ポリリン酸を安定化剤とするエリスロポエチン溶液製剤
【課題】安定なエリスロポエチン溶液製剤、特にこれまで製剤処方例のない安定なネコエリスロポエチン溶液製剤の提供。
【解決手段】安定化剤としてポリリン酸を含むエリスロポエチン溶液製剤は、エリスロポエチンの活性を保持し、長期間安定であるため、安定なエリスロポエチン溶液製剤処方として有効である。さらに好ましくは、ポリリン酸の濃度が１μＭ〜１ｍＭであること、ｐＨ６．０〜７．０のクエン酸緩衝液を含むこと、等張化剤として塩化ナトリウムを含むこと、吸着防止剤としてポリソルベート８０を含むこと、安定化剤としてさらにマルトースを含むことである。
【解決手段】安定化剤としてポリリン酸を含むエリスロポエチン溶液製剤は、エリスロポエチンの活性を保持し、長期間安定であるため、安定なエリスロポエチン溶液製剤処方として有効である。さらに好ましくは、ポリリン酸の濃度が１μＭ〜１ｍＭであること、ｐＨ６．０〜７．０のクエン酸緩衝液を含むこと、等張化剤として塩化ナトリウムを含むこと、吸着防止剤としてポリソルベート８０を含むこと、安定化剤としてさらにマルトースを含むことである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は安定なエリスロポエチン溶液製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチン（以下、本明細書において「ＥＰＯ」と記載することがある。）は、赤血球産生を促進するホルモンで、主に腎臓において生産される。ヒトＥＰＯは１９２残基のアミノ酸で構成されており、その内、Ｎ末端から２７残基がシグナルペプチド、１６５残基が成熟タンパク質のアミノ酸配列からなり、Ｎ型結合糖鎖およびＯ型結合糖鎖修飾を受けた分子量約３４，０００Ｄａの糖タンパク質である。組織が低酸素ストレスを受けると、ＥＰＯは骨髄中の原始前駆細胞が、前赤芽球に変換されるのを促進することにより赤血球の産生を増大させる。その他、ヒト以外にも、マウス、ラット、イヌ、ネコなどのＥＰＯ ｃＤＮＡクローニングがなされている（非特許文献１）。
【０００３】
ＥＰＯは慢性腎不全、化学療法剤又は外科手術によって引き起こされる貧血の改善に有効であり、ヒトＥＰＯは医薬品として利用されている。なお、コンパニオンアニマルであるイヌおよびネコにおいても上記ヒトと同様の貧血が見られ、これらの動物の死亡および能力障害の主な原因となっており、医薬品として唯一開発されているヒトＥＰＯがその治療薬として利用されている（非特許文献２）。しかしながら、ヒトＥＰＯがイヌおよびネコに投与された場合には種の違いにより中和抗体が発現し、この抗体により投与したＥＰＯの有効性が減弱したり、またイヌ、ネコ本来のＥＰＯと交叉反応して貧血を悪化させたりする（非特許文献１）などの問題点がある。
【０００４】
ヒトＥＰＯ製剤としては、安定化剤としてタンパク質ではなくアミノ酸を含む溶液製剤があり、１０℃で２年間、２５℃で６ヶ月以上、４０℃で２週間以上保存し、その剤のエリスロポエチン残存率は９５％以上との結果が示されている（特許文献１）。しかしながら、特許文献１にはＥＰＯ溶液製剤の安定化剤としてポリリン酸が使用できることについては記載がなく、また、特許文献１にはネコＥＰＯ溶液製剤に関する記載もない。
【特許文献１】特開平１０−１８２４８１号公報
【非特許文献１】ヴェンら：ブラッド（Blood）、８２、１５０７（１９９３）
【非特許文献２】コーキルら：ジャーナル・アメリカン・ベターナリー・メディカル・アソシエーション（J.Am.Vet.Med Assc）、１５，２１４（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は安定なエリスロポエチン溶液製剤、特にこれまで製剤処方例のない安定なネコエリスロポエチン溶液製剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討の結果、エリスロポエチン溶液製剤においてポリリン酸が安定化剤として有効であることを新規に見いだし、発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１）安定化剤としてポリリン酸を含むことを特徴とする安定なエリスロポエチン溶液製剤。
（２）ポリリン酸の濃度が１μＭ〜１ｍＭであることを特徴とする（１）に記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
（３）ｐＨ６．０〜７．０のクエン酸緩衝液を含むことを特徴とする（１）または（２）に記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
（４）等張化剤として塩化ナトリウムを含むことを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
（５）吸着防止剤としてポリソルベート８０を含むことを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
（６）安定化剤としてさらにマルトースを含むことを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
（７）エリスロポエチンが組換え動物細胞で生産されることを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
（８）エリスロポエチンがネコエリスロポエチンであることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、安定で不溶性微粒子が少なく、注射剤として調製可能なＥＰＯ溶液製剤を調製することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で使用するＥＰＯは、哺乳動物由来であれば特に限定されないが、好ましくはヒト、イヌまたはネコのＥＰＯであり、より好ましくはネコのＥＰＯである。と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のものや遺伝子組換えにより得られた天然由来のＥＰＯと実質的に同じ生物学的活性を有するものであってもよく、遺伝子組換えにより得られるＥＰＯは天然のＥＰＯとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の１または複数個を欠失、置換、付加したもので生物学的活性を有するものであってもよい。また、本発明で使用するＥＰＯはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の化学修飾されたＥＰＯであってもよい。
【００１０】
本発明で使用されるＥＰＯはいかなる方法で製造されたものでもよく、例えば尿より種々の方法で抽出・分離精製したもの、遺伝子工学的手法により得られた組換え動物細胞で産生し、種々の方法で抽出・分離精製したものであってもよいが、好ましくは組換え動物細胞より産生されたものであり、より好ましくは組換えＣＨＯ細胞より産生されたものである。
【００１１】
本発明で使用されるＥＰＯを組換え動物細胞を用いて製造する場合の製造方法について、以下に説明する。
【００１２】
組換え動物細胞の製造方法としては、例えば、ＥＰＯをコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドすなわち、発現ベクターを調製し、定法により動物細胞に形質転換する方法が挙げられる。該発現ベクターに組込まれるプロモーターは、宿主である動物細胞により、ＳＶ４０初期、後期、ｈＣＭＶなど最終的に活性型のＥＰＯを得られるものであればよい。マーカー遺伝子は、ネオマイシン（ｎｅｏ）遺伝子やジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子などが用いられる。選択用添加物質として、マーカー遺伝子がｎｅｏ遺伝子の場合はＧ−４１８、ｄｈｆｒ遺伝子の場合はメトトレキセートが例示される。宿主細胞への形質転換は、公知の方法、例えばリン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法。リポフェクチン法などの沈殿法、プロトプラストポリエチレン法、エレクトロポレーション法などが利用できる。
【００１３】
前記組換え動物細胞から産生されたＥＰＯの精製方法は、上記のようにして動物細胞を培養して培養上清中に得られたＥＰＯを数種類のカラムクロマトを実施することで精製可能である。例えば、銅キレート担体、陰イオン交換体、ゲル濾過担体の組み合わせにより精製可能である。
【００１４】
本発明に使用される安定化剤としては、ポリリン酸が適している。好ましいポリリン酸は、オルトリン酸が脱水縮合して得られる直鎖縮合ポリリン酸が挙げられ、２個以上のＰＯ４四面体が頂点の酸素原子を共有して直鎖状に連なった構造をした直鎖縮合ポリリン酸が挙げられる。なお、ここでいうポリリン酸は、ポリリン酸の水酸基の水素が金属と置換した分子構造をしたポリリン酸塩であってもよく、金属としてはナトリウム、カリウムが挙げられる。なお、ポリリン酸のリン酸の重合数を表すｎは好ましくは１５〜２０００である。
【００１５】
製剤中の安定化剤であるポリリン酸の含有量としては特に限定されないが、好ましくは１μＭ〜１ｍＭである。なお、本発明の溶液製剤は血清アルブミンまたはゼラチン等のＥＰＯ以外のタンパク質あるいはアミノ酸を実質的に含まなくても安定であることから、前記タンパク質またはアミノ酸を含まないことが好ましい。
【００１６】
また、本発明においては安定化剤として前記ポリリン酸に加えてマルトースを含有することも好ましい態様の１つである。マルトースは、別名麦芽糖とも呼ばれており、α−グルコース２分子がα１−４グリコシド結合した還元性二糖である。マルトースの含有量は、好ましくは１１０ｍｇ／ｍＬ〜４４０ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは１５０ｍｇ／ｍＬ〜４００ｍｇ／ｍＬである。なお、溶液製剤中に安定化剤としてポリリン酸を１μＭ〜１ｍＭ、マルトースを１５０ｍｇ／ｍＬ〜４００ｍｇ／ｍＬを含有する場合、４０℃、１ヶ月の加速試験において、最も高いＥＰＯの残存活性を示した。
【００１７】
本発明の溶液製剤は、トリス緩衝液やクエン酸緩衝液などの溶液製剤の分野で公知の緩衝液に溶解することにより好ましく調製可能であるが、安定性の観点からクエン酸緩衝液が好ましく使用される。クエン酸緩衝液としては、クエン酸ナトリウムの緩衝液が好ましい。緩衝液の好ましいｐＨは５．０〜８．０、より好ましくは６．０〜７．０である。
【００１８】
本発明の溶液製剤は、等張化剤が好ましく使用され、中でも塩が好ましく使用される。等張化剤として使用される塩の具体例としては、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムが挙げられるが、本発明の溶液製剤での好ましい塩は塩化ナトリウムである。等張化剤の好ましい含有量としては、５ｍｇ〜１０ｇであり、より好ましくは８ｍｇ〜２０ｍｇである。
【００１９】
さらに、本発明の溶液製剤は、吸着防止剤が好ましく使用される。吸着防止剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル系の界面活性剤が好ましく、具体例として、ポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０または８５が挙げられるが、中でもポリソルベート８０がより好ましい。吸着防止剤の好ましい添加量は、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０２〜０．１ｍｇ／ｍＬである。
【００２０】
本発明に溶液製剤中に含まれるネコＥＰＯの量は、治療対象となる疾患の種類、重症度、年齢などに応じて設定できるが、一般的には１００〜５０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは２００〜２０００Ｕ／ｍＬである。本発明の溶液製剤は、経口、注射剤（皮下もしくは静注）、経皮、経粘膜、経鼻などで投与されるが、好ましくは注射剤により投与される。
【００２１】
本発明の溶液製剤には、ＥＰＯ、ポリリン酸の他にも、ポリエチレングリコール、デキストラン、Ｄ−マンニトール、ソルビトール、イノシトール、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、スクロースなどの糖類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩類、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩、などの溶液製剤に通常添加される成分を含むことも可能である。
【００２２】
本発明の溶液製剤は、通常密封、滅菌されたプラスチックまたはガラス容器に収納されている。注射剤である場合、容器はアンプル、バイアル、ディスポーザブル注射器などの形状のもので供給される。
【００２３】
本発明の溶液製剤が安定な溶液製剤であるかどうかについては、４０℃、２ヶ月の加速試験中または加速試験後のＥＰＯの残存活性を測定することにより確認することができる。ＥＰＯの残存活性はヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社製）に添付の方法に従い測定し、その添加効果を調べることで確認することができる。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【００２５】
参考例１ ネコＥＰＯを発現する組換えＣＨＯ細胞の作製およびネコＥＰＯ産生
市販のｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン社製）にネコＥＰＯ遺伝子（配列番号１）またはマウスｄｈｆｒ遺伝子（配列番号２）を挿入したベクターをそれぞれ１００μg、１０μgを調製し、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ-細胞１×１０７ｃｅｌｌｓ／７５０μＬ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製したものと混合した。室温で３０分静置し、エレクトロポレーション装置（バイオラッド社製）に設置し、３３０μＦ、４００Ｖで通電した。５分間静置後、氷上でさらに１０分静置し、１０％ＦＢＳ、ヒポキサンチン、チミジンを含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）１０ｃｃに懸濁し、１０ｃｍシャーレにまいた。３７℃、５％ＣＯ２条件下２日間培養し、細胞を遠心操作により回収し、１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍＬ Ｇ−４１８を含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）１０ｃｃに懸濁し、１００μＬ／ｗｅｌｌの割合で９６穴プレートに処理した。３日毎に１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍＬ Ｇ−４１８を含むＩＭＤＭ培地で交換し、１５日間培養を行った。１５日後、顕微鏡観察を行い、生存している細胞を選択し、コロニー単離を行った。
【００２６】
得られたクローンを１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍＬ Ｇ−４１８を含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）で増殖させ、２×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｃｃ／１０ｃｍシャーレを準備し、最終濃度５ｎＭメトトレキセート（ＭＴＸ）を添加した。３日毎に５ｎＭ ＭＴＸを含む上記培地と交換し、１０−１５日間培養を継続し、細胞が生存していてコロニーを形成しているものについて、細胞を回収し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｃｃ／１０ｃｍシャーレを準備し、最終濃度５０ｎＭ ＭＴＸを添加した。同様の方法で、５００ｎＭ ＭＴＸまで処理を行い、細胞の生存が確認できる２クローンを選別した。
【００２７】
得られた動物細胞形質転換体２クローン（ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１、ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ２）を用いて、無血清培地への馴化を行った。無血清培地として、２０μｇ／ｍＬインスリンおよび抗生物質としてペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）を準備した。上記（２）の１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地（血清培地とする）で継代した細胞を用いて以下の方法で馴化した。無血清培地：血清培地＝０：１００（培地Ａ）、５０：５０（培地Ｂ）、１００：０（培地Ｃ）の混合液をそれぞれ用意し、２５０ｍＬ三角フラスコを用いて細胞接種時に細胞密度５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製し、まず培地Ａで３７℃、５％ＣＯ２存在下細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Ｂで３７℃、５％ＣＯ２存在下で細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Ｃで３７℃、５％ＣＯ２存在下で細胞培養を行い、継代を４−６回実施した。その結果、得られた細胞をそれぞれｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１’またはｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ２’とした。これらの細胞は、２０μｇ／ｍＬインスリン存在下生育可能なインスリン要求性の細胞であり、浮遊性細胞であった。
【００２８】
得られた細胞をそれぞれ、２５０ｍＬ三角フラスコにより初期細胞密度５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製し、５％ＣＯ２・３７℃・１００ｒｐｍ条件下、前記無血清培地で５日間培養すると組換えネコＥＰＯの生産性はいずれも約１０ｍｇ/Ｌであった。
【００２９】
参考例２ ネコＥＰＯの検出
参考例１で得られた培養上清中のネコＥＰＯをウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー（株）製のアクリルアミドゲル“パジェル”中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー（株）製の“クリアブロットメンブラン”に常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗ヒトＥＰＯポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含む“ブロックエース”（大日本製薬（株）製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット（株）製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ（株）製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１’およびｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ２’の細胞培養上清から、いずれも約３０〜３５ｋＤａのバンドを検出した。
【００３０】
ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて、培養液中のネコＥＰＯの定量を行った。その結果、ネコＥＰＯの生産速度は８００〜１２００Ｕ／１０６ ｃｅｌｌｓ／４８ｈであった。ネコＥＰＯの推定分子量がおよそ３０〜３５ｋＤａであり、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔによる測定の結果、ＥＰＯの定量が可能であったことから、参考例１の培養上清中にネコＥＰＯが発現したものと判断した。
【００３１】
参考例３ ＣＨＯ細胞生産ネコＥＰＯの精製
１．限外濾過法による濃縮・バッファー交換
参考例１で得られたネコＥＰＯを含む細胞培養上清を、限外ろ過装置（ミリポア社製）により、分子量１００００以下の物質の除去およびＨＣＯ６０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）にバッファー置換を行い、３０倍濃縮を行った。限外ろ過に使用した膜は、ＹＭ１０（ミリポア社製、分子量１００００カット）を使用した。
【００３２】
２．陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
次に、ＨＣＯ６０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した陰イオン（アニオン）交換担体であるＤＥＡＥセファロース（アマシャム社製）を用意し、濃縮したネコＥＰＯを含む溶液を導入した。十分にカラムの洗浄を行った後、ＨＣＯ６０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ緩衝液（ｐＨ６）、ＨＣＯ６０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）を通液し、カラム内のｐＨを低下させて不純物を除去した。次に、ｐＨ５に達したところで、５０ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）／０．０１％ ＨＣＯ６０、１００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）／０．０１％ ＨＣＯ６０、２００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）／０．０１％ ＨＣＯ６０、５００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）／０．０１％ ＨＣＯ６０で段階的に溶出させ、２００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）／０．０１％ ＨＣＯ６０の画分を次の銅キレートカラムクロマトグラフィーに供した。
【００３３】
本操作における活性回収率をヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔによる測定した結果、約５０−７０％であった。
【００３４】
３．銅キレートカラムクロマトグラフィー
次に、上記２の精製フラクションを、銅イオンをキレート結合させた銅キレーティングセファロースファーストフロー（アマシャム社製）を予めＨＣＯ６０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５）で平衡化させた後、通液した。さらにＨＣＯ６０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ緩衝液（ｐＨ５）でカラムに通液したところ、ネコＥＰＯ以外の高分子量不純物が除去され、これらのフロースルーを回収した。
【００３５】
本操作における活性回収率をヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔによる測定した結果、７０−８０％であった。
【００３６】
４．ゲル濾過
最後に、上記３の精製フラクションを、セファクリルＳ−２００(アマシャム社製)のカラムに導入し脱塩操作を行った。このカラムは、ｐＨ６．８〜７．０の２０ｍＭクエン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム／０．０１％ ＨＣＯ６０で展開した。
【００３７】
５．得られたネコＥＰＯの純度、精製収率および比活性
上記１〜４の操作の結果得られたネコＥＰＯサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、図１のレーン５に示すように銀染色によるゲル染色において、ネコＥＰＯの単一化を確認した。また、イメージアナライザー（バイオラッド社製）により染色したゲルを用いた純度検定を行った結果、９０％の純度を確認することができた。さらに、得られたネコＥＰＯサンプルをＣ４樹脂カラム（ＶＹＤＡＣ社製）に供した。測定条件は、流速１ｍＬ／ｍｉｎで通液し、０〜８０％エタノール/１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）のグラジエント溶出を行い、２３０ｎｍのＵＶ吸光度測定を行った。その結果、リテンションタイム５０−６０ｍｉｎ、約６６−８０％エタノールの画分に溶出が見られ、得られたネコＥＰＯの純度は約９０％であった。
【００３８】
さらに、上記１〜４の操作の結果得られたネコＥＰＯの最終的な精製収率をヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔによる測定した結果、３５−５０％であった。また、ゲル濾過精製溶液のタンパク定量をＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ(ＰＩＥＲＣＥ社製)を用いて定量した結果、比活性は約１０００００Ｕ／ｍｇであった。また、エンドトキシン含量は０．９ｎｇ／ｍｇ蛋白量であった。
【００３９】
参考例４ 精製ネコＥＰＯを用いたｐＨ安定性検討
ネコＥＰＯ５００U、ポリソルベート８０ ０．０５ｍｇ、塩化ナトリウム ８．５ｍｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液または１０ｍＭクエン酸緩衝液で１ｍＬに調製した。各緩衝液のｐＨは、ｐＨ４，５，６，７，８，９に調製した。それぞれ調製した溶液を２ｍＬのガラスバイアルに充填し、４０℃恒温槽内に１ヶ月放置した。製剤中のネコＥＰＯの残存活性は、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて評価した。得られた結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
本結果から、pHが６〜７で最もネコＥＰＯの残存活性が高いことが判明した。
【００４２】
実施例１ 安定化剤であるポリリン酸の効果
ネコＥＰＯ ５００U、ポリソルベート８０ ０．０５ｍｇ、塩化ナトリウム８．５ｍｇを、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１ｍＬに調製した。さらに、ポリリン酸（ＳＩＧＭＡ社製、Ｐ８５１０、重合数ｎ＝１２）を最終濃度１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭになるように添加した。それぞれ調製した溶液を２ｍＬのガラスバイアルに充填し、４０度恒温槽内に３ヶ月放置した。製剤中のネコＥＰＯの残存活性は、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて評価した。得られた結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
本結果から、ポリリン酸を添加すると安定性が向上することが判明した。
【００４５】
実施例２ 安定化剤であるポリリン酸およびマルトースを含むネコＥＰＯ溶液製剤の保存安定性検討
ネコＥＰＯ５００U、ポリソルベート８０ ０．０５ｍｇ、塩化ナトリウム８．５ｍｇを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１ｍＬに調製した。さらに、マルトースが最終濃度４４０ｍｇ／ｍＬになるように添加し、さらにポリリン酸（ＳＩＧＭＡ社製、Ｐ８５１０、重合数ｎ＝１２）が最終濃度１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭになるように調製した溶液を２ｍＬのガラスバイアルに充填し、４０℃恒温槽内に４ヶ月放置した。１ヶ月毎の製剤中のネコＥＰＯの残存活性は、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて評価した。得られた結果を図１に示す。保存４ヶ月に渡り活性が約１００％維持できていた。
【００４６】
実施例３ マウスを用いた急性毒性試験
実施例２で調製したネコＥＰＯ溶液製剤（ネコＥＰＯ ５００U、ポリソルベート８０ ０．０５ｍｇ、塩化ナトリウム８．５ｍｇ、マルトース４４０ｍｇを、ポリリン酸１００μＭを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１ｍＬに調製）を用いて急性毒性試験を実施した。Ｃｒｊ：ＣＤ−１（ＩＣＲ）マウス１群５匹（メス）に対して、皮下投与を行った。用量は１μg／頭、１０μg／頭、１００μg／頭、１ｍｇ／頭、１０ｍｇ／頭の５用量を設定し、投与した。投与後から投与１４日間一般状態観察、体重測定は週１回、１４日後に剖検を行ったところ、異常を示す症状は見られなかった。
【００４７】
実施例４ 貧血モデル猫へのネコＥＰＯ製剤投与試験
実施例２で調製したネコＥＰＯ溶液製剤（ネコＥＰＯ ５００U、ポリソルベート８０ ０．０５ｍｇ、塩化ナトリウム８．５ｍｇ、マルトース４４０ｍｇを、ポリリン酸１００μＭを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１ｍＬに調製）を用いて、貧血モデル猫への投与試験を実施した。貧血モデル猫は、ネコＥＰＯ投与前１週間にフェニルヒドラジン（ＰＨＺ）７ｍｇ／ｋｇを週２回皮下投与して作出した。コントロールとして、ＰＨＺのみ投与およびＰＨＺおよびヒトＥＰＯ製剤（５００Ｕ／ｋｇ）投与した群を設定し、投薬群はネコＥＰＯ製剤１００Ｕ／ｋｇ投与群、５００Ｕ／ｋｇ投与群をそれぞれ設定し、皮下および静注を行った（表３）。
【００４８】
コントロール１では投薬期間中の赤血球数の増加は見られなかったが、投薬群全て（コントロール２も含める）で赤血球数の増加を確認することができた。投薬開始３週目には赤血球数は１０００×１０４μＬになり、健常猫と同等にまで回復した。また、投与後から終了後までの一般状態観察、体重測定は週１回、５週後に剖検を行ったところ、異常を示す症状は見られなかったことから、安全性の高い溶液製剤であることが確認された。
【００４９】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本願の発明によれば、安定なＥＰＯ溶液製剤、特にネコ貧血治療用のネコＥＰＯ溶液製剤を提供することが可能になり、注射剤等医薬品を提供可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ポリリン酸存在下、保存４ヶ月間でのネコEPO残存活性の推移を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は安定なエリスロポエチン溶液製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチン（以下、本明細書において「ＥＰＯ」と記載することがある。）は、赤血球産生を促進するホルモンで、主に腎臓において生産される。ヒトＥＰＯは１９２残基のアミノ酸で構成されており、その内、Ｎ末端から２７残基がシグナルペプチド、１６５残基が成熟タンパク質のアミノ酸配列からなり、Ｎ型結合糖鎖およびＯ型結合糖鎖修飾を受けた分子量約３４，０００Ｄａの糖タンパク質である。組織が低酸素ストレスを受けると、ＥＰＯは骨髄中の原始前駆細胞が、前赤芽球に変換されるのを促進することにより赤血球の産生を増大させる。その他、ヒト以外にも、マウス、ラット、イヌ、ネコなどのＥＰＯ ｃＤＮＡクローニングがなされている（非特許文献１）。
【０００３】
ＥＰＯは慢性腎不全、化学療法剤又は外科手術によって引き起こされる貧血の改善に有効であり、ヒトＥＰＯは医薬品として利用されている。なお、コンパニオンアニマルであるイヌおよびネコにおいても上記ヒトと同様の貧血が見られ、これらの動物の死亡および能力障害の主な原因となっており、医薬品として唯一開発されているヒトＥＰＯがその治療薬として利用されている（非特許文献２）。しかしながら、ヒトＥＰＯがイヌおよびネコに投与された場合には種の違いにより中和抗体が発現し、この抗体により投与したＥＰＯの有効性が減弱したり、またイヌ、ネコ本来のＥＰＯと交叉反応して貧血を悪化させたりする（非特許文献１）などの問題点がある。
【０００４】
ヒトＥＰＯ製剤としては、安定化剤としてタンパク質ではなくアミノ酸を含む溶液製剤があり、１０℃で２年間、２５℃で６ヶ月以上、４０℃で２週間以上保存し、その剤のエリスロポエチン残存率は９５％以上との結果が示されている（特許文献１）。しかしながら、特許文献１にはＥＰＯ溶液製剤の安定化剤としてポリリン酸が使用できることについては記載がなく、また、特許文献１にはネコＥＰＯ溶液製剤に関する記載もない。
【特許文献１】特開平１０−１８２４８１号公報
【非特許文献１】ヴェンら：ブラッド（Blood）、８２、１５０７（１９９３）
【非特許文献２】コーキルら：ジャーナル・アメリカン・ベターナリー・メディカル・アソシエーション（J.Am.Vet.Med Assc）、１５，２１４（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は安定なエリスロポエチン溶液製剤、特にこれまで製剤処方例のない安定なネコエリスロポエチン溶液製剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討の結果、エリスロポエチン溶液製剤においてポリリン酸が安定化剤として有効であることを新規に見いだし、発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１）安定化剤としてポリリン酸を含むことを特徴とする安定なエリスロポエチン溶液製剤。
（２）ポリリン酸の濃度が１μＭ〜１ｍＭであることを特徴とする（１）に記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
（３）ｐＨ６．０〜７．０のクエン酸緩衝液を含むことを特徴とする（１）または（２）に記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
（４）等張化剤として塩化ナトリウムを含むことを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
（５）吸着防止剤としてポリソルベート８０を含むことを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
（６）安定化剤としてさらにマルトースを含むことを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
（７）エリスロポエチンが組換え動物細胞で生産されることを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
（８）エリスロポエチンがネコエリスロポエチンであることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、安定で不溶性微粒子が少なく、注射剤として調製可能なＥＰＯ溶液製剤を調製することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で使用するＥＰＯは、哺乳動物由来であれば特に限定されないが、好ましくはヒト、イヌまたはネコのＥＰＯであり、より好ましくはネコのＥＰＯである。と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のものや遺伝子組換えにより得られた天然由来のＥＰＯと実質的に同じ生物学的活性を有するものであってもよく、遺伝子組換えにより得られるＥＰＯは天然のＥＰＯとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の１または複数個を欠失、置換、付加したもので生物学的活性を有するものであってもよい。また、本発明で使用するＥＰＯはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の化学修飾されたＥＰＯであってもよい。
【００１０】
本発明で使用されるＥＰＯはいかなる方法で製造されたものでもよく、例えば尿より種々の方法で抽出・分離精製したもの、遺伝子工学的手法により得られた組換え動物細胞で産生し、種々の方法で抽出・分離精製したものであってもよいが、好ましくは組換え動物細胞より産生されたものであり、より好ましくは組換えＣＨＯ細胞より産生されたものである。
【００１１】
本発明で使用されるＥＰＯを組換え動物細胞を用いて製造する場合の製造方法について、以下に説明する。
【００１２】
組換え動物細胞の製造方法としては、例えば、ＥＰＯをコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドすなわち、発現ベクターを調製し、定法により動物細胞に形質転換する方法が挙げられる。該発現ベクターに組込まれるプロモーターは、宿主である動物細胞により、ＳＶ４０初期、後期、ｈＣＭＶなど最終的に活性型のＥＰＯを得られるものであればよい。マーカー遺伝子は、ネオマイシン（ｎｅｏ）遺伝子やジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子などが用いられる。選択用添加物質として、マーカー遺伝子がｎｅｏ遺伝子の場合はＧ−４１８、ｄｈｆｒ遺伝子の場合はメトトレキセートが例示される。宿主細胞への形質転換は、公知の方法、例えばリン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法。リポフェクチン法などの沈殿法、プロトプラストポリエチレン法、エレクトロポレーション法などが利用できる。
【００１３】
前記組換え動物細胞から産生されたＥＰＯの精製方法は、上記のようにして動物細胞を培養して培養上清中に得られたＥＰＯを数種類のカラムクロマトを実施することで精製可能である。例えば、銅キレート担体、陰イオン交換体、ゲル濾過担体の組み合わせにより精製可能である。
【００１４】
本発明に使用される安定化剤としては、ポリリン酸が適している。好ましいポリリン酸は、オルトリン酸が脱水縮合して得られる直鎖縮合ポリリン酸が挙げられ、２個以上のＰＯ４四面体が頂点の酸素原子を共有して直鎖状に連なった構造をした直鎖縮合ポリリン酸が挙げられる。なお、ここでいうポリリン酸は、ポリリン酸の水酸基の水素が金属と置換した分子構造をしたポリリン酸塩であってもよく、金属としてはナトリウム、カリウムが挙げられる。なお、ポリリン酸のリン酸の重合数を表すｎは好ましくは１５〜２０００である。
【００１５】
製剤中の安定化剤であるポリリン酸の含有量としては特に限定されないが、好ましくは１μＭ〜１ｍＭである。なお、本発明の溶液製剤は血清アルブミンまたはゼラチン等のＥＰＯ以外のタンパク質あるいはアミノ酸を実質的に含まなくても安定であることから、前記タンパク質またはアミノ酸を含まないことが好ましい。
【００１６】
また、本発明においては安定化剤として前記ポリリン酸に加えてマルトースを含有することも好ましい態様の１つである。マルトースは、別名麦芽糖とも呼ばれており、α−グルコース２分子がα１−４グリコシド結合した還元性二糖である。マルトースの含有量は、好ましくは１１０ｍｇ／ｍＬ〜４４０ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは１５０ｍｇ／ｍＬ〜４００ｍｇ／ｍＬである。なお、溶液製剤中に安定化剤としてポリリン酸を１μＭ〜１ｍＭ、マルトースを１５０ｍｇ／ｍＬ〜４００ｍｇ／ｍＬを含有する場合、４０℃、１ヶ月の加速試験において、最も高いＥＰＯの残存活性を示した。
【００１７】
本発明の溶液製剤は、トリス緩衝液やクエン酸緩衝液などの溶液製剤の分野で公知の緩衝液に溶解することにより好ましく調製可能であるが、安定性の観点からクエン酸緩衝液が好ましく使用される。クエン酸緩衝液としては、クエン酸ナトリウムの緩衝液が好ましい。緩衝液の好ましいｐＨは５．０〜８．０、より好ましくは６．０〜７．０である。
【００１８】
本発明の溶液製剤は、等張化剤が好ましく使用され、中でも塩が好ましく使用される。等張化剤として使用される塩の具体例としては、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムが挙げられるが、本発明の溶液製剤での好ましい塩は塩化ナトリウムである。等張化剤の好ましい含有量としては、５ｍｇ〜１０ｇであり、より好ましくは８ｍｇ〜２０ｍｇである。
【００１９】
さらに、本発明の溶液製剤は、吸着防止剤が好ましく使用される。吸着防止剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル系の界面活性剤が好ましく、具体例として、ポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０または８５が挙げられるが、中でもポリソルベート８０がより好ましい。吸着防止剤の好ましい添加量は、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０２〜０．１ｍｇ／ｍＬである。
【００２０】
本発明に溶液製剤中に含まれるネコＥＰＯの量は、治療対象となる疾患の種類、重症度、年齢などに応じて設定できるが、一般的には１００〜５０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは２００〜２０００Ｕ／ｍＬである。本発明の溶液製剤は、経口、注射剤（皮下もしくは静注）、経皮、経粘膜、経鼻などで投与されるが、好ましくは注射剤により投与される。
【００２１】
本発明の溶液製剤には、ＥＰＯ、ポリリン酸の他にも、ポリエチレングリコール、デキストラン、Ｄ−マンニトール、ソルビトール、イノシトール、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、スクロースなどの糖類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩類、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩、などの溶液製剤に通常添加される成分を含むことも可能である。
【００２２】
本発明の溶液製剤は、通常密封、滅菌されたプラスチックまたはガラス容器に収納されている。注射剤である場合、容器はアンプル、バイアル、ディスポーザブル注射器などの形状のもので供給される。
【００２３】
本発明の溶液製剤が安定な溶液製剤であるかどうかについては、４０℃、２ヶ月の加速試験中または加速試験後のＥＰＯの残存活性を測定することにより確認することができる。ＥＰＯの残存活性はヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社製）に添付の方法に従い測定し、その添加効果を調べることで確認することができる。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【００２５】
参考例１ ネコＥＰＯを発現する組換えＣＨＯ細胞の作製およびネコＥＰＯ産生
市販のｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン社製）にネコＥＰＯ遺伝子（配列番号１）またはマウスｄｈｆｒ遺伝子（配列番号２）を挿入したベクターをそれぞれ１００μg、１０μgを調製し、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ-細胞１×１０７ｃｅｌｌｓ／７５０μＬ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製したものと混合した。室温で３０分静置し、エレクトロポレーション装置（バイオラッド社製）に設置し、３３０μＦ、４００Ｖで通電した。５分間静置後、氷上でさらに１０分静置し、１０％ＦＢＳ、ヒポキサンチン、チミジンを含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）１０ｃｃに懸濁し、１０ｃｍシャーレにまいた。３７℃、５％ＣＯ２条件下２日間培養し、細胞を遠心操作により回収し、１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍＬ Ｇ−４１８を含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）１０ｃｃに懸濁し、１００μＬ／ｗｅｌｌの割合で９６穴プレートに処理した。３日毎に１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍＬ Ｇ−４１８を含むＩＭＤＭ培地で交換し、１５日間培養を行った。１５日後、顕微鏡観察を行い、生存している細胞を選択し、コロニー単離を行った。
【００２６】
得られたクローンを１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍＬ Ｇ−４１８を含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）で増殖させ、２×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｃｃ／１０ｃｍシャーレを準備し、最終濃度５ｎＭメトトレキセート（ＭＴＸ）を添加した。３日毎に５ｎＭ ＭＴＸを含む上記培地と交換し、１０−１５日間培養を継続し、細胞が生存していてコロニーを形成しているものについて、細胞を回収し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｃｃ／１０ｃｍシャーレを準備し、最終濃度５０ｎＭ ＭＴＸを添加した。同様の方法で、５００ｎＭ ＭＴＸまで処理を行い、細胞の生存が確認できる２クローンを選別した。
【００２７】
得られた動物細胞形質転換体２クローン（ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１、ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ２）を用いて、無血清培地への馴化を行った。無血清培地として、２０μｇ／ｍＬインスリンおよび抗生物質としてペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）を準備した。上記（２）の１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地（血清培地とする）で継代した細胞を用いて以下の方法で馴化した。無血清培地：血清培地＝０：１００（培地Ａ）、５０：５０（培地Ｂ）、１００：０（培地Ｃ）の混合液をそれぞれ用意し、２５０ｍＬ三角フラスコを用いて細胞接種時に細胞密度５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製し、まず培地Ａで３７℃、５％ＣＯ２存在下細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Ｂで３７℃、５％ＣＯ２存在下で細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Ｃで３７℃、５％ＣＯ２存在下で細胞培養を行い、継代を４−６回実施した。その結果、得られた細胞をそれぞれｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１’またはｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ２’とした。これらの細胞は、２０μｇ／ｍＬインスリン存在下生育可能なインスリン要求性の細胞であり、浮遊性細胞であった。
【００２８】
得られた細胞をそれぞれ、２５０ｍＬ三角フラスコにより初期細胞密度５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製し、５％ＣＯ２・３７℃・１００ｒｐｍ条件下、前記無血清培地で５日間培養すると組換えネコＥＰＯの生産性はいずれも約１０ｍｇ/Ｌであった。
【００２９】
参考例２ ネコＥＰＯの検出
参考例１で得られた培養上清中のネコＥＰＯをウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー（株）製のアクリルアミドゲル“パジェル”中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー（株）製の“クリアブロットメンブラン”に常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗ヒトＥＰＯポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含む“ブロックエース”（大日本製薬（株）製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット（株）製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ（株）製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１’およびｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ２’の細胞培養上清から、いずれも約３０〜３５ｋＤａのバンドを検出した。
【００３０】
ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて、培養液中のネコＥＰＯの定量を行った。その結果、ネコＥＰＯの生産速度は８００〜１２００Ｕ／１０６ ｃｅｌｌｓ／４８ｈであった。ネコＥＰＯの推定分子量がおよそ３０〜３５ｋＤａであり、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔによる測定の結果、ＥＰＯの定量が可能であったことから、参考例１の培養上清中にネコＥＰＯが発現したものと判断した。
【００３１】
参考例３ ＣＨＯ細胞生産ネコＥＰＯの精製
１．限外濾過法による濃縮・バッファー交換
参考例１で得られたネコＥＰＯを含む細胞培養上清を、限外ろ過装置（ミリポア社製）により、分子量１００００以下の物質の除去およびＨＣＯ６０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）にバッファー置換を行い、３０倍濃縮を行った。限外ろ過に使用した膜は、ＹＭ１０（ミリポア社製、分子量１００００カット）を使用した。
【００３２】
２．陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
次に、ＨＣＯ６０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した陰イオン（アニオン）交換担体であるＤＥＡＥセファロース（アマシャム社製）を用意し、濃縮したネコＥＰＯを含む溶液を導入した。十分にカラムの洗浄を行った後、ＨＣＯ６０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ緩衝液（ｐＨ６）、ＨＣＯ６０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）を通液し、カラム内のｐＨを低下させて不純物を除去した。次に、ｐＨ５に達したところで、５０ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）／０．０１％ ＨＣＯ６０、１００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）／０．０１％ ＨＣＯ６０、２００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）／０．０１％ ＨＣＯ６０、５００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）／０．０１％ ＨＣＯ６０で段階的に溶出させ、２００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）／０．０１％ ＨＣＯ６０の画分を次の銅キレートカラムクロマトグラフィーに供した。
【００３３】
本操作における活性回収率をヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔによる測定した結果、約５０−７０％であった。
【００３４】
３．銅キレートカラムクロマトグラフィー
次に、上記２の精製フラクションを、銅イオンをキレート結合させた銅キレーティングセファロースファーストフロー（アマシャム社製）を予めＨＣＯ６０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５）で平衡化させた後、通液した。さらにＨＣＯ６０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ緩衝液（ｐＨ５）でカラムに通液したところ、ネコＥＰＯ以外の高分子量不純物が除去され、これらのフロースルーを回収した。
【００３５】
本操作における活性回収率をヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔによる測定した結果、７０−８０％であった。
【００３６】
４．ゲル濾過
最後に、上記３の精製フラクションを、セファクリルＳ−２００(アマシャム社製)のカラムに導入し脱塩操作を行った。このカラムは、ｐＨ６．８〜７．０の２０ｍＭクエン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム／０．０１％ ＨＣＯ６０で展開した。
【００３７】
５．得られたネコＥＰＯの純度、精製収率および比活性
上記１〜４の操作の結果得られたネコＥＰＯサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、図１のレーン５に示すように銀染色によるゲル染色において、ネコＥＰＯの単一化を確認した。また、イメージアナライザー（バイオラッド社製）により染色したゲルを用いた純度検定を行った結果、９０％の純度を確認することができた。さらに、得られたネコＥＰＯサンプルをＣ４樹脂カラム（ＶＹＤＡＣ社製）に供した。測定条件は、流速１ｍＬ／ｍｉｎで通液し、０〜８０％エタノール/１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）のグラジエント溶出を行い、２３０ｎｍのＵＶ吸光度測定を行った。その結果、リテンションタイム５０−６０ｍｉｎ、約６６−８０％エタノールの画分に溶出が見られ、得られたネコＥＰＯの純度は約９０％であった。
【００３８】
さらに、上記１〜４の操作の結果得られたネコＥＰＯの最終的な精製収率をヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔによる測定した結果、３５−５０％であった。また、ゲル濾過精製溶液のタンパク定量をＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ(ＰＩＥＲＣＥ社製)を用いて定量した結果、比活性は約１０００００Ｕ／ｍｇであった。また、エンドトキシン含量は０．９ｎｇ／ｍｇ蛋白量であった。
【００３９】
参考例４ 精製ネコＥＰＯを用いたｐＨ安定性検討
ネコＥＰＯ５００U、ポリソルベート８０ ０．０５ｍｇ、塩化ナトリウム ８．５ｍｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液または１０ｍＭクエン酸緩衝液で１ｍＬに調製した。各緩衝液のｐＨは、ｐＨ４，５，６，７，８，９に調製した。それぞれ調製した溶液を２ｍＬのガラスバイアルに充填し、４０℃恒温槽内に１ヶ月放置した。製剤中のネコＥＰＯの残存活性は、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて評価した。得られた結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
本結果から、pHが６〜７で最もネコＥＰＯの残存活性が高いことが判明した。
【００４２】
実施例１ 安定化剤であるポリリン酸の効果
ネコＥＰＯ ５００U、ポリソルベート８０ ０．０５ｍｇ、塩化ナトリウム８．５ｍｇを、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１ｍＬに調製した。さらに、ポリリン酸（ＳＩＧＭＡ社製、Ｐ８５１０、重合数ｎ＝１２）を最終濃度１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭになるように添加した。それぞれ調製した溶液を２ｍＬのガラスバイアルに充填し、４０度恒温槽内に３ヶ月放置した。製剤中のネコＥＰＯの残存活性は、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて評価した。得られた結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
本結果から、ポリリン酸を添加すると安定性が向上することが判明した。
【００４５】
実施例２ 安定化剤であるポリリン酸およびマルトースを含むネコＥＰＯ溶液製剤の保存安定性検討
ネコＥＰＯ５００U、ポリソルベート８０ ０．０５ｍｇ、塩化ナトリウム８．５ｍｇを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１ｍＬに調製した。さらに、マルトースが最終濃度４４０ｍｇ／ｍＬになるように添加し、さらにポリリン酸（ＳＩＧＭＡ社製、Ｐ８５１０、重合数ｎ＝１２）が最終濃度１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭになるように調製した溶液を２ｍＬのガラスバイアルに充填し、４０℃恒温槽内に４ヶ月放置した。１ヶ月毎の製剤中のネコＥＰＯの残存活性は、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて評価した。得られた結果を図１に示す。保存４ヶ月に渡り活性が約１００％維持できていた。
【００４６】
実施例３ マウスを用いた急性毒性試験
実施例２で調製したネコＥＰＯ溶液製剤（ネコＥＰＯ ５００U、ポリソルベート８０ ０．０５ｍｇ、塩化ナトリウム８．５ｍｇ、マルトース４４０ｍｇを、ポリリン酸１００μＭを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１ｍＬに調製）を用いて急性毒性試験を実施した。Ｃｒｊ：ＣＤ−１（ＩＣＲ）マウス１群５匹（メス）に対して、皮下投与を行った。用量は１μg／頭、１０μg／頭、１００μg／頭、１ｍｇ／頭、１０ｍｇ／頭の５用量を設定し、投与した。投与後から投与１４日間一般状態観察、体重測定は週１回、１４日後に剖検を行ったところ、異常を示す症状は見られなかった。
【００４７】
実施例４ 貧血モデル猫へのネコＥＰＯ製剤投与試験
実施例２で調製したネコＥＰＯ溶液製剤（ネコＥＰＯ ５００U、ポリソルベート８０ ０．０５ｍｇ、塩化ナトリウム８．５ｍｇ、マルトース４４０ｍｇを、ポリリン酸１００μＭを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１ｍＬに調製）を用いて、貧血モデル猫への投与試験を実施した。貧血モデル猫は、ネコＥＰＯ投与前１週間にフェニルヒドラジン（ＰＨＺ）７ｍｇ／ｋｇを週２回皮下投与して作出した。コントロールとして、ＰＨＺのみ投与およびＰＨＺおよびヒトＥＰＯ製剤（５００Ｕ／ｋｇ）投与した群を設定し、投薬群はネコＥＰＯ製剤１００Ｕ／ｋｇ投与群、５００Ｕ／ｋｇ投与群をそれぞれ設定し、皮下および静注を行った（表３）。
【００４８】
コントロール１では投薬期間中の赤血球数の増加は見られなかったが、投薬群全て（コントロール２も含める）で赤血球数の増加を確認することができた。投薬開始３週目には赤血球数は１０００×１０４μＬになり、健常猫と同等にまで回復した。また、投与後から終了後までの一般状態観察、体重測定は週１回、５週後に剖検を行ったところ、異常を示す症状は見られなかったことから、安全性の高い溶液製剤であることが確認された。
【００４９】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本願の発明によれば、安定なＥＰＯ溶液製剤、特にネコ貧血治療用のネコＥＰＯ溶液製剤を提供することが可能になり、注射剤等医薬品を提供可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ポリリン酸存在下、保存４ヶ月間でのネコEPO残存活性の推移を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化剤としてポリリン酸を含むことを特徴とする安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【請求項２】
ポリリン酸の濃度が１μＭ〜１ｍＭであることを特徴とする請求項１に記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【請求項３】
ｐＨ６．０〜７．０のクエン酸緩衝液を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【請求項４】
等張化剤として塩化ナトリウムを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【請求項５】
吸着防止剤としてポリソルベート８０を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【請求項６】
安定化剤としてさらにマルトースを含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【請求項７】
エリスロポエチンが組換え動物細胞で生産されることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【請求項８】
エリスロポエチンがネコエリスロポエチンであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【請求項１】
安定化剤としてポリリン酸を含むことを特徴とする安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【請求項２】
ポリリン酸の濃度が１μＭ〜１ｍＭであることを特徴とする請求項１に記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【請求項３】
ｐＨ６．０〜７．０のクエン酸緩衝液を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【請求項４】
等張化剤として塩化ナトリウムを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【請求項５】
吸着防止剤としてポリソルベート８０を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【請求項６】
安定化剤としてさらにマルトースを含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【請求項７】
エリスロポエチンが組換え動物細胞で生産されることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【請求項８】
エリスロポエチンがネコエリスロポエチンであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の安定なエリスロポエチン溶液製剤。
【図１】
【公開番号】特開２００９−２４９２９２（Ｐ２００９−２４９２９２Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９４９７３（Ｐ２００８−９４９７３）
【出願日】平成２０年４月１日（２００８．４．１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１日（２００８．４．１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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