ポリマーナノ微粒子及び光分子イメージング用造影剤
【課題】ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）効率と分散性に優れたポリマーナノ微粒子及びそれを用いた光分子イメージング用造影剤を提供すること。
【解決手段】蛍光性ポリマーのマトリックス中に蛍光色素が分散したポリマーナノ微粒子であって、該微粒子表面が界面活性剤で保護され、前記蛍光性ポリマーと前記蛍光色素間のＦＲＥＴで蛍光を発光することを特徴とするポリマーナノ微粒子及び前記ポリマーナノ微粒子を用いた光分子イメージング用造影剤。
【解決手段】蛍光性ポリマーのマトリックス中に蛍光色素が分散したポリマーナノ微粒子であって、該微粒子表面が界面活性剤で保護され、前記蛍光性ポリマーと前記蛍光色素間のＦＲＥＴで蛍光を発光することを特徴とするポリマーナノ微粒子及び前記ポリマーナノ微粒子を用いた光分子イメージング用造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動で蛍光を発光するポリマーナノ微粒子、及び、前記ポリマーナノ微粒子を用いた光分子イメージング用造影剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な産業分野への応用を指向して、ポリマーナノ微粒子に関する研究開発が盛んに行われており、中でも医薬、診断薬等、医療・診断分野への応用が加速している。特に最近では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、以降「ＦＲＥＴ」と記載する）を利用したポリマーナノ微粒子が光分子イメージング用造影剤として注目されつつある。
【０００３】
ＦＲＥＴで蛍光を発光するポリマーナノ微粒子として、非特許文献１には、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で表面保護されたポリフルオレンナノ微粒子の表面に、カチオン性蛍光色素を静電的に吸着させて固定化したポリマーナノ微粒子に関する技術が開示されている。そこでは、ポリフルオレン（ＰＦ２/６）を光励起することによって、ＦＲＥＴでカチオン性蛍光色素（ローダミン６Ｇ）から蛍光が発光すると報告されている。
【０００４】
一方、非特許文献２には、２種類の異なるポリマーから成るポリマーブレンドナノ微粒子を得る技術が開示されている。具体的には、２種類の異なる蛍光性ポリマー（ＰＦ２/６、ｍ−ＬＰＰＰ）を溶解したクロロホルムをＳＤＳ水溶液と混合した後、超音波照射によって形成したエマルジョンを加温してクロロホルムを除去することにより得られることが開示されている。そこでは、ＰＦ２/６を光励起することによって、ＦＲＥＴでｍ−ＬＰＰＰから蛍光が発光すると報告されている。
【０００５】
更に、非特許文献３には、蛍光性ポリマーのマトリックス中に蛍光色素が分散したポリマーナノ微粒子を得る技術が開示されている。具体的には、まず、蛍光性ポリマー（ＰＤＨＦ）と蛍光色素（クマリン６）を溶解したＴＨＦ（テトラヒドロフラン）溶液を脱塩水中に超音波照射しながら注入する。続いて、得られたサスペンションを０．２μｍのメンブランフィルターに通した後、ＴＨＦを減圧留去することで得ることが出来る。そこでは、ＰＤＨＦを光励起することによって、ＦＲＥＴでクマリン６から蛍光が発光すると報告されている。
【０００６】
特許文献１では、スルホン酸（又はカルボン酸）表面のポリスチレンラテックス粒子をＴＨＦ（又はＤＭＦ）で膨潤し、１種類又は複数の有機色素を取込ませることで、当該粒子中に有機色素が分散したポリマーナノ微粒子を得る技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５７６３１８９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】"Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．"、２００６，２７，２００から２０２頁
【非特許文献２】"Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ"，２００３，２，４０８から４１２頁
【非特許文献３】"Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃ，２００８、１１２，１７７２から１７８１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
非特許文献１において、ポリフルオレン（ＰＦ２/６）を光励起することによって、ＦＲＥＴでカチオン性蛍光色素（ローダミン６Ｇ）から蛍光が発光すると報告されているが、そのＦＲＥＴ効率は高くない。
【００１０】
また、非特許文献１のポリマーナノ微粒子では、微粒子表面に静電吸着させたカチオン性蛍光色素は、生理食塩水のような塩を含有する水溶液中において脱着する恐れがあり、その結果、ＦＲＥＴ効率の低下を招く恐れが考えられる。
【００１１】
一方、非特許文献２においては、ＰＦ２/６を光励起することによって、ＦＲＥＴでｍ−ＬＰＰＰから蛍光が発光すると報告されているが、ＦＲＥＴ効率に関する明確な記載はなされていない。
【００１２】
また、非特許文献２のポリマーナノ微粒子では、微粒子内に２種類の異なる蛍光性ポリマーを内包しているが、このように異なるポリマーを使用する場合、相溶性の問題、即ち、相分離の可能性があり、その結果、ＦＲＥＴ効率の低下を招く恐れが考えられる。
【００１３】
一方、非特許文献３においては、微粒子表面が界面活性剤で保護されていないことから、生理食塩水のような塩を含有する水溶液中において、ポリマーナノ微粒子の凝集が懸念される。
【００１４】
一方、特許文献１においては、微粒子内にドナー色素、アクセプター色素を仕込み比通りに内包させることは困難であり、色素の仕込み比にバラツキが生じ易く、ＦＲＥＴ効率の低下や蛍光強度の低下を招く恐れが考えられる。
【００１５】
本発明は、このような背景技術に鑑みてなされたものであり、ＦＲＥＴ効率が優れ、且つ分散性に優れたポリマーナノ微粒子を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明のポリマーナノ微粒子は、蛍光性ポリマーのマトリックス中に蛍光色素が分散したポリマーナノ微粒子であって、該微粒子表面が界面活性剤で保護され、前記蛍光性ポリマーと前記蛍光色素間のＦＲＥＴで蛍光を発光することを特徴とする。
【００１７】
また、別の本発明のポリマーナノ微粒子は、ポリマーのマトリックス中に２種類の異なる蛍光色素が分散したポリマーナノ微粒子であって、該微粒子表面が界面活性剤で保護され、前記２種類の異なる蛍光色素間のＦＲＥＴで蛍光を発光することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、蛍光性ポリマーのマトリックス中に蛍光色素が分散した構造を有することから、従来技術に比べてＦＲＥＴ効率の優れたポリマーナノ微粒子を提供することができる。
【００１９】
また、別の本発明によれば、ポリマーのマトリックス中に２種類の異なる蛍光色素が分散した構造を有することから、従来技術に比べてＦＲＥＴ効率の優れたポリマーナノ微粒子を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】第一の本発明に係るポリマーナノ微粒子の構造を示す概略図である。
【図２】第二の本発明に係るポリマーナノ微粒子の構造を示す概略図である。
【図３】第一の本発明に係るポリマーナノ微粒子を製造する工程の一例を示す図である。
【図４】第二の本発明に係るポリマーナノ微粒子を製造する工程の一例を示す図である。
【図５】実施例１におけるポリマーナノ微粒子１のＦＲＥＴ特性を示すグラフである。
【図６】実施例２におけるポリマーナノ微粒子２のＦＲＥＴ特性を示すグラフである。
【図７】実施例８におけるポリマーナノ微粒子８のＦＲＥＴ特性を示すグラフである。
【図８】実施例１２におけるポリマーナノ微粒子１２のＦＲＥＴ特性を示すグラフである。
【図９】実施例１８におけるポリマーナノ微粒子１８のＦＲＥＴ特性を示すグラフである。
【図１０】実施例１９におけるポリマーナノ微粒子１９のＴＥＭ写真である。
【図１１】実施例３７におけるポリマーナノ微粒子３７の蛍光像である。
【図１２】実施例３７におけるＱＤ５６５の蛍光像である。
【図１３】実施例３７におけるポリマーナノ微粒子３７とＱＤ５６５の輝度ヒストグラムである。
【図１４】実施例３８におけるポリマーナノ微粒子３８のＴＥＭ写真である。
【図１５】実施例３８におけるポリマーナノ微粒子３８の蛍光像である。
【図１６】実施例３８におけるＱＤ５６５の蛍光像である。
【図１７】実施例３８におけるポリマーナノ微粒子３８とＱＤ５６５の輝度ヒストグラムである。
【図１８】塩化ナトリウム水溶液中におけるポリマーナノ微粒子３９、４０、４１の粒径分布を示すグラフである。
【図１９】ＰＢＳおよびＦＢＳ中におけるポリマーナノ微粒子１８の粒径分布を示すグラフである。
【図２０】ＰＢＳおよびＦＢＳ中におけるポリマーナノ微粒子４０の粒径分布を示すグラフである。
【図２１】ＰＢＳおよびＦＢＳ中におけるポリマーナノ微粒子４１の粒径分布を示すグラフである。
【図２２】実施例４０におけるポリマーナノ微粒子４２のＴＥＭ写真である。
【図２３】実施例４０におけるポリマーナノ微粒子４２のＦＲＥＴ特性を示すグラフである。
【図２４】実施例４０におけるポリマーナノ微粒子４２の蛍光像である。
【図２５】実施例４０におけるＱＤ８００の蛍光像である。
【図２６】実施例４０におけるポリマーナノ微粒子４２とＱＤ８００の輝度ヒストグラムである。
【図２７】ＰＢＳおよびＦＢＳ中におけるポリマーナノ微粒子４３の粒径分布を示すグラフである。
【図２８】実施例４０におけるポリマーナノ微粒子４２を投与したヌードマウスの蛍光像である。
【図２９】特許文献１に開示の方法に従って合成したポリマーナノ微粒子の規格化した蛍光スペクトルを示すグラフである。
【図３０】ポリマーナノ微粒子４９、５０の蛍光強度を比較したグラフである。
【図３１】実施例１８におけるポリマーナノ微粒子１８を投与したヌードマウスの蛍光像である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２２】
（ポリマーナノ微粒子）
第一の本発明は、図１に示すように蛍光性ポリマー２のマトリックス中に蛍光色素（アクセプター）３が分散したポリマーナノ微粒子１であり、界面活性剤４がポリマーナノ微粒子１の表面に存在する。
【００２３】
また、第二の本発明は、図２に示すように、ポリマー６のマトリックス中に２種類の異なる蛍光色素３及び５が分散したポリマーナノ微粒子１０であり、界面活性剤４がポリマーナノ微粒子１０の表面に存在する。
【００２４】
また、本発明のポリマーナノ微粒子の好ましい態様の一つは、６００ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下の近赤外波長域に蛍光発光を有する蛍光色素と蛍光性ポリマーの組合せからなるＦＲＥＴによって、生体透過性の優れた蛍光を発光することを特徴とする。
【００２５】
また、別の本発明のポリマーナノ微粒子の好ましい態様の一つは、６００ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下の近赤外波長域に蛍光発光を有する２種類の異なる蛍光色素（ドナー、アクセプター）の組合せからなるＦＲＥＴによって、生体透過性の優れた蛍光を発光することを特徴とする。
【００２６】
また、本発明のポリマーナノ微粒子は、該微粒子表面が界面活性剤で保護されていることから、生理食塩水のような塩を含む水溶液中においても優れた分散性を有することを特徴とする。
【００２７】
ポリマーナノ微粒子は、蛍光性ポリマーと蛍光色素と界面活性剤とを有する。該蛍光色素は蛍光性ポリマーのマトリックス中に分散しており、該界面活性剤はポリマーナノ微粒子表面に存在する。
【００２８】
本発明のポリマーナノ微粒子は、目的とする用途に対して平均粒径を制御することが可能であり、その平均粒径は１０ｎｍ以上、２００ｎｍ以下であることを特徴とする。
【００２９】
（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ；蛍光共鳴エネルギー移動）とは、ドナーとなる蛍光分子の蛍光スペクトルとアクセプターとなる蛍光分子の吸収スペクトルに重なりを有する２種類の蛍光分子が、１から１０ｎｍ以内に接近している状況下において、励起された蛍光分子(ドナー)の光エネルギーが別の蛍光分子(アクセプター)に移動して励起される現象のことである。ＦＲＥＴの強度は両分子間の距離の６乗に反比例し、距離と共に急速に減少する。２種類の蛍光分子として、蛍光性ポリマーと蛍光色素もしくは、異なる２種類の蛍光色素を用いることができる。
【００３０】
（蛍光性ポリマー）
第一の本発明における蛍光性ポリマーとは、励起光によって励起された後、基底状態に戻る際に蛍光を発光するポリマーであり、また、その蛍光スペクトルが蛍光色素の吸収スペクトルとの重なりを有するポリマーであれば、特に限定されない。蛍光性ポリマーの一部として、以下のような共役ポリマーを挙げることができる。上記共役ポリマーの具体例としては、
化学式１で示されるＦ８ＢＴ：poly[2,1,3-benzothiadiazole-4,7-diyl(9,9-dioctyl-9H-fluorene-2,7-diyl)]、
化学式２で示されるＭＥＨ−ＰＰＶ：poly(2-methoxy-5-(2'-ethyl-hexyloxy)-p-phenylene vinylene)、
化学式３で示されるＰ−１：copoly(2,3-diphenylthieno [3,4-b] pyrazine -alt- 9,9- didecylfluorene)、
化学式４で示されるＰ−２：copoly(thieno [3,4-b] pyrazine -alt- 9,9- didecylfluorene)、
化学式５で示されるＰＦ１１１１２：poly(9,9-bis(3,7,11-trimethyldodecyl) fluorene)、
化学式６で示されるｍ−ＬＰＰＰ：ladder-type poly(para-phenylene)、
化学式７で示されるＰＦＢ：poly(9,9-dioctylfluorene-co- N,N'- bis(4-butylphenyl)-N,N'- diphenyl-1,4-phenylenediamine)、
化学式８で示されるＰＦ２／６：poly[9,9-bis(2-ethylhexyl)fluorene-2,7-diyl]、
化学式９で示されるＡＤＳ１０４ＲＥ：poly[(2-methoxy-5-(3,7-dimethyl-octyloxy)-1,4- phenylenevinylene)end capped with DMP、
化学式１０で示されるＡＤＳ１０６ＲＥ：poly[9,9-di-(2-ethylhexyl)-fluorenyl-2,7-diyl] end capped with 2,5-diphenyl-1,2,4-oxadiazole、
化学式１１で示されるＡＤＳ３００ＲＥ：poly[2,5-bis(3,7-dimethyloctyloxy)-1,4-phenylene- vinylene]、
化学式１２で示されるＡＤＳ１２９ＢＥ：poly(9,9-dioctyfluorenyl-2,7-diyl)end capped with dimethylphenyl、
化学式１３で示されるＣＤＰＤＯＦ：copoly(2,3-diphenylthieno[3,4-b]pyrazine-alt-9,9- dioctylfluorene)、
化学式１４で示されるＣＯＴＴＯＦ：copoly(thienothiadiazole-alt-9,9-ioctylfluorene)（式中、Ｘ：Ｙは１：０〜０．１：１）、
化学式１５で示されるＣＯＢＢＯＦ：copoly(benzobisthiadiazole-alt-9,9-dioctylfluorene) （式中、Ｘ：Ｙは１：０〜０．１：１）等である。但し、本発明における蛍光性ポリマーとは上記に限定されるものではない。
【００３１】
これらの蛍光性ポリマーの平均分子量は２０００〜１００００００であり、好ましくは１００００〜６０００００のものを好適に利用できる。
【００３２】
【化１】
【００３３】
【化２】
【００３４】
【化３】
【００３５】
【化４】
【００３６】
【化５】
【００３７】
【化６】
【００３８】
【化７】
【００３９】
【化８】
【００４０】
【化９】
【００４１】
【化１０】
【００４２】
【化１１】
【００４３】
【化１２】
【００４４】
【化１３】
【００４５】
【化１４】
【００４６】
【化１５】
【００４７】
（蛍光色素）
第一の本発明における蛍光色素とは、その吸収スペクトルが蛍光性ポリマーの蛍光スペクトルと重なりを持つ蛍光色素であれば、特に限定されないが、生体透過性の観点から、６００ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下の近赤外波長域に蛍光発光を有する蛍光色素が好ましい。
【００４８】
第二の本発明における２種類の異なる蛍光色素は、一方の蛍光色素の吸収スペクトルが他方の蛍光色素の蛍光スペクトルと重なりを持つ蛍光色素、即ち、ドナー、アクセプターの蛍光色素の組合せであれば、特に限定されない。ただし、生体透過性の観点から、６００ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下の近赤外波長域に蛍光発光を有する蛍光色素が好ましい。なお、第二の本発明に係るポリマーナノ微粒子は、3種類以上の異なる蛍光色素を含んでいてもよい。
【００４９】
これらの蛍光色素として、以下のような色素を挙げることができる。
化学式１６で示されるＤｉＤ：1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine perchlorate、化学式１７で示されるＤｉＲ：1;1'-Dioctadecyl-3;3;3';3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide、ＤｉＩ：1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate、ＩＣＧ（インドシアニングリーン）等のシアニン系蛍光色素、化学式１８で示されるＳｉＰｃＴＨＳＯ：silicon phthalocycanine bis(trihexyl-silyloxide)、silicon 2,3,9,10,16,17,23,24- octakis (octyloxy) -29H,31H-phthalocycanine dihydroxide、silicon 2,9,16,23-tetra-tert- butyl-29H,31H- phthalocycanine dihydroxide、化学式１９で示されるβ tetra (neopentyloxy) -29H, 31H- phthalocycanine、2,3,9,10,16,17,23,24-octa(4-tert-butylphenoxy) -29H,31H- phthalocycanine、β tetra (thiobuthoxy)-29H, 31H- phthalocycanine、1,4,8,11,15,18,22,25 octa ethoxy-zinc phthalocycanine等のフタロシアニン系蛍光色素、化学式２０で示されるsilicon 2,3-naphthalocyanine dioctyloxide、silicon 2,3- naphthalocyanine dihydroxide、silicon 2,3-naphthalocyanine bis(trihexylsilyloxide)等のナフタロシアニン系蛍光色素、hexapropyl -3,6-diphenyl tetraazaporphyrin、5,10,15,20-Tetraphenyl-22H, 24H-prophyrin等のポルフィリン系蛍光色素、β tetra(tert-buthyl)- tetra pyrazino porphyrazin等のポルフィラジン系蛍光色素、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＸ、テトラメチルロ−ダミン等のキサンテン系蛍光色素、メチレンブルー等のチアジン系蛍光色素、クマリン６等のクマリン系蛍光色素、オキサジン系蛍光色素、ポリメチン系蛍光色素、ポリフェニル系蛍光色素、スチルベン系蛍光色素、オキサゾール系蛍光色素、オキサジアゾール系蛍光色素、ペリレン系蛍光色素、アクリジン系蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ系蛍光色素等の蛍光色素である。但し、本発明における蛍光色素とは上記に限定されるものではない。
【００５０】
【化１６】
【００５１】
【化１７】
【００５２】
【化１８】
【００５３】
【化１９】
【００５４】
【化２０】
【００５５】
（ポリマー）
第二の本発明におけるポリマーは、後述する有機溶媒に溶解するポリマーであれば、特に限定されないが、例えば、ＰＳ：Polystyrene（ポリスチレン）、ＰＭＭＡ（Poly(methyl methacrylate)：ポリメタクリル酸メチル）、ＰＢＭＡ（Poly(butyl methacrylate)：ポリメタクリル酸ブチル）、Ｐ（ＢＭＡ−ｃｏ−ＭＭＡ）（Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)：ポリ（メタクリル酸ブチル−メタクリル酸メチル）共重合体）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルソエステル、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリ酸無水物、デキストラン誘導体、セルロース誘導体等のポリマーを挙げることができる。
【００５６】
（ポリマーナノ微粒子の製造方法）
第一の本発明におけるポリマーナノ微粒子の製造方法について説明する。
【００５７】
第一の本発明におけるポリマーナノ微粒子の製造方法は、
蛍光性ポリマーと蛍光色素を含有する第一液体を、界面活性剤を含有する第二液体に加えて混合液を得る工程と、前記混合液からエマルジョンを得る工程と、前記エマルジョンの分散質から前記第一液体を留去する工程と、を有する。即ち、本発明のポリマーナノ微粒子を得る方法としては、ミニエマルジョン法を挙げることができるが、上記に限定されるものではない。
【００５８】
次に第二の発明におけるポリマーナノ微粒子の製造方法について説明する。
【００５９】
第二の本発明におけるポリマーナノ微粒子の製造方法は、
２種類の異なる蛍光色素及びポリマーを含有する第一液体を、界面活性剤を含有する第二液体に加えて混合液を得る工程と、前記混合液からエマルジョンを得る工程と、前記エマルジョンの分散質から前記第一液体を留去する工程と、を有する。即ち、本発明のポリマーナノ微粒子を得る方法としては、ミニエマルジョン法を挙げることができるが、上記に限定されるものではない。
【００６０】
（第一液体）
第一液体とは有機溶媒であり、水への溶解性がないか又は溶解性が小さく、且つ前述の蛍光性ポリマー、ポリマー、蛍光色素を溶解する有機溶媒であればいかなる溶媒も適用可能であるが、揮発性の有機溶媒であることが好ましい。
【００６１】
このような有機溶媒の具体例として、次の溶媒が挙げられる。ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタン、クロロホルム、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）、エーテル類（エチルエーテル、イソブチルエーテル等）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、芳香族炭化水素（ベンゼン、トルエン、キシレン等）等。これらを単独で用いても良いし、あるいは２種類以上を適宜の割合で混合して用いることもできる。但し、第一液体である有機溶媒は上記に限定されるものではない。
【００６２】
また、第一液体における蛍光性ポリマーおよび蛍光色素の濃度はこれらが溶解する範囲であれば特に限定されないが、好ましい濃度として例えば、蛍光性ポリマーについては０．５〜１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。また、蛍光色素の好ましい濃度として、例えば０．０００５〜１ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【００６３】
また、第一液体における蛍光性ポリマーと蛍光色素との重量比は、好ましくは、１０００：１〜４：１の範囲である。
【００６４】
また、第一液体におけるポリマーおよび２種類の異なる蛍光色素の濃度はこれらが溶解する範囲であれば特に限定されないが、好ましい濃度として、例えば、ポリマーについては０．５〜１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。また、２種類の異なる蛍光色素の好ましい濃度としては、例えば０．０００５〜５ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【００６５】
また、第一液体におけるポリマーと２種類の異なる蛍光色素の総量との重量比は、好ましくは、１０００：１〜４：１の範囲である。また、第一液体における２種類の異なる蛍光色素のうち、ドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素との重量比が１０００：１〜０．１：１の範囲にあることが好ましい。
【００６６】
（第二液体）
第二液体とは水または水溶液である。第一液体と混合した際にエマルジョンを安定化させることを目的として、第二液体に分散剤として界面活性剤をあらかじめ共存させることが好ましい。ただし、第一、第二液体を混合した分散液に界面活性剤を含ませることができれば、上記の方法に限定されるものではない。
【００６７】
（界面活性剤）
界面活性剤としては、以下の材料を使用することができる。
【００６８】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ８５、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ７６、Ｂｒｉｊ９８、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＴｒｉｔｏｎＸ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ−１０１、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｉｇｅｐｏｌ ＣＯ５３０、Ｉｇｅｐｏｌ ＣＯ６３０、Ｉｇｅｐｏｌ ＣＯ７２０、Ｉｇｅｐｏｌ ＣＯ７３０等が挙げられる。
【００６９】
また、アニオン性界面活性剤としては、例えば、以下のものが挙げられる。ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホネート、デシルベンゼンスルホネート、ウンデシルベンゼンスルホネート、トリデシルベンゼンスルホネート、ノニルベンゼンスルホネート並びにこれらのナトリウム、カリウム、アンモニウム塩等。
【００７０】
また、カチオン性界面活性剤としては、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。このうち好ましくは非イオン性界面活性剤である。
【００７１】
また、第二液体に含まれる界面活性剤の濃度は、第一液体との混合比にも依るが、好ましい濃度として例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【００７２】
（エマルジョン）
エマルジョンとは、本発明の目的を達成可能な範囲において如何なる物性のエマルジョンも含めるものであるが、好ましくは１ピークの粒径分布を有し、且つ、平均粒径が１０ｎｍ以上、２００ｎｍ以下の単分散エマルジョンである。
【００７３】
このようなエマルジョンは従来公知の乳化手法によって調製することが可能である。従来公知の方法とは、例えば、断続振とう法、プロペラ型攪拌機、タービン型攪拌機等のミキサーを利用する攪拌法、コロイドミル法、ホモジナイザー法、超音波照射法等がある。これらの方法は、単独で用いることも、あるいは複数を組み合わせて用いることも可能である。また、エマルジョンは1段階の乳化によって調製しても良いし、多段階の乳化によって調製しても良い。但し、エマルジョンは、本発明の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【００７４】
エマルジョンは、第二液体に第一液体を加えて得られる混合液から調製される水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョンである。ここで、第一液体と第二液体の混合とは、第一液体と第二液体を空間的に隔離せずに互いに接触して存在させることであり、必ずしも互いに混和することを要さない。
【００７５】
混合液における第一液体と第二液体との割合は、水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョンを形成することができれば特に限定はないが、好ましくは、第一液体と第二液体との重量比が、１：２．５〜１：１２．５となる範囲で混合することが好ましい。
【００７６】
（留去）
留去とは、エマルジョンの分散質から第一液体を除去する操作である。即ち、蛍光性ポリマー、ポリマー、蛍光色素、有機溶媒から構成された分散質から有機溶媒を除去することである。
【００７７】
留去は、従来知られる何れの方法でも実施可能であるが、加熱によって除去する方法、あるいはエバポレーター等の減圧装置を利用した方法を挙げることができる。加熱による除去の場合の加熱温度は、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを維持できれば特に限定されないが、好ましい温度は０℃から８０℃の範囲である。但し、留去は、本発明の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【００７８】
第一の本発明におけるポリマーナノ微粒子１を製造する工程の一例を図３に示している。具体的には、以下の（１）から（３）の工程を経てポリマーナノ微粒子の水分散液を得られる。
（１）蛍光性ポリマー２と蛍光色素（アクセプター）３を含有する水に不溶または難溶の有機溶媒７を、界面活性剤４を含有する水溶液８に加えて混合液を得る工程。
（２）前記混合液を乳化することによりＯ／Ｗ型のエマルジョン９を得る工程。
（３）前記エマルジョン９の分散質から有機溶媒を留去する工程。
【００７９】
また、第二の本発明におけるポリマーナノ微粒子１０を製造する工程の一例を図４に示す。具体的には、以下の（１）から（３）の工程を経てポリマーナノ微粒子の水分散液を得られる。
（１）ポリマー６と２種類の異なる蛍光色素３（アクセプター）及び蛍光色素５（ドナー）を含有する水に不溶または難溶の有機溶媒を、界面活性剤４を含有する水溶液８に加えて混合液を得る工程。
（２）前記混合液を乳化することによりＯ／Ｗ型のエマルジョン１１を得る工程。
（３）前記エマルジョン１１の分散質から有機溶媒を留去する工程。
【００８０】
（光分子イメージング用造影剤）
本発明におけるポリマーナノ微粒子は、微粒子内での蛍光性ポリマーと蛍光色素間のＦＲＥＴ、又は微粒子内での２種類の異なる蛍光色素間のＦＲＥＴを利用して、光分子イメージング用造影剤として応用することができる。
【００８１】
また、本発明におけるポリマーナノ微粒子は、６００ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下の近赤外波長域に蛍光発光を有する蛍光色素と蛍光性ポリマーの組合せからなるＦＲＥＴによって、生体透過性の優れた蛍光を発光することから、光分子イメージング用造影剤として好適である。
【００８２】
また、本発明におけるポリマーナノ微粒子は、６００ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下の近赤外波長域に蛍光発光を有する２種類の異なる蛍光色素の組合せからなるＦＲＥＴによって、生体透過性の優れた蛍光を発光することから、光分子イメージング用造影剤として好適である。
【００８３】
本発明における光分子イメージング用造影剤は、EPR(Enhanced Permeability and Retention：増強されたパーミアビリティーおよび保持）効果を利用して腫瘍部位にポリマーナノ微粒子を送達させることができる。腫瘍部位に到達した後、ポリマーナノ微粒子を光励起して、ＦＲＥＴに伴う蛍光発光を検出することによって腫瘍部位を可視化することができる。
【００８４】
本発明のポリマーナノ微粒子は表面が界面活性剤で保護されていることから、光分子イメージング用造影剤として使用する際も、ポリマーナノ微粒子は水に分散させたものを好適に用いることができる。
【実施例】
【００８５】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有するポリマーナノ微粒子が得られる範囲で自由に変えることができる。
【００８６】
まず、第一の本発明に関して詳細を説明する。
【００８７】
＜実施例１＞
（ポリマーナノ微粒子１の合成）
前記化学式１で示されるＦ８ＢＴ（０．４ｍｇ、平均分子量１０，０００〜３０，０００、ＡＤＳ製）と前記化学式１６で示されるＤｉＤ（０.０８７ｍｇ、Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ製）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【００８８】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＣＩ製）を溶解した水溶液（１重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した。その後、超音波分散機（Ｍｉｓｏｎｉｘ，Ｉｎｃ製、Ｍｉｃｒｏｓｏｎ ＸＬ２０００）で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【００８９】
次に、前記エマルジョンを４０℃で１時間加熱し、分散質からクロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＦ８ＢＴ中にＤｉＤが分散したポリマーナノ微粒子１の水分散液を得た。
【００９０】
得られたポリマーナノ微粒子１の粒径を動的光散乱解析装置（大塚電子製、ＥＬＳ-Ｚ）で分析したところ、平均粒径は８７．４ｎｍであった。
【００９１】
（ＦＲＥＴ特性評価）
蛍光分光測定装置（日立製、Ｆ−４５００）を用いて、前記ポリマーナノ微粒子１の水分散液のＦＲＥＴ特性を評価した。その結果を図５に示した。
【００９２】
ポリマーナノ微粒子１の水分散液に４５０ｎｍの励起光を照射すると、Ｆ８ＢＴの蛍光が大きく減少し、且つ６８０ｎｍのＤｉＤの蛍光発光が見られたことから、Ｆ８ＢＴからＤｉＤへのＦＲＥＴが効率良く起こることが確認された。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【００９３】
＜実施例２＞
（ポリマーナノ微粒子２の合成）
前記化学式２で示されるＭＥＨ−ＰＰＶ（０．４ｍｇ、平均分子量４０，０００〜７０，０００、Ａｌｄｒｉｃｈ製）とＤｉＤ（０．０４ｍｇ）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【００９４】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液（２重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【００９５】
次に、前記エマルジョンを４０℃で１時間加熱し、分散質からクロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＭＥＨ−ＰＰＶマトリックス中にＤｉＤが分散したポリマーナノ微粒子２の水分散液を得た。
【００９６】
得られたポリマーナノ微粒子２の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は１０２．３ｎｍであった。
【００９７】
（ＦＲＥＴ特性評価）
蛍光分光測定装置を用いて、前記ポリマーナノ微粒子２の水分散液のＦＲＥＴ特性を評価した。その結果を図６に示した。
【００９８】
ポリマーナノ微粒子２の水分散液に５００ｎｍの励起光を照射すると、ＭＥＨ−ＰＰＶの蛍光が大きく減少し、且つ６８０ｎｍのＤｉＤの蛍光発光が見られたことから、ＭＥＨ−ＰＰＶからＤｉＤへのＦＲＥＴが効率良く起こることが確認された。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【００９９】
＜実施例３＞
（ポリマーナノ微粒子３の合成）
実施例２のＤｉＤの使用量を０．０４ｍｇから０．００４ｍｇに替えた以外は、実施例２と同様にして、ポリマーナノ微粒子３の水分散液を得た。得られたポリマーナノ微粒子３の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は５９．３ｎｍであった。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１００】
＜実施例４＞
（ポリマーナノ微粒子４の合成）
実施例２のＤｉＤの使用量を０．０４ｍｇから０．０００４ｍｇに替えた以外は、実施例２と同様にして、ポリマーナノ微粒子４の水分散液を得た。得られたポリマーナノ微粒子４の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は９０．１ｎｍであった。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１０１】
＜実施例５＞
（ポリマーナノ微粒子５の合成）
ＭＥＨ−ＰＰＶ（０．４ｍｇ）とＤｉＤ（０．０４６ｍｇ）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１０２】
次に、ＤＴＡＣ（塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ製）を溶解した水溶液（０．７０重量％、２ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とした。この混合液を２時間攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１０３】
次に、前記エマルジョンを６０℃で３０分間加熱し、クロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＤＴＡＣで保護され、且つＭＥＨ−ＰＰＶマトリックス中にＤｉＤが分散したポリマーナノ微粒子５の水分散液を得た。
【０１０４】
得られたポリマーナノ微粒子５の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は４２．０ｎｍであった。また、ＦＲＥＴ特性に関しては、その結果を表１に示した。
【０１０５】
＜実施例６＞
（ポリマーナノ微粒子６の合成）
実施例５のＤｉＤの使用量を０．０４６ｍｇから０．００４６ｍｇに替えた以外は、実施例５と同様にして、ポリマーナノ微粒子６の水分散液を得た。得られたポリマーナノ微粒子６の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は５１．７ｎｍであった。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１０６】
＜実施例７＞
（ポリマーナノ微粒子７の合成）
実施例５のＤｉＤの使用量を０．０４６ｍｇから０．０００４６ｍｇに替えた以外は、実施例５と同様にして、ポリマーナノ微粒子７の水分散液を得た。得られたポリマーナノ微粒子７の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は１９．７ｎｍであった。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１０７】
＜実施例８＞
（ポリマーナノ微粒子８の合成）
前記化学式１で示されるＦ８ＢＴ（０．４ｍｇ）と前記化学式１８で示されるＳｉＰｃＴＨＳＯ（０．０４ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１０８】
次に、ＤＴＡＣを溶解した水溶液（０．７０重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１０９】
次に、前記エマルジョンを６０℃で３０分間加熱し、クロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＤＴＡＣで保護され、且つＦ８ＢＴマトリックス中にＳｉＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子８の水分散液を得た。得られたポリマーナノ微粒子８の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は３４．３ｎｍであった。
【０１１０】
（ＦＲＥＴ特性評価）
蛍光分光測定装置を用いて、前記ポリマーナノ微粒子８の水分散液のＦＲＥＴ特性を評価した。その結果を図７に示した。
【０１１１】
ポリマーナノ微粒子８の水分散液に４５０ｎｍの励起光を照射すると、Ｆ８ＢＴの蛍光が大きく減少し、且つ６６９．８ｎｍのＳｉＰｃＴＨＳＯの蛍光発光が見られたことから、Ｆ８ＢＴからＳｉＰｃＴＨＳＯへのＦＲＥＴが効率良く起こることが確認された。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１１２】
＜実施例９＞
（ポリマーナノ微粒子９の合成）
実施例８のＳｉＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０２ｍｇに替えた以外は、実施例８と同様にして、ポリマーナノ微粒子９の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１１３】
＜実施例１０＞
（ポリマーナノ微粒子１０の合成）
実施例８のＳｉＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０１ｍｇに替えた以外は、実施例８と同様にして、ポリマーナノ微粒子１０の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１１４】
＜実施例１１＞
（ポリマーナノ微粒子１１の合成）
実施例８のＳｉＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．００４ｍｇに替えた以外は、実施例８と同様にして、ポリマーナノ微粒子１１の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１１５】
＜実施例１２＞
（ポリマーナノ微粒子１２の合成）
前記化学式１０で示されるＡＤＳ１０６ＲＥ（０．４ｍｇ、平均分子量５０，０００〜２００，０００、ＡＤＳ製）と化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．０４ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１１６】
【化２１】
【０１１７】
次に、ＤＴＡＣ（塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ製）を溶解した水溶液（０．７０重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とした。この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１１８】
次に、前記エマルジョンを６０℃で３０分間加熱し、クロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＤＴＡＣで保護され、且つＡＤＳ１０６ＲＥマトリックス中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子１２の水分散液を得た。得られたポリマーナノ微粒子１２の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は２５．９ｎｍであった。
【０１１９】
（ＦＲＥＴ特性評価）
蛍光分光測定装置（日立製、Ｆ−４５００）を用いて、前記ポリマーナノ微粒子１２の水分散液のＦＲＥＴ特性を評価した。その結果を図８に示した。
【０１２０】
ポリマーナノ微粒子１２の水分散液に４５０ｎｍの励起光を照射すると、ＡＤＳ１０６ＲＥの蛍光が大きく減少し、且つ７７７．０ｎｍのＳｉＮＰｃＴＨＳＯの蛍光発光が見られた。このことから、ＡＤＳ１０６ＲＥからＳｉＮＰｃＴＨＳＯへのＦＲＥＴが効率良く起こることが確認された。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１２１】
＜実施例１３＞
（ポリマーナノ微粒子１３の合成）
実施例１２のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０３ｍｇに替えた以外は、実施例１２と同様にして、ポリマーナノ微粒子１３の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１２２】
＜実施例１４＞
（ポリマーナノ微粒子１４の合成）
実施例１２のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０２ｍｇに替えた以外は、実施例１２と同様にして、ポリマーナノ微粒子１４の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１２３】
＜実施例１５＞
（ポリマーナノ微粒子１５の合成）
実施例１２のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０１ｍｇに替えた以外は、実施例１２と同様にして、ポリマーナノ微粒子１５の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１２４】
＜実施例１６＞
（ポリマーナノ微粒子１６の合成）
実施例１２のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．００４ｍｇに替えた以外は、実施例１２と同様にして、ポリマーナノ微粒子１６の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１２５】
＜実施例１７＞
（ポリマーナノ微粒子１７の合成）
実施例１２のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．００２ｍｇに替えた以外は、実施例１２と同様にして、ポリマーナノ微粒子１７の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１２６】
＜実施例１８＞
（ポリマーナノ微粒子１８の合成）
前記化学式１３で示されるＣＤＰＤＯＦ（４ｍｇ、平均分子量１８，０００（ＧＰＣ（Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によるポリスチレン換算値）、筆者合成品）と前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．1ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１２７】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液（１重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１２８】
次に、前記エマルジョンを４０℃で１時間加熱し、分散質からクロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＣＤＰＤＯＦ中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子１８の水分散液を得た。得られたポリマーナノ微粒子１８の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は７８．６ｎｍであった。
【０１２９】
（ＦＲＥＴ特性評価）
蛍光分光測定装置（日本分光製、ＦＰ−６６００）を用いて、前記ポリマーナノ微粒子１８の水分散液のＦＲＥＴ特性を評価した。その結果を図９に示した。
【０１３０】
ポリマーナノ微粒子１８の水分散液に６００ｎｍの励起光を照射すると、ＣＤＰＤＯＦの蛍光が大きく減少し、且つ７８０ｎｍのＳｉＮＰｃＴＨＳＯの蛍光発光が見られた。このことから、ＣＤＰＤＯＦからＳｉＮＰｃＴＨＳＯへのＦＲＥＴが効率良く起こることが確認された。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１３１】
（ヌードマウスのｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージング）
前記ポリマーナノ微粒子１８の水分散液を滅菌済みの限外濾過フィルターで２倍に濃縮した。濃縮した水分散液について、滅菌済みのシリンジフィルター（０．２０μｍ径）で処理を行った後、ＰＢＳで２倍に希釈し、ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ、９週齢、メス）の尾静脈から０．２ｍｌ投与した。投与してから１５分、３時間、１日、２日、３日後に蛍光イメージング装置（Ｘｅｎｏｇｅｎ製、ＩＶＩＳ２００）でヌードマウスの蛍光像を撮影した。その結果を図３１に示した。ヌードマウスの体内から強い蛍光が検出され、ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージングできることが確認できた。
【０１３２】
＜実施例１９＞
（ポリマーナノ微粒子１９の合成）
実施例１８のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．１ｍｇから０．０４ｍｇに替えた以外は、実施例１８と同様にして、ポリマーナノ微粒子１９の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。また、ポリマーナノ微粒子１９のＴＥＭ写真を図１０に示した。
【０１３３】
＜実施例２０＞
（ポリマーナノ微粒子２０の合成）
実施例１８のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．１ｍｇから０．１７ｍｇに替えた以外は、実施例１８と同様にして、ポリマーナノ微粒子２０の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１３４】
＜実施例２１＞
（ポリマーナノ微粒子２１の合成）
実施例１８のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．１ｍｇから０．３ｍｇに替えた以外は、実施例１８と同様にして、ポリマーナノ微粒子２１の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１３５】
＜実施例２２＞
（ポリマーナノ微粒子２２の合成）
実施例１９のＣＤＰＤＯＦの使用量を４ｍｇから０．４ｍｇに替えた以外は、実施例１９と同様にして、ポリマーナノ微粒子２２の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１３６】
＜実施例２３＞
（ポリマーナノ微粒子２３の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０１ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子２３の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１３７】
＜実施例２４＞
（ポリマーナノ微粒子２４の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０１３ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子２４の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１３８】
＜実施例２５＞
（ポリマーナノ微粒子２５の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０１7ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子２５の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１３９】
＜実施例２６＞
（ポリマーナノ微粒子２６の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０２ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子２６の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４０】
＜実施例２７＞
（ポリマーナノ微粒子２７の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０３ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子２７の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４１】
＜実施例２８＞
（ポリマーナノ微粒子２８の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０５４ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子２８の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４２】
＜実施例２９＞
（ポリマーナノ微粒子２９の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０８ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子２９の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４３】
＜実施例３０＞
（ポリマーナノ微粒子３０の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．２ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子３０の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４４】
＜実施例３１＞
（ポリマーナノ微粒子３１の合成）
前記化学式１３で示されるＣＤＰＤＯＦ（０．４ｍｇ、筆者合成品）と前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．００４ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１４５】
次に、ＤＴＡＣ（塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ製）を溶解した水溶液（０．７０重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とした。この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルションを調製した。
【０１４６】
次に、前記エマルションを６０℃で３０分間加熱し、クロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＤＴＡＣで保護され、且つＣＤＰＤＯＦマトリックス中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子３１の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４７】
＜実施例３２＞
（ポリマーナノ微粒子３２の合成）
実施例３１のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．００４ｍｇから０．０１ｍｇに替えた以外は、実施例３１と同様にして、ポリマーナノ微粒子３２の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４８】
＜実施例３３＞
（ポリマーナノ微粒子３３の合成）
実施例３１のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．００４ｍｇから０．０３ｍｇに替えた以外は、実施例３１と同様にして、ポリマーナノ微粒子３３の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４９】
＜実施例３４＞
（ポリマーナノ微粒子３４の合成）
前記化学式１０で示されるＡＤＳ１０６ＲＥ（０．４ｍｇ）と前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．０３ｍｇ）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１５０】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液（１重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１５１】
次に、前記エマルジョンを４０℃で１時間加熱し、分散質からクロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＡＤＳ１０６ＲＥ中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子３４の水分散液を得た。
【０１５２】
得られたポリマーナノ微粒子３４の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は７３．１ｎｍであった。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１５３】
＜実施例３５＞
（ポリマーナノ微粒子３５の合成）
実施例３４のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０３ｍｇから０．０１ｍｇに替えた以外は、実施例３４と同様にして、ポリマーナノ微粒子３５の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１５４】
＜実施例３６＞
（ポリマーナノ微粒子３６の合成）
実施例３４のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０３ｍｇから０．０２ｍｇに替えた以外は、実施例３４と同様にして、ポリマーナノ微粒子３６の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１５５】
＜比較例１＞
非特許文献１で得られた微粒子を比較例１とし、実施例１から３６で得られたポリマーナノ微粒子１から３６、及び比較例１の微粒子のＦＲＥＴ効率を比較した。その結果を表１にまとめて示した。
【０１５６】
表１の結果から、本発明のポリマーナノ微粒子１〜３６（ポリマーナノ微粒子２３、及び３１〜３３は除く）のＦＲＥＴ効率が比較例１（非特許文献１）よりも優れていることが確認された。
【０１５７】
【表１−１】
【０１５８】
【表１−２】
【０１５９】
＜実施例３７＞
（ポリマーナノ微粒子３７とＱＤ（量子ドット）の輝度比較）
本発明のポリマーナノ微粒子３７、及びＱＤを用いて輝度比較を行った。評価に用いたポリマーナノ微粒子３７は、以下の合成例に従って合成した。また、ＱＤとして、ＱＤ５６５（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【０１６０】
（ポリマーナノ微粒子３７の合成例）
前記化学式１で示されるＦ８ＢＴ（４ｍｇ）と前記化学式１８で示されるＳｉＰｃＴＨＳＯ（０．０４ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１６１】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液（１重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１６２】
次に、前記エマルジョンを４０℃で１時間加熱し、クロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＦ８ＢＴマトリックス中にＳｉＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子３７の水分散液を得た。
【０１６３】
（輝度比較）
ポリマーナノ微粒子３７及びＱＤ５６５を同一ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）ｆｉｌｍ内に分散させ、蛍光顕微鏡により観察した。その際、観察にはそれぞれの粒子しか観察できないフィルターを用い同一箇所で、別々に蛍光像を取得した。その結果を図１１、図１２に示した。
【０１６４】
また、ポリマーナノ微粒子３７及びＱＤ５６５の輝度分布をヒストグラム化し、比較した結果を図１３に示した。以上の結果から、ポリマーナノ微粒子３７がＱＤ５６５よりも大きな輝度を示すことが確認できた。
【０１６５】
＜実施例３８＞
（ポリマーナノ微粒子３８とＱＤの輝度比較）
本発明のポリマーナノ微粒子３８、及びＱＤを用いて輝度比較を行った。評価に用いたポリマーナノ微粒子３８は、以下の合成例に従って合成した。また、ＱＤとして、実施例３７と同様にＱＤ５６５を使用した。
【０１６６】
（ポリマーナノ微粒子３８の合成例）
前記化学式１０で示されるＡＤＳ１０６ＲＥ（４ｍｇ）と前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．０４ｍｇ）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１６７】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液（１重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１６８】
次に、前記エマルジョンを４０℃で１時間加熱し、分散質からクロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＡＤＳ１０６ＲＥ中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子３８の水分散液を得た。また、ポリマーナノ微粒子３８のＴＥＭ写真を図１４に示した。
【０１６９】
（輝度比較）
実施例３７と同様に、ポリマーナノ微粒子３８及びＱＤ５６５を同一ＰＶＡ ｆｉｌｍ内に分散させ、蛍光顕微鏡により観察した。その際、観察にはそれぞれの粒子しか観察できないフィルターを用い同一箇所で、別々に蛍光像を取得した。その結果を図１５、図１６に示した。
【０１７０】
また、ポリマーナノ微粒子３８及びＱＤ５６５の輝度分布をヒストグラム化し、比較した結果を図１７に示した。以上の結果から、ポリマーナノ微粒子３８がＱＤ５６５よりも大きな輝度を示すことが確認できた。
【０１７１】
＜実施例３９＞
（ポリマーナノ微粒子の分散安定性評価）
本発明のポリマーナノ微粒子１８、３９、４０、及び非特許文献３の方法で得たポリマーナノ微粒子４１を用いて、分散安定性に関する評価を行った。評価に用いたポリマーナノ微粒子３９から４１は以下の合成例に従って合成した。また、ポリマーナノ微粒子１８は実施例１８に従って合成した。
【０１７２】
（ポリマーナノ微粒子３９の合成例）
前記化学式１０で示されるＡＤＳ１０６ＲＥ（０．４ｍｇ）と前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．０４ｍｇ）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１７３】
次に、ＤＴＡＣを溶解した水溶液（０．７０重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１７４】
次に、前記エマルジョンを６０℃で３０分間加熱し、クロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＤＴＡＣで保護され、且つＡＤＳ１０６ＲＥマトリックス中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子３９の水分散液を得た。
【０１７５】
（ポリマーナノ微粒子４０の合成例）
前記化学式１０で示されるＡＤＳ１０６ＲＥ（０．４ｍｇ）と前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．０４ｍｇ）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１７６】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液（１重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１７７】
次に、前記エマルジョンを４０℃で１時間加熱し、分散質からクロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＡＤＳ１０６ＲＥ中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子４０の水分散液を得た。
【０１７８】
（ポリマーナノ微粒子４１の合成例）
前記化学式１０で示されるＡＤＳ１０６ＲＥ（０．０８ｍｇ）と前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．００４ｍｇ）をＴＨＦ（２ｇ）に溶解させて、ＴＨＦ溶液を調製した。
【０１７９】
次に、超純水（８ｇ）に、前記ＴＨＦ溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理した。
【０１８０】
次に、この溶液を７０℃で３０分間加熱し、分散質からＴＨＦを留去することによって、ＡＤＳ１０６ＲＥ中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子４１の水分散液を得た。
【０１８１】
（分散安定性評価１）
前記ポリマーナノ微粒子３９、４０、４１の粒径を動的光散乱解析装置で分析した。粒径を測定した後、各ポリマーナノ微粒子の水分散液（１．８ｇ）に対して、１．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液（０．２ｇ）を加えた。一晩放置した後、再び動的光散乱解析装置で粒径を分析し、その結果を図１８に示した。
【０１８２】
図１８から、本発明のポリマーナノ微粒子３９、４０において、分散液を調製してから一晩放置後においても目立った凝集は観察されず、特に、ポリマーナノ微粒子４０は、分散安定性に優れていることが確認された。一方、比較例のポリマーナノ微粒子４１では、微粒子表面が界面活性剤で保護されていないことから、一晩放置後、大きな凝集体が生成し、本発明のポリマーナノ微粒子３９、４０と比較して分散安定性に劣ることが確認された。
【０１８３】
（分散安定性評価２）
前記ポリマーナノ微粒子１８、４０、４１の粒径を動的光散乱解析装置で分析した。粒径を測定した後、各ポリマーナノ微粒子の水分散液（１．８ｇ）に対して、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．２ｇ）およびウシ胎児血清（ＦＢＳ、０．２ｇ）を加えた。室温で一晩放置した後、再び動的光散乱解析装置で粒径を分析し、その結果を図１９〜２１に示した。
【０１８４】
図１９〜２１より、本発明のポリマーナノ微粒子１８、４０において、分散液を調製してから一晩放置後においてもリン酸緩衝液およびウシ胎児血清中で目立った凝集は観察されず、分散安定性に優れていることが確認された。一方、比較例のポリマーナノ微粒子４１では、微粒子表面が界面活性剤で保護されていないことから、一晩放置後、リン酸緩衝液中で大きな凝集体が生成し、本発明のポリマーナノ微粒子１８、４０と比較して分散安定性に劣ることが確認された。
【０１８５】
次に、第二の本発明に関して、実施例を用いて説明する。
【０１８６】
＜実施例４０＞
（ポリマーナノ微粒子４２の合成）
ＰＳ（４ｍｇ、ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＰＯＬＹＭＥＲ ＰＲＯＤＵＣＴＳ製、分子量２２，０００）、前記化学式１８で示されるＳｉＰｃＴＨＳＯ（０．７５６ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）、前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．０４２ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１８７】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液（１．５重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１８８】
次に、前記エマルジョンを４０℃で２時間加熱し、分散質からクロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＰＳ中にＳｉＰｃＴＨＳＯとＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子４２の水分散液を得た。また、ポリマーナノ微粒子４２のＴＥＭ写真を図２２に示した。得られたポリマーナノ微粒子４２の粒径を透過型電子顕微鏡により観察したところ、平均粒径は６６．９ｎｍであった。
【０１８９】
（ＦＲＥＴ特性評価）
蛍光分光測定装置を用いて、前記ポリマーナノ微粒子４２の水分散液のＦＲＥＴ特性を評価した。その結果を図２３に示した。
【０１９０】
ポリマーナノ微粒子４２の水分散液に６００ｎｍの励起光を照射すると、ＳｉＰｃＴＨＳＯの蛍光が大きく減少し、且つ７８０ｎｍのＳｉＮＰｃＴＨＳＯの蛍光発光が見られたことから、ＳｉＰｃＴＨＳＯからＳｉＮＰｃＴＨＳＯへのＦＲＥＴが効率良く起こることが確認された。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表３に示した。
【０１９１】
（輝度比較）
ポリマーナノ微粒子４２またはＱＤ８００を分散させたＰＶＡ ｆｉｌｍを別々のスライドガラス上に作製し、それぞれ蛍光顕微鏡により観察した。その際、観察には共通の励起フィルター、ダイクロイックミラー、蛍光フィルターを用い、別々に蛍光像を取得した。その結果を図２４、図２５に示した。また、１粒子当たりの吸光係数、蛍光量子収率、蛍光強度を表２に示した。
【０１９２】
更に、ポリマーナノ微粒子４２またはＱＤ８００の輝度分布をヒストグラム化し、比較した結果を図２６に示した。以上の結果から、ポリマーナノ微粒子４２がＱＤ８００よりも大きな輝度を示すことが確認できた。
【０１９３】
【表２】
【０１９４】
（分散安定性評価）
ＳｉＰｃＴＨＳＯ及びＳｉＮＰｃＴＨＳＯを含まないこと以外は、実施例４０と同様にして、ＰＳのみからなるポリマーナノ微粒子４３を作製し、その粒径を動的光散乱解析装置で分析した。粒径を測定した後、ポリマーナノ微粒子４３の水分散液（０．９ｇ）に対して、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．１ｇ）またはウシ胎児血清（ＦＢＳ、０．１ｇ）を加えた。室温で一晩放置した後、再び動的光散乱解析装置で粒径を分析し、その結果を図２７に示した。
【０１９５】
図２７より、ポリマーナノ微粒子４３において、分散液を調製してから一晩放置後においてもリン酸緩衝液およびウシ胎児血清中で目立った凝集は観察されず、分散安定性に優れていることが確認された。
【０１９６】
（ヌードマウスのｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージング）
前記ポリマーナノ微粒子４２の水分散液をＰＢＳで４倍に希釈し、滅菌済みの限外濾過フィルター（０．２２μｍ径）で処理を行った後、ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ、９週齢、メス）の尾静脈から０．２ｍｌ投与した。投与してから１５分、３時間、１日、２日、３日後に蛍光イメージング装置（Ｘｅｎｏｇｅｎ製、ＩＶＩＳ２００）でヌードマウスの蛍光像を撮影した。その結果を図２８に示した。ヌードマウスの体内から強い蛍光が検出され、ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージングできることが確認できた。
【０１９７】
＜実施例４１＞
（ポリマーナノ微粒子４４の合成）
実施例４０のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４２ｍｇから０．００８４ｍｇに替えた以外は、実施例４０と同様にして、ポリマーナノ微粒子４４の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表３に示した。
【０１９８】
＜実施例４２＞
（ポリマーナノ微粒子４５の合成）
実施例４０のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４２ｍｇから０．０２１ｍｇに替えた以外は、実施例４０と同様にして、ポリマーナノ微粒子４５の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表３に示した。
【０１９９】
＜実施例４３＞
（ポリマーナノ微粒子４６の合成）
実施例４０のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４２ｍｇから０．０８４ｍｇに替えた以外は、実施例４０と同様にして、ポリマーナノ微粒子４６の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表３に示した。
【０２００】
＜実施例４４＞
（ポリマーナノ微粒子４７の合成）
実施例４０のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４２ｍｇから０．１４ｍｇに替えた以外は、実施例４０と同様にして、ポリマーナノ微粒子４７の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表３に示した。
【０２０１】
【表３】
【０２０２】
＜実施例４５＞
（ポリマーナノ微粒子４８の合成例）
特許文献１に開示されている方法に従って、ポリマーナノ微粒子４８を合成した。
【０２０３】
攪拌中のＬａｔｅｘ溶液（０．６ｍＬ，４％ｗ／ｖ：Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｃｏｒｐ． Ｉｎｃ．）にＤＭＦ（１．３３ｍＬ）を５分かけて滴下し、更に３０分間攪拌してＬａｔｅｘを膨潤させた。続いて、色素（溶液全量 （２ｍＬ）に対してＳｉＰｃＴＨＳＯ ０．６６８ｍｇ、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯ ０．２ｍｇ）を溶解させたＤＭＦ（０．０７ｍＬ）を５分かけて滴下し、更に３０分間攪拌した。最後に冷蔵庫内（約７°Ｃ）で１５時間透析を行い、ＤＭＦを除去してポリマーナノ微粒子４８を得た。
【０２０４】
（ポリマーナノ微粒子のＦＲＥＴ効率比較）
特許文献１に開示されている方法に従って、ＳｉＰｃＴＨＳＯのみ、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯのみ、ＳｉＰｃＴＨＳＯとＳｉＮＰｃＴＨＳＯを含有したポリマーナノ微粒子を作製し蛍光を測定した。図２９はその規格化した蛍光スペクトルである。ＳｉＰｃＴＨＳＯとＳｉＮＰｃＴＨＳＯを含有したポリマーナノ微粒子４８は、ＳｉＰｃＴＨＳＯの蛍光が消光し、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯの蛍光が観察された。
【０２０５】
本発明のポリマーナノ微粒子４２、及び特許文献１に開示されている製造方法で得たポリマーナノ微粒子４８を用いて、ＦＲＥＴ効率に関する比較を行った。その結果、ポリマーナノ微粒子４８のＦＲＥＴ効率は３２．３％であり、本発明のポリマーナノ微粒子４２（ＦＲＥＴ効率９６．４％）の方が優れていることが確認された。
【０２０６】
（ポリマーナノ微粒子の蛍光強度比較）
本発明のポリマーナノ微粒子と特許文献１に開示されているポリマーナノ微粒子のポリマー濃度が同程度（０．００８９％ｗｖ-1）になるように調製して得られた微粒子をそれぞれポリマーナノ微粒子４９、ポリマーナノ微粒子５０とした。それらの蛍光強度を比較し、その結果を図３０に示した。７８１ｎｍにおける蛍光強度はポリマーナノ微粒子４９が２２４３、ポリマーナノ微粒子５０が１９であり、ポリマーナノ微粒子４９の蛍光強度の方が１００倍以上大きいことが確認された。
【０２０７】
また、吸光度からポリマーに対する色素濃度を計算すると、ポリマーナノ微粒子４９ではＳｉＰｃＴＨＳＯが２．７ｗｔ％、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯが０．３ｗｔ％含有していた。これに対して、ポリマーナノ微粒子５０ではＳｉＰｃＴＨＳＯが０．０５４ｗｔ％、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯが０．０１３ｗｔ％であった。
【０２０８】
更に１粒子当たりの色素含有量は、ポリマーナノ微粒子４９ではＳｉＰｃＴＨＳＯが３８００個、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯが４００個であるのに対して、ポリマーナノ微粒子５０はＳｉＰｃＴＨＳＯが１５０個、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯが３０個となった。これらのことから、特許文献１に開示されている製造方法ではポリマー粒子内にドナー色素、アクセプター色素を効率的に内包させることは困難であることが分かった。また、ＳｉＰｃＴＨＳＯ、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯはＤＭＦに溶け難く、これ以上の濃度で仕込むのは難しいと考えられる。以上の結果を表４にまとめた。
【０２０９】
【表４】
【符号の説明】
【０２１０】
１ ポリマーナノ微粒子
２ 蛍光性ポリマー
３ 蛍光色素（アクセプター）
４ 界面活性剤
５ 蛍光色素（ドナー）
６ ポリマー
７ 有機溶媒
８ 界面活性剤を有する水溶液
９ エマルジョン
１０ ポリマーナノ微粒子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動で蛍光を発光するポリマーナノ微粒子、及び、前記ポリマーナノ微粒子を用いた光分子イメージング用造影剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な産業分野への応用を指向して、ポリマーナノ微粒子に関する研究開発が盛んに行われており、中でも医薬、診断薬等、医療・診断分野への応用が加速している。特に最近では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、以降「ＦＲＥＴ」と記載する）を利用したポリマーナノ微粒子が光分子イメージング用造影剤として注目されつつある。
【０００３】
ＦＲＥＴで蛍光を発光するポリマーナノ微粒子として、非特許文献１には、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で表面保護されたポリフルオレンナノ微粒子の表面に、カチオン性蛍光色素を静電的に吸着させて固定化したポリマーナノ微粒子に関する技術が開示されている。そこでは、ポリフルオレン（ＰＦ２/６）を光励起することによって、ＦＲＥＴでカチオン性蛍光色素（ローダミン６Ｇ）から蛍光が発光すると報告されている。
【０００４】
一方、非特許文献２には、２種類の異なるポリマーから成るポリマーブレンドナノ微粒子を得る技術が開示されている。具体的には、２種類の異なる蛍光性ポリマー（ＰＦ２/６、ｍ−ＬＰＰＰ）を溶解したクロロホルムをＳＤＳ水溶液と混合した後、超音波照射によって形成したエマルジョンを加温してクロロホルムを除去することにより得られることが開示されている。そこでは、ＰＦ２/６を光励起することによって、ＦＲＥＴでｍ−ＬＰＰＰから蛍光が発光すると報告されている。
【０００５】
更に、非特許文献３には、蛍光性ポリマーのマトリックス中に蛍光色素が分散したポリマーナノ微粒子を得る技術が開示されている。具体的には、まず、蛍光性ポリマー（ＰＤＨＦ）と蛍光色素（クマリン６）を溶解したＴＨＦ（テトラヒドロフラン）溶液を脱塩水中に超音波照射しながら注入する。続いて、得られたサスペンションを０．２μｍのメンブランフィルターに通した後、ＴＨＦを減圧留去することで得ることが出来る。そこでは、ＰＤＨＦを光励起することによって、ＦＲＥＴでクマリン６から蛍光が発光すると報告されている。
【０００６】
特許文献１では、スルホン酸（又はカルボン酸）表面のポリスチレンラテックス粒子をＴＨＦ（又はＤＭＦ）で膨潤し、１種類又は複数の有機色素を取込ませることで、当該粒子中に有機色素が分散したポリマーナノ微粒子を得る技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５７６３１８９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】"Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．"、２００６，２７，２００から２０２頁
【非特許文献２】"Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ"，２００３，２，４０８から４１２頁
【非特許文献３】"Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃ，２００８、１１２，１７７２から１７８１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
非特許文献１において、ポリフルオレン（ＰＦ２/６）を光励起することによって、ＦＲＥＴでカチオン性蛍光色素（ローダミン６Ｇ）から蛍光が発光すると報告されているが、そのＦＲＥＴ効率は高くない。
【００１０】
また、非特許文献１のポリマーナノ微粒子では、微粒子表面に静電吸着させたカチオン性蛍光色素は、生理食塩水のような塩を含有する水溶液中において脱着する恐れがあり、その結果、ＦＲＥＴ効率の低下を招く恐れが考えられる。
【００１１】
一方、非特許文献２においては、ＰＦ２/６を光励起することによって、ＦＲＥＴでｍ−ＬＰＰＰから蛍光が発光すると報告されているが、ＦＲＥＴ効率に関する明確な記載はなされていない。
【００１２】
また、非特許文献２のポリマーナノ微粒子では、微粒子内に２種類の異なる蛍光性ポリマーを内包しているが、このように異なるポリマーを使用する場合、相溶性の問題、即ち、相分離の可能性があり、その結果、ＦＲＥＴ効率の低下を招く恐れが考えられる。
【００１３】
一方、非特許文献３においては、微粒子表面が界面活性剤で保護されていないことから、生理食塩水のような塩を含有する水溶液中において、ポリマーナノ微粒子の凝集が懸念される。
【００１４】
一方、特許文献１においては、微粒子内にドナー色素、アクセプター色素を仕込み比通りに内包させることは困難であり、色素の仕込み比にバラツキが生じ易く、ＦＲＥＴ効率の低下や蛍光強度の低下を招く恐れが考えられる。
【００１５】
本発明は、このような背景技術に鑑みてなされたものであり、ＦＲＥＴ効率が優れ、且つ分散性に優れたポリマーナノ微粒子を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明のポリマーナノ微粒子は、蛍光性ポリマーのマトリックス中に蛍光色素が分散したポリマーナノ微粒子であって、該微粒子表面が界面活性剤で保護され、前記蛍光性ポリマーと前記蛍光色素間のＦＲＥＴで蛍光を発光することを特徴とする。
【００１７】
また、別の本発明のポリマーナノ微粒子は、ポリマーのマトリックス中に２種類の異なる蛍光色素が分散したポリマーナノ微粒子であって、該微粒子表面が界面活性剤で保護され、前記２種類の異なる蛍光色素間のＦＲＥＴで蛍光を発光することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、蛍光性ポリマーのマトリックス中に蛍光色素が分散した構造を有することから、従来技術に比べてＦＲＥＴ効率の優れたポリマーナノ微粒子を提供することができる。
【００１９】
また、別の本発明によれば、ポリマーのマトリックス中に２種類の異なる蛍光色素が分散した構造を有することから、従来技術に比べてＦＲＥＴ効率の優れたポリマーナノ微粒子を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】第一の本発明に係るポリマーナノ微粒子の構造を示す概略図である。
【図２】第二の本発明に係るポリマーナノ微粒子の構造を示す概略図である。
【図３】第一の本発明に係るポリマーナノ微粒子を製造する工程の一例を示す図である。
【図４】第二の本発明に係るポリマーナノ微粒子を製造する工程の一例を示す図である。
【図５】実施例１におけるポリマーナノ微粒子１のＦＲＥＴ特性を示すグラフである。
【図６】実施例２におけるポリマーナノ微粒子２のＦＲＥＴ特性を示すグラフである。
【図７】実施例８におけるポリマーナノ微粒子８のＦＲＥＴ特性を示すグラフである。
【図８】実施例１２におけるポリマーナノ微粒子１２のＦＲＥＴ特性を示すグラフである。
【図９】実施例１８におけるポリマーナノ微粒子１８のＦＲＥＴ特性を示すグラフである。
【図１０】実施例１９におけるポリマーナノ微粒子１９のＴＥＭ写真である。
【図１１】実施例３７におけるポリマーナノ微粒子３７の蛍光像である。
【図１２】実施例３７におけるＱＤ５６５の蛍光像である。
【図１３】実施例３７におけるポリマーナノ微粒子３７とＱＤ５６５の輝度ヒストグラムである。
【図１４】実施例３８におけるポリマーナノ微粒子３８のＴＥＭ写真である。
【図１５】実施例３８におけるポリマーナノ微粒子３８の蛍光像である。
【図１６】実施例３８におけるＱＤ５６５の蛍光像である。
【図１７】実施例３８におけるポリマーナノ微粒子３８とＱＤ５６５の輝度ヒストグラムである。
【図１８】塩化ナトリウム水溶液中におけるポリマーナノ微粒子３９、４０、４１の粒径分布を示すグラフである。
【図１９】ＰＢＳおよびＦＢＳ中におけるポリマーナノ微粒子１８の粒径分布を示すグラフである。
【図２０】ＰＢＳおよびＦＢＳ中におけるポリマーナノ微粒子４０の粒径分布を示すグラフである。
【図２１】ＰＢＳおよびＦＢＳ中におけるポリマーナノ微粒子４１の粒径分布を示すグラフである。
【図２２】実施例４０におけるポリマーナノ微粒子４２のＴＥＭ写真である。
【図２３】実施例４０におけるポリマーナノ微粒子４２のＦＲＥＴ特性を示すグラフである。
【図２４】実施例４０におけるポリマーナノ微粒子４２の蛍光像である。
【図２５】実施例４０におけるＱＤ８００の蛍光像である。
【図２６】実施例４０におけるポリマーナノ微粒子４２とＱＤ８００の輝度ヒストグラムである。
【図２７】ＰＢＳおよびＦＢＳ中におけるポリマーナノ微粒子４３の粒径分布を示すグラフである。
【図２８】実施例４０におけるポリマーナノ微粒子４２を投与したヌードマウスの蛍光像である。
【図２９】特許文献１に開示の方法に従って合成したポリマーナノ微粒子の規格化した蛍光スペクトルを示すグラフである。
【図３０】ポリマーナノ微粒子４９、５０の蛍光強度を比較したグラフである。
【図３１】実施例１８におけるポリマーナノ微粒子１８を投与したヌードマウスの蛍光像である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２２】
（ポリマーナノ微粒子）
第一の本発明は、図１に示すように蛍光性ポリマー２のマトリックス中に蛍光色素（アクセプター）３が分散したポリマーナノ微粒子１であり、界面活性剤４がポリマーナノ微粒子１の表面に存在する。
【００２３】
また、第二の本発明は、図２に示すように、ポリマー６のマトリックス中に２種類の異なる蛍光色素３及び５が分散したポリマーナノ微粒子１０であり、界面活性剤４がポリマーナノ微粒子１０の表面に存在する。
【００２４】
また、本発明のポリマーナノ微粒子の好ましい態様の一つは、６００ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下の近赤外波長域に蛍光発光を有する蛍光色素と蛍光性ポリマーの組合せからなるＦＲＥＴによって、生体透過性の優れた蛍光を発光することを特徴とする。
【００２５】
また、別の本発明のポリマーナノ微粒子の好ましい態様の一つは、６００ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下の近赤外波長域に蛍光発光を有する２種類の異なる蛍光色素（ドナー、アクセプター）の組合せからなるＦＲＥＴによって、生体透過性の優れた蛍光を発光することを特徴とする。
【００２６】
また、本発明のポリマーナノ微粒子は、該微粒子表面が界面活性剤で保護されていることから、生理食塩水のような塩を含む水溶液中においても優れた分散性を有することを特徴とする。
【００２７】
ポリマーナノ微粒子は、蛍光性ポリマーと蛍光色素と界面活性剤とを有する。該蛍光色素は蛍光性ポリマーのマトリックス中に分散しており、該界面活性剤はポリマーナノ微粒子表面に存在する。
【００２８】
本発明のポリマーナノ微粒子は、目的とする用途に対して平均粒径を制御することが可能であり、その平均粒径は１０ｎｍ以上、２００ｎｍ以下であることを特徴とする。
【００２９】
（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ；蛍光共鳴エネルギー移動）とは、ドナーとなる蛍光分子の蛍光スペクトルとアクセプターとなる蛍光分子の吸収スペクトルに重なりを有する２種類の蛍光分子が、１から１０ｎｍ以内に接近している状況下において、励起された蛍光分子(ドナー)の光エネルギーが別の蛍光分子(アクセプター)に移動して励起される現象のことである。ＦＲＥＴの強度は両分子間の距離の６乗に反比例し、距離と共に急速に減少する。２種類の蛍光分子として、蛍光性ポリマーと蛍光色素もしくは、異なる２種類の蛍光色素を用いることができる。
【００３０】
（蛍光性ポリマー）
第一の本発明における蛍光性ポリマーとは、励起光によって励起された後、基底状態に戻る際に蛍光を発光するポリマーであり、また、その蛍光スペクトルが蛍光色素の吸収スペクトルとの重なりを有するポリマーであれば、特に限定されない。蛍光性ポリマーの一部として、以下のような共役ポリマーを挙げることができる。上記共役ポリマーの具体例としては、
化学式１で示されるＦ８ＢＴ：poly[2,1,3-benzothiadiazole-4,7-diyl(9,9-dioctyl-9H-fluorene-2,7-diyl)]、
化学式２で示されるＭＥＨ−ＰＰＶ：poly(2-methoxy-5-(2'-ethyl-hexyloxy)-p-phenylene vinylene)、
化学式３で示されるＰ−１：copoly(2,3-diphenylthieno [3,4-b] pyrazine -alt- 9,9- didecylfluorene)、
化学式４で示されるＰ−２：copoly(thieno [3,4-b] pyrazine -alt- 9,9- didecylfluorene)、
化学式５で示されるＰＦ１１１１２：poly(9,9-bis(3,7,11-trimethyldodecyl) fluorene)、
化学式６で示されるｍ−ＬＰＰＰ：ladder-type poly(para-phenylene)、
化学式７で示されるＰＦＢ：poly(9,9-dioctylfluorene-co- N,N'- bis(4-butylphenyl)-N,N'- diphenyl-1,4-phenylenediamine)、
化学式８で示されるＰＦ２／６：poly[9,9-bis(2-ethylhexyl)fluorene-2,7-diyl]、
化学式９で示されるＡＤＳ１０４ＲＥ：poly[(2-methoxy-5-(3,7-dimethyl-octyloxy)-1,4- phenylenevinylene)end capped with DMP、
化学式１０で示されるＡＤＳ１０６ＲＥ：poly[9,9-di-(2-ethylhexyl)-fluorenyl-2,7-diyl] end capped with 2,5-diphenyl-1,2,4-oxadiazole、
化学式１１で示されるＡＤＳ３００ＲＥ：poly[2,5-bis(3,7-dimethyloctyloxy)-1,4-phenylene- vinylene]、
化学式１２で示されるＡＤＳ１２９ＢＥ：poly(9,9-dioctyfluorenyl-2,7-diyl)end capped with dimethylphenyl、
化学式１３で示されるＣＤＰＤＯＦ：copoly(2,3-diphenylthieno[3,4-b]pyrazine-alt-9,9- dioctylfluorene)、
化学式１４で示されるＣＯＴＴＯＦ：copoly(thienothiadiazole-alt-9,9-ioctylfluorene)（式中、Ｘ：Ｙは１：０〜０．１：１）、
化学式１５で示されるＣＯＢＢＯＦ：copoly(benzobisthiadiazole-alt-9,9-dioctylfluorene) （式中、Ｘ：Ｙは１：０〜０．１：１）等である。但し、本発明における蛍光性ポリマーとは上記に限定されるものではない。
【００３１】
これらの蛍光性ポリマーの平均分子量は２０００〜１００００００であり、好ましくは１００００〜６０００００のものを好適に利用できる。
【００３２】
【化１】
【００３３】
【化２】
【００３４】
【化３】
【００３５】
【化４】
【００３６】
【化５】
【００３７】
【化６】
【００３８】
【化７】
【００３９】
【化８】
【００４０】
【化９】
【００４１】
【化１０】
【００４２】
【化１１】
【００４３】
【化１２】
【００４４】
【化１３】
【００４５】
【化１４】
【００４６】
【化１５】
【００４７】
（蛍光色素）
第一の本発明における蛍光色素とは、その吸収スペクトルが蛍光性ポリマーの蛍光スペクトルと重なりを持つ蛍光色素であれば、特に限定されないが、生体透過性の観点から、６００ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下の近赤外波長域に蛍光発光を有する蛍光色素が好ましい。
【００４８】
第二の本発明における２種類の異なる蛍光色素は、一方の蛍光色素の吸収スペクトルが他方の蛍光色素の蛍光スペクトルと重なりを持つ蛍光色素、即ち、ドナー、アクセプターの蛍光色素の組合せであれば、特に限定されない。ただし、生体透過性の観点から、６００ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下の近赤外波長域に蛍光発光を有する蛍光色素が好ましい。なお、第二の本発明に係るポリマーナノ微粒子は、3種類以上の異なる蛍光色素を含んでいてもよい。
【００４９】
これらの蛍光色素として、以下のような色素を挙げることができる。
化学式１６で示されるＤｉＤ：1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine perchlorate、化学式１７で示されるＤｉＲ：1;1'-Dioctadecyl-3;3;3';3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide、ＤｉＩ：1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate、ＩＣＧ（インドシアニングリーン）等のシアニン系蛍光色素、化学式１８で示されるＳｉＰｃＴＨＳＯ：silicon phthalocycanine bis(trihexyl-silyloxide)、silicon 2,3,9,10,16,17,23,24- octakis (octyloxy) -29H,31H-phthalocycanine dihydroxide、silicon 2,9,16,23-tetra-tert- butyl-29H,31H- phthalocycanine dihydroxide、化学式１９で示されるβ tetra (neopentyloxy) -29H, 31H- phthalocycanine、2,3,9,10,16,17,23,24-octa(4-tert-butylphenoxy) -29H,31H- phthalocycanine、β tetra (thiobuthoxy)-29H, 31H- phthalocycanine、1,4,8,11,15,18,22,25 octa ethoxy-zinc phthalocycanine等のフタロシアニン系蛍光色素、化学式２０で示されるsilicon 2,3-naphthalocyanine dioctyloxide、silicon 2,3- naphthalocyanine dihydroxide、silicon 2,3-naphthalocyanine bis(trihexylsilyloxide)等のナフタロシアニン系蛍光色素、hexapropyl -3,6-diphenyl tetraazaporphyrin、5,10,15,20-Tetraphenyl-22H, 24H-prophyrin等のポルフィリン系蛍光色素、β tetra(tert-buthyl)- tetra pyrazino porphyrazin等のポルフィラジン系蛍光色素、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＸ、テトラメチルロ−ダミン等のキサンテン系蛍光色素、メチレンブルー等のチアジン系蛍光色素、クマリン６等のクマリン系蛍光色素、オキサジン系蛍光色素、ポリメチン系蛍光色素、ポリフェニル系蛍光色素、スチルベン系蛍光色素、オキサゾール系蛍光色素、オキサジアゾール系蛍光色素、ペリレン系蛍光色素、アクリジン系蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ系蛍光色素等の蛍光色素である。但し、本発明における蛍光色素とは上記に限定されるものではない。
【００５０】
【化１６】
【００５１】
【化１７】
【００５２】
【化１８】
【００５３】
【化１９】
【００５４】
【化２０】
【００５５】
（ポリマー）
第二の本発明におけるポリマーは、後述する有機溶媒に溶解するポリマーであれば、特に限定されないが、例えば、ＰＳ：Polystyrene（ポリスチレン）、ＰＭＭＡ（Poly(methyl methacrylate)：ポリメタクリル酸メチル）、ＰＢＭＡ（Poly(butyl methacrylate)：ポリメタクリル酸ブチル）、Ｐ（ＢＭＡ−ｃｏ−ＭＭＡ）（Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)：ポリ（メタクリル酸ブチル−メタクリル酸メチル）共重合体）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルソエステル、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリ酸無水物、デキストラン誘導体、セルロース誘導体等のポリマーを挙げることができる。
【００５６】
（ポリマーナノ微粒子の製造方法）
第一の本発明におけるポリマーナノ微粒子の製造方法について説明する。
【００５７】
第一の本発明におけるポリマーナノ微粒子の製造方法は、
蛍光性ポリマーと蛍光色素を含有する第一液体を、界面活性剤を含有する第二液体に加えて混合液を得る工程と、前記混合液からエマルジョンを得る工程と、前記エマルジョンの分散質から前記第一液体を留去する工程と、を有する。即ち、本発明のポリマーナノ微粒子を得る方法としては、ミニエマルジョン法を挙げることができるが、上記に限定されるものではない。
【００５８】
次に第二の発明におけるポリマーナノ微粒子の製造方法について説明する。
【００５９】
第二の本発明におけるポリマーナノ微粒子の製造方法は、
２種類の異なる蛍光色素及びポリマーを含有する第一液体を、界面活性剤を含有する第二液体に加えて混合液を得る工程と、前記混合液からエマルジョンを得る工程と、前記エマルジョンの分散質から前記第一液体を留去する工程と、を有する。即ち、本発明のポリマーナノ微粒子を得る方法としては、ミニエマルジョン法を挙げることができるが、上記に限定されるものではない。
【００６０】
（第一液体）
第一液体とは有機溶媒であり、水への溶解性がないか又は溶解性が小さく、且つ前述の蛍光性ポリマー、ポリマー、蛍光色素を溶解する有機溶媒であればいかなる溶媒も適用可能であるが、揮発性の有機溶媒であることが好ましい。
【００６１】
このような有機溶媒の具体例として、次の溶媒が挙げられる。ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタン、クロロホルム、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）、エーテル類（エチルエーテル、イソブチルエーテル等）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、芳香族炭化水素（ベンゼン、トルエン、キシレン等）等。これらを単独で用いても良いし、あるいは２種類以上を適宜の割合で混合して用いることもできる。但し、第一液体である有機溶媒は上記に限定されるものではない。
【００６２】
また、第一液体における蛍光性ポリマーおよび蛍光色素の濃度はこれらが溶解する範囲であれば特に限定されないが、好ましい濃度として例えば、蛍光性ポリマーについては０．５〜１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。また、蛍光色素の好ましい濃度として、例えば０．０００５〜１ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【００６３】
また、第一液体における蛍光性ポリマーと蛍光色素との重量比は、好ましくは、１０００：１〜４：１の範囲である。
【００６４】
また、第一液体におけるポリマーおよび２種類の異なる蛍光色素の濃度はこれらが溶解する範囲であれば特に限定されないが、好ましい濃度として、例えば、ポリマーについては０．５〜１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。また、２種類の異なる蛍光色素の好ましい濃度としては、例えば０．０００５〜５ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【００６５】
また、第一液体におけるポリマーと２種類の異なる蛍光色素の総量との重量比は、好ましくは、１０００：１〜４：１の範囲である。また、第一液体における２種類の異なる蛍光色素のうち、ドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素との重量比が１０００：１〜０．１：１の範囲にあることが好ましい。
【００６６】
（第二液体）
第二液体とは水または水溶液である。第一液体と混合した際にエマルジョンを安定化させることを目的として、第二液体に分散剤として界面活性剤をあらかじめ共存させることが好ましい。ただし、第一、第二液体を混合した分散液に界面活性剤を含ませることができれば、上記の方法に限定されるものではない。
【００６７】
（界面活性剤）
界面活性剤としては、以下の材料を使用することができる。
【００６８】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ８５、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ７６、Ｂｒｉｊ９８、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＴｒｉｔｏｎＸ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ−１０１、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｉｇｅｐｏｌ ＣＯ５３０、Ｉｇｅｐｏｌ ＣＯ６３０、Ｉｇｅｐｏｌ ＣＯ７２０、Ｉｇｅｐｏｌ ＣＯ７３０等が挙げられる。
【００６９】
また、アニオン性界面活性剤としては、例えば、以下のものが挙げられる。ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホネート、デシルベンゼンスルホネート、ウンデシルベンゼンスルホネート、トリデシルベンゼンスルホネート、ノニルベンゼンスルホネート並びにこれらのナトリウム、カリウム、アンモニウム塩等。
【００７０】
また、カチオン性界面活性剤としては、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。このうち好ましくは非イオン性界面活性剤である。
【００７１】
また、第二液体に含まれる界面活性剤の濃度は、第一液体との混合比にも依るが、好ましい濃度として例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【００７２】
（エマルジョン）
エマルジョンとは、本発明の目的を達成可能な範囲において如何なる物性のエマルジョンも含めるものであるが、好ましくは１ピークの粒径分布を有し、且つ、平均粒径が１０ｎｍ以上、２００ｎｍ以下の単分散エマルジョンである。
【００７３】
このようなエマルジョンは従来公知の乳化手法によって調製することが可能である。従来公知の方法とは、例えば、断続振とう法、プロペラ型攪拌機、タービン型攪拌機等のミキサーを利用する攪拌法、コロイドミル法、ホモジナイザー法、超音波照射法等がある。これらの方法は、単独で用いることも、あるいは複数を組み合わせて用いることも可能である。また、エマルジョンは1段階の乳化によって調製しても良いし、多段階の乳化によって調製しても良い。但し、エマルジョンは、本発明の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【００７４】
エマルジョンは、第二液体に第一液体を加えて得られる混合液から調製される水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョンである。ここで、第一液体と第二液体の混合とは、第一液体と第二液体を空間的に隔離せずに互いに接触して存在させることであり、必ずしも互いに混和することを要さない。
【００７５】
混合液における第一液体と第二液体との割合は、水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョンを形成することができれば特に限定はないが、好ましくは、第一液体と第二液体との重量比が、１：２．５〜１：１２．５となる範囲で混合することが好ましい。
【００７６】
（留去）
留去とは、エマルジョンの分散質から第一液体を除去する操作である。即ち、蛍光性ポリマー、ポリマー、蛍光色素、有機溶媒から構成された分散質から有機溶媒を除去することである。
【００７７】
留去は、従来知られる何れの方法でも実施可能であるが、加熱によって除去する方法、あるいはエバポレーター等の減圧装置を利用した方法を挙げることができる。加熱による除去の場合の加熱温度は、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを維持できれば特に限定されないが、好ましい温度は０℃から８０℃の範囲である。但し、留去は、本発明の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【００７８】
第一の本発明におけるポリマーナノ微粒子１を製造する工程の一例を図３に示している。具体的には、以下の（１）から（３）の工程を経てポリマーナノ微粒子の水分散液を得られる。
（１）蛍光性ポリマー２と蛍光色素（アクセプター）３を含有する水に不溶または難溶の有機溶媒７を、界面活性剤４を含有する水溶液８に加えて混合液を得る工程。
（２）前記混合液を乳化することによりＯ／Ｗ型のエマルジョン９を得る工程。
（３）前記エマルジョン９の分散質から有機溶媒を留去する工程。
【００７９】
また、第二の本発明におけるポリマーナノ微粒子１０を製造する工程の一例を図４に示す。具体的には、以下の（１）から（３）の工程を経てポリマーナノ微粒子の水分散液を得られる。
（１）ポリマー６と２種類の異なる蛍光色素３（アクセプター）及び蛍光色素５（ドナー）を含有する水に不溶または難溶の有機溶媒を、界面活性剤４を含有する水溶液８に加えて混合液を得る工程。
（２）前記混合液を乳化することによりＯ／Ｗ型のエマルジョン１１を得る工程。
（３）前記エマルジョン１１の分散質から有機溶媒を留去する工程。
【００８０】
（光分子イメージング用造影剤）
本発明におけるポリマーナノ微粒子は、微粒子内での蛍光性ポリマーと蛍光色素間のＦＲＥＴ、又は微粒子内での２種類の異なる蛍光色素間のＦＲＥＴを利用して、光分子イメージング用造影剤として応用することができる。
【００８１】
また、本発明におけるポリマーナノ微粒子は、６００ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下の近赤外波長域に蛍光発光を有する蛍光色素と蛍光性ポリマーの組合せからなるＦＲＥＴによって、生体透過性の優れた蛍光を発光することから、光分子イメージング用造影剤として好適である。
【００８２】
また、本発明におけるポリマーナノ微粒子は、６００ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下の近赤外波長域に蛍光発光を有する２種類の異なる蛍光色素の組合せからなるＦＲＥＴによって、生体透過性の優れた蛍光を発光することから、光分子イメージング用造影剤として好適である。
【００８３】
本発明における光分子イメージング用造影剤は、EPR(Enhanced Permeability and Retention：増強されたパーミアビリティーおよび保持）効果を利用して腫瘍部位にポリマーナノ微粒子を送達させることができる。腫瘍部位に到達した後、ポリマーナノ微粒子を光励起して、ＦＲＥＴに伴う蛍光発光を検出することによって腫瘍部位を可視化することができる。
【００８４】
本発明のポリマーナノ微粒子は表面が界面活性剤で保護されていることから、光分子イメージング用造影剤として使用する際も、ポリマーナノ微粒子は水に分散させたものを好適に用いることができる。
【実施例】
【００８５】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有するポリマーナノ微粒子が得られる範囲で自由に変えることができる。
【００８６】
まず、第一の本発明に関して詳細を説明する。
【００８７】
＜実施例１＞
（ポリマーナノ微粒子１の合成）
前記化学式１で示されるＦ８ＢＴ（０．４ｍｇ、平均分子量１０，０００〜３０，０００、ＡＤＳ製）と前記化学式１６で示されるＤｉＤ（０.０８７ｍｇ、Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ製）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【００８８】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＣＩ製）を溶解した水溶液（１重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した。その後、超音波分散機（Ｍｉｓｏｎｉｘ，Ｉｎｃ製、Ｍｉｃｒｏｓｏｎ ＸＬ２０００）で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【００８９】
次に、前記エマルジョンを４０℃で１時間加熱し、分散質からクロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＦ８ＢＴ中にＤｉＤが分散したポリマーナノ微粒子１の水分散液を得た。
【００９０】
得られたポリマーナノ微粒子１の粒径を動的光散乱解析装置（大塚電子製、ＥＬＳ-Ｚ）で分析したところ、平均粒径は８７．４ｎｍであった。
【００９１】
（ＦＲＥＴ特性評価）
蛍光分光測定装置（日立製、Ｆ−４５００）を用いて、前記ポリマーナノ微粒子１の水分散液のＦＲＥＴ特性を評価した。その結果を図５に示した。
【００９２】
ポリマーナノ微粒子１の水分散液に４５０ｎｍの励起光を照射すると、Ｆ８ＢＴの蛍光が大きく減少し、且つ６８０ｎｍのＤｉＤの蛍光発光が見られたことから、Ｆ８ＢＴからＤｉＤへのＦＲＥＴが効率良く起こることが確認された。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【００９３】
＜実施例２＞
（ポリマーナノ微粒子２の合成）
前記化学式２で示されるＭＥＨ−ＰＰＶ（０．４ｍｇ、平均分子量４０，０００〜７０，０００、Ａｌｄｒｉｃｈ製）とＤｉＤ（０．０４ｍｇ）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【００９４】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液（２重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【００９５】
次に、前記エマルジョンを４０℃で１時間加熱し、分散質からクロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＭＥＨ−ＰＰＶマトリックス中にＤｉＤが分散したポリマーナノ微粒子２の水分散液を得た。
【００９６】
得られたポリマーナノ微粒子２の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は１０２．３ｎｍであった。
【００９７】
（ＦＲＥＴ特性評価）
蛍光分光測定装置を用いて、前記ポリマーナノ微粒子２の水分散液のＦＲＥＴ特性を評価した。その結果を図６に示した。
【００９８】
ポリマーナノ微粒子２の水分散液に５００ｎｍの励起光を照射すると、ＭＥＨ−ＰＰＶの蛍光が大きく減少し、且つ６８０ｎｍのＤｉＤの蛍光発光が見られたことから、ＭＥＨ−ＰＰＶからＤｉＤへのＦＲＥＴが効率良く起こることが確認された。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【００９９】
＜実施例３＞
（ポリマーナノ微粒子３の合成）
実施例２のＤｉＤの使用量を０．０４ｍｇから０．００４ｍｇに替えた以外は、実施例２と同様にして、ポリマーナノ微粒子３の水分散液を得た。得られたポリマーナノ微粒子３の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は５９．３ｎｍであった。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１００】
＜実施例４＞
（ポリマーナノ微粒子４の合成）
実施例２のＤｉＤの使用量を０．０４ｍｇから０．０００４ｍｇに替えた以外は、実施例２と同様にして、ポリマーナノ微粒子４の水分散液を得た。得られたポリマーナノ微粒子４の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は９０．１ｎｍであった。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１０１】
＜実施例５＞
（ポリマーナノ微粒子５の合成）
ＭＥＨ−ＰＰＶ（０．４ｍｇ）とＤｉＤ（０．０４６ｍｇ）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１０２】
次に、ＤＴＡＣ（塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ製）を溶解した水溶液（０．７０重量％、２ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とした。この混合液を２時間攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１０３】
次に、前記エマルジョンを６０℃で３０分間加熱し、クロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＤＴＡＣで保護され、且つＭＥＨ−ＰＰＶマトリックス中にＤｉＤが分散したポリマーナノ微粒子５の水分散液を得た。
【０１０４】
得られたポリマーナノ微粒子５の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は４２．０ｎｍであった。また、ＦＲＥＴ特性に関しては、その結果を表１に示した。
【０１０５】
＜実施例６＞
（ポリマーナノ微粒子６の合成）
実施例５のＤｉＤの使用量を０．０４６ｍｇから０．００４６ｍｇに替えた以外は、実施例５と同様にして、ポリマーナノ微粒子６の水分散液を得た。得られたポリマーナノ微粒子６の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は５１．７ｎｍであった。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１０６】
＜実施例７＞
（ポリマーナノ微粒子７の合成）
実施例５のＤｉＤの使用量を０．０４６ｍｇから０．０００４６ｍｇに替えた以外は、実施例５と同様にして、ポリマーナノ微粒子７の水分散液を得た。得られたポリマーナノ微粒子７の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は１９．７ｎｍであった。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１０７】
＜実施例８＞
（ポリマーナノ微粒子８の合成）
前記化学式１で示されるＦ８ＢＴ（０．４ｍｇ）と前記化学式１８で示されるＳｉＰｃＴＨＳＯ（０．０４ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１０８】
次に、ＤＴＡＣを溶解した水溶液（０．７０重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１０９】
次に、前記エマルジョンを６０℃で３０分間加熱し、クロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＤＴＡＣで保護され、且つＦ８ＢＴマトリックス中にＳｉＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子８の水分散液を得た。得られたポリマーナノ微粒子８の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は３４．３ｎｍであった。
【０１１０】
（ＦＲＥＴ特性評価）
蛍光分光測定装置を用いて、前記ポリマーナノ微粒子８の水分散液のＦＲＥＴ特性を評価した。その結果を図７に示した。
【０１１１】
ポリマーナノ微粒子８の水分散液に４５０ｎｍの励起光を照射すると、Ｆ８ＢＴの蛍光が大きく減少し、且つ６６９．８ｎｍのＳｉＰｃＴＨＳＯの蛍光発光が見られたことから、Ｆ８ＢＴからＳｉＰｃＴＨＳＯへのＦＲＥＴが効率良く起こることが確認された。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１１２】
＜実施例９＞
（ポリマーナノ微粒子９の合成）
実施例８のＳｉＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０２ｍｇに替えた以外は、実施例８と同様にして、ポリマーナノ微粒子９の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１１３】
＜実施例１０＞
（ポリマーナノ微粒子１０の合成）
実施例８のＳｉＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０１ｍｇに替えた以外は、実施例８と同様にして、ポリマーナノ微粒子１０の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１１４】
＜実施例１１＞
（ポリマーナノ微粒子１１の合成）
実施例８のＳｉＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．００４ｍｇに替えた以外は、実施例８と同様にして、ポリマーナノ微粒子１１の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１１５】
＜実施例１２＞
（ポリマーナノ微粒子１２の合成）
前記化学式１０で示されるＡＤＳ１０６ＲＥ（０．４ｍｇ、平均分子量５０，０００〜２００，０００、ＡＤＳ製）と化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．０４ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１１６】
【化２１】
【０１１７】
次に、ＤＴＡＣ（塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ製）を溶解した水溶液（０．７０重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とした。この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１１８】
次に、前記エマルジョンを６０℃で３０分間加熱し、クロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＤＴＡＣで保護され、且つＡＤＳ１０６ＲＥマトリックス中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子１２の水分散液を得た。得られたポリマーナノ微粒子１２の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は２５．９ｎｍであった。
【０１１９】
（ＦＲＥＴ特性評価）
蛍光分光測定装置（日立製、Ｆ−４５００）を用いて、前記ポリマーナノ微粒子１２の水分散液のＦＲＥＴ特性を評価した。その結果を図８に示した。
【０１２０】
ポリマーナノ微粒子１２の水分散液に４５０ｎｍの励起光を照射すると、ＡＤＳ１０６ＲＥの蛍光が大きく減少し、且つ７７７．０ｎｍのＳｉＮＰｃＴＨＳＯの蛍光発光が見られた。このことから、ＡＤＳ１０６ＲＥからＳｉＮＰｃＴＨＳＯへのＦＲＥＴが効率良く起こることが確認された。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１２１】
＜実施例１３＞
（ポリマーナノ微粒子１３の合成）
実施例１２のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０３ｍｇに替えた以外は、実施例１２と同様にして、ポリマーナノ微粒子１３の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１２２】
＜実施例１４＞
（ポリマーナノ微粒子１４の合成）
実施例１２のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０２ｍｇに替えた以外は、実施例１２と同様にして、ポリマーナノ微粒子１４の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１２３】
＜実施例１５＞
（ポリマーナノ微粒子１５の合成）
実施例１２のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０１ｍｇに替えた以外は、実施例１２と同様にして、ポリマーナノ微粒子１５の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１２４】
＜実施例１６＞
（ポリマーナノ微粒子１６の合成）
実施例１２のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．００４ｍｇに替えた以外は、実施例１２と同様にして、ポリマーナノ微粒子１６の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１２５】
＜実施例１７＞
（ポリマーナノ微粒子１７の合成）
実施例１２のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．００２ｍｇに替えた以外は、実施例１２と同様にして、ポリマーナノ微粒子１７の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１２６】
＜実施例１８＞
（ポリマーナノ微粒子１８の合成）
前記化学式１３で示されるＣＤＰＤＯＦ（４ｍｇ、平均分子量１８，０００（ＧＰＣ（Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によるポリスチレン換算値）、筆者合成品）と前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．1ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１２７】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液（１重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１２８】
次に、前記エマルジョンを４０℃で１時間加熱し、分散質からクロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＣＤＰＤＯＦ中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子１８の水分散液を得た。得られたポリマーナノ微粒子１８の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は７８．６ｎｍであった。
【０１２９】
（ＦＲＥＴ特性評価）
蛍光分光測定装置（日本分光製、ＦＰ−６６００）を用いて、前記ポリマーナノ微粒子１８の水分散液のＦＲＥＴ特性を評価した。その結果を図９に示した。
【０１３０】
ポリマーナノ微粒子１８の水分散液に６００ｎｍの励起光を照射すると、ＣＤＰＤＯＦの蛍光が大きく減少し、且つ７８０ｎｍのＳｉＮＰｃＴＨＳＯの蛍光発光が見られた。このことから、ＣＤＰＤＯＦからＳｉＮＰｃＴＨＳＯへのＦＲＥＴが効率良く起こることが確認された。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１３１】
（ヌードマウスのｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージング）
前記ポリマーナノ微粒子１８の水分散液を滅菌済みの限外濾過フィルターで２倍に濃縮した。濃縮した水分散液について、滅菌済みのシリンジフィルター（０．２０μｍ径）で処理を行った後、ＰＢＳで２倍に希釈し、ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ、９週齢、メス）の尾静脈から０．２ｍｌ投与した。投与してから１５分、３時間、１日、２日、３日後に蛍光イメージング装置（Ｘｅｎｏｇｅｎ製、ＩＶＩＳ２００）でヌードマウスの蛍光像を撮影した。その結果を図３１に示した。ヌードマウスの体内から強い蛍光が検出され、ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージングできることが確認できた。
【０１３２】
＜実施例１９＞
（ポリマーナノ微粒子１９の合成）
実施例１８のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．１ｍｇから０．０４ｍｇに替えた以外は、実施例１８と同様にして、ポリマーナノ微粒子１９の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。また、ポリマーナノ微粒子１９のＴＥＭ写真を図１０に示した。
【０１３３】
＜実施例２０＞
（ポリマーナノ微粒子２０の合成）
実施例１８のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．１ｍｇから０．１７ｍｇに替えた以外は、実施例１８と同様にして、ポリマーナノ微粒子２０の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１３４】
＜実施例２１＞
（ポリマーナノ微粒子２１の合成）
実施例１８のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．１ｍｇから０．３ｍｇに替えた以外は、実施例１８と同様にして、ポリマーナノ微粒子２１の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１３５】
＜実施例２２＞
（ポリマーナノ微粒子２２の合成）
実施例１９のＣＤＰＤＯＦの使用量を４ｍｇから０．４ｍｇに替えた以外は、実施例１９と同様にして、ポリマーナノ微粒子２２の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１３６】
＜実施例２３＞
（ポリマーナノ微粒子２３の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０１ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子２３の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１３７】
＜実施例２４＞
（ポリマーナノ微粒子２４の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０１３ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子２４の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１３８】
＜実施例２５＞
（ポリマーナノ微粒子２５の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０１7ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子２５の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１３９】
＜実施例２６＞
（ポリマーナノ微粒子２６の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０２ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子２６の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４０】
＜実施例２７＞
（ポリマーナノ微粒子２７の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０３ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子２７の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４１】
＜実施例２８＞
（ポリマーナノ微粒子２８の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０５４ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子２８の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４２】
＜実施例２９＞
（ポリマーナノ微粒子２９の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．０８ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子２９の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４３】
＜実施例３０＞
（ポリマーナノ微粒子３０の合成）
実施例２２のＳｉＮＰｃＨＳＯの使用量を０．０４ｍｇから０．２ｍｇに替えた以外は、実施例２２と同様にして、ポリマーナノ微粒子３０の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４４】
＜実施例３１＞
（ポリマーナノ微粒子３１の合成）
前記化学式１３で示されるＣＤＰＤＯＦ（０．４ｍｇ、筆者合成品）と前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．００４ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１４５】
次に、ＤＴＡＣ（塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ製）を溶解した水溶液（０．７０重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とした。この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルションを調製した。
【０１４６】
次に、前記エマルションを６０℃で３０分間加熱し、クロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＤＴＡＣで保護され、且つＣＤＰＤＯＦマトリックス中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子３１の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４７】
＜実施例３２＞
（ポリマーナノ微粒子３２の合成）
実施例３１のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．００４ｍｇから０．０１ｍｇに替えた以外は、実施例３１と同様にして、ポリマーナノ微粒子３２の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４８】
＜実施例３３＞
（ポリマーナノ微粒子３３の合成）
実施例３１のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．００４ｍｇから０．０３ｍｇに替えた以外は、実施例３１と同様にして、ポリマーナノ微粒子３３の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１４９】
＜実施例３４＞
（ポリマーナノ微粒子３４の合成）
前記化学式１０で示されるＡＤＳ１０６ＲＥ（０．４ｍｇ）と前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．０３ｍｇ）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１５０】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液（１重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１５１】
次に、前記エマルジョンを４０℃で１時間加熱し、分散質からクロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＡＤＳ１０６ＲＥ中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子３４の水分散液を得た。
【０１５２】
得られたポリマーナノ微粒子３４の粒径を動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は７３．１ｎｍであった。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１５３】
＜実施例３５＞
（ポリマーナノ微粒子３５の合成）
実施例３４のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０３ｍｇから０．０１ｍｇに替えた以外は、実施例３４と同様にして、ポリマーナノ微粒子３５の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１５４】
＜実施例３６＞
（ポリマーナノ微粒子３６の合成）
実施例３４のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０３ｍｇから０．０２ｍｇに替えた以外は、実施例３４と同様にして、ポリマーナノ微粒子３６の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表１に示した。
【０１５５】
＜比較例１＞
非特許文献１で得られた微粒子を比較例１とし、実施例１から３６で得られたポリマーナノ微粒子１から３６、及び比較例１の微粒子のＦＲＥＴ効率を比較した。その結果を表１にまとめて示した。
【０１５６】
表１の結果から、本発明のポリマーナノ微粒子１〜３６（ポリマーナノ微粒子２３、及び３１〜３３は除く）のＦＲＥＴ効率が比較例１（非特許文献１）よりも優れていることが確認された。
【０１５７】
【表１−１】
【０１５８】
【表１−２】
【０１５９】
＜実施例３７＞
（ポリマーナノ微粒子３７とＱＤ（量子ドット）の輝度比較）
本発明のポリマーナノ微粒子３７、及びＱＤを用いて輝度比較を行った。評価に用いたポリマーナノ微粒子３７は、以下の合成例に従って合成した。また、ＱＤとして、ＱＤ５６５（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【０１６０】
（ポリマーナノ微粒子３７の合成例）
前記化学式１で示されるＦ８ＢＴ（４ｍｇ）と前記化学式１８で示されるＳｉＰｃＴＨＳＯ（０．０４ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１６１】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液（１重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１６２】
次に、前記エマルジョンを４０℃で１時間加熱し、クロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＦ８ＢＴマトリックス中にＳｉＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子３７の水分散液を得た。
【０１６３】
（輝度比較）
ポリマーナノ微粒子３７及びＱＤ５６５を同一ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）ｆｉｌｍ内に分散させ、蛍光顕微鏡により観察した。その際、観察にはそれぞれの粒子しか観察できないフィルターを用い同一箇所で、別々に蛍光像を取得した。その結果を図１１、図１２に示した。
【０１６４】
また、ポリマーナノ微粒子３７及びＱＤ５６５の輝度分布をヒストグラム化し、比較した結果を図１３に示した。以上の結果から、ポリマーナノ微粒子３７がＱＤ５６５よりも大きな輝度を示すことが確認できた。
【０１６５】
＜実施例３８＞
（ポリマーナノ微粒子３８とＱＤの輝度比較）
本発明のポリマーナノ微粒子３８、及びＱＤを用いて輝度比較を行った。評価に用いたポリマーナノ微粒子３８は、以下の合成例に従って合成した。また、ＱＤとして、実施例３７と同様にＱＤ５６５を使用した。
【０１６６】
（ポリマーナノ微粒子３８の合成例）
前記化学式１０で示されるＡＤＳ１０６ＲＥ（４ｍｇ）と前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．０４ｍｇ）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１６７】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液（１重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１６８】
次に、前記エマルジョンを４０℃で１時間加熱し、分散質からクロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＡＤＳ１０６ＲＥ中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子３８の水分散液を得た。また、ポリマーナノ微粒子３８のＴＥＭ写真を図１４に示した。
【０１６９】
（輝度比較）
実施例３７と同様に、ポリマーナノ微粒子３８及びＱＤ５６５を同一ＰＶＡ ｆｉｌｍ内に分散させ、蛍光顕微鏡により観察した。その際、観察にはそれぞれの粒子しか観察できないフィルターを用い同一箇所で、別々に蛍光像を取得した。その結果を図１５、図１６に示した。
【０１７０】
また、ポリマーナノ微粒子３８及びＱＤ５６５の輝度分布をヒストグラム化し、比較した結果を図１７に示した。以上の結果から、ポリマーナノ微粒子３８がＱＤ５６５よりも大きな輝度を示すことが確認できた。
【０１７１】
＜実施例３９＞
（ポリマーナノ微粒子の分散安定性評価）
本発明のポリマーナノ微粒子１８、３９、４０、及び非特許文献３の方法で得たポリマーナノ微粒子４１を用いて、分散安定性に関する評価を行った。評価に用いたポリマーナノ微粒子３９から４１は以下の合成例に従って合成した。また、ポリマーナノ微粒子１８は実施例１８に従って合成した。
【０１７２】
（ポリマーナノ微粒子３９の合成例）
前記化学式１０で示されるＡＤＳ１０６ＲＥ（０．４ｍｇ）と前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．０４ｍｇ）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１７３】
次に、ＤＴＡＣを溶解した水溶液（０．７０重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１７４】
次に、前記エマルジョンを６０℃で３０分間加熱し、クロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＤＴＡＣで保護され、且つＡＤＳ１０６ＲＥマトリックス中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子３９の水分散液を得た。
【０１７５】
（ポリマーナノ微粒子４０の合成例）
前記化学式１０で示されるＡＤＳ１０６ＲＥ（０．４ｍｇ）と前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．０４ｍｇ）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１７６】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液（１重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１７７】
次に、前記エマルジョンを４０℃で１時間加熱し、分散質からクロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＡＤＳ１０６ＲＥ中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子４０の水分散液を得た。
【０１７８】
（ポリマーナノ微粒子４１の合成例）
前記化学式１０で示されるＡＤＳ１０６ＲＥ（０．０８ｍｇ）と前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．００４ｍｇ）をＴＨＦ（２ｇ）に溶解させて、ＴＨＦ溶液を調製した。
【０１７９】
次に、超純水（８ｇ）に、前記ＴＨＦ溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理した。
【０１８０】
次に、この溶液を７０℃で３０分間加熱し、分散質からＴＨＦを留去することによって、ＡＤＳ１０６ＲＥ中にＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子４１の水分散液を得た。
【０１８１】
（分散安定性評価１）
前記ポリマーナノ微粒子３９、４０、４１の粒径を動的光散乱解析装置で分析した。粒径を測定した後、各ポリマーナノ微粒子の水分散液（１．８ｇ）に対して、１．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液（０．２ｇ）を加えた。一晩放置した後、再び動的光散乱解析装置で粒径を分析し、その結果を図１８に示した。
【０１８２】
図１８から、本発明のポリマーナノ微粒子３９、４０において、分散液を調製してから一晩放置後においても目立った凝集は観察されず、特に、ポリマーナノ微粒子４０は、分散安定性に優れていることが確認された。一方、比較例のポリマーナノ微粒子４１では、微粒子表面が界面活性剤で保護されていないことから、一晩放置後、大きな凝集体が生成し、本発明のポリマーナノ微粒子３９、４０と比較して分散安定性に劣ることが確認された。
【０１８３】
（分散安定性評価２）
前記ポリマーナノ微粒子１８、４０、４１の粒径を動的光散乱解析装置で分析した。粒径を測定した後、各ポリマーナノ微粒子の水分散液（１．８ｇ）に対して、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．２ｇ）およびウシ胎児血清（ＦＢＳ、０．２ｇ）を加えた。室温で一晩放置した後、再び動的光散乱解析装置で粒径を分析し、その結果を図１９〜２１に示した。
【０１８４】
図１９〜２１より、本発明のポリマーナノ微粒子１８、４０において、分散液を調製してから一晩放置後においてもリン酸緩衝液およびウシ胎児血清中で目立った凝集は観察されず、分散安定性に優れていることが確認された。一方、比較例のポリマーナノ微粒子４１では、微粒子表面が界面活性剤で保護されていないことから、一晩放置後、リン酸緩衝液中で大きな凝集体が生成し、本発明のポリマーナノ微粒子１８、４０と比較して分散安定性に劣ることが確認された。
【０１８５】
次に、第二の本発明に関して、実施例を用いて説明する。
【０１８６】
＜実施例４０＞
（ポリマーナノ微粒子４２の合成）
ＰＳ（４ｍｇ、ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＰＯＬＹＭＥＲ ＰＲＯＤＵＣＴＳ製、分子量２２，０００）、前記化学式１８で示されるＳｉＰｃＴＨＳＯ（０．７５６ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）、前記化学式２１で示されるＳｉＮＰｃＴＨＳＯ（０．０４２ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）をクロロホルム（０．８ｇ）に溶解させて、クロロホルム溶液を調製した。
【０１８７】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０を溶解した水溶液（１．５重量％、１０ｇ）に、前記クロロホルム溶液を加えて混合液とし、この混合液を攪拌した後、超音波分散機で３０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１８８】
次に、前記エマルジョンを４０℃で２時間加熱し、分散質からクロロホルムを留去することによって、微粒子の表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＰＳ中にＳｉＰｃＴＨＳＯとＳｉＮＰｃＴＨＳＯが分散したポリマーナノ微粒子４２の水分散液を得た。また、ポリマーナノ微粒子４２のＴＥＭ写真を図２２に示した。得られたポリマーナノ微粒子４２の粒径を透過型電子顕微鏡により観察したところ、平均粒径は６６．９ｎｍであった。
【０１８９】
（ＦＲＥＴ特性評価）
蛍光分光測定装置を用いて、前記ポリマーナノ微粒子４２の水分散液のＦＲＥＴ特性を評価した。その結果を図２３に示した。
【０１９０】
ポリマーナノ微粒子４２の水分散液に６００ｎｍの励起光を照射すると、ＳｉＰｃＴＨＳＯの蛍光が大きく減少し、且つ７８０ｎｍのＳｉＮＰｃＴＨＳＯの蛍光発光が見られたことから、ＳｉＰｃＴＨＳＯからＳｉＮＰｃＴＨＳＯへのＦＲＥＴが効率良く起こることが確認された。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表３に示した。
【０１９１】
（輝度比較）
ポリマーナノ微粒子４２またはＱＤ８００を分散させたＰＶＡ ｆｉｌｍを別々のスライドガラス上に作製し、それぞれ蛍光顕微鏡により観察した。その際、観察には共通の励起フィルター、ダイクロイックミラー、蛍光フィルターを用い、別々に蛍光像を取得した。その結果を図２４、図２５に示した。また、１粒子当たりの吸光係数、蛍光量子収率、蛍光強度を表２に示した。
【０１９２】
更に、ポリマーナノ微粒子４２またはＱＤ８００の輝度分布をヒストグラム化し、比較した結果を図２６に示した。以上の結果から、ポリマーナノ微粒子４２がＱＤ８００よりも大きな輝度を示すことが確認できた。
【０１９３】
【表２】
【０１９４】
（分散安定性評価）
ＳｉＰｃＴＨＳＯ及びＳｉＮＰｃＴＨＳＯを含まないこと以外は、実施例４０と同様にして、ＰＳのみからなるポリマーナノ微粒子４３を作製し、その粒径を動的光散乱解析装置で分析した。粒径を測定した後、ポリマーナノ微粒子４３の水分散液（０．９ｇ）に対して、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．１ｇ）またはウシ胎児血清（ＦＢＳ、０．１ｇ）を加えた。室温で一晩放置した後、再び動的光散乱解析装置で粒径を分析し、その結果を図２７に示した。
【０１９５】
図２７より、ポリマーナノ微粒子４３において、分散液を調製してから一晩放置後においてもリン酸緩衝液およびウシ胎児血清中で目立った凝集は観察されず、分散安定性に優れていることが確認された。
【０１９６】
（ヌードマウスのｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージング）
前記ポリマーナノ微粒子４２の水分散液をＰＢＳで４倍に希釈し、滅菌済みの限外濾過フィルター（０．２２μｍ径）で処理を行った後、ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ、９週齢、メス）の尾静脈から０．２ｍｌ投与した。投与してから１５分、３時間、１日、２日、３日後に蛍光イメージング装置（Ｘｅｎｏｇｅｎ製、ＩＶＩＳ２００）でヌードマウスの蛍光像を撮影した。その結果を図２８に示した。ヌードマウスの体内から強い蛍光が検出され、ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージングできることが確認できた。
【０１９７】
＜実施例４１＞
（ポリマーナノ微粒子４４の合成）
実施例４０のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４２ｍｇから０．００８４ｍｇに替えた以外は、実施例４０と同様にして、ポリマーナノ微粒子４４の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表３に示した。
【０１９８】
＜実施例４２＞
（ポリマーナノ微粒子４５の合成）
実施例４０のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４２ｍｇから０．０２１ｍｇに替えた以外は、実施例４０と同様にして、ポリマーナノ微粒子４５の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表３に示した。
【０１９９】
＜実施例４３＞
（ポリマーナノ微粒子４６の合成）
実施例４０のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４２ｍｇから０．０８４ｍｇに替えた以外は、実施例４０と同様にして、ポリマーナノ微粒子４６の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表３に示した。
【０２００】
＜実施例４４＞
（ポリマーナノ微粒子４７の合成）
実施例４０のＳｉＮＰｃＴＨＳＯの使用量を０．０４２ｍｇから０．１４ｍｇに替えた以外は、実施例４０と同様にして、ポリマーナノ微粒子４７の水分散液を得た。また、ＦＲＥＴ効率に関しては、その結果を表３に示した。
【０２０１】
【表３】
【０２０２】
＜実施例４５＞
（ポリマーナノ微粒子４８の合成例）
特許文献１に開示されている方法に従って、ポリマーナノ微粒子４８を合成した。
【０２０３】
攪拌中のＬａｔｅｘ溶液（０．６ｍＬ，４％ｗ／ｖ：Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｃｏｒｐ． Ｉｎｃ．）にＤＭＦ（１．３３ｍＬ）を５分かけて滴下し、更に３０分間攪拌してＬａｔｅｘを膨潤させた。続いて、色素（溶液全量 （２ｍＬ）に対してＳｉＰｃＴＨＳＯ ０．６６８ｍｇ、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯ ０．２ｍｇ）を溶解させたＤＭＦ（０．０７ｍＬ）を５分かけて滴下し、更に３０分間攪拌した。最後に冷蔵庫内（約７°Ｃ）で１５時間透析を行い、ＤＭＦを除去してポリマーナノ微粒子４８を得た。
【０２０４】
（ポリマーナノ微粒子のＦＲＥＴ効率比較）
特許文献１に開示されている方法に従って、ＳｉＰｃＴＨＳＯのみ、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯのみ、ＳｉＰｃＴＨＳＯとＳｉＮＰｃＴＨＳＯを含有したポリマーナノ微粒子を作製し蛍光を測定した。図２９はその規格化した蛍光スペクトルである。ＳｉＰｃＴＨＳＯとＳｉＮＰｃＴＨＳＯを含有したポリマーナノ微粒子４８は、ＳｉＰｃＴＨＳＯの蛍光が消光し、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯの蛍光が観察された。
【０２０５】
本発明のポリマーナノ微粒子４２、及び特許文献１に開示されている製造方法で得たポリマーナノ微粒子４８を用いて、ＦＲＥＴ効率に関する比較を行った。その結果、ポリマーナノ微粒子４８のＦＲＥＴ効率は３２．３％であり、本発明のポリマーナノ微粒子４２（ＦＲＥＴ効率９６．４％）の方が優れていることが確認された。
【０２０６】
（ポリマーナノ微粒子の蛍光強度比較）
本発明のポリマーナノ微粒子と特許文献１に開示されているポリマーナノ微粒子のポリマー濃度が同程度（０．００８９％ｗｖ-1）になるように調製して得られた微粒子をそれぞれポリマーナノ微粒子４９、ポリマーナノ微粒子５０とした。それらの蛍光強度を比較し、その結果を図３０に示した。７８１ｎｍにおける蛍光強度はポリマーナノ微粒子４９が２２４３、ポリマーナノ微粒子５０が１９であり、ポリマーナノ微粒子４９の蛍光強度の方が１００倍以上大きいことが確認された。
【０２０７】
また、吸光度からポリマーに対する色素濃度を計算すると、ポリマーナノ微粒子４９ではＳｉＰｃＴＨＳＯが２．７ｗｔ％、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯが０．３ｗｔ％含有していた。これに対して、ポリマーナノ微粒子５０ではＳｉＰｃＴＨＳＯが０．０５４ｗｔ％、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯが０．０１３ｗｔ％であった。
【０２０８】
更に１粒子当たりの色素含有量は、ポリマーナノ微粒子４９ではＳｉＰｃＴＨＳＯが３８００個、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯが４００個であるのに対して、ポリマーナノ微粒子５０はＳｉＰｃＴＨＳＯが１５０個、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯが３０個となった。これらのことから、特許文献１に開示されている製造方法ではポリマー粒子内にドナー色素、アクセプター色素を効率的に内包させることは困難であることが分かった。また、ＳｉＰｃＴＨＳＯ、ＳｉＮＰｃＴＨＳＯはＤＭＦに溶け難く、これ以上の濃度で仕込むのは難しいと考えられる。以上の結果を表４にまとめた。
【０２０９】
【表４】
【符号の説明】
【０２１０】
１ ポリマーナノ微粒子
２ 蛍光性ポリマー
３ 蛍光色素（アクセプター）
４ 界面活性剤
５ 蛍光色素（ドナー）
６ ポリマー
７ 有機溶媒
８ 界面活性剤を有する水溶液
９ エマルジョン
１０ ポリマーナノ微粒子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光性ポリマーのマトリックス中に蛍光色素が分散したポリマーナノ微粒子であって、該微粒子表面が界面活性剤で保護され、前記蛍光性ポリマーと前記蛍光色素間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）で蛍光を発光することを特徴とするポリマーナノ微粒子。
【請求項２】
前記蛍光性ポリマーが共役ポリマーであることを特徴とする請求項１に記載のポリマーナノ微粒子。
【請求項３】
ポリマーのマトリックス中に２種類の異なる蛍光色素が分散したポリマーナノ微粒子であって、該微粒子表面が界面活性剤で保護され、前記２種類の異なる蛍光色素間のＦＲＥＴで蛍光を発光することを特徴とするポリマーナノ微粒子。
【請求項４】
前記のＦＲＥＴで発光する蛍光が６００ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下の近赤外波長であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のポリマーナノ微粒子。
【請求項５】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のポリマーナノ微粒子。
【請求項６】
前記微粒子の平均粒径が１０ｎｍ以上、２００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のポリマーナノ微粒子。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載のポリマーナノ微粒子を含有することを特徴とする光分子イメージング用造影剤。
【請求項１】
蛍光性ポリマーのマトリックス中に蛍光色素が分散したポリマーナノ微粒子であって、該微粒子表面が界面活性剤で保護され、前記蛍光性ポリマーと前記蛍光色素間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）で蛍光を発光することを特徴とするポリマーナノ微粒子。
【請求項２】
前記蛍光性ポリマーが共役ポリマーであることを特徴とする請求項１に記載のポリマーナノ微粒子。
【請求項３】
ポリマーのマトリックス中に２種類の異なる蛍光色素が分散したポリマーナノ微粒子であって、該微粒子表面が界面活性剤で保護され、前記２種類の異なる蛍光色素間のＦＲＥＴで蛍光を発光することを特徴とするポリマーナノ微粒子。
【請求項４】
前記のＦＲＥＴで発光する蛍光が６００ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下の近赤外波長であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のポリマーナノ微粒子。
【請求項５】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のポリマーナノ微粒子。
【請求項６】
前記微粒子の平均粒径が１０ｎｍ以上、２００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のポリマーナノ微粒子。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載のポリマーナノ微粒子を含有することを特徴とする光分子イメージング用造影剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１１】
【図１２】
【図１５】
【図１６】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２４】
【図２５】
【図２７】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１３】
【図１４】
【図１７】
【図２２】
【図２３】
【図２６】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１１】
【図１２】
【図１５】
【図１６】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２４】
【図２５】
【図２７】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１３】
【図１４】
【図１７】
【図２２】
【図２３】
【図２６】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【公開番号】特開２０１０−８３８６０（Ｐ２０１０−８３８６０Ａ）
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４４２２２（Ｐ２００９−４４２２２）
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、文部科学省、「先端融合領域イノベーション創出拠点の形成（高次生体イメージング先端テクノハブ）」に係わる委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、文部科学省、「先端融合領域イノベーション創出拠点の形成（高次生体イメージング先端テクノハブ）」に係わる委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
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