ポリグリシドール誘導体、及びこれを含む複合薬物担体
【課題】生体適合性に優れ、且つ、安価に提供することができる新規の温度感受性高分子化合物、及び、該温度感受性高分子化合物と薬剤とからなる温度感受性薬剤放出システムを提供する。
【解決手段】温度感受性高分子化合物は、ポリグリセリン骨格を主鎖とし、少なくとも下記式（ａ）
（式中、ＧＬはグリセリン残基、Ｘはリンカー、Ｒは感熱応答性基を示す）で表される繰り返し単位を有する。この高分子化合物は、分子量が１２０〜１２０００であり、全ての水酸基のうち１級水酸基が５０％以上であるポリグリセリンに、反応により感熱応答性基を導入可能な官能基を有する１価の有機基であるリンカーの前駆体Ｘ1を導入し、続いて感熱応答性基Ｒを導入して得られるもの。
【解決手段】温度感受性高分子化合物は、ポリグリセリン骨格を主鎖とし、少なくとも下記式（ａ）
（式中、ＧＬはグリセリン残基、Ｘはリンカー、Ｒは感熱応答性基を示す）で表される繰り返し単位を有する。この高分子化合物は、分子量が１２０〜１２０００であり、全ての水酸基のうち１級水酸基が５０％以上であるポリグリセリンに、反応により感熱応答性基を導入可能な官能基を有する１価の有機基であるリンカーの前駆体Ｘ1を導入し、続いて感熱応答性基Ｒを導入して得られるもの。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病巣部位を確実にターゲッティングして、目的病巣部位の細胞内に薬物を安全にかつ効率良く送達するドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）として有用な、特に遺伝子の細胞伝達・発現に実用的な複合薬物担体と、該複合薬物担体の調製に用いられるポリグリシドール誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤、ＤＮＡ（遺伝子）、ペプチドあるいはタンパク質などの治療及び／又は診断のための薬物投与において、薬効を最大限に引き出すためには、癌、リンパ腫、肺炎、肝炎、腎炎、血管内皮損傷部位などの病巣部位を確実にターゲッティングし、薬物を安全にかつ効率良く送達するために、薬物送達の正確なコントロールが望まれる。近年、このようなドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）における運搬体（担体）として、リポソーム、エマルジョン、リピッドマイクロスフェアなどの閉鎖小胞を応用しようとする研究が盛んに行われている。
【０００３】
一方で各種刺激応答性デンドリマー化合物は、上記のような市場要求事項を満足できるＤＤＳ基材として注目されている。即ち、刺激応答性能として簡便な、光、ｐＨ、温度が付与されたデンドリマー化合物が検討されて来ている（非特許文献１）。中でもｐＨ応答性リポソームは、細胞内に取り込まれると弱酸性のエンドソームと融合することで、内包物をサイトゾルに移行させることから、細胞内デリバリーシステムとして有用であると考えられている。効果的な細胞内デリバリーを実現するためには、ｐＨ応答性リポソームは中性で安定に存在し、わずかなｐＨ低下に鋭敏に反応して膜融合性を発現することが求められる。また応答刺激には一般的に有用なものとして光、温度、ｐＨが挙げられるが、中でも温度応答が最も汎用である。そのため、自動的に体内の低ｐＨ部分で放出される薬剤と同時に、人為刺激として温度を用いた薬剤放出を促進する薬剤担体が最も汎用性が高く有用であると考えられる。
【０００４】
しかしながら、現在検討されているｐＨ応答性のリポソームは、そのｐＨ応答性が不十分であるため、実用化に至っていない（特許文献１、２）。また、ｐＨ応答と温度応答の両方を有する薬剤担体あるいはリポソーム誘導体は、研究レベルにおいても存在していなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】河野 健司、児島 千恵著、遺伝子医学ＭＯＯＫ別冊、「絵で見てわかるナノＤＤＳ〜マテリアルから見た治療・診断・予後・予防、ヘルスケア技術の最先端」、ｐ．１０６−１１２（２００７）、メディカルドゥ
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−３５２６１９号公報
【特許文献２】特開２００８−１２０７１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、実用性の高いｐＨ感受性薬物放出剤として用いることのできる複合薬物担体と、該複合薬物担体の調製に用いられる新規なポリグリシドール誘導体を提供することにある。
本発明の他の目的は、実用性の高いｐＨ及び温度感受性薬物放出剤として用いることのできる複合薬物担体と、該複合薬物担体の調製に用いられる新規なポリグリシドール誘導体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、中心部に高分岐ポリグリセリン骨格を有し、末端部にカルボキシル基、または２種以上の異なるアミド基を有する高分子をリポソーム等に適用すると、ｐＨ応答性、又はｐＨ及び温度応答性に優れた薬剤放出システムが得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、水酸基の５０％以上が１級水酸基であるポリグリセリンから誘導されるポリグリシドール誘導体であって、少なくとも下記式（ａ）
【化１】
（式中、ＧＬはグリセリン残基、Ｘはリンカーを示す。Ｒは、（ｉ）カルボキシル基であるか、又は（ii）イソプロピルカルバモイル基又は炭素数８以上のアルキルカルバモイル基であって、これらのアルキルカルバモイル基を２種以上有する）
で表される繰り返し単位を有するポリグリシドール誘導体を提供する。
【００１０】
本発明は、また、前記のポリグリシドール誘導体と脂質膜を有する担体粒子からなる複合薬物担体を提供する。
【００１１】
この複合薬物担体は、さらに、診断及び／又は治療のための薬物が内包されていてもよい。
【００１２】
前記担体粒子は、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソーム及びエマルジョンからなる群より選択された少なくとも１種の形態を取り得る。
【００１３】
前記薬物として、抗ガン剤、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子及びその類縁体からなる群より選択された少なくとも１種の薬物を使用できる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の複合薬物担体によれば、従来のｐＨ感受性リポソームよりもｐＨ感受性が強く、且つデンドリマーを用いた場合よりも極めて安価であり、より実用性に優れたｐＨ感受性薬剤放出システムとして使用できる。例えば、本発明の複合薬物担体を用いると、環境のｐＨ変化差が１．０以下であっても、薬物担体から９０％以上の薬物を放出させることが可能である。
また、本発明の複合薬物担体によれば、従来のリポソームでは持ち得なかったｐＨ応答性と温度応答性とを実現でき、実用性と汎用性に優れたｐＨ及び温度感受性薬剤放出システムとして使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１で得られたカルボン酸末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図２】実施例２で得られたカルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図３】実施例３で得られたカルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図４】実施例４で得られたカルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図５】実施例５で得られたカルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図６】比較例１で得られたカルボン酸末端リニア型ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図７】ポリグリシドール誘導体における水酸基残存率とカルボン酸導入率の算出法を示す図である。
【図８】製造例１で得られたサクシニル化ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図９】実施例６〜１１で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図１０】比較例２で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図１１】比較例３で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図１２】比較例４で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図１３】実施例１〜５、比較例１で得られたポリグリシドール誘導体のｐＨ感受性評価試験の結果を示す図である。
【図１４】比較例４で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）で修飾されたリポソームの薬物放出に及ぼすｐＨと温度の影響を示す図である。縦軸は薬物の放出率（％）、横軸はｐＨを示す。
【図１５】実施例９で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）で修飾されたリポソームの薬物放出に及ぼすｐＨと温度の影響を示す図である。縦軸は薬物の放出率（％）、横軸はｐＨを示す。
【図１６】実施例１１で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）で修飾されたリポソームの薬物放出に及ぼすｐＨと温度の影響を示す図である。縦軸は薬物の放出率（％）、横軸はｐＨを示す。
【図１７】実施例６で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）で修飾されたリポソームの薬物放出に及ぼすｐＨと温度の影響を示す図である。縦軸は薬物の放出率（％）、横軸はｐＨを示す。
【図１８】実施例８で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）で修飾されたリポソームの薬物放出に及ぼすｐＨと温度の影響を示す図である。縦軸は薬物の放出率（％）、横軸はｐＨを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のポリグリシドール誘導体は、水酸基の５０％以上が１級水酸基であるポリグリセリンから誘導されるポリグリシドール誘導体であって、少なくとも前記式（ａ）で表される繰り返し単位を有する。式（ａ）中、ＧＬはグリセリン残基、Ｘはリンカーを示す。Ｒは、（ｉ）カルボキシル基であるか、又は（ii）イソプロピルカルバモイル基又は炭素数８以上のアルキルカルバモイル基であって、これらのアルキルカルバモイル基を２種以上有する。本発明の複合薬物担体は、上記のポリグリシドール誘導体とリポソーム等の脂質膜を有する担体粒子とで構成される。
【００１７】
上記のポリグリシドール誘導体を用いて複合薬物担体を構成すると、該複合薬物担体は、特定のｐＨ（例えば、ｐＨ７以上）では通常のリポソーム等と同様に水溶性を呈し、薬物（薬剤）が安定に保持され、一方、特定のｐＨ（例えば、ｐＨ６付近）で急激に脂質膜を有する担体粒子が崩壊して、薬物が放出される。複合薬物担体としては、ｐＨ７で３０分間インキュベートした後の当該複合薬物担体からの薬物の放出率が５％以下で、且つｐＨ６で３０分間インキュベートした後の当該複合薬物担体からの薬物の放出率が８５％以上、特に８７％以上であるのが好ましい。なお、式（ａ）において、Ｒがイソプロピルカルバモイル基又は炭素数８以上のアルキルカルバモイル基であって、これらのアルキルカルバモイル基を２種以上有する場合には、複合薬物担体はｐＨ感受性だけでなく、温度感受性をも備える。
【００１８】
本発明において、特定のｐＨで複合薬物担体が崩壊する機構は必ずしも明らかではないが、おそらく、ｐＨが低下すると、増加した系中の水素イオンによって、カルボキシル基部分（カルボン酸部分）、カルバモイル基部分（アミド部分）の水溶性が低下し、リポソーム等の脂質膜を有する担体粒子が構造変化を引き起こすことで崩壊すると考えられる。
【００１９】
ポリグリセリン（ＰＧＬ）は、グリシドールのような重合性グリセリン等価体を原料として合成することができ、ポリグリセリンの分子量としては、例えば１２０〜１２０００程度、好ましくは２４０〜１００００程度、特に好ましくは３５０〜８０００程度である。なお、Ｒの種類によっては（例えば、Ｒがカルボキシル基の場合等）には、ポリグリセリンの分子量は、例えば１２０〜４０００程度（好ましくは２４０〜４０００程度、さらに好ましくは３５０〜４０００程度）であってもよい。ポリグリセリンの分子量が上記の範囲にある場合には、リポソーム崩壊ｐＨを好ましい範囲にすることができる。
【００２０】
また、上記ポリグリセリン（ＰＧＬ）は高分岐構造を有している必要がある。高分岐構造を有することにより、分子内部に空隙が形成され、その空隙中に薬物を保持することができる。高分岐構造はポリグリセリンの水酸基の一級比率により調整することができる。本発明では、ポリグリセリンの水酸基のうち１級水酸基が５０％以上であり、なかでも６０％以上であることが好ましく、特に７０％以上であることが好ましい。本発明においては、ポリグリセリンとして、高分岐ポリ（デカ）グリセリン（商品名「ＰＧＬ１０ＰＳ」、ダイセル化学工業社製）、高分岐ポリ（２０）グリセリン（商品名「ＰＧＬ２０Ｐ」、ダイセル化学工業社製）、高分岐ポリ（４０）グリセリン（商品名「ＰＧＬＸＰ」、ダイセル化学工業社製）、高分岐ポリ（８０）グリセリン（商品名「ＨＰＧ８０」、ダイセル化学工業社製）などの市販品を好適に使用することができる。
【００２１】
前記式（ａ）において、ＧＬ（グリセリン残基）は、下記式（ｂ）、（ｃ）で示される何れかの構造を有する。
【化２】
【００２２】
リンカーＸとしては、例えば、２価の炭化水素基、カルボニル基、これらが２以上結合した基、又はこれらの１又は２以上の基と１又は２以上の連結基とが結合した２価の基が挙げられる。２価の炭化水素基としては、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、トリメチレン、テトラメチレン、２−メチルトリメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、オクタメチレン、デカメチレン基等のアルキレン基（例えば、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキレン基）；アルケニレン基（例えば、炭素数２〜２０、好ましくは２〜１０、さらに好ましくは２〜５のアルキレン基）；シクロペンチレン、シクロへキシレン基等のシクロアルキレン基などの２価の脂環式炭化水素基；これらが２以上結合した基などが挙げられる。
【００２３】
連結基としては、例えば、エーテル結合（−Ｏ−）、チオエーテル結合（−Ｓ−）、アミン結合（−ＮＲ’−）、カルボニル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−）、エステル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、シリル結合（−Ｓｉ−）、カーボネート結合、アミド結合、尿素結合、ウレタン結合等が挙げられる。Ｒ’は水素原子又はアルキル基（例えば、炭素数１〜４のアルキル基等）を示す。
【００２４】
好ましいＸとしては、例えば、カルボニル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−）を末端（ＧＬ側）に有するメチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、２−メチルトリメチレン基等の２価の炭化水素基（アルキレン基等）などを挙げることができる。Ｒがカルボキシル基である場合には、Ｘとして、カルボニル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−）を末端（ＧＬ側）に有する分岐鎖状のアルキレン基（特に、２−メチルトリメチレン基）が好ましい。
【００２５】
Ｒが（ii）の場合、Ｒにおける炭素数８以上のアルキルカルバモイル基としては、例えば、オクチルカルバモイル、イソオクチルカルバモイル、ノニルカルバモイル、イソノニルカルバモイル、デシルカルバモイル、ドデシルカルバモイル基などの炭素数８〜２０（好ましくは、炭素数８〜１５）の直鎖状又は分岐鎖状のアルキルカルバモイル基（アルキルアミド基）などが挙げられる。
【００２６】
Ｒが（ii）の場合、Ｒとして、分岐鎖状のアルキルカルバモイル基と直鎖状のアルキルカルバモイル基の両者が存在するのが好ましい。この場合、分岐鎖状のアルキルカルバモイル基と直鎖状のアルキルカルバモイル基の存在比（割合）は、例えば、前者／後者（モル比）＝１／９９〜９９／１、好ましくは５／９５〜９５／５、さらに好ましくは１０／９０〜９０／１０、特に好ましくは２０／８０〜８５／１５である。分岐鎖状のアルキルカルバモイル基としては、特にイソプロピルカルバモイル基が好ましい。
【００２７】
Ｒが（ii）の場合であって、Ｒの１つがイソプロピルカルバモイル基の場合、イソプロピルカルバモイル基と他のアルキルカルバモイル基（炭素数８以上のアルキルカルバモイル基）の存在比（割合）は、前者／後者（モル比）は、例えば５０／５０〜９９／１、好ましくは５０／５０〜９０／１０、さらに好ましくは６０／４０〜８５／１５である。
【００２８】
本発明のポリグリシドール誘導体のうち、式（ａ）中のＲがカルボキシル基であるポリマーは、例えば、ポリグリセリンに酸無水物を反応させることにより製造できる。
【００２９】
酸無水物としては、例えば、無水シュウ酸、無水マロン酸、無水コハク酸、無水グルタル酸、３−メチルグルタル酸無水物、無水アジピン酸などの飽和脂肪族ジカルボン酸無水物（例えば、炭素数２〜１０の飽和脂肪族ジカルボン酸無水物等）；１，２−シクロペンタンジカルボン酸無水物、１，２−シクロヘキサンジカルボン酸無水物などの脂環式ジカルボン酸無水物などが挙げられる。
【００３０】
上記反応は、溶媒の存在下又は非存在下で行われる。溶媒としては、反応条件下で不活性なものであればよく、例えば、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸；アセトニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリルなどのニトリル類；ホルムアミド、アセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）などのアミド類；ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロドデカンなどの脂肪族炭化水素；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素；クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、四塩化炭素、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼンなどのハロゲン化炭化水素；ニトロベンゼン、ニトロメタン、ニトロエタンなどのニトロ化合物；酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル類；ヘキサフルオロイソプロピルアルコール、トリフルオロエタノール等のフッ素系アルコール；およびこれらの混合溶媒などが挙げられる。後述の塩基を溶媒として用いてもよい。
【００３１】
反応には、必要に応じて、塩基（トリエチルアミン等のアミン、ピリジン等の含窒素芳香族複素環化合物）、酸、縮合剤、触媒（塩化リチウム等のアルカリ金属塩等）などを用いてもよい。
【００３２】
反応温度は、反応の種類、使用する化合物の種類や、溶媒等の種類により適宜選択でき、特に制限されない。例えば、０〜２５０℃程度、好ましくは２５〜１５０℃程度、さらに好ましくは５０〜１５０℃程度である。反応の種類によっては室温付近で円滑に反応が進行する場合もある。反応は、窒素やアルゴンなどの不活性ガス雰囲気下で行ってもよく、空気雰囲気下又は酸素雰囲気下で行うことも可能である。反応生成物の精製は、晶析、沈殿、カラムクロマトグラフィー等の慣用の方法で行うことができる。
【００３３】
本発明のポリグリシドール誘導体のうち、式（ａ）中のＲが２種以上のアルキルカルバモイル基であるポリマーは、例えば、前記の方法により得られた式（ａ）中のＲがカルボキシル基であるポリマーに、アルキルカルバモイル基に対応するアミンを反応させることにより製造できる。
【００３４】
アミンとしては、例えば、イソプロピルアミン、オクチルアミン、ノニルアミン、デシルアミン、ドデシルアミンなどが挙げられる。
【００３５】
式（ａ）中のＲがカルボキシル基であるポリマーとアミンとの反応は、溶媒の存在下又は非存在下で行われる。溶媒としては、反応条件下で不活性なものであればよく、例えば、ＮＭＰ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、その他前記例示の溶媒などを使用できる。反応には、必要に応じて、縮合剤、触媒などを用いてもよい。縮合剤として、例えば、ＤＭＴ−ＭＭ［４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルフォリニウム クロリド ］、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）などが挙げられる。反応温度は、例えば、−１０℃〜１５０℃、好ましくは０〜６０℃程度である。反応は、窒素やアルゴンなどの不活性ガス雰囲気下で行うのが好ましい。また、遮光条件下で行うことが望ましい。反応生成物の精製は、晶析、沈殿、カラムクロマトグラフィー等の慣用の方法で行うことができる。
【００３６】
本発明のポリグリシドール誘導体のうち、式（ａ）中のＲがカルボキシル基であるポリマー［（ｉ）の場合］においては、ポリグリセリンの水酸基への−Ｘ−Ｒの導入率は、例えば１０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上である。
【００３７】
また、本発明のポリグリシドール誘導体のうち、式（ａ）中のＲが２種以上のアルキルカルバモイル基であるポリマー［（ii）の場合］においては、Ｒがアルキルカルバモイル基である式（ａ）の単位の割合は、ポリマーを構成する全繰り返し単位に対して、例えば１０％以上、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上である。この場合、Ｒがカルボキシル基である式（ａ）の単位が存在していてもよく、例えば、該単位は、ポリマーを構成する全繰り返し単位に対して、０〜９０％、好ましくは０〜８０％、さらに好ましくは０〜７０％、特に０〜５０％程度であってもよい。
【００３８】
［複合薬物担体］
本発明の複合薬物担体は、前記本発明のポリグリシドール誘導体と脂質膜を有する担体粒子とで構成されている。この複合薬物担体は、診断及び／又は治療のための薬物が内包されていてもよい。ポリグリシドール誘導体が前記式（ａ）中のＲがカルボキシル基であるポリマーの場合には、薬物を内包した複合薬物担体は、ｐＨ感受性薬剤放出システムを構成する。また、ポリグリシドール誘導体が前記式（ａ）中のＲが２種以上のアルキルカルバモイル基（アルキルアミド基）であるポリマーの場合には、薬物を内包した複合薬物担体は、ｐＨ及び温度感受性薬剤放出システムを構成する。
【００３９】
前記脂質膜を有する担体粒子としては、特に制限されないが、特にその内部に薬物を高濃度封入できる潜在的機能を有する、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソーム及びエマルジョンからなる群より選択された少なくとも１種の形態であるのが好ましい。
【００４０】
上記薬物（薬剤）としては、親水性薬剤、脂溶性薬剤（疎水性薬剤）の何れであってもよい。親水性薬剤を使用する場合は、複合薬物担体内部の閉鎖空間の親水性領域に封入され、脂溶性薬剤を使用する場合は、複合薬物担体の疎水性部分に担持される。また、薬剤としては特に限定されないが、温熱療法と併用される抗ガン剤、抗炎症剤などが挙げられる。抗ガン剤などは過剰量使用することにより引き起こされる重篤な副作用が問題となるが、本発明におけるｐＨ（又は、ｐＨ及び温度）感受性薬剤放出システムを利用すると、標的とする細胞のみに特異的に抗ガン剤を作用させることができ、効果的な治療を行うことができ、さらに、抗ガン剤による副作用を最小に留めることができる。
【００４１】
上記抗ガン剤としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、テチラプラチン、イプロプラチンなどの金属錯体；アドリアマイシン、マイトマイシン、アクチノマイシン、アンサマイトシン、ブレオマイシン、シタラビン、バウノマイシンなどの制ガン抗生物質；５−フルオロウラシル、メトトレキセート、ＴＡＣ−７８８などの代謝拮抗剤；ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵなどのアルキル化剤；インターフェロン−α、β、又はγ、各種インターロイキンなどのリンホカインなどが挙げられる。また、抗炎症剤としては、例えば、プレドニゾロン、ベタメタゾン、ベタメタゾン・ｄ−マレイン酸クロルフェニラミンなどが挙げられる。
【００４２】
上記の薬剤には疾患治療のための遺伝子も含まれる。このような遺伝子としては、例えば、重症複合型免疫不全症の治療のためのアデノシンデアミナーゼ遺伝子、家族性高コレステロール血症の治療のためのＬＤＬ受容体遺伝子、ガン治療のためのインターフェロン−α、β、又はγ遺伝子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子、各種インターロイキン遺伝子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α遺伝子、リンホトキシン（ＬＴ）−β遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）遺伝子、Ｔ細胞活性化共刺激因子遺伝子などが挙げられる。その他、アルツハイマー病、脊椎損傷、パーキンソン病、動脈硬化症、糖尿病、高血圧症などの治療のための遺伝子も挙げられる。
【００４３】
薬物としては、抗ガン剤、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子及びその類縁体からなる群より選択された少なくとも１種であるのが好ましい。
【００４４】
薬物（薬剤）の量は特に限定されず、薬物（薬剤）の種類などにより適宜選択できる。
【００４５】
ｐＨ（又は、ｐＨ及び温度）温度感受性薬剤放出システムは、上記薬剤以外に少なくとも１種の医薬添加剤を含有することが好ましい。医薬添加剤としては、ｐＨ（又は、ｐＨ及び温度）感受性薬剤放出システムの剤型に対応する公知慣用の医薬添加剤を使用することができ、例えば、ｐＨ（又は、ｐＨ及び温度）感受性薬剤放出システムが液体製剤である場合、例えば、生理食塩水、滅菌水、緩衝液などの担体；コレステロールなどの膜安定化剤；塩化ナトリウム、グルコース、グリセリンなどの等張化剤；トコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなどの抗酸化剤；クロルブタノール、パラベンなどの防腐剤などが挙げられる。上記担体はｐＨ（ｐＨ及び温度）感受性薬剤放出システムを製造する際に溶媒として使用することができる。
【００４６】
ｐＨ（又は、ｐＨ及び温度）感受性薬剤放出システムが固形製剤である場合、例えば、担体（例えば、乳糖、ショ糖などの糖類；トウモロコシデンプンのようなデンプン類；結晶セルロースのようなセルロース類；アラビアゴム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールなど）、結合剤（例えば、マンニトール、ショ糖のような糖類、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、崩壊剤（例えば、馬鈴薯デンプンのようなデンプン類、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース類、架橋ポリビニルピロリドンなど）、着色剤、矯味矯臭剤などが挙げられる。
【００４７】
薬物を内包した複合薬物担体［ｐＨ（又は、ｐＨ及び温度）感受性薬剤放出システム］は、例えば次のようにして製造することができる。すなわち、まず、フラスコ内に、リン脂質等の担体膜構成材料を、クロロホルム等の有機溶媒に溶かし、有機溶媒を留去後、真空乾燥することにより、フラスコ内壁に薄膜を形成させる。次に、該フラスコ内に薬物の水溶液を加え、超音波照射を行い、薄膜を剥がす。凍結−融解を数回繰り返し、エクストルーダーにより膜を通して粒径を揃え、カラムにより遊離の薬物を除去し、ポリマー未修飾のリポソーム溶液等を調製する。一方、ポリグリシドール誘導体のバッファー溶液（ポリマー溶液）を調製する。調製したリポソーム溶液等とポリマー溶液とバッファーとを混合して、リポソーム等をポリマー（ポリグリシドール誘導体）で修飾する。
【００４８】
複合薬物担体［ｐＨ（又は、ｐＨ及び温度）感受性薬剤放出システム］を使用して、例えば抗ガン剤を標的とする細胞に送達するメカニズムとしては、次のようなことが考えられる。ガン細胞周辺の微小血管には２００ｎｍ程度の穴が多く存在している。一方、正常な細胞周辺の微小血管にはこのような穴が存在しないので、正常な細胞周辺では抗ガン剤封入複合薬物担体が血管から漏れ出すことはない。よって、抗ガン剤を封入した複合薬物担体の粒径を２００ｎｍ程度とすることにより、該複合薬物担体は標的とするガン細胞付近で微小血管から漏れ出して、ガン細胞に到達することができる。このようにして、抗ガン剤封入複合薬物担体は、標的とするガン細胞周辺部位に特異的に、且つ、高濃度で蓄積することができる。
【００４９】
本発明に係る複合薬物担体においては、粒径を２００ｎｍ程度とすることが好ましく、例えば、封入される薬物量が複合薬物担体中のポリグリシドール誘導体の量に対して０．１〜３０モル％、好ましくは１〜６モル％とすることで、粒径を２００ｎｍ程度とすることができる。
【００５０】
本発明に係る複合薬物担体は、経口、非経口経路の何れによっても投与することができるが、例えば、薬物として抗ガン剤を封入する場合は、非経口経路で投与（特に、経静脈投与）することが好ましい。また、本発明に係る複合薬物担体は、親油性の薬剤を封入することで、肝臓において親油性薬剤が代謝されることを抑制することができ、それにより、血中滞留時間が高められるため、長時間の持続投与、例えば静脈内への持続点滴など特殊な投与技術や器具・装置の使用しなくとも、例えば、ワンショット投与しても血中から速やかに消失或いは排出されることがなく、目的とする治療効果を得ることができる。さらに、目的とする治療効果を得るために大量投与する必要がなく、これにより予期せぬ副作用の発生を最小に留めることができる。
【００５１】
また、本発明に係る複合薬物担体の投与対象としては、哺乳動物が好ましく、特にヒトに対して好適に使用することができる。
【００５２】
本発明に係る複合薬物担体は、ｐＨ感受性を有しており、例えば、ｐＨ７以上では５０℃以上の高温で加熱しなければ封入された薬剤の放出が引き起こされないが、一方、ｐＨ７未満では４０〜４５℃で加熱することで、速やかに封入された薬剤を放出することができる。そして、正常細胞がｐＨ７．４付近であるのに対して、ガン細胞はｐＨ６．８程度の酸性に傾く傾向があるため、たとえ正常細胞に複合薬物担体が到達したとしても、４０〜４５℃に加熱することでは封入された薬剤の放出が引き起こされないため、より特異的にガン細胞に薬剤を作用させることができ、正常細胞が抗ガン剤により損傷を受ける可能性をより低減することができる。
【００５３】
本発明において、ポリグリシドール誘導体が前記式（ａ）中のＲが２種以上のアルキルカルバモイル基（アルキルアミド基）であるポリマーの場合[（ii）の場合]には、ｐＨ感受性だけでなく、温度感受性をも有する。この場合、例えば、標的とする患部を４０℃以上、好ましくは４０〜４５℃付近の温度に加熱することにより、患部に到達した複合薬物担体を構成するポリマーを相転移させて、封入された薬剤を放出させることができる。患部を加熱する方法としては、通常の温熱療法で使用される方法を採用することができ、例えば、ホットバック、気泡浴のように加湿された空気，温水を介して熱を伝える湿熱式方法、赤外線、乾式パックのように乾燥した空気を介する感熱式方法、レーザー、マイクロ波のような電磁波、超音波などの電気エネルギー、物理的振動が体内で熱に変わる転換熱式方法などが挙げられる。
【００５４】
本発明に係る複合薬物担体は、食品添加物として認められている安価な脂肪酸エステルによって形成されるため生体適合性に優れ、コストを削減することができ、安価に提供することができる。また、血中滞留時間が長く、ｐＨ感受性（又は、ｐＨ感受性及び温度感受性）を有するため、より的確に標的とする細胞のみに薬剤を到達させることができ、優れた治療効果を発揮することができ、副作用の発現を最小に留めることができる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。なお、実施例において原料として用いた高分岐ポリグリセリンは、水酸基の５０％以上が１級水酸基である。
【００５６】
実施例１
（カルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
高分岐ポリ（デカ）グリセリン（商品名「ＰＧＬ１０ＰＳ」、ダイセル化学工業社製）５．６１ｇをピリジン６０ｍＬに溶解させ、これに、塩化リチウム（触媒）１．２ｇ及び３−メチルグルタル酸無水物３．４１ｇ（ポリグリセリンの水酸基に対して３当量）を加え、アルゴン雰囲気下、１１５℃で２４時間還流した。ロータリーエバポレーターによってピリジンを減圧留去した後、炭酸水素ナトリウム水溶液によって中和し、３日間透析することで未反応の酸無水物等を除去し、凍結乾燥して白色固体（ＭＧｕ−ＨＰＧ１０）を得た。化合物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）により行った（図１）。
【００５７】
実施例２
（カルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
高分岐ポリ（２０）グリセリン（商品名「ＰＧＬ２０Ｐ」、ダイセル化学工業社製） ６．２３ｇをピリジン６０ｍＬに溶解させ、これに、塩化リチウム（触媒）１．２ｇ及び３−メチルグルタル酸無水物３．５１ｇ（ポリグリセリンの水酸基に対して３当量）を加え、アルゴン雰囲気下、１１５℃で２４時間還流した。ロータリーエバポレーターによってピリジンを減圧留去した後、炭酸水素ナトリウム水溶液によって中和し、３日間透析することで未反応の酸無水物等を除去し、凍結乾燥して白色固体（ＭＧｕ−ＨＰＧ２０）を得た。化合物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）により行った（図２）。
【００５８】
実施例３
（カルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
高分岐ポリ（４０）グリセリン（商品名「ＰＧＬＸＰ」、ダイセル化学工業社製）６．５４ｇをピリジン６０ｍＬに溶解させ、これに、塩化リチウム（触媒）１．２ｇ及び３−メチルグルタル酸無水物３．５４ｇ（ポリグリセリンの水酸基に対して３当量）を加え、アルゴン雰囲気下、１１５℃で２４時間還流した。ロータリーエバポレーターによってピリジンを減圧留去した後、炭酸水素ナトリウム水溶液によって中和し、３日間透析することで未反応の酸無水物等を除去し、凍結乾燥して白色固体（ＭＧｕ−ＨＰＧ４０）を得た。化合物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）により行った（図３）。
【００５９】
実施例４
（カルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
高分岐ポリ（６０）グリセリン（商品名「ＰＧＬ６０Ｐ」、ダイセル化学工業社製）５．６６ｇをピリジン６０ｍＬに溶解させ、これに、塩化リチウム（触媒）１．２ｇ及び３−メチルグルタル酸無水物３．０２ｇ（ポリグリセリンの水酸基に対して３当量）を加え、アルゴン雰囲気下、１１５℃で２４時間還流した。ロータリーエバポレーターによってピリジンを減圧留去した後、炭酸水素ナトリウム水溶液によって中和し、３日間透析することで未反応の酸無水物等を除去し、凍結乾燥して白色固体（ＭＧｕ−ＨＰＧ６０）を得た。化合物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）により行った（図４）。
【００６０】
実施例５
（カルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
高分岐ポリ（８０）グリセリン（商品名「ＨＰＧ８０」、ダイセル化学工業社製）５．７８ｇをピリジン６０ｍＬに溶解させ、これに、塩化リチウム（触媒）１．２ｇ及び３−メチルグルタル酸無水物３．０６ｇ（ポリグリセリンの水酸基に対して３当量）を加え、アルゴン雰囲気下、１１５℃で２４時間還流した。ロータリーエバポレーターによってピリジンを減圧留去した後、炭酸水素ナトリウム水溶液によって中和し、３日間透析することで未反応の酸無水物等を除去し、凍結乾燥して白色固体（ＭＧｕ−ＨＰＧ８０）を得た。化合物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）により行った（図５）。
【００６１】
比較例１
（カルボン酸末端低分岐ポリグリセリンの製造）
低分岐ポリ（１０）グリセリン（商品名「ポリグリセリン＃７５０」、坂本薬品工業社製）５．４３ｇをピリジン６０ｍＬに溶解させ、これに、塩化リチウム（触媒）１．２ｇ及び３−メチルグルタル酸無水物３．３０ｇ（ポリグリセリンの水酸基に対して３当量）を加え、アルゴン雰囲気下、１１５℃で２４時間還流した。ロータリーエバポレーターによってピリジンを減圧留去した後、炭酸水素ナトリウム水溶液によって中和し、３日間透析することで未反応の酸無水物等を除去し、凍結乾燥して白色固体（ＭＧｕ−ＬＰＧ）を得た。化合物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）により行った（図６）。なお、比較例１において原料として用いた高分岐ポリグリセリンでは、全水酸基のうち１級水酸基は５０％未満である。
【００６２】
＜水酸基残存率とカルボン酸導入率の算出＞
実施例１〜５、及び比較例１で得られたカルボン酸末端ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）における水酸基残存率とカルボン酸導入率を以下の方法により求めた。図７はポリグリシドール誘導体における水酸基残存率とカルボン酸導入率の算出法を示す図である。この1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、グリシドール部位（水酸基を有する繰り返し構造単位）、カルボキシル部位（カルボキシル基を有する繰り返し構造単位）の組成比をそれぞれ、ｘ、ｙとする。主鎖由来のプロトンのピークの多くはａの位置に出現するが、カルボキシル基が修飾されたユニットの元水酸基隣のプロトンは高磁場シフトするためｂの位置に出現する（各５Ｈ分）。まず、主鎖部分由来のプロトンのシグナルの積分比より（１）式が成り立つ。
５ｘ＋５ｙ＝７６．１８１４ （１）
次に、カルボキシル基側鎖由来のメチレン・メチンプロトンはｃの位置に、メチルプロトンはｄの位置にピークが出現する（合計８Ｈ）。従って、（２）式のようになる。
８ｙ＝１２０．３７８１ （２）
（２）式よりｙの値を求め、それを（１）式に代入することで、ｘとｙの比が求まるため、それを１００分率に計算し直すことで、水酸基残存率、カルボキシル基導入率を求めることができる。
その結果、ＭＧｕ−ＨＰＧ１０（実施例１）、ＭＧｕ−ＨＰＧ２０（実施例２）、ＭＧｕ−ＨＰＧ４０（実施例３）、ＭＧｕ−ＨＰＧ８０（実施例５）及びＭＧｕ−ＬＰＧ（比較例１）については、いずれも、水酸基残存率は０％、カルボン酸導入率は１００％であった。ＭＧｕ−ＨＰＧ６０（実施例４）については、水酸基残存率は４．８％、カルボン酸導入率は９５．２％であった。
【００６３】
製造例１
（サクシニル化ポリグリセリンの製造）
高分岐ポリ（４０）グリセリン（重合度４０；商品名「ＰＧＬＸＰ」、ダイセル化学工業社製）５．６６ｇ、無水コハク酸２３．８ｇ、ピリジン６０ｍｌを混合させ、ポリグリセロールを溶解させた。次に還流管を用いて、還流が開始したのを確認した後、アルミホイルで遮光し、７時間加熱撹拌を行った。放冷、冷蔵保存後、溶液は黒紫色で、紫色の固体が析出した。減圧濾過により析出した固体を取り除いた後、エバポレーションによりピリジンを留去した。ジエチルエーテルとメタノールによる再沈殿後、得られた赤茶色の粘性固体をメタノールで溶かし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（展開溶媒：メタノール）により精製した。溶液を回収した後、エバポレーションによりメタノールを留去して得られた淡黄色の粘性の高い固体に、水を適量加えてエバポレーションする操作を６回繰り返した後、凍結乾燥を行った。この生成物（サクシニル化ポリグリセリン；Ｓｕｃ−ＰＧ）を1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）により解析した結果を図８に示す。収量９．７ｇ、収率７１．１％。
【００６４】
実施例６
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
Ｓｕｃ−ＰＧ０．２８５ｇをＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）４ｍｌに超音波照射を用いて溶解させた後、ＤＭＴ−ＭＭ［４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルフォリニウム クロリド ］０．５４７ｇ（１．２ｅｑ）を加え、さらにＩＰＡ（イソプロピルアミン）２．３３ＭのＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）溶液を４９５μｌ（０．７ｅｑ）加えて、Ａｒ封入後、遮光撹拌し、一日放置した。白濁していた溶液は一日後、黄濁色になっていた。ＮＭＰ１ｍｌで希釈したＤＡ（デシルアミン）を３２μｌ（０．１ｅｑ）加え、Ａｒ封入後、遮光撹拌し、三日間放置した。三日後、溶液の色は濃くなっていた。三日後、この反応溶液を水と酢酸水溶液で再沈殿し、ジエチルエーテルを用いて洗浄した。遠心分離で沈殿物を取り除いた後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（展開溶媒：メタノール）により精製した。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図９に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）及びデシルアミド（デシルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、それぞれ、６４．６％、１０．３％であった。
【００６５】
実施例７
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）を０．６ｅｑ、ＤＡ（デシルアミン）を０．１ｅｑ用いた以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図９に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）及びデシルアミド（デシルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、それぞれ、５６．４％、１０．７％であった。
【００６６】
実施例８
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）を０．８ｅｑ、ＤＡ（デシルアミン）を０．１ｅｑ用いた以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図９に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）及びデシルアミド（デシルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、それぞれ、７３．４％、１０．５％であった。
【００６７】
実施例９
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）を０．４ｅｑ、ＤＡ（デシルアミン）を０．１ｅｑ用いた以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図９に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）及びデシルアミド（デシルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、それぞれ、３４．９％、９．７６％であった。
【００６８】
実施例１０
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）を０．９ｅｑ、ＤＡ（デシルアミン）を０．１ｅｑ用いた以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図９に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）及びデシルアミド（デシルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、それぞれ、８２．６％、１０．５％であった。
【００６９】
実施例１１
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）を０．５ｅｑ、ＤＡ（デシルアミン）を０．１ｅｑ用いた以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図９に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）及びデシルアミド（デシルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、それぞれ、４５．７％、１０．１％であった。
【００７０】
なお、図９におけるスペクトルは、上から、実施例１０、実施例８、実施例６、実施例７、実施例１１、実施例９の順に記載されている。
【００７１】
比較例２
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）を０．７ｅｑ用い、ＤＡ（デシルアミン）は用いなかった以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図１０に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、６３．８％であった。
【００７２】
比較例３
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）を０．６ｅｑ用い、ＤＡ（デシルアミン）は用いなかった以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図１１に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、５６．５％であった。
【００７３】
比較例４
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）は用いず、ＤＡ（デシルアミン）を０．１ｅｑ用いた以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図１２に示す。ポリマー中のデシルアミド（デシルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、１１．１％であった。
【００７４】
調製例１
（１）パイラニン（ｐｙｒａｎｉｎｅ；蛍光物質）水溶液の調製
ｐｙｒａｎｉｎｅ３８ｍｇ、ＤＰＸ４３ｍｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4１４ｍｇを、全量が２ｍｌになるように１Ｎ ＨＣｌとイオン交換水を用いてｐＨ７．４、ｐｙｒａｎｉｎｅ３５ｍＭ、ＤＰＸ５０ｍＭ、Ｎａ2ＨＰＯ4５０ｍＭのｐｙｒａｎｉｎｅ水溶液を調製した。
（２）ポリマー修飾リポソームの調製
１．ポリマー未修飾ｐｙｒａｎｉｎ内包リポソームの調製
ＥＹＰＣ（卵黄フォスファチジルコリン）１２ｍｇ／ｍｌのクロロホルム溶液２ｍｌを１０ｍｌのナスフラスコにとり、エバポレーションして薄膜を形成させた後、４時間、真空乾燥を行うことにより、残留溶媒を取り除いた。乾燥後、ｐＨを７．４に調整したｐｙｒａｎｉｎｅ水溶液（ｐｙｒａｎｉｎ３５ｍＭ、ＤＰＸ５０ｍＭ、Ｎａ2ＨＰＯ4５０ｍＭ）を１７００μｌ加えて、超音波照射を１０ｍｉｎ行い、薄膜を剥がした。凍結−融解を５回行った後、エクストルーダーにより１００ｎｍのポリカーボネート膜に通した。エクストルーダーにより粒径を揃えた後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ２５ｍＭ，ｓａｌｉｎｅ１５０ｍＭ；ｐＨ７．４）で平衡化したセファロース４Ｂカラムによりｆｒｅｅのｐｙｒａｎｉｎを除いた。和光リン脂質Ｃ−テストワコーにより脂質濃度を測定した。
２．各種ポリマー水溶液の調製
実施例及び比較例で合成した各種のポリマーを、イオン交換水、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＣｌ、１Ｎ ＮａＯＨを用いて溶解させ、ポリマー濃度が１０ｍｇ／ｍｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4の濃度が２５ｍＭ、ＮａＣｌの濃度が１５０ｍＭ、ｐＨがｐＨ７．４となるようなポリマー水溶液をそれぞれ調製した。
３．各種ポリマーのリポソームへの修飾
調製したリポソーム溶液、ポリマー水溶液、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ２５ｍＭ、ｓａｌｉｎｅ１５０ｍＭ；ｐＨ７．４）を、脂質濃度が１．２５ｍＭ、ポリマー濃度が３．１３ｍｇ／ｍｌになるように混合し、１時間、ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎすることによりリポソームに修飾した。
なお、実施例１〜５、比較例１で得られたポリマーについては、蛍光物質パイラニン（ｐｙｒａｎｉｎｅ）を内包した卵黄フォスファチジルコリン（ＥＹＰＣ）リポソーム（２×１０-5Ｍ）を含む種々ｐＨのＭＥＳバッファー（２５ｍＭ ＭＥＳ，１２５ｍＭ ＮａＣｌ）に実施例１〜５、及び比較例１で得られた各カルボン酸末端ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）（１０ｍｇ／ｍＬ）を２５μＬ添加し、全量を２．５ｍＬとした。
４．精製
リポソームに修飾されていないポリマーを除くために、分画数１２００−１６０００ の透析膜を用いて外相ｐＨ７．４のＰＢＳに対して透析を一日間行った。
【００７５】
＜ｐＨ感受性評価試験（実施例１〜５、比較例１）＞
実施例１〜５、比較例１で得られたポリマーについて、上記で得られた溶液の励起波長４１６ｎｍ、蛍光波長５１２ｎｍにおける蛍光強度の経時変化を測定した。Ｐｙｒａｎｉｎｅはリポソーム内部ではＤＰＸにより消光されているが、リポソームから放出されると励起され蛍光を発する。その結果を図１３に示す。図中のプロットは３０分後の値を示している。
【００７６】
リニア型のＭＧｕ−ＬＰＧ（比較例１）を用いたものは、ｐＨ７からｐＨ５．５にかけてｐＨの低下とともにリポソームからのパイラニンの放出を促進した。しかし、多分岐型（高分岐型）のＭＧｌｕ−ＨＰＧ（実施例１〜５）を用いたものは、より狭いｐＨ領域において急激に内包物の放出を引き起こした。また、主鎖の重合度が増加すると応答するｐＨが高くなった。このようにポリマーの主鎖構造を多分岐型にすることで鋭敏なｐＨ応答性高分子が得られることがわかった。
【００７７】
＜ｐＨおよび温度感受性評価（実施例６、８、９、１１、比較例４）＞
蛍光セルに各種ｐＨに調整したＰＢＳ ２４９５μｌを入れ、一定の各種温度にしてオートゼロした後、上記で得られたポリマー修飾リポソーム（脂質濃度１．２５ｍＭ、ポリマー濃度３．１３ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ加えてｐｙｒａｎｉｎｅ（励起波長４１６ｎｍ， 蛍光波長５１２ｎｍ）の蛍光強度の経時変化を測定した。ポリマー修飾リポソームからのｐｙｒａｎｉｎｅ放出に及ぼすｐＨと温度の影響を検討した。その結果を図１４〜図１８に示す。図１４は比較例４で得られたポリマーで修飾したリポソーム、図１５は実施例９で得られたポリマーで修飾したリポソーム、図１６は実施例１１で得られたポリマーで修飾したリポソーム、図１７は実施例６で得られたポリマーで修飾したリポソーム、図１８は実施例８で得られたポリマーで修飾したリポソームのそれぞれの評価結果を示すグラフである。
【００７８】
１種類の直鎖のアルキルカルバモイル基（アルキルアミド基）を有するポリグリシドール誘導体で修飾されたリポソームでは、ｐＨが同じ場合には、薬物の放出率は温度によりさほど変化しない。これに対し、２種類のアルキルカルバモイル基（アルキルアミド基）を有するポリグリシドール誘導体で修飾されたリポソームでは、薬物の放出率はｐＨにより変化するだけでなく、ｐＨが同じ場合であっても、温度により大きく変化し、２種のポリグリシドール誘導体の比率を調整することで、ｐＨ応答性と温度応答性を調整することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
これまで癌を標的としたＤＤＳの開発は様々な研究者によって多くの研究がなされているが、実用化されているＤＤＳ材料は少ない。その理由としては、ＤＤＳ材料の安全性の検証に時間がかかることであった。したがって、材料として高機能を有するものでも、安全性が確立されていない合成化合物の実用化は容易ではなく、また総じて高価であるという問題があった。本研究において骨格に用いたポリグリセリンは比較的安価であるだけではなく、生体適合性に優れていることは既にこの基材を用いた脂肪酸エステルが食品添加物として認められている事からも明らかである。即ち、本研究の材料を用いる事で、ＤＤＳ材料として安価かつ安全性に優れた温度応答性ＤＤＳの設計が行え、人々を未だ苦しめてやまない癌等の疾患への治療に貢献できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病巣部位を確実にターゲッティングして、目的病巣部位の細胞内に薬物を安全にかつ効率良く送達するドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）として有用な、特に遺伝子の細胞伝達・発現に実用的な複合薬物担体と、該複合薬物担体の調製に用いられるポリグリシドール誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤、ＤＮＡ（遺伝子）、ペプチドあるいはタンパク質などの治療及び／又は診断のための薬物投与において、薬効を最大限に引き出すためには、癌、リンパ腫、肺炎、肝炎、腎炎、血管内皮損傷部位などの病巣部位を確実にターゲッティングし、薬物を安全にかつ効率良く送達するために、薬物送達の正確なコントロールが望まれる。近年、このようなドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）における運搬体（担体）として、リポソーム、エマルジョン、リピッドマイクロスフェアなどの閉鎖小胞を応用しようとする研究が盛んに行われている。
【０００３】
一方で各種刺激応答性デンドリマー化合物は、上記のような市場要求事項を満足できるＤＤＳ基材として注目されている。即ち、刺激応答性能として簡便な、光、ｐＨ、温度が付与されたデンドリマー化合物が検討されて来ている（非特許文献１）。中でもｐＨ応答性リポソームは、細胞内に取り込まれると弱酸性のエンドソームと融合することで、内包物をサイトゾルに移行させることから、細胞内デリバリーシステムとして有用であると考えられている。効果的な細胞内デリバリーを実現するためには、ｐＨ応答性リポソームは中性で安定に存在し、わずかなｐＨ低下に鋭敏に反応して膜融合性を発現することが求められる。また応答刺激には一般的に有用なものとして光、温度、ｐＨが挙げられるが、中でも温度応答が最も汎用である。そのため、自動的に体内の低ｐＨ部分で放出される薬剤と同時に、人為刺激として温度を用いた薬剤放出を促進する薬剤担体が最も汎用性が高く有用であると考えられる。
【０００４】
しかしながら、現在検討されているｐＨ応答性のリポソームは、そのｐＨ応答性が不十分であるため、実用化に至っていない（特許文献１、２）。また、ｐＨ応答と温度応答の両方を有する薬剤担体あるいはリポソーム誘導体は、研究レベルにおいても存在していなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】河野 健司、児島 千恵著、遺伝子医学ＭＯＯＫ別冊、「絵で見てわかるナノＤＤＳ〜マテリアルから見た治療・診断・予後・予防、ヘルスケア技術の最先端」、ｐ．１０６−１１２（２００７）、メディカルドゥ
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−３５２６１９号公報
【特許文献２】特開２００８−１２０７１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、実用性の高いｐＨ感受性薬物放出剤として用いることのできる複合薬物担体と、該複合薬物担体の調製に用いられる新規なポリグリシドール誘導体を提供することにある。
本発明の他の目的は、実用性の高いｐＨ及び温度感受性薬物放出剤として用いることのできる複合薬物担体と、該複合薬物担体の調製に用いられる新規なポリグリシドール誘導体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、中心部に高分岐ポリグリセリン骨格を有し、末端部にカルボキシル基、または２種以上の異なるアミド基を有する高分子をリポソーム等に適用すると、ｐＨ応答性、又はｐＨ及び温度応答性に優れた薬剤放出システムが得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、水酸基の５０％以上が１級水酸基であるポリグリセリンから誘導されるポリグリシドール誘導体であって、少なくとも下記式（ａ）
【化１】
（式中、ＧＬはグリセリン残基、Ｘはリンカーを示す。Ｒは、（ｉ）カルボキシル基であるか、又は（ii）イソプロピルカルバモイル基又は炭素数８以上のアルキルカルバモイル基であって、これらのアルキルカルバモイル基を２種以上有する）
で表される繰り返し単位を有するポリグリシドール誘導体を提供する。
【００１０】
本発明は、また、前記のポリグリシドール誘導体と脂質膜を有する担体粒子からなる複合薬物担体を提供する。
【００１１】
この複合薬物担体は、さらに、診断及び／又は治療のための薬物が内包されていてもよい。
【００１２】
前記担体粒子は、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソーム及びエマルジョンからなる群より選択された少なくとも１種の形態を取り得る。
【００１３】
前記薬物として、抗ガン剤、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子及びその類縁体からなる群より選択された少なくとも１種の薬物を使用できる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の複合薬物担体によれば、従来のｐＨ感受性リポソームよりもｐＨ感受性が強く、且つデンドリマーを用いた場合よりも極めて安価であり、より実用性に優れたｐＨ感受性薬剤放出システムとして使用できる。例えば、本発明の複合薬物担体を用いると、環境のｐＨ変化差が１．０以下であっても、薬物担体から９０％以上の薬物を放出させることが可能である。
また、本発明の複合薬物担体によれば、従来のリポソームでは持ち得なかったｐＨ応答性と温度応答性とを実現でき、実用性と汎用性に優れたｐＨ及び温度感受性薬剤放出システムとして使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１で得られたカルボン酸末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図２】実施例２で得られたカルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図３】実施例３で得られたカルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図４】実施例４で得られたカルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図５】実施例５で得られたカルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図６】比較例１で得られたカルボン酸末端リニア型ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図７】ポリグリシドール誘導体における水酸基残存率とカルボン酸導入率の算出法を示す図である。
【図８】製造例１で得られたサクシニル化ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図９】実施例６〜１１で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図１０】比較例２で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図１１】比較例３で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図１２】比較例４で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）の1Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示す図である。
【図１３】実施例１〜５、比較例１で得られたポリグリシドール誘導体のｐＨ感受性評価試験の結果を示す図である。
【図１４】比較例４で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）で修飾されたリポソームの薬物放出に及ぼすｐＨと温度の影響を示す図である。縦軸は薬物の放出率（％）、横軸はｐＨを示す。
【図１５】実施例９で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）で修飾されたリポソームの薬物放出に及ぼすｐＨと温度の影響を示す図である。縦軸は薬物の放出率（％）、横軸はｐＨを示す。
【図１６】実施例１１で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）で修飾されたリポソームの薬物放出に及ぼすｐＨと温度の影響を示す図である。縦軸は薬物の放出率（％）、横軸はｐＨを示す。
【図１７】実施例６で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）で修飾されたリポソームの薬物放出に及ぼすｐＨと温度の影響を示す図である。縦軸は薬物の放出率（％）、横軸はｐＨを示す。
【図１８】実施例８で得られたアミド末端ハイパーブランチ（多分岐型）ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）で修飾されたリポソームの薬物放出に及ぼすｐＨと温度の影響を示す図である。縦軸は薬物の放出率（％）、横軸はｐＨを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のポリグリシドール誘導体は、水酸基の５０％以上が１級水酸基であるポリグリセリンから誘導されるポリグリシドール誘導体であって、少なくとも前記式（ａ）で表される繰り返し単位を有する。式（ａ）中、ＧＬはグリセリン残基、Ｘはリンカーを示す。Ｒは、（ｉ）カルボキシル基であるか、又は（ii）イソプロピルカルバモイル基又は炭素数８以上のアルキルカルバモイル基であって、これらのアルキルカルバモイル基を２種以上有する。本発明の複合薬物担体は、上記のポリグリシドール誘導体とリポソーム等の脂質膜を有する担体粒子とで構成される。
【００１７】
上記のポリグリシドール誘導体を用いて複合薬物担体を構成すると、該複合薬物担体は、特定のｐＨ（例えば、ｐＨ７以上）では通常のリポソーム等と同様に水溶性を呈し、薬物（薬剤）が安定に保持され、一方、特定のｐＨ（例えば、ｐＨ６付近）で急激に脂質膜を有する担体粒子が崩壊して、薬物が放出される。複合薬物担体としては、ｐＨ７で３０分間インキュベートした後の当該複合薬物担体からの薬物の放出率が５％以下で、且つｐＨ６で３０分間インキュベートした後の当該複合薬物担体からの薬物の放出率が８５％以上、特に８７％以上であるのが好ましい。なお、式（ａ）において、Ｒがイソプロピルカルバモイル基又は炭素数８以上のアルキルカルバモイル基であって、これらのアルキルカルバモイル基を２種以上有する場合には、複合薬物担体はｐＨ感受性だけでなく、温度感受性をも備える。
【００１８】
本発明において、特定のｐＨで複合薬物担体が崩壊する機構は必ずしも明らかではないが、おそらく、ｐＨが低下すると、増加した系中の水素イオンによって、カルボキシル基部分（カルボン酸部分）、カルバモイル基部分（アミド部分）の水溶性が低下し、リポソーム等の脂質膜を有する担体粒子が構造変化を引き起こすことで崩壊すると考えられる。
【００１９】
ポリグリセリン（ＰＧＬ）は、グリシドールのような重合性グリセリン等価体を原料として合成することができ、ポリグリセリンの分子量としては、例えば１２０〜１２０００程度、好ましくは２４０〜１００００程度、特に好ましくは３５０〜８０００程度である。なお、Ｒの種類によっては（例えば、Ｒがカルボキシル基の場合等）には、ポリグリセリンの分子量は、例えば１２０〜４０００程度（好ましくは２４０〜４０００程度、さらに好ましくは３５０〜４０００程度）であってもよい。ポリグリセリンの分子量が上記の範囲にある場合には、リポソーム崩壊ｐＨを好ましい範囲にすることができる。
【００２０】
また、上記ポリグリセリン（ＰＧＬ）は高分岐構造を有している必要がある。高分岐構造を有することにより、分子内部に空隙が形成され、その空隙中に薬物を保持することができる。高分岐構造はポリグリセリンの水酸基の一級比率により調整することができる。本発明では、ポリグリセリンの水酸基のうち１級水酸基が５０％以上であり、なかでも６０％以上であることが好ましく、特に７０％以上であることが好ましい。本発明においては、ポリグリセリンとして、高分岐ポリ（デカ）グリセリン（商品名「ＰＧＬ１０ＰＳ」、ダイセル化学工業社製）、高分岐ポリ（２０）グリセリン（商品名「ＰＧＬ２０Ｐ」、ダイセル化学工業社製）、高分岐ポリ（４０）グリセリン（商品名「ＰＧＬＸＰ」、ダイセル化学工業社製）、高分岐ポリ（８０）グリセリン（商品名「ＨＰＧ８０」、ダイセル化学工業社製）などの市販品を好適に使用することができる。
【００２１】
前記式（ａ）において、ＧＬ（グリセリン残基）は、下記式（ｂ）、（ｃ）で示される何れかの構造を有する。
【化２】
【００２２】
リンカーＸとしては、例えば、２価の炭化水素基、カルボニル基、これらが２以上結合した基、又はこれらの１又は２以上の基と１又は２以上の連結基とが結合した２価の基が挙げられる。２価の炭化水素基としては、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、トリメチレン、テトラメチレン、２−メチルトリメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、オクタメチレン、デカメチレン基等のアルキレン基（例えば、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキレン基）；アルケニレン基（例えば、炭素数２〜２０、好ましくは２〜１０、さらに好ましくは２〜５のアルキレン基）；シクロペンチレン、シクロへキシレン基等のシクロアルキレン基などの２価の脂環式炭化水素基；これらが２以上結合した基などが挙げられる。
【００２３】
連結基としては、例えば、エーテル結合（−Ｏ−）、チオエーテル結合（−Ｓ−）、アミン結合（−ＮＲ’−）、カルボニル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−）、エステル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、シリル結合（−Ｓｉ−）、カーボネート結合、アミド結合、尿素結合、ウレタン結合等が挙げられる。Ｒ’は水素原子又はアルキル基（例えば、炭素数１〜４のアルキル基等）を示す。
【００２４】
好ましいＸとしては、例えば、カルボニル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−）を末端（ＧＬ側）に有するメチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、２−メチルトリメチレン基等の２価の炭化水素基（アルキレン基等）などを挙げることができる。Ｒがカルボキシル基である場合には、Ｘとして、カルボニル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−）を末端（ＧＬ側）に有する分岐鎖状のアルキレン基（特に、２−メチルトリメチレン基）が好ましい。
【００２５】
Ｒが（ii）の場合、Ｒにおける炭素数８以上のアルキルカルバモイル基としては、例えば、オクチルカルバモイル、イソオクチルカルバモイル、ノニルカルバモイル、イソノニルカルバモイル、デシルカルバモイル、ドデシルカルバモイル基などの炭素数８〜２０（好ましくは、炭素数８〜１５）の直鎖状又は分岐鎖状のアルキルカルバモイル基（アルキルアミド基）などが挙げられる。
【００２６】
Ｒが（ii）の場合、Ｒとして、分岐鎖状のアルキルカルバモイル基と直鎖状のアルキルカルバモイル基の両者が存在するのが好ましい。この場合、分岐鎖状のアルキルカルバモイル基と直鎖状のアルキルカルバモイル基の存在比（割合）は、例えば、前者／後者（モル比）＝１／９９〜９９／１、好ましくは５／９５〜９５／５、さらに好ましくは１０／９０〜９０／１０、特に好ましくは２０／８０〜８５／１５である。分岐鎖状のアルキルカルバモイル基としては、特にイソプロピルカルバモイル基が好ましい。
【００２７】
Ｒが（ii）の場合であって、Ｒの１つがイソプロピルカルバモイル基の場合、イソプロピルカルバモイル基と他のアルキルカルバモイル基（炭素数８以上のアルキルカルバモイル基）の存在比（割合）は、前者／後者（モル比）は、例えば５０／５０〜９９／１、好ましくは５０／５０〜９０／１０、さらに好ましくは６０／４０〜８５／１５である。
【００２８】
本発明のポリグリシドール誘導体のうち、式（ａ）中のＲがカルボキシル基であるポリマーは、例えば、ポリグリセリンに酸無水物を反応させることにより製造できる。
【００２９】
酸無水物としては、例えば、無水シュウ酸、無水マロン酸、無水コハク酸、無水グルタル酸、３−メチルグルタル酸無水物、無水アジピン酸などの飽和脂肪族ジカルボン酸無水物（例えば、炭素数２〜１０の飽和脂肪族ジカルボン酸無水物等）；１，２−シクロペンタンジカルボン酸無水物、１，２−シクロヘキサンジカルボン酸無水物などの脂環式ジカルボン酸無水物などが挙げられる。
【００３０】
上記反応は、溶媒の存在下又は非存在下で行われる。溶媒としては、反応条件下で不活性なものであればよく、例えば、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸；アセトニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリルなどのニトリル類；ホルムアミド、アセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）などのアミド類；ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロドデカンなどの脂肪族炭化水素；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素；クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、四塩化炭素、クロロベンゼン、トリフルオロメチルベンゼンなどのハロゲン化炭化水素；ニトロベンゼン、ニトロメタン、ニトロエタンなどのニトロ化合物；酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル類；ヘキサフルオロイソプロピルアルコール、トリフルオロエタノール等のフッ素系アルコール；およびこれらの混合溶媒などが挙げられる。後述の塩基を溶媒として用いてもよい。
【００３１】
反応には、必要に応じて、塩基（トリエチルアミン等のアミン、ピリジン等の含窒素芳香族複素環化合物）、酸、縮合剤、触媒（塩化リチウム等のアルカリ金属塩等）などを用いてもよい。
【００３２】
反応温度は、反応の種類、使用する化合物の種類や、溶媒等の種類により適宜選択でき、特に制限されない。例えば、０〜２５０℃程度、好ましくは２５〜１５０℃程度、さらに好ましくは５０〜１５０℃程度である。反応の種類によっては室温付近で円滑に反応が進行する場合もある。反応は、窒素やアルゴンなどの不活性ガス雰囲気下で行ってもよく、空気雰囲気下又は酸素雰囲気下で行うことも可能である。反応生成物の精製は、晶析、沈殿、カラムクロマトグラフィー等の慣用の方法で行うことができる。
【００３３】
本発明のポリグリシドール誘導体のうち、式（ａ）中のＲが２種以上のアルキルカルバモイル基であるポリマーは、例えば、前記の方法により得られた式（ａ）中のＲがカルボキシル基であるポリマーに、アルキルカルバモイル基に対応するアミンを反応させることにより製造できる。
【００３４】
アミンとしては、例えば、イソプロピルアミン、オクチルアミン、ノニルアミン、デシルアミン、ドデシルアミンなどが挙げられる。
【００３５】
式（ａ）中のＲがカルボキシル基であるポリマーとアミンとの反応は、溶媒の存在下又は非存在下で行われる。溶媒としては、反応条件下で不活性なものであればよく、例えば、ＮＭＰ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、その他前記例示の溶媒などを使用できる。反応には、必要に応じて、縮合剤、触媒などを用いてもよい。縮合剤として、例えば、ＤＭＴ−ＭＭ［４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルフォリニウム クロリド ］、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）などが挙げられる。反応温度は、例えば、−１０℃〜１５０℃、好ましくは０〜６０℃程度である。反応は、窒素やアルゴンなどの不活性ガス雰囲気下で行うのが好ましい。また、遮光条件下で行うことが望ましい。反応生成物の精製は、晶析、沈殿、カラムクロマトグラフィー等の慣用の方法で行うことができる。
【００３６】
本発明のポリグリシドール誘導体のうち、式（ａ）中のＲがカルボキシル基であるポリマー［（ｉ）の場合］においては、ポリグリセリンの水酸基への−Ｘ−Ｒの導入率は、例えば１０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上である。
【００３７】
また、本発明のポリグリシドール誘導体のうち、式（ａ）中のＲが２種以上のアルキルカルバモイル基であるポリマー［（ii）の場合］においては、Ｒがアルキルカルバモイル基である式（ａ）の単位の割合は、ポリマーを構成する全繰り返し単位に対して、例えば１０％以上、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上である。この場合、Ｒがカルボキシル基である式（ａ）の単位が存在していてもよく、例えば、該単位は、ポリマーを構成する全繰り返し単位に対して、０〜９０％、好ましくは０〜８０％、さらに好ましくは０〜７０％、特に０〜５０％程度であってもよい。
【００３８】
［複合薬物担体］
本発明の複合薬物担体は、前記本発明のポリグリシドール誘導体と脂質膜を有する担体粒子とで構成されている。この複合薬物担体は、診断及び／又は治療のための薬物が内包されていてもよい。ポリグリシドール誘導体が前記式（ａ）中のＲがカルボキシル基であるポリマーの場合には、薬物を内包した複合薬物担体は、ｐＨ感受性薬剤放出システムを構成する。また、ポリグリシドール誘導体が前記式（ａ）中のＲが２種以上のアルキルカルバモイル基（アルキルアミド基）であるポリマーの場合には、薬物を内包した複合薬物担体は、ｐＨ及び温度感受性薬剤放出システムを構成する。
【００３９】
前記脂質膜を有する担体粒子としては、特に制限されないが、特にその内部に薬物を高濃度封入できる潜在的機能を有する、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソーム及びエマルジョンからなる群より選択された少なくとも１種の形態であるのが好ましい。
【００４０】
上記薬物（薬剤）としては、親水性薬剤、脂溶性薬剤（疎水性薬剤）の何れであってもよい。親水性薬剤を使用する場合は、複合薬物担体内部の閉鎖空間の親水性領域に封入され、脂溶性薬剤を使用する場合は、複合薬物担体の疎水性部分に担持される。また、薬剤としては特に限定されないが、温熱療法と併用される抗ガン剤、抗炎症剤などが挙げられる。抗ガン剤などは過剰量使用することにより引き起こされる重篤な副作用が問題となるが、本発明におけるｐＨ（又は、ｐＨ及び温度）感受性薬剤放出システムを利用すると、標的とする細胞のみに特異的に抗ガン剤を作用させることができ、効果的な治療を行うことができ、さらに、抗ガン剤による副作用を最小に留めることができる。
【００４１】
上記抗ガン剤としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、テチラプラチン、イプロプラチンなどの金属錯体；アドリアマイシン、マイトマイシン、アクチノマイシン、アンサマイトシン、ブレオマイシン、シタラビン、バウノマイシンなどの制ガン抗生物質；５−フルオロウラシル、メトトレキセート、ＴＡＣ−７８８などの代謝拮抗剤；ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵなどのアルキル化剤；インターフェロン−α、β、又はγ、各種インターロイキンなどのリンホカインなどが挙げられる。また、抗炎症剤としては、例えば、プレドニゾロン、ベタメタゾン、ベタメタゾン・ｄ−マレイン酸クロルフェニラミンなどが挙げられる。
【００４２】
上記の薬剤には疾患治療のための遺伝子も含まれる。このような遺伝子としては、例えば、重症複合型免疫不全症の治療のためのアデノシンデアミナーゼ遺伝子、家族性高コレステロール血症の治療のためのＬＤＬ受容体遺伝子、ガン治療のためのインターフェロン−α、β、又はγ遺伝子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子、各種インターロイキン遺伝子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α遺伝子、リンホトキシン（ＬＴ）−β遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）遺伝子、Ｔ細胞活性化共刺激因子遺伝子などが挙げられる。その他、アルツハイマー病、脊椎損傷、パーキンソン病、動脈硬化症、糖尿病、高血圧症などの治療のための遺伝子も挙げられる。
【００４３】
薬物としては、抗ガン剤、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子及びその類縁体からなる群より選択された少なくとも１種であるのが好ましい。
【００４４】
薬物（薬剤）の量は特に限定されず、薬物（薬剤）の種類などにより適宜選択できる。
【００４５】
ｐＨ（又は、ｐＨ及び温度）温度感受性薬剤放出システムは、上記薬剤以外に少なくとも１種の医薬添加剤を含有することが好ましい。医薬添加剤としては、ｐＨ（又は、ｐＨ及び温度）感受性薬剤放出システムの剤型に対応する公知慣用の医薬添加剤を使用することができ、例えば、ｐＨ（又は、ｐＨ及び温度）感受性薬剤放出システムが液体製剤である場合、例えば、生理食塩水、滅菌水、緩衝液などの担体；コレステロールなどの膜安定化剤；塩化ナトリウム、グルコース、グリセリンなどの等張化剤；トコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなどの抗酸化剤；クロルブタノール、パラベンなどの防腐剤などが挙げられる。上記担体はｐＨ（ｐＨ及び温度）感受性薬剤放出システムを製造する際に溶媒として使用することができる。
【００４６】
ｐＨ（又は、ｐＨ及び温度）感受性薬剤放出システムが固形製剤である場合、例えば、担体（例えば、乳糖、ショ糖などの糖類；トウモロコシデンプンのようなデンプン類；結晶セルロースのようなセルロース類；アラビアゴム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールなど）、結合剤（例えば、マンニトール、ショ糖のような糖類、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、崩壊剤（例えば、馬鈴薯デンプンのようなデンプン類、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース類、架橋ポリビニルピロリドンなど）、着色剤、矯味矯臭剤などが挙げられる。
【００４７】
薬物を内包した複合薬物担体［ｐＨ（又は、ｐＨ及び温度）感受性薬剤放出システム］は、例えば次のようにして製造することができる。すなわち、まず、フラスコ内に、リン脂質等の担体膜構成材料を、クロロホルム等の有機溶媒に溶かし、有機溶媒を留去後、真空乾燥することにより、フラスコ内壁に薄膜を形成させる。次に、該フラスコ内に薬物の水溶液を加え、超音波照射を行い、薄膜を剥がす。凍結−融解を数回繰り返し、エクストルーダーにより膜を通して粒径を揃え、カラムにより遊離の薬物を除去し、ポリマー未修飾のリポソーム溶液等を調製する。一方、ポリグリシドール誘導体のバッファー溶液（ポリマー溶液）を調製する。調製したリポソーム溶液等とポリマー溶液とバッファーとを混合して、リポソーム等をポリマー（ポリグリシドール誘導体）で修飾する。
【００４８】
複合薬物担体［ｐＨ（又は、ｐＨ及び温度）感受性薬剤放出システム］を使用して、例えば抗ガン剤を標的とする細胞に送達するメカニズムとしては、次のようなことが考えられる。ガン細胞周辺の微小血管には２００ｎｍ程度の穴が多く存在している。一方、正常な細胞周辺の微小血管にはこのような穴が存在しないので、正常な細胞周辺では抗ガン剤封入複合薬物担体が血管から漏れ出すことはない。よって、抗ガン剤を封入した複合薬物担体の粒径を２００ｎｍ程度とすることにより、該複合薬物担体は標的とするガン細胞付近で微小血管から漏れ出して、ガン細胞に到達することができる。このようにして、抗ガン剤封入複合薬物担体は、標的とするガン細胞周辺部位に特異的に、且つ、高濃度で蓄積することができる。
【００４９】
本発明に係る複合薬物担体においては、粒径を２００ｎｍ程度とすることが好ましく、例えば、封入される薬物量が複合薬物担体中のポリグリシドール誘導体の量に対して０．１〜３０モル％、好ましくは１〜６モル％とすることで、粒径を２００ｎｍ程度とすることができる。
【００５０】
本発明に係る複合薬物担体は、経口、非経口経路の何れによっても投与することができるが、例えば、薬物として抗ガン剤を封入する場合は、非経口経路で投与（特に、経静脈投与）することが好ましい。また、本発明に係る複合薬物担体は、親油性の薬剤を封入することで、肝臓において親油性薬剤が代謝されることを抑制することができ、それにより、血中滞留時間が高められるため、長時間の持続投与、例えば静脈内への持続点滴など特殊な投与技術や器具・装置の使用しなくとも、例えば、ワンショット投与しても血中から速やかに消失或いは排出されることがなく、目的とする治療効果を得ることができる。さらに、目的とする治療効果を得るために大量投与する必要がなく、これにより予期せぬ副作用の発生を最小に留めることができる。
【００５１】
また、本発明に係る複合薬物担体の投与対象としては、哺乳動物が好ましく、特にヒトに対して好適に使用することができる。
【００５２】
本発明に係る複合薬物担体は、ｐＨ感受性を有しており、例えば、ｐＨ７以上では５０℃以上の高温で加熱しなければ封入された薬剤の放出が引き起こされないが、一方、ｐＨ７未満では４０〜４５℃で加熱することで、速やかに封入された薬剤を放出することができる。そして、正常細胞がｐＨ７．４付近であるのに対して、ガン細胞はｐＨ６．８程度の酸性に傾く傾向があるため、たとえ正常細胞に複合薬物担体が到達したとしても、４０〜４５℃に加熱することでは封入された薬剤の放出が引き起こされないため、より特異的にガン細胞に薬剤を作用させることができ、正常細胞が抗ガン剤により損傷を受ける可能性をより低減することができる。
【００５３】
本発明において、ポリグリシドール誘導体が前記式（ａ）中のＲが２種以上のアルキルカルバモイル基（アルキルアミド基）であるポリマーの場合[（ii）の場合]には、ｐＨ感受性だけでなく、温度感受性をも有する。この場合、例えば、標的とする患部を４０℃以上、好ましくは４０〜４５℃付近の温度に加熱することにより、患部に到達した複合薬物担体を構成するポリマーを相転移させて、封入された薬剤を放出させることができる。患部を加熱する方法としては、通常の温熱療法で使用される方法を採用することができ、例えば、ホットバック、気泡浴のように加湿された空気，温水を介して熱を伝える湿熱式方法、赤外線、乾式パックのように乾燥した空気を介する感熱式方法、レーザー、マイクロ波のような電磁波、超音波などの電気エネルギー、物理的振動が体内で熱に変わる転換熱式方法などが挙げられる。
【００５４】
本発明に係る複合薬物担体は、食品添加物として認められている安価な脂肪酸エステルによって形成されるため生体適合性に優れ、コストを削減することができ、安価に提供することができる。また、血中滞留時間が長く、ｐＨ感受性（又は、ｐＨ感受性及び温度感受性）を有するため、より的確に標的とする細胞のみに薬剤を到達させることができ、優れた治療効果を発揮することができ、副作用の発現を最小に留めることができる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。なお、実施例において原料として用いた高分岐ポリグリセリンは、水酸基の５０％以上が１級水酸基である。
【００５６】
実施例１
（カルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
高分岐ポリ（デカ）グリセリン（商品名「ＰＧＬ１０ＰＳ」、ダイセル化学工業社製）５．６１ｇをピリジン６０ｍＬに溶解させ、これに、塩化リチウム（触媒）１．２ｇ及び３−メチルグルタル酸無水物３．４１ｇ（ポリグリセリンの水酸基に対して３当量）を加え、アルゴン雰囲気下、１１５℃で２４時間還流した。ロータリーエバポレーターによってピリジンを減圧留去した後、炭酸水素ナトリウム水溶液によって中和し、３日間透析することで未反応の酸無水物等を除去し、凍結乾燥して白色固体（ＭＧｕ−ＨＰＧ１０）を得た。化合物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）により行った（図１）。
【００５７】
実施例２
（カルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
高分岐ポリ（２０）グリセリン（商品名「ＰＧＬ２０Ｐ」、ダイセル化学工業社製） ６．２３ｇをピリジン６０ｍＬに溶解させ、これに、塩化リチウム（触媒）１．２ｇ及び３−メチルグルタル酸無水物３．５１ｇ（ポリグリセリンの水酸基に対して３当量）を加え、アルゴン雰囲気下、１１５℃で２４時間還流した。ロータリーエバポレーターによってピリジンを減圧留去した後、炭酸水素ナトリウム水溶液によって中和し、３日間透析することで未反応の酸無水物等を除去し、凍結乾燥して白色固体（ＭＧｕ−ＨＰＧ２０）を得た。化合物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）により行った（図２）。
【００５８】
実施例３
（カルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
高分岐ポリ（４０）グリセリン（商品名「ＰＧＬＸＰ」、ダイセル化学工業社製）６．５４ｇをピリジン６０ｍＬに溶解させ、これに、塩化リチウム（触媒）１．２ｇ及び３−メチルグルタル酸無水物３．５４ｇ（ポリグリセリンの水酸基に対して３当量）を加え、アルゴン雰囲気下、１１５℃で２４時間還流した。ロータリーエバポレーターによってピリジンを減圧留去した後、炭酸水素ナトリウム水溶液によって中和し、３日間透析することで未反応の酸無水物等を除去し、凍結乾燥して白色固体（ＭＧｕ−ＨＰＧ４０）を得た。化合物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）により行った（図３）。
【００５９】
実施例４
（カルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
高分岐ポリ（６０）グリセリン（商品名「ＰＧＬ６０Ｐ」、ダイセル化学工業社製）５．６６ｇをピリジン６０ｍＬに溶解させ、これに、塩化リチウム（触媒）１．２ｇ及び３−メチルグルタル酸無水物３．０２ｇ（ポリグリセリンの水酸基に対して３当量）を加え、アルゴン雰囲気下、１１５℃で２４時間還流した。ロータリーエバポレーターによってピリジンを減圧留去した後、炭酸水素ナトリウム水溶液によって中和し、３日間透析することで未反応の酸無水物等を除去し、凍結乾燥して白色固体（ＭＧｕ−ＨＰＧ６０）を得た。化合物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）により行った（図４）。
【００６０】
実施例５
（カルボン酸末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
高分岐ポリ（８０）グリセリン（商品名「ＨＰＧ８０」、ダイセル化学工業社製）５．７８ｇをピリジン６０ｍＬに溶解させ、これに、塩化リチウム（触媒）１．２ｇ及び３−メチルグルタル酸無水物３．０６ｇ（ポリグリセリンの水酸基に対して３当量）を加え、アルゴン雰囲気下、１１５℃で２４時間還流した。ロータリーエバポレーターによってピリジンを減圧留去した後、炭酸水素ナトリウム水溶液によって中和し、３日間透析することで未反応の酸無水物等を除去し、凍結乾燥して白色固体（ＭＧｕ−ＨＰＧ８０）を得た。化合物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）により行った（図５）。
【００６１】
比較例１
（カルボン酸末端低分岐ポリグリセリンの製造）
低分岐ポリ（１０）グリセリン（商品名「ポリグリセリン＃７５０」、坂本薬品工業社製）５．４３ｇをピリジン６０ｍＬに溶解させ、これに、塩化リチウム（触媒）１．２ｇ及び３−メチルグルタル酸無水物３．３０ｇ（ポリグリセリンの水酸基に対して３当量）を加え、アルゴン雰囲気下、１１５℃で２４時間還流した。ロータリーエバポレーターによってピリジンを減圧留去した後、炭酸水素ナトリウム水溶液によって中和し、３日間透析することで未反応の酸無水物等を除去し、凍結乾燥して白色固体（ＭＧｕ−ＬＰＧ）を得た。化合物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）により行った（図６）。なお、比較例１において原料として用いた高分岐ポリグリセリンでは、全水酸基のうち１級水酸基は５０％未満である。
【００６２】
＜水酸基残存率とカルボン酸導入率の算出＞
実施例１〜５、及び比較例１で得られたカルボン酸末端ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）における水酸基残存率とカルボン酸導入率を以下の方法により求めた。図７はポリグリシドール誘導体における水酸基残存率とカルボン酸導入率の算出法を示す図である。この1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、グリシドール部位（水酸基を有する繰り返し構造単位）、カルボキシル部位（カルボキシル基を有する繰り返し構造単位）の組成比をそれぞれ、ｘ、ｙとする。主鎖由来のプロトンのピークの多くはａの位置に出現するが、カルボキシル基が修飾されたユニットの元水酸基隣のプロトンは高磁場シフトするためｂの位置に出現する（各５Ｈ分）。まず、主鎖部分由来のプロトンのシグナルの積分比より（１）式が成り立つ。
５ｘ＋５ｙ＝７６．１８１４ （１）
次に、カルボキシル基側鎖由来のメチレン・メチンプロトンはｃの位置に、メチルプロトンはｄの位置にピークが出現する（合計８Ｈ）。従って、（２）式のようになる。
８ｙ＝１２０．３７８１ （２）
（２）式よりｙの値を求め、それを（１）式に代入することで、ｘとｙの比が求まるため、それを１００分率に計算し直すことで、水酸基残存率、カルボキシル基導入率を求めることができる。
その結果、ＭＧｕ−ＨＰＧ１０（実施例１）、ＭＧｕ−ＨＰＧ２０（実施例２）、ＭＧｕ−ＨＰＧ４０（実施例３）、ＭＧｕ−ＨＰＧ８０（実施例５）及びＭＧｕ−ＬＰＧ（比較例１）については、いずれも、水酸基残存率は０％、カルボン酸導入率は１００％であった。ＭＧｕ−ＨＰＧ６０（実施例４）については、水酸基残存率は４．８％、カルボン酸導入率は９５．２％であった。
【００６３】
製造例１
（サクシニル化ポリグリセリンの製造）
高分岐ポリ（４０）グリセリン（重合度４０；商品名「ＰＧＬＸＰ」、ダイセル化学工業社製）５．６６ｇ、無水コハク酸２３．８ｇ、ピリジン６０ｍｌを混合させ、ポリグリセロールを溶解させた。次に還流管を用いて、還流が開始したのを確認した後、アルミホイルで遮光し、７時間加熱撹拌を行った。放冷、冷蔵保存後、溶液は黒紫色で、紫色の固体が析出した。減圧濾過により析出した固体を取り除いた後、エバポレーションによりピリジンを留去した。ジエチルエーテルとメタノールによる再沈殿後、得られた赤茶色の粘性固体をメタノールで溶かし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（展開溶媒：メタノール）により精製した。溶液を回収した後、エバポレーションによりメタノールを留去して得られた淡黄色の粘性の高い固体に、水を適量加えてエバポレーションする操作を６回繰り返した後、凍結乾燥を行った。この生成物（サクシニル化ポリグリセリン；Ｓｕｃ−ＰＧ）を1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）により解析した結果を図８に示す。収量９．７ｇ、収率７１．１％。
【００６４】
実施例６
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
Ｓｕｃ−ＰＧ０．２８５ｇをＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）４ｍｌに超音波照射を用いて溶解させた後、ＤＭＴ−ＭＭ［４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルフォリニウム クロリド ］０．５４７ｇ（１．２ｅｑ）を加え、さらにＩＰＡ（イソプロピルアミン）２．３３ＭのＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）溶液を４９５μｌ（０．７ｅｑ）加えて、Ａｒ封入後、遮光撹拌し、一日放置した。白濁していた溶液は一日後、黄濁色になっていた。ＮＭＰ１ｍｌで希釈したＤＡ（デシルアミン）を３２μｌ（０．１ｅｑ）加え、Ａｒ封入後、遮光撹拌し、三日間放置した。三日後、溶液の色は濃くなっていた。三日後、この反応溶液を水と酢酸水溶液で再沈殿し、ジエチルエーテルを用いて洗浄した。遠心分離で沈殿物を取り除いた後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（展開溶媒：メタノール）により精製した。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図９に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）及びデシルアミド（デシルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、それぞれ、６４．６％、１０．３％であった。
【００６５】
実施例７
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）を０．６ｅｑ、ＤＡ（デシルアミン）を０．１ｅｑ用いた以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図９に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）及びデシルアミド（デシルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、それぞれ、５６．４％、１０．７％であった。
【００６６】
実施例８
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）を０．８ｅｑ、ＤＡ（デシルアミン）を０．１ｅｑ用いた以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図９に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）及びデシルアミド（デシルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、それぞれ、７３．４％、１０．５％であった。
【００６７】
実施例９
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）を０．４ｅｑ、ＤＡ（デシルアミン）を０．１ｅｑ用いた以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図９に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）及びデシルアミド（デシルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、それぞれ、３４．９％、９．７６％であった。
【００６８】
実施例１０
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）を０．９ｅｑ、ＤＡ（デシルアミン）を０．１ｅｑ用いた以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図９に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）及びデシルアミド（デシルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、それぞれ、８２．６％、１０．５％であった。
【００６９】
実施例１１
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）を０．５ｅｑ、ＤＡ（デシルアミン）を０．１ｅｑ用いた以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図９に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）及びデシルアミド（デシルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、それぞれ、４５．７％、１０．１％であった。
【００７０】
なお、図９におけるスペクトルは、上から、実施例１０、実施例８、実施例６、実施例７、実施例１１、実施例９の順に記載されている。
【００７１】
比較例２
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）を０．７ｅｑ用い、ＤＡ（デシルアミン）は用いなかった以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図１０に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、６３．８％であった。
【００７２】
比較例３
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）を０．６ｅｑ用い、ＤＡ（デシルアミン）は用いなかった以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図１１に示す。ポリマー中のイソプロピルアミド（イソプロピルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、５６．５％であった。
【００７３】
比較例４
（アミド末端ハイパーブランチポリグリセリンの製造）
アミンとして、ＩＰＡ（イソプロピルアミン）は用いず、ＤＡ（デシルアミン）を０．１ｅｑ用いた以外は、実施例６と同様の操作を行った。得られたポリマーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ3ＯＤ）を図１２に示す。ポリマー中のデシルアミド（デシルカルバモイル基）の導入率を1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより求めたところ、１１．１％であった。
【００７４】
調製例１
（１）パイラニン（ｐｙｒａｎｉｎｅ；蛍光物質）水溶液の調製
ｐｙｒａｎｉｎｅ３８ｍｇ、ＤＰＸ４３ｍｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4１４ｍｇを、全量が２ｍｌになるように１Ｎ ＨＣｌとイオン交換水を用いてｐＨ７．４、ｐｙｒａｎｉｎｅ３５ｍＭ、ＤＰＸ５０ｍＭ、Ｎａ2ＨＰＯ4５０ｍＭのｐｙｒａｎｉｎｅ水溶液を調製した。
（２）ポリマー修飾リポソームの調製
１．ポリマー未修飾ｐｙｒａｎｉｎ内包リポソームの調製
ＥＹＰＣ（卵黄フォスファチジルコリン）１２ｍｇ／ｍｌのクロロホルム溶液２ｍｌを１０ｍｌのナスフラスコにとり、エバポレーションして薄膜を形成させた後、４時間、真空乾燥を行うことにより、残留溶媒を取り除いた。乾燥後、ｐＨを７．４に調整したｐｙｒａｎｉｎｅ水溶液（ｐｙｒａｎｉｎ３５ｍＭ、ＤＰＸ５０ｍＭ、Ｎａ2ＨＰＯ4５０ｍＭ）を１７００μｌ加えて、超音波照射を１０ｍｉｎ行い、薄膜を剥がした。凍結−融解を５回行った後、エクストルーダーにより１００ｎｍのポリカーボネート膜に通した。エクストルーダーにより粒径を揃えた後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ２５ｍＭ，ｓａｌｉｎｅ１５０ｍＭ；ｐＨ７．４）で平衡化したセファロース４Ｂカラムによりｆｒｅｅのｐｙｒａｎｉｎを除いた。和光リン脂質Ｃ−テストワコーにより脂質濃度を測定した。
２．各種ポリマー水溶液の調製
実施例及び比較例で合成した各種のポリマーを、イオン交換水、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＣｌ、１Ｎ ＮａＯＨを用いて溶解させ、ポリマー濃度が１０ｍｇ／ｍｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4の濃度が２５ｍＭ、ＮａＣｌの濃度が１５０ｍＭ、ｐＨがｐＨ７．４となるようなポリマー水溶液をそれぞれ調製した。
３．各種ポリマーのリポソームへの修飾
調製したリポソーム溶液、ポリマー水溶液、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ２５ｍＭ、ｓａｌｉｎｅ１５０ｍＭ；ｐＨ７．４）を、脂質濃度が１．２５ｍＭ、ポリマー濃度が３．１３ｍｇ／ｍｌになるように混合し、１時間、ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎすることによりリポソームに修飾した。
なお、実施例１〜５、比較例１で得られたポリマーについては、蛍光物質パイラニン（ｐｙｒａｎｉｎｅ）を内包した卵黄フォスファチジルコリン（ＥＹＰＣ）リポソーム（２×１０-5Ｍ）を含む種々ｐＨのＭＥＳバッファー（２５ｍＭ ＭＥＳ，１２５ｍＭ ＮａＣｌ）に実施例１〜５、及び比較例１で得られた各カルボン酸末端ポリグリセリン（ポリグリシドール誘導体）（１０ｍｇ／ｍＬ）を２５μＬ添加し、全量を２．５ｍＬとした。
４．精製
リポソームに修飾されていないポリマーを除くために、分画数１２００−１６０００ の透析膜を用いて外相ｐＨ７．４のＰＢＳに対して透析を一日間行った。
【００７５】
＜ｐＨ感受性評価試験（実施例１〜５、比較例１）＞
実施例１〜５、比較例１で得られたポリマーについて、上記で得られた溶液の励起波長４１６ｎｍ、蛍光波長５１２ｎｍにおける蛍光強度の経時変化を測定した。Ｐｙｒａｎｉｎｅはリポソーム内部ではＤＰＸにより消光されているが、リポソームから放出されると励起され蛍光を発する。その結果を図１３に示す。図中のプロットは３０分後の値を示している。
【００７６】
リニア型のＭＧｕ−ＬＰＧ（比較例１）を用いたものは、ｐＨ７からｐＨ５．５にかけてｐＨの低下とともにリポソームからのパイラニンの放出を促進した。しかし、多分岐型（高分岐型）のＭＧｌｕ−ＨＰＧ（実施例１〜５）を用いたものは、より狭いｐＨ領域において急激に内包物の放出を引き起こした。また、主鎖の重合度が増加すると応答するｐＨが高くなった。このようにポリマーの主鎖構造を多分岐型にすることで鋭敏なｐＨ応答性高分子が得られることがわかった。
【００７７】
＜ｐＨおよび温度感受性評価（実施例６、８、９、１１、比較例４）＞
蛍光セルに各種ｐＨに調整したＰＢＳ ２４９５μｌを入れ、一定の各種温度にしてオートゼロした後、上記で得られたポリマー修飾リポソーム（脂質濃度１．２５ｍＭ、ポリマー濃度３．１３ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ加えてｐｙｒａｎｉｎｅ（励起波長４１６ｎｍ， 蛍光波長５１２ｎｍ）の蛍光強度の経時変化を測定した。ポリマー修飾リポソームからのｐｙｒａｎｉｎｅ放出に及ぼすｐＨと温度の影響を検討した。その結果を図１４〜図１８に示す。図１４は比較例４で得られたポリマーで修飾したリポソーム、図１５は実施例９で得られたポリマーで修飾したリポソーム、図１６は実施例１１で得られたポリマーで修飾したリポソーム、図１７は実施例６で得られたポリマーで修飾したリポソーム、図１８は実施例８で得られたポリマーで修飾したリポソームのそれぞれの評価結果を示すグラフである。
【００７８】
１種類の直鎖のアルキルカルバモイル基（アルキルアミド基）を有するポリグリシドール誘導体で修飾されたリポソームでは、ｐＨが同じ場合には、薬物の放出率は温度によりさほど変化しない。これに対し、２種類のアルキルカルバモイル基（アルキルアミド基）を有するポリグリシドール誘導体で修飾されたリポソームでは、薬物の放出率はｐＨにより変化するだけでなく、ｐＨが同じ場合であっても、温度により大きく変化し、２種のポリグリシドール誘導体の比率を調整することで、ｐＨ応答性と温度応答性を調整することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
これまで癌を標的としたＤＤＳの開発は様々な研究者によって多くの研究がなされているが、実用化されているＤＤＳ材料は少ない。その理由としては、ＤＤＳ材料の安全性の検証に時間がかかることであった。したがって、材料として高機能を有するものでも、安全性が確立されていない合成化合物の実用化は容易ではなく、また総じて高価であるという問題があった。本研究において骨格に用いたポリグリセリンは比較的安価であるだけではなく、生体適合性に優れていることは既にこの基材を用いた脂肪酸エステルが食品添加物として認められている事からも明らかである。即ち、本研究の材料を用いる事で、ＤＤＳ材料として安価かつ安全性に優れた温度応答性ＤＤＳの設計が行え、人々を未だ苦しめてやまない癌等の疾患への治療に貢献できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸基の５０％以上が１級水酸基であるポリグリセリンから誘導されるポリグリシドール誘導体であって、少なくとも下記式（ａ）
【化１】
（式中、ＧＬはグリセリン残基、Ｘはリンカーを示す。Ｒは、（ｉ）カルボキシル基であるか、又は（ii）イソプロピルカルバモイル基又は炭素数８以上のアルキルカルバモイル基であって、これらのアルキルカルバモイル基を２種以上有する）
で表される繰り返し単位を有するポリグリシドール誘導体。
【請求項２】
請求項１記載のポリグリシドール誘導体と脂質膜を有する担体粒子からなる複合薬物担体。
【請求項３】
さらに、診断及び／又は治療のための薬物が内包されている請求項２記載の複合薬物担体。
【請求項４】
担体粒子が、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソーム及びエマルジョンからなる群より選択された少なくとも１種の形態である請求項２又は３記載の複合薬物担体。
【請求項５】
薬物が、抗ガン剤、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子及びその類縁体からなる群より選択された少なくとも１種である請求項３記載の複合薬物担体。
【請求項１】
水酸基の５０％以上が１級水酸基であるポリグリセリンから誘導されるポリグリシドール誘導体であって、少なくとも下記式（ａ）
【化１】
（式中、ＧＬはグリセリン残基、Ｘはリンカーを示す。Ｒは、（ｉ）カルボキシル基であるか、又は（ii）イソプロピルカルバモイル基又は炭素数８以上のアルキルカルバモイル基であって、これらのアルキルカルバモイル基を２種以上有する）
で表される繰り返し単位を有するポリグリシドール誘導体。
【請求項２】
請求項１記載のポリグリシドール誘導体と脂質膜を有する担体粒子からなる複合薬物担体。
【請求項３】
さらに、診断及び／又は治療のための薬物が内包されている請求項２記載の複合薬物担体。
【請求項４】
担体粒子が、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソーム及びエマルジョンからなる群より選択された少なくとも１種の形態である請求項２又は３記載の複合薬物担体。
【請求項５】
薬物が、抗ガン剤、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子及びその類縁体からなる群より選択された少なくとも１種である請求項３記載の複合薬物担体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１０−２６０９８６（Ｐ２０１０−２６０９８６Ａ）
【公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１４１８１（Ｐ２００９−１１４１８１）
【出願日】平成２１年５月１１日（２００９．５．１１）
【出願人】（０００００２９０１）ダイセル化学工業株式会社 (1,236)
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１１日（２００９．５．１１）
【出願人】（０００００２９０１）ダイセル化学工業株式会社 (1,236)
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
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