ポリペプチド、ポリペプチドの製造方法、摂食調節組成物および摂食量の調節方法
【課題】Ｎ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドの詳細な特性を解明し、摂食調節効果を有するポリペプチド、該ポリペプチドの製造方法、該ポリペプチド等を有効成分として含有する摂食調節組成物、および、これらを用いる摂食量の調節方法を提供する。
【解決手段】摂食調節作用を有し、特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド、前記アミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、前記アミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【解決手段】摂食調節作用を有し、特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド、前記アミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、前記アミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、摂食調節中枢において合成される神経ペプチドに関連する、ポリペプチド、ポリペプチドの製造方法、摂食調節組成物および摂食量の調節方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
視床下部には摂食調節中枢が存在しており、多くの神経ペプチドが合成されていることが知られている。このような摂食調節に関連する神経ペプチドについては、数々の産業に利用できることもあり、多くの研究がなされている（非特許文献１ないし非特許文献３参照）。その中でも、摂食を調節する神経ペプチドとして、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）が最もよく知られている（特許文献１参照）。この神経ペプチドニューロペプチドＹは、脳内に広く分布しており、摂食以外にもエネルギー調節に重要な役割を果たしていることが知られている。
【０００３】
ニューロペプチドＹ以外の摂食に関連する神経ペプチドは、いくつか知られているが、それら因子のみで摂食調節機構の全容を説明することは困難である。そこで、本発明者らにより、同様の摂食調節遺伝子が視床下部に存在するか否かが検討された。その結果、摂食調節に関連する分泌性ペプチドの前駆体と考えられる新規遺伝子の存在が見出され、別の染色体に存在しているパラログ遺伝子も見出された。また、これらのホモログ遺伝子は魚類、両生類、鳥類および哺乳類を含めた多くの動物種に存在していることも明らかとなった。さらに、当該新規遺伝子ｍＲＮＡ発現量が、エネルギーホメオスタシスに関連して変動することも明らかとなった（非特許文献４および非特許文献５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００３−５２８０５１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｈｉｎｓｕｋｅ Ｏｈ−Ｉ，Ｈｉｒｏｙｕｋｉ Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔｅｔｓｕｒｏｕ Ｓａｔｏｈ，Ｓｈｕｉｃｈｉ Ｏｋａｄａ，Ｓａｃｈｉｋａ Ａｄａｃｈｉ，Ｋｉｎｊｉ Ｉｎｏｕｅ，Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｅｇｕｃｈｉ，Ｍａｓａｎｏｒｉ Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔｏｓｈｉｈｉｒｏ Ｉｍａｋｉ，Ｋｏｕｓｈｉ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔａｋａｆｕｍｉ Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｔｓｕｙｏｓｈｉ Ｍｏｎｄｅｎ，Ｋａｚｕｈｉｋｏ Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ，Ｍａｓａｎｏｂｕ Ｙａｍａｄａ ａｎｄ Ｍａｓａｔｏｍｏ Ｍｏｒｉ、２００６、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｓｆａｔｉｎ−１ ａｓ ａ ｓａｔｉｅｔｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ．、Ｎａｔｕｒｅ ４４３、７０９−７１２
【非特許文献２】Ａ．Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｌ． Ｚｈａｎｇ、２０１０、Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｃｕａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ ｄｕｒｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｄｅｆｉｃｉｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ３１６、１０９−１１９
【非特許文献３】Ｅｌｅｎａ Ｖａｌａｓｓｉ， Ｍａｓｓｉｍｏ Ｓｃａｃｃｈｉ， Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ｃａｖａｇｎｉｎｉ、２００８、Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ．、Ｎｕｔｒｉｔｉｎ， Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．１８、１５８−１６８
【非特許文献４】浮穴和義、岩越−浮穴栄子、田中幸恵、橘哲也、２０１０、ニワトリの視床下部で見出した新規摂食調節関連遺伝子、（社）日本動物学会第８１回大会予稿集、１２９
【非特許文献５】岩越栄子、田中幸恵、橘哲也、浮穴和義、２０１０、視床下部における新規摂食調節関連遺伝子の発見、第３５回日本比較内分泌学会及びシンポジウム２０１０静岡、３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前述の分泌性ペプチドのアミノ酸配列、ならびに、その前駆体と考えられる新規遺伝子の塩基配列およびアクセッション番号等については、未だ解明されていない。そのため、当該分泌性ペプチドを用い摂食調節を行おうとする場合、本発明者らが長期にわたり行った後述する研究および検討方法を再度経て、当該分泌性ペプチドのアミノ酸配列等を特定する必要があり、また、当該ペプチドの発現機構を解明する必要がある。
【０００７】
さらに、当該分泌性ペプチドの詳細な特性についても未だ解明されていない。詳細な特性とは、神経ペプチド部分として機能しているアミノ酸配列部分、当該分泌性ペプチドを用いた具体的な摂食調節方法、すなわち摂食促進および／または抑制方法、ならびに、摂食調節作用が機能するペプチドのアミノ酸配列の状態等が挙げられる。このような詳細な特性が解明された際には、当該分泌性ペプチドの摂食調節効果を利用することにより、産業上非常に大きく有意な影響を与えることとなる。
【０００８】
なお、当該新規遺伝子およびその分泌性ペプチド、ならびに前述した別の染色体に存在しているパラログ遺伝子およびその分泌性ペプチドについて、それぞれの脊椎動物等のホモログ遺伝子も含め、コードネームとして、以下、Ｎ１遺伝子およびＮ１ペプチド、ならびにＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子およびＮ１−ｌｉｋｅペプチドと示す。図１は、本発明に係るラットのＮ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドを含む前駆体タンパク質の模式構造を示す図である。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、Ｎ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドの詳細な特性を解明し、摂食調節効果を有するポリペプチド、該ポリペプチドの製造方法、該ポリペプチド等を有効成分として含有する摂食調節組成物、および、これらを用いる摂食量の調節方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成する為に、本発明者らが行った研究の経緯および方法について説明する。まず、食欲旺盛なニワトリ（ブロイラー）の摂食調節中枢の１つである視床下部漏斗部において、小脳に発現している遺伝子と比較し、特異的に発現している遺伝子群に着目した。このような１０００以上の遺伝子群から摂食調節に関連する神経ペプチドとなる遺伝子を網羅的に探索し、同定する為、ニワトリの雛の視床下部漏斗部と小脳から総ＲＮＡを抽出し、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションを行い、視床下部漏斗部において発現差のある遺伝子群をスクリーニングし、その後、ＤＮＡシークエンサーを用いて当該遺伝子群の配列を同定した。
【００１１】
このように得られた遺伝子群の配列を、ＮＣＢＩにおけるＧｅｎｂａｎｋ配列データベースに対するニワトリのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）検索を用いて解析した。その結果、機能既知のタンパク質をコードした遺伝子を除くと、２０の遺伝子に選出することができた。
【００１２】
さらに、選出した機能未知遺伝子２０種類について、ニワトリの視床下部漏斗部にのみ特異的に発現している遺伝子であるかどうかを調べる為に、リアルタイムＰＣＲによる二次スクリーニングを行った。このように、二度のスクリーニングによって選出した結果、ある１つの機能未知遺伝子が、ニワトリの視床下部漏斗部に特異的に発現していることが明らかとなった。なお、ここで選出された１つのニワトリの機能未知遺伝子のアクセッション番号は、ＸＭ＿４３０１２６であった。また、前述したように、当該機能未知遺伝子は、ホモログ遺伝子として魚類、両生類、鳥類および哺乳類を含めた多くの動物種に存在していることもデータベース検索を行って確認できた。図２は、種々の脊椎動物のＮ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドに係るアミノ酸配列のアライメントを示す図である。図２において、黒色で示す部分は、検索、解析した全ての動物種で共通なアミノ酸配列の部分を示す。
【００１３】
さらに、翻訳したアミノ酸配列中にシグナルペプチドがあるかどうかについて、コンピュータープログラムＳｉｇｎａｌＰ ３．０ Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）にて解析したところ、シグナルペプチドが含まれることも示唆された。また、当該アミノ酸配列中にプロセシングサイト（ＧＫＲ）の存在も発見された為（図１参照）、シグナルペプチド以降の８０アミノ酸残基のＣ末端がアミド化しており神経ペプチドとして製造されると予測された。このような経緯および方法を経て、本発明に係る摂食調節に関連するＮ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドの発見に至った。
【００１４】
なお、ニワトリのＮ１ペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に、ヒトのＮ１ペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に、ラットのＮ１ペプチドのアミノ酸配列を配列番号３に、マウスのＮ１ペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に、ニワトリのＮ１−ｌｉｋｅペプチドのアミノ酸配列を配列番号５に、ヒトのＮ１−ｌｉｋｅペプチドのアミノ酸配列を配列番号６に、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドのアミノ酸配列を配列番号７に、マウスのＮ１−ｌｉｋｅペプチドのアミノ酸配列を配列番号８に示す。また、ニワトリのＮ１遺伝子の塩基配列を配列番号９に、ヒトのＮ１遺伝子の塩基配列を配列番号１０に、ラットのＮ１遺伝子の塩基配列を配列番号１１に、マウスのＮ１遺伝子の塩基配列を配列番号１２に、ニワトリのＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号１３に、ヒトのＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号１４に、ラットのＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号１５に、マウスのＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号１６に示す。
【００１５】
このように、本発明者らが鋭意研究を行った結果、Ｎ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドの詳細な特性、すなわちアミノ酸配列およびその前駆体と考えられる新規遺伝子の塩基配列およびアクセッション番号等が解明された。
【００１６】
本発明の第１の態様に係るポリペプチドは、以下の（ａ）ないし（ｆ）のいずれかであり、かつ摂食調節作用を有することを特徴とする。
（ａ）配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｂ）配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｃ）配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｄ）配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｅ）配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｆ）配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【００１７】
好ましくは、前記ポリペプチドのＣ末端は、アミド化していることを特徴とする。
【００１８】
より好ましくは、前記ポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合を有することを特徴とする。
【００１９】
さらに好ましくは、前記ポリペプチドは、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕs）、および／または、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に対する摂食調節作用を有することを特徴とする。
【００２０】
本発明の第２の態様に係るポリペプチドの製造方法は、第１の態様に係るポリペプチドを作製することを特徴とする。
【００２１】
好ましくは、前記製造方法は、大腸菌培養による遺伝子工学的製造方法を用いることを特徴とする。
【００２２】
また、好ましくは、前記製造方法は、ネイティブケミカルライゲーション法を用いることを特徴とする。
【００２３】
好ましくは、製造される前記ポリペプチドは、配列番号３もしくは７に記載のアミノ酸配列、配列番号３もしくは７に記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加したアミノ酸配列、または、配列番号３もしくは７に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれかであることを特徴とする。
【００２４】
また、好ましくは、製造される前記ポリペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ジスルフィド結合を再形成させる工程を含むことを特徴とする。
【００２５】
本発明の第３の態様に係る摂食調節組成物は、第１の態様に係るポリペプチド、または、前記ポリペプチドにおいて薬学的に許容される誘導体もしくは薬学的に許容される塩類を有効成分として含有することを特徴とする。
【００２６】
本発明の第４の態様に係る摂食量の調節方法は、第１の態様に係るポリペプチドまたは第３の態様に係る摂食調節組成物を投与する工程を含むことを特徴とする。
【００２７】
好ましくは、前記ポリペプチドまたは前記摂食調節組成物を、脊椎動物の脳室内に投与することを特徴とする。
【００２８】
より好ましくは、前記摂食量の調節方法は摂食量の抑制方法であり、ラットの脳室内に前記ポリペプチドまたは前記摂食調節組成物を長期間連続投与することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、Ｎ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドの詳細な特性が解明され、摂食調節効果を有するポリペプチド、該ポリペプチドの製造方法、該ポリペプチド等を有効成分として含有する摂食調節組成物、および、これらを用いる摂食量の調節方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明に係るラットのＮ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドを含む前駆体タンパク質の模式構造を示す図である。
【図２】種々の脊椎動物のＮ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドに係るアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図３】ネイティブケミカルライゲーション法を用いて調製したラットＮ１−ｌｉｋｅペプチドを示す概要図である。
【図４】実施例１に係るＮ１−ｌｉｋｅペプチド単回投与後２時間におけるラットの摂食促進効果の結果を示す図である。
【図５】実施例２に係るＮ１ペプチド単回投与後２２時間におけるラットの摂食促進効果の結果を示す図である。
【図６】実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの２４時間毎の体重変化を示す図である。
【図７】実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの２４時間毎の体重増加量を示す図である。
【図８】実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの明期１２時間の総摂食量を示す図である。
【図９】実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの暗期１２時間の総摂食量を示す図である。
【図１０】実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの総摂食量を示す図である。
【図１１】実施例４に係るＮ１−ｌｉｋｅペプチド単回投与におけるニワトリ雛の摂食抑制効果の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書において「有する」、「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意も含むものとする。
【００３２】
（ポリペプチド）
本発明の実施の形態１は、特定のアミノ酸配列を有し、摂食調節効果を有するポリペプチドに関する。特定のアミノ酸配列とは、好ましくは、ニワトリのＮ１ペプチドである配列番号１に記載のポリペプチド、ヒトのＮ１ペプチドである配列番号２に記載のポリペプチド、ラットのＮ１ペプチドである配列番号３に記載のポリペプチド、または、マウスのＮ１ペプチドである配列番号４に記載のポリペプチドのいずれかが挙げられるが、最も好ましくは、後述する実施例２および３にて確認されているラットのＮ１ペプチドである配列番号３に記載のポリペプチドである。Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドの場合、好ましくは、ニワトリのＮ１−ｌｉｋｅペプチドである配列番号５に記載のポリペプチド、ヒトのＮ１−ｌｉｋｅペプチドである配列番号６に記載のポリペプチド、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドである配列番号７に記載のポリペプチド、または、マウスのＮ１−ｌｉｋｅペプチドである配列番号８に記載のポリペプチドのいずれかが挙げられるが、同様に、最も好ましくは、後述する実施例１および４にて確認されている、ニワトリのＮ１−ｌｉｋｅペプチドである配列番号５に記載のポリペプチド、または、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドである配列番号７に記載のポリペプチドである。
【００３３】
次に好ましい特定のアミノ酸配列とは、Ｎ１ペプチドの場合、配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ摂食調節作用を有するポリペプチドが挙げられる。Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドの場合、配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ摂食調節作用を有するポリペプチドが挙げられる。
【００３４】
なお、「数個」とは、各々のポリペプチドのアミノ酸配列の長さによって異なり、例えば、１５個ないし１個のいずれか、１０個ないし１個のいずれか、５個ないし１個のいずれか、または、３個ないし１個のいずれか等の個数が挙げられる。また、本明細書において「摂食調節作用（効果）を有する（もたらす）」とは、摂食量の促進・増加および／もしくは抑制・減少作用を有する（もたらす）という意味を示し、さらに通常これらと同様の意味で使用される言語も含まれる。具体的には、例えば、ヒト、ラットまたはマウス等の脊椎動物に、当該ポリペプチドまたはコントロールとしての生理食塩水等を投与した際に、投与後の当該脊椎動物の摂食に対する作用（摂食量等）を比較し、ポリペプチドまたはコントロールの当該作用が異なる状況を示す。特に、このような摂食調節作用がもたらされる脊椎動物は、ニワトリ、ヒト、ラットまたはマウスのいずれかが好ましい。摂食量の促進・増加および／もしくは抑制・減少作用のいずれを有するかは、それぞれの動物種（魚類、両生類、鳥類および哺乳類を含めた多くの動物種）によって異なる。
【００３５】
また、他の好ましい特定のアミノ酸配列には、Ｎ１ペプチドの場合、配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ摂食調節作用を有するポリペプチドが挙げられる。Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドの場合、配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ摂食調節作用を有するポリペプチドが挙げられる。なお、これらポリペプチドの配列の同一性に関しては、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の同一性を有する。
【００３６】
前述のような、ニワトリ、ヒト、ラットまたはマウスのＮ１ペプチドまたはＮ１−ｌｉｋｅペプチドのアミノ酸配列と相同性が高いポリペプチドであって、かつ摂食調節効果を有するポリペプチドであれば、前述した本発明者らが行った研究の経緯の結果から、これらのポリペプチドは、前述以外の他の脊椎動物（魚類、両生類、鳥類および哺乳類を含めた多くの動物種）等のＮ１遺伝子またはＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子から翻訳されるＮ１ペプチドまたはＮ１−ｌｉｋｅペプチドであることが示唆される（図２参照）。
【００３７】
このような特定のアミノ酸配列を有する本実施の形態１に係るポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端がアミド化していることが好ましい。また、ポリペプチドが、少なくとも１つのジスルフィド結合を有しているとより好ましい。
【００３８】
（ポリペプチドの製造方法）
本発明の実施の形態２は、前述の実施の形態１のポリペプチドを製造する方法に関する。そのため、本実施の形態２は、前述の実施の形態１のポリペプチドに特徴を有する。従って、本実施の形態２の製造方法は、当該技術分野の任意の方法で当該ポリペプチドのアミノ酸配列の長さが合成、製造可能である方法であれば限定されない。例えば、当該技術分野における常法である、人工的なポリペプチド合成法によって合成してもよいし、大腸菌等を用いた遺伝子工学的な方法を用いて製造してもよい（調製例参照）。具体的には、ポリペプチド合成法の場合、液相法または固相法を挙げることができる。液相法は、反応を溶液状態で行い、反応混合物から生成物を単離精製し、この生成物を中間体として次のペプチド伸長反応に用いる方法である。一方、固相法は、反応溶媒に対して不溶の固相担体にアミノ酸を結合させ、このアミノ酸に順次縮合反応を行い、ペプチド鎖を伸長させていく方法である。
【００３９】
具体的に、ポリペプチド合成は、まず、カルボキシル基を保護したアミノ酸にアミノ基を保護したアミノ酸を脱水縮合させ、ペプチド結合を形成させる。次に、アミノ保護基を除去後、遊離したアミノ基に次のアミノ基保護アミノ酸をＣ末端からＮ末端に向かって１つずつ順次延長させていく。脱水縮合反応では、カルボキシル基を活性化し、結合させようとするアミノ基と反応させる。活性化にはジシクロへキシカルボジイミド（ＤＣＣ）法、活性エステル法、酸無水物法またはアジド法等が挙げられるが、その反応性の高さ、ラセミ化およびその他の副反応を考慮し、適宜選択すればよい。縮合反応時の副反応を防止する為、アミノ酸のアミノ基、カルボキシル基および／または側鎖の官能基には保護基が導入される。これらの保護基は、縮合反応での条件において安定であり、必要な時には速やかに除去可能であるものが好ましい。また、アミノ基の保護基とカルボキシル基の保護基とは、互いに選択的に除去可能であることが好ましい。
【００４０】
アミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニルまたは９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等を挙げることができる。カルボキシ基の保護基としては、例えば、アルキルエステルまたはベンジルエステル等を形成し得る基を挙げることができる。
【００４１】
ただし、固相法の場合、Ｃ末端のカルボキシル基は、クロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂またはp−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している為、縮合反応はカルボジイミド等の縮合剤の存在下、またはＮ保護アミノ酸活性エステルもしくはペプチド活性エステルを用いて実施すると好ましい。縮合反応終了後、保護基は除去される。固相法の場合、ペプチドのＣ末端と樹脂との結合も切断される。その後、薬学合成されたポリペプチドは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、エドマン分解法またはガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）等により精製、解析をすることが可能である。
【００４２】
遺伝子工学的方法では、本実施の形態１に係るポリペプチドをコードするＮ１遺伝子またはＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子を用いる。Ｎ１遺伝子およびＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子は、当該技術分野の当業者であれば常法を用い、前述の脊椎動物等からＤＮＡの分離精製を行うことが可能である。また、例えば、ＤＮＡ合成キット等を使用し、人工的にＤＮＡ合成を行っても構わない。
【００４３】
その後、合成したＮ１遺伝子またはＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子と、当該遺伝子を宿主細胞内で発現させる為の種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサーおよび／または発現レベルを制御する種々のシスエレメント等）とを用い、発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを宿主細胞に応じて構築する。このようにして構築した組換えベクターは、例えば、所定の宿主細胞（大腸菌等）に導入し、所定の条件で培養する。これにより、本実施の形態１に係るポリペプチドの、宿主細胞内での発現、抽出が可能となる。特に、宿主細胞内での発現では、通常用いられる大腸菌培養による発現、抽出が好ましい。
【００４４】
また、本実施の形態２に係るポリペプチドの製造方法には、より効率的な製造方法が存在する。当該製造方法とは、ネイティブケミカルライゲーション法（ネイティブケミカルライゲーション法：Ｎｉｌｓｓｏｎ ＢＬ，Ｓｏｅｌｌｎｅｒ ＭＢ，Ｒａｉｎｅｓ ＲＴ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．３４、９１−１１８、２００５参照）を用いる製造方法である。ネイティブケミカルライゲーション法を用いることにより、効率的にＮ１ペプチドまたはＮ１−ｌｉｋｅペプチドを産生することが可能となる。本発明におけるネイティブケミカルライゲーション法とは、Ｃ末端がチオエステル化しているペプチドフラグメントと、Ｎ末端にＣｙｓ残基を持つペプチドフラグメントとを試験管内において混合することにより、分子内でＳ−Ｎアシル基転移反応を生じさせ、二つのペプチドフラグメントを連結させる方法を意味する。ネイティブケミカルライゲーション法を用いてのＮ１ペプチドまたはＮ１−ｌｉｋｅペプチドの製造の詳細については、後述する調製例２を参照されたい。
【００４５】
なお、前述の実施の形態１に係るポリペプチドのうち、ニワトリのＮ１ペプチドまたはＮ１−ｌｉｋｅペプチド等の製造方法においては、ジスルフィド結合を再形成させる工程を含むと好ましい。当該理由および詳細については、実施例４を参照されたい。
【００４６】
このようにペプチド合成法または遺伝子工学的方法を用いる方法によって製造した、前述の実施の形態１に係る摂食調節作用をもたらすポリペプチドは、後述の実施の形態３に係る摂食調節組成物の有効成分として利用することが可能となる。
【００４７】
（摂食調節組成物）
本発明の実施の形態３は、前述の実施の形態１に係るポリペプチド等を利用した組成物に関する。具体的には、実施の形態１に係るポリペプチド、または、該ポリペプチドにおいて薬学的に許容される誘導体もしくは薬学的に許容される塩類を有効成分として含有する、摂食調節組成物である。
【００４８】
本明細書において、「摂食調節組成物」とは、具体的には、例えば、摂食調節作用をもたらすことができる、試薬、医薬品または食品等を挙げることができる。さらに詳細には、試薬または医薬品の場合、例えば、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、タブレットまたはカプセル剤等を挙げることができる。食品の場合、例えば、摂食に関与する疾患等の予防、改善および治療等をコンセプトとした、健康食品、サプリメントまたは特定保健用食品等を挙げることができる。なお、これらの試薬、医薬品または食品等において、ポリペプチド等の有効成分としての含有量、一日における投与量および投与間隔等は、当該組成物等の種類によって適宜調節することが可能であるが、さらに、後述する実施の形態４の摂食量の調節方法も参照されたい。
【００４９】
薬学的に許容される誘導体としては、ポリペプチドの一部置換体、ポリペプチドの一部架橋体、または、付加化合物等のポリペプチド誘導体を挙げることができる。さらに具体的には、例えば、カルボキシル基をアミド化またはアシル化した誘導体を例示することができる。薬学的に許容される塩類としては、塩酸塩、硝酸塩もしくは臭化水素酸塩等の無機酸塩、または、ｐ−トルエンスルホン酸塩、メタスルホン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩もしくは乳酸塩等の有機酸塩等を挙げることができる。
【００５０】
（摂食量の調節方法）
本発明の実施の形態４は、前述の実施の形態１のポリペプチドおよび実施の形態３の摂食調節組成物を利用する、摂食量の調節方法に関する。具体的には、該ポリペプチドまたは該摂食調節組成物を投与する工程を含む。好ましくは、該ポリペプチドまたは該摂食調節組成物を、非ヒト脊椎動物の脳室内に投与する工程を含む。例えば、ニワトリ、ラットまたはマウス等の脳室内に投与する。
【００５１】
本明細書において、「摂食量の調節方法」とは、前述した「摂食調節作用」と同様に、摂食量を促進・増加および／もしくは抑制・減少させる方法という意味を示す。前述したように、摂食量の促進・増加および／もしくは抑制・減少作用のいずれを有するかは、それぞれの動物種（魚類、両生類、鳥類および哺乳類を含めた多くの動物種）によって異なるため、本実施の形態４に係る摂食量の調節方法でも、目的とする作用に適した動物種の当該ペプチドを用いればよい。さらに、摂食量の促進・増加および／もしくは抑制・減少作用のいずれを有するかは、前述の実施の形態１に係るポリペプチドまたは実施の形態３に係る摂食調節組成物を、単回投与する方法か、または長期間連続投与する方法かによって異なる。本明細書において「単回投与」とは、例えば、１回投与した場合または長期間連続投与する場合でも投与初期の状態を意味する。本明細書において「長期間連続投与」とは、連続的に一定量を一定速度で投与する（例えば一日当たり１５ｎｍｏｌの量を投与）という意味のほかに、例えば、定期的に間隔をおいて複数回長期にわたって投与することを意味する。より具体的には、長期間とは、少なくとも５日以上、好ましくは７日以上である。また、連続投与においては、対象動物に対して影響を与えない量および間隔で投与することが好ましい。定期的に間隔をおいての投与の場合、例えば１日に２〜１０回、好ましくは１日に５〜７回程度の投与が挙げられる。
【００５２】
例えば、ニワトリの場合について述べる。ニワトリにニワトリＮ１ペプチドもしくはＮ１−ｌｉｋｅペプチドまたは当該ペプチドに係る実施の形態３の摂食調節組成物を単回投与した後、投与後少なくとも約９０分までは摂食量は抑制される。
【００５３】
例えば、ラットの場合について述べる。ラットにラットＮ１ペプチドもしくはＮ１−ｌｉｋｅペプチドまたは当該ペプチドに係る実施の形態３の摂食調節組成物を投与（１回（単回）投与）した後、投与後１０時間程度までは摂食量が促進する。しかし、当該ペプチドまたは当該摂食調節組成物を、長期間連続投与すると、摂食量は結果的に抑制される。
【００５４】
ポリペプチドおよび摂食調節組成物の投与方法は、投与する動物の種類等によって適当な当該技術分野の任意の方法を利用すればよい。例えば、後述する実施例にて詳細に述べるように、手術においてカニューラ等を使用し、直接ラットまたは食用動物等の脳室内に投与する方法が挙げられる。連続投与の場合は、浸透圧ポンプを用いると好ましい。
【００５５】
本発明を用いると、例えば、当該ポリペプチドまたは当該摂食調節組成物の摂食促進効果により、食肉用の動物等の生産量を膨大に増加させることも可能となる。さらには、本発明に係るＮ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドの生体内機構を研究することにより、摂食に関連する疾患（例えば、拒食症および糖尿病等）の医療および医薬への応用も期待できる。すなわち、当該Ｎ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドの様々な産業へ与える影響、効果は非常に大きなものである。
【実施例】
【００５６】
以下、調製例および実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、調製例および実施例は本発明を限定するものではない。
【００５７】
（調製例１）
本調製例１では、組み換えラットＮ１−ｌｉｋｅペプチドの製造方法に係る調製例について詳細に述べる。
【００５８】
まず、大腸菌を形質転換する為の発現プラスミドの構築を行った。成体ラット（Ｗｉｓｔａｒ、雄）の脳から、摂食調節中枢を含む視床下部基底部を摘出し、総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）を用いて、添付されたプロトコールに従って抽出した。総ＲＮＡをＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてｍＲＮＡに精製した後、ＲｅｖｅｒＴｒａ ＡＣＥ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。そのｃＤＮＡを鋳型に、制限酵素ＮｄｅＩサイトを付加した順方向プライマーと制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを付加した逆方向プライマーとを用いてＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子をＰＣＲにて８０μｌの系で増幅した。その際、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ、ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ（タカラバイオ）を含む反応溶液を作成した。なお、反応条件は、９５度２０秒間でＤＮＡを変性させ、９５度２０秒、５５度２０秒および７２度２０秒の増幅反応を４０サイクル繰り返した。ＴＡクローニングを行う為、最後に７２度で１０分反応させ、ＰＣＲ産物にアデニン塩基を付加させた。
【００５９】
得られたＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、Ｎ１−ｌｉｋｅ遺伝子の大きさに相当する約３００ ｂｐ弱のバンドをＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてＴＡクローニングのインサートＮ１−ｌｉｋｅＤＮＡとして回収した。精製したインサートを、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（プロメガ）に挿入し、大腸菌のコンピテントセルＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換した。得られたコロニーを鋳型にして、順方向プライマーＭ１３ＦＷと逆方向プライマーＭ１３ＲＶとを用いてコロニーＰＣＲを行った。インサートが入っていることを確認したコロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が入った５ｍｌ ＬＢ培地で一晩３７度にて培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いてプラスミド抽出を行った。順方向プライマーＭ１３ＦＷと逆方向プライマーＭ１３ＲＶを用いてプラスミドを鋳型にＢｉｇＤｙｅ反応をし、ＤＮＡシークエンサーによりインサートの配列の確認を行った。
【００６０】
正しい配列であると確認されたＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子が挿入されたｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（プロメガ）を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで３７度１時間で処理した後、１．５％アガロースゲルで電気泳動し、約３００ｂｐのバンドをＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてインサートＮ１−ｌｉｋｅＤＮＡとして回収した。同様に制限酵素処理して精製したｐＣｏｌｄ ＴＦ ＤＮＡベクター（タカラバイオ）にインサートＮ１−ｌｉｋｅＤＮＡを挿入して、ＤＨ５α株を形質転換した。得られたコロニーを鋳型にして順方向プライマーｐＣｏｌｄ−ＴＦ−Ｆ１と逆方向プライマーｐＣｏｌｄ−Ｒを用いてコロニーＰＣＲを行い、インサートが入っているのを確認した。さらに、インサートＮ１−ｌｉｋｅＤＮＡの５’側にｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター由来の配列がないかコロニーＰＣＲ産物の配列の確認を行い、付加配列がないと確認されたコロニーを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が入った５ｍｌ ＬＢ培地で一晩３７度にて培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて、Ｈｉｓ−ＴＦ−Ｎ１−ｌｉｋｅタンパク質発現プラスミドを回収した。
【００６１】
次に、Ｈｉｓ−ＴＦ−Ｎ１−ｌｉｋｅタンパク質発現プラスミドで、大腸菌のコンピテントセルＳＨｕｆｆｌｅ株（ＮＥＢ）を形質転換した。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が入った５ｍｌ ＬＢ培地で一晩３７度培養したものを、５０倍希釈にし、５ｍｌでＯＤ６００＝０．５まで３７度で振とう培養した。目的のＯＤ値になったところで、１５度で３０分間冷却し、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭになるように添加して、２４時間振とう培養した。大腸菌培養液を１０，０００×ｇ、４度、１０分間の条件において遠心して集菌し、集菌した菌体を−８０度で凍結した。大腸菌培養液１．５ｍｌ分の凍結大腸菌ペレットに、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）３００μｌを添加し、２０，４００×ｇ、４度、２０分間の条件において遠心して上清と沈殿とを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後に２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩキット（コスモ・バイオ）でゲルを染色し、発現の確認を行った。
【００６２】
なお、大量培養は、１Ｌのバッフル付きフラスコ中に２００ｍｌＬＢ培地で振とう速度１５０ ｒｐｍにて行った。ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭ、菌回収時の遠心は４，０００×ｇ、４度、２０分間の条件で行った。凍結大腸菌ペレット湿重量１ｇに対してＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）５ｍｌの割合でタンパク質抽出を行った。これら以外の方法および条件は前述と同様である。
【００６３】
次に、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドの精製を行った。空カラムに大腸菌ペレット湿重量１ｇに対してＴＡＬＯＮレジン（クロンテック）３ｍｌ（５０％懸濁液）を入れ、カラム体積５倍量の平衡化バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で平衡化した。タンパク質抽出液の上清をカラムに添加し、Ｈｉｓ−ＴＦ−Ｎ１−ｌｉｋｅタンパク質をＴＡＬＯＮレジンに吸着させる為、４度で１時間撹拌した。素通り画分を回収し、カラム体積１６倍量の洗浄溶液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で洗浄した。カラム体積４倍量の溶出バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．０）を用いて溶出した。ＴＡＬＯＮレジンカラム精製での各画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩキット（コスモバイオ）でゲルを染色し確認した。
【００６４】
溶液交換のためＴＡＬＯＮレジンカラム溶出液をＦａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０）を２時間ごとに２回交換し、一晩４度にて透析した。透析膜チューブから液を回収し、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてタンパク定量を行った。タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌになるようＦａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応バッファー（ＮＥＢ）を加え、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ（ＮＥＢ）を終濃度２μｇ／ｍｌになるように添加し、２５度で１６時間撹拌した。Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応液に、ＰＭＳＦを終濃度１ｍＭになるように入れ、反応を停止させた。Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応液の一部を用い、１５％アクリルアミドゲル（オリエンタルインスツルメンツ）とＳＤＳトリス・トリシン泳動バッファー（コスモ・バイオ）とを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および、２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩキット（コスモ・バイオ）でのゲル染色を行い、タグ切断を確認した。
【００６５】
Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応液中のタグ除去の為、反応液を再度ＴＡＬＯＮレジンカラムへアプライし、素通り画分を回収した。その方法は次の通りである。まず、ＴＡＬＯＮレジンをカラム体積５倍量の平衡化バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で平衡化した。Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応液をカラムに添加し、Ｈｉｓ−ＴＦタンパク質部分をＴＡＬＯＮレジンに吸着させるため４度で１時間撹拌した。その後、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドを含む素通り画分を回収し、０．４５μｍ遠心フィルター（ミリポア）に通した。この液をＨＰＬＣにより逆相カラム（ＣＮ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて０．１％ＴＦＡ（ｐＨ ２．２）中３３−５３％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収でモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したＮ１−ｌｉｋｅペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【００６６】
さらに、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドのＣ末端をアミド化するためにアミド化酵素反応を行った。なお、前述したとおり、ペプチドの形態としてＣ末端がアミド化されているポリペプチド誘導体が最も好ましい。Ｃ末端がアミド化したＮ１−ｌｉｋｅペプチドを、次の組成にて反応させた。Ｎ１−ｌｉｋｅペプチド０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１μｇ／ｍｌ カタラーゼ、１０μＭ ＣｕＳＯ４、１ｍＭ アスコルビン酸、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、および、１０Ｕ／ｍｌ ペプチジルグリシンα−アミド化酵素（和光純薬工業）を用い、３７度で一晩撹拌した。反応終了後、０．４５μｍ遠心フィルター（ミリポア）に通した後、ＨＰＬＣにより逆相カラム（ＣＮ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて０．１％ＴＦＡ（ｐＨ ２．２）中３３−５３％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収でモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したアミド化Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。これを後述の行動実験に用いた。
【００６７】
（調製例２）
本調製例２では、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドの製造方法に係る調製例について、より効率的に製造できる方法について詳細に説明する。
【００６８】
まず、概要について簡単に述べる。本調製例２では、前述した二つのペプチドフラグメントを縮合（ライゲーション）する手法であるネイティブケミカルライゲーション法を用いてラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドを調製した。また、本調製例２では、インテインというタンパク質を使用している。インテインは、タンパク質スプライシング作用を有し、チオエステルを反応中間体としている。つまり、インテインとの組み換え融合タンパク質を構築することによりペプチドの末端がチオエステル化するシステムが開発されており、それを容易にするベクターも商品化されている（ＮＥＢ）。
【００６９】
ペプチド固相合成法によるペプチド製造は通常５０アミノ酸残基程度であり、それ以上長いペプチドの製造には、組み換えタンパク質発現や、上記のライゲーション法が必要となる。本調製例２に関するラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドは８８アミノ酸残基であり、ペプチド固相合成法のみによるペプチド化学合成は出来ないことがこれまでの先行研究からわかった。一方、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドはＣｙｓ残基を三つ有する。ここで、Ｎ末端から二番目のＣｙｓ残基以降のアミノ酸残基数が６１残基で、当該Ｃ末端側６１アミノ酸残基のペプチド部分をペプチド固相合成法により製造を行った。さらに、このＣ末端側６１アミノ酸残基のペプチドフラグメントと、インテイン融合タンパク質により製造したＮ末端側のペプチドフラグメントとをライゲーションすることにより、Ｃ末端側がアミド化した全長８８アミノ酸残基のラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドの製造を、効率よく行うことが出来た。図３は、ネイティブケミカルライゲーション法を用いて調製したラットＮ１−ｌｉｋｅペプチドを示す概要図である。
【００７０】
次に、本調製例２の詳細な調製方法について述べる。
【００７１】
最初に、大腸菌を形質転換するための発現プラスミドの構築を行った。成体ラット（Ｗｉｓｔａｒ、雄）の脳から、摂食調節中枢を含む視床下部基底部を摘出し、総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）を用いて、添付されたプロトコールに従って抽出した。抽出した総ＲＮＡを、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０〈Ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてｍＲＮＡに精製した後、ＲｅｖｅｒＴｒａ ＡＣＥ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。そのｃＤＮＡを鋳型に、制限酵素ＮｄｅＩサイトを付加した順方向プライマーと制限酵素ＳａｐＩサイトを付加した逆方向プライマーとを用いて、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドのＮ末端側２７アミノ酸残基に対応する遺伝子をＰＣＲにて増幅した。その際、Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ）を含む反応溶液を作成した。なお、反応条件は、９４度３分間でＤＮＡを変性させ、９４度３０秒、５５度３０秒および７２度１５秒の増幅反応を３０サイクル繰り返した。
【００７２】
得られたＰＣＲ産物を、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いて精製し、制限酵素ＮｄｅＩとＳａｐＩで３７度において３時間処理した。その後、２％アガロースゲルで電気泳動し、約８５ｂｐのバンドをＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてインサートＮ１−ｌｉｋｅ ＤＮＡとして回収した。同様に制限酵素処理して精製したインテイン融合タンパク質発現用のｐＴＸＢ１ベクター（ＮＥＢ）に、インサートＮ１−ｌｉｋｅ ＤＮＡを挿入して、ＤＨ５α株を形質転換した。得られたコロニーを鋳型にし、順方向プライマーＴ７と逆方向プライマーＭｘｅ Ｉｎｔｅｉｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＩＩを用いてコロニーＰＣＲを行い、インサートＮ１−ｌｉｋｅ ＤＮＡが入っていることを確認した。さらに、ＢｉｇＤｙｅ反応をし、ＤＮＡシークエンサーによりインサートの配列の確認を行った。正しい配列が確認されたコロニーを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が入った５ｍｌ ＬＢ培地で一晩３７度にて培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて、Ｎｉ−ｌｉｋｅペプチド２７アミノ酸残基とインテインとの融合タンパク質発現プラスミドを回収した。
【００７３】
次に、このタンパク質発現プラスミドで、大腸菌のコンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）株（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ）を形質転換した。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が入った５ｍｌ ＬＢ培地で一晩３７度にて培養したものを、５０倍希釈にし、５ｍｌでＯＤ６００＝０．５まで３７度で振とう培養した。目的のＯＤ値になったところで、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭになるように添加して、３時間振とう培養した。大腸菌培養液を１０，０００×ｇ、４度、１０分間の条件において遠心して集菌し、集菌した菌体を−８０度で凍結した。大腸菌培養液１．５ｍｌ分の凍結大腸菌ペレットに、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）３００μｌを添加し、２０，４００×ｇ、４度、２０分間の条件において遠心して上清と沈殿とを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後に、２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩキット（コスモ・バイオ）でゲルを染色し、発現の確認を行った。
【００７４】
なお、大量培養は、１Ｌのバッフル付きフラスコ中に３００ｍｌ ＬＢ培地で振とう速度１５０ｒｐｍにて行った。ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭ、菌回収時の遠心は４，０００×ｇ、４度、１０分間の条件で行った。凍結大腸菌ペレット湿重量１ｇに対して、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）５ｍｌおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）２μｌの割合で加え、タンパク質抽出を行った。これら以外の方法および条件は前述と同様である。
【００７５】
次いで、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチド２７アミノ酸残基とインテインとの融合タンパク質の精製を行った。この融合タンパク質の精製を容易にするためにＣ末端側にキチン結合ドメインが付加されている。培養液９００ｍｌ分の抽出液に対してキチンビーズ（ＮＥＢ）を４００ｍｌ使用した。オープンカラムにキチンビーズを詰め、１０倍量のカラムバッファー（２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ）を添加し、カラムを平衡化した。その後、上記で調製した大腸菌抽出液をカラムにロードした。その際、３倍量のカラムバッファーを添加し、非特異的な吸着物を除去した。次いで、カラムの流れを止め、３倍量のクリーベイジバッファー（５００ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＭＥＳＮＡ）／カラムバッファー）を添加し、２５度で１６時間反応させた。その後、カラムの栓を開け、反応後の素通り画分を回収した。このクリーベイジによりＮ１−ｌｉｋｅペプチド２７アミノ酸残基とインテインとの結合が切れ、さらにＣ末端がチオエステル化したＮ１−ｌｉｋｅペプチド２７アミノ酸残基が得られる。
【００７６】
回収した素通り画分を０．４５μｍ遠心フィルター（ミリポア）に通した後、ＨＰＬＣにより、Ｃ１８逆相カラム（ＯＤＳ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中３２−７２％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収をモニターしながら精製した。回収したピークをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【００７７】
Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドのＣ末端側６１アミノ酸残基は、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成により製造した。Ｃ末端アミド化を生じるレジンを用い、ペプチド合成機（ＰＳＳＭ８、島津）により自動合成を行った。保護基をクリーベイジ後、ジエチルエーテルで洗浄した後に乾燥させ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解した。ＨＰＬＣにより、Ｃ１８逆相カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８、ＹＭＣ）を用いて、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中３５−６５％／３０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで２８０ｎｍの紫外線吸収をモニターしながら溶出した。回収したピークをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【００７８】
このように得られたチオエステル化したＮ末端側２７アミノ酸残基と、アミド化したＣ末端側６１アミノ酸残基からなる二つのペプチドフラグメントを、ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）法によりライゲーションさせた。
【００７９】
まず、ペプチドフラグメントを反応させるＮＣＬバッファー（０．１Ｍ ４−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＭＰＡＡ）、２０ｍＭ ＴＣＥＰ、８Ｍ グアニジン塩酸塩、０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．０）を調製した。このＮＣＬバッファー１ｍｌに対して、Ｎ末端側２７アミノ酸残基ペプチド２．０ｍｇと、Ｃ末端側６１アミノ酸残基ペプチド４．７ｍｇを溶解した（それぞれ０．５〜１．０ｍＭ）。その後、チューブ内を窒素で置換し、２５度で約２４時間静置することでライゲーション反応を行った。この反応液を０．４５μｍ遠心フィルター（ミリポア）に通した後、ＨＰＣＬによりＣＮ逆相カラム（ＣＮ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中３５−５５％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収をモニターしながら溶出した。回収したピークをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したＮ１−ｌｉｋｅペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【００８０】
製造したＮ１−ｌｉｋｅペプチド中のジスルフィド結合は、前述の調製例１と同様に活性発現に重要であると思われる。そのために、フェリシアン化カリウムを用いてジスルフィド結合を生じさせた。凍結乾燥したＮ１−ｌｉｋｅペプチド１ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．３ｍｌで溶解し、８Ｍ尿素／５０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー２．７ｍｌを加えた。その後、攪拌しながらさらに１５０ｍＭフェリシアン化カリウム溶液を６０μｌ加え、室温で１時間攪拌し続けた。次いで、酢酸６００μｌで反応を停止し、陰イオン交換樹脂（ＡＧ４−ｘ４、バイオラッド）に通し過剰なフェリシアン化カリウムを除去した。素通り溶液をＨＰＬＣによりＣＮ逆相カラム（ＣＮ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中３５−５５％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収をモニターしながら精製した。回収したピークをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したＮ１−ｌｉｋｅペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【００８１】
すなわち、前述の調製例１と比較すると、本調製例２は、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチド（８８アミノ酸残基）のＮ末端側２７アミノ酸残基は大腸菌を用いてＣ末端がチオエステル化した組み換えペプチドとして製造し、Ｃ末端側６１アミノ酸残基はＣ末端がアミド化したペプチドをペプチド化学合成により製造し、それぞれのペプチドフラグメントをライゲーションしている。これにより、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドのＣ末端はペプチド固相合成により確実にアミド化しているために、アミド化酵素による翻訳後修飾を施さなくてもよく、より効率的にラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドを製造可能であることが確認された。
【００８２】
（実施例１）
本実施例１では、調製例１で製造したアミド化Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドのラットへの単回投与、および投与後２時間における観察実験について詳細に述べる。
【００８３】
まず、ラットを購入後１週間程度飼育し、脳手術でのストレスを軽減させる目的でハンドリングを行って馴化させた。ジエチルエーテルでラットを軽く麻酔した後、ソムノペンチル（４０ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与して麻酔し、体が脱力したのを確認してから、イヤーバーを差し込み（７ｍｍ）、切歯バーを取り付け、脳定位固定装置（室町機械）に固定した。麻酔の効果で体温が下がるため、手術中はカイロで体温を温めながら行った。頭の毛を剃り７０％エタノールで消毒した後、手術用ハサミを用いて正中に沿って頭皮を切り綿棒で止血した。その後、頭蓋骨をアセトンで拭いた。頭蓋骨にあるブレグマとラムダの位置を水平にし、マニュピレーターに取り付けたガイドカニューラの先端をブレグマの位置に合わせ、ラット脳地図を参考にして脳室（左側脳室、ブレグマより後位１ｍｍ、側位１．５ｍｍ）に先端を移動させて、印をつけた。電動ドリルで印の位置に穴を開け、カニューラを腹位３．７ｍｍに挿入した。挿入後、瞬間接着剤（Ｌｏｃｔｉｔｅ４５４）と歯科用セメントを用いて、カニューラを頭蓋に固定した。手術後、抗生物質セファゾリンナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ体重）と消炎鎮痛剤リマダイル（５ｍｇ／ｋｇ体重）とを皮下投与した。投与時以外は挿入したガイドカニューラにダミーカニューラを挿入した。脳手術後１週間、回復期間に当てた。脳室内投与実験２日前に脳室内へカニューラが入っていることを確かめるために、アンギオテンシンＩＩ（４０ｐｍｏｌ）を脳室内投与し、飲水行動が惹起されることを確認した。
【００８４】
先端にインターナルカニューラをつけたコネクターチューブに１ｍｌシリンジで滅菌水を満たし、空気をはさんで、投与溶液を充填した。Ｎ１−ｌｉｋｅペプチド投与は、暗期開始１０分前に行い、実験群にはＮ１−ｌｉｋｅペプチド（５ｎｍｏｌ／５μｌ）を、コントロール群には溶媒である０．９％ＮａＣｌおよび１０％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を、５μｌずつ投与した。投与後は３０秒間ほどカニューラをそのままにし、溶液を拡散させてからカニューラを抜き、ダミーカニューラを挿入しケージに戻した。投与後、１および２時間後に摂食量を測定した。
【００８５】
図４は、実施例１に係るＮ１−ｌｉｋｅペプチド投与後２時間におけるラットの摂食促進効果の結果を示す図である。なお、縦軸は累積の摂食量（ｇ）を示す。図３に示すように、１時間後（１ｈｒ）および２時間後（２ｈｒ）のいずれも、コントロールと比較すると有意に摂食量を増加させた。１時間後では、約５倍も摂食量を増加させた。なお、この効果は投与後２時間まで統計的に有意であった（６時間後では有意差はなかった）。これらの結果から、最初、サブトラクション法によって発見した、Ｎ１−ｌｉｋｅ遺伝子のパラログ遺伝子である新規摂食調節遺伝子Ｎ１遺伝子によりコードされるＮ１ペプチドであっても、脊椎動物に投与することにより摂食量が増すことが示唆される。また、これらのホモログ遺伝子を有する脊椎動物にも、同様のことが示唆される。
【００８６】
（調製例３）
本調製例３では、ラットのＮ１ペプチドの製造方法に係る調製例について、詳細に説明する。
【００８７】
ラットのＮ１ペプチドは、Ｆｍｏｃ固相法によるペプチド化学合成により製造した。なお、ラットのＮ１ペプチドのＣ末端はアミド化している。カップリング試薬としてＨＢＴＵを用い、脱保護試薬としてピペリジンを用いた。合成機はマイクロウェーブ法による自動合成が可能な、Ｌｉｂｅｒｔｙ１（ＣＥＭ）を用いた。保護基をクリーベイジ後、合成ペプチドをジエチルエーテルで洗浄した。その後、合成ペプチドをＨＰＬＣによりＣ１８逆相カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８、ＹＭＣ）を用いて０．１%ＴＦＡ(ｐＨ ２．２）中３５−６５％／３０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで２８０ｎｍの紫外線吸収でモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。
【００８８】
製造したＮ１ペプチド中において、ジスルフィド結合は活性発現に重要であると思われる。そのために、グルタチオンを用いてジスルフィド結合を生じさせた。凍結乾燥したＮ１ペプチド１ｍｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．１ｍｌで溶解し、１Ｍトリスバッファー（ｐＨ ８．５）０．４ｍｌ加えた。さらにアセトニトリル０．５ｍｌ、０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ ８．０）２μｌ、還元型グルタチオン１．５ｍｇ、および酸化型グルタチオン０．３ｍｇ加え、室温で３日間撹拌した。反応溶液をＨＰＬＣによりＣ１８逆相カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８、ＹＭＣ）を用いて０．１%ＴＦＡ(ｐＨ ２．２）中３５−６５％／３０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで２８０ｎｍの紫外線吸収でモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。このようにジスルフィド結合を形成したラットのＮ１ペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【００８９】
（実施例２）
本実施例２では、前述の調製例３により製造したＮ１ペプチドのラットへの単回投与、および投与後２２時間における観察実験について詳細に述べる。
【００９０】
まず、ラットを購入後１週間程度飼育し、脳手術でのストレスを軽減させる目的でハンドリングを行って馴化させた。ジエチルエーテルでラットを軽く麻酔した後、ソムノペンチル（４０ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与して麻酔し、体が脱力したのを確認してから、イヤーバーを差し込み（７ｍｍ）、切歯バーを取り付け、脳定位固定装置（室町機械）に固定した。麻酔の効果で体温が下がるため、手術中はカイロで体温を温めながら行った。頭の毛を剃り７０％エタノールで消毒した後、手術用ハサミを用いて正中に沿って頭皮を切り綿棒で止血した。その後、頭蓋骨をアセトンで拭いた。頭蓋骨にあるブレグマとラムダの位置を水平にし、マニュピレーターに取り付けたガイドカニューラの先端をブレグマの位置に合わせ、ラット脳地図を参考にして脳室（左側脳室、ブレグマより後位１ｍｍ、側位１．５ｍｍ）に先端を移動させて、印をつけた。電動ドリルで印の位置に穴を開け、カニューラを腹位３．５ｍｍに挿入した。挿入後、瞬間接着剤（Ｌｏｃｔｉｔｅ４５４）と歯科用セメントを用いて、カニューラを頭蓋に固定した。手術後、抗生物質セファゾリンナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ体重）と消炎鎮痛剤リマダイル（５ｍｇ／ｋｇ体重）を皮下投与した。
【００９１】
次に、先端にインターナルカニューラをつけたコネクターチューブに１ｍｌシリンジで滅菌水を満たし、空気をはさんで、投与溶液を充填した。Ｎ１ペプチド投与は、明期２時間後に行い、実験群にはＮ１ペプチド（５ｎｍｏｌ／５μｌ）を、コントロール群には溶媒であるＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７−８）および１０％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を、５μｌずつ投与した。投与後は３０秒間ほどカニューラをそのままにし、溶液を拡散させてからカニューラを抜き、ダミーカニューラを挿入しケージに戻した。投与後、１、２、６、１０および２２時間後に摂食量を測定した。
【００９２】
図５は、実施例２に係るＮ１ペプチド単回投与後２２時間におけるラットの摂食促進効果の結果を示す図である。なお、縦軸は総摂食量（ｇ）を示す。図５に示すように、３０分後（０−０．５ｈ）から１０時間後（０−１０ｈ）のいずれも、コントロールと比較すると有意に摂食量を増加させた（ｎ＝４、＊：ｐ＜０．０５）。なお、２２時間後では有意差がなかった。このように、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドだけでなく、ラットのＮ１ペプチドの場合でも単回投与することによって、投与後１０時間程度にわたって摂食量が促進するということが確認された。
【００９３】
（実施例３）
本実施例３では、前述の調製例３により製造したＮ１ペプチドのラットへの長期間（１週間）にわたる連続投与の実験について詳細に述べる。
【００９４】
ラットの飼育から、抗生物質セファゾリンナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ体重）と消炎鎮痛剤リマダイル（５ｍｇ／ｋｇ体重）の皮下投与までの手順は、前述した実施例２と同様である。その後、浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ ｍｏｄｅｌ２００２）にＮ１ペプチド（１．２５ｎｍｏｌ／μｌ、ｐＨ７−８）の投与溶液を充填した。次にチューブ（５ｃｍ）を介してカニューラ（Ｂｒａｉｎ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｋｉｔ １，Ａｌｚｅｔ）を浸透圧ポンプと連結させた。浸透圧ポンプは、カニューラの脳内への挿入前に３７℃の０．９％ＮａＣｌに１２時間以上浸して可動させておいた。このカニューラをラットの脳室へ挿入した後、浸透圧ポンプをラットの肩甲骨の皮下へと埋め込み、１週間の長期間投与（１５ｎｍｏｌ／ｄａｙ）を行った。コントロール群には溶媒であるＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７−８）および１０％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を投与した。
【００９５】
図６は、実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの２４時間毎の体重変化を示す図である。なお、縦軸は体重（ｇ）を示す。図６に示すように、６日目からコントロールと比較し、有意に体重が減少した（ｎ＝８、＊：ｐ＜０．０５）。なお、２２時間後では有意差がなかった。また、この際の体重増加量についても確認した。図７は、実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの２４時間毎の体重増加量を示す図である。なお、縦軸は体重増加量（ｇ）を示し、手術当日の体重を０ｇとしている。図７に示すように、体重増加量（ｇ）では、４日目からコントロールと比較し、有意に体重増加量が減少していた（ｎ＝８、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。
【００９６】
さらに、当該ラットの１日分の総摂食量の変化について確認した。その際、まず、明期１２時間（昼夜を明期１２時間と暗期１２時間とした場合）における、総摂食量の変化について確認した。図８は、実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの明期１２時間の総摂食量を示す図である。縦軸は摂食量（ｇ）を示し、ｎ＝８、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１である。図８に示すように、明期１２時間では摂食量を増やす効果があることが確認された。次いで、暗期１２時間における、総摂食量の変化について確認した。図９は、実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの暗期１２時間の総摂食量を示す図である。縦軸は摂食量（ｇ）を示し、ｎ＝８、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１である。図９に示すように、手術日５日目から有意差を確認できた。暗期１２時間では明期１２時間とは逆で、摂食量を減少させる効果があることが確認された。
【００９７】
これらを踏まえ、Ｎ１ペプチド１週間連続投与ラットの２４時間単位での総摂食量の変化について確認した。図１０は、実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの総摂食量を示す図である。縦軸は摂食量（ｇ）を示し、ｎ＝８、＊：ｐ＜０．０５である。図１０に示すように、投与開始１日目では有意にＮ１ペプチド投与群の摂食量（ｇ）が促進されるが、投与開始７日目となるとＮ１ペプチド投与群の摂食量（ｇ）が減少することが確認された。
【００９８】
当該Ｎ１ペプチド長期間連続投与での摂食量減少という実験結果は、前述の図６および図７の体重および体重増加量減少にも現れている。また、図８および図９のみの結果を比較すると、図８での明期の摂食量の増加は多い場合でも約４ｇ程度であるが、図９での暗期の摂食量の減少は多い場合約１５ｇ程度まで達している。これは、暗期、すなわちラットの活動期に着目すれば摂食量の減少を顕著に多く起こすことを示しており、すなわち、活動期の摂食量の抑制がなされ、その結果、前述のとおり体重の減少という現象に現れたと考えられる。
【００９９】
（調製例４）
本調製例４では、組み換えニワトリＮ１−ｌｉｋｅペプチドの製造方法に係る調製例について詳細に述べる。
【０１００】
まず、大腸菌を形質転換するための発現プラスミドの構築を行った。ニワトリ雛の脳から、摂食調節中枢を含む視床下部漏斗部を摘出し、総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）を用いて、添付されたプロトコールに従って抽出した。抽出した総ＲＮＡを、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０〈Ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてｍＲＮＡに精製した後、ＲｅｖｅｒＴｒａ ＡＣＥ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。次いで、そのｃＤＮＡを鋳型に、制限酵素ＮｄｅＩサイトを付加した順方向プライマーと、制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを付加した逆方向プライマーとを用いてＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子をＰＣＲにて１００μｌの系で増幅した。なお、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチド製造後にアミド化酵素によりＣ末端アミド化処理を行うために、Ｃ末端はＧｌｙ残基が付加するように逆方向プライマーを設計した。その際、Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ）を含む反応溶液を作成した。なお、当該反応条件は、９４度３分間でＤＮＡを変性させ、９４度３０秒、５５度３０秒および７２度３０秒の増幅反応を３０サイクル繰り返した。
【０１０１】
得られたＰＣＲ産物を、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いて精製し、制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで３７度で１時間処理した後、１．５％アガロースゲルで電気泳動を行った。その後、電気泳動での約３００ｂｐのバンドを、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてインサートＮ１−ｌｉｋｅ ＤＮＡとして回収した。同様に制限酵素処理して精製したｐＣｏｌｄ ＴＦ ＤＮＡベクター（タカラバイオ）にインサートＮ１−ｌｉｋｅ ＤＮＡを挿入して、ＤＨ５α株を形質転換した。次に、得られたコロニーを鋳型にし、順方向プライマーｐＣｏｌｄ−ＴＦ−Ｆ１と、逆方向プライマーｐＣｏｌｄ−Ｒとを用いてコロニーＰＣＲを行い、インサートが入っていることを確認した。さらに、ＢｉｇＤｙｅ反応を行い、ＤＮＡシークエンサーによりインサートの配列の確認も行った。正しい配列が確認されたコロニーを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が入った５ｍｌ ＬＢ培地で一晩３７度にて培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて、Ｈｉｓ−ＴＦ−Ｎ１−ｌｉｋｅタンパク質発現プラスミドを回収した。
【０１０２】
次に、Ｈｉｓ−ＴＦ−Ｎ１−ｌｉｋｅタンパク質発現プラスミドで、大腸菌のコンピテントセルＢＬ２１ Ｓｔａｒ(ＤＥ３)ｐＬｙｓＳ株（インビトロジェン）を形質転換した。その後、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が入った５ｍｌ ＬＢ培地で一晩３７度にて培養したものを、５０倍希釈にし、５ｍｌでＯＤ６００＝０．５まで３７度で振とう培養した。目的のＯＤ値になったところで、１５度で３０分間冷却し、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭになるように添加して、２４時間振とう培養した。当該大腸菌培養液を１０，０００×ｇ、４度、１０分間の条件において遠心して集菌し、集菌した菌体を−８０度で凍結した。次に、大腸菌培養液１．５ｍｌ分の凍結大腸菌ペレットに、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）３００μｌを添加し、２０，４００×ｇ、４度、２０分間の条件において遠心して上清と沈殿とを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後に、２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩキット（コスモ・バイオ）でゲルを染色し、発現の確認を行った。
【０１０３】
なお、大量培養は、１Ｌのバッフル付きフラスコ中に３００ｍｌ ＬＢ培地で振とう速度１５０ｒｐｍにて行った。ＩＰＴＧの添加は終濃度０．１ｍＭとなるように行い、菌回収時の遠心は４，０００×ｇ、４度、２０分間の条件で行った。なお、凍結大腸菌ペレット湿重量１ｇに対して、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）５ｍｌと、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）５μｌの割合で加え、タンパク質抽出を行った。これら以外の方法および条件は前述と同様である。
【０１０４】
次に、ニワトリのＮ１−ｌｉｋｅペプチドの精製を行った。空カラムに大腸菌ペレット湿重量約３ｇに対してＴＡＬＯＮレジン（クロンテック）２０ｍｌ（５０％懸濁液）を入れ、カラム体積５倍量の平衡化バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で平衡化した。タンパク質抽出液の上清をカラムに添加し、素通り画分を回収し、カラム体積５倍量の洗浄溶液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で洗浄した。また、カラム体積３倍量の溶出バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．０）を用いて溶出した。ＴＡＬＯＮレジンカラム精製での各画分については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩキット（コスモバイオ）でゲルを染色し、確認した。
【０１０５】
溶液交換のため、ＴＡＬＯＮレジンカラム溶出液を、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０）を２時間ごとに２回交換し、一晩４度にて透析した。その後、透析膜チューブから液を回収し、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてタンパク定量を行った。タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌになるようＦａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応バッファーを加え、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ（ＮＥＢ）を終濃度１μｇ／ｍｌになるよう添加し、２５度で１６時間攪拌した。その後、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応液に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）（ナカライテスク）を終濃度５０ｍＭになるように加え、一晩４度で還元反応を行った。
【０１０６】
この工程は、本発明者らが研究した結果、発現したニワトリのＮ１−ｌｉｋｅペプチドは、可溶化タグ（ＴＦ）と強い相互作用を有しており、可溶化タグ切断のためのプロテアーゼ（Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ）を用いて切断した後も離れないことを解明し、強い還元剤であるトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を作用させることによって、その相互作用を切断することを発見したことによる。
【０１０７】
還元処理を行ったサンプル中にはタグタンパク質が存在しているために、終濃度８０％になるように冷アセトンを加え、氷水中で３０分間冷却し、不要なタグタンパク質を沈殿させ、遠心分離し除去した。その後、上清のアセトンを遠心エバポレーターで蒸発させ、残りの溶液をＨＰＬＣにより逆相カラム（ＣＮ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中３５−５５％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収でモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したＮ１−ｌｉｋｅペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【０１０８】
なお、前述のＴＣＥＰによる還元処理のために、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチド中の二つのＣｙｓ残基からなるジスルフィド結合は解離した状態となってしまう。そのため、再度酸化させ、ジスルフィド結合を再形成させる必要がある。ここで、凍結乾燥したＮ１−ｌｉｋｅペプチド１ｍｇを、８Ｍ尿素／５０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー１ｍｌで溶解させ、さらに１５０ｍＭフェリシアン化カリウム溶液を２０μｌ加え、室温にて１時間攪拌した。その後、酢酸２００μｌで反応を停止し、陰イオン交換樹脂（ＡＧ４−ｘ４、バイオラッド）に通し、鉄イオンを除去した。素通り溶液をＨＰＬＣにより逆相カラム（ＣＮ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中３２−５２％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収でモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したＮ１−ｌｉｋｅペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【０１０９】
さらに、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドのＣ末端をアミド化するために、アミド化酵素反応を行った。なお、ペプチドの形態として、Ｃ末端がアミド化されているポリペプチド誘導体が最も好ましい。Ｃ末端がＧｌｙであるＮ１−ｌｉｋｅペプチドを、次の組成にてアミド化反応させた。当該組成は、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチド０．５ｍｇ／ｍｌ、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１００μｇ／ｍｌカタラーゼ、２０μＭ ＣｕＳＯ４、１ｍＭアスコルビン酸、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、および、１０Ｕ／ｍｌペプチジルグリシンα−アミド化酵素（和光純薬工業）であり、これらを３７度で一晩攪拌した。反応終了後、０．４５μｍ遠心フィルター（ミリポア）に通した後、ＨＰＬＣにより逆相カラム（ＣＮ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中３２−５２％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収でモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したＮ１−ｌｉｋｅペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。これを後述のニワトリの行動実験に用いた。
【０１１０】
（実施例４）
本実施例４では、調製例４で製造したニワトリのアミド化Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドを利用したニワトリ雛への投与実験について詳細に述べる。
【０１１１】
まず、ニワトリ雛を購入後３〜４日程度個別飼育した。その後、脳室内投与用の自作の脳定位固定装置にてニワトリ雛の頭部を保持し、マイクロシリンジを用いて脳室内投与を行った。Ｎ１−ｌｉｋｅペプチド投与は、実験群（８個体）にはＮ１−ｌｉｋｅペプチド（５ｎｍｏｌ／５μｌ）を、コントロール群（１１個体）には溶媒である１０％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を含んだ１０ｍＭリン酸緩衝食塩水をそれぞれ５μｌずつ投与した。投与後、３０、６０および９０分後に摂食量を測定した。なお、脳室内投与成功の有無は、投与液に青色の色素であるエバンスブルーを混合しておき、実験終了後に脳室内に色素が注入されていることで確認を行った。脳室内に色素が注入されていない個体はデータから排除した。
【０１１２】
図１１は、実施例４に係るＮ１−ｌｉｋｅペプチド単回投与におけるニワトリ雛の摂食抑制効果の結果を示す図である。なお、縦軸は累積の摂食量（ｇ）を示す。図１１に示すように、６０分後および９０分後のいずれも、コントロールと比較すると有意に摂食量が抑制されている。これらの結果から、ニワトリのＮ１−ｌｉｋｅペプチドをニワトリ雛の脳室内に投与すると、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドとは相反して、摂食量を抑制させる効果を有するということがわかった。
【０１１３】
このように、実施例１ないし実施例４の結果を考慮すると、Ｎ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドは、単回、複数回、連続投与および投与間隔等の投与方法によって、摂食量を促進または抑制させる摂食調節が可能であったり、同様の投与方法であっても他の動物種であったら相反する作用効果での摂食調節が可能であることが確認された。すなわち、種々の脊椎動物のホモログ遺伝子のＮ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドを利用することにより、任意の摂食調節が可能である。
【０１１４】
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【０１１５】
本明細書の中で明示した論文および公開特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【０１１６】
本出願は、２０１１年３月２４日に出願された日本国特許出願２０１１−６５２１６号に基づく。本明細書中に、日本国特許出願２０１１−６５２１６号の、明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明者らが鋭意研究した結果、大腸菌を用いて製造させたラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドをラットの脳室内に投与すると、投与後１０時間程度はコントロール群と比較して摂取量を促進するようになるということを発見した。一方、ニワトリのＮ１−ｌｉｋｅペプチドをニワトリの脳室内に投与すると、ラットとは逆に、投与後９０分間程度はコントロール群と比較して摂取量を抑制するようになるということを発見した。さらに、ラットのＮ１ペプチドを長期間ラットに連続投与すると、６、７日以降には摂食抑制の効果を有するということも発見した。また、当該ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドはネイティブケミカルライゲーション法を用いることによって効率よく製造できることも見出した。
【０１１８】
そこで、本発明によれば、Ｎ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドの詳細な特性が開示、解明され、摂食調節効果を有するポリペプチド、該ポリペプチドの製造方法、該ポリペプチド等を有効成分として含有する摂食調節組成物、および、これらを用いる摂食量の調節方法が提供される。すなわち、具体的には、食肉動物の生産量を膨大に増加させることも可能となり、さらには、摂食に関連する疾患（例えば拒食症および糖尿病等）の医療および医薬への応用も期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、摂食調節中枢において合成される神経ペプチドに関連する、ポリペプチド、ポリペプチドの製造方法、摂食調節組成物および摂食量の調節方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
視床下部には摂食調節中枢が存在しており、多くの神経ペプチドが合成されていることが知られている。このような摂食調節に関連する神経ペプチドについては、数々の産業に利用できることもあり、多くの研究がなされている（非特許文献１ないし非特許文献３参照）。その中でも、摂食を調節する神経ペプチドとして、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）が最もよく知られている（特許文献１参照）。この神経ペプチドニューロペプチドＹは、脳内に広く分布しており、摂食以外にもエネルギー調節に重要な役割を果たしていることが知られている。
【０００３】
ニューロペプチドＹ以外の摂食に関連する神経ペプチドは、いくつか知られているが、それら因子のみで摂食調節機構の全容を説明することは困難である。そこで、本発明者らにより、同様の摂食調節遺伝子が視床下部に存在するか否かが検討された。その結果、摂食調節に関連する分泌性ペプチドの前駆体と考えられる新規遺伝子の存在が見出され、別の染色体に存在しているパラログ遺伝子も見出された。また、これらのホモログ遺伝子は魚類、両生類、鳥類および哺乳類を含めた多くの動物種に存在していることも明らかとなった。さらに、当該新規遺伝子ｍＲＮＡ発現量が、エネルギーホメオスタシスに関連して変動することも明らかとなった（非特許文献４および非特許文献５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００３−５２８０５１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｈｉｎｓｕｋｅ Ｏｈ−Ｉ，Ｈｉｒｏｙｕｋｉ Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔｅｔｓｕｒｏｕ Ｓａｔｏｈ，Ｓｈｕｉｃｈｉ Ｏｋａｄａ，Ｓａｃｈｉｋａ Ａｄａｃｈｉ，Ｋｉｎｊｉ Ｉｎｏｕｅ，Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｅｇｕｃｈｉ，Ｍａｓａｎｏｒｉ Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔｏｓｈｉｈｉｒｏ Ｉｍａｋｉ，Ｋｏｕｓｈｉ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔａｋａｆｕｍｉ Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｔｓｕｙｏｓｈｉ Ｍｏｎｄｅｎ，Ｋａｚｕｈｉｋｏ Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ，Ｍａｓａｎｏｂｕ Ｙａｍａｄａ ａｎｄ Ｍａｓａｔｏｍｏ Ｍｏｒｉ、２００６、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｓｆａｔｉｎ−１ ａｓ ａ ｓａｔｉｅｔｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ．、Ｎａｔｕｒｅ ４４３、７０９−７１２
【非特許文献２】Ａ．Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｌ． Ｚｈａｎｇ、２０１０、Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｃｕａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ ｄｕｒｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｄｅｆｉｃｉｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ３１６、１０９−１１９
【非特許文献３】Ｅｌｅｎａ Ｖａｌａｓｓｉ， Ｍａｓｓｉｍｏ Ｓｃａｃｃｈｉ， Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ｃａｖａｇｎｉｎｉ、２００８、Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ．、Ｎｕｔｒｉｔｉｎ， Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．１８、１５８−１６８
【非特許文献４】浮穴和義、岩越−浮穴栄子、田中幸恵、橘哲也、２０１０、ニワトリの視床下部で見出した新規摂食調節関連遺伝子、（社）日本動物学会第８１回大会予稿集、１２９
【非特許文献５】岩越栄子、田中幸恵、橘哲也、浮穴和義、２０１０、視床下部における新規摂食調節関連遺伝子の発見、第３５回日本比較内分泌学会及びシンポジウム２０１０静岡、３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前述の分泌性ペプチドのアミノ酸配列、ならびに、その前駆体と考えられる新規遺伝子の塩基配列およびアクセッション番号等については、未だ解明されていない。そのため、当該分泌性ペプチドを用い摂食調節を行おうとする場合、本発明者らが長期にわたり行った後述する研究および検討方法を再度経て、当該分泌性ペプチドのアミノ酸配列等を特定する必要があり、また、当該ペプチドの発現機構を解明する必要がある。
【０００７】
さらに、当該分泌性ペプチドの詳細な特性についても未だ解明されていない。詳細な特性とは、神経ペプチド部分として機能しているアミノ酸配列部分、当該分泌性ペプチドを用いた具体的な摂食調節方法、すなわち摂食促進および／または抑制方法、ならびに、摂食調節作用が機能するペプチドのアミノ酸配列の状態等が挙げられる。このような詳細な特性が解明された際には、当該分泌性ペプチドの摂食調節効果を利用することにより、産業上非常に大きく有意な影響を与えることとなる。
【０００８】
なお、当該新規遺伝子およびその分泌性ペプチド、ならびに前述した別の染色体に存在しているパラログ遺伝子およびその分泌性ペプチドについて、それぞれの脊椎動物等のホモログ遺伝子も含め、コードネームとして、以下、Ｎ１遺伝子およびＮ１ペプチド、ならびにＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子およびＮ１−ｌｉｋｅペプチドと示す。図１は、本発明に係るラットのＮ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドを含む前駆体タンパク質の模式構造を示す図である。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、Ｎ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドの詳細な特性を解明し、摂食調節効果を有するポリペプチド、該ポリペプチドの製造方法、該ポリペプチド等を有効成分として含有する摂食調節組成物、および、これらを用いる摂食量の調節方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成する為に、本発明者らが行った研究の経緯および方法について説明する。まず、食欲旺盛なニワトリ（ブロイラー）の摂食調節中枢の１つである視床下部漏斗部において、小脳に発現している遺伝子と比較し、特異的に発現している遺伝子群に着目した。このような１０００以上の遺伝子群から摂食調節に関連する神経ペプチドとなる遺伝子を網羅的に探索し、同定する為、ニワトリの雛の視床下部漏斗部と小脳から総ＲＮＡを抽出し、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションを行い、視床下部漏斗部において発現差のある遺伝子群をスクリーニングし、その後、ＤＮＡシークエンサーを用いて当該遺伝子群の配列を同定した。
【００１１】
このように得られた遺伝子群の配列を、ＮＣＢＩにおけるＧｅｎｂａｎｋ配列データベースに対するニワトリのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）検索を用いて解析した。その結果、機能既知のタンパク質をコードした遺伝子を除くと、２０の遺伝子に選出することができた。
【００１２】
さらに、選出した機能未知遺伝子２０種類について、ニワトリの視床下部漏斗部にのみ特異的に発現している遺伝子であるかどうかを調べる為に、リアルタイムＰＣＲによる二次スクリーニングを行った。このように、二度のスクリーニングによって選出した結果、ある１つの機能未知遺伝子が、ニワトリの視床下部漏斗部に特異的に発現していることが明らかとなった。なお、ここで選出された１つのニワトリの機能未知遺伝子のアクセッション番号は、ＸＭ＿４３０１２６であった。また、前述したように、当該機能未知遺伝子は、ホモログ遺伝子として魚類、両生類、鳥類および哺乳類を含めた多くの動物種に存在していることもデータベース検索を行って確認できた。図２は、種々の脊椎動物のＮ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドに係るアミノ酸配列のアライメントを示す図である。図２において、黒色で示す部分は、検索、解析した全ての動物種で共通なアミノ酸配列の部分を示す。
【００１３】
さらに、翻訳したアミノ酸配列中にシグナルペプチドがあるかどうかについて、コンピュータープログラムＳｉｇｎａｌＰ ３．０ Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）にて解析したところ、シグナルペプチドが含まれることも示唆された。また、当該アミノ酸配列中にプロセシングサイト（ＧＫＲ）の存在も発見された為（図１参照）、シグナルペプチド以降の８０アミノ酸残基のＣ末端がアミド化しており神経ペプチドとして製造されると予測された。このような経緯および方法を経て、本発明に係る摂食調節に関連するＮ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドの発見に至った。
【００１４】
なお、ニワトリのＮ１ペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に、ヒトのＮ１ペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に、ラットのＮ１ペプチドのアミノ酸配列を配列番号３に、マウスのＮ１ペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に、ニワトリのＮ１−ｌｉｋｅペプチドのアミノ酸配列を配列番号５に、ヒトのＮ１−ｌｉｋｅペプチドのアミノ酸配列を配列番号６に、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドのアミノ酸配列を配列番号７に、マウスのＮ１−ｌｉｋｅペプチドのアミノ酸配列を配列番号８に示す。また、ニワトリのＮ１遺伝子の塩基配列を配列番号９に、ヒトのＮ１遺伝子の塩基配列を配列番号１０に、ラットのＮ１遺伝子の塩基配列を配列番号１１に、マウスのＮ１遺伝子の塩基配列を配列番号１２に、ニワトリのＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号１３に、ヒトのＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号１４に、ラットのＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号１５に、マウスのＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号１６に示す。
【００１５】
このように、本発明者らが鋭意研究を行った結果、Ｎ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドの詳細な特性、すなわちアミノ酸配列およびその前駆体と考えられる新規遺伝子の塩基配列およびアクセッション番号等が解明された。
【００１６】
本発明の第１の態様に係るポリペプチドは、以下の（ａ）ないし（ｆ）のいずれかであり、かつ摂食調節作用を有することを特徴とする。
（ａ）配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｂ）配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｃ）配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｄ）配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｅ）配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｆ）配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【００１７】
好ましくは、前記ポリペプチドのＣ末端は、アミド化していることを特徴とする。
【００１８】
より好ましくは、前記ポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合を有することを特徴とする。
【００１９】
さらに好ましくは、前記ポリペプチドは、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕs）、および／または、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に対する摂食調節作用を有することを特徴とする。
【００２０】
本発明の第２の態様に係るポリペプチドの製造方法は、第１の態様に係るポリペプチドを作製することを特徴とする。
【００２１】
好ましくは、前記製造方法は、大腸菌培養による遺伝子工学的製造方法を用いることを特徴とする。
【００２２】
また、好ましくは、前記製造方法は、ネイティブケミカルライゲーション法を用いることを特徴とする。
【００２３】
好ましくは、製造される前記ポリペプチドは、配列番号３もしくは７に記載のアミノ酸配列、配列番号３もしくは７に記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加したアミノ酸配列、または、配列番号３もしくは７に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれかであることを特徴とする。
【００２４】
また、好ましくは、製造される前記ポリペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ジスルフィド結合を再形成させる工程を含むことを特徴とする。
【００２５】
本発明の第３の態様に係る摂食調節組成物は、第１の態様に係るポリペプチド、または、前記ポリペプチドにおいて薬学的に許容される誘導体もしくは薬学的に許容される塩類を有効成分として含有することを特徴とする。
【００２６】
本発明の第４の態様に係る摂食量の調節方法は、第１の態様に係るポリペプチドまたは第３の態様に係る摂食調節組成物を投与する工程を含むことを特徴とする。
【００２７】
好ましくは、前記ポリペプチドまたは前記摂食調節組成物を、脊椎動物の脳室内に投与することを特徴とする。
【００２８】
より好ましくは、前記摂食量の調節方法は摂食量の抑制方法であり、ラットの脳室内に前記ポリペプチドまたは前記摂食調節組成物を長期間連続投与することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、Ｎ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドの詳細な特性が解明され、摂食調節効果を有するポリペプチド、該ポリペプチドの製造方法、該ポリペプチド等を有効成分として含有する摂食調節組成物、および、これらを用いる摂食量の調節方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明に係るラットのＮ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドを含む前駆体タンパク質の模式構造を示す図である。
【図２】種々の脊椎動物のＮ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドに係るアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図３】ネイティブケミカルライゲーション法を用いて調製したラットＮ１−ｌｉｋｅペプチドを示す概要図である。
【図４】実施例１に係るＮ１−ｌｉｋｅペプチド単回投与後２時間におけるラットの摂食促進効果の結果を示す図である。
【図５】実施例２に係るＮ１ペプチド単回投与後２２時間におけるラットの摂食促進効果の結果を示す図である。
【図６】実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの２４時間毎の体重変化を示す図である。
【図７】実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの２４時間毎の体重増加量を示す図である。
【図８】実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの明期１２時間の総摂食量を示す図である。
【図９】実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの暗期１２時間の総摂食量を示す図である。
【図１０】実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの総摂食量を示す図である。
【図１１】実施例４に係るＮ１−ｌｉｋｅペプチド単回投与におけるニワトリ雛の摂食抑制効果の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書において「有する」、「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意も含むものとする。
【００３２】
（ポリペプチド）
本発明の実施の形態１は、特定のアミノ酸配列を有し、摂食調節効果を有するポリペプチドに関する。特定のアミノ酸配列とは、好ましくは、ニワトリのＮ１ペプチドである配列番号１に記載のポリペプチド、ヒトのＮ１ペプチドである配列番号２に記載のポリペプチド、ラットのＮ１ペプチドである配列番号３に記載のポリペプチド、または、マウスのＮ１ペプチドである配列番号４に記載のポリペプチドのいずれかが挙げられるが、最も好ましくは、後述する実施例２および３にて確認されているラットのＮ１ペプチドである配列番号３に記載のポリペプチドである。Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドの場合、好ましくは、ニワトリのＮ１−ｌｉｋｅペプチドである配列番号５に記載のポリペプチド、ヒトのＮ１−ｌｉｋｅペプチドである配列番号６に記載のポリペプチド、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドである配列番号７に記載のポリペプチド、または、マウスのＮ１−ｌｉｋｅペプチドである配列番号８に記載のポリペプチドのいずれかが挙げられるが、同様に、最も好ましくは、後述する実施例１および４にて確認されている、ニワトリのＮ１−ｌｉｋｅペプチドである配列番号５に記載のポリペプチド、または、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドである配列番号７に記載のポリペプチドである。
【００３３】
次に好ましい特定のアミノ酸配列とは、Ｎ１ペプチドの場合、配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ摂食調節作用を有するポリペプチドが挙げられる。Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドの場合、配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ摂食調節作用を有するポリペプチドが挙げられる。
【００３４】
なお、「数個」とは、各々のポリペプチドのアミノ酸配列の長さによって異なり、例えば、１５個ないし１個のいずれか、１０個ないし１個のいずれか、５個ないし１個のいずれか、または、３個ないし１個のいずれか等の個数が挙げられる。また、本明細書において「摂食調節作用（効果）を有する（もたらす）」とは、摂食量の促進・増加および／もしくは抑制・減少作用を有する（もたらす）という意味を示し、さらに通常これらと同様の意味で使用される言語も含まれる。具体的には、例えば、ヒト、ラットまたはマウス等の脊椎動物に、当該ポリペプチドまたはコントロールとしての生理食塩水等を投与した際に、投与後の当該脊椎動物の摂食に対する作用（摂食量等）を比較し、ポリペプチドまたはコントロールの当該作用が異なる状況を示す。特に、このような摂食調節作用がもたらされる脊椎動物は、ニワトリ、ヒト、ラットまたはマウスのいずれかが好ましい。摂食量の促進・増加および／もしくは抑制・減少作用のいずれを有するかは、それぞれの動物種（魚類、両生類、鳥類および哺乳類を含めた多くの動物種）によって異なる。
【００３５】
また、他の好ましい特定のアミノ酸配列には、Ｎ１ペプチドの場合、配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ摂食調節作用を有するポリペプチドが挙げられる。Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドの場合、配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ摂食調節作用を有するポリペプチドが挙げられる。なお、これらポリペプチドの配列の同一性に関しては、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の同一性を有する。
【００３６】
前述のような、ニワトリ、ヒト、ラットまたはマウスのＮ１ペプチドまたはＮ１−ｌｉｋｅペプチドのアミノ酸配列と相同性が高いポリペプチドであって、かつ摂食調節効果を有するポリペプチドであれば、前述した本発明者らが行った研究の経緯の結果から、これらのポリペプチドは、前述以外の他の脊椎動物（魚類、両生類、鳥類および哺乳類を含めた多くの動物種）等のＮ１遺伝子またはＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子から翻訳されるＮ１ペプチドまたはＮ１−ｌｉｋｅペプチドであることが示唆される（図２参照）。
【００３７】
このような特定のアミノ酸配列を有する本実施の形態１に係るポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端がアミド化していることが好ましい。また、ポリペプチドが、少なくとも１つのジスルフィド結合を有しているとより好ましい。
【００３８】
（ポリペプチドの製造方法）
本発明の実施の形態２は、前述の実施の形態１のポリペプチドを製造する方法に関する。そのため、本実施の形態２は、前述の実施の形態１のポリペプチドに特徴を有する。従って、本実施の形態２の製造方法は、当該技術分野の任意の方法で当該ポリペプチドのアミノ酸配列の長さが合成、製造可能である方法であれば限定されない。例えば、当該技術分野における常法である、人工的なポリペプチド合成法によって合成してもよいし、大腸菌等を用いた遺伝子工学的な方法を用いて製造してもよい（調製例参照）。具体的には、ポリペプチド合成法の場合、液相法または固相法を挙げることができる。液相法は、反応を溶液状態で行い、反応混合物から生成物を単離精製し、この生成物を中間体として次のペプチド伸長反応に用いる方法である。一方、固相法は、反応溶媒に対して不溶の固相担体にアミノ酸を結合させ、このアミノ酸に順次縮合反応を行い、ペプチド鎖を伸長させていく方法である。
【００３９】
具体的に、ポリペプチド合成は、まず、カルボキシル基を保護したアミノ酸にアミノ基を保護したアミノ酸を脱水縮合させ、ペプチド結合を形成させる。次に、アミノ保護基を除去後、遊離したアミノ基に次のアミノ基保護アミノ酸をＣ末端からＮ末端に向かって１つずつ順次延長させていく。脱水縮合反応では、カルボキシル基を活性化し、結合させようとするアミノ基と反応させる。活性化にはジシクロへキシカルボジイミド（ＤＣＣ）法、活性エステル法、酸無水物法またはアジド法等が挙げられるが、その反応性の高さ、ラセミ化およびその他の副反応を考慮し、適宜選択すればよい。縮合反応時の副反応を防止する為、アミノ酸のアミノ基、カルボキシル基および／または側鎖の官能基には保護基が導入される。これらの保護基は、縮合反応での条件において安定であり、必要な時には速やかに除去可能であるものが好ましい。また、アミノ基の保護基とカルボキシル基の保護基とは、互いに選択的に除去可能であることが好ましい。
【００４０】
アミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニルまたは９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等を挙げることができる。カルボキシ基の保護基としては、例えば、アルキルエステルまたはベンジルエステル等を形成し得る基を挙げることができる。
【００４１】
ただし、固相法の場合、Ｃ末端のカルボキシル基は、クロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂またはp−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している為、縮合反応はカルボジイミド等の縮合剤の存在下、またはＮ保護アミノ酸活性エステルもしくはペプチド活性エステルを用いて実施すると好ましい。縮合反応終了後、保護基は除去される。固相法の場合、ペプチドのＣ末端と樹脂との結合も切断される。その後、薬学合成されたポリペプチドは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、エドマン分解法またはガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）等により精製、解析をすることが可能である。
【００４２】
遺伝子工学的方法では、本実施の形態１に係るポリペプチドをコードするＮ１遺伝子またはＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子を用いる。Ｎ１遺伝子およびＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子は、当該技術分野の当業者であれば常法を用い、前述の脊椎動物等からＤＮＡの分離精製を行うことが可能である。また、例えば、ＤＮＡ合成キット等を使用し、人工的にＤＮＡ合成を行っても構わない。
【００４３】
その後、合成したＮ１遺伝子またはＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子と、当該遺伝子を宿主細胞内で発現させる為の種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサーおよび／または発現レベルを制御する種々のシスエレメント等）とを用い、発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを宿主細胞に応じて構築する。このようにして構築した組換えベクターは、例えば、所定の宿主細胞（大腸菌等）に導入し、所定の条件で培養する。これにより、本実施の形態１に係るポリペプチドの、宿主細胞内での発現、抽出が可能となる。特に、宿主細胞内での発現では、通常用いられる大腸菌培養による発現、抽出が好ましい。
【００４４】
また、本実施の形態２に係るポリペプチドの製造方法には、より効率的な製造方法が存在する。当該製造方法とは、ネイティブケミカルライゲーション法（ネイティブケミカルライゲーション法：Ｎｉｌｓｓｏｎ ＢＬ，Ｓｏｅｌｌｎｅｒ ＭＢ，Ｒａｉｎｅｓ ＲＴ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．３４、９１−１１８、２００５参照）を用いる製造方法である。ネイティブケミカルライゲーション法を用いることにより、効率的にＮ１ペプチドまたはＮ１−ｌｉｋｅペプチドを産生することが可能となる。本発明におけるネイティブケミカルライゲーション法とは、Ｃ末端がチオエステル化しているペプチドフラグメントと、Ｎ末端にＣｙｓ残基を持つペプチドフラグメントとを試験管内において混合することにより、分子内でＳ−Ｎアシル基転移反応を生じさせ、二つのペプチドフラグメントを連結させる方法を意味する。ネイティブケミカルライゲーション法を用いてのＮ１ペプチドまたはＮ１−ｌｉｋｅペプチドの製造の詳細については、後述する調製例２を参照されたい。
【００４５】
なお、前述の実施の形態１に係るポリペプチドのうち、ニワトリのＮ１ペプチドまたはＮ１−ｌｉｋｅペプチド等の製造方法においては、ジスルフィド結合を再形成させる工程を含むと好ましい。当該理由および詳細については、実施例４を参照されたい。
【００４６】
このようにペプチド合成法または遺伝子工学的方法を用いる方法によって製造した、前述の実施の形態１に係る摂食調節作用をもたらすポリペプチドは、後述の実施の形態３に係る摂食調節組成物の有効成分として利用することが可能となる。
【００４７】
（摂食調節組成物）
本発明の実施の形態３は、前述の実施の形態１に係るポリペプチド等を利用した組成物に関する。具体的には、実施の形態１に係るポリペプチド、または、該ポリペプチドにおいて薬学的に許容される誘導体もしくは薬学的に許容される塩類を有効成分として含有する、摂食調節組成物である。
【００４８】
本明細書において、「摂食調節組成物」とは、具体的には、例えば、摂食調節作用をもたらすことができる、試薬、医薬品または食品等を挙げることができる。さらに詳細には、試薬または医薬品の場合、例えば、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、タブレットまたはカプセル剤等を挙げることができる。食品の場合、例えば、摂食に関与する疾患等の予防、改善および治療等をコンセプトとした、健康食品、サプリメントまたは特定保健用食品等を挙げることができる。なお、これらの試薬、医薬品または食品等において、ポリペプチド等の有効成分としての含有量、一日における投与量および投与間隔等は、当該組成物等の種類によって適宜調節することが可能であるが、さらに、後述する実施の形態４の摂食量の調節方法も参照されたい。
【００４９】
薬学的に許容される誘導体としては、ポリペプチドの一部置換体、ポリペプチドの一部架橋体、または、付加化合物等のポリペプチド誘導体を挙げることができる。さらに具体的には、例えば、カルボキシル基をアミド化またはアシル化した誘導体を例示することができる。薬学的に許容される塩類としては、塩酸塩、硝酸塩もしくは臭化水素酸塩等の無機酸塩、または、ｐ−トルエンスルホン酸塩、メタスルホン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩もしくは乳酸塩等の有機酸塩等を挙げることができる。
【００５０】
（摂食量の調節方法）
本発明の実施の形態４は、前述の実施の形態１のポリペプチドおよび実施の形態３の摂食調節組成物を利用する、摂食量の調節方法に関する。具体的には、該ポリペプチドまたは該摂食調節組成物を投与する工程を含む。好ましくは、該ポリペプチドまたは該摂食調節組成物を、非ヒト脊椎動物の脳室内に投与する工程を含む。例えば、ニワトリ、ラットまたはマウス等の脳室内に投与する。
【００５１】
本明細書において、「摂食量の調節方法」とは、前述した「摂食調節作用」と同様に、摂食量を促進・増加および／もしくは抑制・減少させる方法という意味を示す。前述したように、摂食量の促進・増加および／もしくは抑制・減少作用のいずれを有するかは、それぞれの動物種（魚類、両生類、鳥類および哺乳類を含めた多くの動物種）によって異なるため、本実施の形態４に係る摂食量の調節方法でも、目的とする作用に適した動物種の当該ペプチドを用いればよい。さらに、摂食量の促進・増加および／もしくは抑制・減少作用のいずれを有するかは、前述の実施の形態１に係るポリペプチドまたは実施の形態３に係る摂食調節組成物を、単回投与する方法か、または長期間連続投与する方法かによって異なる。本明細書において「単回投与」とは、例えば、１回投与した場合または長期間連続投与する場合でも投与初期の状態を意味する。本明細書において「長期間連続投与」とは、連続的に一定量を一定速度で投与する（例えば一日当たり１５ｎｍｏｌの量を投与）という意味のほかに、例えば、定期的に間隔をおいて複数回長期にわたって投与することを意味する。より具体的には、長期間とは、少なくとも５日以上、好ましくは７日以上である。また、連続投与においては、対象動物に対して影響を与えない量および間隔で投与することが好ましい。定期的に間隔をおいての投与の場合、例えば１日に２〜１０回、好ましくは１日に５〜７回程度の投与が挙げられる。
【００５２】
例えば、ニワトリの場合について述べる。ニワトリにニワトリＮ１ペプチドもしくはＮ１−ｌｉｋｅペプチドまたは当該ペプチドに係る実施の形態３の摂食調節組成物を単回投与した後、投与後少なくとも約９０分までは摂食量は抑制される。
【００５３】
例えば、ラットの場合について述べる。ラットにラットＮ１ペプチドもしくはＮ１−ｌｉｋｅペプチドまたは当該ペプチドに係る実施の形態３の摂食調節組成物を投与（１回（単回）投与）した後、投与後１０時間程度までは摂食量が促進する。しかし、当該ペプチドまたは当該摂食調節組成物を、長期間連続投与すると、摂食量は結果的に抑制される。
【００５４】
ポリペプチドおよび摂食調節組成物の投与方法は、投与する動物の種類等によって適当な当該技術分野の任意の方法を利用すればよい。例えば、後述する実施例にて詳細に述べるように、手術においてカニューラ等を使用し、直接ラットまたは食用動物等の脳室内に投与する方法が挙げられる。連続投与の場合は、浸透圧ポンプを用いると好ましい。
【００５５】
本発明を用いると、例えば、当該ポリペプチドまたは当該摂食調節組成物の摂食促進効果により、食肉用の動物等の生産量を膨大に増加させることも可能となる。さらには、本発明に係るＮ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドの生体内機構を研究することにより、摂食に関連する疾患（例えば、拒食症および糖尿病等）の医療および医薬への応用も期待できる。すなわち、当該Ｎ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドの様々な産業へ与える影響、効果は非常に大きなものである。
【実施例】
【００５６】
以下、調製例および実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、調製例および実施例は本発明を限定するものではない。
【００５７】
（調製例１）
本調製例１では、組み換えラットＮ１−ｌｉｋｅペプチドの製造方法に係る調製例について詳細に述べる。
【００５８】
まず、大腸菌を形質転換する為の発現プラスミドの構築を行った。成体ラット（Ｗｉｓｔａｒ、雄）の脳から、摂食調節中枢を含む視床下部基底部を摘出し、総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）を用いて、添付されたプロトコールに従って抽出した。総ＲＮＡをＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてｍＲＮＡに精製した後、ＲｅｖｅｒＴｒａ ＡＣＥ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。そのｃＤＮＡを鋳型に、制限酵素ＮｄｅＩサイトを付加した順方向プライマーと制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを付加した逆方向プライマーとを用いてＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子をＰＣＲにて８０μｌの系で増幅した。その際、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ、ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ（タカラバイオ）を含む反応溶液を作成した。なお、反応条件は、９５度２０秒間でＤＮＡを変性させ、９５度２０秒、５５度２０秒および７２度２０秒の増幅反応を４０サイクル繰り返した。ＴＡクローニングを行う為、最後に７２度で１０分反応させ、ＰＣＲ産物にアデニン塩基を付加させた。
【００５９】
得られたＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、Ｎ１−ｌｉｋｅ遺伝子の大きさに相当する約３００ ｂｐ弱のバンドをＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてＴＡクローニングのインサートＮ１−ｌｉｋｅＤＮＡとして回収した。精製したインサートを、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（プロメガ）に挿入し、大腸菌のコンピテントセルＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換した。得られたコロニーを鋳型にして、順方向プライマーＭ１３ＦＷと逆方向プライマーＭ１３ＲＶとを用いてコロニーＰＣＲを行った。インサートが入っていることを確認したコロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が入った５ｍｌ ＬＢ培地で一晩３７度にて培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いてプラスミド抽出を行った。順方向プライマーＭ１３ＦＷと逆方向プライマーＭ１３ＲＶを用いてプラスミドを鋳型にＢｉｇＤｙｅ反応をし、ＤＮＡシークエンサーによりインサートの配列の確認を行った。
【００６０】
正しい配列であると確認されたＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子が挿入されたｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（プロメガ）を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで３７度１時間で処理した後、１．５％アガロースゲルで電気泳動し、約３００ｂｐのバンドをＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてインサートＮ１−ｌｉｋｅＤＮＡとして回収した。同様に制限酵素処理して精製したｐＣｏｌｄ ＴＦ ＤＮＡベクター（タカラバイオ）にインサートＮ１−ｌｉｋｅＤＮＡを挿入して、ＤＨ５α株を形質転換した。得られたコロニーを鋳型にして順方向プライマーｐＣｏｌｄ−ＴＦ−Ｆ１と逆方向プライマーｐＣｏｌｄ−Ｒを用いてコロニーＰＣＲを行い、インサートが入っているのを確認した。さらに、インサートＮ１−ｌｉｋｅＤＮＡの５’側にｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター由来の配列がないかコロニーＰＣＲ産物の配列の確認を行い、付加配列がないと確認されたコロニーを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が入った５ｍｌ ＬＢ培地で一晩３７度にて培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて、Ｈｉｓ−ＴＦ−Ｎ１−ｌｉｋｅタンパク質発現プラスミドを回収した。
【００６１】
次に、Ｈｉｓ−ＴＦ−Ｎ１−ｌｉｋｅタンパク質発現プラスミドで、大腸菌のコンピテントセルＳＨｕｆｆｌｅ株（ＮＥＢ）を形質転換した。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が入った５ｍｌ ＬＢ培地で一晩３７度培養したものを、５０倍希釈にし、５ｍｌでＯＤ６００＝０．５まで３７度で振とう培養した。目的のＯＤ値になったところで、１５度で３０分間冷却し、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭになるように添加して、２４時間振とう培養した。大腸菌培養液を１０，０００×ｇ、４度、１０分間の条件において遠心して集菌し、集菌した菌体を−８０度で凍結した。大腸菌培養液１．５ｍｌ分の凍結大腸菌ペレットに、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）３００μｌを添加し、２０，４００×ｇ、４度、２０分間の条件において遠心して上清と沈殿とを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後に２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩキット（コスモ・バイオ）でゲルを染色し、発現の確認を行った。
【００６２】
なお、大量培養は、１Ｌのバッフル付きフラスコ中に２００ｍｌＬＢ培地で振とう速度１５０ ｒｐｍにて行った。ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭ、菌回収時の遠心は４，０００×ｇ、４度、２０分間の条件で行った。凍結大腸菌ペレット湿重量１ｇに対してＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）５ｍｌの割合でタンパク質抽出を行った。これら以外の方法および条件は前述と同様である。
【００６３】
次に、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドの精製を行った。空カラムに大腸菌ペレット湿重量１ｇに対してＴＡＬＯＮレジン（クロンテック）３ｍｌ（５０％懸濁液）を入れ、カラム体積５倍量の平衡化バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で平衡化した。タンパク質抽出液の上清をカラムに添加し、Ｈｉｓ−ＴＦ−Ｎ１−ｌｉｋｅタンパク質をＴＡＬＯＮレジンに吸着させる為、４度で１時間撹拌した。素通り画分を回収し、カラム体積１６倍量の洗浄溶液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で洗浄した。カラム体積４倍量の溶出バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．０）を用いて溶出した。ＴＡＬＯＮレジンカラム精製での各画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩキット（コスモバイオ）でゲルを染色し確認した。
【００６４】
溶液交換のためＴＡＬＯＮレジンカラム溶出液をＦａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０）を２時間ごとに２回交換し、一晩４度にて透析した。透析膜チューブから液を回収し、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてタンパク定量を行った。タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌになるようＦａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応バッファー（ＮＥＢ）を加え、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ（ＮＥＢ）を終濃度２μｇ／ｍｌになるように添加し、２５度で１６時間撹拌した。Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応液に、ＰＭＳＦを終濃度１ｍＭになるように入れ、反応を停止させた。Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応液の一部を用い、１５％アクリルアミドゲル（オリエンタルインスツルメンツ）とＳＤＳトリス・トリシン泳動バッファー（コスモ・バイオ）とを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および、２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩキット（コスモ・バイオ）でのゲル染色を行い、タグ切断を確認した。
【００６５】
Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応液中のタグ除去の為、反応液を再度ＴＡＬＯＮレジンカラムへアプライし、素通り画分を回収した。その方法は次の通りである。まず、ＴＡＬＯＮレジンをカラム体積５倍量の平衡化バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で平衡化した。Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応液をカラムに添加し、Ｈｉｓ−ＴＦタンパク質部分をＴＡＬＯＮレジンに吸着させるため４度で１時間撹拌した。その後、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドを含む素通り画分を回収し、０．４５μｍ遠心フィルター（ミリポア）に通した。この液をＨＰＬＣにより逆相カラム（ＣＮ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて０．１％ＴＦＡ（ｐＨ ２．２）中３３−５３％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収でモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したＮ１−ｌｉｋｅペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【００６６】
さらに、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドのＣ末端をアミド化するためにアミド化酵素反応を行った。なお、前述したとおり、ペプチドの形態としてＣ末端がアミド化されているポリペプチド誘導体が最も好ましい。Ｃ末端がアミド化したＮ１−ｌｉｋｅペプチドを、次の組成にて反応させた。Ｎ１−ｌｉｋｅペプチド０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１μｇ／ｍｌ カタラーゼ、１０μＭ ＣｕＳＯ４、１ｍＭ アスコルビン酸、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、および、１０Ｕ／ｍｌ ペプチジルグリシンα−アミド化酵素（和光純薬工業）を用い、３７度で一晩撹拌した。反応終了後、０．４５μｍ遠心フィルター（ミリポア）に通した後、ＨＰＬＣにより逆相カラム（ＣＮ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて０．１％ＴＦＡ（ｐＨ ２．２）中３３−５３％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収でモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したアミド化Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。これを後述の行動実験に用いた。
【００６７】
（調製例２）
本調製例２では、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドの製造方法に係る調製例について、より効率的に製造できる方法について詳細に説明する。
【００６８】
まず、概要について簡単に述べる。本調製例２では、前述した二つのペプチドフラグメントを縮合（ライゲーション）する手法であるネイティブケミカルライゲーション法を用いてラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドを調製した。また、本調製例２では、インテインというタンパク質を使用している。インテインは、タンパク質スプライシング作用を有し、チオエステルを反応中間体としている。つまり、インテインとの組み換え融合タンパク質を構築することによりペプチドの末端がチオエステル化するシステムが開発されており、それを容易にするベクターも商品化されている（ＮＥＢ）。
【００６９】
ペプチド固相合成法によるペプチド製造は通常５０アミノ酸残基程度であり、それ以上長いペプチドの製造には、組み換えタンパク質発現や、上記のライゲーション法が必要となる。本調製例２に関するラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドは８８アミノ酸残基であり、ペプチド固相合成法のみによるペプチド化学合成は出来ないことがこれまでの先行研究からわかった。一方、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドはＣｙｓ残基を三つ有する。ここで、Ｎ末端から二番目のＣｙｓ残基以降のアミノ酸残基数が６１残基で、当該Ｃ末端側６１アミノ酸残基のペプチド部分をペプチド固相合成法により製造を行った。さらに、このＣ末端側６１アミノ酸残基のペプチドフラグメントと、インテイン融合タンパク質により製造したＮ末端側のペプチドフラグメントとをライゲーションすることにより、Ｃ末端側がアミド化した全長８８アミノ酸残基のラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドの製造を、効率よく行うことが出来た。図３は、ネイティブケミカルライゲーション法を用いて調製したラットＮ１−ｌｉｋｅペプチドを示す概要図である。
【００７０】
次に、本調製例２の詳細な調製方法について述べる。
【００７１】
最初に、大腸菌を形質転換するための発現プラスミドの構築を行った。成体ラット（Ｗｉｓｔａｒ、雄）の脳から、摂食調節中枢を含む視床下部基底部を摘出し、総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）を用いて、添付されたプロトコールに従って抽出した。抽出した総ＲＮＡを、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０〈Ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてｍＲＮＡに精製した後、ＲｅｖｅｒＴｒａ ＡＣＥ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。そのｃＤＮＡを鋳型に、制限酵素ＮｄｅＩサイトを付加した順方向プライマーと制限酵素ＳａｐＩサイトを付加した逆方向プライマーとを用いて、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドのＮ末端側２７アミノ酸残基に対応する遺伝子をＰＣＲにて増幅した。その際、Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ）を含む反応溶液を作成した。なお、反応条件は、９４度３分間でＤＮＡを変性させ、９４度３０秒、５５度３０秒および７２度１５秒の増幅反応を３０サイクル繰り返した。
【００７２】
得られたＰＣＲ産物を、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いて精製し、制限酵素ＮｄｅＩとＳａｐＩで３７度において３時間処理した。その後、２％アガロースゲルで電気泳動し、約８５ｂｐのバンドをＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてインサートＮ１−ｌｉｋｅ ＤＮＡとして回収した。同様に制限酵素処理して精製したインテイン融合タンパク質発現用のｐＴＸＢ１ベクター（ＮＥＢ）に、インサートＮ１−ｌｉｋｅ ＤＮＡを挿入して、ＤＨ５α株を形質転換した。得られたコロニーを鋳型にし、順方向プライマーＴ７と逆方向プライマーＭｘｅ Ｉｎｔｅｉｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＩＩを用いてコロニーＰＣＲを行い、インサートＮ１−ｌｉｋｅ ＤＮＡが入っていることを確認した。さらに、ＢｉｇＤｙｅ反応をし、ＤＮＡシークエンサーによりインサートの配列の確認を行った。正しい配列が確認されたコロニーを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が入った５ｍｌ ＬＢ培地で一晩３７度にて培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて、Ｎｉ−ｌｉｋｅペプチド２７アミノ酸残基とインテインとの融合タンパク質発現プラスミドを回収した。
【００７３】
次に、このタンパク質発現プラスミドで、大腸菌のコンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）株（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ）を形質転換した。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が入った５ｍｌ ＬＢ培地で一晩３７度にて培養したものを、５０倍希釈にし、５ｍｌでＯＤ６００＝０．５まで３７度で振とう培養した。目的のＯＤ値になったところで、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭになるように添加して、３時間振とう培養した。大腸菌培養液を１０，０００×ｇ、４度、１０分間の条件において遠心して集菌し、集菌した菌体を−８０度で凍結した。大腸菌培養液１．５ｍｌ分の凍結大腸菌ペレットに、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）３００μｌを添加し、２０，４００×ｇ、４度、２０分間の条件において遠心して上清と沈殿とを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後に、２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩキット（コスモ・バイオ）でゲルを染色し、発現の確認を行った。
【００７４】
なお、大量培養は、１Ｌのバッフル付きフラスコ中に３００ｍｌ ＬＢ培地で振とう速度１５０ｒｐｍにて行った。ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭ、菌回収時の遠心は４，０００×ｇ、４度、１０分間の条件で行った。凍結大腸菌ペレット湿重量１ｇに対して、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）５ｍｌおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）２μｌの割合で加え、タンパク質抽出を行った。これら以外の方法および条件は前述と同様である。
【００７５】
次いで、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチド２７アミノ酸残基とインテインとの融合タンパク質の精製を行った。この融合タンパク質の精製を容易にするためにＣ末端側にキチン結合ドメインが付加されている。培養液９００ｍｌ分の抽出液に対してキチンビーズ（ＮＥＢ）を４００ｍｌ使用した。オープンカラムにキチンビーズを詰め、１０倍量のカラムバッファー（２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ）を添加し、カラムを平衡化した。その後、上記で調製した大腸菌抽出液をカラムにロードした。その際、３倍量のカラムバッファーを添加し、非特異的な吸着物を除去した。次いで、カラムの流れを止め、３倍量のクリーベイジバッファー（５００ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＭＥＳＮＡ）／カラムバッファー）を添加し、２５度で１６時間反応させた。その後、カラムの栓を開け、反応後の素通り画分を回収した。このクリーベイジによりＮ１−ｌｉｋｅペプチド２７アミノ酸残基とインテインとの結合が切れ、さらにＣ末端がチオエステル化したＮ１−ｌｉｋｅペプチド２７アミノ酸残基が得られる。
【００７６】
回収した素通り画分を０．４５μｍ遠心フィルター（ミリポア）に通した後、ＨＰＬＣにより、Ｃ１８逆相カラム（ＯＤＳ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中３２−７２％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収をモニターしながら精製した。回収したピークをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【００７７】
Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドのＣ末端側６１アミノ酸残基は、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成により製造した。Ｃ末端アミド化を生じるレジンを用い、ペプチド合成機（ＰＳＳＭ８、島津）により自動合成を行った。保護基をクリーベイジ後、ジエチルエーテルで洗浄した後に乾燥させ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解した。ＨＰＬＣにより、Ｃ１８逆相カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８、ＹＭＣ）を用いて、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中３５−６５％／３０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで２８０ｎｍの紫外線吸収をモニターしながら溶出した。回収したピークをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【００７８】
このように得られたチオエステル化したＮ末端側２７アミノ酸残基と、アミド化したＣ末端側６１アミノ酸残基からなる二つのペプチドフラグメントを、ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）法によりライゲーションさせた。
【００７９】
まず、ペプチドフラグメントを反応させるＮＣＬバッファー（０．１Ｍ ４−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＭＰＡＡ）、２０ｍＭ ＴＣＥＰ、８Ｍ グアニジン塩酸塩、０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．０）を調製した。このＮＣＬバッファー１ｍｌに対して、Ｎ末端側２７アミノ酸残基ペプチド２．０ｍｇと、Ｃ末端側６１アミノ酸残基ペプチド４．７ｍｇを溶解した（それぞれ０．５〜１．０ｍＭ）。その後、チューブ内を窒素で置換し、２５度で約２４時間静置することでライゲーション反応を行った。この反応液を０．４５μｍ遠心フィルター（ミリポア）に通した後、ＨＰＣＬによりＣＮ逆相カラム（ＣＮ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中３５−５５％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収をモニターしながら溶出した。回収したピークをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したＮ１−ｌｉｋｅペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【００８０】
製造したＮ１−ｌｉｋｅペプチド中のジスルフィド結合は、前述の調製例１と同様に活性発現に重要であると思われる。そのために、フェリシアン化カリウムを用いてジスルフィド結合を生じさせた。凍結乾燥したＮ１−ｌｉｋｅペプチド１ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．３ｍｌで溶解し、８Ｍ尿素／５０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー２．７ｍｌを加えた。その後、攪拌しながらさらに１５０ｍＭフェリシアン化カリウム溶液を６０μｌ加え、室温で１時間攪拌し続けた。次いで、酢酸６００μｌで反応を停止し、陰イオン交換樹脂（ＡＧ４−ｘ４、バイオラッド）に通し過剰なフェリシアン化カリウムを除去した。素通り溶液をＨＰＬＣによりＣＮ逆相カラム（ＣＮ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中３５−５５％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収をモニターしながら精製した。回収したピークをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したＮ１−ｌｉｋｅペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【００８１】
すなわち、前述の調製例１と比較すると、本調製例２は、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチド（８８アミノ酸残基）のＮ末端側２７アミノ酸残基は大腸菌を用いてＣ末端がチオエステル化した組み換えペプチドとして製造し、Ｃ末端側６１アミノ酸残基はＣ末端がアミド化したペプチドをペプチド化学合成により製造し、それぞれのペプチドフラグメントをライゲーションしている。これにより、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドのＣ末端はペプチド固相合成により確実にアミド化しているために、アミド化酵素による翻訳後修飾を施さなくてもよく、より効率的にラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドを製造可能であることが確認された。
【００８２】
（実施例１）
本実施例１では、調製例１で製造したアミド化Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドのラットへの単回投与、および投与後２時間における観察実験について詳細に述べる。
【００８３】
まず、ラットを購入後１週間程度飼育し、脳手術でのストレスを軽減させる目的でハンドリングを行って馴化させた。ジエチルエーテルでラットを軽く麻酔した後、ソムノペンチル（４０ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与して麻酔し、体が脱力したのを確認してから、イヤーバーを差し込み（７ｍｍ）、切歯バーを取り付け、脳定位固定装置（室町機械）に固定した。麻酔の効果で体温が下がるため、手術中はカイロで体温を温めながら行った。頭の毛を剃り７０％エタノールで消毒した後、手術用ハサミを用いて正中に沿って頭皮を切り綿棒で止血した。その後、頭蓋骨をアセトンで拭いた。頭蓋骨にあるブレグマとラムダの位置を水平にし、マニュピレーターに取り付けたガイドカニューラの先端をブレグマの位置に合わせ、ラット脳地図を参考にして脳室（左側脳室、ブレグマより後位１ｍｍ、側位１．５ｍｍ）に先端を移動させて、印をつけた。電動ドリルで印の位置に穴を開け、カニューラを腹位３．７ｍｍに挿入した。挿入後、瞬間接着剤（Ｌｏｃｔｉｔｅ４５４）と歯科用セメントを用いて、カニューラを頭蓋に固定した。手術後、抗生物質セファゾリンナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ体重）と消炎鎮痛剤リマダイル（５ｍｇ／ｋｇ体重）とを皮下投与した。投与時以外は挿入したガイドカニューラにダミーカニューラを挿入した。脳手術後１週間、回復期間に当てた。脳室内投与実験２日前に脳室内へカニューラが入っていることを確かめるために、アンギオテンシンＩＩ（４０ｐｍｏｌ）を脳室内投与し、飲水行動が惹起されることを確認した。
【００８４】
先端にインターナルカニューラをつけたコネクターチューブに１ｍｌシリンジで滅菌水を満たし、空気をはさんで、投与溶液を充填した。Ｎ１−ｌｉｋｅペプチド投与は、暗期開始１０分前に行い、実験群にはＮ１−ｌｉｋｅペプチド（５ｎｍｏｌ／５μｌ）を、コントロール群には溶媒である０．９％ＮａＣｌおよび１０％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を、５μｌずつ投与した。投与後は３０秒間ほどカニューラをそのままにし、溶液を拡散させてからカニューラを抜き、ダミーカニューラを挿入しケージに戻した。投与後、１および２時間後に摂食量を測定した。
【００８５】
図４は、実施例１に係るＮ１−ｌｉｋｅペプチド投与後２時間におけるラットの摂食促進効果の結果を示す図である。なお、縦軸は累積の摂食量（ｇ）を示す。図３に示すように、１時間後（１ｈｒ）および２時間後（２ｈｒ）のいずれも、コントロールと比較すると有意に摂食量を増加させた。１時間後では、約５倍も摂食量を増加させた。なお、この効果は投与後２時間まで統計的に有意であった（６時間後では有意差はなかった）。これらの結果から、最初、サブトラクション法によって発見した、Ｎ１−ｌｉｋｅ遺伝子のパラログ遺伝子である新規摂食調節遺伝子Ｎ１遺伝子によりコードされるＮ１ペプチドであっても、脊椎動物に投与することにより摂食量が増すことが示唆される。また、これらのホモログ遺伝子を有する脊椎動物にも、同様のことが示唆される。
【００８６】
（調製例３）
本調製例３では、ラットのＮ１ペプチドの製造方法に係る調製例について、詳細に説明する。
【００８７】
ラットのＮ１ペプチドは、Ｆｍｏｃ固相法によるペプチド化学合成により製造した。なお、ラットのＮ１ペプチドのＣ末端はアミド化している。カップリング試薬としてＨＢＴＵを用い、脱保護試薬としてピペリジンを用いた。合成機はマイクロウェーブ法による自動合成が可能な、Ｌｉｂｅｒｔｙ１（ＣＥＭ）を用いた。保護基をクリーベイジ後、合成ペプチドをジエチルエーテルで洗浄した。その後、合成ペプチドをＨＰＬＣによりＣ１８逆相カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８、ＹＭＣ）を用いて０．１%ＴＦＡ(ｐＨ ２．２）中３５−６５％／３０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで２８０ｎｍの紫外線吸収でモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。
【００８８】
製造したＮ１ペプチド中において、ジスルフィド結合は活性発現に重要であると思われる。そのために、グルタチオンを用いてジスルフィド結合を生じさせた。凍結乾燥したＮ１ペプチド１ｍｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．１ｍｌで溶解し、１Ｍトリスバッファー（ｐＨ ８．５）０．４ｍｌ加えた。さらにアセトニトリル０．５ｍｌ、０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ ８．０）２μｌ、還元型グルタチオン１．５ｍｇ、および酸化型グルタチオン０．３ｍｇ加え、室温で３日間撹拌した。反応溶液をＨＰＬＣによりＣ１８逆相カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８、ＹＭＣ）を用いて０．１%ＴＦＡ(ｐＨ ２．２）中３５−６５％／３０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで２８０ｎｍの紫外線吸収でモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。このようにジスルフィド結合を形成したラットのＮ１ペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【００８９】
（実施例２）
本実施例２では、前述の調製例３により製造したＮ１ペプチドのラットへの単回投与、および投与後２２時間における観察実験について詳細に述べる。
【００９０】
まず、ラットを購入後１週間程度飼育し、脳手術でのストレスを軽減させる目的でハンドリングを行って馴化させた。ジエチルエーテルでラットを軽く麻酔した後、ソムノペンチル（４０ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与して麻酔し、体が脱力したのを確認してから、イヤーバーを差し込み（７ｍｍ）、切歯バーを取り付け、脳定位固定装置（室町機械）に固定した。麻酔の効果で体温が下がるため、手術中はカイロで体温を温めながら行った。頭の毛を剃り７０％エタノールで消毒した後、手術用ハサミを用いて正中に沿って頭皮を切り綿棒で止血した。その後、頭蓋骨をアセトンで拭いた。頭蓋骨にあるブレグマとラムダの位置を水平にし、マニュピレーターに取り付けたガイドカニューラの先端をブレグマの位置に合わせ、ラット脳地図を参考にして脳室（左側脳室、ブレグマより後位１ｍｍ、側位１．５ｍｍ）に先端を移動させて、印をつけた。電動ドリルで印の位置に穴を開け、カニューラを腹位３．５ｍｍに挿入した。挿入後、瞬間接着剤（Ｌｏｃｔｉｔｅ４５４）と歯科用セメントを用いて、カニューラを頭蓋に固定した。手術後、抗生物質セファゾリンナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ体重）と消炎鎮痛剤リマダイル（５ｍｇ／ｋｇ体重）を皮下投与した。
【００９１】
次に、先端にインターナルカニューラをつけたコネクターチューブに１ｍｌシリンジで滅菌水を満たし、空気をはさんで、投与溶液を充填した。Ｎ１ペプチド投与は、明期２時間後に行い、実験群にはＮ１ペプチド（５ｎｍｏｌ／５μｌ）を、コントロール群には溶媒であるＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７−８）および１０％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を、５μｌずつ投与した。投与後は３０秒間ほどカニューラをそのままにし、溶液を拡散させてからカニューラを抜き、ダミーカニューラを挿入しケージに戻した。投与後、１、２、６、１０および２２時間後に摂食量を測定した。
【００９２】
図５は、実施例２に係るＮ１ペプチド単回投与後２２時間におけるラットの摂食促進効果の結果を示す図である。なお、縦軸は総摂食量（ｇ）を示す。図５に示すように、３０分後（０−０．５ｈ）から１０時間後（０−１０ｈ）のいずれも、コントロールと比較すると有意に摂食量を増加させた（ｎ＝４、＊：ｐ＜０．０５）。なお、２２時間後では有意差がなかった。このように、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドだけでなく、ラットのＮ１ペプチドの場合でも単回投与することによって、投与後１０時間程度にわたって摂食量が促進するということが確認された。
【００９３】
（実施例３）
本実施例３では、前述の調製例３により製造したＮ１ペプチドのラットへの長期間（１週間）にわたる連続投与の実験について詳細に述べる。
【００９４】
ラットの飼育から、抗生物質セファゾリンナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ体重）と消炎鎮痛剤リマダイル（５ｍｇ／ｋｇ体重）の皮下投与までの手順は、前述した実施例２と同様である。その後、浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ ｍｏｄｅｌ２００２）にＮ１ペプチド（１．２５ｎｍｏｌ／μｌ、ｐＨ７−８）の投与溶液を充填した。次にチューブ（５ｃｍ）を介してカニューラ（Ｂｒａｉｎ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｋｉｔ １，Ａｌｚｅｔ）を浸透圧ポンプと連結させた。浸透圧ポンプは、カニューラの脳内への挿入前に３７℃の０．９％ＮａＣｌに１２時間以上浸して可動させておいた。このカニューラをラットの脳室へ挿入した後、浸透圧ポンプをラットの肩甲骨の皮下へと埋め込み、１週間の長期間投与（１５ｎｍｏｌ／ｄａｙ）を行った。コントロール群には溶媒であるＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７−８）および１０％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を投与した。
【００９５】
図６は、実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの２４時間毎の体重変化を示す図である。なお、縦軸は体重（ｇ）を示す。図６に示すように、６日目からコントロールと比較し、有意に体重が減少した（ｎ＝８、＊：ｐ＜０．０５）。なお、２２時間後では有意差がなかった。また、この際の体重増加量についても確認した。図７は、実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの２４時間毎の体重増加量を示す図である。なお、縦軸は体重増加量（ｇ）を示し、手術当日の体重を０ｇとしている。図７に示すように、体重増加量（ｇ）では、４日目からコントロールと比較し、有意に体重増加量が減少していた（ｎ＝８、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。
【００９６】
さらに、当該ラットの１日分の総摂食量の変化について確認した。その際、まず、明期１２時間（昼夜を明期１２時間と暗期１２時間とした場合）における、総摂食量の変化について確認した。図８は、実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの明期１２時間の総摂食量を示す図である。縦軸は摂食量（ｇ）を示し、ｎ＝８、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１である。図８に示すように、明期１２時間では摂食量を増やす効果があることが確認された。次いで、暗期１２時間における、総摂食量の変化について確認した。図９は、実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの暗期１２時間の総摂食量を示す図である。縦軸は摂食量（ｇ）を示し、ｎ＝８、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１である。図９に示すように、手術日５日目から有意差を確認できた。暗期１２時間では明期１２時間とは逆で、摂食量を減少させる効果があることが確認された。
【００９７】
これらを踏まえ、Ｎ１ペプチド１週間連続投与ラットの２４時間単位での総摂食量の変化について確認した。図１０は、実施例３に係るＮ１ペプチド長期間連続投与におけるラットの総摂食量を示す図である。縦軸は摂食量（ｇ）を示し、ｎ＝８、＊：ｐ＜０．０５である。図１０に示すように、投与開始１日目では有意にＮ１ペプチド投与群の摂食量（ｇ）が促進されるが、投与開始７日目となるとＮ１ペプチド投与群の摂食量（ｇ）が減少することが確認された。
【００９８】
当該Ｎ１ペプチド長期間連続投与での摂食量減少という実験結果は、前述の図６および図７の体重および体重増加量減少にも現れている。また、図８および図９のみの結果を比較すると、図８での明期の摂食量の増加は多い場合でも約４ｇ程度であるが、図９での暗期の摂食量の減少は多い場合約１５ｇ程度まで達している。これは、暗期、すなわちラットの活動期に着目すれば摂食量の減少を顕著に多く起こすことを示しており、すなわち、活動期の摂食量の抑制がなされ、その結果、前述のとおり体重の減少という現象に現れたと考えられる。
【００９９】
（調製例４）
本調製例４では、組み換えニワトリＮ１−ｌｉｋｅペプチドの製造方法に係る調製例について詳細に述べる。
【０１００】
まず、大腸菌を形質転換するための発現プラスミドの構築を行った。ニワトリ雛の脳から、摂食調節中枢を含む視床下部漏斗部を摘出し、総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）を用いて、添付されたプロトコールに従って抽出した。抽出した総ＲＮＡを、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０〈Ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてｍＲＮＡに精製した後、ＲｅｖｅｒＴｒａ ＡＣＥ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。次いで、そのｃＤＮＡを鋳型に、制限酵素ＮｄｅＩサイトを付加した順方向プライマーと、制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを付加した逆方向プライマーとを用いてＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子をＰＣＲにて１００μｌの系で増幅した。なお、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチド製造後にアミド化酵素によりＣ末端アミド化処理を行うために、Ｃ末端はＧｌｙ残基が付加するように逆方向プライマーを設計した。その際、Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ）を含む反応溶液を作成した。なお、当該反応条件は、９４度３分間でＤＮＡを変性させ、９４度３０秒、５５度３０秒および７２度３０秒の増幅反応を３０サイクル繰り返した。
【０１０１】
得られたＰＣＲ産物を、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いて精製し、制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで３７度で１時間処理した後、１．５％アガロースゲルで電気泳動を行った。その後、電気泳動での約３００ｂｐのバンドを、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてインサートＮ１−ｌｉｋｅ ＤＮＡとして回収した。同様に制限酵素処理して精製したｐＣｏｌｄ ＴＦ ＤＮＡベクター（タカラバイオ）にインサートＮ１−ｌｉｋｅ ＤＮＡを挿入して、ＤＨ５α株を形質転換した。次に、得られたコロニーを鋳型にし、順方向プライマーｐＣｏｌｄ−ＴＦ−Ｆ１と、逆方向プライマーｐＣｏｌｄ−Ｒとを用いてコロニーＰＣＲを行い、インサートが入っていることを確認した。さらに、ＢｉｇＤｙｅ反応を行い、ＤＮＡシークエンサーによりインサートの配列の確認も行った。正しい配列が確認されたコロニーを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が入った５ｍｌ ＬＢ培地で一晩３７度にて培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて、Ｈｉｓ−ＴＦ−Ｎ１−ｌｉｋｅタンパク質発現プラスミドを回収した。
【０１０２】
次に、Ｈｉｓ−ＴＦ−Ｎ１−ｌｉｋｅタンパク質発現プラスミドで、大腸菌のコンピテントセルＢＬ２１ Ｓｔａｒ(ＤＥ３)ｐＬｙｓＳ株（インビトロジェン）を形質転換した。その後、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が入った５ｍｌ ＬＢ培地で一晩３７度にて培養したものを、５０倍希釈にし、５ｍｌでＯＤ６００＝０．５まで３７度で振とう培養した。目的のＯＤ値になったところで、１５度で３０分間冷却し、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭになるように添加して、２４時間振とう培養した。当該大腸菌培養液を１０，０００×ｇ、４度、１０分間の条件において遠心して集菌し、集菌した菌体を−８０度で凍結した。次に、大腸菌培養液１．５ｍｌ分の凍結大腸菌ペレットに、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）３００μｌを添加し、２０，４００×ｇ、４度、２０分間の条件において遠心して上清と沈殿とを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後に、２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩキット（コスモ・バイオ）でゲルを染色し、発現の確認を行った。
【０１０３】
なお、大量培養は、１Ｌのバッフル付きフラスコ中に３００ｍｌ ＬＢ培地で振とう速度１５０ｒｐｍにて行った。ＩＰＴＧの添加は終濃度０．１ｍＭとなるように行い、菌回収時の遠心は４，０００×ｇ、４度、２０分間の条件で行った。なお、凍結大腸菌ペレット湿重量１ｇに対して、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）５ｍｌと、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）５μｌの割合で加え、タンパク質抽出を行った。これら以外の方法および条件は前述と同様である。
【０１０４】
次に、ニワトリのＮ１−ｌｉｋｅペプチドの精製を行った。空カラムに大腸菌ペレット湿重量約３ｇに対してＴＡＬＯＮレジン（クロンテック）２０ｍｌ（５０％懸濁液）を入れ、カラム体積５倍量の平衡化バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で平衡化した。タンパク質抽出液の上清をカラムに添加し、素通り画分を回収し、カラム体積５倍量の洗浄溶液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で洗浄した。また、カラム体積３倍量の溶出バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．０）を用いて溶出した。ＴＡＬＯＮレジンカラム精製での各画分については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩキット（コスモバイオ）でゲルを染色し、確認した。
【０１０５】
溶液交換のため、ＴＡＬＯＮレジンカラム溶出液を、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０）を２時間ごとに２回交換し、一晩４度にて透析した。その後、透析膜チューブから液を回収し、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてタンパク定量を行った。タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌになるようＦａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応バッファーを加え、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ（ＮＥＢ）を終濃度１μｇ／ｍｌになるよう添加し、２５度で１６時間攪拌した。その後、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ反応液に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）（ナカライテスク）を終濃度５０ｍＭになるように加え、一晩４度で還元反応を行った。
【０１０６】
この工程は、本発明者らが研究した結果、発現したニワトリのＮ１−ｌｉｋｅペプチドは、可溶化タグ（ＴＦ）と強い相互作用を有しており、可溶化タグ切断のためのプロテアーゼ（Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ）を用いて切断した後も離れないことを解明し、強い還元剤であるトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を作用させることによって、その相互作用を切断することを発見したことによる。
【０１０７】
還元処理を行ったサンプル中にはタグタンパク質が存在しているために、終濃度８０％になるように冷アセトンを加え、氷水中で３０分間冷却し、不要なタグタンパク質を沈殿させ、遠心分離し除去した。その後、上清のアセトンを遠心エバポレーターで蒸発させ、残りの溶液をＨＰＬＣにより逆相カラム（ＣＮ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中３５−５５％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収でモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したＮ１−ｌｉｋｅペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【０１０８】
なお、前述のＴＣＥＰによる還元処理のために、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチド中の二つのＣｙｓ残基からなるジスルフィド結合は解離した状態となってしまう。そのため、再度酸化させ、ジスルフィド結合を再形成させる必要がある。ここで、凍結乾燥したＮ１−ｌｉｋｅペプチド１ｍｇを、８Ｍ尿素／５０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー１ｍｌで溶解させ、さらに１５０ｍＭフェリシアン化カリウム溶液を２０μｌ加え、室温にて１時間攪拌した。その後、酢酸２００μｌで反応を停止し、陰イオン交換樹脂（ＡＧ４−ｘ４、バイオラッド）に通し、鉄イオンを除去した。素通り溶液をＨＰＬＣにより逆相カラム（ＣＮ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中３２−５２％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収でモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したＮ１−ｌｉｋｅペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。
【０１０９】
さらに、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドのＣ末端をアミド化するために、アミド化酵素反応を行った。なお、ペプチドの形態として、Ｃ末端がアミド化されているポリペプチド誘導体が最も好ましい。Ｃ末端がＧｌｙであるＮ１−ｌｉｋｅペプチドを、次の組成にてアミド化反応させた。当該組成は、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチド０．５ｍｇ／ｍｌ、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１００μｇ／ｍｌカタラーゼ、２０μＭ ＣｕＳＯ４、１ｍＭアスコルビン酸、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、および、１０Ｕ／ｍｌペプチジルグリシンα−アミド化酵素（和光純薬工業）であり、これらを３７度で一晩攪拌した。反応終了後、０．４５μｍ遠心フィルター（ミリポア）に通した後、ＨＰＬＣにより逆相カラム（ＣＮ−８０Ｔｓ、東ソー）を用いて０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中３２−５２％／４０ｍｉｎのアセトニトリル直線濃度勾配により、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２２０ｎｍの紫外線吸収でモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。精製したＮ１−ｌｉｋｅペプチドを凍結乾燥し、−２０度で保存した。これを後述のニワトリの行動実験に用いた。
【０１１０】
（実施例４）
本実施例４では、調製例４で製造したニワトリのアミド化Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドを利用したニワトリ雛への投与実験について詳細に述べる。
【０１１１】
まず、ニワトリ雛を購入後３〜４日程度個別飼育した。その後、脳室内投与用の自作の脳定位固定装置にてニワトリ雛の頭部を保持し、マイクロシリンジを用いて脳室内投与を行った。Ｎ１−ｌｉｋｅペプチド投与は、実験群（８個体）にはＮ１−ｌｉｋｅペプチド（５ｎｍｏｌ／５μｌ）を、コントロール群（１１個体）には溶媒である１０％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を含んだ１０ｍＭリン酸緩衝食塩水をそれぞれ５μｌずつ投与した。投与後、３０、６０および９０分後に摂食量を測定した。なお、脳室内投与成功の有無は、投与液に青色の色素であるエバンスブルーを混合しておき、実験終了後に脳室内に色素が注入されていることで確認を行った。脳室内に色素が注入されていない個体はデータから排除した。
【０１１２】
図１１は、実施例４に係るＮ１−ｌｉｋｅペプチド単回投与におけるニワトリ雛の摂食抑制効果の結果を示す図である。なお、縦軸は累積の摂食量（ｇ）を示す。図１１に示すように、６０分後および９０分後のいずれも、コントロールと比較すると有意に摂食量が抑制されている。これらの結果から、ニワトリのＮ１−ｌｉｋｅペプチドをニワトリ雛の脳室内に投与すると、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドとは相反して、摂食量を抑制させる効果を有するということがわかった。
【０１１３】
このように、実施例１ないし実施例４の結果を考慮すると、Ｎ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドは、単回、複数回、連続投与および投与間隔等の投与方法によって、摂食量を促進または抑制させる摂食調節が可能であったり、同様の投与方法であっても他の動物種であったら相反する作用効果での摂食調節が可能であることが確認された。すなわち、種々の脊椎動物のホモログ遺伝子のＮ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドを利用することにより、任意の摂食調節が可能である。
【０１１４】
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【０１１５】
本明細書の中で明示した論文および公開特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【０１１６】
本出願は、２０１１年３月２４日に出願された日本国特許出願２０１１−６５２１６号に基づく。本明細書中に、日本国特許出願２０１１−６５２１６号の、明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明者らが鋭意研究した結果、大腸菌を用いて製造させたラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドをラットの脳室内に投与すると、投与後１０時間程度はコントロール群と比較して摂取量を促進するようになるということを発見した。一方、ニワトリのＮ１−ｌｉｋｅペプチドをニワトリの脳室内に投与すると、ラットとは逆に、投与後９０分間程度はコントロール群と比較して摂取量を抑制するようになるということを発見した。さらに、ラットのＮ１ペプチドを長期間ラットに連続投与すると、６、７日以降には摂食抑制の効果を有するということも発見した。また、当該ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドはネイティブケミカルライゲーション法を用いることによって効率よく製造できることも見出した。
【０１１８】
そこで、本発明によれば、Ｎ１ペプチドおよびＮ１−ｌｉｋｅペプチドの詳細な特性が開示、解明され、摂食調節効果を有するポリペプチド、該ポリペプチドの製造方法、該ポリペプチド等を有効成分として含有する摂食調節組成物、および、これらを用いる摂食量の調節方法が提供される。すなわち、具体的には、食肉動物の生産量を膨大に増加させることも可能となり、さらには、摂食に関連する疾患（例えば拒食症および糖尿病等）の医療および医薬への応用も期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）ないし（ｆ）のいずれかであり、かつ摂食調節作用を有することを特徴とする、ポリペプチド。
（ａ）配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｂ）配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｃ）配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｄ）配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｅ）配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｆ）配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドのＣ末端は、アミド化していることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合を有することを特徴とする、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕs）、および／または、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に対する摂食調節作用を有することを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリペプチドを作製することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
【請求項６】
前記製造方法は、大腸菌培養による遺伝子工学的製造方法を用いることを特徴とする、請求項５に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項７】
前記製造方法は、ネイティブケミカルライゲーション法を用いることを特徴とする、請求項５に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項８】
製造される前記ポリペプチドは、配列番号３もしくは７に記載のアミノ酸配列、配列番号３もしくは７に記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加したアミノ酸配列、または、配列番号３もしくは７に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれかであることを特徴とする、請求項７に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
製造される前記ポリペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ジスルフィド結合を再形成させる工程を含むことを特徴とする、請求項６または７に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリペプチド、または、前記ポリペプチドにおいて薬学的に許容される誘導体もしくは薬学的に許容される塩類を有効成分として含有することを特徴とする、摂食調節組成物。
【請求項１１】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１０に記載の摂食調節組成物を投与する工程を含むことを特徴とする、摂食量の調節方法。
【請求項１２】
前記ポリペプチドまたは前記摂食調節組成物を、非ヒト脊椎動物の脳室内に投与することを特徴とする、請求項１１に記載の摂食量の調節方法。
【請求項１３】
前記摂食量の調節方法は摂食量の抑制方法であり、ラットの脳室内に前記ポリペプチドまたは前記摂食調節組成物を長期間連続投与することを特徴とする、請求項１１または１２に記載の摂食量の調節方法。
【請求項１】
以下の（ａ）ないし（ｆ）のいずれかであり、かつ摂食調節作用を有することを特徴とする、ポリペプチド。
（ａ）配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｂ）配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｃ）配列番号１ないし配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｄ）配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｅ）配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（ｆ）配列番号５ないし配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドのＣ末端は、アミド化していることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合を有することを特徴とする、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕs）、および／または、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に対する摂食調節作用を有することを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリペプチドを作製することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
【請求項６】
前記製造方法は、大腸菌培養による遺伝子工学的製造方法を用いることを特徴とする、請求項５に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項７】
前記製造方法は、ネイティブケミカルライゲーション法を用いることを特徴とする、請求項５に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項８】
製造される前記ポリペプチドは、配列番号３もしくは７に記載のアミノ酸配列、配列番号３もしくは７に記載のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加したアミノ酸配列、または、配列番号３もしくは７に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれかであることを特徴とする、請求項７に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
製造される前記ポリペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ジスルフィド結合を再形成させる工程を含むことを特徴とする、請求項６または７に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリペプチド、または、前記ポリペプチドにおいて薬学的に許容される誘導体もしくは薬学的に許容される塩類を有効成分として含有することを特徴とする、摂食調節組成物。
【請求項１１】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１０に記載の摂食調節組成物を投与する工程を含むことを特徴とする、摂食量の調節方法。
【請求項１２】
前記ポリペプチドまたは前記摂食調節組成物を、非ヒト脊椎動物の脳室内に投与することを特徴とする、請求項１１に記載の摂食量の調節方法。
【請求項１３】
前記摂食量の調節方法は摂食量の抑制方法であり、ラットの脳室内に前記ポリペプチドまたは前記摂食調節組成物を長期間連続投与することを特徴とする、請求項１１または１２に記載の摂食量の調節方法。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−２１１１２１（Ｐ２０１２−２１１１２１Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４８００６（Ｐ２０１１−２４８００６）
【出願日】平成２３年１１月１１日（２０１１．１１．１１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２３年度、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 生物系特定産業技術研究支援センター・イノベーション創出基礎的研究推進事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月１１日（２０１１．１１．１１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２３年度、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 生物系特定産業技術研究支援センター・イノベーション創出基礎的研究推進事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
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