ポリエチレングリコールサンプルの多分散度および／または分子量分布を決定する方法
本明細書に開示されるのは、質量分析法を用いて反応性ＰＥＧサンプルの多分散度（ＰＤＩ）および分子質量分布（ＭＭＤ）を測定する方法である。より具体的には、高分子量ＰＥＧサンプルに対して既知のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析より正確な測定結果を提供するＧＥＭＭＡと呼ばれる質量分析法が、ＰＥＧサンプルのＰＤＩおよびＭＭＤを測定するために用いられる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの第２の末端は、メトキシメチル基を含む。様々な実施形態において、反応性官能基は、スクシンイミジルスクシネート基を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００８年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／１１５，７８１号の利益を主張し、この米国仮特許出願の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
現代社会において、ポリマーは、広範囲にわたる応用に提供されている。顕著な用途の１つは、ペプチドおよびタンパク質へのそれらの結合である。合成ペプチドおよび組み換えタンパク質は、いくつかの内的要因、生体内での低い安定性、それゆえに短い血中濃度半減期、および免疫原性のために自由な適用は制限されるが、効能のある特異的な治療薬として広く用いられている。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、デキストランもしくはポリ（アミノ酸）のようなポリマーを用いた、ペプチド／タンパク質ベースの薬物の結合は、これらの制限を克服し、ペプチド／タンパク質療法の大規模な適用を促進するための戦略として評判を高めている。
【０００３】
タンパク質／ペプチド結合に適するポリマーは、様々な基準を満たす必要がある。該ポリマーは、体内での進行蓄積を回避するために、易生分解性でなくてはならない。その多分散度は、最終的なタンパク質結合体に許容しうる均質性をもたらすために、可能な限り１に近くなくてはならない。所望の体区画での分布および蓄積ならびに持続性作用が、十分な体／区画滞留時間によって提供されなくてはならない。最後に、不均質な生成物をもたらす架橋を回避するために、ペプチド／タンパク質へのポリマーの結合が単一反応基によって達成されなくてはならない。
【０００４】
ＰＥＧは、優れた特性ゆえにポリマー−薬物結合に用いられる最も顕著なポリマーの１つである。ＰＥＧは、無毒性、非免疫原性、非抗原性であり、他の溶媒のみならず水にも溶解度が高く、ヒト用としてＦＤＡおよびＥＭＥＡに承認されている。水および他の多くの有機溶媒中におけるその溶解度は、タンパク質および／またはペプチドを穏やかな生理的条件下でペグ化することを可能にする。ＰＥＧの屈曲性鎖とエチレンオキシド単位当たり２〜３個の水分子を結合する能力との両方が、免疫原性および抗原性を低減し、立体障害の増加によりペプチド／タンパク質の酵素分解を妨げるその能力に寄与する。ＰＥＧの医薬用途に関わる別の重要な特性は、低多分散度（ＰＤＩ：ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ）、Ｍｗ／Ｍｎが約１.０１から約１.１、の可能性である。
【０００５】
薬物結合に適用されるポリマーの必要条件を考慮すると、ＰＥＧは適切な選択肢である。ＰＥＧタンパク質結合体は、免疫原性および抗原性が低減され、体内滞留時間が短縮され、かつ代謝酵素に対する安定性が向上した治療薬を提供することができる。ＰＥＧ結合体では未修飾タンパク質と比較していくつかの生物活性が失われることもあるが、この損失は、しばしば半減期の増加によって補うことができる。タンパク質のペグ化が１９７０年代に導入されて以来、数多くのＰＥＧ−薬物結合体、例えばＡＤＡＧＥＮ（登録商標）、ＮＥＵＬＡＳＴＡ（登録商標）、ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）、ＯＮＣＡＳＰＡＲ（登録商標）が導入され、より多くのＰＥＧ−タンパク質が現在治験フェーズにある。ＰＥＧのさらなる医薬応用には、抗腫瘍薬、ペプチド、もしくはオリゴヌクレオチドのような、より小さい薬物への結合ならびに薬物送達システムあるいは診断キャリアとしての用途がある。
【０００６】
薬物製造は、厳しい管理を受けるので、薬物結合に適用される反応性ＰＥＧのバッチは、詳細に評価されなければならない。一般に、モノメトキシル化ＰＥＧ（ｍＰＥＧ：ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ ＰＥＧ）が用いられる。ｍＰＥＧは、メトキシドイオンを用いて開始されるアニオン開環重合によって合成される。重合の間に存在する微量の水ゆえに、市販のｍＰＥＧには、望ましくない架橋副生成物および様々なレベルのカプリング基をもたらす、かなりの量（１５％まで）のジオールＰＥＧが含まれる可能性がある。
【０００７】
ＰＥＧバッチは、一般に様々な数のモノマーによって構築された分子からなり、従って、理想的な場合にはガウス型分子質量分布（ＭＭＤ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を生じる。起こりうる結果は、様々な生物学的特性、例えば体内滞留時間および／または免疫原性、を持つ薬物結合体である。望ましくない架橋生成物を回避し、ＰＥＧサンプルのＰＤＩおよびＭＭＤを測定するために、結合プロセスの前に、クロマトグラフィーもしくは動的光散乱法のような様々な分析技術を用いてバッチを評価することが推奨されている。しかしながら、ＰＥＧサンプルのＰＤＩおよび／またはＭＭＤを見積もる他の方法の必要性も存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書に開示されるのは、ＰＥＧサンプルのＰＤＩおよび／またはＭＭＤを、気相電気泳動移動度巨大分子分析（ＧＥＭＭＡ：ｇａｓ ｐｈａｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて測定する方法である。特に、本明細書に開示される方法は、ａ）異なった分子量の複数のＰＥＧポリマーを含むＰＥＧサンプルを提供する工程であって、それぞれのＰＥＧポリマーは、第１の末端および第２の末端を含み、第１の末端は、反応性官能基を含む、提供する工程；ｂ）該ＰＥＧサンプルをイオン化して、複数のイオンを提供する工程；ｃ）該複数のイオンを還元して、中性または一価の種を提供する工程；ｄ）微分型移動度分析器（ＤＭＡ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、該複数の中性または一価の種をそれぞれの種の電気泳動移動度直径（ＥＭＤ：ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｄｉａｍｅｔｅｒ）によって分離する工程；およびｅ）それぞれ種のＥＭＤをＰＥＧサンプルのＰＤＩおよび／またはＭＭＤに関連づける工程を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧの第２の末端は、メトキシメチル基を含む。様々な実施形態において、反応性官能基は、スクシンイミジルスクシネート基を含む。サンプルにおけるＰＥＧの濃度は、少なくとも約１ｎＭまたは少なくとも約０.２ｍＭとすることができる。いくつかの特定の場合に、サンプルにおけるＰＥＧの濃度は、約５ｎＭから約１００ｍＭである。
【００１０】
ＰＥＧサンプルをイオン化することは、サンプルにエレクトロスプレーイオン化を受けさせることによって可能である。イオンを還元することは、イオンを両極性雰囲気に曝露することによって可能である。特定の場合に、両極性雰囲気は、ポロニウム源によって生成することができる。キャラクタライズすることは、それぞれのイオンのＥＭＤを既知の分子量のＥＭＤに関連づけることによることができる。それぞれのイオンのＥＭＤは、少なくとも約３ｎｍとすることができる。イオンは、ユニマー、二量体、三量体、またはｑｕａｄｒａｍｅｒを形成することができる。いくつかの場合には、イオンが三量体および二量体を形成し、ＰＥＧサンプルのＰＤＩおよびＭＭＤの両方が算出される。特定の場合に、ＰＤＩおよび／またはＭＭＤの算出精度は、少なくとも５％、または少なくとも２％である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネートの構造、および様々なＰＥＧサンプルに対して算出された分子量をモノマー数とともに示す。
【図２】図２は、３つのＰＥＧサンプルのＧＥＭＭＡスペクトルを示す。各ＧＥＭＭＡスペクトルではユニマー、一価の１つのポリマー鎖、二または三量体を含んだエアロゾル液滴に対応する、２つから３つのピークを観察することができる。
【図３】図３は、様々な濃度のｍＰＥＧ−ＳＳ ２０ＫのＧＥＭＭＡスペクトルを示す。
【図４】図４は、挙げられた技術（ＤＨＢ、ＳｕｐｅｒＤＨＢ、およびＮａＣｌを含むＳｕｐｅｒＤＨＢ）によって調製され、リフレクトロン・モードで取得されたｍＰＥＧ−ＳＳ ２ＫのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。図４の挿入図は、狭いｍ／ｚ範囲の質量スペクトルの詳細を観察可能な分子イオンおよび対応する質量値の違う（ΔＭ）とともに示す。
【図５】図５は、ＮａＣｌを含んだｓｕｐｅｒＤＨＢを用いたｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ，１０Ｋおよび２０ＫのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書に開示されるのは、ＰＥＧサンプルのＰＤＩおよび／またはＭＭＤを測定する方法である。ＰＥＧサンプルは、タンパク質結合治療薬を形成するためのタンパク質またはペプチドへの結合前に評価される。かかる治療薬が、様々な薬物管理委員会（例えば、ＦＤＡおよびＥＤＭＡ）によって典型的に厳しく管理またはモニターされることから、かかる測定は、タンパク質またはペプチドへの結合に関わる特定のＰＥＧサンプルの適合性を検証するために重要である。典型的に、適切なＰＥＧサンプルは、１に近い、例えば約１．０５から約１．２、または約１．０５から約１．１のＰＤＩを有する。
【００１３】
ＰＥＧサンプルは、通常は複数のポリマー、すなわち、エチレングリコール単量体の繰り返し数が異なるために分子量が異なるポリマーを有する。ＰＥＧサンプルにおけるＰＥＧポリマーの分子量分布の測定がサンプルのＭＭＤを提供する。サンプルのＰＤＩは、ポリマー・サンプルの重量平均（Ｍｗ）：数平均分子量（Ｍｎ）の比率に関する測定結果である。Ｍｗは、ポリマー・サンプルから無作為に選択された特定のポリマーが、平均するとＭｗの質量を持つポリマーの重量平均質量である。Ｍｎは、ポリマーの数平均質量であり、ポリマー・サンプルにおけるすべてのポリマーのすべての分子量の平均である。
【００１４】
本開示の方法において分析されるＰＥＧサンプルは、典型的に１つの末端に反応性官能基を有する。例えば、ＰＥＧは、１つの末端にタンパク質またはペプチドへの結合を可能にする適切な反応基、および他の末端に非反応性官能基を有することができる。非反応性官能基は、特定の反応条件下で不活性な官能基である。タンパク質および／またはペプチドへのＰＥＧのカップリング条件下において、非反応性官能基は、以下には限定されないが、メトキシ基とすることができる。反応性官能基は、特定の反応条件下において対象のタンパク質、ペプチド、または他の分子と結合体を形成することができる官能基である。かかる反応性官能基の非限定の例は、スクシンイミジルスクシネートなどを含む。
【００１５】
ＰＥＧサンプルは、ＧＥＭＭＡを用いた質量分析法によって分析される。ＧＥＭＭＡでは、サンプルがイオン化される。イオン化は、エレクトロスプレーイオン化によって可能であるが、他の既知のイオン化技術を用いることもできる。次に、形成されたイオンが還元されて一価のイオンまたは中性種が形成される。イオンは、還元雰囲気、例えば両極性雰囲気に曝露されることによって還元されることができる。いくつかの場合に、両極性雰囲気は、ポロニウム源のようなα粒子源に由来する。イオンは、次に空気中における移動度に応じてイオンを分離する微分型移動度分析器を用いて分離される。次に、イオンは、凝縮粒子カウンタを用いて検出される。各イオンの電気泳動移動度直径（ＥＭＤ）は、ミリカンの式を用いて算出することができ、その後イオンの分子量に関連づけることができる。通常は、かかる関連づけに、分子量が既知の分子に関するＥＭＤの比較が用いられる。ＧＥＭＭＡ分析は、Ａｌｌｍａｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃ．，３６：１０３８−１０５２（２００１）で一般的に論じられる。
【００１６】
ＧＥＭＭＡ分析では、分子量を測定するためにイオンのＥＭＤを用いるので、一般にＥＭＤが大きいほどより正確な測定が提供される。従って、いくつかの実施形態において、イオンのＥＭＤは、少なくとも２ｎｍ、または少なくとも３ｎｍである。イオンは、ユニマー（１個のイオン）、二量体（一緒にクラスター化した２個のイオン）、三量体（一緒にクラスター化した３個のイオン）、ｑｕａｄｒａｍｅｒ（一緒にクラスター化した４個のイオン）、またはより高次の構造を形成することができる。三量体およびｑｕａｄｒａｍｅｒが形成されると、ＥＭＤが典型的に大きくなり、従って粒子カウンタを用いてより容易に検出することができる。それゆえに、ＭＭＤおよび／またはＰＤＩのより正確な測定が、かかる構造の形成によって可能になる。
【００１７】
サンプル中のＰＥＧの濃度によって、二量体、三量体、ｑｕａｄｒａｍｅｒなどの形成をもたらすことができる。濃度が高いほど、より多くの二量体、三量体、および／またはｑｕａｄｒａｍｅｒが形成される。いくつかの場合に、ＰＥＧサンプルは、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも３ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも０.１ｍＭ、または少なくとも０.２ｍＭのＰＥＧ濃度を有する。
【００１８】
測定の精度は、当分野で知られる方法によって測定することができる。ＰＤＩおよび／またはＭＭＤ測定の精度は、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、または少なくとも約２％とすることができる。
【００１９】
国内的および国際的な規制機関の厳重な管理が、薬物製造（例えば、組み換えタンパク質）においてペグ化に適用される反応性ＰＥＧポリマーのバッチに関する正確なキャラクタリゼーションを強いる。ＭＭＤおよび多分散度の測定は、不均質な最終生成物に起因して特に重要である。本開示のように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびＧＥＭＭＡ、異なった物理化学的原理に基づく２つの装置を用いて、４つのｍＰＥＧ−ＳＳバッチが分析された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析による分子質量の測定は、飛行時間および相関するｍ／ｚ値の測定に基づき、ＧＥＭＭＡ分析は、電気泳動移動度直径および導出される分子質量に従って機能する。ｍＰＥＧ−ＳＳバッチについて得られたＭＭＤ極大は、会社によって公表された仕様、ＭＭＤ±１０％、の範囲内にあり、ＧＥＭＭＡまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって達成されるデータ品質に関しては、より詳細な製品情報、例えば会社によって得られた正確なＭＭＤ極大の欠如ゆえに、さらなる結論を引き出すことはできなかった。ＧＥＭＭＡならびにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータから、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋに対して１.０２、およびｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ、１０Ｋ，２０Ｋに対して１.０１の多分散度の値が算出され、ｍＰＥＧ−ＳＳ誘導体が、低いＭＭＤを提示し、タンパク質およびペプチドへの結合に利用するのに好ましい基準を満たすことが示唆された。
【００２０】
ＭＭＤの増加とともに、ポリマーのＧＥＭＭＡ分析の精度は向上し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの精度は低下する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの精度の低下は、ＴＯＦ質量分析器の分解能の減少に基づく。ＧＥＭＭＡの精度の向上は、１から３個のＰＥＧ鎖を含んだ多量体クラスターの検出に基づくものであり、これらがＭＭＤの相対的な狭小化をもたらす。従って、低いＭＭＤを持つＰＥＧに対しては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを利用してより有意義なデータを得ることができるのに対して、高いＭＭＤを持つＰＥＧの分析には、ＧＥＭＭＡの方がより適切な方法である。
【実施例】
【００２１】
構造と算出された正確な分子質量とが図１に示される４つのモノメトキシＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート（ｍＰＥＧ−ＳＳ）サンプルが、ＭＭＤおよびＰＤＩによってキャラクタライズされた。各サンプルのＥＭＤが、ＧＥＭＭＡによって測定された。多価の巨大分子イオンが、ナノエレクトロスプレー（ｎＥＳ：ｎａｎｏ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）を用いて生成され、中性および一価のイオンを得るために、電荷が、ポロニウム源を用いて生成された両極性雰囲気によって還元された。ナノ微分型移動度分析器（ｎＤＭＡ：ｎａｎｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、これらのイオンが、ＥＭＤに従ってサイズ分離され、凝縮粒子カウンタ（μＣＰＣ：ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｕｎｔｅｒ）によって検出された。既知の分子に関するＥＭＤ対分子量の相関関係に基づいて、４つのｍＰＥＧ−ＳＳ誘導体のＭＭＤが決定された。ＧＥＭＭＡにおいて得られたデータを確認し、かつ補完するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳが適用された。加速された分子イオンがイオン源と検出器との間の距離を通過するのに必要な時間に基づいて、サンプルの正確な分子量データが測定された。
【００２２】
化学薬品：
２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）および２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸（ＭＳＡ）がＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入された。塩化ナトリウム、酢酸アンモニウム、エタノール９６％（ＥｔＯＨ）および水ｐ．ａ（２５°Ｃにおける導電率≦１μＳ／ｃｍ）がＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手された。ＳｕｎＢｉｏ（Ａｎｙａｎｇ Ｃｉｔｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）からの薬物用途専用の４つの直鎖ＰＥＧサンプル（メトキシＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート）、すなわち、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋ、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ、ｍＰＥＧ−ＳＳ １０ＫおよびｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋが検討された。
【００２３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのためのサンプル調製：
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析のために、ＰＥＧが水に溶解され、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋに対して１ｍｇ／ｍＬ、およびｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ、１０Ｋおよび２０Ｋに対して１０ｍｇ／ｍＬの濃度が得られた。水／ＥｔＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）に溶解したＤＨＢに基づく３つのマトリックス・システムが、最高質量分析分解能の観点から評価された。
マトリックス・システムＡは、１ｍＬの水／ＥｔＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）に溶解した１０ｍｇのＤＨＢからなった。２μＬのＰＥＧ溶液と１μＬのマトリックス溶液とがステンレス製ＭＡＬＤＩターゲット上で直接に混合された。マトリックス・システムＢは、ｓｕｐｅｒＤＨＢ、水／ＥｔＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）中のＤＨＢとＭＳＡとの混合物（９：１、ｗ／ｗ)、からなった；ＰＥＧ溶液とマトリックス溶液とがエッペンドルフ管中で予め混合され（１：４、ｖ／ｖ)、１．５μＬのこの混合物が２回ターゲット上に塗られた。スポットは、０．８μＬのＥｔＯＨを用いて再結晶化された。
マトリックス・システムＣは、ＰＥＧ濃度に関連して１：１（ｖ／ｖ）の比率で０.１ＭのＮａＣｌ溶液を加えたｓｕｐｅｒＤＨＢ（１ｍＬの水／ＥｔＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）に溶解したＤＨＢ／ＭＳＡ（９：１、ｗ／ｗ））からなった。
【００２４】
ポリマー・サンプルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルが、窒素レーザー（λ＝３３７ｎｍ）を装備したＡＸＩＭＡ ＴＯＦ２（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｋｒａｔｏｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）で取得された。装置は、陽イオン、リニアならびにリフレクトロン・モードで動作された。各質量スペクトルは、連続した任意抽出の８０から８００レーザーショットを平均することによって取得された。データ解析前に、質量スペクトルがＳａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズムを用いてスムージングされた。
【００２５】
ＧＥＭＭＡ分析のためのサンプル調製：ＧＥＭＭＡ分析のために、４つすべてのＰＥＧが、酢酸アンモニウム緩衝剤（ｐＨ６．８；２０ｍＭ）に溶解され、１ｍｇ／ｍＬの濃度が得られた。ＧＥＭＭＡシステムは、ナノ−エレクトロスプレー（ｎＥＳ）ユニット、ナノ微分型移動度分析器（ｎＤＭＡ）、および検出器として超微細凝縮粒子カウンタ（μＣＰＣ）（すべての部分がＴＳＩ Ｉｎｃ，Ｓｈｏｒｅｖｉｅｗ，Ｍｎ，ＵＳＡ製）からなる。多価イオンが、エレクトロスプレー・プロセスによって生成され、電荷が低減されて、中性または一価の分子が得られた。イオンは、電気泳動移動度直径（ＥＭＤ）に従ってｎＤＭＡにおいてサイズ分離され、μＣＰＣを用いて検出された。ＰＥＧサイズを測定して分子量を導出するために、いくつかの明確に特徴づけられた球状の標準タンパク質のＥＭＤが測定され、キャリブラントとして用いられた。その結果に基づいて、未知のポリマーのＥＭＤと分子質量との間の相関関係がキャラクタライズされた。ｎＥＳ源の設定は２ｋＶであり、使用された酢酸アンモニウム緩衝剤（ｐＨ６．８；２０ｍＭ）に対して装置を安定なコーンジェット・モードで動作させるために、０．３Ｌ／分のＣＯ２（９９．９９５％，Ａｉｒ Ｌｉｑｕｉｄｅ，Ｓｃｈｗｅｃｈａｔ，Ａｕｓｔｒｉａ）／１Ｌ／分の圧縮空気（９９．９９９％合成空気，Ａｉｒ Ｌｉｑｕｉｄｅ）が適用された。溶融石英キャピラリーの内径は１５０ｎｍであり、エレクトロスプレー・プロセスは陽イオン・モードで動作された。各最終サイズのＧＥＭＭＡスペクトルに対して、１０回のスキャンが平均された。
【００２６】
図２は、検討された４つのＰＥＧのうちの３つに対して得られたＧＥＭＭＡスペクトルを示す。各ＧＥＭＭＡスペクトルにおいて、ユニマー、一価の１つのポリマー鎖、二または三量体、単一電荷を帯びたクラスターを形成した２つまたは３つのポリマー鎖、を含んだエアロゾル液滴に対応する、２から３個のピークを観察することができる。すべてのＥＭ直径の値、および対応するＭＭＤ極大が表１に要約される。３ｎｍ粒径におけるμＣＰＣ分析器の機能的限界ゆえに、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２ＫではＧＥＭＭＡデータを得ることができなかった。同じ理由のために、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋのユニマーは検出できなかった。しかしながら、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋの二および三量体は、３．７２ｎｍおよび４．２９ｎｍのＥＭ直径で検出可能であった。ｍＰＥＧ−ＳＳ １０ＫのＧＥＭＭＡスペクトルは、ユニマー（３．８５ｎｍ）、ならびに二量体（４．７８ｎｍ）および三量体（５.５２ｎｍ）を提示した。ｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋは、ＥＭ直径が４．７８ｎｍのユニマー、５．９４ｎｍの二量体および６．８５ｎｍの三量体を生じた。
【００２７】
【表１】
二量体および三量体の形成（およびその存在割合）は、サンプル濃度と直接に相関し、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋの様々な濃度におけるＧＥＭＭＡスペクトルを提示した図３にこれが示される。サンプル濃度の増加とともに（０．２ｍＭ〜１ｎＭ）ユニマーだけでなく、二および三量体、より高濃度（０．２ｍＭ〜２０ｎＭ）ではさらに４量体も検出された。１ｎＭ未満の濃度からはユニマーのみが検出された。
【００２８】
これらの多量体クラスターは、固有の質量分布を有する個別分子を含み、それらが質量分布の相対的な狭小化をもたらすので、ＭＭＤの測定には、これらのクラスターを検出することが望ましい。クラスター化プロセスによって得られる質量分布のこの相対的な狭小化を、様々なＰＥＧ標準品をキャラクタライズするために利用することができる。形成された多量体クラスターに基づいてＭＭＤ極大が測定され、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋに対して４．７７ｋＤａ、ｍＰＥＧ−ＳＳ １０Ｋに対して９．７６ｋＤａ、およびｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋに対して１８．７０ｋＤａが得られた。ＧＥＭＭＡ分析の精度は、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ（±４.４％）からｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋ（±１.８％）に向上した。すべてのＭＭＤ極大データが表２に要約される。
【００２９】
【表２】
マトリックスＤＨＢの３つの調製方法、広く使用されるＰＥＧキャラクタリゼーション用ＭＡＬＤＩマトリックスが、得られるＭＭＤおよび信号強度に関して評価された。一般に、水／ＥｔＯＨに溶解したＤＨＢは、長い針状結晶を形成し、ターゲット・スポット上にサンプルおよびマトリックスの不均質な分布を生じさせる。高いＳ／Ｎ比および質量分析分解能を有するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルの取得は、マトリックスおよびサンプルが明確な結晶構造内で均質に混合された、いわゆる「スイート・スポット」においてのみ可能である。１０％のＭＳＡ添加および／またはＥｔＯＨを用いた再結晶化が、好ましくないＤＨＢの結晶化挙動を克服するために役立つ。いずれの場合も、より小さくてより一様に分布した結晶が形成され、かくして感度および分解能の向上をもたらす。再結晶化は、好ましい副次的効果、塩汚染の除去を伴うこともありうる。バイオポリマーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳとは対照的に、合成ポリマーのイオン化は、ほとんどがプロトン化よりむしろカチオン化によって生じ、延いては（無機）カチオン化剤の添加が質量分析感度の増加をもたらす。カチオン化剤の使用に伴う別の効果は、ポリマー・サンプル、マトリックスまたは溶媒中に存在する他の塩汚染の抑制である。ｍＰＥＧ−ＳＳサンプルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルに対する、上述のマトリックス添加物（ＭＳＡ）、カチオン化剤および再結晶化の影響が調べられた。
【００３０】
図４は、挙げられた技術（ＤＨＢ、ｓｕｐｅｒＤＨＢ、およびＮａＣｌを含むＳｕｐｅｒＤＨＢ）によって調製され、リフレクトロン・モードで取得されたｍＰＥＧ−ＳＳ ２ＫのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。図４の挿入図は、狭いｍ／ｚ範囲の質量スペクトルの詳細を観察可能な分子イオンおよび対応するΔＭ値とともに示す。３つすべての質量スペクトルにおいて、Ｎａ付加イオンが最も顕著な種である。添加物のないＤＨＢを用いた単純な調製でさえも、４４Ｄａ間隔の３つのイオン群、それぞれＮａ付加イオン（最も強い種）、Ｋ付加イオン（Δｍ ３８Ｄａ、またはＮａ付加イオンに対してΔｍ １６Ｄａ）、および[Ｍ＋Ｎａ＋Ｋ−Ｈ］＋（Ｎａ付加イオンに対してΔｍ ３９Ｄａ）に由来する第３の信号を示す。ｓｕｐｅｒＤＨＢの使用によって、同じくＮａ付加イオン（最も強い）とＫ付加イオンとを含んだＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルが測定されたが、第３の種は観測できなかった。おそらく、この種は、ＥｔＯＨを用いた再結晶化によって除去された。第３のマトリックス溶液は、カチオン化剤として作用するＮａＣｌを混合したｓｕｐｅｒＤＨＢであった。ここで漸く、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋのプロトン化分子イオンを測定することができたが、Ｎａ付加イオンが依然としてより顕著なピークであったのに対して、Ｋ付加イオンは観測することはできなかった。ＮａＣｌを含んだｓｕｐｅｒＤＨＢは、より単純なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを生じ、プロトン化分子イオンならびに依然として優勢なＮａ付加イオンを示した。質量スペクトルの分析がｍ／ｚ １４７７からｍ／ｚ ２７９７に至るＭＭＤを示した。他のポリマー・サンプル、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ、１０Ｋおよび２０ＫのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析のために、ＮａＣｌを含んだｓｕｐｅｒＤＨＢが用いられた。図５に、得られた質量スペクトルが示される。リフレクトロン・モードで取得されたｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋの陽イオンＭＡＬＤＩ質量スペクトルは、ｍ／ｚ ４０７５で始まってｍ／ｚ ５７０３に至る、隣接したポリマー分子イオン間の質量差が４４ＤａのＮａ付加イオン分布を示す。Ｋ付加体もプロトン化分子イオンも観測されなかった。ｍＰＥＧ−ＳＳ １０Ｋの質量スペクトルが、リフレクトロン・モードで分析されたｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋおよび５Ｋとは違って、リニア動作モードで取得され、４４Ｄａ差を持つ一連のＮａ付加イオンが得られた。
【００３１】
ポリマー種の分子イオン分布は、ｍ／ｚ ８９５０からｍ／ｚ １１５９０に及ぶ。ｍＰＥＧ−ＳＳ ２０ＫのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析が、同じくリニア動作モードで行われ、ｍ／ｚ １７８００で始まってｍ／ｚ ２１４５０で終わる分離された信号が得られた。このｍ／ｚ範囲において達成可能な質量分析分解能は、（ちょうど４４Ｄａ離れた）ポリマー種の個別分子イオンを分離するためにはもはや十分でなかった。表２に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって得られたＭＭＤ極大が要約される。以下のＭＭＤ極大が得られた：ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋに対して２１９１Ｄａ、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ ４８７０Ｄａ、ｍＰＥＧ−ＳＳ １０Ｋ １０１５０Ｄａ、およびｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋに対して１９７２０Ｄａ。これらの値は、図１のリストにおける算出された平均分子質量とは異なる；ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋでは＋２００Ｄａ、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋでは−１１８Ｄａ、ｍＰＥＧ−ＳＳ １０Ｋでは＋１４０Ｄａ、ｍＰＥＧ−ＳＳ２０Ｋでは−２９０Ｄａの差を生じる。ＴＯＦ質量分析器の分解能の減少ゆえに、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の精度は、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋ（±０.３％）からｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋ（±１.７％）まで低下した。
【００３２】
検討されたｍＰＥＧ−ＳＳ誘導体のＭＭＤ極大を比較すると、２つの方法（ＧＥＭＭＡおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）の精度が、逆傾向にあることが認められた。ＭＭＤの増加とともに、ポリマーのＧＥＭＭＡ分析の精度は向上し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの精度は低下する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの精度低下は、ＴＯＦ質量分析器の分解能の減少に基づくものである。ＧＥＭＭＡの精度向上は、１から３個のＰＥＧ鎖を含んだ多量体クラスターの検出に基づくもので、これがＭＭＤの相対的な狭小化をもたらす。従って、低いＭＭＤを持つＰＥＧでは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを利用してより有意義なデータを得ることができ、一方でより高いＭＭＤを有するＰＥＧの分析に対しては、ＧＥＭＭＡがより適切な方法である。しかしながら、両方法ともに、会社によって公表された仕様、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて得られたＭＭＤ±１０％、の範囲内にあるＭＭＤ極大をもたらす。ＭＭＤデータは、製品データシートによって提供され、適用された方法に関する情報は、ｗｗｗ．ｓｕｎｂｉｏ．ｃｏｍで得られた。従って、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって得られたＭＭＤ極大（２１９０Ｄａ）は、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋに対して１８００から２２００Ｄａの公表仕様の範囲内にある。上述のように、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋに対するＭＭＤ極大は、３ｎｍ粒径におけるμＣＰＣ検出器の機能的限界ゆえにＧＥＭＭＡ分析では得ることができなかった。ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋに対する４７７０Ｄａ（ＧＥＭＭＡ）および４８７０Ｄａ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）のＭＭＤ極大も、３６００から４４００Ｄａの会社仕様を満たす。ｍＰＥＧ−ＳＳ １０Ｋに対して、ＧＥＭＭＡ分析では９７６０Ｄａ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析では１０１５０Ｄａの極大が得られ、９０００から１１０００ＤａのＭＭＤに完全に適合した。また、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋに対して取得されたＭＭＤ極大、１８７００Ｄａ（ＧＥＭＭＡ）および１９７００（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）も、１８０００から２２０００Ｄａの仕様の範囲内にあった。
【００３３】
ｍＰＥＧ−ＳＳ誘導体のキャラクタリゼーションのための第２のパラメータは、多分散度であり、表３にデータが要約される。会社によって公表された多分散度は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳデータならびにＧＰＣデータに基づくものであり、与えられた仕様は１.０５〜１.１である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータに基づく多分散度の算出は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳアプリケーション・ソフトウェア（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌａｕｎｃｈｐａｄ ２．７，Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｋｒａｔｏｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）によってサポートされたのに対して、ＧＥＭＭＡデータに基づく算出は、他の式を用いることによって行なわれた。ｍＰＥＧ−ＳＳ ２ＫではμＣＰＣ（ＧＥＭＭＡ検出器）の機能的限界ゆえにＧＥＭＭＡデータを得ることができなかったので、ＭＡＬＤＩデータだけから多分散度が算出された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳは、１．０２の多分散度を示した。ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ、１０Ｋおよび２０Ｋに対して、多分散度は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦならびにＧＥＭＭＡデータから算出することができ、両方法およびすべての実験を通じて一貫した１．０１の多分散度が得られた。算出されたすべての多分散度の値は、会社データと一致し、公表された限界値よりさらに低い。従って、すべてのｍＰＥＧ−ＳＳサンプルは、低い多分散度の値によって示唆される非常に低いＭＭＤを提示する。
【００３４】
【表３】
上記は、本発明を記載し、かつ例示するが、添付の請求項によって規定される本発明を限定することは意図されない。本出願に開示され、かつ請求されるすべての方法は、過度の実験を行うことなく本開示を踏まえて作り出し、かつ実行することができる。本発明の材料および方法が特定の実施形態に関して記載されたが、当業者には当然のことながら、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される材料および／または方法ならびに方法のステップまたはステップの順序に変化を加えることができる。より具体的には、本明細書に記載される薬剤は、化学的にも生理学的にも関連するいくつかの薬剤によって置き換えることができ、併せて同じかまたは同様の結果が達成されるであろうことは明らかであろう。
【００３５】
【数１】
【００３６】
【数２】
【００３７】
【数３】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００８年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／１１５，７８１号の利益を主張し、この米国仮特許出願の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
現代社会において、ポリマーは、広範囲にわたる応用に提供されている。顕著な用途の１つは、ペプチドおよびタンパク質へのそれらの結合である。合成ペプチドおよび組み換えタンパク質は、いくつかの内的要因、生体内での低い安定性、それゆえに短い血中濃度半減期、および免疫原性のために自由な適用は制限されるが、効能のある特異的な治療薬として広く用いられている。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、デキストランもしくはポリ（アミノ酸）のようなポリマーを用いた、ペプチド／タンパク質ベースの薬物の結合は、これらの制限を克服し、ペプチド／タンパク質療法の大規模な適用を促進するための戦略として評判を高めている。
【０００３】
タンパク質／ペプチド結合に適するポリマーは、様々な基準を満たす必要がある。該ポリマーは、体内での進行蓄積を回避するために、易生分解性でなくてはならない。その多分散度は、最終的なタンパク質結合体に許容しうる均質性をもたらすために、可能な限り１に近くなくてはならない。所望の体区画での分布および蓄積ならびに持続性作用が、十分な体／区画滞留時間によって提供されなくてはならない。最後に、不均質な生成物をもたらす架橋を回避するために、ペプチド／タンパク質へのポリマーの結合が単一反応基によって達成されなくてはならない。
【０００４】
ＰＥＧは、優れた特性ゆえにポリマー−薬物結合に用いられる最も顕著なポリマーの１つである。ＰＥＧは、無毒性、非免疫原性、非抗原性であり、他の溶媒のみならず水にも溶解度が高く、ヒト用としてＦＤＡおよびＥＭＥＡに承認されている。水および他の多くの有機溶媒中におけるその溶解度は、タンパク質および／またはペプチドを穏やかな生理的条件下でペグ化することを可能にする。ＰＥＧの屈曲性鎖とエチレンオキシド単位当たり２〜３個の水分子を結合する能力との両方が、免疫原性および抗原性を低減し、立体障害の増加によりペプチド／タンパク質の酵素分解を妨げるその能力に寄与する。ＰＥＧの医薬用途に関わる別の重要な特性は、低多分散度（ＰＤＩ：ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ）、Ｍｗ／Ｍｎが約１.０１から約１.１、の可能性である。
【０００５】
薬物結合に適用されるポリマーの必要条件を考慮すると、ＰＥＧは適切な選択肢である。ＰＥＧタンパク質結合体は、免疫原性および抗原性が低減され、体内滞留時間が短縮され、かつ代謝酵素に対する安定性が向上した治療薬を提供することができる。ＰＥＧ結合体では未修飾タンパク質と比較していくつかの生物活性が失われることもあるが、この損失は、しばしば半減期の増加によって補うことができる。タンパク質のペグ化が１９７０年代に導入されて以来、数多くのＰＥＧ−薬物結合体、例えばＡＤＡＧＥＮ（登録商標）、ＮＥＵＬＡＳＴＡ（登録商標）、ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）、ＯＮＣＡＳＰＡＲ（登録商標）が導入され、より多くのＰＥＧ−タンパク質が現在治験フェーズにある。ＰＥＧのさらなる医薬応用には、抗腫瘍薬、ペプチド、もしくはオリゴヌクレオチドのような、より小さい薬物への結合ならびに薬物送達システムあるいは診断キャリアとしての用途がある。
【０００６】
薬物製造は、厳しい管理を受けるので、薬物結合に適用される反応性ＰＥＧのバッチは、詳細に評価されなければならない。一般に、モノメトキシル化ＰＥＧ（ｍＰＥＧ：ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ ＰＥＧ）が用いられる。ｍＰＥＧは、メトキシドイオンを用いて開始されるアニオン開環重合によって合成される。重合の間に存在する微量の水ゆえに、市販のｍＰＥＧには、望ましくない架橋副生成物および様々なレベルのカプリング基をもたらす、かなりの量（１５％まで）のジオールＰＥＧが含まれる可能性がある。
【０００７】
ＰＥＧバッチは、一般に様々な数のモノマーによって構築された分子からなり、従って、理想的な場合にはガウス型分子質量分布（ＭＭＤ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を生じる。起こりうる結果は、様々な生物学的特性、例えば体内滞留時間および／または免疫原性、を持つ薬物結合体である。望ましくない架橋生成物を回避し、ＰＥＧサンプルのＰＤＩおよびＭＭＤを測定するために、結合プロセスの前に、クロマトグラフィーもしくは動的光散乱法のような様々な分析技術を用いてバッチを評価することが推奨されている。しかしながら、ＰＥＧサンプルのＰＤＩおよび／またはＭＭＤを見積もる他の方法の必要性も存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書に開示されるのは、ＰＥＧサンプルのＰＤＩおよび／またはＭＭＤを、気相電気泳動移動度巨大分子分析（ＧＥＭＭＡ：ｇａｓ ｐｈａｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて測定する方法である。特に、本明細書に開示される方法は、ａ）異なった分子量の複数のＰＥＧポリマーを含むＰＥＧサンプルを提供する工程であって、それぞれのＰＥＧポリマーは、第１の末端および第２の末端を含み、第１の末端は、反応性官能基を含む、提供する工程；ｂ）該ＰＥＧサンプルをイオン化して、複数のイオンを提供する工程；ｃ）該複数のイオンを還元して、中性または一価の種を提供する工程；ｄ）微分型移動度分析器（ＤＭＡ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、該複数の中性または一価の種をそれぞれの種の電気泳動移動度直径（ＥＭＤ：ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｄｉａｍｅｔｅｒ）によって分離する工程；およびｅ）それぞれ種のＥＭＤをＰＥＧサンプルのＰＤＩおよび／またはＭＭＤに関連づける工程を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧの第２の末端は、メトキシメチル基を含む。様々な実施形態において、反応性官能基は、スクシンイミジルスクシネート基を含む。サンプルにおけるＰＥＧの濃度は、少なくとも約１ｎＭまたは少なくとも約０.２ｍＭとすることができる。いくつかの特定の場合に、サンプルにおけるＰＥＧの濃度は、約５ｎＭから約１００ｍＭである。
【００１０】
ＰＥＧサンプルをイオン化することは、サンプルにエレクトロスプレーイオン化を受けさせることによって可能である。イオンを還元することは、イオンを両極性雰囲気に曝露することによって可能である。特定の場合に、両極性雰囲気は、ポロニウム源によって生成することができる。キャラクタライズすることは、それぞれのイオンのＥＭＤを既知の分子量のＥＭＤに関連づけることによることができる。それぞれのイオンのＥＭＤは、少なくとも約３ｎｍとすることができる。イオンは、ユニマー、二量体、三量体、またはｑｕａｄｒａｍｅｒを形成することができる。いくつかの場合には、イオンが三量体および二量体を形成し、ＰＥＧサンプルのＰＤＩおよびＭＭＤの両方が算出される。特定の場合に、ＰＤＩおよび／またはＭＭＤの算出精度は、少なくとも５％、または少なくとも２％である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネートの構造、および様々なＰＥＧサンプルに対して算出された分子量をモノマー数とともに示す。
【図２】図２は、３つのＰＥＧサンプルのＧＥＭＭＡスペクトルを示す。各ＧＥＭＭＡスペクトルではユニマー、一価の１つのポリマー鎖、二または三量体を含んだエアロゾル液滴に対応する、２つから３つのピークを観察することができる。
【図３】図３は、様々な濃度のｍＰＥＧ−ＳＳ ２０ＫのＧＥＭＭＡスペクトルを示す。
【図４】図４は、挙げられた技術（ＤＨＢ、ＳｕｐｅｒＤＨＢ、およびＮａＣｌを含むＳｕｐｅｒＤＨＢ）によって調製され、リフレクトロン・モードで取得されたｍＰＥＧ−ＳＳ ２ＫのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。図４の挿入図は、狭いｍ／ｚ範囲の質量スペクトルの詳細を観察可能な分子イオンおよび対応する質量値の違う（ΔＭ）とともに示す。
【図５】図５は、ＮａＣｌを含んだｓｕｐｅｒＤＨＢを用いたｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ，１０Ｋおよび２０ＫのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書に開示されるのは、ＰＥＧサンプルのＰＤＩおよび／またはＭＭＤを測定する方法である。ＰＥＧサンプルは、タンパク質結合治療薬を形成するためのタンパク質またはペプチドへの結合前に評価される。かかる治療薬が、様々な薬物管理委員会（例えば、ＦＤＡおよびＥＤＭＡ）によって典型的に厳しく管理またはモニターされることから、かかる測定は、タンパク質またはペプチドへの結合に関わる特定のＰＥＧサンプルの適合性を検証するために重要である。典型的に、適切なＰＥＧサンプルは、１に近い、例えば約１．０５から約１．２、または約１．０５から約１．１のＰＤＩを有する。
【００１３】
ＰＥＧサンプルは、通常は複数のポリマー、すなわち、エチレングリコール単量体の繰り返し数が異なるために分子量が異なるポリマーを有する。ＰＥＧサンプルにおけるＰＥＧポリマーの分子量分布の測定がサンプルのＭＭＤを提供する。サンプルのＰＤＩは、ポリマー・サンプルの重量平均（Ｍｗ）：数平均分子量（Ｍｎ）の比率に関する測定結果である。Ｍｗは、ポリマー・サンプルから無作為に選択された特定のポリマーが、平均するとＭｗの質量を持つポリマーの重量平均質量である。Ｍｎは、ポリマーの数平均質量であり、ポリマー・サンプルにおけるすべてのポリマーのすべての分子量の平均である。
【００１４】
本開示の方法において分析されるＰＥＧサンプルは、典型的に１つの末端に反応性官能基を有する。例えば、ＰＥＧは、１つの末端にタンパク質またはペプチドへの結合を可能にする適切な反応基、および他の末端に非反応性官能基を有することができる。非反応性官能基は、特定の反応条件下で不活性な官能基である。タンパク質および／またはペプチドへのＰＥＧのカップリング条件下において、非反応性官能基は、以下には限定されないが、メトキシ基とすることができる。反応性官能基は、特定の反応条件下において対象のタンパク質、ペプチド、または他の分子と結合体を形成することができる官能基である。かかる反応性官能基の非限定の例は、スクシンイミジルスクシネートなどを含む。
【００１５】
ＰＥＧサンプルは、ＧＥＭＭＡを用いた質量分析法によって分析される。ＧＥＭＭＡでは、サンプルがイオン化される。イオン化は、エレクトロスプレーイオン化によって可能であるが、他の既知のイオン化技術を用いることもできる。次に、形成されたイオンが還元されて一価のイオンまたは中性種が形成される。イオンは、還元雰囲気、例えば両極性雰囲気に曝露されることによって還元されることができる。いくつかの場合に、両極性雰囲気は、ポロニウム源のようなα粒子源に由来する。イオンは、次に空気中における移動度に応じてイオンを分離する微分型移動度分析器を用いて分離される。次に、イオンは、凝縮粒子カウンタを用いて検出される。各イオンの電気泳動移動度直径（ＥＭＤ）は、ミリカンの式を用いて算出することができ、その後イオンの分子量に関連づけることができる。通常は、かかる関連づけに、分子量が既知の分子に関するＥＭＤの比較が用いられる。ＧＥＭＭＡ分析は、Ａｌｌｍａｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃ．，３６：１０３８−１０５２（２００１）で一般的に論じられる。
【００１６】
ＧＥＭＭＡ分析では、分子量を測定するためにイオンのＥＭＤを用いるので、一般にＥＭＤが大きいほどより正確な測定が提供される。従って、いくつかの実施形態において、イオンのＥＭＤは、少なくとも２ｎｍ、または少なくとも３ｎｍである。イオンは、ユニマー（１個のイオン）、二量体（一緒にクラスター化した２個のイオン）、三量体（一緒にクラスター化した３個のイオン）、ｑｕａｄｒａｍｅｒ（一緒にクラスター化した４個のイオン）、またはより高次の構造を形成することができる。三量体およびｑｕａｄｒａｍｅｒが形成されると、ＥＭＤが典型的に大きくなり、従って粒子カウンタを用いてより容易に検出することができる。それゆえに、ＭＭＤおよび／またはＰＤＩのより正確な測定が、かかる構造の形成によって可能になる。
【００１７】
サンプル中のＰＥＧの濃度によって、二量体、三量体、ｑｕａｄｒａｍｅｒなどの形成をもたらすことができる。濃度が高いほど、より多くの二量体、三量体、および／またはｑｕａｄｒａｍｅｒが形成される。いくつかの場合に、ＰＥＧサンプルは、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも３ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも０.１ｍＭ、または少なくとも０.２ｍＭのＰＥＧ濃度を有する。
【００１８】
測定の精度は、当分野で知られる方法によって測定することができる。ＰＤＩおよび／またはＭＭＤ測定の精度は、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、または少なくとも約２％とすることができる。
【００１９】
国内的および国際的な規制機関の厳重な管理が、薬物製造（例えば、組み換えタンパク質）においてペグ化に適用される反応性ＰＥＧポリマーのバッチに関する正確なキャラクタリゼーションを強いる。ＭＭＤおよび多分散度の測定は、不均質な最終生成物に起因して特に重要である。本開示のように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびＧＥＭＭＡ、異なった物理化学的原理に基づく２つの装置を用いて、４つのｍＰＥＧ−ＳＳバッチが分析された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析による分子質量の測定は、飛行時間および相関するｍ／ｚ値の測定に基づき、ＧＥＭＭＡ分析は、電気泳動移動度直径および導出される分子質量に従って機能する。ｍＰＥＧ−ＳＳバッチについて得られたＭＭＤ極大は、会社によって公表された仕様、ＭＭＤ±１０％、の範囲内にあり、ＧＥＭＭＡまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって達成されるデータ品質に関しては、より詳細な製品情報、例えば会社によって得られた正確なＭＭＤ極大の欠如ゆえに、さらなる結論を引き出すことはできなかった。ＧＥＭＭＡならびにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータから、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋに対して１.０２、およびｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ、１０Ｋ，２０Ｋに対して１.０１の多分散度の値が算出され、ｍＰＥＧ−ＳＳ誘導体が、低いＭＭＤを提示し、タンパク質およびペプチドへの結合に利用するのに好ましい基準を満たすことが示唆された。
【００２０】
ＭＭＤの増加とともに、ポリマーのＧＥＭＭＡ分析の精度は向上し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの精度は低下する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの精度の低下は、ＴＯＦ質量分析器の分解能の減少に基づく。ＧＥＭＭＡの精度の向上は、１から３個のＰＥＧ鎖を含んだ多量体クラスターの検出に基づくものであり、これらがＭＭＤの相対的な狭小化をもたらす。従って、低いＭＭＤを持つＰＥＧに対しては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを利用してより有意義なデータを得ることができるのに対して、高いＭＭＤを持つＰＥＧの分析には、ＧＥＭＭＡの方がより適切な方法である。
【実施例】
【００２１】
構造と算出された正確な分子質量とが図１に示される４つのモノメトキシＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート（ｍＰＥＧ−ＳＳ）サンプルが、ＭＭＤおよびＰＤＩによってキャラクタライズされた。各サンプルのＥＭＤが、ＧＥＭＭＡによって測定された。多価の巨大分子イオンが、ナノエレクトロスプレー（ｎＥＳ：ｎａｎｏ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）を用いて生成され、中性および一価のイオンを得るために、電荷が、ポロニウム源を用いて生成された両極性雰囲気によって還元された。ナノ微分型移動度分析器（ｎＤＭＡ：ｎａｎｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、これらのイオンが、ＥＭＤに従ってサイズ分離され、凝縮粒子カウンタ（μＣＰＣ：ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｕｎｔｅｒ）によって検出された。既知の分子に関するＥＭＤ対分子量の相関関係に基づいて、４つのｍＰＥＧ−ＳＳ誘導体のＭＭＤが決定された。ＧＥＭＭＡにおいて得られたデータを確認し、かつ補完するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳが適用された。加速された分子イオンがイオン源と検出器との間の距離を通過するのに必要な時間に基づいて、サンプルの正確な分子量データが測定された。
【００２２】
化学薬品：
２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）および２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸（ＭＳＡ）がＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入された。塩化ナトリウム、酢酸アンモニウム、エタノール９６％（ＥｔＯＨ）および水ｐ．ａ（２５°Ｃにおける導電率≦１μＳ／ｃｍ）がＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手された。ＳｕｎＢｉｏ（Ａｎｙａｎｇ Ｃｉｔｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）からの薬物用途専用の４つの直鎖ＰＥＧサンプル（メトキシＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート）、すなわち、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋ、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ、ｍＰＥＧ−ＳＳ １０ＫおよびｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋが検討された。
【００２３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのためのサンプル調製：
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析のために、ＰＥＧが水に溶解され、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋに対して１ｍｇ／ｍＬ、およびｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ、１０Ｋおよび２０Ｋに対して１０ｍｇ／ｍＬの濃度が得られた。水／ＥｔＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）に溶解したＤＨＢに基づく３つのマトリックス・システムが、最高質量分析分解能の観点から評価された。
マトリックス・システムＡは、１ｍＬの水／ＥｔＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）に溶解した１０ｍｇのＤＨＢからなった。２μＬのＰＥＧ溶液と１μＬのマトリックス溶液とがステンレス製ＭＡＬＤＩターゲット上で直接に混合された。マトリックス・システムＢは、ｓｕｐｅｒＤＨＢ、水／ＥｔＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）中のＤＨＢとＭＳＡとの混合物（９：１、ｗ／ｗ)、からなった；ＰＥＧ溶液とマトリックス溶液とがエッペンドルフ管中で予め混合され（１：４、ｖ／ｖ)、１．５μＬのこの混合物が２回ターゲット上に塗られた。スポットは、０．８μＬのＥｔＯＨを用いて再結晶化された。
マトリックス・システムＣは、ＰＥＧ濃度に関連して１：１（ｖ／ｖ）の比率で０.１ＭのＮａＣｌ溶液を加えたｓｕｐｅｒＤＨＢ（１ｍＬの水／ＥｔＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）に溶解したＤＨＢ／ＭＳＡ（９：１、ｗ／ｗ））からなった。
【００２４】
ポリマー・サンプルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルが、窒素レーザー（λ＝３３７ｎｍ）を装備したＡＸＩＭＡ ＴＯＦ２（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｋｒａｔｏｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）で取得された。装置は、陽イオン、リニアならびにリフレクトロン・モードで動作された。各質量スペクトルは、連続した任意抽出の８０から８００レーザーショットを平均することによって取得された。データ解析前に、質量スペクトルがＳａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズムを用いてスムージングされた。
【００２５】
ＧＥＭＭＡ分析のためのサンプル調製：ＧＥＭＭＡ分析のために、４つすべてのＰＥＧが、酢酸アンモニウム緩衝剤（ｐＨ６．８；２０ｍＭ）に溶解され、１ｍｇ／ｍＬの濃度が得られた。ＧＥＭＭＡシステムは、ナノ−エレクトロスプレー（ｎＥＳ）ユニット、ナノ微分型移動度分析器（ｎＤＭＡ）、および検出器として超微細凝縮粒子カウンタ（μＣＰＣ）（すべての部分がＴＳＩ Ｉｎｃ，Ｓｈｏｒｅｖｉｅｗ，Ｍｎ，ＵＳＡ製）からなる。多価イオンが、エレクトロスプレー・プロセスによって生成され、電荷が低減されて、中性または一価の分子が得られた。イオンは、電気泳動移動度直径（ＥＭＤ）に従ってｎＤＭＡにおいてサイズ分離され、μＣＰＣを用いて検出された。ＰＥＧサイズを測定して分子量を導出するために、いくつかの明確に特徴づけられた球状の標準タンパク質のＥＭＤが測定され、キャリブラントとして用いられた。その結果に基づいて、未知のポリマーのＥＭＤと分子質量との間の相関関係がキャラクタライズされた。ｎＥＳ源の設定は２ｋＶであり、使用された酢酸アンモニウム緩衝剤（ｐＨ６．８；２０ｍＭ）に対して装置を安定なコーンジェット・モードで動作させるために、０．３Ｌ／分のＣＯ２（９９．９９５％，Ａｉｒ Ｌｉｑｕｉｄｅ，Ｓｃｈｗｅｃｈａｔ，Ａｕｓｔｒｉａ）／１Ｌ／分の圧縮空気（９９．９９９％合成空気，Ａｉｒ Ｌｉｑｕｉｄｅ）が適用された。溶融石英キャピラリーの内径は１５０ｎｍであり、エレクトロスプレー・プロセスは陽イオン・モードで動作された。各最終サイズのＧＥＭＭＡスペクトルに対して、１０回のスキャンが平均された。
【００２６】
図２は、検討された４つのＰＥＧのうちの３つに対して得られたＧＥＭＭＡスペクトルを示す。各ＧＥＭＭＡスペクトルにおいて、ユニマー、一価の１つのポリマー鎖、二または三量体、単一電荷を帯びたクラスターを形成した２つまたは３つのポリマー鎖、を含んだエアロゾル液滴に対応する、２から３個のピークを観察することができる。すべてのＥＭ直径の値、および対応するＭＭＤ極大が表１に要約される。３ｎｍ粒径におけるμＣＰＣ分析器の機能的限界ゆえに、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２ＫではＧＥＭＭＡデータを得ることができなかった。同じ理由のために、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋのユニマーは検出できなかった。しかしながら、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋの二および三量体は、３．７２ｎｍおよび４．２９ｎｍのＥＭ直径で検出可能であった。ｍＰＥＧ−ＳＳ １０ＫのＧＥＭＭＡスペクトルは、ユニマー（３．８５ｎｍ）、ならびに二量体（４．７８ｎｍ）および三量体（５.５２ｎｍ）を提示した。ｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋは、ＥＭ直径が４．７８ｎｍのユニマー、５．９４ｎｍの二量体および６．８５ｎｍの三量体を生じた。
【００２７】
【表１】
二量体および三量体の形成（およびその存在割合）は、サンプル濃度と直接に相関し、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋの様々な濃度におけるＧＥＭＭＡスペクトルを提示した図３にこれが示される。サンプル濃度の増加とともに（０．２ｍＭ〜１ｎＭ）ユニマーだけでなく、二および三量体、より高濃度（０．２ｍＭ〜２０ｎＭ）ではさらに４量体も検出された。１ｎＭ未満の濃度からはユニマーのみが検出された。
【００２８】
これらの多量体クラスターは、固有の質量分布を有する個別分子を含み、それらが質量分布の相対的な狭小化をもたらすので、ＭＭＤの測定には、これらのクラスターを検出することが望ましい。クラスター化プロセスによって得られる質量分布のこの相対的な狭小化を、様々なＰＥＧ標準品をキャラクタライズするために利用することができる。形成された多量体クラスターに基づいてＭＭＤ極大が測定され、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋに対して４．７７ｋＤａ、ｍＰＥＧ−ＳＳ １０Ｋに対して９．７６ｋＤａ、およびｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋに対して１８．７０ｋＤａが得られた。ＧＥＭＭＡ分析の精度は、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ（±４.４％）からｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋ（±１.８％）に向上した。すべてのＭＭＤ極大データが表２に要約される。
【００２９】
【表２】
マトリックスＤＨＢの３つの調製方法、広く使用されるＰＥＧキャラクタリゼーション用ＭＡＬＤＩマトリックスが、得られるＭＭＤおよび信号強度に関して評価された。一般に、水／ＥｔＯＨに溶解したＤＨＢは、長い針状結晶を形成し、ターゲット・スポット上にサンプルおよびマトリックスの不均質な分布を生じさせる。高いＳ／Ｎ比および質量分析分解能を有するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルの取得は、マトリックスおよびサンプルが明確な結晶構造内で均質に混合された、いわゆる「スイート・スポット」においてのみ可能である。１０％のＭＳＡ添加および／またはＥｔＯＨを用いた再結晶化が、好ましくないＤＨＢの結晶化挙動を克服するために役立つ。いずれの場合も、より小さくてより一様に分布した結晶が形成され、かくして感度および分解能の向上をもたらす。再結晶化は、好ましい副次的効果、塩汚染の除去を伴うこともありうる。バイオポリマーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳとは対照的に、合成ポリマーのイオン化は、ほとんどがプロトン化よりむしろカチオン化によって生じ、延いては（無機）カチオン化剤の添加が質量分析感度の増加をもたらす。カチオン化剤の使用に伴う別の効果は、ポリマー・サンプル、マトリックスまたは溶媒中に存在する他の塩汚染の抑制である。ｍＰＥＧ−ＳＳサンプルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルに対する、上述のマトリックス添加物（ＭＳＡ）、カチオン化剤および再結晶化の影響が調べられた。
【００３０】
図４は、挙げられた技術（ＤＨＢ、ｓｕｐｅｒＤＨＢ、およびＮａＣｌを含むＳｕｐｅｒＤＨＢ）によって調製され、リフレクトロン・モードで取得されたｍＰＥＧ−ＳＳ ２ＫのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。図４の挿入図は、狭いｍ／ｚ範囲の質量スペクトルの詳細を観察可能な分子イオンおよび対応するΔＭ値とともに示す。３つすべての質量スペクトルにおいて、Ｎａ付加イオンが最も顕著な種である。添加物のないＤＨＢを用いた単純な調製でさえも、４４Ｄａ間隔の３つのイオン群、それぞれＮａ付加イオン（最も強い種）、Ｋ付加イオン（Δｍ ３８Ｄａ、またはＮａ付加イオンに対してΔｍ １６Ｄａ）、および[Ｍ＋Ｎａ＋Ｋ−Ｈ］＋（Ｎａ付加イオンに対してΔｍ ３９Ｄａ）に由来する第３の信号を示す。ｓｕｐｅｒＤＨＢの使用によって、同じくＮａ付加イオン（最も強い）とＫ付加イオンとを含んだＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルが測定されたが、第３の種は観測できなかった。おそらく、この種は、ＥｔＯＨを用いた再結晶化によって除去された。第３のマトリックス溶液は、カチオン化剤として作用するＮａＣｌを混合したｓｕｐｅｒＤＨＢであった。ここで漸く、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋのプロトン化分子イオンを測定することができたが、Ｎａ付加イオンが依然としてより顕著なピークであったのに対して、Ｋ付加イオンは観測することはできなかった。ＮａＣｌを含んだｓｕｐｅｒＤＨＢは、より単純なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを生じ、プロトン化分子イオンならびに依然として優勢なＮａ付加イオンを示した。質量スペクトルの分析がｍ／ｚ １４７７からｍ／ｚ ２７９７に至るＭＭＤを示した。他のポリマー・サンプル、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ、１０Ｋおよび２０ＫのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析のために、ＮａＣｌを含んだｓｕｐｅｒＤＨＢが用いられた。図５に、得られた質量スペクトルが示される。リフレクトロン・モードで取得されたｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋの陽イオンＭＡＬＤＩ質量スペクトルは、ｍ／ｚ ４０７５で始まってｍ／ｚ ５７０３に至る、隣接したポリマー分子イオン間の質量差が４４ＤａのＮａ付加イオン分布を示す。Ｋ付加体もプロトン化分子イオンも観測されなかった。ｍＰＥＧ−ＳＳ １０Ｋの質量スペクトルが、リフレクトロン・モードで分析されたｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋおよび５Ｋとは違って、リニア動作モードで取得され、４４Ｄａ差を持つ一連のＮａ付加イオンが得られた。
【００３１】
ポリマー種の分子イオン分布は、ｍ／ｚ ８９５０からｍ／ｚ １１５９０に及ぶ。ｍＰＥＧ−ＳＳ ２０ＫのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析が、同じくリニア動作モードで行われ、ｍ／ｚ １７８００で始まってｍ／ｚ ２１４５０で終わる分離された信号が得られた。このｍ／ｚ範囲において達成可能な質量分析分解能は、（ちょうど４４Ｄａ離れた）ポリマー種の個別分子イオンを分離するためにはもはや十分でなかった。表２に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって得られたＭＭＤ極大が要約される。以下のＭＭＤ極大が得られた：ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋに対して２１９１Ｄａ、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ ４８７０Ｄａ、ｍＰＥＧ−ＳＳ １０Ｋ １０１５０Ｄａ、およびｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋに対して１９７２０Ｄａ。これらの値は、図１のリストにおける算出された平均分子質量とは異なる；ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋでは＋２００Ｄａ、ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋでは−１１８Ｄａ、ｍＰＥＧ−ＳＳ １０Ｋでは＋１４０Ｄａ、ｍＰＥＧ−ＳＳ２０Ｋでは−２９０Ｄａの差を生じる。ＴＯＦ質量分析器の分解能の減少ゆえに、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の精度は、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋ（±０.３％）からｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋ（±１.７％）まで低下した。
【００３２】
検討されたｍＰＥＧ−ＳＳ誘導体のＭＭＤ極大を比較すると、２つの方法（ＧＥＭＭＡおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）の精度が、逆傾向にあることが認められた。ＭＭＤの増加とともに、ポリマーのＧＥＭＭＡ分析の精度は向上し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの精度は低下する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの精度低下は、ＴＯＦ質量分析器の分解能の減少に基づくものである。ＧＥＭＭＡの精度向上は、１から３個のＰＥＧ鎖を含んだ多量体クラスターの検出に基づくもので、これがＭＭＤの相対的な狭小化をもたらす。従って、低いＭＭＤを持つＰＥＧでは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを利用してより有意義なデータを得ることができ、一方でより高いＭＭＤを有するＰＥＧの分析に対しては、ＧＥＭＭＡがより適切な方法である。しかしながら、両方法ともに、会社によって公表された仕様、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて得られたＭＭＤ±１０％、の範囲内にあるＭＭＤ極大をもたらす。ＭＭＤデータは、製品データシートによって提供され、適用された方法に関する情報は、ｗｗｗ．ｓｕｎｂｉｏ．ｃｏｍで得られた。従って、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって得られたＭＭＤ極大（２１９０Ｄａ）は、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋに対して１８００から２２００Ｄａの公表仕様の範囲内にある。上述のように、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２Ｋに対するＭＭＤ極大は、３ｎｍ粒径におけるμＣＰＣ検出器の機能的限界ゆえにＧＥＭＭＡ分析では得ることができなかった。ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋに対する４７７０Ｄａ（ＧＥＭＭＡ）および４８７０Ｄａ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）のＭＭＤ極大も、３６００から４４００Ｄａの会社仕様を満たす。ｍＰＥＧ−ＳＳ １０Ｋに対して、ＧＥＭＭＡ分析では９７６０Ｄａ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析では１０１５０Ｄａの極大が得られ、９０００から１１０００ＤａのＭＭＤに完全に適合した。また、ｍＰＥＧ−ＳＳ ２０Ｋに対して取得されたＭＭＤ極大、１８７００Ｄａ（ＧＥＭＭＡ）および１９７００（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）も、１８０００から２２０００Ｄａの仕様の範囲内にあった。
【００３３】
ｍＰＥＧ−ＳＳ誘導体のキャラクタリゼーションのための第２のパラメータは、多分散度であり、表３にデータが要約される。会社によって公表された多分散度は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳデータならびにＧＰＣデータに基づくものであり、与えられた仕様は１.０５〜１.１である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータに基づく多分散度の算出は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳアプリケーション・ソフトウェア（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌａｕｎｃｈｐａｄ ２．７，Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｋｒａｔｏｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）によってサポートされたのに対して、ＧＥＭＭＡデータに基づく算出は、他の式を用いることによって行なわれた。ｍＰＥＧ−ＳＳ ２ＫではμＣＰＣ（ＧＥＭＭＡ検出器）の機能的限界ゆえにＧＥＭＭＡデータを得ることができなかったので、ＭＡＬＤＩデータだけから多分散度が算出された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳは、１．０２の多分散度を示した。ｍＰＥＧ−ＳＳ ５Ｋ、１０Ｋおよび２０Ｋに対して、多分散度は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦならびにＧＥＭＭＡデータから算出することができ、両方法およびすべての実験を通じて一貫した１．０１の多分散度が得られた。算出されたすべての多分散度の値は、会社データと一致し、公表された限界値よりさらに低い。従って、すべてのｍＰＥＧ−ＳＳサンプルは、低い多分散度の値によって示唆される非常に低いＭＭＤを提示する。
【００３４】
【表３】
上記は、本発明を記載し、かつ例示するが、添付の請求項によって規定される本発明を限定することは意図されない。本出願に開示され、かつ請求されるすべての方法は、過度の実験を行うことなく本開示を踏まえて作り出し、かつ実行することができる。本発明の材料および方法が特定の実施形態に関して記載されたが、当業者には当然のことながら、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される材料および／または方法ならびに方法のステップまたはステップの順序に変化を加えることができる。より具体的には、本明細書に記載される薬剤は、化学的にも生理学的にも関連するいくつかの薬剤によって置き換えることができ、併せて同じかまたは同様の結果が達成されるであろうことは明らかであろう。
【００３５】
【数１】
【００３６】
【数２】
【００３７】
【数３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サンプルの多分散度を測定する方法であって、該方法は、
ａ）異なった分子量の複数のＰＥＧポリマーを含む該ＰＥＧサンプルを提供する工程であって、それぞれのＰＥＧポリマーは、第１の末端および第２の末端を含み、該第１の末端は反応性官能基を含む、工程；
ｂ）該ＰＥＧサンプルをイオン化して、複数のイオンを提供する工程；
ｃ）該複数のイオンを還元して、中性または一価の種を提供する工程；
ｄ）微分型移動度分析器（ＤＭＡ）を用いて、該複数の中性または一価の種をそれぞれの種の電気泳動移動度直径（ＥＭＤ）によって分離する工程；および
ｅ）それぞれの種の該ＥＭＤを該ＰＥＧサンプルの該多分散度に関連づける工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記第２の末端は、メトキシ基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応性官能基は、スクシンイミジルスクシネート基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記イオン化する工程は、前記混合物にエレクトロスプレーイオン化を受けさせる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記還元する工程は、前記中性または一価の種を両極性雰囲気に曝露する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記両極性雰囲気は、ポロニウム源によって生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記関連づける工程は、それぞれの中性または一価の種の前記ＥＭＤを既知の分子量のＥＭＤに関連づける工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの中性または一価の種の前記ＥＭＤは、少なくとも約３ｎｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＥＧは、前記混合物中で少なくとも１ｎＭの濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＥＧは、前記混合物中で少なくとも０．２ｍＭの濃度を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記中性または一価の種は、ユニマー、二量体、三量体、ｑｕａｄｒａｍｅｒまたはそれらの組み合わせを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記中性または一価の種は、三量体またはｑｕａｄｒａｍｅｒを形成し、前記関連づける工程は、前記混合物中での前記ＰＥＧの分子質量分布（ＭＭＤ）を算出する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＭＤ算出は、５％以内の精度を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記精度は、２％以内である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サンプルの分子量分布を測定する方法であって、該方法は、
ａ）異なった分子量の複数のＰＥＧポリマーを含む該ＰＥＧサンプルを提供する工程であって、それぞれのＰＥＧポリマーは、第１の末端および第２の末端を含み、該第１の末端は反応性官能基を含む、工程；
ｂ）該ＰＥＧサンプルをイオン化して、複数のイオンを提供する工程；
ｃ）該複数のイオンを還元して、中性または一価の種を提供する工程；
ｄ）微分型移動度分析器（ＤＭＡ）を用いて、該複数の中性または一価の種をそれぞれの種の電気泳動移動度直径（ＥＭＤ）によって分離する工程；および
ｅ）それぞれの種の該ＥＭＤを該ＰＥＧサンプルの該分子量分布に関連づける工程
を含む、方法。
【請求項１６】
前記第２の末端は、メトキシ基を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記反応性官能基は、スクシンイミジルスクシネート基を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記イオン化する工程は、前記混合物にエレクトロスプレーイオン化を受けさせる工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記還元する工程は、前記中性または一価の種を両極性雰囲気に曝露する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記両極性雰囲気は、ポロニウム源によって生成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記関連づける工程は、それぞれの中性または一価の種の前記ＥＭＤを既知の分子量のＥＭＤに関連づける工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記中性または一価の種の少なくとも１つのＥＭＤは、少なくとも約３ｎｍである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＰＥＧは、前記混合物中で少なくとも１ｎＭの濃度を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＥＧは、前記混合物中で少なくとも０．２ｍＭの濃度を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記中性または一価の種は、ユニマー、二量体、三量体、ｑｕａｄｒａｍｅｒまたはそれらの組み合わせを形成する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＭＭＤ算出は、５％以内の精度を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記精度は、２％以内である、請求項２６に記載の方法。
【請求項１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サンプルの多分散度を測定する方法であって、該方法は、
ａ）異なった分子量の複数のＰＥＧポリマーを含む該ＰＥＧサンプルを提供する工程であって、それぞれのＰＥＧポリマーは、第１の末端および第２の末端を含み、該第１の末端は反応性官能基を含む、工程；
ｂ）該ＰＥＧサンプルをイオン化して、複数のイオンを提供する工程；
ｃ）該複数のイオンを還元して、中性または一価の種を提供する工程；
ｄ）微分型移動度分析器（ＤＭＡ）を用いて、該複数の中性または一価の種をそれぞれの種の電気泳動移動度直径（ＥＭＤ）によって分離する工程；および
ｅ）それぞれの種の該ＥＭＤを該ＰＥＧサンプルの該多分散度に関連づける工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記第２の末端は、メトキシ基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応性官能基は、スクシンイミジルスクシネート基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記イオン化する工程は、前記混合物にエレクトロスプレーイオン化を受けさせる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記還元する工程は、前記中性または一価の種を両極性雰囲気に曝露する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記両極性雰囲気は、ポロニウム源によって生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記関連づける工程は、それぞれの中性または一価の種の前記ＥＭＤを既知の分子量のＥＭＤに関連づける工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの中性または一価の種の前記ＥＭＤは、少なくとも約３ｎｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＥＧは、前記混合物中で少なくとも１ｎＭの濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＥＧは、前記混合物中で少なくとも０．２ｍＭの濃度を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記中性または一価の種は、ユニマー、二量体、三量体、ｑｕａｄｒａｍｅｒまたはそれらの組み合わせを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記中性または一価の種は、三量体またはｑｕａｄｒａｍｅｒを形成し、前記関連づける工程は、前記混合物中での前記ＰＥＧの分子質量分布（ＭＭＤ）を算出する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＭＤ算出は、５％以内の精度を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記精度は、２％以内である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サンプルの分子量分布を測定する方法であって、該方法は、
ａ）異なった分子量の複数のＰＥＧポリマーを含む該ＰＥＧサンプルを提供する工程であって、それぞれのＰＥＧポリマーは、第１の末端および第２の末端を含み、該第１の末端は反応性官能基を含む、工程；
ｂ）該ＰＥＧサンプルをイオン化して、複数のイオンを提供する工程；
ｃ）該複数のイオンを還元して、中性または一価の種を提供する工程；
ｄ）微分型移動度分析器（ＤＭＡ）を用いて、該複数の中性または一価の種をそれぞれの種の電気泳動移動度直径（ＥＭＤ）によって分離する工程；および
ｅ）それぞれの種の該ＥＭＤを該ＰＥＧサンプルの該分子量分布に関連づける工程
を含む、方法。
【請求項１６】
前記第２の末端は、メトキシ基を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記反応性官能基は、スクシンイミジルスクシネート基を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記イオン化する工程は、前記混合物にエレクトロスプレーイオン化を受けさせる工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記還元する工程は、前記中性または一価の種を両極性雰囲気に曝露する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記両極性雰囲気は、ポロニウム源によって生成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記関連づける工程は、それぞれの中性または一価の種の前記ＥＭＤを既知の分子量のＥＭＤに関連づける工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記中性または一価の種の少なくとも１つのＥＭＤは、少なくとも約３ｎｍである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＰＥＧは、前記混合物中で少なくとも１ｎＭの濃度を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＥＧは、前記混合物中で少なくとも０．２ｍＭの濃度を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記中性または一価の種は、ユニマー、二量体、三量体、ｑｕａｄｒａｍｅｒまたはそれらの組み合わせを形成する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＭＭＤ算出は、５％以内の精度を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記精度は、２％以内である、請求項２６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５０９４６９（Ｐ２０１２−５０９４６９Ａ）
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３６６１２（Ｐ２０１１−５３６６１２）
【出願日】平成２１年１１月１８日（２００９．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６４８９６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５９６６１
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【出願人】（５０９２１３９９０）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１８日（２００９．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６４８９６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５９６６１
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【出願人】（５０９２１３９９０）
【Ｆターム（参考）】
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