ポックスウイルスゲノムへの異種遺伝子の組込みのためのベクター
【課題】ポックスウイルスのゲノムに異種配列を挿入するのに有用な核酸配列を含むＤＮＡベクターの提供
【解決手段】ポックスウイルスゲノム由来の転写制御因子又は転写制御因子のコンセンサス配列がクローニング部位に導入されているベクター、マーカー遺伝子、治療用遺伝子、ホスト域遺伝子および／または免疫原性抗原決定基のグループから選択される異種コーディング配列、マーカー遺伝子、ホスト域遺伝子を含むベクターにより転移された核酸配列をそのゲノム中に含む、組換え型ポックスウイルス、および、ポックスウイルスゲノムに異種配列を導入する方法。
【解決手段】ポックスウイルスゲノム由来の転写制御因子又は転写制御因子のコンセンサス配列がクローニング部位に導入されているベクター、マーカー遺伝子、治療用遺伝子、ホスト域遺伝子および／または免疫原性抗原決定基のグループから選択される異種コーディング配列、マーカー遺伝子、ホスト域遺伝子を含むベクターにより転移された核酸配列をそのゲノム中に含む、組換え型ポックスウイルス、および、ポックスウイルスゲノムに異種配列を導入する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相同組換えを利用したポックスウイルスのゲノム中への異種配列の挿入に有用な核酸配列を含む、新規のＤＮＡベクターを供給するものである。本発明はまた、特に本発明によるベクターにより転移される異種のコーディング配列を保持している組換え型のポックスウイルスに関連するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウエスタンリザーブ、コペンハーゲン、アンカラといったワクシニアウイルス株のような、オルソポックスウイルス生菌でのワクチン注射による天然痘の世界的な根絶の成功は、８０年代初期のより厳密で詳細にわたるポックスウイルスの研究を刺激した。その後、天然痘ウイルスは詳細に理解され、扱いやすいウイルスベクターもしくは研究のツールとして開発された（Ｍｏｓｓ， １９９６）。今日では、ポックスウイルスベクターは例えば発現ベクターとして、もしくはワクチン開発や治療物質の開発のために様々な分野で使用されている。ポックスウイルスベクターの高い許容性の大きな理由は、以下に示す有望な特徴からである：第一に、ベクターウイルスは操作が簡単であり、安定性が高く、安価に作成できる。第二に、上述のベクターウイルスは大量の異種遺伝子に適合することができ、そして多用途な発現ベクターであることが証明されている。第三に、容易にｉｎ ｖｉｖｏで導入することができ、そして体液性・細胞性免疫応答の刺激を起すことができる。従って、感染症もしくは癌に対する防御的免疫のための組換え型ワクチンとしての使用は、ポックスウイルスベクターを特に魅力的なものとする。特に、オルソポックスウイルス科のよく知られたメンバーであるワクシニアウイルスは、多くの多様な動物モデルでの疾病防御に対する組換え型ワクチンとして首尾よく使用されてきた（Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｓｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４ａ）。
【０００３】
組換え型ワクシニアウイルスの開発と樹立のために、いくつかの挿入部位が使用された。ワクシニアゲノムでの最も目だった挿入部位は、ウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子の遺伝子座である（Ｍａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９８２）。しかしながら、ウイルスヘマグルチニン遺伝子およびリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子（Ｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９８７， Ｈｏｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ． １９９６）のような必須ではない他の遺伝子または自然発生した欠如部位ＩＩや欠如部位ＩＩＩもまた、ワクシニアウイルスゲノムへの異種遺伝子ＤＮＡ配列の挿入に使用されたきた（Ｓｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４ａ）。いくつかの異種遺伝子または免疫原性のある抗原決定部位を保持する組換え型ウイルスベクターの構築は、より一層一般的な興味の対象となっている。それゆえに、ウイルスゲノムにおいて、さらなる異種遺伝子配列の導入に適したさらなる部位を同定することに対する強い要請がある。
【０００４】
ポックスウイルスゲノムへの異種なＤＮＡ配列の導入は、ポックスウイルスの生活環の完全な理解を欠いていることから、ウイルス繁殖に必須の領域を破壊するリスクを負っている。いくつかのポックスウイルスゲノムの配列情報（Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ． １９９０； Ａｎｔｏｉｎｅ ｅｔ ａｌ． １９９８）が利用可能であるが、同定されたオープンリーディングフレームによりコードされる大抵の蛋白質の機能は知られていない。それゆえに、ウイルスの複製および増殖に必須な任意の配列を破壊することなしに、異種遺伝子を安定的に取り込ませるのに適したゲノム中の位置の決定はいまだに複雑な試みである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ポックスウイルスゲノムにおける新規の挿入部位を同定し、該挿入部位への異種ＤＮＡ配列の直接的な組込みに適したベクターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前述の目的および他の目的を達成するために、本発明は、配列番号１による核酸配列またはそれの相補鎖を含むベクターを提する。配列番号１による核酸配列は、ポックスウイルスゲノムの部分的なゲノム配列と高度に相同性がある。この相同性ゆえに、本発明による核酸配列は、上述の配列とポックスウイルスの相当するゲノム配列の間で相同組換えを起す能力がある。従って本発明は、異なるオルソポックスウイルスゲノム中に、好ましくは改変されたワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）のゲノム中に、さらにまた、例えばワクシニアウイルス株であるウエスタンリザーブ、コペンハーゲンというのような関連するオルソポックスウイルスなどのゲノム中に、ＤＮＡ配列を直接的に組込むために有用な手段を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明で言及された配列番号１の構造。
【図２】本発明で作成されたｐＳＷ１プラスミドの制限酵素認識部位を示したマップ。
【０００８】
好ましい実施例によると、本発明の核酸配列は、改変されたワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、特に、単離され且つブダペスト条約に従って１９９４年１月２７日に寄託番号Ｖ９４０１２７０７でＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， ＵＫ）に保管されたＭＶＡに由来するものである。
【０００９】
本発明はさらに、厳格な条件下において、配列番号１による配列もしくはそれの相補鎖にハイブリダイズする核酸配列を含むベクターを供給する。本発明との関連において、“ベクター”という用語はプラスミド、コスミドのような環状構造をとるもの、または人工染色体でのＤＮＡの伝達手段と理解される。上述のベクターは目的とする核酸配列に加えて、制御的配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、選択マーカー遺伝子、そしてベクターの自己複製を可能にするレプリコンから構成される。従って、本発明によるベクターは単細胞のホスト生物中で容易に増幅され、分離されうる。さらに“厳格な条件下”という用語は、反応温度、ホルムアミド濃度もしくは塩濃度のような、ＤＮＡ―ＤＮＡ配列（相同性が約７０％付近以上）のハイブリダイゼーションを許容する標準的なプロトコールによるパラメーターを定義する。上記のように、ポックスウイルスゲノムの相当する配列にハイブリダイズするこれらの配列は、特に、オルソポックスウイルスのゲノムへの異種配列の組込みに有用である。
【００１０】
加えて、本発明は上記で言及した核酸配列の断片を含むベクターを提供する。これらの断片は上述の核酸配列の連続的な塩基対を含んでおり、そしてまた相同組換えによるポックスウイルスゲノムへの組込みに有用である。上述の断片の長さは変異に富んでおり、そしてポックスウイルスゲノムの相当する部分と３０塩基対でのみ相同である断片でも、組換えを引き起こすのには十分である。しかしながら、ポックスウイルスゲノムと本発明で使用されるような断片の間の相同組換えの効率を増加するために、上述の断片は長さで約２００塩基対以上であることが好ましく、約３００もしくは約５００塩基対以上であればより好ましい。
【００１１】
相同組換えを開始するために、本発明によるベクターと野生型のポックスウイルスがホスト細胞に導入された。ポックスウイルスゲノムの複製の間に、ベクターに挿入された核酸配列とポックスウイルスゲノムの相当する配列の間で相同組換えが生じる。相同組換えは統計学的確率上１：１０３から１：１０４程度の確率で生じるので、生成したあらゆる組換え型ポックスウイルスも分離される必要がある。このため、例えば機能的に関連する制御因子をもつマーカー遺伝子が、ベクター内にもうけられた核酸配列のクローニングサイトに挿入された。相同組換え後に生成した組換え型ポックスウイルスはそれぞれ、上述のマーカー遺伝子の発現に対するスクリーニング、もしくは優性選択マーカー遺伝子の発現に対する選択により分離された。
【００１２】
さらなる実施例によると、本発明のベクターは、特にポックスウイルスゲノムへの目的の異種コーディング配列の挿入に対して特に有用である。本発明との関連において、“異種”という用語は、自然界で密接に関連しているものでは通常は認められない核酸配列の任意の組み合わせに対して使用される。本発明による異種遺伝子は、好ましくはマーカー遺伝子の一群、抗ウイルス遺伝子、抗腫瘍遺伝子、サイトカインもしくはケモカイン遺伝子、自殺遺伝子のような治療用遺伝子から選択されるが、またホスト域遺伝子もしくは免疫原性のある抗原決定基からも選択される。ポックスウイルスゲノムを用いた目的の異種コーディング配列の挿入および／または発現のために、上述の異種コーディング配列が核酸配列内のクローニングサイトに挿入される。
【００１３】
一般的には、クローニングサイトは制限酵素認識部位である。本発明によると、異種配列の挿入における好ましいクローニングサイトはＥｃｏＲＩ酵素の制限酵素認識部位である。ＥｃｏＲＩ認識部位は本発明の核酸配列中でユニークであり、そして上述の核酸配列に含まれる２つのＯＲＦの間に配置されている（図１）。これとは別に、上述の２つのＯＲＦ間の非コーディング領域に配置されるさらなる任意の制限酵素認識部位が、クローニングサイトとして使用可能である。意外にも、ＯＲＦの１つに位置するいかなるクローニングサイトもまた、異種配列の挿入に使用することができる。特に、発明者等はＯＲＦへのそのような挿入による上述ＯＲＦの破壊は、それぞれウイルスの生活環もしくは複製効率を妨害しないことを見出した。同様に、相同組換えを惹起するためにベクター内に導入された本発明による断片の使用もまた、ウイルスの繁殖および複製効率に影響しないことが発明者等によって見出された。
【００１４】
一般的に、相同組換えによってウイルスゲノム内に組込まれる異種配列の両端は、ウイルスゲノムの相当する配列に対して相同である配列に接している。しかしながら、本発明はまた、異種配列の片側のみが上述の核酸配列に接しているベクターを含む。本発明によると、断片および望ましい異種配列を含んでいるベクターは、ポックスウイルスゲノムへ上述の異種配列を挿入するために有用である。
【００１５】
挿入された異種コーディング配列の発現を保証するために、少なくとも１つの転写制御因子が付加的にクローニングサイトに挿入される。この転写制御領域は異種のコーディング配列に機能的に関連しており、それにより、発現を制御および／または可能にする。本発明のさらなる好ましい実施例によると、この転写制御因子はポックスウイルスに由来し、および／またはポックスウイルス由来の転写制御因子のコンセンサス配列である。
【００１６】
本発明のさらなる実施例によると、このベクターは、特にクローニングサイトに挿入された例えばマーカー遺伝子もしくはホスト域遺伝子、および／または転写制御因子などの１以上の異種のコーディング配列に接する少なくとも２つの組換え型の（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）配列を含む。“組換え型配列”という用語は、ゲノム内の相同組換えにより上述の組換え型配列間の任意の配列を（それらの類似性もしくはほぼ同一の構造により）削除する能力のある核酸配列を定義する。従って、上述の組換え型配列に接している配列はウイルスゲノムに一時的にのみ挿入され、そして引き続き完全に削除される。上述の組換え型の（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）配列に接する配列の削除は、治療用遺伝子もしくは免疫原性遺伝子をコードする異種のコーディング配列のみを含み、どのようなさらなるマーカーもしくはホスト域遺伝子も含まないはずの組換え型ポックスウイルスを分離するために特に重要である。このために、マーカー遺伝子、ホスト域遺伝子、および／または結局は転写制御因子も（しかし、例えば治療用遺伝子もしくは免疫原性の抗原決定基のような目的とする異種コーディング配列は除く）、そのような組換え型配列に接している。マーカー遺伝子もしくはホスト域遺伝子の選択圧の下で行われる組換え型ウイルスの分離の後に、選択圧が解除されて、マーカー遺伝子もしくはホスト域遺伝子を削除するためのゲノム内での相同組換えが許容される。
【００１７】
本発明はさらに、ゲノム内に本発明によるベクターにより転移された核酸配列を含む組換え型ポックスウイルスを提供する。この組換え型ウイルスは組換え型のＭＶＡウイルスであることがもっとも好ましい。
【００１８】
本発明のさらなる実施例は、感染症もしくは増殖性の障害の治療および／または予防の方法を提供する。上述の方法は、本発明による組換え型ポックスウイルスで標的細胞の集団を感染させる（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの何れか）方法を含む。或いは、この方法によると、標的細胞は本発明によるベクターで形質導入（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの何れか）され、そして本発明の組換え型ポックスウイルスを含む任意のオルソポックスウイルスで同時に、または時間をずらして感染される。この場合、ポックスウイルスは細胞にウイルスの複製と転写機構を供給する。結果的に、ベクターに取り込まれ、ポックスウイルス由来の転写制御因子で制御される目的の異種のコーディング配列は、標的細胞内で発現する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入され感染された標的細胞は、本発明の方法により、ヒトを含む動物の生体に適用されうる。
【００１９】
本発明は感染症もしくは増殖性の障害の治療および／または予防に有用なベクター、組換え型ポックスウイルス、および／または本発明による標的細胞を提供する。さらに、本発明によるベクター、組換え型ポックスウイルス、および／または標的細胞は上記のようにｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子の運搬に有用な薬学的な構成物（特にワクチン）の生産、および／またはヒトを含む哺乳類でのワクチン接種に使用される。
【００２０】
本発明は特に以下に示す要件の単独もしくは組み合わせから構成される。
【００２１】
ポックスウイルスゲノムへの異種コーディング配列の挿入に使用するベクターであって、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群の中から選択された１以上の因子から構成される核酸配列を含む：
（ａ）配列番号１による核酸配列またはその相補鎖；
（ｂ）厳格な条件下で（ａ）に定義する配列とハイブリダイズする核酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に定義される核酸配列のうち少なくとも連続的な３０塩基対を含む断片。
【００２２】
前記核酸配列が改変されたワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）に由来する前記のベクター。
【００２３】
付加的に少なくとも１つの転写制御因子が当該核酸配列の中の少なくとも１つのクローニングサイトに導入されている前記のベクター。
【００２４】
前記転写制御因子がポックスウイルスゲノム由来であるか、またポックスウイルス由来の転写制御因子のコンセンサス配列である前記のベクター。
【００２５】
付加的に少なくとも１つの異種コーディング配列を含み、該異種コーディング配列は前記の転写制御因子と機能的に関連するものである前記のベクター。
【００２６】
前記異種コーディング配列がマーカー遺伝子、治療用遺伝子、ホスト域遺伝子および／または免疫原性抗原決定基のグループから選択される前記のベクター。
【００２７】
マーカー遺伝子、ホスト域遺伝子、および／または前記の転写制御因子をコードする１以上の異種コーディング配列に接している組換え型の配列を含む、前記のベクター。
【００２８】
前記ベクターにより転移された核酸配列をそのゲノム中に含む、組換え型ポックスウイルス。
【００２９】
ポックスウイルスが改変されたワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）である前記の組換え型ポックスウイルス。
【００３０】
ポックスウイルスゲノムに異種配列を導入する方法であって、
（ａ）前記ベクターを用いて、ホスト細胞を形質導入することと；
（ｂ）上述のホスト細胞をポックスウイルスで感染させることと；
（ｃ）組換え型ポックスウイルスを分離することと
を含む方法。
【００３１】
動物生体（ヒトを含む）の感染症もしくは増殖性の障害を治療および／または予防する方法であって、前記動物生体に対して、前記ポックスウイルス、および／または前記ベクターの適用、或いは他の何れかのポックスウイルスによる前記ベクターの適用を含む方法。
【００３２】
前記組換え型ポックスウイルスがオルソポックスウイルスに由来する前記の方法。
【００３３】
前記の組換え型ポックスウイルス、および／または前記ベクターを含む標的細胞。
【００３４】
感染症もしくは増殖性の障害の治療および／または予防のための、前記ベクター、前記組換え型ポックスウイルス、および／または前記標的細胞。
【００３５】
前記ベクター、前記組換え型ポックスウイルス、および／または前記標的細胞の使用であって、感染症もしくは増殖性障害の治療および／または予防のための薬物を生産するための使用。
【００３６】
前記ベクター、前記組換え型ポックスウイルス、および／または前記標的細胞、並びに薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤を含む医薬組成物。
【００３７】
前記ベクター、ポックスウイルス（前記の組換え型ポックスウイルスを除く）、並びに薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤を含む医薬組成物。
【００３８】
下記の実施例はさらに本発明を説明する。当業者は、提出された実施例が、本発明より提供される技術の適用性をこの実施例に制限するようには決して解釈されないことを十分に理解するであろう、それゆえに本発明は付属の請求項の全範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００３９】
実施例１
挿入ベクターの構築
ポックスウイルスゲノムへの組換えに適した配列を得るために、改変されたワクシニアアンカラウイルス（寄託番号Ｖ９４０１２７０７でＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， ＵＫにブタペスト条約により保管された）に由来するＤＮＡ断片が、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した通常のＰＣＲ法により増幅された。
Ａ２４Ｒ＿１；５’−ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＡＣＧＣＣＡＧＡＧＧ−３’， 配列番号２
Ａ２７Ｌ＿１ｃ；５’−ＡＧＧＣＴＣＧＡＧＴＡＡＧＡＧＣＧＧＣＴＡＴＧＡＴ−３’， 配列番号３
オリゴヌクレオチドプライマーは、クローニングベクターへの生成した増殖断片のサブクローニングのために、５’端の近くに下線で示された制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号２）もしくはＸｈｏＩ（配列番号３）の認識配列を含んでいる。それにより、１．７ｋｂの特異的に増幅された配列（配列番号１）がｐＵＣ１９クローニングプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．： Ｘ０２５１４）にＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでサブクローニングされた。生成したプラスミドはｐＳＷ１（図２）と名づけられた。
【００４０】
サブクローニングされたインサートの配列が調べられ、そしてこの配列はワクシニアウイルス株であるコペンハーゲン、ＷＲ、ＭＶＡからの他の既知の配列と比較された。上述の配列はＭＶＡ−ＡＴＩ領域の部分配列を含むことがわかった。大抵のオルソポックスウイルスのＡＴＩ遺伝子は、感染した細胞で光学顕微鏡により観察しうる、いわゆる封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ）と称する成熟したウイルス体に埋め込まれた密集した細胞質間充質を形成する。推測上のＡＴＩの機能は、一般的な環境下での感染性ウイルス粒子の高い安定性と伝播性の延長である。オルソポックスウイルスはエクトロメリアウイルス、牛痘ウイルス、アライグマポックスウイルスを含むいくつかのグループであり、１３０ｋＤａから１６０ｋＤａの典型的な封入体蛋白質を産生する。しかしながら、例えばワクシニアウイルスウエスタンリザーブ（ＷＲ）、ワクシニアウイルスコペンハーゲンもしくはＭＶＡのようなオルソポックス属の他のメンバーは、そのような封入体を形成しない。これは配列の削除もしくはフレームシフト変異の結果であり、コーディング配列の欠失を導き、またＡＴＩホモログの欠如を生じる。例えば、ワクシニアウイルスＷＲは９４ｋＤａのＡＴＩホモログを発現するが、一方、ＭＶＡとワクシニアウイルスコペンハーゲンはそのようなＡＴＩホモログを発現しない。
【００４１】
挿入ベクターのさらなる構築のために、自然発生した制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位が、増幅した配列を２つの部分に分離するために使用された。これらの分節はフランキング領域（ｆｌａｎｋ１、ｆｌａｎｋ２）として働き、ポックスウイルスゲノムとの相同組換えを起こさせる。それらのフランキング領域の間に、操作される異種遺伝子の挿入のためのマルチプルクローニングサイトに加え、例えば、７．５プロモーター（７．５）、および／または合成したプロモーターによるワクシニアウイルスのプロモーター配列が挿入された。生成したプラスミドはｐＳＷ−７．５−ｓＰ， ｐＳＷ−７．５， ｐＳＷ−ｓＰと名づけられた。
【００４２】
また、ＥＧＦＰフュージョン遺伝子（ｐＥＧＦＰ， Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ， ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃： Ｕ７６５６１から分離された）と融合させたワクシニアウイルスのホスト域遺伝子（Ｋ１Ｌ）から成る発現カセットと、天然に存在するＫ１Ｌプロモーターが上記のフランキング領域の間に挿入された。この発現カセットは組換え型のウイルスの効率的な選択と分離に特に有用である。生成したプラスミドはｐＳＷｋ１ｌｇｆｐと名づけられた。
【００４３】
組換え型ウイルスの産生
組換え型ウイルスを産生するために、およそ８０％コンフルエントの単層培養細胞を有する６ウェルの組織培養プレートが使用された。組換え型ＭＶＡを産生するために、ニワトリ胚繊維芽細胞のような許容細胞（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｃｅｌｌ）が使用された。組換え型ＷＲ株ワクシニアウイルスを産生するために、アフリカミドリ猿の細胞（Ｖｅｒｏ）が使用された。
【００４４】
最初に、細胞培養の培地を除去し、ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が０．０１（例えば、１ウェル５ｘ１０５細胞１ｍｌ培地中に接種物５ｘ１０３ＩＵ（感染単位））の野生型のポックスウイルスを含んだ無血清培地が細胞の上に層状に加えられた。この混合物は、３７℃、５％ ＣＯ２存在下で１時間インキュベーションされた。そして、接種物が除かれ、細胞がウェル毎に２ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭで２回洗浄された。
【００４５】
引き続き、単層細胞は、メーカー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）記載の方法により調整したリポフェクチン／プラスミドＤＮＡ混合物（全量：１ｍｌ）およびｐＳＷｋ１ｌｇｆｐのプラスミドＤＮＡ１５μｇでカバーされた。この混合物は、５％ ＣＯ２の存在下において、３７℃で５−１２時間インキュベーションされた。次いで、リポフェクチン／プラスミドＤＮＡ混合物が除かれ、細胞は、１．５ｍｌの１０％ＦＣＳが添加された新鮮な培地でカバーされた。感染の４８時間後に、単層細胞はセルスクレーパーではがされて、細胞および培地は２ｍｌの遠心チューブに移された。トランスフェクション回収物は、‐２０〜‐８０℃で保存された。ポックスウイルス感染細胞へのｐＳＷｋ１ｌｇｆｐプラスミドのトランスフェクションに際して、ＥＧＦＰ遺伝子に融合したホスト域遺伝子Ｋ１Ｌは、ベクタープラスミドのフランキング領域と相同性のあるポックスウイルスゲノムの部位に正確に組換えられる。
【００４６】
非組換え型のＭＶＡウイルスから組換え型ＭＶＡウイルスを分離するために、ホスト域細胞であるウサギ腎臓（ＲＫ）１３が、上記のトランスフェクション実験で得られたウイルス成分で感染された。以前の研究において、ＲＫ１３細胞でのＭＶＡ感染は、ウイルスＲＮＡの中間生成物の合成損傷およびウイルスＤＮＡの複製欠如を特徴とするウイルス複製の早期阻害に至ることが示された。しかしながら、このＲＫ１３細胞での非生産的ＭＶＡ感染は、ワクシニアウイルスのホスト域遺伝子であるＫ１Ｌの過剰発現によって克服することができた（Ｓｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４ｂ）。従って、ＲＫ１３培養細胞に対する上記トランスフェクション実験で得られたウイルス成分の接種は、Ｋ１Ｌ遺伝子を共発現する組換え型のみの高選択的繁殖を生じた。６ウェルもしくは９６ウェルの組織培養プレートにおいて培養されたＲＫ１３細胞上で連続的に５回継代した後に、ＭＶＡ−Ｋ１ＬＧＦＰウイルスが分離された。非組換え型のＭＶＡが存在しないことはＰＣＲ法により証明された。
【００４７】
また、融合されたＥＧＦＰ遺伝子の発現は、ＧＦＰの蛍光によって組換え型ウイルス感染の直接的なモニタリングを可能にした。また、直接的なモニタリングは、Ｋ１Ｌ選択に対して感受性でない組換え型ワクシニアウイルスのＷＲ株の同定、およびその後の分離に使用される。
【参照文献】
【００４８】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、相同組換えを利用したポックスウイルスのゲノム中への異種配列の挿入に有用な核酸配列を含む、新規のＤＮＡベクターを供給するものである。本発明はまた、特に本発明によるベクターにより転移される異種のコーディング配列を保持している組換え型のポックスウイルスに関連するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウエスタンリザーブ、コペンハーゲン、アンカラといったワクシニアウイルス株のような、オルソポックスウイルス生菌でのワクチン注射による天然痘の世界的な根絶の成功は、８０年代初期のより厳密で詳細にわたるポックスウイルスの研究を刺激した。その後、天然痘ウイルスは詳細に理解され、扱いやすいウイルスベクターもしくは研究のツールとして開発された（Ｍｏｓｓ， １９９６）。今日では、ポックスウイルスベクターは例えば発現ベクターとして、もしくはワクチン開発や治療物質の開発のために様々な分野で使用されている。ポックスウイルスベクターの高い許容性の大きな理由は、以下に示す有望な特徴からである：第一に、ベクターウイルスは操作が簡単であり、安定性が高く、安価に作成できる。第二に、上述のベクターウイルスは大量の異種遺伝子に適合することができ、そして多用途な発現ベクターであることが証明されている。第三に、容易にｉｎ ｖｉｖｏで導入することができ、そして体液性・細胞性免疫応答の刺激を起すことができる。従って、感染症もしくは癌に対する防御的免疫のための組換え型ワクチンとしての使用は、ポックスウイルスベクターを特に魅力的なものとする。特に、オルソポックスウイルス科のよく知られたメンバーであるワクシニアウイルスは、多くの多様な動物モデルでの疾病防御に対する組換え型ワクチンとして首尾よく使用されてきた（Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｓｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４ａ）。
【０００３】
組換え型ワクシニアウイルスの開発と樹立のために、いくつかの挿入部位が使用された。ワクシニアゲノムでの最も目だった挿入部位は、ウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子の遺伝子座である（Ｍａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９８２）。しかしながら、ウイルスヘマグルチニン遺伝子およびリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子（Ｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９８７， Ｈｏｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ． １９９６）のような必須ではない他の遺伝子または自然発生した欠如部位ＩＩや欠如部位ＩＩＩもまた、ワクシニアウイルスゲノムへの異種遺伝子ＤＮＡ配列の挿入に使用されたきた（Ｓｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４ａ）。いくつかの異種遺伝子または免疫原性のある抗原決定部位を保持する組換え型ウイルスベクターの構築は、より一層一般的な興味の対象となっている。それゆえに、ウイルスゲノムにおいて、さらなる異種遺伝子配列の導入に適したさらなる部位を同定することに対する強い要請がある。
【０００４】
ポックスウイルスゲノムへの異種なＤＮＡ配列の導入は、ポックスウイルスの生活環の完全な理解を欠いていることから、ウイルス繁殖に必須の領域を破壊するリスクを負っている。いくつかのポックスウイルスゲノムの配列情報（Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ． １９９０； Ａｎｔｏｉｎｅ ｅｔ ａｌ． １９９８）が利用可能であるが、同定されたオープンリーディングフレームによりコードされる大抵の蛋白質の機能は知られていない。それゆえに、ウイルスの複製および増殖に必須な任意の配列を破壊することなしに、異種遺伝子を安定的に取り込ませるのに適したゲノム中の位置の決定はいまだに複雑な試みである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ポックスウイルスゲノムにおける新規の挿入部位を同定し、該挿入部位への異種ＤＮＡ配列の直接的な組込みに適したベクターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前述の目的および他の目的を達成するために、本発明は、配列番号１による核酸配列またはそれの相補鎖を含むベクターを提する。配列番号１による核酸配列は、ポックスウイルスゲノムの部分的なゲノム配列と高度に相同性がある。この相同性ゆえに、本発明による核酸配列は、上述の配列とポックスウイルスの相当するゲノム配列の間で相同組換えを起す能力がある。従って本発明は、異なるオルソポックスウイルスゲノム中に、好ましくは改変されたワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）のゲノム中に、さらにまた、例えばワクシニアウイルス株であるウエスタンリザーブ、コペンハーゲンというのような関連するオルソポックスウイルスなどのゲノム中に、ＤＮＡ配列を直接的に組込むために有用な手段を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明で言及された配列番号１の構造。
【図２】本発明で作成されたｐＳＷ１プラスミドの制限酵素認識部位を示したマップ。
【０００８】
好ましい実施例によると、本発明の核酸配列は、改変されたワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、特に、単離され且つブダペスト条約に従って１９９４年１月２７日に寄託番号Ｖ９４０１２７０７でＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， ＵＫ）に保管されたＭＶＡに由来するものである。
【０００９】
本発明はさらに、厳格な条件下において、配列番号１による配列もしくはそれの相補鎖にハイブリダイズする核酸配列を含むベクターを供給する。本発明との関連において、“ベクター”という用語はプラスミド、コスミドのような環状構造をとるもの、または人工染色体でのＤＮＡの伝達手段と理解される。上述のベクターは目的とする核酸配列に加えて、制御的配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、選択マーカー遺伝子、そしてベクターの自己複製を可能にするレプリコンから構成される。従って、本発明によるベクターは単細胞のホスト生物中で容易に増幅され、分離されうる。さらに“厳格な条件下”という用語は、反応温度、ホルムアミド濃度もしくは塩濃度のような、ＤＮＡ―ＤＮＡ配列（相同性が約７０％付近以上）のハイブリダイゼーションを許容する標準的なプロトコールによるパラメーターを定義する。上記のように、ポックスウイルスゲノムの相当する配列にハイブリダイズするこれらの配列は、特に、オルソポックスウイルスのゲノムへの異種配列の組込みに有用である。
【００１０】
加えて、本発明は上記で言及した核酸配列の断片を含むベクターを提供する。これらの断片は上述の核酸配列の連続的な塩基対を含んでおり、そしてまた相同組換えによるポックスウイルスゲノムへの組込みに有用である。上述の断片の長さは変異に富んでおり、そしてポックスウイルスゲノムの相当する部分と３０塩基対でのみ相同である断片でも、組換えを引き起こすのには十分である。しかしながら、ポックスウイルスゲノムと本発明で使用されるような断片の間の相同組換えの効率を増加するために、上述の断片は長さで約２００塩基対以上であることが好ましく、約３００もしくは約５００塩基対以上であればより好ましい。
【００１１】
相同組換えを開始するために、本発明によるベクターと野生型のポックスウイルスがホスト細胞に導入された。ポックスウイルスゲノムの複製の間に、ベクターに挿入された核酸配列とポックスウイルスゲノムの相当する配列の間で相同組換えが生じる。相同組換えは統計学的確率上１：１０３から１：１０４程度の確率で生じるので、生成したあらゆる組換え型ポックスウイルスも分離される必要がある。このため、例えば機能的に関連する制御因子をもつマーカー遺伝子が、ベクター内にもうけられた核酸配列のクローニングサイトに挿入された。相同組換え後に生成した組換え型ポックスウイルスはそれぞれ、上述のマーカー遺伝子の発現に対するスクリーニング、もしくは優性選択マーカー遺伝子の発現に対する選択により分離された。
【００１２】
さらなる実施例によると、本発明のベクターは、特にポックスウイルスゲノムへの目的の異種コーディング配列の挿入に対して特に有用である。本発明との関連において、“異種”という用語は、自然界で密接に関連しているものでは通常は認められない核酸配列の任意の組み合わせに対して使用される。本発明による異種遺伝子は、好ましくはマーカー遺伝子の一群、抗ウイルス遺伝子、抗腫瘍遺伝子、サイトカインもしくはケモカイン遺伝子、自殺遺伝子のような治療用遺伝子から選択されるが、またホスト域遺伝子もしくは免疫原性のある抗原決定基からも選択される。ポックスウイルスゲノムを用いた目的の異種コーディング配列の挿入および／または発現のために、上述の異種コーディング配列が核酸配列内のクローニングサイトに挿入される。
【００１３】
一般的には、クローニングサイトは制限酵素認識部位である。本発明によると、異種配列の挿入における好ましいクローニングサイトはＥｃｏＲＩ酵素の制限酵素認識部位である。ＥｃｏＲＩ認識部位は本発明の核酸配列中でユニークであり、そして上述の核酸配列に含まれる２つのＯＲＦの間に配置されている（図１）。これとは別に、上述の２つのＯＲＦ間の非コーディング領域に配置されるさらなる任意の制限酵素認識部位が、クローニングサイトとして使用可能である。意外にも、ＯＲＦの１つに位置するいかなるクローニングサイトもまた、異種配列の挿入に使用することができる。特に、発明者等はＯＲＦへのそのような挿入による上述ＯＲＦの破壊は、それぞれウイルスの生活環もしくは複製効率を妨害しないことを見出した。同様に、相同組換えを惹起するためにベクター内に導入された本発明による断片の使用もまた、ウイルスの繁殖および複製効率に影響しないことが発明者等によって見出された。
【００１４】
一般的に、相同組換えによってウイルスゲノム内に組込まれる異種配列の両端は、ウイルスゲノムの相当する配列に対して相同である配列に接している。しかしながら、本発明はまた、異種配列の片側のみが上述の核酸配列に接しているベクターを含む。本発明によると、断片および望ましい異種配列を含んでいるベクターは、ポックスウイルスゲノムへ上述の異種配列を挿入するために有用である。
【００１５】
挿入された異種コーディング配列の発現を保証するために、少なくとも１つの転写制御因子が付加的にクローニングサイトに挿入される。この転写制御領域は異種のコーディング配列に機能的に関連しており、それにより、発現を制御および／または可能にする。本発明のさらなる好ましい実施例によると、この転写制御因子はポックスウイルスに由来し、および／またはポックスウイルス由来の転写制御因子のコンセンサス配列である。
【００１６】
本発明のさらなる実施例によると、このベクターは、特にクローニングサイトに挿入された例えばマーカー遺伝子もしくはホスト域遺伝子、および／または転写制御因子などの１以上の異種のコーディング配列に接する少なくとも２つの組換え型の（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）配列を含む。“組換え型配列”という用語は、ゲノム内の相同組換えにより上述の組換え型配列間の任意の配列を（それらの類似性もしくはほぼ同一の構造により）削除する能力のある核酸配列を定義する。従って、上述の組換え型配列に接している配列はウイルスゲノムに一時的にのみ挿入され、そして引き続き完全に削除される。上述の組換え型の（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）配列に接する配列の削除は、治療用遺伝子もしくは免疫原性遺伝子をコードする異種のコーディング配列のみを含み、どのようなさらなるマーカーもしくはホスト域遺伝子も含まないはずの組換え型ポックスウイルスを分離するために特に重要である。このために、マーカー遺伝子、ホスト域遺伝子、および／または結局は転写制御因子も（しかし、例えば治療用遺伝子もしくは免疫原性の抗原決定基のような目的とする異種コーディング配列は除く）、そのような組換え型配列に接している。マーカー遺伝子もしくはホスト域遺伝子の選択圧の下で行われる組換え型ウイルスの分離の後に、選択圧が解除されて、マーカー遺伝子もしくはホスト域遺伝子を削除するためのゲノム内での相同組換えが許容される。
【００１７】
本発明はさらに、ゲノム内に本発明によるベクターにより転移された核酸配列を含む組換え型ポックスウイルスを提供する。この組換え型ウイルスは組換え型のＭＶＡウイルスであることがもっとも好ましい。
【００１８】
本発明のさらなる実施例は、感染症もしくは増殖性の障害の治療および／または予防の方法を提供する。上述の方法は、本発明による組換え型ポックスウイルスで標的細胞の集団を感染させる（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの何れか）方法を含む。或いは、この方法によると、標的細胞は本発明によるベクターで形質導入（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの何れか）され、そして本発明の組換え型ポックスウイルスを含む任意のオルソポックスウイルスで同時に、または時間をずらして感染される。この場合、ポックスウイルスは細胞にウイルスの複製と転写機構を供給する。結果的に、ベクターに取り込まれ、ポックスウイルス由来の転写制御因子で制御される目的の異種のコーディング配列は、標的細胞内で発現する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入され感染された標的細胞は、本発明の方法により、ヒトを含む動物の生体に適用されうる。
【００１９】
本発明は感染症もしくは増殖性の障害の治療および／または予防に有用なベクター、組換え型ポックスウイルス、および／または本発明による標的細胞を提供する。さらに、本発明によるベクター、組換え型ポックスウイルス、および／または標的細胞は上記のようにｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子の運搬に有用な薬学的な構成物（特にワクチン）の生産、および／またはヒトを含む哺乳類でのワクチン接種に使用される。
【００２０】
本発明は特に以下に示す要件の単独もしくは組み合わせから構成される。
【００２１】
ポックスウイルスゲノムへの異種コーディング配列の挿入に使用するベクターであって、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群の中から選択された１以上の因子から構成される核酸配列を含む：
（ａ）配列番号１による核酸配列またはその相補鎖；
（ｂ）厳格な条件下で（ａ）に定義する配列とハイブリダイズする核酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に定義される核酸配列のうち少なくとも連続的な３０塩基対を含む断片。
【００２２】
前記核酸配列が改変されたワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）に由来する前記のベクター。
【００２３】
付加的に少なくとも１つの転写制御因子が当該核酸配列の中の少なくとも１つのクローニングサイトに導入されている前記のベクター。
【００２４】
前記転写制御因子がポックスウイルスゲノム由来であるか、またポックスウイルス由来の転写制御因子のコンセンサス配列である前記のベクター。
【００２５】
付加的に少なくとも１つの異種コーディング配列を含み、該異種コーディング配列は前記の転写制御因子と機能的に関連するものである前記のベクター。
【００２６】
前記異種コーディング配列がマーカー遺伝子、治療用遺伝子、ホスト域遺伝子および／または免疫原性抗原決定基のグループから選択される前記のベクター。
【００２７】
マーカー遺伝子、ホスト域遺伝子、および／または前記の転写制御因子をコードする１以上の異種コーディング配列に接している組換え型の配列を含む、前記のベクター。
【００２８】
前記ベクターにより転移された核酸配列をそのゲノム中に含む、組換え型ポックスウイルス。
【００２９】
ポックスウイルスが改変されたワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）である前記の組換え型ポックスウイルス。
【００３０】
ポックスウイルスゲノムに異種配列を導入する方法であって、
（ａ）前記ベクターを用いて、ホスト細胞を形質導入することと；
（ｂ）上述のホスト細胞をポックスウイルスで感染させることと；
（ｃ）組換え型ポックスウイルスを分離することと
を含む方法。
【００３１】
動物生体（ヒトを含む）の感染症もしくは増殖性の障害を治療および／または予防する方法であって、前記動物生体に対して、前記ポックスウイルス、および／または前記ベクターの適用、或いは他の何れかのポックスウイルスによる前記ベクターの適用を含む方法。
【００３２】
前記組換え型ポックスウイルスがオルソポックスウイルスに由来する前記の方法。
【００３３】
前記の組換え型ポックスウイルス、および／または前記ベクターを含む標的細胞。
【００３４】
感染症もしくは増殖性の障害の治療および／または予防のための、前記ベクター、前記組換え型ポックスウイルス、および／または前記標的細胞。
【００３５】
前記ベクター、前記組換え型ポックスウイルス、および／または前記標的細胞の使用であって、感染症もしくは増殖性障害の治療および／または予防のための薬物を生産するための使用。
【００３６】
前記ベクター、前記組換え型ポックスウイルス、および／または前記標的細胞、並びに薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤を含む医薬組成物。
【００３７】
前記ベクター、ポックスウイルス（前記の組換え型ポックスウイルスを除く）、並びに薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤を含む医薬組成物。
【００３８】
下記の実施例はさらに本発明を説明する。当業者は、提出された実施例が、本発明より提供される技術の適用性をこの実施例に制限するようには決して解釈されないことを十分に理解するであろう、それゆえに本発明は付属の請求項の全範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００３９】
実施例１
挿入ベクターの構築
ポックスウイルスゲノムへの組換えに適した配列を得るために、改変されたワクシニアアンカラウイルス（寄託番号Ｖ９４０１２７０７でＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， ＵＫにブタペスト条約により保管された）に由来するＤＮＡ断片が、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した通常のＰＣＲ法により増幅された。
Ａ２４Ｒ＿１；５’−ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＡＣＧＣＣＡＧＡＧＧ−３’， 配列番号２
Ａ２７Ｌ＿１ｃ；５’−ＡＧＧＣＴＣＧＡＧＴＡＡＧＡＧＣＧＧＣＴＡＴＧＡＴ−３’， 配列番号３
オリゴヌクレオチドプライマーは、クローニングベクターへの生成した増殖断片のサブクローニングのために、５’端の近くに下線で示された制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号２）もしくはＸｈｏＩ（配列番号３）の認識配列を含んでいる。それにより、１．７ｋｂの特異的に増幅された配列（配列番号１）がｐＵＣ１９クローニングプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．： Ｘ０２５１４）にＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでサブクローニングされた。生成したプラスミドはｐＳＷ１（図２）と名づけられた。
【００４０】
サブクローニングされたインサートの配列が調べられ、そしてこの配列はワクシニアウイルス株であるコペンハーゲン、ＷＲ、ＭＶＡからの他の既知の配列と比較された。上述の配列はＭＶＡ−ＡＴＩ領域の部分配列を含むことがわかった。大抵のオルソポックスウイルスのＡＴＩ遺伝子は、感染した細胞で光学顕微鏡により観察しうる、いわゆる封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ）と称する成熟したウイルス体に埋め込まれた密集した細胞質間充質を形成する。推測上のＡＴＩの機能は、一般的な環境下での感染性ウイルス粒子の高い安定性と伝播性の延長である。オルソポックスウイルスはエクトロメリアウイルス、牛痘ウイルス、アライグマポックスウイルスを含むいくつかのグループであり、１３０ｋＤａから１６０ｋＤａの典型的な封入体蛋白質を産生する。しかしながら、例えばワクシニアウイルスウエスタンリザーブ（ＷＲ）、ワクシニアウイルスコペンハーゲンもしくはＭＶＡのようなオルソポックス属の他のメンバーは、そのような封入体を形成しない。これは配列の削除もしくはフレームシフト変異の結果であり、コーディング配列の欠失を導き、またＡＴＩホモログの欠如を生じる。例えば、ワクシニアウイルスＷＲは９４ｋＤａのＡＴＩホモログを発現するが、一方、ＭＶＡとワクシニアウイルスコペンハーゲンはそのようなＡＴＩホモログを発現しない。
【００４１】
挿入ベクターのさらなる構築のために、自然発生した制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位が、増幅した配列を２つの部分に分離するために使用された。これらの分節はフランキング領域（ｆｌａｎｋ１、ｆｌａｎｋ２）として働き、ポックスウイルスゲノムとの相同組換えを起こさせる。それらのフランキング領域の間に、操作される異種遺伝子の挿入のためのマルチプルクローニングサイトに加え、例えば、７．５プロモーター（７．５）、および／または合成したプロモーターによるワクシニアウイルスのプロモーター配列が挿入された。生成したプラスミドはｐＳＷ−７．５−ｓＰ， ｐＳＷ−７．５， ｐＳＷ−ｓＰと名づけられた。
【００４２】
また、ＥＧＦＰフュージョン遺伝子（ｐＥＧＦＰ， Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ， ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃： Ｕ７６５６１から分離された）と融合させたワクシニアウイルスのホスト域遺伝子（Ｋ１Ｌ）から成る発現カセットと、天然に存在するＫ１Ｌプロモーターが上記のフランキング領域の間に挿入された。この発現カセットは組換え型のウイルスの効率的な選択と分離に特に有用である。生成したプラスミドはｐＳＷｋ１ｌｇｆｐと名づけられた。
【００４３】
組換え型ウイルスの産生
組換え型ウイルスを産生するために、およそ８０％コンフルエントの単層培養細胞を有する６ウェルの組織培養プレートが使用された。組換え型ＭＶＡを産生するために、ニワトリ胚繊維芽細胞のような許容細胞（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｃｅｌｌ）が使用された。組換え型ＷＲ株ワクシニアウイルスを産生するために、アフリカミドリ猿の細胞（Ｖｅｒｏ）が使用された。
【００４４】
最初に、細胞培養の培地を除去し、ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が０．０１（例えば、１ウェル５ｘ１０５細胞１ｍｌ培地中に接種物５ｘ１０３ＩＵ（感染単位））の野生型のポックスウイルスを含んだ無血清培地が細胞の上に層状に加えられた。この混合物は、３７℃、５％ ＣＯ２存在下で１時間インキュベーションされた。そして、接種物が除かれ、細胞がウェル毎に２ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭで２回洗浄された。
【００４５】
引き続き、単層細胞は、メーカー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）記載の方法により調整したリポフェクチン／プラスミドＤＮＡ混合物（全量：１ｍｌ）およびｐＳＷｋ１ｌｇｆｐのプラスミドＤＮＡ１５μｇでカバーされた。この混合物は、５％ ＣＯ２の存在下において、３７℃で５−１２時間インキュベーションされた。次いで、リポフェクチン／プラスミドＤＮＡ混合物が除かれ、細胞は、１．５ｍｌの１０％ＦＣＳが添加された新鮮な培地でカバーされた。感染の４８時間後に、単層細胞はセルスクレーパーではがされて、細胞および培地は２ｍｌの遠心チューブに移された。トランスフェクション回収物は、‐２０〜‐８０℃で保存された。ポックスウイルス感染細胞へのｐＳＷｋ１ｌｇｆｐプラスミドのトランスフェクションに際して、ＥＧＦＰ遺伝子に融合したホスト域遺伝子Ｋ１Ｌは、ベクタープラスミドのフランキング領域と相同性のあるポックスウイルスゲノムの部位に正確に組換えられる。
【００４６】
非組換え型のＭＶＡウイルスから組換え型ＭＶＡウイルスを分離するために、ホスト域細胞であるウサギ腎臓（ＲＫ）１３が、上記のトランスフェクション実験で得られたウイルス成分で感染された。以前の研究において、ＲＫ１３細胞でのＭＶＡ感染は、ウイルスＲＮＡの中間生成物の合成損傷およびウイルスＤＮＡの複製欠如を特徴とするウイルス複製の早期阻害に至ることが示された。しかしながら、このＲＫ１３細胞での非生産的ＭＶＡ感染は、ワクシニアウイルスのホスト域遺伝子であるＫ１Ｌの過剰発現によって克服することができた（Ｓｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４ｂ）。従って、ＲＫ１３培養細胞に対する上記トランスフェクション実験で得られたウイルス成分の接種は、Ｋ１Ｌ遺伝子を共発現する組換え型のみの高選択的繁殖を生じた。６ウェルもしくは９６ウェルの組織培養プレートにおいて培養されたＲＫ１３細胞上で連続的に５回継代した後に、ＭＶＡ−Ｋ１ＬＧＦＰウイルスが分離された。非組換え型のＭＶＡが存在しないことはＰＣＲ法により証明された。
【００４７】
また、融合されたＥＧＦＰ遺伝子の発現は、ＧＦＰの蛍光によって組換え型ウイルス感染の直接的なモニタリングを可能にした。また、直接的なモニタリングは、Ｋ１Ｌ選択に対して感受性でない組換え型ワクシニアウイルスのＷＲ株の同定、およびその後の分離に使用される。
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【００４８】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポックスウイルスゲノムへの異種なコーディング配列の挿入に使用するベクターであって、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群の中から選択された１以上の因子から構成される核酸配列を含むベクター：
（ａ）配列番号１による核酸配列またはその相補鎖；
（ｂ）厳格な条件下で（ａ）に定義する配列とハイブリダイズする１つの核酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に定義される核酸配列のうち少なくとも連続的な３０塩基対を含む断片。
【請求項２】
前記核酸配列が改変されたワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）に由来する請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
付加的に少なくとも１つの転写制御因子が当該核酸配列の中のクローニング部位に導入されている請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
前記転写制御因子がポックスウイルスゲノム由来であるか、またはポックスウイルス由来の転写制御因子のコンセンサス配列である請求項３に記載されたベクター。
【請求項５】
付加的に少なくとも１つの異種コーディング配列を含み、該異種コーディング配列は請求項３または４に記載された転写制御因子と機能的に関連するものである、請求項１〜４の何れか１項に記載のベクター。
【請求項６】
前記異種コーディング配列がマーカー遺伝子、治療用遺伝子、ホスト域遺伝子および／または免疫原性抗原決定基のグループから選択される請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
マーカー遺伝子、ホスト域遺伝子および／または請求項３〜５に記載の転写制御因子をコードする１以上の異種コーディング配列に接している組換え型の配列を含む、請求項３〜６の何れか１項に記載のベクター。
【請求項８】
請求項３〜７の何れか１項に記載のベクターにより転移された核酸配列をそのゲノム中に含む、組換え型ポックスウイルス。
【請求項９】
ポックスウイルスが改変されたワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）である請求項８に記載の組換え型ポックスウイルス。
【請求項１０】
ポックスウイルスゲノムに異種配列を導入する方法であって、
（ａ）請求項３〜７の何れか１項に記載のベクターを用いて、ホスト細胞を形質導入することと；
（ｂ）上述のホスト細胞をポックスウイルスで感染させることと；
（ｃ）組換え型ポックスウイルスを分離することと
を含む方法。
【請求項１１】
請求項８または９に記載の組換え型ポックスウイルス、および／または請求項１〜７の何れか１項に記載のベクターを含む標的細胞。
【請求項１２】
感染症もしくは増殖性の障害の治療および／または予防のための、前述の請求項１〜７の何れか１項に記載のベクター、請求項８もしくは９記載の組換え型ポックスウイルス、および／または請求項１１に記載の標的細胞。
【請求項１３】
請求項１〜７の何れか１項に記載のベクター、請求項８もしくは９に記載の組換え型ポックスウイルス、および／または請求項１１に記載の標的細胞の使用であって、感染症もしくは増殖性障害の治療および／または予防のための薬物を製造するための使用。
【請求項１４】
請求項１〜７の何れか１項に記載のベクター、請求項８または９の何れか１項に記載の組換え型ポックスウイルス、および／または請求項１１に記載の標的細胞、並びに薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項１５】
前述の請求項１〜７の何れか１項に記載のベクター、何れかのポックスウイルス（請求項８もしくは請求項９に記載された組換え型ポックスウイルスを除く）、並びに薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項１６】
動物生体（ヒトを含む）の感染症もしくは増殖性の障害を治療および／または予防する方法であって、前記動物生体に対して、請求項８もしくは９に記載の組換え型ポックスウイルス、および／または請求項１〜７の何れか１項に記載のベクターの適用、或いは他の何れかの組換え型ポックスウイルスに含まれる前記ベクターの適用を含む方法。
【請求項１７】
前記組換え型ポックスウイルスがオルソポックスウイルスに由来する請求項１６に記載の方法。
【請求項１】
ポックスウイルスゲノムへの異種なコーディング配列の挿入に使用するベクターであって、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群の中から選択された１以上の因子から構成される核酸配列を含むベクター：
（ａ）配列番号１による核酸配列またはその相補鎖；
（ｂ）厳格な条件下で（ａ）に定義する配列とハイブリダイズする１つの核酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に定義される核酸配列のうち少なくとも連続的な３０塩基対を含む断片。
【請求項２】
前記核酸配列が改変されたワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）に由来する請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
付加的に少なくとも１つの転写制御因子が当該核酸配列の中のクローニング部位に導入されている請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
前記転写制御因子がポックスウイルスゲノム由来であるか、またはポックスウイルス由来の転写制御因子のコンセンサス配列である請求項３に記載されたベクター。
【請求項５】
付加的に少なくとも１つの異種コーディング配列を含み、該異種コーディング配列は請求項３または４に記載された転写制御因子と機能的に関連するものである、請求項１〜４の何れか１項に記載のベクター。
【請求項６】
前記異種コーディング配列がマーカー遺伝子、治療用遺伝子、ホスト域遺伝子および／または免疫原性抗原決定基のグループから選択される請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
マーカー遺伝子、ホスト域遺伝子および／または請求項３〜５に記載の転写制御因子をコードする１以上の異種コーディング配列に接している組換え型の配列を含む、請求項３〜６の何れか１項に記載のベクター。
【請求項８】
請求項３〜７の何れか１項に記載のベクターにより転移された核酸配列をそのゲノム中に含む、組換え型ポックスウイルス。
【請求項９】
ポックスウイルスが改変されたワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）である請求項８に記載の組換え型ポックスウイルス。
【請求項１０】
ポックスウイルスゲノムに異種配列を導入する方法であって、
（ａ）請求項３〜７の何れか１項に記載のベクターを用いて、ホスト細胞を形質導入することと；
（ｂ）上述のホスト細胞をポックスウイルスで感染させることと；
（ｃ）組換え型ポックスウイルスを分離することと
を含む方法。
【請求項１１】
請求項８または９に記載の組換え型ポックスウイルス、および／または請求項１〜７の何れか１項に記載のベクターを含む標的細胞。
【請求項１２】
感染症もしくは増殖性の障害の治療および／または予防のための、前述の請求項１〜７の何れか１項に記載のベクター、請求項８もしくは９記載の組換え型ポックスウイルス、および／または請求項１１に記載の標的細胞。
【請求項１３】
請求項１〜７の何れか１項に記載のベクター、請求項８もしくは９に記載の組換え型ポックスウイルス、および／または請求項１１に記載の標的細胞の使用であって、感染症もしくは増殖性障害の治療および／または予防のための薬物を製造するための使用。
【請求項１４】
請求項１〜７の何れか１項に記載のベクター、請求項８または９の何れか１項に記載の組換え型ポックスウイルス、および／または請求項１１に記載の標的細胞、並びに薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項１５】
前述の請求項１〜７の何れか１項に記載のベクター、何れかのポックスウイルス（請求項８もしくは請求項９に記載された組換え型ポックスウイルスを除く）、並びに薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項１６】
動物生体（ヒトを含む）の感染症もしくは増殖性の障害を治療および／または予防する方法であって、前記動物生体に対して、請求項８もしくは９に記載の組換え型ポックスウイルス、および／または請求項１〜７の何れか１項に記載のベクターの適用、或いは他の何れかの組換え型ポックスウイルスに含まれる前記ベクターの適用を含む方法。
【請求項１７】
前記組換え型ポックスウイルスがオルソポックスウイルスに由来する請求項１６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−２３４７３１（Ｐ２０１１−２３４７３１Ａ）
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１６０６９３（Ｐ２０１１−１６０６９３）
【出願日】平成２３年７月２２日（２０１１．７．２２）
【分割の表示】特願２００１−５００７８８（Ｐ２００１−５００７８８）の分割
【原出願日】平成１２年５月２５日（２０００．５．２５）
【出願人】（３９８０６１２４５）ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヒェン・ドイチェス・フォルシュンクスツェントルム・フューア・ゲズントハイト・ウント・ウムベルト（ゲーエムベーハー） (19)
【氏名又は名称原語表記】Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ ｆｕｅｒ Ｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔ ｕｎｄ Ｕｍｗｅｌｔ （ＧｍｂＨ）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６０６９３（Ｐ２０１１−１６０６９３）
【出願日】平成２３年７月２２日（２０１１．７．２２）
【分割の表示】特願２００１−５００７８８（Ｐ２００１−５００７８８）の分割
【原出願日】平成１２年５月２５日（２０００．５．２５）
【出願人】（３９８０６１２４５）ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヒェン・ドイチェス・フォルシュンクスツェントルム・フューア・ゲズントハイト・ウント・ウムベルト（ゲーエムベーハー） (19)
【氏名又は名称原語表記】Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ ｆｕｅｒ Ｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔ ｕｎｄ Ｕｍｗｅｌｔ （ＧｍｂＨ）
【Ｆターム（参考）】
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