ポリブチレンテレフタレート及びポリブチレンテレフタレートの製造方法
【課題】色調良好なＰＢＴを提供すること、及び原料ＢＧのＴＨＦへの転化率が低く、ＰＢＴを効率的に製造できる方法を提供すること。
【解決手段】テレフタル酸由来の構成単位と１，４ブタンジオール由来の構成単位を含み、窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであることを特徴とするポリブチレンテレフタレート。このうち、特に、上記１，４−ブタンジオールがバイオマス資源由来であるものが好ましい。また、上記１，４−ブタンジオール中の窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであることが好ましい。
【解決手段】テレフタル酸由来の構成単位と１，４ブタンジオール由来の構成単位を含み、窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであることを特徴とするポリブチレンテレフタレート。このうち、特に、上記１，４−ブタンジオールがバイオマス資源由来であるものが好ましい。また、上記１，４−ブタンジオール中の窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、窒素原子含有量が特定範囲で色調良好なポリブチレンテレフタレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
熱可塑性ポリエステル樹脂の中で代表的なエンジニアリンブプラスチックであるポリブチレンテレフタレート（以下ＰＢＴと表す)は、成形加工の容易性、機械的物性、耐熱性
、耐薬品性、保香性、その他の物理的・化学的特性に優れていることから、自動車部品、電気・電子部品、精密機器部品などの射出成形品に広く使用されている。また、近年は、その優れた性質を活かし、フィルム、シート、モノフィラメント、繊維などの一般消費材分野でも広く使用されており、これに伴って、色調良好なＰＢＴが求められるようになってきている。
【０００３】
ＰＢＴは、通常、テレフタル酸又はそのアルキルエステルと１，４−ブタンジオール（以下ＢＧと表すことがある）とを反応させて製造するが、ＢＧは反応中にテトラヒドロフラン(以下ＴＨＦと表すことがある)に転化しやすいため、ＴＨＦ転化率の低いＰＢＴの製造方法が求められている。
一方、循環型（サステイナブル）社会の構築を求める声の高まりとともに、樹脂材料分野においてもエネルギーと同様に化石燃料原料からの脱却が望まれている。化石燃料を原料としない樹脂材料を開発する場合、植物などを原料とするバイオマス資源が有力な原料候補であり、バイオマスプラスチックの実用化が進んでいる。
【０００４】
原料である１，４ブタンジオールがバイオマス資源から得られたものである場合、化石燃料から得られたものである場合に比べ、ＰＢＴの色調が悪くなる。
特許文献１には、バイオマス資源を原料としてポリエステルを得る技術について、ジカルボン酸中の窒素含有量を制御することにより、窒素含有量１０００質量ｐｐｍ以下のポリエステルを得ることについて記載されている。しかしながら、該文献には、ジオール中の窒素含有量及びその影響については記載も示唆もない。又、ＰＢＴに関する記載も全く無い。（尚、以下、本発明において、特に断らない限り濃度表示「ｐｐｍ」は、「質量ｐｐｍ」を表す。）
【特許文献１】特開２００５―１３９２８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の現状に鑑みてなされたものであり、色調良好なＰＢＴを提供すること、及び原料ＢＧのＴＨＦへの転化率が低く、ＰＢＴを効率的に製造できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討した。この結果、特定量の窒素原子を含有するＰＢＴの色調が良好であることを見出し本発明に到達した。
即ち、本発明の要旨は、テレフタル酸由来の構成単位と１，４ブタンジオール由来の構成単位を含み、窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであることを特徴とするポリブチレンテレフタレートに存する。また、本発明の別の要旨は、テレフタル酸又はテレフタル酸アルキレートと窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍの１，４ブタンジオールとをエステル化反応又はエステル交換反応させた後、重縮合反応させるポリブチレンテレフタレートの製造方法に存する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、色調良好で高品質なＰＢＴを得ることができる。特に、バイオマス資源由来のＢＧを原料として、色調良好なＰＢＴを得ることができる。また、原料ＢＧのＴＨＦへの転化率が低く、効率的にＰＢＴ原料を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下に記載する各構成要件の説明は、本発明の実施態様の代表例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
尚、本明細書において、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。また、本明細書における、下限値又は上限値は、その下限値又は上限値の数値を含む範囲を意味する。
＜ＰＢＴ製造原料＞
本発明のＰＢＴは、テレフタル酸又はテレフタル酸アルキレートと１，４ブタンジオールとをエステル化反応又はエステル交換反応させた後、重縮合反応させることにより得られる。本発明のＰＢＴの製造に用いる原料は、バイオマス資源由来であるのが、環境保護の点から好ましい。
【０００９】
テレフタル酸又はテレフタル酸アルキルエステルは、全ジカルボン酸成分の８０モル％以上であるのが好ましく、９０モル％以上であるのが更に好ましく、１００モル％であるのが最も好ましい。また、ＢＧ成分は、全ジオール成分の８０モル％以上であるのが好ましく、９０モル％以上であるのが更に好ましく、１００モル％であるのが最も好ましい。テレフタル酸又はテレフタル酸アルキルエステルの全ジカルボン酸成分に占める割合及びＢＧ成分の全ジオール成分に占める割合が前記範囲以上であると、電気部品等に成形する際の結晶化の点やフィルム、繊維等に成形する際の延伸による分子鎖の配向結晶化の点から、成形体としての機械的強度、耐熱性、保香性等が良好になりやすい。
【００１０】
テレフタル酸又はテレフタル酸アルキルエステル以外のジカルボン酸成分としては、具体的には、例えば、フタル酸、イソフタル酸、ジブロモイソフタル酸、スルホイソフタル酸ナトリウム、フェニレンジオキシジカルボン酸、４，４’−ジフェニルジカルボン酸、４，４’−ジフェニルエーテルジカルボン酸、４，４’−ジフェニルケトンジカルボン酸、４，４’−ジフェノキシエタンジカルボン酸、４，４’−ジフェニルスルホンジカルボン酸、２，６−ナフタレンジカルボン酸等の芳香族ジカルボン酸およびこれらのエステル形成性誘導体；ヘキサヒドロテレフタル酸、ヘキサヒドロイソフタル酸等の脂環式ジカルボン酸およびこれらのエステル形成性誘導体；コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカジカルボン酸、ドデカジカルボン酸等の脂肪族鎖式ジカルボン酸よびこれらのエステル形成性誘導体等が挙げられる。
【００１１】
ＢＧ以外のジオール成分としては、具体的には、例えば、エチレングリコール、トリメチレングリコール、ペンタメチレングリコール、ヘキサメチレングリコール、オクタメチレングリコール、デカメチレングリコール、ネオペンチルグリコール、２−エチル−２−ブチル−１，３−プロパンジオール、ポリエチレングリコール、ポリテトラメチレンエーテルグリコール等の脂肪族鎖式ジオール；１，２−シクロヘキサンジオール、１，４−シクロヘキサンジオール、１，１−シクロヘキサンジメチロール、１，４−シクロヘキサンジメチロール、２，５−ノルボルナンジメチロール等の脂環式ジオール；キシリレングリコール、４，４’−ジヒドロキシビフェニル、２，２−ビス（４’−ヒドロキシフェニル）プロパン、２，２−ビス（４’−β−ヒドロキシエトキシフェニル）プロパン、ビス（４−ヒドロキシフェニル）スルホン、ビス（４−β−ヒドロキシエトキシフェニル）スルホン酸等の芳香族ジオール；２，２−ビス（４’−ヒドロキシフェニル）プロパンのエチレンオキサイド付加物又はプロピレンオキサイド付加物；バイオマス資源由来でないＢＧ等が挙げられる。
【００１２】
なお、共重合成分として、更に、以下の成分が用いられていてもよい。例えば、グリコール酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−β−ヒドロキシエトキシ安息香酸等のヒドロキシカルボン酸やアルコキシカルボン酸、及び、ステアリルアルコール、ヘネイコサノール、オクタコサノール、ベンジルアルコール、ステアリン酸、ベヘン酸、安息香酸、ｔ−ブチル安息香酸、ベンゾイル安息香酸等の単官能成分、トリカルバリル酸、トリメリット酸、トリメシン酸、ピロメリット酸、ナフタレンテトラカルボン酸、没食子酸、トリメチロールエタン、トリメチロールプロパン、グリセロール、ペンタエリスリトール、シュガーエステル等の三官能以上の多官能成分、等が挙げられる。
【００１３】
＜バイオマス資源由来ＢＧ＞
本発明のＰＢＴの製造に用いるジカルボン酸成分は、バイオマス資源由来であるのが架橋保護の点から好ましい。
バイオマス資源とは、植物の光合成作用で太陽の光エネルギーがデンプンやセルロースなどの形に変換されて蓄えられたもの、植物体を食べて成育する動物の体や、植物体や動物体を加工してできる製品等が含まれる。具体的には、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣、水産物残渣、家畜排泄物、下水汚泥、食品廃棄物等が挙げられる。この中でも、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣等の植物資源が好ましく、より好ましくは、木材、稲わら、籾殻、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、芋、油脂、古紙、製紙残渣が挙げられ、最も好ましくはとうもろこし、さとうきび、キャッサバ、サゴヤシが挙げられる。
【００１４】
バイオマス資源は、一般に、窒素元素やＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ等の多くのアルカリ金属及びアルカリ土類金属を含有する。
これらのバイオマス資源は、その方法は特に限定はされないが、例えば、酸やアルカリ等の化学処理、微生物を用いた生物学的処理、物理的処理等の公知の前処理・糖化の工程等を経て炭素源へと誘導される。その工程には、バイオマス資源をチップ化する、削る、擦り潰す等の前処理による微細化工程が含まれることが多く、必要に応じて、更にグラインダーやミルによる粉砕工程も含まれる。こうして微細化されたバイオマス資源は、通常、更に前処理・糖化の工程を経て炭素源へと誘導される。その具体的な方法としては、硫酸、硝酸、塩酸、燐酸等の強酸による酸処理、アルカリ処理、アンモニア凍結蒸煮爆砕法、溶媒抽出、超臨界流体処理、酸化剤処理等の化学的方法；微粉砕、蒸煮爆砕法、マイクロ波処理、電子線照射等の物理的方法；微生物や酵素処理による加水分解等生物学的処理等が挙げられる。
【００１５】
上記のバイオマス資源から誘導される炭素源としては、通常、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース等のヘキソース；アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース等のペントース；ペントサン、サッカロース、澱粉、セルロース等の２糖・多糖類；酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノクチン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、アラキドン酸、ベヘニン酸、エルカ酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リグノセリン酸、セラコレン酸等の油脂；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられる。このうち、グルコース、フルクトース、キシロース等のヘキソース又はペントースが好ましく、特にグルコースが好ましい。より広義の植物資源由来の炭素源としては、紙の主成分であるセルロースも好ましい。
【００１６】
通常、これらの炭素源を用いて、微生物変換による発酵法や加水分解・脱水反応・水和反応・酸化反応等の反応工程を含む化学変換法ならびにこれらの発酵法と化学変換法の組み合わせによりジオールが合成される。これらの中でも、微生物変換による発酵法が好ましい。
本発明のＰＢＴを製造するのに用いるジオールは、窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであるのが好ましい。バイオマス資源のジオールを用いる場合、具体的には、例えば、グルコース等の炭素源から発酵法により直接ジオールを製造してもよいし、発酵法により得られたコハク酸、コハク酸無水物、コハク酸エステル等を化学反応によりジオール化合物に変換しても良いし、発酵法により得られた１，３−ブタジエンから１，４−ブタンジオールを製造する等してもよい。この中でも、発酵法により得られたコハク酸（又はコハク酸をコハク酸ジメチルに変成後に）を、還元触媒により水添して１，４−ブタンジオールを得る方法が効率的で好ましい。
【００１７】
コハク酸を水添する触媒の例としては、例えば、Ｐｄ、Ｒｕ、Ｒｅ、Ｒｈ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｏ及びその化合物等が挙げられる。具体的には、Ｐｄ／Ａｇ／Ｒｅ、Ｒｕ／Ｎｉ／Ｃｏ／ＺｎＯ、Ｃｕ／Ｚｎ酸化物、Ｃｕ／Ｚｎ／Ｃｒ酸化物、Ｒｕ／Ｒｅ、Ｒｅ／Ｃ、Ｒｕ／Ｓｎ、Ｒｕ／Ｐｔ／Ｓｎ、Ｐｔ／Ｒｅ／アルカリ、Ｐｔ／Ｒｅ、Ｐｄ／Ｃｏ／Ｒｅ、Ｃｕ／Ｓｉ、Ｃｕ／Ｃｒ／Ｍｎ、ＲｅＯ／ＣｕＯ／ＺｎＯ、ＣｕＯ／ＣｒＯ、Ｐｄ／Ｒｅ、Ｎｉ／Ｃｏ、Ｐｄ／ＣｕＯ／ＣｒＯ３、リン酸Ｒｕ、Ｎｉ／Ｃｏ、Ｃｏ／Ｒｕ／Ｍｎ、Ｃｕ／Ｐｄ／ＫＯＨ、Ｃｕ／Ｃｒ／Ｚｎ等が挙げられる。この中でも、Ｒｕ／Ｓｎ又はＲｕ／Ｐｔ／Ｓｎが触媒活性の点で好ましい。
また、更に、バイオマス資源から公知の有機化学触媒反応との組み合わせによりＢＧを製造する方法も用いられる。例えば、バイオマス資源としてペントースを利用する場合には公知の脱水反応、触媒反応の組み合わせで容易にブタンジオール等のジオールを製造できる。
【００１８】
＜ＢＧ中の窒素原子含有量＞
バイオマス資源由来から誘導されたＢＧには、発酵処理ならびに酸による中和工程を含む精製処理に起因して不純物として窒素原子が含まれてくる。具体的には、アミノ酸、蛋白質、アンモニア、尿素、発酵菌由来等の窒素原子が含まれてくる。
本発明においてＰＢＴの原料となる、バイオマス資源から得られたＢＧの窒素原子含有量は、該ＢＧに対して質量比で、上限は、通常５０ｐｐｍ、好ましくは１０ｐｐｍ、より好ましくは２ｐｐｍであるのよい。また、下限は特に制限されないが、通常、０．０１ｐｐｍ、好ましくは０．０５ｐｐｍがよく、特に、精製工程の経済性の観点からは、０．１ｐｐｍであるのが好ましい。ＢＧ中の窒素原子含有量が上記上限以下であると、ＰＢＴ製造における重縮合反応速度、生成するＰＢＴの色調などが好ましくなる傾向が強い。一方、上記下限以上であると、精製工程が簡便としやすく経済的に有利な上、ＰＢＴ製造反応中でのＢＧのＴＨＦへの転化も低く押させやすい。
【００１９】
上記上限以下であると重縮合反応速度や色調の点で好ましくなりやすい理由は定かではないが、発酵処理ならびに酸による中和処理を含む精製処理において、窒素源となる化合物以外に重縮合反応を阻害し、ＰＢＴの色調を悪化させる着色誘引物質が生成しやすくなっているのではないかと推定される。また、発酵における窒素源となるアンモニア、アミノ酸なども反応を遅延させ、ＰＢＴの色調悪化を誘引するものと考えられる。
【００２０】
ＢＧ中の窒素原子量は、例えば、バイオマス資源の発酵により得られるコハク酸を水添してＢＧを得る場合は、その発酵条件、アンモニアによる中和条件、コハク酸の晶析条件などによりコハク酸中の窒素原子量を調節することにより調節可能である。また、コハク酸を水添して得られるＢＧは、蒸留を含む精製条件により、その含有窒素原子含有量を調
節できる。また、ＢＧがバイオマス資源の発酵により直接得られる場合にも、その発酵条件、アンモニアによる中和条件、得られたＢＧの蒸留を含む精製条件などにより調節できる。
【００２１】
＜ＢＧ中の硫黄原子含有量＞
発酵法により製造したＢＧ等を用いる場合には、酸による中和工程を含む精製処理等により硫黄原子が含まれてくる場合がある。この場合、具体的に、硫黄原子が含有される不純物としては、硫酸、亜硫酸、有機スルホン酸塩等が挙げられる。
ＢＧ中に含まれる硫黄原子量は、該ＢＧに対して質量比で、上限は通常１００ｐｐｍ、好ましくは２０ｐｐｍ、より好ましくは１０ｐｐｍ、特に好ましくは５ｐｐｍ、最も好ましくは０．５ｐｐｍである。一方、下限は特に制限されないが、通常０．００１ｐｐｍ、好ましくは０．０１ｐｐｍ、より好ましくは０．０５ｐｐｍ、特に好ましくは、０．１ｐｐｍである。上記上限以下であると、重縮合反応速度やＰＢＴの安定性が好ましくなる傾向がある。一方、上記下限以上であると、精製工程を簡便にして経済的に有利にしやすくなる。硫黄原子含有量は、公知の元素分析法により測定される値である。
【００２２】
＜ＢＧ中の１−アセトキシ−４−ヒドロキシブタン及び２−（４−ヒドロキシブチルオキシ）テトラヒドロフラン）の含有量＞
窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであるＢＧを用いると、ＰＢＴを製造する際の重縮合速度が大きくなる。具体的には、実施例で後述する通り、バイオマス資源から得られ、窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであるＢＧを用いると、化石燃料原料から得られたＢＧを使用した場合に比べて、重縮合速度が大きくなっている。これは、本発明の実施例で用いたＢＧにおける１−アセトキシ−４−ヒドロキシブタン（１，４−ＨＡＢと表すことが有る）及び／又は２−（４−ヒドロキシブチルオキシ）テトラヒドロフラン（ＢＧＴＦと表すことが有る）の含有量が少ないために、重縮合反応の阻害が少ないためであると考えられる。従って、ＢＧ中の１−アセトキシ−４−ヒドロキシブタンは、５０質量ｐｐｍ以下が好ましく、１０質量ｐｐｍ以下がより好ましい。また、下限は少ないほうが良いが通常０．１質量ｐｐｍである。
【００２３】
＜ＰＢＴ製造方法＞
本発明のＰＢＴは、これを製造できれば特に制限されない。ＰＢＴの公知の製造方法は、主原料としてテレフタル酸を用いるいわゆる直接重合法と、主原料としてテレフタル酸ジアルキルエステルを用いるエステル交換法とに大別される。前者は、初期のエステル化反応で水が生成し、後者は初期のエステル交換反応でアルコールが生成するという違いがあるが、原料の入手安定性、留出物の処理の容易さ、原料原単位の高さ、また本発明による改良効果という観点からは直接重合法が好ましい。
【００２４】
直接重合法の一例としては、テレフタル酸とＢＧとを、単数若しくは複数段のエステル化反応槽内で、エステル化反応触媒の存在下に、温度が、通常１８０以上、好ましくは２００℃以上、特に好ましくは２１０℃以上、通常２６０℃以下、好ましくは２５０℃以下、特に好ましくは２４５℃以下で、圧力が、通常１０ｋＰａ以上、好ましくは１３ｋＰａ以上、特に好ましくは５０ｋＰａ以上、通常１３３ｋＰａ以下、好ましくは１０１ｋＰａ以下、特に好ましくは９０ｋＰａ以下で、反応時間が、通常０．５時間以上、好ましくは１時間以上、通常５時間以下、好ましくは３時間以下で、連続的にエステル化反応させ、得られたエステル化反応生成物としてのオリゴマーを重縮合反応槽に移送し、複数段の重縮合反応槽内で、重縮合反応触媒の存在下で連続的に、温度が、通常２１０℃以上、好ましくは２２０℃以上、通常２６０℃以下、好ましくは２５０℃以下、特に好ましくは２４５℃以下で、圧力が、通常２７ｋＰａ以下、好ましくは２０ｋＰａ以下、より好ましくは１３ｋＰａ以下、中でも少なくとも１つの重縮合反応槽においては好ましくは２ｋＰａ以下の減圧下で、攪拌しながら、通常２〜１２時間好ましくは２〜１０時間で縮合反応させる方法等が挙げられる。
【００２５】
エステル交換法の一例としては、テレフタル酸ジメチルとＢＧとを、単数若しくは複数段のエステル化反応槽内で、エステル交換反応触媒の存在下に、温度が１１０℃以上、好ましくは１４０℃以上、特に好ましくは１８０℃以上、２６０℃以下、好ましくは２４５℃以下、特に好ましくは２２０℃以下で、圧力が通常１０ｋＰａ以上、好ましくは１３ｋＰａ以上、特に好ましくは６０ｋＰａ以上、通常１３３ｋＰａ以下、好ましくは１０１ｋＰａ以下、特に好ましくは９０ｋＰａ以下で、反応時間が通常０．５時間以上、好ましくは１時間以上、通常５時間以下、好ましくは３時間以下で、連続的にエステル交換反応させ、得られたエステル交換反応生成物としてのオリゴマーを重縮合反応槽に移送し、複数段の重縮合反応槽内で、重縮合反応触媒の存在下で連続的に、温度が、通常２１０℃以上、好ましくは２２０℃以上、通常２６０℃以下、好ましくは２５０℃以下、特に好ましくは２４５℃以下で、圧力が、通常２７ｋＰａ以下、好ましくは２０ｋＰａ以下、特に好ましくは１３ｋＰａ以下の減圧下、中でも少なくとも１つの重縮合反応槽においては好ましくは２ｋＰａ以下の減圧下で、攪拌しながら、通常２〜１２時間好ましくは２〜１０時間、重縮合反応させる方法等が挙げられる。
【００２６】
エステル化反応またはエステル交換反応触媒としては、例えば、三酸化二アンチモン等のアンチモン化合物；二酸化ゲルマニウム、四酸化ゲルマニウム等のゲルマニウム化合物；テトラメチルチタネート、テトライソプロピルチタネート、テトラブチルチタネート等のチタンアルコラート、テトラフェニルチタネート等のチタンフェノラート等、のチタン化合物；ジブチルスズオキサイド、メチルフェニルスズオキサイド、テトラエチルスズ、ヘキサエチルジスズオキサイド、シクロヘキサヘキシルジスズオキサイド、ジドデシルスズオキサイド、トリエチルスズハイドロオキサイド、トリフェニルスズハイドロオキサイド、トリイソブチルスズアセテート、ジブチルスズジアセテート、ジフェニルスズジラウレート、モノブチルスズトリクロライド、トリブチルスズクロライド、ジブチルスズサルファイド、ブチルヒドロキシスズオキサイド、メチルスタンノン酸、エチルスタンノン酸、ブチルスタンノン酸等のスズ化合物；酢酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マグネシウムアルコキサイド、燐酸水素マグネシウム等のマグネシウム化合物、酢酸カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、カルシウムアルコキサイド、燐酸水素カルシウム、等の等のカルシウム化合物等のアルカリ土類金属化合物の他、マンガン化合物、亜鉛化合物等を挙げることができる。中でも、チタン化合物、スズ化合物が好ましく、テトラブチルチタネートが特に好ましい。
【００２７】
エステル化反応またはエステル交換反応触媒の使用量は特に限定されないが、ＰＢＴ中の金属濃度（質量）として、通常１ｐｐｍ以上、好ましくは５ｐｐｍ以上、更に好ましくは１０ｐｐｍ以上、特に好ましくは２０ｐｐｍ以上、最も好ましくは３０ｐｍｍ以上、通常３００ｐｐｍ以下、好ましくは２００ｐｐｍ以下、より好ましくは１５０ｐｐｍ以下、更に好ましくは１００ｐｐｍ以下、特に好ましくは９０ｐｐｍ以下、最も好ましくは６０ｐｍｍ以下が良い。上記上限以下であると、異物の原因となりにくい上、ＰＢＴの熱滞留時の劣化反応やガス発生が起こりにくい傾向があり、上記下限以上であると、主反応速度が速く副反応が起こりにくい。
【００２８】
また、重縮合反応触媒としては、エステル化反応またはエステル交換反応の触媒をそのまま重縮合反応触媒として用いてもよいし、更に前記触媒を添加してもよい。重縮合反応触媒の使用量に特に制限はないが、上記のエステル化反応またはエステル交換反応の触媒と同様の理由から、ＰＢＴ中の金属濃度（質量）として、通常３００ｐｐｍ以下、好ましくは２００ｐｐｍ以下、更に好ましくは１００ｐｐｍ以下、特に好ましくは５０ｐｐｍ以下、最も好ましくは３０ｐｐｍ以下がよい。
【００２９】
また、触媒として有機チタン化合物を用いる場合には、異物抑制の観点から、最終的にはＰＢＴ中のチタン金属濃度（質量）は、２５０ｐｐｍ以下であることが好ましく、１００ｐｐｍ以下であることが更に好ましく、６０ｐｐｍ以下であることが特に好ましく、５０ｐｐｍ以下であることが最も好ましい。
ＰＢＴ中の金属濃度（質量）は、湿式灰化等の方法でＰＢＴ中の金属を回収した後、原子発光、Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ（ＩＣＰ）法等を用いて測定することができる。
【００３０】
また、前記のエステル化反応、エステル交換反応及び重縮合反応において、前記触媒の他に、正燐酸、亜燐酸、次亜燐酸、ポリ燐酸およびそれらのエステルや金属塩等の燐化合物；水酸化ナトリウム、安息香酸ナトリウム等のナトリウム化合物、酢酸リチウム、水酸化カリウム、酢酸カリウム等のカリウム化合物等のアルカリ金属化合物等の反応助剤；酢酸マグネシウム、酢酸カルシウム等のアルカリ土類金属化合物等の反応助剤；２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−オクチルフェノール、ペンタエリスリチル−テトラキス〔３−（３’，５’−ｔ−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）プロピオネート〕等のフェノール化合物；ジラウリル−３，３’−チオジプロピオネート、ペンタエリスリチル−テトラキス（３−ラウリルチオジプロピオネート）等のチオエーテル化合物；トリフェニルホスファイト、トリス（ノニルフェニル）ホスファイト、トリス（２，４−ジ−ｔ−ブチルフェニル）ホスファイト等の燐化合物等の抗酸化剤；パラフィンワックス、マイクロクリスタリンワックス、ポリエチレンワックス、モンタン酸やモンタン酸エステルに代表される長鎖脂肪酸およびそのエステル；シリコーンオイル等の離型剤等を使用しても良い。
【００３１】
重縮合反応槽としては、縦型攪拌重合槽、横型攪拌重合槽、薄膜蒸発式重合槽等の公知のものを挙げることができる。反応液の粘度が上昇する重縮合の後期は、反応速度よりも物質移動が分子量増大の支配因子になる傾向があるため、副反応を抑制しつつ主反応を押し進めるには、可能な限り温度を下げ、表面更新性を上げた方が本発明の目的を達成するには有利であり、表面更新性とプラグフロー性、セルフクリーニング性に優れた薄膜蒸発機能を有した単数または複数の横型攪拌重合機を選定することが好ましい。
【００３２】
また、本発明の製造法で得られたＰＢＴは、引き続き公知の方法で固相重縮合させて分子量を上げることもできる。
重縮合反応により得られたＰＢＴは、通常、重縮合反応槽の底部からポリマー抜出ダイに移送されてストランド状に抜き出され、水冷されながら若しくは水冷後、カッターで切断されてペレット状又はチップ状の粒状体とされる。粒状体は、引き続き公知の方法等で固相重縮合させて、その固有粘度を上ることもできる。
【００３３】
＜ＰＢＴ＞
本発明のＰＢＴは、テレフタル酸由来の構成単位と１，４ブタンジオール由来の構成単位を含み、窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍである。本発明のＰＢＴにおける窒素原子含有量（質量比）で、上限は、好ましくは１０ｐｐｍ、より好ましくは２ｐｐｍであるのよく、下限は、好ましくは０．０５ｐｐｍ、より好ましくは０．１ｐｐｍであるのが良い。窒素原子含有量が上記範囲内のＰＢＴは、上記の好ましいテレフタル酸又はテレフタル酸アルキレートと１，４ブタンジオールとを原料とすることにより得ることができる。
【００３４】
本発明のＰＢＴの固有粘度に特に制限はないが、機械的物性、ペレット化の安定性、成形性の観点からは、好ましくは０．５０ｄＬ／ｇ以上、更に好ましくは０．７０ｄＬ／ｇ以上、好ましくは１．５０ｄＬ／ｇの以下、更に好ましくは１．３５ｄＬ／ｇ以下であるのが良い。ＰＢＴの固有粘度が上記下限以上であると成形品の機械物性の点で好ましく、
上記上限以下であると成形性の点好ましい傾向がある。
【００３５】
本発明のＰＢＴの末端カルボキシル基濃度に特に制限はないが、下限が、１当量／トンであることが好ましく、２当量／トンであることが更に好ましく、３当量／トンであることが特に好ましく、５当量／トンであることが最も好ましく、上限が、５０当量／トンであることが好ましく、４０当量／トンであることが更に好ましく、３０当量／トンであることが特に好ましく、２５当量／トンであることが最も好ましい。ＰＢＴの末端カルボキシル基濃度が上記上限以下であるとＰＢＴの耐加水分解性を良好な傾向にあり、上記下限以上であると重縮合性が良好な傾向にある。ＰＢＴの末端カルボキシル基濃度は、樹脂を有機溶媒に溶解し、水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液を用いて滴定することにより求めることができる。
【００３６】
本発明のＰＢＴの末端ビニル基濃度に特に制限はないが、色調や重縮合性の点から、好ましくは１５当量／トン以下、更に好ましくは１０当量／トン以下、特には好ましくは７当量／トン以下がよい。ＰＢＴの末端ビニル基濃度は、ＰＢＴを溶媒に溶かしてから各磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を測定することによって求められる。
＜ＰＢＴの色調＞
本発明のＰＢＴは、色調が良好である。
【００３７】
＜ＰＢＴ組成物＞
本発明のＰＢＴは、本発明の優れた効果を大幅に損なわない範囲で、ＰＢＴ以外の成分を含んでいてもよい。具体例を挙げると、熱可塑性、熱硬化性などの各種樹脂、離型剤、充填剤、難燃剤、その他各種添加剤などが挙げられる。
熱可塑性樹脂としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸エステル、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリフェニレンサルファイド、ポリエチレンテレフタレート、液晶ポリエステル、ポリアセタール、ポリフェニレンオキサイド等が挙げられる。また、熱硬化性樹脂としては、フェノール樹脂、メラミン樹脂、シリコーン樹脂、エポキシ樹脂などが挙げられる。これらの樹脂は、１種のみ用いてもよいし、２種以上を組み合わせて使用することも出来る。このうち、熱可塑性樹脂をよく配合する。
【００３８】
これらの樹脂の配合量（質量）は、本発明の優れた効果が発現されていればいくつでもよいが、樹脂全量に対して、ＰＢＴが、通常０．１質量％以上、好ましくは１質量％以上、更に好ましくは１０質量%以上、通常９９．９質量％以下、好ましくは９９質量％以下、更に好ましくは９０質量%以下がよい。
離型剤としては、特に制限されないが、例えば、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−オクチルフェノール、ペンタエリスリチル−テトラキス〔３−（３'，５'−ｔ−ブチル−４'−
ヒドロキシフェニル）プロピオネート〕等のフェノール化合物、ジラウリル−３，３'−
チオジプロピオネート、ペンタエリスリチル-テトラキス（３-ラウリルチオジプロピオネート）等のチオエーテル化合物、トリフェニルホスファイト、トリス（ノニルフェニル）ホスファイト、トリス（２，４−ジ−ｔ−ブチルフェニル）ホスファイト等の燐化合物などの抗酸化剤；パラフィンワックス、マイクロクリスタリンワックス、ポリエチレンワックス；モンタン酸やモンタン酸エステルに代表される長鎖脂肪酸およびそのエステル；シリコーンオイル等などが挙げられる。
【００３９】
強化充填材としては、特に制限されないが、例えば、ガラス繊維、カーボン繊維、シリカ・アルミナ繊維、ジルコニア繊維、ホウ素繊維、窒化ホウ素繊維、窒化ケイ素チタン酸カリウム繊維、金属繊維などの無機繊維；芳香族ポリアミド繊維、フッ素樹脂繊維などの有機繊維などが挙げられる。このうち、無機充填材、特にガラス繊維が好適に使用される。強化充填材は、１種類のみ用いてもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００４０】
強化充填材が無機又は有機繊維である場合、その平均繊維径は、特に制限されないが、通常１〜１００μｍ、好ましくは２〜５０μｍ、更に好ましくは３〜３０μｍ、特に好ましくは５〜２０μｍである。また、平均繊維長は、特に制限されないが、通常０．１〜２０ｍｍ、好ましくは１〜１０ｍｍである。
強化充填材は、ＰＢＴとの界面密着性を向上させるため、収束剤または表面処理剤で表面処理されたものを用いるのが好ましい。収束剤または表面処理剤としては、例えば、エポキシ系化合物、アクリル系化合物、イソシアネート系化合物、シラン系化合物、チタネート系化合物などの官能性化合物が挙げられる。収束剤または表面処理剤による処理は、強化充填剤を予め表面処理しておいてもよいし、ＰＢＴ組成物を調製する際に収束剤または表面処理剤と接触させてもよい。強化充填材の量は、ＰＢＴ樹脂１００質量部に対し、通常１５０質量部以下、好ましくは５〜１００重量部である。
【００４１】
本発明の製造方法で得られるＰＢＴには、強化充填材以外の充填材を配合してもよい。具体的には、例えば、板状無機充填材、セラミックビーズ、アスベスト、ワラストナイト、タルク、クレー、マイカ、ゼオライト、カオリン、チタン酸カリウム、硫酸バリウム、酸化チタン、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム等が挙げられる。板状無機充填材を配合することにより、成形品の異方性およびソリを低減することが出来る。板状無機充填材としては、例えば、ガラスフレーク、雲母、金属箔などを挙げることが出来る。これらの中ではガラスフレークが好適に使用される。
【００４２】
難燃性を付与するために用いる難燃剤としては、特に制限されず、例えば、有機ハロゲン化合物、アンチモン化合物、リン化合物、その他の有機難燃剤、無機難燃剤などが挙げられる。有機ハロゲン化合物としては、例えば、臭素化ポリカーボネート、臭素化エポキシ樹脂、臭素化フェノキシ樹脂、臭素化ポリフェニレンエーテル樹脂、臭素化ポリスチレン樹脂、臭素化ビスフェノールＡ、ポリペンタブロモベンジルアクリレート等が挙げられる。アンチモン化合物としては、例えば、三酸化アンチモン、五酸化アンチモン、アンチモン酸ソーダ等が挙げられる。リン化合物としては、例えば、リン酸エステル、ポリリン酸、ポリリン酸アンモニウム、赤リン等が挙げられる。その他の有機難燃剤としては、例えば、メラミン、シアヌール酸などの窒素化合物などが挙げられる。その他の無機難燃剤としては、例えば、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、ケイ素化合物、ホウ素化合物などが挙げられる。
【００４３】
その他の各種添加剤としては、特に制限されないが、例えば、酸化防止剤、耐熱安定剤などの安定剤の他、滑剤、離型剤、触媒失活剤、結晶核剤、結晶化促進剤などが挙げられる。これらの添加剤は、重縮合途中または重縮合後に添加してもよい。また、紫外線吸収剤、耐候安定剤などの安定剤、染顔料などの着色剤、帯電防止剤、発泡剤、可塑剤、耐衝撃性改良剤などを配合してもよい。
【００４４】
上記のその他成分の配合方法は、特に制限されないが、例えば、ベント口から脱揮できる設備を有する１軸または２軸の押出機を混練機として使用する方法が好ましい。各成分は、付加的成分を含めて、混練機に一括して供給することが出来、あるいは、順次供給することも出来る。また、付加的成分を含めて、各成分から選ばれた２種以上の成分をあらかじめ混合しておくことも出来る。
【００４５】
＜ＰＢＴの成形加工＞
ＰＢＴの成形加工方法は、特に制限されず、熱可塑性樹脂について一般に使用されている成形法等、具体的には、射出成形、中空成形、押し出し成形、プレス成形などを適用出来る。
本発明のＰＢＴ及びこれを含んだ組成物は、色調、熱安定性、透明性、品質安定性に優
れ、電気、電子部品、自動車用部品などの射出成形部品、フィルム、モノフィラメント、繊維などの押出し成形品用途において好適に使用できる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を用いて本発明の内容を更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例により限定されるものではない。
（分析方法）
＜窒素原子含有量（質量ｐｐｍ）の測定方法＞
試料１５ｍｇを石英ボートへ採取して、微量全窒素分析装置(ダイヤインスツルメンツ
社製「ＴＮ−１０型」)を用いて試料を燃焼し、燃焼・化学発光法により定量した。また
、その際に使用した標準試料は、トルエン中にアニリンを溶解し、窒素換算で０，０．５，１．０，２．０μｇ／ｍＬを作製し使用した。
【００４７】
＜ＢＧ中の１，４−ＨＡＢ、ＢＧＴＦ、ＴＨＦ量（質量ｐｐｍ）及びＴＨＦ転化率＞
島津製作所製ガスクロマト分析装置「島津ＧＣＣ−１４ＢＰＦ型」にて、ＤＢ−ＷＡＸカラムを用い、修正面積百分率法により各ピークの成分の含有量を求めた。各ピークの係数は、１，４−ブタンジオールを１．０００とした時に、有効炭素数に基づいて、１，４−ＨＡＢは０．９９０、ＢＧＴＦは０．９２２、ＴＨＦは０．７４７として計算した。
エステル交換反応又はエステル化反応における留出液について、カールフィッシャー法（三菱化学社製「ＣＡ−０３」で測定）にて水分量を求め、水分以外は有機成分とした。有機成分中のＴＨＦ量を上記ガスクロ法により求め、ＴＨＦ生成量とした。ＴＨＦ生成量をテレフタル酸又はジメチルテレフタレートに対するモル％で表し、転化率とした。
【００４８】
＜ＰＢＴの固有粘度、ＩＶ＞
ウベローデ型粘度計を使用して以下の手順で求めた。すなわち、フェノール／テトラクロロエタン（質量比１／１）の混合溶媒を使用し、３０℃において、濃度１.０ｇ／ｄＬ
のポリマー溶液および溶媒のみの落下秒数を測定し、以下の式より求めた。
ＩＶ＝（（１＋４ＫＨηｓｐ）0.5-１）／（２ＫＨＨＣ）
但し、ηｓｐ＝(η／η0)-１であり、ηはポリマー溶液落下秒数、η0は溶媒の落下秒
数、Ｃはポリマー溶液濃度（ｇ／ｄＬ）、ＫＨはハギンズの定数である。ＫＨは０．３３を採用した。
【００４９】
＜ＰＢＴの末端カルボキシル基濃度（当量／トンＰＢＴ）＞
ベンジルアルコール２５ｍＬにＰＢＴ０．５ｇを溶解し、水酸化ナトリウムの０．０１モル／Ｌベンジルアルコール溶液を使用して滴定した。
末端カルボキシル基濃度＝（Ａ−Ｂ）×０．１×ｆ／Ｗ（当量／トン）
（ここで、Ａは、滴定に要した０．０１Ｎの水酸化ナトリウムのベンジルアルコール溶液の量（μＬ）、Ｂは、ブランクでの滴定に要した０．０１モル／Ｌの水酸化ナトリウムのベンジルアルコール溶液の量（μＬ）、Ｗは、ＰＢＴ試料の量（ｇ）、ｆは、０．０１モル／Ｌの水酸化ナトリウムのベンジルアルコール溶液の力価である。）
【００５０】
＜ＰＢＴ 色調ｂ値＞
ペレット状のＰＢＴを日本電色（株）製色差計「Ｚ−３００Ａ型」を使用して、Ｌ、ａ、ｂ表色系におけるｂ値で評価した。値が低いほど黄ばみが少なく色調が良好であることを示す。
【００５１】
＜引張試験片、曲げ試験片の成形方法＞
ペレットを、１２０℃、２ｋＰａで８時間減圧乾燥させた。次に乾燥したペレットを住友重機械工業社製「ＭＩＮＩＭＡＴ８／７Ａ型射出成形機」にて、シリンダ温度２５０℃、金型温度８０℃、射出保圧時間５秒、冷却２０秒で成形し、引張試験片と曲げ試験片を
それぞれ得た。
引張試験片の形状は長さ５５ｍｍ、厚み３ｍｍ、中央平行部長さ２５ｍｍ、中央平行部幅３．２ｍｍ、両端幅６ｍｍのダンベル状であり、曲げ試験片の形状は長さ５３ｍｍ、厚み３ｍｍ、幅７ｍｍの短冊状であった。引張試験片の形状を図１に示す。
【００５２】
＜成形品の引張強度 ＭＰａ＞
上記で得られた引張試験片をＪＩＳ Ｋ７１１３に準拠して温度２５℃、相対湿度５０％の恒温恒湿下で、島津製作所社製「オートグラフＡＧＳ−５ｋＮＧ型試験機」を用いて、チャック間距離３２ｍｍ、引張試験速度１０ｍｍ／分にて測定した。
【００５３】
＜成形品の曲げ弾性率 ＭＰａ＞
上記で得られた曲げ試験片をＪＩＳ Ｋ７１７１に準拠して温度２５℃、相対湿度５０％の恒温恒湿下で、東洋精機社製「ストログラフＲ２型試験機」を用いて、スパン３０ｍｍ、載荷速度２ｍｍ／分にて測定した。
（製造例）
参考例１から参考例５の＜コハク酸醗酵液からのコハク酸精製＞までは、特願２００６−５２４９７６号と同様に行った。
【００５４】
参考例１
＜遺伝子破壊用ベクターの構築＞
（Ａ）枯草菌ゲノムＤＮＡの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。
【００５５】
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。更にドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５質量％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０質量％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【００５６】
（Ｂ）ＰＣＲによるＳａｃＢ遺伝子の増幅およびクローニング
枯草菌ＳａｃＢ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、既に報告されている該遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｘ０２７３０）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。
【００５７】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。
【００５８】
増幅産物の確認は、０．７５質量％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００５９】
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ：ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ製）のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００６０】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、次に５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１０質量％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃で２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。ＳａｃＢ遺伝子が大腸菌内で機能的に発現する株は、ショ糖含有培地にて生育不能となるはずである。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断することにより、約２ｋｂの挿入断片が認められ、該プラスミドをｐＢＳ／ＳａｃＢと命名した。
【００６１】
（Ｃ）クロラムフェニコール耐性ＳａｃＢベクターの構築
大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造：クロラムフェニコール耐性マーカー）５００ｎｇに制限酵素ＰｓｈＢＩ１０ユニットを３７℃で１時間反応させた後、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造製）により両末端を平滑化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕＩリンカー（宝酒造）を連結、環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ＭｌｕＩの切断部位を有するクローンを選抜し、ｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕと命名した。
【００６２】
一方、上記（Ｂ）にて構築したｐＢＳ／ＳａｃＢを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断した後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化した。これにライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕＩリンカーを連結したのち、０．７５質量％アガロースゲル電気泳動によりＳａｃＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収した。このＳａｃＢ遺伝子断片を、制限酵素ＭｌｕＩ切断後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）にて末端を脱リン酸化したｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕ断片とライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。こうして得られたコロニーを、次に３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１０質量％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃で２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法によりプラスミドＤＮＡを精製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＭｌｕＩ切断により解析した結果、約２．０ｋｂの挿入断片を持つことが確認され、これをｐＣＭＢ１と命名した。
【００６３】
（Ｄ）カナマイシン耐性遺伝子の取得
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（宝酒造：カナマイシン耐性マーカー）のＤＮＡを鋳型とし、配列番号３および配列番号４で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）０．１μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．５μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【００６４】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６２℃で１５秒、７２℃で１分２０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５質量％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．１ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した。
【００６５】
（Ｅ）カナマイシン耐性ＳａｃＢベクターの構築
上記（Ｃ）で構築したｐＣＭＢ１を制限酵素Ｖａｎ９１ＩおよびＳｃａＩで切断して得られた約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５質量％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを上記（Ｄ）で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００６６】
このカナマイシン含有培地上で生育した株は、ショ糖含有培地にて生育不能であることが確認された。また、同株から調製したプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎｄIII消化
により３５４、４７３、１８０７、１９９７ｂｐの断片を生じたことから、図２に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＫＭＢ１と命名した。
【００６７】
参考例２
＜ＬＤＨ遺伝子破壊株の作製＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ
、カザミノ酸 １ｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体から上記参考例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
【００６８】
（Ｂ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
ＭＪ２３３株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、特開平１１−２０６３８５号公報に記載の該遺伝子の塩基配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【００６９】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５質量％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００７０】
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨと命名した。
【００７１】
（Ｃ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの構築
上記（Ｂ）で作製したｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで切断することにより約０．２５ｋｂからなるラクテートデヒドロゲナーゼのコーディング領域を切り出した。残った約３．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をクレノウフラグメントにて平滑化し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたクローンを選抜し、これをｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨと命名した。
【００７２】
次に、上記ｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断して生じる約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を、０．７５質量％アガロースゲル電気泳動により分離、回収し、欠損領域を含むラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片を調製した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断した参考例１にて構築したｐＫＭＢ１と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬX−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に
塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨと命名した（図３）。
【００７３】
（Ｄ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
【００７４】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．１４４， ｐ．１８１−１８５， １９９３）によ
って行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［
トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース ２０ｇ、
及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００７５】
この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
【００７６】
次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０質量％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約１０個得た。
この様にして得られた株の中には、そのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子がｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号７および配列番号８）を用いて分析すると、野生型では７２０ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では４７１ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。
上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨと命名した。
【００７７】
（Ｅ）ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の確認
上記（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株をＡ培地に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）］で洗浄した。
【００７８】
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍＬに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
【００７９】
ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ+に酸化されるのを、３４０ｎｍの
吸光度変化として測定した［Ｌ． Ｋａｎａｒｅｋ ａｎｄ Ｒ． Ｌ． Ｈｉｌｌ， Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３９， ４２０２（１９６４）］。反応は、５０ｍＭ カリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ ピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７
℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性に対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、１０分の１以下であった。
【００８０】
参考例３
＜コリネ型細菌発現ベクターの構築＞
（Ａ）コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有することが報告された特開平７−９５８９１号公報の配列番号４に記載のＤＮＡ断片（以降ＴＺ４プロモーターと称する）を利用することとした。本プロモーター断片の取得は、参考例２の（Ａ）で調製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ゲノムＤＮＡを鋳型とし、特開平７−９５８９１号公報の配列番号４に記載の配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号９および配列番号１０）を用いたＰＣＲによって行った。
【００８１】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
【００８２】
増幅産物の確認は、２．０質量％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．２５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００８３】
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１９（宝酒造）のＳｍａI部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００８４】
この培地上で白色のコロニーを形成した６クローンについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。これ中でＴＺ４プロモーターがｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターと逆方向に転写活性を有するように挿入されたクローンを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４と命名した。
次に、ｐＵＣ／ＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡ断片に、５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号１１および配列番号１２）から成り、両末端にそれぞれＢａｍＨＩとＰｓｔＩに対する粘着末端を有するＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。本ＤＮＡリンカーには、リボソーム結合配列（ＡＧＧＡＧＧ）およびその下流に配したクローニングサイト（上流から順に、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＡｐａＩ）が含まれている。
【００８５】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤと命名した。
この様にして構築したｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することにより生じた約０．３ｋｂのプロモーター断片を、２．０質量％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
【００８６】
（Ｂ）コリネ型細菌発現ベクターの構築
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、特開平１２−９３１８３号公報記載のｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを利用する。本プラスミドは、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４４株が保有する天然型プラスミドｐＢＹ５０３の複製領域および安定化機能を有する領域と大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８（宝酒造）に由来するカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。ｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを制限酵素ＳｓｅＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡを、上記（Ａ）で調製したＴＺ４プロモーター断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、該プラスミドをｐＴＺ４と命名した（図３に構築手順を示した）。
【００８７】
参考例４
＜ピルベートカルボキシラーゼ活性増強株の作製＞
（Ａ）ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得は、参考例２の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１３および配列番号１４）を用いたＰＣＲによって行った。
【００８８】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、更に７２℃で３０分保温した。
【００８９】
増幅産物の確認は、０．７５質量％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００９０】
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００９１】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭ／ＭＪＰＣと命名した。
ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビックダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号１５に記載する。また、アミノ酸配列のみを配列番号１６に記載する。本アミノ酸配列はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株由来のそれと極めて高い相同性（９９．４％）を示すことから、ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来のピルベートカルボキシラーゼ遺伝子であると断定した。
【００９２】
（Ｂ）ピルベートカルボキシラーゼ活性増強用プラスミドの構築
上記（Ａ）で作製したｐＧＥＭ／ＭＪＰＣを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより生じる約３．７ｋｂからなるピルベートカルボキシラーゼ遺伝子断片を、０．７５質量％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
このＤＮＡ断片を、制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩにて切断した、参考例３にて構築したｐＴＺ４と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１と命名した（図５）。
【００９３】
（Ｃ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株内で複製可能なｐＭＪＰＣ１による形質転換用のプラスミドＤＮＡは、上記（Ｂ）で形質転換した大腸菌（ＤＨ５α株）から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．, Ｖｏｌ．１４４，ｐ．１８１−１８５， １９９３）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培
地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース ２０
ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上に生育した株から、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素切断による解析を行った結果、同株がｐＭＪＰＣ１を保持していることを確認し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
【００９４】
（Ｄ）ピルベートカルボキシラーゼ酵素活性
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２質量％、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含むＡ培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍｌで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は１００ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、 ０．１ｍｇ／１０ｍｌビオチン、
５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、５ｍＭ ピルビン酸ナトリウム
、５ｍＭ アデノシン三リン酸ナトリウム、０．３２ｍＭ ＮＡＤＨ、２０ｕｎｉｔｓ／
１．５ｍｌリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＷＡＫＯ製、酵母由来）及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼを発現させた無細胞抽出液における比活性は０．２Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。尚親株であるＭＪ２３３／△ＬＤＨ株をＡ培地を用いて同様に培養した菌体では、本活性測定方法によりピルベートカルボキシラーゼ活性
は検出されなかった。
【００９５】
参考例５
＜発酵液の調製＞
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０質量％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５質量％カナマイシン水溶液を５０μＬ添加し、参考例４（Ｃ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。
【００９６】
尿素：１２ｇ、硫酸アンモニウム：４２ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：６０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：６０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：６００μｇ、塩酸チアミン：６００μｇ、酵母エキス３ｇ、カザミノ酸３ｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２５００ｍＬの培地を５Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した１２質量％グルコース水溶液を５００ｍＬ添加し、これに前述の種培養液を全量加えて、３０℃に保温した。通気は毎分５００ｍＬ、攪拌は毎分５００回転で本培養を行った。１２時間後にグルコースがほぼ消費されていた。
【００９７】
硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：６０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：６０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：６００μｇ、塩酸チアミン：６００μｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：５ｍｌ及び蒸留水：１．５Ｌの培地を３Ｌの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記の本培養により得られた培養液を１００００ｇ、５分の遠心分離により集菌した菌体を添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が６０になるように再懸濁した。この懸濁液１．５Ｌとあらかじめ滅菌した２０質量％グルコース溶液１．５Ｌを５Ｌのジャーファーメンターに入れて混合し、３５℃に保温した。ｐＨは２Ｍ炭酸アンモニウムを用いて７．６に保ち、毎分５００ｍＬで通気、毎分３００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約５０時間でグルコースがほぼ消費されていた。コハク酸が５７ｇ／Ｌ蓄積されていた。この発酵液を１００００ｇ、５分間の遠心分離、限外濾過（日東電工（株）製 ＮＴＵ−３０００−Ｃ１Ｒ）により菌体と上清に分離した。以上の操作を３０回行うことにより、コハク酸発酵液上清を１０３Ｌ得ることが出来た。
【００９８】
＜コハク酸醗酵液からのコハク酸精製＞
上記のようにして得られたコハク酸発酵液上清を１０３Ｌ（コハク酸含有量５．８７ｋｇ）を、減圧しながらジャケット付き攪拌槽にて濃縮し、コハク酸の濃度が３２.９質量
％、アンモニア１１．９質量％の濃縮液：１７．８ｋｇ（計算値）を得た。これに酢酸（ダイセル化学社製）を８．５８ｋｇ加えて３０℃まで冷却し、更にメタノール（キシダ化学社製）を４．０ｋｇ加えて１５℃まで冷却し１時間攪拌した後、２０℃にて４時間攪拌を継続した。
【００９９】
結晶が析出しており、これを遠心ろ過器にてろ過を行い、コハク酸を７４．６質量％、酢酸３．５質量％、アンモニア１２．２質量％を含有する結晶４．９５ｋｇを得た。
酢酸１１．３ｋｇに得られた結晶４．９ｋｇを入れ、８５℃にて溶解し、直ちに２０℃まで冷却した。既に結晶は析出していたが、そのまま更に３時間攪拌を続けた後、遠心ろ過器にてろ過を行い、コハク酸８７．９質量％、酢酸８．４質量％、アンモニア０．６質
量％を含有する結晶２．４４ｋｇを得た。
【０１００】
５℃に冷やした脱塩水３．５Ｌにて得られた結晶を懸洗し、これを遠心ろ過器にてろ過すると、コハク酸９０質量％、酢酸１．７質量％、アンモニア０．０５質量％（およそ５００質量ｐｐｍ）含有する２．０８ｋｇの結晶が得られた。
この粗コハク酸結晶２．０ｋｇを２８．５Ｌの脱塩水に溶解し、１Ｌのイオン交換樹脂（三菱化学社製ＳＫ１ＢＨ）をつめた塔にＳＶ＝２にて通液し、約３３Ｌの処理液を得た。これを減圧したロータリーエバポレータに連続フィードしながら、およそ５．２Ｌまで濃縮した。この段階で既に結晶が析出していた。更に、５℃に冷却し、２時間攪拌を継続した後、これをろ過すると、コハク酸９６．７質量％の結晶１．７６ｋｇを得た。 これを真空乾燥機にて乾燥すると１．６８ｋｇのコハク酸を得る事が出来た。
【０１０１】
＜１，４−ブタンジオールの製造＞
上記のような方法で得られたバイオマス資源由来コハク酸を用いて、以下の方法で１，４−ブタンジオールを得た。
バイオマス資源由来コハク酸１００重量部、メタノール３１７重量部ならびに濃硫酸（９７質量％）２重量部の混合液を、還流下で２時間攪拌させた。反応液を冷却後、炭酸水素ナトリウム３．６重量部を添加して６０℃で３０分間反応液を攪拌させた。常圧下での蒸留ならびにその蒸留残をろ過後、減圧蒸留することによりコハク酸ジメチル（収率９３％）を得た。得られたコハク酸ジメチル１００重量部をＣｕＯ−ＺｎＯ触媒（ズードケミー社製「Ｔ―８４０２」）１５重量部存在下、仕込みコハク酸ジメチルに対して約４倍の体積容量を持つオートクレーブ（ハステロイＣ）を用いて水素５ＭＰａ加圧下で攪拌させながら１時間かけて２３０℃まで昇温させた。その後、２３０℃で１５ＭＰａの水素加圧下９時間反応液を攪拌させた。反応液を冷却後、脱ガスを行った。反応液からろ過により触媒を除去した。ろ液を減圧蒸留することにより精製１，４−ブタンジオールを得た（収率８１％）。製造された精製１，４−ブタンジオール中には窒素原子が０．７質量ｐｐｍ含まれたが、硫黄原子は含まれていなかった。また、１，４−ブタンジオール中には酸化生成物である２-(４-ヒドロキシブチルオキシ)テトラヒドロフランが５８４質量ｐｐｍ含有されていた。
【０１０２】
［実施例１］
攪拌装置、窒素導入口、加熱装置、温度計、留出管、減圧用排気口を備えた反応容器に、ジメチルテレフタレート（帝人製）１３２質量部、窒素原子０．７質量ｐｐｍを含有する製造例１で得られたＢＧ７４質量部及び触媒としてテトラブチルチタネートをあらかじめ６質量％溶解させた１，４―ブタンジオール溶液１．７質量部を仕込み、窒素―減圧置換によって系内を窒素雰囲気下にした。
【０１０３】
次に、系内を撹拌しながら１５０℃まで加温後、２１５℃に昇温しながらエステル交換反応によって生成するメタノールを留出させつつ３時間反応した。次に、１．５時間かけて２４５℃まで昇温するとともに、１．５時間かけて０．０７ｋＰａになるように減圧し、同減圧度で１．５時間重縮合反応を行い、反応系を常圧に戻し重縮合を終了した。得られたＰＢＴを反応槽の底部からストランドとして抜き出し、１０℃の水中を潜らせた後、カッターでストランドをカットすることによりペレット状のＰＢＴを得た。
【０１０４】
得られたＰＢＴ中の窒素原子含有量は、０．４質量ｐｐｍ、ＰＢＴの固有粘度（ＩＶ）は１．０６ｄＬ／ｇ、末端カルボキシル基量は２１当量／トンあった。減圧開始から重縮合終了までを重縮合時間として、固有粘度／重縮合時間を重縮合速度とした。
重縮合速度は０．３５ｄＬ／ｇ／ｈであった。
ＴＨＦ転化率は、エステル交換反応中の留出液をドライアイストラップで冷却採取したものについてＴＨＦ量を分析し、ジメチルテレフタレートあたりのモル％で表した。２モ
ル％であった。結果を表１に示す。
【０１０５】
［比較例１］
実施例１においてＢＧを化石燃料原料由来のＢＧ（三菱化学製ＢＧ）に変え、重縮合時間を表１に示す時間に変えた以外は実施例１と同様に行い、ＰＢＴを得た。各種分析結果を表１に示す。
［実施例２］
攪拌装置、窒素導入口、加熱装置、温度計及び減圧用排気口を備えた反応容器に、テレフタル酸１１３質量部、窒素原子０．７質量ｐｐｍを含有する製造例１で得られたＢＧ１８３質量部及び触媒としてテトラブチルチタネートをあらかじめ６質量％溶解させた１，４―ブタンジオール溶液０．７質量部を仕込み、窒素―減圧置換によって系内を窒素雰囲気下にした。
【０１０６】
次に、系内を撹拌しながら１５０℃まで加温後、圧力を７８ｋＰａになるよう減圧した後、２２０℃に１時間で昇温させて、さらに２時間生成する水を留出させつつエステル化反応した後窒素ガスにて常圧に戻した。
次に、酢酸マグネシウム４水塩を水に溶解し、さらにＢＧに溶解させた酢酸マグネシウム４水塩１質量％の１，４―ブタンジオール溶液（酢酸マグネシウム４水塩、水、１，４―ブタンジオールの質量比は１：２：９７）１．３質量部を添加した。
【０１０７】
次に、１．５時間かけて２４５℃まで昇温するとともに、１．５時間かけて０．０７ｋＰａになるように減圧し、同減圧度で１．１時間重縮合反応を行い、反応系を常圧に戻し重縮合を終了した。得られたＰＢＴを反応槽の底部からストランドとして抜き出し、１０℃の水中を潜らせた後、カッターでストランドをカットすることによりペレット状のＰＢＴを得た。
【０１０８】
酢酸マグネシウム添加後の減圧開始から重縮合終了までを重縮合時間として、固有粘度／重縮合時間を重縮合速度とした。重縮合速度は０．３５ｄＬ／ｇ／ｈであった。ＴＨＦ転化率は、エステル化反応中の留出液をドライアイストラップで冷却採取したものについてＴＨＦ量を分析し、仕込みテレフタル酸あたりのモル％で表した。５４モル％であった。
得られたぺレット状のＰＢＴを射出成形にて引張試験片、曲げ試験片に成形し引張強度と曲げ弾性率を測定した。
各種分析結果を表１に示す。
【０１０９】
［比較例２］
実施例２においてＢＧを化石燃料原料由来のＢＧ（三菱化学製）に変え、重縮合時間を表１に示す時間に変えた以外は実施例２と同様に行い、ＰＢＴを得た。各種分析結果を表１に示す。
【０１１０】
［比較例３］
実施例２においてＢＧを化石燃料原料由来のＢＧ（東燃化学製）に変え、重縮合時間を表１に示す時間に変えた以外は実施例２と同様に行い、ＰＢＴを得た。各種分析結果を表１に示す。
表１より、実施例は、重縮合速度が大きく、ＴＨＦ化への転化率が小さいこと、及び実施例のＰＢＴは窒素含有量が少なく、色調が良好であること、等がわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明のＰＢＴは、色調良好である。また、本発明のＰＢＴの製法は、効率的に、ＴＨＦへの転化が少ない。更に、バイオマス資源の有効利用にも寄与している。
【０１１２】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】引張試験片の形状 単位ｍｍ。
【図２】ｐＫＭＢ１の構築の概略を示す。
【図３】ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨの構築の概略を示す。
【図４】ｐＴＺベクターの構築の概略を示す。
【図５】ｐＭＪＰＣ１の構築の概略を示す。
【図６】配列番号
【図７】配列番号
【図８】配列番号
【図９】配列番号
【図１０】配列番号
【図１１】配列番号
【図１２】配列番号
【図１３】配列番号
【図１４】配列番号
【図１５】配列番号
【図１６】配列番号
【図１７】配列番号
【技術分野】
【０００１】
本発明は、窒素原子含有量が特定範囲で色調良好なポリブチレンテレフタレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
熱可塑性ポリエステル樹脂の中で代表的なエンジニアリンブプラスチックであるポリブチレンテレフタレート（以下ＰＢＴと表す)は、成形加工の容易性、機械的物性、耐熱性
、耐薬品性、保香性、その他の物理的・化学的特性に優れていることから、自動車部品、電気・電子部品、精密機器部品などの射出成形品に広く使用されている。また、近年は、その優れた性質を活かし、フィルム、シート、モノフィラメント、繊維などの一般消費材分野でも広く使用されており、これに伴って、色調良好なＰＢＴが求められるようになってきている。
【０００３】
ＰＢＴは、通常、テレフタル酸又はそのアルキルエステルと１，４−ブタンジオール（以下ＢＧと表すことがある）とを反応させて製造するが、ＢＧは反応中にテトラヒドロフラン(以下ＴＨＦと表すことがある)に転化しやすいため、ＴＨＦ転化率の低いＰＢＴの製造方法が求められている。
一方、循環型（サステイナブル）社会の構築を求める声の高まりとともに、樹脂材料分野においてもエネルギーと同様に化石燃料原料からの脱却が望まれている。化石燃料を原料としない樹脂材料を開発する場合、植物などを原料とするバイオマス資源が有力な原料候補であり、バイオマスプラスチックの実用化が進んでいる。
【０００４】
原料である１，４ブタンジオールがバイオマス資源から得られたものである場合、化石燃料から得られたものである場合に比べ、ＰＢＴの色調が悪くなる。
特許文献１には、バイオマス資源を原料としてポリエステルを得る技術について、ジカルボン酸中の窒素含有量を制御することにより、窒素含有量１０００質量ｐｐｍ以下のポリエステルを得ることについて記載されている。しかしながら、該文献には、ジオール中の窒素含有量及びその影響については記載も示唆もない。又、ＰＢＴに関する記載も全く無い。（尚、以下、本発明において、特に断らない限り濃度表示「ｐｐｍ」は、「質量ｐｐｍ」を表す。）
【特許文献１】特開２００５―１３９２８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の現状に鑑みてなされたものであり、色調良好なＰＢＴを提供すること、及び原料ＢＧのＴＨＦへの転化率が低く、ＰＢＴを効率的に製造できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討した。この結果、特定量の窒素原子を含有するＰＢＴの色調が良好であることを見出し本発明に到達した。
即ち、本発明の要旨は、テレフタル酸由来の構成単位と１，４ブタンジオール由来の構成単位を含み、窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであることを特徴とするポリブチレンテレフタレートに存する。また、本発明の別の要旨は、テレフタル酸又はテレフタル酸アルキレートと窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍの１，４ブタンジオールとをエステル化反応又はエステル交換反応させた後、重縮合反応させるポリブチレンテレフタレートの製造方法に存する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、色調良好で高品質なＰＢＴを得ることができる。特に、バイオマス資源由来のＢＧを原料として、色調良好なＰＢＴを得ることができる。また、原料ＢＧのＴＨＦへの転化率が低く、効率的にＰＢＴ原料を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下に記載する各構成要件の説明は、本発明の実施態様の代表例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
尚、本明細書において、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。また、本明細書における、下限値又は上限値は、その下限値又は上限値の数値を含む範囲を意味する。
＜ＰＢＴ製造原料＞
本発明のＰＢＴは、テレフタル酸又はテレフタル酸アルキレートと１，４ブタンジオールとをエステル化反応又はエステル交換反応させた後、重縮合反応させることにより得られる。本発明のＰＢＴの製造に用いる原料は、バイオマス資源由来であるのが、環境保護の点から好ましい。
【０００９】
テレフタル酸又はテレフタル酸アルキルエステルは、全ジカルボン酸成分の８０モル％以上であるのが好ましく、９０モル％以上であるのが更に好ましく、１００モル％であるのが最も好ましい。また、ＢＧ成分は、全ジオール成分の８０モル％以上であるのが好ましく、９０モル％以上であるのが更に好ましく、１００モル％であるのが最も好ましい。テレフタル酸又はテレフタル酸アルキルエステルの全ジカルボン酸成分に占める割合及びＢＧ成分の全ジオール成分に占める割合が前記範囲以上であると、電気部品等に成形する際の結晶化の点やフィルム、繊維等に成形する際の延伸による分子鎖の配向結晶化の点から、成形体としての機械的強度、耐熱性、保香性等が良好になりやすい。
【００１０】
テレフタル酸又はテレフタル酸アルキルエステル以外のジカルボン酸成分としては、具体的には、例えば、フタル酸、イソフタル酸、ジブロモイソフタル酸、スルホイソフタル酸ナトリウム、フェニレンジオキシジカルボン酸、４，４’−ジフェニルジカルボン酸、４，４’−ジフェニルエーテルジカルボン酸、４，４’−ジフェニルケトンジカルボン酸、４，４’−ジフェノキシエタンジカルボン酸、４，４’−ジフェニルスルホンジカルボン酸、２，６−ナフタレンジカルボン酸等の芳香族ジカルボン酸およびこれらのエステル形成性誘導体；ヘキサヒドロテレフタル酸、ヘキサヒドロイソフタル酸等の脂環式ジカルボン酸およびこれらのエステル形成性誘導体；コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカジカルボン酸、ドデカジカルボン酸等の脂肪族鎖式ジカルボン酸よびこれらのエステル形成性誘導体等が挙げられる。
【００１１】
ＢＧ以外のジオール成分としては、具体的には、例えば、エチレングリコール、トリメチレングリコール、ペンタメチレングリコール、ヘキサメチレングリコール、オクタメチレングリコール、デカメチレングリコール、ネオペンチルグリコール、２−エチル−２−ブチル−１，３−プロパンジオール、ポリエチレングリコール、ポリテトラメチレンエーテルグリコール等の脂肪族鎖式ジオール；１，２−シクロヘキサンジオール、１，４−シクロヘキサンジオール、１，１−シクロヘキサンジメチロール、１，４−シクロヘキサンジメチロール、２，５−ノルボルナンジメチロール等の脂環式ジオール；キシリレングリコール、４，４’−ジヒドロキシビフェニル、２，２−ビス（４’−ヒドロキシフェニル）プロパン、２，２−ビス（４’−β−ヒドロキシエトキシフェニル）プロパン、ビス（４−ヒドロキシフェニル）スルホン、ビス（４−β−ヒドロキシエトキシフェニル）スルホン酸等の芳香族ジオール；２，２−ビス（４’−ヒドロキシフェニル）プロパンのエチレンオキサイド付加物又はプロピレンオキサイド付加物；バイオマス資源由来でないＢＧ等が挙げられる。
【００１２】
なお、共重合成分として、更に、以下の成分が用いられていてもよい。例えば、グリコール酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−β−ヒドロキシエトキシ安息香酸等のヒドロキシカルボン酸やアルコキシカルボン酸、及び、ステアリルアルコール、ヘネイコサノール、オクタコサノール、ベンジルアルコール、ステアリン酸、ベヘン酸、安息香酸、ｔ−ブチル安息香酸、ベンゾイル安息香酸等の単官能成分、トリカルバリル酸、トリメリット酸、トリメシン酸、ピロメリット酸、ナフタレンテトラカルボン酸、没食子酸、トリメチロールエタン、トリメチロールプロパン、グリセロール、ペンタエリスリトール、シュガーエステル等の三官能以上の多官能成分、等が挙げられる。
【００１３】
＜バイオマス資源由来ＢＧ＞
本発明のＰＢＴの製造に用いるジカルボン酸成分は、バイオマス資源由来であるのが架橋保護の点から好ましい。
バイオマス資源とは、植物の光合成作用で太陽の光エネルギーがデンプンやセルロースなどの形に変換されて蓄えられたもの、植物体を食べて成育する動物の体や、植物体や動物体を加工してできる製品等が含まれる。具体的には、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣、水産物残渣、家畜排泄物、下水汚泥、食品廃棄物等が挙げられる。この中でも、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣等の植物資源が好ましく、より好ましくは、木材、稲わら、籾殻、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、芋、油脂、古紙、製紙残渣が挙げられ、最も好ましくはとうもろこし、さとうきび、キャッサバ、サゴヤシが挙げられる。
【００１４】
バイオマス資源は、一般に、窒素元素やＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ等の多くのアルカリ金属及びアルカリ土類金属を含有する。
これらのバイオマス資源は、その方法は特に限定はされないが、例えば、酸やアルカリ等の化学処理、微生物を用いた生物学的処理、物理的処理等の公知の前処理・糖化の工程等を経て炭素源へと誘導される。その工程には、バイオマス資源をチップ化する、削る、擦り潰す等の前処理による微細化工程が含まれることが多く、必要に応じて、更にグラインダーやミルによる粉砕工程も含まれる。こうして微細化されたバイオマス資源は、通常、更に前処理・糖化の工程を経て炭素源へと誘導される。その具体的な方法としては、硫酸、硝酸、塩酸、燐酸等の強酸による酸処理、アルカリ処理、アンモニア凍結蒸煮爆砕法、溶媒抽出、超臨界流体処理、酸化剤処理等の化学的方法；微粉砕、蒸煮爆砕法、マイクロ波処理、電子線照射等の物理的方法；微生物や酵素処理による加水分解等生物学的処理等が挙げられる。
【００１５】
上記のバイオマス資源から誘導される炭素源としては、通常、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース等のヘキソース；アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース等のペントース；ペントサン、サッカロース、澱粉、セルロース等の２糖・多糖類；酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノクチン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、アラキドン酸、ベヘニン酸、エルカ酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リグノセリン酸、セラコレン酸等の油脂；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられる。このうち、グルコース、フルクトース、キシロース等のヘキソース又はペントースが好ましく、特にグルコースが好ましい。より広義の植物資源由来の炭素源としては、紙の主成分であるセルロースも好ましい。
【００１６】
通常、これらの炭素源を用いて、微生物変換による発酵法や加水分解・脱水反応・水和反応・酸化反応等の反応工程を含む化学変換法ならびにこれらの発酵法と化学変換法の組み合わせによりジオールが合成される。これらの中でも、微生物変換による発酵法が好ましい。
本発明のＰＢＴを製造するのに用いるジオールは、窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであるのが好ましい。バイオマス資源のジオールを用いる場合、具体的には、例えば、グルコース等の炭素源から発酵法により直接ジオールを製造してもよいし、発酵法により得られたコハク酸、コハク酸無水物、コハク酸エステル等を化学反応によりジオール化合物に変換しても良いし、発酵法により得られた１，３−ブタジエンから１，４−ブタンジオールを製造する等してもよい。この中でも、発酵法により得られたコハク酸（又はコハク酸をコハク酸ジメチルに変成後に）を、還元触媒により水添して１，４−ブタンジオールを得る方法が効率的で好ましい。
【００１７】
コハク酸を水添する触媒の例としては、例えば、Ｐｄ、Ｒｕ、Ｒｅ、Ｒｈ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｏ及びその化合物等が挙げられる。具体的には、Ｐｄ／Ａｇ／Ｒｅ、Ｒｕ／Ｎｉ／Ｃｏ／ＺｎＯ、Ｃｕ／Ｚｎ酸化物、Ｃｕ／Ｚｎ／Ｃｒ酸化物、Ｒｕ／Ｒｅ、Ｒｅ／Ｃ、Ｒｕ／Ｓｎ、Ｒｕ／Ｐｔ／Ｓｎ、Ｐｔ／Ｒｅ／アルカリ、Ｐｔ／Ｒｅ、Ｐｄ／Ｃｏ／Ｒｅ、Ｃｕ／Ｓｉ、Ｃｕ／Ｃｒ／Ｍｎ、ＲｅＯ／ＣｕＯ／ＺｎＯ、ＣｕＯ／ＣｒＯ、Ｐｄ／Ｒｅ、Ｎｉ／Ｃｏ、Ｐｄ／ＣｕＯ／ＣｒＯ３、リン酸Ｒｕ、Ｎｉ／Ｃｏ、Ｃｏ／Ｒｕ／Ｍｎ、Ｃｕ／Ｐｄ／ＫＯＨ、Ｃｕ／Ｃｒ／Ｚｎ等が挙げられる。この中でも、Ｒｕ／Ｓｎ又はＲｕ／Ｐｔ／Ｓｎが触媒活性の点で好ましい。
また、更に、バイオマス資源から公知の有機化学触媒反応との組み合わせによりＢＧを製造する方法も用いられる。例えば、バイオマス資源としてペントースを利用する場合には公知の脱水反応、触媒反応の組み合わせで容易にブタンジオール等のジオールを製造できる。
【００１８】
＜ＢＧ中の窒素原子含有量＞
バイオマス資源由来から誘導されたＢＧには、発酵処理ならびに酸による中和工程を含む精製処理に起因して不純物として窒素原子が含まれてくる。具体的には、アミノ酸、蛋白質、アンモニア、尿素、発酵菌由来等の窒素原子が含まれてくる。
本発明においてＰＢＴの原料となる、バイオマス資源から得られたＢＧの窒素原子含有量は、該ＢＧに対して質量比で、上限は、通常５０ｐｐｍ、好ましくは１０ｐｐｍ、より好ましくは２ｐｐｍであるのよい。また、下限は特に制限されないが、通常、０．０１ｐｐｍ、好ましくは０．０５ｐｐｍがよく、特に、精製工程の経済性の観点からは、０．１ｐｐｍであるのが好ましい。ＢＧ中の窒素原子含有量が上記上限以下であると、ＰＢＴ製造における重縮合反応速度、生成するＰＢＴの色調などが好ましくなる傾向が強い。一方、上記下限以上であると、精製工程が簡便としやすく経済的に有利な上、ＰＢＴ製造反応中でのＢＧのＴＨＦへの転化も低く押させやすい。
【００１９】
上記上限以下であると重縮合反応速度や色調の点で好ましくなりやすい理由は定かではないが、発酵処理ならびに酸による中和処理を含む精製処理において、窒素源となる化合物以外に重縮合反応を阻害し、ＰＢＴの色調を悪化させる着色誘引物質が生成しやすくなっているのではないかと推定される。また、発酵における窒素源となるアンモニア、アミノ酸なども反応を遅延させ、ＰＢＴの色調悪化を誘引するものと考えられる。
【００２０】
ＢＧ中の窒素原子量は、例えば、バイオマス資源の発酵により得られるコハク酸を水添してＢＧを得る場合は、その発酵条件、アンモニアによる中和条件、コハク酸の晶析条件などによりコハク酸中の窒素原子量を調節することにより調節可能である。また、コハク酸を水添して得られるＢＧは、蒸留を含む精製条件により、その含有窒素原子含有量を調
節できる。また、ＢＧがバイオマス資源の発酵により直接得られる場合にも、その発酵条件、アンモニアによる中和条件、得られたＢＧの蒸留を含む精製条件などにより調節できる。
【００２１】
＜ＢＧ中の硫黄原子含有量＞
発酵法により製造したＢＧ等を用いる場合には、酸による中和工程を含む精製処理等により硫黄原子が含まれてくる場合がある。この場合、具体的に、硫黄原子が含有される不純物としては、硫酸、亜硫酸、有機スルホン酸塩等が挙げられる。
ＢＧ中に含まれる硫黄原子量は、該ＢＧに対して質量比で、上限は通常１００ｐｐｍ、好ましくは２０ｐｐｍ、より好ましくは１０ｐｐｍ、特に好ましくは５ｐｐｍ、最も好ましくは０．５ｐｐｍである。一方、下限は特に制限されないが、通常０．００１ｐｐｍ、好ましくは０．０１ｐｐｍ、より好ましくは０．０５ｐｐｍ、特に好ましくは、０．１ｐｐｍである。上記上限以下であると、重縮合反応速度やＰＢＴの安定性が好ましくなる傾向がある。一方、上記下限以上であると、精製工程を簡便にして経済的に有利にしやすくなる。硫黄原子含有量は、公知の元素分析法により測定される値である。
【００２２】
＜ＢＧ中の１−アセトキシ−４−ヒドロキシブタン及び２−（４−ヒドロキシブチルオキシ）テトラヒドロフラン）の含有量＞
窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであるＢＧを用いると、ＰＢＴを製造する際の重縮合速度が大きくなる。具体的には、実施例で後述する通り、バイオマス資源から得られ、窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであるＢＧを用いると、化石燃料原料から得られたＢＧを使用した場合に比べて、重縮合速度が大きくなっている。これは、本発明の実施例で用いたＢＧにおける１−アセトキシ−４−ヒドロキシブタン（１，４−ＨＡＢと表すことが有る）及び／又は２−（４−ヒドロキシブチルオキシ）テトラヒドロフラン（ＢＧＴＦと表すことが有る）の含有量が少ないために、重縮合反応の阻害が少ないためであると考えられる。従って、ＢＧ中の１−アセトキシ−４−ヒドロキシブタンは、５０質量ｐｐｍ以下が好ましく、１０質量ｐｐｍ以下がより好ましい。また、下限は少ないほうが良いが通常０．１質量ｐｐｍである。
【００２３】
＜ＰＢＴ製造方法＞
本発明のＰＢＴは、これを製造できれば特に制限されない。ＰＢＴの公知の製造方法は、主原料としてテレフタル酸を用いるいわゆる直接重合法と、主原料としてテレフタル酸ジアルキルエステルを用いるエステル交換法とに大別される。前者は、初期のエステル化反応で水が生成し、後者は初期のエステル交換反応でアルコールが生成するという違いがあるが、原料の入手安定性、留出物の処理の容易さ、原料原単位の高さ、また本発明による改良効果という観点からは直接重合法が好ましい。
【００２４】
直接重合法の一例としては、テレフタル酸とＢＧとを、単数若しくは複数段のエステル化反応槽内で、エステル化反応触媒の存在下に、温度が、通常１８０以上、好ましくは２００℃以上、特に好ましくは２１０℃以上、通常２６０℃以下、好ましくは２５０℃以下、特に好ましくは２４５℃以下で、圧力が、通常１０ｋＰａ以上、好ましくは１３ｋＰａ以上、特に好ましくは５０ｋＰａ以上、通常１３３ｋＰａ以下、好ましくは１０１ｋＰａ以下、特に好ましくは９０ｋＰａ以下で、反応時間が、通常０．５時間以上、好ましくは１時間以上、通常５時間以下、好ましくは３時間以下で、連続的にエステル化反応させ、得られたエステル化反応生成物としてのオリゴマーを重縮合反応槽に移送し、複数段の重縮合反応槽内で、重縮合反応触媒の存在下で連続的に、温度が、通常２１０℃以上、好ましくは２２０℃以上、通常２６０℃以下、好ましくは２５０℃以下、特に好ましくは２４５℃以下で、圧力が、通常２７ｋＰａ以下、好ましくは２０ｋＰａ以下、より好ましくは１３ｋＰａ以下、中でも少なくとも１つの重縮合反応槽においては好ましくは２ｋＰａ以下の減圧下で、攪拌しながら、通常２〜１２時間好ましくは２〜１０時間で縮合反応させる方法等が挙げられる。
【００２５】
エステル交換法の一例としては、テレフタル酸ジメチルとＢＧとを、単数若しくは複数段のエステル化反応槽内で、エステル交換反応触媒の存在下に、温度が１１０℃以上、好ましくは１４０℃以上、特に好ましくは１８０℃以上、２６０℃以下、好ましくは２４５℃以下、特に好ましくは２２０℃以下で、圧力が通常１０ｋＰａ以上、好ましくは１３ｋＰａ以上、特に好ましくは６０ｋＰａ以上、通常１３３ｋＰａ以下、好ましくは１０１ｋＰａ以下、特に好ましくは９０ｋＰａ以下で、反応時間が通常０．５時間以上、好ましくは１時間以上、通常５時間以下、好ましくは３時間以下で、連続的にエステル交換反応させ、得られたエステル交換反応生成物としてのオリゴマーを重縮合反応槽に移送し、複数段の重縮合反応槽内で、重縮合反応触媒の存在下で連続的に、温度が、通常２１０℃以上、好ましくは２２０℃以上、通常２６０℃以下、好ましくは２５０℃以下、特に好ましくは２４５℃以下で、圧力が、通常２７ｋＰａ以下、好ましくは２０ｋＰａ以下、特に好ましくは１３ｋＰａ以下の減圧下、中でも少なくとも１つの重縮合反応槽においては好ましくは２ｋＰａ以下の減圧下で、攪拌しながら、通常２〜１２時間好ましくは２〜１０時間、重縮合反応させる方法等が挙げられる。
【００２６】
エステル化反応またはエステル交換反応触媒としては、例えば、三酸化二アンチモン等のアンチモン化合物；二酸化ゲルマニウム、四酸化ゲルマニウム等のゲルマニウム化合物；テトラメチルチタネート、テトライソプロピルチタネート、テトラブチルチタネート等のチタンアルコラート、テトラフェニルチタネート等のチタンフェノラート等、のチタン化合物；ジブチルスズオキサイド、メチルフェニルスズオキサイド、テトラエチルスズ、ヘキサエチルジスズオキサイド、シクロヘキサヘキシルジスズオキサイド、ジドデシルスズオキサイド、トリエチルスズハイドロオキサイド、トリフェニルスズハイドロオキサイド、トリイソブチルスズアセテート、ジブチルスズジアセテート、ジフェニルスズジラウレート、モノブチルスズトリクロライド、トリブチルスズクロライド、ジブチルスズサルファイド、ブチルヒドロキシスズオキサイド、メチルスタンノン酸、エチルスタンノン酸、ブチルスタンノン酸等のスズ化合物；酢酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マグネシウムアルコキサイド、燐酸水素マグネシウム等のマグネシウム化合物、酢酸カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、カルシウムアルコキサイド、燐酸水素カルシウム、等の等のカルシウム化合物等のアルカリ土類金属化合物の他、マンガン化合物、亜鉛化合物等を挙げることができる。中でも、チタン化合物、スズ化合物が好ましく、テトラブチルチタネートが特に好ましい。
【００２７】
エステル化反応またはエステル交換反応触媒の使用量は特に限定されないが、ＰＢＴ中の金属濃度（質量）として、通常１ｐｐｍ以上、好ましくは５ｐｐｍ以上、更に好ましくは１０ｐｐｍ以上、特に好ましくは２０ｐｐｍ以上、最も好ましくは３０ｐｍｍ以上、通常３００ｐｐｍ以下、好ましくは２００ｐｐｍ以下、より好ましくは１５０ｐｐｍ以下、更に好ましくは１００ｐｐｍ以下、特に好ましくは９０ｐｐｍ以下、最も好ましくは６０ｐｍｍ以下が良い。上記上限以下であると、異物の原因となりにくい上、ＰＢＴの熱滞留時の劣化反応やガス発生が起こりにくい傾向があり、上記下限以上であると、主反応速度が速く副反応が起こりにくい。
【００２８】
また、重縮合反応触媒としては、エステル化反応またはエステル交換反応の触媒をそのまま重縮合反応触媒として用いてもよいし、更に前記触媒を添加してもよい。重縮合反応触媒の使用量に特に制限はないが、上記のエステル化反応またはエステル交換反応の触媒と同様の理由から、ＰＢＴ中の金属濃度（質量）として、通常３００ｐｐｍ以下、好ましくは２００ｐｐｍ以下、更に好ましくは１００ｐｐｍ以下、特に好ましくは５０ｐｐｍ以下、最も好ましくは３０ｐｐｍ以下がよい。
【００２９】
また、触媒として有機チタン化合物を用いる場合には、異物抑制の観点から、最終的にはＰＢＴ中のチタン金属濃度（質量）は、２５０ｐｐｍ以下であることが好ましく、１００ｐｐｍ以下であることが更に好ましく、６０ｐｐｍ以下であることが特に好ましく、５０ｐｐｍ以下であることが最も好ましい。
ＰＢＴ中の金属濃度（質量）は、湿式灰化等の方法でＰＢＴ中の金属を回収した後、原子発光、Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ（ＩＣＰ）法等を用いて測定することができる。
【００３０】
また、前記のエステル化反応、エステル交換反応及び重縮合反応において、前記触媒の他に、正燐酸、亜燐酸、次亜燐酸、ポリ燐酸およびそれらのエステルや金属塩等の燐化合物；水酸化ナトリウム、安息香酸ナトリウム等のナトリウム化合物、酢酸リチウム、水酸化カリウム、酢酸カリウム等のカリウム化合物等のアルカリ金属化合物等の反応助剤；酢酸マグネシウム、酢酸カルシウム等のアルカリ土類金属化合物等の反応助剤；２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−オクチルフェノール、ペンタエリスリチル−テトラキス〔３−（３’，５’−ｔ−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）プロピオネート〕等のフェノール化合物；ジラウリル−３，３’−チオジプロピオネート、ペンタエリスリチル−テトラキス（３−ラウリルチオジプロピオネート）等のチオエーテル化合物；トリフェニルホスファイト、トリス（ノニルフェニル）ホスファイト、トリス（２，４−ジ−ｔ−ブチルフェニル）ホスファイト等の燐化合物等の抗酸化剤；パラフィンワックス、マイクロクリスタリンワックス、ポリエチレンワックス、モンタン酸やモンタン酸エステルに代表される長鎖脂肪酸およびそのエステル；シリコーンオイル等の離型剤等を使用しても良い。
【００３１】
重縮合反応槽としては、縦型攪拌重合槽、横型攪拌重合槽、薄膜蒸発式重合槽等の公知のものを挙げることができる。反応液の粘度が上昇する重縮合の後期は、反応速度よりも物質移動が分子量増大の支配因子になる傾向があるため、副反応を抑制しつつ主反応を押し進めるには、可能な限り温度を下げ、表面更新性を上げた方が本発明の目的を達成するには有利であり、表面更新性とプラグフロー性、セルフクリーニング性に優れた薄膜蒸発機能を有した単数または複数の横型攪拌重合機を選定することが好ましい。
【００３２】
また、本発明の製造法で得られたＰＢＴは、引き続き公知の方法で固相重縮合させて分子量を上げることもできる。
重縮合反応により得られたＰＢＴは、通常、重縮合反応槽の底部からポリマー抜出ダイに移送されてストランド状に抜き出され、水冷されながら若しくは水冷後、カッターで切断されてペレット状又はチップ状の粒状体とされる。粒状体は、引き続き公知の方法等で固相重縮合させて、その固有粘度を上ることもできる。
【００３３】
＜ＰＢＴ＞
本発明のＰＢＴは、テレフタル酸由来の構成単位と１，４ブタンジオール由来の構成単位を含み、窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍである。本発明のＰＢＴにおける窒素原子含有量（質量比）で、上限は、好ましくは１０ｐｐｍ、より好ましくは２ｐｐｍであるのよく、下限は、好ましくは０．０５ｐｐｍ、より好ましくは０．１ｐｐｍであるのが良い。窒素原子含有量が上記範囲内のＰＢＴは、上記の好ましいテレフタル酸又はテレフタル酸アルキレートと１，４ブタンジオールとを原料とすることにより得ることができる。
【００３４】
本発明のＰＢＴの固有粘度に特に制限はないが、機械的物性、ペレット化の安定性、成形性の観点からは、好ましくは０．５０ｄＬ／ｇ以上、更に好ましくは０．７０ｄＬ／ｇ以上、好ましくは１．５０ｄＬ／ｇの以下、更に好ましくは１．３５ｄＬ／ｇ以下であるのが良い。ＰＢＴの固有粘度が上記下限以上であると成形品の機械物性の点で好ましく、
上記上限以下であると成形性の点好ましい傾向がある。
【００３５】
本発明のＰＢＴの末端カルボキシル基濃度に特に制限はないが、下限が、１当量／トンであることが好ましく、２当量／トンであることが更に好ましく、３当量／トンであることが特に好ましく、５当量／トンであることが最も好ましく、上限が、５０当量／トンであることが好ましく、４０当量／トンであることが更に好ましく、３０当量／トンであることが特に好ましく、２５当量／トンであることが最も好ましい。ＰＢＴの末端カルボキシル基濃度が上記上限以下であるとＰＢＴの耐加水分解性を良好な傾向にあり、上記下限以上であると重縮合性が良好な傾向にある。ＰＢＴの末端カルボキシル基濃度は、樹脂を有機溶媒に溶解し、水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液を用いて滴定することにより求めることができる。
【００３６】
本発明のＰＢＴの末端ビニル基濃度に特に制限はないが、色調や重縮合性の点から、好ましくは１５当量／トン以下、更に好ましくは１０当量／トン以下、特には好ましくは７当量／トン以下がよい。ＰＢＴの末端ビニル基濃度は、ＰＢＴを溶媒に溶かしてから各磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を測定することによって求められる。
＜ＰＢＴの色調＞
本発明のＰＢＴは、色調が良好である。
【００３７】
＜ＰＢＴ組成物＞
本発明のＰＢＴは、本発明の優れた効果を大幅に損なわない範囲で、ＰＢＴ以外の成分を含んでいてもよい。具体例を挙げると、熱可塑性、熱硬化性などの各種樹脂、離型剤、充填剤、難燃剤、その他各種添加剤などが挙げられる。
熱可塑性樹脂としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸エステル、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリフェニレンサルファイド、ポリエチレンテレフタレート、液晶ポリエステル、ポリアセタール、ポリフェニレンオキサイド等が挙げられる。また、熱硬化性樹脂としては、フェノール樹脂、メラミン樹脂、シリコーン樹脂、エポキシ樹脂などが挙げられる。これらの樹脂は、１種のみ用いてもよいし、２種以上を組み合わせて使用することも出来る。このうち、熱可塑性樹脂をよく配合する。
【００３８】
これらの樹脂の配合量（質量）は、本発明の優れた効果が発現されていればいくつでもよいが、樹脂全量に対して、ＰＢＴが、通常０．１質量％以上、好ましくは１質量％以上、更に好ましくは１０質量%以上、通常９９．９質量％以下、好ましくは９９質量％以下、更に好ましくは９０質量%以下がよい。
離型剤としては、特に制限されないが、例えば、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−オクチルフェノール、ペンタエリスリチル−テトラキス〔３−（３'，５'−ｔ−ブチル−４'−
ヒドロキシフェニル）プロピオネート〕等のフェノール化合物、ジラウリル−３，３'−
チオジプロピオネート、ペンタエリスリチル-テトラキス（３-ラウリルチオジプロピオネート）等のチオエーテル化合物、トリフェニルホスファイト、トリス（ノニルフェニル）ホスファイト、トリス（２，４−ジ−ｔ−ブチルフェニル）ホスファイト等の燐化合物などの抗酸化剤；パラフィンワックス、マイクロクリスタリンワックス、ポリエチレンワックス；モンタン酸やモンタン酸エステルに代表される長鎖脂肪酸およびそのエステル；シリコーンオイル等などが挙げられる。
【００３９】
強化充填材としては、特に制限されないが、例えば、ガラス繊維、カーボン繊維、シリカ・アルミナ繊維、ジルコニア繊維、ホウ素繊維、窒化ホウ素繊維、窒化ケイ素チタン酸カリウム繊維、金属繊維などの無機繊維；芳香族ポリアミド繊維、フッ素樹脂繊維などの有機繊維などが挙げられる。このうち、無機充填材、特にガラス繊維が好適に使用される。強化充填材は、１種類のみ用いてもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００４０】
強化充填材が無機又は有機繊維である場合、その平均繊維径は、特に制限されないが、通常１〜１００μｍ、好ましくは２〜５０μｍ、更に好ましくは３〜３０μｍ、特に好ましくは５〜２０μｍである。また、平均繊維長は、特に制限されないが、通常０．１〜２０ｍｍ、好ましくは１〜１０ｍｍである。
強化充填材は、ＰＢＴとの界面密着性を向上させるため、収束剤または表面処理剤で表面処理されたものを用いるのが好ましい。収束剤または表面処理剤としては、例えば、エポキシ系化合物、アクリル系化合物、イソシアネート系化合物、シラン系化合物、チタネート系化合物などの官能性化合物が挙げられる。収束剤または表面処理剤による処理は、強化充填剤を予め表面処理しておいてもよいし、ＰＢＴ組成物を調製する際に収束剤または表面処理剤と接触させてもよい。強化充填材の量は、ＰＢＴ樹脂１００質量部に対し、通常１５０質量部以下、好ましくは５〜１００重量部である。
【００４１】
本発明の製造方法で得られるＰＢＴには、強化充填材以外の充填材を配合してもよい。具体的には、例えば、板状無機充填材、セラミックビーズ、アスベスト、ワラストナイト、タルク、クレー、マイカ、ゼオライト、カオリン、チタン酸カリウム、硫酸バリウム、酸化チタン、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム等が挙げられる。板状無機充填材を配合することにより、成形品の異方性およびソリを低減することが出来る。板状無機充填材としては、例えば、ガラスフレーク、雲母、金属箔などを挙げることが出来る。これらの中ではガラスフレークが好適に使用される。
【００４２】
難燃性を付与するために用いる難燃剤としては、特に制限されず、例えば、有機ハロゲン化合物、アンチモン化合物、リン化合物、その他の有機難燃剤、無機難燃剤などが挙げられる。有機ハロゲン化合物としては、例えば、臭素化ポリカーボネート、臭素化エポキシ樹脂、臭素化フェノキシ樹脂、臭素化ポリフェニレンエーテル樹脂、臭素化ポリスチレン樹脂、臭素化ビスフェノールＡ、ポリペンタブロモベンジルアクリレート等が挙げられる。アンチモン化合物としては、例えば、三酸化アンチモン、五酸化アンチモン、アンチモン酸ソーダ等が挙げられる。リン化合物としては、例えば、リン酸エステル、ポリリン酸、ポリリン酸アンモニウム、赤リン等が挙げられる。その他の有機難燃剤としては、例えば、メラミン、シアヌール酸などの窒素化合物などが挙げられる。その他の無機難燃剤としては、例えば、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、ケイ素化合物、ホウ素化合物などが挙げられる。
【００４３】
その他の各種添加剤としては、特に制限されないが、例えば、酸化防止剤、耐熱安定剤などの安定剤の他、滑剤、離型剤、触媒失活剤、結晶核剤、結晶化促進剤などが挙げられる。これらの添加剤は、重縮合途中または重縮合後に添加してもよい。また、紫外線吸収剤、耐候安定剤などの安定剤、染顔料などの着色剤、帯電防止剤、発泡剤、可塑剤、耐衝撃性改良剤などを配合してもよい。
【００４４】
上記のその他成分の配合方法は、特に制限されないが、例えば、ベント口から脱揮できる設備を有する１軸または２軸の押出機を混練機として使用する方法が好ましい。各成分は、付加的成分を含めて、混練機に一括して供給することが出来、あるいは、順次供給することも出来る。また、付加的成分を含めて、各成分から選ばれた２種以上の成分をあらかじめ混合しておくことも出来る。
【００４５】
＜ＰＢＴの成形加工＞
ＰＢＴの成形加工方法は、特に制限されず、熱可塑性樹脂について一般に使用されている成形法等、具体的には、射出成形、中空成形、押し出し成形、プレス成形などを適用出来る。
本発明のＰＢＴ及びこれを含んだ組成物は、色調、熱安定性、透明性、品質安定性に優
れ、電気、電子部品、自動車用部品などの射出成形部品、フィルム、モノフィラメント、繊維などの押出し成形品用途において好適に使用できる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を用いて本発明の内容を更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例により限定されるものではない。
（分析方法）
＜窒素原子含有量（質量ｐｐｍ）の測定方法＞
試料１５ｍｇを石英ボートへ採取して、微量全窒素分析装置(ダイヤインスツルメンツ
社製「ＴＮ−１０型」)を用いて試料を燃焼し、燃焼・化学発光法により定量した。また
、その際に使用した標準試料は、トルエン中にアニリンを溶解し、窒素換算で０，０．５，１．０，２．０μｇ／ｍＬを作製し使用した。
【００４７】
＜ＢＧ中の１，４−ＨＡＢ、ＢＧＴＦ、ＴＨＦ量（質量ｐｐｍ）及びＴＨＦ転化率＞
島津製作所製ガスクロマト分析装置「島津ＧＣＣ−１４ＢＰＦ型」にて、ＤＢ−ＷＡＸカラムを用い、修正面積百分率法により各ピークの成分の含有量を求めた。各ピークの係数は、１，４−ブタンジオールを１．０００とした時に、有効炭素数に基づいて、１，４−ＨＡＢは０．９９０、ＢＧＴＦは０．９２２、ＴＨＦは０．７４７として計算した。
エステル交換反応又はエステル化反応における留出液について、カールフィッシャー法（三菱化学社製「ＣＡ−０３」で測定）にて水分量を求め、水分以外は有機成分とした。有機成分中のＴＨＦ量を上記ガスクロ法により求め、ＴＨＦ生成量とした。ＴＨＦ生成量をテレフタル酸又はジメチルテレフタレートに対するモル％で表し、転化率とした。
【００４８】
＜ＰＢＴの固有粘度、ＩＶ＞
ウベローデ型粘度計を使用して以下の手順で求めた。すなわち、フェノール／テトラクロロエタン（質量比１／１）の混合溶媒を使用し、３０℃において、濃度１.０ｇ／ｄＬ
のポリマー溶液および溶媒のみの落下秒数を測定し、以下の式より求めた。
ＩＶ＝（（１＋４ＫＨηｓｐ）0.5-１）／（２ＫＨＨＣ）
但し、ηｓｐ＝(η／η0)-１であり、ηはポリマー溶液落下秒数、η0は溶媒の落下秒
数、Ｃはポリマー溶液濃度（ｇ／ｄＬ）、ＫＨはハギンズの定数である。ＫＨは０．３３を採用した。
【００４９】
＜ＰＢＴの末端カルボキシル基濃度（当量／トンＰＢＴ）＞
ベンジルアルコール２５ｍＬにＰＢＴ０．５ｇを溶解し、水酸化ナトリウムの０．０１モル／Ｌベンジルアルコール溶液を使用して滴定した。
末端カルボキシル基濃度＝（Ａ−Ｂ）×０．１×ｆ／Ｗ（当量／トン）
（ここで、Ａは、滴定に要した０．０１Ｎの水酸化ナトリウムのベンジルアルコール溶液の量（μＬ）、Ｂは、ブランクでの滴定に要した０．０１モル／Ｌの水酸化ナトリウムのベンジルアルコール溶液の量（μＬ）、Ｗは、ＰＢＴ試料の量（ｇ）、ｆは、０．０１モル／Ｌの水酸化ナトリウムのベンジルアルコール溶液の力価である。）
【００５０】
＜ＰＢＴ 色調ｂ値＞
ペレット状のＰＢＴを日本電色（株）製色差計「Ｚ−３００Ａ型」を使用して、Ｌ、ａ、ｂ表色系におけるｂ値で評価した。値が低いほど黄ばみが少なく色調が良好であることを示す。
【００５１】
＜引張試験片、曲げ試験片の成形方法＞
ペレットを、１２０℃、２ｋＰａで８時間減圧乾燥させた。次に乾燥したペレットを住友重機械工業社製「ＭＩＮＩＭＡＴ８／７Ａ型射出成形機」にて、シリンダ温度２５０℃、金型温度８０℃、射出保圧時間５秒、冷却２０秒で成形し、引張試験片と曲げ試験片を
それぞれ得た。
引張試験片の形状は長さ５５ｍｍ、厚み３ｍｍ、中央平行部長さ２５ｍｍ、中央平行部幅３．２ｍｍ、両端幅６ｍｍのダンベル状であり、曲げ試験片の形状は長さ５３ｍｍ、厚み３ｍｍ、幅７ｍｍの短冊状であった。引張試験片の形状を図１に示す。
【００５２】
＜成形品の引張強度 ＭＰａ＞
上記で得られた引張試験片をＪＩＳ Ｋ７１１３に準拠して温度２５℃、相対湿度５０％の恒温恒湿下で、島津製作所社製「オートグラフＡＧＳ−５ｋＮＧ型試験機」を用いて、チャック間距離３２ｍｍ、引張試験速度１０ｍｍ／分にて測定した。
【００５３】
＜成形品の曲げ弾性率 ＭＰａ＞
上記で得られた曲げ試験片をＪＩＳ Ｋ７１７１に準拠して温度２５℃、相対湿度５０％の恒温恒湿下で、東洋精機社製「ストログラフＲ２型試験機」を用いて、スパン３０ｍｍ、載荷速度２ｍｍ／分にて測定した。
（製造例）
参考例１から参考例５の＜コハク酸醗酵液からのコハク酸精製＞までは、特願２００６−５２４９７６号と同様に行った。
【００５４】
参考例１
＜遺伝子破壊用ベクターの構築＞
（Ａ）枯草菌ゲノムＤＮＡの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。
【００５５】
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。更にドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５質量％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０質量％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【００５６】
（Ｂ）ＰＣＲによるＳａｃＢ遺伝子の増幅およびクローニング
枯草菌ＳａｃＢ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、既に報告されている該遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｘ０２７３０）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。
【００５７】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。
【００５８】
増幅産物の確認は、０．７５質量％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００５９】
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ：ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ製）のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００６０】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、次に５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１０質量％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃で２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。ＳａｃＢ遺伝子が大腸菌内で機能的に発現する株は、ショ糖含有培地にて生育不能となるはずである。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断することにより、約２ｋｂの挿入断片が認められ、該プラスミドをｐＢＳ／ＳａｃＢと命名した。
【００６１】
（Ｃ）クロラムフェニコール耐性ＳａｃＢベクターの構築
大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造：クロラムフェニコール耐性マーカー）５００ｎｇに制限酵素ＰｓｈＢＩ１０ユニットを３７℃で１時間反応させた後、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造製）により両末端を平滑化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕＩリンカー（宝酒造）を連結、環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ＭｌｕＩの切断部位を有するクローンを選抜し、ｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕと命名した。
【００６２】
一方、上記（Ｂ）にて構築したｐＢＳ／ＳａｃＢを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断した後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化した。これにライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕＩリンカーを連結したのち、０．７５質量％アガロースゲル電気泳動によりＳａｃＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収した。このＳａｃＢ遺伝子断片を、制限酵素ＭｌｕＩ切断後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）にて末端を脱リン酸化したｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕ断片とライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。こうして得られたコロニーを、次に３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１０質量％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃で２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法によりプラスミドＤＮＡを精製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＭｌｕＩ切断により解析した結果、約２．０ｋｂの挿入断片を持つことが確認され、これをｐＣＭＢ１と命名した。
【００６３】
（Ｄ）カナマイシン耐性遺伝子の取得
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（宝酒造：カナマイシン耐性マーカー）のＤＮＡを鋳型とし、配列番号３および配列番号４で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）０．１μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．５μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【００６４】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６２℃で１５秒、７２℃で１分２０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５質量％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．１ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した。
【００６５】
（Ｅ）カナマイシン耐性ＳａｃＢベクターの構築
上記（Ｃ）で構築したｐＣＭＢ１を制限酵素Ｖａｎ９１ＩおよびＳｃａＩで切断して得られた約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５質量％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを上記（Ｄ）で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００６６】
このカナマイシン含有培地上で生育した株は、ショ糖含有培地にて生育不能であることが確認された。また、同株から調製したプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎｄIII消化
により３５４、４７３、１８０７、１９９７ｂｐの断片を生じたことから、図２に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＫＭＢ１と命名した。
【００６７】
参考例２
＜ＬＤＨ遺伝子破壊株の作製＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ
、カザミノ酸 １ｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体から上記参考例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
【００６８】
（Ｂ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
ＭＪ２３３株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、特開平１１−２０６３８５号公報に記載の該遺伝子の塩基配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【００６９】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５質量％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００７０】
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨと命名した。
【００７１】
（Ｃ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの構築
上記（Ｂ）で作製したｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで切断することにより約０．２５ｋｂからなるラクテートデヒドロゲナーゼのコーディング領域を切り出した。残った約３．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をクレノウフラグメントにて平滑化し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたクローンを選抜し、これをｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨと命名した。
【００７２】
次に、上記ｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断して生じる約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を、０．７５質量％アガロースゲル電気泳動により分離、回収し、欠損領域を含むラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片を調製した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断した参考例１にて構築したｐＫＭＢ１と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬX−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に
塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨと命名した（図３）。
【００７３】
（Ｄ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
【００７４】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．１４４， ｐ．１８１−１８５， １９９３）によ
って行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［
トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース ２０ｇ、
及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００７５】
この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
【００７６】
次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０質量％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約１０個得た。
この様にして得られた株の中には、そのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子がｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号７および配列番号８）を用いて分析すると、野生型では７２０ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では４７１ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。
上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨと命名した。
【００７７】
（Ｅ）ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の確認
上記（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株をＡ培地に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）］で洗浄した。
【００７８】
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍＬに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
【００７９】
ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ+に酸化されるのを、３４０ｎｍの
吸光度変化として測定した［Ｌ． Ｋａｎａｒｅｋ ａｎｄ Ｒ． Ｌ． Ｈｉｌｌ， Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３９， ４２０２（１９６４）］。反応は、５０ｍＭ カリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ ピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７
℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性に対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、１０分の１以下であった。
【００８０】
参考例３
＜コリネ型細菌発現ベクターの構築＞
（Ａ）コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有することが報告された特開平７−９５８９１号公報の配列番号４に記載のＤＮＡ断片（以降ＴＺ４プロモーターと称する）を利用することとした。本プロモーター断片の取得は、参考例２の（Ａ）で調製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ゲノムＤＮＡを鋳型とし、特開平７−９５８９１号公報の配列番号４に記載の配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号９および配列番号１０）を用いたＰＣＲによって行った。
【００８１】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
【００８２】
増幅産物の確認は、２．０質量％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．２５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００８３】
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１９（宝酒造）のＳｍａI部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００８４】
この培地上で白色のコロニーを形成した６クローンについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。これ中でＴＺ４プロモーターがｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターと逆方向に転写活性を有するように挿入されたクローンを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４と命名した。
次に、ｐＵＣ／ＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡ断片に、５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号１１および配列番号１２）から成り、両末端にそれぞれＢａｍＨＩとＰｓｔＩに対する粘着末端を有するＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。本ＤＮＡリンカーには、リボソーム結合配列（ＡＧＧＡＧＧ）およびその下流に配したクローニングサイト（上流から順に、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＡｐａＩ）が含まれている。
【００８５】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤと命名した。
この様にして構築したｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することにより生じた約０．３ｋｂのプロモーター断片を、２．０質量％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
【００８６】
（Ｂ）コリネ型細菌発現ベクターの構築
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、特開平１２−９３１８３号公報記載のｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを利用する。本プラスミドは、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４４株が保有する天然型プラスミドｐＢＹ５０３の複製領域および安定化機能を有する領域と大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８（宝酒造）に由来するカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。ｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを制限酵素ＳｓｅＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡを、上記（Ａ）で調製したＴＺ４プロモーター断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、該プラスミドをｐＴＺ４と命名した（図３に構築手順を示した）。
【００８７】
参考例４
＜ピルベートカルボキシラーゼ活性増強株の作製＞
（Ａ）ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得は、参考例２の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１３および配列番号１４）を用いたＰＣＲによって行った。
【００８８】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、更に７２℃で３０分保温した。
【００８９】
増幅産物の確認は、０．７５質量％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００９０】
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００９１】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭ／ＭＪＰＣと命名した。
ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビックダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号１５に記載する。また、アミノ酸配列のみを配列番号１６に記載する。本アミノ酸配列はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株由来のそれと極めて高い相同性（９９．４％）を示すことから、ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来のピルベートカルボキシラーゼ遺伝子であると断定した。
【００９２】
（Ｂ）ピルベートカルボキシラーゼ活性増強用プラスミドの構築
上記（Ａ）で作製したｐＧＥＭ／ＭＪＰＣを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより生じる約３．７ｋｂからなるピルベートカルボキシラーゼ遺伝子断片を、０．７５質量％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
このＤＮＡ断片を、制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩにて切断した、参考例３にて構築したｐＴＺ４と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１と命名した（図５）。
【００９３】
（Ｃ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株内で複製可能なｐＭＪＰＣ１による形質転換用のプラスミドＤＮＡは、上記（Ｂ）で形質転換した大腸菌（ＤＨ５α株）から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．, Ｖｏｌ．１４４，ｐ．１８１−１８５， １９９３）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培
地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース ２０
ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上に生育した株から、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素切断による解析を行った結果、同株がｐＭＪＰＣ１を保持していることを確認し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
【００９４】
（Ｄ）ピルベートカルボキシラーゼ酵素活性
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２質量％、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含むＡ培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍｌで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は１００ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、 ０．１ｍｇ／１０ｍｌビオチン、
５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、５ｍＭ ピルビン酸ナトリウム
、５ｍＭ アデノシン三リン酸ナトリウム、０．３２ｍＭ ＮＡＤＨ、２０ｕｎｉｔｓ／
１．５ｍｌリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＷＡＫＯ製、酵母由来）及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼを発現させた無細胞抽出液における比活性は０．２Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。尚親株であるＭＪ２３３／△ＬＤＨ株をＡ培地を用いて同様に培養した菌体では、本活性測定方法によりピルベートカルボキシラーゼ活性
は検出されなかった。
【００９５】
参考例５
＜発酵液の調製＞
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０質量％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５質量％カナマイシン水溶液を５０μＬ添加し、参考例４（Ｃ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。
【００９６】
尿素：１２ｇ、硫酸アンモニウム：４２ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：６０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：６０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：６００μｇ、塩酸チアミン：６００μｇ、酵母エキス３ｇ、カザミノ酸３ｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２５００ｍＬの培地を５Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した１２質量％グルコース水溶液を５００ｍＬ添加し、これに前述の種培養液を全量加えて、３０℃に保温した。通気は毎分５００ｍＬ、攪拌は毎分５００回転で本培養を行った。１２時間後にグルコースがほぼ消費されていた。
【００９７】
硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：６０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：６０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：６００μｇ、塩酸チアミン：６００μｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：５ｍｌ及び蒸留水：１．５Ｌの培地を３Ｌの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記の本培養により得られた培養液を１００００ｇ、５分の遠心分離により集菌した菌体を添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が６０になるように再懸濁した。この懸濁液１．５Ｌとあらかじめ滅菌した２０質量％グルコース溶液１．５Ｌを５Ｌのジャーファーメンターに入れて混合し、３５℃に保温した。ｐＨは２Ｍ炭酸アンモニウムを用いて７．６に保ち、毎分５００ｍＬで通気、毎分３００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約５０時間でグルコースがほぼ消費されていた。コハク酸が５７ｇ／Ｌ蓄積されていた。この発酵液を１００００ｇ、５分間の遠心分離、限外濾過（日東電工（株）製 ＮＴＵ−３０００−Ｃ１Ｒ）により菌体と上清に分離した。以上の操作を３０回行うことにより、コハク酸発酵液上清を１０３Ｌ得ることが出来た。
【００９８】
＜コハク酸醗酵液からのコハク酸精製＞
上記のようにして得られたコハク酸発酵液上清を１０３Ｌ（コハク酸含有量５．８７ｋｇ）を、減圧しながらジャケット付き攪拌槽にて濃縮し、コハク酸の濃度が３２.９質量
％、アンモニア１１．９質量％の濃縮液：１７．８ｋｇ（計算値）を得た。これに酢酸（ダイセル化学社製）を８．５８ｋｇ加えて３０℃まで冷却し、更にメタノール（キシダ化学社製）を４．０ｋｇ加えて１５℃まで冷却し１時間攪拌した後、２０℃にて４時間攪拌を継続した。
【００９９】
結晶が析出しており、これを遠心ろ過器にてろ過を行い、コハク酸を７４．６質量％、酢酸３．５質量％、アンモニア１２．２質量％を含有する結晶４．９５ｋｇを得た。
酢酸１１．３ｋｇに得られた結晶４．９ｋｇを入れ、８５℃にて溶解し、直ちに２０℃まで冷却した。既に結晶は析出していたが、そのまま更に３時間攪拌を続けた後、遠心ろ過器にてろ過を行い、コハク酸８７．９質量％、酢酸８．４質量％、アンモニア０．６質
量％を含有する結晶２．４４ｋｇを得た。
【０１００】
５℃に冷やした脱塩水３．５Ｌにて得られた結晶を懸洗し、これを遠心ろ過器にてろ過すると、コハク酸９０質量％、酢酸１．７質量％、アンモニア０．０５質量％（およそ５００質量ｐｐｍ）含有する２．０８ｋｇの結晶が得られた。
この粗コハク酸結晶２．０ｋｇを２８．５Ｌの脱塩水に溶解し、１Ｌのイオン交換樹脂（三菱化学社製ＳＫ１ＢＨ）をつめた塔にＳＶ＝２にて通液し、約３３Ｌの処理液を得た。これを減圧したロータリーエバポレータに連続フィードしながら、およそ５．２Ｌまで濃縮した。この段階で既に結晶が析出していた。更に、５℃に冷却し、２時間攪拌を継続した後、これをろ過すると、コハク酸９６．７質量％の結晶１．７６ｋｇを得た。 これを真空乾燥機にて乾燥すると１．６８ｋｇのコハク酸を得る事が出来た。
【０１０１】
＜１，４−ブタンジオールの製造＞
上記のような方法で得られたバイオマス資源由来コハク酸を用いて、以下の方法で１，４−ブタンジオールを得た。
バイオマス資源由来コハク酸１００重量部、メタノール３１７重量部ならびに濃硫酸（９７質量％）２重量部の混合液を、還流下で２時間攪拌させた。反応液を冷却後、炭酸水素ナトリウム３．６重量部を添加して６０℃で３０分間反応液を攪拌させた。常圧下での蒸留ならびにその蒸留残をろ過後、減圧蒸留することによりコハク酸ジメチル（収率９３％）を得た。得られたコハク酸ジメチル１００重量部をＣｕＯ−ＺｎＯ触媒（ズードケミー社製「Ｔ―８４０２」）１５重量部存在下、仕込みコハク酸ジメチルに対して約４倍の体積容量を持つオートクレーブ（ハステロイＣ）を用いて水素５ＭＰａ加圧下で攪拌させながら１時間かけて２３０℃まで昇温させた。その後、２３０℃で１５ＭＰａの水素加圧下９時間反応液を攪拌させた。反応液を冷却後、脱ガスを行った。反応液からろ過により触媒を除去した。ろ液を減圧蒸留することにより精製１，４−ブタンジオールを得た（収率８１％）。製造された精製１，４−ブタンジオール中には窒素原子が０．７質量ｐｐｍ含まれたが、硫黄原子は含まれていなかった。また、１，４−ブタンジオール中には酸化生成物である２-(４-ヒドロキシブチルオキシ)テトラヒドロフランが５８４質量ｐｐｍ含有されていた。
【０１０２】
［実施例１］
攪拌装置、窒素導入口、加熱装置、温度計、留出管、減圧用排気口を備えた反応容器に、ジメチルテレフタレート（帝人製）１３２質量部、窒素原子０．７質量ｐｐｍを含有する製造例１で得られたＢＧ７４質量部及び触媒としてテトラブチルチタネートをあらかじめ６質量％溶解させた１，４―ブタンジオール溶液１．７質量部を仕込み、窒素―減圧置換によって系内を窒素雰囲気下にした。
【０１０３】
次に、系内を撹拌しながら１５０℃まで加温後、２１５℃に昇温しながらエステル交換反応によって生成するメタノールを留出させつつ３時間反応した。次に、１．５時間かけて２４５℃まで昇温するとともに、１．５時間かけて０．０７ｋＰａになるように減圧し、同減圧度で１．５時間重縮合反応を行い、反応系を常圧に戻し重縮合を終了した。得られたＰＢＴを反応槽の底部からストランドとして抜き出し、１０℃の水中を潜らせた後、カッターでストランドをカットすることによりペレット状のＰＢＴを得た。
【０１０４】
得られたＰＢＴ中の窒素原子含有量は、０．４質量ｐｐｍ、ＰＢＴの固有粘度（ＩＶ）は１．０６ｄＬ／ｇ、末端カルボキシル基量は２１当量／トンあった。減圧開始から重縮合終了までを重縮合時間として、固有粘度／重縮合時間を重縮合速度とした。
重縮合速度は０．３５ｄＬ／ｇ／ｈであった。
ＴＨＦ転化率は、エステル交換反応中の留出液をドライアイストラップで冷却採取したものについてＴＨＦ量を分析し、ジメチルテレフタレートあたりのモル％で表した。２モ
ル％であった。結果を表１に示す。
【０１０５】
［比較例１］
実施例１においてＢＧを化石燃料原料由来のＢＧ（三菱化学製ＢＧ）に変え、重縮合時間を表１に示す時間に変えた以外は実施例１と同様に行い、ＰＢＴを得た。各種分析結果を表１に示す。
［実施例２］
攪拌装置、窒素導入口、加熱装置、温度計及び減圧用排気口を備えた反応容器に、テレフタル酸１１３質量部、窒素原子０．７質量ｐｐｍを含有する製造例１で得られたＢＧ１８３質量部及び触媒としてテトラブチルチタネートをあらかじめ６質量％溶解させた１，４―ブタンジオール溶液０．７質量部を仕込み、窒素―減圧置換によって系内を窒素雰囲気下にした。
【０１０６】
次に、系内を撹拌しながら１５０℃まで加温後、圧力を７８ｋＰａになるよう減圧した後、２２０℃に１時間で昇温させて、さらに２時間生成する水を留出させつつエステル化反応した後窒素ガスにて常圧に戻した。
次に、酢酸マグネシウム４水塩を水に溶解し、さらにＢＧに溶解させた酢酸マグネシウム４水塩１質量％の１，４―ブタンジオール溶液（酢酸マグネシウム４水塩、水、１，４―ブタンジオールの質量比は１：２：９７）１．３質量部を添加した。
【０１０７】
次に、１．５時間かけて２４５℃まで昇温するとともに、１．５時間かけて０．０７ｋＰａになるように減圧し、同減圧度で１．１時間重縮合反応を行い、反応系を常圧に戻し重縮合を終了した。得られたＰＢＴを反応槽の底部からストランドとして抜き出し、１０℃の水中を潜らせた後、カッターでストランドをカットすることによりペレット状のＰＢＴを得た。
【０１０８】
酢酸マグネシウム添加後の減圧開始から重縮合終了までを重縮合時間として、固有粘度／重縮合時間を重縮合速度とした。重縮合速度は０．３５ｄＬ／ｇ／ｈであった。ＴＨＦ転化率は、エステル化反応中の留出液をドライアイストラップで冷却採取したものについてＴＨＦ量を分析し、仕込みテレフタル酸あたりのモル％で表した。５４モル％であった。
得られたぺレット状のＰＢＴを射出成形にて引張試験片、曲げ試験片に成形し引張強度と曲げ弾性率を測定した。
各種分析結果を表１に示す。
【０１０９】
［比較例２］
実施例２においてＢＧを化石燃料原料由来のＢＧ（三菱化学製）に変え、重縮合時間を表１に示す時間に変えた以外は実施例２と同様に行い、ＰＢＴを得た。各種分析結果を表１に示す。
【０１１０】
［比較例３］
実施例２においてＢＧを化石燃料原料由来のＢＧ（東燃化学製）に変え、重縮合時間を表１に示す時間に変えた以外は実施例２と同様に行い、ＰＢＴを得た。各種分析結果を表１に示す。
表１より、実施例は、重縮合速度が大きく、ＴＨＦ化への転化率が小さいこと、及び実施例のＰＢＴは窒素含有量が少なく、色調が良好であること、等がわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明のＰＢＴは、色調良好である。また、本発明のＰＢＴの製法は、効率的に、ＴＨＦへの転化が少ない。更に、バイオマス資源の有効利用にも寄与している。
【０１１２】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】引張試験片の形状 単位ｍｍ。
【図２】ｐＫＭＢ１の構築の概略を示す。
【図３】ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨの構築の概略を示す。
【図４】ｐＴＺベクターの構築の概略を示す。
【図５】ｐＭＪＰＣ１の構築の概略を示す。
【図６】配列番号
【図７】配列番号
【図８】配列番号
【図９】配列番号
【図１０】配列番号
【図１１】配列番号
【図１２】配列番号
【図１３】配列番号
【図１４】配列番号
【図１５】配列番号
【図１６】配列番号
【図１７】配列番号
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テレフタル酸由来の構成単位と１，４ブタンジオール由来の構成単位を含み、窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであることを特徴とするポリブチレンテレフタレート。
【請求項２】
請求項１記載のポリブチレンテレフタレートであって、前記１，４ブタンジオールがバイオマス資源由来であることを特徴とするポリブチレンテレフタレート。
【請求項３】
請求項１又は２記載のポリブチレンテレフタレートであって、前記１，４ブタンジオールの窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであることを特徴とするポリブチレンテレフタレート。
【請求項４】
請求項１〜３記載のポリブチレンテレフタレートであって、前記１，４ブタンジオール中の１−アセトキシ４−ヒドロキシブタンの含有量が０．１〜５０質量ｐｐｍであることを特徴とするポリブチレンテレフタレート。
【請求項５】
請求項１〜４記載のポリブチレンテレフタレート９９．９〜０．１質量％に対して、熱可塑性樹脂０．１〜９９．９質量％を配合することにより得られる樹脂組成物。
【請求項６】
請求項１〜４記載のポリブチレンテレフタレート又は請求項５記載の樹脂組成物を成形してなる成形体。
【請求項７】
テレフタル酸又はテレフタル酸アルキレートと窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍの１，４ブタンジオールとをエステル化反応又はエステル交換反応させた後、重縮合反応させるポリブチレンテレフタレートの製造方法。
【請求項１】
テレフタル酸由来の構成単位と１，４ブタンジオール由来の構成単位を含み、窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであることを特徴とするポリブチレンテレフタレート。
【請求項２】
請求項１記載のポリブチレンテレフタレートであって、前記１，４ブタンジオールがバイオマス資源由来であることを特徴とするポリブチレンテレフタレート。
【請求項３】
請求項１又は２記載のポリブチレンテレフタレートであって、前記１，４ブタンジオールの窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍであることを特徴とするポリブチレンテレフタレート。
【請求項４】
請求項１〜３記載のポリブチレンテレフタレートであって、前記１，４ブタンジオール中の１−アセトキシ４−ヒドロキシブタンの含有量が０．１〜５０質量ｐｐｍであることを特徴とするポリブチレンテレフタレート。
【請求項５】
請求項１〜４記載のポリブチレンテレフタレート９９．９〜０．１質量％に対して、熱可塑性樹脂０．１〜９９．９質量％を配合することにより得られる樹脂組成物。
【請求項６】
請求項１〜４記載のポリブチレンテレフタレート又は請求項５記載の樹脂組成物を成形してなる成形体。
【請求項７】
テレフタル酸又はテレフタル酸アルキレートと窒素原子含有量が０．０１〜５０質量ｐｐｍの１，４ブタンジオールとをエステル化反応又はエステル交換反応させた後、重縮合反応させるポリブチレンテレフタレートの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００８−１０１１４３（Ｐ２００８−１０１１４３Ａ）
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２８５４９３（Ｐ２００６−２８５４９３）
【出願日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
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