ポリオール脱水素酵素の製造方法
【課題】熱安定性および保存安定性に優れるＰＱＱ依存性ＰＤＨを簡便に製造する方法を提供する。
【解決手段】補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を２価性架橋試薬で架橋反応させる工程（１）と、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方で架橋反応を停止して酵素溶液を得る工程（２）と、前記酵素溶液を凍結乾燥して粉末酵素を得る工程（３）と、を含む、ポリオール脱水素酵素の製造方法。
【解決手段】補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を２価性架橋試薬で架橋反応させる工程（１）と、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方で架橋反応を停止して酵素溶液を得る工程（２）と、前記酵素溶液を凍結乾燥して粉末酵素を得る工程（３）と、を含む、ポリオール脱水素酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（以下、ＰＱＱ依存性ＰＤＨとも称する。）の製造方法、該ＰＱＱ依存性ＰＤＨを含むポリオール測定試薬、および該ＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いたポリオールの定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、例えば、グリセロールに関しては、下記式（１）および式（２）で示すような、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）とグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）またはグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）とを用いることによる定量方法が知られている。
【０００３】
【化１】
【０００４】
しかしながら、この方法は二種類の酵素を用いるため反応が煩雑であった。さらに、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用いた場合は溶存酸素の影響を受けるという問題点があり、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた場合は、高価なＮＡＤ+を添加する必要がある。溶存酸素の影響を受けず、一種類の酵素を用いる方法としては、下記式（３）で示すように、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いる方法が知られている。
【０００５】
【化２】
【０００６】
しかしながら、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼは、補酵素結合型酵素ではないため、高価なＮＡＤ+を添加しなければならない。より安価で簡便なグリセロールの定量法として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性グリセロールデヒドロゲナーゼが知られている。ＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いるグリセロールの定量方法は、下記式（４）の反応によって行われる。
【０００７】
【化３】
【０００８】
従来から、ＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼとして酢酸菌由来のものが報告されているが（非特許文献１）、該酵素は細胞膜結合型酵素であり、疎水性が高いために水溶媒系では不安定であり、また、熱安定性も低い。特許文献１において、可溶化および安定化に界面活性剤やグリセロールを必要としない、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＴＥ３４９３由来のＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼが報告されているが、５０℃、１０分間の熱処理で残存活性は４０％程度であり、熱安定性が十分であるとはいえない。熱安定性が低い酵素を用いた場合、溶液中に含まれる酵素が熱によって容易に失活するため、測定対象物質を正確に定量できなくなる可能性がある。
【０００９】
したがって、測定用試薬に使用される酵素は、熱安定性が高いことが求められる。例えば、特許文献２では、グルコノバクター属から得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して界面活性剤の存在下、２価性架橋試薬で化学修飾することによって、熱安定性に優れるポリオール脱水素酵素が提案されている。
【００１０】
また、測定用試薬が粉末状である場合には、凍結乾燥後の粉末酵素の保存安定性が優れていることが求められている。このような改良を目的として、酵素を２価性架橋試薬で化学修飾することにより、凍結乾燥後の粉末酵素の保存安定性を向上させる技術も開発されている（特許文献３）。
【特許文献１】特許第３０４１８４０号明細書
【特許文献２】特開２００６−２７１２５７号公報
【特許文献３】特開平１−３０９６８７号公報
【非特許文献１】Ａｍｅｙａｍａ ｅｔ． ａｌ．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９，１００１−１０１０（１９８５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
測定用試薬に不安定な酵素を用いると、反応液中および保存中に失活が起こり、結果として測定結果の精度に悪影響を与える。そのため、用いる酵素は特に、熱安定性に優れ、凍結乾燥した場合には、凍結乾燥の工程によっても失活せず、かつ、凍結乾燥後の粉末酵素の保存安定性が優れていることが要求される。
【００１２】
しかしながら、上記非特許文献１記載のグルコノバクター属由来のＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼおよび特許文献１記載のＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼは熱安定性が十分でない。また、該特許文献１記載のＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼは、特定の微生物から得られる酵素であり、入手が困難であるなどの問題がある。また、特許文献３で対象とする酵素は、水溶性の酵素を対象としたものであり、非特許文献１に記載される細胞膜結合型酵素、すなわち疎水性が高い酵素に対する効果は不明である。さらに、特許文献２では、溶液中では比較的安定であるが、凍結乾燥して得られた粉末酵素の場合の保存安定性は不明である。
【００１３】
このような状況のもと、本発明は、酵素の熱安定性に優れ、凍結乾燥の工程を経ても酵素が失活せず、凍結乾燥後の粉末酵素の保存安定性に優れる、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記問題点に鑑み鋭意研究した結果、酵素を２価性架橋試薬により架橋し、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方で反応を停止することにより、酵素の保存安定性を向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を２価性架橋試薬で架橋反応させる工程（１）と、ストレプトマイシンまたはジヒドロストレプトマイシンで架橋反応を停止して酵素溶液を得る工程（２）と、前記酵素溶液を凍結乾燥して粉末酵素を得る工程（３）と、を含む、ポリオール脱水素酵素の製造方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、安価かつ簡便にＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させることが可能である。また、保存安定性に優れたポリオール測定試薬を提供可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明の第一は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を２価性架橋試薬で架橋反応させる工程（１）と、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方で架橋反応を停止して酵素溶液を得る工程（２）と、前記酵素溶液を凍結乾燥して粉末酵素を得る工程（３）と、を含む、ポリオール脱水素酵素の製造方法である。
【００１８】
従来から、熱安定性を向上させることを目的として、架橋試薬で酵素を架橋させる方法が用いられてきた。該架橋反応を停止させる停止剤として、従来は、グリシン溶液（グリシン−ＮａＯＨ緩衝液）、トリス溶液（トリス−塩酸緩衝液）または、エタノールアミン溶液のようなアミノ基を有する停止剤が用いられてきた。本発明者らは、架橋反応を停止する停止剤について鋭意研究した結果、従来から一般的に使用されている停止剤よりも、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方で架橋反応を停止することにより、凍結乾燥後の粉末酵素の保存安定性が格段に向上することを見出した。また、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方で架橋反応を停止しても、反応停止剤としてトリス溶液等を用いた場合と同様、熱安定性が向上することも見出した。
【００１９】
工程（１）において、架橋試薬によって架橋される、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、従来公知の酵素をいずれも好ましく使用することができる。該酵素は、例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属、アシネトバクター属など様々な細菌が産生することが知られており、これらＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌が産生するいずれのＰＱＱ依存性ＰＤＨも好適に使用することができる。さらに、入手の容易さから、グルコノバクター属、特には、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３１３０、３１７１、３１７２、３１８９、３２４４、３２５０、３２５３、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８５、３２８７、３２８９、３２９０、３２９１、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、３９９０、１２４６７、１４８１９；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ） ＮＢＲＣ ３２５１、３２５４、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２７１、３２７２、３２７３、３２７４、３２８６、１６６６９；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ） ＮＢＲＣ ３２６２、３２６３、３２６６、３２６７、３２６９、３２７５、３２７６等を使用することができる。また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを産生することができれば、これらの自然突然変異株または、人為突然変異株を使用してもよい。人為突然変異処理方法は、当業者に周知の方法によって同様にしてあるいは適宜修飾して、あるいはこれらの方法を適宜組み合わせて適用することができる。このような微生物の代表菌株として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１がある。
【００２０】
架橋構造を導入するＰＱＱ依存性ＰＤＨを調製するには、具体的には、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌を栄養培地に培養し、該培養物からＰＱＱ依存性ＰＤＨを採取すればよい。ＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール、ソルビトール等が使用される。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産誘導物質として、ポリオールを培地に添加しておくことが望ましい。培地は通常、振とう培養、あるいは通気撹はん培養で行う。培養温度は２０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃、培養ｐＨは５〜１０の範囲で、好ましくは６〜９に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常１〜５日が好ましい。なお、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨは、上記培養によって得られた酵素でも、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であっても良い。
【００２１】
次いで、得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する。抽出法は一般に使用される抽出法を用いることができ、例えば、超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、リゾチーム法等が例示される。抽出したＰＱＱ依存性ＰＤＨの精製法は、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精製することができる。
【００２２】
本発明で使用する２価性架橋試薬は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに含まれるアミノ基などと反応して架橋構造を導入できるものであれば特に制限はなく、固定化酵素の分野で酵素の架橋試薬として使用できるジアルデヒド化合物、ジカルボン酸化合物、ジイソシアネート系化合物、イミデート化合物などを好適に使用することができる。ジアルデヒド化合物としては、グルタルアルデヒド、スクシンジアルデヒド、アジピンアルデヒド等があり、ジカルボン酸化合物としては、アジピン酸、ジメチルアジピン酸等があり、ジイソシアネート系化合物としてはヘキサメチレンジイソシアネート、トルエンジイソシアネートなどがあり、イミデート化合物としては、ジメチルスベルイミデート、ジメチルピメルイミデートなどがある。本発明では、上記２価性架橋試薬の中でも、反応性の点から、ジアルデヒド化合物が好ましく、グルタルアルデヒドがより好ましい。
【００２３】
本発明では、２価性架橋試薬による架橋を行うが、得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨは酵素同士を相互に架橋するものではなく、酵素の立体構造を強固にすることで熱安定性を向上させるものである。したがって、酵素同士の架橋を防止するため、一般には架橋反応溶液中、上記酵素濃度を０．１〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜３０ｍｇ／ｍｌとすることが好ましい。なお、架橋反応溶液とは、酵素および２価性架橋試薬を、緩衝液に溶解した溶液を指す。架橋反応溶液のｐＨは、好ましくは６．０〜１０、より好ましくは７．０〜９．５、特に好ましくは７．５〜９．０である。緩衝液としては、上記ｐＨ範囲となるような緩衝液を使用すればよく、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、及びＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳのようなＧＯＯＤ緩衝液を用いることができる。ただし、該緩衝液として、トリス−塩酸緩衝液やグリシン−ＮａＯＨ緩衝液のようにアミノ基を有する緩衝液は、使用することができない。
【００２４】
また、架橋反応溶液に対して、上記２価性架橋試薬を０．０５〜０．９ｇ／１００ｍＬ、好ましくは、０．１〜０．７ｇ／１００ｍＬ、特に好ましくは０．１〜０．５ｇ／１００ｍＬ添加して、架橋させることが好ましい。かような濃度で架橋試薬を添加すれば、反応に要する時間が適切で、また架橋後の酵素活性の回収率および熱処理における残存活性の結果の再現性が良好となる。
【００２５】
さらに、架橋反応溶液には、界面活性剤が含まれていることが好ましい。界面活性剤が存在することにより、２価性架橋試薬により酵素を凝集させることなく架橋でき、酵素の立体構造が安定に保持され、熱安定性が向上するとともに、２価性架橋試薬が溶媒中に均一に分散するため、酵素活性を低下させることなく架橋することが可能となる。このような界面活性剤としては、一般的に膜タンパク質の可溶化に用いられているものであれば特に限定されず、トライトンＸ−１００、オクチルグルコシド、コール酸ナトリウムなどがある。界面活性剤の濃度は、架橋反応溶液に対して、０．０１〜１０ｇ／１００ｍＬであることが好ましく、より好ましくは０．０２〜５ｇ／１００ｍＬ、特に好ましくは０．０５〜２ｇ／１００ｍＬである。０．０１ｇ／１００ｍＬ未満では、界面活性剤濃度が薄すぎるために、酵素の失活を招く可能性がある。
【００２６】
上記架橋反応溶液中または、下記停止反応中および停止反応後に、酵素の安定性を向上させることを目的として、２価の金属イオン、ＰＱＱ、または還元剤を加えてもよい。２価の金属イオンとしては、特に限定されるものではないが、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンが好ましい。２価の金属イオンの濃度は、酵素の失活および変性が起こらない程度であれば特に限定されないが、反応溶液に対して、終濃度で０．１〜１００ｍＭであることが好ましく、より好ましくは０．５〜５０ｍＭである。還元剤としては、特に限定されるものではないが、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールが挙げられる。還元剤の濃度は、酵素の失活および変性が起こらない程度であれば特に限定されないが、反応溶液に対して、終濃度で０．１〜２０ｍＭであることが好ましい。
【００２７】
架橋反応時の温度は、０〜３０℃が好ましく、より好ましくは４〜２５℃である。反応時間は、好ましくは１０〜１８０分、より好ましくは１０〜１２０分、特に好ましくは３０〜９０分、最も好ましくは６０〜９０分である。反応時間がかような範囲であれば、反応が適度に進行し、保存安定性の再現性が良好である。
【００２８】
本発明では、工程（２）において、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方によって、架橋反応を停止させる。ストレプトマイシンまたはジヒドロストレプトマイシンは１種単独で用いてもよいし、２種併用してもよい。
【００２９】
ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシンの濃度は架橋反応が停止される限り、特に限定されるものではないが、架橋反応溶液に対して、ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシンの合計で好ましくは終濃度で０．０１〜３Ｍ、より好ましくは０．０２〜２Ｍ、特に好ましくは０．０２〜１Ｍで、添加される。ストレプトマイシンまたはジヒドロストレプトマイシンの添加方法は、特に限定されるものではないが、水溶液の形態で添加されることが好ましい。以下、ストレプトマイシンまたはジヒドロストレプトマイシンを添加後の溶液を反応停止溶液とも称する。なお、逆反応を起こさせないため、上記架橋反応溶液中または、停止反応中および停止反応後に水素化シアノホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、水素化ホウ素ナトリウムのような還元剤を加えてもよい。このような還元剤を添加する場合の、還元剤の添加量は、逆反応を抑制・防止できる量であれば、特に制限されない。
【００３０】
反応停止溶液のｐＨは、好ましくは６〜１０．５、より好ましくは７〜１０．０、特に好ましくは７．５〜９．５である。かような範囲であれば、酵素の失活を招く虞が少ない。
【００３１】
停止反応温度は、好ましくは４〜５０℃、より好ましくは４〜４０℃、特に好ましくは４〜３０℃である。かような範囲であれば、停止反応が進行しやすく、また、酵素の失活が起こる可能性が低い。停止反応時間は、停止反応温度によるが、一般的には５〜１８０分である。５分未満では反応時間が短すぎるため、架橋反応が完全に停止しない場合があり、一方１８０分以上では、酵素の失活を招く場合がある。
【００３２】
停止反応終了後、過剰量のストレプトマイシンまたはジヒドロストレプトマイシン、未反応のグルタルアルデヒド、及び低分子量のものを取り除くため、透析、クロマトグラフィー、限外ろ過等を単独または組み合わせて行うことが望ましい。
【００３３】
上記操作後、酵素溶液を凍結し、凍結乾燥を行うことにより、粉末酵素を得ることができる。凍結乾燥は、通常公知の方法により行うことができる。
【００３４】
上記方法で得られた、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、熱安定性に優れ、凍結乾燥の工程によっても失活せず、かつ凍結乾燥後の粉末酵素の保存安定性に非常に優れたＰＱＱ依存性ＰＤＨである。
【００３５】
本発明の第一のポリオール脱水素酵素の基質は、２つ以上のヒドロキシ基（ＯＨ）を有するアルコール（糖アルコールを含む）であれば、特に制限されないが、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ラクチトールなどの二糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、リビトールなどのペンチトール、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。中でも好ましくは、グリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）、ソルビトール（ピロロキノリンキノン依存性ソルビトール脱水素酵素）、アラビトール（ピロロキノリンキノン依存性アラビトール脱水素酵素）、及びマンニトール（ピロロキノリンキノン依存性マンニトール脱水素酵素）を基質とし、より好ましくはグリセロールを基質とする。
【００３６】
本発明の第二は、上記方法によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを含むポリオール測定試薬である。本発明の第二のポリオール測定試薬は、本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを含み、ポリオールを測定するために使用する試薬である。ポリオール脱水素酵素として本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する点に特徴があり、例えば特許公報第３０４１８４０号、特許公報第３４５０９１１号、特許公報第３４９４３９８号などに記載されるポリオール測定で使用するポリオール脱水素酵素として本発明の第一の発明によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用することができる。
【００３７】
本発明の第二で測定するポリオールは、２つ以上のヒドロキシ基（ＯＨ）を有するアルコール（糖アルコールを含む）であれば、特に制限されないが、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ラクチトールなどの二糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、リビトールなどのペンチトール、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。中でも好ましくは、グリセロール、ソルビトール、アラビトール、及びマンニトールであり、より好ましくはグリセロールである。
【００３８】
本発明の第三は、本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨをポリオールと反応させることを特徴とする、ポリオールの定量方法である。
【００３９】
本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、下記式（１）のようにポリオールがグリセロールである場合、グリセロールと酸化型電子受容体とを、対応する脱水素物と還元型電子受容体とに変換することができる。
【００４０】
【化４】
【００４１】
式（１）において酸化型電子受容体の減少、還元型電子受容体の増加、ジヒドロキシアセトンの量を測定することによって簡便にグリセロールが定量できる。なお、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨはアポ化しないため、あえてＰＱＱを反応系に添加することなく、ポリオールを定量することができる。
【００４２】
本発明において好適に使用できる電子受容体としては、フェリシアン化カリウム、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、Ｗｕｒｓｔｅｒ’ｓ ｂｌｕｅ、ニトロテトラゾリウムブルー等がある。
【００４３】
本発明の定量法において、ポリオールを含む試料としては、食品、血清、血漿や全血等がある。また本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨは血清や血漿、全血等の中性脂肪測定にも使用することができる。すなわちこれらの試料に含まれる中性脂肪は、例えばリポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールに分解されるが、ここで生じたグリセロールを本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用して、定量することができる。中性脂肪測定時には精神病治療患者、透析患者では遊離グリセロールが問題になるが、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いてグリセロールを予め消去するか、もしくはその量を測定しておくことで真の中性脂肪値を求めることが可能である。なお、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨは溶液中に界面活性剤を含んでいてもポリオールを正確に定量することができる。
【実施例】
【００４４】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。なお、本発明において、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、下記方法により測定した。
【００４５】
（酵素活性）
ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、５０μＭ ＤＣＩＰ、０．２ｍＭ ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）、４５０ｍＭ グリセロールを含んだ０．１ｇ／１００ｍＬ トライトンＸ−１００を含む１０ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ ７．０中に、酵素溶液を加え、酵素と基質の反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ ７．０におけるミリモル吸光係数は１６．３ ｍＭ−１とした。
【００４６】
（実施例１）
ソルビトール ２ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス ０．３ｇ／１００ｍＬ、肉エキス ０．３ｇ／１００ｍＬ、コーンスティープリカー ０．３ｇ／１００ｍＬ、ポリペプトン １ｇ／１００ｍＬ、尿素 ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／１００ｍＬ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／１００ｍＬ、ｐＨ７．０からなる培地１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００４７】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。
【００４８】
次に上記と同じ組成で調製した培地５Ｌを８Ｌ容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で５０分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液２４０ｍＬを移した。これを、４００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎ、３０℃で２６時間培養した。
【００４９】
所定時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×g、１０分、４℃）して集菌し、緩衝液で懸濁後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×g、１０分、４℃）し、得られた上清を超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）して、膜画分を沈殿物として得た。
【００５０】
この膜画分を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し、終濃度が１ｇ／１００ｍＬとなるようにトライトンＸ−１００を加え、４℃で２時間撹拌した。超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）し、上清を０．１ｇ／１００ｍＬトライトンＸ−１００を含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析し、これを可溶化膜画分とした。
【００５１】
この可溶化膜画分をＦＰＬＣにてＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ｍＬで夾雑するグルコース脱水素酵素を除き、ポリオール脱水素酵素活性画分を得た。この画分を０．１ｇ／１００ｍＬトライトンＸ−１００、５ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析することにより、比活性１７Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素標品を得た。これをグルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨと称する。
【００５２】
ついで、該グルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨ（比活性１７．０Ｕ／ｍｇ 蛋白、蛋白濃度：０．６２５ｍｇ／ｍＬ）４０ｍＬに、終濃度０．２ｇ／１００ｍＬになるように１ｇ／１００ｍＬグルタルアルデヒド水溶液 １０ｍＬを加え（架橋反応溶液、ｐＨ７．５）、２０℃で６０分穏やかに撹拌した。
【００５３】
ついで０．５Ｍ ストレプトマイシン水溶液（ｐＨ８．０）を５０ｍＬ加え、２０℃で６０分反応させることにより架橋反応を停止した。反応停止終了後、上記溶液に対して０．１ｇ／１００ｍＬトライトンＸ−１００を含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）１０００倍量で一晩透析後、外液を捨て、再度上記緩衝液１０００倍量で一晩透析することにより、未反応のグルタルアルデヒド、過剰量のストレプトマイシン及び低分子量の夾雑物を取り除き、得られたＰＤＨを架橋ＳＭＰＤＨとした（サンプル１）。続いて、架橋ＳＭＰＤＨを−８０℃で凍結後、凍結乾燥機により凍結乾燥を行った（サンプル２）。
【００５４】
（実施例２）
ストレプトマイシンの代わりに０．５Ｍ ジヒドロストレプトマイシン水溶液（ｐＨ８．０）を加えて架橋反応を停止後（得られたＰＤＨを架橋ＤＳＭＰＤＨとした（サンプル３））、凍結乾燥を行った（サンプル４）こと以外は、実施例１と同様に行った。
【００５５】
（評価例１）
実施例１で得た修飾ＳＭＰＤＨ及び実施例２で得た修飾ＤＳＭＰＤＨの熱安定性を検討するため、サンプル１及び３を５０℃で、１０分間、ウォ−ターバスによりインキュベートした後、残存する酵素活性を測定した。同様に、ストレプトマイシンの代わりに０．５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて架橋反応を停止させた試料（サンプル５）および架橋処理していないグルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨの残存する酵素活性を測定した。結果を表１に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
酵素をグルタルアルデヒドで架橋後、ストレプトマイシンまたはジヒドロストレプトマイシンで架橋反応を停止させたものは、トリスで架橋反応を停止させたものと同程度の熱安定性を有していた。
【００５８】
（評価例２）
実施例１および２で得た修飾ＰＤＨの保存安定性を検討するため、５０℃で、１時間保存し、残存する酵素活性を測定した。結果を表２に示す。また、比較としてストレプトマイシンの代わりに０．５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて架橋反応を停止後、凍結乾燥させた試料（サンプル６）を用いて同様に残存する酵素活性を測定した結果を併せて表２に示す。さらに、架橋処理していないグルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨを用いて同様に残存する酵素活性を測定した結果（未架橋ＰＤＨ）を併せて表２に示す。
【００５９】
【表２】
【００６０】
酵素をグルタルアルデヒドで架橋後、ストレプトマイシン及びジヒドロストレプトマイシンで架橋反応を停止させることにより、粉末酵素の保存安定性が格段に向上したことが分かる。
【００６１】
（評価例３）
５０μＭ ＤＣＩＰ、０．２ｍＭ ＰＭＳ、実施例１の酵素溶液（０．３Ｕ）を含んだ０．１ｇ／１００ｍＬトライトンＸ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０中に、終濃度が１００、２００、３００、４００、５００μＭになるようにグリセロールを加え、ＤＣＩＰの６００ｎｍにおける吸光度の減少を測定した。結果を図１に示す。１００〜５００μＭグリセロールまで直線性がよく、定量可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】評価例３の結果であり、本発明の修飾ＰＤＨを使用して、ポリオールの検量線が作成できることを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（以下、ＰＱＱ依存性ＰＤＨとも称する。）の製造方法、該ＰＱＱ依存性ＰＤＨを含むポリオール測定試薬、および該ＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いたポリオールの定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、例えば、グリセロールに関しては、下記式（１）および式（２）で示すような、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）とグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）またはグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）とを用いることによる定量方法が知られている。
【０００３】
【化１】
【０００４】
しかしながら、この方法は二種類の酵素を用いるため反応が煩雑であった。さらに、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用いた場合は溶存酸素の影響を受けるという問題点があり、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた場合は、高価なＮＡＤ+を添加する必要がある。溶存酸素の影響を受けず、一種類の酵素を用いる方法としては、下記式（３）で示すように、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いる方法が知られている。
【０００５】
【化２】
【０００６】
しかしながら、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼは、補酵素結合型酵素ではないため、高価なＮＡＤ+を添加しなければならない。より安価で簡便なグリセロールの定量法として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性グリセロールデヒドロゲナーゼが知られている。ＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いるグリセロールの定量方法は、下記式（４）の反応によって行われる。
【０００７】
【化３】
【０００８】
従来から、ＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼとして酢酸菌由来のものが報告されているが（非特許文献１）、該酵素は細胞膜結合型酵素であり、疎水性が高いために水溶媒系では不安定であり、また、熱安定性も低い。特許文献１において、可溶化および安定化に界面活性剤やグリセロールを必要としない、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＴＥ３４９３由来のＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼが報告されているが、５０℃、１０分間の熱処理で残存活性は４０％程度であり、熱安定性が十分であるとはいえない。熱安定性が低い酵素を用いた場合、溶液中に含まれる酵素が熱によって容易に失活するため、測定対象物質を正確に定量できなくなる可能性がある。
【０００９】
したがって、測定用試薬に使用される酵素は、熱安定性が高いことが求められる。例えば、特許文献２では、グルコノバクター属から得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して界面活性剤の存在下、２価性架橋試薬で化学修飾することによって、熱安定性に優れるポリオール脱水素酵素が提案されている。
【００１０】
また、測定用試薬が粉末状である場合には、凍結乾燥後の粉末酵素の保存安定性が優れていることが求められている。このような改良を目的として、酵素を２価性架橋試薬で化学修飾することにより、凍結乾燥後の粉末酵素の保存安定性を向上させる技術も開発されている（特許文献３）。
【特許文献１】特許第３０４１８４０号明細書
【特許文献２】特開２００６−２７１２５７号公報
【特許文献３】特開平１−３０９６８７号公報
【非特許文献１】Ａｍｅｙａｍａ ｅｔ． ａｌ．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９，１００１−１０１０（１９８５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
測定用試薬に不安定な酵素を用いると、反応液中および保存中に失活が起こり、結果として測定結果の精度に悪影響を与える。そのため、用いる酵素は特に、熱安定性に優れ、凍結乾燥した場合には、凍結乾燥の工程によっても失活せず、かつ、凍結乾燥後の粉末酵素の保存安定性が優れていることが要求される。
【００１２】
しかしながら、上記非特許文献１記載のグルコノバクター属由来のＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼおよび特許文献１記載のＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼは熱安定性が十分でない。また、該特許文献１記載のＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼは、特定の微生物から得られる酵素であり、入手が困難であるなどの問題がある。また、特許文献３で対象とする酵素は、水溶性の酵素を対象としたものであり、非特許文献１に記載される細胞膜結合型酵素、すなわち疎水性が高い酵素に対する効果は不明である。さらに、特許文献２では、溶液中では比較的安定であるが、凍結乾燥して得られた粉末酵素の場合の保存安定性は不明である。
【００１３】
このような状況のもと、本発明は、酵素の熱安定性に優れ、凍結乾燥の工程を経ても酵素が失活せず、凍結乾燥後の粉末酵素の保存安定性に優れる、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記問題点に鑑み鋭意研究した結果、酵素を２価性架橋試薬により架橋し、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方で反応を停止することにより、酵素の保存安定性を向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を２価性架橋試薬で架橋反応させる工程（１）と、ストレプトマイシンまたはジヒドロストレプトマイシンで架橋反応を停止して酵素溶液を得る工程（２）と、前記酵素溶液を凍結乾燥して粉末酵素を得る工程（３）と、を含む、ポリオール脱水素酵素の製造方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、安価かつ簡便にＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させることが可能である。また、保存安定性に優れたポリオール測定試薬を提供可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明の第一は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を２価性架橋試薬で架橋反応させる工程（１）と、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方で架橋反応を停止して酵素溶液を得る工程（２）と、前記酵素溶液を凍結乾燥して粉末酵素を得る工程（３）と、を含む、ポリオール脱水素酵素の製造方法である。
【００１８】
従来から、熱安定性を向上させることを目的として、架橋試薬で酵素を架橋させる方法が用いられてきた。該架橋反応を停止させる停止剤として、従来は、グリシン溶液（グリシン−ＮａＯＨ緩衝液）、トリス溶液（トリス−塩酸緩衝液）または、エタノールアミン溶液のようなアミノ基を有する停止剤が用いられてきた。本発明者らは、架橋反応を停止する停止剤について鋭意研究した結果、従来から一般的に使用されている停止剤よりも、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方で架橋反応を停止することにより、凍結乾燥後の粉末酵素の保存安定性が格段に向上することを見出した。また、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方で架橋反応を停止しても、反応停止剤としてトリス溶液等を用いた場合と同様、熱安定性が向上することも見出した。
【００１９】
工程（１）において、架橋試薬によって架橋される、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、従来公知の酵素をいずれも好ましく使用することができる。該酵素は、例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属、アシネトバクター属など様々な細菌が産生することが知られており、これらＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌が産生するいずれのＰＱＱ依存性ＰＤＨも好適に使用することができる。さらに、入手の容易さから、グルコノバクター属、特には、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３１３０、３１７１、３１７２、３１８９、３２４４、３２５０、３２５３、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８５、３２８７、３２８９、３２９０、３２９１、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、３９９０、１２４６７、１４８１９；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ） ＮＢＲＣ ３２５１、３２５４、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２７１、３２７２、３２７３、３２７４、３２８６、１６６６９；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ） ＮＢＲＣ ３２６２、３２６３、３２６６、３２６７、３２６９、３２７５、３２７６等を使用することができる。また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを産生することができれば、これらの自然突然変異株または、人為突然変異株を使用してもよい。人為突然変異処理方法は、当業者に周知の方法によって同様にしてあるいは適宜修飾して、あるいはこれらの方法を適宜組み合わせて適用することができる。このような微生物の代表菌株として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１がある。
【００２０】
架橋構造を導入するＰＱＱ依存性ＰＤＨを調製するには、具体的には、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌を栄養培地に培養し、該培養物からＰＱＱ依存性ＰＤＨを採取すればよい。ＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール、ソルビトール等が使用される。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産誘導物質として、ポリオールを培地に添加しておくことが望ましい。培地は通常、振とう培養、あるいは通気撹はん培養で行う。培養温度は２０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃、培養ｐＨは５〜１０の範囲で、好ましくは６〜９に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常１〜５日が好ましい。なお、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨは、上記培養によって得られた酵素でも、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であっても良い。
【００２１】
次いで、得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する。抽出法は一般に使用される抽出法を用いることができ、例えば、超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、リゾチーム法等が例示される。抽出したＰＱＱ依存性ＰＤＨの精製法は、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精製することができる。
【００２２】
本発明で使用する２価性架橋試薬は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに含まれるアミノ基などと反応して架橋構造を導入できるものであれば特に制限はなく、固定化酵素の分野で酵素の架橋試薬として使用できるジアルデヒド化合物、ジカルボン酸化合物、ジイソシアネート系化合物、イミデート化合物などを好適に使用することができる。ジアルデヒド化合物としては、グルタルアルデヒド、スクシンジアルデヒド、アジピンアルデヒド等があり、ジカルボン酸化合物としては、アジピン酸、ジメチルアジピン酸等があり、ジイソシアネート系化合物としてはヘキサメチレンジイソシアネート、トルエンジイソシアネートなどがあり、イミデート化合物としては、ジメチルスベルイミデート、ジメチルピメルイミデートなどがある。本発明では、上記２価性架橋試薬の中でも、反応性の点から、ジアルデヒド化合物が好ましく、グルタルアルデヒドがより好ましい。
【００２３】
本発明では、２価性架橋試薬による架橋を行うが、得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨは酵素同士を相互に架橋するものではなく、酵素の立体構造を強固にすることで熱安定性を向上させるものである。したがって、酵素同士の架橋を防止するため、一般には架橋反応溶液中、上記酵素濃度を０．１〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜３０ｍｇ／ｍｌとすることが好ましい。なお、架橋反応溶液とは、酵素および２価性架橋試薬を、緩衝液に溶解した溶液を指す。架橋反応溶液のｐＨは、好ましくは６．０〜１０、より好ましくは７．０〜９．５、特に好ましくは７．５〜９．０である。緩衝液としては、上記ｐＨ範囲となるような緩衝液を使用すればよく、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、及びＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳのようなＧＯＯＤ緩衝液を用いることができる。ただし、該緩衝液として、トリス−塩酸緩衝液やグリシン−ＮａＯＨ緩衝液のようにアミノ基を有する緩衝液は、使用することができない。
【００２４】
また、架橋反応溶液に対して、上記２価性架橋試薬を０．０５〜０．９ｇ／１００ｍＬ、好ましくは、０．１〜０．７ｇ／１００ｍＬ、特に好ましくは０．１〜０．５ｇ／１００ｍＬ添加して、架橋させることが好ましい。かような濃度で架橋試薬を添加すれば、反応に要する時間が適切で、また架橋後の酵素活性の回収率および熱処理における残存活性の結果の再現性が良好となる。
【００２５】
さらに、架橋反応溶液には、界面活性剤が含まれていることが好ましい。界面活性剤が存在することにより、２価性架橋試薬により酵素を凝集させることなく架橋でき、酵素の立体構造が安定に保持され、熱安定性が向上するとともに、２価性架橋試薬が溶媒中に均一に分散するため、酵素活性を低下させることなく架橋することが可能となる。このような界面活性剤としては、一般的に膜タンパク質の可溶化に用いられているものであれば特に限定されず、トライトンＸ−１００、オクチルグルコシド、コール酸ナトリウムなどがある。界面活性剤の濃度は、架橋反応溶液に対して、０．０１〜１０ｇ／１００ｍＬであることが好ましく、より好ましくは０．０２〜５ｇ／１００ｍＬ、特に好ましくは０．０５〜２ｇ／１００ｍＬである。０．０１ｇ／１００ｍＬ未満では、界面活性剤濃度が薄すぎるために、酵素の失活を招く可能性がある。
【００２６】
上記架橋反応溶液中または、下記停止反応中および停止反応後に、酵素の安定性を向上させることを目的として、２価の金属イオン、ＰＱＱ、または還元剤を加えてもよい。２価の金属イオンとしては、特に限定されるものではないが、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンが好ましい。２価の金属イオンの濃度は、酵素の失活および変性が起こらない程度であれば特に限定されないが、反応溶液に対して、終濃度で０．１〜１００ｍＭであることが好ましく、より好ましくは０．５〜５０ｍＭである。還元剤としては、特に限定されるものではないが、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールが挙げられる。還元剤の濃度は、酵素の失活および変性が起こらない程度であれば特に限定されないが、反応溶液に対して、終濃度で０．１〜２０ｍＭであることが好ましい。
【００２７】
架橋反応時の温度は、０〜３０℃が好ましく、より好ましくは４〜２５℃である。反応時間は、好ましくは１０〜１８０分、より好ましくは１０〜１２０分、特に好ましくは３０〜９０分、最も好ましくは６０〜９０分である。反応時間がかような範囲であれば、反応が適度に進行し、保存安定性の再現性が良好である。
【００２８】
本発明では、工程（２）において、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方によって、架橋反応を停止させる。ストレプトマイシンまたはジヒドロストレプトマイシンは１種単独で用いてもよいし、２種併用してもよい。
【００２９】
ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシンの濃度は架橋反応が停止される限り、特に限定されるものではないが、架橋反応溶液に対して、ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシンの合計で好ましくは終濃度で０．０１〜３Ｍ、より好ましくは０．０２〜２Ｍ、特に好ましくは０．０２〜１Ｍで、添加される。ストレプトマイシンまたはジヒドロストレプトマイシンの添加方法は、特に限定されるものではないが、水溶液の形態で添加されることが好ましい。以下、ストレプトマイシンまたはジヒドロストレプトマイシンを添加後の溶液を反応停止溶液とも称する。なお、逆反応を起こさせないため、上記架橋反応溶液中または、停止反応中および停止反応後に水素化シアノホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、水素化ホウ素ナトリウムのような還元剤を加えてもよい。このような還元剤を添加する場合の、還元剤の添加量は、逆反応を抑制・防止できる量であれば、特に制限されない。
【００３０】
反応停止溶液のｐＨは、好ましくは６〜１０．５、より好ましくは７〜１０．０、特に好ましくは７．５〜９．５である。かような範囲であれば、酵素の失活を招く虞が少ない。
【００３１】
停止反応温度は、好ましくは４〜５０℃、より好ましくは４〜４０℃、特に好ましくは４〜３０℃である。かような範囲であれば、停止反応が進行しやすく、また、酵素の失活が起こる可能性が低い。停止反応時間は、停止反応温度によるが、一般的には５〜１８０分である。５分未満では反応時間が短すぎるため、架橋反応が完全に停止しない場合があり、一方１８０分以上では、酵素の失活を招く場合がある。
【００３２】
停止反応終了後、過剰量のストレプトマイシンまたはジヒドロストレプトマイシン、未反応のグルタルアルデヒド、及び低分子量のものを取り除くため、透析、クロマトグラフィー、限外ろ過等を単独または組み合わせて行うことが望ましい。
【００３３】
上記操作後、酵素溶液を凍結し、凍結乾燥を行うことにより、粉末酵素を得ることができる。凍結乾燥は、通常公知の方法により行うことができる。
【００３４】
上記方法で得られた、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、熱安定性に優れ、凍結乾燥の工程によっても失活せず、かつ凍結乾燥後の粉末酵素の保存安定性に非常に優れたＰＱＱ依存性ＰＤＨである。
【００３５】
本発明の第一のポリオール脱水素酵素の基質は、２つ以上のヒドロキシ基（ＯＨ）を有するアルコール（糖アルコールを含む）であれば、特に制限されないが、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ラクチトールなどの二糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、リビトールなどのペンチトール、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。中でも好ましくは、グリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）、ソルビトール（ピロロキノリンキノン依存性ソルビトール脱水素酵素）、アラビトール（ピロロキノリンキノン依存性アラビトール脱水素酵素）、及びマンニトール（ピロロキノリンキノン依存性マンニトール脱水素酵素）を基質とし、より好ましくはグリセロールを基質とする。
【００３６】
本発明の第二は、上記方法によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを含むポリオール測定試薬である。本発明の第二のポリオール測定試薬は、本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを含み、ポリオールを測定するために使用する試薬である。ポリオール脱水素酵素として本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する点に特徴があり、例えば特許公報第３０４１８４０号、特許公報第３４５０９１１号、特許公報第３４９４３９８号などに記載されるポリオール測定で使用するポリオール脱水素酵素として本発明の第一の発明によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用することができる。
【００３７】
本発明の第二で測定するポリオールは、２つ以上のヒドロキシ基（ＯＨ）を有するアルコール（糖アルコールを含む）であれば、特に制限されないが、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ラクチトールなどの二糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、リビトールなどのペンチトール、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。中でも好ましくは、グリセロール、ソルビトール、アラビトール、及びマンニトールであり、より好ましくはグリセロールである。
【００３８】
本発明の第三は、本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨをポリオールと反応させることを特徴とする、ポリオールの定量方法である。
【００３９】
本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、下記式（１）のようにポリオールがグリセロールである場合、グリセロールと酸化型電子受容体とを、対応する脱水素物と還元型電子受容体とに変換することができる。
【００４０】
【化４】
【００４１】
式（１）において酸化型電子受容体の減少、還元型電子受容体の増加、ジヒドロキシアセトンの量を測定することによって簡便にグリセロールが定量できる。なお、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨはアポ化しないため、あえてＰＱＱを反応系に添加することなく、ポリオールを定量することができる。
【００４２】
本発明において好適に使用できる電子受容体としては、フェリシアン化カリウム、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、Ｗｕｒｓｔｅｒ’ｓ ｂｌｕｅ、ニトロテトラゾリウムブルー等がある。
【００４３】
本発明の定量法において、ポリオールを含む試料としては、食品、血清、血漿や全血等がある。また本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨは血清や血漿、全血等の中性脂肪測定にも使用することができる。すなわちこれらの試料に含まれる中性脂肪は、例えばリポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールに分解されるが、ここで生じたグリセロールを本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用して、定量することができる。中性脂肪測定時には精神病治療患者、透析患者では遊離グリセロールが問題になるが、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いてグリセロールを予め消去するか、もしくはその量を測定しておくことで真の中性脂肪値を求めることが可能である。なお、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨは溶液中に界面活性剤を含んでいてもポリオールを正確に定量することができる。
【実施例】
【００４４】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。なお、本発明において、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、下記方法により測定した。
【００４５】
（酵素活性）
ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、５０μＭ ＤＣＩＰ、０．２ｍＭ ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）、４５０ｍＭ グリセロールを含んだ０．１ｇ／１００ｍＬ トライトンＸ−１００を含む１０ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ ７．０中に、酵素溶液を加え、酵素と基質の反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ ７．０におけるミリモル吸光係数は１６．３ ｍＭ−１とした。
【００４６】
（実施例１）
ソルビトール ２ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス ０．３ｇ／１００ｍＬ、肉エキス ０．３ｇ／１００ｍＬ、コーンスティープリカー ０．３ｇ／１００ｍＬ、ポリペプトン １ｇ／１００ｍＬ、尿素 ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／１００ｍＬ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／１００ｍＬ、ｐＨ７．０からなる培地１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００４７】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。
【００４８】
次に上記と同じ組成で調製した培地５Ｌを８Ｌ容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で５０分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液２４０ｍＬを移した。これを、４００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎ、３０℃で２６時間培養した。
【００４９】
所定時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×g、１０分、４℃）して集菌し、緩衝液で懸濁後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×g、１０分、４℃）し、得られた上清を超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）して、膜画分を沈殿物として得た。
【００５０】
この膜画分を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し、終濃度が１ｇ／１００ｍＬとなるようにトライトンＸ−１００を加え、４℃で２時間撹拌した。超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）し、上清を０．１ｇ／１００ｍＬトライトンＸ−１００を含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析し、これを可溶化膜画分とした。
【００５１】
この可溶化膜画分をＦＰＬＣにてＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ｍＬで夾雑するグルコース脱水素酵素を除き、ポリオール脱水素酵素活性画分を得た。この画分を０．１ｇ／１００ｍＬトライトンＸ−１００、５ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析することにより、比活性１７Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素標品を得た。これをグルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨと称する。
【００５２】
ついで、該グルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨ（比活性１７．０Ｕ／ｍｇ 蛋白、蛋白濃度：０．６２５ｍｇ／ｍＬ）４０ｍＬに、終濃度０．２ｇ／１００ｍＬになるように１ｇ／１００ｍＬグルタルアルデヒド水溶液 １０ｍＬを加え（架橋反応溶液、ｐＨ７．５）、２０℃で６０分穏やかに撹拌した。
【００５３】
ついで０．５Ｍ ストレプトマイシン水溶液（ｐＨ８．０）を５０ｍＬ加え、２０℃で６０分反応させることにより架橋反応を停止した。反応停止終了後、上記溶液に対して０．１ｇ／１００ｍＬトライトンＸ−１００を含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）１０００倍量で一晩透析後、外液を捨て、再度上記緩衝液１０００倍量で一晩透析することにより、未反応のグルタルアルデヒド、過剰量のストレプトマイシン及び低分子量の夾雑物を取り除き、得られたＰＤＨを架橋ＳＭＰＤＨとした（サンプル１）。続いて、架橋ＳＭＰＤＨを−８０℃で凍結後、凍結乾燥機により凍結乾燥を行った（サンプル２）。
【００５４】
（実施例２）
ストレプトマイシンの代わりに０．５Ｍ ジヒドロストレプトマイシン水溶液（ｐＨ８．０）を加えて架橋反応を停止後（得られたＰＤＨを架橋ＤＳＭＰＤＨとした（サンプル３））、凍結乾燥を行った（サンプル４）こと以外は、実施例１と同様に行った。
【００５５】
（評価例１）
実施例１で得た修飾ＳＭＰＤＨ及び実施例２で得た修飾ＤＳＭＰＤＨの熱安定性を検討するため、サンプル１及び３を５０℃で、１０分間、ウォ−ターバスによりインキュベートした後、残存する酵素活性を測定した。同様に、ストレプトマイシンの代わりに０．５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて架橋反応を停止させた試料（サンプル５）および架橋処理していないグルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨの残存する酵素活性を測定した。結果を表１に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
酵素をグルタルアルデヒドで架橋後、ストレプトマイシンまたはジヒドロストレプトマイシンで架橋反応を停止させたものは、トリスで架橋反応を停止させたものと同程度の熱安定性を有していた。
【００５８】
（評価例２）
実施例１および２で得た修飾ＰＤＨの保存安定性を検討するため、５０℃で、１時間保存し、残存する酵素活性を測定した。結果を表２に示す。また、比較としてストレプトマイシンの代わりに０．５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて架橋反応を停止後、凍結乾燥させた試料（サンプル６）を用いて同様に残存する酵素活性を測定した結果を併せて表２に示す。さらに、架橋処理していないグルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨを用いて同様に残存する酵素活性を測定した結果（未架橋ＰＤＨ）を併せて表２に示す。
【００５９】
【表２】
【００６０】
酵素をグルタルアルデヒドで架橋後、ストレプトマイシン及びジヒドロストレプトマイシンで架橋反応を停止させることにより、粉末酵素の保存安定性が格段に向上したことが分かる。
【００６１】
（評価例３）
５０μＭ ＤＣＩＰ、０．２ｍＭ ＰＭＳ、実施例１の酵素溶液（０．３Ｕ）を含んだ０．１ｇ／１００ｍＬトライトンＸ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０中に、終濃度が１００、２００、３００、４００、５００μＭになるようにグリセロールを加え、ＤＣＩＰの６００ｎｍにおける吸光度の減少を測定した。結果を図１に示す。１００〜５００μＭグリセロールまで直線性がよく、定量可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】評価例３の結果であり、本発明の修飾ＰＤＨを使用して、ポリオールの検量線が作成できることを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を２価性架橋試薬で架橋反応させる工程（１）と、
ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方で架橋反応を停止して酵素溶液を得る工程（２）と、
前記酵素溶液を凍結乾燥して粉末酵素を得る工程（３）と、
を含む、ポリオール脱水素酵素の製造方法。
【請求項２】
前記２価性架橋試薬がグルタルアルデヒドである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ポリオール脱水素酵素は、グリセロールを基質とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記工程（１）は、界面活性剤の存在下で架橋反応を行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で製造されたポリオール脱水素酵素。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で製造されたポリオール脱水素酵素を含む、ポリオール測定試薬。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で製造されたポリオール脱水素酵素を、ポリオールと反応させる、ポリオールの定量方法。
【請求項１】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を２価性架橋試薬で架橋反応させる工程（１）と、
ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方で架橋反応を停止して酵素溶液を得る工程（２）と、
前記酵素溶液を凍結乾燥して粉末酵素を得る工程（３）と、
を含む、ポリオール脱水素酵素の製造方法。
【請求項２】
前記２価性架橋試薬がグルタルアルデヒドである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ポリオール脱水素酵素は、グリセロールを基質とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記工程（１）は、界面活性剤の存在下で架橋反応を行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で製造されたポリオール脱水素酵素。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で製造されたポリオール脱水素酵素を含む、ポリオール測定試薬。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で製造されたポリオール脱水素酵素を、ポリオールと反応させる、ポリオールの定量方法。
【図１】
【公開番号】特開２００８−２４５５５９（Ｐ２００８−２４５５５９Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−９００１３（Ｐ２００７−９００１３）
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【Ｆターム（参考）】
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