ポリペプチドの収量を改良する方法
本発明は蛋白質収量を改良するための方法に関する。本方法は、真核生物宿主における１つまたは複数の蛋白質特性について、最適範囲内に入るか最適値にもっと近づくように、一組の関連蛋白質特性の値を修飾するステップを含む。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、ポリペプチドの収量を改良する方法に関する。特に、本発明は、ポリペプチドの主鎖を修飾するステップによりポリペプチドの収量を改良する方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
ゲノムおよびメタゲノムシークエンシングにおける最近の急速な進歩は、潜在的に非常に興味深い多様な蛋白質を表す多くの遺伝子をもたらしている。これらの遺伝子をかなりの水準で発現させる問題は、これらの遺伝子によりコードされる蛋白質の機能性の調査を妨げ、結果として、経済的な実現可能な方法での、このような蛋白質の利用の可能性を阻む。多くの場合、発見された遺伝子は大規模生産にあまり適していないか、または現在の遺伝子工学ツールにかなり利用し難しい生物に由来するため、遺伝子導入系および十分に開発された遺伝子工学ツールが利用可能な、十分に確立された産生宿主を使用することが極めて望ましい。特に糸状菌および酵母等の真核生物は、蛋白質の産生における、特に細胞外蛋白質の産生における、細胞工場として広く使用される。長期にわたり伝統的に使用されているため、これらの種の幾つかは一般に安全である（ＧＲＡＳ）と見なされ、ヒト用製品の製造に非常に興味深いものとなっている。しかし、かなりの改良にもかかわらず、異種遺伝子で得られる産生レベルは大抵、相同遺伝子でみられるものよりはるかに低い。多くの場合、蛋白質の発現は皆無である。
【０００３】
蛋白質産生のレベルを上げるために様々な方法がある。これらの中には、強力プロモーターの利用、コピー数の増加、最適コザック（Ｋｏｚａｋ）配列、ｍＲＮＡ安定要素、最適化コドン使用（国際公開第２００８／０００６３２号パンフレット）および遺伝子などがある。しかしながら、これらの戦略は一般に、蛋白質が検出可能なレベルで産生されることを保証するものではない。今日まで、異種蛋白質を産生するための最も成功したアプローチは、それらを、効率的に分泌される相同蛋白質との翻訳融合として発現させることである。それにも拘わらず、産生レベルはやはりそれでもなお著しく後れを取り、多くの場合、発現レベルは問題になるほど低い。一般に、発酵における低発現は、回収における低収量につながる。たとえ発現が最適化されても、最終的な成熟蛋白質生成物は、下流処理での大きな損失のため、やはり非常に低い生成収量に終わるかもしれない。これは、発現された蛋白質がバイオマスと結合したままであるとき、該当するかもしれない。これは高損失に終わるか、あるいは、蛋白質を可溶化するために、高価な、そして時には望ましくない洗剤の使用を必要とする。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は、クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）発現ベクターｐＫＬＰＧＥ−ＷＴ（実施例１に記載の構築物）のプラスミドマップを表す。図１は、他のｐＫＬＰＧＥ−発現プラスミドの代表的なマップも提供する。ＰＧＥコード化遺伝子に関連したＬＡＣ４プロモーターおよびａｍｄＳ選択マーカーカセットを示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、形質転換前に、制限酵素ＳａｃＩＩで消化することにより、除去できる。
【図２】図２は、発現ベクターｐＡＮＰＧＥ−３（実施例１に記載の構築物）のプラスミドマップを表す。図２は、他のｐＡＮＰＧＥ−発現プラスミド類の代表的なマップも提供する。加えて、ｇｌａＡプロモーターおよび本発明の方法によって変異体ＰＧＥ酵素をコード化する切断型ＧｌａＡの配列およびＰＧＥコード化配列が示される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株の形質転換前に、制限酵素ＮｏｔＩで消化することにより、除去できる。
【図３】図３は、発現ベクターｐＧＢＦＩＮＺＤＵ−ＷＴ（実施例１に記載の構築物）のプラスミドマップを表す。図３は、他のｐＧＢＦＩＮＺＤＵ−プラスミド、ｐＧＢＦＩＮＺＴＢ−プラスミドおよびｐＧＢＦＩＮＺＴＣ−プラスミドの代表的なマップも提供する。ａｍｄＳ選択マーカーカセットに関連したｇｌａＡ隣接領域を示す。加えて、ｇｌａＡプロモーターの配列ならびに本発明の方法によって変異体酵素をコード化するＺＤＵ配列、ＺＴＢ配列およびＺＴＣ配列が示される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株の形質転換前に、制限酵素ＮｏｔＩで消化することにより、除去できる。
【図４】アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ６およびＰＧＥ変異形質転換体ｐＡＮＰＧＥ１２＃１６（Ａ）およびｐＡＮＰＧＥ１３＃３０（Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析。培養の２日（Ｄ２）および３日（Ｄ３）の上澄を分析した。１４ｋＤａおよび９７ｋＤａにおける水平線は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットのアラインメント用である。左側のマーカーの大きさは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ染色マーカーに相当し、また右側のマーカーはウエスタンブロットマーカーに相当する。
【図５】図５は、全てｇｌａＡプロモーターのコントロール下での、異なるＺＤＵ構築物を発現する、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株の、３日間発酵後の培養ブロス中のキチナーゼ活性を表す。シグナル配列、Ｎ−末端および蛋白質デザインが修飾されている、変異体ＳＤＵ構築物を発現するアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株の培養ブロス中のキチナーゼ活性を表す。異なる構築物に関する詳細は、表６に示す。相対的キチナーゼ活性は、ＯＤ５９０測定値として表す。表示した全ての形質転換体群について、３つの形質転換体を単離し、独立に培養した。
【図６】図６は、全てｇｌａＡプロモーターのコントロール下での、変異体ＺＤＵ構築物を発現する、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ６菌株およびＺＤＵ菌株の、４日間発酵後の、培養ブロスのＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析を表す。異なる構築物および発現したＺＤＵ蛋白質に関する詳細は、表６に表す。表示した全ての形質転換体群について、３つの形質転換体を単離し、独立に培養した。
【図７】図７は、全てｇｌａＡプロモーターのコントロール下での、変異体ＺＴＢ構築物を発現するアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ６菌株およびＺＴＢ−菌株の、４日間発酵後の、培養ブロスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を表す。異なる構築物および発現したＺＴＢ蛋白質に関する詳細を、表７に表す。表示した全ての形質転換体群について、３つの形質転換体を単離し、独立に培養した。
【図８】図８は、全てｇｌａＡプロモーターのコントロール下での、変異体ＺＴＣ構築物を発現する、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ６菌株およびＺＴＣ−菌株の、５日間発酵後の、培養ブロスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を表す。異なる構築物および発現したＺＴＣ蛋白質に関する詳細を、表８に表す。表示したＺＴＣ−ＷＴ形質転換体群について３つの形質転換体を、他の２つの菌株型については２つの菌株を、単離して独立に培養した。
【図９】図９は、局所的な蛋白質特性を表す。
【０００５】
［配列番号の説明］
配列番号１：ｃＤＮＡコドン対最適化（ＣＰＯ）前胃エステラーゼ（ＰＧＥ）；プロセシングした、すなわちシグナル配列コード化部分がない
配列番号２：蛋白質子ウシ前胃エステラーゼ（ＰＧＥ）、シグナル配列を含む
配列番号３：ＤＮＡ ＰＧＥ蛋白質特性最適化（ＰＦＯ）変異体ＫＬ８、グリコシル化部位１つ追加
配列番号４：蛋白質ＰＧＥ ＰＦＯ変異体ＫＬ８、グリコシル化部位１つ追加
配列番号５：ＤＮＡ ＰＧＥ ＰＦＯ変異体ＫＬ９、グリコシル化部位５つ追加
配列番号６：蛋白質ＰＧＥ ＰＦＯ変異体ＫＬ９、グリコシル化部位５つ追加
配列番号７：ＤＮＡ ＰＧＥ ＰＦＯ変異体ＫＬ１１、６．９６から７．７４へのｐｌシフト
配列番号８：蛋白質 ＰＧＥ ＰＦＯ変異体ＫＬ１１、６．９６から７．７４へのｐｌシフト
配列番号９：ＤＮＡ ＰＧＥ ＰＦＯ変異体ＫＬ１２、６．９６から６．７へのｐｌシフト
配列番号１０：蛋白質ＰＧＥ ＰＦＯ変異体ＫＬ１２、６．９６から６．７へのｐｌシフト
配列番号１１：ＤＮＡ ＰＧＥ、天然のシグナル配列がα−ＭＡＴ因子シグナルプレ（プロ−）配列に融合したＰＧＥ変異体
配列番号１２：ＤＮＡ ＰＧＥ ＡＮ３、Ｋｅｘ部位（ＫＲ）とのＣＰＯ遺伝子ｔＡＧ融合物
配列番号１３：ＤＮＡ ＰＧＥ変異体ＡＮ１２、６．９６から４．６へのｐｌシフト
配列番号１４：蛋白質ＰＧＥ変異体ＡＮ１２、６．９６から４．６へのｐｌシフト
配列番号１５：ＤＮＡ ＰＧＥ変異体ＡＮ１３、６．９６から４．８８へのｐｌシフト
配列番号１６：蛋白質ＰＧＥ変異体ＡＮ１３、６．９６から４．８８へのｐｌシフト
配列番号１７：ＤＮＡキチナーゼ（ＺＤＵ）野生型
配列番号１８：蛋白質キチナーゼ（ＺＤＵ）野生型
配列番号１９：ＤＮＡキチナーゼ変異体ＺＤＵ−６
配列番号２０：蛋白質キチナーゼ変異体ＺＤＵ−６
配列番号２１：ＤＮＡキチナーゼ変異体ＺＤＵ−７
配列番号２２：蛋白質キチナーゼ変異体ＺＤＵ−７
配列番号２３：ＤＮＡ β−グルコシダーゼ野生型ＺＴＢ−ＷＴ
配列番号２４：蛋白質β−グルコシダーゼ野生型ＺＴＢ−ＷＴ
配列番号２５：ＤＮＡ β−グルコシダーゼ変異体ＺＴＢ−４
配列番号２６：蛋白質β−グルコシダーゼ変異体ＺＴＢ−４
配列番号２７：ＤＮＡエンドグルカナーゼ野生型ＺＴＣ−ＷＴ
配列番号２８：蛋白質エンドグルカナーゼ野生型ＺＴＣ−ＷＴ
配列番号２９：ＤＮＡエンドグルカナーゼ変異体ＺＴＣ−５
配列番号３０：蛋白質エンドグルカナーゼ変異体ＺＴＣ−５
【０００６】
［詳細な説明］
本発明は、真核生物宿主における１つまたは複数の蛋白質特性について最適範囲内に入るか、または最適値により近づくように、ポリペプチドのアミノ酸主鎖における一組の関連する蛋白質特性値を修飾するステップにより、真核生物宿主細胞によって対象ポリペプチドの分泌を改良する方法に関する。
【０００７】
１つの利点は、以前には分泌されないか、または商業的応用は魅力のないほど少量が分泌されるに過ぎなかったが、今では、分泌が改良されたために産業的プロセスに利用可能である、興味深い機能を有する蛋白質である。もう一つの利点は、設計されたポリペプチドがバイオマスから既に分離されているため、下流処理およびポリペプチド類の回収がより容易になることである。
【０００８】
本明細書の文脈では、蛋白質特性は、蛋白質アミノ酸配列およびＤＮＡ配列から計算により導くことができる性質である。
【０００９】
ポリペプチドの修飾は、本明細書では、ポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらすあらゆる事象と定義される。修飾は、１つまたは複数の修飾と理解される。修飾は、ポリペプチド主鎖における１つまたは複数のアミノ酸の導入（挿入）、置換または除去（削除）によって遂行することが可能である。
【００１０】
本明細書の文脈では、用語「分泌」は、細胞外培地、一般に成長培地または生産培地中での、ポリペプチドの出現を指す。分泌されるポリペプチドは、バイオマスを含まない。分泌のレベルは、活性アッセイ（活性単位）、比活性（蛋白質重量当たりの単位）、定量的ＰＡＧＥ解析、定量的質量分析法および抗体法を含む、当該技術分野で周知の方法で測定することが可能である。
【００１１】
「ポリペプチドの分泌の改良」という表現は、細胞の、細胞外培地中に分泌されるポリペプチド量の増加を指す。改良は、たとえば細胞内ポリペプチド等の、通常は分泌されないポリペプチドが、今では分泌されるようになることにより反映され得る。改良はまた、たとえばシグナル配列を含むため分泌されると予想されていたのに分泌されなかったポリペプチドが、今では分泌されるようになったということでもある。改良は、もちろん、常に同一宿主遺伝的背景および同一培養または発酵条件に関して測定される。こうした場合、改良された分泌は、たとえば、改良前には可視バンドが皆無であったポリアクリルアミドゲルに蛋白質バンドが出現することから、明白なこともある。
【００１２】
あるいは、改良は、非常に少量で分泌されるポリペプチドが、上昇した分泌レベルを示すことにより反映されることもある。
【００１３】
一実施形態では、分泌されたポリペプチドの量は、細胞外培地中のポリペプチドの活性を測定することにより決定される。改良前の状況に比べて、細胞外培地中の活性は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％または少なくとも２０％、上昇している可能性がある。好ましくは、活性は少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％または少なくとも４０％、上昇している。より好ましい実施形態では、活性は、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％または少なくとも１０００％、上昇している。活性は、細胞外培地中で、無活性から若干の活性に上昇していてもよい。
【００１４】
任意の真核細胞を、本発明の方法で使用し得る。好ましくは、真核細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、または藻類細胞である。好ましい哺乳類細胞としては、たとえばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ６細胞、およびハイブリドーマなどが挙げられる。好ましい昆虫細胞としては、たとえばＳｆ９細胞およびＳｆ２１細胞およびそれらの派生物などがある。より好ましくは、真核細胞は真菌細胞、すなわち、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）菌株等の、酵母細胞である。より好ましくは、クリベロミセス・ラクテス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセス・セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、または糸状菌細胞由来である。最も好ましくは、真核細胞は、糸状菌細胞である。
【００１５】
「糸状菌」は、亜門真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の全ての線維状型を含む（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈらにより、Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫで定義されている通り）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖類からなる菌糸壁（ｍｙｃｅｌｉａｌ ｗａｌｌ）を特徴とする。栄養生長は菌糸伸長により、また炭素異化は偏性好気性である。糸状菌菌株としては、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、パネロカエテ（Ｐａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、プリュロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、シーラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などの菌株が挙げられるが、その限りではない。
【００１６】
好ましい糸状菌細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の種属に属し、最も好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、タラロミセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）またはペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の種属に属する。本発明による宿主細胞がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞であるとき、その宿主細胞は、好ましくはＣＢＳ ５１３．８８またはその派生物である。
【００１７】
糸状菌の幾つかの菌株は、たとえば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭ））、オランダ微生物株保存センター（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ））、および農業研究サービス特許カルチャーコレクション、北部領域研究センター（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ））アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ ５１３．８８、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣ ２０４２３、ＩＦＯ ４１７７、ＡＴＣＣ １０１１、ＡＴＣＣ ９５７６、ＡＴＣＣ １４４８８−１４４９１、ＡＴＣＣ １１６０１、ＡＴＣＣ １２８９２、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＣＢＳ ４５５．９５、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ ３８０６５、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｐ２、タラロミセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）ＣＢＳ １２４．９０２、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ３６２２５またはＡＴＣＣ ４８２７２、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ ２６９２１またはＡＴＣＣ ５６７６５またはＡＴＣＣ ２６９２１、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）ＡＴＣＣ１１９０６、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ４４００６およびそれらの派生物等、多数のカルチャー・コレクションで公的に、容易に入手できる。
【００１８】
本発明の一実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）またはクリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）が使用される。
【００１９】
一実施形態において、真核細胞は、組換え技術でポリペプチドが産生される宿主細胞である。宿主細胞を形質転換または形質移入する好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）および他の実験マニュアルを参照されたい。したがって、本発明はまた、ポリペプチドの分泌を改良するための本発明による方法を対象ポリペプチドに適用し、組換え技術により、本発明に従って修飾されたポリペプチドを産生するステップによって対象ポリペプチドを産生する方法にも関する。本発明はまた、前記組換技術により産生されるポリペプチドにも関する。本発明はまた、ポリペプチドの分泌を改良するための本発明による方法で得られるポリペプチドにも関し；好ましくは前記ポリペプチドは、ポリペプチドの分泌を改良するための本発明による方法で得られる。
【００２０】
本発明の方法に従って分泌が改良される対象ポリペプチドは、対象生物活性を有する任意のポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、コラーゲンまたはゼラチン、あるいはそれらの変異体または混成物であってもよい。ポリペプチドは、抗体またはその一部、抗原、凝固因子、酵素、ホルモンまたはホルモン変異体、受容体またはその一部、調節蛋白質、構造蛋白質、レポーター、あるいは血清アルブミン、たとえばウシ血清アルブミンおよびヒト血清アルブミン等、またはトランスフェリン、たとえばラクトフェリン等の、輸送蛋白質、分泌過程に関与する蛋白質、折り畳み過程に関与する蛋白質、シャペロン、ペプチドアミノ酸輸送体、グリコシル化因子、転写因子、合成ペプチドまたはオリゴペプチド、その天然型が細胞内蛋白質であり、かつシグナルペプチドへの融合およびその天然型で既に分泌されているポリペプチドへの融合等の、当該技術分野で周知の方法により分泌される蛋白質であってもよい。このような細胞内蛋白質は、プロテアーゼ、セラミダーゼ類、エポキシド加水分解酵素、アミノペプチダーゼ、アシラーゼ類、アルドラーゼ、ヒドロキシラーゼ、アミノペプチダーゼ、リパーゼ等の酵素であってもよい。ポリペプチドは、その天然型で細胞外に分泌される酵素であってもよい。このような酵素は、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼの群に属してもよい。酵素は、カルボヒドラーゼ、たとえばエンドグルカナーゼ類、β−グルカナーゼ類、セロビオヒドロラーゼ類またはβ−グルコシダーゼ類等のセルラーゼ類、ヘミセルラーゼ類、あるいはペクチン分解酵素、たとえばキシラナーゼ類、キシロシダーゼ類、マンナナーゼ類、ガラクタナーゼ類、ガラクトシダーゼ類、ペクチンメチルエステラーゼ類、ペクチンリアーゼ類、ペクチン酸リアーゼ類、エンドポリガラクツロナーゼ類、エキソポリガラクツロナーゼ類、ラムノガラクツロナーゼ類、アラバナーゼ類、アラビノフラノシダーゼ類、アラビノキシラン加水分解酵素、ガラクツロナーゼ類、リアーゼ類、またはアミロース分解酵素等；加水分解酵素、イソメラーゼ、またはリガーゼ、フィターゼ等のホスファターゼ類、リパーゼ等のエステラーゼ類、蛋白分解酵素、オキシダーゼ類、トランスフェラーゼ類、またはイソメラーゼ類等の酸化還元酵素であってもよい。酵素は、フィターゼであってもよい。酵素は、アミノペプチダーゼ、アスパラギナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンド−プロテアーゼ、メタロ−プロテアーゼ、セリン−プロテアーゼカタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロパーオキシダーゼ、蛋白質デアミナーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ミュータナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはグルコースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼであってもよい。分泌が改良されるポリペプチドは、宿主細胞と相同であっても異種であってもよい。相同ポリペプチドの好適な例は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）にクローニングされて産生される、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）蛋白質である。異種発現の好適な例としては、糸状菌または酵母にクローニングされて産生される、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来の細菌ポリペプチド、または、糸状菌または酵母にクローニングされて産生される、たとえばウシまたはヤギ由来の哺乳類蛋白質、または酵母にクローニングされて産生される糸状菌ポリペプチド、あるいは、別の真菌にクローニングされて産生される、糸状菌蛋白質などがある。好ましくは、ポリペプチド類をコード化する核酸は、たとえばコドン対最適化により、関連宿主細胞における発現用に最適化される。コドン対最適化は、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列の改良された発現および／またはコード化されたポリペプチドの改良された産生を得るために、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を、それらのコドン使用、特に使用されるコドン対に関して、修飾しておく方法である。コドン対は、コード配列における、一組の、２つの後続するトリプレット（コドン）と定義される。コドン対最適化は、好ましくは国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに記載の通りに実施される。
【００２１】
好ましくは、修飾されたポリペプチドの特異性は、分泌の改良前と実質的に同じである。これは、たとえば基質特異性または結合特異性が実質的に保持されることを意味する。本明細書の文脈では、用語「実質的に保持される」は、特異性の６０％超、６５％超、７０％超または７５％超が保持されることを意味する。好ましくは、特異性の８０％超、８５％または９０％が保持される。最も好ましくは、特異性の９５％超、９６％、９７％、９８％または９９％が保持される。
【００２２】
本発明の方法によれば、改良された分泌の指標である、細胞外培地中の活性レベルは上昇する。しかし、修飾されたポリペプチドの比活性は、低下しない限り、上昇しなくてもよい。したがって、比活性は、好ましくは分泌の改良前と実質的に同じか、それより高い。好ましい実施形態では、比活性は、改良前と実質的に同じである。本明細書の文脈では、「実施的に同レベルの活性」という表現は、親ポリペプチドの活性レベルと、１５％未満、好ましくは１２％未満または１０％未満、より好ましくは８％未満、６％未満または４％未満異なる活性レベルを指す。
【００２３】
本明細書の文脈では、用語「ポリペプチド」および蛋白質」は、互換的に使用される。本発明の方法により、あらゆるタイプのポリペプチドが、その分泌を改良することが可能である。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に前述したリストの１つである。
【００２４】
本発明の方法によれば、真核生物宿主における１つまたは複数の蛋白質特性について最適範囲内に入るか、または最適値にもっと近づくように、アミノ酸主鎖における一組の関連する蛋白質特性値が修飾される。
【００２５】
修飾されたポリペプチドとリファレンスポリペプチドとの間の蛋白質特性の変化量は、相対的改良（ＲＩ）および正規化相対的改良（ＲＩＮ）という２つの方法で定義することができる。
【００２６】
蛋白質特性のＲＩは、最適値からの蛋白質特性の絶対偏差（Ｄ）という観点で定義される：
ＲＩ＝（ＤＲＥＦ−ＤＰＦＯ）／ＤＲＥＦ，
ここで、Ｄ＝｜ＦＰＯＩ−Ｆ０ＰＴ｜、ＦＰＯＩは、対象蛋白質特性値であって、
リファレンスまたはＰＦＯのいずれかであり，ＦＯＰＴは最適特性値である。
ＲＩＮは、どの特性が実質的に重要であるかを理解するために、正規化偏差（ＤＮ）の観点で定義される。ＤＮは、特性値の上界（ＵＢ）および下界（ＬＢ）を考慮に入れる（表１参照）。
ＲＩＮ＝ＤＮ，ＲＥＦ−ＤＮ，ＰＦＯ，
ここで、ＦＰＯＩ＞ＦＯＰＴであれば、ＤＮ＝（ＦＰＯＩ−ＦＯＰＴ）／（ＵＢ−ＦＯＰＴ）
ＦＰＯＩ＜ＦＯＰＴであれば、ＤＮ＝（ＦＰＯＩ−ＦＯＰＴ）／（ＬＢ−ＦＯＰＴ）
【００２７】
本発明の方法によれば、修飾はポリペプチド主鎖に行われる。本明細書の文脈では、用語「主鎖」は、アミノ酸がペプチド結合を介して結合されて、共有結合した一連のアミノ酸を形成するとき、形成される正規構造を指す。本発明では、好ましくは、成熟ポリペプチドの主鎖が修飾される。本発明に関連して、「成熟ポリペプチド」は本明細書では、翻訳および何らかの翻訳後修飾、たとえばＮ−末端プロセシング、Ｃ−末端切断、グリコシル化、リン酸化等々の後に、その最終的な機能形であるポリペプチドとして定義される。修飾前のポリペプチドは、親ポリペプチドまたはリファレンスポリペプチドまたは野生型ポリペプチドと呼ばれ、それに由来する修飾されたポリペプチドと区別される。用語「親ポリペプチド」、「野生型ポリペプチド」および「リファレンス−ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用される。ポリペプチドがキメラポリペプチドであるとき、すなわち効率的に分泌されるポリペプチドとの、好ましくは宿主細胞に由来するポリペプチドとの、翻訳融合物であるとき、キメラポリペプチド全体を本発明に従って修飾することが可能である。キメラポリペプチドが、対象ポリペプチドに融合したリーダーポリペプチドとして効率的に分泌されるポリペプチドを含むとき、対象ポリペプチドは、好ましく修飾される。
【００２８】
当業者に周知の通り、成熟中のプロセシングエラーのため、成熟ポリペプチドのＮ−末端は、成熟ポリペプチドのＣ−末端と同様、異種であり得る可能性がある。特に、このようなプロセシングエラーは、ポリペプチドの過剰発現で起こり得る。加えて、エキソプロテアーゼ活性は、異質性を生じさせるかもしれない。異質性が起こる程度は、使用される宿主および発酵プリトコールによっても異なる。このようなＮ−末端およびＣ−末端プロセシング人工産物は、予想される成熟ポリペプチドと比較して、短いポリペプチド類または長いポリペプチド類をもたらすかもしれない。
【００２９】
本発明の一実施形態では、本方法は、
（ｉ）真核生物宿主における、１つまたは複数の蛋白質特性の最適範囲および最適値を決定するステップ、および
（ｉｉ）真核生物宿主における、一組の関連した蛋白質特性を決定するステップ（これらの関連した特性の１つまたは複数が、ポリペプチドのアミノ酸主鎖において修飾されるのであれば、その特性は、真核生物宿主によるポリペプチドの分泌を改良するであろう）、および
（ｉｉｉ）（ｉ）で決定されたように、最適範囲内に入るかまたは最適値により近づくように、関連した蛋白質特性値を修飾するステップ（ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は任意の順序で実施し得る）、
を含む。
【００３０】
任意の方法を使用して、一組の関連した特性を決定し得る。一実施形態では、ポリペプチドの分泌を改良するための、関連した一組の特性は下記の通りに決定される：
（ｉ）特定の真核生物宿主における適量の蛋白質の分泌レベルならびにこれらの蛋白質のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を含む、データセットＳの収集または作成。データセットＳは、分泌蛋白質（Ｓ＋）を含んでもよい。好ましくは、データセットＳはまた、非分泌蛋白質（Ｓ−）も含む。たとえば、全ての予測される分泌蛋白質をアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）で、発現させることができる（Ｔｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４６：Ｓ１５３−１６０）。分泌される蛋白質は、セットＳ＋に属するが、分泌されない蛋白質は、セットＳ−に属する。任意の方法を使用して、分泌レベルを測定し得る。あるいは、セットＳ−は、真核生物宿主における文献で周知の非分泌蛋白質を含んでもよい。Ｓにおける蛋白質は、真核生物宿主と相同であっても異種であってもよい。
（ｉｉ）データセットＳにおける全ての蛋白質についての、蛋白質特性（Ｆ）の計算。Ｆは、これらの蛋白質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の両者から誘導することが可能である；
（ｉｉｉ）適切に規定された分類子性能基準に従って、Ｓ＋とＳ−とを区別するために、統計分類子の最高の成果を与える、ｉｉ）で計算した蛋白質特性のサブセット（Ｆｓ）を選択するための統計的分類方法の使用。Ｆｓは、ＤＮＡ配列（Ｆｓ＿ＤＮＡ）およびアミノ酸配列（Ｆｓ＿ＡＡ）の両者から誘導され得る；
【００３１】
Ｆｓ＿ＡＡにおける蛋白質特性は、対応する真核生物宿主における蛋白質分泌を改良するための修飾についての関連する特徴である。
【００３２】
好ましくは、成熟ポリペプチドの主鎖は、本発明の方法に従って修飾されるため、蛋白質特性は、一組の成熟蛋白質から計算されることが好ましい。
【００３３】
当該技術分野で周知の、標準的統計的分類方法、たとえば、線形判別分類器（Ｌｉｎｅａｒ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ（ＬＤＣ））、二次判別分類器（Ｑｕａｄｒａｔｉｃ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ（ＱＤＣ））、最近傍平均分類器（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｍｅａｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ（ＮＭＣ））、１−／ｋ−最近傍分類器（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒｓ）、サポートベクターマシーンおよび決定木等々を使用することができる（Ｗｅｂｂ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，２ｎｄ ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ｓｏｎｓ）。このような方法を適用するとき、データセットＳは、学習データセットと確認データセットに分けることができ、また当該技術分野で周知の確認方式（たとえば、１０分割交差確認）を使用することが可能である。
【００３４】
当該技術分野で周知の任意の分類器性能測定、たとえば、特異性、感度、確度、精度および受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積を使用し得る。
【００３５】
任意の好適な方法を使用して、蛋白質特性の最適範囲または最適値を決定し得る。
【００３６】
一実施形態では、真核生物宿主の蛋白質特性の最適範囲または最適値は、以下の通りに決定される：
ｉ）特定の真核生物宿主における適量の蛋白質の分泌レベルならびにこれらの蛋白質のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を含む、データセットＳの収集または作成。データセットＳは、分泌蛋白質（Ｓ＋）を含んでもよい。好ましくは、データセットＳはまた、非分泌蛋白質（Ｓ−）も含む。たとえば、全ての予測される分泌白質をアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）で、発現させることができる（Ｔｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４６：Ｓ１５３−１６０）。分泌される蛋白質は、セットＳ＋に属するが、分泌されない蛋白質は、セットＳ−に属する。任意の方法を使用して、分泌レベルを測定し得る。あるいは、セットＳ−は、真核生物宿主における文献で周知の非分泌蛋白質を含んでもよい。Ｓにおける蛋白質は、真核生物宿主と相同であっても異種であってもよい。
ｉｉ）データセットＳにおける全ての蛋白質についての、蛋白質特性（Ｆ）の計算。Ｆは、これらの蛋白質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列から誘導され得る；
ｉｉｉ）対応する真核生物宿主の各特性についての最適値（Ｆ＿ｏｐｔ）の決定：最適値は、Ｓ＋から算出される各蛋白質特性の中心値を算出することによって得てもよい。任意の中心値、たとえば、幾何平均、調和平均、算術平均、トリム平均、最頻値および中央値を使用し得る。算出される中心値は、対応する真核生物宿主に関する特性の最適値である。あるいは、特性値の分布が、選択される確率分布によって十分に説明されるように、Ｓ＋から算出される各蛋白質特性に確率分布を合わせる。任意の確率分布を使用し得、たとえば正規分布、指数分布、または対数正規分布を使用し得る。確率分布の平均が、対応する真核生物宿主の特性の最適値である。
ｉｖ）対応する真核生物宿主について各特性の最適範囲の決定：分泌される蛋白質のみを含むＳ＋セットを考慮すると、蛋白質特性の最適範囲の下界は、Ｓ＋から算出される蛋白質特性の、０．３−、０．２−、０．１５または好ましくは０．１０−および０．０５−変位値に相当する値と定義される。ここで、値０．３、０．２、０．１５、等々は、累積確率を指す。特定の累積確率に相当する変位値は、任意の統計的方法で、たとえば、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｔｏｏｌｂｏｘ，Ｍａｔｌａｂ Ｒ２００７ａ（Ｔｈｅ Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ）の分位関数を使用して、算出し得る。蛋白質特性の最適範囲の上界は、Ｓ＋から算出される蛋白質特性の、０．７−、０．８−、０．８５または好ましくは０．９０−および０．９５−変位値に相当する値と定義される。あるいは、分泌蛋白質および非分泌蛋白質の両方を含む全データセットＳを考慮すると、蛋白質特性の最適範囲の下界は、それより下の値ではＳにおける蛋白質の７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％または９５％が分泌されない低い蛋白質特性の値として定義してもよい；蛋白質特性の最適範囲の上界は、それより上の値ではＳにおける蛋白質の７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％または９５％が分泌されない蛋白質特性値として定義される。
【００３７】
関連特性および最適範囲および最適値のセットは、宿主細胞ごとに異なるであろう。アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の場合、蛋白質分泌を増加するために修飾されるべき関連蛋白質特性（Ｆｓ＿ＡＡ）としては、塩基性アミノ酸頻度、極性アミノ酸頻度、非極性アミノ酸頻度、微小アミノ酸頻度、小アミノ酸頻度、帯電アミノ酸頻度、正味荷電（ｐＨ７．２における）、等電点、アスパラギン、アルギニン、イソロイシン、システイン、ヒスチジン、グルタミン、バリン、リシン、グリシン、トレオニンおよびロイシンの頻度、ターン（Ｇａｒｎｉｅｒにより算出）、ＥＰＥＳＴＦＩＮＤにより算出されるＰＥＳＴモチーフ、ｐｌの局所特性（ＬＦ）値、特にＬＦ１およびＬＦ６、ＧｒａｖｙスコアのＬＦ値、特にＬＦ２およびＬＦ４、アロマスコアのＬＦ値、特にＬＦ３、ＬＦ４およびＬＦ６、原子組成ｗ．ｒ．ｔ．イオウ（Ｓ）および局在化特性（たとえば、ＭｕｌｔｉＬｏｃ 局在化予測ツールで予測される）などが挙げられるが、その限りではない。
【００３８】
正味荷電は、陽子の電荷と同じ単位を有する。長さ当たりの正味電荷／正味正電荷／正味負電荷／全電荷は、陽子の電荷と同じ単位を有するが、ポリペプチドの長さに正規化される。
【００３９】
ポリペプチドの正味荷電は、本明細書では、全てのアミノ酸が溶媒に完全に露出しており、隣接したペプチド類は、所与のアミノ酸のｐＫに影響を及ぼさず、また構成アミノ酸は、Ｎ末端およびＣ末端と同様、未修飾であると仮定して、推定される。様々なプログラムを使用して、たとえば、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｔｏｏｌｂｏｘ ｏｆ Ｍａｔｌａｂ（バージョンＲ２００８ｂ）の「等電」機能を使用して、またはｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／で入手可能な、ＥＭＢＯＳＳ Ｅｘｐｌｏｒｅｒの「蛋白質統計学（ｐｅｐｓｔａｔｓ）」機能を使用して、特定のｐＨにおけるポリペプチドの正味電荷を算出することができる（初期値ｐＨ＝７．２による）。
【００４０】
長さ当たりの正味荷電は、本明細書では、ポリペプチドの長さで割ったポリペプチドの正味荷電と定義される。
【００４１】
長さ当たりの正味正電荷は、本明細書では、ｐＨ７．２における、ポリペプチドのＮ−末端ならびに全てのリシン残基、アルギニン残基およびヒスチジン残基の部分電荷を合計することによって算出される、ポリペプチドの正味正電荷と定義される。長さ当たりの正味正電荷は、ポリペプチドの正味正電荷をポリペプチドの長さで割ることにより決定される。
【００４２】
長さ当たりの正味負電荷は、本明細書では、ｐＨ７．２における、ポリペプチドのＣ−末端ならびに全てのアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、システイン残基およびチロシン残基の部分電荷を合計することによって算出される、ポリペプチドの正味負電荷と定義される。長さ当たりの正味負電荷は、ポリペプチドの正味負電荷をポリペプチドの長さで割ることにより決定される。
【００４３】
長さ当たりの全電荷は、本明細書では、ポリペプチドの正味陽性電荷（正の数）をポリペプチドの正味負電荷（負の数）だけ減算することにより算出される、ポリペプチドの全電荷と定義される。長さ当たりの全電荷は、ポリペプチドの全電荷をポリペプチドの長さで割ることにより決定される。
【００４４】
グレイビー・スコア（ｇｒａｖｙ ｓｃｏｒｅ）は、本明細書では、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）により定義された通り、ポリペプチドの疎水性親水性指数と定義される。各アミノ酸は、４．６と−４．６の間の疎水性スコアを有する。４．６は、最も疎水性の蛋白質に割り当てられ、また−４．６は最も親水性の蛋白質に割り当てられる。ポリペプチドのＧＲＡＶＹスコアは、好ましくは、Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）．Ｋｙｔｅ，Ｊ．ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．１９８２蛋白質の疎水性親水性特徴を表示する簡単な方法（Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ．）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２．に従って決定される。
【００４５】
ポリペプチドのアロマスコアは、本明細書では、ポリペプチド中の３つの芳香族アミノ酸、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの頻度を合計することにより算出される。
【００４６】
脂肪族指数は、本明細書では、脂肪族側鎖によって占められる相対体積と定義される。ポリペプチドの脂肪族指数（ＡＩ）は、Ｉｋａｉの式（１９８０）：ＡＩ＝ｆ＿Ａｌａ＋ａｆ＿Ｖａｌ＋ｂ（ｆ＿Ｉｌｅ＋ｆ＿Ｌｅｕ）に従って算出される。アミノ酸類アラニン、バリン、イソロイシンおよびロイシンは、脂肪族側鎖を有する。
ここで、ａはバリン側鎖の相対体積であり（ａ＝２．９）、ｂはロイシンおよびイソロイシン側鎖の相対体積である（ｂ＝３．９）。ｆ＿Ａｌａ、ｆ＿Ｖａｌ、ｆ＿Ｉｌｅおよびｆ＿Ｌｅｕは、それぞれ、ポリペプチド中の、アラニン、バリン、イソロイシンおよびロイシンの頻度である。Ｉｋａｉ，Ａ．Ｊ．１９８０球状蛋白質の熱安定性および脂肪族指数（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｌｉｐｈａｔｉｃ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８８：１８９５−１８９８。）
【００４７】
ＧＲＡＶＹおよび脂肪族について、ＥｘＰＡＳｙサーバー上の蛋白質同定および分析ツール（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓ ｏｎ ｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ Ｓｅｒｖｅｒ；Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ Ｅ．，Ｈｏｏｇｌａｎｄ Ｃ．，Ｇａｔｔｉｋｅｒ Ａ．，Ｄｕｖａｕｄ Ｓ．，Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｍ．Ｒ．，Ａｐｐｅｌ Ｒ．Ｄ．，Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ．；（Ｉｎ）Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ（ｅｄ）：Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）．ｐｐ．５７１−６０７．も参照することができるであろう。
【００４８】
理化学的特性に基づくアミノ酸の種類：
酸性：Ｄ，Ｅ
脂肪族：Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｖ
芳香族：Ｆ，Ｗ，Ｙ
塩基性：Ｈ，Ｋ，Ｒ
帯電：Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｋ，Ｒ
非極性：Ａ，Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｖ，Ｗ，Ｙ
極性：Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｋ，Ｎ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ
小：Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｇ，Ｎ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｖ
微小：Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｓ，Ｇ
【００４９】
配列中の単一要素の組成に基づく特性は、要素ｉの頻度ｆｉから算出される。頻度と割合は、本明細書では、互換的に使用される。頻度は、配列中の要素総数で割った、要素ｉが配列中に出現する回数と定義される。配列中の単一要素、たとえばアミノ酸を、多重要素たとえば、微小、酸性に結合することができる。
【００５０】
ポリペプチド内のアミノ酸残基の表面接触性は、当該技術分野で周知の任意の方法で決定し得る。
【００５１】
ポリペプチドが実験的に解明される構造を有する場合、溶媒接触表面積（ＡＳＡ）は、Å２で与えられ、またその面積は、蛋白質表面上を、水分子大の球を回転させることによって算出することができる［１］。次いで、ＡＳＡを相対表面積（ＲＳＡ）に変換するが、これは、グリシン［２］またはアラニン［３］と並んだトリペプチドの中央の残基の最大可能露出と比較した、ポリペプチド鎖中の所与のアミノ酸残基のＡＳＡとして算出される。閾値アルファより大きいＲＳＡ（ＲＳＡ＞＝アルファ、０＜＝アルファ＜＝１）を有する残基は、露出していると言われ、閾値ベータ未満のＲＳＡ（ＲＳＡ＜＝アルファ、０＜＝ベータ＜＝１）を有する残基は、埋没していると言われる。好ましくは、アルファ＞＝０．２５、より好ましくはアルファ＝０．２５である。好ましくはベータ＜＝０．２５、より好ましくはベータ＝０．２５である。
【００５２】
ポリペプチドの構造を入手できなければ、表面接触性は、ポリペプチドのアミノ酸配列からも予測することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列から表面接触性を予測するために、様々な方法を文献で入手することができ、たとえば［３］、［４］、［５］および［６］に記載されている。好ましくは、ＲＳＡは、［４］に記載されているいわゆるＮｅｔＳｕｒｆＰ法を使用して予測され、これはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＳｕｒｆＰ／でオンラインアクセスすることができる。このアプリケーションで、表面接触性は、成熟蛋白質のアミノ酸配列から予測される。露出した残基および埋没した残基の定義は、前述と同じである。
［１］Ｃｏｎｎｏｌｌｙ Ｍ：分析的分子表面計算（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ．）。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ １９８３，１６（５）：５４８−５５８．
［２］Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ：蛋白質における接触可能表面および埋没表面の性質（Ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ａｎｄ ｂｕｒｉｅｄ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）。Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９７６，１０５（１）：１−１２．
［３］Ａｈｍａｄ Ｓ，Ｇｒｏｍｉｈａ ＭＭ，Ｓａｒａｉ Ａ：アミノ酸配列からの溶媒接触可能性の実数値予測（Ｒｅａｌ ｖａｌｕｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．）。Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２００３，５０（４）：６２９−６３５．
［４］Ｂｅｎｔ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ：溶媒接触性予測に適用される信頼性スコアの包括的割り当て方法（Ａ ｇｅｎｅｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ．）。ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００９，９：５１．
［５］Ｄｏｒ Ｏ，Ｚｈｏｕ Ｙ：Ｒｅａｌ−ＳＰＩＮＥ：蛋白質構造特性の実数値予測のための神経回路網の集積システム（ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｆｏｒ ｒｅａｌ−ｖａｌｕｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．）。Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２００７，６８（１）：７６−８１．
［６］Ｆａｒａｇｇｉ Ｅ，Ｘｕｅ Ｂ，Ｚｈｏｕ Ｙ：二層神経回路網を介した指導学習による蛋白質の残基溶媒接触可能性および実数値主鎖ねじれ角の予測確度を改良すること（Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅ ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅａｌ−ｖａｌｕｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｔｏｒｓｉｏｎ ａｎｇｌｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｇｕｉｄｅｄ−ｌｅａｒｎｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｔｗｏ−ｌａｙｅｒ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ．）。Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２００９，７４（４）：８４７−８５６．
【００５３】
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の最適値および最適範囲を表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
【表２】
【００５６】
表１において、全蛋白質配列から計算される全ての特性は、全蛋白質の長さに基づく。成熟蛋白質配列、露出残基および埋没残基から計算される全ての特性は、成熟蛋白質の長さに基づく。
【００５７】
好ましくは、最適値および範囲特性は、表２から選択される；これらの特性は、一次特性と言われ、その他の特性、すなわち、表２にない表１の特性は、二次特性である。
【００５８】
【表３】
【００５９】
クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）について、好ましい一次特性を表３に示す。
【００６０】
【表４】
【００６１】
別の実施形態では、ポリペプチドの分泌は、下記のステップで改良される：
ｉ）ポリペプチドの蛋白質特性を計算するステップ、
ｉｉ）ポリペプチドの１つまたは複数の蛋白質特性が、最適範囲外であるか、または真核生物宿主の最適値から実質的に逸脱しているかどうかを決定するステップ（ここで、実質的逸脱は、最適値から２０％、３０％、４０％または５０％超の差と定義される）、
ｉｉｉ）ポリペプチドの１つまたは複数のＦｓ＿ＡＡの値が、最適範囲内に入るか、または適量だけ、最適値に向けて移行するように、好ましくはポリペプチドの蛋白質特性と、蛋白質特性の最適値との差が、１０％、１５％、２０％、または３０％超、減少するように、ポリペプチドのアミノ酸配列を合理的に変えるステップ。
【００６２】
好ましくは、２つ、３つ、４つまたは５つの蛋白質特性が一緒に修飾され、さらに好ましくは、１０超、１５または２０の蛋白質特性が一緒に組み合わせて修飾される。最も好ましくは、２５超または３０の蛋白質特性が一緒に修飾される。
【００６３】
好ましくは、最適範囲は、表１から選ばれ、さらに好ましくは最適範囲は、表２から選ばれる。あるいは、最適範囲は表３から選ばれる。
【００６４】
上記ステップｉｉｉ）で、ポリペプチドのアミノ酸配列は、当該技術分野で周知の任意の方法で合理的に変えし得る。たとえば、これは、：
（ｉ）相同配列を検索するステップ；
（ｉｉ）相同配列を、対象配列と配列比較するステップ；
（ｉｉｉ）蛋白質機能的特性に重要なアミノ酸類を同定するステップ；
（ｉｖ）機能的特性を保持しながら、所望のアミノ酸配列特性を導入する；
（ｖｉ）所与の宿主に最適なコドンを使用して、最終的な修飾された配列を遺伝子に翻訳するステップ；
（ｖｉｉ）宿主における、再設計されたポリペプチドのクローニングおよび発現
によって達成するステップが可能である。
【００６５】
好ましくは、アミノ酸主鎖のアミノ酸類の少なくとも５％が修飾され、より好ましくは、アミノ酸主鎖のアミノ酸類の少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２０％が修飾される。
【００６６】
好ましくは、アミノ酸主鎖の少なくとも５つのアミノ酸類が修飾され、より好ましくはアミノ酸主鎖の少なくとも１０のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも１５のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも２０のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも２５のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも３０のアミノ酸類が修飾される。
【００６７】
好ましくは、本発明によれば、一次特性は改良されるが、二次特性は特定の境界内に保たれる。したがって、総体的な最適性スコアＦは、全ｎ個の一次特性および全ｍ個の二次特性のＤＮ値に基づいて規定される：
【数１】
【００６８】
ηは、０と１の間で０および１を含む（０≦η≦１）の重み係数である。好ましくはη＜０．５、より好ましくはη≦０．４、最も好ましくはη＝０．３である。ρは、１と５の間で１および５を含み（１≦ｐ≦５）、好ましくはρ＝２である（Ｆは、このとき、ユークリッド距離を表す）。好ましくは、η＝０．３およびρ＝２である。好ましくは、野生型リファレンス蛋白質に関して、少なくとも５％のＦ−スコアの改良が達成され、より好ましくは少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２０％およびさらにより好ましくは少なくとも３０％の改良が達成される。
【００６９】
好ましくは、少なくとも２、３、４、または５つの特性が修飾され、より好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは少なくとも１５、さらにより好ましくは少なくとも２０、さらにより好ましくは少なくとも２５、およびさらにより好ましくは少なくとも３０の特性が修飾される。好ましくは、少なくとも２、３、４、または５つの特性が改良され、より好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは少なくとも１５、さらにより好ましくは少なくとも２０、さらにより好ましくは少なくとも２５、およびさらにより好ましくは少なくとも３０の特性が改良されるが、好ましくは、１０未満、さらにより好ましくは５未満、さらにより好ましくは４未満、の特性が悪化する。好ましくは、その特性は一次特性である。
【００７０】
相同配列は、好ましくは、適切な配列データベースのＢＬＡＳＴ検索を実施することにより、検索される。相同配列は、対象配列と好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５、％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。最も好ましくは、相同配列は、対象配列と好ましくは約５０％の同一性を有する。当業者は、幾つかの異なるコンピュータープログラムを利用して、２つの配列を並べて２つの配列間の相同性を決定できることを知るであろう（Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（ｅｄ．）中のＫｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）配列比較の概説（Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）、タイムワープ、文字列編集および巨大分子：配列比較の理論と実際（Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ），ｐｐ．１−４４ＡｄｄｉｓｏｎＷｅｓｌｅｙ）。当該技術分野で周知の任意の方法を配列比較に使用し得る。２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、たとえば２配列のアラインメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して、決定することが可能である（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）。
【００７１】
対象必須機能特性に重要なアミノ酸類を同定する方法は、当該技術分野で周知である。好適なツールは、対象蛋白質の３Ｄ構造または３Ｄモデルの使用、対象蛋白質または相同蛋白質の突然変異誘発試験、機能的に中性の置換と機能的置換を確立するためのサイト飽和ライブラリーの使用を含む。
【００７２】
アミノ酸配列特性を導入するとき、置換は好ましくは、所与の位置に、所要のアミノ酸配列特徴とより多く一致するアミノ酸が相同配列に見られるアミノ酸群から選択される方法で選択される。最新のモデリング技法を使用して、天然の相同体には見られない許容可能な置換を同定することが可能である。所与の折り畳みを採用する新しい配列の生成を許容するモデリング技法に好ましいリファレンスは以下の通りである：
Ｋｕｈｌｍａｎ Ｂ，Ｄａｎｔａｓ Ｇ，Ｉｒｅｔｏｎ ＧＣ，Ｖａｒａｎｉ Ｇ，Ｓｔｏｄｄａｒｄ ＢＬ，Ｂａｋｅｒ Ｄ（２００３）。原子レベルの確度を有する新規な球状蛋白質折り畳みの設計（Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄ ｗｉｔｈ ａｔｏｍｉｃ−ｌｅｖｅｌ ａｃｃｕｒａｃｙ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２，１３６４−８。
Ｂａｋｅｒ Ｄ（２００６）。巨大分子構造および相互作用の予測および設計（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．）。Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．，Ｂ，Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３６１，４５９−６３デノボ蛋白質設計：完全自動化配列選択に向けて（Ｄｅ Ｎｏｖｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｏｗａｒｄｓ ｆｕｌｌｙ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ’） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３巻４号，１９９７年１１月７日，７８９−７９６ページ Ｂａｓｓｉｌ Ｉ．Ｄａｈｉｙａｔ，Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ａ．Ｓａｒｉｓｋｙ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｌ．Ｍａｙｏ
【００７３】
最新の計算方法は、所与の蛋白質折り畳みを採用することが可能な多数の潜在的配列の生成を許容する。最適な配列を取り出すために使用されるスコアリング機能に特性最適化を導入することによって、所与の産生宿主に最適な配列が、計算による方法で選択され得る。
【００７４】
本発明の方法に従って修飾することが可能な蛋白質特性としては、組成特性、生理特性および構造特性などがある。このような特性の好適な例は、アミノ酸の数、分子量、等電点、特定のｐＨにおける正味荷電、ＧＲＡＶＹスコア、脂肪族指数、不安定指数、組成的特性、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ原子に関する原子組成、アミノ酸頻度、ジペプチド頻度、トリペプチド頻度、酸性アミノ酸頻度、脂肪族アミノ酸頻度、芳香族アミノ酸頻度、塩基性アミノ酸頻度、グリコシル化パターンおよび帯電アミノ酸頻度ならびに表１に記載の特性である。修飾される特性の組合せも、本発明に包含される。好ましくは２、３、４または５つの蛋白質特性が、一緒に修飾される。より好ましくは、１０超、１５または２０の蛋白質特性が一緒に修飾される。最も好ましくは、２５超または３０の蛋白質特性が一緒に修飾される。
【００７５】
本発明の一実施形態では、１つまたは複数のグリコシル化部位が導入され、他の蛋白質特性も修飾される。本発明の別の実施形態では、帯電アミノ酸頻度が修飾され、他の蛋白質特性も修飾される。本発明の別の実施形態では、極性アミノ酸頻度が修飾され、他の蛋白質特性も修飾される。
【００７６】
アミノ酸全体またはＤＮＡ配列から計算される蛋白質特性は、蛋白質全体の平均値であり、これから、局所的蛋白質特性が明らかにならない可能性がある。たとえば、ある蛋白質は平均すると親水性であるが、それでも大きな内部疎水性領域を含むこともあり得る。局所的蛋白質特性は、たとえば、Ｂｅｎｉｔａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｅｎｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，５：１５６７−１５８０）により略述されている方法を用いて、アミノ酸またはＤＮＡ配列から計算することができる。
【００７７】
ある蛋白質特性の局所特性を計算するために、適当な数のアミノ酸またはヌクレオチドのスライディングウィンドウで、蛋白質特性を局所的に計算することが可能である。次いで、図９に図示する通り、得られた値を、蛋白質のアミノ酸またはＤＮＡ配列の長さに沿った曲線としてプロットする。
【００７８】
【表５】
【００７９】
たとえば、ＬＦ１は図１における暗灰色の面積に相当し、ＬＦ２は図１における明灰色の面積に相当する。その面積は、台形法を使用して算出することができる（Ｂｅｎｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，５：１５６７−１５８０）。局所的特性を計算するために、好適な上限および下限、ならびにスライディングウィンドウの大きさを選択することができる。スライディングウィンドウは、任意のサイズのものであってもよい。たとえば、２１アミノ酸または塩基対のスライディングウィンドウサイズを使用することができる。上限および下限の値は、曲線における極値ピークを反映するように選択することができる。たとえば、より高い上限は、低いものより多い極値ピークを考慮に入れる。好ましくは、上限および下限は、データセットＳ＋およびＳ−のＦｉｓｃｈｅｒ基準を最大化するように選択される。Ｆｉｓｃｈｅｒ基準（ＪＦ）は以下の通りに定義される：
【数２】
ここでμｓ−およびμｓ＋は、それぞれＳ−およびＳ＋のセットから計算される局所的特性値の平均値を表し、σ２ｓ−およびσ２ｓ＋は、それぞれＳ−およびＳ＋のセットから計算される局所的特性値の分散を表す。
【００８０】
上で定義した局所的特徴は、任意の蛋白質特性、たとえばＧｒａｖｙスコア、アロマスコアおよび等電点について算出し得る。
【００８１】
首尾よく分泌された蛋白質の配列から誘導できる特性に加えて、特に、標的蛋白質の溶媒接触表面の親水性が上昇すると、細胞から分泌された可溶性蛋白質の増量に大きく成功することが確認された。より詳細には、発現が増加するのみならず、有意に多い蛋白質が、バイオマスまたは他の不溶性物質に付着していない可溶形で、ブロス中に蓄積した。改良された表面親水性を有する蛋白質が与えられれば、いずれも有意により高い分泌で回収することが可能であろう。バイオマスを（濾過または遠心分離によって）除去すると、産生された蛋白質の大部分は濾液中または上澄中にそのまま残る。
【００８２】
親水性の上昇は、
・非極性アミノ酸類を、より極性のアミノ酸類に代えること
・より低極性のアミノ酸類を、より極性のアミノ酸類に代えること
・極性アミノ酸類を帯電アミノ酸類に代えること
によって行うことができる。
【００８３】
より極性のアミノ酸類または帯電アミノ酸類の数を増加させることにより親水性を上昇させることは、アミノ酸組成を変えることになり、したがって分泌を増加するために適合させることができる組成特性として考えることができる。
【００８４】
非極性アミノ酸類は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｃ、Ｍ、Ｆ群から選択される。アミノ酸類Ｇ、Ｐ、Ｙ、Ｗは、極性状況下では非極性として考えることができ、また非極性状況下では極性として考えることができる。より極性の残基は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｒ、Ｋ群から選択される。帯電した残基は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｒ、Ｋ群から選択される。酸性または負に帯電した残基は、Ｅ、Ｄから選択される。塩基性または正に帯電した残基は、Ｈ、Ｋ、Ｒから選択される。極性用比較尺度を使用すると：［Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｃ］＜［Ｇ、Ｐ、Ｙ、Ｗ］＜［Ｓ、Ｔ］＜［Ｎ、Ｑ、Ｈ］＜［Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ］。
【００８５】
極めて疎水性の表面領域は、産生宿主における高い産生ストレス、宿主における蛋白質の蓄積、および分泌妨害または無分泌をもたらす、望ましくない凝集またはバイオマスへの望ましくない固着を招く傾向があることが分かっている。総体的親水性を上昇させる置換は、特にこれらの残基が溶媒接触残基（＝蛋白質表面残基）を含むとき、分泌改良に非常に有効であることが認められている。より詳細には、接触表面領域において、非極性残基をより極性の残基で置換するとき、極性残基の割合は、組成特性分析の上方境界で定められる極性残基の割合を上回る可能性さえあることが認められている。標的蛋白質の配列特性と宿主要件との非適合性は、標的蛋白質の親水性を上昇させることによって、より詳細には、正と負の電荷が表面全体に一様に分布して、正または負の電荷のホットスポットを防ぐように分布させた追加的電荷を導入することにより、補償することが可能である。
【００８６】
特定のアミノ酸配列が与えられれば、幾つかの予測ツールは、どのアミノ酸が表面上にありそうかを予測するために使用できるが、溶媒接触非極性パッチまたは疎水性パッチを予測することが必要なとき、これらのツールの性能は全く貧弱である。したがって、蛋白質接触表面の親水性を調節するためには、３Ｄ構造または３Ｄ構造モデルが必要である。蛋白質の３Ｄ構造は、Ｘ線結晶学によって、およびＮＭＲによって、決定することができる。加えて、比較モデリングまたは鋳型に基づくモデリングを使用して、相同蛋白質の３Ｄ構造に基づく所与の配列のための信頼できる３Ｄモデルを構築することが可能である（ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）。比較モデリングのための様々なサーバーおよびソフトウェアパッケージは：ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅでみつかる。
【００８７】
蛋白質構造予測およびモデリングに関する最近の総説については、Ｙａｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００８，１８：３４２−３４８を参照されたい。
【００８８】
３Ｄ構造または３Ｄモデルの原子座標が与えられれば、当該技術分野で周知の方法により、接触表面を算出することができる。よく知られた方法は、Ｆｒｅｄｅｒｉｃ Ｒｉｃｈａｒｄｓにより開発されたローリングボールアルゴリズムによる算出である（１９７７，「面積、体積、充填および蛋白質構造（Ａｒｅａｓ，ｖｏｌｕｍｅｓ，ｐａｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．）」、ＡｎｎｕＲｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｅｎｇ，６：１５１−１７６）。ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａも参照されたい。
【００８９】
接触表面を決定するためには、置換が多量体（たとえば二量体、三量体、四量体等々）における個々のポリペプチド（モノマー）間の相互作用を妨害するのを回避するために、最終的な成熟蛋白質の四次構造を考えるべきである。
【００９０】
表面変調は、下記を含む：
・適切な分泌および回収を妨げかねない、潜在的な粘着性のパッチを生じさせる溶媒から、非極性残基が接触される領域をスポットすること。
・機能的役割を果たす領域、たとえば活性部位全般を、そしてより具体的には基質、共基質およびコファクター用の結合ポケットを除外すること。
・非極性残基を、帯電残基も含む、より極性の残基で置換すること。
・極性残基を、より極性の残基または帯電残基で置換すること。
・高い負電荷を有する領域または高い正電荷を有する領域を回避するために、帯電残基を再分布させること。
・疎水性表面パッチを置換する代わりに、非極性領域の近くにグリコシル化を導入することにより、このような領域を遮蔽することも可能である。
【００９１】
一次構造の場合、上昇した親水性は、たとえば下表のように修飾の前後の極性残基の数を比較することによって表される。
【００９２】
【表６】
【００９３】
接触表面を考えるとき、様々な極性アミノ酸の寄与は、総接触表面に対する、ある特定のアミノ酸またはある特定のアミノ酸群により形成される接触表面の割合として表現することができる。たとえば、帯電残基の総接触表面を算出して、総接触表面積と比較することができる。全ての極性残基を考えることにより、極性接触表面を算出することができる。蛋白質表面の親水性は、非極性表面を犠牲にして極性表面の割合が増加するとき、上昇すると言われる。
【００９４】
原則として、グリコシル化を導入し、そのグリコシル化によって遮蔽される領域を推定することもできる。電荷の分布は、視覚的検査を含む任意の利用可能な方法で行い得る。
一実施形態では、改良された分泌のために修飾すべき特性は、表面電荷（再）分布、表面極性−非極性分布、配列モチーフ、たとえばグリコシル化、またはこれらの組合せである。１つの特性、たとえばアミノ酸の修飾は、多くの場合、別の特性の修飾、たとえばＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ原子に関して原子組成の修飾を、もたらすことを当業者は理解するであろう。
【００９５】
本発明による方法は、蛋白質産生レベルを高めるための最新の技法と、またはこれらの技法の１つまたは複数の組み合わせと、都合よく組み合わせられることを理解されたい。これらは、強力プロモーター類、コピー数の増加、最適Ｋｏｚａｋ配列、ｍＲＮＡ安定要素および最適化コドン使用の適用を含むが、その限りではない（国際公開２００８／０００６３２号パンフレット）。
【００９６】
［実施例］
［菌株］
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株：ＷＴ １：このアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株を、野生型菌株として使用した。この菌株は、寄託番号ＣＢＳ ５１３．８８．で、ＣＢＳ研究所（ＣＢＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に寄託される。
ＷＴ ２：このアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株は、グルコアミラーゼをコード化する遺伝子（ｇｌａＡ）の欠失を含むＷＴ １菌株である。ＷＴ ２は、欧州特許出願公開第０ ６３５ ５７４ Ｂ１号明細書に記載の「ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ」アプローチを使用して構築した。この特許では、ＣＢＳ ５１３．８８のゲノム中のｇｌａＡ特異的ＤＮＡ配列の削除方法が詳細に説明されている。この手順は、最終的に外来ＤＮＡ配列を全く持たない、ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ ΔｇｌａＡ組換えアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８菌株をもたらした。
ＷＴ ３：ＷＴ ２における主要な細胞外アスパラギン酸プロテアーゼＰｅｐＡをコード化しているｐｅｐＡ遺伝子を中断するために、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｍｂｅｒｇｈらにより記述されている通り、ＷＴ ２のゲノム中のｐｅｐＡ特異的ＤＮＡ配列を削除した（ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｍｂｅｒｇｈ ＪＰ，Ｓｏｌｌｅｗｉｊｎ Ｇｅｌｐｋｅ ＭＤ，ｖａｎ ｄｅ Ｖｏｎｄｅｒｖｏｏｒｔ ＰＪ，Ｂｕｘｔｏｎ ＦＰ，Ｖｉｓｓｅｒ Ｊ．（１９９７）−アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）における３つの酸プロテアーゼの破壊−プロテアーゼスペクトル、細胞内蛋白質分解、および標的蛋白質の分解に及ぼす影響−Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７（２）：６０５−１３）。この手順は、ＷＴ ２菌株バックグラウンドに不活性化されたｐｅｐＡ遺伝子を有する、ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ ＷＴ ３菌株をもたらした。
ＷＴ ４：ＷＴ ３中のｈｄｆＡ遺伝子を削除するために、先に、国際公開第０５／０９５６２４号パンフレットに詳細に記載されている方法を使用して、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ４（ΔｇｌａＡ，ΔｐｅｐＡ，ΔｈｄｆＡ）を作成した。
ＷＴ ５：このアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株は、シュウ酸欠損アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株をもたらす欠失を含むＷＴ ４菌株である。ＷＴ ５は、欧州特許出願公開第１１５７１００号明細書および米国特許第６，９３６，４３８号明細書に記載の方法を使用することによって構築され、その中では、オキサロ酢酸加水分解酵素をコード化するｏａｈＡ遺伝子の欠失によってシュウ酸欠損菌株が得られ、菌株ＷＴ ５は、ＷＴ ４菌株バックグラウンドに不活性化されたｏａｈＡ遺伝子を有する代表的な菌株として選択された。
ＷＴ ６：このアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株は、後続する３ステップで、アルファ−アミラーゼ類をコード化する３遺伝子（ａｍｙＢ、ａｍｙＢＩおよびａｍｙＢＩＩ）の欠失を含む、ＷＴ ５菌株である。欠失ベクターの構築およびこれらの３遺伝子のゲノム欠失は、国際公開第２００５０９５６２４号パンフレットに詳述されている。国際公開第２００５０９５６２４号パンフレットに記載のベクターｐＤＥＬ−ＡＭＹＡ、ｐＤＥＬ−ＡＭＹＢＩおよびｐＤＥＬ−ＡＭＹＢＩＩは、欧州特許出願公開第０ ６３５ ５７４ Ｂ１号明細書に記載の「ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ」アプローチに従って使用された。上述の手順は、最終的に外来ＤＮＡ配列を全く持たない、シュウ酸欠損、ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ、ΔａｍｙＡ、ΔａｍｙＢＩおよびΔａｍｙＢＩＩアミラーゼ−陰性組換えアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ ５１３．８８菌株である、ＷＴ ６をもたらした。このように、菌株ＷＴ ６は低いアミラーゼバックグラウンドを有し、ＷＴ １と比較して、より効率的な配列のターゲティングに関して高いＨＲ／ＮＨＲ比を有し、また細胞外蛋白質発現および検出用に最適化されている。
【００９７】
クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）菌株：クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）におけるＰＧＥおよびその変異体の発現を評価するために、２つの菌株を使用した。ＧＧ７９９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、および本明細書ではＷＴ ７とも呼ばれ、米国特許第６，２６５，１８６ Ｂ１号明細書により詳細に記載されている、クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＣＢＳ ６８５．９７の派生物。菌株クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＷＴ ７は、突然変異誘発（古典的菌株改良）および遺伝子操作によって、ＣＢＳ ６８５．９７から誘導した。
【００９８】
［キチナーゼ活性アッセイ］
反応混合物は、キチン−アズール（Ｓｉｇｍａ）３ｍｇ、０．１Ｍ Ｎａ−クエン酸−リン酸バッファー０．５ｍｌ、ｐＨ５．０の分析試料（培養液）０．１ｍｌを含んでいた。この反応混合物を振盪しながら３７℃で２４時間、インキュベートし、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してＯＤ５９０を測定した。
【００９９】
［ｐＮＰ−β−グルコピラノシドを基質として使用するβ−グルコシダーゼ活性］
５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ＝４．５中、３ｍＭ ｐＮＰ−β−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ Ｎ７００６）原液を調製した。アッセイ：基質原液（３ｍＭ）２５０μｌ＋希釈酵素試料２５０μＬを、４０℃でインキュベートした。ｔ＝０、１０、２０および３０分に、培養標本１００μｌと１Ｍ炭酸ナトリウム１００μｌとを混合することによって反応を停止させた。吸光度は、ＭＴＰ読み取り装置を使用して４０５ｎｍで測定した。活性は、放出されたｐＮＰ μｍｏｌ／ｍｌ／分で表す。
【０１００】
［セロビオースを基質として使用する、β−グルコシダーゼ活性］
５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ＝４．５中、最終濃度１０ｍＭのセロビオース（ＳｉｇｍａＣ７２５２）原液を調製した。アッセイ用に、基質原液（１０ｍＭ）２０００μｌ＋希釈酵素試料１００μＬを混合し、４０℃でインキュベートした。ｔ＝０、１０、２０および３０分に、培養標本１００μｌ＋５０ｍＭ水酸化ナトリウム１００μｌを混合することによって反応を停止させた。試料を限外濾過に付し、ＥＤ４０パルスアンペロメトリー検出器を具備するＤｉｏｎｅｘ ＤＸ−５００で実施されるパルスアンペロメトリー検出器を用いた高性能陰イオン交換クロマトグラフィ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を使用して分析した。活性は、放出されたグルコースμｍｏｌ／ｍｌ／分で表す。
【０１０１】
［ＡＺＯ−ＣＭ−セルロースを使用するエンドグルカナーゼ活性］
本アッセイは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ手順書Ｓ−ＡＣＭＣ ０４／０７（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｌｔｄ，ｈｔｔｐ：／／ｓｅｃｕｒｅ．ｍｅｇａｚｙｍｅ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｅｎ／ｄａｔａ／Ｓ−ＡＣＭＣ．ｐｄｆ）に従って実施する。活性は、１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ４．６中、２％ＡＺＯ−ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅを用いて４０℃で測定した。アッセイ用に、基質原液（２％）２５０μＬ＋希釈酵素溶液２５０μＬを混合した。３０分後、沈殿剤溶液１２５０μＬを加えた。沈殿剤溶液（エタノール７６％中、３００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ＝５と２０ｍＭ Ｚｎ−酢酸）を加えることによって反応を停止させた。１０００ｘｇで１０分間遠心分離した後、分光光度計を使用して、上澄の５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。活性は、放出された色素μｍｏｌ／ｍｌ／分で表す。
【０１０２】
［トリブチリンプレートアッセイ］
トリブチリン（Ｃ４）を基質として、ローダミンＢリパーゼプレートスクリーニングアッセイを行った。ローダミンＢプレートアッセイは、試料中の、リパーゼ活性存在のスクリーニングによく使用され、文献（Ｇ．Ｋｏｕｋｅｒ，Ｋ．Ｅ．Ｊａｅｇｅｒ，Ａｐｐｌ．ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８７，２１１−２１３）に記載のアッセイから改変された。使用した全ての化学薬品は、分析グレードであった。アラビアゴムエマルジョンは、ＮａＣｌ １７．９ｇおよびＫＨ２ＰＯ４ ０．４１ｇをＨ２Ｏ ４００ｍｌに溶解し、最後にグリセロール（８７％）５４０ｍｌを加えることによって作った。アラビアゴム６（６．０）ｇを徐々に加え、溶解した後、Ｈ２Ｏを加えることにより全量１０００ｍｌとした。
ローダミンＢ溶液は、ローダミンＢを２０ｍｇ／ｍｌの濃度でエタノールに溶解することによって調製した。４％アガロース溶液は、加熱により、アガロース４ｇをバッファー液（０．１Ｍ酢酸塩 ｐＨ＝５．５）１００ｍｌに溶解することによって調製した。リパーゼ活性のスクリーニングに使用した基質は、トリブチリンであった。
プレートアッセイ手順：基質１ｍｌおよびアラビアゴムエマルジョン１．５ｍｌを、バッファー液５ｍｌと混合し、振幅２０μｍで２×６０秒間Ｓｏｎｉｐｒｅｐを使用して、または任意選択的に、緑色に設定したＵｌｔｒａｔｕｒａｘで２分間、超音波処理した。この溶液に、熱いアガロース溶液７．５ｍｌをローダミンＢ １５０μｌと一緒に加えた。最終溶液をペトリ皿プレートに注入した。プレートは、使用するまで冷蔵庫内に保存した。使用直前に、レプリケーターを使用して、直径３ｍｍの穴を作った。リパーゼ活性を確認する溶液１０μｌを穴にピペッティングし、その後、プレートを３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。穴の周囲の蛍光ハロは、リパーゼ活性を示す。
【０１０３】
［ｐＮＰ−ブチレートアッセイ］
前胃エステラーゼ（ＰＧＥ）活性は、内部酵素標準に対して、最終濃度１ｍＭのパラ−ニトロフェニルブチレートを基質として使用し、３７℃で測定した。基質溶液は、アセトニトリル中５０ｍＭパラ−ニトロフェニルブチレート原液を作り、それを、０．２％ＢＳＡおよび２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ６．７で５倍希釈することによって調製した。０．２％ＢＳＡを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．７ １２０μｌ、基質溶液１５μｌを加えた。３７℃に予熱した後、適切な希釈度の試料（０．２％ＢＳＡを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．７で希釈）１５μｌを加え、その後、３７℃で５分間のインキュベーションの間ずっと、４０５ｎｍにおける吸光度の上昇を分光光度法で測定した。
試料応答は、ブランクバックグラウンド（試料の代わりに、０．２％ＢＳＡを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．７ １５μｌのインキュベーション）の補正をし、ブランク補正後、一般に０．０５〜０．５ｄＡｂｓの範囲であった。
内部標準を、ｐＨ６．０および３０℃で実施される、トリブチリンを用いた滴定分析で較正した。ＰＧＥ試料液（ｍｉｌｌｉＱ水で調製）５ｍｌを、予熱したトリブチリン／アラビアゴムエマルジョン（それぞれ、水中９３ｇ／Ｌおよび５７ｇ／Ｌ）３０ｍＬに加えた。放出された遊離脂肪酸を、０．０２Ｎ ＮａＯＨで滴定することによって５分間にわたり測定した。
【０１０４】
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動］
試料前処理：試料３０μｌを、水３５μｌおよびＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ試料バッファー（４×）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２５μｌおよびＮｕＰＡＧＥ（商標）試料還元剤（Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（１０×）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １０μｌに加えた。試料を、サーモミキサー内、７０℃で１０分間加熱した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、供給者の指示書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｇｅｌ：４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、バッファー：ＭＥＳ ＳＤＳ泳動バッファー、実行時間：３５分）に従って、二重に実施した。２つのゲルのうちの１つをブロッティングに使用し、試料液１０μｌおよびマーカーＭ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μｌをゲル上に適用した（ＮｕＰＡＧＥ（商標） Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
ゲルは、外部バッファー室内の２０倍希釈したＭＥＳ−ＳＤＳバッファー６００ｍｌ、および内部バッファー室内の酸化防止剤（ＮｕＰＡＧＥＴＭ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５ｍｌを含有する２０倍希釈したＭＥＳ−ＳＤＳバッファー２００ｍｌを備えたＸＣＥＬＬ Ｓｕｒｅｌｏｃｋを使用して、２００Ｖで動かした。ラン実行後、ゲルを５０％メタノール／７％酢酸（５０ｍｌ）で１時間固定し、脱塩水で２回すすぎ、シプロルビー（Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ）（５０ｍｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で一晩染色した。
画像は、ゲルを脱塩水で１０分間洗浄した後、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９２００（６１０ ＢＰ ３０，Ｇｒｅｅｎ（５３２ｎｍ），ＰＭＴ ６００Ｖ，１００μｍ）を使用して作成した。
【０１０５】
［ウエスタンブロッティング］
［ＰＧＥポリクローナル抗体］
ＰＧＥポリクローナル抗体は、迅速２８日プログラムおよび抗原としての２つの合成ＰＧＥペプチドを使用して、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（ベルギー）に注文した。ＰＧＥ抗体は、市販のＰｉｃｃａｎｔａｓｅ Ｃ（ＤＦＳ）酵素製剤と比較して確認した（データ表示せず）。
ウエスタンブロッティングは、分析Ｓ２３００の方法に従って実施した。
膜：ＮＣ ０．４５μｍ
実行時間：２５Ｖで９０分
バッファー：メタノールを含むトランスファーバッファー
【０１０６】
膜に移動させた後、以下のステップを実施した：
膜を、スキムミルク（ＰＢＳＴ中１％のスキムミルク；１０ｍＭ ＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）２０ｍｌ中で２時間ブロックする。
抗体１：ＳＹ０７１６，ウサギ；抗体４０μｌを、ＰＢＳＴ ２０ｍｌに溶解する）室温で一晩（１：５００）。
膜を、ＰＢＳ−Ｔですすぎ、次にＰＢＳＴバッファーで３×２０分間洗浄する。
抗体２：ＥＣＬ Ｐｌｅｘヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｃｙ３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；ＥＣＬ Ｐｌｅｘ１０μｌを、ＰＢＳＴ ２５ｍｌに溶解する、暗所に保管）１時間。（１：２５００）
膜を４回すすぎ、次にＰＢＳＴで２×１０分間洗浄する
ＰＢＳで２×１０分間洗浄する
画像は、Ｔｙｐｈｏｏｎ９２００（６７０ＢＰ３０，緑色（５３２ｎｍ），ＰＭＴ ４５０Ｖ，１００μｍ）を使用して、膜から作成した。
【０１０７】
［分子生物学技法］
本明細書の実施例では、当業者に周知の分子生物学技法（ｓｅｅ：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）を使用して、幾つかの遺伝子を過剰発現させ、その他を、下記の通りに下方制御した。
【０１０８】
記述され、使用された全ての遺伝子置換ベクターは、周知の原理に従って設計され、またルーチンのクローニング手順に従って構築された。本質的に、これらのベクター類は、宿命的なゲノム遺伝子座における相同組換えを目標とするため、それぞれのＯＲＦ配列の、約１〜２ｋｂの隣接領域を含む。加えて、これらのベクター類は、形質転換のために、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）双方向ａｍｄＳ選択マーカーを、直接反復の中間に含む。本明細書の全実施例で遺伝子欠失に利用された方法は線状ＤＮＡを使用するが、これは、二重交差によってゲノムのフランキング配列の相同遺伝子座に組み込まれ、したがって削除されるべき遺伝子がａｍｄＳ遺伝子に代わる。形質転換後、この直接反復によって、（第２の）相同組換え事象による選択マーカーの除去が可能になる。ａｍｄＳマーカーの除去は、フルオロアセトアミド培地上にプレーティングすることにより行うことができ、無マーカー遺伝子菌株を選択する結果となる。欧州特許第０ ６３５ ５７４号明細書に「ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ」アプローチとしても記述されている、形質転換および後続の対抗選択という、この戦略を使用すれば、ａｍｄＳマーカーを菌株修飾プログラムで無制限に使用することができる。遺伝子破壊のための基本手順は、国際公開第２００６０４０３１２号パンフレットの図６に描かれている。欠失ベクター類の一般設計は、以前に欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書および国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記述されており、また欠失ベクターを構築するための一般的クローニングベクターｐＧＢＤＥＬの使用および対抗選択手順は、国際公開第０６／０４０３１２号パンフレットに記述されている。
発現ベクター類、具体的には遺伝子過剰発現用のｐＧＢＦＩＮ−発現ベクター類の一般設計、形質転換、マーカー類の使用および選択培地の例は、国際公開第１９９８４６７７２号パンフレット、国際公開第１９９９３２６１７号パンフレット、国際公開第２００１１２１７７９号パンフレット、国際公開第２００５０９５６２４号パンフレット、欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書および国際公開第２００５１００５７３号パンフレットにある。
【０１０９】
［振盪フラスコ発酵］
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株を、国際公開第９９／３２６１７号パンフレットの実施例：「アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）振盪フラスコ発酵」セクションに記載の通りに、ＣＳＬ前培養培地２０ｍｌ中で前培養した（１００ｍｌフラスコ、バッフル）。３４℃および１７０ｒｐｍで１８〜２４時間成長させた後、この培養１０ｍｌを、発酵培地（ＦＭ）に移す。ＦＭ中での発酵は、概ね国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載の通り、発酵ブロス１００ｍｌが入ったバッフル付き５００ｍｌフラスコ内、３４℃および１７０ｒｐｍで指示された日数、実施する。
ＣＳＬ培地は（１リットル当たりの量で）：コーン・スティープ・ソリッド（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）１００ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４＊Ｈ２０ １ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、グルコース＊Ｈ２Ｏ １０ｇおよびバシルドン（Ｂａｓｉｌｄｏｎ）（消泡剤）０．２５ｇで構成されていた。成分を脱塩水に溶解し、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４でｐＨをｐＨ５．８に調整した；バッフル付き１００ｍｌフラスコおよびフォームボールを発酵培地２０ｍｌで満たし、１２０℃で２０分間、滅菌した。
発酵培地（ＦＭ）は（１リットル当たりの量で）、マルトース＊Ｈ２Ｏ １５０ｇ、ソイトン（Ｓｏｙｔｏｎｅ）（ペプトン）６０ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４＊Ｈ２Ｏ １ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ １５ｇ、トゥイン（Ｔｗｅｅｎ）８０ ０．０８ｇ、バシルドン（Ｂａｓｉｌｄｏｎ）（消泡剤）０．０２ｇ、ＭＥＳ ２０ｇ、Ｌ−アルギニン １ｇで構成されていた。成分を脱塩水に溶解し、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４でｐＨをｐＨ６．２に調整した；バッフル付き５００ｍｌフラスコおよびフォームボールを発酵ブロス１００ｍｌで満たし、１２０℃で２０分間、滅菌した。
クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）振盪フラスコ発酵の場合、クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＰＧＥ形質転換体の単一コロニーを、１リットル当たり酵母エキス１０ｇ、バクトペプトン２０ｇ、グルコース４０ｇおよび１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．７を含有する、ＹＥＰ（４％）−Ｄ／ＭＥＳ培地１００ｍｌ（フラスコ）に接種した。発酵は、２８０ｒｐｍの振盪インキュベーター内、３０℃で実施した。上澄を２日および３日に採取し、下記の通りにさらに分析した。
【０１１０】
［実施例１］
［本発明の方法による、野生型酵素および酵素変異体用のクリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）発現ベクターおよびアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターの構築］
この実施例では、本発明の酵素の変異体用に、多数の発現ベクターを構築した。クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）における発現のための全ての変異体を、ｐＫＬＡＣ２発現ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に酷似したｐＫＬＰＧＥ−ベクターでクローニングした。全てのｐＫＬＰＧＥ−ベクター類の一般設計図を図１に示す。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）における発現用の全ての変異体は、ｐＧＢＦＩＮ−５発現ベクターまたはｐＧＢＴＯＰ−発現ベクターでクローニングした。構築、一般設計図およびこれらのベクター類の使用は、国際公開第１９９９３２６１７号パンフレットに詳述されている。
【０１１１】
［クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）構築物］
ウシ前胃エステラーゼ（ＰＧＥ）は、産業上興味深い酵素であり、またその全長ｃＤＮＡ配列は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓら（１９９４，Ｇｅｎｅ １４７：２５９−２６２）により公開されている。クリベロミセス・ラクテス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）におけるＰＧＥの発現の場合、このｃＤＮＡ配列は、最適化されたコドン対（配列番号１）であり、合成的に調製されている（たとえば、ＤＮＡ２．０，ＵＳＡ，ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｓｌｏｎｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）α−因子プレ（プロ−）シグナル配列およびＫＲＥＡＥＡ Ｋｅｘプレ（プロ−）−配列プロセシング部位との融合を含む発現構築物を作成した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ制限部位を介して、合成遺伝子をクリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）発現ベクターでクローニングし、ａｍｄＳ選択マーカーも含む、ｐＫＬＰＧＥ−ＷＴ（図１）を産生した。加えて、本発明の方法に従って、改良された蛋白質特性を有する幾つかのＰＧＥ変異体を設計した。これらの突然変異体は、グリコシル化部位数および／または疎水性に関して、コドン対最適化野生型ＰＧＥ酵素（配列番号２）と異なっていた。ＰＧＥ突然変異体酵素コード化遺伝子も、上記の通り、やはり最適化コドン対であり、また合成的に調製されてもいる。ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩクローニング部位を使用して本質的に前述の通りに、変異体を、クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）発現ベクターにクローニングした。ＰＧＥ構築物のための全ての関連ヌクレオチドおよび蛋白質の詳細を表４に示す。
【０１１２】
【表７】
【０１１３】
［アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）構築物］
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるウシ前胃エステラーゼＰＧＥの発現の場合、ｃＤＮＡ配列は、最適化コドン対（配列番号１２）であり、合成的に調製された（たとえば、ＤＮＡ２．０，ＵＳＡ，ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｓｔｏｎｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。コドン対最適化ＰＧＥコード化遺伝子は、切断型グルコアミラーゼキャリア蛋白質（ｔＡＧ）への融合物として合成的に調製された。図２のｐＡＮＰＧＥ−３に示す通り、この融合フラグメントを、ｐＧＢＴＯＰ−アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターに挿入した。
【０１１４】
仮想キチナーゼ（ＺＤＵ，ＥＣ３．２．１．１４，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａ５ＡＢ４８）をコード化する野生型アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）遺伝子Ａｎ０８ｇ０９０３０は、アスペルギルス・ニガー（Ａｎｉｇｅｒ）ゲノム配列で同定された（ＥＭＢＬ：ＡＭ２６９９４８−ＡＭ２７０４１５；Ｐｅｌ ｅｔ ａｌ，「汎用細胞工場アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８のゲノムシークエンシングおよび分析（Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＣＢＳ５１３．８８．）」。Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７Ｆｅｂ；２５（２）：２２１−２３１）。野生型キチナーゼＺＤＵのｃＤＮＡ配列は、配列番号１７として同定することができ、推定される野生型キチナーゼＺＤＵ蛋白質配列は、配列番号１８として同定することができる。Ａｎ０８ｇ０９０３０のコード配列は最適化コドン対であり（国際公開第２００８０００６３２号パンフレットに詳述されている通り）、またグルコアミラーゼｇｌａＡプロモーターの翻訳開始配列は、作成された全ての発現構築物で５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ ＡＴＧ−３’に修飾されていた（やはり国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットに詳述されている通り）。加えて、最適翻訳停止配列が使用され、したがって、全ての発現構築物で、野生型５’−ＴＧＡ−３’翻訳停止配列は５’−ＴＡＡＡ−３に置き換えられた（国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットに詳述されている通り）。最適化キチナーゼＺＤＵ構築物は、ＰａｃＩ−ＡｓｃＩフラグメントとして完全合成し、サブクローニングして配列を検証した。合成されたフラグメント両端のＰａｃＩ−ＡｓｃＩ制限部位を使用して、ＰａｃＩ−ＡｓｃＩ消化ｐＧＢＦＩＮ−５発現ベクターの大きいベクターフラグメントでのクローニングを可能にし、ｐＧＢＦＩＮＺＤＵ−ＷＴ発現ベクターを作成した（図３）。
加えて、またＺＤＵキチナーゼの場合と同様の方法で、タラロミセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）β−グルコシダーゼ（ＺＴＢ，ＥＣ ３．２．１．２１，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８Ｘ２１４）およびファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）エンドグルカナーゼ（ＺＴＣ，ＥＣ ３．２．１．４，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６６ＮＢ６）は、最適化コドン対であり（国際公開第２００８０００６３２号パンフレットに詳述されている通り）、また全ての適切な制御要素をＰａｃＩ−ＡｓｃＩフラグメントとしてｐＧＢＦＩＮ−５にクローニングし、それぞれｐＧＢＦＩＮＺＴＢ−ＷＴおよびｐＧＢＦＩＮＺＴＣ−ＷＴを作成した。
【０１１５】
本発明の方法による蛋白質特性最適化（ＰＦＯ）を、ウシ前胃エステラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）キチナーゼ蛋白質配列、タラロミセス・エメルソニ（Ｔ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）β−グルコシダーゼおよびファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）エンドグルカナーゼ蛋白質配列に適用した。ウシ前胃エステラーゼの設計された変異体を含むコード配列をＥｃｏＲＩ−ＳｎａＢＩフラグメントとして完全合成し、配列を検証した。合成フラグメントをｐＧＢＴＯＰ−ベクターでクローニングし、ｐＡＮＰＧＥ−発現構築物を作成した。アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＰＧＥ構築物のための全ての関連ヌクレオチドおよび蛋白質の詳細を表５に示す。
【０１１６】
【表８】
【０１１７】
キチナーゼ、β−グルコシダーゼおよびエンドグルカナーゼの設計された変異体を含むコード配列をＰａｃＩ−ＡｓｃＩフラグメントとして完全合成し、サブクローニングして配列を検証した。合成されたフラグメント両端のＰａｃＩ−ＡｓｃＩ制限部位を使用して、ＰａｃＩ−ＡｓｃＩ消化ｐＧＢＦＩＮ−５発現ベクターの大きいベクターフラグメントでのクローニングを可能にし、変異体ｐＧＢＦＩＮ−発現ベクターを作成した。変異体発現構築物は、下記の通りに命名され、ｐＧＢＦＩＮＺＤＵ−構築物の特徴ならびにそれぞれのヌクレオチド配列および蛋白質配列ののリファレンスは、表６から推定することができ、ｐＧＢＦＩＮＺＴＢ−構築物のそれらは表７から、またｐＧＢＦＩＮＺＴＣ−構築物のそれらは表８から推定される。
【０１１８】
【表９】
【０１１９】
【表１０】
【０１２０】
【表１１】
【０１２１】
［実施例２］
［クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）野生型の発現および分泌分析ならびに蛋白質特性最適化ＰＧＥ］
菌株クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＧＧ７９９ＷＴ７を、ａｍｄＳ選択マーカーも含むクリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ｐＫＬＰＧＥ−構築物（表４）で形質転換した。各形質転換について、２０コロニーを、アセトアミドを含有する選択培地で純化した。コロニーの一部を使用して、ＰＣＲ反応用のＤＮＡ鋳型を作成し、各菌株におけるＰＧＥ構築物のコピー数を決定した。構築物当たり３つの、ＰＣＲスクリーニングで陽性の形質転換体を、酵素基質としてトリブチリンを含有するプレートアッセイでさらにスクリーニングした。野生型ＰＧＥ酵素の場合、トリブチリンプレートアッセイを使用して、明白な活性ハロを検出することはできなかった。ＰＧＥ産生用のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた上澄の分析もまた、陽性結果を示さなかった。意外なことに、最適化蛋白質特性を有するＰＧＥ突然変異体５つのうち４つでは、トリブチリンプレートアッセイを使用して、明白な活性ハロを確認することができた。
野生型および突然変異体ＰＧＥの多数の形質転換体を、振盪フラスコ内で成長させ、ｐＮＰ−ブチレートを基質として使用して、ブロスおよび上澄のリパーゼ活性を試験した。ＰＧＥ突然変異体の様々な活性アッセイの概要を表９に示す。
【０１２２】
【表１２】
【０１２３】
クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ｐＫＬＰＧＥ−ＷＴ（ＰＧＥＣＰＯ）形質転換体（様々なコピー数）では、０．２Ｕ／ｍｌという最大活性が得られた。ＰＧＥの蛋白質特性最適化によって、すなわちｐＫＬＰＧＥ−１２で発現されるとき、このＰＧＥ突然変異体の５０×を超える活性上昇が確認された。ＰＧＥ−９、ＰＧＥ−１１およびＰＧＥ−１２変異体の多数の突然変異体を大規模ベースで発酵させ、改良された分泌を確認した（データ表示せず）。この実施例では、グリコシル化部位数の改変および表面に露出している疎水性酵素部分の極性の変更により（ＰＧＥモデリングに基づいて決定される）、我々はクリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）におけるＰＧＥ酵素発現および分泌を劇的に改良できることが分かった。さらに、かなりの量の活性が、上澄にも存在していた。
【０１２４】
［実施例３］
［アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における野生型および蛋白質特性最適化ＰＧＥの発現および分泌分析］
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ６を、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ選択マーカーおよび変異体ｐＡＮＰＧＥ−プラスミドを担持するｐＧＢＡＡＳ構築物で共形質転換した（表５）。全て、国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載の通り、各形質転換について、２０コロニーを、アセトアミドを含有する選択培地で純化し、続いてスポアプレートを調製した。真の共形質転換体であった、たとえば、ＰＧＥカセットおよびａｍｄＳカセットの両者を含んでいた、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）形質転換体を選択するために、ＰＣＲ確認する（表示せず）。結果から、選択された形質転換体２０のうち少なくとも５０％が、ＰＧＥ発現構築物の１つまたは複数のコピーを含んでいた。形質転換体を含むこれらのＰＧＥを継続した。ＰＧＥ ｃｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓのスポアを回収し、ＦＭ培地で振盪フラスコ発酵を実施した。２日目に、上澄試料を採取し、トリブチリンプレートアッセイを使用してリパーゼ活性についてスクリーニングした。
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｐＡＮＰＧＥ−３形質転換体から回収された試料中に、非常に僅かな活性ハロを検出することができた（データ表示せず）。ｐＡＮＰＧＥ−１２およびｐＡＮＰＧＥ−１３形質転換体では、大きい活性ハロを検出することができた（データ表示せず）。各構築物ｐＡＮＰＧＥ−３、ｐＡＮＰＧＥ−１２およびｐＡＮＰＧＥ−１３について、トリブチリンプレートアッセイで最大のハロを示した形質転換体（１〜３）のリパーゼ活性を、基質としてｐＮＰ−ブチレートを使用して試験した。ＰＧＥ突然変異体の様々な活性アッセイの概要を表１０に示す。
【０１２５】
【表１３】
【０１２６】
ＷＴ ６および選択された形質転換体ｐＡＮＰＧＥ−１２＃１６およびｐＡＮＰＧＥ−１３＃３０の上澄試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰＧＥポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロットで、さらに分析した（図４参照）。ｐＡＮＰＧＥ−１２のアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＰＧＥＰＦＯ変異体では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで、成熟ＰＧＥに相当するバンドを検出することができた。ＰＧＥポリクローナル抗体ＰＧＥを使用して、両形質転換体の上澄中に、交差ハイブリダイズバンドを検出することができた。
最高分子量のバンド（約５５ｋＤａ）はおそらく成熟ＰＧＥ突然変異体に相当し、また、より低分子量の交差ハイブリダイズバンドは、蛋白質分解の結果であろう。
蛋白質特性最適化の法則に従って、表面に露出している酵素部分の極性（ＰＧＥモデリングに基づいて決定される）を変えることにより、我々はアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるＰＧＥ酵素発現を劇的に改良できるという結論に達する。さらに、高い酵素活性も、上澄中で認められた。
【０１２７】
［実施例４］
［アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における野生型およびＰＦＯ最適化真菌酵素の発現］
実施例１（ｓｕｐｅｒ）で調製された、ｐＧＢＦＩＮＺＤＵ−発現構築物、ｐＧＢＦＩＮＺＴＢ−発現構築物およびｐＧＢＦＩＮＺＴＣ−発現構築物を、下記の通り、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）を使用した形質転換により導入した。ＷＴ ６で、異なるｐＧＢＦＩＮＺＤＵ−ベクター、ｐＧＢＦＩＮＺＴＢ−ベクターおよびｐＧＢＦＩＮＺＴＣ−ベクター（それぞれ、表６、７および８）を導入するために、国際公開第１９９８／４６７７２号パンフレットおよび国際公開第１９９９／３２６１７号パンフレットに記載の通りに、形質転換および後続する形質転換体の選択を実施した。簡単に記載すると、全てのｐＧＢＦＩＮ−構築物の線状ＤＮＡを単離して、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ６の形質転換に使用した。形質転換体をアセトアミド培地で選択し、標準手順に従って、コロニーを純化した。コロニーのｇｌａＡ遺伝子座における組み込みおよびコピー数を、ＰＣＲを使用して診断した。類似した推定コピー数（仮想単一コピー）を有する各ｐＧＢＦＩＮＺＤＵ−構築物、ｐＧＢＦＩＮＺＴＢ−構築物およびｐＧＢＦＩＮＺＴＣ−構築物について、独立した３つの形質転換体を選択し、形質転換プラスミドの数を使用して、たとえば、それぞれ、ＺＤＵ−ＷＴ−１、ＺＤＵ−ＷＴ−２、ＺＤＵ−ＷＴ−３、ＺＤＵ−６−１、ＺＤＵ−６−２、ＺＤＵ−６−３等々と命名した。
上述の通り、３４℃および１７０ｒｐｍのインキュベーターシェーカーで、５００ｍｌバッフル付き振盪フラスコを使用し、選択されたＺＤＵ−菌株、ＺＴＢ−菌株およびＺＴＣ−菌株ならびにアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ６を使用して、ＦＭ培地１００ｍｌで、振盪フラスコ実験を実施した。発酵の３日、４日および５日の後、試料を採取し、電気泳動およびキチナーゼ活性により細胞外蛋白質の産生量を測定した。
【０１２８】
異なる構築物を含むアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＺＤＵ−５形質転換体の各形質転換体により発現されたキチナーゼの産生を、培養上澄で測定した。３日に測定されたキチナーゼ活性レベルを図５に示す。加えて、４日にサンプリングした培養上澄をＳＤＳゲル電気泳動法および染色で分析した（図６）。これらの結果から、最適化された蛋白質特性は、蛋白質分泌にプラスの影響を与え、そして検出可能な、したがって蛋白質発現レベル上昇およびキチナーゼ酵素活性レベル上昇をもたらすことが明白である。結果を表６にまとめた。
【０１２９】
異なる構築物を含むアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＺＴＢ−形質転換体の各形質転換体により発現されたβ−グルコシダーゼの産生を、培養上澄で測定した。４日目にサンプリングした培養上澄をＳＤＳゲル電気泳動法および染色で分析した（図７）。これらの結果から、最適化された蛋白質特性は、蛋白質分泌にプラスの影響を与え、そして検出可能な、したがって、β−グルコシダーゼ酵素のための蛋白質発現レベル上昇をもたらすことが明白である。加えて、３日目にサンプリングした上澄中の活性を、基質としてｐＮＰ−β−グルコピラノシドを使用し、ｐＨ＝４．５および４０℃で測定した。蛋白質特性最適化に付しておいたβ−グルコシダーゼの上澄は、コドン最適化遺伝子によりコード化された親β−グルコシダーゼと比較して、最高２０倍の活性上昇を示した。空宿主で測定されるバックグラウンドβ−グルコシダーゼ活性は、コドン最適化遺伝子によりコード化された親ベータ−グルコシダーゼの２分の１〜４分の１の低さであった。活性はまた、セロビオースを基質として使用し、ｐＨ＝４．５および４０℃でも測定した。測定された活性上昇は、コドン最適化遺伝子によりコード化された親β−グルコシダーゼと比較して、少なくとも３０倍であった（空宿主菌株は、コドン最適化遺伝子によりコード化された親β−グルコシダーゼの３分の１〜１０分の１の低さであった）。結果を表７にまとめた。
【０１３０】
異なる構築物を含むアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＺＴＣ−形質転換体の各形質転換体により発現されたエンドグルカナーゼの産生を、培養上澄で測定した。４日目にサンプリングした培養上澄をＳＤＳゲル電気泳動法および染色で分析した（図８）。これらの結果から、最適化された蛋白質特性は、蛋白質分泌にプラスの影響を与え、そして検出可能な、したがってエンドグルカナーゼ酵素のための蛋白質発現レベル上昇をもたらすことが明白である。３日目にサンプリングした上澄中のエンドグルカナーゼ活性を、ＡＺＯ−ＣＭ−セルロースを基質として使用し、ｐＨ＝４．５および４０℃で測定した。蛋白質特性最適化に付しておいたエンドグルカナーゼの上澄は、同一宿主で発現されるコドン最適化遺伝子と比較して、３５０倍を超える活性上昇を示した。空菌株におけるバックグラウンド活性は非常に低いため（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出不能）、活性上昇がそのように高い数字で表されることに留意すべきである。コドン最適化遺伝子によりコード化されたエンドグルカナーゼについては、測定された活性は、ほぼ空宿主菌株で観測されるバックグラウンド活性であった。結果を表８にまとめた。
【０１３１】
明らかに、これらの実施例は、対象蛋白質および酵素の改良された分泌および産生のために、蛋白質特性最適化のための本発明の方法を、いかに使用できるかを示すものである。さらに、これらの結果は、発現構築物および宿主は、既に幾つかの他の最適化、たとえば強力プロモーター、改良された翻訳開始配列、改良された翻訳停止配列、最適化コドンおよびコドン対使用、および／または蛋白質発現のための改良された宿主等を有するものの、宿主における蛋白質発現を改良するために、本発明の方法を広く利用できることを示している。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、ポリペプチドの収量を改良する方法に関する。特に、本発明は、ポリペプチドの主鎖を修飾するステップによりポリペプチドの収量を改良する方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
ゲノムおよびメタゲノムシークエンシングにおける最近の急速な進歩は、潜在的に非常に興味深い多様な蛋白質を表す多くの遺伝子をもたらしている。これらの遺伝子をかなりの水準で発現させる問題は、これらの遺伝子によりコードされる蛋白質の機能性の調査を妨げ、結果として、経済的な実現可能な方法での、このような蛋白質の利用の可能性を阻む。多くの場合、発見された遺伝子は大規模生産にあまり適していないか、または現在の遺伝子工学ツールにかなり利用し難しい生物に由来するため、遺伝子導入系および十分に開発された遺伝子工学ツールが利用可能な、十分に確立された産生宿主を使用することが極めて望ましい。特に糸状菌および酵母等の真核生物は、蛋白質の産生における、特に細胞外蛋白質の産生における、細胞工場として広く使用される。長期にわたり伝統的に使用されているため、これらの種の幾つかは一般に安全である（ＧＲＡＳ）と見なされ、ヒト用製品の製造に非常に興味深いものとなっている。しかし、かなりの改良にもかかわらず、異種遺伝子で得られる産生レベルは大抵、相同遺伝子でみられるものよりはるかに低い。多くの場合、蛋白質の発現は皆無である。
【０００３】
蛋白質産生のレベルを上げるために様々な方法がある。これらの中には、強力プロモーターの利用、コピー数の増加、最適コザック（Ｋｏｚａｋ）配列、ｍＲＮＡ安定要素、最適化コドン使用（国際公開第２００８／０００６３２号パンフレット）および遺伝子などがある。しかしながら、これらの戦略は一般に、蛋白質が検出可能なレベルで産生されることを保証するものではない。今日まで、異種蛋白質を産生するための最も成功したアプローチは、それらを、効率的に分泌される相同蛋白質との翻訳融合として発現させることである。それにも拘わらず、産生レベルはやはりそれでもなお著しく後れを取り、多くの場合、発現レベルは問題になるほど低い。一般に、発酵における低発現は、回収における低収量につながる。たとえ発現が最適化されても、最終的な成熟蛋白質生成物は、下流処理での大きな損失のため、やはり非常に低い生成収量に終わるかもしれない。これは、発現された蛋白質がバイオマスと結合したままであるとき、該当するかもしれない。これは高損失に終わるか、あるいは、蛋白質を可溶化するために、高価な、そして時には望ましくない洗剤の使用を必要とする。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は、クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）発現ベクターｐＫＬＰＧＥ−ＷＴ（実施例１に記載の構築物）のプラスミドマップを表す。図１は、他のｐＫＬＰＧＥ−発現プラスミドの代表的なマップも提供する。ＰＧＥコード化遺伝子に関連したＬＡＣ４プロモーターおよびａｍｄＳ選択マーカーカセットを示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、形質転換前に、制限酵素ＳａｃＩＩで消化することにより、除去できる。
【図２】図２は、発現ベクターｐＡＮＰＧＥ−３（実施例１に記載の構築物）のプラスミドマップを表す。図２は、他のｐＡＮＰＧＥ−発現プラスミド類の代表的なマップも提供する。加えて、ｇｌａＡプロモーターおよび本発明の方法によって変異体ＰＧＥ酵素をコード化する切断型ＧｌａＡの配列およびＰＧＥコード化配列が示される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株の形質転換前に、制限酵素ＮｏｔＩで消化することにより、除去できる。
【図３】図３は、発現ベクターｐＧＢＦＩＮＺＤＵ−ＷＴ（実施例１に記載の構築物）のプラスミドマップを表す。図３は、他のｐＧＢＦＩＮＺＤＵ−プラスミド、ｐＧＢＦＩＮＺＴＢ−プラスミドおよびｐＧＢＦＩＮＺＴＣ−プラスミドの代表的なマップも提供する。ａｍｄＳ選択マーカーカセットに関連したｇｌａＡ隣接領域を示す。加えて、ｇｌａＡプロモーターの配列ならびに本発明の方法によって変異体酵素をコード化するＺＤＵ配列、ＺＴＢ配列およびＺＴＣ配列が示される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株の形質転換前に、制限酵素ＮｏｔＩで消化することにより、除去できる。
【図４】アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ６およびＰＧＥ変異形質転換体ｐＡＮＰＧＥ１２＃１６（Ａ）およびｐＡＮＰＧＥ１３＃３０（Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析。培養の２日（Ｄ２）および３日（Ｄ３）の上澄を分析した。１４ｋＤａおよび９７ｋＤａにおける水平線は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットのアラインメント用である。左側のマーカーの大きさは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ染色マーカーに相当し、また右側のマーカーはウエスタンブロットマーカーに相当する。
【図５】図５は、全てｇｌａＡプロモーターのコントロール下での、異なるＺＤＵ構築物を発現する、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株の、３日間発酵後の培養ブロス中のキチナーゼ活性を表す。シグナル配列、Ｎ−末端および蛋白質デザインが修飾されている、変異体ＳＤＵ構築物を発現するアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株の培養ブロス中のキチナーゼ活性を表す。異なる構築物に関する詳細は、表６に示す。相対的キチナーゼ活性は、ＯＤ５９０測定値として表す。表示した全ての形質転換体群について、３つの形質転換体を単離し、独立に培養した。
【図６】図６は、全てｇｌａＡプロモーターのコントロール下での、変異体ＺＤＵ構築物を発現する、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ６菌株およびＺＤＵ菌株の、４日間発酵後の、培養ブロスのＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析を表す。異なる構築物および発現したＺＤＵ蛋白質に関する詳細は、表６に表す。表示した全ての形質転換体群について、３つの形質転換体を単離し、独立に培養した。
【図７】図７は、全てｇｌａＡプロモーターのコントロール下での、変異体ＺＴＢ構築物を発現するアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ６菌株およびＺＴＢ−菌株の、４日間発酵後の、培養ブロスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を表す。異なる構築物および発現したＺＴＢ蛋白質に関する詳細を、表７に表す。表示した全ての形質転換体群について、３つの形質転換体を単離し、独立に培養した。
【図８】図８は、全てｇｌａＡプロモーターのコントロール下での、変異体ＺＴＣ構築物を発現する、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ６菌株およびＺＴＣ−菌株の、５日間発酵後の、培養ブロスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を表す。異なる構築物および発現したＺＴＣ蛋白質に関する詳細を、表８に表す。表示したＺＴＣ−ＷＴ形質転換体群について３つの形質転換体を、他の２つの菌株型については２つの菌株を、単離して独立に培養した。
【図９】図９は、局所的な蛋白質特性を表す。
【０００５】
［配列番号の説明］
配列番号１：ｃＤＮＡコドン対最適化（ＣＰＯ）前胃エステラーゼ（ＰＧＥ）；プロセシングした、すなわちシグナル配列コード化部分がない
配列番号２：蛋白質子ウシ前胃エステラーゼ（ＰＧＥ）、シグナル配列を含む
配列番号３：ＤＮＡ ＰＧＥ蛋白質特性最適化（ＰＦＯ）変異体ＫＬ８、グリコシル化部位１つ追加
配列番号４：蛋白質ＰＧＥ ＰＦＯ変異体ＫＬ８、グリコシル化部位１つ追加
配列番号５：ＤＮＡ ＰＧＥ ＰＦＯ変異体ＫＬ９、グリコシル化部位５つ追加
配列番号６：蛋白質ＰＧＥ ＰＦＯ変異体ＫＬ９、グリコシル化部位５つ追加
配列番号７：ＤＮＡ ＰＧＥ ＰＦＯ変異体ＫＬ１１、６．９６から７．７４へのｐｌシフト
配列番号８：蛋白質 ＰＧＥ ＰＦＯ変異体ＫＬ１１、６．９６から７．７４へのｐｌシフト
配列番号９：ＤＮＡ ＰＧＥ ＰＦＯ変異体ＫＬ１２、６．９６から６．７へのｐｌシフト
配列番号１０：蛋白質ＰＧＥ ＰＦＯ変異体ＫＬ１２、６．９６から６．７へのｐｌシフト
配列番号１１：ＤＮＡ ＰＧＥ、天然のシグナル配列がα−ＭＡＴ因子シグナルプレ（プロ−）配列に融合したＰＧＥ変異体
配列番号１２：ＤＮＡ ＰＧＥ ＡＮ３、Ｋｅｘ部位（ＫＲ）とのＣＰＯ遺伝子ｔＡＧ融合物
配列番号１３：ＤＮＡ ＰＧＥ変異体ＡＮ１２、６．９６から４．６へのｐｌシフト
配列番号１４：蛋白質ＰＧＥ変異体ＡＮ１２、６．９６から４．６へのｐｌシフト
配列番号１５：ＤＮＡ ＰＧＥ変異体ＡＮ１３、６．９６から４．８８へのｐｌシフト
配列番号１６：蛋白質ＰＧＥ変異体ＡＮ１３、６．９６から４．８８へのｐｌシフト
配列番号１７：ＤＮＡキチナーゼ（ＺＤＵ）野生型
配列番号１８：蛋白質キチナーゼ（ＺＤＵ）野生型
配列番号１９：ＤＮＡキチナーゼ変異体ＺＤＵ−６
配列番号２０：蛋白質キチナーゼ変異体ＺＤＵ−６
配列番号２１：ＤＮＡキチナーゼ変異体ＺＤＵ−７
配列番号２２：蛋白質キチナーゼ変異体ＺＤＵ−７
配列番号２３：ＤＮＡ β−グルコシダーゼ野生型ＺＴＢ−ＷＴ
配列番号２４：蛋白質β−グルコシダーゼ野生型ＺＴＢ−ＷＴ
配列番号２５：ＤＮＡ β−グルコシダーゼ変異体ＺＴＢ−４
配列番号２６：蛋白質β−グルコシダーゼ変異体ＺＴＢ−４
配列番号２７：ＤＮＡエンドグルカナーゼ野生型ＺＴＣ−ＷＴ
配列番号２８：蛋白質エンドグルカナーゼ野生型ＺＴＣ−ＷＴ
配列番号２９：ＤＮＡエンドグルカナーゼ変異体ＺＴＣ−５
配列番号３０：蛋白質エンドグルカナーゼ変異体ＺＴＣ−５
【０００６】
［詳細な説明］
本発明は、真核生物宿主における１つまたは複数の蛋白質特性について最適範囲内に入るか、または最適値により近づくように、ポリペプチドのアミノ酸主鎖における一組の関連する蛋白質特性値を修飾するステップにより、真核生物宿主細胞によって対象ポリペプチドの分泌を改良する方法に関する。
【０００７】
１つの利点は、以前には分泌されないか、または商業的応用は魅力のないほど少量が分泌されるに過ぎなかったが、今では、分泌が改良されたために産業的プロセスに利用可能である、興味深い機能を有する蛋白質である。もう一つの利点は、設計されたポリペプチドがバイオマスから既に分離されているため、下流処理およびポリペプチド類の回収がより容易になることである。
【０００８】
本明細書の文脈では、蛋白質特性は、蛋白質アミノ酸配列およびＤＮＡ配列から計算により導くことができる性質である。
【０００９】
ポリペプチドの修飾は、本明細書では、ポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらすあらゆる事象と定義される。修飾は、１つまたは複数の修飾と理解される。修飾は、ポリペプチド主鎖における１つまたは複数のアミノ酸の導入（挿入）、置換または除去（削除）によって遂行することが可能である。
【００１０】
本明細書の文脈では、用語「分泌」は、細胞外培地、一般に成長培地または生産培地中での、ポリペプチドの出現を指す。分泌されるポリペプチドは、バイオマスを含まない。分泌のレベルは、活性アッセイ（活性単位）、比活性（蛋白質重量当たりの単位）、定量的ＰＡＧＥ解析、定量的質量分析法および抗体法を含む、当該技術分野で周知の方法で測定することが可能である。
【００１１】
「ポリペプチドの分泌の改良」という表現は、細胞の、細胞外培地中に分泌されるポリペプチド量の増加を指す。改良は、たとえば細胞内ポリペプチド等の、通常は分泌されないポリペプチドが、今では分泌されるようになることにより反映され得る。改良はまた、たとえばシグナル配列を含むため分泌されると予想されていたのに分泌されなかったポリペプチドが、今では分泌されるようになったということでもある。改良は、もちろん、常に同一宿主遺伝的背景および同一培養または発酵条件に関して測定される。こうした場合、改良された分泌は、たとえば、改良前には可視バンドが皆無であったポリアクリルアミドゲルに蛋白質バンドが出現することから、明白なこともある。
【００１２】
あるいは、改良は、非常に少量で分泌されるポリペプチドが、上昇した分泌レベルを示すことにより反映されることもある。
【００１３】
一実施形態では、分泌されたポリペプチドの量は、細胞外培地中のポリペプチドの活性を測定することにより決定される。改良前の状況に比べて、細胞外培地中の活性は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％または少なくとも２０％、上昇している可能性がある。好ましくは、活性は少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％または少なくとも４０％、上昇している。より好ましい実施形態では、活性は、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％または少なくとも１０００％、上昇している。活性は、細胞外培地中で、無活性から若干の活性に上昇していてもよい。
【００１４】
任意の真核細胞を、本発明の方法で使用し得る。好ましくは、真核細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、または藻類細胞である。好ましい哺乳類細胞としては、たとえばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ６細胞、およびハイブリドーマなどが挙げられる。好ましい昆虫細胞としては、たとえばＳｆ９細胞およびＳｆ２１細胞およびそれらの派生物などがある。より好ましくは、真核細胞は真菌細胞、すなわち、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）菌株等の、酵母細胞である。より好ましくは、クリベロミセス・ラクテス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセス・セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、または糸状菌細胞由来である。最も好ましくは、真核細胞は、糸状菌細胞である。
【００１５】
「糸状菌」は、亜門真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の全ての線維状型を含む（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈらにより、Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫで定義されている通り）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖類からなる菌糸壁（ｍｙｃｅｌｉａｌ ｗａｌｌ）を特徴とする。栄養生長は菌糸伸長により、また炭素異化は偏性好気性である。糸状菌菌株としては、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、パネロカエテ（Ｐａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、プリュロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、シーラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などの菌株が挙げられるが、その限りではない。
【００１６】
好ましい糸状菌細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の種属に属し、最も好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、タラロミセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）またはペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の種属に属する。本発明による宿主細胞がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞であるとき、その宿主細胞は、好ましくはＣＢＳ ５１３．８８またはその派生物である。
【００１７】
糸状菌の幾つかの菌株は、たとえば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭ））、オランダ微生物株保存センター（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ））、および農業研究サービス特許カルチャーコレクション、北部領域研究センター（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ））アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ ５１３．８８、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣ ２０４２３、ＩＦＯ ４１７７、ＡＴＣＣ １０１１、ＡＴＣＣ ９５７６、ＡＴＣＣ １４４８８−１４４９１、ＡＴＣＣ １１６０１、ＡＴＣＣ １２８９２、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＣＢＳ ４５５．９５、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ ３８０６５、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｐ２、タラロミセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）ＣＢＳ １２４．９０２、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ３６２２５またはＡＴＣＣ ４８２７２、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ ２６９２１またはＡＴＣＣ ５６７６５またはＡＴＣＣ ２６９２１、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）ＡＴＣＣ１１９０６、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ４４００６およびそれらの派生物等、多数のカルチャー・コレクションで公的に、容易に入手できる。
【００１８】
本発明の一実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）またはクリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）が使用される。
【００１９】
一実施形態において、真核細胞は、組換え技術でポリペプチドが産生される宿主細胞である。宿主細胞を形質転換または形質移入する好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）および他の実験マニュアルを参照されたい。したがって、本発明はまた、ポリペプチドの分泌を改良するための本発明による方法を対象ポリペプチドに適用し、組換え技術により、本発明に従って修飾されたポリペプチドを産生するステップによって対象ポリペプチドを産生する方法にも関する。本発明はまた、前記組換技術により産生されるポリペプチドにも関する。本発明はまた、ポリペプチドの分泌を改良するための本発明による方法で得られるポリペプチドにも関し；好ましくは前記ポリペプチドは、ポリペプチドの分泌を改良するための本発明による方法で得られる。
【００２０】
本発明の方法に従って分泌が改良される対象ポリペプチドは、対象生物活性を有する任意のポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、コラーゲンまたはゼラチン、あるいはそれらの変異体または混成物であってもよい。ポリペプチドは、抗体またはその一部、抗原、凝固因子、酵素、ホルモンまたはホルモン変異体、受容体またはその一部、調節蛋白質、構造蛋白質、レポーター、あるいは血清アルブミン、たとえばウシ血清アルブミンおよびヒト血清アルブミン等、またはトランスフェリン、たとえばラクトフェリン等の、輸送蛋白質、分泌過程に関与する蛋白質、折り畳み過程に関与する蛋白質、シャペロン、ペプチドアミノ酸輸送体、グリコシル化因子、転写因子、合成ペプチドまたはオリゴペプチド、その天然型が細胞内蛋白質であり、かつシグナルペプチドへの融合およびその天然型で既に分泌されているポリペプチドへの融合等の、当該技術分野で周知の方法により分泌される蛋白質であってもよい。このような細胞内蛋白質は、プロテアーゼ、セラミダーゼ類、エポキシド加水分解酵素、アミノペプチダーゼ、アシラーゼ類、アルドラーゼ、ヒドロキシラーゼ、アミノペプチダーゼ、リパーゼ等の酵素であってもよい。ポリペプチドは、その天然型で細胞外に分泌される酵素であってもよい。このような酵素は、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼの群に属してもよい。酵素は、カルボヒドラーゼ、たとえばエンドグルカナーゼ類、β−グルカナーゼ類、セロビオヒドロラーゼ類またはβ−グルコシダーゼ類等のセルラーゼ類、ヘミセルラーゼ類、あるいはペクチン分解酵素、たとえばキシラナーゼ類、キシロシダーゼ類、マンナナーゼ類、ガラクタナーゼ類、ガラクトシダーゼ類、ペクチンメチルエステラーゼ類、ペクチンリアーゼ類、ペクチン酸リアーゼ類、エンドポリガラクツロナーゼ類、エキソポリガラクツロナーゼ類、ラムノガラクツロナーゼ類、アラバナーゼ類、アラビノフラノシダーゼ類、アラビノキシラン加水分解酵素、ガラクツロナーゼ類、リアーゼ類、またはアミロース分解酵素等；加水分解酵素、イソメラーゼ、またはリガーゼ、フィターゼ等のホスファターゼ類、リパーゼ等のエステラーゼ類、蛋白分解酵素、オキシダーゼ類、トランスフェラーゼ類、またはイソメラーゼ類等の酸化還元酵素であってもよい。酵素は、フィターゼであってもよい。酵素は、アミノペプチダーゼ、アスパラギナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンド−プロテアーゼ、メタロ−プロテアーゼ、セリン−プロテアーゼカタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロパーオキシダーゼ、蛋白質デアミナーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ミュータナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはグルコースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼであってもよい。分泌が改良されるポリペプチドは、宿主細胞と相同であっても異種であってもよい。相同ポリペプチドの好適な例は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）にクローニングされて産生される、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）蛋白質である。異種発現の好適な例としては、糸状菌または酵母にクローニングされて産生される、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来の細菌ポリペプチド、または、糸状菌または酵母にクローニングされて産生される、たとえばウシまたはヤギ由来の哺乳類蛋白質、または酵母にクローニングされて産生される糸状菌ポリペプチド、あるいは、別の真菌にクローニングされて産生される、糸状菌蛋白質などがある。好ましくは、ポリペプチド類をコード化する核酸は、たとえばコドン対最適化により、関連宿主細胞における発現用に最適化される。コドン対最適化は、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列の改良された発現および／またはコード化されたポリペプチドの改良された産生を得るために、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を、それらのコドン使用、特に使用されるコドン対に関して、修飾しておく方法である。コドン対は、コード配列における、一組の、２つの後続するトリプレット（コドン）と定義される。コドン対最適化は、好ましくは国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに記載の通りに実施される。
【００２１】
好ましくは、修飾されたポリペプチドの特異性は、分泌の改良前と実質的に同じである。これは、たとえば基質特異性または結合特異性が実質的に保持されることを意味する。本明細書の文脈では、用語「実質的に保持される」は、特異性の６０％超、６５％超、７０％超または７５％超が保持されることを意味する。好ましくは、特異性の８０％超、８５％または９０％が保持される。最も好ましくは、特異性の９５％超、９６％、９７％、９８％または９９％が保持される。
【００２２】
本発明の方法によれば、改良された分泌の指標である、細胞外培地中の活性レベルは上昇する。しかし、修飾されたポリペプチドの比活性は、低下しない限り、上昇しなくてもよい。したがって、比活性は、好ましくは分泌の改良前と実質的に同じか、それより高い。好ましい実施形態では、比活性は、改良前と実質的に同じである。本明細書の文脈では、「実施的に同レベルの活性」という表現は、親ポリペプチドの活性レベルと、１５％未満、好ましくは１２％未満または１０％未満、より好ましくは８％未満、６％未満または４％未満異なる活性レベルを指す。
【００２３】
本明細書の文脈では、用語「ポリペプチド」および蛋白質」は、互換的に使用される。本発明の方法により、あらゆるタイプのポリペプチドが、その分泌を改良することが可能である。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に前述したリストの１つである。
【００２４】
本発明の方法によれば、真核生物宿主における１つまたは複数の蛋白質特性について最適範囲内に入るか、または最適値にもっと近づくように、アミノ酸主鎖における一組の関連する蛋白質特性値が修飾される。
【００２５】
修飾されたポリペプチドとリファレンスポリペプチドとの間の蛋白質特性の変化量は、相対的改良（ＲＩ）および正規化相対的改良（ＲＩＮ）という２つの方法で定義することができる。
【００２６】
蛋白質特性のＲＩは、最適値からの蛋白質特性の絶対偏差（Ｄ）という観点で定義される：
ＲＩ＝（ＤＲＥＦ−ＤＰＦＯ）／ＤＲＥＦ，
ここで、Ｄ＝｜ＦＰＯＩ−Ｆ０ＰＴ｜、ＦＰＯＩは、対象蛋白質特性値であって、
リファレンスまたはＰＦＯのいずれかであり，ＦＯＰＴは最適特性値である。
ＲＩＮは、どの特性が実質的に重要であるかを理解するために、正規化偏差（ＤＮ）の観点で定義される。ＤＮは、特性値の上界（ＵＢ）および下界（ＬＢ）を考慮に入れる（表１参照）。
ＲＩＮ＝ＤＮ，ＲＥＦ−ＤＮ，ＰＦＯ，
ここで、ＦＰＯＩ＞ＦＯＰＴであれば、ＤＮ＝（ＦＰＯＩ−ＦＯＰＴ）／（ＵＢ−ＦＯＰＴ）
ＦＰＯＩ＜ＦＯＰＴであれば、ＤＮ＝（ＦＰＯＩ−ＦＯＰＴ）／（ＬＢ−ＦＯＰＴ）
【００２７】
本発明の方法によれば、修飾はポリペプチド主鎖に行われる。本明細書の文脈では、用語「主鎖」は、アミノ酸がペプチド結合を介して結合されて、共有結合した一連のアミノ酸を形成するとき、形成される正規構造を指す。本発明では、好ましくは、成熟ポリペプチドの主鎖が修飾される。本発明に関連して、「成熟ポリペプチド」は本明細書では、翻訳および何らかの翻訳後修飾、たとえばＮ−末端プロセシング、Ｃ−末端切断、グリコシル化、リン酸化等々の後に、その最終的な機能形であるポリペプチドとして定義される。修飾前のポリペプチドは、親ポリペプチドまたはリファレンスポリペプチドまたは野生型ポリペプチドと呼ばれ、それに由来する修飾されたポリペプチドと区別される。用語「親ポリペプチド」、「野生型ポリペプチド」および「リファレンス−ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用される。ポリペプチドがキメラポリペプチドであるとき、すなわち効率的に分泌されるポリペプチドとの、好ましくは宿主細胞に由来するポリペプチドとの、翻訳融合物であるとき、キメラポリペプチド全体を本発明に従って修飾することが可能である。キメラポリペプチドが、対象ポリペプチドに融合したリーダーポリペプチドとして効率的に分泌されるポリペプチドを含むとき、対象ポリペプチドは、好ましく修飾される。
【００２８】
当業者に周知の通り、成熟中のプロセシングエラーのため、成熟ポリペプチドのＮ−末端は、成熟ポリペプチドのＣ−末端と同様、異種であり得る可能性がある。特に、このようなプロセシングエラーは、ポリペプチドの過剰発現で起こり得る。加えて、エキソプロテアーゼ活性は、異質性を生じさせるかもしれない。異質性が起こる程度は、使用される宿主および発酵プリトコールによっても異なる。このようなＮ−末端およびＣ−末端プロセシング人工産物は、予想される成熟ポリペプチドと比較して、短いポリペプチド類または長いポリペプチド類をもたらすかもしれない。
【００２９】
本発明の一実施形態では、本方法は、
（ｉ）真核生物宿主における、１つまたは複数の蛋白質特性の最適範囲および最適値を決定するステップ、および
（ｉｉ）真核生物宿主における、一組の関連した蛋白質特性を決定するステップ（これらの関連した特性の１つまたは複数が、ポリペプチドのアミノ酸主鎖において修飾されるのであれば、その特性は、真核生物宿主によるポリペプチドの分泌を改良するであろう）、および
（ｉｉｉ）（ｉ）で決定されたように、最適範囲内に入るかまたは最適値により近づくように、関連した蛋白質特性値を修飾するステップ（ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は任意の順序で実施し得る）、
を含む。
【００３０】
任意の方法を使用して、一組の関連した特性を決定し得る。一実施形態では、ポリペプチドの分泌を改良するための、関連した一組の特性は下記の通りに決定される：
（ｉ）特定の真核生物宿主における適量の蛋白質の分泌レベルならびにこれらの蛋白質のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を含む、データセットＳの収集または作成。データセットＳは、分泌蛋白質（Ｓ＋）を含んでもよい。好ましくは、データセットＳはまた、非分泌蛋白質（Ｓ−）も含む。たとえば、全ての予測される分泌蛋白質をアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）で、発現させることができる（Ｔｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４６：Ｓ１５３−１６０）。分泌される蛋白質は、セットＳ＋に属するが、分泌されない蛋白質は、セットＳ−に属する。任意の方法を使用して、分泌レベルを測定し得る。あるいは、セットＳ−は、真核生物宿主における文献で周知の非分泌蛋白質を含んでもよい。Ｓにおける蛋白質は、真核生物宿主と相同であっても異種であってもよい。
（ｉｉ）データセットＳにおける全ての蛋白質についての、蛋白質特性（Ｆ）の計算。Ｆは、これらの蛋白質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の両者から誘導することが可能である；
（ｉｉｉ）適切に規定された分類子性能基準に従って、Ｓ＋とＳ−とを区別するために、統計分類子の最高の成果を与える、ｉｉ）で計算した蛋白質特性のサブセット（Ｆｓ）を選択するための統計的分類方法の使用。Ｆｓは、ＤＮＡ配列（Ｆｓ＿ＤＮＡ）およびアミノ酸配列（Ｆｓ＿ＡＡ）の両者から誘導され得る；
【００３１】
Ｆｓ＿ＡＡにおける蛋白質特性は、対応する真核生物宿主における蛋白質分泌を改良するための修飾についての関連する特徴である。
【００３２】
好ましくは、成熟ポリペプチドの主鎖は、本発明の方法に従って修飾されるため、蛋白質特性は、一組の成熟蛋白質から計算されることが好ましい。
【００３３】
当該技術分野で周知の、標準的統計的分類方法、たとえば、線形判別分類器（Ｌｉｎｅａｒ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ（ＬＤＣ））、二次判別分類器（Ｑｕａｄｒａｔｉｃ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ（ＱＤＣ））、最近傍平均分類器（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｍｅａｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ（ＮＭＣ））、１−／ｋ−最近傍分類器（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒｓ）、サポートベクターマシーンおよび決定木等々を使用することができる（Ｗｅｂｂ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，２ｎｄ ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ｓｏｎｓ）。このような方法を適用するとき、データセットＳは、学習データセットと確認データセットに分けることができ、また当該技術分野で周知の確認方式（たとえば、１０分割交差確認）を使用することが可能である。
【００３４】
当該技術分野で周知の任意の分類器性能測定、たとえば、特異性、感度、確度、精度および受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積を使用し得る。
【００３５】
任意の好適な方法を使用して、蛋白質特性の最適範囲または最適値を決定し得る。
【００３６】
一実施形態では、真核生物宿主の蛋白質特性の最適範囲または最適値は、以下の通りに決定される：
ｉ）特定の真核生物宿主における適量の蛋白質の分泌レベルならびにこれらの蛋白質のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を含む、データセットＳの収集または作成。データセットＳは、分泌蛋白質（Ｓ＋）を含んでもよい。好ましくは、データセットＳはまた、非分泌蛋白質（Ｓ−）も含む。たとえば、全ての予測される分泌白質をアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）で、発現させることができる（Ｔｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４６：Ｓ１５３−１６０）。分泌される蛋白質は、セットＳ＋に属するが、分泌されない蛋白質は、セットＳ−に属する。任意の方法を使用して、分泌レベルを測定し得る。あるいは、セットＳ−は、真核生物宿主における文献で周知の非分泌蛋白質を含んでもよい。Ｓにおける蛋白質は、真核生物宿主と相同であっても異種であってもよい。
ｉｉ）データセットＳにおける全ての蛋白質についての、蛋白質特性（Ｆ）の計算。Ｆは、これらの蛋白質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列から誘導され得る；
ｉｉｉ）対応する真核生物宿主の各特性についての最適値（Ｆ＿ｏｐｔ）の決定：最適値は、Ｓ＋から算出される各蛋白質特性の中心値を算出することによって得てもよい。任意の中心値、たとえば、幾何平均、調和平均、算術平均、トリム平均、最頻値および中央値を使用し得る。算出される中心値は、対応する真核生物宿主に関する特性の最適値である。あるいは、特性値の分布が、選択される確率分布によって十分に説明されるように、Ｓ＋から算出される各蛋白質特性に確率分布を合わせる。任意の確率分布を使用し得、たとえば正規分布、指数分布、または対数正規分布を使用し得る。確率分布の平均が、対応する真核生物宿主の特性の最適値である。
ｉｖ）対応する真核生物宿主について各特性の最適範囲の決定：分泌される蛋白質のみを含むＳ＋セットを考慮すると、蛋白質特性の最適範囲の下界は、Ｓ＋から算出される蛋白質特性の、０．３−、０．２−、０．１５または好ましくは０．１０−および０．０５−変位値に相当する値と定義される。ここで、値０．３、０．２、０．１５、等々は、累積確率を指す。特定の累積確率に相当する変位値は、任意の統計的方法で、たとえば、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｔｏｏｌｂｏｘ，Ｍａｔｌａｂ Ｒ２００７ａ（Ｔｈｅ Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ）の分位関数を使用して、算出し得る。蛋白質特性の最適範囲の上界は、Ｓ＋から算出される蛋白質特性の、０．７−、０．８−、０．８５または好ましくは０．９０−および０．９５−変位値に相当する値と定義される。あるいは、分泌蛋白質および非分泌蛋白質の両方を含む全データセットＳを考慮すると、蛋白質特性の最適範囲の下界は、それより下の値ではＳにおける蛋白質の７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％または９５％が分泌されない低い蛋白質特性の値として定義してもよい；蛋白質特性の最適範囲の上界は、それより上の値ではＳにおける蛋白質の７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％または９５％が分泌されない蛋白質特性値として定義される。
【００３７】
関連特性および最適範囲および最適値のセットは、宿主細胞ごとに異なるであろう。アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の場合、蛋白質分泌を増加するために修飾されるべき関連蛋白質特性（Ｆｓ＿ＡＡ）としては、塩基性アミノ酸頻度、極性アミノ酸頻度、非極性アミノ酸頻度、微小アミノ酸頻度、小アミノ酸頻度、帯電アミノ酸頻度、正味荷電（ｐＨ７．２における）、等電点、アスパラギン、アルギニン、イソロイシン、システイン、ヒスチジン、グルタミン、バリン、リシン、グリシン、トレオニンおよびロイシンの頻度、ターン（Ｇａｒｎｉｅｒにより算出）、ＥＰＥＳＴＦＩＮＤにより算出されるＰＥＳＴモチーフ、ｐｌの局所特性（ＬＦ）値、特にＬＦ１およびＬＦ６、ＧｒａｖｙスコアのＬＦ値、特にＬＦ２およびＬＦ４、アロマスコアのＬＦ値、特にＬＦ３、ＬＦ４およびＬＦ６、原子組成ｗ．ｒ．ｔ．イオウ（Ｓ）および局在化特性（たとえば、ＭｕｌｔｉＬｏｃ 局在化予測ツールで予測される）などが挙げられるが、その限りではない。
【００３８】
正味荷電は、陽子の電荷と同じ単位を有する。長さ当たりの正味電荷／正味正電荷／正味負電荷／全電荷は、陽子の電荷と同じ単位を有するが、ポリペプチドの長さに正規化される。
【００３９】
ポリペプチドの正味荷電は、本明細書では、全てのアミノ酸が溶媒に完全に露出しており、隣接したペプチド類は、所与のアミノ酸のｐＫに影響を及ぼさず、また構成アミノ酸は、Ｎ末端およびＣ末端と同様、未修飾であると仮定して、推定される。様々なプログラムを使用して、たとえば、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｔｏｏｌｂｏｘ ｏｆ Ｍａｔｌａｂ（バージョンＲ２００８ｂ）の「等電」機能を使用して、またはｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／で入手可能な、ＥＭＢＯＳＳ Ｅｘｐｌｏｒｅｒの「蛋白質統計学（ｐｅｐｓｔａｔｓ）」機能を使用して、特定のｐＨにおけるポリペプチドの正味電荷を算出することができる（初期値ｐＨ＝７．２による）。
【００４０】
長さ当たりの正味荷電は、本明細書では、ポリペプチドの長さで割ったポリペプチドの正味荷電と定義される。
【００４１】
長さ当たりの正味正電荷は、本明細書では、ｐＨ７．２における、ポリペプチドのＮ−末端ならびに全てのリシン残基、アルギニン残基およびヒスチジン残基の部分電荷を合計することによって算出される、ポリペプチドの正味正電荷と定義される。長さ当たりの正味正電荷は、ポリペプチドの正味正電荷をポリペプチドの長さで割ることにより決定される。
【００４２】
長さ当たりの正味負電荷は、本明細書では、ｐＨ７．２における、ポリペプチドのＣ−末端ならびに全てのアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、システイン残基およびチロシン残基の部分電荷を合計することによって算出される、ポリペプチドの正味負電荷と定義される。長さ当たりの正味負電荷は、ポリペプチドの正味負電荷をポリペプチドの長さで割ることにより決定される。
【００４３】
長さ当たりの全電荷は、本明細書では、ポリペプチドの正味陽性電荷（正の数）をポリペプチドの正味負電荷（負の数）だけ減算することにより算出される、ポリペプチドの全電荷と定義される。長さ当たりの全電荷は、ポリペプチドの全電荷をポリペプチドの長さで割ることにより決定される。
【００４４】
グレイビー・スコア（ｇｒａｖｙ ｓｃｏｒｅ）は、本明細書では、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）により定義された通り、ポリペプチドの疎水性親水性指数と定義される。各アミノ酸は、４．６と−４．６の間の疎水性スコアを有する。４．６は、最も疎水性の蛋白質に割り当てられ、また−４．６は最も親水性の蛋白質に割り当てられる。ポリペプチドのＧＲＡＶＹスコアは、好ましくは、Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）．Ｋｙｔｅ，Ｊ．ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．１９８２蛋白質の疎水性親水性特徴を表示する簡単な方法（Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ．）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２．に従って決定される。
【００４５】
ポリペプチドのアロマスコアは、本明細書では、ポリペプチド中の３つの芳香族アミノ酸、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの頻度を合計することにより算出される。
【００４６】
脂肪族指数は、本明細書では、脂肪族側鎖によって占められる相対体積と定義される。ポリペプチドの脂肪族指数（ＡＩ）は、Ｉｋａｉの式（１９８０）：ＡＩ＝ｆ＿Ａｌａ＋ａｆ＿Ｖａｌ＋ｂ（ｆ＿Ｉｌｅ＋ｆ＿Ｌｅｕ）に従って算出される。アミノ酸類アラニン、バリン、イソロイシンおよびロイシンは、脂肪族側鎖を有する。
ここで、ａはバリン側鎖の相対体積であり（ａ＝２．９）、ｂはロイシンおよびイソロイシン側鎖の相対体積である（ｂ＝３．９）。ｆ＿Ａｌａ、ｆ＿Ｖａｌ、ｆ＿Ｉｌｅおよびｆ＿Ｌｅｕは、それぞれ、ポリペプチド中の、アラニン、バリン、イソロイシンおよびロイシンの頻度である。Ｉｋａｉ，Ａ．Ｊ．１９８０球状蛋白質の熱安定性および脂肪族指数（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｌｉｐｈａｔｉｃ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８８：１８９５−１８９８。）
【００４７】
ＧＲＡＶＹおよび脂肪族について、ＥｘＰＡＳｙサーバー上の蛋白質同定および分析ツール（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓ ｏｎ ｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ Ｓｅｒｖｅｒ；Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ Ｅ．，Ｈｏｏｇｌａｎｄ Ｃ．，Ｇａｔｔｉｋｅｒ Ａ．，Ｄｕｖａｕｄ Ｓ．，Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｍ．Ｒ．，Ａｐｐｅｌ Ｒ．Ｄ．，Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ．；（Ｉｎ）Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ（ｅｄ）：Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）．ｐｐ．５７１−６０７．も参照することができるであろう。
【００４８】
理化学的特性に基づくアミノ酸の種類：
酸性：Ｄ，Ｅ
脂肪族：Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｖ
芳香族：Ｆ，Ｗ，Ｙ
塩基性：Ｈ，Ｋ，Ｒ
帯電：Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｋ，Ｒ
非極性：Ａ，Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｖ，Ｗ，Ｙ
極性：Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｋ，Ｎ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ
小：Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｇ，Ｎ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｖ
微小：Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｓ，Ｇ
【００４９】
配列中の単一要素の組成に基づく特性は、要素ｉの頻度ｆｉから算出される。頻度と割合は、本明細書では、互換的に使用される。頻度は、配列中の要素総数で割った、要素ｉが配列中に出現する回数と定義される。配列中の単一要素、たとえばアミノ酸を、多重要素たとえば、微小、酸性に結合することができる。
【００５０】
ポリペプチド内のアミノ酸残基の表面接触性は、当該技術分野で周知の任意の方法で決定し得る。
【００５１】
ポリペプチドが実験的に解明される構造を有する場合、溶媒接触表面積（ＡＳＡ）は、Å２で与えられ、またその面積は、蛋白質表面上を、水分子大の球を回転させることによって算出することができる［１］。次いで、ＡＳＡを相対表面積（ＲＳＡ）に変換するが、これは、グリシン［２］またはアラニン［３］と並んだトリペプチドの中央の残基の最大可能露出と比較した、ポリペプチド鎖中の所与のアミノ酸残基のＡＳＡとして算出される。閾値アルファより大きいＲＳＡ（ＲＳＡ＞＝アルファ、０＜＝アルファ＜＝１）を有する残基は、露出していると言われ、閾値ベータ未満のＲＳＡ（ＲＳＡ＜＝アルファ、０＜＝ベータ＜＝１）を有する残基は、埋没していると言われる。好ましくは、アルファ＞＝０．２５、より好ましくはアルファ＝０．２５である。好ましくはベータ＜＝０．２５、より好ましくはベータ＝０．２５である。
【００５２】
ポリペプチドの構造を入手できなければ、表面接触性は、ポリペプチドのアミノ酸配列からも予測することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列から表面接触性を予測するために、様々な方法を文献で入手することができ、たとえば［３］、［４］、［５］および［６］に記載されている。好ましくは、ＲＳＡは、［４］に記載されているいわゆるＮｅｔＳｕｒｆＰ法を使用して予測され、これはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＳｕｒｆＰ／でオンラインアクセスすることができる。このアプリケーションで、表面接触性は、成熟蛋白質のアミノ酸配列から予測される。露出した残基および埋没した残基の定義は、前述と同じである。
［１］Ｃｏｎｎｏｌｌｙ Ｍ：分析的分子表面計算（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ．）。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ １９８３，１６（５）：５４８−５５８．
［２］Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ：蛋白質における接触可能表面および埋没表面の性質（Ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ａｎｄ ｂｕｒｉｅｄ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）。Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９７６，１０５（１）：１−１２．
［３］Ａｈｍａｄ Ｓ，Ｇｒｏｍｉｈａ ＭＭ，Ｓａｒａｉ Ａ：アミノ酸配列からの溶媒接触可能性の実数値予測（Ｒｅａｌ ｖａｌｕｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．）。Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２００３，５０（４）：６２９−６３５．
［４］Ｂｅｎｔ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ：溶媒接触性予測に適用される信頼性スコアの包括的割り当て方法（Ａ ｇｅｎｅｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ．）。ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００９，９：５１．
［５］Ｄｏｒ Ｏ，Ｚｈｏｕ Ｙ：Ｒｅａｌ−ＳＰＩＮＥ：蛋白質構造特性の実数値予測のための神経回路網の集積システム（ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｆｏｒ ｒｅａｌ−ｖａｌｕｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．）。Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２００７，６８（１）：７６−８１．
［６］Ｆａｒａｇｇｉ Ｅ，Ｘｕｅ Ｂ，Ｚｈｏｕ Ｙ：二層神経回路網を介した指導学習による蛋白質の残基溶媒接触可能性および実数値主鎖ねじれ角の予測確度を改良すること（Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅ ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅａｌ−ｖａｌｕｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｔｏｒｓｉｏｎ ａｎｇｌｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｇｕｉｄｅｄ−ｌｅａｒｎｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｔｗｏ−ｌａｙｅｒ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ．）。Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２００９，７４（４）：８４７−８５６．
【００５３】
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の最適値および最適範囲を表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
【表２】
【００５６】
表１において、全蛋白質配列から計算される全ての特性は、全蛋白質の長さに基づく。成熟蛋白質配列、露出残基および埋没残基から計算される全ての特性は、成熟蛋白質の長さに基づく。
【００５７】
好ましくは、最適値および範囲特性は、表２から選択される；これらの特性は、一次特性と言われ、その他の特性、すなわち、表２にない表１の特性は、二次特性である。
【００５８】
【表３】
【００５９】
クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）について、好ましい一次特性を表３に示す。
【００６０】
【表４】
【００６１】
別の実施形態では、ポリペプチドの分泌は、下記のステップで改良される：
ｉ）ポリペプチドの蛋白質特性を計算するステップ、
ｉｉ）ポリペプチドの１つまたは複数の蛋白質特性が、最適範囲外であるか、または真核生物宿主の最適値から実質的に逸脱しているかどうかを決定するステップ（ここで、実質的逸脱は、最適値から２０％、３０％、４０％または５０％超の差と定義される）、
ｉｉｉ）ポリペプチドの１つまたは複数のＦｓ＿ＡＡの値が、最適範囲内に入るか、または適量だけ、最適値に向けて移行するように、好ましくはポリペプチドの蛋白質特性と、蛋白質特性の最適値との差が、１０％、１５％、２０％、または３０％超、減少するように、ポリペプチドのアミノ酸配列を合理的に変えるステップ。
【００６２】
好ましくは、２つ、３つ、４つまたは５つの蛋白質特性が一緒に修飾され、さらに好ましくは、１０超、１５または２０の蛋白質特性が一緒に組み合わせて修飾される。最も好ましくは、２５超または３０の蛋白質特性が一緒に修飾される。
【００６３】
好ましくは、最適範囲は、表１から選ばれ、さらに好ましくは最適範囲は、表２から選ばれる。あるいは、最適範囲は表３から選ばれる。
【００６４】
上記ステップｉｉｉ）で、ポリペプチドのアミノ酸配列は、当該技術分野で周知の任意の方法で合理的に変えし得る。たとえば、これは、：
（ｉ）相同配列を検索するステップ；
（ｉｉ）相同配列を、対象配列と配列比較するステップ；
（ｉｉｉ）蛋白質機能的特性に重要なアミノ酸類を同定するステップ；
（ｉｖ）機能的特性を保持しながら、所望のアミノ酸配列特性を導入する；
（ｖｉ）所与の宿主に最適なコドンを使用して、最終的な修飾された配列を遺伝子に翻訳するステップ；
（ｖｉｉ）宿主における、再設計されたポリペプチドのクローニングおよび発現
によって達成するステップが可能である。
【００６５】
好ましくは、アミノ酸主鎖のアミノ酸類の少なくとも５％が修飾され、より好ましくは、アミノ酸主鎖のアミノ酸類の少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２０％が修飾される。
【００６６】
好ましくは、アミノ酸主鎖の少なくとも５つのアミノ酸類が修飾され、より好ましくはアミノ酸主鎖の少なくとも１０のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも１５のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも２０のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも２５のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも３０のアミノ酸類が修飾される。
【００６７】
好ましくは、本発明によれば、一次特性は改良されるが、二次特性は特定の境界内に保たれる。したがって、総体的な最適性スコアＦは、全ｎ個の一次特性および全ｍ個の二次特性のＤＮ値に基づいて規定される：
【数１】
【００６８】
ηは、０と１の間で０および１を含む（０≦η≦１）の重み係数である。好ましくはη＜０．５、より好ましくはη≦０．４、最も好ましくはη＝０．３である。ρは、１と５の間で１および５を含み（１≦ｐ≦５）、好ましくはρ＝２である（Ｆは、このとき、ユークリッド距離を表す）。好ましくは、η＝０．３およびρ＝２である。好ましくは、野生型リファレンス蛋白質に関して、少なくとも５％のＦ−スコアの改良が達成され、より好ましくは少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２０％およびさらにより好ましくは少なくとも３０％の改良が達成される。
【００６９】
好ましくは、少なくとも２、３、４、または５つの特性が修飾され、より好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは少なくとも１５、さらにより好ましくは少なくとも２０、さらにより好ましくは少なくとも２５、およびさらにより好ましくは少なくとも３０の特性が修飾される。好ましくは、少なくとも２、３、４、または５つの特性が改良され、より好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは少なくとも１５、さらにより好ましくは少なくとも２０、さらにより好ましくは少なくとも２５、およびさらにより好ましくは少なくとも３０の特性が改良されるが、好ましくは、１０未満、さらにより好ましくは５未満、さらにより好ましくは４未満、の特性が悪化する。好ましくは、その特性は一次特性である。
【００７０】
相同配列は、好ましくは、適切な配列データベースのＢＬＡＳＴ検索を実施することにより、検索される。相同配列は、対象配列と好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５、％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。最も好ましくは、相同配列は、対象配列と好ましくは約５０％の同一性を有する。当業者は、幾つかの異なるコンピュータープログラムを利用して、２つの配列を並べて２つの配列間の相同性を決定できることを知るであろう（Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（ｅｄ．）中のＫｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）配列比較の概説（Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）、タイムワープ、文字列編集および巨大分子：配列比較の理論と実際（Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ），ｐｐ．１−４４ＡｄｄｉｓｏｎＷｅｓｌｅｙ）。当該技術分野で周知の任意の方法を配列比較に使用し得る。２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、たとえば２配列のアラインメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して、決定することが可能である（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）。
【００７１】
対象必須機能特性に重要なアミノ酸類を同定する方法は、当該技術分野で周知である。好適なツールは、対象蛋白質の３Ｄ構造または３Ｄモデルの使用、対象蛋白質または相同蛋白質の突然変異誘発試験、機能的に中性の置換と機能的置換を確立するためのサイト飽和ライブラリーの使用を含む。
【００７２】
アミノ酸配列特性を導入するとき、置換は好ましくは、所与の位置に、所要のアミノ酸配列特徴とより多く一致するアミノ酸が相同配列に見られるアミノ酸群から選択される方法で選択される。最新のモデリング技法を使用して、天然の相同体には見られない許容可能な置換を同定することが可能である。所与の折り畳みを採用する新しい配列の生成を許容するモデリング技法に好ましいリファレンスは以下の通りである：
Ｋｕｈｌｍａｎ Ｂ，Ｄａｎｔａｓ Ｇ，Ｉｒｅｔｏｎ ＧＣ，Ｖａｒａｎｉ Ｇ，Ｓｔｏｄｄａｒｄ ＢＬ，Ｂａｋｅｒ Ｄ（２００３）。原子レベルの確度を有する新規な球状蛋白質折り畳みの設計（Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄ ｗｉｔｈ ａｔｏｍｉｃ−ｌｅｖｅｌ ａｃｃｕｒａｃｙ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２，１３６４−８。
Ｂａｋｅｒ Ｄ（２００６）。巨大分子構造および相互作用の予測および設計（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．）。Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．，Ｂ，Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３６１，４５９−６３デノボ蛋白質設計：完全自動化配列選択に向けて（Ｄｅ Ｎｏｖｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｏｗａｒｄｓ ｆｕｌｌｙ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ’） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３巻４号，１９９７年１１月７日，７８９−７９６ページ Ｂａｓｓｉｌ Ｉ．Ｄａｈｉｙａｔ，Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ａ．Ｓａｒｉｓｋｙ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｌ．Ｍａｙｏ
【００７３】
最新の計算方法は、所与の蛋白質折り畳みを採用することが可能な多数の潜在的配列の生成を許容する。最適な配列を取り出すために使用されるスコアリング機能に特性最適化を導入することによって、所与の産生宿主に最適な配列が、計算による方法で選択され得る。
【００７４】
本発明の方法に従って修飾することが可能な蛋白質特性としては、組成特性、生理特性および構造特性などがある。このような特性の好適な例は、アミノ酸の数、分子量、等電点、特定のｐＨにおける正味荷電、ＧＲＡＶＹスコア、脂肪族指数、不安定指数、組成的特性、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ原子に関する原子組成、アミノ酸頻度、ジペプチド頻度、トリペプチド頻度、酸性アミノ酸頻度、脂肪族アミノ酸頻度、芳香族アミノ酸頻度、塩基性アミノ酸頻度、グリコシル化パターンおよび帯電アミノ酸頻度ならびに表１に記載の特性である。修飾される特性の組合せも、本発明に包含される。好ましくは２、３、４または５つの蛋白質特性が、一緒に修飾される。より好ましくは、１０超、１５または２０の蛋白質特性が一緒に修飾される。最も好ましくは、２５超または３０の蛋白質特性が一緒に修飾される。
【００７５】
本発明の一実施形態では、１つまたは複数のグリコシル化部位が導入され、他の蛋白質特性も修飾される。本発明の別の実施形態では、帯電アミノ酸頻度が修飾され、他の蛋白質特性も修飾される。本発明の別の実施形態では、極性アミノ酸頻度が修飾され、他の蛋白質特性も修飾される。
【００７６】
アミノ酸全体またはＤＮＡ配列から計算される蛋白質特性は、蛋白質全体の平均値であり、これから、局所的蛋白質特性が明らかにならない可能性がある。たとえば、ある蛋白質は平均すると親水性であるが、それでも大きな内部疎水性領域を含むこともあり得る。局所的蛋白質特性は、たとえば、Ｂｅｎｉｔａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｅｎｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，５：１５６７−１５８０）により略述されている方法を用いて、アミノ酸またはＤＮＡ配列から計算することができる。
【００７７】
ある蛋白質特性の局所特性を計算するために、適当な数のアミノ酸またはヌクレオチドのスライディングウィンドウで、蛋白質特性を局所的に計算することが可能である。次いで、図９に図示する通り、得られた値を、蛋白質のアミノ酸またはＤＮＡ配列の長さに沿った曲線としてプロットする。
【００７８】
【表５】
【００７９】
たとえば、ＬＦ１は図１における暗灰色の面積に相当し、ＬＦ２は図１における明灰色の面積に相当する。その面積は、台形法を使用して算出することができる（Ｂｅｎｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，５：１５６７−１５８０）。局所的特性を計算するために、好適な上限および下限、ならびにスライディングウィンドウの大きさを選択することができる。スライディングウィンドウは、任意のサイズのものであってもよい。たとえば、２１アミノ酸または塩基対のスライディングウィンドウサイズを使用することができる。上限および下限の値は、曲線における極値ピークを反映するように選択することができる。たとえば、より高い上限は、低いものより多い極値ピークを考慮に入れる。好ましくは、上限および下限は、データセットＳ＋およびＳ−のＦｉｓｃｈｅｒ基準を最大化するように選択される。Ｆｉｓｃｈｅｒ基準（ＪＦ）は以下の通りに定義される：
【数２】
ここでμｓ−およびμｓ＋は、それぞれＳ−およびＳ＋のセットから計算される局所的特性値の平均値を表し、σ２ｓ−およびσ２ｓ＋は、それぞれＳ−およびＳ＋のセットから計算される局所的特性値の分散を表す。
【００８０】
上で定義した局所的特徴は、任意の蛋白質特性、たとえばＧｒａｖｙスコア、アロマスコアおよび等電点について算出し得る。
【００８１】
首尾よく分泌された蛋白質の配列から誘導できる特性に加えて、特に、標的蛋白質の溶媒接触表面の親水性が上昇すると、細胞から分泌された可溶性蛋白質の増量に大きく成功することが確認された。より詳細には、発現が増加するのみならず、有意に多い蛋白質が、バイオマスまたは他の不溶性物質に付着していない可溶形で、ブロス中に蓄積した。改良された表面親水性を有する蛋白質が与えられれば、いずれも有意により高い分泌で回収することが可能であろう。バイオマスを（濾過または遠心分離によって）除去すると、産生された蛋白質の大部分は濾液中または上澄中にそのまま残る。
【００８２】
親水性の上昇は、
・非極性アミノ酸類を、より極性のアミノ酸類に代えること
・より低極性のアミノ酸類を、より極性のアミノ酸類に代えること
・極性アミノ酸類を帯電アミノ酸類に代えること
によって行うことができる。
【００８３】
より極性のアミノ酸類または帯電アミノ酸類の数を増加させることにより親水性を上昇させることは、アミノ酸組成を変えることになり、したがって分泌を増加するために適合させることができる組成特性として考えることができる。
【００８４】
非極性アミノ酸類は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｃ、Ｍ、Ｆ群から選択される。アミノ酸類Ｇ、Ｐ、Ｙ、Ｗは、極性状況下では非極性として考えることができ、また非極性状況下では極性として考えることができる。より極性の残基は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｒ、Ｋ群から選択される。帯電した残基は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｒ、Ｋ群から選択される。酸性または負に帯電した残基は、Ｅ、Ｄから選択される。塩基性または正に帯電した残基は、Ｈ、Ｋ、Ｒから選択される。極性用比較尺度を使用すると：［Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｃ］＜［Ｇ、Ｐ、Ｙ、Ｗ］＜［Ｓ、Ｔ］＜［Ｎ、Ｑ、Ｈ］＜［Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ］。
【００８５】
極めて疎水性の表面領域は、産生宿主における高い産生ストレス、宿主における蛋白質の蓄積、および分泌妨害または無分泌をもたらす、望ましくない凝集またはバイオマスへの望ましくない固着を招く傾向があることが分かっている。総体的親水性を上昇させる置換は、特にこれらの残基が溶媒接触残基（＝蛋白質表面残基）を含むとき、分泌改良に非常に有効であることが認められている。より詳細には、接触表面領域において、非極性残基をより極性の残基で置換するとき、極性残基の割合は、組成特性分析の上方境界で定められる極性残基の割合を上回る可能性さえあることが認められている。標的蛋白質の配列特性と宿主要件との非適合性は、標的蛋白質の親水性を上昇させることによって、より詳細には、正と負の電荷が表面全体に一様に分布して、正または負の電荷のホットスポットを防ぐように分布させた追加的電荷を導入することにより、補償することが可能である。
【００８６】
特定のアミノ酸配列が与えられれば、幾つかの予測ツールは、どのアミノ酸が表面上にありそうかを予測するために使用できるが、溶媒接触非極性パッチまたは疎水性パッチを予測することが必要なとき、これらのツールの性能は全く貧弱である。したがって、蛋白質接触表面の親水性を調節するためには、３Ｄ構造または３Ｄ構造モデルが必要である。蛋白質の３Ｄ構造は、Ｘ線結晶学によって、およびＮＭＲによって、決定することができる。加えて、比較モデリングまたは鋳型に基づくモデリングを使用して、相同蛋白質の３Ｄ構造に基づく所与の配列のための信頼できる３Ｄモデルを構築することが可能である（ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）。比較モデリングのための様々なサーバーおよびソフトウェアパッケージは：ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅでみつかる。
【００８７】
蛋白質構造予測およびモデリングに関する最近の総説については、Ｙａｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００８，１８：３４２−３４８を参照されたい。
【００８８】
３Ｄ構造または３Ｄモデルの原子座標が与えられれば、当該技術分野で周知の方法により、接触表面を算出することができる。よく知られた方法は、Ｆｒｅｄｅｒｉｃ Ｒｉｃｈａｒｄｓにより開発されたローリングボールアルゴリズムによる算出である（１９７７，「面積、体積、充填および蛋白質構造（Ａｒｅａｓ，ｖｏｌｕｍｅｓ，ｐａｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．）」、ＡｎｎｕＲｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｅｎｇ，６：１５１−１７６）。ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａも参照されたい。
【００８９】
接触表面を決定するためには、置換が多量体（たとえば二量体、三量体、四量体等々）における個々のポリペプチド（モノマー）間の相互作用を妨害するのを回避するために、最終的な成熟蛋白質の四次構造を考えるべきである。
【００９０】
表面変調は、下記を含む：
・適切な分泌および回収を妨げかねない、潜在的な粘着性のパッチを生じさせる溶媒から、非極性残基が接触される領域をスポットすること。
・機能的役割を果たす領域、たとえば活性部位全般を、そしてより具体的には基質、共基質およびコファクター用の結合ポケットを除外すること。
・非極性残基を、帯電残基も含む、より極性の残基で置換すること。
・極性残基を、より極性の残基または帯電残基で置換すること。
・高い負電荷を有する領域または高い正電荷を有する領域を回避するために、帯電残基を再分布させること。
・疎水性表面パッチを置換する代わりに、非極性領域の近くにグリコシル化を導入することにより、このような領域を遮蔽することも可能である。
【００９１】
一次構造の場合、上昇した親水性は、たとえば下表のように修飾の前後の極性残基の数を比較することによって表される。
【００９２】
【表６】
【００９３】
接触表面を考えるとき、様々な極性アミノ酸の寄与は、総接触表面に対する、ある特定のアミノ酸またはある特定のアミノ酸群により形成される接触表面の割合として表現することができる。たとえば、帯電残基の総接触表面を算出して、総接触表面積と比較することができる。全ての極性残基を考えることにより、極性接触表面を算出することができる。蛋白質表面の親水性は、非極性表面を犠牲にして極性表面の割合が増加するとき、上昇すると言われる。
【００９４】
原則として、グリコシル化を導入し、そのグリコシル化によって遮蔽される領域を推定することもできる。電荷の分布は、視覚的検査を含む任意の利用可能な方法で行い得る。
一実施形態では、改良された分泌のために修飾すべき特性は、表面電荷（再）分布、表面極性−非極性分布、配列モチーフ、たとえばグリコシル化、またはこれらの組合せである。１つの特性、たとえばアミノ酸の修飾は、多くの場合、別の特性の修飾、たとえばＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ原子に関して原子組成の修飾を、もたらすことを当業者は理解するであろう。
【００９５】
本発明による方法は、蛋白質産生レベルを高めるための最新の技法と、またはこれらの技法の１つまたは複数の組み合わせと、都合よく組み合わせられることを理解されたい。これらは、強力プロモーター類、コピー数の増加、最適Ｋｏｚａｋ配列、ｍＲＮＡ安定要素および最適化コドン使用の適用を含むが、その限りではない（国際公開２００８／０００６３２号パンフレット）。
【００９６】
［実施例］
［菌株］
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株：ＷＴ １：このアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株を、野生型菌株として使用した。この菌株は、寄託番号ＣＢＳ ５１３．８８．で、ＣＢＳ研究所（ＣＢＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に寄託される。
ＷＴ ２：このアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株は、グルコアミラーゼをコード化する遺伝子（ｇｌａＡ）の欠失を含むＷＴ １菌株である。ＷＴ ２は、欧州特許出願公開第０ ６３５ ５７４ Ｂ１号明細書に記載の「ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ」アプローチを使用して構築した。この特許では、ＣＢＳ ５１３．８８のゲノム中のｇｌａＡ特異的ＤＮＡ配列の削除方法が詳細に説明されている。この手順は、最終的に外来ＤＮＡ配列を全く持たない、ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ ΔｇｌａＡ組換えアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８菌株をもたらした。
ＷＴ ３：ＷＴ ２における主要な細胞外アスパラギン酸プロテアーゼＰｅｐＡをコード化しているｐｅｐＡ遺伝子を中断するために、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｍｂｅｒｇｈらにより記述されている通り、ＷＴ ２のゲノム中のｐｅｐＡ特異的ＤＮＡ配列を削除した（ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｍｂｅｒｇｈ ＪＰ，Ｓｏｌｌｅｗｉｊｎ Ｇｅｌｐｋｅ ＭＤ，ｖａｎ ｄｅ Ｖｏｎｄｅｒｖｏｏｒｔ ＰＪ，Ｂｕｘｔｏｎ ＦＰ，Ｖｉｓｓｅｒ Ｊ．（１９９７）−アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）における３つの酸プロテアーゼの破壊−プロテアーゼスペクトル、細胞内蛋白質分解、および標的蛋白質の分解に及ぼす影響−Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７（２）：６０５−１３）。この手順は、ＷＴ ２菌株バックグラウンドに不活性化されたｐｅｐＡ遺伝子を有する、ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ ＷＴ ３菌株をもたらした。
ＷＴ ４：ＷＴ ３中のｈｄｆＡ遺伝子を削除するために、先に、国際公開第０５／０９５６２４号パンフレットに詳細に記載されている方法を使用して、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ４（ΔｇｌａＡ，ΔｐｅｐＡ，ΔｈｄｆＡ）を作成した。
ＷＴ ５：このアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株は、シュウ酸欠損アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株をもたらす欠失を含むＷＴ ４菌株である。ＷＴ ５は、欧州特許出願公開第１１５７１００号明細書および米国特許第６，９３６，４３８号明細書に記載の方法を使用することによって構築され、その中では、オキサロ酢酸加水分解酵素をコード化するｏａｈＡ遺伝子の欠失によってシュウ酸欠損菌株が得られ、菌株ＷＴ ５は、ＷＴ ４菌株バックグラウンドに不活性化されたｏａｈＡ遺伝子を有する代表的な菌株として選択された。
ＷＴ ６：このアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株は、後続する３ステップで、アルファ−アミラーゼ類をコード化する３遺伝子（ａｍｙＢ、ａｍｙＢＩおよびａｍｙＢＩＩ）の欠失を含む、ＷＴ ５菌株である。欠失ベクターの構築およびこれらの３遺伝子のゲノム欠失は、国際公開第２００５０９５６２４号パンフレットに詳述されている。国際公開第２００５０９５６２４号パンフレットに記載のベクターｐＤＥＬ−ＡＭＹＡ、ｐＤＥＬ−ＡＭＹＢＩおよびｐＤＥＬ−ＡＭＹＢＩＩは、欧州特許出願公開第０ ６３５ ５７４ Ｂ１号明細書に記載の「ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ」アプローチに従って使用された。上述の手順は、最終的に外来ＤＮＡ配列を全く持たない、シュウ酸欠損、ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ、ΔａｍｙＡ、ΔａｍｙＢＩおよびΔａｍｙＢＩＩアミラーゼ−陰性組換えアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ ５１３．８８菌株である、ＷＴ ６をもたらした。このように、菌株ＷＴ ６は低いアミラーゼバックグラウンドを有し、ＷＴ １と比較して、より効率的な配列のターゲティングに関して高いＨＲ／ＮＨＲ比を有し、また細胞外蛋白質発現および検出用に最適化されている。
【００９７】
クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）菌株：クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）におけるＰＧＥおよびその変異体の発現を評価するために、２つの菌株を使用した。ＧＧ７９９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、および本明細書ではＷＴ ７とも呼ばれ、米国特許第６，２６５，１８６ Ｂ１号明細書により詳細に記載されている、クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＣＢＳ ６８５．９７の派生物。菌株クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＷＴ ７は、突然変異誘発（古典的菌株改良）および遺伝子操作によって、ＣＢＳ ６８５．９７から誘導した。
【００９８】
［キチナーゼ活性アッセイ］
反応混合物は、キチン−アズール（Ｓｉｇｍａ）３ｍｇ、０．１Ｍ Ｎａ−クエン酸−リン酸バッファー０．５ｍｌ、ｐＨ５．０の分析試料（培養液）０．１ｍｌを含んでいた。この反応混合物を振盪しながら３７℃で２４時間、インキュベートし、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してＯＤ５９０を測定した。
【００９９】
［ｐＮＰ−β−グルコピラノシドを基質として使用するβ−グルコシダーゼ活性］
５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ＝４．５中、３ｍＭ ｐＮＰ−β−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ Ｎ７００６）原液を調製した。アッセイ：基質原液（３ｍＭ）２５０μｌ＋希釈酵素試料２５０μＬを、４０℃でインキュベートした。ｔ＝０、１０、２０および３０分に、培養標本１００μｌと１Ｍ炭酸ナトリウム１００μｌとを混合することによって反応を停止させた。吸光度は、ＭＴＰ読み取り装置を使用して４０５ｎｍで測定した。活性は、放出されたｐＮＰ μｍｏｌ／ｍｌ／分で表す。
【０１００】
［セロビオースを基質として使用する、β−グルコシダーゼ活性］
５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ＝４．５中、最終濃度１０ｍＭのセロビオース（ＳｉｇｍａＣ７２５２）原液を調製した。アッセイ用に、基質原液（１０ｍＭ）２０００μｌ＋希釈酵素試料１００μＬを混合し、４０℃でインキュベートした。ｔ＝０、１０、２０および３０分に、培養標本１００μｌ＋５０ｍＭ水酸化ナトリウム１００μｌを混合することによって反応を停止させた。試料を限外濾過に付し、ＥＤ４０パルスアンペロメトリー検出器を具備するＤｉｏｎｅｘ ＤＸ−５００で実施されるパルスアンペロメトリー検出器を用いた高性能陰イオン交換クロマトグラフィ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を使用して分析した。活性は、放出されたグルコースμｍｏｌ／ｍｌ／分で表す。
【０１０１】
［ＡＺＯ−ＣＭ−セルロースを使用するエンドグルカナーゼ活性］
本アッセイは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ手順書Ｓ−ＡＣＭＣ ０４／０７（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｌｔｄ，ｈｔｔｐ：／／ｓｅｃｕｒｅ．ｍｅｇａｚｙｍｅ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｅｎ／ｄａｔａ／Ｓ−ＡＣＭＣ．ｐｄｆ）に従って実施する。活性は、１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ４．６中、２％ＡＺＯ−ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅを用いて４０℃で測定した。アッセイ用に、基質原液（２％）２５０μＬ＋希釈酵素溶液２５０μＬを混合した。３０分後、沈殿剤溶液１２５０μＬを加えた。沈殿剤溶液（エタノール７６％中、３００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ＝５と２０ｍＭ Ｚｎ−酢酸）を加えることによって反応を停止させた。１０００ｘｇで１０分間遠心分離した後、分光光度計を使用して、上澄の５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。活性は、放出された色素μｍｏｌ／ｍｌ／分で表す。
【０１０２】
［トリブチリンプレートアッセイ］
トリブチリン（Ｃ４）を基質として、ローダミンＢリパーゼプレートスクリーニングアッセイを行った。ローダミンＢプレートアッセイは、試料中の、リパーゼ活性存在のスクリーニングによく使用され、文献（Ｇ．Ｋｏｕｋｅｒ，Ｋ．Ｅ．Ｊａｅｇｅｒ，Ａｐｐｌ．ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８７，２１１−２１３）に記載のアッセイから改変された。使用した全ての化学薬品は、分析グレードであった。アラビアゴムエマルジョンは、ＮａＣｌ １７．９ｇおよびＫＨ２ＰＯ４ ０．４１ｇをＨ２Ｏ ４００ｍｌに溶解し、最後にグリセロール（８７％）５４０ｍｌを加えることによって作った。アラビアゴム６（６．０）ｇを徐々に加え、溶解した後、Ｈ２Ｏを加えることにより全量１０００ｍｌとした。
ローダミンＢ溶液は、ローダミンＢを２０ｍｇ／ｍｌの濃度でエタノールに溶解することによって調製した。４％アガロース溶液は、加熱により、アガロース４ｇをバッファー液（０．１Ｍ酢酸塩 ｐＨ＝５．５）１００ｍｌに溶解することによって調製した。リパーゼ活性のスクリーニングに使用した基質は、トリブチリンであった。
プレートアッセイ手順：基質１ｍｌおよびアラビアゴムエマルジョン１．５ｍｌを、バッファー液５ｍｌと混合し、振幅２０μｍで２×６０秒間Ｓｏｎｉｐｒｅｐを使用して、または任意選択的に、緑色に設定したＵｌｔｒａｔｕｒａｘで２分間、超音波処理した。この溶液に、熱いアガロース溶液７．５ｍｌをローダミンＢ １５０μｌと一緒に加えた。最終溶液をペトリ皿プレートに注入した。プレートは、使用するまで冷蔵庫内に保存した。使用直前に、レプリケーターを使用して、直径３ｍｍの穴を作った。リパーゼ活性を確認する溶液１０μｌを穴にピペッティングし、その後、プレートを３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。穴の周囲の蛍光ハロは、リパーゼ活性を示す。
【０１０３】
［ｐＮＰ−ブチレートアッセイ］
前胃エステラーゼ（ＰＧＥ）活性は、内部酵素標準に対して、最終濃度１ｍＭのパラ−ニトロフェニルブチレートを基質として使用し、３７℃で測定した。基質溶液は、アセトニトリル中５０ｍＭパラ−ニトロフェニルブチレート原液を作り、それを、０．２％ＢＳＡおよび２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ６．７で５倍希釈することによって調製した。０．２％ＢＳＡを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．７ １２０μｌ、基質溶液１５μｌを加えた。３７℃に予熱した後、適切な希釈度の試料（０．２％ＢＳＡを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．７で希釈）１５μｌを加え、その後、３７℃で５分間のインキュベーションの間ずっと、４０５ｎｍにおける吸光度の上昇を分光光度法で測定した。
試料応答は、ブランクバックグラウンド（試料の代わりに、０．２％ＢＳＡを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．７ １５μｌのインキュベーション）の補正をし、ブランク補正後、一般に０．０５〜０．５ｄＡｂｓの範囲であった。
内部標準を、ｐＨ６．０および３０℃で実施される、トリブチリンを用いた滴定分析で較正した。ＰＧＥ試料液（ｍｉｌｌｉＱ水で調製）５ｍｌを、予熱したトリブチリン／アラビアゴムエマルジョン（それぞれ、水中９３ｇ／Ｌおよび５７ｇ／Ｌ）３０ｍＬに加えた。放出された遊離脂肪酸を、０．０２Ｎ ＮａＯＨで滴定することによって５分間にわたり測定した。
【０１０４】
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動］
試料前処理：試料３０μｌを、水３５μｌおよびＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ試料バッファー（４×）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２５μｌおよびＮｕＰＡＧＥ（商標）試料還元剤（Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（１０×）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １０μｌに加えた。試料を、サーモミキサー内、７０℃で１０分間加熱した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、供給者の指示書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｇｅｌ：４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、バッファー：ＭＥＳ ＳＤＳ泳動バッファー、実行時間：３５分）に従って、二重に実施した。２つのゲルのうちの１つをブロッティングに使用し、試料液１０μｌおよびマーカーＭ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μｌをゲル上に適用した（ＮｕＰＡＧＥ（商標） Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
ゲルは、外部バッファー室内の２０倍希釈したＭＥＳ−ＳＤＳバッファー６００ｍｌ、および内部バッファー室内の酸化防止剤（ＮｕＰＡＧＥＴＭ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５ｍｌを含有する２０倍希釈したＭＥＳ−ＳＤＳバッファー２００ｍｌを備えたＸＣＥＬＬ Ｓｕｒｅｌｏｃｋを使用して、２００Ｖで動かした。ラン実行後、ゲルを５０％メタノール／７％酢酸（５０ｍｌ）で１時間固定し、脱塩水で２回すすぎ、シプロルビー（Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ）（５０ｍｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で一晩染色した。
画像は、ゲルを脱塩水で１０分間洗浄した後、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９２００（６１０ ＢＰ ３０，Ｇｒｅｅｎ（５３２ｎｍ），ＰＭＴ ６００Ｖ，１００μｍ）を使用して作成した。
【０１０５】
［ウエスタンブロッティング］
［ＰＧＥポリクローナル抗体］
ＰＧＥポリクローナル抗体は、迅速２８日プログラムおよび抗原としての２つの合成ＰＧＥペプチドを使用して、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（ベルギー）に注文した。ＰＧＥ抗体は、市販のＰｉｃｃａｎｔａｓｅ Ｃ（ＤＦＳ）酵素製剤と比較して確認した（データ表示せず）。
ウエスタンブロッティングは、分析Ｓ２３００の方法に従って実施した。
膜：ＮＣ ０．４５μｍ
実行時間：２５Ｖで９０分
バッファー：メタノールを含むトランスファーバッファー
【０１０６】
膜に移動させた後、以下のステップを実施した：
膜を、スキムミルク（ＰＢＳＴ中１％のスキムミルク；１０ｍＭ ＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）２０ｍｌ中で２時間ブロックする。
抗体１：ＳＹ０７１６，ウサギ；抗体４０μｌを、ＰＢＳＴ ２０ｍｌに溶解する）室温で一晩（１：５００）。
膜を、ＰＢＳ−Ｔですすぎ、次にＰＢＳＴバッファーで３×２０分間洗浄する。
抗体２：ＥＣＬ Ｐｌｅｘヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｃｙ３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；ＥＣＬ Ｐｌｅｘ１０μｌを、ＰＢＳＴ ２５ｍｌに溶解する、暗所に保管）１時間。（１：２５００）
膜を４回すすぎ、次にＰＢＳＴで２×１０分間洗浄する
ＰＢＳで２×１０分間洗浄する
画像は、Ｔｙｐｈｏｏｎ９２００（６７０ＢＰ３０，緑色（５３２ｎｍ），ＰＭＴ ４５０Ｖ，１００μｍ）を使用して、膜から作成した。
【０１０７】
［分子生物学技法］
本明細書の実施例では、当業者に周知の分子生物学技法（ｓｅｅ：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）を使用して、幾つかの遺伝子を過剰発現させ、その他を、下記の通りに下方制御した。
【０１０８】
記述され、使用された全ての遺伝子置換ベクターは、周知の原理に従って設計され、またルーチンのクローニング手順に従って構築された。本質的に、これらのベクター類は、宿命的なゲノム遺伝子座における相同組換えを目標とするため、それぞれのＯＲＦ配列の、約１〜２ｋｂの隣接領域を含む。加えて、これらのベクター類は、形質転換のために、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）双方向ａｍｄＳ選択マーカーを、直接反復の中間に含む。本明細書の全実施例で遺伝子欠失に利用された方法は線状ＤＮＡを使用するが、これは、二重交差によってゲノムのフランキング配列の相同遺伝子座に組み込まれ、したがって削除されるべき遺伝子がａｍｄＳ遺伝子に代わる。形質転換後、この直接反復によって、（第２の）相同組換え事象による選択マーカーの除去が可能になる。ａｍｄＳマーカーの除去は、フルオロアセトアミド培地上にプレーティングすることにより行うことができ、無マーカー遺伝子菌株を選択する結果となる。欧州特許第０ ６３５ ５７４号明細書に「ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ」アプローチとしても記述されている、形質転換および後続の対抗選択という、この戦略を使用すれば、ａｍｄＳマーカーを菌株修飾プログラムで無制限に使用することができる。遺伝子破壊のための基本手順は、国際公開第２００６０４０３１２号パンフレットの図６に描かれている。欠失ベクター類の一般設計は、以前に欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書および国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記述されており、また欠失ベクターを構築するための一般的クローニングベクターｐＧＢＤＥＬの使用および対抗選択手順は、国際公開第０６／０４０３１２号パンフレットに記述されている。
発現ベクター類、具体的には遺伝子過剰発現用のｐＧＢＦＩＮ−発現ベクター類の一般設計、形質転換、マーカー類の使用および選択培地の例は、国際公開第１９９８４６７７２号パンフレット、国際公開第１９９９３２６１７号パンフレット、国際公開第２００１１２１７７９号パンフレット、国際公開第２００５０９５６２４号パンフレット、欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書および国際公開第２００５１００５７３号パンフレットにある。
【０１０９】
［振盪フラスコ発酵］
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株を、国際公開第９９／３２６１７号パンフレットの実施例：「アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）振盪フラスコ発酵」セクションに記載の通りに、ＣＳＬ前培養培地２０ｍｌ中で前培養した（１００ｍｌフラスコ、バッフル）。３４℃および１７０ｒｐｍで１８〜２４時間成長させた後、この培養１０ｍｌを、発酵培地（ＦＭ）に移す。ＦＭ中での発酵は、概ね国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載の通り、発酵ブロス１００ｍｌが入ったバッフル付き５００ｍｌフラスコ内、３４℃および１７０ｒｐｍで指示された日数、実施する。
ＣＳＬ培地は（１リットル当たりの量で）：コーン・スティープ・ソリッド（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）１００ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４＊Ｈ２０ １ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、グルコース＊Ｈ２Ｏ １０ｇおよびバシルドン（Ｂａｓｉｌｄｏｎ）（消泡剤）０．２５ｇで構成されていた。成分を脱塩水に溶解し、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４でｐＨをｐＨ５．８に調整した；バッフル付き１００ｍｌフラスコおよびフォームボールを発酵培地２０ｍｌで満たし、１２０℃で２０分間、滅菌した。
発酵培地（ＦＭ）は（１リットル当たりの量で）、マルトース＊Ｈ２Ｏ １５０ｇ、ソイトン（Ｓｏｙｔｏｎｅ）（ペプトン）６０ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４＊Ｈ２Ｏ １ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ １５ｇ、トゥイン（Ｔｗｅｅｎ）８０ ０．０８ｇ、バシルドン（Ｂａｓｉｌｄｏｎ）（消泡剤）０．０２ｇ、ＭＥＳ ２０ｇ、Ｌ−アルギニン １ｇで構成されていた。成分を脱塩水に溶解し、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４でｐＨをｐＨ６．２に調整した；バッフル付き５００ｍｌフラスコおよびフォームボールを発酵ブロス１００ｍｌで満たし、１２０℃で２０分間、滅菌した。
クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）振盪フラスコ発酵の場合、クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＰＧＥ形質転換体の単一コロニーを、１リットル当たり酵母エキス１０ｇ、バクトペプトン２０ｇ、グルコース４０ｇおよび１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．７を含有する、ＹＥＰ（４％）−Ｄ／ＭＥＳ培地１００ｍｌ（フラスコ）に接種した。発酵は、２８０ｒｐｍの振盪インキュベーター内、３０℃で実施した。上澄を２日および３日に採取し、下記の通りにさらに分析した。
【０１１０】
［実施例１］
［本発明の方法による、野生型酵素および酵素変異体用のクリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）発現ベクターおよびアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターの構築］
この実施例では、本発明の酵素の変異体用に、多数の発現ベクターを構築した。クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）における発現のための全ての変異体を、ｐＫＬＡＣ２発現ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に酷似したｐＫＬＰＧＥ−ベクターでクローニングした。全てのｐＫＬＰＧＥ−ベクター類の一般設計図を図１に示す。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）における発現用の全ての変異体は、ｐＧＢＦＩＮ−５発現ベクターまたはｐＧＢＴＯＰ−発現ベクターでクローニングした。構築、一般設計図およびこれらのベクター類の使用は、国際公開第１９９９３２６１７号パンフレットに詳述されている。
【０１１１】
［クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）構築物］
ウシ前胃エステラーゼ（ＰＧＥ）は、産業上興味深い酵素であり、またその全長ｃＤＮＡ配列は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓら（１９９４，Ｇｅｎｅ １４７：２５９−２６２）により公開されている。クリベロミセス・ラクテス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）におけるＰＧＥの発現の場合、このｃＤＮＡ配列は、最適化されたコドン対（配列番号１）であり、合成的に調製されている（たとえば、ＤＮＡ２．０，ＵＳＡ，ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｓｌｏｎｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）α−因子プレ（プロ−）シグナル配列およびＫＲＥＡＥＡ Ｋｅｘプレ（プロ−）−配列プロセシング部位との融合を含む発現構築物を作成した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ制限部位を介して、合成遺伝子をクリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）発現ベクターでクローニングし、ａｍｄＳ選択マーカーも含む、ｐＫＬＰＧＥ−ＷＴ（図１）を産生した。加えて、本発明の方法に従って、改良された蛋白質特性を有する幾つかのＰＧＥ変異体を設計した。これらの突然変異体は、グリコシル化部位数および／または疎水性に関して、コドン対最適化野生型ＰＧＥ酵素（配列番号２）と異なっていた。ＰＧＥ突然変異体酵素コード化遺伝子も、上記の通り、やはり最適化コドン対であり、また合成的に調製されてもいる。ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩクローニング部位を使用して本質的に前述の通りに、変異体を、クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）発現ベクターにクローニングした。ＰＧＥ構築物のための全ての関連ヌクレオチドおよび蛋白質の詳細を表４に示す。
【０１１２】
【表７】
【０１１３】
［アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）構築物］
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるウシ前胃エステラーゼＰＧＥの発現の場合、ｃＤＮＡ配列は、最適化コドン対（配列番号１２）であり、合成的に調製された（たとえば、ＤＮＡ２．０，ＵＳＡ，ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｓｔｏｎｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。コドン対最適化ＰＧＥコード化遺伝子は、切断型グルコアミラーゼキャリア蛋白質（ｔＡＧ）への融合物として合成的に調製された。図２のｐＡＮＰＧＥ−３に示す通り、この融合フラグメントを、ｐＧＢＴＯＰ−アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターに挿入した。
【０１１４】
仮想キチナーゼ（ＺＤＵ，ＥＣ３．２．１．１４，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａ５ＡＢ４８）をコード化する野生型アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）遺伝子Ａｎ０８ｇ０９０３０は、アスペルギルス・ニガー（Ａｎｉｇｅｒ）ゲノム配列で同定された（ＥＭＢＬ：ＡＭ２６９９４８−ＡＭ２７０４１５；Ｐｅｌ ｅｔ ａｌ，「汎用細胞工場アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８のゲノムシークエンシングおよび分析（Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＣＢＳ５１３．８８．）」。Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７Ｆｅｂ；２５（２）：２２１−２３１）。野生型キチナーゼＺＤＵのｃＤＮＡ配列は、配列番号１７として同定することができ、推定される野生型キチナーゼＺＤＵ蛋白質配列は、配列番号１８として同定することができる。Ａｎ０８ｇ０９０３０のコード配列は最適化コドン対であり（国際公開第２００８０００６３２号パンフレットに詳述されている通り）、またグルコアミラーゼｇｌａＡプロモーターの翻訳開始配列は、作成された全ての発現構築物で５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ ＡＴＧ−３’に修飾されていた（やはり国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットに詳述されている通り）。加えて、最適翻訳停止配列が使用され、したがって、全ての発現構築物で、野生型５’−ＴＧＡ−３’翻訳停止配列は５’−ＴＡＡＡ−３に置き換えられた（国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットに詳述されている通り）。最適化キチナーゼＺＤＵ構築物は、ＰａｃＩ−ＡｓｃＩフラグメントとして完全合成し、サブクローニングして配列を検証した。合成されたフラグメント両端のＰａｃＩ−ＡｓｃＩ制限部位を使用して、ＰａｃＩ−ＡｓｃＩ消化ｐＧＢＦＩＮ−５発現ベクターの大きいベクターフラグメントでのクローニングを可能にし、ｐＧＢＦＩＮＺＤＵ−ＷＴ発現ベクターを作成した（図３）。
加えて、またＺＤＵキチナーゼの場合と同様の方法で、タラロミセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）β−グルコシダーゼ（ＺＴＢ，ＥＣ ３．２．１．２１，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８Ｘ２１４）およびファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）エンドグルカナーゼ（ＺＴＣ，ＥＣ ３．２．１．４，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６６ＮＢ６）は、最適化コドン対であり（国際公開第２００８０００６３２号パンフレットに詳述されている通り）、また全ての適切な制御要素をＰａｃＩ−ＡｓｃＩフラグメントとしてｐＧＢＦＩＮ−５にクローニングし、それぞれｐＧＢＦＩＮＺＴＢ−ＷＴおよびｐＧＢＦＩＮＺＴＣ−ＷＴを作成した。
【０１１５】
本発明の方法による蛋白質特性最適化（ＰＦＯ）を、ウシ前胃エステラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）キチナーゼ蛋白質配列、タラロミセス・エメルソニ（Ｔ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）β−グルコシダーゼおよびファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）エンドグルカナーゼ蛋白質配列に適用した。ウシ前胃エステラーゼの設計された変異体を含むコード配列をＥｃｏＲＩ−ＳｎａＢＩフラグメントとして完全合成し、配列を検証した。合成フラグメントをｐＧＢＴＯＰ−ベクターでクローニングし、ｐＡＮＰＧＥ−発現構築物を作成した。アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＰＧＥ構築物のための全ての関連ヌクレオチドおよび蛋白質の詳細を表５に示す。
【０１１６】
【表８】
【０１１７】
キチナーゼ、β−グルコシダーゼおよびエンドグルカナーゼの設計された変異体を含むコード配列をＰａｃＩ−ＡｓｃＩフラグメントとして完全合成し、サブクローニングして配列を検証した。合成されたフラグメント両端のＰａｃＩ−ＡｓｃＩ制限部位を使用して、ＰａｃＩ−ＡｓｃＩ消化ｐＧＢＦＩＮ−５発現ベクターの大きいベクターフラグメントでのクローニングを可能にし、変異体ｐＧＢＦＩＮ−発現ベクターを作成した。変異体発現構築物は、下記の通りに命名され、ｐＧＢＦＩＮＺＤＵ−構築物の特徴ならびにそれぞれのヌクレオチド配列および蛋白質配列ののリファレンスは、表６から推定することができ、ｐＧＢＦＩＮＺＴＢ−構築物のそれらは表７から、またｐＧＢＦＩＮＺＴＣ−構築物のそれらは表８から推定される。
【０１１８】
【表９】
【０１１９】
【表１０】
【０１２０】
【表１１】
【０１２１】
［実施例２］
［クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）野生型の発現および分泌分析ならびに蛋白質特性最適化ＰＧＥ］
菌株クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＧＧ７９９ＷＴ７を、ａｍｄＳ選択マーカーも含むクリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ｐＫＬＰＧＥ−構築物（表４）で形質転換した。各形質転換について、２０コロニーを、アセトアミドを含有する選択培地で純化した。コロニーの一部を使用して、ＰＣＲ反応用のＤＮＡ鋳型を作成し、各菌株におけるＰＧＥ構築物のコピー数を決定した。構築物当たり３つの、ＰＣＲスクリーニングで陽性の形質転換体を、酵素基質としてトリブチリンを含有するプレートアッセイでさらにスクリーニングした。野生型ＰＧＥ酵素の場合、トリブチリンプレートアッセイを使用して、明白な活性ハロを検出することはできなかった。ＰＧＥ産生用のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた上澄の分析もまた、陽性結果を示さなかった。意外なことに、最適化蛋白質特性を有するＰＧＥ突然変異体５つのうち４つでは、トリブチリンプレートアッセイを使用して、明白な活性ハロを確認することができた。
野生型および突然変異体ＰＧＥの多数の形質転換体を、振盪フラスコ内で成長させ、ｐＮＰ−ブチレートを基質として使用して、ブロスおよび上澄のリパーゼ活性を試験した。ＰＧＥ突然変異体の様々な活性アッセイの概要を表９に示す。
【０１２２】
【表１２】
【０１２３】
クリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ｐＫＬＰＧＥ−ＷＴ（ＰＧＥＣＰＯ）形質転換体（様々なコピー数）では、０．２Ｕ／ｍｌという最大活性が得られた。ＰＧＥの蛋白質特性最適化によって、すなわちｐＫＬＰＧＥ−１２で発現されるとき、このＰＧＥ突然変異体の５０×を超える活性上昇が確認された。ＰＧＥ−９、ＰＧＥ−１１およびＰＧＥ−１２変異体の多数の突然変異体を大規模ベースで発酵させ、改良された分泌を確認した（データ表示せず）。この実施例では、グリコシル化部位数の改変および表面に露出している疎水性酵素部分の極性の変更により（ＰＧＥモデリングに基づいて決定される）、我々はクリベロミセス・ラクテス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）におけるＰＧＥ酵素発現および分泌を劇的に改良できることが分かった。さらに、かなりの量の活性が、上澄にも存在していた。
【０１２４】
［実施例３］
［アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における野生型および蛋白質特性最適化ＰＧＥの発現および分泌分析］
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ６を、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ選択マーカーおよび変異体ｐＡＮＰＧＥ−プラスミドを担持するｐＧＢＡＡＳ構築物で共形質転換した（表５）。全て、国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載の通り、各形質転換について、２０コロニーを、アセトアミドを含有する選択培地で純化し、続いてスポアプレートを調製した。真の共形質転換体であった、たとえば、ＰＧＥカセットおよびａｍｄＳカセットの両者を含んでいた、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）形質転換体を選択するために、ＰＣＲ確認する（表示せず）。結果から、選択された形質転換体２０のうち少なくとも５０％が、ＰＧＥ発現構築物の１つまたは複数のコピーを含んでいた。形質転換体を含むこれらのＰＧＥを継続した。ＰＧＥ ｃｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓのスポアを回収し、ＦＭ培地で振盪フラスコ発酵を実施した。２日目に、上澄試料を採取し、トリブチリンプレートアッセイを使用してリパーゼ活性についてスクリーニングした。
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｐＡＮＰＧＥ−３形質転換体から回収された試料中に、非常に僅かな活性ハロを検出することができた（データ表示せず）。ｐＡＮＰＧＥ−１２およびｐＡＮＰＧＥ−１３形質転換体では、大きい活性ハロを検出することができた（データ表示せず）。各構築物ｐＡＮＰＧＥ−３、ｐＡＮＰＧＥ−１２およびｐＡＮＰＧＥ−１３について、トリブチリンプレートアッセイで最大のハロを示した形質転換体（１〜３）のリパーゼ活性を、基質としてｐＮＰ−ブチレートを使用して試験した。ＰＧＥ突然変異体の様々な活性アッセイの概要を表１０に示す。
【０１２５】
【表１３】
【０１２６】
ＷＴ ６および選択された形質転換体ｐＡＮＰＧＥ−１２＃１６およびｐＡＮＰＧＥ−１３＃３０の上澄試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰＧＥポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロットで、さらに分析した（図４参照）。ｐＡＮＰＧＥ−１２のアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＰＧＥＰＦＯ変異体では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで、成熟ＰＧＥに相当するバンドを検出することができた。ＰＧＥポリクローナル抗体ＰＧＥを使用して、両形質転換体の上澄中に、交差ハイブリダイズバンドを検出することができた。
最高分子量のバンド（約５５ｋＤａ）はおそらく成熟ＰＧＥ突然変異体に相当し、また、より低分子量の交差ハイブリダイズバンドは、蛋白質分解の結果であろう。
蛋白質特性最適化の法則に従って、表面に露出している酵素部分の極性（ＰＧＥモデリングに基づいて決定される）を変えることにより、我々はアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるＰＧＥ酵素発現を劇的に改良できるという結論に達する。さらに、高い酵素活性も、上澄中で認められた。
【０１２７】
［実施例４］
［アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における野生型およびＰＦＯ最適化真菌酵素の発現］
実施例１（ｓｕｐｅｒ）で調製された、ｐＧＢＦＩＮＺＤＵ−発現構築物、ｐＧＢＦＩＮＺＴＢ−発現構築物およびｐＧＢＦＩＮＺＴＣ−発現構築物を、下記の通り、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）を使用した形質転換により導入した。ＷＴ ６で、異なるｐＧＢＦＩＮＺＤＵ−ベクター、ｐＧＢＦＩＮＺＴＢ−ベクターおよびｐＧＢＦＩＮＺＴＣ−ベクター（それぞれ、表６、７および８）を導入するために、国際公開第１９９８／４６７７２号パンフレットおよび国際公開第１９９９／３２６１７号パンフレットに記載の通りに、形質転換および後続する形質転換体の選択を実施した。簡単に記載すると、全てのｐＧＢＦＩＮ−構築物の線状ＤＮＡを単離して、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ６の形質転換に使用した。形質転換体をアセトアミド培地で選択し、標準手順に従って、コロニーを純化した。コロニーのｇｌａＡ遺伝子座における組み込みおよびコピー数を、ＰＣＲを使用して診断した。類似した推定コピー数（仮想単一コピー）を有する各ｐＧＢＦＩＮＺＤＵ−構築物、ｐＧＢＦＩＮＺＴＢ−構築物およびｐＧＢＦＩＮＺＴＣ−構築物について、独立した３つの形質転換体を選択し、形質転換プラスミドの数を使用して、たとえば、それぞれ、ＺＤＵ−ＷＴ−１、ＺＤＵ−ＷＴ−２、ＺＤＵ−ＷＴ−３、ＺＤＵ−６−１、ＺＤＵ−６−２、ＺＤＵ−６−３等々と命名した。
上述の通り、３４℃および１７０ｒｐｍのインキュベーターシェーカーで、５００ｍｌバッフル付き振盪フラスコを使用し、選択されたＺＤＵ−菌株、ＺＴＢ−菌株およびＺＴＣ−菌株ならびにアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ６を使用して、ＦＭ培地１００ｍｌで、振盪フラスコ実験を実施した。発酵の３日、４日および５日の後、試料を採取し、電気泳動およびキチナーゼ活性により細胞外蛋白質の産生量を測定した。
【０１２８】
異なる構築物を含むアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＺＤＵ−５形質転換体の各形質転換体により発現されたキチナーゼの産生を、培養上澄で測定した。３日に測定されたキチナーゼ活性レベルを図５に示す。加えて、４日にサンプリングした培養上澄をＳＤＳゲル電気泳動法および染色で分析した（図６）。これらの結果から、最適化された蛋白質特性は、蛋白質分泌にプラスの影響を与え、そして検出可能な、したがって蛋白質発現レベル上昇およびキチナーゼ酵素活性レベル上昇をもたらすことが明白である。結果を表６にまとめた。
【０１２９】
異なる構築物を含むアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＺＴＢ−形質転換体の各形質転換体により発現されたβ−グルコシダーゼの産生を、培養上澄で測定した。４日目にサンプリングした培養上澄をＳＤＳゲル電気泳動法および染色で分析した（図７）。これらの結果から、最適化された蛋白質特性は、蛋白質分泌にプラスの影響を与え、そして検出可能な、したがって、β−グルコシダーゼ酵素のための蛋白質発現レベル上昇をもたらすことが明白である。加えて、３日目にサンプリングした上澄中の活性を、基質としてｐＮＰ−β−グルコピラノシドを使用し、ｐＨ＝４．５および４０℃で測定した。蛋白質特性最適化に付しておいたβ−グルコシダーゼの上澄は、コドン最適化遺伝子によりコード化された親β−グルコシダーゼと比較して、最高２０倍の活性上昇を示した。空宿主で測定されるバックグラウンドβ−グルコシダーゼ活性は、コドン最適化遺伝子によりコード化された親ベータ−グルコシダーゼの２分の１〜４分の１の低さであった。活性はまた、セロビオースを基質として使用し、ｐＨ＝４．５および４０℃でも測定した。測定された活性上昇は、コドン最適化遺伝子によりコード化された親β−グルコシダーゼと比較して、少なくとも３０倍であった（空宿主菌株は、コドン最適化遺伝子によりコード化された親β−グルコシダーゼの３分の１〜１０分の１の低さであった）。結果を表７にまとめた。
【０１３０】
異なる構築物を含むアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＺＴＣ−形質転換体の各形質転換体により発現されたエンドグルカナーゼの産生を、培養上澄で測定した。４日目にサンプリングした培養上澄をＳＤＳゲル電気泳動法および染色で分析した（図８）。これらの結果から、最適化された蛋白質特性は、蛋白質分泌にプラスの影響を与え、そして検出可能な、したがってエンドグルカナーゼ酵素のための蛋白質発現レベル上昇をもたらすことが明白である。３日目にサンプリングした上澄中のエンドグルカナーゼ活性を、ＡＺＯ−ＣＭ−セルロースを基質として使用し、ｐＨ＝４．５および４０℃で測定した。蛋白質特性最適化に付しておいたエンドグルカナーゼの上澄は、同一宿主で発現されるコドン最適化遺伝子と比較して、３５０倍を超える活性上昇を示した。空菌株におけるバックグラウンド活性は非常に低いため（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出不能）、活性上昇がそのように高い数字で表されることに留意すべきである。コドン最適化遺伝子によりコード化されたエンドグルカナーゼについては、測定された活性は、ほぼ空宿主菌株で観測されるバックグラウンド活性であった。結果を表８にまとめた。
【０１３１】
明らかに、これらの実施例は、対象蛋白質および酵素の改良された分泌および産生のために、蛋白質特性最適化のための本発明の方法を、いかに使用できるかを示すものである。さらに、これらの結果は、発現構築物および宿主は、既に幾つかの他の最適化、たとえば強力プロモーター、改良された翻訳開始配列、改良された翻訳停止配列、最適化コドンおよびコドン対使用、および／または蛋白質発現のための改良された宿主等を有するものの、宿主における蛋白質発現を改良するために、本発明の方法を広く利用できることを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物宿主細胞によって対象ポリペプチドの分泌を改良するための方法であって、前記真核生物宿主における１つまたは複数の蛋白質特性について最適範囲内に入るか、または最適値により近づくように、前記ポリペプチドのアミノ酸主鎖における一組の関連する蛋白質特性の値を修飾するステップを含む方法。
【請求項２】
（ｉ）前記真核生物宿主における１つまたは複数の蛋白質特性について最適範囲および最適値を決定するステップ、および
（ｉｉ）前記真核生物宿主における一組の関連する蛋白質特性を決定するステップであって、前記ポリペプチドのアミノ酸主鎖におけるこれらの関連特性の１つまたは複数が修飾されれば、前記真核生物宿主による前記ポリペプチドの前記分泌を改良するであろう特性を決定するステップ、および、
（ｉｉｉ）（ｉ）で決定される通り、前記最適範囲内に入るか、または前記最適値により近づくように前記関連する蛋白質特性の値を修飾するステップ、
を含み、
（ｉ）および（ｉｉ）は、任意の順序で実施し得る、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
関連した一組の特性が、
ａ．特定の真核生物宿主における適量の蛋白質の分泌レベルおよびこれらの蛋白質の前記アミノ酸配列およびＤＮＡ配列を含む、データセットＳを収集または作成するステップ；
ｂ．前記データセットＳにおける全ての蛋白質について蛋白質特性（Ｆ）を計算するステップ；
ｃ．適切に規定された分類子性能基準に従って、前記データセットＳにおける分泌蛋白質Ｓ＋と非分泌蛋白質Ｓ−とを区別するために、統計分類子の最高の成果を与える蛋白質特性のサブセット（Ｆｓ）を選択するための統計的分類方法を使用するステップ；
によって決定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記蛋白質特性が一組の成熟蛋白質から算出される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
真核生物宿主の蛋白質特性の最適範囲または最適値が、
ａ．特定の真核生物宿主における適量の蛋白質の分泌レベルおよびこれらの蛋白質の前記アミノ酸配列およびＤＮＡ配列を含む、データセットＳを収集または作成するステップ；
ｂ．前記データセットＳにおける全ての蛋白質について蛋白質特性（Ｆ）を計算するステップ；
ｃ．前記特性の値の分布が前記選択される確立分布によって十分に説明されるように、Ｓ＋から算出される各蛋白質特性に確率分布を合わせるステップにより、前記真核生物宿主の各特性の最適値（Ｆ＿ｏｐｔ）を決定するステップ；
ｄ．前記真核生物宿主について各特性の最適範囲を決定するステップ；
によって決定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
真核生物宿主によるポリペプチドの分泌を改良する方法であって、
ｉ）前記ポリペプチドについて、蛋白質特性を計算するステップ、
ｉｉ）前記ポリペプチドの１つまたは複数の蛋白質特性が、最適範囲外であるかまたは前記真核生物宿主の最適値から実質的に逸脱しているかどうかを決定するステップ、
ｉｉｉ）前記ポリペプチドの１つまたは複数のＦｓ＿ＡＡの値が、前記最適範囲内に入るか、または、ＲＩまたはＲＩＮにより規定される適量だけ、前記最適値に向けて移行するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列を合理的に変えるステップであって、ここで、ＲＩまたはＲＩＮで規定される変化は、好ましくは１０％超、１５％、２０％、および最も好ましくは３０％超である、ステップ
を含む方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドの主鎖が、下記の特徴：アミノ酸の数、分子量、等電点、特定のｐＨにおける正味荷電、ＧＲＡＶＹスコア、脂肪族指数、不安定指数、組成的特性、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ原子の原子組成、アミノ酸頻度、ジペプチド頻度、トリペプチド頻度、酸性アミノ酸頻度、脂肪族アミノ酸頻度、芳香族アミノ酸頻度、塩基性アミノ酸頻度、局所的特徴、局在化特性、グリコシル化パターンおよび帯電アミノ酸頻度；
の１つまたは複数に関して修飾される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドの主鎖が、下記の特性：塩基性アミノ酸頻度、極性アミノ酸頻度、非極性アミノ酸頻度、微小アミノ酸頻度、小アミノ酸頻度、帯電アミノ酸頻度、ｐＨ７．２における正味電荷、等電点、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、ＴｈｒおよびＬｅｕのそれぞれの頻度、局在化特性、Ｇａｒｎｉｅｒにより算出されるターン、ＥＰＥＳＴＦＩＮＤにより算出されるＰＥＳＴモチーフ、ｐｌのＬＦ値、ＧｒａｖｙスコアのＬＦ値、アロマスコアのＬＦ値、イオウ（Ｓ）組成；
の１つまたは複数に関して修飾される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドの主鎖が：ｐｌ、正味電荷、長さ当たりの正味荷電、長さ当たりの正味正電荷、長さ当たりの正味負電荷、長さ当たりの全電荷、グレイビースコア、アロマスコア、脂肪族指数、微小アミノ酸頻度、小アミノ酸頻度、極性アミノ酸頻度、非極性アミノ酸頻度、帯電アミノ酸頻度、酸性アミノ酸頻度、塩基性アミノ酸頻度、脂肪族アミノ酸頻度、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌのそれぞれの頻度、からなる群から選択される１つまたは複数の特性に関して修飾される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドの主鎖が、ｐｌ、正味荷電（ｐＨ７．２）、長さ当たりの正味荷電（ｐＨ７．２）、長さ当たりの正味正電荷（ｐＨ７．２）、長さ当たりの全電荷（ｐＨ７．２）、脂肪族指数、小アミノ酸頻度、極性アミノ酸頻度、非極性アミノ酸頻度、帯電アミノ酸頻度、アミノ酸頻度、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＰｈｅおよびＴｈｒのそれぞれの頻度からなる群から選択される１つまたは複数の特徴に関して修飾される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチドの主鎖が、グリコシル化部位、グレイビースコア、極性アミノ酸頻度、非極性アミノ酸頻度、帯電アミノ酸頻度、酸性アミノ酸頻度、塩基性アミノ酸頻度、Ｇｌｕ、ＬｙｓおよびＴｈｒのそれぞれの頻度からなる群から選択される１つまたは複数の特性に関して修飾される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アミノ酸主鎖のアミノ酸類の少なくとも５％が修飾される、より好ましくは前記アミノ酸主鎖のアミノ酸類の少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２０％が修飾される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アミノ酸主鎖の少なくとも５つのアミノ酸類が修飾される、より好ましくは前記アミノ酸主鎖の少なくとも１０のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも１５のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも２０のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも２５のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも３０のアミノ酸類が修飾される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
野生型リファレンス蛋白質に関して、少なくとも５％のＦ−スコアの改良が達成される、より好ましくは少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％の改良が達成され、前記Ｆ−スコアは式：
【数１】
式中、ηは０と１の間で０および１を含む（０≦η≦１）の重み係数であって、好ましくはη０．５以下、より好ましくはη０．４以下、最も好ましくはη＝０．３であり、ρは、１と５の間で１および５を含み（１≦ｐ≦５）、好ましくはρ＝２である）
にしたがって算出される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２、３、４、または５つの特性が修飾される、より好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは少なくとも１５、さらにより好ましくは少なくとも２０、さらにより好ましくは少なくとも２５、およびさらにより好ましくは少なくとも３０の特性が修飾される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも２、３、４、または５つの特性が改良される、より好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは少なくとも１５、さらにより好ましくは少なくとも２０、さらにより好ましくは少なくとも２５、およびさらにより好ましくは少なくとも３０の特性が改良され、好ましくは１０未満、さらにより好ましくは５未満、さらにより好ましくは４未満の特性が悪化する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記特性は一次特性である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドの主鎖が１つまたは複数の他の蛋白質特性に関して修飾される、請求項１または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記成熟ポリペプチドの主鎖が修飾される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記真核細胞が、酵母細胞または糸状菌細胞である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが哺乳類ポリペプチドまたは細菌ポリペプチドである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記修飾されるポリペプチドの特異性が実質的に分泌の改良前と同じに保持される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記修飾されるポリペプチドの比活性が実質的に分泌の改良前と同じに保持される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記分泌の改良が前記活性の上昇によって測定され、また前記細胞外培地中の活性が少なくとも５％上昇する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが酵素、膜蛋白質、ホルモンまたは受容体である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載の方法を、対象ポリペプチドに適用するステップ、および組換え技術により修飾されたポリペプチドを産生するステップを含む、対象ポリペプチドを産生する方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法で得られるポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法で入手できるポリペプチド。
【請求項２９】
請求項１〜２５に記載の方法で得られる修飾されたポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１〜２５に記載の方法で入手できる修飾されたポリペプチド。
【請求項１】
真核生物宿主細胞によって対象ポリペプチドの分泌を改良するための方法であって、前記真核生物宿主における１つまたは複数の蛋白質特性について最適範囲内に入るか、または最適値により近づくように、前記ポリペプチドのアミノ酸主鎖における一組の関連する蛋白質特性の値を修飾するステップを含む方法。
【請求項２】
（ｉ）前記真核生物宿主における１つまたは複数の蛋白質特性について最適範囲および最適値を決定するステップ、および
（ｉｉ）前記真核生物宿主における一組の関連する蛋白質特性を決定するステップであって、前記ポリペプチドのアミノ酸主鎖におけるこれらの関連特性の１つまたは複数が修飾されれば、前記真核生物宿主による前記ポリペプチドの前記分泌を改良するであろう特性を決定するステップ、および、
（ｉｉｉ）（ｉ）で決定される通り、前記最適範囲内に入るか、または前記最適値により近づくように前記関連する蛋白質特性の値を修飾するステップ、
を含み、
（ｉ）および（ｉｉ）は、任意の順序で実施し得る、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
関連した一組の特性が、
ａ．特定の真核生物宿主における適量の蛋白質の分泌レベルおよびこれらの蛋白質の前記アミノ酸配列およびＤＮＡ配列を含む、データセットＳを収集または作成するステップ；
ｂ．前記データセットＳにおける全ての蛋白質について蛋白質特性（Ｆ）を計算するステップ；
ｃ．適切に規定された分類子性能基準に従って、前記データセットＳにおける分泌蛋白質Ｓ＋と非分泌蛋白質Ｓ−とを区別するために、統計分類子の最高の成果を与える蛋白質特性のサブセット（Ｆｓ）を選択するための統計的分類方法を使用するステップ；
によって決定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記蛋白質特性が一組の成熟蛋白質から算出される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
真核生物宿主の蛋白質特性の最適範囲または最適値が、
ａ．特定の真核生物宿主における適量の蛋白質の分泌レベルおよびこれらの蛋白質の前記アミノ酸配列およびＤＮＡ配列を含む、データセットＳを収集または作成するステップ；
ｂ．前記データセットＳにおける全ての蛋白質について蛋白質特性（Ｆ）を計算するステップ；
ｃ．前記特性の値の分布が前記選択される確立分布によって十分に説明されるように、Ｓ＋から算出される各蛋白質特性に確率分布を合わせるステップにより、前記真核生物宿主の各特性の最適値（Ｆ＿ｏｐｔ）を決定するステップ；
ｄ．前記真核生物宿主について各特性の最適範囲を決定するステップ；
によって決定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
真核生物宿主によるポリペプチドの分泌を改良する方法であって、
ｉ）前記ポリペプチドについて、蛋白質特性を計算するステップ、
ｉｉ）前記ポリペプチドの１つまたは複数の蛋白質特性が、最適範囲外であるかまたは前記真核生物宿主の最適値から実質的に逸脱しているかどうかを決定するステップ、
ｉｉｉ）前記ポリペプチドの１つまたは複数のＦｓ＿ＡＡの値が、前記最適範囲内に入るか、または、ＲＩまたはＲＩＮにより規定される適量だけ、前記最適値に向けて移行するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列を合理的に変えるステップであって、ここで、ＲＩまたはＲＩＮで規定される変化は、好ましくは１０％超、１５％、２０％、および最も好ましくは３０％超である、ステップ
を含む方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドの主鎖が、下記の特徴：アミノ酸の数、分子量、等電点、特定のｐＨにおける正味荷電、ＧＲＡＶＹスコア、脂肪族指数、不安定指数、組成的特性、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ原子の原子組成、アミノ酸頻度、ジペプチド頻度、トリペプチド頻度、酸性アミノ酸頻度、脂肪族アミノ酸頻度、芳香族アミノ酸頻度、塩基性アミノ酸頻度、局所的特徴、局在化特性、グリコシル化パターンおよび帯電アミノ酸頻度；
の１つまたは複数に関して修飾される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドの主鎖が、下記の特性：塩基性アミノ酸頻度、極性アミノ酸頻度、非極性アミノ酸頻度、微小アミノ酸頻度、小アミノ酸頻度、帯電アミノ酸頻度、ｐＨ７．２における正味電荷、等電点、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、ＴｈｒおよびＬｅｕのそれぞれの頻度、局在化特性、Ｇａｒｎｉｅｒにより算出されるターン、ＥＰＥＳＴＦＩＮＤにより算出されるＰＥＳＴモチーフ、ｐｌのＬＦ値、ＧｒａｖｙスコアのＬＦ値、アロマスコアのＬＦ値、イオウ（Ｓ）組成；
の１つまたは複数に関して修飾される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドの主鎖が：ｐｌ、正味電荷、長さ当たりの正味荷電、長さ当たりの正味正電荷、長さ当たりの正味負電荷、長さ当たりの全電荷、グレイビースコア、アロマスコア、脂肪族指数、微小アミノ酸頻度、小アミノ酸頻度、極性アミノ酸頻度、非極性アミノ酸頻度、帯電アミノ酸頻度、酸性アミノ酸頻度、塩基性アミノ酸頻度、脂肪族アミノ酸頻度、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌのそれぞれの頻度、からなる群から選択される１つまたは複数の特性に関して修飾される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドの主鎖が、ｐｌ、正味荷電（ｐＨ７．２）、長さ当たりの正味荷電（ｐＨ７．２）、長さ当たりの正味正電荷（ｐＨ７．２）、長さ当たりの全電荷（ｐＨ７．２）、脂肪族指数、小アミノ酸頻度、極性アミノ酸頻度、非極性アミノ酸頻度、帯電アミノ酸頻度、アミノ酸頻度、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＰｈｅおよびＴｈｒのそれぞれの頻度からなる群から選択される１つまたは複数の特徴に関して修飾される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチドの主鎖が、グリコシル化部位、グレイビースコア、極性アミノ酸頻度、非極性アミノ酸頻度、帯電アミノ酸頻度、酸性アミノ酸頻度、塩基性アミノ酸頻度、Ｇｌｕ、ＬｙｓおよびＴｈｒのそれぞれの頻度からなる群から選択される１つまたは複数の特性に関して修飾される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アミノ酸主鎖のアミノ酸類の少なくとも５％が修飾される、より好ましくは前記アミノ酸主鎖のアミノ酸類の少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２０％が修飾される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アミノ酸主鎖の少なくとも５つのアミノ酸類が修飾される、より好ましくは前記アミノ酸主鎖の少なくとも１０のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも１５のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも２０のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも２５のアミノ酸類、さらにより好ましくは少なくとも３０のアミノ酸類が修飾される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
野生型リファレンス蛋白質に関して、少なくとも５％のＦ−スコアの改良が達成される、より好ましくは少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％の改良が達成され、前記Ｆ−スコアは式：
【数１】
式中、ηは０と１の間で０および１を含む（０≦η≦１）の重み係数であって、好ましくはη０．５以下、より好ましくはη０．４以下、最も好ましくはη＝０．３であり、ρは、１と５の間で１および５を含み（１≦ｐ≦５）、好ましくはρ＝２である）
にしたがって算出される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２、３、４、または５つの特性が修飾される、より好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは少なくとも１５、さらにより好ましくは少なくとも２０、さらにより好ましくは少なくとも２５、およびさらにより好ましくは少なくとも３０の特性が修飾される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも２、３、４、または５つの特性が改良される、より好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは少なくとも１５、さらにより好ましくは少なくとも２０、さらにより好ましくは少なくとも２５、およびさらにより好ましくは少なくとも３０の特性が改良され、好ましくは１０未満、さらにより好ましくは５未満、さらにより好ましくは４未満の特性が悪化する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記特性は一次特性である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドの主鎖が１つまたは複数の他の蛋白質特性に関して修飾される、請求項１または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記成熟ポリペプチドの主鎖が修飾される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記真核細胞が、酵母細胞または糸状菌細胞である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが哺乳類ポリペプチドまたは細菌ポリペプチドである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記修飾されるポリペプチドの特異性が実質的に分泌の改良前と同じに保持される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記修飾されるポリペプチドの比活性が実質的に分泌の改良前と同じに保持される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記分泌の改良が前記活性の上昇によって測定され、また前記細胞外培地中の活性が少なくとも５％上昇する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが酵素、膜蛋白質、ホルモンまたは受容体である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載の方法を、対象ポリペプチドに適用するステップ、および組換え技術により修飾されたポリペプチドを産生するステップを含む、対象ポリペプチドを産生する方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法で得られるポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法で入手できるポリペプチド。
【請求項２９】
請求項１〜２５に記載の方法で得られる修飾されたポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１〜２５に記載の方法で入手できる修飾されたポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１２−５２００６４（Ｐ２０１２−５２００６４Ａ）
【公表日】平成２４年９月６日（２０１２．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５３４１６（Ｐ２０１１−５５３４１６）
【出願日】平成２２年３月８日（２０１０．３．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５２９１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０２９８２
【国際公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月６日（２０１２．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月８日（２０１０．３．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５２９１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０２９８２
【国際公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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