ポリペプチドレパートリーから可逆的にアンフォールドするポリペプチドを回収するための方法
【課題】可逆的にアンフォールドするポリペプチドを製造する方法、可逆的にアンフォールドするポリペプチドを選択および/または単離する方法、ならびに可逆的にアンフォールドするポリペプチドを製造する方法の提供。
【解決手段】免疫グロブリン可変ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該免疫グロブリン可変ドメインは、標的リガンドに対して結合特異性を有し、適切なアンフォールド温度まで加熱された場合、可逆的にアンフォールドし、大腸菌で発現される場合、分泌可能であるが、但し、該可変ドメインは、生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである1つ以上のフレームワークアミノ酸を含まず、該免疫グロブリン可変ドメインは、特定のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【解決手段】免疫グロブリン可変ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該免疫グロブリン可変ドメインは、標的リガンドに対して結合特異性を有し、適切なアンフォールド温度まで加熱された場合、可逆的にアンフォールドし、大腸菌で発現される場合、分泌可能であるが、但し、該可変ドメインは、生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである1つ以上のフレームワークアミノ酸を含まず、該免疫グロブリン可変ドメインは、特定のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
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【特許請求の範囲】
【請求項1】
免疫グロブリン可変ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該免疫グロブリン可変ドメインは、標的リガンドに対して結合特異性を有し、適切なアンフォールド温度まで加熱された場合、可逆的にアンフォールドし、大腸菌で発現される場合、分泌可能であるが、但し、該可変ドメインは、生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである1つ以上のフレームワークアミノ酸を含まず、該免疫グロブリン可変ドメインは、配列番号:6のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:
K45E、D、Q、P、NもしくはH;
I48N、P、D、TもしくはG;
Y49N、D、S、C、E、G、KもしくはR;
A50P、N、DもしくはE;
I75NもしくはM;
S31G/Y49D;
Y32S/I75N;
P40S/Y49D;
K45E/I75N;
L46P/A50D/W35G;
S26N/K42T/A50D;
Y32F/K45E/G57E;
Y49D/P80A/Q89R;
Y49N/G68E/Q79R;
T20S/C23W/L46F/Y49N;または
I29V/K42N/K45E/F83L/Y92H
の置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される、単離されたポリペプチド。
【請求項2】
前記適切なアンフォールド温度が、免疫グロブリン可変ドメインの融解温度(Tm)よりも高い請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項3】
前記適切なアンフォールド温度が80℃である請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項4】
標的リガンドがヒト抗原またはエピトープである請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項5】
前記ポリペプチドが抗体の形態である請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項6】
前記ポリペプチドが単一のVHからなる単離されたポリペプチドであって、該免疫グロブリン可変ドメインは、配列番号:3のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:
F27Q、A、H、D、S、GもしくはC;
F29G、S、D、P、QもしくはH;
S30P、D、G、T、LもしくはV;
S31PもしくはD;
Y32D、G、Q、EもしくはP;
A33P、DもしくはG;
S35NもしくはD;
G54R、W、S、P、A、GもしくはV;
S30N/A33D;
S31N/A84D;
V12E/A33P/G55D;
A23V/F27S/G54D;
F27S/A33D/T87S;
S30G/G54D/A98D;
M34L/G52aD/K94E;
L11S/S30G/Y32D/T77M;または
S31N/S62P/E85D/Y96N/W103G
の置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される、請求項5記載の単離されたポリペプチド。
【請求項7】
前記可変ドメインが、50nM〜20pMの解離定数(Kd)および5×10−1s-1〜1×10−7s-1のKoffで前記標的リガンドに結合する請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項8】
前記可変ドメインが、大腸菌で発現される場合、少なくとも0.5mg/Lの量で分泌される請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項9】
前記可変ドメインが、大腸菌で発現される場合、少なくとも1mg/L〜少なくとも1g/mLの量で分泌される請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項10】
レパートリーの少なくとも10%のポリペプチドが、可逆的にアンフォールドし、大腸菌で発現される場合、分泌可能である、抗体可変ドメインポリペプチドのレパートリーであって、該抗体可変ドメインポリペプチドは、
(i)配列番号:6のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:
K45E、D、Q、P、NもしくはH;
I48N、P、D、TもしくはG;
Y49N、D、S、C、E、G、KもしくはR;
A50P、N、DもしくはE;
I75NもしくはM;
S31G/Y49D;
Y32S/I75N;
P40S/Y49D;
K45E/I75N;
L46P/A50D/W35G;
S26N/K42T/A50D;
Y32F/K45E/G57E;
Y49D/P80A/Q89R;
Y49N/G68E/Q79R;
T20S/C23W/L46F/Y49N;または
I29V/K42N/K45E/F83L/Y92H
の置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される;あるいは
(ii) 配列番号:3のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:
F27Q、A、H、D、S、GもしくはC;
F29G、S、D、P、QもしくはH;
S30P、D、G、T、LもしくはV;
S31PもしくはD;
Y32D、G、Q、EもしくはP;
A33P、DもしくはG;
S35NもしくはD;
G54R、W、S、P、A、GもしくはV;
S30N/A33D;
S31N/A84D;
V12E/A33P/G55D;
A23V/F27S/G54D;
F27S/A33D/T87S;
S30G/G54D/A98D;
M34L/G52aD/K94E;
L11S/S30G/Y32D/T77M;または
S31N/S62P/E85D/Y96N/W103G
の置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される、レパートリー。
【請求項11】
前記ポリペプチドがヒト抗体可変ドメインを含む請求項10記載のレパートリー。
【請求項12】
前記ポリペプチドが、バクテリオファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、乳剤分画化およびディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のポリペプチドディスプレイ、ならびに共有結合的ディスプレイからなる群より選ばれるポリペプチドディスプレイシステムにおいてディスプレイされる請求項10記載のレパートリー。
【請求項13】
請求項10〜12いずれか1項記載のポリペプチドのレパートリーをコードする核酸のライブラリー。
【請求項14】
請求項1〜9いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドを含有してなる組成物。
【請求項15】
前記ポリペプチドが5重量%〜99重量%の範囲の量で存在する請求項14記載の組成物。
【請求項16】
請求項1〜9いずれか記載の可逆的にアンフォールドする凍結乾燥ポリペプチドを含有してなる組成物。
【請求項17】
前記可逆的にアンフォールドする凍結乾燥ポリペプチドが、再水和された場合、その活性の20%以下を喪失する請求項16記載の組成物。
【請求項18】
請求項1〜9いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする組換え核酸を含む組換え宿主細胞であって、該組換え核酸が発現制御配列に作動可能に連結されている、組換え宿主細胞。
【請求項19】
前記組換え核酸の発現に適した条件下で請求項18記載の宿主細胞を維持する工程を含み、それにより前記組換え核酸が発現され、前記可逆的にアンフォールドするポリペプチドが製造される、可逆的にアンフォールドするポリペプチドの製造方法。
【請求項20】
可逆的にリフォールドするポリペプチドを選択するための、請求項10〜12いずれか記載のレパートリーまたは請求項13記載のライブラリーの使用。
【請求項21】
前記可逆的にリフォールドするポリペプチドが、可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインを含む請求項20記載の使用。
【請求項22】
前記可逆的にリフォールドするポリペプチドが抗体の形態を含む請求項20記載の使用。
【請求項23】
(a)可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインポリペプチドのアミノ酸配列、(b)それに同一なアミノ酸配列、および(c)1〜10個のアミノ酸の置換、欠失または挿入により、それとは異なるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を提供する工程;および
該アミノ酸配列を含む抗体可変ドメインポリペプチドを合成する工程または該アミノ酸配列をコードする核酸を発現させる工程、それによって可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインポリペプチドが製造される、
を含む、可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインポリペプチドを製造する方法であって、該抗体可変ドメインポリペプチドは、
(i)配列番号:6のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:
K45E、D、Q、P、NもしくはH;
I48N、P、D、TもしくはG;
Y49N、D、S、C、E、G、KもしくはR;
A50P、N、DもしくはE;
I75NもしくはM;
S31G/Y49D;
Y32S/I75N;
P40S/Y49D;
K45E/I75N;
L46P/A50D/W35G;
S26N/K42T/A50D;
Y32F/K45E/G57E;
Y49D/P80A/Q89R;
Y49N/G68E/Q79R;
T20S/C23W/L46F/Y49N;または
I29V/K42N/K45E/F83L/Y92H
の置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される;あるいは
(ii) 配列番号:3のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:
F27Q、A、H、D、S、GもしくはC;
F29G、S、D、P、QもしくはH;
S30P、D、G、T、LもしくはV;
S31PもしくはD;
Y32D、G、Q、EもしくはP;
A33P、DもしくはG;
S35NもしくはD;
G54R、W、S、P、A、GもしくはV;
S30N/A33D;
S31N/A84D;
V12E/A33P/G55D;
A23V/F27S/G54D;
F27S/A33D/T87S;
S30G/G54D/A98D;
M34L/G52aD/K94E;
L11S/S30G/Y32D/T77M;または
S31N/S62P/E85D/Y96N/W103G
の置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される、方法。
【請求項24】
合成したポリペプチドが可逆的にアンフォールドすることを確認する工程をさらに含む請求項23記載の方法。
【請求項25】
前記ポリペプチドが加熱の際に可逆的にアンフォールドする請求項23記載の方法。
【請求項1】
免疫グロブリン可変ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該免疫グロブリン可変ドメインは、標的リガンドに対して結合特異性を有し、適切なアンフォールド温度まで加熱された場合、可逆的にアンフォールドし、大腸菌で発現される場合、分泌可能であるが、但し、該可変ドメインは、生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである1つ以上のフレームワークアミノ酸を含まず、該免疫グロブリン可変ドメインは、配列番号:6のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:
K45E、D、Q、P、NもしくはH;
I48N、P、D、TもしくはG;
Y49N、D、S、C、E、G、KもしくはR;
A50P、N、DもしくはE;
I75NもしくはM;
S31G/Y49D;
Y32S/I75N;
P40S/Y49D;
K45E/I75N;
L46P/A50D/W35G;
S26N/K42T/A50D;
Y32F/K45E/G57E;
Y49D/P80A/Q89R;
Y49N/G68E/Q79R;
T20S/C23W/L46F/Y49N;または
I29V/K42N/K45E/F83L/Y92H
の置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される、単離されたポリペプチド。
【請求項2】
前記適切なアンフォールド温度が、免疫グロブリン可変ドメインの融解温度(Tm)よりも高い請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項3】
前記適切なアンフォールド温度が80℃である請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項4】
標的リガンドがヒト抗原またはエピトープである請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項5】
前記ポリペプチドが抗体の形態である請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項6】
前記ポリペプチドが単一のVHからなる単離されたポリペプチドであって、該免疫グロブリン可変ドメインは、配列番号:3のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:
F27Q、A、H、D、S、GもしくはC;
F29G、S、D、P、QもしくはH;
S30P、D、G、T、LもしくはV;
S31PもしくはD;
Y32D、G、Q、EもしくはP;
A33P、DもしくはG;
S35NもしくはD;
G54R、W、S、P、A、GもしくはV;
S30N/A33D;
S31N/A84D;
V12E/A33P/G55D;
A23V/F27S/G54D;
F27S/A33D/T87S;
S30G/G54D/A98D;
M34L/G52aD/K94E;
L11S/S30G/Y32D/T77M;または
S31N/S62P/E85D/Y96N/W103G
の置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される、請求項5記載の単離されたポリペプチド。
【請求項7】
前記可変ドメインが、50nM〜20pMの解離定数(Kd)および5×10−1s-1〜1×10−7s-1のKoffで前記標的リガンドに結合する請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項8】
前記可変ドメインが、大腸菌で発現される場合、少なくとも0.5mg/Lの量で分泌される請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項9】
前記可変ドメインが、大腸菌で発現される場合、少なくとも1mg/L〜少なくとも1g/mLの量で分泌される請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項10】
レパートリーの少なくとも10%のポリペプチドが、可逆的にアンフォールドし、大腸菌で発現される場合、分泌可能である、抗体可変ドメインポリペプチドのレパートリーであって、該抗体可変ドメインポリペプチドは、
(i)配列番号:6のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:
K45E、D、Q、P、NもしくはH;
I48N、P、D、TもしくはG;
Y49N、D、S、C、E、G、KもしくはR;
A50P、N、DもしくはE;
I75NもしくはM;
S31G/Y49D;
Y32S/I75N;
P40S/Y49D;
K45E/I75N;
L46P/A50D/W35G;
S26N/K42T/A50D;
Y32F/K45E/G57E;
Y49D/P80A/Q89R;
Y49N/G68E/Q79R;
T20S/C23W/L46F/Y49N;または
I29V/K42N/K45E/F83L/Y92H
の置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される;あるいは
(ii) 配列番号:3のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:
F27Q、A、H、D、S、GもしくはC;
F29G、S、D、P、QもしくはH;
S30P、D、G、T、LもしくはV;
S31PもしくはD;
Y32D、G、Q、EもしくはP;
A33P、DもしくはG;
S35NもしくはD;
G54R、W、S、P、A、GもしくはV;
S30N/A33D;
S31N/A84D;
V12E/A33P/G55D;
A23V/F27S/G54D;
F27S/A33D/T87S;
S30G/G54D/A98D;
M34L/G52aD/K94E;
L11S/S30G/Y32D/T77M;または
S31N/S62P/E85D/Y96N/W103G
の置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される、レパートリー。
【請求項11】
前記ポリペプチドがヒト抗体可変ドメインを含む請求項10記載のレパートリー。
【請求項12】
前記ポリペプチドが、バクテリオファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、乳剤分画化およびディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のポリペプチドディスプレイ、ならびに共有結合的ディスプレイからなる群より選ばれるポリペプチドディスプレイシステムにおいてディスプレイされる請求項10記載のレパートリー。
【請求項13】
請求項10〜12いずれか1項記載のポリペプチドのレパートリーをコードする核酸のライブラリー。
【請求項14】
請求項1〜9いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドを含有してなる組成物。
【請求項15】
前記ポリペプチドが5重量%〜99重量%の範囲の量で存在する請求項14記載の組成物。
【請求項16】
請求項1〜9いずれか記載の可逆的にアンフォールドする凍結乾燥ポリペプチドを含有してなる組成物。
【請求項17】
前記可逆的にアンフォールドする凍結乾燥ポリペプチドが、再水和された場合、その活性の20%以下を喪失する請求項16記載の組成物。
【請求項18】
請求項1〜9いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする組換え核酸を含む組換え宿主細胞であって、該組換え核酸が発現制御配列に作動可能に連結されている、組換え宿主細胞。
【請求項19】
前記組換え核酸の発現に適した条件下で請求項18記載の宿主細胞を維持する工程を含み、それにより前記組換え核酸が発現され、前記可逆的にアンフォールドするポリペプチドが製造される、可逆的にアンフォールドするポリペプチドの製造方法。
【請求項20】
可逆的にリフォールドするポリペプチドを選択するための、請求項10〜12いずれか記載のレパートリーまたは請求項13記載のライブラリーの使用。
【請求項21】
前記可逆的にリフォールドするポリペプチドが、可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインを含む請求項20記載の使用。
【請求項22】
前記可逆的にリフォールドするポリペプチドが抗体の形態を含む請求項20記載の使用。
【請求項23】
(a)可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインポリペプチドのアミノ酸配列、(b)それに同一なアミノ酸配列、および(c)1〜10個のアミノ酸の置換、欠失または挿入により、それとは異なるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を提供する工程;および
該アミノ酸配列を含む抗体可変ドメインポリペプチドを合成する工程または該アミノ酸配列をコードする核酸を発現させる工程、それによって可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインポリペプチドが製造される、
を含む、可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインポリペプチドを製造する方法であって、該抗体可変ドメインポリペプチドは、
(i)配列番号:6のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:
K45E、D、Q、P、NもしくはH;
I48N、P、D、TもしくはG;
Y49N、D、S、C、E、G、KもしくはR;
A50P、N、DもしくはE;
I75NもしくはM;
S31G/Y49D;
Y32S/I75N;
P40S/Y49D;
K45E/I75N;
L46P/A50D/W35G;
S26N/K42T/A50D;
Y32F/K45E/G57E;
Y49D/P80A/Q89R;
Y49N/G68E/Q79R;
T20S/C23W/L46F/Y49N;または
I29V/K42N/K45E/F83L/Y92H
の置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される;あるいは
(ii) 配列番号:3のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:
F27Q、A、H、D、S、GもしくはC;
F29G、S、D、P、QもしくはH;
S30P、D、G、T、LもしくはV;
S31PもしくはD;
Y32D、G、Q、EもしくはP;
A33P、DもしくはG;
S35NもしくはD;
G54R、W、S、P、A、GもしくはV;
S30N/A33D;
S31N/A84D;
V12E/A33P/G55D;
A23V/F27S/G54D;
F27S/A33D/T87S;
S30G/G54D/A98D;
M34L/G52aD/K94E;
L11S/S30G/Y32D/T77M;または
S31N/S62P/E85D/Y96N/W103G
の置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される、方法。
【請求項24】
合成したポリペプチドが可逆的にアンフォールドすることを確認する工程をさらに含む請求項23記載の方法。
【請求項25】
前記ポリペプチドが加熱の際に可逆的にアンフォールドする請求項23記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3−1】
【図3−2】
【図3−3】
【図3−4】
【図3−5】
【図3−6】
【図4−1】
【図4−2】
【図4−3】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図2】
【図3−1】
【図3−2】
【図3−3】
【図3−4】
【図3−5】
【図3−6】
【図4−1】
【図4−2】
【図4−3】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【公開番号】特開2012−70743(P2012−70743A)
【公開日】平成24年4月12日(2012.4.12)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−246170(P2011−246170)
【出願日】平成23年11月10日(2011.11.10)
【分割の表示】特願2006−530506(P2006−530506)の分割
【原出願日】平成16年5月14日(2004.5.14)
【出願人】(502197046)ドマンティス リミテッド (47)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成24年4月12日(2012.4.12)
【国際特許分類】
【出願日】平成23年11月10日(2011.11.10)
【分割の表示】特願2006−530506(P2006−530506)の分割
【原出願日】平成16年5月14日(2004.5.14)
【出願人】(502197046)ドマンティス リミテッド (47)
【Fターム(参考)】
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