。
【００３６】
本発明の方法によって得られる部分精製壊死毒素は、純度が高く内毒素のほとんどが除去されているため、動物用ワクチンの調製に有用であり、さらに従来の精製方法と組み合わせて純度を高めると各種試薬、医薬品の調製、さらには人体用百日咳ワクチンの調製への展開も可能である。
【００３７】
ところで、Ｂｂの自然感染例ではほとんどの場合、ＢｂＴ中和抗体の出現を認めないが菌凝集抗体は高率に上昇し本病の血清学的診断法として応用されている。本発明者らの調査においてもＡＲ発生農場である１５県４８農場３２７頭のＢｂＴ中和抗体を検査したところ、１農場(２.１％)の２頭(０.６％)が陽性であるにすぎなかった。従来のＢｂ死菌ワクチンは菌凝集抗体を上昇させるため、診断の妨げとなっていた。しかし、本発明の精製法と従来の精製法を組み合わせることによってＢｂＴの精製度を高めると、中和抗体を付与するものの菌凝集抗体を上昇させないトキソイドの調製が可能となる。このように、ワクチン抗体と感染抗体を血清学的に判別可能にならしめるワクチンやトキソイドは「マーカーワクチン」と呼ばれる。例えば、特定病原体フリー(以下、ＳＰＦと略称することがある)農場において、本発明のトキソイドの使用によりＡＲの予防を行ないながら、万一Ｂｂの感染が認められた場合でも菌凝集抗体を測定することにより感染豚を摘発することができる。
【００３８】
本発明のもう一つの態様は、前記の精製方法に従って調製されたＢｂＴトキソイドとパスツレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドを主成分とする混合トキソイドを提供することである。
【００３９】
本発明において用いられるＰｍＴに関して、出発材料であるＰｍ菌体抽出液とは、毒素原性Ｐｍあるいは非定型的パスツレラ(Kamp，E.M.I.E．et al.，ヴェテリナリー レコード:Vet．Rec.,１２６,ｐ.４３４〜４３７(１９９０))の菌体抽出液を包含する。または、遺伝子組換え技術によりＰｍＴを発現させた細胞抽出液も本発明の出発材料として含まれる。本発明において好ましい抽出液は、毒素原性Ｐｍの菌体抽出液であり、本菌をデキストロース・スターチ培地、血液寒天培地、ＹＰＣ培地(Namioka，S．and Murata，M.，コーネル ヴェテリナリアン:Cornell Vet.,５１,ｐ.４９８〜５０７(１９６１))などの寒天培地あるいはハートインフュージョン培地、トリプチケース・ソイ・ブロス、Luria-Bertani培地、肉水培地(de Jong，M.F．and Akkermans，J.P.W.M.，ヴェテリナリー クオテリー:Vet．Quart.,８,ｐ.２９４〜２１４(１９８６))などの液体培地で、常法により静置培養または振盪培養もしくは通気撹拌培養する。寒天培養菌は、コーンラージ棒等でトリス緩衝液等に浮遊する。液体培養菌は、遠心分離により菌体を回収し、次の精製工程に適した適当な緩衝液に浮遊する。この菌体浮遊液を超音波処理、酵素処理、プレス処理、凍結融解の繰り返し等を行なうことにより菌体を破壊し、遠心分離あるいは膜ろ過により菌体残渣を除去する。
【００４０】
この抽出物をイオン交換クロマトグラフィー、ＰｍＴを認識する抗体で作製した親和性クロマトグラフィーなどにより精製を行なう。あるいは毒素原性Ｐｍを液体培地で２４〜６５時間培養した上清を精製の出発材料に、あるいはそのまま減毒工程に進むことも可能である。
【００４１】
上述のように調製した毒素画分をホルマリン、グルタールアルデヒドなどによって処理し減毒を実施する。減毒化終了後、透析などによって緩衝液をリン酸緩衝食塩水に置換し、アジュバントを加える。アジュバントとしては、アルミニウムゲル、油性アジュバント、サポニンなどが使用できる。混合トキソイドは、各々抗原濃度を単味の場合の２倍に調整しアジュバントを加えたものを等量混合することにより製造される。
【００４２】
本発明により得られる混合トキソイドは安全性にも優れており、従来のワクチンとは異なってＢｂＴ及びＰｍＴを中和する抗体を同時に付与することにより、両毒素による鼻甲介萎縮や発育遅延から豚を予防することができる。
【００４３】
本発明により得られるＢｂＴトキソイド並びに混合トキソイドは、妊娠豚に対し分娩の１週間以上前までに２〜６週間隔で２回筋肉内注射されることにより、初乳による移行抗体で産子を予防する。次回の分娩からは分娩前に本トキソイドを１回接種するだけで十分な免疫が成立する。重度のＡＲ感染農場では、７日齢以上の子豚に対し本トキソイドを２〜６週間隔で２回筋肉内注射することにより直接予防することも有効である。
【００４４】
実施例
以下、本発明を調製例並びに実施例を挙げより詳細に説明するが、本発明はなんらこれらに限定されるものではない。
調製例１
０℃以下の温度にてピリジン６００mlにクロルスルホン酸１１７ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、混液を加熱し、６５〜７０℃に昇温する。この中にセルロファインＧＣ-１５(チッソ社製)８０ｇを加え、撹拌下６５〜７０℃にて３時間反応させる。反応終了後、冷却し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を加えて徐々に中和する。ゲルをろ過分離し、０.０１Ｍリン酸緩衝食塩水で充分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを得る。
【００４５】
調製例２
０℃以下の温度にてピリジン６００mlにクロルスルホン酸１１７ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、混液を加熱し、６５〜７０℃に昇温する。この中に結晶セルロースであるクロマトグラフィー用アビセル(旭化成工業社製)８０ｇを加え、撹拌下６５〜７０℃にて４時間保持する。反応終了後、冷却し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲルをろ過分離し、０.０１Ｍリン酸緩衝食塩水で充分に洗浄して結晶セルロース硫酸エステルゲルを得る。
【００４６】
調製例３
０〜５℃の温度にてピリジン５００mlにクロルスルホン酸８２ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、混液を加熱し、６５〜７０℃に昇温する。この中にセルロファインＧＣ-２５(チッソ社製)８０ｇを加え、撹拌下６５〜７０℃にて４時間反応させる。反応終了後、冷却し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を徐々に加えて中和する。ゲルをろ過分離し、０.０１Ｍリン酸緩衝食塩水(ｐＨ７.２)で充分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを得る。
【００４７】
実施例１
(カラムからのグラジェント溶離法)
前記調製例１と同様にして調製したセルロファインＧＣ-１５の硫酸化エステル化物をカラム(５０mm(内径)×２００mm)に充填し、これに０.０２Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８.０，比電導度約３ms/cm)を通液して平衡化した。このカラムにＢｂ菌Ｓ６１１株菌体破砕抽出液２００mlを通液した。通液後、上記緩衝液にて洗浄し夾雑物質を洗い出した。ついで、０〜０.５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液(ｐＨ８.０、比電導度約３〜４６ms/cm)でグラジェント溶出し、総蛋白量９.１mgの壊死毒素を含む画分を得た。壊死毒素の回収率は３９.６％で、精製度(精製壊死毒素画分の比活性／菌体破砕抽出液の比活性)は３２.１倍に達した。
【００４８】
実施例２
(カラムからのステップワイズ溶離法)
前記調製例１と同様にして調製したセルロファインＧＣ-１５の硫酸化エステル化物をカラム(２５２mm(内径)×２１０mm)に充填し、これに０.０２Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８.０、比電導度約３ms/cm)を通液して平衡化した。このカラムに総蛋白量２９〜３５ｇのＢｂＳ６１１株菌体破砕抽出液を通液した。通液後、０〜０.１５Ｍ塩化ナトリウム添加０.０２Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.８〜８.０、比電導度約３〜１７ms/cm)にて洗浄し、夾雑物質を洗い出した。ついで、０.３〜０.５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液(ｐＨ７.５〜７.７、比電導度約３０〜４６ms/cm)で溶出し、総蛋白量０.２〜１.１ｇの壊死毒素を含む画分を得た。表１に示したとおり壊死毒素の回収率は７６〜１００％で、精製度(精製壊死毒素画分の比活性／菌体破砕抽出液の比活性)は２３〜１１４倍に達し、内毒素は０.１〜３％に低減された。
【００４９】
【表１】
【００５０】
実施例３
(ヘパリンセファロースカラムからのグラジェント溶離法)
ヘパリンセファロースＣＬ-６Ｂ(ファルマシア社製)をカラム(２５mm(内径)×１４０mm)に充填し、これに０.０２Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８.０、比電導度約３mS/cm)を通液して平衡化した。このカラムに総蛋白量４２０mgのＢｂＳ６１１株菌体破砕抽出液を通液した。通液後、上記緩衝液にて洗浄し夾雑物を洗い出した。ついで、０〜０.５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液(ｐＨ８.０、比電導度約３〜４６mS/cm)でグラジェント溶出し、総蛋白量２４mgの壊死毒素を含む画分を得た。壊死毒素の回収率は４０.８％で、精製度(精製壊死毒素画分の比活性／菌体破砕抽出液の比活性)は７.０倍に達した。分析結果を表２に記した。
【００５１】
実施例４
(ＳＰ-トヨパール６５０Ｍカラムからのグラジェント溶離法)
ＳＰ-トヨパール６５０Ｍカラム(東ソー社製)をカラム(５０mm(内径)×１４０mm)に充填し、これに０.０２Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８.０、比電導度約３mS/cm)を通液して平衡化した。このカラムに総蛋白量６３１mgのＢｂＳ６１１株菌体破砕抽出液を通液した。通液後、上記緩衝液にて洗浄し夾雑物を洗い出した。ついで、０〜０.５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液(ｐＨ８.０、比電導度約３〜４６mS/cm)でグラジェント溶出し、総蛋白量２mgの壊死毒素を含む画分を得た。壊死毒素の回収率は１１.５％で、精製度(精製壊死毒素画分の比活性／菌体破砕抽出液の比活性)は３５.５倍に達した。分析結果を表２に記した。
【００５２】
【表２】
【００５３】
実施例５
(高純度精製)
前記実施例１と同様にして調製したセルロース硫酸エステルゲル精製画分を３３ｍＭクエン酸・６６ｍＭリン酸２ナトリウム・１Ｍ尿素(ｐＨ５.０)で透析した。同緩衝液で平衡化したＳＰ-Toyopearl ６５０Ｍ(東ソー社製:１０mm(内径)×８０mm)に総蛋白量９.１mgの透析内容物を通液し、同緩衝液にて洗浄し夾雑物を洗い出した。ついで０〜０.５Ｍ塩化ナトリウム添加の上記緩衝液でグラジェント溶出し、総蛋白量３.１mgの壊死毒素を含む画分(ＳＰ画分)を得た。５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７.１)・０.３Ｍ硫酸ナトリウム・１Ｍ尿素で平衡化したＴＳＫ-ｇｅｌ G3000SW (21mm(内径)×６００mm)にＳＰ画分を通液し、上記緩衝液にて高速液体クロマトグラフィーを行ない総蛋白量１.３mgの壊死毒素を含む画分(ＨＰＬＣ画分)を得た。これらのクロマトグラムを図１〜図３に示した。また、菌体破砕抽出液〜壊死毒素画分の分析結果を表３及び図４に、精製毒素の性状を表４に記した。
【００５４】
【表３】
【００５５】
【表４】
【００５６】
実施例６
(減毒化)
前記実施例１〜５と同様にして得られた壊死毒素画分にホルマリンを加え３７〜４０℃で３〜１４日間反応させて減毒化を行なった。壊死毒素画分に３／１００量の１０％ホルマリンを加え、翌日、同量を、翌々日には２／１００量を加えた。減毒化終了後、リン酸緩衝食塩液で透析した。
【００５７】
実施例７
(アジュバント添加)
前記実施例６と同様にして得られた減毒化壊死毒素に水酸化アルミニウムゲル及び保存剤(チメロサールあるいはホルマリン)を加えた。
【００５８】
実施例８
(マウス力価試験)
前記実施例７と同様にして得られたトキソイドを５週齢ｄｄＹマウスの腹腔内に０.５mlずつ２週間間隔で２回注射した。最終免疫の２週後に約５０(２５〜１００)ＬＤ50の壊死毒素で腹腔内攻撃し生死を７日間観察した。結果を図５に示した。トキソイド量とマウス生残率に正の相関関係が認められた。
【００５９】
実施例９
(育成ブタでの安全性試験)
前記実施例２と同様にして得られた画分を前記実施例６のとおりに減毒化、前記実施例７のとおりに水酸化アルミニウムゲルを加えたトキソイド２〜５０μg／２ml／ドースを調製し、１０週齢ＳＰＦブタに３週間隔で２回筋肉内注射した。注射による臨床症状や体温の異常はいずれのブタにも認められなかった。
【００６０】
実施例１０
(妊娠ブタでの有効性試験)
前記実施例５と同様にして得られたＨＰＬＣ画分を、前記実施例６のとおりに減毒化、前記実施例７のとおりに水酸化アルミニウムゲルを加えたトキソイド(２５μg/ml)を妊娠ブタに分娩６及び３週前の２回、２mlずつ筋肉内注射した。対照ブタにはプラセボワクチンを注射した。初乳を十分に摂取させた産子について、３日齢時にＢｂＳ６１１株２億個を全頭の鼻内に、さらに半数の子豚について２及び３週齢時の２回、壊死毒素2600MNDを筋肉内注射により攻撃した。壊死毒素中和抗体価の成績を表５に記した。分娩時の母ブタ血中ＢｂＴ中和抗体価は３２倍、初乳中は２５６倍、産子の移行抗体価は１２８倍であった。この移行抗体は６週間以上陽性であった。プラセボ注射ブタ及びその産子は抗体陰性であった。攻撃試験の成績を表６に記した。鼻甲介萎縮は対照群の１２頭中９頭に＋〜+++のスコアーで認められたが、免疫群には認められなかった。鼻内からの菌回収には両群の差は認められなかった。増体重は、図６に示したとおりＢｂ生菌に加え壊死毒素による攻撃を実施した群間で差が認められた。２週齢時に実施した１回目の壊死毒素攻撃では、対照群の増体率は免疫群の約１／３に低下し、２回目攻撃(３週齢時)により対照群の全頭が死亡した。
【００６１】
【表５】
【００６２】
【表６】
【００６３】
実施例１１
(育成ブタでの有効性試験)
前記実施例２と同様にして得られた画分を前記実施例６のとおりに減毒化、前記実施例７のとおりに水酸化アルミニウムゲルを加えたトキソイド２〜５０μg/2ml/ドースを調製し、１０週齢ＳＰＦブタに３週間隔で２回筋肉内注射した。最終免疫から４週後に２億個のＢｂ生菌で鼻内攻撃し、攻撃後３週目までの壊死毒素中和抗体価及を検査した。表７に示したとおり対照ブタは攻撃後もＢｂＴ中和抗体陰性であった。免疫群は全頭がＢｂＴ中和抗体が陽転した。攻撃により２及び６μg/２ml/ドースのトキソイド注射ブタは急激な中和抗体の上昇が認められたが、２０及び５０μg/２ml/ドース以上では上昇しなかった。
【００６４】
壊死毒素には抗体産生抑制作用のあることが報告されている(Sekiya，K.,マイクロバイオロジー アンド イムノロジー: Microbiol．Immunol.，２７，ｐ.９０５〜９１５(１９８３))。攻撃後、対照ブタに中和抗体が上昇しない理由は、攻撃菌の産生するＢｂＴの作用によるものと考えれらえる。従って、免疫群における急激な中和抗体の上昇はＢｂＴの抗体産生抑制作用を防御した結果であることから、育成ブタでは２μgのＢｂＴトキソイドでも有効であることが示唆された。
【００６５】
【表７】
【００６６】
調製例４
(菌体破砕抽出液：ＢｂＴトキソイド１)
ＢｂＳ６１１株をペプトン培地で３７℃、２４時間通気撹拌培養した。菌体を遠心濃縮後、菌体破砕処理し菌体残渣を遠心あるいは膜ろ過(ポアー径０.４５μm)で除去した溶液(粗ＢｂＴ画分)にホルマリンを終濃度０.８％に加えて３７〜４０℃で７日間減毒した。このトキソイドをリン酸緩衝食塩水に対して透析した。透析内容物に水酸化アルミニウムゲルを１mg(アルミニウム量換算)/mlに加えてＢｂＴトキソイド１とした。
【００６７】
調製例５
(ＢｂＴトキソイド２)
前記調製例４と同様にして得られた粗ＢｂＴ画分をセルロース硫酸エステルゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)で平衡化したセルロース硫酸エステルゲルに粗ＢｂＴを通液し、同緩衝液で洗浄した。ＢｂＴは１.５ＭＮａＣｌ，１Ｍ尿素添加２０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)でセルロース硫酸エステルゲルカラム(７.８cm(内径)×４５cm)から溶出した。この溶出画分(ＣＳ１画分)を前記調製例４と同様に減毒処理を行ない、透析後、水酸化アルミニウムゲルを加えてＢｂＴトキソイド２とした。
【００６８】
調製例６
(ＢｂＴトキソイド３)
前記調製例５と同様にして得られたＣＳ１画分をさらにＴＳＫゲルＨＷ65(２.６４cm(内径)×６９cm)及びＨＷ75(２.６４cm(内径)×６４cm)連結カラムで精製した。０.３Ｍ硫酸ナトリウム、１Ｍ尿素加０.０５Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.２)で平衡化させたカラムにＣＳ１画分を通液し、同緩衝液で分画後、壊死毒活性を有する画分を混合した。この画分を前記調製例４と同様に減毒処理を行ない、透析後、水酸化アルミニウムゲルを加えてＢｂＴトキソイド３とした。
【００６９】
調製例７
(ＢｂＴトキソイド４)
前記調製例４と同様にして得られた粗ＢｂＴ画分をセルロース硫酸エステルゲルクロマトグラフィーにより精製した。０.１ＭＮａＣｌ加２０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)で平衡化したセルロース硫酸エステルゲルに粗ＢｂＴを通液し、同緩衝液で洗浄した。ＢｂＴは０.５ＭＮａＣｌ加２０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)でセルロース硫酸エステルゲルから溶出した。この画分(ＣＳ２画分)を前記調製例４と同様に減毒処理を行ない、透析後、水酸化アルミニウムゲルを加えてＢｂＴトキソイド４とした。
【００７０】
調製例８
(ＢｂＴトキソイド５)
前記調製例７と同様にして得られたＣＳ２画分をさらにAffi-gel blueカラム(ＢｉｏＲａｄ社製、１００-２００メッシュ、５.０cm(内径)×１７cm)で精製した。５０ｍＭ トリス緩衝液(ｐＨ ７.５)で平衡化させたAffi-gel blue カラムに同緩衝液に対して透析したＣＳ２画分を通液し、１Ｍ リン酸２ナトリウム加５０ｍＭトリス緩衝液(ｐＨ ７.５)で洗浄した。さらに５０ｍＭトリス緩衝液(ｐＨ ７.５)で洗浄後、２Ｍ塩化マグネシウム、１Ｍ尿素加５０Ｍｍトリス緩衝液(ｐＨ ７.５)でＢｂＴを溶出した。この画分を前記調製例４と同様に減毒処理を行ない、透析後、水酸化アルミニウムゲルを加えてＢｂＴトキソイド５とした。
【００７１】
調製例９
(ＢｂＴ抗毒素)
前記実施例１及び５と同様にして得られた高度精製ＢｂＴ画分を前記調製例４と同様に減毒処理を行ない、透析後、水酸化アルミニウムゲルを加えてＢｂＴトキソイド６とした。さらに、２７週齢ＳＰＦブタに対して当該トキソイドを３か月間で１mlずつ８回筋肉内接種してＢｂＴ抗毒素(中和価４,０９６倍、菌凝集抗体価２０倍以下)を得た。
【００７２】
調製例１０
(ＰｍＴトキソイド)
毒素原性ＰｍＤ型ｓ７０株をハートインフュージョンブロスで３７℃、２４時間通気撹拌培養した。菌体を遠心濃縮後、菌体破砕処理し菌体残渣を遠心あるいは膜ろ過(ポアー径０.４５μm)で除去した溶液(粗ＰｍＴと略)を陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。０〜０.３ＭＮａＣｌ加中性リン酸緩衝液またはトリス緩衝液で平衡化した陰イオン交換体に粗ＰｍＴを通液し、同緩衝液で洗浄した。ＰｍＴは０.４〜０.５ＭＮａＣｌを含む同緩衝液でイオン交換体から溶出した。この部分精製ＰｍＴ画分にホルマリンを０.４％に加え、３７℃で１４日間以上減毒した。このトキソイドをリン酸緩衝食塩水に対して透析した。透析内容物に水酸化アルミニウムゲルを１mg Al/mlに加えてＰｍＴトキソイドとした。
【００７３】
実施例１２
(各種精製方法により得られたＢｂＴトキソイドのモルモットでの免疫原性)
前記調製例４〜８と同様にして得られた３,０００ MND/ml(減毒前活性)のＢｂＴトキソイドをモルモット(Hartley,雌，５週齢)の大腿部筋肉内に０.５ml注射した。注射後２８日目に採血し、ＢｂＴ中和抗体価を検査した。中和抗体測定法は、非働化血清をリン酸緩衝食塩水で２倍階段希釈した。これに等量のＢｂＴ(力価 ４MND/０.１ml)を加え、氷冷下で一夜反応後、モルモットの皮下に０.１mlずつ注射した。判定は注射後１日目に実施し、中和価は壊死反応を阻止した血清の最大希釈倍数(血清希釈倍率)で示した。
【００７４】
表８に示したとおり、比活性が１.４×１０4 MND/mg蛋白のＢｂＴトキソイド１及び２を注射したモルモットではすべて中和抗体が陰性であった。比活性が３.７×１０4 MND/mg 蛋白のＢｂＴトキソイド３を注射したモルモットでは３頭中２頭が中和抗体が陽性で、７.８×１０4MND/mg 蛋白以上では全頭陽転した。
【００７５】
ＢｂＴは精製の過程で不溶化しやすく、脂質、酸性蛋白など菌体由来の物質と複合体を形成しやすい性質を有している(Wordlaw，A.C．and Parton，R.，Parmacol．Ther.,１９,ｐ.１〜５３(１９８３))。そのため、これらの菌体由来物質を低減することにより、より十分な減毒化が可能になるか、あるいはまた毒素活性部位のマスキングを減少させ抗原提示効率が向上することによりＢｂＴトキソイドの免疫原性が高まるものと考えられる。
【００７６】
【表８】
【００７７】
実施例１３
(ＢｂＴ中和抗体による防御ライン)
前記調製例１０で得られたＢｂＴ抗毒素 ０.２，１.０，２.０及び２０mlを２日齢ＳＰＦブタの腹腔内に注射して受身免疫を賦与した。３日齢時にＢｂＳ６１１株１０8CFUで鼻内攻撃し、さらに７日齢時に粗ＢｂＴ(１，９４０MND/頭)で筋肉内攻撃した。図７に示したとおり、ＢｂＴの致死作用に対してはＢｂＴ中和抗体価１倍以上で防御が認められ、壊死作用に対しては４倍以上で防御が可能であった。
【００７８】
実施例１４
(ＰｍＴ中和抗体による防御ライン)
前記調製例１０と同様にして得られた粗ＰｍＴのトキソイドを等量のフロイント不完全アジュバントで乳化した。８頭のＳＰＦ妊娠ブタのうち６頭を免疫群、２頭を対照群とした。免疫群は妊娠期間中に３mlのトキソイド(８４０ MND/ml)を２〜５回筋肉内注射した。分娩後、初乳を産子に十分飲ませ２日齢または９日齢時に２０〜１６０MNDの粗ＰｍＴで筋肉内攻撃した。子ブタは攻撃後１４日間観察し鼻甲介病変を観察した。表９に示したとおり、ＰｍＴの鼻甲介萎縮作用に対してはＰｍＴ中和抗体価２倍以上で防御が認められ、致死作用に対しては２倍以下でも防御が可能であった。
【００７９】
【表９】
【００８０】
実施例１５
(ＢｂＴ抗毒素受身免疫ブタのＢｂ及びＰｍ攻撃試験)
前記調製例１０で得られたＢｂＴ抗毒素２０mlを２日齢ＳＰＦブタの腹腔内に注射して受身免疫を賦与した。３日齢及び７日齢時にそれぞれＢｂＳ６１１株１０8CFU及びＰｍＤ型s70株１０8CFUで鼻内攻撃し、６週齢で剖検した。表１０に示すように、ＢｂＴ抗毒素でＢｂの鼻粘膜から大量の菌が回収されたが、Ｐｍの回収は対照に比べると大幅に少なかった。また、対照群の鼻甲介病変は重度(+++)〜極度(++++)であったが、免疫群は一頭が正常(−)で残りが重度及び極度と個体間における差が大きかった。
【００８１】
【表１０】
【００８２】
壊死毒素は菌体内に産生され、溶菌に伴い菌体外に放出される。従って、ＢｂＴ抗毒素によってＢｂの鼻粘膜定着を阻止することはできない。Ｐｍが定着するためには予めＢｂが粘膜に障害を与えていなくてはならない。Ｂｂの産生する鼻粘膜障害因子としては、ＢｂＴ(Elias，B.ら，ジャパニーズ ジャーナル ヴェテリナリー サイエンス: Jpn．J．Vet．Sci.，５２,ｐ.６７７〜６８８(１９９０))及び気管細胞毒素(Cookson，B.T．and Goldman，W.E.,ジャーナル オブ セルラー バイオケミストリー: J．Cell．Biochem.,１１B(Suppl.)ｐ.１２４；Dugal，F.らカナディアン ジャーナル ヴェテリナリー リサーチ:Can．J．Vet．Res.,５６，ｐ.２６０-２６４(１９９２))が重要である。気管細胞毒素はＰｍの定着促進に重要な気管線毛運動停止作用や線毛上皮細胞崩壊作用及び粘液分泌亢進作用を有するため、ＢｂＴ抗毒素による免疫ではＰｍ定着を部分的にしか阻止することはできない。
【００８３】
これらの事実からＰｍの鼻粘膜への定着を阻止するためには、少なくともＢｂＴ及び気管細胞毒に対する免疫を成立させる必要がある。しかし、気管細胞毒トキソイドは精製方法の確立、免疫原性、収量など実用化までには多くの問題を抱えている。そのため、萎縮性鼻炎の主症状を予防し経済的損失を抑制するためのＡＲ不活化ワクチンとしては少なくとも壊死毒混合トキソイドを含有する必要がある。
【００８４】
実施例１６
(トキソイド混合例)
前記実施例２及び６と同様にして得られた減毒化ＢｂＴに水酸化アルミニウムゲルを加え攪拌した。ＢｂＴ濃度を８,７００〜２２０,０００MND/ml(減毒前毒素量ＢｂＴ蛋白で２〜５０μg/mlに相当)に、アルミニウム濃度を０.５〜２.５mg/mlになるよう調製し、保存剤を加えてＢｂＴ原液とした。
【００８５】
前記調製例１１と同様にして得られた水酸化アルミニウムゲル添加減毒化ＰｍＴを３,４００MND/ml以上(減毒前毒素量)に調製し保存剤を加えてＰｍＴ原液とした。保存剤としては、０.０１％チメロサールあるいは０.１〜０.４％ホルマリンを使用した。ＢｂＴ原液及びＰｍＴ原液を等量ずつ加えて混合トキソイドを調製した。
【００８６】
この混合トキソイドを９週齢ＳＰＦブタの頚部筋肉内に３週間隔で２回、２mlずつ接種した。経時的に血清を採取し、ＢｂＴ中和抗体価並びにＰｍＴ中和抗体価を測定した。ＰｍＴ中和抗体価は牛胎仔肺細胞(Rutter，J.M. and Luther，P.D.，ヴェテリナリー レコード:Vet．Rec.,１１４,ｐ.３９３〜３９６(１９８４))を用いた中和試験により求めた。ブタでの中和抗体価を表１１に、マウスでの力価試験成績を表１２に示した。ＢｂＴ及びＰｍＴの各単味トキソイドと混合トキソイドはブタ及びマウスに注射したとき免疫原性の差が認められず、防御に十分な中和抗体応答が認められ、また安全性も十分であった。
【００８７】
【表１１】
【００８８】
【表１２】
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は本発明による壊死毒素精製法の過程のクロマトグラムを示す。
【００９０】
【図２】図２は本発明による壊死毒素精製法の過程のクロマトグラムを示す。
【００９１】
【図３】図３は本発明による壊死毒素精製法の過程のクロマトグラムを示す。
【００９２】
【図４】図４は本発明による壊死毒素精製法を用いて得られた壊死毒素画分の分析結果を示す。
【００９３】
【図５】図５は本発明によって得られるトキソイドのマウス力価試験の結果を示す。
【００９４】
【図６】図６は本発明によって得られるトキソイドの妊娠ブタでの有効性試験の結果を示す。
【００９５】
【図７】図７はＢｂＴ中和抗体による防御ラインの検討結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、豚の伝染性疾患に対する予防薬に関する。さらに詳細には、改良されたボルデテラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドおよびそのパスツレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドとの混合トキソイド並びに該トキソイドの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
萎縮性鼻炎（以下、ＡＲと略称することがある）は豚の慢性呼吸器病で、鼻甲介萎縮、発育遅延、鼻出血、鼻曲がり及び他の呼吸器病の誘発等を主徴とする伝播力の極めて強い疾病である。本病の起因菌としては、毒素原性気管支敗血症菌（以下、Ｂｂと略称することがある）及び毒素原性パスツレラ・マルトシーダ（以下、Ｐｍと略称することがある）が認められており、上部気道粘膜に感染する。Ｂｂは定着因子である赤血球凝集素や線毛を保有しているため鼻粘膜に対する定着性が強いが、それを保有しないＰｍは単独で定着することが困難である。そのため、Ｐｍの感染が成立するためには予め鼻粘膜を障害する因子の存在が必要である。その最も代表的な因子がＢｂであり、鼻粘膜障害に関与する病原性因子として、気管細胞毒素や壊死毒素が知られている。実験感染では、子ブタに対しＢｂ、続いて数日後にＰｍを鼻内感染させることにより野外農場で観察されるような重篤なＡＲを再現することができる。
【０００３】
ボルデテラ属菌には、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌、ボルデテラ・アビウム等があり、これらは種々の生物学的活性物質を産生する。Ｂｂ壊死毒素（以下、ＢｂＴと略称することがある）はこれらの生物学的活性物質の１つであり、いずれのボルデテラ属菌もＢｂＴを産生する。ＢｂＴは出血壊死作用、鼻甲介萎縮作用、発育遅延作用、致死作用、血管平滑筋収縮作用、局所の血行障害、脾臓萎縮作用および抗体産生阻害作用などの生物学的活性を有し、ボルデテラ属菌による発症において重要な役割を演じていることが明らかになった。さらに、ＢｂＴはＢｂによる子豚の肺炎病巣形成にも重要な役割を演じていることが明らかにされた(非特許文献１)。
【０００４】
一方、パスツレラ・マルトシーダの一部あるいは非定型的パスツレラの一部の菌株は、Ｐｍ壊死毒素（以下、ＰｍＴと略称することがある）を産生する。ＰｍＴは出血壊死作用、鼻甲介萎縮作用、発育遅延作用、致死作用、局所の血行障害および脾臓萎縮作用などの生物学的活性を有し、毒素原性Ｐｍによる発症において重要な役割を演じていることが明らかにされている。また、ＰｍＴは毒素原性Ｐｍによる豚の肺炎病巣形成において密接に関係していることが明らかになった(非特許文献２)。ＢｂＴおよびＰｍＴはいずれも培地中に産生されず菌体内に蓄積されるが、長期間培養による溶菌に伴って菌体内から培養上清に遊離する。生体内においては溶菌に伴って菌体内から遊離した壊死毒素が作用する。
【０００５】
従来知られている細菌由来の壊死毒素含有液、とりわけボルデテラ菌菌体抽出液からの壊死毒素の部分精製方法としてはイオン交換クロマトグラフィーによる方法がある(非特許文献３)。しかしながら、この方法は再現性に乏しい欠点がある。また、同様に壊死毒素の部分精製例として、透析、ショ糖密度勾配超遠心分離及びゲルろ過クロマトグラフィーに基づく方法がある(非特許文献４)が、この方法は再現性に乏しく、さらに、工程が多いにもかかわらず精製度があまり高くないという欠点がある。
【０００６】
他の例として、核酸除去剤処理及び陰イオン交換クロマトグラフィー及びハイドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーによる方法がある(非特許文献５)。しかしながら、この方法は核酸除去剤のような高価な試薬を必要とし、工程が多い欠点がある。また、核酸除去剤、透析及び陽イオン交換クロマトグラフィーによる方法もある(非特許文献６)が、この方法は再現性が高く比較的高純度の壊死毒素が得られるものの、前記方法と同様、高価な試薬を必要とする欠点がある。
【０００７】
さらに別の例として、塩析及び色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーによる方法がある(非特許文献７)が、この方法は再現性は高いものの精製度があまり高くないという欠点がある。
【０００８】
従来報告されたＡＲ不活化ワクチンにはＢｂ単味、Ｐｍ単味並びにＢｂ、Ｐｍ混合不活化ワクチンの３種類があり研究あるいは実用化されている。
【０００９】
Ｂｂ不活化ワクチンとしては、ホルマリンやグルタールアルデヒド等で不活化された死菌にアルミニウムゲルや油性アジュバントを加えたものがある(非特許文献８、非特許文献９および非特許文献１０)。また、Ｂｂの外膜に存在しアデニールサイクラーゼ活性を有する６８ｋＤaの蛋白に萎縮性鼻炎の防御効果のあることが明らかにされている(非特許文献１１)。さらに、Ｂｂ菌の産生する線維状赤血球凝集素を主成分とするコンポーネントワクチンが存在する(非特許文献１２および非特許文献１３)。抗毒素を与える目的で壊死毒素を加えたワクチンは効果を得ていないという報告もある(非特許文献１４および非特許文献１５)。
【００１０】
一方、Ｐｍの不活化単味ワクチンとしては、ＰｍＴトキソイド(非特許文献１６および非特許文献１７)が研究あるいは実用化されている。
【００１１】
さらに、Ｂｂ及びＰｍの混合不活化ワクチンとしては、（１）ＡＲの予防のみを目的とするためＢｂとＰｍD型のＰｍＴ産生株の死菌を混合したもの、これらにＰｍＴ非産生株を加えたもの、あるいはＢｂとＰｍＴトキソイドを混合したもの(非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０および非特許文献２１)、（２）ＡＲと肺炎予防を目的とするため、ＢｂとＰｍＤ型のＰｍＴ産生株、ＰｍＡ型の死菌を混合したもの(非特許文献２２)、（３）ＡＲと肺炎に加えて他の疾病の予防も目的とするためＢｂ、ＰｍＡ型株、豚丹毒菌の死菌にＰｍＴトキソイドを加えたものが実用化されている(非特許文献２３)。
【００１２】
ところで、Roop II，R.M.らはＢｂＴがＢｂ感染による豚の鼻甲介萎縮や肺炎病巣形成に重要な役割を演じていることから、ＢｂＴトキソイドの必要性を指摘している(非特許文献１)。しかし、ＢｂＴとＰｍＴトキソイドとの混合化に関しては全く言及していない。また、Chanter，N.らはＢｂＴ及びＰｍＴの共同作用による豚鼻粘膜障害がＢｂ及びＰｍの増殖に好ましい環境を形成することから、Ｂｂの重要な成分を含有するＰｍＴトキソイドがより効果的であることを提案している（非特許文献２４)。
【００１３】
しかし、これまでのところ、単にＢｂＴ活性を有する画分からなるワクチンではＢｂＴ中和抗体を上昇させることに成功していない(非特許文献１４、非特許文献１５)。
【００１４】
一方で、中井らは高度に精製したＢｂＴトキソイドを用いてブタ及びマウスに中和抗体の上昇することを明らかにした（非特許文献２５)。しかし、彼らも当該ＢｂＴトキソイドとＰｍＴトキソイドとの混合化に関しては全く触れていない。
【非特許文献１】Roop II,R.M．ら、Infection and Immunity，５５,ｐ.２１７〜２２２(１９８７)
【非特許文献２】Iwamatsu, S.およびSawada, T.、Japanese Journal of Veterinary Science, ５０, ｐ.１２００〜１２０６(１９８８)
【非特許文献３】Kume，K.ら，Infection and Immunity, ５２(４), ｐ.３７０〜３７７(１９８６)
【非特許文献４】Endoh，M.ら，Microbiology and Immunology, ３０,(７), ｐ.６５９〜６７３(１９８６)
【非特許文献５】Horiguchi，Y.ら、Microbial Pathogenesis, ６, ｐ.３６１〜３６８(１９８９)
【非特許文献６】Horiguchi，Y.ら、FEMS Microbiology Letters, ６６, ｐ.３９〜４４(１９９０)
【非特許文献７】Zhang Y. L.およびSekura R. D.、Infection and Immunity, ５９(１０), ,ｐ.３７５４〜３７５９(１９９１)
【非特許文献８】Goodnow, R. A.、Veterinary Medicine Small Animal Clinician, ７２, ｐ.１２１０〜１２１２(１９７７)
【非特許文献９】Nakase，Y.ら、Proceedings of International Pig Veterinary Society Congress, ８,(１９７６)
【非特許文献１０】Giles, C. J.およびSmith, I. M.、Veterinary Bulletin (London), ５３, ｐ.３２７〜３３８(１９８３)
【非特許文献１１】Montaraz J. A.ら、Infection and Immunity, ４７, ｐ.７４４〜７５５(１９８５)
【非特許文献１２】Hansen, G. R.ら、In Atrophic rhinitis in pigs (Peterson, K. B.およびNielsen, N.C.編）Communication of the European Communities，Luxembourg, ｐ.８９〜９７(１９８３)
【非特許文献１３】Ohgitani, T.ら、Vaccine, ９, ｐ.６５３〜６５８(１９９１)
【非特許文献１４】Soderlind, O.およびBergstrom, G.，Proceedings of International Pig Veterinary Science Congress, ｐ.１７５(１９８４)
【非特許文献１５】Marel, C. M. von der.ら、Proceedings of International Pig Veterinary Science Congress, ｐ.１７０(１９８４)
【非特許文献１６】Pedersen, K. B.およびBarfod, K.、Nordish Veterina Medicine, ３１, ｐ.２９３〜３０２(１９８２)
【非特許文献１７】Foged, N. T.ら、ヴェテリナリー レコード:Veterinary Record, １２５, ｐ.７〜１１(１９８９)
【非特許文献１８】Barfod, K.およびPedersen,K. B.、Nordish Veterina Medicine, ３６, ｐ.３３７〜３４５(１９８４)
【非特許文献１９】Baalsrud, K. J.、Acta Veterina Scandinavia., ２８, ｐ.３０５〜３１１(１９８７)
【非特許文献２０】de Jong, M. F.ら、Veterinary Quarterly, ９, ｐ.４９〜５９(１９８７)
【非特許文献２１】Kobisch, M.およびPennings, A.、Veterinary Record, １２４, ｐ.５７〜６１(１９８９)
【非特許文献２２】Ostle, A. G.ら、Veterinary Medicine, ｐ.７７２〜７７５(１９８６)
【非特許文献２３】Jayappa, H.ら、International Pig Veterinary Society Congress, ｐ.４４(１９８８)
【非特許文献２４】Chanter, N.ら、Research Veterinary Science, ４７, ｐ．４８〜５３(１９８９)
【非特許文献２５】第111回日本獣医学会講演要旨集，ｐ.１８３(１９９１)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述の状況下、壊死毒素の生体防御における役割についてはなお不明な点があり、これらを解明していく上での壊死毒素を大量に調製する方法の開発、ならびに疾病予防のための壊死毒素のトキソイドの開発が望まれている。しかし、壊死毒素は熱に対し不安定で精製が進むにつれて自己凝集しやすくなったり、脂質、酸性蛋白質および疎水性物質等の菌体由来物質と複合体を形成するなどの性質のため精製が困難といった問題点があった。
また、前記ＢｂＴとＰｍＴは生物学的活性は類似しているものの、免疫学的に交差しないことが明らかにされており、このようなことから、獣医療上、養豚産業上安全かつ有効なＢｂＴ・ＰｍＴ混合トキソイドの開発が切望されている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、壊死毒素の効率的な精製方法を見い出すべく種々検討を重ねた結果、（１）壊死毒素含有溶液例えばボルデテラ属菌菌体抽出物を、セルロース硫酸エステルゲル、ヘパリン固定化吸着ゲルもしくは硫酸化アルキル基固定化吸着ゲル等で例示される直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを用いてクロマトグラフィーを行なうことにより内毒素含有量の少ない部分精製壊死毒素が簡単にしかも比較的高い回収率で得られること、（２）上記直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを用いて部分精製した壊死毒素をさらに透析、陽イオン交換クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーを実施することにより高純度の壊死毒素が簡単に、しかも比較的高回収率で得られること、（３）直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを用いて部分精製した壊死毒素が未精製のボルデテラ属菌菌体抽出物中壊死毒素に比べ免疫応答が大幅に改善されることの知見を得た。
【００１７】
さらに、本発明者らは、ボルデテラ属菌菌体抽出物を直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルに接触せしめ、壊死毒素を吸着させ、夾雑物質と分離し、ゲルから溶出することにより得られた壊死毒素画分を化学的に減毒したものが豚において安全かつ萎縮性鼻炎の予防に有効であることを確認し本発明を完成するに至った。
【００１８】
豚に対してＰｍの感染が成立するためには予め豚鼻粘膜を障害する因子としてのＢｂの前感染が必要である。ＢｂＴ抗毒素による免疫をブタに行なった場合、Ｂｂ及びＰｍの攻撃によりＰｍの鼻粘膜定着並びに鼻甲介萎縮を軽減できる。しかし、個体間で効果に大きな差が認められることから、ＡＲ不活化ワクチンの成分としてＢｂＴトキソイドのみでは不十分であることが判明した。
【００１９】
本発明者らは、上述の知見を基に混合トキソイドを開発すべく鋭意検討を重ねた結果、ボルデテラ属菌菌体抽出物をセルロース硫酸エステルゲル等を用いて比活性３７,０００MND/mg蛋白以上に精製した毒素に由来するトキソイドと毒素原性Ｐｍ産生ＰｍＴに由来するトキソイドを混合することにより得られる混合トキソイドが、豚において安全かつ萎縮性鼻炎の予防に有効であることを確認し、本発明の第二の態様である混合トキソイドを供するに至った。
【００２０】
なお、本発明において使用される最少壊死毒単位(ＭＮＤ)とは、リポポリサッカライド(大腸菌、血清型０111:Ｂ４由来など)１μg/ml存在下でモルモット皮内に注射され１日後に直径５ｍｍ以上の壊死斑を形成する最少毒素量を１ＭＮＤと定義される量に基づくものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、壊死毒素含有液をセルロース硫酸エステル等の直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルに接触せしめ、壊死毒素を吸着させた後、ゲルから溶出することを特徴とする壊死毒素の部分精製方法を提供する。また、前記壊死毒素の部分精製方法によって得られたＢｂＴに由来するＢｂＴのトキソイド、並びに該ＢｂＴトキソイドと毒素原性Ｐｍ産生ＰｍＴに由来するトキソイドを混合することにより得られる、豚において安全かつ萎縮性鼻炎の予防に有効な混合トキソイドを提供するものである。
【００２２】
本発明において、出発材料である壊死毒素含有液とは、Ｂｂ、百日咳菌、パラ百日咳菌及びボルデテラ アビウムの菌体抽出液を含む。または、遺伝子組換え技術によりＢｂＴを発現させた細胞抽出液も本発明の出発材料として含まれる。
【００２３】
本発明において好ましい抽出液は、Ｂｂの菌体抽出液であり、Ｂｂをボルデ・ジャング培地、マッコンキー培地などの寒天培地あるいはペプトン培地(Horiguchi, Y.ら,マイクロバイアル パソジェネーシス：Microb. Pathogen., ６,ｐ.３６１〜３６８(１９８９))、コーエン・ウィラー培地、ステナー・ショルテ培地などの液体培地にて、常法により静置培養または振盪培養もしくは通気撹拌培養する。寒天培養菌は、コーンラージ棒等でセルロース硫酸エステルゲルの開始緩衝液に浮遊する。液体培養菌は、遠心分離により菌体を回収し、セルロース硫酸エステルゲルの開始緩衝液に浮遊する。
【００２４】
この菌体浮遊液について、Kume, K.らの方法(インフェクション アンド イムニティー:Infect. Immun. ５２(4), ｐ.３７０〜３７７(１９８６))、Endoh, M.らの方法(マイクロバイオロジー アンド イムノロジー:Microbial. Immunol., ３０(7), ｐ.６５９〜６７３(１９８６))、Horiguchi, Y.らの方法(マイクロバイアル パソジェネーシス:Microbial Pathogen., ６, ｐ.３６１〜３６８(１９８９)あるいはFEMSマイクロバイオロジー レターズ:FEMS Microbiol. Letters, ６６, ｐ.３９〜４４(１９９０))、Zhang Y. L.およびSekura R. D．の方法(インフェクション アンド イムニティー:Infect. Immun., ５９(10), ｐ.３７５４〜３７５９(１９９１))によって、またはセルロース硫酸エステルゲル等の直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを用いた吸着クロマトグラフィーにより精製を行なうことができるが、本発明においては、直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを用いた吸着クロマトグラフィーによる精製を実施することを最適な態様とする。
【００２５】
この菌体浮遊液を超音波処理、酵素処理、プレス処理、凍結融解の繰り返し等を行なうことにより菌体を破壊し、遠心分離あるいは膜ろ過により菌体残渣を除去する。この菌体抽出物の形であるいは核酸除去剤、塩析、超遠心分離等の前段部分精製処理後に本発明の方法に供される。本発明の方法によれば、前段部分精製処理をあえて行なう必要はなく、菌体抽出液をそのまま硫酸基を有する分子をリガンドとする吸着ゲルあるいは直接硫酸化された吸着ゲルを用いた吸着クロマトグラフィーに付すことができ、工程がきわめて簡便となる。
【００２６】
本発明で用いられる直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルについては以下のものが例示される。
【００２７】
直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルとは、セルロースなどのクロマト担体ゲルが、ピリジンなどの有機溶媒の存在下、クロルスルホン酸、無水硫酸などの硫酸化剤の作用により例えばエステル結合を介してクロマト担体ゲルそのものに直接硫酸基が導入されたものを意味し、結晶セルロースまたは結晶領域および非結晶領域セルロースなどからなる球状セルロースに硫酸エステルが導入されたセルロース硫酸エステルのゲルはその代表である。この場合、得られたセルロース硫酸エステルは原料の形状を保持し、水性溶媒に不溶性であり、物理的安定性に優れ、クロマトグラフィー用ゲルとして好適である。これらの原料セルロース類はすでに市販されており、例えばアビセル(旭化成工業社製)、セルロファインＧＣ−１５、同ＧＨ−２５、同ＧＣ−１００、同ＧＣ−２００(チッソ社製)などがある。原料セルロースを前記の方法で硫酸化することもできるし、そのなかのいくつかは硫酸化セルロースとして例えば「硫酸化−セルロファイン」の販売名(チッソ社製)で市販されている。
【００２８】
硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルとは、架橋セルロース、架橋デキストランもしくは架橋アガロースゲルなどの天然高分子重合体または親水性ビニルポリマーもしくはスチレンジビニルベンゼン共重合体などの人工高分子重合体からなるクロマト担体ゲルに、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンであるヘパリン、硫酸化アルキル基の一種であるスルフォプロピル基またはスルフォン基を有するブルー色素などがＣＮＢｒ法などの方法で共有結合的に結合されているものを意味し、すでに数多くのものが市販されている。ヘパリン結合クロマト担体ゲルとしては、「ヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ」(ファルマシア社)、「アフィゲルヘパリンゲル」(バイオラッド社)、「ヘパリンセルロファイン」(生化学工業社)など、ブルー色素結合クロマト担体ゲルとしては「アフィゲルブルーゲル」(バイオラッド社)、「ＡＦ−ブルートヨパール」(東ソー社)、「ブルーセルロファイン」(生化学工業社)など、さらにスルフォプロピル基結合クロマト担体ゲルとしては「ＳＰ−セファデックス」(ファルマシア社)、「ＳＰ−トヨパール６５０Ｍ」(東ソー社)などが例示される。
【００２９】
本発明において、硫酸基を有する分子をリガンドとする吸着ゲルあるいは直接硫酸化された吸着ゲルを用いて壊死毒素含有液とりわけボルデテラ属菌菌体抽出液中の壊死毒素を精製採取するにあたっては、以下の方法で実施する。ここでは、好適な実施態様であるセルロース硫酸エステルゲルを用いた例について概説するが、他のゲルの場合も同様の条件下で実施することができる。
【００３０】
セルロース硫酸エステルゲルを、予め、例えば０〜０.２Ｍ塩化ナトリウム添加０.０２Ｍリン酸緩衝液等の中性付近のｐＨ値(ｐＨ７〜９)であり、適当な比電導度、すなわちゲルクロマトグラフィーにおける洗浄、溶出の際の一定の基準となる比電導度(その範囲はゲルの種類によっても若干異なるが、通常、２０mS/cm以下、一般的には３〜２０mS/cm、より一般的には５〜２０mS/cmの範囲にある)またはそれ以下の比電導度を有する緩衝液にて平衡化した後に、壊死毒素の吸着操作に供する。セルロース硫酸エステルゲルへの壊死毒素の吸着、ゲルの洗浄、壊死毒素の溶出等一連の精製操作は、バッチ法およびカラム法等の工業的に通常よく用いられる操作方法で行なう。バッチ法で行なう場合は、ボルデテラ属菌菌体抽出液中にセルロース硫酸エステルを投入し、ｐＨ７.０〜９.０程度の範囲において０〜３０℃程度の温度にて１０〜６０分程度緩く撹拌して壊死毒素を吸着させる。この際、ボルデテラ属菌菌体抽出液の比電導度が上記所定の範囲、一般的に３〜２０mS/cmの範囲、またはそれ以下となるように、適宜濃縮または希釈して吸着操作に付す。
【００３１】
吸着終了後、抽出物・ゲル混合液をろ過器上に充填し、吸引ろ過してゲルとろ液を分離する。分離したゲルを、上記所定の範囲の比電導度(一般的には３〜２０mS/cm程度)またはそれ以下で、ｐＨが５〜１０程度である適当な緩衝液、例えば、０.１Ｍ塩化ナトリウム添加０.０２Ｍリン酸緩衝液等を注ぎ吸引して洗浄する。この後、ｐＨが５〜１０程度で、比電導度が上記所定の範囲の比電導度以上で、一般的には１３０mS/cm以下のもの(好ましい範囲は、例えば２２〜４６mS/cm程度）である適当な緩衝液、０.２〜０.５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着している壊死毒素を溶出する。
【００３２】
カラム法にて本発明方法を実施する場合は原材料、洗浄用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はバッチ法の場合と同様でよく、これらの通液速度は、１０ml/cm2/hr〜５００ml/cm2/hr程度に調整して行なうことが推奨される。
【００３３】
本発明の精製方法によれば、壊死毒素含有液中の壊死毒素に対する特異的吸着能に優れ、壊死毒素の精製度は数１０倍〜１１０倍に達し、しかも壊死毒素の回収率は４０％〜１００％と良好である。発熱やショック等副作用の原因物質で壊死毒素とともに菌体破砕抽出液中に大量に含まれる内毒素はセルロース硫酸エステルゲルに吸着しないため、１／３０〜１／８００量に低減される。得られた精製壊死毒素の比活性が４×１０5〜３×１０6MND/mg蛋白と高く、ＳＤＳ-ポリアクリルアミド電気泳動分析において主要バンドを形成する。
【００３４】
上述のとおり、本発明の方法によれば、出発材料の壊死毒素含有液から所望の壊死毒素を良好な収率、純度で採取することができ、その操作も極めて簡便で、また、その精製用クロマトグラフィー吸着体は安価に調製あるいは入手でき、しかも繰り返し使用しても劣化が全くなく経済的にも極めて優れている。従って、本発明の方法は壊死毒素の工業的製造法として極めて優れた方法である。また、本発明の方法は従来の技術である陽イオン交換クロマトグラフィー法、ゲルろ過クロマトグラフィー法等と組み合わせて純度をさらに高めることも可能であり、その際は従来法で得られる結果をはるかに凌ぐ結果を得ることができる。
【００３５】
本発明の方法により精製された壊死毒素は、化学薬品で処理することにより、免疫原性を保持しながら毒素活性を消失させトキソイド化される。トキソイド化に際しては一般的に用いられている方法、例えばホルマリンによる方法(Nakai，T.ら，インフェクション アンド イムニティー: Infect．Immun.，４６，ｐ.４２９〜４３４(１９８４))やグルタールアルデヒドによる方法(Endoh，M.ら，マイクロバイオロジー アンド イムノロジー：Microbiol．Immunol.，３０，ｐ.６５９〜６７３(１９８６))などが適用され得る。さらに、当該トキソイドを体内に投与して液性免疫の惹起を期する場合はアジュバントを加える。加えるアジュバントとしては、アルミニウムゲル、油性アジュバント、サポニンなどが使用できる。当該トキソイドは未精製の壊死毒素画分に比べ免疫原性が高く、かつ安全性にも優れており、このことは後述の実施例のデータにより支持される。
【００３６】
本発明の方法によって得られる部分精製壊死毒素は、純度が高く内毒素のほとんどが除去されているため、動物用ワクチンの調製に有用であり、さらに従来の精製方法と組み合わせて純度を高めると各種試薬、医薬品の調製、さらには人体用百日咳ワクチンの調製への展開も可能である。
【００３７】
ところで、Ｂｂの自然感染例ではほとんどの場合、ＢｂＴ中和抗体の出現を認めないが菌凝集抗体は高率に上昇し本病の血清学的診断法として応用されている。本発明者らの調査においてもＡＲ発生農場である１５県４８農場３２７頭のＢｂＴ中和抗体を検査したところ、１農場(２.１％)の２頭(０.６％)が陽性であるにすぎなかった。従来のＢｂ死菌ワクチンは菌凝集抗体を上昇させるため、診断の妨げとなっていた。しかし、本発明の精製法と従来の精製法を組み合わせることによってＢｂＴの精製度を高めると、中和抗体を付与するものの菌凝集抗体を上昇させないトキソイドの調製が可能となる。このように、ワクチン抗体と感染抗体を血清学的に判別可能にならしめるワクチンやトキソイドは「マーカーワクチン」と呼ばれる。例えば、特定病原体フリー(以下、ＳＰＦと略称することがある)農場において、本発明のトキソイドの使用によりＡＲの予防を行ないながら、万一Ｂｂの感染が認められた場合でも菌凝集抗体を測定することにより感染豚を摘発することができる。
【００３８】
本発明のもう一つの態様は、前記の精製方法に従って調製されたＢｂＴトキソイドとパスツレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドを主成分とする混合トキソイドを提供することである。
【００３９】
本発明において用いられるＰｍＴに関して、出発材料であるＰｍ菌体抽出液とは、毒素原性Ｐｍあるいは非定型的パスツレラ(Kamp，E.M.I.E．et al.，ヴェテリナリー レコード:Vet．Rec.,１２６,ｐ.４３４〜４３７(１９９０))の菌体抽出液を包含する。または、遺伝子組換え技術によりＰｍＴを発現させた細胞抽出液も本発明の出発材料として含まれる。本発明において好ましい抽出液は、毒素原性Ｐｍの菌体抽出液であり、本菌をデキストロース・スターチ培地、血液寒天培地、ＹＰＣ培地(Namioka，S．and Murata，M.，コーネル ヴェテリナリアン:Cornell Vet.,５１,ｐ.４９８〜５０７(１９６１))などの寒天培地あるいはハートインフュージョン培地、トリプチケース・ソイ・ブロス、Luria-Bertani培地、肉水培地(de Jong，M.F．and Akkermans，J.P.W.M.，ヴェテリナリー クオテリー:Vet．Quart.,８,ｐ.２９４〜２１４(１９８６))などの液体培地で、常法により静置培養または振盪培養もしくは通気撹拌培養する。寒天培養菌は、コーンラージ棒等でトリス緩衝液等に浮遊する。液体培養菌は、遠心分離により菌体を回収し、次の精製工程に適した適当な緩衝液に浮遊する。この菌体浮遊液を超音波処理、酵素処理、プレス処理、凍結融解の繰り返し等を行なうことにより菌体を破壊し、遠心分離あるいは膜ろ過により菌体残渣を除去する。
【００４０】
この抽出物をイオン交換クロマトグラフィー、ＰｍＴを認識する抗体で作製した親和性クロマトグラフィーなどにより精製を行なう。あるいは毒素原性Ｐｍを液体培地で２４〜６５時間培養した上清を精製の出発材料に、あるいはそのまま減毒工程に進むことも可能である。
【００４１】
上述のように調製した毒素画分をホルマリン、グルタールアルデヒドなどによって処理し減毒を実施する。減毒化終了後、透析などによって緩衝液をリン酸緩衝食塩水に置換し、アジュバントを加える。アジュバントとしては、アルミニウムゲル、油性アジュバント、サポニンなどが使用できる。混合トキソイドは、各々抗原濃度を単味の場合の２倍に調整しアジュバントを加えたものを等量混合することにより製造される。
【００４２】
本発明により得られる混合トキソイドは安全性にも優れており、従来のワクチンとは異なってＢｂＴ及びＰｍＴを中和する抗体を同時に付与することにより、両毒素による鼻甲介萎縮や発育遅延から豚を予防することができる。
【００４３】
本発明により得られるＢｂＴトキソイド並びに混合トキソイドは、妊娠豚に対し分娩の１週間以上前までに２〜６週間隔で２回筋肉内注射されることにより、初乳による移行抗体で産子を予防する。次回の分娩からは分娩前に本トキソイドを１回接種するだけで十分な免疫が成立する。重度のＡＲ感染農場では、７日齢以上の子豚に対し本トキソイドを２〜６週間隔で２回筋肉内注射することにより直接予防することも有効である。
【００４４】
実施例
以下、本発明を調製例並びに実施例を挙げより詳細に説明するが、本発明はなんらこれらに限定されるものではない。
調製例１
０℃以下の温度にてピリジン６００mlにクロルスルホン酸１１７ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、混液を加熱し、６５〜７０℃に昇温する。この中にセルロファインＧＣ-１５(チッソ社製)８０ｇを加え、撹拌下６５〜７０℃にて３時間反応させる。反応終了後、冷却し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を加えて徐々に中和する。ゲルをろ過分離し、０.０１Ｍリン酸緩衝食塩水で充分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを得る。
【００４５】
調製例２
０℃以下の温度にてピリジン６００mlにクロルスルホン酸１１７ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、混液を加熱し、６５〜７０℃に昇温する。この中に結晶セルロースであるクロマトグラフィー用アビセル(旭化成工業社製)８０ｇを加え、撹拌下６５〜７０℃にて４時間保持する。反応終了後、冷却し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲルをろ過分離し、０.０１Ｍリン酸緩衝食塩水で充分に洗浄して結晶セルロース硫酸エステルゲルを得る。
【００４６】
調製例３
０〜５℃の温度にてピリジン５００mlにクロルスルホン酸８２ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、混液を加熱し、６５〜７０℃に昇温する。この中にセルロファインＧＣ-２５(チッソ社製)８０ｇを加え、撹拌下６５〜７０℃にて４時間反応させる。反応終了後、冷却し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を徐々に加えて中和する。ゲルをろ過分離し、０.０１Ｍリン酸緩衝食塩水(ｐＨ７.２)で充分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを得る。
【００４７】
実施例１
(カラムからのグラジェント溶離法)
前記調製例１と同様にして調製したセルロファインＧＣ-１５の硫酸化エステル化物をカラム(５０mm(内径)×２００mm)に充填し、これに０.０２Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８.０，比電導度約３ms/cm)を通液して平衡化した。このカラムにＢｂ菌Ｓ６１１株菌体破砕抽出液２００mlを通液した。通液後、上記緩衝液にて洗浄し夾雑物質を洗い出した。ついで、０〜０.５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液(ｐＨ８.０、比電導度約３〜４６ms/cm)でグラジェント溶出し、総蛋白量９.１mgの壊死毒素を含む画分を得た。壊死毒素の回収率は３９.６％で、精製度(精製壊死毒素画分の比活性／菌体破砕抽出液の比活性)は３２.１倍に達した。
【００４８】
実施例２
(カラムからのステップワイズ溶離法)
前記調製例１と同様にして調製したセルロファインＧＣ-１５の硫酸化エステル化物をカラム(２５２mm(内径)×２１０mm)に充填し、これに０.０２Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８.０、比電導度約３ms/cm)を通液して平衡化した。このカラムに総蛋白量２９〜３５ｇのＢｂＳ６１１株菌体破砕抽出液を通液した。通液後、０〜０.１５Ｍ塩化ナトリウム添加０.０２Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.８〜８.０、比電導度約３〜１７ms/cm)にて洗浄し、夾雑物質を洗い出した。ついで、０.３〜０.５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液(ｐＨ７.５〜７.７、比電導度約３０〜４６ms/cm)で溶出し、総蛋白量０.２〜１.１ｇの壊死毒素を含む画分を得た。表１に示したとおり壊死毒素の回収率は７６〜１００％で、精製度(精製壊死毒素画分の比活性／菌体破砕抽出液の比活性)は２３〜１１４倍に達し、内毒素は０.１〜３％に低減された。
【００４９】
【表１】
【００５０】
実施例３
(ヘパリンセファロースカラムからのグラジェント溶離法)
ヘパリンセファロースＣＬ-６Ｂ(ファルマシア社製)をカラム(２５mm(内径)×１４０mm)に充填し、これに０.０２Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８.０、比電導度約３mS/cm)を通液して平衡化した。このカラムに総蛋白量４２０mgのＢｂＳ６１１株菌体破砕抽出液を通液した。通液後、上記緩衝液にて洗浄し夾雑物を洗い出した。ついで、０〜０.５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液(ｐＨ８.０、比電導度約３〜４６mS/cm)でグラジェント溶出し、総蛋白量２４mgの壊死毒素を含む画分を得た。壊死毒素の回収率は４０.８％で、精製度(精製壊死毒素画分の比活性／菌体破砕抽出液の比活性)は７.０倍に達した。分析結果を表２に記した。
【００５１】
実施例４
(ＳＰ-トヨパール６５０Ｍカラムからのグラジェント溶離法)
ＳＰ-トヨパール６５０Ｍカラム(東ソー社製)をカラム(５０mm(内径)×１４０mm)に充填し、これに０.０２Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８.０、比電導度約３mS/cm)を通液して平衡化した。このカラムに総蛋白量６３１mgのＢｂＳ６１１株菌体破砕抽出液を通液した。通液後、上記緩衝液にて洗浄し夾雑物を洗い出した。ついで、０〜０.５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液(ｐＨ８.０、比電導度約３〜４６mS/cm)でグラジェント溶出し、総蛋白量２mgの壊死毒素を含む画分を得た。壊死毒素の回収率は１１.５％で、精製度(精製壊死毒素画分の比活性／菌体破砕抽出液の比活性)は３５.５倍に達した。分析結果を表２に記した。
【００５２】
【表２】
【００５３】
実施例５
(高純度精製)
前記実施例１と同様にして調製したセルロース硫酸エステルゲル精製画分を３３ｍＭクエン酸・６６ｍＭリン酸２ナトリウム・１Ｍ尿素(ｐＨ５.０)で透析した。同緩衝液で平衡化したＳＰ-Toyopearl ６５０Ｍ(東ソー社製:１０mm(内径)×８０mm)に総蛋白量９.１mgの透析内容物を通液し、同緩衝液にて洗浄し夾雑物を洗い出した。ついで０〜０.５Ｍ塩化ナトリウム添加の上記緩衝液でグラジェント溶出し、総蛋白量３.１mgの壊死毒素を含む画分(ＳＰ画分)を得た。５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７.１)・０.３Ｍ硫酸ナトリウム・１Ｍ尿素で平衡化したＴＳＫ-ｇｅｌ G3000SW (21mm(内径)×６００mm)にＳＰ画分を通液し、上記緩衝液にて高速液体クロマトグラフィーを行ない総蛋白量１.３mgの壊死毒素を含む画分(ＨＰＬＣ画分)を得た。これらのクロマトグラムを図１〜図３に示した。また、菌体破砕抽出液〜壊死毒素画分の分析結果を表３及び図４に、精製毒素の性状を表４に記した。
【００５４】
【表３】
【００５５】
【表４】
【００５６】
実施例６
(減毒化)
前記実施例１〜５と同様にして得られた壊死毒素画分にホルマリンを加え３７〜４０℃で３〜１４日間反応させて減毒化を行なった。壊死毒素画分に３／１００量の１０％ホルマリンを加え、翌日、同量を、翌々日には２／１００量を加えた。減毒化終了後、リン酸緩衝食塩液で透析した。
【００５７】
実施例７
(アジュバント添加)
前記実施例６と同様にして得られた減毒化壊死毒素に水酸化アルミニウムゲル及び保存剤(チメロサールあるいはホルマリン)を加えた。
【００５８】
実施例８
(マウス力価試験)
前記実施例７と同様にして得られたトキソイドを５週齢ｄｄＹマウスの腹腔内に０.５mlずつ２週間間隔で２回注射した。最終免疫の２週後に約５０(２５〜１００)ＬＤ50の壊死毒素で腹腔内攻撃し生死を７日間観察した。結果を図５に示した。トキソイド量とマウス生残率に正の相関関係が認められた。
【００５９】
実施例９
(育成ブタでの安全性試験)
前記実施例２と同様にして得られた画分を前記実施例６のとおりに減毒化、前記実施例７のとおりに水酸化アルミニウムゲルを加えたトキソイド２〜５０μg／２ml／ドースを調製し、１０週齢ＳＰＦブタに３週間隔で２回筋肉内注射した。注射による臨床症状や体温の異常はいずれのブタにも認められなかった。
【００６０】
実施例１０
(妊娠ブタでの有効性試験)
前記実施例５と同様にして得られたＨＰＬＣ画分を、前記実施例６のとおりに減毒化、前記実施例７のとおりに水酸化アルミニウムゲルを加えたトキソイド(２５μg/ml)を妊娠ブタに分娩６及び３週前の２回、２mlずつ筋肉内注射した。対照ブタにはプラセボワクチンを注射した。初乳を十分に摂取させた産子について、３日齢時にＢｂＳ６１１株２億個を全頭の鼻内に、さらに半数の子豚について２及び３週齢時の２回、壊死毒素2600MNDを筋肉内注射により攻撃した。壊死毒素中和抗体価の成績を表５に記した。分娩時の母ブタ血中ＢｂＴ中和抗体価は３２倍、初乳中は２５６倍、産子の移行抗体価は１２８倍であった。この移行抗体は６週間以上陽性であった。プラセボ注射ブタ及びその産子は抗体陰性であった。攻撃試験の成績を表６に記した。鼻甲介萎縮は対照群の１２頭中９頭に＋〜+++のスコアーで認められたが、免疫群には認められなかった。鼻内からの菌回収には両群の差は認められなかった。増体重は、図６に示したとおりＢｂ生菌に加え壊死毒素による攻撃を実施した群間で差が認められた。２週齢時に実施した１回目の壊死毒素攻撃では、対照群の増体率は免疫群の約１／３に低下し、２回目攻撃(３週齢時)により対照群の全頭が死亡した。
【００６１】
【表５】
【００６２】
【表６】
【００６３】
実施例１１
(育成ブタでの有効性試験)
前記実施例２と同様にして得られた画分を前記実施例６のとおりに減毒化、前記実施例７のとおりに水酸化アルミニウムゲルを加えたトキソイド２〜５０μg/2ml/ドースを調製し、１０週齢ＳＰＦブタに３週間隔で２回筋肉内注射した。最終免疫から４週後に２億個のＢｂ生菌で鼻内攻撃し、攻撃後３週目までの壊死毒素中和抗体価及を検査した。表７に示したとおり対照ブタは攻撃後もＢｂＴ中和抗体陰性であった。免疫群は全頭がＢｂＴ中和抗体が陽転した。攻撃により２及び６μg/２ml/ドースのトキソイド注射ブタは急激な中和抗体の上昇が認められたが、２０及び５０μg/２ml/ドース以上では上昇しなかった。
【００６４】
壊死毒素には抗体産生抑制作用のあることが報告されている(Sekiya，K.,マイクロバイオロジー アンド イムノロジー: Microbiol．Immunol.，２７，ｐ.９０５〜９１５(１９８３))。攻撃後、対照ブタに中和抗体が上昇しない理由は、攻撃菌の産生するＢｂＴの作用によるものと考えれらえる。従って、免疫群における急激な中和抗体の上昇はＢｂＴの抗体産生抑制作用を防御した結果であることから、育成ブタでは２μgのＢｂＴトキソイドでも有効であることが示唆された。
【００６５】
【表７】
【００６６】
調製例４
(菌体破砕抽出液：ＢｂＴトキソイド１)
ＢｂＳ６１１株をペプトン培地で３７℃、２４時間通気撹拌培養した。菌体を遠心濃縮後、菌体破砕処理し菌体残渣を遠心あるいは膜ろ過(ポアー径０.４５μm)で除去した溶液(粗ＢｂＴ画分)にホルマリンを終濃度０.８％に加えて３７〜４０℃で７日間減毒した。このトキソイドをリン酸緩衝食塩水に対して透析した。透析内容物に水酸化アルミニウムゲルを１mg(アルミニウム量換算)/mlに加えてＢｂＴトキソイド１とした。
【００６７】
調製例５
(ＢｂＴトキソイド２)
前記調製例４と同様にして得られた粗ＢｂＴ画分をセルロース硫酸エステルゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)で平衡化したセルロース硫酸エステルゲルに粗ＢｂＴを通液し、同緩衝液で洗浄した。ＢｂＴは１.５ＭＮａＣｌ，１Ｍ尿素添加２０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)でセルロース硫酸エステルゲルカラム(７.８cm(内径)×４５cm)から溶出した。この溶出画分(ＣＳ１画分)を前記調製例４と同様に減毒処理を行ない、透析後、水酸化アルミニウムゲルを加えてＢｂＴトキソイド２とした。
【００６８】
調製例６
(ＢｂＴトキソイド３)
前記調製例５と同様にして得られたＣＳ１画分をさらにＴＳＫゲルＨＷ65(２.６４cm(内径)×６９cm)及びＨＷ75(２.６４cm(内径)×６４cm)連結カラムで精製した。０.３Ｍ硫酸ナトリウム、１Ｍ尿素加０.０５Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.２)で平衡化させたカラムにＣＳ１画分を通液し、同緩衝液で分画後、壊死毒活性を有する画分を混合した。この画分を前記調製例４と同様に減毒処理を行ない、透析後、水酸化アルミニウムゲルを加えてＢｂＴトキソイド３とした。
【００６９】
調製例７
(ＢｂＴトキソイド４)
前記調製例４と同様にして得られた粗ＢｂＴ画分をセルロース硫酸エステルゲルクロマトグラフィーにより精製した。０.１ＭＮａＣｌ加２０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)で平衡化したセルロース硫酸エステルゲルに粗ＢｂＴを通液し、同緩衝液で洗浄した。ＢｂＴは０.５ＭＮａＣｌ加２０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)でセルロース硫酸エステルゲルから溶出した。この画分(ＣＳ２画分)を前記調製例４と同様に減毒処理を行ない、透析後、水酸化アルミニウムゲルを加えてＢｂＴトキソイド４とした。
【００７０】
調製例８
(ＢｂＴトキソイド５)
前記調製例７と同様にして得られたＣＳ２画分をさらにAffi-gel blueカラム(ＢｉｏＲａｄ社製、１００-２００メッシュ、５.０cm(内径)×１７cm)で精製した。５０ｍＭ トリス緩衝液(ｐＨ ７.５)で平衡化させたAffi-gel blue カラムに同緩衝液に対して透析したＣＳ２画分を通液し、１Ｍ リン酸２ナトリウム加５０ｍＭトリス緩衝液(ｐＨ ７.５)で洗浄した。さらに５０ｍＭトリス緩衝液(ｐＨ ７.５)で洗浄後、２Ｍ塩化マグネシウム、１Ｍ尿素加５０Ｍｍトリス緩衝液(ｐＨ ７.５)でＢｂＴを溶出した。この画分を前記調製例４と同様に減毒処理を行ない、透析後、水酸化アルミニウムゲルを加えてＢｂＴトキソイド５とした。
【００７１】
調製例９
(ＢｂＴ抗毒素)
前記実施例１及び５と同様にして得られた高度精製ＢｂＴ画分を前記調製例４と同様に減毒処理を行ない、透析後、水酸化アルミニウムゲルを加えてＢｂＴトキソイド６とした。さらに、２７週齢ＳＰＦブタに対して当該トキソイドを３か月間で１mlずつ８回筋肉内接種してＢｂＴ抗毒素(中和価４,０９６倍、菌凝集抗体価２０倍以下)を得た。
【００７２】
調製例１０
(ＰｍＴトキソイド)
毒素原性ＰｍＤ型ｓ７０株をハートインフュージョンブロスで３７℃、２４時間通気撹拌培養した。菌体を遠心濃縮後、菌体破砕処理し菌体残渣を遠心あるいは膜ろ過(ポアー径０.４５μm)で除去した溶液(粗ＰｍＴと略)を陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。０〜０.３ＭＮａＣｌ加中性リン酸緩衝液またはトリス緩衝液で平衡化した陰イオン交換体に粗ＰｍＴを通液し、同緩衝液で洗浄した。ＰｍＴは０.４〜０.５ＭＮａＣｌを含む同緩衝液でイオン交換体から溶出した。この部分精製ＰｍＴ画分にホルマリンを０.４％に加え、３７℃で１４日間以上減毒した。このトキソイドをリン酸緩衝食塩水に対して透析した。透析内容物に水酸化アルミニウムゲルを１mg Al/mlに加えてＰｍＴトキソイドとした。
【００７３】
実施例１２
(各種精製方法により得られたＢｂＴトキソイドのモルモットでの免疫原性)
前記調製例４〜８と同様にして得られた３,０００ MND/ml(減毒前活性)のＢｂＴトキソイドをモルモット(Hartley,雌，５週齢)の大腿部筋肉内に０.５ml注射した。注射後２８日目に採血し、ＢｂＴ中和抗体価を検査した。中和抗体測定法は、非働化血清をリン酸緩衝食塩水で２倍階段希釈した。これに等量のＢｂＴ(力価 ４MND/０.１ml)を加え、氷冷下で一夜反応後、モルモットの皮下に０.１mlずつ注射した。判定は注射後１日目に実施し、中和価は壊死反応を阻止した血清の最大希釈倍数(血清希釈倍率)で示した。
【００７４】
表８に示したとおり、比活性が１.４×１０4 MND/mg蛋白のＢｂＴトキソイド１及び２を注射したモルモットではすべて中和抗体が陰性であった。比活性が３.７×１０4 MND/mg 蛋白のＢｂＴトキソイド３を注射したモルモットでは３頭中２頭が中和抗体が陽性で、７.８×１０4MND/mg 蛋白以上では全頭陽転した。
【００７５】
ＢｂＴは精製の過程で不溶化しやすく、脂質、酸性蛋白など菌体由来の物質と複合体を形成しやすい性質を有している(Wordlaw，A.C．and Parton，R.，Parmacol．Ther.,１９,ｐ.１〜５３(１９８３))。そのため、これらの菌体由来物質を低減することにより、より十分な減毒化が可能になるか、あるいはまた毒素活性部位のマスキングを減少させ抗原提示効率が向上することによりＢｂＴトキソイドの免疫原性が高まるものと考えられる。
【００７６】
【表８】
【００７７】
実施例１３
(ＢｂＴ中和抗体による防御ライン)
前記調製例１０で得られたＢｂＴ抗毒素 ０.２，１.０，２.０及び２０mlを２日齢ＳＰＦブタの腹腔内に注射して受身免疫を賦与した。３日齢時にＢｂＳ６１１株１０8CFUで鼻内攻撃し、さらに７日齢時に粗ＢｂＴ(１，９４０MND/頭)で筋肉内攻撃した。図７に示したとおり、ＢｂＴの致死作用に対してはＢｂＴ中和抗体価１倍以上で防御が認められ、壊死作用に対しては４倍以上で防御が可能であった。
【００７８】
実施例１４
(ＰｍＴ中和抗体による防御ライン)
前記調製例１０と同様にして得られた粗ＰｍＴのトキソイドを等量のフロイント不完全アジュバントで乳化した。８頭のＳＰＦ妊娠ブタのうち６頭を免疫群、２頭を対照群とした。免疫群は妊娠期間中に３mlのトキソイド(８４０ MND/ml)を２〜５回筋肉内注射した。分娩後、初乳を産子に十分飲ませ２日齢または９日齢時に２０〜１６０MNDの粗ＰｍＴで筋肉内攻撃した。子ブタは攻撃後１４日間観察し鼻甲介病変を観察した。表９に示したとおり、ＰｍＴの鼻甲介萎縮作用に対してはＰｍＴ中和抗体価２倍以上で防御が認められ、致死作用に対しては２倍以下でも防御が可能であった。
【００７９】
【表９】
【００８０】
実施例１５
(ＢｂＴ抗毒素受身免疫ブタのＢｂ及びＰｍ攻撃試験)
前記調製例１０で得られたＢｂＴ抗毒素２０mlを２日齢ＳＰＦブタの腹腔内に注射して受身免疫を賦与した。３日齢及び７日齢時にそれぞれＢｂＳ６１１株１０8CFU及びＰｍＤ型s70株１０8CFUで鼻内攻撃し、６週齢で剖検した。表１０に示すように、ＢｂＴ抗毒素でＢｂの鼻粘膜から大量の菌が回収されたが、Ｐｍの回収は対照に比べると大幅に少なかった。また、対照群の鼻甲介病変は重度(+++)〜極度(++++)であったが、免疫群は一頭が正常(−)で残りが重度及び極度と個体間における差が大きかった。
【００８１】
【表１０】
【００８２】
壊死毒素は菌体内に産生され、溶菌に伴い菌体外に放出される。従って、ＢｂＴ抗毒素によってＢｂの鼻粘膜定着を阻止することはできない。Ｐｍが定着するためには予めＢｂが粘膜に障害を与えていなくてはならない。Ｂｂの産生する鼻粘膜障害因子としては、ＢｂＴ(Elias，B.ら，ジャパニーズ ジャーナル ヴェテリナリー サイエンス: Jpn．J．Vet．Sci.，５２,ｐ.６７７〜６８８(１９９０))及び気管細胞毒素(Cookson，B.T．and Goldman，W.E.,ジャーナル オブ セルラー バイオケミストリー: J．Cell．Biochem.,１１B(Suppl.)ｐ.１２４；Dugal，F.らカナディアン ジャーナル ヴェテリナリー リサーチ:Can．J．Vet．Res.,５６，ｐ.２６０-２６４(１９９２))が重要である。気管細胞毒素はＰｍの定着促進に重要な気管線毛運動停止作用や線毛上皮細胞崩壊作用及び粘液分泌亢進作用を有するため、ＢｂＴ抗毒素による免疫ではＰｍ定着を部分的にしか阻止することはできない。
【００８３】
これらの事実からＰｍの鼻粘膜への定着を阻止するためには、少なくともＢｂＴ及び気管細胞毒に対する免疫を成立させる必要がある。しかし、気管細胞毒トキソイドは精製方法の確立、免疫原性、収量など実用化までには多くの問題を抱えている。そのため、萎縮性鼻炎の主症状を予防し経済的損失を抑制するためのＡＲ不活化ワクチンとしては少なくとも壊死毒混合トキソイドを含有する必要がある。
【００８４】
実施例１６
(トキソイド混合例)
前記実施例２及び６と同様にして得られた減毒化ＢｂＴに水酸化アルミニウムゲルを加え攪拌した。ＢｂＴ濃度を８,７００〜２２０,０００MND/ml(減毒前毒素量ＢｂＴ蛋白で２〜５０μg/mlに相当)に、アルミニウム濃度を０.５〜２.５mg/mlになるよう調製し、保存剤を加えてＢｂＴ原液とした。
【００８５】
前記調製例１１と同様にして得られた水酸化アルミニウムゲル添加減毒化ＰｍＴを３,４００MND/ml以上(減毒前毒素量)に調製し保存剤を加えてＰｍＴ原液とした。保存剤としては、０.０１％チメロサールあるいは０.１〜０.４％ホルマリンを使用した。ＢｂＴ原液及びＰｍＴ原液を等量ずつ加えて混合トキソイドを調製した。
【００８６】
この混合トキソイドを９週齢ＳＰＦブタの頚部筋肉内に３週間隔で２回、２mlずつ接種した。経時的に血清を採取し、ＢｂＴ中和抗体価並びにＰｍＴ中和抗体価を測定した。ＰｍＴ中和抗体価は牛胎仔肺細胞(Rutter，J.M. and Luther，P.D.，ヴェテリナリー レコード:Vet．Rec.,１１４,ｐ.３９３〜３９６(１９８４))を用いた中和試験により求めた。ブタでの中和抗体価を表１１に、マウスでの力価試験成績を表１２に示した。ＢｂＴ及びＰｍＴの各単味トキソイドと混合トキソイドはブタ及びマウスに注射したとき免疫原性の差が認められず、防御に十分な中和抗体応答が認められ、また安全性も十分であった。
【００８７】
【表１１】
【００８８】
【表１２】
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は本発明による壊死毒素精製法の過程のクロマトグラムを示す。
【００９０】
【図２】図２は本発明による壊死毒素精製法の過程のクロマトグラムを示す。
【００９１】
【図３】図３は本発明による壊死毒素精製法の過程のクロマトグラムを示す。
【００９２】
【図４】図４は本発明による壊死毒素精製法を用いて得られた壊死毒素画分の分析結果を示す。
【００９３】
【図５】図５は本発明によって得られるトキソイドのマウス力価試験の結果を示す。
【００９４】
【図６】図６は本発明によって得られるトキソイドの妊娠ブタでの有効性試験の結果を示す。
【００９５】
【図７】図７はＢｂＴ中和抗体による防御ラインの検討結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボルデテラ・ブロンキセプティカ（気管支敗血症菌）が産生する壊死毒素の含有液を、直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルまたは天然高分子重合体または人工高分子重合体からなるクロマト担体ゲルにヘパリン、スルフォプロピル基もしくは分子内にスルフォン基を有するブルー色素が単独でもしくは組み合わされて結合されたゲルに接触せしめ、当該壊死毒素を吸着させた後、吸着した壊死毒素をゲルから溶出することによって得られる部分精製壊死毒素、あるいは当該部分精製壊死毒素を他の精製方法と組み合わせてさらに高純度に精製したものを、化学的処理により免疫原性を保持しながら活性を消失させた、３７,０００最少壊死毒単位（以下、ＭＮＤと略称する）／ｍｇ蛋白以上の比活性を有するボルデテラ・ブロンキセプティカ壊死毒素のトキソイド。
【請求項２】
該部分精製壊死毒素が、下記の工程：
(1) 直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを、ｐＨ７〜９、３〜２０ｍＳ／ｃｍの範囲にある所定の比電導度以下の緩衝液であらかじめ処理して平衡化したのち、
(2) ボルデテラ・ブロンキセプティカ壊死毒素含有液をｐＨ７〜９、温度０〜３０℃、３〜２０ｍＳ／ｃｍの範囲にある所定の比電導度以下の条件下で直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルに接触させ、
(3) 壊死毒素のゲルからの溶出処理に先だって、吸着ゲルをｐＨ５〜１０、３〜２０ｍＳ／ｃｍの範囲にある所定の比電導度以下の緩衝液で洗浄し、
(4) 壊死毒素のゲルからの溶出を、ｐＨ５〜１０、３〜２０ｍＳ／ｃｍの範囲にある所定の比電導度以上〜１３０ｍＳ／ｃｍの緩衝液を用いて行なう
からなる方法によって得られる部分精製壊死毒素である請求項１に記載のボルデテラ・ブロンキセプティカ壊死毒素のトキソイド。
【請求項３】
ボルデテラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドおよびパスツレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドを主成分とする混合ワクチン。
【請求項４】
請求項１または２に記載のボルデテラ・ブロンキセプティカ（気管支敗血症菌）が産生する壊死毒素のトキソイドおよびパスツレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドを主成分とする請求項３に記載の混合ワクチン。
【請求項５】
３７,０００ＭＮＤ／ｍｇ蛋白以上の比活性を有するボルデテラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドを含有する請求項３に記載の混合ワクチン。
【請求項１】
ボルデテラ・ブロンキセプティカ（気管支敗血症菌）が産生する壊死毒素の含有液を、直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルまたは天然高分子重合体または人工高分子重合体からなるクロマト担体ゲルにヘパリン、スルフォプロピル基もしくは分子内にスルフォン基を有するブルー色素が単独でもしくは組み合わされて結合されたゲルに接触せしめ、当該壊死毒素を吸着させた後、吸着した壊死毒素をゲルから溶出することによって得られる部分精製壊死毒素、あるいは当該部分精製壊死毒素を他の精製方法と組み合わせてさらに高純度に精製したものを、化学的処理により免疫原性を保持しながら活性を消失させた、３７,０００最少壊死毒単位（以下、ＭＮＤと略称する）／ｍｇ蛋白以上の比活性を有するボルデテラ・ブロンキセプティカ壊死毒素のトキソイド。
【請求項２】
該部分精製壊死毒素が、下記の工程：
(1) 直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを、ｐＨ７〜９、３〜２０ｍＳ／ｃｍの範囲にある所定の比電導度以下の緩衝液であらかじめ処理して平衡化したのち、
(2) ボルデテラ・ブロンキセプティカ壊死毒素含有液をｐＨ７〜９、温度０〜３０℃、３〜２０ｍＳ／ｃｍの範囲にある所定の比電導度以下の条件下で直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルに接触させ、
(3) 壊死毒素のゲルからの溶出処理に先だって、吸着ゲルをｐＨ５〜１０、３〜２０ｍＳ／ｃｍの範囲にある所定の比電導度以下の緩衝液で洗浄し、
(4) 壊死毒素のゲルからの溶出を、ｐＨ５〜１０、３〜２０ｍＳ／ｃｍの範囲にある所定の比電導度以上〜１３０ｍＳ／ｃｍの緩衝液を用いて行なう
からなる方法によって得られる部分精製壊死毒素である請求項１に記載のボルデテラ・ブロンキセプティカ壊死毒素のトキソイド。
【請求項３】
ボルデテラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドおよびパスツレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドを主成分とする混合ワクチン。
【請求項４】
請求項１または２に記載のボルデテラ・ブロンキセプティカ（気管支敗血症菌）が産生する壊死毒素のトキソイドおよびパスツレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドを主成分とする請求項３に記載の混合ワクチン。
【請求項５】
３７,０００ＭＮＤ／ｍｇ蛋白以上の比活性を有するボルデテラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドを含有する請求項３に記載の混合ワクチン。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−３４２１７５（Ｐ２００６−３４２１７５Ａ）
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２１４５８２（Ｐ２００６−２１４５８２）
【出願日】平成１８年８月７日（２００６．８．７）
【分割の表示】特願平８−５０１９２５の分割
【原出願日】平成７年６月７日（１９９５．６．７）
【出願人】（０００１７３５５５）財団法人化学及血清療法研究所 (86)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月７日（２００６．８．７）
【分割の表示】特願平８−５０１９２５の分割
【原出願日】平成７年６月７日（１９９５．６．７）
【出願人】（０００１７３５５５）財団法人化学及血清療法研究所 (86)
【Ｆターム（参考）】
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