ポリクローナル抗体およびその利用
【課題】フコイダンと特異的に反応する抗体を作製すると共に、これを利用してオキナワモズクフコイダンを正確に測定することのできる測定系や免疫染色系を提供する。
【解決手段】オキナワモズクフコイダンと特異的に反応することを特徴とするポリクローナル抗体およびこの抗体を利用したオキナワモズクフコイダンの測定方法、測定キット、免疫染色方法。
【解決手段】オキナワモズクフコイダンと特異的に反応することを特徴とするポリクローナル抗体およびこの抗体を利用したオキナワモズクフコイダンの測定方法、測定キット、免疫染色方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オキナワモズクフコイダンに特異的に反応するポリクローナル抗体およびこの抗体を利用したオキナワモズクフコイダンの測定方法、免疫染色方法、測定キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
フコイダンは褐藻類に特有の多糖で、硫酸化されたフコースを構成糖に有するものであるが、褐藻類の種類によってその構造は異なることが知られている。例えば、フコイダンの中でもオキナワモズクフコイダンは下記式で示すようにα１,３結合したフコースを主鎖として、フコース６分子にグルクロン酸が１分子結合したものであり、また、フコースの半分は硫酸化されているものである。
【化１】
【０００３】
そしてこのオキナワモズクフコイダンには抗潰瘍作用、抗炎症作用、整腸作用、抗腫瘍作用、コレステロール低下作用等が報告されている（非特許文献１〜４）。
【０００４】
しかしながら、このオキナワモズクフコイダンに限らず、その他のフコイダンについても血中、組織中の濃度測定系が殆ど確立しておらず、摂取されたフコイダンがどのようにして上記作用を奏しているのかは全く不明であった。
【０００５】
一応、これまでに、ガゴメコンブ由来のフコイダンを抗原として得られたモノクローナル抗体を利用したもの、マコンブ由来のフコイダンを抗原として得られたモノクローナル抗体を利用したもの、ワカメ由来のフコダイダンを抗原として得られたモノクローナル抗体を利用したもの等も報告されているが（特許文献１、非特許文献５〜６）、これらの抗体はオキナワモズクフコイダンに特異的に反応するものではないため、これらの抗体を利用してオキナワモズクフコイダンを正確に測定することはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ００／０７７０４９国際公開パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Matsumoto S, et al. Fucoidan derived from Cladosiphon okamuranus Tokita ameriorates murine chronic colitis through the down-regulation of interleukin-6 production on colonic epithelial cells. Clin Exp Immunol 2004,136; 432-439.
【非特許文献２】Shibata H, et al. Properties of fucoidan from Cladosiphon okamuranus tokita in gastric mucosal protection. BioFactors 2000, 11; 235-245.
【非特許文献３】曽根俊郎 他、オキナワモズクの抗炎症作用 ＦＲＡＧＲＡＮＣＥ Ｊｏｕｒｎａｌ１２月号、２００１年、８７1−８９２
【非特許文献４】Nagamine T, et al.Inhibitory effect of fucoidan on Huh7 hepatoma cells through downregulation of CXCL12. Nutr Cancer 2009, 61; 340-347.
【非特許文献５】Mizuno M et al. Quantification and localization of fucoidan in Laminaria Japonica Using a novel antibody. Biosci Biotechnol Biochem 2009, 73; 335-338.
【非特許文献６】Irhimeh MR, et al. A quantitative method to detect fucoidan in human血漿 using a novel antibody. Methods Find Exp Clin Pharmacol 2005, 27;705-710.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の課題はフコイダンと特異的に反応する抗体を作製すると共に、これを利用してオキナワモズクフコイダンを正確に測定することのできる測定系や免疫染色系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、オキナワモズクフコイダンに特定の生体高分子を結合させた結合物を抗原として動物に免疫して得られる抗血清を特定の方法で精製することによりオキナワモズクフコイダンに特異的に反応する抗体を作製できることを見出した。また、この抗体を利用することでオキナワモズクフコイダンの濃度の測定や免疫染色を行えることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち本発明は、オキナワモズクフコイダンと特異的に反応することを特徴とするポリクローナル抗体である。
【００１１】
また、本発明はオキナワモズクフコイダンに、オブアルブミン、スカシ貝ヘモシアニンおよびウシ血清アルブミンから選ばれる生体高分子の一つを結合させ、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から得られる抗血清を、更にオキナワモズクフコイダンを用いたアフィニティー精製をすることを特徴とする上記ポリクローナル抗体の製造方法である。
【００１２】
更に、本発明は検体に、上記ポリクローナル抗体を作用させ、検体中のオキナワモズクフコイダンを測定することを特徴とするオキナワモズクフコイダンの測定方法である。
【００１３】
また更に、本発明は上記ポリクローナル抗体を含有することを特徴とするオキナワモズクフコイダンの測定キットである。
【００１４】
更にまた、本発明は検体に、上記ポリクローナル抗体を作用させた後、染色試薬により、検体中のオキナワモズクフコイダンを染色することを特徴とするオキナワモズクフコイダンの免疫染色方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のポリクローナル抗体は、オキナワモズクフコイダンと特異的に反応するものである。そのため、この抗体を利用してオキナワモズクフコイダンの測定系を構築すると、血清、尿、細胞、組織等の検体中のオキナワモズクフコイダンをｎｇのオーダーで測定することができる。また、この抗体は細胞や肝臓、腸管等の組織中のオキナワモズクフコイダンの染色にも利用することができる。
【００１６】
従って、本発明のポリクローナル抗体を利用すれば、血中や組織中のオキナワモズクフコイダン代謝を解明することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】免疫スケジュールを示す図である。
【図２】本発明のポリクローナル抗体による免疫染色の結果を示す図である。
【図３】本発明のポリクローナル抗体を利用したサンドイッチ法によるオキナワモズクフコイダンおよび多糖類の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のポリクローナル抗体（以下、「本発明抗体」という）は、オキナワモズクフコイダンと特異的に反応するものである。ここで特異的とは、ポリクローナル抗体がオキナワモズクフコイダンと抗原・抗体反応で反応し、オキナワモズクフコイダン以外の多糖類とは実質的に交差反応しないことをいい、また、オキナワモズクフコイダン以外の多糖類とは実質的に交差反応しないとは、後記する本発明抗体を用いたサンドイッチ法（本発明抗体を一次抗体および二次抗体の両方に使用）にて、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸Ｃ、デキストラン硫酸、ラミナリン、アルギン酸等の多糖類を測定した場合に、１００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定されないことをいう。
【００１９】
上記本発明抗体は、例えば、オキナワモズクフコイダンに生体高分子を結合させ、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から得られる抗血清を、更にオキナワモズクフコイダンを用いたアフィニティー精製をすることにより得られる。
【００２０】
上記においてオキナワモズクフコイダンと結合される生体高分子としては、特に限定されないが、例えば、オブアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）から選ばれるものが挙げられる。これらの生体高分子の中でも得られる抗体の感度が高いためＫＬＨが好ましい。また、これら生体高分子とオキナワモズクフコイダンとの結合は、特に制限されず種々の方法で行うことができ、例えば、ＫＬＨとオキナワモズクフコイダンとの結合であれば、１−メチル３−（３ジメチルラミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いてグルクロン酸のカルボキシル基を活性化した後、ＫＬＨ中のリジン残基とをカップリングさせる方法等で行うことができる。具体的に、ＫＬＨとオキナワモズクフコイダンとの結合物は、１〜４０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２〜３０ｍｇ／ｍｌのオキナワモズクフコイダン水溶液０.２５〜５ｍｌ、好ましくは１.２５〜２.２５ｍｌ／ｍｌに、０.５〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２.５〜７.５ｍｇ／ｍｌのＫＬＨを０.１〜２ｍｌ、好ましくは０.５〜１.５ｍｌを混和したのちに、これを撹拌しながら０.５〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２.５〜７.５ｍｇ／ｍｌのＥＤＣを０.１〜２ｍｌ、好ましくは０.５〜１.５ｍｌをゆっくり滴下して混ぜ、４℃で５〜９６時間、好ましくは２４〜３６時間撹拌することにより得られる。
【００２１】
上記結合物を用いた動物の免疫は、例えば、マウス、ラット、ウサギ等のほ乳動物に、結合物と、フロイント完全アジュバンド、フロイント非完全アジュバント等のアジュバンドとを併用し、これを皮内、腹腔等に注射等で投与することにより行われる。免疫のスケジュールは、例えば、結合物を１〜４週間毎、好ましくは１〜３週間毎に、計１〜１０回、好ましくは３〜７回動物に摂種する。摂種量は初回が０.０１〜０.３０ｍｇ、好ましくは０.７５〜２.２５ｍｇ、その後は０.０３〜０.６０ｍｇ、好ましくは０.１５〜０.４５ｍｇである。最終の免疫をしてから１〜１０週間後、好ましくは２〜６週間後に全採血することにより抗血清が得られる。
【００２２】
上記抗血清のオキナワモズクフコイダンを用いたアフィニティー精製は、特に制限されず種々の方法で行うことができ、例えば、オキナワモズクフコイダンを固相化したアフィニティーカラムで行うことができる。具体的には、オキナワモズクフコイダンを、セファロース等を臭化シアン等で活性化した活性化樹脂等にカルボジイミド法やグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法等の方法で固相化したものをカラムに詰めて作製したアフィニティーカラムに、上記のようにして得られる抗血清を通液し、オキナワモズクフコイダンと抗血清中のポリクローナル抗体を結合させた後、アフィニティーカラムに塩化マグネシウムやグリシン緩衝液等の溶出液を通液し、オキナワモズクフコイダンと結合していたポリクローナル抗体（本発明抗体）を溶出させることにより抗血清を精製することができる。具体的に、抗血清の精製は、まず、カラム内の活性化樹脂等に適量の抗血清を乗せて３〜４０分、好ましくは１５〜３０分間静置し、樹脂担体と抗体を反応させる。その後、濾液を回収し、残りの抗血清を同様にして反応させる。この操作を抗血清がなくなるまで繰り返す。さらに、回収した濾液を２〜１０回、好ましくは４〜７回カラム内を循環させる。濾液をすべて回収したのち、ゲル内に残ったポリクローナル抗体（本発明抗体）を溶出バッファー（アジ化ナトリウムとリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の混液）で押し出す。このとき、分光光度計にて吸光度が計測されなくなるまでＰＢＳで洗浄する。その後、前述の溶出バッファーをゲルにのせ、フラクションコレクターで回収する。このとき、グリシン緩衝液を用いて溶出する場合はトリス緩衝液などで中和する。分光光度計により抗体が溶出するフラクションの範囲を決め、回収したものをＰＢＳで透析して本発明抗体を得ることができる。
【００２３】
上記のようにして得られる本発明抗体はオキナワモズクフコイダンと特異的に反応するものである。そのため本発明抗体を利用すれば、検体中のオキナワモズクフコイダンの測定、免疫染色等ができる。
【００２４】
本発明抗体を用いて検体中のオキナワモズクフコイダンを測定する方法は、特に限定されないが、例えば、検体に本発明抗体を作用させることにより、検体中のオキナワモズクフコイダンを測定することができる。本発明抗体をオキナワモズクフコイダンに作用させる方法としては、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体法（Gerlich WH and Luer W, J. Med. Virol. 1979, 4, 227-38）、アビジン・ビオチン標識法（Hsu SM, Rain L and Fanger H, Am. J. Clin. Pathol. 1981, 75, 734-738）等が挙げられる。
【００２５】
また、本発明抗体を用いたオキナワモズクフコイダンの測定には、例えば、本発明抗体を固相化したプレート、標識化した本発明抗体、前記標識を発色させるための発色試薬、洗浄液等から構成されるサンドイッチＥＬＩＳＡキットを利用することができる。この様なキットであれば検体中のオキナワモズクフコイダンを１００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定することができる。
【００２６】
上記測定に用いることのできる検体としては、尿、血清、血漿、細胞または肝臓、腎臓、小腸等の組織等が挙げられ、これらの中でも特に尿、血清または血漿が好ましい。
【００２７】
一方、本発明抗体を用いて検体中のオキナワモズクフコイダンを免疫染色する方法は、特に限定されないが、例えば、検体に本発明抗体を作用させた後、更に染色試薬を作用させることにより、検体中のオキナワモズクフコイダンを染色することができる。本発明抗体や染色試薬を作用させる方法に特に制限はないが、例えば、酵素抗体法（間接法：Yolken RH and Leister FJ, J. Immunol. Methods, 43, 209-218 (1981)）等を利用することができる。
【００２８】
上記免疫染色に用いることのできる検体としては、手術材料、生検材料、各種細胞または肝臓、腎臓、小腸等の組織等が挙げられ、これらの中でも特に各種細胞または肝臓、腎臓、小腸等の組織が好ましい。
【００２９】
また、本発明抗体を用いたオキナワモズクフコイダンの免疫染色には、例えば、本発明抗体、標識化した２次抗体、前記標識を発色させるための発色試薬等から構成される免疫染色キットを利用することができる。この様なキットであれば検体中のオキナワモズクフコイダンを特異的に感度良く免疫染色することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３１】
実 施 例 １
抗血清の作製：
２０ｍｇ／ｍｌのオキナワモズクフコイダン（品名：フコイダン、サウスプロダクト社製）溶液を２.５ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌのスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ：ＰＩＥＲＣＥ製）溶液を１ｍｌ混合し、攪拌しながら５ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ：ＰＩＥＲＣＥ製）の１ｍｌをゆっくり滴下した。これを４℃で２日間攪拌し、オキナワモズクフコイダンのグルクロン酸が持つカルボキシル基と、ＫＬＨのアミノ基とをカルボジイミド反応を用いて結合させた結合物（以下、「ＫＬＨ結合物」という）を作製した。
【００３２】
この結合物とアジュバンドを混合したものを抗原として３匹の家兔に図１のスケジュールで皮内注射して免疫し、免疫終了後に全採血をして抗血清を得た。なお、アジュバンドとしてはフロイント完全アジュバンド（ＦＣＡ）を使用した。
【００３３】
また、抗原として、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、オキナワモズクフコイダンを用いて、上記と同様にして抗血清を得た。
【００３４】
これら３種の抗原を用いて得られた抗血清に含まれる抗体の感度を比較した。具体的には、フコイダン標準液（２００ｍｌ中にオキナワモズクフコイダンを１ｇ含有）の希釈系列を作製して、希釈液中のオキナワモズクフコイダン濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。その結果、ＫＬＨ結合物を抗原として得られた抗体（５万倍希釈）＞ＢＳＡ結合物を抗原として得られた抗体（１万倍希釈）＞オキナワモズクフコイダンを抗原として得られた抗体（８千倍希釈）の順で感度が高いことがわかった。
【００３５】
実 施 例２
フコイダン抗体の調製：
（１）オキナワモズクフコイダンアフィニティーカラムの作製
ＥＡＨセファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）をカラムに充填した後、０.５Ｍの塩化ナトリウム水溶液４００ｍｌで洗浄した。次に、洗浄後のＥＡＨセファロース４Ｂと２０ｍｇ／ｍｌのオキナワモズクフコイダン１０ｍｌを５０ｍｌ容量の遠沈管に入れ、それを振りながら５ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ１０ｍｌを滴下し、それを室温で２時間攪拌し、更に、４℃で３日間攪拌した。その後、これをカラムに充填し、０.５Ｍの塩化ナトリウム溶液４００ｍｌで洗浄し、１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４.５）に室温で２時間浸漬し、ブロッキングをした。最後にこれをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、オキナワモズクフコイダンアフィニティーカラムを作製した。
【００３６】
（２）抗血清の精製：
上記で作製したオキナワモズクフコイダンアフィニティーカラムのコックを閉じ、ゲルの上に、上記実施例１で得られた抗血清を適量のせて１５〜２０分ほど放置してカラム内のオキナワモズクフコイダンと結合させた。その後、カラムのコックを開け、ろ液を回収し、これを再度ゲルにのせた。この操作を数回繰り返した後、ゲル内に残った抗血清を０.０３％のアジ化ナトリウムと１０ｍＭのＰＢＳの混液で押し出した。その後、分光光度計にて吸光度が計測されなくなるまでＰＢＳで洗浄した。
【００３７】
上記作製した抗血清とオキナワモズクフコイダンが結合したカラムに、３Ｍの塩化マグネシウム溶液を加え、溶出液をフラクションコレクターで回収した。回収した溶出液をＰＢＳに透析し、モノスペシフィックに精製されたポリクローナル抗体（以下、「フコイダン抗体」という）を得た。
【００３８】
実 施 例３
フコイダン抗体による免疫染色試験：
培養ヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２細胞）に、オキナワモズクフコイダンを０、２００、５００μｇ／ｍｌ投与し、投与１２時間後に実施例２で得られたフコイダン抗体を使用して酵素抗体法（間接法）で免疫染色した。なお、免疫染色は以下の手順で行った。また、予め実施例２で得られたフコイダン抗体に、オキナワモズクフコイダンを十分に吸収させた後、上記と同様にして培養ヒト肝細胞を免疫染色した。それらの結果を図２に示した（上段はオキナワモズクフコイダン吸収前（吸収前）、下段はオキナワモズクフコイダン吸収後（吸収後））。
＜免疫染色手順＞
１）細胞標本の固定
標本（ＨｅｐＧ２細胞）を９５％エタノールに浸漬（室温、３０分）後、流水で水洗（
２〜３分）した
２）内因性ペルオキシダーゼの除去
標本を３％過酸化水素加１００％メタノール＊１に浸漬（３０分）した
３）洗浄
標本を流水で水洗（５分）した
４）マイクロウェーブ処理による抗原賦活化
０.０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６.０）を予備加温（５００Ｗ電子レンジ・５分）した
後、加温した緩衝液に標本を浸してさらに加温（５００Ｗ電子レンジ・５分）し、その
後室温で冷却（常温まで・２０〜３０分）した
５）洗浄
標本をＰＢＳ＊２で洗浄（３分×３回）した
６）一次抗体（フコイダン抗体）の添加・反応
フコイダン抗体を抗体希釈液＊３で１：５０に希釈して、１標本当たり５０〜１００μ
ｌ添加し、反応（室温、１２０分・本実験の希釈抗体濃度 約６μｇ／ｍｌ）させた
７）洗浄
標本を０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ＊４で洗浄（３分×３回）した
８）二次抗体の添加・反応
二次抗体（Histofine Simple Stain MAX-PO(MULTI)：ニチレイ製）を１標本当たり１
〜２滴添加し、反応（室温、６０分）させた
９）洗浄
標本を０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ＊４で洗浄（３分×３回）した
１０）発色反応
標本を発色試薬＊５に浸漬し、発色反応（室温、２０〜３０分・時間は発色の程度を確
認しながら決めた）させた
１１）洗浄
標本を流水で水洗（５分）した
１２）染色
標本をマイヤーのヘマトキシリンで核染色（室温、１〜２分）した
１３）洗浄
標本を流水で水洗（５〜１０分）した
１４）脱水・透徹
標本を以下の順序で脱水・透徹した
ａ）７０％エタノール（数秒）
ｂ）９０％エタノール（数秒）
ｃ）１００％エタノール（数秒）
ｄ）無水エタノールI（数秒）
ｅ）無水エタノールII（数秒）
ｆ）キシレンI（数十秒）
ｇ）キシレンII（数十秒）
１５）封入
標本をマリノール（武藤化学製）で封入した
＊１：１００％メタノールに３０％過酸化水素水を３％になるように加えた溶液
＊２：０.０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）に塩化ナトリウムを０.８％加えた溶液
＊３：２％ブロックエース（大日本製薬製）、０.８％塩化ナトリウムおよび０.１％アジ
化ナトリウムを含有する水溶液
＊４：ＰＢＳ＊２にＴｗｅｅｎ２０を０.０５％になるように加えた溶液
＊５：０.０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.６）にジアミノベンチジン（ＤＡＢ）を０.
０２％加えた溶液
【００３９】
図２より、フコイダン抗体は、濃度依存的に細胞内フコイダンを染色した（吸収前）。また、フコイダンを予め吸収させたフコイダン抗体で免疫染色した結果、細胞内フコイダンは染色されなかった（吸収後）。これらの結果からフコイダン抗体はオキナワモズクフコイダンを特異的に免疫染色することがわかった。
【００４０】
実 施 例４
サンドイッチ法による測定：
実施例２で得られたフコイダン抗体を、マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）の各ウエルに添加し、４℃で一夜インキュベートすることによって固相化した。次に、この各ウエルにブロッキングバッファー（１０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０.０５％プロリンを含むＰＢＳ）を加えてブロッキングし、更にその後、洗浄バッファー（０.２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で各ウエルを洗浄して、フコイダン抗体を固相化したプレートを作製した。このプレートの各ウエルに種々の濃度のオキナワモズクフコイダンを含む溶液を添加し、室温（２０〜２５℃）で振動させながら１時間インキュベートし、固相化したフコイダン抗体とオキナワモズクフコイダンとを結合させた。その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と結合させたフコイダン抗体を含み、０.０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳの１００μｌを各ウエルに添加し、室温（２０〜２５℃）で穏やかに振動させながら１時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、１００μｌの発色試薬溶液（０.４ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）ｏ−フェニレンジアミン）を添加し、室温で振動させながら２０分間インキュベートし、十分に発色したところで、１００μｌの１Ｎ硫酸溶液を加え、反応を停止させた。最後にプレートをマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４：トーソー製）を用いて波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。また、オキナワモズクフコイダンに代えて、多糖類（ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸Ｃ、デキストラン硫酸、アルギン酸、ラミナリン）についても同様の測定を行った。これらの結果を図３に示した。
【００４１】
図３より上記測定系では１００ｎｇ／ｍｌ以下、特に１〜１００ｎｇ／ｍｌのオキナワモズクフコイダン濃度を特異的に測定できることがわかった。また、この濃度範囲においては、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸Ｃ、デキストラン硫酸、ラミナリン、アルギン酸との交差反応は認められなかった。
【００４２】
実 施 例５
ヒト検体中のオキナワモズクフコイダンの測定：
１０名のボランティアにオキナワモズクフコイダン（品名：フコイダン、サウスプロダクト社製）１ｇを経口摂取させ、０時間（摂取前）、３時間、６時間、９時間後に血清、血漿および尿を採取し、以下の前処理を行った後、実施例４の測定系で各サンプル中のオキナワモズクフコイダン濃度を測定した。その結果を表１に示した。
【００４３】
血清、血漿および尿の前処理は、まず、血清、血漿および尿をＰＢＳで４倍に希釈し、ドライサーモユニット（タイテック製）を用いて１００℃で１０分間沸騰させた。その後氷で冷却し、更に、これを１２,０００ｒｐｍで１０分間遠心し、その上清をサンプルとした。
【００４４】
【表１】
【００４５】
その結果、全例で尿中オキナワモズクフコイダンを検出した。また、７例では血清および血漿中にオキナワモズクフコイダンを検出した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のポリクローナル抗体は、オキナワモズクフコイダンと特異的に反応するため、オキナワモズクフコイダン摂取後の血中、尿中等の濃度測定や組織の染色に利用できる。
以 上
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オキナワモズクフコイダンに特異的に反応するポリクローナル抗体およびこの抗体を利用したオキナワモズクフコイダンの測定方法、免疫染色方法、測定キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
フコイダンは褐藻類に特有の多糖で、硫酸化されたフコースを構成糖に有するものであるが、褐藻類の種類によってその構造は異なることが知られている。例えば、フコイダンの中でもオキナワモズクフコイダンは下記式で示すようにα１,３結合したフコースを主鎖として、フコース６分子にグルクロン酸が１分子結合したものであり、また、フコースの半分は硫酸化されているものである。
【化１】
【０００３】
そしてこのオキナワモズクフコイダンには抗潰瘍作用、抗炎症作用、整腸作用、抗腫瘍作用、コレステロール低下作用等が報告されている（非特許文献１〜４）。
【０００４】
しかしながら、このオキナワモズクフコイダンに限らず、その他のフコイダンについても血中、組織中の濃度測定系が殆ど確立しておらず、摂取されたフコイダンがどのようにして上記作用を奏しているのかは全く不明であった。
【０００５】
一応、これまでに、ガゴメコンブ由来のフコイダンを抗原として得られたモノクローナル抗体を利用したもの、マコンブ由来のフコイダンを抗原として得られたモノクローナル抗体を利用したもの、ワカメ由来のフコダイダンを抗原として得られたモノクローナル抗体を利用したもの等も報告されているが（特許文献１、非特許文献５〜６）、これらの抗体はオキナワモズクフコイダンに特異的に反応するものではないため、これらの抗体を利用してオキナワモズクフコイダンを正確に測定することはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ００／０７７０４９国際公開パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Matsumoto S, et al. Fucoidan derived from Cladosiphon okamuranus Tokita ameriorates murine chronic colitis through the down-regulation of interleukin-6 production on colonic epithelial cells. Clin Exp Immunol 2004,136; 432-439.
【非特許文献２】Shibata H, et al. Properties of fucoidan from Cladosiphon okamuranus tokita in gastric mucosal protection. BioFactors 2000, 11; 235-245.
【非特許文献３】曽根俊郎 他、オキナワモズクの抗炎症作用 ＦＲＡＧＲＡＮＣＥ Ｊｏｕｒｎａｌ１２月号、２００１年、８７1−８９２
【非特許文献４】Nagamine T, et al.Inhibitory effect of fucoidan on Huh7 hepatoma cells through downregulation of CXCL12. Nutr Cancer 2009, 61; 340-347.
【非特許文献５】Mizuno M et al. Quantification and localization of fucoidan in Laminaria Japonica Using a novel antibody. Biosci Biotechnol Biochem 2009, 73; 335-338.
【非特許文献６】Irhimeh MR, et al. A quantitative method to detect fucoidan in human血漿 using a novel antibody. Methods Find Exp Clin Pharmacol 2005, 27;705-710.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の課題はフコイダンと特異的に反応する抗体を作製すると共に、これを利用してオキナワモズクフコイダンを正確に測定することのできる測定系や免疫染色系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、オキナワモズクフコイダンに特定の生体高分子を結合させた結合物を抗原として動物に免疫して得られる抗血清を特定の方法で精製することによりオキナワモズクフコイダンに特異的に反応する抗体を作製できることを見出した。また、この抗体を利用することでオキナワモズクフコイダンの濃度の測定や免疫染色を行えることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち本発明は、オキナワモズクフコイダンと特異的に反応することを特徴とするポリクローナル抗体である。
【００１１】
また、本発明はオキナワモズクフコイダンに、オブアルブミン、スカシ貝ヘモシアニンおよびウシ血清アルブミンから選ばれる生体高分子の一つを結合させ、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から得られる抗血清を、更にオキナワモズクフコイダンを用いたアフィニティー精製をすることを特徴とする上記ポリクローナル抗体の製造方法である。
【００１２】
更に、本発明は検体に、上記ポリクローナル抗体を作用させ、検体中のオキナワモズクフコイダンを測定することを特徴とするオキナワモズクフコイダンの測定方法である。
【００１３】
また更に、本発明は上記ポリクローナル抗体を含有することを特徴とするオキナワモズクフコイダンの測定キットである。
【００１４】
更にまた、本発明は検体に、上記ポリクローナル抗体を作用させた後、染色試薬により、検体中のオキナワモズクフコイダンを染色することを特徴とするオキナワモズクフコイダンの免疫染色方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のポリクローナル抗体は、オキナワモズクフコイダンと特異的に反応するものである。そのため、この抗体を利用してオキナワモズクフコイダンの測定系を構築すると、血清、尿、細胞、組織等の検体中のオキナワモズクフコイダンをｎｇのオーダーで測定することができる。また、この抗体は細胞や肝臓、腸管等の組織中のオキナワモズクフコイダンの染色にも利用することができる。
【００１６】
従って、本発明のポリクローナル抗体を利用すれば、血中や組織中のオキナワモズクフコイダン代謝を解明することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】免疫スケジュールを示す図である。
【図２】本発明のポリクローナル抗体による免疫染色の結果を示す図である。
【図３】本発明のポリクローナル抗体を利用したサンドイッチ法によるオキナワモズクフコイダンおよび多糖類の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のポリクローナル抗体（以下、「本発明抗体」という）は、オキナワモズクフコイダンと特異的に反応するものである。ここで特異的とは、ポリクローナル抗体がオキナワモズクフコイダンと抗原・抗体反応で反応し、オキナワモズクフコイダン以外の多糖類とは実質的に交差反応しないことをいい、また、オキナワモズクフコイダン以外の多糖類とは実質的に交差反応しないとは、後記する本発明抗体を用いたサンドイッチ法（本発明抗体を一次抗体および二次抗体の両方に使用）にて、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸Ｃ、デキストラン硫酸、ラミナリン、アルギン酸等の多糖類を測定した場合に、１００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定されないことをいう。
【００１９】
上記本発明抗体は、例えば、オキナワモズクフコイダンに生体高分子を結合させ、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から得られる抗血清を、更にオキナワモズクフコイダンを用いたアフィニティー精製をすることにより得られる。
【００２０】
上記においてオキナワモズクフコイダンと結合される生体高分子としては、特に限定されないが、例えば、オブアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）から選ばれるものが挙げられる。これらの生体高分子の中でも得られる抗体の感度が高いためＫＬＨが好ましい。また、これら生体高分子とオキナワモズクフコイダンとの結合は、特に制限されず種々の方法で行うことができ、例えば、ＫＬＨとオキナワモズクフコイダンとの結合であれば、１−メチル３−（３ジメチルラミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いてグルクロン酸のカルボキシル基を活性化した後、ＫＬＨ中のリジン残基とをカップリングさせる方法等で行うことができる。具体的に、ＫＬＨとオキナワモズクフコイダンとの結合物は、１〜４０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２〜３０ｍｇ／ｍｌのオキナワモズクフコイダン水溶液０.２５〜５ｍｌ、好ましくは１.２５〜２.２５ｍｌ／ｍｌに、０.５〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２.５〜７.５ｍｇ／ｍｌのＫＬＨを０.１〜２ｍｌ、好ましくは０.５〜１.５ｍｌを混和したのちに、これを撹拌しながら０.５〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２.５〜７.５ｍｇ／ｍｌのＥＤＣを０.１〜２ｍｌ、好ましくは０.５〜１.５ｍｌをゆっくり滴下して混ぜ、４℃で５〜９６時間、好ましくは２４〜３６時間撹拌することにより得られる。
【００２１】
上記結合物を用いた動物の免疫は、例えば、マウス、ラット、ウサギ等のほ乳動物に、結合物と、フロイント完全アジュバンド、フロイント非完全アジュバント等のアジュバンドとを併用し、これを皮内、腹腔等に注射等で投与することにより行われる。免疫のスケジュールは、例えば、結合物を１〜４週間毎、好ましくは１〜３週間毎に、計１〜１０回、好ましくは３〜７回動物に摂種する。摂種量は初回が０.０１〜０.３０ｍｇ、好ましくは０.７５〜２.２５ｍｇ、その後は０.０３〜０.６０ｍｇ、好ましくは０.１５〜０.４５ｍｇである。最終の免疫をしてから１〜１０週間後、好ましくは２〜６週間後に全採血することにより抗血清が得られる。
【００２２】
上記抗血清のオキナワモズクフコイダンを用いたアフィニティー精製は、特に制限されず種々の方法で行うことができ、例えば、オキナワモズクフコイダンを固相化したアフィニティーカラムで行うことができる。具体的には、オキナワモズクフコイダンを、セファロース等を臭化シアン等で活性化した活性化樹脂等にカルボジイミド法やグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法等の方法で固相化したものをカラムに詰めて作製したアフィニティーカラムに、上記のようにして得られる抗血清を通液し、オキナワモズクフコイダンと抗血清中のポリクローナル抗体を結合させた後、アフィニティーカラムに塩化マグネシウムやグリシン緩衝液等の溶出液を通液し、オキナワモズクフコイダンと結合していたポリクローナル抗体（本発明抗体）を溶出させることにより抗血清を精製することができる。具体的に、抗血清の精製は、まず、カラム内の活性化樹脂等に適量の抗血清を乗せて３〜４０分、好ましくは１５〜３０分間静置し、樹脂担体と抗体を反応させる。その後、濾液を回収し、残りの抗血清を同様にして反応させる。この操作を抗血清がなくなるまで繰り返す。さらに、回収した濾液を２〜１０回、好ましくは４〜７回カラム内を循環させる。濾液をすべて回収したのち、ゲル内に残ったポリクローナル抗体（本発明抗体）を溶出バッファー（アジ化ナトリウムとリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の混液）で押し出す。このとき、分光光度計にて吸光度が計測されなくなるまでＰＢＳで洗浄する。その後、前述の溶出バッファーをゲルにのせ、フラクションコレクターで回収する。このとき、グリシン緩衝液を用いて溶出する場合はトリス緩衝液などで中和する。分光光度計により抗体が溶出するフラクションの範囲を決め、回収したものをＰＢＳで透析して本発明抗体を得ることができる。
【００２３】
上記のようにして得られる本発明抗体はオキナワモズクフコイダンと特異的に反応するものである。そのため本発明抗体を利用すれば、検体中のオキナワモズクフコイダンの測定、免疫染色等ができる。
【００２４】
本発明抗体を用いて検体中のオキナワモズクフコイダンを測定する方法は、特に限定されないが、例えば、検体に本発明抗体を作用させることにより、検体中のオキナワモズクフコイダンを測定することができる。本発明抗体をオキナワモズクフコイダンに作用させる方法としては、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体法（Gerlich WH and Luer W, J. Med. Virol. 1979, 4, 227-38）、アビジン・ビオチン標識法（Hsu SM, Rain L and Fanger H, Am. J. Clin. Pathol. 1981, 75, 734-738）等が挙げられる。
【００２５】
また、本発明抗体を用いたオキナワモズクフコイダンの測定には、例えば、本発明抗体を固相化したプレート、標識化した本発明抗体、前記標識を発色させるための発色試薬、洗浄液等から構成されるサンドイッチＥＬＩＳＡキットを利用することができる。この様なキットであれば検体中のオキナワモズクフコイダンを１００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定することができる。
【００２６】
上記測定に用いることのできる検体としては、尿、血清、血漿、細胞または肝臓、腎臓、小腸等の組織等が挙げられ、これらの中でも特に尿、血清または血漿が好ましい。
【００２７】
一方、本発明抗体を用いて検体中のオキナワモズクフコイダンを免疫染色する方法は、特に限定されないが、例えば、検体に本発明抗体を作用させた後、更に染色試薬を作用させることにより、検体中のオキナワモズクフコイダンを染色することができる。本発明抗体や染色試薬を作用させる方法に特に制限はないが、例えば、酵素抗体法（間接法：Yolken RH and Leister FJ, J. Immunol. Methods, 43, 209-218 (1981)）等を利用することができる。
【００２８】
上記免疫染色に用いることのできる検体としては、手術材料、生検材料、各種細胞または肝臓、腎臓、小腸等の組織等が挙げられ、これらの中でも特に各種細胞または肝臓、腎臓、小腸等の組織が好ましい。
【００２９】
また、本発明抗体を用いたオキナワモズクフコイダンの免疫染色には、例えば、本発明抗体、標識化した２次抗体、前記標識を発色させるための発色試薬等から構成される免疫染色キットを利用することができる。この様なキットであれば検体中のオキナワモズクフコイダンを特異的に感度良く免疫染色することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３１】
実 施 例 １
抗血清の作製：
２０ｍｇ／ｍｌのオキナワモズクフコイダン（品名：フコイダン、サウスプロダクト社製）溶液を２.５ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌのスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ：ＰＩＥＲＣＥ製）溶液を１ｍｌ混合し、攪拌しながら５ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ：ＰＩＥＲＣＥ製）の１ｍｌをゆっくり滴下した。これを４℃で２日間攪拌し、オキナワモズクフコイダンのグルクロン酸が持つカルボキシル基と、ＫＬＨのアミノ基とをカルボジイミド反応を用いて結合させた結合物（以下、「ＫＬＨ結合物」という）を作製した。
【００３２】
この結合物とアジュバンドを混合したものを抗原として３匹の家兔に図１のスケジュールで皮内注射して免疫し、免疫終了後に全採血をして抗血清を得た。なお、アジュバンドとしてはフロイント完全アジュバンド（ＦＣＡ）を使用した。
【００３３】
また、抗原として、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、オキナワモズクフコイダンを用いて、上記と同様にして抗血清を得た。
【００３４】
これら３種の抗原を用いて得られた抗血清に含まれる抗体の感度を比較した。具体的には、フコイダン標準液（２００ｍｌ中にオキナワモズクフコイダンを１ｇ含有）の希釈系列を作製して、希釈液中のオキナワモズクフコイダン濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。その結果、ＫＬＨ結合物を抗原として得られた抗体（５万倍希釈）＞ＢＳＡ結合物を抗原として得られた抗体（１万倍希釈）＞オキナワモズクフコイダンを抗原として得られた抗体（８千倍希釈）の順で感度が高いことがわかった。
【００３５】
実 施 例２
フコイダン抗体の調製：
（１）オキナワモズクフコイダンアフィニティーカラムの作製
ＥＡＨセファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）をカラムに充填した後、０.５Ｍの塩化ナトリウム水溶液４００ｍｌで洗浄した。次に、洗浄後のＥＡＨセファロース４Ｂと２０ｍｇ／ｍｌのオキナワモズクフコイダン１０ｍｌを５０ｍｌ容量の遠沈管に入れ、それを振りながら５ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ１０ｍｌを滴下し、それを室温で２時間攪拌し、更に、４℃で３日間攪拌した。その後、これをカラムに充填し、０.５Ｍの塩化ナトリウム溶液４００ｍｌで洗浄し、１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４.５）に室温で２時間浸漬し、ブロッキングをした。最後にこれをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、オキナワモズクフコイダンアフィニティーカラムを作製した。
【００３６】
（２）抗血清の精製：
上記で作製したオキナワモズクフコイダンアフィニティーカラムのコックを閉じ、ゲルの上に、上記実施例１で得られた抗血清を適量のせて１５〜２０分ほど放置してカラム内のオキナワモズクフコイダンと結合させた。その後、カラムのコックを開け、ろ液を回収し、これを再度ゲルにのせた。この操作を数回繰り返した後、ゲル内に残った抗血清を０.０３％のアジ化ナトリウムと１０ｍＭのＰＢＳの混液で押し出した。その後、分光光度計にて吸光度が計測されなくなるまでＰＢＳで洗浄した。
【００３７】
上記作製した抗血清とオキナワモズクフコイダンが結合したカラムに、３Ｍの塩化マグネシウム溶液を加え、溶出液をフラクションコレクターで回収した。回収した溶出液をＰＢＳに透析し、モノスペシフィックに精製されたポリクローナル抗体（以下、「フコイダン抗体」という）を得た。
【００３８】
実 施 例３
フコイダン抗体による免疫染色試験：
培養ヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２細胞）に、オキナワモズクフコイダンを０、２００、５００μｇ／ｍｌ投与し、投与１２時間後に実施例２で得られたフコイダン抗体を使用して酵素抗体法（間接法）で免疫染色した。なお、免疫染色は以下の手順で行った。また、予め実施例２で得られたフコイダン抗体に、オキナワモズクフコイダンを十分に吸収させた後、上記と同様にして培養ヒト肝細胞を免疫染色した。それらの結果を図２に示した（上段はオキナワモズクフコイダン吸収前（吸収前）、下段はオキナワモズクフコイダン吸収後（吸収後））。
＜免疫染色手順＞
１）細胞標本の固定
標本（ＨｅｐＧ２細胞）を９５％エタノールに浸漬（室温、３０分）後、流水で水洗（
２〜３分）した
２）内因性ペルオキシダーゼの除去
標本を３％過酸化水素加１００％メタノール＊１に浸漬（３０分）した
３）洗浄
標本を流水で水洗（５分）した
４）マイクロウェーブ処理による抗原賦活化
０.０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６.０）を予備加温（５００Ｗ電子レンジ・５分）した
後、加温した緩衝液に標本を浸してさらに加温（５００Ｗ電子レンジ・５分）し、その
後室温で冷却（常温まで・２０〜３０分）した
５）洗浄
標本をＰＢＳ＊２で洗浄（３分×３回）した
６）一次抗体（フコイダン抗体）の添加・反応
フコイダン抗体を抗体希釈液＊３で１：５０に希釈して、１標本当たり５０〜１００μ
ｌ添加し、反応（室温、１２０分・本実験の希釈抗体濃度 約６μｇ／ｍｌ）させた
７）洗浄
標本を０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ＊４で洗浄（３分×３回）した
８）二次抗体の添加・反応
二次抗体（Histofine Simple Stain MAX-PO(MULTI)：ニチレイ製）を１標本当たり１
〜２滴添加し、反応（室温、６０分）させた
９）洗浄
標本を０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ＊４で洗浄（３分×３回）した
１０）発色反応
標本を発色試薬＊５に浸漬し、発色反応（室温、２０〜３０分・時間は発色の程度を確
認しながら決めた）させた
１１）洗浄
標本を流水で水洗（５分）した
１２）染色
標本をマイヤーのヘマトキシリンで核染色（室温、１〜２分）した
１３）洗浄
標本を流水で水洗（５〜１０分）した
１４）脱水・透徹
標本を以下の順序で脱水・透徹した
ａ）７０％エタノール（数秒）
ｂ）９０％エタノール（数秒）
ｃ）１００％エタノール（数秒）
ｄ）無水エタノールI（数秒）
ｅ）無水エタノールII（数秒）
ｆ）キシレンI（数十秒）
ｇ）キシレンII（数十秒）
１５）封入
標本をマリノール（武藤化学製）で封入した
＊１：１００％メタノールに３０％過酸化水素水を３％になるように加えた溶液
＊２：０.０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）に塩化ナトリウムを０.８％加えた溶液
＊３：２％ブロックエース（大日本製薬製）、０.８％塩化ナトリウムおよび０.１％アジ
化ナトリウムを含有する水溶液
＊４：ＰＢＳ＊２にＴｗｅｅｎ２０を０.０５％になるように加えた溶液
＊５：０.０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.６）にジアミノベンチジン（ＤＡＢ）を０.
０２％加えた溶液
【００３９】
図２より、フコイダン抗体は、濃度依存的に細胞内フコイダンを染色した（吸収前）。また、フコイダンを予め吸収させたフコイダン抗体で免疫染色した結果、細胞内フコイダンは染色されなかった（吸収後）。これらの結果からフコイダン抗体はオキナワモズクフコイダンを特異的に免疫染色することがわかった。
【００４０】
実 施 例４
サンドイッチ法による測定：
実施例２で得られたフコイダン抗体を、マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）の各ウエルに添加し、４℃で一夜インキュベートすることによって固相化した。次に、この各ウエルにブロッキングバッファー（１０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０.０５％プロリンを含むＰＢＳ）を加えてブロッキングし、更にその後、洗浄バッファー（０.２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で各ウエルを洗浄して、フコイダン抗体を固相化したプレートを作製した。このプレートの各ウエルに種々の濃度のオキナワモズクフコイダンを含む溶液を添加し、室温（２０〜２５℃）で振動させながら１時間インキュベートし、固相化したフコイダン抗体とオキナワモズクフコイダンとを結合させた。その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と結合させたフコイダン抗体を含み、０.０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳの１００μｌを各ウエルに添加し、室温（２０〜２５℃）で穏やかに振動させながら１時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、１００μｌの発色試薬溶液（０.４ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）ｏ−フェニレンジアミン）を添加し、室温で振動させながら２０分間インキュベートし、十分に発色したところで、１００μｌの１Ｎ硫酸溶液を加え、反応を停止させた。最後にプレートをマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４：トーソー製）を用いて波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。また、オキナワモズクフコイダンに代えて、多糖類（ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸Ｃ、デキストラン硫酸、アルギン酸、ラミナリン）についても同様の測定を行った。これらの結果を図３に示した。
【００４１】
図３より上記測定系では１００ｎｇ／ｍｌ以下、特に１〜１００ｎｇ／ｍｌのオキナワモズクフコイダン濃度を特異的に測定できることがわかった。また、この濃度範囲においては、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸Ｃ、デキストラン硫酸、ラミナリン、アルギン酸との交差反応は認められなかった。
【００４２】
実 施 例５
ヒト検体中のオキナワモズクフコイダンの測定：
１０名のボランティアにオキナワモズクフコイダン（品名：フコイダン、サウスプロダクト社製）１ｇを経口摂取させ、０時間（摂取前）、３時間、６時間、９時間後に血清、血漿および尿を採取し、以下の前処理を行った後、実施例４の測定系で各サンプル中のオキナワモズクフコイダン濃度を測定した。その結果を表１に示した。
【００４３】
血清、血漿および尿の前処理は、まず、血清、血漿および尿をＰＢＳで４倍に希釈し、ドライサーモユニット（タイテック製）を用いて１００℃で１０分間沸騰させた。その後氷で冷却し、更に、これを１２,０００ｒｐｍで１０分間遠心し、その上清をサンプルとした。
【００４４】
【表１】
【００４５】
その結果、全例で尿中オキナワモズクフコイダンを検出した。また、７例では血清および血漿中にオキナワモズクフコイダンを検出した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のポリクローナル抗体は、オキナワモズクフコイダンと特異的に反応するため、オキナワモズクフコイダン摂取後の血中、尿中等の濃度測定や組織の染色に利用できる。
以 上
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキナワモズクフコイダンと特異的に反応することを特徴とするポリクローナル抗体。
【請求項２】
オキナワモズクフコイダン以外の多糖類と実質的に交差反応をしないものである請求項１記載のポリクローナル抗体。
【請求項３】
オキナワモズクフコイダンに、オブアルブミン、スカシ貝ヘモシアニンおよびウシ血清アルブミンから選ばれる生体高分子の一つを結合させ、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から得られる抗血清を、更にオキナワモズクフコイダンを用いたアフィニティー精製をすることにより得られたものである請求項１記載のポリクローナル抗体。
【請求項４】
オキナワモズクフコイダンに、オブアルブミン、スカシ貝ヘモシアニンおよびウシ血清アルブミンから選ばれる生体高分子の一つを結合させ、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から得られる抗血清を、更にオキナワモズクフコイダンを用いたアフィニティー精製をすることを特徴とする請求項１記載のポリクローナル抗体の製造方法。
【請求項５】
検体に、請求項１ないし３の何れかに記載のポリクローナル抗体を作用させ、検体中のオキナワモズクフコイダンを測定することを特徴とするオキナワモズクフコイダンの測定方法。
【請求項６】
検体が、尿、血清または血漿である請求項５記載のオキナワモズクフコイダンの測定方法。
【請求項７】
請求項１ないし３の何れかに記載のポリクローナル抗体を含有することを特徴とするオキナワモズクフコイダンの測定キット。
【請求項８】
検体に、請求項１ないし３の何れかに記載のポリクローナル抗体を作用させた後、更に染色試薬を作用させることにより、検体中のオキナワモズクフコイダンを染色することを特徴とするオキナワモズクフコイダンの免疫染色方法。
【請求項９】
検体が、細胞または組織である請求項８記載のオキナワモズクフコイダンの免疫染色方法。
【請求項１】
オキナワモズクフコイダンと特異的に反応することを特徴とするポリクローナル抗体。
【請求項２】
オキナワモズクフコイダン以外の多糖類と実質的に交差反応をしないものである請求項１記載のポリクローナル抗体。
【請求項３】
オキナワモズクフコイダンに、オブアルブミン、スカシ貝ヘモシアニンおよびウシ血清アルブミンから選ばれる生体高分子の一つを結合させ、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から得られる抗血清を、更にオキナワモズクフコイダンを用いたアフィニティー精製をすることにより得られたものである請求項１記載のポリクローナル抗体。
【請求項４】
オキナワモズクフコイダンに、オブアルブミン、スカシ貝ヘモシアニンおよびウシ血清アルブミンから選ばれる生体高分子の一つを結合させ、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から得られる抗血清を、更にオキナワモズクフコイダンを用いたアフィニティー精製をすることを特徴とする請求項１記載のポリクローナル抗体の製造方法。
【請求項５】
検体に、請求項１ないし３の何れかに記載のポリクローナル抗体を作用させ、検体中のオキナワモズクフコイダンを測定することを特徴とするオキナワモズクフコイダンの測定方法。
【請求項６】
検体が、尿、血清または血漿である請求項５記載のオキナワモズクフコイダンの測定方法。
【請求項７】
請求項１ないし３の何れかに記載のポリクローナル抗体を含有することを特徴とするオキナワモズクフコイダンの測定キット。
【請求項８】
検体に、請求項１ないし３の何れかに記載のポリクローナル抗体を作用させた後、更に染色試薬を作用させることにより、検体中のオキナワモズクフコイダンを染色することを特徴とするオキナワモズクフコイダンの免疫染色方法。
【請求項９】
検体が、細胞または組織である請求項８記載のオキナワモズクフコイダンの免疫染色方法。
【図１】
【図３】
【図２】
【図３】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−９８８９９（Ｐ２０１１−９８８９９Ａ）
【公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５３６０１（Ｐ２００９−２５３６０１）
【出願日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５０４４２６２１８）株式会社サウスプロダクト (15)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５０４４２６２１８）株式会社サウスプロダクト (15)
【Ｆターム（参考）】
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