本発明は、ジスルフィド含有ポリペプチドの組換え生産中におけるジスルフィド結合の還元を防止するための方法及び手段に関する。特に、本発明は、組換え宿主細胞培養物から、抗体を含むジスルフィド含有ポリペプチドの収集の間におけるジスルフィド結合の還元の防止に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え宿主細胞中で発現されるポリペプチドにおけるジスルフィド結合の還元を防止する方法であって、組換え宿主細胞の収集前又は収集培養液にチオレドキシン阻害剤を補充することを含む方法。
【請求項２】
上記チオレドキシン阻害剤を収集前培養液に添加する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記チオレドキシン阻害剤を収集培養液に添加する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記チオレドキシン阻害剤がチオレドキシンの直接阻害剤である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記チオレドキシン阻害剤がアルキル−２−イミダゾリルジスルフィド又はナフトキノンスピロケタール誘導体である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記チオレドキシン阻害剤がチオレドキシンレダクターゼの特異的阻害剤である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記チオレドキシン阻害剤が金錯体である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記金錯体がオーロチオグルコース（ＡＴＧ）又は金チオリンゴ酸塩（ＡＴＭ）である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記ＡＴＧ又は上記ＡＴＭを、約０．１ｍＭと約１ｍＭの間の濃度で添加する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記ＡＴＧ又は上記ＡＴＭを、上記収集前又は収集培養液中のチオレドキシンレダクターゼ濃度の少なくとも約４倍の濃度で添加する請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
上記チオレドキシン阻害剤が金属イオンである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記金属イオンが、Ｈｇ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃｏ^２＋、及びＭｎ^２＋からなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記金属イオンが、硫酸銅の形態で存在するＣｕ^２＋である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記硫酸銅が、五水和物形態又は無水物形態である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記硫酸銅を、約５ｍＭと約１００ｍＭの間の濃度で添加する請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
上記硫酸銅を、約１０ｍＭと約８０ｍＭの間の濃度で添加する請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
上記硫酸銅を、約１５ｍＭと約５０ｍＭの間の濃度で添加する請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
上記硫酸銅を、上記収集前又は収集培養液中のチオレドキシン濃度の少なくとも約２倍の濃度で添加する請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
上記チオレドキシン阻害剤がＧ６ＰＤの阻害剤としてである請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
上記チオレドキシン阻害剤が、ピリドキサール５’−リン酸，１フルオロ−２，４ジニトロベンゼン，デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）及びエピアンドロステロン（ＥＡ）からなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記ＤＨＥＡを、約０．０５ｍＭと約５ｍＭの間の濃度で添加する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
上記ＤＨＥＡを、約０．１ｍＭと約２．５ｍＭの間の濃度で添加する請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
上記チオレドキシン阻害剤が、ヘキソキナーゼ活性の阻害剤である請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
上記チオレドキシン阻害剤が金属イオンのキレート剤である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
金属イオンの上記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
上記ＥＤＴＡを、約５ｍＭと約６０ｍＭの間の濃度で添加する請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
上記ＥＤＴＡを、約１０ｍＭと約５０ｍＭの間の濃度で添加する請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
上記ＥＤＴＡを、約２０ｍＭと約４０ｍＭの間の濃度で添加する請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
上記チオレドキシン阻害剤が、ソルボース−１−リン酸、ポリリン酸、６−デオキシ−６−フルオログルコース、２−Ｃ−ヒドロキシ−メチルグルコース、キシロース、及びリキソースからなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
上記チオレドキシン阻害剤が、シスチン、システイン、又は酸化グルタチオンである請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
上記シスチン、システイン、又は酸化グルタチオンを、上記収集前又は収集培養液中の上記ポリペプチドの濃度の少なくとも約４０倍の濃度で添加する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
上記チオレドキシン阻害剤が、チオレドキシンレダクターゼに特異的に結合するｓｉＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチド、又は抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
上記チオレドキシン阻害剤が、チオレドキシン活性の阻害を間接的に生じさせる手段である請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
上記手段が、上記組換え宿主細胞の収集培養液への空気散布である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上記手段が、上記組換え宿主細胞の収集培養液のｐＨを低下させることである請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
上記組換え宿主細胞の収集培養液へ空気散布する工程を更に含む請求項１から３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３７】
上記組換え宿主細胞の収集培養液のｐＨを低下させる工程を更に含む請求項１から３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
上記ポリペプチドが、抗体又は抗体の生物学的に機能的な断片である請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
上記抗体断片が、抗体断片から形成されたＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）_２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、及び多重特異的抗体から選択される請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
上記抗体又は抗体断片が、治療用抗体又はその生物学的に機能的な断片である請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
上記治療用抗体が、抗ＨＥＲ２抗体；抗ＣＤ２０抗体；抗ＩＬ−８抗体；抗ＶＥＧＦ抗体；抗ＣＤ４０抗体，抗ＣＤ１１ａ抗体；抗ＣＤ１８抗体；抗ＩｇＥ抗体；抗Ａｐｏ−２レセプター抗体；抗組織因子（ＴＦ）抗体；抗ヒトα_４β_７インテグリン抗体；抗ＥＧＦＲ抗体；抗ＣＤ３抗体；抗ＣＤ２５抗体；抗ＣＤ４抗体；抗ＣＤ５２抗体；抗Ｆｃレセプター抗体；抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体；乳房上皮細胞に対する抗体；結腸癌細胞に結合する抗体；抗ＣＤ３８抗体；抗ＣＤ３３抗体；抗ＣＤ２２抗体；抗ＥｐＣＡＭ抗体；抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体；抗ＲＳＶ抗体；抗ＣＭＶ抗体；抗ＨＩＶ抗体；抗肝炎抗体；抗ＣＡ１２５抗体；抗αｖβ３抗体；抗ヒト腎細胞癌抗体；抗ヒト１７−１Ａ抗体；抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮癌；及び抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体，及び抗ＨＬＡＤＲ抗体からなる群から選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
上記治療用抗体が、ＨＥＲレセプター、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４０、又はＤＲ５に結合する抗体である請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
上記ＨＥＲレセプターがＨＥＲ１及び／又はＨＥＲ２である請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＨＥＲレセプターがＨＥＲ２である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
上記治療用抗体が、配列番号１６、１７、１８、及び１９からなる群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
上記治療用抗体が、ＣＤ２０に結合する抗体である請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
上記治療用抗体が、配列番号１から１５からなる群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
上記治療用抗体が、ＶＥＧＦに結合する抗体である請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
上記治療用抗体が、配列番号２０から２５からなる群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を含む請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
上記治療用抗体が、ＣＤ１１ａに結合する抗体である請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
上記治療用抗体が、配列番号２６から２９からなる群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
上記治療用抗体がＤＲ５レセプターに結合する請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
上記治療用抗体が、Ａｐｏｍａｂｓ１．１、２．１、３．１、４．１、５．１、５．２、５．３、６．１、６．２、６．３、７．１、７．２、７．３，８．１、８．３、９．１、１．２、２．２、３．２、４．２、５．２、６．２、７．２、８．２、９．２、１．３、２．２、３．３、４．３、５．３、６．３、７．３、８．３、９．３，及び２５．３からなる群から選択される請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
上記治療用抗体がＡｐｏｍａｂ８．３又はＡｐｏｍａｂ７．３である請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
上記治療用抗体がＡｐｏｍａｂ７．３である請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
上記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
治療用ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン及び牛成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィルブランド因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼ又はヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；ヘモポイエチン増殖因子；腫瘍壊死因子−α及びβ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４等の細胞傷害性Ｔリンパ球抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は増殖因子の受容体；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）、又はＮＧＦ−β等の神経成長因子等の神経栄養因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の線維芽細胞増殖因子；表皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４又はＴＧＦ−β５を含む、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等のトランスフォーミング増殖因子；インスリン様増殖因子−Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）；インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、及びＣＤ４０等のＣＤタンパク質；エリスロポイエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、−γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩解促進因子；例えばＡＩＤＳエンベロープのタンパク質等のウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター；及び上記ポリペプチドの断片からなる群から選択される請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
上記組換え宿主細胞が真核生物宿主細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項５９】
上記真核生物宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
上記哺乳動物宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
組換え宿主細胞が原核生物宿主細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項６２】
原核生物宿主細胞が細菌細胞である請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
細菌細胞が大腸菌細胞である請求項６２に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【公表番号】特表２０１０−５３３１９２（Ｐ２０１０−５３３１９２Ａ）
【公表日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１６１９３（Ｐ２０１０−５１６１９３）
【出願日】平成２０年７月８日（２００８．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６９３９５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００９５２３
【国際公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック，　インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】