説明

ポリ−α−グルタミン酸およびその誘導体の製造方法

本発明は、ポリ-α-グルタミン酸の改良された製造方法に関し、この方法は、α-グルタミン酸N-カルボン酸無水物の第三級γ-エステルを適当な溶媒および開始剤を用いて重合し、その後、得られるポリ-α-グルタミン酸-γ-エステルを酸加水分解することを含む。この方法は、得られるポリ-α-グルタミン酸の分子量を綿密に制御することが可能であるので、特に有利である。また、本発明は、アミノ末端をカルボン酸またはアミノ酸でキャップしたポリ-α-グルタミン酸、およびその製造方法に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ポリ-α-グルタミン酸およびその誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、式(I)のポリ-α-グルタミン酸は、例えば第1級または第2級アミノ基および第1級、第2級または第3級水酸基を含有する幅広い種類の薬物との複合体を製造するための、薬物送達システムとして使用されている。
【0003】
【化1】

【0004】
複合体は、直接、または、例えばアミノ酸またはヒドロキシ酸等の好適なリンカーを介して生じる。例えば、欧州特許EP0932399号、アドヴァンスト・ドラッグ・デリバリー・レビューズ(Advanced Drug Delivery Reviews)、54巻、5号、2002年、695-713頁、およびジャーナル・オブ・コントロールド・リリース(Journal of Controlled Release)、74巻、1-3号、2001年、243-247頁を参照のこと。
【0005】
ポリ-α-グルタミン酸は、適当に保護されたグルタミン酸の重合によって合成することができる。米国特許US 3,635,909号は、とりわけ、開始剤として4-メチル-2-ピロリドンナトリウムを用いた、1,2-ジクロロエタン/1,4-ジオキサン混合物中でのD-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステルN-カルボン酸無水物の重合を開示する。
【発明の概要】
【0006】
本発明の開示は、溶媒および開始剤の適切な選択により、α-グルタミン酸N-カルボン酸無水物の第3級γ-エステルから製造される、ポリ-α-グルタミン酸の分子量の制御が可能になることを示す。従って、本発明は、一つの様相において、ポリ-α-グルタミン酸(I)の製造方法であって、
【0007】
【化2】

【0008】
式中、nは60と310の間に包含される整数であるので、ポリ-α-グルタミン酸は、8,000〜40,000 Da、好ましくは10,000〜35,000 Da、より好ましくは13,000〜16,000 Daの分子量を有し、および、多分散指数が通常≦2、好ましくは≦1.5であり、
該方法が、
a.式(II)のα-グルタミン酸N-カルボン酸無水物の第三級γ-エステル
【0009】
【化3】

【0010】
(式中、Rは、t-ブチル、1,1-ジメチルプロピルおよび1,1-ジメチルブチルより選択され、好ましくはt-ブチル基である)を、水中または、テトラヒドロフラン(THF)、1,4-ジオキサン、ジメチルホルムアミド(DMF)、1,4-ジオキサン/DMFおよび1,4-ジオキサン/テトラヒドロフラン混合物より選択される有機溶媒中、カリウムtert-ブトキシド(t-BuOK)、ナトリウムメトキシド(MeONa)、ジイソプロピルエチルアミン、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデカ-7-エン(DBU)、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)、グルタミン酸ジメチルエステル、およびグルタミン酸-γ-tert-ブチルエステルより選択される開始剤を用いて重合し、式(III)の化合物を得る工程:
【0011】
【化4】

【0012】
式中、nおよびRは上記で規定した通りであり、R'は、開始剤がジイソプロピルエチルアミン、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデカ-7-エン(DBU)、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)、グルタミン酸ジメチルエステルおよびグルタミン酸-γ-tert-ブチルエステルより選択される場合は水素であり、または、R'は、開始剤がt-BuOKおよびMeONaである場合、それぞれt-ブチルまたはメチル基であり、
その後、
b)エステル基を酸加水分解する工程
を含む方法に関する。
【0013】
本明細書全体を通して、記号*はキラル中心を示し、グルタミン酸という用語は、純粋な異性体またはラセミ混合物として、L-およびD-形態の両者を含む。
【0014】
工程a)は、通常、10〜50℃の温度範囲で、α-グルタミン酸N-カルボン酸無水物のγ-エステルの濃度が0.1〜0.3Mの範囲で行われる。好ましい態様では、この方法は、溶媒として1.4-ジオキサンを、開始剤としてDBUを用いて行われる。
【0015】
α-グルタミン酸N-カルボン酸無水物のγ-エステルの開始剤に対するモル比は、通常2〜25の範囲であり;α-グルタミン酸N-カルボン酸無水物のγ-エステルのα-グルタミン酸γ-エステルに対するモル比は100である。
【0016】
工程b)は、「有機合成における保護基(Protective groups in organic synthesis)」第3版、テオドラ(Theodora)W.グリーネ(Greene)およびピーター(Peter)G.M.ウッツ(Wuts)、ウィリー・インターサイエンス出版(Wiley-Interscience publication)、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ(John Wiley & Sons)社、406-408頁、およびその中の出典における記載によって例示された通り、tert-ブチルエステルの除去に慣例的に使用されるあらゆる試薬を用いて行うことができる。好ましい条件としては、20〜60℃の温度範囲での、トリフルオロ酢酸(TFA)、ギ酸および水/ギ酸混合物が挙げられ;TFAは、100v/wの量を使用し、ギ酸および水/ギ酸混合物は20〜50v/wの範囲の量を使用する。
【0017】
本発明の方法は、ポリ-α-グルタミン酸のDおよびL体の両者の製造に好適であるが、特にL体の製造に好適である。さらに、本発明に従って製造されるポリ-α-グルタミン酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸等の無機酸、またはアルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物および水酸化アンモニウム等の無機塩基との反応によって、それらの酸性塩または塩基性塩に容易に変換させることができる。
【0018】
本発明の方法は、マルチアングルレーザー光散乱検出と組み合わせたゲル浸透クロマトグラフィーで測定した重量平均分子量(Mw)が、上記で規定した値の範囲内であり、好ましくは13,000 Da と16,000 Daの間で、多分散指数が≦1.5であるポリ-α-グルタミン酸を提供する。このことは、文献に開示された方法では、異なるγ-保護基(ベンジル、メチルまたはエチル等;ポリマーモノグラフ(Polymer monographs)、9巻:H.ブロック(Block)、ポリ(γ-ベンジル-L-グルタメート)および他のグルタミン酸含有ポリマー、B.フグリン(Huglin)編、サルフォード大学(University of Salford)を参照のこと)によって、制御されない物質および超高分子が提供され、これは所望の分子量の範囲であるポリ-α-グルタミン酸を単離するためのクロマトグラフィー分離がしばしば必要であるので、特に有利である。
【0019】
さらに、本発明の方法により、アミノ末端でのピログルタミン酸エステルの自然発生的形成を阻害することが可能になるが、ピログルタミン酸エステルの形成は、通常、例えばγ-ベンジル、γ-メチルまたはγ-エチルグルタミン酸エステルカルボン酸無水物等を用いた重合の間に起こる。実際、現在入手可能なポリ-α-グルタミン酸は、ピログルタミン酸末端、またはアミノ末端またはそれらの混合物を呈する。ピログルタミン酸末端の形成は、特に、式(II)の化合物であって、Rがt-ブチル基であるものを出発物質として使用する場合に抑制される。従って、遊離アミノ末端を有するポリ-α-グルタミン酸γ-エステルは、所望のN末端をキャップしたポリ-α-グルタミン酸への転化率100%を達成するために、化学量論量のピログルタミン酸または他の好適な酸と反応させることができる。
【0020】
従って、本発明は、別の様相において、式(IV)のポリ-α-グルタミン酸誘導体の製造方法であって、
【0021】
【化5】

【0022】
式中、nは上記で規定した通りであり、および、R1CO-は、
(C1-C10)アルキルカルボニル;(C4-C8)シクロアルキルカルボニル;(C2-C6)カルボキシアルキルカルボニル;(C6-C10)アリールカルボニル;(C6-C10)アリール(C1-C10)アルキルカルボニル;(C1-C10)アルキル(C6-C10)アリールカルボニル;ヘテロ芳香環が1以上の窒素、酸素または硫黄原子を含有する、(C5-C10)ヘテロアリールカルボニルおよび(C5-C10)ヘテロアリール(C1-C10)アルキルカルボニル;ならびにD-またはL-天然および非天然アミノ酸残基;より選択され、
該方法が、上記の工程a)に従って得られた式(III)の化合物
【0023】
【化6】

【0024】
を、脱水剤の存在下、カルボン酸R1COOHと、または、塩化アシルR1COClまたは無水物(R1CO)2O(式中、R1CO-は上記で規定した通りである)等の活性カルボン酸と反応させて、式(V)の化合物を得ること、
【0025】
【化7】

【0026】
および、式(V)の化合物を式(IV)の化合物に加水分解することを含む、方法をも提供する。
【0027】
式(IV)および(V)の化合物において:
好ましい(C1-C10)アルキルカルボニルは、アセチルおよびブチリルであり;
好ましい(C4-C8)シクロアルキルカルボニルは、シクロプロピルカルボニル、シクロブタンカルボニル、シクロヘキシルカルボニルであり;
好ましい(C2-C6)カルボキシアルキルカルボニルは、スクシニルであり;
好ましい(C6-C10)アリールカルボニルは、ベンゾイル、1-ナフトイル、2-ナフトイルであり;
好ましい(C6-C10)アリール(C1-C10)アルキルカルボニルは、フェニルアセチルおよびフェニルブチリルであり;
好ましい(C1-C10)アルキル(C6-C10)アリールカルボニルは、o-、m-およびp-トリルであり;
好ましい(C5-C10)ヘテロアリールカルボニルは、ニコチノイル、N-メチルピロール-3-カルボニル、3-チオフェンカルボニルおよび3-キノリンカルボニルであり;
好ましい(C5-C10)ヘテロアリール(C1-C10)アルキルカルボニルは、3-ピリジルアセチルであり;
好ましいD-またはL-天然アミノ酸残基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リシン、ピログルタミン酸、フェニルアラニン、トリプトファンおよびシステインに由来するものであり;
好ましい非天然アミノ酸残基は、β-アラニン、α,α-ジメチルグリシン、α-フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、3-アミノ-3-(4-メチルフェニル)プロピオン酸、および2-(1-アミノシクロペンチル)酢酸に由来するものである。
【0028】
化合物(III)と酸R1COOHとの反応は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびジイソプロピルカルボジイミド等のカルボジイミド、2-1H-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートメタンアミニウム(HATU)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム-ヘキサフルオロホスファート(HBTU)および2-(1H-6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム-ヘキサフルオロホスファート(HCTU)等のウロニウム塩、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyBOP)等のホスホニウム塩などのような、ペプチド化学において通常使用される脱水剤の存在下で実施される。天然または非天然アミノ酸がキャッピング剤として使用される場合、好ましくは、そのアミノ基は、好適な保護基、好ましくはt-ブトキシカルボニル保護基によって保護される。その後、上記の工程b)に記載した通りのN-キャップしたポリ-α-グルタミン酸-γ-エステルの酸加水分解により、N-キャップしたポリ-α-グルタミン酸を与える。要すれば、式(IV)の化合物は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸等の無機酸、またはアルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物および水酸化アンモニウム等の無機塩基との反応によって、それらの酸性塩または塩基性塩に変換することができる。
【0029】
本発明の別の様相として、式(IV)および(V)の化合物が開示される。
【0030】
特に好ましい態様は、式(IV)の化合物であって、式中、R1COはD-またはL-ピログルタミン酸残基であり、N-末端遊離アミンの含量が1%w/w未満、好ましくは0.2%w/w未満である、化合物である。
【0031】
上述の式(IV)の化合物の製造方法は、一般的な適用性を有し、即ち、さらにカルボン酸R1COOH、または塩化アシルR1COClまたは無水物(R1CO)2O等の活性カルボン酸に対し、-NH2末端と反応し得るあらゆる化合物が、式(III)の化合物との反応に使用され得る。このような化合物の例は、アルデヒド、ケトン、α,β-不飽和ケトン、塩化スルホニルおよびニトリルであり、これらは技術のある化学者に知られている方法により、化合物(III)と反応させることができる。本発明のさらなる態様では、カルボン酸、または活性カルボン酸、または無水物、または-NH2末端と反応し得る化合物は、少なくとも、水酸基、アミノ基またはチオ基等の基も有していてもよく、この基は、ポリ-α-グルタミン酸の薬物動態的特性を調整するのに適切な部分でさらに官能化することができる。従って、本発明の別の様相は、ポリ-α-グルタミン酸の薬物動態的特性を調整するのに適切な部分でさらに官能化することができる基で、-NH2末端が置換されたポリ-α-グルタミン酸でもある。
【0032】
以下、下記の実施例において、本発明をより詳細に説明する。
【0033】
実施例1
工程a−L-α-Glu-NCA-γ-tBuエステルの製造
【0034】
【化8】

【0035】
40.17gのトリホスゲン(0.135 mol;ホスゲン/L-Glu-γ-tBuエステル=2.74/1)および862.5 mLのTHFを、窒素下、機械撹拌器を備えた1Lのジャケット付き反応器に入れた。反応器を20℃に温度調節し、混合物を、トリホスゲンが完全に溶解するまで撹拌し(数分間必要)、その後、30 gのL-α-Glu-γ-tBuエステル(0.148 mol)を一回で非常に迅速に添加した。得られる懸濁液を20℃で2時間反応させた。初めは発熱が観察され(4℃位)、その後、反応が進行するにつれて固体が溶解し:約30分後、透明な溶液が得られた。
【0036】
反応の終点で、ジャケットの温度を20℃以下に保って、溶媒を減圧留去したが、蒸留は極めて激しかった。蒸留は、固体ではなく、濃厚な油状残留物が得られるまで継続した(期待残量約80 mL)。蒸留の終点で、750 mLのn-ヘプタンを約15分にわたって滴下し、混合物を、生成物が完全に結晶化するまで、20/23℃で約1時間、窒素下で撹拌した。通常、結晶化は、n-ヘプタンを150 mL加えた後に始まる。
【0037】
得られた純粋な白色固体をブフナー漏斗で濾過し、n-ヘプタン90 mLで3回洗浄した後、オーブン中、動的真空(dynamic vaccum)下、20/25℃で20時間以下、乾燥した。固体はできる限り迅速に使用しなければならず、シリカゲルの存在下、静的真空(static vacuum)下で保存しなければならない。
【0038】
30 gのL-α-Glu-γ-tBuエステルより出発し、23.3gのL-α-Glu-NCA-γ-tBuエステルを得た(収率68.8%)。
【0039】
工程b−α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステルN-カルボン酸無水物(NCA)のポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステルへの重合
【0040】
【化9】

【0041】
1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン遊離塩基(DBU;分子量152.24; 585 mg, 3.84 mmol)を1,4-ジオキサン(全量から5mL)中に数分以内に溶解した。
【0042】
1Lのジャケット付きガラス製反応器で、1,4-ジオキサン(550 mL)およびα-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステルN-カルボン酸無水物(NCA)(22 g, 96 mmol; NCA/DBU=25)を25℃で、完全に溶解するまで混合した。
【0043】
得られた溶液を、予め調製したDBU溶液に非常に迅速に添加した。沈殿が即時見られ、低温の発熱が観察された(約3℃)。
【0044】
混合物を4時間撹拌した後、水(1100 mL)を30〜40分に渡ってゆっくり注いだ。25℃でさらに30分間撹拌した後、沈殿した固体を濾過により回収し、水洗した(50 mL×3回)。次に、回収した白色固体を真空下、40℃で乾燥し、16.4 gの純粋な物質、t-BuPG(回収率92%;DPn=137.2、数平均重合度;Mn=25,400 Da、1H-NMRによる数平均分子量)を得た。
【0045】
工程c−ポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステルのポリ-α-L-グルタミン酸への加水分解
【0046】
【化10】

【0047】
100 mLのジャケット付きガラス製反応器で、固体のポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステル(4 g)を、窒素雰囲気下、99%ギ酸(80 mL、20容量倍)中に懸濁した。混合物を60℃で5時間撹拌した。約30分間加熱した後、懸濁液は溶液になり、その後、固体が沈殿し始めた。
【0048】
その後、ギ酸の殆どを減圧蒸留により除去した(P=15 torr;内温は常に60℃未満)。残存するギ酸は、トルエンとの共沸蒸留により留去した(40 mL×2回;T<40℃)。
【0049】
得られた残渣を水(40 mL)に懸濁し、混合物を3〜5℃に冷却した後、30%w/wのNaOHを慎重に加えて、pHを8にした。pHが23〜25℃で安定した時点で、得られた溶液を0.22μmのマイクロフィルターで濾過した。
【0050】
透明な溶液を、硫酸を用いてpH 2.5まで酸性化した後、得られた懸濁液を2時間撹拌した。沈殿した固体を濾別し、真空下で乾燥した(30℃、一晩)。Mw=13,900 Daおよび多分散性が1.04(GPC-MALLS)の白色固形物を回収した(2.7 g)。
【0051】
実施例2
α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステルN-カルボン酸無水物(3.95 g、17.2 mmol)を窒素気流下、THF(100 mL)に溶解して、濃度を0.039 g/mL(0.17M)とした。撹拌速度を800 rpmとした。
【0052】
その後、DBU(105 mg、A/I=25)をシリンジで非常に迅速に添加し、混合物を22〜23℃で4時間撹拌した。開始剤の添加後まもなく、わずかな発熱が見られた。
【0053】
その後、反応混合物を濃縮乾固し、残渣を新しい1,4-ジオキサン(100 mL)でリンスした。次に2倍容量の水を反応混合物に加え、30分間撹拌した。沈殿した固体を回収し、水洗し、真空下、40℃で少なくとも12時間乾燥した。
【0054】
2.85 gのポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステル(回収率90%)を、Mn=34,100 DaおよびDPn=184(1H-NMRによる)の白色粉末として得た。
【0055】
その後、得られたポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステルを、実施例1の工程cに記載した方法に従って、99%熱HCOOH中で加水分解し、マルチアングルレーザー光散乱解析と組み合わせたゲル浸透クロマトグラフィーによればMw=25,700および多分散性が1.2、nは100位である、約1.7 gのポリ-α-L-グルタミン酸(回収率84%)を得た。
【0056】
実施例3
ポリマーキャッピング反応の一般的方法
本書に記載した実験方法(実施例1および2参照)に従って得られる、代表的なポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステルは、1H-NMR分析で測定して、N-末端に約1モル%の遊離アミノ基を含有する。このパーセンテージを、キャッピング反応のためにポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステルに加える適当な酸のモル当量を計算するために使用した。
【0057】
ポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステルをTHF(20 mL/g)に溶解した後、触媒量の4-ジメチルアミノピリジン(DMAP;添加した酸の約5〜10モル%)を加えた。先の混合物に、適当な酸(10モル当量)を加え、ジイソプロピルカルボジイミド(DIPC、添加した酸の30〜50モル%過剰量)を約10分間で滴下した。溶液を2時間撹拌した。
【0058】
次に、2倍容量の水を加え、得られた混合物を30分間撹拌した。N-アシル-ポリ-α-L- グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステルよりなる沈殿した固体を回収した後、ギ酸(20容量倍)中に懸濁した。60℃で2時間撹拌した後、2倍容量の水を加え、得られた混合物を30分間撹拌した。沈殿した固体を濾過により除去し、水洗し、真空下で乾燥(30℃、一晩)して、適切にN-キャップしたポリ-α-L-グルタミン酸(N-アシル-ポリ-L-α-グルタミン酸)を得た。
【0059】
実施例3a
ポリ-α-L-グルタミン酸-γ-( tert-ブチル)エステル(1 g, 0.054 mmol)をTHF(20 mL)に溶解し、触媒量のDMAP(8 mg, 0.07 mol)を加えた。その後、混合物にN-BOC-L-フェニルアラニン(180 mg, 0.7 mmol)を加え、直後にDIPC(160μl, 1 mmol)を滴下した。得られた溶液を約2時間撹拌した後、水(2倍容量)を加えたところ、即座に白色沈殿が形成された。懸濁液を30分間撹拌し、濾過した後、白色の粉末固体をギ酸(18 mL)に懸濁した。得られた混合物を60℃で2時間撹拌し、ギ酸を減圧蒸留(P=15 torr)によって除去した後、わずかな減圧下でトルエン(10 mLのトルエン×2回)と共沸蒸留した(ラクハンパル(Lakhanpal)M.L.;マンダル(Mandal)H.G.;ラル(Lal)G.;Indian J. Chem、13巻、1309頁 (1975年))。固体残渣をNaHCO3水溶液に溶解し、得られた溶液を、5,000 Daカットオフ膜で限外濾過した。保持物を約30 mLに濃縮し、硫酸でpH 2〜2.5に酸性化した。沈殿した物質を30分間撹拌し、濾過により回収して、真空下で乾燥(30℃、一晩)後、対応するN-末端がフェニルアラニンでキャップされたポリ-α-L-グルタミン酸、即ち、N-フェニルアラニル-ポリ-α-L-グルタミン酸(530 mg, 回収率84%)を得た。1H-NMRは提案された構造と一致した。
【0060】
N-末端の遊離アミノ酸含量(ポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステル段階では明らかに検出可能)は、1H-NMR分析またはo-フタルアルデヒドでの誘導体化後の分析ではもはや検出できなかった。
Mw = 13,300、GPC-MALLS分析によって測定した多分散性= 1.16
【0061】
実施例3b
ポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステル(1 g, 0.054 mmol)をTHF(40 mL)に溶解し、DMAP(42 mg, 0.34 mol)を加えた。その後、混合物にL-ピログルタミン酸(44 mg, 0.34 mmol)を加え、直後にDIPC(160μl, 0.7 mmol)を滴下した。得られた溶液を約2時間撹拌した後、水(2倍容量)を加えたところ、即座に白色沈殿が形成された。懸濁液を30分間撹拌した後、濾過し、回収した白色粉末をギ酸(18 mL)に懸濁した。得られた混合物を60℃で2時間撹拌し、ギ酸を減圧蒸留(P=15 torr)によって除去した後、わずかな減圧下でトルエン(10 mLのトルエン×2回)と共沸蒸留した。固体残渣をNaHCO3水溶液に溶解し、得られた溶液を、5,000 Daカットオフ膜で限外濾過した。保持物を約30 mLに濃縮し、硫酸によりpH 2〜2.5に酸性化した。沈殿した物質を30分間撹拌し、濾過により回収して、真空下で乾燥(30℃、一晩)後、対応するN-末端をピロ-L-グルタミン酸でキャップしたポリ-α-L-グルタミン酸(400 mg, 回収率64%)を得た。1H-NMRは提案された構造と一致し、遊離アミン(ポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステル段階では明らかに検出可能)は、1H-NMRまたはo-フタルアルデヒド分析ではもはや検出できなかった。
【0062】
実施例3c
ナフタレン-2-イル酢酸(19.7 mg, 0.106 mmol)およびN-メチルモルホリン(23.7 mg, 25.7μL, 0.234 mmol)をCH2Cl2(10 mL)に溶解し、混合物を0℃に冷却した。
【0063】
クロロトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyClop, 0.106 mmol, 44.7 mg)を混合物に加え、得られた溶液を約1時間撹拌した後、ポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステルを迅速に添加し(nは100位;1 g, 0.054 mmol)、冷却槽を外した後、反応液をさらに5時間撹拌した。溶媒を減圧留去した。粗製物質を再度THF(10 mL)に溶解し、水(2倍容量)を加えた。得られた懸濁液を30分間撹拌した後、濾過し、回収した白色粉末をギ酸(18 mL)に懸濁した。得られた混合物を60℃で2時間撹拌した。混合物を冷却し、ギ酸を減圧蒸留(P=15 torr)によって除去した後、トルエン(各10 mL×2回)と共沸蒸留した。固体残渣をNaHCO3水溶液に溶解し、得られた溶液を、5,000 Daカットオフ膜で限外濾過した。保持物を約30 mLに濃縮し、硫酸によりpH 2〜2.5に酸性化した。沈殿した物質を30分間撹拌し、濾過により回収して、真空下で乾燥(30℃、一晩)後、対応するN-(ナフタレン-2-イル-アセチル)-ポリ-α-L-グルタミン酸(570 mg, 回収率82%)を得た。1H-NMRは提案された構造と一致し、遊離アミン(ポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステル段階では明らかに検出可能)は、1H-NMRまたはo-フタルアルデヒド分析ではもはや検出できなかった。
【0064】
実施例3d
ナフタレン-2-イル酢酸(31.7 mg, 0.17 mmol)、TEA(3.5 mg, 4.7μL, 0.034 mmol)およびN,N′-ジスクシンイミジルカルボナート(DSC, 43.6 mg, 0.17 mmol)を、CH2Cl2/CH3CNの1:1の混合物(2 mL)に溶解し、得られた混合物を室温で2時間撹拌した。混合物をポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステル(nは100位;1 g, 0.054 mmol)のCH2Cl2(10 mL)溶液に滴下し、得られた溶液を一晩撹拌した。その後、溶媒を減圧下で除去し、粗製物質を、実施例3cに記載したものと同様の方法で処理した。
【0065】
回収した固体を、真空下で乾燥(30℃、一晩)して、対応するN-(ナフタレン-2-イル-アセチル)-ポリ-α-L-グルタミン酸(612 mg, 回収率88%)を得た。1H-NMRは提案された構造と一致し、遊離アミン(ポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステル段階では明らかに検出可能)は、1H-NMRまたはo-フタルアルデヒド分析ではもはや検出できなかった。
【0066】
実施例3e
ポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステル(nは100位;1 g, 0.054 mmol)をTHF(20 mL)に溶解し、触媒量のDMAP(8 mg, 0.07 mol)を加えた。その後、混合物に2-チオフェン酪酸(119 mg, 0.7 mmol)を加え、直後にDIPC(160μl, 1 mmol)を滴下した。得られた溶液を約2時間撹拌した後、水(2倍容量)を加えたところ、即座に白色沈殿が形成された。懸濁液を30分間撹拌し、濾過した後、白色の粉末固体をギ酸(18 mL)に懸濁した。得られた混合物を60℃で2時間撹拌し、ギ酸を減圧蒸留(P=15 torr)によって除去した後、わずかな減圧下でトルエン(10 mLのトルエン×2回)と共沸蒸留した。固体残渣をNaHCO3水溶液に溶解し、得られた溶液を、ファイバーグラスフィルター(0.2μm)で濾過した。濾液を2N H2SO4でpH 2〜2.5に酸性化した。沈殿した物質を30分間撹拌し、濾過により回収して、真空下で乾燥(30℃、一晩)後、対応するN-末端を2-チオフェンブチロイルでキャップしたポリ-α-L-グルタミン酸、即ち、N-(2-チオフェンブチロイル)-ポリ-α-L-グルタミン酸(480 mg、回収率76%)を得た。1H-NMRは提案された構造と一致した。
【0067】
N-末端の遊離アミノ酸含量(ポリ-α-L-グルタミン酸-γ-(tert-ブチル)エステル段階では明らかに検出可能)は、1H-NMR分析またはo-フタルアルデヒドでの誘導体化後の分析ではもはや検出できなかった。
Mw = 13,300、GPC-MALLS分析によって測定した多分散性= 1.12
【0068】
非常に類似した方法によって、N-(2-チオフェンプロパノイル)-ポリ-α-L-グルタミン酸およびN-(2-チオフェンペンタノイル)-ポリ-α-L-グルタミン酸も得た。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
式(I)のポリ-α-グルタミン酸の製造方法であって、
【化11】

(式中、記号*は、キラル中心を示し、nは60と310との間であるので、ポリ-α-グルタミン酸は、8,000〜40,000 Daの分子量を有する)
該方法が、
a)式(II)のα-グルタミン酸N-カルボン酸無水物の第三級γ-エステル
【化12】

(式中、記号*は上記で規定した通りであり、Rは、t-ブチル、1,1-ジメチルプロピルおよび1,1-ジメチルブチルより選択される)
を、水中または、テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン、ジメチルホルムアミド、1,4-ジオキサン/DMFおよび1,4-ジオキサン/テトラヒドロフラン混合物より選択される有機溶媒中、カリウムtert-ブトキシド、ナトリウムメトキシド、ジイソプロピルエチルアミン、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデカ-7-エン、ジメチルアミノピリジンおよびL-グルタミン酸-γ-tert-ブチルエステルより選択される開始剤を用いて重合し、式(III)の化合物を得る工程:
【化13】

(式中、*およびRは上記で規定した通りであり、開始剤がジイソプロピルエチルアミン、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデカ-7-エン、4-ジメチルアミノピリジン、グルタミン酸ジメチルエステルおよびグルタミン酸-γ-tert-ブチルエステルより選択される場合、R'は水素であり、開始剤がカリウムtert-ブトキシドおよびナトリウムメトキシドである場合R'は、それぞれt-ブチルまたはメチル基である)
その後、
b)γ-およびα-エステル基を酸加水分解して、化合物(I)を得る工程
を含む方法。
【請求項2】
前記溶媒が1,4-ジオキサンであり、前記開始剤が1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデカ-7-エンである、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
温度が10〜50℃の範囲である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項4】
α-グルタミン酸N-カルボシ酸無水物の第三級γ-エステルの濃度が、0.1〜0.3 Mの範囲である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
工程b)が、トリフルオロ酢酸、ギ酸および水/ギ酸混合物より選択される酸の中で、20〜60℃の温度範囲で行われる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
Rがt-ブチルである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ポリ-α-グルタミン酸(I)の分子量が、13,000〜16,000 Daの範囲であり、多分散指数が≦1.5である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
式(IV)のポリ-α-グルタミン酸誘導体の製造方法であって、
【化14】

(式中、記号*はキラル中心を示し、nは60と310との間に包含される整数であり、および、R1CO-は、
(C1-C10)アルキルカルボニル;
(C4-C8)シクロアルキルカルボニル;
(C2-C6)カルボキシアルキルカルボニル;
(C6-C10)アリールカルボニル;
(C6-C10)アリール(C1-C10)アルキルカルボニル;
(C1-C10)アルキル(C6-C10)アリールカルボニル;
ヘテロ芳香環が1以上の窒素、酸素または硫黄原子を含有する(C5-C10)ヘテロアリールカルボニルおよび(C5-C10)ヘテロアリール(C1-C10)アルキルカルボニル;ならびに
D-またはL-アミノ酸および非天然アミノ酸残基;より選択される)
該方法が、
a)式(II)のα-グルタミン酸N-カルボン酸無水物の第三級γ-エステル
【化15】

(式中、記号*は上記で規定した通りであり、Rは、t-ブチル、1,1-ジメチルプロピルおよび1,1-ジメチルブチルより選択される)
を、水中または、テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン、ジメチルホルムアミド、1,4-ジオキサン/DMFおよび1,4-ジオキサン/テトラヒドロフラン混合物より選択される有機溶媒中、カリウムtert -ブトキシド、ナトリウムメトキシド、ジイソプロピルエチルアミン、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデカ-7-エン、ジメチルアミノピリジンおよびL-グルタミン酸-γ-tert-ブチルエステルより選択される開始剤を用いて重合し、式(III)の化合物を得る工程:
b)上記の工程a)に従って得られた式(III)の化合物
【化16】

を、カルボン酸R1COOH、または塩化アシルR1COClまたは無水物(R1CO)2Oであって、R1が上述の通りであるものと共に、脱水剤の存在下、反応させて、式(V)の化合物を得る工程
【化17】

および
c)式(V)の化合物を加水分解して、式(IV)の化合物を得る工程
を含む、方法。
【請求項9】
(C1-C10)アルキルカルボニルがアセチルまたはブチリルである、請求項8に記載の方法。
【請求項10】
(C4-C8)シクロアルキルカルボニルがシクロプロピルカルボニル、シクロブタンカルボニル、またはシクロヘキシルカルボニルである、請求項8に記載の方法。
【請求項11】
(C2-C6)カルボキシアルキルカルボニルがスクシニルである、請求項8に記載の方法。
【請求項12】
(C6-C10)アリールカルボニルがベンゾイル、1-ナフトイルまたは2-ナフトイルである、請求項8に記載の方法。
【請求項13】
(C6-C10)アリール(C1-C10)アルキルカルボニルがフェニルアセチルまたはフェニルブチリルである、請求項8に記載の方法。
【請求項14】
(C1-C10)アルキル(C6-C10)アリールカルボニルがo-、m-またはp-トリルである、請求項8に記載の方法。
【請求項15】
(C5-C10)ヘテロアリールカルボニルがニコチノイル、N-メチルピロール-3-カルボニル、3-チオフェンカルボニルまたは3-キノリンカルボニルである、請求項8に記載の方法。
【請求項16】
(C5-C10)ヘテロアリール(C1-C10)アルキルカルボニルが3-ピリジルアセチルである、請求項8に記載の方法。
【請求項17】
D-またはL-天然アミノ酸残基が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リシン、ピログルタミン酸、フェニルアラニン、トリプトファンおよびシステインに由来するものである、請求項8に記載の方法。
【請求項18】
アミノ酸残基がフェニルアラニン残基である、請求項17に記載の方法。
【請求項19】
DまたはL非天然アミノ酸残基が、β-アラニン、α,α-ジメチルグリシン、α-フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、3-アミノ-3-(4-メチルフェニル)プロピオン酸、および2-(1-アミノシクロペンチル)酢酸に由来する残基である、請求項8に記載の方法。
【請求項20】
式(IV)のポリ-α-グルタミン酸誘導体、および、無機酸または塩基とのそれらの塩:
【化18】

式中、記号*はキラル中心を示し、nは60と310との間に包含される整数であり、および、R1CO-は、
(C1-C10)アルキルカルボニル;
(C4-C8)シクロアルキルカルボニル;
(C6-C10)アリールカルボニル;
(C6-C10)アリール(C1-C10)アルキルカルボニル;
(C1-C10)アルキル(C6-C10)アリールカルボニル;
ヘテロ芳香環が1以上の窒素、酸素または硫黄原子を含有する(C5-C10)ヘテロアリールカルボニルおよび(C5-C10)ヘテロアリール(C1-C10)アルキルカルボニル;
D-またはL-アミノ酸および非天然アミノ酸残基より選択される。
【請求項21】
R1COがD-またはL-ピログルタミン酸残基であり、N-末端遊離アミンの含量が1%w/w未満、好ましくは0.2%w/w未満である、請求項19に記載の化合物。
【請求項22】
式(V)のポリ-α-グルタミン酸誘導体:
【化19】

式中、記号*はキラル中心を示し、nは60と310との間に包含される整数であり、Rは、t-ブチル、1,1-ジメチルプロピルおよび1,1-ジメチルブチルより選択され、R'は水素またはt-ブチルまたはメチル基であり、および、R1COは、
(C1-C10)アルキルカルボニル;
(C4-C8)シクロアルキルカルボニル;
(C6-C10)アリールカルボニル;
(C6-C10)アリール(C1-C10)アルキルカルボニル;
(C1-C10)アルキル(C6-C10)アリールカルボニル;
ヘテロ芳香環が1以上の窒素、酸素または硫黄原子を含有する(C5-C10)ヘテロアリールカルボニルおよび(C5-C10)ヘテロアリール(C1-C10);ならびに
D-またはL-アミノ酸および非天然アミノ酸残基より選択される。
【請求項23】
ポリ-α-グルタミン酸の薬物動態的特性を調整するのに適切な部分でさらに官能化することができる基で-NH2末端が置換されたポリ-α-グルタミン酸。

【公表番号】特表2009−540071(P2009−540071A)
【公表日】平成21年11月19日(2009.11.19)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−514692(P2009−514692)
【出願日】平成19年6月12日(2007.6.12)
【国際出願番号】PCT/EP2007/005172
【国際公開番号】WO2007/144140
【国際公開日】平成19年12月21日(2007.12.21)
【出願人】(508366662)セル セラピューティクス インコーポレーテッド セーデ セコンダリア (1)
【出願人】(501394804)セル セラピューティクス インコーポレーテッド (3)
【Fターム(参考)】