ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体、並びに細胞維持及び分化のための方法
本発明は、ナノフィブリル構造体を有する製品向けの、細胞付着性ポリマーコーティングを提供する。上記コーティングは、少なくとも１種のペンダント型アミン基を有する、合成の、非生分解性ポリマーを含み、前記ポリマーは、潜在性反応性基により、上記製品上に共有結合で固定されている。本発明はまた、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体を用いて、細胞を長期間培養するための方法を提供する。本発明のポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体は、神経前駆細胞を含む、細胞の増殖及び分化のために特に有用であることが見出された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、「ポリマーコーティン並びに細胞維持及び分化のための方法」と題する、２００５年７月２０日に出願された、シリアルナンバー第６０／７００，８６０号を有する米国仮出願；「ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体、並びに細胞維持及び分化のための方法」と題する、２００５年９月２２日に出願されたシリアルナンバー第６０／７１９，３５１号を有する米国仮出願；及び「ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体、並びに細胞維持及び分化のための方法」と題する２００６年２月３日に出願されたシリアルナンバー第６０／７６４，８４９号を有する米国仮出願の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、非生分解性アミン提供ポリマーを含むコーティングを有するナノフィブリル構造体と、これらのコーティングを含む表面への細胞の付着を促進するための方法とに関する。本発明はまた、細胞を分化する方法と、これらのコーティングを有する細胞を維持するための方法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞接着及び増殖に好適な表面を提供するために、種々のアプローチが用いられている。多くの細胞は足場依存的であり、それらが、増殖又は分化のために、基剤へのいくつかのタイプの接着を証明しなければならないことを意味する。ｉｎ ｖｉｖｏで、細胞は、上にある上皮又は内皮を支持する構造体である基底膜中に存在するたんぱく因子に接着することができる。上記基底膜は、基底板と称される膜と、下にあるコラーゲン原線維のネットワークとから成る。細胞接着及び増殖のための優れた基剤を提供することができるため、基底膜内に見出される成分に基づいた、細胞接着用の人工表面が作成されている。上記人工表面は、ｉｎ ｖｉｖｏ、例えば、移植可能な医療装置、及びｉｎ ｖｉｔｒｏ、例えば、細胞培養製品中で用いられている。
【０００４】
細胞を基層に接着させるために、荷電表面が用いられている。しかし、培養工程の際に、荷電表面の全てが、細胞の十分な接着に好適というわけではない。例えば、いくつかのマイナスに帯電した表面は、好適な基剤を供給しない。というのは、多くの細胞は、細胞が表面に接着することを媒介するために十分な量の、正に帯電したタンパク質を示さないからである。
【０００５】
天然のポリペプチド系細胞接着因子、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンが、細胞の基剤への接着を強化するために用いられている。生分解性合成ポリマーカチオン、例えば、ポリリジン及びポリオルニチンが、種々の足場依存性細胞種の接着を促進するコーティングを提供するために用いられている。これらの種類のポリマー物質を用いることに伴う課題の一つは、当該物質が、培養の液体培地内に存在することとなる場合があるプロテアーゼか、又は血清中にｉｎ ｖｉｖｏで存在するプロテアーゼにより、長期間にわたり分解されうることである。従って、これらの物質を含む表面は、限定的な期間のみ、細胞接着のために有用である場合がある。細胞付着性に関連する特性は、上記コーティング内に存在する物質の分解により、ある程度解決することができる。
【０００６】
さらに、細胞接着を促進するために用いられているいくつかのコーティングはまた、コーティング物質が上記製品の表面に適切に接着しないと、当該コーティングから失われる場合があるとの観点から問題となる場合がある。次いで、これらの物質が、液体培地又は体液中に存在し、そして当該体液と接触する細胞に影響を与える可能性がある。例えば、上記コーティングから失われたポリマー物質は、上記細胞の表面と結合し、そして細胞が上記基剤に接着することに影響を与える可能性があるか、又は培養物中の細胞−細胞相互作用に影響を与える可能性がある。いくつかのポリマー物質はまた、細胞の生存に有害な場合がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、細胞を培養することを含む工程において用いられる製品向けの、改良されたポリマーコーティングを提供する必要がある。上記改良されたコーティングは、一次細胞、培養することが難しい細胞系、及び幹細胞の維持及び分化を含む方法の利益となる有用な細胞培養製品を規定することができる。上記コーティングをまた、ｉｎ ｖｉｖｏで使用するための移植可能な医療用製品の表面をコーティングするために用いることができる。従って、上記コーティングは、数多くの疾患及び病気を治療するための、組織特異再生技術の利益となるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
態様の一つでは、本発明は、細胞を培養するための方法、そして特に、長期間（長期間培養）培養において、細胞を保持するための方法に有用な細胞培養製品向けのコーティングを提供する。本明細書において、培養は、代謝的に活性な細胞を、ポリマーコーティングを有するナノフィブリル構造体を含む細胞培養製品に置くことを含む方法を指す。本発明のポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体は、ポリマーコーティングの安定性に起因する、長期間の細胞培養のために理想の表面を提供し、細胞接着のための優れた表面及び多種多様の細胞種を培養するための広範な適用性を提供することできることを示している。
【０００９】
ナノフィブリル構造体は、約１０００ｎｍ以下、例えば、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲、そしてさらに好ましくは約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲の平均径を有する繊維構造体であるナノ繊維のメッシュ様ネットワークを指す。いくつかの態様では、上記ナノフィブリル構造体は、ポリマー溶液のエレクトロスピニングを含む方法により生成する。いくつかの態様では、上記ナノフィブリル構造体には、ポリアミド、ポリエステル、同様の合成ポリマー、又はそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの態様では、上記ポリアミドは、ナイロンポリマーから選択される。さらに他の態様では、上記ナノ繊維は、水−又はアルコール−不溶性ナノ繊維を供給するために、水−又はアルコール−可溶性ナイロンポリマーの架橋を含む方法により生成されている。
【００１０】
多くの態様では、上記ナノフィブリル構造体は、別の細胞培養製品と併せて用いられている。上記ナノフィブリル構造体は、細胞培養面、例えば、細胞培養容器の表面に配置させるように、適合又は構成されうる。細胞培養容器の例には、複数のウェルのプレート、皿及びフラスコが含まれる。従って、ナノフィブリル構造体を、培養容器、例えば、細胞培養のウェル内に配置させるために好適な形状の中で得ることができ、そして細胞培養工程を、上記ウェルの表面（例えば、底面）上のナノフィブリル構造体と共に、上記細胞培養のウェル内で実施することができる。
【００１１】
細胞を、液体培地内で、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体上で培養し、所望の代謝的に活性な細胞状態を提供することができる。上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体を用いて、上記細胞が、休止（非増殖及び非分化状態）、細胞増殖の状態及び細胞分化の状態にある状態を含む、１つ又は２つ以上の代謝的に活性な細胞状態を促進することができる。
【００１２】
本発明の別の態様では、上記コーティングを、ナノフィブリル構造体を含む移植可能な医療装置上に供給する。いくつかの方式では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで提供されるような上記コーティングの機能と同様に、上記コーティングをこれらの表面に用いて、細胞接着を促進することができる。これは、組織形成、上皮形成及び血管形成の促進を含む、多くの用途に有用である。
【００１３】
本発明のポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体は、ペンダント型アミン基を有する非生分解性ポリマーを含み、上記コーティングはまた、１種又は２種以上の潜在性反応性基（ｌａｔｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ）を含む。上記コーティングでは、上記潜在性反応性基の少なくとも一部が反応して、上記ポリマーを、上記ナノフィブリル構造体の表面に共有結合させる。
【００１４】
上記コーティングでは、上記潜在性反応性基を、ペンダント型潜在性反応性基として、上記ポリマーに供給することができる。あるいは、ペンダント型潜在性反応性基を、上記ポリマーから独立した化合物（例えば、架橋剤）に含ませ、次いで、上記ポリマーを上記ナノフィブリル構造体の表面に結合させるために用いることができる。
【００１５】
潜在性反応性基は、特定の適用された外部刺激に応答し、ターゲットとの得られた共有結合を有する活性種の生成をうける基を指す。上記潜在性反応性基は、外部の電磁気又は運動（熱）エネルギーを吸収した際に、活性種、例えば、フリーラジカル、ニトレン、カルベン、及びケトンの励起状態を発生させる。態様の一つでは、上記潜在性反応性基は、活性状態に活性化し、上記ポリマー及び細胞培養製品の表面を結合させる光反応性基である。例示的な光反応性基には、アリールケトン、例えば、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様複素環（例えば、アントロンの複素環式類似体、例えば、１０位に窒素、酸素又は硫黄を有するもの）、又はそれらの置換誘導体（例えば、環置換誘導体）が含まれる。
【００１６】
上記ペンダント型潜在性反応性基を介した結合により、上記ポリマーを上記表面に最適に形成させ、細胞付着性を促進させるコーティングが提供されると考えられる。
【００１７】
上記ナノ繊維上のポリマーコーティングは、上記ナノフィブリル構造体への細胞接着を促進するアミン基を供給する。
本発明のいくつかの態様では、本発明のポリマーは、次の式：
−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
（式中、Ｒ1は下記：
【化１】
であり、
Ｒ2は、Ｃ1〜Ｃ8の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そして
Ｒ3及びＲ4は、共に上記窒素に結合し、そして個々に、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキルである）
のペンダント型アミン含有基を含む。
【００１８】
いくつかの態様では、Ｒ1は下記：
【化２】
であり、Ｒ2は、Ｃ2〜Ｃ4の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そしてＲ3及びＲ4は、共に上記窒素に結合し、そして個々に、Ｈ、ＣＨ3又はＣ2Ｈ5である。
【００１９】
例示的なアミン含有基には、重合性モノマー、例えば、３−アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ）、３−アミノエチルメタクリルアミド（ＡＥＭＡ）及びジメチルアミノプロピルメタクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）上に見出されるものが含まれる。いくつかの態様では、ペンダント型アミン基及び潜在性反応性基を含むポリマーは、上記基−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4を有するモノマーを、潜在性反応性基を有するコモノマーと共重合することにより生成させうる。他の態様では、ポリマーは、式Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4を有するモノマーを重合させ、次いで１種又は２種以上のペンダント型アミン基を、潜在性反応性基を有する化合物と反応させて生成させうる。
【００２０】
他の態様では、ペンダント型アミン基を有するポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）及びポリアミドアミンから選択される。ＰＥＩは、エチレンイミンを重合して生成させることができ；所望により、重合性基及び潜在性反応性基を有するモノマーをエチレンイミンと共重合して、ペンダント型潜在性反応性基を有するＰＥＩを生成することができる。特定の態様の一つでは、上記ポリマーには、１種又は２種以上の潜在性光反応性基を有するポリエチレンイミンが含まれる。
【００２１】
少なくとも１種のペンダント型アミン及び少なくとも１種の潜在性反応性基を有するポリマーを含むコーティングを、任意の好適な方法を用いて、上記ナノフィブリル構造体の表面に生成させることができる。上記コーティングを生成させるための方法の一つには、事前生成したポリマーをナノフィブリル表面上に配置し、次いで、上記潜在性反応性基を活性化して、上記ポリマーを上記表面に結合させることが含まれる。いくつかの態様では、上記潜在性反応性基は、上記ポリマー由来のペンダントであることができる。他の態様では、上記潜在性反応性基は、上記ポリマーから独立していてもよい。あるいは、モノマー物質を上記ナノフィブリル表面で重合して、当該表面に上記ポリマーを結合させる１種又は２種以上の潜在性反応性基を有するポリマー及びペンダント型アミンを生成させることができる。
【００２２】
本発明のポリマーコーティングは、ナノフィブリル構造体を含む、種々の細胞培養製品の調製に有用であることが示された。上記ナノフィブリル構造体を、複数のウェルの細胞培養プレート、細胞培養皿、細胞培養袋、細胞培養チューブ、マイクロキャリア及び細胞培養瓶を含む細胞培養製品と連結することができる。
【００２３】
上記ナノフィブリル構造体は、例えば、コーティングされたナノフィブリル構造体と併せて用いられる、培養すべき特定の一又は複数の細胞種、培養すべき複数の細胞、培養の期間、そして所望による細胞培養機器に基づいて、上記細胞培養工程の１つ又は２つ以上の態様に最適である寸法を有するように作成されうる。いくつかの態様では、上記ナノフィブリル構造体は、複数のウェルの細胞培養機器と併せて用いるために好適な面積及び深さを有する。例えば、支持体上に生成させた、ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体を、複数のウェルの培養機器のウェル内に適合するように形成させることができる。上記ナノフィブリル構造体の深さは変わることができるが、約０．１μｍ〜１０μｍの範囲の深さが見出されており、そして約１μｍ〜約５μｍの範囲が、細胞培養向けの特に有効な基剤を供給することができる。
【００２４】
上記ナノフィブリル構造体はまた、各ナノ繊維の間に所望の間隔を有するナノ繊維のネットワークを供給するように加工することができ、当該間隔は、上記構造体中の孔に似ている。多くの態様では、ネットワークを連結する上記ナノ繊維は、上記各繊維の間に比較的小さな間隔、例えば、約０．０１μｍ〜約２５μｍ、そしてある場合には、約０．２μｍ〜約１０μｍを有する。
【００２５】
３次元のナノ繊維系細胞培養製品のコーティング面は、細胞を接着させることができる足場と似ている場合がある。上記各ナノ繊維の間の間隔及び上記ナノフィブリル構造体上で培養される一又は複数の種類の細胞にもよるが、上記細胞を、２次元又は３次元で培養することができる。２次元の培養工程では、一般的に一つの面内で、コーティングされたナノ繊維に細胞を接着することができ、一方、３次元の培養工程では、上記細胞を、ナノ繊維のネットワーク内の一つ超の面内で、上記ナノ繊維に接着することができる。
【００２６】
上記ナノフィブリル構造体を、細胞培養工程に好適な形態で供給することができる。いくつかの態様では、上記ナノフィブリル構造体を、支持体上に供給する。上記支持体を、ガラス基材、例えば、ガラス顕微鏡スライド、カバーガラス、ミクロスフェア及びガラスフィルム；ポリマー基材、例えば、ポリマーフィルム；及び細胞培養向けに好適な他の生体物質基材から選択することができる。上記支持体は、細胞培養装置の調製及び／又は使用に有用な一定の特性を有することができる。いくつかの特定の態様では、上記支持体は、１つ又は２つ以上の特性、例えば、可操作度及び／又は可とう性、耐殺菌性、耐放射線分解性、化学的不活性性、透明性、不燃性及び滑らかな表面特性を有する。いくつかの特定の態様では、上記支持体には、ハロゲン化した熱可塑性樹脂、例えば、ハロゲン化フッ素化−塩素化樹脂が含まれる。具体的には、上記支持体は、クロロトリフルオロエチレン（ＣＴＦＥ）を含むことができる。他の特定の態様では、上記支持体は約０．２５ｍｍ以下である。
【００２７】
細胞培養製品を調製するための、そして細胞を培養する方法における多くの優位性が、本明細書に記載される本発明の知見に基づいて明白になった。
第一に、ペンダント型アミン基及び潜在性反応性基を有するポリマーを含むコーティングを使用することにより、ナノフィブリル構造体に付着面（すなわち、細胞付着性に関する）を供給する非常に有効且つ効率的な方式が供給される。多くの場合には、上記ポリマーを含む液状組成物を、ナノフィブリル構造体に適用し、次いで処理し、それにより上記液状組成物により接触された上記ナノ繊維の一部又は全部の上にポリマー物質のコーティングを生成することができる。いくつかのケースでは、ポリマー物質のコーティングを、上記ナノフィブリル構造体の一部、例えば、上記培養工程の際、細胞が接触する部分に生成させることができる。これは、上記ナノ繊維を生成させるために用いられる物質が、必ずしも必要でないので、経済的に優位でありうる。
【００２８】
本明細書に記載される上記コーティング組成物及び方法はまた、上記ナノ繊維により供給される構造体全体の形態を妥協せずに、付着面を供給することができる。本発明の方法は、上記ナノ繊維の表面に、極めて薄いが、非常に有効なポリマーコーティング層を供給する。すなわち、上記ナノフィブリル構造体の表面全体よりはむしろ、個々のナノ繊維の周りに、ポリマーコーティングを生成させる。従来のポリマーコーティング法（例えば、ポリマーを、基材上で乾燥させる）は、上記表面のコーティングのウェビングを生じさせ、そして上記ナノ繊維表面の形態を変化させる場合がある。しかし、本発明のポリマーコーティングは、非常に薄く、そして上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維の寸法に比例する。
【００２９】
ペンダント型アミン基を有するポリマーを有するコーティングを含むナノフィブリル構造体は、培養工程の際に、細胞の強い付着を促進することができる。これにより、上記コーティングに接着するためのある程度の足場依存性を示し、そして培養される細胞の種類及び当該細胞が培養される培地の種類にもよるが１種又は２種以上の代謝活性を示す細胞が可能となる。従って、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体は、非付着性であるか、付着性に乏しいか、又は適度な付着性を有する細胞を培養するために特に有用である。本発明のポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体はまた、細胞増殖及び分化を可能とするコーティングを提供するために特に有用である。
【００３０】
本発明は、非常に安定であり且つ細胞培養工程に有用であるポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体を提供する。従って、本発明のこれらの構造体は、長期間の細胞の培養を含む手順に特に有用である。
【００３１】
これらの態様では、上記アミン提供ポリマーが、上記培養培地の存在下で分解せず、従って、相当の期間にわたる培養において細胞の付着を促進するために用いることができるので、本発明のポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体は、特に有利であることが見出された。これは、分解性天然ポリマー、例えば、ポリペプチド及び多糖類、並びに生分解性合成ポリマーから主として構成されるコーティングとの比較である。これらの種類の生分解性コーティングは、より短期間（例えば、数週間）で分解し、そして培養において細胞の付着を促進するそれらの能力を失う場合がある。
【００３２】
さらに、本発明のポリマーは、上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面と共有結合しているので、当該表面からアミン提供ポリマーの損失が最小であるか、又は当該ポリマーの損失がない。これは、多くの点で有利である；第一に、培養の間、上記表面に接着するか又は接着して残る上記細胞の能力が変化しないであろう。すなわち、ナノフィブリル表面に接着するアミン提供ポリマーの量は、長期にわたって有意に変化しないであろう。第二に、上記培養中に、アミン提供ポリマーが損失するリスクが最小である。
【００３３】
これはまた有利である、というのは、そうでないと、上記培養中に失われたポリマーが、上記細胞の特性を変化させる可能性があるからである。例えば、上記細胞は、非付着性となりうるか、又は上記細胞の表面のたんぱく質により運搬される他の特性を失う場合がある。さらに、ある場合には、上記コーティング面から上記培地中に失われた特定の種類のポリマーが、上記細胞に対する毒性を有する可能性がある。例えば、種々の培養系における２５ｋＤａ以上の分子量を有するいくつかのポリエチレンイミンの場合、ＰＥＩを細胞外に添加した場合に、毒性が報告されている（Ｆｉｓｃｈｅｒらの「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．」（１９９８）４８，１０８；Ｆｉｓｃｈｅｒらの「Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．」（１９９９）１６，１７２３−１７２９）。従って、本発明のポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体は、先行技術において細胞接着及び培養を促進するために従来用いられているコーティングに見出されるいくつかの欠点を克服する。
【００３４】
上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体上の本発明のコーティングは、非生分解性アミン提供ポリマーを含むが、他の非生分解性物質又は分解性物質、例えば、生分解性ポリマー又は生活性分子が、上記コーティング中に存在することができる。例えば、生分解性ポリマーが上記コーティング中に存在し、そしてより短期間、細胞を培養するための優位性を提供することができる一方で、上記非生分解性ポリマーは、上記コーティング中に存在したままであり、そして長期間、付着面を提供することができる。
【００３５】
いくつかの態様では、本発明は、ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体上で細胞を培養するための方法を提供する。当該方法は、ナノフィブリル構造体を得る段階を含み、当該ナノフィブリル構造体は、上記ポリマーを上記製品の表面に結合させる、少なくとも１種のペンダント型アミン基及び少なくとも１種の潜在性反応性基を有する非生分解性合成ポリマーを含むコーティングを有する。次いで、典型的には環境（液体培地）内で、細胞を、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体と接触して置く。上記細胞が所望の生理状態に維持されうるか、又は所望の生理状態を有するように誘導されうるように、当該細胞を、上記ナノフィブリル細胞培養製品上の上記コーティングに付着させることができる。
【００３６】
いくつかの態様では、上記方法は、長期間、上記細胞を液体培地内で培養する段階を含む。「長期間」は、１４日超の期間を指すのが一般的である。適応があれば、「長期間」は、２１日超、２８日超、３５日超、４２日超、４９日超又は５６日超であることができる。従って、いくつかの態様では、上記細胞をまた、約１４〜約６０日の範囲にわたる期間、培養物中に保持することができる。本発明の明確に区別できる優位性は、細胞付着を促進することができる新鮮なコーティングを有する新しいナノフィブリル培養製品に、上記細胞を移動させる必要がないことである。しかし、長期間の培養の際には、上記液体培地を、例えば、置換又は補給により変化させて、所望の生理状態を得るために好適な環境を提供することができる。
【００３７】
いくつかの態様では、上記培養工程の期間、上記方法を用いて、細胞を、代謝活性が低い状態に維持（例えば、休止細胞の維持）することができる。すなわち、いくつかの態様では、上記細胞内の代謝性変化、例えば、上記細胞の形態を変化させることができるものを促進することなく、適切な培地中で、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造上で細胞を維持することができる。この方法はまた、細胞を維持するために有用であることができ、そして細胞増殖により細胞の個体群を増やすことができる。本発明のポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造を用いた細胞培養において維持することができる例示的な細胞種には、未分化細胞、例えば、幹細胞、又は部分的若しくは完全に分化した細胞種、例えば、肝細胞、膵島細胞、神経細胞及び星状細胞が含まれる。上記未分化細胞は、多分化能の、全能の又は多能性の細胞種を含むことができる。
【００３８】
この点では、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体が、一定の期間にわたり、コーティングされた製品を置き換える必要がない、細胞の長期間の維持のために用いられうるコーティングされた製品を提供するという点で特に有用である。
【００３９】
他の態様では、培養工程の期間、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体を、細胞の分化を促進するための方法に用いることができる。任意の好適な事前分化又は前駆細胞種を用いることができる。上記方法は、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体を得る段階、次いで事前分化細胞を上記構造体に置く段階を含むことができ、そこでは、上記細胞が、コーティングされた構造体に付着する。上記方法はまた、上記細胞の代謝活性を変化させることができる成分を含む環境（液体培地）の存在下で、上記細胞を培養する段階を含み、１つ又は２つ以上の細胞の態様、例えば、細胞形態に変化がもたらされる。
【００４０】
上記成分は、上記事前分化細胞の成熟を、部分的又は完全に分化した状態へと促進させる任意の種類の成分を指す分化因子でありうる。次いで、上記方法は、長期間にわたり、ナノフィブリルのコーティング面と接触している上記細胞を分化させる段階を含む。いくつかの態様では、１４日超、２１日超、２８日超、３５日超、４２日超、４９日超又は５６日超の期間、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体上で、上記細胞を分化させることができる。いくつかの態様では、上記細胞の初期接種密度にもよるが、上記細胞をまた、約１４〜約６０日の範囲の期間、分化させることができる。長期間の培養の間、上記液体培地を、例えば、置換又は補給により変化させ、所望の生理状態を得るために好適な環境を提供することができる。
【００４１】
本発明に従って分化させることができる例示的な細胞種には、一次細胞、神経前駆細胞、骨髄細胞、幹細胞、例えば、胚（胚盤胞由来）幹細胞等が含まれる。
【００４２】
いくつかの態様では、上記方法は、神経前駆細胞の成熟を、所望の分化した神経細胞種へと促進させるために用いられる。本発明のポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体は、神経前駆細胞の接着を促進し、次いで、１又は２以上の所望の分化因子の存在下で、長期間培養することができることが示された。
【００４３】
上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体は、神経突起の外殖及び／又は伸張を促進する一方で、同一培地条件の下で従来型のコーティングがなされた製品上で培養した神経前駆細胞は生き残らなかった。上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体はまた、コーティングされたナノ繊維上で増殖する一部の神経細胞内の成熟した神経細胞マーカーの発生を促進する。上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体はまた、神経前駆細胞の構造を星状細胞へと促進させることが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下に記載される本発明の実施形態は、次の詳細な説明に開示される正確な形態に本発明を制限するか、又は網羅的であることを目的とするものではない。むしろ、上記実施形態は、当業者が本発明の原理及び実施を正しく評価し、かつ理解することができるように選択及び記載されている。
【００４５】
本明細書で言及される全ての出版物及び特許を、参照により本明細書に組み入れる。本明細書に開示される出版物及び特許は、単にそれらの公表のために提供されている。発明者が、先行する任意の出版物及び／又は特許（本明細書で引用される任意の出版物及び／又は特許を含む）に権利を与えないことの自認として解釈される。
【００４６】
いくつかの態様では、本発明は、ナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面に、コーティングを付与するための試薬及び方法を提供し、上記コーティングには、少なくとも１種のペンダント型アミン基及び少なくとも１種の潜在性反応性基を有するポリマー物質が含まれ、上記ポリマー上の少なくとも１種の潜在性反応性基は、上記ポリマーを、上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面に結合させるために用いられる。
【００４７】
「細胞培養製品」は、細胞培養機器の任意の一部を指す。例えば、細胞培養製品は、ナノフィブリル構造体を有する製品でありうる。細胞培養製品はまた、細胞培養工程で用いられるレセプタクル、例えば、細胞培養容器であることができる。ある場合には、２又は３以上の細胞培養製品（例えば、ナノフィブリル構造体及び細胞培養容器）が、細胞培養機器を形成する；他の場合では、単一の細胞培養製品、例えば、上記ナノフィブリル構造体が、細胞培養機器を形成する。
【００４８】
「ナノフィブリル構造体」は、ナノ繊維のメッシュ様ネットワークを指す。ナノフィブリル構造体は、細胞培養製品であることができ、そして細胞培養機器の任意の種類に含まれることができ、ここで、細胞接着は所望であるか、又は細胞培養工程が実施される。多くの場合には、ナノ繊維のネットワークを含む製品は、１種又は２種以上の他の非ナノ繊維物質に加えて、ナノ繊維のネットワークを含む。例えば、ナノフィブリル構造体は、支持体上に、ナノ繊維のネットワークを含むことができ、ここで、当該支持体は、上記ナノ繊維とは異なる物質から形成される。ナノフィブリル構造体をまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養工程内で用いられない製品と共に用いることができる。
【００４９】
上記ナノフィブリル構造体を、別の細胞培養製品の表面、例えば、細胞培養容器上に置くことができる。多くの態様では、上記ナノフィブリル構造体を、別の製品に「挿入するために適合」させることができる。これは、上記ナノフィブリル構造体を、別の製品、例えば、細胞培養容器の１つ又は２つ以上の表面の寸法内、又は当該寸法まで用いるために製造又は形成することができることを意味する。上記ナノフィブリル構造体は、一片の当該ナノフィブリル構造体を、例えば、連結シート、ロール又はマットから、例えば、上記培養容器の表面に挿入するために好適なサイズに切断することにより、上記培養容器の表面の寸法内又は当該寸法まで用いるための大きさに作ることができる。
【００５０】
「細胞培養容器」は、細胞培養製品の一例であり、そして本明細書において、上記ナノフィブリル構造体と連結することができ、そして細胞又は組織を培養するための培地を含むことができるレセプタクルを意味する。上記細胞培養容器は、ガラス又はプラスチックであることができる。当該プラスチックは、非細胞毒性であることが好ましい。例示的な細胞培養容器には、単一及び複数のウェルのプレート、例えば、６個のウェル及び１２個のウェルの培養プレート及びより小さなウェルの培養プレート（ｗｅｌｌｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ）、例えば、９６、３８４及び１５３６個のウェルのプレート、培養ジャー、培養皿、ペトリ皿、培養フラスコ、培養プレート、培養ローラーボトル、培養スライド、例えば、チャンバー化（ｃｈａｍｂｅｒｅｄ）及び複数チャンバー化培養スライド、培養管、カバーガラス、カップ、スピナーボトル、かん流チャンバー、バイオリアクター及び発酵槽が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
ナノフィブリル構造体は、本明細書において、密集して織り込んだ、もつれさせた、又は付着させたナノ繊維の素材（ｍａｓｓ）を意味する「マット」の状態であることができる。上記マット内のナノ繊維の分布は、ランダムであるか、又は配向されていることができる。マットは、織られていないか、又はネットであることができる。マットは、支持体上に堆積させることも堆積させなくともよい。マットは、約１００ｎｍ〜約１０，０００ｎｍ又は約１０００ｎｍ〜約５０００ｎｍの厚さを有する。
【００５２】
本発明のポリマーコーティングを、ナノフィブリル構造体の任意の種類の好適なナノ繊維上に形成させることができる。いくつかの態様では、１又は２以上の細胞種の増殖及び分化に十分な表面を供給するナノフィブリル構造体を有する細胞培養製品を供給することが望ましい。上記製品は、分化する細胞の特定の形態を支持する表面を理想的に有する。例えば、神経前駆細胞の分化のケースでは、上記ナノフィブリル表面により、神経突起の形成、又は１０μｍ超若しくは２００μｍ超である神経性細胞の他の特徴が可能となる。
【００５３】
培養する細胞の種類及び生成の方法にもよるが、細胞が、上記ナノフィブリル構造体の一つの面又は一つ超の面内で増殖することができる。概して、ナノフィブリル構造体を含む細胞培養製品のコーティング面は、細胞が接着する足場と似ている。
【００５４】
上記ポリマーコーティングを、ナノフィブリル構造体のナノ繊維上に生成させることができ、上記ナノ繊維を多種多様の物質から作成することができる。上記ナノフィブリル構造体を生成させるために用いられる物質を、本明細書で、「ナノ繊維物質」と称し、一方、上記ナノ繊維上にポリマーコーティングを生成させるために用いられる物質を、本明細書で、「コーティング物質」と称する。
例示的なナノフィブリル構造体は、米国特許出願公開第２００５／００９５６９５号明細書に記載されている。
【００５５】
上記ナノフィブリル構造体は、１種又は２種以上のナノ繊維を含む、代謝的に活性な細胞を培養するための環境を提供し、ここで、当該構造体は、１種又は２種以上のナノ繊維のネットワークにより規定される。いくつかの実施形態では、上記ナノフィブリル構造体は基剤を含み、ここで、上記ナノフィブリル構造体は、上記基剤の表面に堆積した１種又は２種以上のナノ繊維のネットワークにより規定される。上記ナノフィブリル構造体の間隔における、ナノ形態、上記ナノ繊維ネットワークの形態及び上記ナノ繊維ネットワークのナノ繊維の配置を作り変えて、単層又は複層化された細胞培養物内の同型又は異型の細胞増殖及び／又は細胞分化を促進するために相性がよい組織であるｉｎ ｖｉｔｒｏの生体模倣基層を供給する。上記ナノフィブリル構造を層状にして、複層化されたナノフィブリルアセンブリ、細胞のアレイ又は組織構造体を生成する。
【００５６】
本明細書において、用語「ネットワーク」は、増殖及び培養安定性を促進するように選択された各繊維間の間隔との相互接続ネットを形成するように制御されている間隔におけるナノ繊維のランダム又は配向した分布を意味する。上記ネットワークは、当該ネットワーク内のチャネル又は孔を形成するネットワークを含む各繊維間の小さな間隔を有する。上記孔又はチャネルは、厚さ方向に（ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）、約０．０１μｍ〜約２５μｍ、そしてさらに典型的には、約０．２μｍ〜約１０μｍの直径を有する。有利には、上記ナノ繊維上に生成する上記ポリマーコーティングは、上記孔又はチャネルの直径を顕著に小さくすることはない。
【００５７】
ネットワークは、ナノ繊維の単層、連続的なナノ繊維により生成した単層、ナノ繊維の複合膜、連続的なナノ繊維により生成した複層膜、又はマットを含むことができる。上記ネットワークは、織られていないか、又はネットであることができる。ネットワークは、単一ナノ繊維の直径付近〜約１０μｍの厚さを有することができる。テクスチャ、しわ、接着力、多孔性、固体率（ｓｏｌｉｄｉｔｙ）、弾性、幾何学的形態、相互接続性（ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）、比表面積、繊維直径、繊維溶解性／不溶性、親水性／疎水性、フィブリル密度及び繊維配向を含む（それらに限定されるものではない）ネットワークの物理的性質を、所望のパラメータに作り変えることができる。
【００５８】
有利には、本発明のポリマーコーティングを、ナノ繊維のネットワークにより提供される有益な特性を大きく変化させることなく、上記ナノ繊維上に生成させることができる。例えば、上記ポリマーコーティングは、当該ポリマーコーティングが生体模倣基層としてのその機能を減らすような方式で、上記ナノフィブリル構造体の構造上の特徴を変えることはない。
本明細書において、用語「ナノ繊維」は、約１０００ｎｍ以下の直径を含む、ポリマーの細繊維（ｆｉｎｅ ｆｉｂｅｒ）を意味する。
【００５９】
広範囲のポリマー物質を、上記ナノフィブリル構造体の調製時に、ナノ繊維物質として用いることができる。ナノ繊維物質には、付加ポリマー物質及び縮合ポリマー物質の両方、例えば、ポリオレフィン、ポリアセタール、ポリアミド、ポリエステル、セルロースエーテル及びエステル、ポリアルキレンスルフィド、ポリアリーレンオキシド、ポリスルホン、変性ポリスルホンポリマー及びそれらの混合物が含まれうる。
【００６０】
これらの一般的な分類内の例示的な物質には、ポリエチレン、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ラクテート）、ポリ（グリコレート）、ポリプロピレン、ポリ（ビニルクロリド）、ポリメチルメタクリレート（及び他のアクリル）、ポリスチレン及びそれらのコポリマー（ＡＢＡ型ブロックコポリマーを含む）、ポリ（ビニリデンフルオリド）、ポリ（ビニリデンクロリド）、架橋又は非架橋の状態における、種々の加水分解度（８７％〜９９．５％）のポリビニルアルコールが含まれる。例示的な付加ポリマーは、ガラス質（室温超のＴｇ）の傾向がある。これは、ポリビニルクロリド及びポリメチルメタクリレート、ポリスチレンポリマー組成物、若しくは合金に関するケースであるか、又はポリフッ化ビニリデン及びポリビニルアルコールの結晶化度の低さのケースである。
【００６１】
本発明の一部の実施形態では、上記ナノ繊維物質、ポリアミド縮合ポリマーである。さらに特定の実施形態では、上記ポリアミド縮合ポリマーは、ナイロンポリマーである。用語「ナイロン」は、全ての長分子鎖合成ポリアミドに関する一般名称である。概して、ナイロンの学名には、一連の数、例えば、出発原料がＣ6ジアミン及びＣ6二塩基酸であることを示すナイロン−６，６（第一の数字は、Ｃ6ジアミンを示し、そして第二の数字は、Ｃ6ジカルボン酸化合物を示す）におけるものが含まれる。少量の水の存在下で、ε−カプロラクタムの重縮合を行うことにより、別のナイロンを製造することができる。
【００６２】
この反応により、直鎖のポリアミドであるナイロン−６（ε−アミノカプロン酸としても公知の環状ラクタムから製造）が生成する。さらに、ナイロンコポリマーがまた、企図される。コポリマーは、反応混合物中で、種々のジアミン化合物、種々の二塩基酸化合物及び種々の環状ラクタム構造体を混合し、次いで、ポリアミド構造体中でランダムに配置させたモノマー物質を用いてナイロンを生成させることにより製造されうる。例えば、ナイロン６，６−６，１０物質は、ヘキサメチレンジアミンと、Ｃ6及びＣ10の二塩基酸のブレンドとから製造したナイロンである。ナイロン６−６，６−６，１０は、アミノカプロン酸、ヘキサメチレンジアミン並びにＣ6及びＣ10の二塩基酸物質のブレンドの共重合により製造したナイロンである。
【００６３】
ブロックコポリマーをまた、ナノ繊維物質として用いることができる。ナノ繊維を調製するための組成物の調製において、各ブロックが溶媒に可溶となるように、当該溶媒系を選択することができる。一例は、メチレンクロリド溶媒中のＡＢＡ（スチレン−ＥＰ−スチレン）又はＡＢ（スチレン−ＥＰ）ポリマーである。上記ブロックコポリマーの例は、Ｋｒａｔｏｎ（商標）型のＡＢ及びＡＢＡブロックポリマー、例えば、スチレン／ブタジエン及びスチレン／水素化ブタジエン（エチレンプロピレン）、Ｐｅｂａｘ（商標）型のε−カプロラクタム／エチレンオキシド、Ｓｙｍｐａｔｅｘ（商標）ポリエステル／エチレンオキシド並びにエチレンオキシド及びイソシアネートのポリウレタンである。
【００６４】
付加ポリマー、例えば、ポリフッ化ビニリデン、シンジオタクチックポリスチレン、ビニリデンフルオリド及びヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、非晶質付加ポリマー、例えば、ポリ（アクリロニトリル）及びそのアクリル酸及びメタクリレートとのコポリマー、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）及びその種々のコポリマー、ポリ（メチルメタクリレート）及びその種々のコポリマーを、比較的容易にソリューションスピニング（ｓｏｌｔｉｏｎ ｓｐｉｎ）することができる。というのは、それらは、低圧及び低温で溶解するからである。ポリエチレン及びポリプロピレンのような高結晶性ポリマーは、それらをソリューションスピニングすべき場合には、より高い温度及び高圧が必要である。エレクトロスタティックソリューションスピニング（ｅｌｅｃｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｐｉｎｎｉｎｇ）は、ナノ繊維及びミクロ繊維を製造する方法の一つである。
【００６５】
ナノ繊維をまた、ポリマー混和物質、アロイ状態、又は架橋され化学結合した構造体の中の２種又は３種以上のポリマー物質を含むポリマー組成物から生成させることができる。上記ポリマー組成物は、ポリマー特性を変えることにより、例えば、ポリマー鎖の可とう性又はポリマー鎖の可動性を改良することにより、全体の分子量を大きくすることにより、そしてポリマー物質のネットワークの形状により補強することで、物理的性質を変えることができる。
【００６６】
２種の関連するポリマー物質を混合して、有益な特性を有するナノ繊維を供給することができる。例えば、高分子量ポリビニルクロリドを、低分子量ポリビニルクロリドと混合することができる。同様に、高分子量ナイロン物質を、低分子量ナイロン物質と混合することができる。さらに、異種の一般的なポリマー種を混合することができる。例えば、高分子量スチレン物質を、低分子量の耐衝撃性ポリスチレンと混合することができる。ナイロン−６物質を、ナイロンコポリマー、例えば、ナイロン−６；６，６；６，１０コポリマーと混合することができる。さらに、加水分解度の低いポリビニルアルコール、例えば、８７％加水分解されたポリビニルアルコールを、９８〜９９．９％及び９９．９％超の加水分解度を有する完全に又は超加水分解されたポリビニルアルコールと混合することができる。
【００６７】
混和物質内のこれらの全ての物質を、適切な架橋機構を用いて、架橋することができる。アミド結合内の窒素原子と反応性を有する架橋剤を用いて、ナイロンを架橋することができる。ポリビニルアルコール物質を、ヒドロキシル反応性物質、例えば、モノアルデヒド、例えば、ホルムアルデヒド、ウレア、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂及びその類似物、ホウ酸及び他の無機化合物、ジアルデヒド、二塩基酸、ウレタン、エポキシ及び他の公知の架橋剤を用いて架橋することができる。架橋試薬が反応し、そして各ポリマー鎖の間に供給結合を形成し、分子量、耐薬品性、全体的な強度及び機械的分解に対する抵抗性を実質的に改良する。
【００６８】
エレクトロスピニングは、直径（概して、約５ｎｍ〜約１０００ｎｍ）が異なることができるナノ繊維の集合体を製造することができる。
ナノ繊維は、ポリマーの形成及び堆積を制御するために、電界を用いるエレクトロスピニング方法により製造することができる。電位（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を用いてポリマー溶液を注入する。当該電位により、エミッタの先端、例えば、ニードルからポリマー溶液流の放出をもたらす電荷不均衡が生ずる。上記電界内のポリマー噴出物は、接地した基材の方に向かい、その際、溶媒が蒸発して、そして繊維が生成する。得られた単一の連続フィラメントは、支持体上で不織布として集められる。ナノ繊維を製造するためのエレクトロスピニング法は、米国特許第４，６５０，５０６号明細書（Ｂａｒｒｉｓ）及び同６，７４３，２７３号明細書（Ｃｈｕｎｇら）に記載されている。
【００６９】
ランダム又は方向性を有する配向を有するエレクトロスピニングされたナノ繊維ネットワークを製造することができるランダムな繊維を層状の表面に集合させることができる。いくつかの実施形態では、本発明のナノ繊維は、連結ネットワークを形成するように結合させることができる細繊維のランダムな分布を含む。ナノ繊維が連結するネットワークは、上記各繊維の間に比較的小さな間隔を有する。上記間隔は、各繊維の間で、約０．０１〜約２５μｍ、好ましくは約２〜約１０μｍの範囲を有するのが典型的である。上記間隔により、イオン、代謝産物、たんぱく質及び／若しくは生活性分子の拡散が可能となり、そして／又は上記ネットワークに細胞を透過及び浸透させ、そして細胞及び上記ナノ繊維の間のマルチポイント接着を促進する環境内で細胞を増殖させる上記ナノ繊維ネットワーク内で孔又はチャネルが形成する。
【００７０】
ナノ繊維ネットワークをまた、配向させた様式で、エレクトロスピニングさせることができる。上記配向させたエレクトロスピニングにより、複数のナノ繊維の単層又は連続的なナノ繊維により形成した単層を含むナノ繊維ネットワークを作成することができ、ここで、当該ネットワークは、単一のナノ繊維の直径の高さを有する。多孔性、固体率、フィブリル密度、テクスチャ、しわ及び単層ネットワークの繊維配向性を含む物理的性質を、エレクトロスピニングプロセスの際に、上記支持体上で上記ナノ繊維の方向及び／又は配向を制御することにより選択することができる。好ましくは、上記孔のサイズにより、細胞が、単層ナノ繊維ネットワーク内を透過及び／又は移動する。ある実施形態では、各繊維の間の間隔は、約０．０１〜約２５μｍである。別の実施形態では、各繊維の間の間隔は、約２〜約１０μｍである。
【００７１】
上記ナノ繊維は、他の物質を所望により含むことができる。
いくつかの態様では、上記ナノ繊維は、ポリマー物質を添加剤組成物と混合することにより生成されうる。上記添加剤組成物は、上記ポリマーのエレクトロスピニングにより当該添加剤を含まないポリマー溶液からエレクトロスピニングしたナノ繊維の集合体と比較して、より数が多い又はパーセンテージが高い薄い繊維を有するナノ繊維の集合体の製造物が生ずるように、上記ポリマーのパッキングに影響を及ぼしうる。ある実施形態では、上記ポリマー溶液は、約０．２５％〜約１５％ｗ／ｗの添加剤組成物を含む。別の実施形態では、上記ポリマー溶液は、約１％〜約１０％ｗ／ｗの添加剤組成物を含む。いくつかの実施形態では、上記ポリマーのパッキングに影響を及ぼす添加剤組成物は、生活性分子、例えば、脂質を含む。いくつかの実施形態では、上記脂質は、リソホォスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、コレステロール及びそれらの混合物からなる群から選択することができる。
【００７２】
上記ナノ繊維上のポリマーコーティングが、細胞接着を促進する一方で、上記ナノフィブリル構造体のテクスチャ及びしわを作り変えることにより細胞接着をさらに改良することができる。例えば、上記ナノフィブリル構造体は、異なるポリマーから作製された異なる直径及び／又は複数のナノ繊維を有する複数のナノ繊維から構成されうる。上記ナノフィブリル構造体の固体率をまた、細胞増殖及び／又は分化に影響を与えるように作り変えることができる。ある実施形態では、上記ナノフィブリル構造体は、約３％〜約７０％の固体率を有する。別の実施形態では、上記ナノフィブリル構造体は、約３％〜約５０％の固体率を有する。別の実施形態では、上記ナノフィブリル構造体は、約３％〜約３０％の固体率を有する。別の実施形態では、上記ナノフィブリル構造体は、約３％〜約１０％の固体率を有する。別の実施形態では、上記ナノフィブリル構造体は、約３％〜約５％の固体率を有する。別の実施形態では、上記ナノフィブリル構造体は、約１０％〜約３０％の固体率を有する。
【００７３】
いくつかの態様では、上記ナノ繊維は、蛍光マーカーを含む。上記蛍光マーカーにより、例えば、ナノ繊維の可視化、ナノ繊維ブレンド内の特定のナノ繊維の識別、ナノ繊維の化学的又は物理的性質の同定、及び組織を作り変えるために有用な複層化された集成体を含む、ナノ繊維及び／又はナノ繊維を含む構造体の分解及び／又は再分布の評価が可能になる。上記蛍光マーカーは、光退色性又は非光退色性であることができる。上記蛍光マーカーは、ｐＨ感受性又はｐＨ非感受性であることができる。好ましくは、上記蛍光マーカーは、非細胞毒性を有する。
【００７４】
上記ナノ繊維を形成させるために用いられる上記ポリマーはまた、セルロース、ポリビニル、ポリエステル、ポリスチレン又はポリアミド支持体と接触した際に、上記ナノ繊維が上記支持体に確実に結合し且つ機械的応力に関連する離層作用に抵抗することができるような十分な強度で、当該ナノ繊維が上記支持体に付着するような付着特性を有することができる。上記ナノ繊維の上記支持体への付着性は、当該繊維が当該支持体に接触する際の繊維構造体の溶媒効果、又は熱若しくは圧力を用いた当該支持体上の繊維の後処理から生ずることができる。付着の際に溶媒又は蒸気を用いて可塑化したポリマーは、付着性が高い場合がある。
【００７５】
本明細書において、用語「ナノフィブリル支持体」は、ナノ繊維又はナノ繊維のネットワークを堆積させる表面を意味する。上記ナノフィブリル支持体は、ナノ繊維の堆積したネットワークのための構造支持体を提供する任意の表面でありうる。上記ナノフィブリル支持体は、ガラス又はプラスチックを含むことができる。好ましくは、上記プラスチックは、非細胞毒性を有する。いくつかの態様では、上記ナノフィブリル支持体は、フィルム又は培養コンテナであることができる。
【００７６】
上記ナノフィブリル支持体は、水溶性又は水不溶性でありうる。水溶性であるナノフィブリル支持体は、ポリビニルアルコールフィルムであることは好ましい。多くの態様では、そして大部分の方法において、上記ナノフィブリル構造体内の孔の平均サイズが非常に小さいので、細胞が上記ナノフィブリル構造体に入り込むことができない。しかし、細胞の運動は、当該細胞のサイズ及び上記ナノフィブリル構造体内の孔のサイズによって決まりうる。
【００７７】
好ましくは、多孔質のナノフィブリル構造体の孔は、約０．２μｍ〜約１０μｍの直径を有する。上記ナノフィブリル構造体は、生分解性及び／又は生物溶解性（ｂｉｏｄｉｓｓｏｌｖａｂｌｅ）であることができる。好ましくは、上記ナノフィブリル構造体は、生体適合性を有する。
【００７８】
いくつかの態様では、上記ナノフィブリル支持体を、ガラス基材、例えば、ガラス顕微鏡スライド、カバーガラス及びガラスフィルム；ポリマー基材、例えば、ポリマーフィルム；及び細胞培養に好適な他の生体物質基材から選択する。上記ナノフィブリル支持体は、細胞培養装置の調製及び／又は使用に有用な一定の特性を有することができる。いくつかの特定の態様では、上記ナノフィブリル支持体は、１つ又は２つ以上の特性、例えば、可操作度及び／又は可とう性、耐殺菌性、耐放射線分解性、化学的不活性性、透明性、不燃性及び滑らかな表面特性を有する。いくつかの特定の態様では、上記ナノフィブリル支持体には、ハロゲン化した熱可塑性樹脂、例えば、ハロゲン化したフッ素化−塩素化樹脂が含まれる。特に、上記支持体は、クロロトリフルオロエチレン（ＣＴＦＥ）を含むことができる。他の特定の態様では、上記支持体は、約０．２５ｍｍ以下である。
【００７９】
本明細書において、用語「スペーサー」は、上記構造体が当該スペーサーの直径又は厚さにより分離されるように、支持体の表面又は別のナノフィブリル構造体の表面からナノ繊維又はナノ繊維ネットワークを分離する層を意味する。上記スペーサーは、ポリマー細繊維又はフィルムを含むことができる。好ましくは、上記フィルムは、約１０μｍ〜約５０μｍの厚さを有する。上記スペーサーは、セルロース、でん粉、ポリアミド、ポリエステル又はポリテトラフルオロエチレンを含むポリマーを含むことができる。上記細繊維は、ミクロ繊維を含むことができる。ミクロ繊維は、約１μｍ〜約３０μｍの直径を含む、ポリマー細繊維である。上記ミクロ繊維は、織られていないか、又はネットであることができる。
【００８０】
本発明の他の態様では、少なくとも１種のペンダント型アミン基及び少なくとも１種の潜在性反応性基を含むポリマーを有する上記コーティングを、他の種類のナノ構造を有する製品上に生成することができる。他の例示的なナノ構造を有する細胞培養製品には、複層カーボンナノチューブ（ＭＷＣＮ；Ｃｈｅｎらの「Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１９９８）２８２：９５を参照せよ）；ヒドロキシアパタイト微粒子表面（Ｒｏｓａらの「Ｄｅｎｔａｌ Ｍａｔｅｒ．」（２００３）１９：７６８−７７２）が含まれる。上記ポリマーコーティングをまた、天然物質、例えば、自己集合性ペプチドナノ繊維骨格（Ｇｅｎｏｖｅらの「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．」（２００５）２６：３３４１−３３５１）及びコラーゲン／ヒアルロン酸高分子電解質複層（Ｚｈｅｎｇらの「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」（２００５）２６：３３５３−６１）の表面に生成させることができる。他のケースでは、３次元の表面を、ナノ粒子の安定化した層から作り出すことができる。
【００８１】
上記ナノフィブリル構造体を、支持体、細胞培養製品及び医療装置等の製品と連結するか、又はそれら上に形成することができる。上記製品を、上記ナノフィブリル構造体と組み合わせるか、又は上記ナノフィブリル構造体と共に作成し、細胞培養機器及び医療装置を含む、種々の製品又は集成体を形成することができる。支持体、細胞培養製品及び医療装置等の製品を、上記ナノフィブリル構造体と同一の物質から作ることができ、又は異なる物質から作ることができる。
【００８２】
上記ナノフィブリル構造体、例えば、支持体、細胞培養製品又は医療装置と連結した製品を形成させるために用いられうる物質の例には、付加重合又は縮合重合のどちらかから得られた合成ポリマー、例えば、オリゴマー、ホモポリマー及びコポリマーが含まれる。好適な付加ポリマーの例には、アクリル、例えば、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、グリセリルアクリレート、グリセリルメタクリレート、メタクリルアミド及びアクリルアミドから重合されたもの；ビニル、例えば、エチレン、プロピレン、塩化ビニル及びスチレンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
細胞培養製品中で一般的に用いられる例示的なポリマー物質には、ポリスチレン及びポリプロピレンが含まれる。
縮合ポリマーの例には、ナイロン、例えば、ポリカプロラクタム、ポリラウリルラクタム、ポリヘキサメチレンアジポアミド及びポリヘキサメチレンドデカンジアミド、並びにポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリスルホン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリジメチルシロキサン及びポリエーテルケトンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
生分解性ポリマーをまた、上記ナノフィブリル構造体と連結した製品の調製に用いることができる。生分解性物質として検討されている合成ポリマーの種類の例には、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリイミノカーボネート、脂肪族カーボネート、ポリホスファゼン、ポリ無水物及びそれらのコポリマーが含まれる。移植可能な医療装置に関連して用いることができる生分解性物質の具体例には、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリジオキサノン（ｐｏｌｙｄｉｏｘａｎｏｎｅ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−ポリジオキサノン）、ポリ無水物、ポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）及びポリ（グリコリド−ｃｏ−カプロラクトン）が含まれる。これらのポリマーと、他の生分解性ポリマーとのブレンドをまた、用いることができる。
【００８５】
いくつかの態様では、上記ナノフィブリル構造体を、ペンダント型アミン基を有するポリマーと異なるポリマー物質でプレコートした製品の表面に形成するか、又は当該表面と連結することができる。例えば、製品を、パリレン又はオルガノシラン物質でプレコートして、上記ナノフィブリル構造体を連結又は形成しうるベースコートを供給することができる。
【００８６】
上記ナノフィブリル構造体を、金属、金属合金及びセラミックから作成した製品上に形成するか、又は当該製品と連結することができ、そして多くの場合には、これらの製品は、パリレン又はオルガノシラン物質のプレコートを有することができる。上記金属及び金属合金には、チタン、ニチノール、ステンレス鋼、タンタル及びコバルトクロムが含まれるが、これらに限定されるものではない。第二の分類の金属には、貴金属、例えば、金、銀、銅及び白金ウリジウム（ｕｒｉｄｉｕｍ）が含まれる。上記セラミックには、窒化ケイ素、炭化ケイ素、ジルコニア及びアルミナ、並びにガラス、シリカ及びサファイアが含まれるが、これらに限定されるものではない。セラミック及び金属の組み合わせは、別の種類の生体物質である。
【００８７】
本発明の他の態様では、上記ポリマーコーティングは、移植可能な医療用製品の少なくとも一部と連結されているか、又は当該一部上に形成されているナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面上に形成されている。これは、移植可能な医療用製品と連結したいくつかの方式における、又は当該移植可能な医療用製品上に形成されているナノ繊維のネットワークを含む移植可能な医療装置を指す。上記装置を、種々の方法により形成することができる。上記装置を形成する方法の一つは、移植可能な医療装置の全て又は一部上のエレクトロスピニングナノ繊維を含むことができる。別の方法には、ナノフィブリル構造体を形成させ、次いで、当該ナノフィブリル構造体を、移植可能な医療装置の一部に接着することが含まれうる。
【００８８】
例示的な医療用製品には、血管用インプラント及び移植片、移植片、外科用装置；合成人工器官；エンドプロテーゼ（ｅｎｄｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）を含む人工血管、ステント移植皮弁、血管内のステント組み合わせ物；小径の移植片、腹部大動脈瘤用移植片；創傷被覆材及び創傷管理装置；止血用バリア；メッシュ及びヘルニアプラグ（ｈｅｒｎｉａ ｐｌｕｇ）；子宮出血用パッチを含むパッチ、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）用パッチ、卵円孔開存症（ＰＦＯ）用パッチ、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）用パッチ及び他の一般的な心臓用パッチ；ＡＳＤ、ＰＦＯ及びＶＳＤクロージャ；経皮クロージャ装置、僧帽弁修復装置；左心耳フィルター；弁形成（ｖａｌｖｅ ａｎｎｕｌｏｐｌａｓｔｙ）装置、カテーテル；中心静脈アクセス用カテーテル、血管アクセス用カテーテル、膿瘍排液用カテーテル、薬物注入用カテーテル、非経口的栄養補給用カテーテル、静脈用カテーテル（例えば、抗血栓薬を用いた処理）、脳卒中治療用カテーテル、血圧及びステント移植片カテーテル；吻合装置及び吻合クロージャ；動脈瘤除外装置；グルコースセンサを含むバイオセンサ；心臓用センサ；受胎調節装置；前胸部用移植片；感染制御装置；膜；組織骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）；組織関連物質；脳脊髄液（ＣＳＦ）シャントを含むシャント、緑内障排出シャント；歯科用装置及び歯科用移植片；耳用装置、例えば、耳用排液チューブ、中耳腔換気用ベントチューブ；眼用装置；排液チューブカフスを含む、装置のカフス及びカフス部分、移植された薬物注入用チューブカフス、カテーテルカフス、縫製カフス；脊椎及び神経学用装置；神経再生導管；神経学用カテーテル；神経用パッチ；整形外科用装置、例えば、整形外科の関節用移植片、骨修復／増大装置、軟骨修復装置；泌尿器用装置及び尿道用装置、例えば、泌尿器用移植片、膀胱用装置、腎臓部用装置及び血液透析装置、人工肛門袋取付け装置；胆汁排液製品が含まれる。
【００８９】
いくつかの態様では、上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維は、非生分解性ポリマーと、１種又は２種以上（好ましくは複数）のペンダント型アミン基と、１種（好ましくは１種超）のペンダント型潜在性反応性基とを含むコーティングを有する。「非生分解性」は、一般的に、非酵素的に、加水分解的に又は酵素的に分解することができないポリマーを指す。例えば、上記非生分解性ポリマーは、プロテアーゼにより生じうる分解に対して抵抗性を有する。しかし、上記コーティングが非生分解性アミン提供ポリマーを含む一方で、上記コーティングは非生分解性物質に限定されず、従って、生分解性物質、例えば、天然又は合成の生分解性ポリマーをも含むことができることに留意すべきである。
【００９０】
上記コーティングは、潜在性反応性基を含み、ここで、当該基の少なくとも一部は、上記コーティング工程の際に活性化し、上記ポリマーを、上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面に結合させる。本発明の生成したコーティングを記載する目的で、上記ナノ繊維の表面に共有結合している（生成したコーティング内の）上記ポリマーは、「潜在性の反応した基（ｌａｔｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ）」又は「反応した基（ｒｅａｃｔｅｄ ｇｒｏｕｐ）」を有すると称することができ、上記ポリマー上の１種又は２種以上のこれらの潜在性反応性基が活性化し、そして反応して、上記ポリマー及び上記ナノ繊維の表面の間に共有結合を形成することを指す。
【００９１】
上記潜在性の反応した基を介して上記表面に結合することにより、固定されたポリマーが、上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面に、正に帯電したアミン基を供給することができる。この結合配置により、細胞接着のおいて非常に耐久性が高く、且つ有効な表面の形成が可能となると考えられる。この表面は、上記ナノフィブリル構造体上の細胞の維持及び分化を含む方法において、非常に有効であることが示された。
【００９２】
上記非生分解性ポリマー上の複数のペンダント型アミン基は、細胞培養のために好適なｐＨ条件において、上記コーティングに正電荷を供給することができる。例えば、上記非生分解性ポリマーは、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約１０．０の範囲の条件において、上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維に正電荷を供給する。
上記非生分解性ポリマーは、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、又は上記ポリマーに由来するこれらのアミン基のペンダントの組み合わせを有することができる。
【００９３】
本発明の一態様では、例示的なアミン含有基は、次の式：
Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
（式中、Ｒ1は、下記：
【化３】
であり、
Ｒ2は、Ｃ1〜Ｃ8の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そして
Ｒ3及びＲ4は、両方とも上記窒素に結合し、そして個々に、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキルである）
を有する。
上記ポリマーに由来するペンダントと同様に、上記アミン含有基を、次の式：
Ｐ−［Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4］
（式中、Ｐは、上記ポリマー主鎖の一部である）
により表すことができる。
【００９４】
いくつかのさらなる特有の態様において、Ｒ1は、下記：
【化４】
であり、
Ｒ2は、Ｃ2〜Ｃ4の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そして
Ｒ3及びＲ4は、両方とも前記窒素に結合し、そしてそれぞれ、Ｈ、ＣＨ3又はＣ2Ｈ5である。
【００９５】
例示的なアミン含有基には、重合性モノマー、例えば、３−アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ）、３−アミノエチルメタクリルアミド（ＡＥＭＡ）、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）等に見出されるものが含まれる。従って、いくつかの態様では、ペンダント型アミン基含有ポリマー及び潜在性反応性基を含むポリマーは、上記基−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4を有するモノマーを、潜在性反応性基を有するコモノマーと共重合して生成させることができる。所望により、他の非アミン又は非潜在性反応性基含有モノマーが、上記ポリマーに含まれうる。
【００９６】
態様の一つでは、上記ポリマーは、上記ポリマーのモノマー含有量に基づいて、約１０％以上のモル濃度量において、アミン含有基を含む。これは、例えば、１０％以上のアミン含有基モノマーを用いてポリマーを調製することにより達成することができる。いくつかの態様では、上記アミン含有基は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上のモル濃度量において存在する。いくつかの態様では、上記ポリマーは、約９０％〜約９９．９５％の範囲におけるモル濃度量において、アミン含有基を含む。コポリマーの例示的な調製には、約９８．４％のアミン含有モノマー（例えば、ＡＰＭＡ、ＡＥＭＡ又はＤＭＡＰＭＡ）と、約１．６％の潜在性反応性基含有モノマーが含まれる。
【００９７】
アミン基の量と潜在性反応性基の量とのコントロールは、アミン含有モノマーを、潜在性反応性基含有モノマー（及び所望により、非アミン又は非光反応性基含有モノマー）と共重合することにより行われうる。他の例示的なアミン含有ポリマーを、例えば、アミン含有モノマー（例えば、Ｎ−（２−アミノ−２−メチルプロピル）メタクリルアミド、ｐ−アミノスチレン、アリルアミン、又はそれらの組み合わせ）を、ペンダント型アミン基及び潜在性反応性基を有するポリマーを供給するためのペンダント型潜在性反応性基を有するモノマーと共重合させて生成することができる。
【００９８】
これらのアミン含有モノマーをまた、他の非第一級アミン含有モノマー、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニルピロリジノン又はそれらの誘導体と共重合して、所望の特性、例えば、所望のアミン基の密度及び光反応性基を有するポリマーを供給することができる。他の好適なアミン基含有ポリマーには、２−アミノメチルメタクリレート、３−（アミノプロピル）−メタクリルアミド及びジアリルアミン等のモノマーから生成させたポリマーが含まれる。感光性基（ｐｈｏｔｏｇｒｏｕｐ）及びペンダント型アミン基を含むデンドリマーをまた、用いることができる。
【００９９】
いくつかの態様では、ペンダント型アミン基及び疎水性の特性を有するポリマーを調製することができる。これは、上記ポリマーを合成するための１つ又は２つ以上のスキームにより得ることができる。例えば、ポリマーを、所望の量の疎水性モノマー、例えば、（アルキル）アクリレートモノマーと共に生成することができ、又は上記アミン提供モノマーは、より長いアルキル鎖長を含むことができる。例えば、基Ｒ2、Ｒ3及び／又はＲ4の１つ又は２つ以上は、３個又は４個以上の炭素原子のアルキル基を含むことができる。
【０１００】
上記非生分解性ポリマーを調製するための別の方法には、予備生成したポリマーを、潜在性反応性基を含む化合物を用いて誘導体化する段階が含まれる。例えば、ペンダント型アミン基を有するホモポリマー又はヘテロポリマーは、上記ペンダント型アミン基の一部を、光反応性基及びアミン基との反応性を有する基（例えば、４−ベンゾイルベンゾイルクロリド）を有する化合物と反応させることにより、当該光反応性基を用いて容易に誘導体化することができる。
【０１０１】
いくつかの態様では、ペンダント型アミン基及び少なくとも１種の潜在性反応性基を有するポリマーを、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン及びポリアミドアミンから選択する。特定の態様の一つでは、上記ポリマー物質は、１種又は２種以上の潜在性反応性基を有するポリエチレンイミンを含む。
【０１０２】
広義の潜在性反応性基は、特定の適用された外部刺激に応答し、ターゲットとの得られた共有結合を有する活性種の生成をうける基である。潜在性反応性基は、貯蔵の条件下ではそれらの共有結合を変化させずに保持するが、活性化の際に他の分子と共有結合を生成する、分子内の原子の基である。上記潜在性反応性基は、外部の電磁気又は運動（熱）エネルギーを吸収した際に、活性種、例えば、フリーラジカル、ニトレン、カルベン、及びケトンの励起状態を発生させる。
【０１０３】
潜在性反応性基を、電磁スペクトルの種々の部分に応答するように選択することができ、そしてスペクトルの紫外線、可視光又は赤外線部分に応答する潜在性反応性基が好ましい。本明細書に記載されるものを含む潜在性反応性基は、当業界で周知である。例えば、米国特許第５，００２，５８２号明細書（Ｇｕｉｒｅらの「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ｖｉａ Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ Ａｔｔａｃｈｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」）を参照せよ。本明細書に記載されるように、本発明は、本発明のコーティングを生成させるために好適な潜在性反応性基を使用することを企図する。
【０１０４】
光反応性基は、電磁気エネルギーを吸収すると、活性種、例えば、フリーラジカル、そして特にニトレン、カルベン、及びケトンの励起状態を生じさせることができる。光反応性基を、電磁スペクトルの種々の部分に応答するように選択することができ、そしてスペクトルの紫外線、可視光又は赤外線部分に応答する潜在性反応性基が好ましい。
【０１０５】
光反応性アリールケトン、例えば、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様複素環（例えば、アントロンの複素環式類似体、例えば、１０位に窒素、酸素又は硫黄を有するもの）、又はそれらの置換誘導体（例えば、環置換誘導体）が好ましい。好ましいアリールケトンの例には、アントロンの複素環式誘導体、例えば、アクリドン、キサントン及びチオキサントン、並びにそれらの環置換誘導体が含まれる。いくつかの好ましい光反応性基は、約３６０ｎｍ超の励起エネルギーを有する、チオキサントン及びその誘導体である。
【０１０６】
上記ケトンの官能基が好ましい。というのは、それらは、本明細書に記載される活性化／不活性化／再活性化サイクルを容易に受けることができるからである。ベンゾフェノンは、特に好ましい潜在性反応性部分である。というのは、当該ベンゾフェノンは、三重項状態への項間交差をうける励起一重項状態の初期構造を有する光化学系励起が可能だからである。上記励起三重項状態は、（例えば、支持体表面から）水素原子を引き抜くことにより、炭素−水素結合に挿入し、そのようにしてラジカル対を作り出すことができる。次にラジカル対が崩壊し、新しい炭素−炭素結合が生成する。結合に、反応性結合（例えば、炭素−水素）が利用できないと、ベンゾフェノン基の紫外線により誘発された励起は可逆性であって、そしてエネルギー源を取り除くと、当該分子は基底状態のエネルギー準位に戻る。光活性化可能なアリールケトン、例えば、ベンゾフェノン及びアセトフェノンは、特に重要である。というのは、これらの基が、水中で複数の再活性化を受け、よって高いコーティング効率を付与するからである。
【０１０７】
アジドが、別の種類の光反応性基を構成し、そしてアリールアジド（Ｃ6Ｒ5Ｎ3）、例えば、フェニルアジド及び４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド；アシルアジド（−ＣＯ−Ｎ3）、例えば、ベンゾイルアジド及びｐ−メチルベンゾイルアジド；アジドホルメート（−Ｏ−ＣＯ−Ｎ3）、例えば、エチルアジドホルメート及びフェニルアジドホルメート；スルホニルアジド（−ＳＯ2−Ｎ3）、例えば、ベンゼンスルホニルアジド；及びホスホリルアジド［（ＲＯ）2ＰＯＮ3］、例えば、ジフェニルホスホリルアジド及びジエチルホスホリルアジドを含む。
【０１０８】
ジアゾ化合物は、別の種類の光反応性基を構成し、そしてジアゾアルカン（−ＣＨＮ2）、例えば、ジアゾメタン及びジフェニルジアゾメタン；ジアゾケトン（−ＣＯ−ＣＨＮ2）、例えば、ジアゾアセトフェノン及び１−トリフルオロメチル−１−ジアゾ−２−ペンタノン；ジアゾアセテート（−Ｏ−ＣＯ−ＣＨＮ2）、例えば、ｔ−ブチルジアゾアセテート及びフェニルジアゾアセテート；及びβ−ケト−α−ジアゾアセタトアセテート（−ＣＯ−ＣＮ2ＣＯ−Ｏ−）、例えば、ｔ−ブチル−α−ジアゾアセトアセテートを含む。
【０１０９】
他の光反応性基には、ジアジリン（−ＣＨＮ2）、例えば、３−トリフルオロメチル−３−フェニルジアジリン；及びケテン（ＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）、例えば、ケテン及びジフェニルケテンが含まれる。
【０１１０】
パーオキシ化合物は、別の種類の潜在性反応性基として企図され、そしてジアルキルパーオキシド、例えば、ジ−ｔ−ブチルパーオキシド及びジシクロヘキシルパーオキシド及びジアシルパーオキシド、例えば、ジベンゾイルパーオキシド及びジアセチルパーオキシド及びパーオキシエステル、例えば、エチルパーオキシベンゾエートを含む。
【０１１１】
いくつかの態様では、上記潜在性反応性基は、（上記ポリマーのモノマーに対して）最大約１０％のモル濃度量、又は最大約５％の量で存在する。いくつかの態様では、上記ポリマーは、約０．０５％〜１０％の範囲のモル濃度量で、上記潜在性反応性基を含む。コポリマーの例示的な調製物には、約９８．４％のアミン含有モノマー（例えば、ＡＰＭＡ、ＡＥＭＡ又はＤＭＡＰＭＡ）と、約１．６％の上記潜在性反応性基を含むモノマーとが含まれる。
【０１１２】
ナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面に生成させる本発明のコーティングは、任意の好適な方法を用いる。上述のように、ペンダント型アミン基及びペンダント型潜在性反応性基を有するポリマーを、上記ナノ繊維の表面に配置させることができ、そして上記潜在性反応性基を活性化し、それにより上記ポリマーを上記ナノ繊維の表面に結合させ、当該ナノ繊維上の薄いポリマーコーティングを生成するように上記表面を処理することができる。
【０１１３】
別の方法では、グラフト重合法により、上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維表面に、上記ポリマーを生成させる。例えば、潜在性反応性基及び重合性基を含むモノマーを、上記ナノ繊維の表面に配置させ、そして結合させることができる。次いで、アミン基含有モノマーの組成物を、上記表面に配置することができ、そして重合反応を開始して、上記製品の表面からポリマー鎖を形成させ、そして上記ナノフィブリル構造体の表面と結合させることができる。
【０１１４】
さらに別の方法では、２つ又は３つ以上の潜在性反応性基を有する架橋剤を用いて上記コーティングを生成させることができ、上記架橋剤は、上記ポリマーを上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面に結合させるために用いられる。上記架橋剤は、本明細書に記載されるような、２つ又は３つ以上の潜在性反応性基を有することができる。上記ポリマーコーティングの生成において、上記架橋剤を、上記ナノフィブリル構造体の表面に配置させ、続いてペンダント型アミン基を有するポリマーを配置させることができ、若しくは上記架橋剤を上記ポリマーと組み合わせて配置することができ、又はその両方であることができる。
【０１１５】
光反応性基が、上記架橋剤上に存在する場合には、当該光反応性基を、可逆性の光分解ホモリシスを受けるように適合させ、それによりポリマー物質に接着させる際に消費されなかった光反応性基を、不活性又は「潜在性」の状態に戻すことが好ましい。続いて、共有結合形成において引き抜くことができる水素を有するポリマーに結合させるために、これらの光反応性基を活性化することができる。従って、上記光反応性基の励起は可逆性であり、そして当該基は、上記エネルギー源を取り除くと、基底状態のエネルギー準位に戻ることができる。いくつかの実施形態では、好ましい架橋剤は、複数の活性化を受け、よって、高いコーティング効率を付与することができる基である。いくつかの実施形態では、上記光反応性部分は、上記ポリマー物質から独立しており、そして例えば、架橋剤であることができる。例示的な架橋剤は、本件出願人の米国特許第５，４１４，０７５号明細書（Ｓｗａｎら）及び米国特許出願公開第２００３／０１６５６１３号明細書（Ｃｈａｐｐａら）に記載されている。また、米国特許第５，７１４，３６０号明細書（Ｓｗａｎら）及び同５，６３７，４６０号明細書（Ｓｗａｎら）を参照せよ。
【０１１６】
ペンダント型アミン基を有する非生分解性ポリマーを、単体で、又は他の所望による成分と共に、ナノフィブリル構造体のナノ繊維に結合させることができる。最も簡単な状態では、上記コーティング組成物は、例えば、（ｉ）少なくとも１種（好ましくは複数種）のペンダント型アミン基と、１種若しくは２種以上の潜在性反応性基とを有する非生分解性ポリマー及び／又は（ｉｉ）少なくとも１種（好ましくは複数種）のペンダント型アミン基と、２つ若しくは３つ若しくは４つ以上の潜在性反応性基を有する架橋剤とを有する非生分解性ポリマーから成る。上記コーティング組成物に他の成分を添加して、上記コーティングの態様を変化させるか、又は改良することができる。上記成分は、ポリマー又は非ポリマー成分であることができる。
【０１１７】
他の合成又は天然の、生分解性又は非生分解性ポリマーを上記組成物に添加して、コーティングを生成させることができる。「合成ポリマー」は、合成的に調製され、そして非天然モノマー単位を含むポリマーを指す。例えば、合成ポリマーは、非天然モノマー単位、例えば、アクリレート、アクリルアミド等を含むことができる。合成ポリマーは、従来の重合反応、例えば、付加重合、縮合重合又はラジカル重合により生成するのが典型的である。合成ポリマーはまた、非天然モノマー単位（例えば、合成のペプチド、ヌクレオチド及び糖誘導体）と組み合わせた天然モノマー単位、例えば、天然のペプチド、ヌクレオチド、及び糖モノマー単位を有するものを含むことができる。このタイプの合成ポリマーを、標準的な合成技法、例えば、固相合成又は組換え（可能な場合）により生成させることができる。
【０１１８】
「天然ポリマー」は、天然、組換え又は合成のいずれかにより調製され、そして上記ポリマー主鎖において天然のモノマー単位から成るポリマーを指す。ある場合には、上記天然ポリマーを、変性、加工、誘導又は処理して、上記天然ポリマーの化学的及び／又は物理的性質を変化させることができる。これらの例では、用語「天然ポリマー」は、上記天然ポリマーに対する変化を反映するように修正されうる（例えば、「誘導した天然ポリマー」又は「脱グルコシル化した天然ポリマー」）。
【０１１９】
生分解性物質、例えば、生分解性ポリマーをまた、上記コーティングに存在させることができる。上記生分解性物質を、上記非生分解性アミン提供ポリマーと同一のコーティング層に、所望により存在させることができ、別のコーティング層（上記コーティングに含まれる場合）に存在させることができ、又はその両方に存在させることができる。例えば、生分解性ポリマーを含むコーティング層を、上記非生分解性アミン提供ポリマーを含むコーティング層と、製品表面との間で生成させることができるか、又は上記非生分解性アミン提供ポリマーを含むコーティング層の頂部に生成させることができる。培養の際、上記生分解性ポリマーが分解可能である一方で、上記非生分解性ポリマーは上記コーティングに存在したままであり、そして長期間の培養の際に、付着面を供給する。
【０１２０】
本発明のいくつかの態様では、「生活性分子」を、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体と連結することができる。例えば、１種又は２種以上の生活性分子が、ペンダント型アミン基及び潜在性反応性基を有する非生分解性ポリマーを含むナノ繊維上のコーティング及び／又はナノ繊維に存在することができる。ある場合には、上記生活性分子が、明細書に記載されるような生分解性物質であることができる。１種又は２種以上の生活性分子を、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体と連結することができる一方で、細胞培養物が、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体と共に用いられる場合には、一又は複数の生活性分子をまた、液体培地内に含ませることができる。従って、複数の生活性分子の列挙は、明細書に特に記載されない限り、当該分子が、上記コーティング又は任意の培地に存在することを限定することを目的とするものではない。
【０１２１】
本明細書において、用語「生活性分子」は、細胞又は組織上に影響を有する分子を意味する。当該用語には、人間又は動物の（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ）治療用の、栄養補助食品、ビタミン、塩、電解質、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、炭水化物、脂質、多糖類、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、糖たんぱく質、リポたんぱく質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、増殖因子、分化因子、ホルモン、神経伝達物質、フェロモン、ケイロン、プロスタグランジン、免疫クロブリン、モノカイン及び他のサイトカイン、保湿剤、ミネラル、電気的及び磁気的反応性物質、光電性物質、抗酸化物質、細胞エネルギーの供給源として代謝されうる分子、抗原、並びに細胞又は生理的応答を起こすことができる任意の分子が含まれる。
【０１２２】
分子の任意の組み合わせ、並びにこれらの分子の作動薬又は拮抗薬を用いることができる。グリコアミノグリカンには、糖たんぱく質、プロテオグリカン及びヒアルロナンが含まれる。多糖類には、セルロース、でん粉、アルギン酸、キトサン又はヒアルロナンが含まれる。サイトカインには、カルディオトロフィン（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）、ストロマ細胞に由来する因子、マクロファージ由来するケモカイン（ＭＤＣ）、メラノーマ増殖刺激活性（ｍｅｌａｎｏｍａ ｇｒｏｗｔｈ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ＭＧＳＡ）、マクロファージ炎症性たんぱく質１α（ＭＩＰ−１α）、２、３α、３β、４及び５、インターロイキン（ＩＬ）１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明に有用な免疫クロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド及びたんぱく質は、任意のサイズ及び複雑さの任意の種類の上記分子、並びに当該分子の組み合わせが含まれうる。例には、構造たんぱく質、酵素及びペプチドホルモンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２３】
用語「生活性分子」はまた、繊維状たんぱく質、付着性たんぱく質、接着性化合物、脱付着性化合物（ｄｅａｄｈｅｓｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）及びターゲット化合物を含む。繊維状たんぱく質には、コラーゲン及びラスチンが含まれる。付着性／脱付着性化合物には、フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンジン及びテネイシンＣが含まれる。付着性たんぱく質には、アクチン、繊維素、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、セレクチン、細胞間接着分子（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）１、２及び３、並びに細胞−マトリックス付着受容体（例えば、インテグリン、例えば、α5β1、α6β1、α7β1、α4β2、α2β3、α6β4を含むがこれらに限定されるものではない）が含まれる。
【０１２４】
いくつかの態様では、細胞接着用のコーティングを生成させるために従来用いられているポリマーを、上記コーティング組成物に含ませることができる。例えば、ポリペプチド系ポリマー、例えば、ポリリジン、コラーゲン、フィブロネクチン、インテグリン及びラミニンを、上記コーティングに含ませることができる。これらのポリペプチドのペプチド部分をまた、上記コーティング組成物に含ませることができる。マトリックスたんぱく質の例示的な結合ドメイン配列を、表１に示す。
【０１２５】
【表１】
【０１２６】
上記コーティング組成物中に存在する試薬にもよるが、これらのポリペプチド系ポリマーは、誘導体化していない状態又は誘導化した状態であることができる。例えば、上記ポリペプチド系ポリマーを、潜在性反応性基を用いて誘導し、次いで、上記非生分解性ポリマーに由来する上記潜在性反応性基ペンダントと共に活性化して上記コーティングを生成することができる。例示的な組み合わせには、１種又は２種以上の感光性ポリリジン（ｐｈｏｔｏ−ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）、感光性コラーゲン、感光性フィブロネクチン及び感光性ラミニン、又はポリペプチドの光誘導体化部分（ｐｈｏｔｏ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｏｒｔｉｏｎｓ）（本明細書に記載されるものを含む）を用いた、感光性ポリ（アミノプロピルメタクリルアミド）又は感光性ポリ（エチレンイミン）が含まれうる。
【０１２７】
光誘導体化ポリペプチド（ｐｈｏｔｏｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンを、米国特許第５，７４４，５１５号明細書（Ｃｌａｐｐｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ Ａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）に記載されるように調製することができる。この特許に記載されるように、ヘテロ二官能性薬剤を、たんぱく質を光誘導体化するために用いることができる。当該薬剤には、一方の端のベンゾフェノン光活性化可能基（ベンゾイル安息香酸、ＢＢＡ）、中間のスペーサー（ε−アミノカプロン酸、ＥＡＣ）及び他方の端のアミン反応性熱化学結合基（Ｎ−オキシスクシンイミド、ＮＯＳ）が含まれる。
【０１２８】
ＢＢＡ−ＥＡＣを、４−ベンゾイルベンゾイルクロリド及び６−アミノカプロン酸から合成する。次いで、ＢＢＡ−ＥＡＣのＮＯＳエステルが、カルボジイミド活性によるＢＢＡ−ＥＡＣのカルボキシ基を、Ｎ−ヒドロキシスクシミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｍｉｄｅ）とエステル化させて合成され、ＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳが生じる。たんぱく質、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等を、商業的な供給源から購入することができる。１モルのたんぱく質当たり、１０〜１５モルのＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳ架橋剤の比で、ＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳ架橋剤を添加することにより、上記たんぱく質を光誘導体化する。
【０１２９】
生活性分子はまた、レプチン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ＲＧＤペプチド、腫瘍壊死因子α及びβ、エンドスタチン、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、骨形成たんぱく質−１、骨形態形成タンパク質２及び７、オステオネクチン、ソマトメジン様ペプチド、オステオカルシン、インターフェロンα、インターフェロンαＡ、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロン１α及びインターロイキン２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７及び１８を含む。
【０１３０】
本明細書において、用語「増殖因子」は、細胞又は組織の増殖を促進する生活性分子を意味する。本発明に有用な増殖因子には、形質転換増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、ＡＡ、ＡＢ及びＢＢイソフォームを含む血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、例えば、ＦＧＦ酸性イソフォーム１及び２、ＦＧＦ基本形状２及びＦＧＦ４、８、９及び１０、神経増殖因子（ＮＧＦ）、例えば、ＮＧＦ２．５ｓ、ＮＧＦ７．０ｓ及びβＮＧＦ及びニューロトロフィン、脳由来神経栄養因子、軟骨由来因子、骨増殖因子（ＢＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＥＧ−ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−関連たんぱく質、Ｂｖ８、ＶＥＧＦ−Ｅ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）Ｉ及びＩＩ、肝細胞増殖因子、グリア神経栄養増殖因子（ＧＤＮＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦα、β、β１、β２及びβ３、骨格増殖因子、骨基剤由来増殖因子及び骨由来増殖因子及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの増殖因子がまた、細胞又は組織の分化を促進することができる。例えば、ＴＧＦは、細胞又は組織の増殖及び／又は分化を促進することができる。いくつかの好ましい増殖因子には、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＦＧＦｂ、ＦＧＦａ及びＢＧＦが含まれる。
【０１３１】
本明細書において、用語「分化因子」は、細胞の分化を促進する生活性分子を意味する。当該用語には、ニューロトロフィン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、又は形質転換増殖因子が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＣＳＦには、顆粒球−ＣＳＦ、マクロファージ−ＣＳＦ、顆粒−マクロファージ−ＣＳＦ、エリスロポエチン及びＩＬ−３が含まれる。いくつかの分化因子はまた、細胞又は組織の増殖を促進することができる。例えば、ＴＧＦ及びＩＬ−３は、細胞の分化及び／又は増殖を促進することができる。
【０１３２】
いくつかの態様では、上記コーティング組成物に、他の所望による成分を添加する場合には、上記非生分解性ポリマーが、当該組成物中で主成分であることが一般的に望ましい。上記コーティングがいくつかの生分解性成分を含む場合には、これらの成分を、一定の期間にわたって分解することができるが、上記非生分解性ポリマーは、上記コーティングの主成分として残る。
【０１３３】
上記コーティング組成物の試薬、例えば、上記ポリマー物質を、好適な液体、例えば、水性又はアルコール系液体の中で調製することができる。例えば、上記ポリマー物質を、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で溶解することができる。しかし、さらに典型的に用いられる濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲にある。
上記コーティングを、浸漬コーティング、インソリューション（ｉｎ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ）コーティング及びスプレーコーティングを含む任意の好適な方法により生成することができる。
【０１３４】
上記コーティングが光反応性基を含む場合には、照射段階を、当該光反応性基の活性化を促進する量の化学線を上記光反応性基に当て、そしてナノフィブリル構造体のナノ繊維と結合させることにより実施することができる。
【０１３５】
化学線は、上記光反応性基の活性化を促進する任意の好適な光源により供給されうる。好ましい光源（例えば、Ｄｙｍａｘ Ｃｏｒｐ．から入手できるもの）は、１９０ｎｍ〜３６０ｎｍの範囲のＵＶを照射する。好適な放射線量は、約１０ｎｍのバンド幅を有し、３３５ｎｍバンドパスフィルターを取り付けた線量計を用いて測定され、約０．１ｍＷ／ｃｍ2〜約２０ｍＷ／ｃｍ2の範囲にある。
【０１３６】
いくつかの態様では、上記光反応性基を活性化する段階に関連して、フィルターを用いることが望ましい場合がある。フィルターの使用は、当該フィルターが、活性化工程の際に上記コーティングに供給される一又は複数の特定の波長の放射線の量を選択的に最小化することができる観点から有益でありうる。これは、上記コーティングの１種又は２種以上の成分が、一又は複数の特定の波長の放射線に対する感度が高く、そしてそれらが曝露の際に分解又は変質する可能性がある場合に有益であることができる。
【０１３７】
典型的には、フィルターを透過させる光の波長により、フィルターを特定することができる。本発明に関連して用いることができるフィルターの２種の実例は、カットオフフィルター及びバンドパスフィルターである。一般的に、カットオフフィルターは、光線透過率が最高透過率の約２５％であるカットオフ透過率により分類されている。バンドパスフィルターの場合、波長の範囲は、当該フィルターに関して特定されており、そして中心波長は、上記フィルターを通過できる波長の中点値である。
【０１３８】
上記コーティングされたナノフィブリル構造体の調製に続いて、上記ナノ繊維の表面に共有結合していない可能性がある過剰の物質を取り除くため、洗浄段階を実施することができる。上記コーティングされたナノフィブリル構造体をまた、さらなるＵＶ照射等により上記ナノフィブリル構造体を殺菌するために処理することができる。
【０１３９】
本発明のいくつかの優位性は、多種多様の細胞種に付着性コーティングを供給するために特に有用であるコーティングを生成することに関連する。上記コーティングの安定性のために、当該コーティング方法を実施してコーティングされたナノフィブリル構造体を供給することができ、次いで、上記コーティングされたナノフィブリル構造体を、使用者に提供するか、又は使用前の一定の期間貯蔵することができる。他のケースでは、上記コーティング試薬（少なくとも上記非生分解性ポリマーを含む）を、キット内で使用者に供給し、次いで当該使用者が、上記コーティング方法を、ナノフィブリル構造体に実施することができる。従って、本発明はまた、非生分解性ポリマー含有コーティングを調製するためのキットを提供することができる。上記キットには、上記コーティングを生成するための指示書が含まれることができ、そして所望により、当該キットの試薬を用いてコーティングされているナノフィブリル構造体を用いて細胞を培養するための方法が含まれうる。
【０１４０】
いくつかの態様では、本発明は、コーティングされたナノフィブリル構造体を用いた、細胞を培養するためのコーティング及び方法を提供し、そこでは、当該コーティングされたナノフィブリル構造体は、細胞接着のための優れた基剤を提供し、そして上記コーティングは、上記細胞が相当な期間（例えば、１４日超、２１日超、２８日超、３５日超、４２日超、４９日超又は５６日超）、上記コーティングされたナノフィブリル構造体と接触して保持することができる方法において用いられうる。いくつかの態様では、上記細胞をまた、約１４〜約６０日の範囲の期間、培養物中で保持することができる。例えば、上記細胞を、コーティングされたナノフィブリル構造体上に配置することができ、そこでは、当該細胞は、上記コーティングされた構造体の一点に付着し、そして適切な培地の存在下で生存が保たれる。ある場合には、上記細胞は増殖により増えることができるが、一般的に、上記細胞の表現型は変化しない。
【０１４１】
本発明のコーティングに関連して、上記細胞は、細胞を維持するか、又は所望の細胞種の形成を促進するために好適である液体培地の中で培養されるのが典型的である。種々のベース液体培地、血清、アミノ酸、微量元素、ホルモン、抗生物質、塩、緩衝剤及び増殖因子（例えば、本明細書に記載されるもの）並びに／又は分化因子（例えば、本明細書に記載されるもの）を補うことができるＲＰＭＩ等を用いることができる。
【０１４２】
細胞の機能（例えば、増殖及び分化）の態様に作用しうる因子をまた、上記液体培地に添加することができる。これらの因子には、ニューロトロフィン、サイトカイン（例えば、インターロイキン）、インスリン様増殖因子、形質転換増殖因子、上皮細胞増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、ヘパリン結合性増殖因子、チロシンキナーゼ受容体配位子、血小板由来増殖因子及び血管内皮増殖因子及びセマフォリンが含まれうる。
【０１４３】
例示的なニューロトロフィンには、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン及び脳誘導神経向性因子が含まれる；例示的な上皮細胞増殖因子には、ニューレグリン、形質転換増殖因子α及びネトリンが含まれる；例示的なサイトカインには、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５及びＧ−ＣＳＦ、白血病抑制因子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルディオトロフィン−１（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１）及びオンコスタチン−Ｍが含まれる；例示的な形質転換増殖因子には、グリア細胞株由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＧＤＮＦ）、アルテミン、ニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）及びパーセフィンが含まれる。
【０１４４】
本発明のいくつかの態様では、上記方法は、適切な培地の存在下で、本明細書に記載されるように、コーティングされた基剤上で幹細胞を培養することを含む。幹細胞は、多分化能を有し且つ成形的である（それらが種々の細胞種に分化することを誘導する）。幹細胞には、胚幹細胞、例えば、胚盤胞から得られるもの及び成体の身体中の種々の組織から得ることができる成体幹細胞、例えば、造血幹細胞源を供給する骨髄が含まれる。胚幹細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで本質的に無限の増殖能を有し、従って、適用、例えば、組織再生を含む適用において、大きく増やすことができる。本発明のコーティングされたナノフィブリル構造体は、これらの細胞を培養するための理想の基剤を提供する。というのは、他の基剤よりも相当長い期間、コーティングされたナノフィブリル構造体上で、上記細胞を維持し、且つ伸張させることができるからである。従って、上記コーティングされたナノフィブリル構造体は、所望の用途、例えば、細胞移植又は再生医療のために、多くの肝細胞を得ることを顕著に促進することができる。
【０１４５】
本発明の方法に従って培養された細胞をまた、ドラッグデリバリー、遺伝子同定のため、そして抗体生産のために用いることができる。
本発明のコーティングされたナノフィブリル構造体はまた、クローン又は少数の細胞をコーティングされた製品容器に接種し、そして培養において、集密状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｓｔａｔｅ）に到達する前の上記細胞を収穫、分割、又は希釈する前に、より長い期間を可能とする。
【０１４６】
ある場合には、上記細胞を上記コーティングされたナノフィブリル表面上に配置させる前に、当該細胞を、細胞のフィーダー層上に保持することができる。上記フィーダー層上で、一定期間、培養することに続いて、本明細書に記載される本発明のコーティングを有するナノフィブリル細胞培養製品に、上記細胞を移動させることができる。本発明に従って、上記コーティングされたナノフィブリル構造体上で、新鮮なコーティング面を供給する必要なく、最大約３０日の期間、上記細胞を培養することができることが見出された。
【０１４７】
本発明の他の態様では、本発明は、神経前駆細胞及び幹細胞の分化のための方法に関する。本発明に従うと、部分的又は完全に成熟した神経細胞表現型の形態学又は生化学的変化の特徴を誘発する１種又は２種以上の因子（例えば、神経栄養増殖因子）及び本発明のコーティングの存在下で、神経前駆細胞を培養することができる。
【０１４８】
さらに具体的には、いくつかの態様では、乏突起神経膠芽細胞、星状細胞及び神経細胞に分化させるために誘導することができる多分化能の神経上皮幹細胞及び系統限定中間前駆細胞を培養するために、上記コーティングされたナノフィブリル構造体を用いることができる。上記前駆細胞は、種々の発育段階においてＣＮＳ中に存在する。
【０１４９】
プラスチックに弱く付着するＰＣ１２細胞（褐色細胞腫細胞）が、本明細書に記載されるコーティングされたナノフィブリル構造体に良好に付着することを実証することができた。一般的に、ＰＣ１２細胞は増殖が遅く、そしてＮＧＦ及びｃＡＭＰの共働作用を用いて分化させることができる。一度分化したＰＣ１２細胞を、約１４日間維持することができる。デキサメタゾンは、非神経系リネージの分化を誘導する。本明細書に記載される結果はまた、上記非生分解性ポリマーアミン含有コーティング及び神経増殖因子（ＮＧＦ）と共にナノフィブリル構造体の存在下の、神経性前駆物質ＰＣ１２細胞が、神経突起伸張及び交感神経系神経細胞表現型の生化学的標識の発現を示すことを教示している。
【実施例】
【０１５０】
例１
感光性ポリマー試薬
Ｉ．感光性ポリ（ＡＰＭＡ）
感光性ポリ（アミノプロピルメタクリルアミド）（感光性ポリ（ＡＰＭＡ）／ＡＰＯ２）の調製を、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド（ＡＰＭＡ−ＨＣｌ）及びＮ−［３−（４−ベンゾイルベンズアミド）プロピル］メタクリルアミド（ＢＢＡ−ＡＰＭＡ）の共重合により実施した。これらの調製は、米国特許第５，８５８，６５３号明細書の、それぞれ、例２及び例３に記載されている。
【０１５１】
２Ｌのフラスコに、２．３７８ｇのＢＢＡ−ＡＰＭＡ（６．７８７７ミリモル）、０．８４９の２，２’−アゾビス（２−メチル−プロピオニトリル）（ＡＩＢＮ）（５．１７４８ミリモル）及び０．８４９ｇのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（６．７７ミリモル）を添加し、次いで、当該成分を溶解させるために７８６ｇのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して共重合を行った。次いで、当該内容物を撹拌し、そして少なくとも５分の間、ヘリウムスパージャを用いて酸素を除去した。別個のフラスコにおいて、窒素スパージャを用いて、３０６ｇのＤＩ水の中に、７２．４ｇのＡＰＭＡ−ＨＣｌ（４０５．２１５ミリモル）を溶解させた。溶解したＡＰＭＡ−ＨＣｌを、ＢＢＡ−ＡＰＭＡを含む混合物に移動し、続いて少なくとも１０分間のヘリウムスパージャを行った。続いて、密封した容器を、５５℃で一晩中加熱して重合を完了させた。
【０１５２】
次いで、１８０ｍＬの量の上記ポリマー溶液を、１８０ｍＬのＤＩ水で希釈し、そして毎分１．２５〜０．３５ガロンの一定流量を用いて、５５ガロンのタンクの中で、少なくとも９６時間の間、１２，０００〜１４，０００の分子量カットオフチューブを用いて、脱イオン水で透析した。
１０μｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲にわたる上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）ポリマーを有する種々のコーティング溶液を、水中で調製した。
【０１５３】
ＩＩ−ＩＶ．感光性コラーゲン、感光性フィブロネクチン及び感光性ラミニン
感光性コラーゲン、感光性フィブロネクチン及び感光性ラミニンを、米国特許第５，７４４，５１５号明細書の例１に記載されるように調製した。
２５μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬの範囲にわたる種々の感光性ラミニンコーティング溶液を、水中で調製した。
感光性フィブロネクチンコーティング溶液を、水中において、２５μｇ／ｍＬに調製した。
感光性コラーゲンコーティング溶液を、０．０１２ＮのＨＣｌ中において、２５μｇ／ｍＬに調製した。
【０１５４】
Ｖ．感光性ＰＥＩ
最初に、減圧下でポリエチレンイミン（ＰＥＩ；２４．２ｗｔ．％ 固形分；２０００ｋｇ／モル Ｍｗ；ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．）を乾燥させ、次いで、１９ｍＬの９０：１０（ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノール溶液に１．０９ｇのＰＥＩを溶解して、感光性ＰＥＩを調製した。次いで、当該ＰＥＩ溶液を、氷浴中で０℃まで冷却した。溶解すべき６２ｍｇのＢＢＡ−Ｃｌ（４−ベンゾイルベンゾイルクロリド；その調製は、米国特許第５，８５８，６５３号明細書に記載されている）を、２．８ｍＬのクロロホルムに添加した。ＢＢＡ−Ｃｌ溶液を冷却し、撹拌しているＰＥＩ溶液に添加した。
【０１５５】
上記反応溶液を、室温まで加温しながら一晩中撹拌した（上記反応のＴＬＣ分析により、２．５時間後に未反応のＢＢＡ−Ｃｌは存在しないことが示された）。翌日、上記反応溶液を大きなフラスコに移し、そして７７．５ｍＬの脱イオン水とともに、１当量の濃塩酸を添加した。水性ＰＥＩ溶液の外観が透明になるまで、有機溶媒を、４０℃、減圧下で取り除いた。次いで、水性ＰＥＩ溶液を、コーティング溶液として用いるための５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。
ＶＩ．感光性ＲＧＤ
感光性ＲＧＤを、同一出願人による米国特許第６，１２１，０２７号明細書の例１に記載されるように調製した。感光性ＲＧＤのコーティング溶液を、水中において、２５μｇ／ｍＬに調製した。
【０１５６】
例２
基剤コーティング
上記例１で調製された感光性ポリマー試薬を、平面（複数のウェルのプレート）及び３次元の基剤（高分子量ナノ繊維）上にコーティングした。
【０１５７】
平面をコーティングするため、１．０ｍＬの量の、例１に記載されるコーティング溶液を、１２個のウェルのプレート（ポリスチレン；Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに添加した。基剤コーティングにおいて、上記コーティング溶液の深さ（上記溶液の表面から、基剤、ポリスチレン又はナノ繊維のどちらかの表面までの距離）は、概して５ｍｍ以下、そして典型的には、約１〜２ｍｍの範囲にある。Ｄｙｍａｘ（商標）製ランプを使用して、１０ｎｍのバンド幅を有する３３５ｎｍのバンドパスフィルターを用いて評価された、２００〜３００ｍＪのエネルギーを供給した（平均して、上記ウェルから２０ｃｍの距離に保たれているランプを用いて、約３〜４分間、上記ウェルを照射した）。次いで、上記ウェルを、ｐＨ７．２の緩衝食塩水を用いて洗浄し、結合していない試薬を取り除いた。次いで、上記ウェルを再度ＵＶ照射し、上述と同一の照射条件を用いて、上記ウェルを殺菌した。
【０１５８】
コーティングされていない１２個のウェルのプレートを、対照として用いた。３次元の表面をコーティングするため、０．５ｍＬの量の、例１に記載されるコーティング溶液を、ディスク状の（ｄｉｓｃ）ナノ繊維基剤（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｃｏ．，ＭＮ；米国特許出願公開第２００５／００９５６９５号）に添加した。約２０ｃｍの距離におけるＤｙｍａｘ（商標）製ランプを用いて、１分間、上記基剤を照射した。次いで、上記ディスクを、水で４回洗浄した。次いで、上記ナノ繊維基剤を、再度ＵＶ照射し、当該ナノ繊維基剤を殺菌した。
コーティングされていないナノ繊維基剤を、対照として使用した。
【０１５９】
例３
感光性ポリマーがコーティングされた基剤上のＰＣ１２細胞の接着アッセイ
付着性の乏しい細胞（ＰＣ１２細胞）を、種々の感光性ポリマー基剤上に平面培養する（ｐｌａｔｅ）効果を決定するために、接着アッセイを実施した。ＡＴＣＣ（登録＃ＣＲＬ １７２１）から購入したラットＰＣ１２（褐色細胞腫）細胞を、１０％の馬血清、５％の牛血清、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の、コラーゲンがコーティングされたポリスチレンフラスコ（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）内で前培養した。細胞を、５％ＣＯ2／９５％空気加湿チャンバー内で、３７℃でインキュベートした。上記培地を、１日おきに交換した。細胞が、８０％の密集度に到達したら、当該細胞をトリプシン処理し、そして継代培養した。例２に記載される方法に従ってコーティングされた１２個のウェルの基剤に上記細胞を平面培養する前に、これらの培養条件を続けた。
【０１６０】
継代培養＃２及び継代培養＃１０の間のＰＣ１２細胞を、実施した全ての実験において用いた。上記細胞をトリプシン処理し、そして５００，０００個の細胞／ｍＬの濃度において、ＲＰＭＩ培地中の１２個のウェルのプレート内に、５００，０００個の細胞／ウェルの密度で接種した。４８時間の間、５％のＣＯ2を用いて、３７℃における加湿したチャンバー内で、細胞をインキュベートした。上記細胞は、平面培養する前に、多角形の形態を有し、少なくとも９９％が生存していた。
【０１６１】
細胞をナノ繊維上に接種するために、ＰＣ１２細胞をトリプシン処理し、そして２００μＬのＲＰＭＩ培地内に再懸濁させた。５００，０００個の細胞／１８ｍｍの密度の上記細胞懸濁液を、コーティングされた又はコーティングされていないナノ繊維（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６０９１９２、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｃｏ．，ＭＮ）に注意深く添加し、そして上記細胞を、層流フードの下、室温で、１０分間、上記ナノ繊維に付着させた。１０分後、８００μＬの増殖培地を、上記ナノ繊維の周りにやさしく添加し、そして上記細胞を、３７℃において、加湿した５％ＣＯ2／９５％空気チャンバー内に置いた。上記培地を、１日おきに交換した。
【０１６２】
ＭＴＴ接着アッセイ
４８時間後、上記増殖培地を取り出し、そしてコーティングされた及びコーティングされていないポリスチレン上で増殖している上記細胞、コーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維を、Ｃａ++−及びＭｇ++−フリーのＰＢＳを用いて、４回洗浄した。これらの複数回の洗浄により、上記ウェルから、ゆるく結合した又は結合していない細胞を除去した。コーティングされた基剤上で、洗浄により５％の細胞が除去された一方で、コーティングされていない基剤上では、洗浄により７０％が除去された。次いで、３７℃における加湿されたチャンバー内で、ＭＴＴを用いて、２時間の間、細胞をインキュベートした（増殖培地、Ｓｉｇｍａを用いて、１：１に希釈）。ＭＴＴを含む培地を取り出し、そして上記細胞を、ＰＢＳを用いてさらに洗浄し、フェノールレッドを取り除いた。５００μＬの染料可溶化剤（０．５ｍＬの０．０４ＮＨＣｌ／イソプロピルアルコール及び０．１２ｍＬの３％ＳＤＳ／水の混合物）を添加し、そして上記ウェルを、室温で３０分間（又は染料が完全に可溶化するまで）、３０ｒｐｍでやさしく揺り動かした。当該試料を、９６個のウェルの皿に移動し、そして分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）内で、５７０ｎｍにおいて、吸光度を読取った。
【０１６３】
コーティングされた及びコーティングされていない平面（１２個のウェルのプレート）上の細胞接着の結果を、図１に示す。ＰＣ１２細胞の最良の接着は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）を用いてコーティングしたウェルで実証され、感光性ラミニン及び感光性ＰＥＩ試薬が続いた。コーティングされていないウェル及び感光性フィブロネクチンによりコーティングされた基剤を、対照として用いた。ＰＣ１２細胞は、フィブロネクチンに良好に付着する他の細胞種と比較して、それらの表面に低濃度のフィブロネクチン受容体を発現させる（Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ及びＲｅｉｃｈａｒｄｔの「Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．」（１９８７）１０５：２３４７−２３５８を参照せよ）。感光性ＲＧＤ及び感光性コラーゲンは、感光性ポリ（ＡＭＰＡ）と同様の、感光性コラーゲン及び感光性ラミニンと比較して感光性ポリ（ＡＭＰＡ）の接着能におおよそ２倍の差を有する実施されたコーティングを供給しなかったことを、当該結果は示している。
【０１６４】
３次元の表面（ナノ繊維）上の細胞接着の結果を、図２に示す。平面上の結果と同様に、上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維は、コーティングされていない基剤と比較して、固定の弱い細胞を、強く接着させることが示された。
【０１６５】
図３は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維（３Ｂ）及びコーティングされていないナノ繊維（３Ａ）上で増殖するＰＣ１２細胞の明視野顕微鏡像を示す。２４時間後に、当該画像を撮影した。ＰＣ１２細胞は、上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で、良好に広がることを実証したが、コーティングされていない表面では、上記細胞は、お互いに接着してクラスターを形成し、コーティングされていない基剤への接着は非常に弱かった。
【０１６６】
図４は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で２４時間の間増殖させ、そしてファロイジン（１：５００、分子プローブ）を用いた染色を受けたＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像を示す。ファロイジンは、線維状アクチン（Ｆ−アクチン）に結合し、そして上記細胞の細胞骨格組織を可視化する。感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で培養されたＰＣ１２細胞は、それらの通常の多角形形態を保持し、上記基剤の強い結合能力が細胞形態に影響を与えないことを示していることを、上記染色結果は示している。ファロイジン染色の場合、ＰＣ１２細胞を、４％のパラホルムアルデヒドを用いて２０分固定し、０．１ＭのＰＢＳで３回洗浄し、そして０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内で希釈したＴＲＩＴＣと共役したファロイジンを用いて、室温で１時間の間インキュベートした。０．１ＭのＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、そして倒立顕微鏡の下で観察した。
【０１６７】
上記細胞が３次元の基剤上で培養されると、アクチンは、大きく広がるのではなく、皮質の環の中で組織化することを、当該画像は示している。アクチンのこの組織化は、組織マトリックス又は組織様マトリックスのどちらかの中で観察される（Ｗａｌｐｉｔａ及びＨａｙの「Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．ＭｏＬ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」（２００２）３：１３７−１４１；米国特許出願第２００５／００９５６９５号明細書）。
【０１６８】
付着性の乏しい細胞系の付着性を特に改良した感光性試薬を実証するために、付着性の強い細胞系を上記感光性ポリマーがコーティングされた基剤上で平面培養した。ヒト包皮繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＨＦＦ）を、ＰＣ１２細胞の場合に用いられる方法に従って、感光性ポリマーがコーティングされた基剤上で平面培養し、そしてＭＴＴ接着アッセイを、培養に続いて実施した。図５は、上記感光性試薬の存在により、むき出しのポリスチレンと比較して、ＨＦＦ細胞の付着性が概して改良されなかったことを示している。試験された種々のコーティングされた基剤上で、接着性の強い細胞系の接着に、利益は観察されなかった。
【０１６９】
例４
感光性ポリマーがコーティングされた表面上のＰＣ１２細胞の増殖
ＰＣ１２細胞を、例３に記載されるように培養した。ＢｒｄＵ取り込みを、コーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６０９１８６、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｃｏ．，ＭＮから市販される）、並びにコーティングされた及びコーティングされていないポリスチレン上で増殖した細胞に関して試験した。一日で、２，５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、１μＭ濃度、Ｓｉｇｍａ）を、上記培養物に添加し、分裂細胞の数の測定を可能とした。免疫細胞化学を実施するために、４８時間の間、ＢｒｄＵを細胞に適用し、次いで、抗ＢｒｄＵ抗体を用いて染色した。
【０１７０】
ＰＣ１２細胞を、Ｓ．Ｐ Ｍｅｍｂｅｒｇ＆Ａ．Ｋ．Ｈａｌｌ（「Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．」（１９９５）２７：２６−４３）の手順により透過化した（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）。細胞培養物を、１時間の間、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清）中の抗ＢｒｄＵ抗体（１：１００、Ｓｉｇｍａ）を用いてインキュベートし、ＰＢＳですすぎ、そして追加の時間、ブロッキングバッファー中の抗マウスＩｇＧｌ二次抗体（１：２００、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートした。培養物を、ＰＢＳで３回すすぎ、そして標識付けた細胞を、倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＬＡ）で観察した。
【０１７１】
図６は、ＰＣ１２細胞内のＢｒｄＵ取り込みの蛍光顕微鏡像を示す。当該画像には、コーティングされていないナノ繊維と比較して、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上でＢｒｄＵがより顕著に取り込まれたことが示されている。コーティングされていない表面と比較して、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた表面のＢｒｄＵのより顕著な組み込みは、より多数の分裂細胞に関連し、そして上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた表面上の上記細胞の接着が改良されたためであると考えられる。一定の範囲に存在する細胞の総数は、ＤＡＰＩ染色により示されている。上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた基剤上で増殖した細胞は、感光性ポリリジンがコーティングされた基剤と比較して、６０％超のＢｒｄＵの取り込みを示した。
【０１７２】
例５
種々のコーティングされた表面及びコーティングされていない表面上のＰＣ１２細胞の分化
感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていないポリスチレン製の１２個のウェルのプレート、感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６０９１８６、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｃｏ．，ＭＮから市販される）、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、並びにＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で増殖するＰＣ１２細胞の分化を、ＮＧＦ（神経増殖因子）の存在下で評価した。
試験された他の感光性試薬には、感光性フィブロネクチン、感光性ラミニン、感光性コラーゲン、感光性ＰＥＩ及び感光性ＲＧＤが含まれていた。
【０１７３】
細胞をトリプシン処理し、そして当該細胞を例３に記載されるそれらの通常の増殖培地内の３０，０００個の細胞／３５ｍｍウェルの密度で平面培養した。２４時間後、上記増殖培地を、分化培地（１％の馬血清、０．５％の牛血清、２μＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で置換した。細胞を、５％のＣＯ2／９５％の空気が加湿されたチャンバー内で、３７℃でインキュベートし、そして１日おきにＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、１０日間分化させた。
【０１７４】
神経細胞への分化を評価するために、１０日間培養した後、上記細胞を、β−ＩＩＩチューブリンに関して染色した。免疫染色を実施するために、上記細胞を２０分間、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．１ＭのＰＢＳで３回洗浄し、そして０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内で、β−ＩＩＩチューブリン一次抗体（１：２００、Ｓｉｇｍａ）を用いて１時間の間インキュベートした。細胞を洗浄し、そして追加の時間、抗マウス二次抗体（ＩｇＧ２ｂ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして倒立顕微鏡の下で観察し、β−ＩＩＩチューブリン染色を視覚化した。
【０１７５】
一般的に、上記感光性ポリマーでコーティングされた平坦又は３次元の表面により、神経細胞含有突起に富む、分化した培養物が生産された。これらの表面上の平均神経突起長は、コーティングされていない表面と比較して２倍であった。他の感光性試薬（感光性ラミニン、感光性ＰＥＩ及び感光性コラーゲン）がまた、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）よりも良好とまではいかないが、コーティングされていないポリスチレン又はナノ繊維よりも良好であることが見出された。
よって、上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた表面により、コーティングされていないポリスチレン、コーティングされていないナノ繊維、コラーゲン、ＰＥＩ及び市販のＰｕｒａｍａｔｒｉｘ及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）調製物と比較して、ＰＣ１２細胞が神経細胞に良好に分化した。
【０１７６】
図７は、コーティングされていないポリスチレンと比較して、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）及び感光性ラミニンがコーティングされたポリスチレン上で、ＰＣ１２細胞が良好に分化することを示す。
図８は、コーティングされていないナノ繊維と比較して、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）及び感光性ラミニンがコーティングされたナノ繊維上で、ＰＣ１２細胞が良好に分化することを示す。
図９は、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（商標）及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）と比較して、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で、ＰＣ１２細胞が良好に分化することを示している。感光性ＡＰＭＡは、ナノ繊維上で、より良好な細胞分化と、より長い神経突起伸張とを、定量的に促進する。
β−ＩＩＩチューブリン染色、神経突起形態及び細胞分化の評価を、表２に要約する。
【０１７７】
【表２】
【０１７８】
例６
感光性ポリマーがコーティングされた表面上のＥＳ−Ｄ３細胞の増殖
ＡＴＣＣ（登録番号ＣＲＬ−１９３４）に由来するＥＳ−Ｄ３細胞を、４日間、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｃａｍｂｒｅｘ）及び白血病抑制因子（ＬＩＦ，１０ｎｇ／ｍＬ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を有するＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内の懸濁皿（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｄｉｓｈ）（Ｎｕｎｃ）内で、集合体として増殖させた。次いで、上記培地を、ＮＥＰ基本培地（１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、５μｇ／ｍＬのインスリン、１６μｇ／ｍＬのプトレシン、２０ｎＭのプロゲステロン、３０ｎＭの亜セレン酸、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、Ｂ２７及びＮ２添加剤を加えた２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補ったＤＭＥＭ−Ｆ−１２）と称される化学的に規定された培地に交換し、そして上記細胞を、フィブロネクチン（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）がコーティングされたポリスチレン皿、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６１０３０４、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｃｏ．，ＭＮ）上に接種した。１日おきに培地を交換し、そして上記細胞を、５％のＣＯ2／９５％の空気が加湿されたチャンバー内で３７℃に維持した（Ｍｕｊｔａｂａ及びＲａｏの「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９９）２１４：１１３〜１２７）。
感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた表面を、ＥＳ−Ｄ３細胞と共に用いた。
【０１７９】
増殖性ＥＳ−Ｄ３細胞のためのネスチン染色
ＥＳ−Ｄ３細胞を、２４時間及び４８時間のところで分析した。ＥＳ−Ｄ３細胞を、次のように、ネスチン、未分化の幹細胞のマーカーの存在のために染色した（Ｕ．Ｌｅｎｄａｈｌらの「Ｃｅｌｌ」（１９９０）６０：５８５−９５）。４％のパラホルムアルデヒドを用いて、細胞を、室温で２０分間固定した。０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いてそれらを３回洗浄し、そして室温で２時間の間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内で１：１に希釈されたラットネスチン（ラット４０１、ＤＳＨＢ）に対する一次抗体を用いてインキュベートした。次いで、細胞を、０．１ＭのＰＢＳを用いて５分間洗浄し、そして追加の時間、０，５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内で希釈された抗マウス第二抗体（１：２００，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートし、その後、０．１ＭのＰＢＳを用いてそれらを３回洗浄し、そして倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，ＤＭＬＡ）の下で観察した。ＢｒｄＵでネスチンを二重に標識付け、そして一次抗体の適切な組み合わせ、次いで交差反応をしない（ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｖｅ）二次抗体の中で細胞を同時にインキュベートして、二重標識実験を実施した。
【０１８０】
図１０は、コーティングされたナノ繊維上に、ネスチン／ＢｒｄＵ陽性ＥＳ−Ｄ３細胞が存在することを示す。上記細胞の大部分は、試験された他の全てのリネージマーカーに関して、ネスチン陽性及び陰性であり（ＧＦＡＰ、β−ＩＩＩチューブリン及びＯ４）、未分化の幹細胞の培養物を、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）でコーティングした、これらの完全なる合成面上で維持することができることを示す。
【０１８１】
例７
コーティング面上のＥＳ−Ｄ３細胞の分化
ネスチン陽性ＥＳ−Ｄ３細胞を、基本培地（１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、５μｇ／ｍＬのインスリン、１６μｇ／ｍＬのプトレシン、２０ｎＭのプロゲステロン、３０ｎＭの亜セレン酸、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、Ｂ２７及びＮ２添加剤を加えた２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補ったＤＭＥＭ−Ｆ−１２）内の感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６０９１９２、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｃｏ．，ＭＮ）上で増殖させた。細胞を誘導して、上記増殖培地からｂＦＧＦを取り除き、そしてレチノイン酸（１μＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＰＤＧＦＢＢ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、ＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、１０％血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを添加して分化させた（Ｍｕｊｔａｂａ及びＲａｏ，上記個所）。誘発剤を毎日添加して６日間培養した後、上記幹細胞は、神経細胞、乏突起神経膠芽細胞及び星状細胞に分化した。上記分化を、上記細胞の基剤を変えることなく達成した。
【０１８２】
β−ＩＩＩチューブリン染色
上記細胞を、４％のパラホルムアルデヒドを用いて２０分間固定し、０．１ＭのＰＢＳで３回洗浄し、そして室温で１時間の間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内の神経細胞用のマーカー、β−ＩＩＩチューブリン（１：２００、Ｓｉｇｍａ）を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして追加の時間、抗マウス二次抗体（ＩｇＧ２ｂ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして倒立顕微鏡の下で観察した。
【０１８３】
場合によっては、次のように、ＤＡＰＩを用いて染色した。上記のように調製した細胞を、ＤＡＰＩ溶液（１００％ＭｅＯＨ内で１：１０００に希釈、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で洗浄した。固定した細胞を、室温で１５分間、ＤＡＰＩ溶液を用いてインキュベートした。
【０１８４】
乏突起神経膠芽細胞のためのＯ４染色
４％のパラホルムアルデヒドを用いて、室温で１０分間、細胞を固定した。０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて、５分間、細胞を３回洗浄した。室温で２時間の間、５％のＢＳＡを含む培地内で、Ｏ４（６μｇ／ｍＬ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する一次抗体と共に、細胞をインキュベートした。次いで、０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて、５分間、調製物を３回洗浄した。二次抗体と共に細胞をインキュベートし、そしてβ−ＩＩＩチューブリンに関して上述のようにさらに処理した。
【０１８５】
星状細胞用のＧＦＡＰ染色
４％のパラホルムアルデヒドを用いて、室温で２０分間、細胞を固定した。０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて、５分間、細胞を３回洗浄した。室温で２時間の間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳで、ＧＦＡＰ（１：５００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する一次抗体と共に、細胞をインキュベートした。細胞を洗浄し、そして抗マウス二次抗体と共にインキュベートし、そしてβ−ＩＩＩチューブリンに関して上述したようにさらに処理した。
【０１８６】
コーティングされていないナノ繊維と、ポリ−リジン（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）及びラミニン（１５μｇ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて二重にコーティングしたポリスチレンとを、対照として用いた。
適切な細胞種への良好な分化は、コーティングされていないナノ繊維及びポリリジン／ラミニンで二重にコーティングされている組織培養プラスチックと比較して、コーティングされたナノ繊維上で得られ、そしてこの分化は、適切な誘発剤を同一の基剤に単に添加するのみで達成される。
【０１８７】
図１１は、ＥＳ−Ｄ３細胞が、コーティングされていないナノ繊維上で増殖する神経細胞と比較して、より長い神経突起長を有する神経細胞含有突起（当該突起は、短く且つ切り株様（ｓｔｕｂｂｙ）である）に分化することを示す。
図１２は、ＥＳ−Ｄ３細胞が、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で、タイプＩ及びタイプＩＩのＧＦＡＰ陽性星状細胞に分化することを示す。当該細胞は、コーティングされたナノ繊維上で、より明るいことに留意する。
【０１８８】
例８
クローン濃度（ｃｌｏｎａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）におけるＰＣ１２細胞の増殖
ＰＣ１２細胞を、３５ｍｍウェル内に置いた３００個の細胞／３２ｍｍナノ繊維ディスク（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６０９１８６、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｃｏ．，ＭＮ）において平面培養し、そして一日おきにＮＧＦを添加して、３０日間分化させた（例５に記載されるように）。３０日後、上記細胞を２０分間、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．１ＭのＰＢＳで３回洗浄し、そして室温で１時間の間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内のβ−ＩＩＩチューブリン（１：２００、Ｓｉｇｍａ）を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして追加の時間、抗マウス二次抗体（ＩｇＧ２ｂ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして倒立顕微鏡の下で観察した。単一細胞は、４日の培養後、クローンを生成し始めた。当該クローンは、迅速に増殖し、そして上記コーティング面にしっかりと接着したままであった。
【０１８９】
例９
感光性ポリマーコーティング上のＰＣ１２細胞の長期間培養
例８に記載されるように培養したＰＣ１２細胞を、４５日間維持し、そしてβ−ＩＩＩチューブリンに関して処理した。図１３は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた表面上で増殖する、分化したＰＣ１２細胞を示す。３０日の培養の後、上記細胞はしっかりしており、そして広範囲な神経突起を示した。
【０１９０】
例１０
感光性ポリマーコーティング上のＥＳ−Ｄ３細胞の長期培養
例７に記載されるように培養及び分化したＥＳ−Ｄ３細胞を、２２日の期間にわたって維持し、そしてβ−ＩＩＩチューブリン及び神経フィラメント並びにＧＦＡＰに関して処理した。図１４は、β−ＩＩＩチューブリン陽性神経細胞内の幹細胞の成熟を示している。これらの神経細胞のサブセットはまた、神経フィラメント+である。この時点で、培養物内で、むき出しのナノ繊維及びポリ−リジン／ラミニン上で増殖している細胞が上記基剤から離れ始めた一方で、ＡＰＭＡコーティングされたナノ繊維上で増殖している細胞は、上記基剤に硬く接着し、そして成熟した神経細胞を含む突起に分化した。図１５は、ＧＦＡＰ+タイプＩ及びタイプＩＩの星状細胞への、星状細胞の成熟を示す。上記細胞は、上記表面に堅く接着したままであった一方で、むき出しのナノ繊維及びポリ−リジン／ラミニン上で増殖している細胞は、上記基剤から離れ始めた。
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】図１は、種々の感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていない平面上のＰＣ１２細胞の接着の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維構造体上のＰＣ１２細胞の接着の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維（３Ａ）及びコーティングされていないナノ繊維（３Ｂ）上で増殖するＰＣ１２細胞の明視野顕微鏡像である。
【０１９２】
【図４】図４は、２４時間の間、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で増殖させた、ファロイジン染色したＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像である。
【図５】図５は、種々の感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていない平面上のＨＦＦ細胞の接着の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維（Ａ）及びコーティングされていないナノ繊維（Ｂ）上で増殖するＰＣ１２細胞のＢｒｄＵ取り込み、並びにこれらの細胞（Ａ’）及び（Ｂ’）それぞれのＤＡＰＩ染色の蛍光顕微鏡像である。
【０１９３】
【図７】図７は、種々の感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていない平坦なポリスチレン表面上で増殖させた、β−ＩＩＩチューブリン染色したＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像である。
【図８】図８は、種々の感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていない平坦なナノ繊維表面上で増殖させた、β−ＩＩＩチューブリン染色したＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像である。
【図９】図９は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維対他の市販の細胞基剤上で増殖させた、β−ＩＩＩチューブリン染色したＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像である。
【０１９４】
【図１０】図１０は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で増殖させたネスチン／ＢｒｄＵ染色したＥＳ−Ｄ３細胞の蛍光顕微鏡像である。
【図１１】図１１は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維及びコーティングされていないナノ繊維上で増殖させたβ−ＩＩＩチューブリン染色されたＥＳ−Ｄ３の神経突起形態を実証する蛍光顕微鏡像である。当該画像は、ＥＳ−Ｄ３細胞が、コーティングされていないナノ繊維上で増殖する神経細胞と比較して、より長い神経突起長を有する神経細胞含有突起（当該突起は、短く且つ切り株様である）に分化することを示す。
【０１９５】
【図１２】図１２は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維及びコーティングされていないナノ繊維上で増殖させた、ＧＦＡＰ染色したＥＳ−Ｄ３の蛍光顕微鏡像である。
【図１３】図１３は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で増殖させ、３０日間分化させた、β−ＩＩＩチューブリン染色したＰＣ１２細胞の広範囲な神経突起形態を実証する蛍光顕微鏡像である。
【図１４】図１４は、β−ＩＩＩチューブリンが染色された陽性神経細胞（Ａ）と、β−ＩＩＩチューブリンが染色された陽性神経細胞のサブセットである、神経フィラメントが染色された神経細胞とを実証する蛍光顕微鏡像である。
【図１５】図１５は、ＧＦＡＰ+が染色された、タイプＩ及びタイプＩＩの星状細胞を示す蛍光顕微鏡像である。
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、「ポリマーコーティン並びに細胞維持及び分化のための方法」と題する、２００５年７月２０日に出願された、シリアルナンバー第６０／７００，８６０号を有する米国仮出願；「ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体、並びに細胞維持及び分化のための方法」と題する、２００５年９月２２日に出願されたシリアルナンバー第６０／７１９，３５１号を有する米国仮出願；及び「ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体、並びに細胞維持及び分化のための方法」と題する２００６年２月３日に出願されたシリアルナンバー第６０／７６４，８４９号を有する米国仮出願の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、非生分解性アミン提供ポリマーを含むコーティングを有するナノフィブリル構造体と、これらのコーティングを含む表面への細胞の付着を促進するための方法とに関する。本発明はまた、細胞を分化する方法と、これらのコーティングを有する細胞を維持するための方法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞接着及び増殖に好適な表面を提供するために、種々のアプローチが用いられている。多くの細胞は足場依存的であり、それらが、増殖又は分化のために、基剤へのいくつかのタイプの接着を証明しなければならないことを意味する。ｉｎ ｖｉｖｏで、細胞は、上にある上皮又は内皮を支持する構造体である基底膜中に存在するたんぱく因子に接着することができる。上記基底膜は、基底板と称される膜と、下にあるコラーゲン原線維のネットワークとから成る。細胞接着及び増殖のための優れた基剤を提供することができるため、基底膜内に見出される成分に基づいた、細胞接着用の人工表面が作成されている。上記人工表面は、ｉｎ ｖｉｖｏ、例えば、移植可能な医療装置、及びｉｎ ｖｉｔｒｏ、例えば、細胞培養製品中で用いられている。
【０００４】
細胞を基層に接着させるために、荷電表面が用いられている。しかし、培養工程の際に、荷電表面の全てが、細胞の十分な接着に好適というわけではない。例えば、いくつかのマイナスに帯電した表面は、好適な基剤を供給しない。というのは、多くの細胞は、細胞が表面に接着することを媒介するために十分な量の、正に帯電したタンパク質を示さないからである。
【０００５】
天然のポリペプチド系細胞接着因子、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンが、細胞の基剤への接着を強化するために用いられている。生分解性合成ポリマーカチオン、例えば、ポリリジン及びポリオルニチンが、種々の足場依存性細胞種の接着を促進するコーティングを提供するために用いられている。これらの種類のポリマー物質を用いることに伴う課題の一つは、当該物質が、培養の液体培地内に存在することとなる場合があるプロテアーゼか、又は血清中にｉｎ ｖｉｖｏで存在するプロテアーゼにより、長期間にわたり分解されうることである。従って、これらの物質を含む表面は、限定的な期間のみ、細胞接着のために有用である場合がある。細胞付着性に関連する特性は、上記コーティング内に存在する物質の分解により、ある程度解決することができる。
【０００６】
さらに、細胞接着を促進するために用いられているいくつかのコーティングはまた、コーティング物質が上記製品の表面に適切に接着しないと、当該コーティングから失われる場合があるとの観点から問題となる場合がある。次いで、これらの物質が、液体培地又は体液中に存在し、そして当該体液と接触する細胞に影響を与える可能性がある。例えば、上記コーティングから失われたポリマー物質は、上記細胞の表面と結合し、そして細胞が上記基剤に接着することに影響を与える可能性があるか、又は培養物中の細胞−細胞相互作用に影響を与える可能性がある。いくつかのポリマー物質はまた、細胞の生存に有害な場合がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、細胞を培養することを含む工程において用いられる製品向けの、改良されたポリマーコーティングを提供する必要がある。上記改良されたコーティングは、一次細胞、培養することが難しい細胞系、及び幹細胞の維持及び分化を含む方法の利益となる有用な細胞培養製品を規定することができる。上記コーティングをまた、ｉｎ ｖｉｖｏで使用するための移植可能な医療用製品の表面をコーティングするために用いることができる。従って、上記コーティングは、数多くの疾患及び病気を治療するための、組織特異再生技術の利益となるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
態様の一つでは、本発明は、細胞を培養するための方法、そして特に、長期間（長期間培養）培養において、細胞を保持するための方法に有用な細胞培養製品向けのコーティングを提供する。本明細書において、培養は、代謝的に活性な細胞を、ポリマーコーティングを有するナノフィブリル構造体を含む細胞培養製品に置くことを含む方法を指す。本発明のポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体は、ポリマーコーティングの安定性に起因する、長期間の細胞培養のために理想の表面を提供し、細胞接着のための優れた表面及び多種多様の細胞種を培養するための広範な適用性を提供することできることを示している。
【０００９】
ナノフィブリル構造体は、約１０００ｎｍ以下、例えば、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲、そしてさらに好ましくは約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲の平均径を有する繊維構造体であるナノ繊維のメッシュ様ネットワークを指す。いくつかの態様では、上記ナノフィブリル構造体は、ポリマー溶液のエレクトロスピニングを含む方法により生成する。いくつかの態様では、上記ナノフィブリル構造体には、ポリアミド、ポリエステル、同様の合成ポリマー、又はそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの態様では、上記ポリアミドは、ナイロンポリマーから選択される。さらに他の態様では、上記ナノ繊維は、水−又はアルコール−不溶性ナノ繊維を供給するために、水−又はアルコール−可溶性ナイロンポリマーの架橋を含む方法により生成されている。
【００１０】
多くの態様では、上記ナノフィブリル構造体は、別の細胞培養製品と併せて用いられている。上記ナノフィブリル構造体は、細胞培養面、例えば、細胞培養容器の表面に配置させるように、適合又は構成されうる。細胞培養容器の例には、複数のウェルのプレート、皿及びフラスコが含まれる。従って、ナノフィブリル構造体を、培養容器、例えば、細胞培養のウェル内に配置させるために好適な形状の中で得ることができ、そして細胞培養工程を、上記ウェルの表面（例えば、底面）上のナノフィブリル構造体と共に、上記細胞培養のウェル内で実施することができる。
【００１１】
細胞を、液体培地内で、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体上で培養し、所望の代謝的に活性な細胞状態を提供することができる。上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体を用いて、上記細胞が、休止（非増殖及び非分化状態）、細胞増殖の状態及び細胞分化の状態にある状態を含む、１つ又は２つ以上の代謝的に活性な細胞状態を促進することができる。
【００１２】
本発明の別の態様では、上記コーティングを、ナノフィブリル構造体を含む移植可能な医療装置上に供給する。いくつかの方式では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで提供されるような上記コーティングの機能と同様に、上記コーティングをこれらの表面に用いて、細胞接着を促進することができる。これは、組織形成、上皮形成及び血管形成の促進を含む、多くの用途に有用である。
【００１３】
本発明のポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体は、ペンダント型アミン基を有する非生分解性ポリマーを含み、上記コーティングはまた、１種又は２種以上の潜在性反応性基（ｌａｔｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ）を含む。上記コーティングでは、上記潜在性反応性基の少なくとも一部が反応して、上記ポリマーを、上記ナノフィブリル構造体の表面に共有結合させる。
【００１４】
上記コーティングでは、上記潜在性反応性基を、ペンダント型潜在性反応性基として、上記ポリマーに供給することができる。あるいは、ペンダント型潜在性反応性基を、上記ポリマーから独立した化合物（例えば、架橋剤）に含ませ、次いで、上記ポリマーを上記ナノフィブリル構造体の表面に結合させるために用いることができる。
【００１５】
潜在性反応性基は、特定の適用された外部刺激に応答し、ターゲットとの得られた共有結合を有する活性種の生成をうける基を指す。上記潜在性反応性基は、外部の電磁気又は運動（熱）エネルギーを吸収した際に、活性種、例えば、フリーラジカル、ニトレン、カルベン、及びケトンの励起状態を発生させる。態様の一つでは、上記潜在性反応性基は、活性状態に活性化し、上記ポリマー及び細胞培養製品の表面を結合させる光反応性基である。例示的な光反応性基には、アリールケトン、例えば、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様複素環（例えば、アントロンの複素環式類似体、例えば、１０位に窒素、酸素又は硫黄を有するもの）、又はそれらの置換誘導体（例えば、環置換誘導体）が含まれる。
【００１６】
上記ペンダント型潜在性反応性基を介した結合により、上記ポリマーを上記表面に最適に形成させ、細胞付着性を促進させるコーティングが提供されると考えられる。
【００１７】
上記ナノ繊維上のポリマーコーティングは、上記ナノフィブリル構造体への細胞接着を促進するアミン基を供給する。
本発明のいくつかの態様では、本発明のポリマーは、次の式：
−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
（式中、Ｒ1は下記：
【化１】
であり、
Ｒ2は、Ｃ1〜Ｃ8の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そして
Ｒ3及びＲ4は、共に上記窒素に結合し、そして個々に、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキルである）
のペンダント型アミン含有基を含む。
【００１８】
いくつかの態様では、Ｒ1は下記：
【化２】
であり、Ｒ2は、Ｃ2〜Ｃ4の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そしてＲ3及びＲ4は、共に上記窒素に結合し、そして個々に、Ｈ、ＣＨ3又はＣ2Ｈ5である。
【００１９】
例示的なアミン含有基には、重合性モノマー、例えば、３−アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ）、３−アミノエチルメタクリルアミド（ＡＥＭＡ）及びジメチルアミノプロピルメタクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）上に見出されるものが含まれる。いくつかの態様では、ペンダント型アミン基及び潜在性反応性基を含むポリマーは、上記基−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4を有するモノマーを、潜在性反応性基を有するコモノマーと共重合することにより生成させうる。他の態様では、ポリマーは、式Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4を有するモノマーを重合させ、次いで１種又は２種以上のペンダント型アミン基を、潜在性反応性基を有する化合物と反応させて生成させうる。
【００２０】
他の態様では、ペンダント型アミン基を有するポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）及びポリアミドアミンから選択される。ＰＥＩは、エチレンイミンを重合して生成させることができ；所望により、重合性基及び潜在性反応性基を有するモノマーをエチレンイミンと共重合して、ペンダント型潜在性反応性基を有するＰＥＩを生成することができる。特定の態様の一つでは、上記ポリマーには、１種又は２種以上の潜在性光反応性基を有するポリエチレンイミンが含まれる。
【００２１】
少なくとも１種のペンダント型アミン及び少なくとも１種の潜在性反応性基を有するポリマーを含むコーティングを、任意の好適な方法を用いて、上記ナノフィブリル構造体の表面に生成させることができる。上記コーティングを生成させるための方法の一つには、事前生成したポリマーをナノフィブリル表面上に配置し、次いで、上記潜在性反応性基を活性化して、上記ポリマーを上記表面に結合させることが含まれる。いくつかの態様では、上記潜在性反応性基は、上記ポリマー由来のペンダントであることができる。他の態様では、上記潜在性反応性基は、上記ポリマーから独立していてもよい。あるいは、モノマー物質を上記ナノフィブリル表面で重合して、当該表面に上記ポリマーを結合させる１種又は２種以上の潜在性反応性基を有するポリマー及びペンダント型アミンを生成させることができる。
【００２２】
本発明のポリマーコーティングは、ナノフィブリル構造体を含む、種々の細胞培養製品の調製に有用であることが示された。上記ナノフィブリル構造体を、複数のウェルの細胞培養プレート、細胞培養皿、細胞培養袋、細胞培養チューブ、マイクロキャリア及び細胞培養瓶を含む細胞培養製品と連結することができる。
【００２３】
上記ナノフィブリル構造体は、例えば、コーティングされたナノフィブリル構造体と併せて用いられる、培養すべき特定の一又は複数の細胞種、培養すべき複数の細胞、培養の期間、そして所望による細胞培養機器に基づいて、上記細胞培養工程の１つ又は２つ以上の態様に最適である寸法を有するように作成されうる。いくつかの態様では、上記ナノフィブリル構造体は、複数のウェルの細胞培養機器と併せて用いるために好適な面積及び深さを有する。例えば、支持体上に生成させた、ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体を、複数のウェルの培養機器のウェル内に適合するように形成させることができる。上記ナノフィブリル構造体の深さは変わることができるが、約０．１μｍ〜１０μｍの範囲の深さが見出されており、そして約１μｍ〜約５μｍの範囲が、細胞培養向けの特に有効な基剤を供給することができる。
【００２４】
上記ナノフィブリル構造体はまた、各ナノ繊維の間に所望の間隔を有するナノ繊維のネットワークを供給するように加工することができ、当該間隔は、上記構造体中の孔に似ている。多くの態様では、ネットワークを連結する上記ナノ繊維は、上記各繊維の間に比較的小さな間隔、例えば、約０．０１μｍ〜約２５μｍ、そしてある場合には、約０．２μｍ〜約１０μｍを有する。
【００２５】
３次元のナノ繊維系細胞培養製品のコーティング面は、細胞を接着させることができる足場と似ている場合がある。上記各ナノ繊維の間の間隔及び上記ナノフィブリル構造体上で培養される一又は複数の種類の細胞にもよるが、上記細胞を、２次元又は３次元で培養することができる。２次元の培養工程では、一般的に一つの面内で、コーティングされたナノ繊維に細胞を接着することができ、一方、３次元の培養工程では、上記細胞を、ナノ繊維のネットワーク内の一つ超の面内で、上記ナノ繊維に接着することができる。
【００２６】
上記ナノフィブリル構造体を、細胞培養工程に好適な形態で供給することができる。いくつかの態様では、上記ナノフィブリル構造体を、支持体上に供給する。上記支持体を、ガラス基材、例えば、ガラス顕微鏡スライド、カバーガラス、ミクロスフェア及びガラスフィルム；ポリマー基材、例えば、ポリマーフィルム；及び細胞培養向けに好適な他の生体物質基材から選択することができる。上記支持体は、細胞培養装置の調製及び／又は使用に有用な一定の特性を有することができる。いくつかの特定の態様では、上記支持体は、１つ又は２つ以上の特性、例えば、可操作度及び／又は可とう性、耐殺菌性、耐放射線分解性、化学的不活性性、透明性、不燃性及び滑らかな表面特性を有する。いくつかの特定の態様では、上記支持体には、ハロゲン化した熱可塑性樹脂、例えば、ハロゲン化フッ素化−塩素化樹脂が含まれる。具体的には、上記支持体は、クロロトリフルオロエチレン（ＣＴＦＥ）を含むことができる。他の特定の態様では、上記支持体は約０．２５ｍｍ以下である。
【００２７】
細胞培養製品を調製するための、そして細胞を培養する方法における多くの優位性が、本明細書に記載される本発明の知見に基づいて明白になった。
第一に、ペンダント型アミン基及び潜在性反応性基を有するポリマーを含むコーティングを使用することにより、ナノフィブリル構造体に付着面（すなわち、細胞付着性に関する）を供給する非常に有効且つ効率的な方式が供給される。多くの場合には、上記ポリマーを含む液状組成物を、ナノフィブリル構造体に適用し、次いで処理し、それにより上記液状組成物により接触された上記ナノ繊維の一部又は全部の上にポリマー物質のコーティングを生成することができる。いくつかのケースでは、ポリマー物質のコーティングを、上記ナノフィブリル構造体の一部、例えば、上記培養工程の際、細胞が接触する部分に生成させることができる。これは、上記ナノ繊維を生成させるために用いられる物質が、必ずしも必要でないので、経済的に優位でありうる。
【００２８】
本明細書に記載される上記コーティング組成物及び方法はまた、上記ナノ繊維により供給される構造体全体の形態を妥協せずに、付着面を供給することができる。本発明の方法は、上記ナノ繊維の表面に、極めて薄いが、非常に有効なポリマーコーティング層を供給する。すなわち、上記ナノフィブリル構造体の表面全体よりはむしろ、個々のナノ繊維の周りに、ポリマーコーティングを生成させる。従来のポリマーコーティング法（例えば、ポリマーを、基材上で乾燥させる）は、上記表面のコーティングのウェビングを生じさせ、そして上記ナノ繊維表面の形態を変化させる場合がある。しかし、本発明のポリマーコーティングは、非常に薄く、そして上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維の寸法に比例する。
【００２９】
ペンダント型アミン基を有するポリマーを有するコーティングを含むナノフィブリル構造体は、培養工程の際に、細胞の強い付着を促進することができる。これにより、上記コーティングに接着するためのある程度の足場依存性を示し、そして培養される細胞の種類及び当該細胞が培養される培地の種類にもよるが１種又は２種以上の代謝活性を示す細胞が可能となる。従って、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体は、非付着性であるか、付着性に乏しいか、又は適度な付着性を有する細胞を培養するために特に有用である。本発明のポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体はまた、細胞増殖及び分化を可能とするコーティングを提供するために特に有用である。
【００３０】
本発明は、非常に安定であり且つ細胞培養工程に有用であるポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体を提供する。従って、本発明のこれらの構造体は、長期間の細胞の培養を含む手順に特に有用である。
【００３１】
これらの態様では、上記アミン提供ポリマーが、上記培養培地の存在下で分解せず、従って、相当の期間にわたる培養において細胞の付着を促進するために用いることができるので、本発明のポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体は、特に有利であることが見出された。これは、分解性天然ポリマー、例えば、ポリペプチド及び多糖類、並びに生分解性合成ポリマーから主として構成されるコーティングとの比較である。これらの種類の生分解性コーティングは、より短期間（例えば、数週間）で分解し、そして培養において細胞の付着を促進するそれらの能力を失う場合がある。
【００３２】
さらに、本発明のポリマーは、上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面と共有結合しているので、当該表面からアミン提供ポリマーの損失が最小であるか、又は当該ポリマーの損失がない。これは、多くの点で有利である；第一に、培養の間、上記表面に接着するか又は接着して残る上記細胞の能力が変化しないであろう。すなわち、ナノフィブリル表面に接着するアミン提供ポリマーの量は、長期にわたって有意に変化しないであろう。第二に、上記培養中に、アミン提供ポリマーが損失するリスクが最小である。
【００３３】
これはまた有利である、というのは、そうでないと、上記培養中に失われたポリマーが、上記細胞の特性を変化させる可能性があるからである。例えば、上記細胞は、非付着性となりうるか、又は上記細胞の表面のたんぱく質により運搬される他の特性を失う場合がある。さらに、ある場合には、上記コーティング面から上記培地中に失われた特定の種類のポリマーが、上記細胞に対する毒性を有する可能性がある。例えば、種々の培養系における２５ｋＤａ以上の分子量を有するいくつかのポリエチレンイミンの場合、ＰＥＩを細胞外に添加した場合に、毒性が報告されている（Ｆｉｓｃｈｅｒらの「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．」（１９９８）４８，１０８；Ｆｉｓｃｈｅｒらの「Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．」（１９９９）１６，１７２３−１７２９）。従って、本発明のポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体は、先行技術において細胞接着及び培養を促進するために従来用いられているコーティングに見出されるいくつかの欠点を克服する。
【００３４】
上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体上の本発明のコーティングは、非生分解性アミン提供ポリマーを含むが、他の非生分解性物質又は分解性物質、例えば、生分解性ポリマー又は生活性分子が、上記コーティング中に存在することができる。例えば、生分解性ポリマーが上記コーティング中に存在し、そしてより短期間、細胞を培養するための優位性を提供することができる一方で、上記非生分解性ポリマーは、上記コーティング中に存在したままであり、そして長期間、付着面を提供することができる。
【００３５】
いくつかの態様では、本発明は、ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体上で細胞を培養するための方法を提供する。当該方法は、ナノフィブリル構造体を得る段階を含み、当該ナノフィブリル構造体は、上記ポリマーを上記製品の表面に結合させる、少なくとも１種のペンダント型アミン基及び少なくとも１種の潜在性反応性基を有する非生分解性合成ポリマーを含むコーティングを有する。次いで、典型的には環境（液体培地）内で、細胞を、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体と接触して置く。上記細胞が所望の生理状態に維持されうるか、又は所望の生理状態を有するように誘導されうるように、当該細胞を、上記ナノフィブリル細胞培養製品上の上記コーティングに付着させることができる。
【００３６】
いくつかの態様では、上記方法は、長期間、上記細胞を液体培地内で培養する段階を含む。「長期間」は、１４日超の期間を指すのが一般的である。適応があれば、「長期間」は、２１日超、２８日超、３５日超、４２日超、４９日超又は５６日超であることができる。従って、いくつかの態様では、上記細胞をまた、約１４〜約６０日の範囲にわたる期間、培養物中に保持することができる。本発明の明確に区別できる優位性は、細胞付着を促進することができる新鮮なコーティングを有する新しいナノフィブリル培養製品に、上記細胞を移動させる必要がないことである。しかし、長期間の培養の際には、上記液体培地を、例えば、置換又は補給により変化させて、所望の生理状態を得るために好適な環境を提供することができる。
【００３７】
いくつかの態様では、上記培養工程の期間、上記方法を用いて、細胞を、代謝活性が低い状態に維持（例えば、休止細胞の維持）することができる。すなわち、いくつかの態様では、上記細胞内の代謝性変化、例えば、上記細胞の形態を変化させることができるものを促進することなく、適切な培地中で、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造上で細胞を維持することができる。この方法はまた、細胞を維持するために有用であることができ、そして細胞増殖により細胞の個体群を増やすことができる。本発明のポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造を用いた細胞培養において維持することができる例示的な細胞種には、未分化細胞、例えば、幹細胞、又は部分的若しくは完全に分化した細胞種、例えば、肝細胞、膵島細胞、神経細胞及び星状細胞が含まれる。上記未分化細胞は、多分化能の、全能の又は多能性の細胞種を含むことができる。
【００３８】
この点では、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体が、一定の期間にわたり、コーティングされた製品を置き換える必要がない、細胞の長期間の維持のために用いられうるコーティングされた製品を提供するという点で特に有用である。
【００３９】
他の態様では、培養工程の期間、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体を、細胞の分化を促進するための方法に用いることができる。任意の好適な事前分化又は前駆細胞種を用いることができる。上記方法は、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体を得る段階、次いで事前分化細胞を上記構造体に置く段階を含むことができ、そこでは、上記細胞が、コーティングされた構造体に付着する。上記方法はまた、上記細胞の代謝活性を変化させることができる成分を含む環境（液体培地）の存在下で、上記細胞を培養する段階を含み、１つ又は２つ以上の細胞の態様、例えば、細胞形態に変化がもたらされる。
【００４０】
上記成分は、上記事前分化細胞の成熟を、部分的又は完全に分化した状態へと促進させる任意の種類の成分を指す分化因子でありうる。次いで、上記方法は、長期間にわたり、ナノフィブリルのコーティング面と接触している上記細胞を分化させる段階を含む。いくつかの態様では、１４日超、２１日超、２８日超、３５日超、４２日超、４９日超又は５６日超の期間、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体上で、上記細胞を分化させることができる。いくつかの態様では、上記細胞の初期接種密度にもよるが、上記細胞をまた、約１４〜約６０日の範囲の期間、分化させることができる。長期間の培養の間、上記液体培地を、例えば、置換又は補給により変化させ、所望の生理状態を得るために好適な環境を提供することができる。
【００４１】
本発明に従って分化させることができる例示的な細胞種には、一次細胞、神経前駆細胞、骨髄細胞、幹細胞、例えば、胚（胚盤胞由来）幹細胞等が含まれる。
【００４２】
いくつかの態様では、上記方法は、神経前駆細胞の成熟を、所望の分化した神経細胞種へと促進させるために用いられる。本発明のポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体は、神経前駆細胞の接着を促進し、次いで、１又は２以上の所望の分化因子の存在下で、長期間培養することができることが示された。
【００４３】
上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体は、神経突起の外殖及び／又は伸張を促進する一方で、同一培地条件の下で従来型のコーティングがなされた製品上で培養した神経前駆細胞は生き残らなかった。上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体はまた、コーティングされたナノ繊維上で増殖する一部の神経細胞内の成熟した神経細胞マーカーの発生を促進する。上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体はまた、神経前駆細胞の構造を星状細胞へと促進させることが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下に記載される本発明の実施形態は、次の詳細な説明に開示される正確な形態に本発明を制限するか、又は網羅的であることを目的とするものではない。むしろ、上記実施形態は、当業者が本発明の原理及び実施を正しく評価し、かつ理解することができるように選択及び記載されている。
【００４５】
本明細書で言及される全ての出版物及び特許を、参照により本明細書に組み入れる。本明細書に開示される出版物及び特許は、単にそれらの公表のために提供されている。発明者が、先行する任意の出版物及び／又は特許（本明細書で引用される任意の出版物及び／又は特許を含む）に権利を与えないことの自認として解釈される。
【００４６】
いくつかの態様では、本発明は、ナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面に、コーティングを付与するための試薬及び方法を提供し、上記コーティングには、少なくとも１種のペンダント型アミン基及び少なくとも１種の潜在性反応性基を有するポリマー物質が含まれ、上記ポリマー上の少なくとも１種の潜在性反応性基は、上記ポリマーを、上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面に結合させるために用いられる。
【００４７】
「細胞培養製品」は、細胞培養機器の任意の一部を指す。例えば、細胞培養製品は、ナノフィブリル構造体を有する製品でありうる。細胞培養製品はまた、細胞培養工程で用いられるレセプタクル、例えば、細胞培養容器であることができる。ある場合には、２又は３以上の細胞培養製品（例えば、ナノフィブリル構造体及び細胞培養容器）が、細胞培養機器を形成する；他の場合では、単一の細胞培養製品、例えば、上記ナノフィブリル構造体が、細胞培養機器を形成する。
【００４８】
「ナノフィブリル構造体」は、ナノ繊維のメッシュ様ネットワークを指す。ナノフィブリル構造体は、細胞培養製品であることができ、そして細胞培養機器の任意の種類に含まれることができ、ここで、細胞接着は所望であるか、又は細胞培養工程が実施される。多くの場合には、ナノ繊維のネットワークを含む製品は、１種又は２種以上の他の非ナノ繊維物質に加えて、ナノ繊維のネットワークを含む。例えば、ナノフィブリル構造体は、支持体上に、ナノ繊維のネットワークを含むことができ、ここで、当該支持体は、上記ナノ繊維とは異なる物質から形成される。ナノフィブリル構造体をまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養工程内で用いられない製品と共に用いることができる。
【００４９】
上記ナノフィブリル構造体を、別の細胞培養製品の表面、例えば、細胞培養容器上に置くことができる。多くの態様では、上記ナノフィブリル構造体を、別の製品に「挿入するために適合」させることができる。これは、上記ナノフィブリル構造体を、別の製品、例えば、細胞培養容器の１つ又は２つ以上の表面の寸法内、又は当該寸法まで用いるために製造又は形成することができることを意味する。上記ナノフィブリル構造体は、一片の当該ナノフィブリル構造体を、例えば、連結シート、ロール又はマットから、例えば、上記培養容器の表面に挿入するために好適なサイズに切断することにより、上記培養容器の表面の寸法内又は当該寸法まで用いるための大きさに作ることができる。
【００５０】
「細胞培養容器」は、細胞培養製品の一例であり、そして本明細書において、上記ナノフィブリル構造体と連結することができ、そして細胞又は組織を培養するための培地を含むことができるレセプタクルを意味する。上記細胞培養容器は、ガラス又はプラスチックであることができる。当該プラスチックは、非細胞毒性であることが好ましい。例示的な細胞培養容器には、単一及び複数のウェルのプレート、例えば、６個のウェル及び１２個のウェルの培養プレート及びより小さなウェルの培養プレート（ｗｅｌｌｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ）、例えば、９６、３８４及び１５３６個のウェルのプレート、培養ジャー、培養皿、ペトリ皿、培養フラスコ、培養プレート、培養ローラーボトル、培養スライド、例えば、チャンバー化（ｃｈａｍｂｅｒｅｄ）及び複数チャンバー化培養スライド、培養管、カバーガラス、カップ、スピナーボトル、かん流チャンバー、バイオリアクター及び発酵槽が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
ナノフィブリル構造体は、本明細書において、密集して織り込んだ、もつれさせた、又は付着させたナノ繊維の素材（ｍａｓｓ）を意味する「マット」の状態であることができる。上記マット内のナノ繊維の分布は、ランダムであるか、又は配向されていることができる。マットは、織られていないか、又はネットであることができる。マットは、支持体上に堆積させることも堆積させなくともよい。マットは、約１００ｎｍ〜約１０，０００ｎｍ又は約１０００ｎｍ〜約５０００ｎｍの厚さを有する。
【００５２】
本発明のポリマーコーティングを、ナノフィブリル構造体の任意の種類の好適なナノ繊維上に形成させることができる。いくつかの態様では、１又は２以上の細胞種の増殖及び分化に十分な表面を供給するナノフィブリル構造体を有する細胞培養製品を供給することが望ましい。上記製品は、分化する細胞の特定の形態を支持する表面を理想的に有する。例えば、神経前駆細胞の分化のケースでは、上記ナノフィブリル表面により、神経突起の形成、又は１０μｍ超若しくは２００μｍ超である神経性細胞の他の特徴が可能となる。
【００５３】
培養する細胞の種類及び生成の方法にもよるが、細胞が、上記ナノフィブリル構造体の一つの面又は一つ超の面内で増殖することができる。概して、ナノフィブリル構造体を含む細胞培養製品のコーティング面は、細胞が接着する足場と似ている。
【００５４】
上記ポリマーコーティングを、ナノフィブリル構造体のナノ繊維上に生成させることができ、上記ナノ繊維を多種多様の物質から作成することができる。上記ナノフィブリル構造体を生成させるために用いられる物質を、本明細書で、「ナノ繊維物質」と称し、一方、上記ナノ繊維上にポリマーコーティングを生成させるために用いられる物質を、本明細書で、「コーティング物質」と称する。
例示的なナノフィブリル構造体は、米国特許出願公開第２００５／００９５６９５号明細書に記載されている。
【００５５】
上記ナノフィブリル構造体は、１種又は２種以上のナノ繊維を含む、代謝的に活性な細胞を培養するための環境を提供し、ここで、当該構造体は、１種又は２種以上のナノ繊維のネットワークにより規定される。いくつかの実施形態では、上記ナノフィブリル構造体は基剤を含み、ここで、上記ナノフィブリル構造体は、上記基剤の表面に堆積した１種又は２種以上のナノ繊維のネットワークにより規定される。上記ナノフィブリル構造体の間隔における、ナノ形態、上記ナノ繊維ネットワークの形態及び上記ナノ繊維ネットワークのナノ繊維の配置を作り変えて、単層又は複層化された細胞培養物内の同型又は異型の細胞増殖及び／又は細胞分化を促進するために相性がよい組織であるｉｎ ｖｉｔｒｏの生体模倣基層を供給する。上記ナノフィブリル構造を層状にして、複層化されたナノフィブリルアセンブリ、細胞のアレイ又は組織構造体を生成する。
【００５６】
本明細書において、用語「ネットワーク」は、増殖及び培養安定性を促進するように選択された各繊維間の間隔との相互接続ネットを形成するように制御されている間隔におけるナノ繊維のランダム又は配向した分布を意味する。上記ネットワークは、当該ネットワーク内のチャネル又は孔を形成するネットワークを含む各繊維間の小さな間隔を有する。上記孔又はチャネルは、厚さ方向に（ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）、約０．０１μｍ〜約２５μｍ、そしてさらに典型的には、約０．２μｍ〜約１０μｍの直径を有する。有利には、上記ナノ繊維上に生成する上記ポリマーコーティングは、上記孔又はチャネルの直径を顕著に小さくすることはない。
【００５７】
ネットワークは、ナノ繊維の単層、連続的なナノ繊維により生成した単層、ナノ繊維の複合膜、連続的なナノ繊維により生成した複層膜、又はマットを含むことができる。上記ネットワークは、織られていないか、又はネットであることができる。ネットワークは、単一ナノ繊維の直径付近〜約１０μｍの厚さを有することができる。テクスチャ、しわ、接着力、多孔性、固体率（ｓｏｌｉｄｉｔｙ）、弾性、幾何学的形態、相互接続性（ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）、比表面積、繊維直径、繊維溶解性／不溶性、親水性／疎水性、フィブリル密度及び繊維配向を含む（それらに限定されるものではない）ネットワークの物理的性質を、所望のパラメータに作り変えることができる。
【００５８】
有利には、本発明のポリマーコーティングを、ナノ繊維のネットワークにより提供される有益な特性を大きく変化させることなく、上記ナノ繊維上に生成させることができる。例えば、上記ポリマーコーティングは、当該ポリマーコーティングが生体模倣基層としてのその機能を減らすような方式で、上記ナノフィブリル構造体の構造上の特徴を変えることはない。
本明細書において、用語「ナノ繊維」は、約１０００ｎｍ以下の直径を含む、ポリマーの細繊維（ｆｉｎｅ ｆｉｂｅｒ）を意味する。
【００５９】
広範囲のポリマー物質を、上記ナノフィブリル構造体の調製時に、ナノ繊維物質として用いることができる。ナノ繊維物質には、付加ポリマー物質及び縮合ポリマー物質の両方、例えば、ポリオレフィン、ポリアセタール、ポリアミド、ポリエステル、セルロースエーテル及びエステル、ポリアルキレンスルフィド、ポリアリーレンオキシド、ポリスルホン、変性ポリスルホンポリマー及びそれらの混合物が含まれうる。
【００６０】
これらの一般的な分類内の例示的な物質には、ポリエチレン、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ラクテート）、ポリ（グリコレート）、ポリプロピレン、ポリ（ビニルクロリド）、ポリメチルメタクリレート（及び他のアクリル）、ポリスチレン及びそれらのコポリマー（ＡＢＡ型ブロックコポリマーを含む）、ポリ（ビニリデンフルオリド）、ポリ（ビニリデンクロリド）、架橋又は非架橋の状態における、種々の加水分解度（８７％〜９９．５％）のポリビニルアルコールが含まれる。例示的な付加ポリマーは、ガラス質（室温超のＴｇ）の傾向がある。これは、ポリビニルクロリド及びポリメチルメタクリレート、ポリスチレンポリマー組成物、若しくは合金に関するケースであるか、又はポリフッ化ビニリデン及びポリビニルアルコールの結晶化度の低さのケースである。
【００６１】
本発明の一部の実施形態では、上記ナノ繊維物質、ポリアミド縮合ポリマーである。さらに特定の実施形態では、上記ポリアミド縮合ポリマーは、ナイロンポリマーである。用語「ナイロン」は、全ての長分子鎖合成ポリアミドに関する一般名称である。概して、ナイロンの学名には、一連の数、例えば、出発原料がＣ6ジアミン及びＣ6二塩基酸であることを示すナイロン−６，６（第一の数字は、Ｃ6ジアミンを示し、そして第二の数字は、Ｃ6ジカルボン酸化合物を示す）におけるものが含まれる。少量の水の存在下で、ε−カプロラクタムの重縮合を行うことにより、別のナイロンを製造することができる。
【００６２】
この反応により、直鎖のポリアミドであるナイロン−６（ε−アミノカプロン酸としても公知の環状ラクタムから製造）が生成する。さらに、ナイロンコポリマーがまた、企図される。コポリマーは、反応混合物中で、種々のジアミン化合物、種々の二塩基酸化合物及び種々の環状ラクタム構造体を混合し、次いで、ポリアミド構造体中でランダムに配置させたモノマー物質を用いてナイロンを生成させることにより製造されうる。例えば、ナイロン６，６−６，１０物質は、ヘキサメチレンジアミンと、Ｃ6及びＣ10の二塩基酸のブレンドとから製造したナイロンである。ナイロン６−６，６−６，１０は、アミノカプロン酸、ヘキサメチレンジアミン並びにＣ6及びＣ10の二塩基酸物質のブレンドの共重合により製造したナイロンである。
【００６３】
ブロックコポリマーをまた、ナノ繊維物質として用いることができる。ナノ繊維を調製するための組成物の調製において、各ブロックが溶媒に可溶となるように、当該溶媒系を選択することができる。一例は、メチレンクロリド溶媒中のＡＢＡ（スチレン−ＥＰ−スチレン）又はＡＢ（スチレン−ＥＰ）ポリマーである。上記ブロックコポリマーの例は、Ｋｒａｔｏｎ（商標）型のＡＢ及びＡＢＡブロックポリマー、例えば、スチレン／ブタジエン及びスチレン／水素化ブタジエン（エチレンプロピレン）、Ｐｅｂａｘ（商標）型のε−カプロラクタム／エチレンオキシド、Ｓｙｍｐａｔｅｘ（商標）ポリエステル／エチレンオキシド並びにエチレンオキシド及びイソシアネートのポリウレタンである。
【００６４】
付加ポリマー、例えば、ポリフッ化ビニリデン、シンジオタクチックポリスチレン、ビニリデンフルオリド及びヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、非晶質付加ポリマー、例えば、ポリ（アクリロニトリル）及びそのアクリル酸及びメタクリレートとのコポリマー、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）及びその種々のコポリマー、ポリ（メチルメタクリレート）及びその種々のコポリマーを、比較的容易にソリューションスピニング（ｓｏｌｔｉｏｎ ｓｐｉｎ）することができる。というのは、それらは、低圧及び低温で溶解するからである。ポリエチレン及びポリプロピレンのような高結晶性ポリマーは、それらをソリューションスピニングすべき場合には、より高い温度及び高圧が必要である。エレクトロスタティックソリューションスピニング（ｅｌｅｃｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｐｉｎｎｉｎｇ）は、ナノ繊維及びミクロ繊維を製造する方法の一つである。
【００６５】
ナノ繊維をまた、ポリマー混和物質、アロイ状態、又は架橋され化学結合した構造体の中の２種又は３種以上のポリマー物質を含むポリマー組成物から生成させることができる。上記ポリマー組成物は、ポリマー特性を変えることにより、例えば、ポリマー鎖の可とう性又はポリマー鎖の可動性を改良することにより、全体の分子量を大きくすることにより、そしてポリマー物質のネットワークの形状により補強することで、物理的性質を変えることができる。
【００６６】
２種の関連するポリマー物質を混合して、有益な特性を有するナノ繊維を供給することができる。例えば、高分子量ポリビニルクロリドを、低分子量ポリビニルクロリドと混合することができる。同様に、高分子量ナイロン物質を、低分子量ナイロン物質と混合することができる。さらに、異種の一般的なポリマー種を混合することができる。例えば、高分子量スチレン物質を、低分子量の耐衝撃性ポリスチレンと混合することができる。ナイロン−６物質を、ナイロンコポリマー、例えば、ナイロン−６；６，６；６，１０コポリマーと混合することができる。さらに、加水分解度の低いポリビニルアルコール、例えば、８７％加水分解されたポリビニルアルコールを、９８〜９９．９％及び９９．９％超の加水分解度を有する完全に又は超加水分解されたポリビニルアルコールと混合することができる。
【００６７】
混和物質内のこれらの全ての物質を、適切な架橋機構を用いて、架橋することができる。アミド結合内の窒素原子と反応性を有する架橋剤を用いて、ナイロンを架橋することができる。ポリビニルアルコール物質を、ヒドロキシル反応性物質、例えば、モノアルデヒド、例えば、ホルムアルデヒド、ウレア、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂及びその類似物、ホウ酸及び他の無機化合物、ジアルデヒド、二塩基酸、ウレタン、エポキシ及び他の公知の架橋剤を用いて架橋することができる。架橋試薬が反応し、そして各ポリマー鎖の間に供給結合を形成し、分子量、耐薬品性、全体的な強度及び機械的分解に対する抵抗性を実質的に改良する。
【００６８】
エレクトロスピニングは、直径（概して、約５ｎｍ〜約１０００ｎｍ）が異なることができるナノ繊維の集合体を製造することができる。
ナノ繊維は、ポリマーの形成及び堆積を制御するために、電界を用いるエレクトロスピニング方法により製造することができる。電位（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を用いてポリマー溶液を注入する。当該電位により、エミッタの先端、例えば、ニードルからポリマー溶液流の放出をもたらす電荷不均衡が生ずる。上記電界内のポリマー噴出物は、接地した基材の方に向かい、その際、溶媒が蒸発して、そして繊維が生成する。得られた単一の連続フィラメントは、支持体上で不織布として集められる。ナノ繊維を製造するためのエレクトロスピニング法は、米国特許第４，６５０，５０６号明細書（Ｂａｒｒｉｓ）及び同６，７４３，２７３号明細書（Ｃｈｕｎｇら）に記載されている。
【００６９】
ランダム又は方向性を有する配向を有するエレクトロスピニングされたナノ繊維ネットワークを製造することができるランダムな繊維を層状の表面に集合させることができる。いくつかの実施形態では、本発明のナノ繊維は、連結ネットワークを形成するように結合させることができる細繊維のランダムな分布を含む。ナノ繊維が連結するネットワークは、上記各繊維の間に比較的小さな間隔を有する。上記間隔は、各繊維の間で、約０．０１〜約２５μｍ、好ましくは約２〜約１０μｍの範囲を有するのが典型的である。上記間隔により、イオン、代謝産物、たんぱく質及び／若しくは生活性分子の拡散が可能となり、そして／又は上記ネットワークに細胞を透過及び浸透させ、そして細胞及び上記ナノ繊維の間のマルチポイント接着を促進する環境内で細胞を増殖させる上記ナノ繊維ネットワーク内で孔又はチャネルが形成する。
【００７０】
ナノ繊維ネットワークをまた、配向させた様式で、エレクトロスピニングさせることができる。上記配向させたエレクトロスピニングにより、複数のナノ繊維の単層又は連続的なナノ繊維により形成した単層を含むナノ繊維ネットワークを作成することができ、ここで、当該ネットワークは、単一のナノ繊維の直径の高さを有する。多孔性、固体率、フィブリル密度、テクスチャ、しわ及び単層ネットワークの繊維配向性を含む物理的性質を、エレクトロスピニングプロセスの際に、上記支持体上で上記ナノ繊維の方向及び／又は配向を制御することにより選択することができる。好ましくは、上記孔のサイズにより、細胞が、単層ナノ繊維ネットワーク内を透過及び／又は移動する。ある実施形態では、各繊維の間の間隔は、約０．０１〜約２５μｍである。別の実施形態では、各繊維の間の間隔は、約２〜約１０μｍである。
【００７１】
上記ナノ繊維は、他の物質を所望により含むことができる。
いくつかの態様では、上記ナノ繊維は、ポリマー物質を添加剤組成物と混合することにより生成されうる。上記添加剤組成物は、上記ポリマーのエレクトロスピニングにより当該添加剤を含まないポリマー溶液からエレクトロスピニングしたナノ繊維の集合体と比較して、より数が多い又はパーセンテージが高い薄い繊維を有するナノ繊維の集合体の製造物が生ずるように、上記ポリマーのパッキングに影響を及ぼしうる。ある実施形態では、上記ポリマー溶液は、約０．２５％〜約１５％ｗ／ｗの添加剤組成物を含む。別の実施形態では、上記ポリマー溶液は、約１％〜約１０％ｗ／ｗの添加剤組成物を含む。いくつかの実施形態では、上記ポリマーのパッキングに影響を及ぼす添加剤組成物は、生活性分子、例えば、脂質を含む。いくつかの実施形態では、上記脂質は、リソホォスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、コレステロール及びそれらの混合物からなる群から選択することができる。
【００７２】
上記ナノ繊維上のポリマーコーティングが、細胞接着を促進する一方で、上記ナノフィブリル構造体のテクスチャ及びしわを作り変えることにより細胞接着をさらに改良することができる。例えば、上記ナノフィブリル構造体は、異なるポリマーから作製された異なる直径及び／又は複数のナノ繊維を有する複数のナノ繊維から構成されうる。上記ナノフィブリル構造体の固体率をまた、細胞増殖及び／又は分化に影響を与えるように作り変えることができる。ある実施形態では、上記ナノフィブリル構造体は、約３％〜約７０％の固体率を有する。別の実施形態では、上記ナノフィブリル構造体は、約３％〜約５０％の固体率を有する。別の実施形態では、上記ナノフィブリル構造体は、約３％〜約３０％の固体率を有する。別の実施形態では、上記ナノフィブリル構造体は、約３％〜約１０％の固体率を有する。別の実施形態では、上記ナノフィブリル構造体は、約３％〜約５％の固体率を有する。別の実施形態では、上記ナノフィブリル構造体は、約１０％〜約３０％の固体率を有する。
【００７３】
いくつかの態様では、上記ナノ繊維は、蛍光マーカーを含む。上記蛍光マーカーにより、例えば、ナノ繊維の可視化、ナノ繊維ブレンド内の特定のナノ繊維の識別、ナノ繊維の化学的又は物理的性質の同定、及び組織を作り変えるために有用な複層化された集成体を含む、ナノ繊維及び／又はナノ繊維を含む構造体の分解及び／又は再分布の評価が可能になる。上記蛍光マーカーは、光退色性又は非光退色性であることができる。上記蛍光マーカーは、ｐＨ感受性又はｐＨ非感受性であることができる。好ましくは、上記蛍光マーカーは、非細胞毒性を有する。
【００７４】
上記ナノ繊維を形成させるために用いられる上記ポリマーはまた、セルロース、ポリビニル、ポリエステル、ポリスチレン又はポリアミド支持体と接触した際に、上記ナノ繊維が上記支持体に確実に結合し且つ機械的応力に関連する離層作用に抵抗することができるような十分な強度で、当該ナノ繊維が上記支持体に付着するような付着特性を有することができる。上記ナノ繊維の上記支持体への付着性は、当該繊維が当該支持体に接触する際の繊維構造体の溶媒効果、又は熱若しくは圧力を用いた当該支持体上の繊維の後処理から生ずることができる。付着の際に溶媒又は蒸気を用いて可塑化したポリマーは、付着性が高い場合がある。
【００７５】
本明細書において、用語「ナノフィブリル支持体」は、ナノ繊維又はナノ繊維のネットワークを堆積させる表面を意味する。上記ナノフィブリル支持体は、ナノ繊維の堆積したネットワークのための構造支持体を提供する任意の表面でありうる。上記ナノフィブリル支持体は、ガラス又はプラスチックを含むことができる。好ましくは、上記プラスチックは、非細胞毒性を有する。いくつかの態様では、上記ナノフィブリル支持体は、フィルム又は培養コンテナであることができる。
【００７６】
上記ナノフィブリル支持体は、水溶性又は水不溶性でありうる。水溶性であるナノフィブリル支持体は、ポリビニルアルコールフィルムであることは好ましい。多くの態様では、そして大部分の方法において、上記ナノフィブリル構造体内の孔の平均サイズが非常に小さいので、細胞が上記ナノフィブリル構造体に入り込むことができない。しかし、細胞の運動は、当該細胞のサイズ及び上記ナノフィブリル構造体内の孔のサイズによって決まりうる。
【００７７】
好ましくは、多孔質のナノフィブリル構造体の孔は、約０．２μｍ〜約１０μｍの直径を有する。上記ナノフィブリル構造体は、生分解性及び／又は生物溶解性（ｂｉｏｄｉｓｓｏｌｖａｂｌｅ）であることができる。好ましくは、上記ナノフィブリル構造体は、生体適合性を有する。
【００７８】
いくつかの態様では、上記ナノフィブリル支持体を、ガラス基材、例えば、ガラス顕微鏡スライド、カバーガラス及びガラスフィルム；ポリマー基材、例えば、ポリマーフィルム；及び細胞培養に好適な他の生体物質基材から選択する。上記ナノフィブリル支持体は、細胞培養装置の調製及び／又は使用に有用な一定の特性を有することができる。いくつかの特定の態様では、上記ナノフィブリル支持体は、１つ又は２つ以上の特性、例えば、可操作度及び／又は可とう性、耐殺菌性、耐放射線分解性、化学的不活性性、透明性、不燃性及び滑らかな表面特性を有する。いくつかの特定の態様では、上記ナノフィブリル支持体には、ハロゲン化した熱可塑性樹脂、例えば、ハロゲン化したフッ素化−塩素化樹脂が含まれる。特に、上記支持体は、クロロトリフルオロエチレン（ＣＴＦＥ）を含むことができる。他の特定の態様では、上記支持体は、約０．２５ｍｍ以下である。
【００７９】
本明細書において、用語「スペーサー」は、上記構造体が当該スペーサーの直径又は厚さにより分離されるように、支持体の表面又は別のナノフィブリル構造体の表面からナノ繊維又はナノ繊維ネットワークを分離する層を意味する。上記スペーサーは、ポリマー細繊維又はフィルムを含むことができる。好ましくは、上記フィルムは、約１０μｍ〜約５０μｍの厚さを有する。上記スペーサーは、セルロース、でん粉、ポリアミド、ポリエステル又はポリテトラフルオロエチレンを含むポリマーを含むことができる。上記細繊維は、ミクロ繊維を含むことができる。ミクロ繊維は、約１μｍ〜約３０μｍの直径を含む、ポリマー細繊維である。上記ミクロ繊維は、織られていないか、又はネットであることができる。
【００８０】
本発明の他の態様では、少なくとも１種のペンダント型アミン基及び少なくとも１種の潜在性反応性基を含むポリマーを有する上記コーティングを、他の種類のナノ構造を有する製品上に生成することができる。他の例示的なナノ構造を有する細胞培養製品には、複層カーボンナノチューブ（ＭＷＣＮ；Ｃｈｅｎらの「Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１９９８）２８２：９５を参照せよ）；ヒドロキシアパタイト微粒子表面（Ｒｏｓａらの「Ｄｅｎｔａｌ Ｍａｔｅｒ．」（２００３）１９：７６８−７７２）が含まれる。上記ポリマーコーティングをまた、天然物質、例えば、自己集合性ペプチドナノ繊維骨格（Ｇｅｎｏｖｅらの「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．」（２００５）２６：３３４１−３３５１）及びコラーゲン／ヒアルロン酸高分子電解質複層（Ｚｈｅｎｇらの「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」（２００５）２６：３３５３−６１）の表面に生成させることができる。他のケースでは、３次元の表面を、ナノ粒子の安定化した層から作り出すことができる。
【００８１】
上記ナノフィブリル構造体を、支持体、細胞培養製品及び医療装置等の製品と連結するか、又はそれら上に形成することができる。上記製品を、上記ナノフィブリル構造体と組み合わせるか、又は上記ナノフィブリル構造体と共に作成し、細胞培養機器及び医療装置を含む、種々の製品又は集成体を形成することができる。支持体、細胞培養製品及び医療装置等の製品を、上記ナノフィブリル構造体と同一の物質から作ることができ、又は異なる物質から作ることができる。
【００８２】
上記ナノフィブリル構造体、例えば、支持体、細胞培養製品又は医療装置と連結した製品を形成させるために用いられうる物質の例には、付加重合又は縮合重合のどちらかから得られた合成ポリマー、例えば、オリゴマー、ホモポリマー及びコポリマーが含まれる。好適な付加ポリマーの例には、アクリル、例えば、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、グリセリルアクリレート、グリセリルメタクリレート、メタクリルアミド及びアクリルアミドから重合されたもの；ビニル、例えば、エチレン、プロピレン、塩化ビニル及びスチレンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
細胞培養製品中で一般的に用いられる例示的なポリマー物質には、ポリスチレン及びポリプロピレンが含まれる。
縮合ポリマーの例には、ナイロン、例えば、ポリカプロラクタム、ポリラウリルラクタム、ポリヘキサメチレンアジポアミド及びポリヘキサメチレンドデカンジアミド、並びにポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリスルホン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリジメチルシロキサン及びポリエーテルケトンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
生分解性ポリマーをまた、上記ナノフィブリル構造体と連結した製品の調製に用いることができる。生分解性物質として検討されている合成ポリマーの種類の例には、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリイミノカーボネート、脂肪族カーボネート、ポリホスファゼン、ポリ無水物及びそれらのコポリマーが含まれる。移植可能な医療装置に関連して用いることができる生分解性物質の具体例には、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリジオキサノン（ｐｏｌｙｄｉｏｘａｎｏｎｅ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−ポリジオキサノン）、ポリ無水物、ポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）及びポリ（グリコリド−ｃｏ−カプロラクトン）が含まれる。これらのポリマーと、他の生分解性ポリマーとのブレンドをまた、用いることができる。
【００８５】
いくつかの態様では、上記ナノフィブリル構造体を、ペンダント型アミン基を有するポリマーと異なるポリマー物質でプレコートした製品の表面に形成するか、又は当該表面と連結することができる。例えば、製品を、パリレン又はオルガノシラン物質でプレコートして、上記ナノフィブリル構造体を連結又は形成しうるベースコートを供給することができる。
【００８６】
上記ナノフィブリル構造体を、金属、金属合金及びセラミックから作成した製品上に形成するか、又は当該製品と連結することができ、そして多くの場合には、これらの製品は、パリレン又はオルガノシラン物質のプレコートを有することができる。上記金属及び金属合金には、チタン、ニチノール、ステンレス鋼、タンタル及びコバルトクロムが含まれるが、これらに限定されるものではない。第二の分類の金属には、貴金属、例えば、金、銀、銅及び白金ウリジウム（ｕｒｉｄｉｕｍ）が含まれる。上記セラミックには、窒化ケイ素、炭化ケイ素、ジルコニア及びアルミナ、並びにガラス、シリカ及びサファイアが含まれるが、これらに限定されるものではない。セラミック及び金属の組み合わせは、別の種類の生体物質である。
【００８７】
本発明の他の態様では、上記ポリマーコーティングは、移植可能な医療用製品の少なくとも一部と連結されているか、又は当該一部上に形成されているナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面上に形成されている。これは、移植可能な医療用製品と連結したいくつかの方式における、又は当該移植可能な医療用製品上に形成されているナノ繊維のネットワークを含む移植可能な医療装置を指す。上記装置を、種々の方法により形成することができる。上記装置を形成する方法の一つは、移植可能な医療装置の全て又は一部上のエレクトロスピニングナノ繊維を含むことができる。別の方法には、ナノフィブリル構造体を形成させ、次いで、当該ナノフィブリル構造体を、移植可能な医療装置の一部に接着することが含まれうる。
【００８８】
例示的な医療用製品には、血管用インプラント及び移植片、移植片、外科用装置；合成人工器官；エンドプロテーゼ（ｅｎｄｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）を含む人工血管、ステント移植皮弁、血管内のステント組み合わせ物；小径の移植片、腹部大動脈瘤用移植片；創傷被覆材及び創傷管理装置；止血用バリア；メッシュ及びヘルニアプラグ（ｈｅｒｎｉａ ｐｌｕｇ）；子宮出血用パッチを含むパッチ、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）用パッチ、卵円孔開存症（ＰＦＯ）用パッチ、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）用パッチ及び他の一般的な心臓用パッチ；ＡＳＤ、ＰＦＯ及びＶＳＤクロージャ；経皮クロージャ装置、僧帽弁修復装置；左心耳フィルター；弁形成（ｖａｌｖｅ ａｎｎｕｌｏｐｌａｓｔｙ）装置、カテーテル；中心静脈アクセス用カテーテル、血管アクセス用カテーテル、膿瘍排液用カテーテル、薬物注入用カテーテル、非経口的栄養補給用カテーテル、静脈用カテーテル（例えば、抗血栓薬を用いた処理）、脳卒中治療用カテーテル、血圧及びステント移植片カテーテル；吻合装置及び吻合クロージャ；動脈瘤除外装置；グルコースセンサを含むバイオセンサ；心臓用センサ；受胎調節装置；前胸部用移植片；感染制御装置；膜；組織骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）；組織関連物質；脳脊髄液（ＣＳＦ）シャントを含むシャント、緑内障排出シャント；歯科用装置及び歯科用移植片；耳用装置、例えば、耳用排液チューブ、中耳腔換気用ベントチューブ；眼用装置；排液チューブカフスを含む、装置のカフス及びカフス部分、移植された薬物注入用チューブカフス、カテーテルカフス、縫製カフス；脊椎及び神経学用装置；神経再生導管；神経学用カテーテル；神経用パッチ；整形外科用装置、例えば、整形外科の関節用移植片、骨修復／増大装置、軟骨修復装置；泌尿器用装置及び尿道用装置、例えば、泌尿器用移植片、膀胱用装置、腎臓部用装置及び血液透析装置、人工肛門袋取付け装置；胆汁排液製品が含まれる。
【００８９】
いくつかの態様では、上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維は、非生分解性ポリマーと、１種又は２種以上（好ましくは複数）のペンダント型アミン基と、１種（好ましくは１種超）のペンダント型潜在性反応性基とを含むコーティングを有する。「非生分解性」は、一般的に、非酵素的に、加水分解的に又は酵素的に分解することができないポリマーを指す。例えば、上記非生分解性ポリマーは、プロテアーゼにより生じうる分解に対して抵抗性を有する。しかし、上記コーティングが非生分解性アミン提供ポリマーを含む一方で、上記コーティングは非生分解性物質に限定されず、従って、生分解性物質、例えば、天然又は合成の生分解性ポリマーをも含むことができることに留意すべきである。
【００９０】
上記コーティングは、潜在性反応性基を含み、ここで、当該基の少なくとも一部は、上記コーティング工程の際に活性化し、上記ポリマーを、上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面に結合させる。本発明の生成したコーティングを記載する目的で、上記ナノ繊維の表面に共有結合している（生成したコーティング内の）上記ポリマーは、「潜在性の反応した基（ｌａｔｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ）」又は「反応した基（ｒｅａｃｔｅｄ ｇｒｏｕｐ）」を有すると称することができ、上記ポリマー上の１種又は２種以上のこれらの潜在性反応性基が活性化し、そして反応して、上記ポリマー及び上記ナノ繊維の表面の間に共有結合を形成することを指す。
【００９１】
上記潜在性の反応した基を介して上記表面に結合することにより、固定されたポリマーが、上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面に、正に帯電したアミン基を供給することができる。この結合配置により、細胞接着のおいて非常に耐久性が高く、且つ有効な表面の形成が可能となると考えられる。この表面は、上記ナノフィブリル構造体上の細胞の維持及び分化を含む方法において、非常に有効であることが示された。
【００９２】
上記非生分解性ポリマー上の複数のペンダント型アミン基は、細胞培養のために好適なｐＨ条件において、上記コーティングに正電荷を供給することができる。例えば、上記非生分解性ポリマーは、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約１０．０の範囲の条件において、上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維に正電荷を供給する。
上記非生分解性ポリマーは、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、又は上記ポリマーに由来するこれらのアミン基のペンダントの組み合わせを有することができる。
【００９３】
本発明の一態様では、例示的なアミン含有基は、次の式：
Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
（式中、Ｒ1は、下記：
【化３】
であり、
Ｒ2は、Ｃ1〜Ｃ8の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そして
Ｒ3及びＲ4は、両方とも上記窒素に結合し、そして個々に、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキルである）
を有する。
上記ポリマーに由来するペンダントと同様に、上記アミン含有基を、次の式：
Ｐ−［Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4］
（式中、Ｐは、上記ポリマー主鎖の一部である）
により表すことができる。
【００９４】
いくつかのさらなる特有の態様において、Ｒ1は、下記：
【化４】
であり、
Ｒ2は、Ｃ2〜Ｃ4の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そして
Ｒ3及びＲ4は、両方とも前記窒素に結合し、そしてそれぞれ、Ｈ、ＣＨ3又はＣ2Ｈ5である。
【００９５】
例示的なアミン含有基には、重合性モノマー、例えば、３−アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ）、３−アミノエチルメタクリルアミド（ＡＥＭＡ）、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）等に見出されるものが含まれる。従って、いくつかの態様では、ペンダント型アミン基含有ポリマー及び潜在性反応性基を含むポリマーは、上記基−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4を有するモノマーを、潜在性反応性基を有するコモノマーと共重合して生成させることができる。所望により、他の非アミン又は非潜在性反応性基含有モノマーが、上記ポリマーに含まれうる。
【００９６】
態様の一つでは、上記ポリマーは、上記ポリマーのモノマー含有量に基づいて、約１０％以上のモル濃度量において、アミン含有基を含む。これは、例えば、１０％以上のアミン含有基モノマーを用いてポリマーを調製することにより達成することができる。いくつかの態様では、上記アミン含有基は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上のモル濃度量において存在する。いくつかの態様では、上記ポリマーは、約９０％〜約９９．９５％の範囲におけるモル濃度量において、アミン含有基を含む。コポリマーの例示的な調製には、約９８．４％のアミン含有モノマー（例えば、ＡＰＭＡ、ＡＥＭＡ又はＤＭＡＰＭＡ）と、約１．６％の潜在性反応性基含有モノマーが含まれる。
【００９７】
アミン基の量と潜在性反応性基の量とのコントロールは、アミン含有モノマーを、潜在性反応性基含有モノマー（及び所望により、非アミン又は非光反応性基含有モノマー）と共重合することにより行われうる。他の例示的なアミン含有ポリマーを、例えば、アミン含有モノマー（例えば、Ｎ−（２−アミノ−２−メチルプロピル）メタクリルアミド、ｐ−アミノスチレン、アリルアミン、又はそれらの組み合わせ）を、ペンダント型アミン基及び潜在性反応性基を有するポリマーを供給するためのペンダント型潜在性反応性基を有するモノマーと共重合させて生成することができる。
【００９８】
これらのアミン含有モノマーをまた、他の非第一級アミン含有モノマー、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニルピロリジノン又はそれらの誘導体と共重合して、所望の特性、例えば、所望のアミン基の密度及び光反応性基を有するポリマーを供給することができる。他の好適なアミン基含有ポリマーには、２−アミノメチルメタクリレート、３−（アミノプロピル）−メタクリルアミド及びジアリルアミン等のモノマーから生成させたポリマーが含まれる。感光性基（ｐｈｏｔｏｇｒｏｕｐ）及びペンダント型アミン基を含むデンドリマーをまた、用いることができる。
【００９９】
いくつかの態様では、ペンダント型アミン基及び疎水性の特性を有するポリマーを調製することができる。これは、上記ポリマーを合成するための１つ又は２つ以上のスキームにより得ることができる。例えば、ポリマーを、所望の量の疎水性モノマー、例えば、（アルキル）アクリレートモノマーと共に生成することができ、又は上記アミン提供モノマーは、より長いアルキル鎖長を含むことができる。例えば、基Ｒ2、Ｒ3及び／又はＲ4の１つ又は２つ以上は、３個又は４個以上の炭素原子のアルキル基を含むことができる。
【０１００】
上記非生分解性ポリマーを調製するための別の方法には、予備生成したポリマーを、潜在性反応性基を含む化合物を用いて誘導体化する段階が含まれる。例えば、ペンダント型アミン基を有するホモポリマー又はヘテロポリマーは、上記ペンダント型アミン基の一部を、光反応性基及びアミン基との反応性を有する基（例えば、４−ベンゾイルベンゾイルクロリド）を有する化合物と反応させることにより、当該光反応性基を用いて容易に誘導体化することができる。
【０１０１】
いくつかの態様では、ペンダント型アミン基及び少なくとも１種の潜在性反応性基を有するポリマーを、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン及びポリアミドアミンから選択する。特定の態様の一つでは、上記ポリマー物質は、１種又は２種以上の潜在性反応性基を有するポリエチレンイミンを含む。
【０１０２】
広義の潜在性反応性基は、特定の適用された外部刺激に応答し、ターゲットとの得られた共有結合を有する活性種の生成をうける基である。潜在性反応性基は、貯蔵の条件下ではそれらの共有結合を変化させずに保持するが、活性化の際に他の分子と共有結合を生成する、分子内の原子の基である。上記潜在性反応性基は、外部の電磁気又は運動（熱）エネルギーを吸収した際に、活性種、例えば、フリーラジカル、ニトレン、カルベン、及びケトンの励起状態を発生させる。
【０１０３】
潜在性反応性基を、電磁スペクトルの種々の部分に応答するように選択することができ、そしてスペクトルの紫外線、可視光又は赤外線部分に応答する潜在性反応性基が好ましい。本明細書に記載されるものを含む潜在性反応性基は、当業界で周知である。例えば、米国特許第５，００２，５８２号明細書（Ｇｕｉｒｅらの「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ｖｉａ Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ Ａｔｔａｃｈｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」）を参照せよ。本明細書に記載されるように、本発明は、本発明のコーティングを生成させるために好適な潜在性反応性基を使用することを企図する。
【０１０４】
光反応性基は、電磁気エネルギーを吸収すると、活性種、例えば、フリーラジカル、そして特にニトレン、カルベン、及びケトンの励起状態を生じさせることができる。光反応性基を、電磁スペクトルの種々の部分に応答するように選択することができ、そしてスペクトルの紫外線、可視光又は赤外線部分に応答する潜在性反応性基が好ましい。
【０１０５】
光反応性アリールケトン、例えば、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様複素環（例えば、アントロンの複素環式類似体、例えば、１０位に窒素、酸素又は硫黄を有するもの）、又はそれらの置換誘導体（例えば、環置換誘導体）が好ましい。好ましいアリールケトンの例には、アントロンの複素環式誘導体、例えば、アクリドン、キサントン及びチオキサントン、並びにそれらの環置換誘導体が含まれる。いくつかの好ましい光反応性基は、約３６０ｎｍ超の励起エネルギーを有する、チオキサントン及びその誘導体である。
【０１０６】
上記ケトンの官能基が好ましい。というのは、それらは、本明細書に記載される活性化／不活性化／再活性化サイクルを容易に受けることができるからである。ベンゾフェノンは、特に好ましい潜在性反応性部分である。というのは、当該ベンゾフェノンは、三重項状態への項間交差をうける励起一重項状態の初期構造を有する光化学系励起が可能だからである。上記励起三重項状態は、（例えば、支持体表面から）水素原子を引き抜くことにより、炭素−水素結合に挿入し、そのようにしてラジカル対を作り出すことができる。次にラジカル対が崩壊し、新しい炭素−炭素結合が生成する。結合に、反応性結合（例えば、炭素−水素）が利用できないと、ベンゾフェノン基の紫外線により誘発された励起は可逆性であって、そしてエネルギー源を取り除くと、当該分子は基底状態のエネルギー準位に戻る。光活性化可能なアリールケトン、例えば、ベンゾフェノン及びアセトフェノンは、特に重要である。というのは、これらの基が、水中で複数の再活性化を受け、よって高いコーティング効率を付与するからである。
【０１０７】
アジドが、別の種類の光反応性基を構成し、そしてアリールアジド（Ｃ6Ｒ5Ｎ3）、例えば、フェニルアジド及び４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド；アシルアジド（−ＣＯ−Ｎ3）、例えば、ベンゾイルアジド及びｐ−メチルベンゾイルアジド；アジドホルメート（−Ｏ−ＣＯ−Ｎ3）、例えば、エチルアジドホルメート及びフェニルアジドホルメート；スルホニルアジド（−ＳＯ2−Ｎ3）、例えば、ベンゼンスルホニルアジド；及びホスホリルアジド［（ＲＯ）2ＰＯＮ3］、例えば、ジフェニルホスホリルアジド及びジエチルホスホリルアジドを含む。
【０１０８】
ジアゾ化合物は、別の種類の光反応性基を構成し、そしてジアゾアルカン（−ＣＨＮ2）、例えば、ジアゾメタン及びジフェニルジアゾメタン；ジアゾケトン（−ＣＯ−ＣＨＮ2）、例えば、ジアゾアセトフェノン及び１−トリフルオロメチル−１−ジアゾ−２−ペンタノン；ジアゾアセテート（−Ｏ−ＣＯ−ＣＨＮ2）、例えば、ｔ−ブチルジアゾアセテート及びフェニルジアゾアセテート；及びβ−ケト−α−ジアゾアセタトアセテート（−ＣＯ−ＣＮ2ＣＯ−Ｏ−）、例えば、ｔ−ブチル−α−ジアゾアセトアセテートを含む。
【０１０９】
他の光反応性基には、ジアジリン（−ＣＨＮ2）、例えば、３−トリフルオロメチル−３−フェニルジアジリン；及びケテン（ＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）、例えば、ケテン及びジフェニルケテンが含まれる。
【０１１０】
パーオキシ化合物は、別の種類の潜在性反応性基として企図され、そしてジアルキルパーオキシド、例えば、ジ−ｔ−ブチルパーオキシド及びジシクロヘキシルパーオキシド及びジアシルパーオキシド、例えば、ジベンゾイルパーオキシド及びジアセチルパーオキシド及びパーオキシエステル、例えば、エチルパーオキシベンゾエートを含む。
【０１１１】
いくつかの態様では、上記潜在性反応性基は、（上記ポリマーのモノマーに対して）最大約１０％のモル濃度量、又は最大約５％の量で存在する。いくつかの態様では、上記ポリマーは、約０．０５％〜１０％の範囲のモル濃度量で、上記潜在性反応性基を含む。コポリマーの例示的な調製物には、約９８．４％のアミン含有モノマー（例えば、ＡＰＭＡ、ＡＥＭＡ又はＤＭＡＰＭＡ）と、約１．６％の上記潜在性反応性基を含むモノマーとが含まれる。
【０１１２】
ナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面に生成させる本発明のコーティングは、任意の好適な方法を用いる。上述のように、ペンダント型アミン基及びペンダント型潜在性反応性基を有するポリマーを、上記ナノ繊維の表面に配置させることができ、そして上記潜在性反応性基を活性化し、それにより上記ポリマーを上記ナノ繊維の表面に結合させ、当該ナノ繊維上の薄いポリマーコーティングを生成するように上記表面を処理することができる。
【０１１３】
別の方法では、グラフト重合法により、上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維表面に、上記ポリマーを生成させる。例えば、潜在性反応性基及び重合性基を含むモノマーを、上記ナノ繊維の表面に配置させ、そして結合させることができる。次いで、アミン基含有モノマーの組成物を、上記表面に配置することができ、そして重合反応を開始して、上記製品の表面からポリマー鎖を形成させ、そして上記ナノフィブリル構造体の表面と結合させることができる。
【０１１４】
さらに別の方法では、２つ又は３つ以上の潜在性反応性基を有する架橋剤を用いて上記コーティングを生成させることができ、上記架橋剤は、上記ポリマーを上記ナノフィブリル構造体のナノ繊維の表面に結合させるために用いられる。上記架橋剤は、本明細書に記載されるような、２つ又は３つ以上の潜在性反応性基を有することができる。上記ポリマーコーティングの生成において、上記架橋剤を、上記ナノフィブリル構造体の表面に配置させ、続いてペンダント型アミン基を有するポリマーを配置させることができ、若しくは上記架橋剤を上記ポリマーと組み合わせて配置することができ、又はその両方であることができる。
【０１１５】
光反応性基が、上記架橋剤上に存在する場合には、当該光反応性基を、可逆性の光分解ホモリシスを受けるように適合させ、それによりポリマー物質に接着させる際に消費されなかった光反応性基を、不活性又は「潜在性」の状態に戻すことが好ましい。続いて、共有結合形成において引き抜くことができる水素を有するポリマーに結合させるために、これらの光反応性基を活性化することができる。従って、上記光反応性基の励起は可逆性であり、そして当該基は、上記エネルギー源を取り除くと、基底状態のエネルギー準位に戻ることができる。いくつかの実施形態では、好ましい架橋剤は、複数の活性化を受け、よって、高いコーティング効率を付与することができる基である。いくつかの実施形態では、上記光反応性部分は、上記ポリマー物質から独立しており、そして例えば、架橋剤であることができる。例示的な架橋剤は、本件出願人の米国特許第５，４１４，０７５号明細書（Ｓｗａｎら）及び米国特許出願公開第２００３／０１６５６１３号明細書（Ｃｈａｐｐａら）に記載されている。また、米国特許第５，７１４，３６０号明細書（Ｓｗａｎら）及び同５，６３７，４６０号明細書（Ｓｗａｎら）を参照せよ。
【０１１６】
ペンダント型アミン基を有する非生分解性ポリマーを、単体で、又は他の所望による成分と共に、ナノフィブリル構造体のナノ繊維に結合させることができる。最も簡単な状態では、上記コーティング組成物は、例えば、（ｉ）少なくとも１種（好ましくは複数種）のペンダント型アミン基と、１種若しくは２種以上の潜在性反応性基とを有する非生分解性ポリマー及び／又は（ｉｉ）少なくとも１種（好ましくは複数種）のペンダント型アミン基と、２つ若しくは３つ若しくは４つ以上の潜在性反応性基を有する架橋剤とを有する非生分解性ポリマーから成る。上記コーティング組成物に他の成分を添加して、上記コーティングの態様を変化させるか、又は改良することができる。上記成分は、ポリマー又は非ポリマー成分であることができる。
【０１１７】
他の合成又は天然の、生分解性又は非生分解性ポリマーを上記組成物に添加して、コーティングを生成させることができる。「合成ポリマー」は、合成的に調製され、そして非天然モノマー単位を含むポリマーを指す。例えば、合成ポリマーは、非天然モノマー単位、例えば、アクリレート、アクリルアミド等を含むことができる。合成ポリマーは、従来の重合反応、例えば、付加重合、縮合重合又はラジカル重合により生成するのが典型的である。合成ポリマーはまた、非天然モノマー単位（例えば、合成のペプチド、ヌクレオチド及び糖誘導体）と組み合わせた天然モノマー単位、例えば、天然のペプチド、ヌクレオチド、及び糖モノマー単位を有するものを含むことができる。このタイプの合成ポリマーを、標準的な合成技法、例えば、固相合成又は組換え（可能な場合）により生成させることができる。
【０１１８】
「天然ポリマー」は、天然、組換え又は合成のいずれかにより調製され、そして上記ポリマー主鎖において天然のモノマー単位から成るポリマーを指す。ある場合には、上記天然ポリマーを、変性、加工、誘導又は処理して、上記天然ポリマーの化学的及び／又は物理的性質を変化させることができる。これらの例では、用語「天然ポリマー」は、上記天然ポリマーに対する変化を反映するように修正されうる（例えば、「誘導した天然ポリマー」又は「脱グルコシル化した天然ポリマー」）。
【０１１９】
生分解性物質、例えば、生分解性ポリマーをまた、上記コーティングに存在させることができる。上記生分解性物質を、上記非生分解性アミン提供ポリマーと同一のコーティング層に、所望により存在させることができ、別のコーティング層（上記コーティングに含まれる場合）に存在させることができ、又はその両方に存在させることができる。例えば、生分解性ポリマーを含むコーティング層を、上記非生分解性アミン提供ポリマーを含むコーティング層と、製品表面との間で生成させることができるか、又は上記非生分解性アミン提供ポリマーを含むコーティング層の頂部に生成させることができる。培養の際、上記生分解性ポリマーが分解可能である一方で、上記非生分解性ポリマーは上記コーティングに存在したままであり、そして長期間の培養の際に、付着面を供給する。
【０１２０】
本発明のいくつかの態様では、「生活性分子」を、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体と連結することができる。例えば、１種又は２種以上の生活性分子が、ペンダント型アミン基及び潜在性反応性基を有する非生分解性ポリマーを含むナノ繊維上のコーティング及び／又はナノ繊維に存在することができる。ある場合には、上記生活性分子が、明細書に記載されるような生分解性物質であることができる。１種又は２種以上の生活性分子を、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体と連結することができる一方で、細胞培養物が、上記ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体と共に用いられる場合には、一又は複数の生活性分子をまた、液体培地内に含ませることができる。従って、複数の生活性分子の列挙は、明細書に特に記載されない限り、当該分子が、上記コーティング又は任意の培地に存在することを限定することを目的とするものではない。
【０１２１】
本明細書において、用語「生活性分子」は、細胞又は組織上に影響を有する分子を意味する。当該用語には、人間又は動物の（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ）治療用の、栄養補助食品、ビタミン、塩、電解質、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、炭水化物、脂質、多糖類、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、糖たんぱく質、リポたんぱく質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、増殖因子、分化因子、ホルモン、神経伝達物質、フェロモン、ケイロン、プロスタグランジン、免疫クロブリン、モノカイン及び他のサイトカイン、保湿剤、ミネラル、電気的及び磁気的反応性物質、光電性物質、抗酸化物質、細胞エネルギーの供給源として代謝されうる分子、抗原、並びに細胞又は生理的応答を起こすことができる任意の分子が含まれる。
【０１２２】
分子の任意の組み合わせ、並びにこれらの分子の作動薬又は拮抗薬を用いることができる。グリコアミノグリカンには、糖たんぱく質、プロテオグリカン及びヒアルロナンが含まれる。多糖類には、セルロース、でん粉、アルギン酸、キトサン又はヒアルロナンが含まれる。サイトカインには、カルディオトロフィン（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）、ストロマ細胞に由来する因子、マクロファージ由来するケモカイン（ＭＤＣ）、メラノーマ増殖刺激活性（ｍｅｌａｎｏｍａ ｇｒｏｗｔｈ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ＭＧＳＡ）、マクロファージ炎症性たんぱく質１α（ＭＩＰ−１α）、２、３α、３β、４及び５、インターロイキン（ＩＬ）１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明に有用な免疫クロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド及びたんぱく質は、任意のサイズ及び複雑さの任意の種類の上記分子、並びに当該分子の組み合わせが含まれうる。例には、構造たんぱく質、酵素及びペプチドホルモンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２３】
用語「生活性分子」はまた、繊維状たんぱく質、付着性たんぱく質、接着性化合物、脱付着性化合物（ｄｅａｄｈｅｓｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）及びターゲット化合物を含む。繊維状たんぱく質には、コラーゲン及びラスチンが含まれる。付着性／脱付着性化合物には、フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンジン及びテネイシンＣが含まれる。付着性たんぱく質には、アクチン、繊維素、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、セレクチン、細胞間接着分子（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）１、２及び３、並びに細胞−マトリックス付着受容体（例えば、インテグリン、例えば、α5β1、α6β1、α7β1、α4β2、α2β3、α6β4を含むがこれらに限定されるものではない）が含まれる。
【０１２４】
いくつかの態様では、細胞接着用のコーティングを生成させるために従来用いられているポリマーを、上記コーティング組成物に含ませることができる。例えば、ポリペプチド系ポリマー、例えば、ポリリジン、コラーゲン、フィブロネクチン、インテグリン及びラミニンを、上記コーティングに含ませることができる。これらのポリペプチドのペプチド部分をまた、上記コーティング組成物に含ませることができる。マトリックスたんぱく質の例示的な結合ドメイン配列を、表１に示す。
【０１２５】
【表１】
【０１２６】
上記コーティング組成物中に存在する試薬にもよるが、これらのポリペプチド系ポリマーは、誘導体化していない状態又は誘導化した状態であることができる。例えば、上記ポリペプチド系ポリマーを、潜在性反応性基を用いて誘導し、次いで、上記非生分解性ポリマーに由来する上記潜在性反応性基ペンダントと共に活性化して上記コーティングを生成することができる。例示的な組み合わせには、１種又は２種以上の感光性ポリリジン（ｐｈｏｔｏ−ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）、感光性コラーゲン、感光性フィブロネクチン及び感光性ラミニン、又はポリペプチドの光誘導体化部分（ｐｈｏｔｏ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｏｒｔｉｏｎｓ）（本明細書に記載されるものを含む）を用いた、感光性ポリ（アミノプロピルメタクリルアミド）又は感光性ポリ（エチレンイミン）が含まれうる。
【０１２７】
光誘導体化ポリペプチド（ｐｈｏｔｏｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンを、米国特許第５，７４４，５１５号明細書（Ｃｌａｐｐｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ Ａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）に記載されるように調製することができる。この特許に記載されるように、ヘテロ二官能性薬剤を、たんぱく質を光誘導体化するために用いることができる。当該薬剤には、一方の端のベンゾフェノン光活性化可能基（ベンゾイル安息香酸、ＢＢＡ）、中間のスペーサー（ε−アミノカプロン酸、ＥＡＣ）及び他方の端のアミン反応性熱化学結合基（Ｎ−オキシスクシンイミド、ＮＯＳ）が含まれる。
【０１２８】
ＢＢＡ−ＥＡＣを、４−ベンゾイルベンゾイルクロリド及び６−アミノカプロン酸から合成する。次いで、ＢＢＡ−ＥＡＣのＮＯＳエステルが、カルボジイミド活性によるＢＢＡ−ＥＡＣのカルボキシ基を、Ｎ−ヒドロキシスクシミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｍｉｄｅ）とエステル化させて合成され、ＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳが生じる。たんぱく質、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等を、商業的な供給源から購入することができる。１モルのたんぱく質当たり、１０〜１５モルのＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳ架橋剤の比で、ＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳ架橋剤を添加することにより、上記たんぱく質を光誘導体化する。
【０１２９】
生活性分子はまた、レプチン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ＲＧＤペプチド、腫瘍壊死因子α及びβ、エンドスタチン、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、骨形成たんぱく質−１、骨形態形成タンパク質２及び７、オステオネクチン、ソマトメジン様ペプチド、オステオカルシン、インターフェロンα、インターフェロンαＡ、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロン１α及びインターロイキン２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７及び１８を含む。
【０１３０】
本明細書において、用語「増殖因子」は、細胞又は組織の増殖を促進する生活性分子を意味する。本発明に有用な増殖因子には、形質転換増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、ＡＡ、ＡＢ及びＢＢイソフォームを含む血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、例えば、ＦＧＦ酸性イソフォーム１及び２、ＦＧＦ基本形状２及びＦＧＦ４、８、９及び１０、神経増殖因子（ＮＧＦ）、例えば、ＮＧＦ２．５ｓ、ＮＧＦ７．０ｓ及びβＮＧＦ及びニューロトロフィン、脳由来神経栄養因子、軟骨由来因子、骨増殖因子（ＢＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＥＧ−ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−関連たんぱく質、Ｂｖ８、ＶＥＧＦ−Ｅ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）Ｉ及びＩＩ、肝細胞増殖因子、グリア神経栄養増殖因子（ＧＤＮＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦα、β、β１、β２及びβ３、骨格増殖因子、骨基剤由来増殖因子及び骨由来増殖因子及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの増殖因子がまた、細胞又は組織の分化を促進することができる。例えば、ＴＧＦは、細胞又は組織の増殖及び／又は分化を促進することができる。いくつかの好ましい増殖因子には、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＦＧＦｂ、ＦＧＦａ及びＢＧＦが含まれる。
【０１３１】
本明細書において、用語「分化因子」は、細胞の分化を促進する生活性分子を意味する。当該用語には、ニューロトロフィン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、又は形質転換増殖因子が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＣＳＦには、顆粒球−ＣＳＦ、マクロファージ−ＣＳＦ、顆粒−マクロファージ−ＣＳＦ、エリスロポエチン及びＩＬ−３が含まれる。いくつかの分化因子はまた、細胞又は組織の増殖を促進することができる。例えば、ＴＧＦ及びＩＬ−３は、細胞の分化及び／又は増殖を促進することができる。
【０１３２】
いくつかの態様では、上記コーティング組成物に、他の所望による成分を添加する場合には、上記非生分解性ポリマーが、当該組成物中で主成分であることが一般的に望ましい。上記コーティングがいくつかの生分解性成分を含む場合には、これらの成分を、一定の期間にわたって分解することができるが、上記非生分解性ポリマーは、上記コーティングの主成分として残る。
【０１３３】
上記コーティング組成物の試薬、例えば、上記ポリマー物質を、好適な液体、例えば、水性又はアルコール系液体の中で調製することができる。例えば、上記ポリマー物質を、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で溶解することができる。しかし、さらに典型的に用いられる濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲にある。
上記コーティングを、浸漬コーティング、インソリューション（ｉｎ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ）コーティング及びスプレーコーティングを含む任意の好適な方法により生成することができる。
【０１３４】
上記コーティングが光反応性基を含む場合には、照射段階を、当該光反応性基の活性化を促進する量の化学線を上記光反応性基に当て、そしてナノフィブリル構造体のナノ繊維と結合させることにより実施することができる。
【０１３５】
化学線は、上記光反応性基の活性化を促進する任意の好適な光源により供給されうる。好ましい光源（例えば、Ｄｙｍａｘ Ｃｏｒｐ．から入手できるもの）は、１９０ｎｍ〜３６０ｎｍの範囲のＵＶを照射する。好適な放射線量は、約１０ｎｍのバンド幅を有し、３３５ｎｍバンドパスフィルターを取り付けた線量計を用いて測定され、約０．１ｍＷ／ｃｍ2〜約２０ｍＷ／ｃｍ2の範囲にある。
【０１３６】
いくつかの態様では、上記光反応性基を活性化する段階に関連して、フィルターを用いることが望ましい場合がある。フィルターの使用は、当該フィルターが、活性化工程の際に上記コーティングに供給される一又は複数の特定の波長の放射線の量を選択的に最小化することができる観点から有益でありうる。これは、上記コーティングの１種又は２種以上の成分が、一又は複数の特定の波長の放射線に対する感度が高く、そしてそれらが曝露の際に分解又は変質する可能性がある場合に有益であることができる。
【０１３７】
典型的には、フィルターを透過させる光の波長により、フィルターを特定することができる。本発明に関連して用いることができるフィルターの２種の実例は、カットオフフィルター及びバンドパスフィルターである。一般的に、カットオフフィルターは、光線透過率が最高透過率の約２５％であるカットオフ透過率により分類されている。バンドパスフィルターの場合、波長の範囲は、当該フィルターに関して特定されており、そして中心波長は、上記フィルターを通過できる波長の中点値である。
【０１３８】
上記コーティングされたナノフィブリル構造体の調製に続いて、上記ナノ繊維の表面に共有結合していない可能性がある過剰の物質を取り除くため、洗浄段階を実施することができる。上記コーティングされたナノフィブリル構造体をまた、さらなるＵＶ照射等により上記ナノフィブリル構造体を殺菌するために処理することができる。
【０１３９】
本発明のいくつかの優位性は、多種多様の細胞種に付着性コーティングを供給するために特に有用であるコーティングを生成することに関連する。上記コーティングの安定性のために、当該コーティング方法を実施してコーティングされたナノフィブリル構造体を供給することができ、次いで、上記コーティングされたナノフィブリル構造体を、使用者に提供するか、又は使用前の一定の期間貯蔵することができる。他のケースでは、上記コーティング試薬（少なくとも上記非生分解性ポリマーを含む）を、キット内で使用者に供給し、次いで当該使用者が、上記コーティング方法を、ナノフィブリル構造体に実施することができる。従って、本発明はまた、非生分解性ポリマー含有コーティングを調製するためのキットを提供することができる。上記キットには、上記コーティングを生成するための指示書が含まれることができ、そして所望により、当該キットの試薬を用いてコーティングされているナノフィブリル構造体を用いて細胞を培養するための方法が含まれうる。
【０１４０】
いくつかの態様では、本発明は、コーティングされたナノフィブリル構造体を用いた、細胞を培養するためのコーティング及び方法を提供し、そこでは、当該コーティングされたナノフィブリル構造体は、細胞接着のための優れた基剤を提供し、そして上記コーティングは、上記細胞が相当な期間（例えば、１４日超、２１日超、２８日超、３５日超、４２日超、４９日超又は５６日超）、上記コーティングされたナノフィブリル構造体と接触して保持することができる方法において用いられうる。いくつかの態様では、上記細胞をまた、約１４〜約６０日の範囲の期間、培養物中で保持することができる。例えば、上記細胞を、コーティングされたナノフィブリル構造体上に配置することができ、そこでは、当該細胞は、上記コーティングされた構造体の一点に付着し、そして適切な培地の存在下で生存が保たれる。ある場合には、上記細胞は増殖により増えることができるが、一般的に、上記細胞の表現型は変化しない。
【０１４１】
本発明のコーティングに関連して、上記細胞は、細胞を維持するか、又は所望の細胞種の形成を促進するために好適である液体培地の中で培養されるのが典型的である。種々のベース液体培地、血清、アミノ酸、微量元素、ホルモン、抗生物質、塩、緩衝剤及び増殖因子（例えば、本明細書に記載されるもの）並びに／又は分化因子（例えば、本明細書に記載されるもの）を補うことができるＲＰＭＩ等を用いることができる。
【０１４２】
細胞の機能（例えば、増殖及び分化）の態様に作用しうる因子をまた、上記液体培地に添加することができる。これらの因子には、ニューロトロフィン、サイトカイン（例えば、インターロイキン）、インスリン様増殖因子、形質転換増殖因子、上皮細胞増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、ヘパリン結合性増殖因子、チロシンキナーゼ受容体配位子、血小板由来増殖因子及び血管内皮増殖因子及びセマフォリンが含まれうる。
【０１４３】
例示的なニューロトロフィンには、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン及び脳誘導神経向性因子が含まれる；例示的な上皮細胞増殖因子には、ニューレグリン、形質転換増殖因子α及びネトリンが含まれる；例示的なサイトカインには、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５及びＧ−ＣＳＦ、白血病抑制因子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルディオトロフィン−１（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１）及びオンコスタチン−Ｍが含まれる；例示的な形質転換増殖因子には、グリア細胞株由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＧＤＮＦ）、アルテミン、ニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）及びパーセフィンが含まれる。
【０１４４】
本発明のいくつかの態様では、上記方法は、適切な培地の存在下で、本明細書に記載されるように、コーティングされた基剤上で幹細胞を培養することを含む。幹細胞は、多分化能を有し且つ成形的である（それらが種々の細胞種に分化することを誘導する）。幹細胞には、胚幹細胞、例えば、胚盤胞から得られるもの及び成体の身体中の種々の組織から得ることができる成体幹細胞、例えば、造血幹細胞源を供給する骨髄が含まれる。胚幹細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで本質的に無限の増殖能を有し、従って、適用、例えば、組織再生を含む適用において、大きく増やすことができる。本発明のコーティングされたナノフィブリル構造体は、これらの細胞を培養するための理想の基剤を提供する。というのは、他の基剤よりも相当長い期間、コーティングされたナノフィブリル構造体上で、上記細胞を維持し、且つ伸張させることができるからである。従って、上記コーティングされたナノフィブリル構造体は、所望の用途、例えば、細胞移植又は再生医療のために、多くの肝細胞を得ることを顕著に促進することができる。
【０１４５】
本発明の方法に従って培養された細胞をまた、ドラッグデリバリー、遺伝子同定のため、そして抗体生産のために用いることができる。
本発明のコーティングされたナノフィブリル構造体はまた、クローン又は少数の細胞をコーティングされた製品容器に接種し、そして培養において、集密状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｓｔａｔｅ）に到達する前の上記細胞を収穫、分割、又は希釈する前に、より長い期間を可能とする。
【０１４６】
ある場合には、上記細胞を上記コーティングされたナノフィブリル表面上に配置させる前に、当該細胞を、細胞のフィーダー層上に保持することができる。上記フィーダー層上で、一定期間、培養することに続いて、本明細書に記載される本発明のコーティングを有するナノフィブリル細胞培養製品に、上記細胞を移動させることができる。本発明に従って、上記コーティングされたナノフィブリル構造体上で、新鮮なコーティング面を供給する必要なく、最大約３０日の期間、上記細胞を培養することができることが見出された。
【０１４７】
本発明の他の態様では、本発明は、神経前駆細胞及び幹細胞の分化のための方法に関する。本発明に従うと、部分的又は完全に成熟した神経細胞表現型の形態学又は生化学的変化の特徴を誘発する１種又は２種以上の因子（例えば、神経栄養増殖因子）及び本発明のコーティングの存在下で、神経前駆細胞を培養することができる。
【０１４８】
さらに具体的には、いくつかの態様では、乏突起神経膠芽細胞、星状細胞及び神経細胞に分化させるために誘導することができる多分化能の神経上皮幹細胞及び系統限定中間前駆細胞を培養するために、上記コーティングされたナノフィブリル構造体を用いることができる。上記前駆細胞は、種々の発育段階においてＣＮＳ中に存在する。
【０１４９】
プラスチックに弱く付着するＰＣ１２細胞（褐色細胞腫細胞）が、本明細書に記載されるコーティングされたナノフィブリル構造体に良好に付着することを実証することができた。一般的に、ＰＣ１２細胞は増殖が遅く、そしてＮＧＦ及びｃＡＭＰの共働作用を用いて分化させることができる。一度分化したＰＣ１２細胞を、約１４日間維持することができる。デキサメタゾンは、非神経系リネージの分化を誘導する。本明細書に記載される結果はまた、上記非生分解性ポリマーアミン含有コーティング及び神経増殖因子（ＮＧＦ）と共にナノフィブリル構造体の存在下の、神経性前駆物質ＰＣ１２細胞が、神経突起伸張及び交感神経系神経細胞表現型の生化学的標識の発現を示すことを教示している。
【実施例】
【０１５０】
例１
感光性ポリマー試薬
Ｉ．感光性ポリ（ＡＰＭＡ）
感光性ポリ（アミノプロピルメタクリルアミド）（感光性ポリ（ＡＰＭＡ）／ＡＰＯ２）の調製を、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド（ＡＰＭＡ−ＨＣｌ）及びＮ−［３−（４−ベンゾイルベンズアミド）プロピル］メタクリルアミド（ＢＢＡ−ＡＰＭＡ）の共重合により実施した。これらの調製は、米国特許第５，８５８，６５３号明細書の、それぞれ、例２及び例３に記載されている。
【０１５１】
２Ｌのフラスコに、２．３７８ｇのＢＢＡ−ＡＰＭＡ（６．７８７７ミリモル）、０．８４９の２，２’−アゾビス（２−メチル−プロピオニトリル）（ＡＩＢＮ）（５．１７４８ミリモル）及び０．８４９ｇのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（６．７７ミリモル）を添加し、次いで、当該成分を溶解させるために７８６ｇのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して共重合を行った。次いで、当該内容物を撹拌し、そして少なくとも５分の間、ヘリウムスパージャを用いて酸素を除去した。別個のフラスコにおいて、窒素スパージャを用いて、３０６ｇのＤＩ水の中に、７２．４ｇのＡＰＭＡ−ＨＣｌ（４０５．２１５ミリモル）を溶解させた。溶解したＡＰＭＡ−ＨＣｌを、ＢＢＡ−ＡＰＭＡを含む混合物に移動し、続いて少なくとも１０分間のヘリウムスパージャを行った。続いて、密封した容器を、５５℃で一晩中加熱して重合を完了させた。
【０１５２】
次いで、１８０ｍＬの量の上記ポリマー溶液を、１８０ｍＬのＤＩ水で希釈し、そして毎分１．２５〜０．３５ガロンの一定流量を用いて、５５ガロンのタンクの中で、少なくとも９６時間の間、１２，０００〜１４，０００の分子量カットオフチューブを用いて、脱イオン水で透析した。
１０μｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲にわたる上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）ポリマーを有する種々のコーティング溶液を、水中で調製した。
【０１５３】
ＩＩ−ＩＶ．感光性コラーゲン、感光性フィブロネクチン及び感光性ラミニン
感光性コラーゲン、感光性フィブロネクチン及び感光性ラミニンを、米国特許第５，７４４，５１５号明細書の例１に記載されるように調製した。
２５μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬの範囲にわたる種々の感光性ラミニンコーティング溶液を、水中で調製した。
感光性フィブロネクチンコーティング溶液を、水中において、２５μｇ／ｍＬに調製した。
感光性コラーゲンコーティング溶液を、０．０１２ＮのＨＣｌ中において、２５μｇ／ｍＬに調製した。
【０１５４】
Ｖ．感光性ＰＥＩ
最初に、減圧下でポリエチレンイミン（ＰＥＩ；２４．２ｗｔ．％ 固形分；２０００ｋｇ／モル Ｍｗ；ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．）を乾燥させ、次いで、１９ｍＬの９０：１０（ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノール溶液に１．０９ｇのＰＥＩを溶解して、感光性ＰＥＩを調製した。次いで、当該ＰＥＩ溶液を、氷浴中で０℃まで冷却した。溶解すべき６２ｍｇのＢＢＡ−Ｃｌ（４−ベンゾイルベンゾイルクロリド；その調製は、米国特許第５，８５８，６５３号明細書に記載されている）を、２．８ｍＬのクロロホルムに添加した。ＢＢＡ−Ｃｌ溶液を冷却し、撹拌しているＰＥＩ溶液に添加した。
【０１５５】
上記反応溶液を、室温まで加温しながら一晩中撹拌した（上記反応のＴＬＣ分析により、２．５時間後に未反応のＢＢＡ−Ｃｌは存在しないことが示された）。翌日、上記反応溶液を大きなフラスコに移し、そして７７．５ｍＬの脱イオン水とともに、１当量の濃塩酸を添加した。水性ＰＥＩ溶液の外観が透明になるまで、有機溶媒を、４０℃、減圧下で取り除いた。次いで、水性ＰＥＩ溶液を、コーティング溶液として用いるための５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。
ＶＩ．感光性ＲＧＤ
感光性ＲＧＤを、同一出願人による米国特許第６，１２１，０２７号明細書の例１に記載されるように調製した。感光性ＲＧＤのコーティング溶液を、水中において、２５μｇ／ｍＬに調製した。
【０１５６】
例２
基剤コーティング
上記例１で調製された感光性ポリマー試薬を、平面（複数のウェルのプレート）及び３次元の基剤（高分子量ナノ繊維）上にコーティングした。
【０１５７】
平面をコーティングするため、１．０ｍＬの量の、例１に記載されるコーティング溶液を、１２個のウェルのプレート（ポリスチレン；Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに添加した。基剤コーティングにおいて、上記コーティング溶液の深さ（上記溶液の表面から、基剤、ポリスチレン又はナノ繊維のどちらかの表面までの距離）は、概して５ｍｍ以下、そして典型的には、約１〜２ｍｍの範囲にある。Ｄｙｍａｘ（商標）製ランプを使用して、１０ｎｍのバンド幅を有する３３５ｎｍのバンドパスフィルターを用いて評価された、２００〜３００ｍＪのエネルギーを供給した（平均して、上記ウェルから２０ｃｍの距離に保たれているランプを用いて、約３〜４分間、上記ウェルを照射した）。次いで、上記ウェルを、ｐＨ７．２の緩衝食塩水を用いて洗浄し、結合していない試薬を取り除いた。次いで、上記ウェルを再度ＵＶ照射し、上述と同一の照射条件を用いて、上記ウェルを殺菌した。
【０１５８】
コーティングされていない１２個のウェルのプレートを、対照として用いた。３次元の表面をコーティングするため、０．５ｍＬの量の、例１に記載されるコーティング溶液を、ディスク状の（ｄｉｓｃ）ナノ繊維基剤（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｃｏ．，ＭＮ；米国特許出願公開第２００５／００９５６９５号）に添加した。約２０ｃｍの距離におけるＤｙｍａｘ（商標）製ランプを用いて、１分間、上記基剤を照射した。次いで、上記ディスクを、水で４回洗浄した。次いで、上記ナノ繊維基剤を、再度ＵＶ照射し、当該ナノ繊維基剤を殺菌した。
コーティングされていないナノ繊維基剤を、対照として使用した。
【０１５９】
例３
感光性ポリマーがコーティングされた基剤上のＰＣ１２細胞の接着アッセイ
付着性の乏しい細胞（ＰＣ１２細胞）を、種々の感光性ポリマー基剤上に平面培養する（ｐｌａｔｅ）効果を決定するために、接着アッセイを実施した。ＡＴＣＣ（登録＃ＣＲＬ １７２１）から購入したラットＰＣ１２（褐色細胞腫）細胞を、１０％の馬血清、５％の牛血清、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の、コラーゲンがコーティングされたポリスチレンフラスコ（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）内で前培養した。細胞を、５％ＣＯ2／９５％空気加湿チャンバー内で、３７℃でインキュベートした。上記培地を、１日おきに交換した。細胞が、８０％の密集度に到達したら、当該細胞をトリプシン処理し、そして継代培養した。例２に記載される方法に従ってコーティングされた１２個のウェルの基剤に上記細胞を平面培養する前に、これらの培養条件を続けた。
【０１６０】
継代培養＃２及び継代培養＃１０の間のＰＣ１２細胞を、実施した全ての実験において用いた。上記細胞をトリプシン処理し、そして５００，０００個の細胞／ｍＬの濃度において、ＲＰＭＩ培地中の１２個のウェルのプレート内に、５００，０００個の細胞／ウェルの密度で接種した。４８時間の間、５％のＣＯ2を用いて、３７℃における加湿したチャンバー内で、細胞をインキュベートした。上記細胞は、平面培養する前に、多角形の形態を有し、少なくとも９９％が生存していた。
【０１６１】
細胞をナノ繊維上に接種するために、ＰＣ１２細胞をトリプシン処理し、そして２００μＬのＲＰＭＩ培地内に再懸濁させた。５００，０００個の細胞／１８ｍｍの密度の上記細胞懸濁液を、コーティングされた又はコーティングされていないナノ繊維（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６０９１９２、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｃｏ．，ＭＮ）に注意深く添加し、そして上記細胞を、層流フードの下、室温で、１０分間、上記ナノ繊維に付着させた。１０分後、８００μＬの増殖培地を、上記ナノ繊維の周りにやさしく添加し、そして上記細胞を、３７℃において、加湿した５％ＣＯ2／９５％空気チャンバー内に置いた。上記培地を、１日おきに交換した。
【０１６２】
ＭＴＴ接着アッセイ
４８時間後、上記増殖培地を取り出し、そしてコーティングされた及びコーティングされていないポリスチレン上で増殖している上記細胞、コーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維を、Ｃａ++−及びＭｇ++−フリーのＰＢＳを用いて、４回洗浄した。これらの複数回の洗浄により、上記ウェルから、ゆるく結合した又は結合していない細胞を除去した。コーティングされた基剤上で、洗浄により５％の細胞が除去された一方で、コーティングされていない基剤上では、洗浄により７０％が除去された。次いで、３７℃における加湿されたチャンバー内で、ＭＴＴを用いて、２時間の間、細胞をインキュベートした（増殖培地、Ｓｉｇｍａを用いて、１：１に希釈）。ＭＴＴを含む培地を取り出し、そして上記細胞を、ＰＢＳを用いてさらに洗浄し、フェノールレッドを取り除いた。５００μＬの染料可溶化剤（０．５ｍＬの０．０４ＮＨＣｌ／イソプロピルアルコール及び０．１２ｍＬの３％ＳＤＳ／水の混合物）を添加し、そして上記ウェルを、室温で３０分間（又は染料が完全に可溶化するまで）、３０ｒｐｍでやさしく揺り動かした。当該試料を、９６個のウェルの皿に移動し、そして分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）内で、５７０ｎｍにおいて、吸光度を読取った。
【０１６３】
コーティングされた及びコーティングされていない平面（１２個のウェルのプレート）上の細胞接着の結果を、図１に示す。ＰＣ１２細胞の最良の接着は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）を用いてコーティングしたウェルで実証され、感光性ラミニン及び感光性ＰＥＩ試薬が続いた。コーティングされていないウェル及び感光性フィブロネクチンによりコーティングされた基剤を、対照として用いた。ＰＣ１２細胞は、フィブロネクチンに良好に付着する他の細胞種と比較して、それらの表面に低濃度のフィブロネクチン受容体を発現させる（Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ及びＲｅｉｃｈａｒｄｔの「Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．」（１９８７）１０５：２３４７−２３５８を参照せよ）。感光性ＲＧＤ及び感光性コラーゲンは、感光性ポリ（ＡＭＰＡ）と同様の、感光性コラーゲン及び感光性ラミニンと比較して感光性ポリ（ＡＭＰＡ）の接着能におおよそ２倍の差を有する実施されたコーティングを供給しなかったことを、当該結果は示している。
【０１６４】
３次元の表面（ナノ繊維）上の細胞接着の結果を、図２に示す。平面上の結果と同様に、上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維は、コーティングされていない基剤と比較して、固定の弱い細胞を、強く接着させることが示された。
【０１６５】
図３は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維（３Ｂ）及びコーティングされていないナノ繊維（３Ａ）上で増殖するＰＣ１２細胞の明視野顕微鏡像を示す。２４時間後に、当該画像を撮影した。ＰＣ１２細胞は、上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で、良好に広がることを実証したが、コーティングされていない表面では、上記細胞は、お互いに接着してクラスターを形成し、コーティングされていない基剤への接着は非常に弱かった。
【０１６６】
図４は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で２４時間の間増殖させ、そしてファロイジン（１：５００、分子プローブ）を用いた染色を受けたＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像を示す。ファロイジンは、線維状アクチン（Ｆ−アクチン）に結合し、そして上記細胞の細胞骨格組織を可視化する。感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で培養されたＰＣ１２細胞は、それらの通常の多角形形態を保持し、上記基剤の強い結合能力が細胞形態に影響を与えないことを示していることを、上記染色結果は示している。ファロイジン染色の場合、ＰＣ１２細胞を、４％のパラホルムアルデヒドを用いて２０分固定し、０．１ＭのＰＢＳで３回洗浄し、そして０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内で希釈したＴＲＩＴＣと共役したファロイジンを用いて、室温で１時間の間インキュベートした。０．１ＭのＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、そして倒立顕微鏡の下で観察した。
【０１６７】
上記細胞が３次元の基剤上で培養されると、アクチンは、大きく広がるのではなく、皮質の環の中で組織化することを、当該画像は示している。アクチンのこの組織化は、組織マトリックス又は組織様マトリックスのどちらかの中で観察される（Ｗａｌｐｉｔａ及びＨａｙの「Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．ＭｏＬ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」（２００２）３：１３７−１４１；米国特許出願第２００５／００９５６９５号明細書）。
【０１６８】
付着性の乏しい細胞系の付着性を特に改良した感光性試薬を実証するために、付着性の強い細胞系を上記感光性ポリマーがコーティングされた基剤上で平面培養した。ヒト包皮繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＨＦＦ）を、ＰＣ１２細胞の場合に用いられる方法に従って、感光性ポリマーがコーティングされた基剤上で平面培養し、そしてＭＴＴ接着アッセイを、培養に続いて実施した。図５は、上記感光性試薬の存在により、むき出しのポリスチレンと比較して、ＨＦＦ細胞の付着性が概して改良されなかったことを示している。試験された種々のコーティングされた基剤上で、接着性の強い細胞系の接着に、利益は観察されなかった。
【０１６９】
例４
感光性ポリマーがコーティングされた表面上のＰＣ１２細胞の増殖
ＰＣ１２細胞を、例３に記載されるように培養した。ＢｒｄＵ取り込みを、コーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６０９１８６、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｃｏ．，ＭＮから市販される）、並びにコーティングされた及びコーティングされていないポリスチレン上で増殖した細胞に関して試験した。一日で、２，５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、１μＭ濃度、Ｓｉｇｍａ）を、上記培養物に添加し、分裂細胞の数の測定を可能とした。免疫細胞化学を実施するために、４８時間の間、ＢｒｄＵを細胞に適用し、次いで、抗ＢｒｄＵ抗体を用いて染色した。
【０１７０】
ＰＣ１２細胞を、Ｓ．Ｐ Ｍｅｍｂｅｒｇ＆Ａ．Ｋ．Ｈａｌｌ（「Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．」（１９９５）２７：２６−４３）の手順により透過化した（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）。細胞培養物を、１時間の間、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清）中の抗ＢｒｄＵ抗体（１：１００、Ｓｉｇｍａ）を用いてインキュベートし、ＰＢＳですすぎ、そして追加の時間、ブロッキングバッファー中の抗マウスＩｇＧｌ二次抗体（１：２００、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートした。培養物を、ＰＢＳで３回すすぎ、そして標識付けた細胞を、倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＬＡ）で観察した。
【０１７１】
図６は、ＰＣ１２細胞内のＢｒｄＵ取り込みの蛍光顕微鏡像を示す。当該画像には、コーティングされていないナノ繊維と比較して、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上でＢｒｄＵがより顕著に取り込まれたことが示されている。コーティングされていない表面と比較して、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた表面のＢｒｄＵのより顕著な組み込みは、より多数の分裂細胞に関連し、そして上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた表面上の上記細胞の接着が改良されたためであると考えられる。一定の範囲に存在する細胞の総数は、ＤＡＰＩ染色により示されている。上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた基剤上で増殖した細胞は、感光性ポリリジンがコーティングされた基剤と比較して、６０％超のＢｒｄＵの取り込みを示した。
【０１７２】
例５
種々のコーティングされた表面及びコーティングされていない表面上のＰＣ１２細胞の分化
感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていないポリスチレン製の１２個のウェルのプレート、感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６０９１８６、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｃｏ．，ＭＮから市販される）、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、並びにＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で増殖するＰＣ１２細胞の分化を、ＮＧＦ（神経増殖因子）の存在下で評価した。
試験された他の感光性試薬には、感光性フィブロネクチン、感光性ラミニン、感光性コラーゲン、感光性ＰＥＩ及び感光性ＲＧＤが含まれていた。
【０１７３】
細胞をトリプシン処理し、そして当該細胞を例３に記載されるそれらの通常の増殖培地内の３０，０００個の細胞／３５ｍｍウェルの密度で平面培養した。２４時間後、上記増殖培地を、分化培地（１％の馬血清、０．５％の牛血清、２μＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で置換した。細胞を、５％のＣＯ2／９５％の空気が加湿されたチャンバー内で、３７℃でインキュベートし、そして１日おきにＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、１０日間分化させた。
【０１７４】
神経細胞への分化を評価するために、１０日間培養した後、上記細胞を、β−ＩＩＩチューブリンに関して染色した。免疫染色を実施するために、上記細胞を２０分間、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．１ＭのＰＢＳで３回洗浄し、そして０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内で、β−ＩＩＩチューブリン一次抗体（１：２００、Ｓｉｇｍａ）を用いて１時間の間インキュベートした。細胞を洗浄し、そして追加の時間、抗マウス二次抗体（ＩｇＧ２ｂ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして倒立顕微鏡の下で観察し、β−ＩＩＩチューブリン染色を視覚化した。
【０１７５】
一般的に、上記感光性ポリマーでコーティングされた平坦又は３次元の表面により、神経細胞含有突起に富む、分化した培養物が生産された。これらの表面上の平均神経突起長は、コーティングされていない表面と比較して２倍であった。他の感光性試薬（感光性ラミニン、感光性ＰＥＩ及び感光性コラーゲン）がまた、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）よりも良好とまではいかないが、コーティングされていないポリスチレン又はナノ繊維よりも良好であることが見出された。
よって、上記感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた表面により、コーティングされていないポリスチレン、コーティングされていないナノ繊維、コラーゲン、ＰＥＩ及び市販のＰｕｒａｍａｔｒｉｘ及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）調製物と比較して、ＰＣ１２細胞が神経細胞に良好に分化した。
【０１７６】
図７は、コーティングされていないポリスチレンと比較して、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）及び感光性ラミニンがコーティングされたポリスチレン上で、ＰＣ１２細胞が良好に分化することを示す。
図８は、コーティングされていないナノ繊維と比較して、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）及び感光性ラミニンがコーティングされたナノ繊維上で、ＰＣ１２細胞が良好に分化することを示す。
図９は、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（商標）及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）と比較して、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で、ＰＣ１２細胞が良好に分化することを示している。感光性ＡＰＭＡは、ナノ繊維上で、より良好な細胞分化と、より長い神経突起伸張とを、定量的に促進する。
β−ＩＩＩチューブリン染色、神経突起形態及び細胞分化の評価を、表２に要約する。
【０１７７】
【表２】
【０１７８】
例６
感光性ポリマーがコーティングされた表面上のＥＳ−Ｄ３細胞の増殖
ＡＴＣＣ（登録番号ＣＲＬ−１９３４）に由来するＥＳ−Ｄ３細胞を、４日間、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｃａｍｂｒｅｘ）及び白血病抑制因子（ＬＩＦ，１０ｎｇ／ｍＬ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を有するＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内の懸濁皿（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｄｉｓｈ）（Ｎｕｎｃ）内で、集合体として増殖させた。次いで、上記培地を、ＮＥＰ基本培地（１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、５μｇ／ｍＬのインスリン、１６μｇ／ｍＬのプトレシン、２０ｎＭのプロゲステロン、３０ｎＭの亜セレン酸、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、Ｂ２７及びＮ２添加剤を加えた２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補ったＤＭＥＭ−Ｆ−１２）と称される化学的に規定された培地に交換し、そして上記細胞を、フィブロネクチン（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）がコーティングされたポリスチレン皿、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６１０３０４、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｃｏ．，ＭＮ）上に接種した。１日おきに培地を交換し、そして上記細胞を、５％のＣＯ2／９５％の空気が加湿されたチャンバー内で３７℃に維持した（Ｍｕｊｔａｂａ及びＲａｏの「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９９）２１４：１１３〜１２７）。
感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた表面を、ＥＳ−Ｄ３細胞と共に用いた。
【０１７９】
増殖性ＥＳ−Ｄ３細胞のためのネスチン染色
ＥＳ−Ｄ３細胞を、２４時間及び４８時間のところで分析した。ＥＳ−Ｄ３細胞を、次のように、ネスチン、未分化の幹細胞のマーカーの存在のために染色した（Ｕ．Ｌｅｎｄａｈｌらの「Ｃｅｌｌ」（１９９０）６０：５８５−９５）。４％のパラホルムアルデヒドを用いて、細胞を、室温で２０分間固定した。０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いてそれらを３回洗浄し、そして室温で２時間の間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内で１：１に希釈されたラットネスチン（ラット４０１、ＤＳＨＢ）に対する一次抗体を用いてインキュベートした。次いで、細胞を、０．１ＭのＰＢＳを用いて５分間洗浄し、そして追加の時間、０，５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内で希釈された抗マウス第二抗体（１：２００，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートし、その後、０．１ＭのＰＢＳを用いてそれらを３回洗浄し、そして倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，ＤＭＬＡ）の下で観察した。ＢｒｄＵでネスチンを二重に標識付け、そして一次抗体の適切な組み合わせ、次いで交差反応をしない（ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｖｅ）二次抗体の中で細胞を同時にインキュベートして、二重標識実験を実施した。
【０１８０】
図１０は、コーティングされたナノ繊維上に、ネスチン／ＢｒｄＵ陽性ＥＳ−Ｄ３細胞が存在することを示す。上記細胞の大部分は、試験された他の全てのリネージマーカーに関して、ネスチン陽性及び陰性であり（ＧＦＡＰ、β−ＩＩＩチューブリン及びＯ４）、未分化の幹細胞の培養物を、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）でコーティングした、これらの完全なる合成面上で維持することができることを示す。
【０１８１】
例７
コーティング面上のＥＳ−Ｄ３細胞の分化
ネスチン陽性ＥＳ−Ｄ３細胞を、基本培地（１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、５μｇ／ｍＬのインスリン、１６μｇ／ｍＬのプトレシン、２０ｎＭのプロゲステロン、３０ｎＭの亜セレン酸、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、Ｂ２７及びＮ２添加剤を加えた２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補ったＤＭＥＭ−Ｆ−１２）内の感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６０９１９２、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｃｏ．，ＭＮ）上で増殖させた。細胞を誘導して、上記増殖培地からｂＦＧＦを取り除き、そしてレチノイン酸（１μＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＰＤＧＦＢＢ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、ＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、１０％血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを添加して分化させた（Ｍｕｊｔａｂａ及びＲａｏ，上記個所）。誘発剤を毎日添加して６日間培養した後、上記幹細胞は、神経細胞、乏突起神経膠芽細胞及び星状細胞に分化した。上記分化を、上記細胞の基剤を変えることなく達成した。
【０１８２】
β−ＩＩＩチューブリン染色
上記細胞を、４％のパラホルムアルデヒドを用いて２０分間固定し、０．１ＭのＰＢＳで３回洗浄し、そして室温で１時間の間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内の神経細胞用のマーカー、β−ＩＩＩチューブリン（１：２００、Ｓｉｇｍａ）を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして追加の時間、抗マウス二次抗体（ＩｇＧ２ｂ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして倒立顕微鏡の下で観察した。
【０１８３】
場合によっては、次のように、ＤＡＰＩを用いて染色した。上記のように調製した細胞を、ＤＡＰＩ溶液（１００％ＭｅＯＨ内で１：１０００に希釈、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で洗浄した。固定した細胞を、室温で１５分間、ＤＡＰＩ溶液を用いてインキュベートした。
【０１８４】
乏突起神経膠芽細胞のためのＯ４染色
４％のパラホルムアルデヒドを用いて、室温で１０分間、細胞を固定した。０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて、５分間、細胞を３回洗浄した。室温で２時間の間、５％のＢＳＡを含む培地内で、Ｏ４（６μｇ／ｍＬ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する一次抗体と共に、細胞をインキュベートした。次いで、０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて、５分間、調製物を３回洗浄した。二次抗体と共に細胞をインキュベートし、そしてβ−ＩＩＩチューブリンに関して上述のようにさらに処理した。
【０１８５】
星状細胞用のＧＦＡＰ染色
４％のパラホルムアルデヒドを用いて、室温で２０分間、細胞を固定した。０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて、５分間、細胞を３回洗浄した。室温で２時間の間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳで、ＧＦＡＰ（１：５００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する一次抗体と共に、細胞をインキュベートした。細胞を洗浄し、そして抗マウス二次抗体と共にインキュベートし、そしてβ−ＩＩＩチューブリンに関して上述したようにさらに処理した。
【０１８６】
コーティングされていないナノ繊維と、ポリ−リジン（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）及びラミニン（１５μｇ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて二重にコーティングしたポリスチレンとを、対照として用いた。
適切な細胞種への良好な分化は、コーティングされていないナノ繊維及びポリリジン／ラミニンで二重にコーティングされている組織培養プラスチックと比較して、コーティングされたナノ繊維上で得られ、そしてこの分化は、適切な誘発剤を同一の基剤に単に添加するのみで達成される。
【０１８７】
図１１は、ＥＳ−Ｄ３細胞が、コーティングされていないナノ繊維上で増殖する神経細胞と比較して、より長い神経突起長を有する神経細胞含有突起（当該突起は、短く且つ切り株様（ｓｔｕｂｂｙ）である）に分化することを示す。
図１２は、ＥＳ−Ｄ３細胞が、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で、タイプＩ及びタイプＩＩのＧＦＡＰ陽性星状細胞に分化することを示す。当該細胞は、コーティングされたナノ繊維上で、より明るいことに留意する。
【０１８８】
例８
クローン濃度（ｃｌｏｎａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）におけるＰＣ１２細胞の増殖
ＰＣ１２細胞を、３５ｍｍウェル内に置いた３００個の細胞／３２ｍｍナノ繊維ディスク（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ＥＣＭ（商標）、製品番号Ｐ６０９１８６、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｃｏ．，ＭＮ）において平面培養し、そして一日おきにＮＧＦを添加して、３０日間分化させた（例５に記載されるように）。３０日後、上記細胞を２０分間、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．１ＭのＰＢＳで３回洗浄し、そして室温で１時間の間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商標）及び５％のヤギ血清を含むＰＢＳ内のβ−ＩＩＩチューブリン（１：２００、Ｓｉｇｍａ）を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして追加の時間、抗マウス二次抗体（ＩｇＧ２ｂ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして倒立顕微鏡の下で観察した。単一細胞は、４日の培養後、クローンを生成し始めた。当該クローンは、迅速に増殖し、そして上記コーティング面にしっかりと接着したままであった。
【０１８９】
例９
感光性ポリマーコーティング上のＰＣ１２細胞の長期間培養
例８に記載されるように培養したＰＣ１２細胞を、４５日間維持し、そしてβ−ＩＩＩチューブリンに関して処理した。図１３は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされた表面上で増殖する、分化したＰＣ１２細胞を示す。３０日の培養の後、上記細胞はしっかりしており、そして広範囲な神経突起を示した。
【０１９０】
例１０
感光性ポリマーコーティング上のＥＳ−Ｄ３細胞の長期培養
例７に記載されるように培養及び分化したＥＳ−Ｄ３細胞を、２２日の期間にわたって維持し、そしてβ−ＩＩＩチューブリン及び神経フィラメント並びにＧＦＡＰに関して処理した。図１４は、β−ＩＩＩチューブリン陽性神経細胞内の幹細胞の成熟を示している。これらの神経細胞のサブセットはまた、神経フィラメント+である。この時点で、培養物内で、むき出しのナノ繊維及びポリ−リジン／ラミニン上で増殖している細胞が上記基剤から離れ始めた一方で、ＡＰＭＡコーティングされたナノ繊維上で増殖している細胞は、上記基剤に硬く接着し、そして成熟した神経細胞を含む突起に分化した。図１５は、ＧＦＡＰ+タイプＩ及びタイプＩＩの星状細胞への、星状細胞の成熟を示す。上記細胞は、上記表面に堅く接着したままであった一方で、むき出しのナノ繊維及びポリ−リジン／ラミニン上で増殖している細胞は、上記基剤から離れ始めた。
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】図１は、種々の感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていない平面上のＰＣ１２細胞の接着の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維構造体上のＰＣ１２細胞の接着の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維（３Ａ）及びコーティングされていないナノ繊維（３Ｂ）上で増殖するＰＣ１２細胞の明視野顕微鏡像である。
【０１９２】
【図４】図４は、２４時間の間、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で増殖させた、ファロイジン染色したＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像である。
【図５】図５は、種々の感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていない平面上のＨＦＦ細胞の接着の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維（Ａ）及びコーティングされていないナノ繊維（Ｂ）上で増殖するＰＣ１２細胞のＢｒｄＵ取り込み、並びにこれらの細胞（Ａ’）及び（Ｂ’）それぞれのＤＡＰＩ染色の蛍光顕微鏡像である。
【０１９３】
【図７】図７は、種々の感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていない平坦なポリスチレン表面上で増殖させた、β−ＩＩＩチューブリン染色したＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像である。
【図８】図８は、種々の感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていない平坦なナノ繊維表面上で増殖させた、β−ＩＩＩチューブリン染色したＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像である。
【図９】図９は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維対他の市販の細胞基剤上で増殖させた、β−ＩＩＩチューブリン染色したＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像である。
【０１９４】
【図１０】図１０は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で増殖させたネスチン／ＢｒｄＵ染色したＥＳ−Ｄ３細胞の蛍光顕微鏡像である。
【図１１】図１１は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維及びコーティングされていないナノ繊維上で増殖させたβ−ＩＩＩチューブリン染色されたＥＳ−Ｄ３の神経突起形態を実証する蛍光顕微鏡像である。当該画像は、ＥＳ−Ｄ３細胞が、コーティングされていないナノ繊維上で増殖する神経細胞と比較して、より長い神経突起長を有する神経細胞含有突起（当該突起は、短く且つ切り株様である）に分化することを示す。
【０１９５】
【図１２】図１２は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維及びコーティングされていないナノ繊維上で増殖させた、ＧＦＡＰ染色したＥＳ−Ｄ３の蛍光顕微鏡像である。
【図１３】図１３は、感光性ポリ（ＡＰＭＡ）がコーティングされたナノ繊維上で増殖させ、３０日間分化させた、β−ＩＩＩチューブリン染色したＰＣ１２細胞の広範囲な神経突起形態を実証する蛍光顕微鏡像である。
【図１４】図１４は、β−ＩＩＩチューブリンが染色された陽性神経細胞（Ａ）と、β−ＩＩＩチューブリンが染色された陽性神経細胞のサブセットである、神経フィラメントが染色された神経細胞とを実証する蛍光顕微鏡像である。
【図１５】図１５は、ＧＦＡＰ+が染色された、タイプＩ及びタイプＩＩの星状細胞を示す蛍光顕微鏡像である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ナノ繊維を含むナノフィブリル構造体；並びに
（ｂ）前記ナノ繊維の少なくとも一部上に生成したコーティング、当該コーティングは、下記を含むポリマーを含む；
（ｉ）少なくとも１種のペンダント型アミン含有基；及び
（ｉｉ）前記ポリマーを前記ナノ繊維に結合させる、少なくとも１種のペンダント型の潜在性の反応した基：
を含む細胞培養製品。
【請求項２】
前記ポリマーが非生分解性ポリマーである、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項３】
前記ポリマーが合成ポリマーである、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項４】
前記ペンダント型アミン含有基が、次の式：
−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
（式中、Ｒ1は、下記：
【化１】
を有し、
Ｒ2は、Ｃ1〜Ｃ8の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そして
Ｒ3及びＲ4は、両方とも前記窒素に結合し、そして個々にＨ又はＣ1〜Ｃ6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキルである）
を有する、請求項３に記載の細胞培養製品。
【請求項５】
前記ペンダント型アミン含有基が、次の式：
−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
を有し、Ｒ1は、下記：
【化２】
であり、Ｒ2は、Ｃ2〜Ｃ4の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そしてＲ3及びＲ4は、両方とも前記窒素に結合し、そしてそれぞれ、Ｈ、ＣＨ3又はＣ2Ｈ5である、請求項４に記載の細胞培養製品。
【請求項６】
前記ポリマーが、３−アミノプロピルメタクリルアミド、３−アミノエチルメタクリルアミド及びジメチルアミノプロピルメタクリルアミドから成る群から選択される１種又は２種以上のモノマーを含む、請求項５に記載の細胞培養製品。
【請求項７】
前記ポリマーが、３−アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ）を含む、請求項６に記載の細胞培養製品。
【請求項８】
前記ペンダント型アミン含有基が、前記ポリマーの総モノマーユニットに基づいて、前記ポリマーの５０％以上のモル濃度量で存在する、請求項４に記載の細胞培養製品。
【請求項９】
前記ペンダント型の潜在性の反応した基が、光反応した基を含む、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項１０】
前記光反応した基が、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様複素環並びにそれらの置換された誘導体から成る群から選択される、請求項９に記載の細胞培養製品。
【請求項１１】
前記光反応した基が、前記ポリマー中の総モノマーユニットに基づいて、０．１％〜１０％の範囲のモル濃度量で存在する、請求項１０に記載の細胞培養製品。
【請求項１２】
前記合成ポリマーが、２０ｋＤａ〜２０００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項３に記載の細胞培養製品。
【請求項１３】
前記ナノ繊維が非生分解性ポリマーを含む、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項１４】
前記ナノ繊維が、水溶性ポリマー又は短分子鎖アルコール可溶性ポリマーを含む、請求項１３に記載の細胞培養製品。
【請求項１５】
前記ナノ繊維が架橋剤を含む、請求項１４に記載の細胞培養製品。
【請求項１６】
前記ナノ繊維が、ＵＶ処理、加熱、又はその組み合わせにより、前記架橋剤を活性化する段階を含む方法により形成された、請求項１５に記載の細胞培養製品。
【請求項１７】
前記ナノ繊維がポリアミドを含む、請求項１３に記載の細胞培養製品。
【請求項１８】
前記ポリアミドが、ナイロンポリマーから成る群から選択される、請求項１７に記載の細胞培養製品。
【請求項１９】
前記ナノ繊維が、２種又は３種以上のナイロンポリマーのブレンドを含む、請求項１８に記載の細胞培養製品。
【請求項２０】
前記ナノ繊維が、５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の直径を有する、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項２１】
前記ナノフィブリル構造体が前記ナノ繊維のネットワークを含み、当該ネットワークは、約０．２μｍ〜１０μｍの範囲の平均孔サイズを有する、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項２２】
前記ナノフィブリル構造体が、０．１μｍ〜１０μｍの範囲の厚みを有する、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項２３】
前記ナノフィブリル構造体が、１ｍｍ2〜４×１０5ｍｍ2の範囲の面積を有する、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項２４】
前記ナノフィブリル構造体のための支持体をさらに含む、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項２５】
前記支持体が、ハロゲン化した熱可塑性樹脂を含む、請求項２４に記載の細胞培養製品。
【請求項２６】
前記支持体がクロロトリフルオロエチレンを含む、請求項２５に記載の細胞培養製品。
【請求項２７】
前記支持体がガラスを含む、請求項２４に記載の細胞培養製品。
【請求項２８】
前記支持体が透明である、請求項２４に記載の細胞培養製品。
【請求項２９】
前記支持体が可とう性である、請求項２４に記載の細胞培養製品。
【請求項３０】
前記ナノフィブリル構造体が、前記支持体上にナノ繊維を配置し、次いで、配置された前記ナノ繊維及び前記支持体を、熱、蒸気又はその組み合わせを用いて処理することにより形成された、請求項２４に記載の細胞培養製品。
【請求項３１】
細胞培養容器の細胞培養面に配置させるように適合されている、請求項２４に記載の細胞培養製品。
【請求項３２】
前記細胞培養容器が、フラスコ、皿及び複数のウェルのプレートから成る群から選択された、請求項３１に記載の細胞培養製品。
【請求項３３】
基剤と接触している細胞をさらに含む、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項３４】
次の段階を含む細胞培養製品を調製するための方法；
（ａ）ナノ繊維を含むナノフィブリル構造体を得る段階、ここで、当該ナノ繊維の少なくとも一部上に、コーティングを生成させ、当該コーティングは、下記を有するポリマーを含み；
（ｉ）少なくとも１種のペンダント型アミン含有基；及び
（ｉｉ）前記ポリマーを前記ナノ繊維に結合させる、少なくとも１種のペンダント型の潜在性の反応した基：そして
（ｂ）前記ナノフィブリル構造体を、細胞培養容器の細胞培養面上に供給する段階。
【請求項３５】
次の各段階を含む、細胞培養製品を調製するための方法；
（ａ）ナノ繊維を含むナノフィブリル構造体を得る段階；
（ｂ）前記ナノ繊維の少なくとも一部上に、コーティング組成物を配置する段階、当該コーティング組成物は、下記を有するポリマーを含む；
（ｉ）少なくとも１種のペンダント型アミン含有基；及び
（ｉｉ）少なくとも１種のペンダント型潜在性反応性基；そして
（ｃ）前記ペンダント型潜在性反応性基を活性化し、そして潜在性の反応した基を経由して前記ポリマーを前記ナノ繊維に結合させ、それにより前記ナノ繊維上にコーティングを生成させるために、前記コーティング組成物を処理する段階。
【請求項３６】
前記ポリマーが、１０μｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲で、前記コーティング組成物中に存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記潜在性反応性基が光反応性基である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記処理段階が、１９０ｎｍ〜３６０ｎｍの範囲の紫外線を用いて前記光反応性基を照射することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記処理段階が、０．１ｍＷ／ｃｍ2〜２０ｍＷ／ｃｍ2の範囲の紫外線の線量を用いて、前記光反応性基を照射することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
１種又は２種以上の細胞を、ナノ繊維を含むナノフィブリル構造体と接触させて置く段階を含む、当該１種又は２種以上の細胞を培養する方法であって、
前記ナノ繊維は、当該ナノ繊維の少なくとも一部上に生成したコーティングを含み、
前記コーティングは、下記を有するポリマーを含む；
（ｉ）少なくとも１種のペンダント型アミン含有基；及び
（ｉｉ）前記ポリマーを前記ナノ繊維に結合させる、少なくとも１種のペンダント型の潜在性の反応した基。
【請求項４１】
前記細胞の９０％が、コーティングされたナノ繊維に接着される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞が、１４日以上の期間、前記ナノフィブリル構造体と接触して置かれる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類及び昆虫類の細胞から成る群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が体細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記体細胞が幹細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記幹細胞が、１時間〜６０日の期間、未分化状態で維持される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
未分化細胞の生存率が、１４日のところで、９０％を超えて減っていない、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
幹細胞を分化させるように誘導する段階をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が神経前駆細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記神経前駆細胞が、当該神経前駆細胞が神経細胞に分化するために十分な期間及び条件の下で前記ナノフィブリル構造体と接触して置かれる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記神経前駆細胞が、当該神経前駆細胞が乏突起神経膠芽細胞に分化するために十分な期間及び条件の下で前記ナノフィブリル構造体と接触して置かれる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記神経前駆細胞が、当該神経前駆細胞が星状細胞に分化するために十分な期間及び条件の下で前記ナノフィブリル構造体と接触して置かれる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記神経前駆細胞の３０％超が、１０日の期間の後に分化させられる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
乏突起神経膠芽細胞、星状細胞及び神経細胞の前駆物質から成る群から選択される細胞を、ナノフィブリル構造体の少なくとも一部に生成させたコーティングを含む当該ナノフィブリル構造体と接触して置く段階を含む、乏突起神経膠芽細胞、星状細胞又は神経細胞を生成するための方法であって、
前記コーティングは、下記を有するポリマーを含み；
（ｉ）少なくとも１種のペンダント型アミン含有基；及び
（ｉｉ）前記ポリマーを基剤に結合させる、少なくとも１種のペンダント型の潜在性の反応した基；
ここで、前記前駆物質は、当該前駆物質がそれぞれ、乏突起神経膠芽細胞、星状細胞又は神経細胞に分化するために十分な期間及び条件の下に置かれる。
【請求項１】
（ａ）ナノ繊維を含むナノフィブリル構造体；並びに
（ｂ）前記ナノ繊維の少なくとも一部上に生成したコーティング、当該コーティングは、下記を含むポリマーを含む；
（ｉ）少なくとも１種のペンダント型アミン含有基；及び
（ｉｉ）前記ポリマーを前記ナノ繊維に結合させる、少なくとも１種のペンダント型の潜在性の反応した基：
を含む細胞培養製品。
【請求項２】
前記ポリマーが非生分解性ポリマーである、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項３】
前記ポリマーが合成ポリマーである、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項４】
前記ペンダント型アミン含有基が、次の式：
−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
（式中、Ｒ1は、下記：
【化１】
を有し、
Ｒ2は、Ｃ1〜Ｃ8の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そして
Ｒ3及びＲ4は、両方とも前記窒素に結合し、そして個々にＨ又はＣ1〜Ｃ6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキルである）
を有する、請求項３に記載の細胞培養製品。
【請求項５】
前記ペンダント型アミン含有基が、次の式：
−Ｒ1Ｒ2ＮＲ3Ｒ4
を有し、Ｒ1は、下記：
【化２】
であり、Ｒ2は、Ｃ2〜Ｃ4の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり；そしてＲ3及びＲ4は、両方とも前記窒素に結合し、そしてそれぞれ、Ｈ、ＣＨ3又はＣ2Ｈ5である、請求項４に記載の細胞培養製品。
【請求項６】
前記ポリマーが、３−アミノプロピルメタクリルアミド、３−アミノエチルメタクリルアミド及びジメチルアミノプロピルメタクリルアミドから成る群から選択される１種又は２種以上のモノマーを含む、請求項５に記載の細胞培養製品。
【請求項７】
前記ポリマーが、３−アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ）を含む、請求項６に記載の細胞培養製品。
【請求項８】
前記ペンダント型アミン含有基が、前記ポリマーの総モノマーユニットに基づいて、前記ポリマーの５０％以上のモル濃度量で存在する、請求項４に記載の細胞培養製品。
【請求項９】
前記ペンダント型の潜在性の反応した基が、光反応した基を含む、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項１０】
前記光反応した基が、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様複素環並びにそれらの置換された誘導体から成る群から選択される、請求項９に記載の細胞培養製品。
【請求項１１】
前記光反応した基が、前記ポリマー中の総モノマーユニットに基づいて、０．１％〜１０％の範囲のモル濃度量で存在する、請求項１０に記載の細胞培養製品。
【請求項１２】
前記合成ポリマーが、２０ｋＤａ〜２０００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項３に記載の細胞培養製品。
【請求項１３】
前記ナノ繊維が非生分解性ポリマーを含む、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項１４】
前記ナノ繊維が、水溶性ポリマー又は短分子鎖アルコール可溶性ポリマーを含む、請求項１３に記載の細胞培養製品。
【請求項１５】
前記ナノ繊維が架橋剤を含む、請求項１４に記載の細胞培養製品。
【請求項１６】
前記ナノ繊維が、ＵＶ処理、加熱、又はその組み合わせにより、前記架橋剤を活性化する段階を含む方法により形成された、請求項１５に記載の細胞培養製品。
【請求項１７】
前記ナノ繊維がポリアミドを含む、請求項１３に記載の細胞培養製品。
【請求項１８】
前記ポリアミドが、ナイロンポリマーから成る群から選択される、請求項１７に記載の細胞培養製品。
【請求項１９】
前記ナノ繊維が、２種又は３種以上のナイロンポリマーのブレンドを含む、請求項１８に記載の細胞培養製品。
【請求項２０】
前記ナノ繊維が、５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の直径を有する、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項２１】
前記ナノフィブリル構造体が前記ナノ繊維のネットワークを含み、当該ネットワークは、約０．２μｍ〜１０μｍの範囲の平均孔サイズを有する、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項２２】
前記ナノフィブリル構造体が、０．１μｍ〜１０μｍの範囲の厚みを有する、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項２３】
前記ナノフィブリル構造体が、１ｍｍ2〜４×１０5ｍｍ2の範囲の面積を有する、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項２４】
前記ナノフィブリル構造体のための支持体をさらに含む、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項２５】
前記支持体が、ハロゲン化した熱可塑性樹脂を含む、請求項２４に記載の細胞培養製品。
【請求項２６】
前記支持体がクロロトリフルオロエチレンを含む、請求項２５に記載の細胞培養製品。
【請求項２７】
前記支持体がガラスを含む、請求項２４に記載の細胞培養製品。
【請求項２８】
前記支持体が透明である、請求項２４に記載の細胞培養製品。
【請求項２９】
前記支持体が可とう性である、請求項２４に記載の細胞培養製品。
【請求項３０】
前記ナノフィブリル構造体が、前記支持体上にナノ繊維を配置し、次いで、配置された前記ナノ繊維及び前記支持体を、熱、蒸気又はその組み合わせを用いて処理することにより形成された、請求項２４に記載の細胞培養製品。
【請求項３１】
細胞培養容器の細胞培養面に配置させるように適合されている、請求項２４に記載の細胞培養製品。
【請求項３２】
前記細胞培養容器が、フラスコ、皿及び複数のウェルのプレートから成る群から選択された、請求項３１に記載の細胞培養製品。
【請求項３３】
基剤と接触している細胞をさらに含む、請求項１に記載の細胞培養製品。
【請求項３４】
次の段階を含む細胞培養製品を調製するための方法；
（ａ）ナノ繊維を含むナノフィブリル構造体を得る段階、ここで、当該ナノ繊維の少なくとも一部上に、コーティングを生成させ、当該コーティングは、下記を有するポリマーを含み；
（ｉ）少なくとも１種のペンダント型アミン含有基；及び
（ｉｉ）前記ポリマーを前記ナノ繊維に結合させる、少なくとも１種のペンダント型の潜在性の反応した基：そして
（ｂ）前記ナノフィブリル構造体を、細胞培養容器の細胞培養面上に供給する段階。
【請求項３５】
次の各段階を含む、細胞培養製品を調製するための方法；
（ａ）ナノ繊維を含むナノフィブリル構造体を得る段階；
（ｂ）前記ナノ繊維の少なくとも一部上に、コーティング組成物を配置する段階、当該コーティング組成物は、下記を有するポリマーを含む；
（ｉ）少なくとも１種のペンダント型アミン含有基；及び
（ｉｉ）少なくとも１種のペンダント型潜在性反応性基；そして
（ｃ）前記ペンダント型潜在性反応性基を活性化し、そして潜在性の反応した基を経由して前記ポリマーを前記ナノ繊維に結合させ、それにより前記ナノ繊維上にコーティングを生成させるために、前記コーティング組成物を処理する段階。
【請求項３６】
前記ポリマーが、１０μｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲で、前記コーティング組成物中に存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記潜在性反応性基が光反応性基である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記処理段階が、１９０ｎｍ〜３６０ｎｍの範囲の紫外線を用いて前記光反応性基を照射することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記処理段階が、０．１ｍＷ／ｃｍ2〜２０ｍＷ／ｃｍ2の範囲の紫外線の線量を用いて、前記光反応性基を照射することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
１種又は２種以上の細胞を、ナノ繊維を含むナノフィブリル構造体と接触させて置く段階を含む、当該１種又は２種以上の細胞を培養する方法であって、
前記ナノ繊維は、当該ナノ繊維の少なくとも一部上に生成したコーティングを含み、
前記コーティングは、下記を有するポリマーを含む；
（ｉ）少なくとも１種のペンダント型アミン含有基；及び
（ｉｉ）前記ポリマーを前記ナノ繊維に結合させる、少なくとも１種のペンダント型の潜在性の反応した基。
【請求項４１】
前記細胞の９０％が、コーティングされたナノ繊維に接着される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞が、１４日以上の期間、前記ナノフィブリル構造体と接触して置かれる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類及び昆虫類の細胞から成る群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が体細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記体細胞が幹細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記幹細胞が、１時間〜６０日の期間、未分化状態で維持される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
未分化細胞の生存率が、１４日のところで、９０％を超えて減っていない、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
幹細胞を分化させるように誘導する段階をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が神経前駆細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記神経前駆細胞が、当該神経前駆細胞が神経細胞に分化するために十分な期間及び条件の下で前記ナノフィブリル構造体と接触して置かれる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記神経前駆細胞が、当該神経前駆細胞が乏突起神経膠芽細胞に分化するために十分な期間及び条件の下で前記ナノフィブリル構造体と接触して置かれる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記神経前駆細胞が、当該神経前駆細胞が星状細胞に分化するために十分な期間及び条件の下で前記ナノフィブリル構造体と接触して置かれる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記神経前駆細胞の３０％超が、１０日の期間の後に分化させられる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
乏突起神経膠芽細胞、星状細胞及び神経細胞の前駆物質から成る群から選択される細胞を、ナノフィブリル構造体の少なくとも一部に生成させたコーティングを含む当該ナノフィブリル構造体と接触して置く段階を含む、乏突起神経膠芽細胞、星状細胞又は神経細胞を生成するための方法であって、
前記コーティングは、下記を有するポリマーを含み；
（ｉ）少なくとも１種のペンダント型アミン含有基；及び
（ｉｉ）前記ポリマーを基剤に結合させる、少なくとも１種のペンダント型の潜在性の反応した基；
ここで、前記前駆物質は、当該前駆物質がそれぞれ、乏突起神経膠芽細胞、星状細胞又は神経細胞に分化するために十分な期間及び条件の下に置かれる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００９−５０２２４２（Ｐ２００９−５０２２４２Ａ）
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２２９７１（Ｐ２００８−５２２９７１）
【出願日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２８２５２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１２０５０
【国際公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【出願人】（５０６１１２６８３）サーモディクス，インコーポレイティド (50)
【出願人】（５０８０１９５２８）ドナルドソン カンパニー，インコーポレイティド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２８２５２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１２０５０
【国際公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【出願人】（５０６１１２６８３）サーモディクス，インコーポレイティド (50)
【出願人】（５０８０１９５２８）ドナルドソン カンパニー，インコーポレイティド (1)
【Ｆターム（参考）】
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